JP2024521364A - 組換えワクシニアウイルスにより免疫応答を誘導するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

対象において抗原への免疫応答を誘導するための方法が開示される。本方法は、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３のコード配列が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１のコード配列で置き換えられた、組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、組換えワクシニアウイルスが、抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含む。

Description

本出願は、２０２１年６月６日に出願された米国特許出願第６３／２０２，２９５号の優先権を主張するものである。前述の出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第ＡＩ０６７３９１号および同ＡＩ１１７１０５号の下に政府支援によりなされたものである。政府は、本発明に対して権原を有する。

分野
本出願は、全体として医学的処置の分野に、特に、免疫応答を誘導するための組換えワクシニアウイルスの使用に関する。

ウイルス糖タンパク質は、ウイルスの最も外側のエンベロープの主成分であり、ウイルスのライフサイクルの非常に重要な面に活発に関与している。ウイルスとその宿主の間の相互作用は、多くの場合、ウイルス糖タンパク質と宿主細胞受容体との間の相互作用によって決定され、したがって、ウイルスのエンベロープに見いだされる糖タンパク質の欠失／突然変異によって、宿主細胞侵入、宿主範囲、および病原体の認識が影響を受けることが多い。したがって、ウイルス糖タンパク質は中和抗体の主たる標的である。次いで、要因のこのような組み合わせによってウイルスの病原性が影響を受ける。

オルソポックスウイルス属のプロトタイプのメンバーであるワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）は、その複製サイクルの過程で形態学的および抗原的に異なる２つの感染型ビリオン：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）および細胞外ビリオン（ＥＶ）を産生する。ＩＭＶ産生の後、サブセットがトランスゴルジ網へと細胞内輸送され、そこで、さらなる２つの膜が付加されて細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）を産生する。ＩＥＶは、細胞表面に輸送される一過性の形態であり、細胞表面で、細胞膜との融合によってウイルスのＥＶ形態が放出されるが、このことは、細胞間拡散および遠達伝播にとって極めて重要である。ＩＭＶには見いだされずＥＶ中に見いだされる４種のタンパク質（Ａ３３、Ａ３４、Ｂ５およびＦ１３）は、オルソポックスウイルス属のメンバー間で高度に保存されている。これら４種のタンパク質のうちのいずれか１つの欠失により小プラーク表現型がもたらされるが、このことは、感染性ＥＶの効率的産生へのそれらの極めて重要な役割を表す。これら４種のうち、Ｆ１３の欠失が、ＥＶ産生と感染性の双方における欠陥が理由で、ＥＶ産生に対して最も多大な影響を及ぼす。

ＶＡＣＶは、天然痘に対する防御免疫をもたらした、史上最大かつ最も成功したワクチン接種プログラムの重要なコンポーネントであったが、また、多くのウイルスワクチンベクター、腫瘍溶解性ベクターおよび遺伝子治療ベクターへのベースとして広範に使用されてもいる。しかし、患者においてＶＡＣＶの使用によって起こる多数の合併症があり、それらの大部分が、投与の当初の部位からのウイルスの制御できない複製および拡散に起因する。したがって、ワクチンベクターとしてのその免疫原性を維持するが、病原性、感染性および副作用が低減した、より安全な、組換えまたは改変されたＶＡＣＶが求められている。

本出願の一態様は、対象において抗原への免疫応答を誘導するための方法に関する。本方法は、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３（ｐ３７、３７－ｋＤａタンパク質、ＶＡＣＷＲ０５２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３７０７５０９としても知られる）が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた、組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、組換えワクシニアウイルスが、抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含む。

一部の実施形態では、抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態では、ウイルス抗原はＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２由来の抗原である。一部の実施形態では、抗原は細菌抗原である。一部の実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。

一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスは、経皮、皮下、または筋肉内で投与される。

本出願の別の態様は、対象において標的への防御免疫応答を誘導するための方法に関する。本方法は、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、組換えワクシニアウイルスが、標的由来の免疫原をコードする核酸を含む。

一部の実施形態では、標的は、ウイルス、細菌および寄生虫などの微生物である。一部の実施形態では、標的はＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である。一部の実施形態では、標的は腫瘍細胞などの細胞である。

本出願の別の態様は、（ａ）細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルス；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、経皮接種、皮下注射または筋肉内注射用に製剤化される、医薬組成物に関する。

一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスは、抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含み、標的細胞の感染時に抗原のエピトープを発現することができる。一部の実施形態では、抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原である。

一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスはエンベロープウイルスであり、ウイルスエンベロープは、ＭＣ０２１に加えて、さらなる外来性糖タンパク質またはその一部を含み、さらなる外来性糖タンパク質は、異なるウイルス由来のウイルスタンパク質である。一部の実施形態では、さらなる外来性糖タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のウイルスタンパク質である。

次に本開示について詳細に説明し、本開示が例示的な実施形態に関連して説明されるが、本開示は図および添付の特許請求の範囲に例示される特定の実施形態によって限定されるものではない。

本出願の組換えワクシニアウイルスゲノムの一実施形態の概略図である。 ＥＶ膜の糖タンパク質含量を示す図である。（パネルＡ）ＲＫ１３細胞に、ＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させた。２４ｈｐｉで、細胞外ビリオンをＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製した。勾配からの画分を勾配の底から滴下して収集し、ＯＤ２６０によって解析し、ＣｓＣｌの濃度を屈折率測定法によって決定した。（パネルＢ）ＥＶを含有する画分を収集し（左）、感染細胞を採取し（右）、以下を用いたウェスタンブロットによって解析した：ウサギ抗ＨＡ抗血清とそれに続くＨＲＰコンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体、ラット抗Ｂ５ ＭＡｂとそれに続くＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗ラット抗体、ウサギ抗Ａ３３抗血清とそれに続くＨＲＰコンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体、ウサギ抗Ｌ１抗血清とそれに続くＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体、およびマウス抗アクチンＭＡｂとそれに続くＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗マウス抗体。キロダルトン表示の質量およびマーカータンパク質の位置を、ＥＶライセートブロットの右側および細胞ライセートブロットの左側に示す。 フローバイロメトリー向けのゲーティング戦略を示す図である。ＲＫ１３細胞にＭＯＩ ５でｖＦ１３Ｌ－ＨＡを２４時間感染させた。細胞外ビリオンをスクロースクッションを通して遠心分離し、固定し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度によるフローサイトメトリーによって解析した。続いて、ビリオンを表すｍＣｈｅｒｒｙ＋集団を糖タンパク質の取り込みについて解析した。ＦＳＣスケールの上端にあるイベント（前方散乱）は除外した。 フローバイロメトリーによって解析されたＥＶ糖タンパク質含量を示す図である。（パネルＡ）ＲＫ１３細胞に、ＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させ、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＥＶをスクロースクッションを通して遠心分離し、固定し、以下を用いて染色した：ウサギ抗ＨＡ抗血清とそれに続くＣｙ２コンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体、ラット抗Ｂ５ ＭＡｂとそれに続くＤｙｌｉｇｈｔ ４０５コンジュゲートされたロバ抗ラット抗体、およびウサギ抗Ａ３３抗血清とそれに続くＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体。ＥＶ膜におけるＦ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ（左）、Ｂ５（中央）、およびＡ３３（右）の取り込みについて代表的な箱ひげ図を示す。^****、ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡを受けたターキーの多重比較検定による。（パネルＢ）ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ（列；左）、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ（列；中央）、およびｖΔＦ１３Ｌ（列右）から産生されたＥＶの、ウイルス表面上でのＢ５およびＦ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ（段；上）、Ａ３３およびＦ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ（段；中）、ならびにＡ３３およびＢ５（段；下）の取り込みに関する代表的なドットブロット。すべてのＲ２値が有意であった（^****、ｐ＜０．００１）。 蛍光活性化ビリオン選別スキームを示す図である。ＲＫ１３細胞に、ＭＯＩ ５でｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰを２４時間感染させた。細胞外ビリオンをスクロースクッションを通して遠心分離し、蛍光活性化ビリオン選別によって解析した。ビリオンを、図３におけるように、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度に対してまずゲーティングし、ｍＣｈｅｒｒｙ＋イベントを、その後に、ＧＦＰ蛍光強度（Ｂ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MED、およびＢ５ＧＦＰ^LOW）に基づいて選別した。Ｙ軸は、より容易な視覚化のために、選別されたイベントの数（ｎ）に対して正規化されたカウントであり、ｎは各集団について表示されている。 Ｂ５－ＧＦＰ組換えウイルスプラーク表現型およびフローバイロメトリーを示す図である。（パネルＡ）ＢＳＣ－４０細胞の単層に表示のウイルスを感染させ、３７℃で一晩インキュベートした。２時間後、接種材料を除去し、細胞を半固体培地でオーバーレイした。３日後、細胞単層を蛍光顕微鏡により画像化し、次いでクリスタルバイオレットで染色し画像化した。（パネルＢ）ＲＫ１３細胞に、ＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させ、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞外ビリオンをスクロースクッションを通して遠心分離し、固定し、以下を用いて染色した：ウサギ抗ＨＡ抗血清とそれに続くＣｙ５コンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体、ラット抗Ｂ５ ＭＡｂとそれに続くＤｙｌｉｇｈｔ ４０５コンジュゲートされたロバ抗ラット抗体、およびウサギ抗Ａ３３抗血清とそれに続くＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０コンジュゲートされたヤギ抗ウサギ抗体。ＥＶ膜におけるＦ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ（左）、Ｂ５（左中）、Ａ３３（右中）、およびＢ５－ＧＦＰ（右）の取り込みについて代表的な箱ひげ図を示す。^****、ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡを受けたターキーの多重比較検定による。 蛍光活性化ビリオン選別および感染性アッセイを示す図である。ＲＫ１３細胞に、ＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させ、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＥＶをスクロースクッションを通して遠心分離し、蛍光活性化ビリオン選別によって解析した。ビリオンをＧＦＰ蛍光強度に基づいて３つのプール（Ｂ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MED、およびＢ５ＧＦＰ^LOW）に選別し、（パネルＡ）総ゲノムコピーおよび（パネルＢ）細胞結合についてｑＰＣＲによって解析した。（パネルＣ）比感染性を、総ゲノムコピー（ｑＰＣＲによる）とプラーク形成単位（プラークアッセイによる）を比較することによって算出した。^**、ｐ＜０．０１および^****、ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡを受けたターキーの多重比較検定による。 病原性および免疫を示す図である。（パネルＡ～Ｆ）野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに片耳の耳介に表示のウイルス１０，０００ｐｆｕを感染させ、組織病状を可視化（パネルＡ～Ｃ）させ、組織の腫脹（パネルＤ）、感染部位にての病変の発達（パネルＥ）および感染部位にての組織喪失（パネルＦ）を測定した。グラフに２つの実験からプールされたデータを示した（ｎ＝１０）。（パネルＧ）ＳＴＡＴ１－／－マウス（ｎ≧３）に各耳介に表示のウイルス１０，０００ｐｆｕを皮内感染させ、生存を感染後２８日間モニタリングした。グラフは、２つの実験からプールされたデータを表す（ｎ＝７～１０）。（パネルＨ）野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを片耳の耳介に表示のウイルス１０，０００ｐｆｕで免疫し、３８日後に血清を採取し、ＶＡＣＶ－ＧＦＰによる感染を阻害する血清希釈の能力をフローサイトメトリーによりアッセイした。（パネルＩ）野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを片耳の耳介で表示のウイルス１０，０００ｐｆｕで免疫し、主要抗原決定基Ｂ８、Ａ８、Ａ３、Ｋ３、Ａ４７およびＡ４２への脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を従来の細胞内サイトカイン分泌アッセイによりアッセイした。（パネルＪ）野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスを片耳の耳介で表示のウイルス１０，０００ｐｆｕで免疫し、次いで３５日後に毒性マウス病原体ＥＣＴＶ ３０００ｐｆｕを用いる足蹠感染により曝露した。マウスの生存を組み合わせた２つの実験から示す（ｎ＝１０）。

添付の構造および図に例を例示しながら、本出願のある特定の態様および例示的な実施形態を詳細に参照する。本出願の態様は方法、材料および例を含めて例示的な実施形態と組み合わされて説明され、このような説明は非限定的なものであり、本出願の範囲は、一般的に知られた、または、本明細書に組み込まれたあらゆる均等物、代替物および改変物を包含することを意図したものである。別段の定義がされない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は本出願が属する技術分野の当業者であれば通常に理解される意味と同じ意味を有する。当業者であれば、本出願の態様および実施形態の実施において使用され得る、本明細書に記載のものと同様のまたは均等な多くの技術および材料を理解するであろう。本出願の記載された態様および実施形態は記載された方法および材料に限定されるものではない。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、内容が明確に別様に示していない限り、複数の指示対象を包含する。

範囲については、「約（ａｂｏｕｔ）」特定のある数値から、および／または、「約」特定の別の数値までとして本明細書に表現される場合がある。このような範囲が表現されている場合、別の実施形態には当該の特定のある数値から、および／または、当該の特定の他の数値までが含まれる。同様に、数値が「約」という先行詞の使用により近似として表現されている場合、特定の数値は別の実施形態を形成することが理解される。さらに、各範囲の終点は、他方の終点と関連する、および他方の終点から独立しているという双方で、有意であることも理解される。本明細書に開示された数値がいくつかあること、および、各数値はその数値自体に加えて、「約」当該の特定の数値としても本明細書に開示されていることがさらに理解される。例えば、数値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。ある数値が「その数値以下」、「その数値以上」として開示されている場合、当業者によって適当に理解されるように、数値同士の間の可能な範囲も開示されていることも理解される。例えば、数値「１０」が開示されている場合、「１０以下」および「１０以上」も開示されている。

Ｉ．定義
本明細書で使用される「ワクシニアウイルス」という用語は、ポックスウイルスファミリーに属する大きく、複雑な、エンベロープウイルスを指す。ワクシニアウイルスは、およそ２００のタンパク質をコードする、長さおよそ１９０ｋｂｐの線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ワクシニアウイルス株には、それらに限定されないが、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ （ＷＲ）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｙｅｔｈ、ＩＨＤ－Ｊ、およびＩＨＤ－Ｗ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ａｎｋａｒａ、ＭＶＡ、Ｄａｉｒｅｎ Ｉ、ＬＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６ＭＯ、ＬＩＶＰ、ＷＲ ６５－１６、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈワクシニアウイルス株の株、これらに由来する株またはこれらの改変型の株が含まれる。

「組換えワクシニアウイルス」とは、１つまたは複数の異種ヌクレオチドを含有するワクシニアウイルスを指し、これは、ウイルス感染細胞において、異種ヌクレオチドを複製するか、または前記ヌクレオチド、ペプチド、異種ペプチド、もしくは異種ヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現する。組換えウイルスは、ウイルスの自然状態では見いだされない遺伝子または遺伝子断片をセンス形態またはアンチセンス形態で発現することができる。加えて、組換えウイルスは、自然状態のウイルスに見いだされる遺伝子を発現することができる。しかし、上記遺伝子は、人為的手段によってウイルスの遺伝子へと再導入されたかまたはレスキューされた改変遺伝子である。

本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、抗原またはワクチンなどの刺激への、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは多形核球（ＰＭＮ）などの免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答には、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含めて、宿主防御応答に関与する身体の任意の細胞が含まれ得る。免疫応答には、それらに限定されないが、自然免疫応答および／または適応免疫応答が含まれる。免疫応答を測定する方法は当技術分野で周知であり、それには、例えば、リンパ球（例えばＢ細胞もしくはＴ細胞）の増殖および／または活性を測定すること、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定することが含まれる。

「防御免疫応答」および「防御免疫」という用語は、宿主にとってたいていは外来性の１つまたは複数の抗原の存在によって特徴付けられる、感染から（例えば、感染を防止するかまたは感染に伴う疾患の発生を防止する）または疾患状態から対象における防御を、対象の免疫系が容易にすることができるような、免疫応答または免疫の状態を指す。

「抗原」という用語は、免疫応答を誘発しかつ抗原に対する特異的抗体（液性応答）または細胞傷害性Ｔリンパ球（細胞性応答）を生成させることができる、物質または分子を指す。したがって、抗原または免疫原は、抗体またはリンパ球などの免疫系のコンポーネントによって認識することができる。抗原は、単一のエピトープ程度に小さい場合もあれば、またはより大きい場合もあり、かつ複数のエピトープを含む場合もある。したがって、抗原のサイズは、約５～１２個のアミノ酸（例えば、ペプチド）程度に小さい場合もあり、多量体および融合タンパク質、キメラタンパク質、またはアゴニストのタンパク質もしくはペプチドを含めて、部分タンパク質、完全長タンパク質程度に大きい場合もある。加えて、抗原は炭水化物を含む場合がある。抗原または免疫原は、微生物（または病原体）由来の抗原、ネオ抗原、腫瘍細胞抗原または自己抗原であってもよい。微生物由来の（または病原体由来の）抗原／免疫原は、細菌、ウイルス、原虫または真菌由来とすることができる。

「免疫原」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲもしくは抗体）などの免疫学的受容体によって認識される能力を有する分子を指す。免疫原は、少なくとも１つのエピトープ、例えば、Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを提示するのであれば、天然であっても非天然であってもよい。

「免疫原性」という用語は、抗原または免疫原のエピトープの存在によって起こされる反応を指す。「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発するのに十分である抗原決定基を指す。これらは、特定の免疫応答を誘発するように、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、連続性のアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングにより並置された非連続性のアミノ酸の両方から形成され得る。当業者であれば、Ｔ細胞エピトープはサイズおよび組成においてＢ細胞エピトープとは異なること、ならびにクラスＩ ＭＨＣ経路を通して提示されるエピトープは、クラスＩＩ ＭＨＣ経路を通して提示されるエピトープとは異なることを理解するであろう。

「腫瘍抗原」、「腫瘍特異的抗原」およびそれの「腫瘍関連抗原」という用語は、前腫瘍性状態、過形成状態、または腫瘍性状態に関連する抗原を参照して使用される。このような抗原は、がんと関連している場合もあり、がんの原因物質である場合もある。

「ネオ抗原」という用語は、本明細書では、例えば、腫瘍細胞における突然変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、ある抗原を対応する野生型の親抗原と明確に区別させている少なくとも１つの改変を有する当該抗原を参照して使用される。上記改変は、フレームシフト、非フレームシフトインデル（例えば、小さな挿入もしくは欠失（例えばヌクレオチドの））または置換多型（インデル）、ミスセンスまたはナンセンス置換、スプライス部位の改変、ゲノム再構成または遺伝子融合、スプライスバリアント、異常なリン酸化またはグリコシル化などの対象のＤＮＡにおける突然変異の結果とすることができる。ある特定の実施形態では、ネオ抗原は腫瘍抗原である。

腫瘍抗原には、それらに限定されないが、任意の腫瘍またはがん由来の抗原が含まれるが、腫瘍またはがんには、それらに限定されないが、黒色腫、扁平上皮癌、乳がん、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、脈管肉腫、血管肉腫、肥満細胞腫瘍、白血病、リンパ腫、原発性肝がん、肺がん、膵臓がん、消化器がん（結腸直腸がんを含む）、腎臓細胞癌、造血器腫瘍およびそれらの転移性がんが含まれる。

「ワクチン」という用語は、ワクチンのレシピエントまたは宿主において免疫応答を誘導する組成物を指す。ワクチンは、レシピエントにおいて、１つもしくは複数の抗原への液性（例えば、中和抗体）応答、１つもしくは複数の抗原に対する細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））の応答、または両方を誘導し、その結果、例えば、現在のもしくは続発性の微生物感染または例えば１つまたは複数のネオ抗原またはがん抗原の存在によって特徴付けられる疾患状態に対する部分的または完全な防御を、レシピエントにおいてもたらすことができる。ワクチンの例としては、それらに限定されないが、弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン（タンパク質またはペプチド）、糖ベースのワクチン（コンジュゲート型または天然）、細菌ベクターワクチンおよびウイルスベクターワクチンが挙げられる。

「ワクチン接種」という用語は、個体の免疫系を刺激して、病原体または非天然抗原を含有する宿主細胞への適応免疫を宿主において発達させる抗原物質の投与を指す。ワクチン接種により、微生物感染またはがんなどの疾患に関連する抗原特異的細胞もしくはエピトープ特異的細胞に伴う１つもしくは複数の症状を防止もしくは改善することができる：および／または前述の疾患状態に伴う１つもしくは複数の症状の重症度もしくは頻度を減ずることができる。

「免疫する」という用語は、ワクチン接種などによって対象が感染症または疾患状態から防御されることをもたらすことに参照して使用される。

「防御」、「免疫防御」および「防御応答」という用語は、宿主に、続発性感染、活動性感染またはある特定の疾患状態への部分的または完全な耐性をもたらして、同義に使用される。ワクチン接種された宿主内で生成される中和抗体により、この防御がもたらされ得る。他の状況では、ＣＴＬ応答によりこの防御がもたらされ得る。状況によっては、中和抗体と細胞性免疫（例えばＣＴＬ）応答の両方によりこの防御がもたらされる。

「アジュバント」という用語は、本出願のワクチン組成物と同時に投与された場合、ワクチン組成物への免疫応答を加速、延長、増強および／またはブーストする作用剤を指す。アジュバントは、例えばリンパ球の動員、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞の刺激、樹状細胞の刺激ならびに／またはマクロファージの刺激をはじめとするいくつかの機構によって免疫応答を増強することができる。

「制御配列」または「調節配列」という用語は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指すＤＮＡ配列を指すが、これらはコード配列の複製、転写および翻訳をレシピエント細胞において集合的にもたらす。選択されたコード配列が適当な宿主細胞において複製、転写および翻訳されることが可能である限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。制御／調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるもの、および、ある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を方向付けるもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。

ある核酸配列が別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、前者の核酸配列は後者の核酸配列に「作動可能に連結されて」いる。一般に、「作動可能に連結されて」とは、連結されているＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が連続性であること、分泌リーダーの場合は連続性でありかつリーディング相内にあることを意味する。さらに、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合にはコード配列に作動可能に連結されていると言われ、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。しかし、エンハンサーは連続性である必要はない。発現ベクターは、イントロンまたはキメライントロンをさらに含むことができる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、その最も広い文脈において捉えるべきであり、正確な転写開始のためのＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントをはじめとする、ゲノム遺伝子由来の転写調節エレメント（ＴＲＥ）またはそれ由来のキメラＴＲＥを含むが、発生刺激および／または外部刺激、ならびにトランス活性化調節タンパク質または核酸に応答して、それへと作動可能に連結された遺伝子の活性化または抑制を調節するさらなるＴＲＥ（すなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサー）を伴うまたは伴わない場合がある。プロモーターは、構成的に活性である場合もあれば、１種以上の組織タイプまたは細胞タイプにおいて発生段階で調節される様式で活性である場合もある。プロモーターはゲノム断片を含有する場合もあれば、組み合わされた１つまたは複数のＴＲＥのキメラを含有する場合もある。

「それを必要とする患者に」、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」という語句には、微生物に対するワクチン接種のための本開示の核酸およびタンパク質免疫原の投与から恩恵を受けると思われる、哺乳動物対象などの対象が含まれる。

「治療有効量」、「薬理学的有効量」および「生理学的有効量」という用語は、免疫防御の閾値レベルをもたらすのに必要とされるワクチン組成物の量を意味して、同義に使用される。精密な量は、例えば、利用される特定の免疫源、組成物の成分および物理特性、意図される患者集団、患者の検討事項などの数多くの要因に左右されることになるが、本明細書で提供される情報またはそうでなければ関連文献で入手可能な情報に基づいて、当業者であれば容易に決定することができる。

「改善する」、「向上させる」または「減少させる」という用語は、本文脈で使用される場合、本明細書に記載される処置の開始前の同一個体の測定値、または本明細書に記載される処置がない場合でのある対照個体（または複数の対照個体）の測定値などの、ベースライン測定値と比較した数値またはパラメータを指す。

ＩＩ．免疫応答を誘導するための方法
本出願の一態様は、対象において標的抗原への免疫応答を誘導するための方法に関する。本方法は、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、組換えワクシニアウイルスが、標的抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含む。Ｆ１３およびＭＣ０２１の完全なアミノ酸配列を下に列記する：
ワクシニアウイルスＦ１３：
MWPFASVPAGAKCRLVETLPENMDFRSDHLTTFECFNEIITLAKKYIYIASFCCNPLSTTRGALIFDKLKEASEKGIKIIVLLDERGKRNLGELQSHCPDINFITVNIDKKNNVGLLLGCFWVSDDERCYVGNASFTGGSIHTIKTLGVYSDYPPLATDLRRRFDTFKAFNSAKNSWLNLCSAACCLPVSTAYHIKNPIGGVFFTDSPEHLLGYSRDLDTDVVIDKLRSAKTSIDIEHLAIVPTTRVDGNSYYWPDIYNSIIEAAINRGVKIRLLVGNWDKNDVYSMATARSLDALCVQNDLSVKVFTIQNNTKLLIVDDEYVHITSANFDGTHYQNHGFVSFNSIDKQLVSEAKKIFERDWVSSHSKSLKI（配列番号１）
ＭＣ０２１：
MGNLTSARPAGCKIVETLPATLPLALPTGSMLTYDCFDTLISQTQRELCIASYCCNLRSTPEGGHVLLRLLELARADVRVTIIVDEQSRDADATQLAGVPNLRYLKLDVGELPGGKPGSLLSSFWVSDKRRFYLGSASLTGGSISTIKSLGVYSECEPLARDLRRRFRDYERLCARRCVRCLSLSTRFHLRRHCENAFFSDAPESLIGSTRTFDADAVLAHVQAARSTIDMELLSLVPLVRDEDSVQYWPRMHDALVRAALERNVRVRLLVGLWHRSDVFSLAAVKGLHELGVGHADISVRVFAIPGAKGDAVNNTKLLVVDDEYVHVTSADMDGTHYARHAFVSFNCAERAFARALGALFERDWQSSFSSPLPRAPPPEPATLLPVN（配列番号２）

一部の実施形態では、標的抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態では、標的抗原は細菌抗原である。一部の実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原である。

本出願の別の態様は、対象において標的微生物または標的細胞への防御免疫応答を誘導するための方法である。本方法は、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３がＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、組換えワクシニアウイルスは標的由来の免疫原または抗原をコードする核酸を含む。

一部の実施形態では、標的微生物はウイルスである。一部の実施形態では、標的微生物は細菌である。一部の実施形態では、標的微生物は寄生虫である。一部の実施形態では、標的微生物は真菌である。一部の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。

免疫応答の標的
標的抗原、標的微生物または標的細胞は、任意の抗原、微生物または細胞とすることができ、この場合、抗原、微生物または細胞に対する免疫応答が望まれるかまたは必要とされる。一部の実施形態では、標的抗原は、標的微生物または標的細胞に由来する。一部の実施形態では、標的抗原は、標的微生物または標的細胞の表面タンパク質内の領域であるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、対象において免疫応答または防御免疫応答を誘導するための、当業者であれば既知のエピトープを含む。

一部の実施形態では、本出願の方法は、標的ウイルスに対するワクチン接種のために使用される。標的ウイルスはＲＮＡウイルスである。ワクチン接種に向けた例示的なＲＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ）；ブニヤウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）；フィロウイルス（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）；フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ＧＢウイルスＣ）；エンテロウイルス（Ａ型～Ｌ型、コクサッキーウイルス（Ａ型～Ｃ型）、エコーウイルス、ライノウイルス（Ａ型～Ｃ型）、ポリオウイルスを含めて）；オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ａ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２を含めて）；パラミクソウイルス（例えば、ルブラウイルス（おたふく風邪）、ルベオラウイルス（麻疹）、呼吸器合胞体ウイルス、ニューカッスル病、パラインフルエンザ）；パルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９ウイルス）；ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）；アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡膜炎ウイルスおよびいくつかのラッサ熱ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、ルホウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルスを含めて）；アルファウイルス（例えば、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、東部馬脳炎ウイルス、西部馬脳炎ウイルス）；Ａ型肝炎ウイルス；Ｄ型肝炎ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ならびに、それらの任意の型、亜型、クレードまたはサブクレード。

一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ科のコロナウイルス（ＣｏＶ）である。遺伝的に多様なＯｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ科は、４つの属（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタコロナウイルス）に分けられる。４つの属は、サブグループ１ａアルファコロナウイルス、サブグループ１ｂアルファコロナウイルス、サブグループ２ａベータコロナウイルス、サブグループ２ｂベータコロナウイルス、サブグループ２ｃベータコロナウイルスおよびサブグループ２ｄベータコロナウイルスに、さらに分けられる。

ヒトＣｏＶはアルファおよびベータサブグループに限定される。ワクチン接種に向けた例示的ヒトＣｏＶとしては、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１が挙げられる。

一部の実施形態では、ワクチン接種に向けたＲＮＡウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスなどの呼吸器ウイルスである。インフルエンザＡウイルスは、ウイルスの表面上の２種のタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて亜型に分けられる。既知の１８のＨＡ亜型および既知の１１のＮＡ亜型がある。ＨＡタンパク質とＮＡタンパク質のさまざまな多数の組み合わせが可能である。例えば、「Ｈ７Ｎ２ウイルス」とは、ＨＡ７タンパク質およびＮＡ２タンパク質を有するインフルエンザＡウイルスの亜型を指す。同様に、「Ｈ５Ｎ１」ウイルスはＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質を有する。Ａ型インフルエンザウイルスを、本開示の方法および組成物によるワクチン接種に向けて標的化することができ、本開示の方法および組成物を使用して、さまざまな亜型、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、およびＨ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ６、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、およびＨ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９、Ｈ１７Ｎ１０、Ｈ１８Ｎ１１ならびにそれらの組み合わせを標的とすることができる。

一部の実施形態では、ワクチン接種に向けたウイルスはＤＮＡウイルスである。ワクチン接種に向けた例示的なＤＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＣＭＶ－１、ＨＨＶ－６、ＨＨＶ－７、ＨＨＶ－８）、パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１、２、４、６、１１、１６、１８、２６、３０、３１、３３、３４、３５、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６４、６７、６８、６９、７０の各型）；ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス）、ヘパドナビウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス）；アネロウイルス（例えば、輸血感染ウイルスまたはトルクテノウイルス（ＴＴＶ））；ならびに、それらの任意の型、亜型、クレードまたはサブクレード。

一部の実施形態では、本出願の方法は、腫瘍抗原または腫瘍細胞に対する免疫応答を導入するために使用される。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」、「腫瘍特異的抗原」およびそれの「腫瘍関連抗原」という用語は、前腫瘍性状態、過形成状態、または腫瘍性状態に関連する抗原を参照して使用される。このような抗原は、がんと関連している場合もあり、がんの原因物質である場合もある。「ネオ抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞における突然変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、ある抗原を対応する野生型の親抗原と明確に区別させている少なくとも１つの改変を有する当該抗原を指す。上記改変は、フレームシフト、非フレームシフトインデル（例えば、小さな挿入もしくは欠失（例えばヌクレオチドの））または置換多型（インデル）、ミスセンスまたはナンセンス置換、スプライス部位の改変、ゲノム再構成または遺伝子融合、スプライスバリアント、異常なリン酸化またはグリコシル化などの対象のＤＮＡにおける突然変異の結果とすることができる。ある特定の実施形態では、ネオ抗原は腫瘍抗原である。

腫瘍抗原には、それらに限定されないが、任意の腫瘍またはがん由来の抗原が含まれ、腫瘍またはがんには、それらに限定されないが、黒色腫、扁平上皮癌、乳がん、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳がん、脈管肉腫、血管肉腫、肥満細胞腫瘍、白血病、リンパ腫、原発性肝がん、肺がん、膵臓がん、消化器がん（結腸直腸がんを含む）、腎臓細胞癌、造血器腫瘍および転移性がんが含まれる。

組換えワクシニアウイルス
本出願の組換えワクシニアウイルスは、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３のコード配列がＦ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１のコード配列で置き換えられたワクシニアウイルスである。このような組換えワクシニアウイルスを調製するための方法は、当技術分野で周知である。このような組換えワクシニアウイルスを生成するための例示的な手順を実施例１に記載する。組換えワクシニアウイルスは任意のワクシニアウイルス株から生成することができる。一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスは、ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＡＣＡＭ ２０００、ＡＣＡＭ ３０００、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（ＩＨＤ）ワクシニア株、ワクシニアＬｉｓｔｅｒ、欠損性ワクシニアＬｉｓｔｅｒ、ワクシニアＷｙｅｔｈ、ワクシニアＡｎｋａｒａ、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、ＭＶＡ－５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）、ＭＶＡ－ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８）およびＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈワクシニア株からなる群に由来する。図１は、組換えワクシニアウイルスゲノムの図的表現である。除去され、伝染性軟属腫ウイルス由来のＭＣ０２１Ｌ遺伝子と置き換えられた、Ｆ１３Ｌとしても知られるＶＡＣＷＲ０５２のおおよその位置を示す。

一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスは、標的微生物もしくは標的細胞由来の抗原／免疫原、抗原／免疫原の断片、および／または抗原／免疫原のエピトープをコードするヌクレオチド配列を含む。コード配列は、コードされた抗原／免疫原および／またはその断片／エピトープの発現を制御する調節エレメントに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、調節エレメントはポックスウイルスプロモーターである。典型的には、コード配列および調節エレメントは、任意の遺伝子間領域などの目立たない領域に挿入される。代替的に、コード配列によって、ウイルスの複製および形態形成に必須ではない遺伝子を置き換えることもできる。例としては、それらに限定されないが、チミジンキナーゼ、血球凝集素、ワクシニアウイルス増殖因子、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット遺伝子（それぞれ、Ｊ２Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｃ１１Ｒ、Ｆ４ＬおよびＩ４Ｌ）が挙げられる。こういったキメラ遺伝子を、次いで、強力なポックスウイルスプロモーターの下に配置させ、目立たない領域のゲノムに挿入することが可能である。

一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、放出されたワクシニアウイルスのエンベロープ上で標的糖タンパク質抗原を発現するように構成され、その結果、組換えワクシニアウイルスの接種後に宿主において標的糖タンパク質抗原に対する免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、外来性糖タンパク質（例えば、他のウイルス由来の糖タンパク質）が、外来性糖タンパク質の細胞外ドメインのコード配列をＡ３３およびＡ３４（ＩＩ型糖タンパク質の場合）またはＢ５（Ｉ型糖タンパク質の場合）のいずれかの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインのコード配列に融合させることによって、組換えワクシニアウイルスのエンベロープに向けられる。こういったキメラ遺伝子を、次いで、強力なポックスウイルス後期プロモーターの下に配置させ、目立たない領域のゲノムに挿入することが可能である。標的糖タンパク質抗原の例としては、それらに限定されないが、インフルエンザ（ＡおよびＢ）ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、コロナウイルススパイクタンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１２０、フラビウイルス（ジカウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス）Ｅタンパク質、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ１、ＨＨＶ２、ＨＨＶ３、ＨＨＶ４、ＨＨＶ５、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７およびＨＨＶ８）および糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ｇＨｇＬが挙げられる。

投薬量および投与経路
本出願の組換えワクシニアウイルスは、組換えウイルスが投与後に所望の免疫応答を起こすことができる限り、任意の投与経路によって投与することができる。一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、経皮接種（皮膚の乱刺）によって投与される。一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは皮下投与によって投与される。一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは筋肉内投与によって投与される。

一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、１×１０⁴～１×１０⁸ＰＦＵの範囲の用量で投与される。一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、１×１０⁴～１×１０⁵ＰＦＵ、１×１０⁴～３×１０⁵ＰＦＵ、１×１０⁴～１×１０⁶ＰＦＵ、１×１０⁴～３×１０⁶ＰＦＵ、１×１０⁴～１×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁴～３×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁴～１×１０⁵ＰＦＵ、３×１０⁴～３×１０⁵ＰＦＵ、３×１０⁴～３×１０⁶ＰＦＵ、３×１０⁴～３×１０⁶ＰＦＵ、３×１０⁴～１×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁴～３×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁴～１×１０⁸ＰＦＵ、１×１０⁵～３×１０⁵ＰＦＵ、１×１０⁵～１×１０⁶ＰＦＵ、１×１０⁵～３×１０⁶ＰＦＵ、１×１０⁵～１×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁵～３×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁵～１×１０⁸ＰＦＵ、３×１０⁵～１×１０⁶ＰＦＵ、３×１０⁵～３×１０⁶ＰＦＵ、３×１０⁵～１×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁵～３×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁵～１×１０⁸ＰＦＵ、１×１０⁶～３×１０⁶ＰＦＵ、１×１０⁶～１×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁶～３×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁶～１×１０⁸ＰＦＵ、３×１０⁶～１×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁶～３×１０⁷ＰＦＵ、３×１０⁶～１×１０⁸ＰＦＵ、１×１０⁷～３×１０⁷ＰＦＵ、１×１０⁷～１×１０⁸ＰＦＵまたは３×１０⁷～１×１０⁸ＰＦＵの範囲の用量で投与される。

一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、５×１０⁵～２×１０⁶ＰＦＵの範囲の用量で経皮、皮下、または筋肉内で投与される。一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、１×１０⁶ＰＦＵの範囲の用量で経皮、皮下、または筋肉内で投与される。

一部の実施形態では、上記の用量は、１、２、３、４、５、６または７日の間隔で２、３、４または５回投与される。一部の実施形態では、上記の用量は、１、２、３、４、５、６または７週間の間隔で２、３、４または５回投与される。一部の実施形態では、上記の用量は、１、２、３、４、５、６または７か月の間隔で２、３、４または５回投与される。一部の実施形態では、単回用量を複数回の注射に分割する。例えば、１×１０⁶ＰＦＵの単回用量を、それぞれ５×１０⁵ＰＦＵの２回の用量に分割し、１、２、３、４、５、６または７日の間隔で投与してもよい。

一部の実施形態では、投薬レジメンは、患者の体格、体重、年齢および性別、疾患の性質および段階、疾患の攻撃性、ならびに組成物の投与経路に基づいて修正される。

ＩＩＩ．併用療法
一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、１種以上のさらなる作用剤と組み合わせで投与される。一部の実施形態では、１種以上のさらなる作用剤は、コロナウイルスに対する抗ウイルス剤などの抗ウイルス剤を含む。例示的な抗ウイルス剤としては、それらに限定されないが、以下が挙げられる：ウイルスポリメラーゼ阻害剤、例えばレムデシビル、ＧＳ－４４１５２４、ファビラビル、ＥＩＤＤ－２８０１、ＥＩＤＤ－２９０１、ＥＩＤＤ－１９３１、リバビリン、６－アザウリジン；回復期血漿；中和ｍＡｂまたはコロナウイルスの付着もしくは侵入を阻害するｍＡｂ、例えばＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、ＬＹ３８１９２５３、ＡＺＤ７４４２、ＢＲＩＩ－１９６、ＣＴ－Ｐ５９、ＪＳ０１６、ＳＣＴＡ０１、ＳＴＩ－１４９９、ＴＹ０２７、４７Ｄ１１；抗ＩＬ６モノクローナル抗体、例えばトシリズマブ；Ｍｐｒｏを標的とするプロテアーゼ阻害剤、例えばロピナビル、リトナビル、ジピリダモール、およびダノプレビル；イベルメクチン；サラカチニブ；ＴＭＰＲＳＳ２を標的とするプロテアーゼ阻害剤、例えばカモスタット、ナフォマスタット、およびメシル酸ナフォマスタット；Ｓタンパク質標的薬、例えばアルビドール（ウミフェノビル）およびヒドロキシクロロキン；サイトカイン、例えばインターフェロン、デキサメタゾン、アナキンラ、ヒドロコルチゾン、アジスロマイシン、ウリナスタチンおよびシクレソニド；ヤヌスキナーゼ阻害剤、例えばルキソリチニブおよびバリシチニブ；ＡＸＬキナーゼ阻害剤、例えばベムセンチニブ；ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤、例えばＰＴＣ２９９；組換えＡＣＥ２；ＨＲ２Ｐ－ＥＫ１Ｃ４、ＩＰＢ０３および上で本明細書に記載のその他のリポペプチド融合阻害剤；フルボキサミン；アピロモド；シクレソニド；テトラヒドロキノリンオキソカルバゼート；ＧＣ３７３；ビタミンＤ；Ｚｎ２＋；ならびにそれらの組み合わせ。

本出願の組成物と組み合わせで使用するためのさらなる抗ウイルス剤には、それらに限定されないが、以下が含まれる：アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アムドキソビル、アンプレナビル、抗プロテアーゼ、アプリシタビン、アルビドール、アルテミシニン、アタザナフィル、アトリプラ、アジドチミジン（ＡＺＴ）、アジスロマイシン、ベビリマト、ボセプレビル、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、クロロキン、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ジピボキシル、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エルビテグラビル、エルブシタビン、エムトリシタビン、エンフビリチド、エンテカビル、エトラビリン、ファムシクロビル、ホスカーネット、ホスアンプレナビル、ガンシクロビル、グロボイドナンＡ、ＧＳＫ－５７２、ＨＩＶ融合阻害剤、ヒドロキシクロロキン、ヒペリシン、イバリズマブ、イドクスウリジン、イムノビル、インジナビル、インターフェロン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型）、ラミブジン、レルシビリン、ロピニビル、ロビリド、マラビロック、マリバビル、ＭＫ－２０４８、モリキサン（ＮＯＶ－２０５）、モロキシジン、ネルフマビル、ネビラピン、ネクサビル、非ヌクレオチドＨＩＶ ＲＴ阻害剤、オセルタミビル、ペグ化インターフェロン（例えば、ペグインターフェロンアルファ－２ａ）、ペンシクロビル、ペンサイクロビル、ペラミビル、プレコナリール、ポドフィロトキシン、ラシビル、ラルテグラビル、レムデシビル、レスキモド、リバビリン、リファンピン、リルピビリン、リマンチジン、リトナビル、サキニビル、スタンピジン、スタブジン、タリバビリン、テノホビル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンチジン、ツルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビベコン、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ）、ジドブジン、硫酸亜鉛、およびそれらの組み合わせ。

一部の実施形態では、本出願の組換えワクシニアウイルスは、１種以上のさらなる抗がん剤と組み合わせで投与される。抗がん剤は以下のものとすることができる：アルキル化剤；アントラサイクリン系抗生物質；抗代謝物質；解毒剤；インターフェロン；ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体；チェックポイント調節因子（例えば、ＰＤ－１もしくはＰＤＬ－１もしくはＣＴＬ－４阻害剤）；ＥＧＦＲ阻害剤；ＨＥＲ２阻害剤；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；ホルモンもしくは抗ホルモン剤；有糸分裂阻害剤；ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤；Ａｋｔ阻害剤；哺乳動物標的のラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤；プロテアソーム阻害剤；ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤；Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤；中心体のデクラスタリング剤；マルチキナーゼ阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤；タキサンもしくはタキサン誘導体、アロマターゼ阻害剤、アントラサイクリン、微小管標的薬、トポイソメラーゼ毒薬、分子標的もしくは酵素（例えば、キナーゼもしくはタンパク質メチルトランスフェラーゼ）の阻害剤、シチジンアナログ、またはそれらの組み合わせ。

ＩＶ．医薬組成物
本出願の別の態様は、医薬組成物に関する。医薬組成物は、本出願の組換えワクシニアウイルス（すなわち、細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルス）および薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下注射または皮膚接種用に製剤化される。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、必要に応じて、動物またはヒトに投与される場合、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体または組成物を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語には、医薬投与に適合する、あらゆる溶媒、可溶化剤、充填剤、安定剤、界面活性剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、賦形剤、滑沢剤、徐放性ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、ゲル、分散媒、コーティング、抗菌剤または抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は血清アルブミンを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような担体および作用剤の使用については、当技術分野で周知である。

例示的な担体または賦形剤としては、それらに限定されないが、以下が挙げられる：炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどのポリマー、水、生理食塩水、等張水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、０．３％水性グリシン、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせ。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールもしくは塩化ナトリウム、またはアルブミン、リポタンパク質およびグロブリンなどの安定性の増強のための糖タンパク質を含めることが好ましいであろう。薬学的に許容される担体は、治療剤の貯蔵寿命または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は血清アルブミンを含む。

改変してもよい製剤特性には、例えば、ｐＨおよび浸透圧が含まれる。例えば、非経口投与した場合に製剤の有効性を促進するために、ヒトの血液または組織のｐＨおよび浸透圧と類似のｐＨおよび浸透圧を有する製剤を得ることが望ましいとすることができる。

本開示では緩衝剤は、他の目的の中でも特に医薬製剤の総ｐＨの操作にとって有用である（とりわけ非経口投与にとって望ましい）。当技術分野で既知のさまざまな緩衝剤を、例えば、クエン酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、乳酸、酢酸、重炭酸、または炭酸イオンの種々の形態を含めて、有機または無機酸、塩基、またはアミノ酸の種々の塩を、本製剤に使用することができる。本開示において、ここに開示される組成物の非経口投与形態で使用するために特に有利な緩衝剤には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、コハク酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含めて、ナトリウムまたはカリウムの緩衝剤が含まれる。

塩化ナトリウムを、０～３００ｍＭの濃度（液体剤形の場合、最適には１５０ｍＭ）で、溶液の張度を改変するために使用することができる。凍結防止剤を、主として０～１０％スクロースであるが（最適には０．５～１．０％）、凍結乾燥の剤形向けに含めることができる。適切な他の凍結防止剤にはトレハロースおよびラクトースが含まれる。増量剤を、主として１～１０％のマンニトール（最適には２～４％）であるが、凍結乾燥の剤形向けに含めることができる。安定剤を、主として１～５０ｍＭ Ｌ－メチオニン（最適には５～１０ｍＭ）であるが、液体と凍結乾燥の剤形の両方で使用することができる。グリシン、アルギニンを含む適切な他の増量剤を、０～０．０５％のポリソルベート－８０（最適には０．００５～０．０１％）として含めることができる。

一実施形態では、リン酸ナトリウムを２０ｍＭに近似する濃度で用いておよそ７．０のｐＨを得る。特に有効なリン酸ナトリウム緩衝系は、リン酸一ナトリウム一水和物およびリン酸二ナトリウム七水和物を含む。リン酸一ナトリウムとリン酸二ナトリウムのこの組み合わせが使用される場合、それぞれの有利な濃度は、リン酸一ナトリウム約０．５～約１．５ｍｇ／ｍｌ、リン酸二ナトリウム約２．０～約４．０ｍｇ／ｍｌであり、この場合、好ましい濃度はリン酸一ナトリウム約０．９ｍｇ／ｍｌおよびリン酸二ナトリウム約３．４ｍｇ／ｍｌである。製剤のｐＨは使用する緩衝剤の量にしたがって変化する。

投与の剤形および意図する経路に応じて、さまざまな濃度の緩衝剤を使用してまたは他の添加物を使用して組成物のｐＨを調整し、その結果他の範囲を包含することがあるいは有利とすることができる。本開示の組成物にとって有用なｐＨの範囲にはｐＨ約２．０～ｐＨ約１２．０が含まれる。

一部の実施形態では、医薬組成物はアジュバントをさらに含む。アジュバントの例としては、それらに限定されないが、以下が挙げられる：油中水型または水中油型エマルジョン（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ７２０ＶＧ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ５０Ｖ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ２０６、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＭＳ １３１２、ＭＦ５９（登録商標）およびＡＳ０３）、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバンとも呼ばれる））、リポソーム、ビロソーム、３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）およびＭＰＬを含有するアジュバント（例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０２、およびＡＳ０４）；サポニンベースのアジュバントを含めて、サポニンベースのアジュバント（例えば、ｉｓｃｏｍｓ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、ＭＡＴＲＩＸ－Ｍ（商標）アジュバント、ＭＡＴＲＩＸ－Ｃ（商標）アジュバント、ＭａｔｒｉｘＱ（商標）アジュバント、ＡＢＩＳＣＯ（商標）－１００アジュバント、ＡＢＩＳＣＯ（商標）－３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）アジュバントおよびＱＳ－２１誘導体およびＱＳ－２１誘導体を含めて誘導体）；例えば、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ、Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ、Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓおよびＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ由来のサポニン誘導体；ポリアミノ酸、アミノ酸のコポリマー、サポニン、パラフィン油、ムラミルジペプチド、リグレシン（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ、Ａｔｈｅｎｓ ＧＡ）、アブリジン、リポソーム、油、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、カルメット・ゲラン桿菌、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、非メチル化ＣｐＧモチーフ、グルカン、３Ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＳ０３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＳ０４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ならびにデキストラン硫酸。加えて、トリパルミトイル－Ｓ－グリセリルシステイニル－セリル－セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの脂質に１つまたは複数のタンパク質免疫原をコンジュゲートさせることによって、ＣＴＬ応答をプライムすることができる。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ＱＳ－２１を５０μｇ／用量／対象で含む。

本出願の医薬組成物は、無菌条件下で凍結乾燥粉末として保存し、投与前に無菌の水溶液と組み合わせてもよい。水溶液は、上述の、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤などの、物理的条件を近似するのに必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。代替的に、本出願の医薬組成物は、投与前に懸濁液、好ましくは水性懸濁液として保存してもよい。

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、経皮投与および皮下投与が挙げられる。皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整用の作用剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。組成物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアルに封入することができる。

投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、本出願の医薬組成物を単位剤形で製剤化することがとりわけ有利である。

本開示を、以下の実施例によりさらに例示するが、以下の実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用されるあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容ならびにそれらの図面および表は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１
材料および方法
細胞
ＢＳＣ－４０細胞はＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＲＫ１３細胞はＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳを補充したアール最小必須培地（ＥＭＥＭ）で維持した。

ウイルスおよび感染。
ｖＦ１３Ｌ－ＨＡおよびｖΔＦ１３Ｌは、Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ（国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）によって好意で提供されたものであり、それらの生成については以前に記載されている（Ｒ．Ｂｌａｓｃｏ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｒｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ３７，０００－Ｄａｌｔｏｎ ｏｕｔｅｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５、５９１０～５９２０頁（１９９１）；Ｍ．Ｈｕｓａｉｎ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ｆ１３Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｏｔｉｆ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ５Ｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐｏｓｔ－Ｇｏｌｇｉ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５、７５２８～７５４２頁（２００１）；Ｍ．Ｈｕｓａｉｎ、Ａ．Ｗｅｉｓｂｅｒｇ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｔａｇｇｅｄ Ｆ１３Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａ ｍａｊｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０８、２３３～２４２頁（２００３）；Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔ、Ｅ．Ｇ．Ｎｉｌｅｓ、Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８３、８１２２～８１２６頁（１９８６））。ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡについては以前に記載されている（Ｓ．Ｒ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ、Ｐ．Ｂｒｙｋ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｔｈｅ Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ Ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ Ｇｅｎｅ ＭＣ０２１Ｌ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｆ１３Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０．１１２８／ｊｖｉ．０１４９６－２０、ＪＶＩ．０１４９６－０１４２０（２０２０））。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびｖΔＦ１３Ｌ／Ａ４－ｍＣｈｅｒｒｙについては以前に記載されている（Ｐ．Ｂｒｙｋ、Ｍ．Ｇ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ１３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０．１１２８／ｊｖｉ．０２１５４－１７（２０１８））。ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙは、ＨｅＬａ細胞にｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡを感染させ、これに続いて、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するプラスミドをトランスフェクトし、Ａ４のＮ末端に５００ｂｐのフランキングホモロジーを用いて融合し、赤色プラークの生産によりスクリーニングすることによって生成した。ＭＣ０２１Ｌ／Ｆ１３Ｌ遺伝子座の配列を決定して、その完全性を検証した。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、およびｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙは、それぞれ、ＨｅＬａ細胞にｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、およびｖΔＦ１３Ｌ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙを感染させ、これに続いて、ｐＢ５Ｒ－ＧＦＰをトランスフェクトし（Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｂ５Ｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｍｅｒａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５、４８０２～４８１３頁（２００１）；Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｇｏｌｇｉ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｂ５Ｒ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４、３７７１～３７８０頁（２０００））、緑色および赤色のプラークの生産によりスクリーニングすることによって生成した。ＶＡＣＶ－ＧＦＰは以前に記載されたものである（Ｃ．Ｃ．Ｎｏｒｂｕｒｙ、Ｄ．Ｍａｌｉｄｅ、Ｊ．Ｓ．Ｇｉｂｂｓ、Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ、Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ、Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３、２６５～２７１頁（２００２））。

マウス。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＳＴＡＴ１＋／－マウスのつがいは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ Ｈｅｒｓｈｅｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの特定病原体不在の動物施設で繁殖させた。皮内（ｉ．ｄ．）ＶＡＣＶ感染の場合、７～１０週齢のマウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、各耳介にＶＡＣＶ １０４ＰＦＵを＜１０μＬで注射した。足蹠ＥＣＴＶ感染症の場合、マウスに右足蹠にＥＣＴＶ Ｍｏｓｃｏｗ ３０００ＰＦＵを注射した。ＶＡＣＶによるＳＴＡＴ１－／－マウスの致死的曝露、またはＥＣＴＶによるＢａｌｂ／ｃマウスの致死的曝露の間、感染後の２８日間、マウスを死亡について１日２回モニタリングした。耳の病原性をモニタリングするために、０．０００１インチマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ａｕｒｏｒａ、ＩＬ）を使用して耳の厚さを測定した。その後、病変の進行およびその後の組織喪失を毎日測定した。

プラークアッセイおよびウイルス定量化。
プラークアッセイを以前に記載のとおりに実施した（Ｓ．Ｒ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ、Ｐ．Ｂｒｙｋ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｔｈｅ Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ Ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ Ｇｅｎｅ ＭＣ０２１Ｌ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｆ１３Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０．１１２８／ｊｖｉ．０１４９６－２０、ＪＶＩ．０１４９６－０１４２０（２０２０））。３日後、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）により制御される冷却電荷結合素子（Ｃｏｏｋｅ）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭＩＲＢ倒立蛍光顕微鏡を使用してプラークを画像化した。画像について、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）を使用して編集し、最小限の処理を行った。ウイルスゲノムを、以前に記載のとおりにｑＰＣＲによって定量化した（Ｊ．Ｌ．Ｂａｋｅｒ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ １９６、１２６～１３２頁（２０１４））。

ＥＥＶの解析。
ＣｓＣｌ勾配によるＥＶ精製を、以前に記載のとおりに実施した（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ２０２０）。ウイルスペレットをタンパク質ゲル試料緩衝剤で希釈し、以前に記載のとおりにウェスタンブロッティングによって解析した（Ｓ．Ｒ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ、Ａ．Ｋ．Ｅａｒｌｅｙ、Ｊ．Ｔａｔｅ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｔｈｅ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ３４ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｉｒｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ Ｌａｒｇｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ５．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９３、ｅ０１３４３－０１３１８ ２０１９））。以下の抗体を使用した：ウサギ抗ＨＡ抗血清（Ｓｉｇｍａ）、ラット抗Ｂ５ ＭＡｂ（Ｍ．Ｓｃｈｍｅｌｚら、Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ：ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｗｒａｐｐｉｎｇ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ Ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８、１３０～１４７頁（１９９４））、ウサギ抗Ａ３３抗血清（ＮＲ－６２８；ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、マウス抗アクチンＭＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、およびウサギ抗Ｌ１抗血清（ＮＲ－６３１；ＢＥＩ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）。ＨＲＰ－およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗ラット抗体および抗マウス抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＨＲＰを、製造業者の説明書にしたがって化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。蛍光および化学発光のシグナルを、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４０００ｍｍ Ｐｒｏ（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ．）を使用して捕獲した。

フローバイロメトリー。
ＲＫ１３細胞に、３７℃でＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させた。翌日、細胞培養上清を収集し、９１３×ｇで１０分間の低速遠心分離によって清澄化した。清澄化上清を、最終濃度７０％エタノールへと濾過済み１００％エタノールと混合し、室温で一晩インキュベートし、翌日、９１３×ｇで１０分間の低速遠心分離によって清澄化した。清澄化上清を３６％スクロースクッション上にオーバーレイし、１００，０００×ｇで４０分間遠心分離してＥＶをペレット化した。図の凡例に記載のように、ＥＶを、一次抗体を含有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝剤に再懸濁し、４℃で３時間インキュベートした。次いで、ＥＶを１６，０００×ｇで１０分間ペレット化し、ＴＥ緩衝剤で３回洗浄し、図の凡例に記載のように二次抗体を含有するＴＥ緩衝剤に再懸濁し、４℃でインキュベートした。３時間後、ＥＶをペレット化し、洗浄し、上記のようにＴＥ緩衝剤に再懸濁した。染色ＥＶを、適当なレーザーとフィルターを使用して、ＬＳＲＩＩ－１８カラーＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓフローサイトメーターで解析した。ビリオンを、図の凡例に記載のように、ｍＣｈｅｒｒｙ＋イベント（Ａ４－ｍＣｈｅｒｒｙ）をゲーティングすることによってデブリから分離し、ｍＣｈｅｒｒｙ＋イベントをＣｙ２（ＨＡまたはＢ５－ＧＦＰ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａ３３またはＨＡ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４０５（Ｂ５）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（Ａ３３）ポジティブイベントについてゲーティングした。以下の抗体を使用した：ウサギ抗ＨＡ抗血清（Ｓｉｇｍａ）、ラット抗Ｂ５ ＭＡｂ（１２）、およびマウス抗Ａ３３ＭＡｂ（ＮＲ－４９２３１；ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートされたロバ抗マウスおよび抗ウサギ抗体、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４０５コンジュゲートされたロバ抗ラット抗体、ならびにＣｙ２コンジュゲートされたロバ抗ウサギ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０コンジュゲートされたヤギ抗マウス抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。すべてのデータを、ＦＡＣＳＤｉｖａ ８．０．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ７（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して解析した。

蛍光活性化ビリオン選別。
ＲＫ１３細胞に、３７℃でＭＯＩ ５で表示のウイルスを感染させた。翌日、細胞培養上清を収集し、９１３×ｇで１０分間の低速遠心分離によって清澄化し、３６％スクロースクッション上にオーバーレイし、１００，０００×ｇで４０分間遠心分離してＥＶをペレット化した。ＥＶをＴＥ緩衝剤に再懸濁し、適当なレーザーとフィルターを使用して、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩフローサイトメーターを備えたＢＳＬ－２設備で、選別した。ポジティブビリオンを、６１０／２０バンドパスフィルターを通してｍＣｈｅｒｒｙ＋イベント（Ａ４－ｍＣｈｅｒｒｙ）をゲーティングすることによってまず単離し、５２５／５０バンドパスフィルターを通して高、中、および低のＧＦＰ蛍光発光に基づいて選別した。選別ＥＶを１６，０００×ｇで１０分間ペレット化し、ｑＰＣＲ、結合、およびプラークの各アッセイ用にＴＥ緩衝剤に再懸濁した。

細胞結合。
ウイルス結合アッセイを実施し、以前に記載のとおりにｑＰＣＲによって定量化した（Ｐ．Ｂｒｙｋ、Ｍ．Ｇ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ１３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０．１１２８／ｊｖｉ．０２１５４－１７（２０１８）；Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ２０２０、Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ２０１９、Ｓ．Ｒ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ、Ａ．Ｋ．Ｅａｒｌｅｙ、Ｒ．Ｓｔｏｎｅ、Ｃ．Ｃ．Ｎｏｒｂｕｒｙ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａ３３，Ａ３４，ａｎｄ Ｂ５ Ｆｏｒｍ ａ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｔｏ ｔｒａｎｓ－Ｇｏｌｇｉ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４、ｅ０２１５５－０２１１９（２０２０）；Ｊ．Ｌ．Ｂａｋｅｒ、Ｂ．Ｍ．Ｗａｒｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ １９６、１２６～１３２頁（２０１４））。

中和抗体。
中和抗体力価を測定するためのフローサイトメトリーアッセイは、以前に記載されている（Ｐ．Ｌ．Ｅａｒｌ、Ｊ．Ｌ．Ａｍｅｒｉｃｏ、Ｂ．Ｍｏｓｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７、１０６８４～１０６８８頁（２００３））。

細胞内サイトカイン染色アッセイ。
単細胞懸濁液を脾臓から生成し、リンパ球をＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｍｂｒｅｘ）上での遠心分離によって単離し、次いで各ＶＡＣＶペプチド１μＭで４時間刺激し、その後に、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍＬを添加した。ＶＡＣＶ由来のペプチドＢ８、Ａ８、Ａ３、Ｋ３、Ａ４７およびＡ４２については以前に記載されている（Ａ．Ｒ．Ｈｅｒｓｐｅｒｇｅｒ、Ｎ．Ａ．Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ、Ｂ．Ｃ．ＤｅＨａｖｅｎ、Ａ．Ｅ．Ｓｎｏｏｋ、Ｌ．Ｃ．Ｅｉｓｅｎｌｏｈｒ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｏｕｓｅｐｏｘ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８、９４７２～９４７５頁（２０１４））。ペプチド刺激の後、細胞を１０％マウス正常マウス血清を含有する２．４Ｇ２上清中で遮断し、次いでＣＤ８について染色した。細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで透過処理し、１０％正常マウス血清および０．５％サポニンを補充した２．４Ｇ２上清中で細胞内ＩＦＮ－γについて染色した。サイトカイン陽性ＴＣＤ８＋の正味の頻度および数を、非刺激のバックグラウンド応答を差し引くことによって算出した。
実施例２

ＭＣ０２１－ＨＡの発現により、糖タンパク質の量が増加したＥＶがもたらされる。
ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡによって産生されるＥＶは、そのホモログＦ１３－ＨＡと比較して、より多くのＭＣ０２１－ＨＡを取り込む。糖タンパク質、Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５は、ＥＶ標的細胞の結合および外膜の溶解において複数の役割を果たしており、そういった糖タンパク質の取り込みの欠失または変更により、感染性が低いＥＶの生産がもたらされる。Ｆ１３／ＭＣ０２１のレベルに差異があることを考慮すると、ｖＭＣ０２１－ＨＡがＥＶの糖タンパク質含量を変化させ、その結果、その感染性の低下をもたらすことができた可能性がある。

Ｂ５およびＡ３３がＥＶのエンベロープに取り込まれたかどうか判定するために、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ、およびｖΔＦ１３Ｌ／Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ（それぞれ、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ、およびｖΔＦ１３Ｌと呼ばれる）を感染させた細胞から放出されたＥＶを収集し、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製した（図２）。ＥＶを表す、１．２４ｇ／ｍｌにてのビリオンの単一ピークが、各ウイルスに存在した。対照的に、ＩＭＶは、ＩＭＶが分画されると知られるＣｓＣｌ １．２８ｇ／ｍｌにてＯＤ２６０によってほとんどまたはまったく検出されなかった。したがって、ＥＶを含む、ＣｓＣｌ １．２４ｇ／ｍｌにての画分および両側の画分を収集し、中に含有されるＥＶを単離し、ウェスタンブロットによって解析した（図２、パネルＢ）。ロードしたＥＶの量を平衡させるために、試料をＩＭＶタンパク質Ｌ１の量に対して最初に正規化した。ＭＣ０２１－ＨＡは、Ｆ１３－ＨＡよりも大幅に取り込まれているように思えた。同様に、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡを感染させた細胞によって産生されたＥＶも、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡおよびｖΔＦ１３Ｌによって産生されたＥＶと比較して、より多くのＢ５およびＡ３３を取り込んだ。感染細胞ライセートのウェスタンブロットにより、Ｆ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ、Ａ３３、およびＢ５の発現が確認された（図２、パネルＢ）。

ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡは小プラーク表現型を呈するが、増量したＦ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ、Ａ３３、およびＢ５が、このウイルスによって産生されたＥＶの外膜に取り込まれた（図２、パネルＢ）。したがって、フローバイロメトリーアッセイを使用して、個々のＥＶの糖タンパク質の取り込みについて定量的に調べた（図４）。Ａ３３、Ｂ５、およびＦ１３またはＭＣ０２１上のいずれかのＨＡエピトープタグに特異的な抗体を使用して、固定ＶＡＣＶ ＥＶを蛍光標識し、フローサイトメトリーを使用して解析した。注目すべきことに、使用したすべての組換えウイルスが、ｍＣｈｅｒｒｙに融合されたコアタンパク質Ａ４を発現する。したがって、個々のビリオンが、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によってデブリおよび細胞外小胞から最初に区別された（図３）。

次に、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ビリオンを、Ｆ１３－ＨＡ／ＭＣ０２１－ＨＡ（ＨＡ）、Ａ３３、およびＢ５のレベルについて調べた。図２と一致して、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡによって産生されたＥＶは、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡおよびｖΔＦ１３Ｌ ＥＶによって産生されたＥＶと比較して、およそ２倍のＢ５およびおよそ３倍のＡ３３を取り込んだ（図４、パネルＡ）。同様に、Ｆ１３Ｌ－ＨＡよりも多くのＭＣ０２１－ＨＡがＥＶ中に見いだされたが、一方、ｖΔＦ１３Ｌによって産生されたＥＶについてはシグナルがほとんどまたはまったく検出されなかった（図４、パネルＡ）。驚くべきことに、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡおよびｖΔＦ１３Ｌ ＥＶによって産生されたＥＶは、等量のＢ５シグナルおよびＡ３３シグナルを含有したが、このことが示唆するところは、Ｆ１３の存在／非存在は取り込まれるＢ５およびＡ３３の量に影響しなかったこと、である。

検出タンパク質とこれらの取り込みの増加との間の関係をよりよく理解するために、それらのＡ３３シグナル（ｙ軸）に対するそれらのＨＡシグナル（ｘ軸）、すなわちＦ１３またはＭＣ０２１について（図４、パネルＢ、上段）、Ｂ５に対するＨＡについて（図４、パネルＢ、中段）、およびＢ５に対するＡ３３について（図４、パネルＢ、下段）、ＥＶをプロットした。相関値（Ｒ２）を算出して、タンパク質の取り込みに直線関係があるか判定した。全体として、Ｂ５：ＨＡ、Ｂ５：Ａ３３、およびＡ３３：ＨＡの相関値は、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡとｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡの両方について高く、このことが指示するところは、取り込まれるタンパク質の１つの各増加に対して、他の２つのタンパク質についても同等の増加があったこと、である。こういった直線関係が指示するところは、これらのタンパク質の化学量論量がエンベロープメントの過程で取り込まれること、である。対照的に、ｖΔＦ１３Ｌについては、Ｂ５またはＡ３３とのいずれかとのＨＡシグナルの対比較のＲ２値が低かった（図４、パネルＢ；右列、上段および中段）。興味深いことに、ｖΔＦ１３Ｌによって産生されたビリオンのＢ５：Ａ３３に最高の相関関係が見られた。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡとｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡの間で相関値がかなり類似していたことを考慮すると、その場合、ＭＣ０２１－ＨＡは、全体的にタンパク質の取り込みを増加させるが、糖タンパク質の取り込みの化学量論的関係は変化させない。

ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ ＥＶのタンパク質の取り込みの増加は、単一のビリオンではなく複数のビリオンの同時解析（コインシデンス解析）がもたらされることになる、ビリオン凝集の結果である。コアタンパク質の量は変化してはならない；したがって、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルをＨＡ、Ｂ５、およびＡ３３に対してプロットして、タンパク質の取り込みに関して検出された増加がビリオン凝集の結果であるかどうかを確認した。各ウイルスについて、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、Ｂ５、Ａ３３、またはＨＡと相関関係がほとんどまたはまったくなく（表１）、このことが指示するところは、これらのタンパク質のレベルは、存在するコアタンパク質の量と無関係であったこと、である。したがって、ビリオン凝集は、ウイルス同士の間のＨＡ、Ｂ５、またはＡ３３の各取り込みにおける大きな差異の原因ではなく、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡによって産生されるＥＶのタンパク質の取り込みの増加はＭＣ０２１－ＨＡの発現によるものとすることができる。

本出願が開示するところは、Ｆ１３が細胞内エンベロープメント過程でＥＶのエンベロープへと取り込まれる糖タンパク質の量を制御すること、である；Ｆ１３は糖タンパク質の取り込みを制限するが、一方、ＭＯＣＶホモログはより多くの取り込みを促進する。同時に、ＭＣ０２１の量の増加がエンベロープ内で見いだされる（図２、パネルＢおよび図４、パネルＡ）。各ビリオンで見いだされるＡ３３、Ｂ５、およびＦ１３／ＭＣ０２１の量の間の強い相関関係が指示するところは、それらの取り込み間の化学量論的関係であり、このことによって、少なくともこれら３つのタンパク質が複合体として取り込まれることが指示される。Ｆ１３Ｌ－ＨＡもＭＣ０２１Ｌ－ＨＡも両方とも同一のＦ１３Ｌプロモーターから発現されたのであるが、Ｆ１３－ＨＡと比較してより多量のＭＣ０２１－ＨＡが感染細胞からのライセート中に検出された（図２、パネルＢ）。ＭＣ０２１のレベルの上昇は、ＥＶタンパク質とＩＭＶ表面上のタンパク質の間の相互作用を促進することによるエンベロープ取り込みの増加の原因でもある可能性がある。すべてではないにしても、極めて重要な４種のＥＶタンパク質（Ａ３３、Ａ３４、Ｂ５、およびＦ１３）のうちの少なくとも１つが、マトリックス様タンパク質として機能して、ＩＭＶのエンベロープメントを促進し、その結果ＥＶを形成することは、大いにあり得る。したがって、マトリックス様複合体の形成の増加は、ＥＶタンパク質とＩＭＶタンパク質間の相互作用の上昇をもたらし、したがって、このことは、放出されたビリオンへの取り込みの増加の原因であると思われる。
実施例３

Ｂ５－ＧＦＰは、ＥＶ産生について機能的にＢ５に取って代わることができる。
Ａ３３、Ａ３４、および／またはＢ５の取り込みの低下は、ＥＶの感染性の低下および小プラーク表現型と相関する。しかし、糖タンパク質の取り込みの増加がＥＶの感染性の欠失と相関したのはこれが初めてである。これらの結果が示唆するところは、最適ＥＶ感染性に必要とされる最適糖タンパク質濃度が存在すること、である。

この仮説を検証するために、３つの組換えウイルスのＢ５Ｒ遺伝子をＢ５Ｒ－ＧＦＰ（ここでは、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ、およびｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰと呼ぶ）で置き換えて、抗体を使用せずに、放出されたＥＶ中の糖タンパク質Ｂ５のレベルをモニタリングした。Ｂ５にＧＦＰを付加すると、感染過程でＢ５に機能的に取って代わることができ、Ｂ５－ＧＦＰは生細胞におけるＩＥＶの放出を研究するための有用なツールであると判明した。Ｂ５－ＧＦＰが、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ感染の状況においてＢ５に機能的に取って代わることができたことを検証するために、Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ親ウイルスのプラーク表現型を、Ｂ５の代わりにＢ５－ＧＦＰを発現する新規な組換え体と比較した（図６、パネルＡ）。これらのウイルスのプラーク表現型の比較によって、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡとｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ、ＶＭＣ０２１Ｌ－ＨＡとｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ、およびｖΔＦ１３ＬとｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの間に差異はないことが明らかになったが、このことが示唆するところは、Ｂ５－ＧＦＰは感染過程でＢ５に機能的に取って代わることができること、である。

意外にも、フローバイロメトリー解析により、解析した組換えウイルス３つすべてについてビリオン当たりの幅広いタンパク質の取り込みが明らかになったが、このことにより、エンベロープ組成の確率過程が示唆された（図４および６）。さらに、糖タンパク質含量の増加により、細胞結合の低下およびｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡの感染性の全体的な減少がもたらされる。細胞受容体と相互作用するビリオン糖タンパク質などの多価系では、粒子表面のリガンド（糖タンパク質）の数の増加によって結合親和性の上昇がもたらされるはずであると一般に認められている。ビリオン表面上の糖タンパク質密度の全体的な上昇が細胞結合にとって等しく有害であったこと、を発見することは予期せぬことである。
実施例４

Ｂ５へのＧＦＰの付加によって、ＨＡ、Ａ３３、およびＢ５の取り込みプロファイルは影響を受けない。
ＭＣ０２１－ＨＡの発現は、Ｂ５と比べてＢ５－ＧＦＰの取り込みに影響を与える可能性がある。Ａ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ組換え体の取り込みプロファイルがＡ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙ親ウイルスの取り込みプロファイル（図４）と似ていたか判定するために、新規の組換えウイルスによって産生されたＥＶをフローバイロメトリーによって解析した。データの解析が示すところは、Ａ４－ｍＣｈｅｒｒｙ親ウイルスに類似の取り込みプロファイルがＢ５－ＧＦＰウイルスについて観察されたこと（図６、パネルＢ）、この場合、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶはｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰと比較して、およそ２～３倍多いＨＡ、Ａ３３、およびＢ５を取り込んでいたこと、である。さらに、Ｂ５シグナル（ｘ軸）をＡ３３シグナル（ｙ軸）に対して、ＨＡをＢ５に対して、Ａ３３をＨＡに対してプロットした相関プロットを作成した（表２）。相関値（Ｒ２）を算出し、親ウイルスによる結果（図４、パネルＢ）と同様であることがわかった。まとめると、これらの結果が指示するところは、Ｂ５－ＧＦＰウイルスは機能性と糖タンパク質の取り込みパターンの両方において親ウイルスに似ていたこと、である。ＧＦＰ蛍光がこれらの固定試料では検出されなかったが、使用したエタノール固定プロトコルによるＧＦＰの変性に起因する可能性が高い。

実施例５

中間レベルのＢ５－ＧＰを含有するＥＶは、Ｂ５－ＧＦＰ量がそれよりも高いか低いＥＶと比較して、より高い比感染性を有する。
Ｂ５－ＧＦＰウイルスが親Ａ４－ｍＣｈｅｒｒｙウイルスのプラーク表現型および取り込みプロファイルを再現することを検証した後（図６）、蛍光活性化ビリオン選別（ＦＡＶＳ）実験を非固定ＥＶを使用して行った。上記のように、ＥＶを、ｍＣｈｅｒｒｙ＋イベントに対してゲーティングすることによって特定し、次いで、高、中または低のＧＦＰ蛍光強度（それぞれ、Ｂ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MEDおよびＢ５ＧＦＰ^LOWと呼ばれる；図５）に基づいて選別した。図４パネルＢのデータに基づいて、それらのＢ５－ＧＦＰ含量にしたがって選別したが、Ａ３３およびＦ１３／ＭＣ０２１のレベルは、Ｂ５－ＧＦＰのレベルと相関するはずである。ＥＶ選別の後、これら３つの群の感染特性について調査した（図７）。

ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶが、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰとｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶの両方と比較してより多くのＢ５を取り込んでいることを考慮すると、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶの総量のうちのより大きなパーセンテージがＢ５ＧＦＰ^HIGH内に入るであろうと予想された。このことを試験するために、Ｂ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MED、およびＢ５ＧＦＰ^L0Wを含むウイルスゲノムコピーの総数のパーセンテージをｑＰＣＲによって定量化した（図６、パネルＡ）。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰとｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの両方の場合、ＥＶのおよそ５０％がＢ５ＧＦＰ^HIGHまたはＢ５ＧＦＰ^MEDのいずれかであり、その他の５０％はＢ５ＧＦＰ^L0Wであった。しかし、予想通り、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの場合、Ｂ５ＧＦＰ^L0WであったＥＶの割合はＢ５ＧＦＰ^HIGHおよびＢ５ＧＦＰ^MEDにシフトしたが、一方、ＥＶのおよそ７０％がＢ５ＧＦＰ^HIGHまたはＢ５ＧＦＰ^MEDのいずれかであり、わずか３０％がＢ５ＧＦＰ^LOWであった。

次に、Ｂ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MED、およびＢ５ＧＦＰ^L0W由来のＥＶを、高感度ｑＰＣＲベースの結合アッセイを使用して細胞結合について試験した（図７、パネルＢ）。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの場合、Ｂ５ＧＦＰ^MED ＥＶは最高の結合効率およそ７６％を呈したが、Ｂ５ＧＦＰ^HIGHおよびＢ５ＧＦＰ^L0W ＥＶは、およそ４５～５０％の、Ｂ５ＲＧＦＰ^MEDと比較して結合効率の有意な減少を示した。同様のパターンが、ｖΔＦ１３Ｌ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶとｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰ ＥＶの両方に対して観察されたが、後者の場合、Ｂ５ＧＦＰ^LOW ＥＶはＢ５ＲＧＦＰ^MEDと比較して結合効率のおよそ２５％の有意な減少を呈した。これらの結果が示唆するところは、組換えウイルスにかかわらず、中間量のＢ５を含有するＥＶは、より多量またはより少量の糖タンパク質を有するＥＶよりも細胞への結合時に良好であったこと、である。

ゲノムコピーの総数をプラーク形成単位（ＰＦＵ）と比較することによって、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰおよびｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰにより産生されるＢ５ＧＦＰ^HIGH、Ｂ５ＧＦＰ^MED、およびＢ５ＧＦＰ^LOWの各ＥＶについて比感染性を算出した、（図７、パネルＣ）。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの場合、Ｂ５ＧＦＰ^MED ＥＶについては２．５３ゲノムコピーごとに１個でプラークがもたらされたが、この数は、それぞれ、Ｂ５ＧＦＰ^LOWおよびＢ５ＧＦＰ^HIGH ＥＶについては１３．８９個ごとに１個および１５．３０個ごとに１個へと、ほぼ５倍に上昇した。同様に、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ／Ｂ５Ｒ－ＧＦＰの場合、２．７１ゲノムコピーごとに１個でプラークがもたらされたＢ５ＧＦＰ^MED ＥＶと比較して、Ｂ５ＧＦＰ^LOWおよびＢ５ＧＦＰ^HIGH ＥＶでは比感染性およそ６倍の上昇を呈したが、それぞれ、１６．１６ゲノムコピーごとに１個でおよび１６．２０ゲノムコピーごとに１個でプラークがもたらされた。重要なことに、比感染性データは結合データと相関していた。まとめると、本データが示すところは、ＥＶの糖タンパク質の取り込みと感染性の間には直接的な関係があること、およびさらに、使用した組換えウイルスにかかわらず、高度に感染性のＥＶを産生するには最適のまたは「ちょうど良い」量の糖タンパク質を取り込む必要があること、である。
実施例６

ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化されるが、免疫原性を保持する。
ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡは、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡと同量のＥＶを産生したが、小プラーク表現型を示した（図６、パネルＡ）。さらに、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ ＥＶは、糖タンパク質Ａ３３およびＢ５の量が増加したが、両方とも中和抗体の標的であることが示されてきた。これらの結果を考慮して、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡはｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化されると思われるが、それでもなお抗原の放出により防御免疫応答を生成することができる可能性があると仮説を立てた。

この仮説を試験するために、天然痘ウイルス撲滅プログラムにおける感染の自然経路とワクシニアによる免疫経路の両方を模倣する経路で、野生型マウスを皮内感染させた。皮内感染の１４日後、ＶＡＣＶ ＷＲ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）を感染させたマウスで組織病状を容易に特定することができたが（図８、パネルＡ）、ｖΔＦ１３Ｌ（図８、パネルＢ）またはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡ（図８、パネルＣ）のいずれかでの感染後は、病状は容易には観察できなかった。

このことを定量化するために、皮膚ＶＡＣＶ感染に通常伴う特徴的な腫脹（図８、パネルＤ）、病変発達（図８、パネルＥ）、および組織喪失（図８、パネルＦ）の測定を行った。ｖΔＦ１３ＬまたはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡのいずれかの感染は局所組織のいくらかの腫脹を起こしたが、これはＶＡＣＶ ＷＲによる感染と比較してはるかに減少しており、ｖΔＦ１３ＬまたはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡのいずれかの感染後の病変の発達またはその後の組織喪失はまったく観察されなかった。ＳＴＡＴ１－／－マウスはオルソポックスウイルス感染に対して特に感受性があり、この感受性は限られた用量のウイルスによる皮膚感染にまで及ぶことがわかった（図８、パネルＧ）。ｖＦ１３Ｌ－ＨＡによる感染の後、すべてのＳＴＡＴ１－／－マウスが感染後８日までに死亡した。しかし、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡまたはｖΔＦ１３Ｌ－ＨＡのいずれかを感染させたマウスはすべて、感染後２８日目の実験終了まで生存した。したがって、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡおよびｖΔＦ１３Ｌ－ＨＡはｉｎ ｖｉｖｏで減弱されるが、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡによって呈されるＥＶ糖タンパク質の増加がこの減弱の一因を担う。

ＥＶ感染性の低下がｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性の同等の減少を引き起こしたかどうかを評価するために、野生型マウスにＶＡＣＶ ＷＲ、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡ、ｖΔＦ１３ＬまたはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡを皮内感染させ、感染３８日後に血清を採取した。感染動物の各コホートからの血清の希釈度がｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＡＣＶ－ＧＦＰを遮断する能力について調べた。ＶＡＣＶ ＷＲまたはｖＦ１３Ｌ－ＨＡのいずれかでの免疫により、およそ１：２５０の希釈度で感染の５０％を遮断する血清抗体が産生されたが、一方、ｖΔＦ１３Ｌでの免疫により、およそ１：３０の希釈度で感染の５０％を遮断する血清抗体が産生されるにすぎなかった（図８、パネルＨ）。しかし、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡにおけるＥＶ糖タンパク質のレベル上昇と一致して、このウイルスでの免疫により、およそ１：２００の希釈度で、ＶＡＣＶ ＷＲで免疫されたものよりわずかすぐ下のレベルで感染の５０％を遮断する血清抗体が産生されたことがわかった（図８、パネルＨ）。Ｈ２ｂバックグラウンドでのマウスにおけるＢ８、Ａ８、Ａ３、Ｋ３、Ａ４７およびＡ４２エピトープを含めて、複数のエピトープを標的とする強力なＴＣＤ８＋応答も、感染８日後にＶＡＣＶ ＷＲによって誘導される（図８、パネルＩ）。同様のＴ細胞応答が、ｖＦ１３Ｌ－ＨＡでの免疫後に観察されるが、ｖΔＦ１３Ｌでの免疫は、調べたすべての決定基へかなり減少した応答を誘導し、Ａ４７エピトープおよびＡ４２エピトープに対してバックグラウンドを超えるが検出限界であった（図８、パネルＩ）。

対照的に、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡの免疫原性はＥＶ糖タンパク質に対してのみ増強されると考えられたが、すべての決定基に対するＴ細胞応答であって、ｖΔＦ１３Ｌでの免疫を受けて誘導される応答を著しく上回り、多くの場合、ＶＡＣＶ ＷＲまたはｖＦ１３Ｌ－ＨＡによる免疫後に観察された応答に接近する、Ｔ細胞応答が観察された。したがって、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡの免疫原性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡散とｉｎ ｖｉｖｏでの病状の誘導における双方の顕著な減少にもかかわらず、インタクトであるように思える。防御免疫の相関関係の機能性を評価するために、感受性Ｂａｌｂ／ｃマウスをＶＡＣＶ ＷＲ、ｖΔＦ１３Ｌ、またはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡで免疫し、３５日後に毒性の強いマウスポックスウイルスエクトロメリア（ＥＣＴＶ）に曝露した。免疫を受けなかったマウスはすべてＥＣＴＶ感染の８日以内に死亡したが、一方、ｖΔＦ１３で免疫したマウスの４０％が、毒性感染を食い止めるための適応免疫系の失敗を指示すると思われる時点である、感染後１０日目と２０日目の間に死亡した。しかし、ＶＡＣＶ ＷＲまたはｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡのいずれかで免疫したマウスはすべて上記曝露を生き延びたが、このことにより、ｖＭＣ０２１Ｌ－ＨＡによる機能的防御免疫の誘導が指示される。

本出願が実証するところは、Ｆ１３が外側のＥＶ膜に取り込まれるＥＶ糖タンパク質の相対量を制限すること、および、感染性に必要とされる糖タンパク質に関し最適濃度が存在すること、である。外膜のＥＶ糖タンパク質の濃度を変化させることによる予期せぬ副効果とは、免疫原性ビリオンが感染細胞から通常の量で産生されること、および、こういったビリオンによって中和抗体応答の標的であるＥＶタンパク質のレベルの増大が発揮され得ること、である。その結果が、免疫時に識別可能な病状をまったく引き起こさないが、野生型ＶＡＣＶでの感染時に誘導されるレベルに接近するレベルで中和抗体を産生する、組換えＶＡＣＶである。予想外なことに、このベクターはまた、効率的に拡散するＶＡＣＶのホールマークである強力なＴＣＤ８＋応答も誘発した。しかし、不活化ＶＡＣＶビリオンでの免疫は効果的なＴＣＤ８＋応答を誘導することができ、したがって、感染した細胞による免疫の部位にてのＥＶの産生が、複製するのにまたはこの免疫原性をさらには上回るのに十分なウイルス粒子を産生する可能性がある。

したがって、ＥＶ糖タンパク質含量を注意深く操作することで、従来のＶＡＣＶベクターの副作用を発揮しないが、非複製ベクターと比べて免疫原性の顕著な増強を発揮する、効果的な免疫原性ウイルスベクターを生産することができる。

上にさまざまな実施形態について記載してきたが、そのような開示は、例としてのみ提示されており、限定するものではないことを理解されたい。よって、本組成物および方法の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物にしたがってのみ定義されるべきである。

上記説明は本発明を実施する方法を当業者に教示するためのものであり、上記説明を読み解くことで当業者であれば明らかとなるであろう上記説明の自明である改変および変形のすべてを詳述することを意図するものではない。しかし、そのようなすべての自明である改変および変形は、下記の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。特許請求の範囲は、文脈が特に反対のことを示していない限り、そこで意図された目的を満たすのに効果的である任意の順序で、成分および工程をカバーすることを意図するものである。

Claims (20)

1. 対象において抗原への免疫応答を誘導するための方法であって、
   細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、
   組換えワクシニアウイルスが、抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含む、
   方法。
2. 前記抗原がウイルス抗原である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ウイルス抗原がＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２由来の抗原である、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗原が細菌抗原である、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
6. 前記組換えワクシニアウイルスが経皮、皮下、または筋肉内で投与される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 対象において標的への防御免疫応答を誘導するための方法であって、
   細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルスの有効量を対象に投与するステップを含み、
   前記組換えワクシニアウイルスが、標的由来の免疫原をコードする核酸を含む、
   方法。
8. 前記標的が微生物である、請求項７に記載の方法。
9. 前記微生物がウイルスである、請求項８に記載の方法。
10. 前記ウイルスがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２である、請求項９に記載の方法。
11. 前記微生物が細菌である、請求項８に記載の方法。
12. 前記標的が腫瘍細胞である、請求項７に記載の方法。
13. 前記組換えワクシニアウイルスが経皮、皮下、または筋肉内で投与される、請求項７から１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記組換えワクシニアウイルスがアジュバントとともに投与される、請求項７から１３のいずれかに記載の方法。
15. （ａ）細胞外ビリオンタンパク質Ｆ１３が、Ｆ１３の伝染性軟属腫ウイルスホモログであるＭＣ０２１で置き換えられた組換えワクシニアウイルス；および
    （ｂ）薬学的に許容される担体
    を含む医薬組成物であって、
    経皮接種、皮下注射または筋肉内注射用に製剤化される、
    医薬組成物。
16. 前記組換えワクシニアウイルスが、抗原の免疫原性エピトープをコードする核酸を含み、標的細胞の感染時に抗原のエピトープを発現することができる、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記抗原がウイルス抗原である、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記ウイルス抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の抗原である、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記組換えワクシニアウイルスがエンベロープウイルスであり、ウイルスエンベロープが、ＭＣ０２１に加えて、さらなる外来性糖タンパク質またはその一部を含み、前記さらなる外来性糖タンパク質が、異なるウイルス由来のウイルスタンパク質である、請求項１５から１８のいずれかに記載の医薬組成物。
20. 前記異なるウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１９に記載の医薬組成物。