JP2024521466A - Ｐｃｒ分析に答える試料のための流体チャネル形状を有する装置とその使用方法 - Google Patents

Abstract

リアルタイムｑＰＣＲシステムにおいて使用するためのチップに関する様々な実施形態が開示される。チップは、試料をチップに受け入れるための少なくとも１つのポートと、少なくともポートと流体連通する少なくとも１つのチャネルと、少なくとも１つのチャネル内に配置され、試料が少なくとも１つのチャネルを通過する際に試料からＤＮＡ／ＲＮＡを捕捉する複数の磁気ビーズと、少なくとも１つのチャネルと流体連通する光検出領域であって、磁気ビーズ上に先に捕捉された溶出ＤＮＡ／ＲＮＡを含む試料の光学分析を行うための光検出領域とを含み得る。

Description

関連出願との相互参照

本出願は、２０２０年１０月１９日に出願され、「Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」と題された米国仮特許出願第６３／０９３，６４０号のＰＣＴ第８条に基づく優先権の利益を主張する。本出願はまた、全て２０２１年１０月１９日に同時出願され、同一の出願人であるＦｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ， Ｉｎｃ．が記載されている「Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、「Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｖｏｌｕｍｅｓ ｔｏ Ａｃｈｉｅｖｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題されたＰＣＴ出願、および「Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｓ ｏｆ ａ Ｃｈｉｐ」と題された米国意匠出願第２９／８１２，０３４号にも関連する。上記出願の内容は全て、参照により、その全体が本明細書に完全に記載されているように組み込まれる。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に関するものであり、より詳細には、これに限定されないが、ｑＰＣＲ処理および分析の効率を改善するための装置および方法に関する。

試料抽出、精製、およびＲＴ－ｑＰＣＲプロセス全体を、小型で使い捨て可能なフォーマットに縮小するための様々な異なるアプローチが存在する。その１つが、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ Ｌｉａｔプラットフォームである。このプラットフォームは、試料溶液を保存バッファから試薬保存用消耗品にピペットで移すために、使い捨ての小型トランスファーピペットを利用する。アッセイを実行するのに必要な試薬は、別々のセクションを持つチューブに封入される。アッセイ中、特定のセクションを破裂させ、適切な試薬を適切なタイミング、適切な順序で導入する。これは、システムを使用する前に、複雑な手作業による試料ハンドリングを必要とする。さらに、全ての流体制御は、流体チャネルを持たない隠れたリザーバで行われる。

もう１つのアプローチは、油と水／水溶液のような二相流体によるエレクトロウェッティング・アプローチである。このアプローチはＮｕＧｅｎ（Ｍｏｎｄｒｉａｎ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｌｏｇｉｃ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮｅｏＰｒｅｐ）によって商品化され、ＮＧＳライブラリ調製専用の試薬を分離しておき、所定のエレクトロウェッティングシーケンスで導入する。これは一部のシーケンスには有効であるが、商業的にはほぼ失敗だった。Ｂａｅｂｉｅｓ社は現在、ＦＩＮＤＥＲプラットフォームでＰＣＲ検査にこの技術を使おうとしている。

ＱＩＡｓｔａｔ－Ｄｘは複数の物理的な仕切りと物理的な移動バリア、あるいは液体を物理的に移動させたり誘導したりするその他の駆動機能を採用したシステムである。このシステムの装置は、消耗品内の流体動作を直接または間接的に駆動し、消耗品に存在するチャネルを通して液体をある領域から別の領域に移動させる。

他のアプローチとしては、遠心装置、いわゆる「ｃｄ－ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」があり、異なる回転速度、界面の特徴を利用して液体の動きを実現する。
ｕｆｌｕｉｄｉｘ．ｃｏｍ／ｃｉｒｃｌｅ／ｗｈａｔｓ－ａ－ｄｉｓｃｍａｎ－ａｎｄ－ｈｏｗ－ｉｓ－ｉｔ－ａ－ｍｅｄｉｃａｌ－ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ－ｄｅｖｉｃｅ－ｃｄ－ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ／を参照のこと。
これはいくつかのワークフローには有用であるが、ｑＰＣＲでは進行中のＰＣＲ反応を熱サイクルごとに画像化する必要がある。さらに、ＤＮＡ－Ｎｕｄｇｅシステムは試薬添加の順序を制御するために回転バルブを使用するが、最終的には固定された場所にある個別の容積においてＰＣＲを行う。

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、リアルタイムｑＰＣＲシステムにおいて使用するためのチップであって、試料をチップに受け入れるための少なくとも１つのポートと、少なくともポートと流体連通する少なくとも１つのチャネルと、少なくとも１つのチャネル内に配置され、試料が少なくとも１つのチャネルを通過する際に試料からＤＮＡ／ＲＮＡを捕捉する複数の磁気ビーズと、磁気ビーズ上に先に捕捉された溶出ＤＮＡ／ＲＮＡを含む試料の光学分析を行うための、少なくとも１つのチャネルと流体連通する光学検査領域と、を備えるチップが提供される。

本発明の実施態様において、チップは、洗浄流体および溶出流体の少なくとも一方をチップに受け入れるための少なくとも１つの追加ポートをさらに備える。

本発明の実施形態において、チップは、少なくとも１つのポートに対応し、少なくとも１つのポートと流体連通し、チップの上面に配置された少なくとも１つの入口をさらに備える。

本発明の実施形態において、チップは、磁気ビーズによって磁気活性になるように構成された少なくとも１つの磁気活性領域をさらに備える。

本発明の実施形態において、１つの磁気活性領域が、光学検査領域の上流に配置される。

本発明の実施形態において、チップは、少なくとも１つの加熱領域をさらに備える。

本発明の実施形態において、１つの加熱領域が光学検査領域の両側に配置される。

本発明の実施形態において、チップは、少なくとも１つのチャネル内に配置された少なくとも１つのフィルタをさらに備える。

本発明の実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、深さ０．５ｍｍ、幅０．５ｍｍである。

本発明の実施形態において、チップは、少なくとも１つのバーストバルブをさらに備える。

本発明の実施形態において、少なくとも１つのバーストバルブは、深さ０．１ｍｍ、幅０．１ｍｍである。

本発明の実施形態において、チップは、チップの外面に配置され、チップの外面から突出する少なくとも１つのチップストッパをさらに備える。

本発明の実施形態において、チップは、チップから試料を排出するための出口バルブをさらに備える。

本発明のいくつかの実施形態の他の態様によれば、カートリッジおよびチップ組立体が提供され、組立体は、少なくとも１つの流体リザーバを備えるカートリッジと、少なくとも１つの流体リザーバに対応する入口およびポートを有するカートリッジの下に配置されるチップと、カートリッジの上に配置された弾性のある膜とを備える。

本発明の一実施形態において、組立体は、チップが、入口が少なくとも１つの流体リザーバと流体連通しないように、カートリッジの少なくとも１つの下部クリップと少なくとも１つの上部クリップとの間に保持される第１の構成を有する。

本発明の一実施形態において、組立体は、チップが、入口が少なくとも１つの流体リザーバと流体連通するように、カートリッジの少なくとも１つの上部クリップとカートリッジとの間に保持される第２の構成を有する。

本発明の一実施形態において、組立体は、カートリッジおよびチップ組立体を第１の構成から第２の構成に移行させるためにカートリッジ上に配置された少なくとも１つのリリースをさらに備える。

本発明の一実施形態において、組立体は、カートリッジの廃棄領域と流体連通するチップの出口バルブおよび出口をさらに備える。

本発明の一実施形態において、組立体は、少なくとも１つのホイルシール、圧縮性層、および光学的に透明なシールのうちの少なくとも１つをさらに備える。

本発明のいくつかの実施形態の他の態様によれば、カートリッジおよびチップ組立体を使用する方法であって、カートリッジおよびチップ組立体のカートリッジの試料リザーバに試料を採取して挿入することと、試料リザーバからチップの入口およびポートを介してカートリッジおよびチップ組立体のチップに試料を押し込むことと、試料を磁気ビーズと混合し、次いでビーズをチップ内に捕捉することと、試料をチップからリザーバに戻すことと、カートリッジ内の少なくとも１つの洗浄流体リザーバから少なくとも１つの洗浄流体を押し込むことと、チップから少なくとも１つの洗浄流体リザーバに少なくとも１つの洗浄流体を戻すことと、弾性のある膜を押し下げることにより、カートリッジの溶出リザーバから、またはカートリッジのＰＣＲリザーバから、溶出バッファをチップに押し込むことと、弾性部材を戻すことにより、溶出バッファを戻すこと、またはＰＣＲリザーバに溶出バッファを後退させることにより、精製された試料を作製することと、精製された試料を回収し、精製された試料をチップの少なくとも１つの加熱領域に引き込むことと、少なくとも１つの加熱領域の温度を設定することと、精製された試料をチップの光学検査領域を通過させて循環させることと、光学検査領域で精製された試料から取り出された信号を測定することとを含む方法が提供される。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および／または材料が以下に記載される。矛盾がある場合は、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、必ずしも限定することを意図していない。

本発明の実施形態の方法および／またはシステムの実施は、選択されたタスクを手動、自動、またはそれらの組み合わせで実行または完了することを含むことができる。さらに、本発明の方法および／またはシステムの実施形態の実際の計装および機器によれば、いくつかの選択されたタスクは、ハードウェアによって、ソフトウェアによって、またはファームウェアによって、あるいはオペレーティングシステムを使用してそれらの組み合わせによって実施され得る。

例えば、本発明の実施形態による選択されたタスクを実行するためのハードウェアは、チップまたは回路として実装され得る。ソフトウェアとして、本発明の実施形態による選択されたタスクは、任意の適切なオペレーティングシステムを使用してコンピュータによって実行される複数のソフトウェア命令として実装され得る。本発明の例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法および／またはシステムの例示的な実施形態に係る１つまたは複数のタスクは、複数の命令を実行するためのコンピューティングプラットフォームなどのデータプロセッサによって実行される。任意に、データプロセッサは、命令および／またはデータを記憶するための揮発性メモリ、および／または、命令および／またはデータを記憶するための、例えば磁気ハードディスクおよび／またはリムーバブル媒体などの不揮発性ストレージを含む。任意に、ネットワーク接続も提供される。ディスプレイおよび／またはキーボードまたはマウスなどのユーザ入力装置も任意に提供される。

本発明のいくつかの実施形態が、添付図面を参照して、例示のためにのみ、本明細書において説明される。ここで図面を具体的に参照して詳細に説明すると、示された特定事項は例示であり、必ずしも縮尺通りではなく、本発明の実施形態の説明のためのものであることが強調される。この点に関して、図面とともに取られる説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。

本発明の例示的な実施形態によるチップの上側斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるチップの下側斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるチップの底面図である。 本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体の分解斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体の上側斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体の下側斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体の断面図である。 図７Ａとは異なる構成のカートリッジおよびチップ組立体の断面図である。 本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体とともに使用される光学検出ユニットの斜視図である。 本発明の例示的な実施形態によるチップを使用する方法のフローチャートである。 本発明の例示的な実施形態による注入口の縦断面図である。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に関するものであり、より詳細には、限定されるものではないが、ｑＰＣＲ処理および分析の効率を改善するための装置および方法に関するものである。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載され、かつ／または図面に例示される構成要素および／または方法の構造の詳細および配置に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施もしくは実行することが可能である。

一般に、本明細書に記載された発明は、バルク試薬リザーバおよび／または廃棄領域へのアクセスを有する流体チャネルのネットワークを使用して、１つの使い捨て消耗品（例えば、カートリッジ／チップ組立体）においてｑＰＣＲおよびＰＣＲのプロセスを完全に自動化する。本明細書に記載される発明は：実験室の機器要件および／またはコストを最小化／単純化し、ＰＣＲ増幅用の試料を調製するための試料抽出および／または精製のプロセスを加速し、有効なレベルの感度を提供しながらｑＰＣＲプロセスを加速する。本明細書で例示的に詳細に説明するように、これらの利点を提供する１つの方法は、（駆動モータと組み合わせたシステムのカートリッジ内）の膜駆動リザーバを使用することによって、適切な試薬および試料を正しい順序でチップに押し込むことである。インテリジェントに計画されたチャネル設計、小さな狭窄（「バーストバルブ」）、および、他のチャネル部分とは明らかに異なる（広い／深い）イメージング領域により、液体を適切な順序で、また制御された予測可能な方法でチップの適切な領域に導入できることが想定されている。ｑＰＣＲシステムの他の構成要素は、関連出願のセクションで相互参照される特許出願に関して記載されている。これらの構成要素の一部または全部を利用する例示的なｑＰＣＲシステムは、マサチューセッツ州ベッドフォードのＦｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ社からｑＰＣＲシステムとして入手可能であろう。

図１は、本発明の例示的な実施形態によるチップ１００の上側斜視図である。チップ１００は、より大きなｑＰＣＲシステムの構成部分であり、これらを一緒にすると、リアルタイムｑＰＣＲ分析を実施することができることが理解されるべきである。本発明の一実施形態において、複数の入口１０２ｉ、１０２ｉｉ、１０２ｉｉｉ、１０２ｉｖ、１０２ｖ、および出口１０２ｖｉがチップ１００に設けられており、流体は、例えば、チップ１００とともに使用されるカートリッジ４０２（図４、図５、図７Ａおよび図７Ｂに関して以下でさらに詳細に説明される）内に配置された流体リザーバまたはウェルから、入口を通してチップに導入されるか、または出口１０２ｖｉを介してチップから排出される。所望の流体の数または容量に応じて、より多くのまたはより少ない入口が提供され得る。本発明の一実施形態において、入口は、例えば、角度のついたカットによって形成されることによって、穿刺／鋭利な上端部を有するように構成される。本発明のいくつかの実施形態において、チップ１００は、チップ１００の周囲または外側の周りにチップストッパ／位置合わせ形状１０４，１０６を備えて構成され、これらは、カートリッジ４０２の対向部品形状（図７Ａから図７Ｂに関して以下でさらに詳細に説明される「クリップ」）と組み合わせて使用される。本発明の一実施形態において、チップ１００は、低コスト、容易に再生産可能、拡張可能かつ／または変更可能な構造のために射出成形される。

図２は、本発明の例示的な実施形態によるチップ１００の下側斜視図である。例示的なチャネル構成が図２に示され、図３に関してさらに説明される。

図３は、本発明の例示的な実施形態によるチップ１００の底面図である。簡潔にするために、図３のチップ１００を、本発明の例示的な実施形態によるチップ１００を使用する方法のフローチャート９００である図９と併せて説明する。試料綿棒をあらかじめ採取し、細胞を溶解すると同時に、露出したＤＮＡおよびＲＮＡ断片をＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅプロテオーム活性から保護するための溶解剤を含む、図５に示され、より詳細に説明される試料リザーバ５０２ｉに挿入する（９０２）。試料と溶解剤のこの溶液は、試料リザーバ５０２ｉから注入口１０２ｉに押し込まれ（９０４ｉ）、チップ１００の試料ポート３０２ｉを通って、チップ１００とその本発明の流体チャネル形状に溶液を導入する。図全体を通して、入口、ポートおよびリザーバ／ウェルの参照数字が一貫して使用され、図１の入口１０２ｉが図３のポート３０２ｉに対応し、その両方が図５のリザーバ５０２ｉに対応するなど、一例として、入口１０２ｉｉ、ポート３０２ｉｉおよびリザーバ５０２ｉｉも対応するようになっていることに留意すべきである。

本発明の一実施形態では、チップ１００は、チップ１００を詰まらせる可能性を低減するために、試料溶液が押し込まれる（９０４ｉ）チャネル内に設計されたフィルタ３０４を有する。フィルタ３０４の後（すなわち下流）には、試料溶液からＤＮＡ／ＲＮＡを捕捉する表面を有するシリカまたはカルボン酸塩磁気ビーズの乾燥した溶液を含む、ある長さのチャネル３０６がある。試料溶液は、ビーズを試料溶液中に再水和させ、核酸物質がビーズに結合する時間を確保するために、繰り返される屈曲を通して、この長いチャネル３０６を数回通過する。本発明の一実施形態において、オンチップ磁気ビーズ抽出によってＲＮＡが濃縮され、マスターミックスの使用量が少なくて済む。磁気ビーズ抽出は、本明細書に記載されるように採用される場合には、優れた感度を示すはずである。

試料溶液は、チャネルを進むにつれて、公称チャネルよりも浅く薄い狭窄領域３０８を通過する。本発明の一実施形態において、チップ上の公称チャネルは、おおよそ深さ０．５ｍｍ、幅０．５ｍｍである。この小さい狭窄領域は、実施形態では、０．１ｍｍ×０．１ｍｍ幅である。これらの狭窄領域、すなわち「バーストバルブ」は、押し込まれる流体の流れを制限し、流体がチップ１００の望ましくない領域に入るのを避け、かつ／または流体をチップ１００の所望の領域に導くように設計されている。このチップの設計により、磁性領域３１０の端部にある出口バルブ３０２ｖｉへの流れが一般に望まれ、そのため、バーストバルブ３０８のようなバーストバルブの設計および／またはチップ１００内の位置によって流体的に促される。

試料溶液はチップ１００を通り、磁性領域３１０を通って押し出される。この流体の移動の間に、磁気ビーズはｑＰＣＲシステムに存在する磁石に抗してチャネルの壁に引き付けられる。残りの溶液は、チャネルを通って、出口バルブ３０２ｖｉ、および流体がチップ１００に戻ることができないカートリッジ４０２の大きな廃棄領域５０４に出る出口ポート５０２ｖｉから排出され続ける。この押し出し（９０４ｉ）の後、試料ポート上の膜４０４は、関連出願のセクションに示された出願の少なくとも１つに記載されたｑＰＣＲシステムの膜駆動モータによって駆動される特別に設計されたカムシャフトの動作により、戻り、これに対応して、任意に、空気圧および／または（空気に加えて、または空気の代わりに圧力を発生させるために第２の非混和性流体が使用される実施形態において）液圧により、試料溶液をそのリザーバ５０２ｉに戻す（９０４ｉｉ）。

操作において、いくつかの試料溶液が、例えば接合部３１８において意図されないバーストバルブを透過し、チップ１００の他の領域にわずかに進行することは予期されないことではない。この点において、バーストバルブは漏れやすいバルブである。しかし、この現象は、洗浄液リザーバ５０２ｉｉｉ、５０２ｉｖから入口１０２ｉｉｉ、１０２ｉｖを通って流入する後続の洗浄液（この実施形態ではエタノール）によって処理され、これらの領域にも「漏れる」。洗浄液はチップ１００内に押し込まれ（９０６ｉ）、磁気的に結合したビーズ上を流れて不純物を除去し、廃棄領域５０４に流れ込む。この実施形態において、チップ１００内に押し込まれ（９０６ｉ）、その後（再び膜駆動モータによって）引き戻される（９０６ｉｉ）洗浄液を収容する２つのリザーバ５０２ｉｉｉ、５０２ｉｖがあるが、他の実施形態においては、もっと多くても少なくてもよい。任意に、接合部３１８が磁化され、磁気ビーズを実質的に定位置に保持することにより漏出防止を補助する。

磁気的に結合したビーズが洗浄された後、溶出バッファがチップ１００内に押し込まれ、磁気ビーズの上にかけられる。この溶出バッファは、溶出リザーバ５０２ｖから入口１０２ｖを通して供給されるか、あるいは、ＰＣＲミックスへの溶出が望まれる場合には、ＰＣＲミックスリザーバ５０２ｉｉから入口１０２ｉｉを通して供給される。溶出バッファが溶出リザーバ５０２ｖから来る実施形態において、ＰＣＲリザーバ５０２ｉｉは空であり、メンブレン４０４は最初に押し下げられ（９０８ｉ）、保持される。このようにして、溶出リザーバ５０２ｖの液体は磁性領域３１０に押し込まれ、ＰＣＲリザーバ５０２ｉｉに対応する膜４０４は戻され（９０８ｉｉ）、溶出した精製された試料をチップのＰＣＲ領域３１４に引き込む。

溶出バッファがＰＣＲリザーバ５０２ｉｉから来る実施形態において、洗浄工程の後に、溶出バッファがＰＣＲリザーバ５０２ｉｉからＰＣＲ領域３１４，３１６を通って磁性領域３１０に押し込まれ（９１０ｉ）、試料を溶出し、溶出後にＰＣＲリザーバ５０２ｉｉに戻る（９１０ｉｉ）。

本発明の一実施形態において、この例示的なチップ１００の最後の機能領域は、「ボクセル」とも呼ばれる光検出領域３１２である。光検出領域３１２を分析するためのｑＰＣＲシステムの光学検出ユニット８００が、図８に代表例として示されている。光検出領域３１２は、それを取り囲むチャネルと同じ寸法とすることもできるし、蛍光信号の光学的検出を強化するために深さや幅を変化させることもできる。この実施形態においては、それを取り囲む流体チャネルよりも広くかつ深いことが示されている。これは、いくつかの実施形態においては、特定のＰＣＲ成分（プライマ、プローブおよびマスターミックス）が、溶出流体がその上を通過する際に、後で再水和するために任意に乾燥させることができる領域である。

精製された試料が磁性領域から回収され、ＰＣＲ領域３１４，３１６に引き込まれた後（９１２）、流体制御と動きは単純になる。ｑＰＣＲシステム内の加熱素子は、別々のＰＣＲ領域３１４，３１６を所望のプロトコルのために所望の温度に加熱するために所望の温度に設定（９１４）される。本発明の例示的な実施形態において、高温領域は９５℃～９８℃に任意に設定され、低温領域は５５℃～６０℃に任意に設定され、加熱素子によって特定の温度に加熱される。ほとんどのＲＮＡワークフローにおいては、ＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写を可能にする時間と温度が含まれる。その後、使用されるＰＣＲ試薬によっては、ＰＣＲ酵素に対する阻害物質を除去するために必要な高温での「ホットスタート」が必要となることがある。本発明のいくつかの実施形態において、温度はＤＮＡの最適な増幅のために定義される。他の例においては、加熱領域の可変性を有する１つの加熱素子が使用されてもよく、追加の例においては、２つ以上の加熱素子が使用されてもよい。

これらの工程は、ヒータが所望の温度に設定されている間、溶出された試料液量、または液体の「スラグ」を、いずれかの加熱領域上に所望の時間配置することを含む。これらの工程の後、加熱素子は所望のＰＣＲアニーリング／伸長および変性温度に設定され（９１４）、スラグは２つの加熱領域３１４，３１６の間で循環され（９１６）、所望の酵素活性の完了を確実にするために各セクションにおいてプログラム可能な時間だけ静止する。スラグの各循環（９１６）の結果、スラグはチップ３１２の光検出領域を通過する。この通過の間、蛍光信号は、信号のｑＰＣＲ増幅を特徴付けるために、光学検出ユニット８００によって測定（９１８）され得る。測定（９１８）が完了すると、スラグ／試料は、出口バルブ３０２ｖｉを介してチップから廃棄領域５０４に排出（９２０）される。

本発明の他の実施形態において、多数のＰＣＲチャネル（複数のチャネル）が共通のＰＣＲ加熱領域を通って並列に走る。そして、これらは全て、加熱領域の間に位置する検出領域を通過し得る。

本発明のいくつかの実施形態において、静電容量式液体検出アレイはＰＣＲ領域３１４，３１６の中および／またはその周辺に配置され、磁気ビーズと組み合わせてチップ１００の流体チャネル内の流体の追跡を可能にする。いくつかの実施形態において、静電容量式検出アレイは光検出領域３１２の両側に配置される。そうすることにより、２つの加熱領域（加熱ＰＣＲ領域３１４，３１６）間の循環の相対位置を決定することができる。さらに、静電容量式液体検出アレイは、加熱ＰＣＲ領域３１４，３１６の入口側と出口側とに配置されてもよく、したがって、増幅プロセス中を移動する試料の完全な追跡を可能にする。静電容量式アレイは、光学検出ユニット３１２とは独立して、または組み合わせて、信号または情報を検出し、膜駆動モータ並びに技術者のためのスクリーンまたは診断のような機器を制御する処理ユニット（図示せず）に送信する際に機能することができる。

図４は、本発明の例示的な実施形態によるカートリッジおよびチップ組立体４００の分解斜視図である。図４は、弾性のある膜４０４、ホイルシール４０６、リザーバを含むカートリッジ４０２、第２のホイルシール４０６、圧縮性層４０８、チップ１００および底部シール４１０（これは、本発明のいくつかの実施形態において、光学的に透明であり、光学検出ユニット８００による光検出領域３１２の走査を可能にする）を示す。本発明の例示的な実施形態において、かつ、本明細書の他の箇所に記載されるように、膜４０４は、カートリッジのリザーバと組み合わせて流体シールを形成するように機能し、記載されているように、チップ１００全体にわたって流体を移動させるための空気圧および／または液圧を作用させる。

さらに、圧縮性層４０８は、カートリッジおよびチップ組立体４００が完全に構築されると、カートリッジ４０２をチップ１００に流体密封する役割を果たすことができる。カートリッジ４０２上の流体リザーバは両端が開口しており、各リザーバの上部は、膜４０４がその中に変形して流体動作に使用される空気圧および／または液圧を引き起こすのに十分な幅を有している。各リザーバの底部には、チップ１００上の入口の穿刺構造よりわずかに大きい開口がある。開口は使用前の状態では密封されている。

図５は、本発明の例示的な実施形態による、カートリッジ４０２およびチップ１００（図示せず）を含むカートリッジおよびチップ組立体４００の上側斜視図である。本発明の実施形態において、種々のリザーバ５０２ｉ（試料リザーバ）、５０２ｉｉ（ＰＣＲリザーバ）、５０２ｉｉｉ（洗浄１リザーバ）、５０２ｉｖ（洗浄２リザーバ）、５０２ｖ（溶出リザーバ）、および廃棄領域５０４への出口ポート５０２ｖｉが示されている。

図６は、本発明の例示的な実施形態に従って、チップ１００がカートリッジ４０２内に装着されているのを見ることができる、カートリッジおよびチップ組立体４００の下側斜視図である。

図７Ａ，図７Ｂは、本発明の例示的な実施形態に従った、異なる構成のカートリッジおよびチップ組立体４００の縦断面図である。図７Ａは、ｑＰＣＲシステムに組立体４００を挿入する前の、製造後のチップ組立体４００の第１の構成を示す。本発明の実施形態において、カートリッジ４０２は、チップ１００をカートリッジ４０２に保持するための様々な一方向クリップを備える。カートリッジ４０２の下部可撓性クリップ７０２は、チップ１００のチップストッパ／位置決め構造１０４に係合し、工場でのカートリッジおよびチップ組立体４００の初期組立後、ｑＰＣＲシステムに挿入されるまで、チップ１００をカートリッジ４０２に保持する。この第１の構成では、下部保持クリップ７０２が、カートリッジ４０２の少なくとも１つの上部保持クリップ７０４に対してチップを保持する。これらの上部保持クリップ７０４は、チップ１００の入口の穿刺／鋭利な上方端部がカートリッジ４０２の底部の第２のホイルシール４０６および圧縮性層４０８を事前に穿刺する（これにより、カートリッジ４０２のリザーバとチップ１００のチャネルとの間に意図せずに流体連通を確立することになる）のを防止するために、チップ１００をカートリッジ４０２から十分に離して保持する。

本発明の実施形態において、使用者は綿棒または他の方法で試料を採取し、それをカートリッジ４０２の試料リザーバ５０２ｉに入れる。本発明の実施形態において、綿棒はカートリッジ４０２内で折れるか、少なくともカートリッジ内に試料を堆積させ、任意に、試料リザーバ５０２ｉに綿棒と係合する登録構造を設け、これにより、綿棒／試料がカートリッジ４０２内にある状態で、付属の蓋を使用して試料リザーバ５０２ｉを密封することができる。このようにして、綿棒／試料は、試料リザーバ５０２ｉ内の予め貯蔵されている湿潤試薬に浸漬される。

図７Ｂは、ｑＰＣＲシステムへの組立体４００の挿入後の組立体４００の第２の構成を示す。本発明の一実施形態において、組立体４００がｑＰＣＲシステムに挿入されると、システムハードウェア機能は、チップストッパリリース７０８を内側に押し、このリリースは、上部クリップ７０４を係合解除／揺動させて、チップ１００を第１の構成の下部位置に保持することから離す。次に、ｑＰＣＲシステムは、リリース７０８、上部クリップ７０４、および下部クリップ７０２への圧力を持続することによってチップ１００の底部を押し、チップ１００を機械的に上方に押して、図７Ｂに示す第２の構成にする。この動作の間、入口の穿刺／鋭利な上方端部は、チップ１００とカートリッジ４０２との間の圧縮性層４０８を貫通し、その後、シール構造が圧縮性層４０８に対して密封する間に、第２のホイル層４０６を穿刺する。この時点で、チップ１００はカートリッジ４０２に対して密封され、上部保持クリップ７０４にも係合する。チップストッパ構造はまた、チップ１００を第２の構成に保持するように作用するチップ１００の側面のチップストッパ／位置決め構造１０６（レリーフの構造を提供する）によっても実現される。

本発明の一実施形態において、チップ１００がカートリッジ４０２と流体的に係合すると、ピンが上部の可撓性膜４０４を押して、カートリッジリザーバに収容されている液体をチップ１００上のチャネルネットワークに移動させる。上部の保持クリップ７０４は、チップ１００をアッセイ実行時間の間中、カートリッジ４０２に係合させ、接続させ、またその後安全に廃棄する。

図８は、本発明の例示的な実施形態による、カートリッジおよびチップ組立体４００とともに使用される光学検出ユニット８００の斜視図である。膜駆動モータがピンを膜４０４に押し込むことによる力によって、試料がチップ１００を通って移動すると、流体は光検出領域３１２を横切り、光学検出ユニット８００が試料に対して分析を実行する。この種の検出は、流体の循環に合わせて光学検出ユニット８００が検出を実行し、増幅がリアルタイムで起こるため、しばしば動的検出と呼ばれる。

図１０は、入口１００２の例示的な実施形態の縦断面図であり、カートリッジのリザーバをチップのチャネルネットワークに流体的に接続する穿刺／鋭利な上方端部１００４および内孔１００６を示す。本発明のいくつかの実施形態において、入口１００２の周囲にトレイ１００８が設けられ、穿孔からの漏れを捕捉して保持し／入口とリザーバとの間の流体接続を形成する。

用語「備える」、「備えている」、「含む」、「含んでいる」、「有する」およびそれらの組合せは、「含むがこれらに限定されない」ことを意味する。

「からなる」という用語は、「～を含み、～に限定される」という意味である。
「本質的にからなる」という用語は、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいが、追加の成分、ステップおよび／または部分が、請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。

「複数」という用語は、「２つ以上」を意味する。

本明細書において、単数形の「一の」、「ある」および「その」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数形の言及を含む。例えば、用語「ある化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

本出願を通じて、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示される場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜上、簡潔にするためのものであり、本発明の範囲を柔軟性なく限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値と同様に、可能な全ての部分範囲を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記述は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までのような部分範囲、およびその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したとみなされるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。

本明細書において数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の引用数字（分数または積分）を含むことを意味する。本明細書において、第１の指示数値と第２の指示数値との「間の範囲」、および第１の指示数値「から」第２の指示数値までの「範囲」という表現は、互換的に使用され、第１および第２の指示数値、並びにその間の全ての分数および整数数字を含むことを意味する。

本明細書において「方法」という用語は、化学、薬学、生物学、生化学および医学の専門家により公知であるか、または公知の方法、手段、技術および手順から容易に開発される方法を含むが、これらに限定されない、所与の課題を達成するための方法、手段、技術および手順を指す。

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されることもあることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴も、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の他の説明された実施形態において適切なように提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明された特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とはみなされない。

本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替案、修正および変形が当業者に明らかであることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲に属する、そのような代替案、修正例および変形例を全て包含することを意図している。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用または特定は、かかる参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈してはならない。セクションの見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。

Claims (20)

1. リアルタイムｑＰＣＲシステムでにおいて使用するためのチップであって、
   試料を前記チップに受け入れるための少なくとも１つのポートと、
   該少なくとも１つのポートと流体連通する少なくとも１つのチャネルと、
   該少なくとも１つのチャネル内に配置され、前記試料が前記少なくとも１つのチャネルを通過する際に前記試料からＤＮＡ／ＲＮＡを捕捉する複数の磁気ビーズと、
   該磁気ビーズ上に先に捕捉された溶出ＤＮＡ／ＲＮＡを含む前記試料の光学的分析を行うために、前記少なくとも１つのチャネルと流体連通する光検出領域とを備えるチップ。
2. 洗浄流体および溶出流体の少なくとも一方を前記チップに受け入れるための少なくとも１つの追加のポートをさらに備える請求項１に記載のチップ。
3. 前記少なくとも１つのポートに対応しかつ流体連通し、前記チップの上面に位置する少なくとも１つの入口をさらに備える請求項１に記載のチップ。
4. 前記磁気ビーズと磁気活性となるように構成された少なくとも１つの磁気活性領域をさらに備える請求項１に記載のチップ。
5. 前記少なくとも１つの磁気活性領域が前記光検出領域の上流に配置されている請求項４に記載のチップ。
6. 少なくとも１つの加熱領域をさらに備える請求項１に記載のチップ。
7. 前記少なくとも１つの加熱領域が前記光検出領域の両側に配置されている請求項６に記載のチップ。
8. 前記少なくとも１つのチャネル内に配置された少なくとも１つのフィルタをさらに備える請求項１に記載のチップ。
9. 前記少なくとも１つのチャネルが、深さ０．５ｍｍ、幅０．５ｍｍである請求項１に記載のチップ。
10. 少なくとも１つのバーストバルブをさらに備える請求項１に記載のチップ。
11. 前記少なくとも１つのバーストバルブが、深さ０．１ｍｍ、幅０．１ｍｍである請求項１０に記載のチップ。
12. 前記チップの外面上に該外面から突出して配置された少なくとも１つのチップストッパをさらに備える請求項１に記載のチップ。
13. 前記試料を前記チップから排出するための出口バルブをさらに備える請求項１に記載のチップ。
14. カートリッジおよびチップ組立体であって、
    少なくとも１つの流体リザーバを備えるカートリッジと、
    該カートリッジの下に配置され、前記少なくとも１つの流体リザーバに対応する入口とポートとを有するチップと、
    前記カートリッジの上部に配置された弾性のある膜とを備えるカートリッジおよびチップ組立体。
15. 前記入口が前記少なくとも１つの流体リザーバと流体連通しないように、前記カートリッジの少なくとも１つの下部クリップと少なくとも１つの上部クリップとの間に前記チップが保持される第１の構成を有する請求項１４に記載のカートリッジおよびチップ組立体。
16. 前記入口が前記少なくとも１つの流体リザーバと流体連通するように、前記カートリッジの少なくとも１つの上部クリップと前記カートリッジとの間に前記チップが保持される第２の構成を有する請求項１４に記載のカートリッジおよびチップ組立体。
17. 前記カートリッジおよび前記チップ組立体を、第１の構成から第２の構成に移行させるために前記カートリッジ上に配置された少なくとも１つのリリースをさらに備える請求項１４に記載のカートリッジおよびチップ組立体。
18. 前記カートリッジの廃棄領域と流体連通する出口バルブおよび前記チップの出口をさらに備える請求項１４に記載のカートリッジおよびチップ組立体。
19. 少なくとも１つのホイルシール、圧縮性層、および光学的に透明なシールのうちの少なくとも１つをさらに備える請求項１４に記載のカートリッジおよびチップ組立体。
20. カートリッジおよびチップ組立体の使用方法であって、
    前記カートリッジおよび前記チップ組立体の前記カートリッジの試料リザーバに試料を採取して挿入することと、
    前記試料を前記試料リザーバから前記カートリッジおよび前記チップ組立体のチップに、該チップの入口およびポートから押し込むことと、
    前記試料を磁気ビーズと混合し、該磁気ビーズを前記チップ内に捕捉することと、
    前記試料を前記チップから前記試料リザーバに戻すことと、
    前記カートリッジ内の少なくとも１つの洗浄流体リザーバから少なくとも１つの洗浄流体を押し出すことと、
    該少なくとも１つの洗浄流体を前記チップから前記少なくとも１つの洗浄流体リザーバに戻すことと、
    溶出バッファを
    弾性のある膜を押圧することによって前記カートリッジの溶出リザーバから、または、
    前記カートリッジのＰＣＲリザーバから、
    前記チップ内に押し込むことと、
    前記溶出バッファを、
    前記弾性部材を戻すか、または、
    前記溶出バッファを前記ＰＣＲリザーバ内に引き込み、精製された試料を作成することによって、戻すことと、
    前記精製された試料を回収し、該精製された試料を前記チップの少なくとも１つの加熱領域に引き込むことと、
    前記少なくとも１つの加熱領域の温度を設定することと、
    前記精製された試料を前記チップの光検出領域を通して循環させることと、
    前記光検出領域において、前記精製された試料から取り出された信号を測定することとを含む方法。
    

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