JP2024520577A - 抗ｎｋｇ２ａ抗体及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、並びに、それを必要とする患者における免疫を増強するために及び癌を処置するために、それらを使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１日に出願された米国仮特許出願第６３/１９５，４７０号の優先権を主張する。その優先権主張出願の開示は、その全体が参照により組み入れられる。

配列表
本出願は配列表を含み、これはＡＳＣＩＩ形式で電子出願され、これはその全体が参照によりここに組み入れられる。２０２１年５月２６日に作成された配列表の電子コピーは０２２６７５＿Ｐ１０６５＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、３５，６３１バイトのサイズである。

発明の背景
ＮＫＧ２たんぱく質は、細胞表面でＣＤ９４と二量体を形成する、Ｃ型レクチン受容体である。ＮＫＧ２Ａは、阻害性ファミリーメンバーであり、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞のサブセット上に発現される。ＮＫＧ２Ａ/ＣＤ９４ヘテロ二量体と非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ｅの結合は、ＮＫＧ２Ａの細胞質尾部内の免疫受容体チロシンキナーゼベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化を引き起こし、結果として、阻害性シグナルの伝達及びその結果としてのＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化の阻害が起こる。

ＨＬＡ－Ｅは、多くの固形腫瘍及び血液癌の細胞上に発現されている。ＨＬＡ－Ｅを過剰発現することによって、癌細胞は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４／ＨＬＡ－Ｅ複合体による阻害性シグナル伝達を増強し得、よって、ＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞障害活性からの防御を得て、より悪い患者の転帰がもたらされる。

癌におけるＮＫＧ２Ａの役割を鑑みて、ＮＫＧ２Ａに標的化する新規かつ改善された抗癌療法が必要とされる。

発明の要約
本開示は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化を増強することのできる、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。該抗体を使用して、それを必要とする患者、例えば、癌又は免疫不全を有する患者における、免疫応答を刺激することができる。また、これらの中の１つ以上の抗体を含んでいる医薬組成物、並びに癌の処置のための該抗体及び医薬組成物の使用も提供される。本明細書に記載の抗体及び組成物は、患者における癌の処置法に使用され得るか；患者における癌の処置のための医薬品の製造のために使用され得るか；又は患者における癌の処置に使用するためのものであり得る。抗体による処置を含む、このような癌のための現在入手可能な処置と比較して、本明細書に記載の抗体及び組成物は、単独で又は別の癌療法剤と組み合わせてのいずれかで、優れた臨床応答を提供し得ると考えられる。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、又は２４１３５と同じヒトＮＫＧ２Ａのエピトープと、結合について競合若しくは交差競合するか、又はそれと結合する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供する。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、前記抗体の６つのＣＤＲ、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン、又は重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列によって定義される。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記の抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
ｂ）前記の抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号８～１０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含んでいる、Ｈ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖を含み；そして
ｂ）前記抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含んでいる、Ｌ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号２５～２７のアミノ酸配列を含んでいる、Ｈ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖を含み；そして
ｂ）前記抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含んでいる、Ｌ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号３５～３７のアミノ酸配列を含んでいる、Ｈ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖を含み；そして
ｂ）前記抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含んでいる、Ｌ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号４５～４７のアミノ酸配列を含んでいる、Ｈ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖を含み；そして
ｂ）前記抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号４８～５０のアミノ酸配列を含んでいる、Ｌ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供し、ここで、
ａ）前記抗体の重鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号５５～５７のアミノ酸配列を含んでいる、Ｈ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；
ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
ｉｖ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖を含み；そして
ｂ）前記抗体の軽鎖は、
ｉ）それぞれ配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含んでいる、Ｌ－ＣＤＲ－１－３；
ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
ｉｖ）配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖を含む。

本開示はまた、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分の、重鎖若しくはその抗原結合部分、軽鎖若しくはその抗原結合部分、又はその両方をコードしている、ヌクレオチド配列を含んでいる、単離された核酸分子、ベクター、及び宿主細胞も提供する。さらに、本開示は、前記宿主細胞を培養することによって、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分を産生するための方法、並びに、本明細書に記載の抗体若しくは抗原結合部分を混合することによって、抗体組成物を産生するための方法を提供する。

本発明の他の特色、目的及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、本発明の実施態様及び態様を示しているが、詳細な説明は、単に説明のために示され、限定のためではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変化及び改変は、詳細な説明から当業者には明らかとなるであろう。

図１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｃ細胞上に発現されるヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合プロファイルを示した、グラフのセットである。抗体の結合は、フローサイトメトリー（ＭＦＩ：平均蛍光強度）によって測定された。 図１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｃ細胞上に発現されるヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合プロファイルを示した、グラフのセットである。抗体の結合は、フローサイトメトリー（ＭＦＩ：平均蛍光強度）によって測定された。 図１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｃ細胞上に発現されるヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合プロファイルを示した、グラフのセットである。抗体の結合は、フローサイトメトリー（ＭＦＩ：平均蛍光強度）によって測定された。 図１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｃ細胞上に発現されるヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合プロファイルを示した、グラフのセットである。抗体の結合は、フローサイトメトリー（ＭＦＩ：平均蛍光強度）によって測定された。 図２は、ヒトＮＫＧ２Ａ（パネルＡ）、カニクイザルＮＫＧ２Ａ（パネルＢ）、ヒトＮＫＧ２Ｃ（パネルＣ）又はカニクイザルＮＫＧ２Ｃ（パネルＤ）を用いて一過性にトランスフェクトされた、ＣＨＯ－Ｓ細胞へのＨＬＡ－Ｅの結合を遮断する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の能力を示した、グラフのセットである。 図２は、ヒトＮＫＧ２Ａ（パネルＡ）、カニクイザルＮＫＧ２Ａ（パネルＢ）、ヒトＮＫＧ２Ｃ（パネルＣ）又はカニクイザルＮＫＧ２Ｃ（パネルＤ）を用いて一過性にトランスフェクトされた、ＣＨＯ－Ｓ細胞へのＨＬＡ－Ｅの結合を遮断する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の能力を示した、グラフのセットである。 図３は、ＨＬＡ－Ｅ/β２ｍと複合体を形成したヒトＮＫＧ２Ａ/ＣＤ９４の結晶構造を示す（タンパク質構造データベース：３ＣＤＧ）。ＨＬＡ－Ｅ/β２ｍ及びＣＤ９４は、リボンとして示される。ＮＫＧ２Ａは、表面の表示として示される。特定の抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（実施例６に考察されているような）についての重要な結合エピトープ残基は、棒として黒色で強調されている。 図４は、ヒトＮＫＧ２Ｃの対応する位置（群）における残基への１アミノ酸又は３アミノ酸置換を有するヒトＮＫＧ２Ａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合を示した、グラフのセットである。ＭＦＩ：平均蛍光強度；偽：偽トランスフェクト細胞。 図４は、ヒトＮＫＧ２Ｃの対応する位置（群）における残基への１アミノ酸又は３アミノ酸置換を有するヒトＮＫＧ２Ａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合を示した、グラフのセットである。ＭＦＩ：平均蛍光強度；偽：偽トランスフェクト細胞。 図４は、ヒトＮＫＧ２Ｃの対応する位置（群）における残基への１アミノ酸又は３アミノ酸置換を有するヒトＮＫＧ２Ａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合を示した、グラフのセットである。ＭＦＩ：平均蛍光強度；偽：偽トランスフェクト細胞。 図４は、ヒトＮＫＧ２Ｃの対応する位置（群）における残基への１アミノ酸又は３アミノ酸置換を有するヒトＮＫＧ２Ａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体の結合を示した、グラフのセットである。ＭＦＩ：平均蛍光強度；偽：偽トランスフェクト細胞。 図５は、一連の抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体とのインキュベート後に、ＮＫ９２細胞（パネルＡ）又は初代ＮＫ細胞（パネルＢ）のいずれかによって媒介される、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の溶解を示したグラフのセットである。データは、平均値±標準誤差として提示される、ｎ＝３。パネルＡ及びＢに提示されたデータの相関がパネルＣに示されている。点線は、抗体で処置されていない（「未処置」）又はモナリズマブ類似体で処置された試料中の溶解レベルを示す。 図５は、一連の抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体とのインキュベート後に、ＮＫ９２細胞（パネルＡ）又は初代ＮＫ細胞（パネルＢ）のいずれかによって媒介される、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の溶解を示したグラフのセットである。データは、平均値±標準誤差として提示される、ｎ＝３。パネルＡ及びＢに提示されたデータの相関がパネルＣに示されている。点線は、抗体で処置されていない（「未処置」）又はモナリズマブ類似体で処置された試料中の溶解レベルを示す。 図６は、示された抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体、リファレンス抗体、ＩｇＧ_４対照（「対照」）抗体、及びＩｇＧ_１－ＬＡＬＡ対照抗体と共にインキュベートした後にＮＫ－２細胞によって媒介される、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の溶解を示した、一対のグラフである。データは、パネルＡの未処置対照に対して標準化される。 図７は、示された抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体、リファレンス抗体、ＩｇＧ_４対照（「対照」）抗体、及びＩｇＧ_１－ＬＡＬＡ対照抗体と共にインキュベートした後に初代ＮＫ細胞によって媒介される、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の溶解を示した、一対のグラフである。データは、未処置対照に対して標準化される。 図８は、示された抗ＮＫＧ２Ａ抗体、リファレンス抗体、及び対照抗体（「対照」）と共にインキュベートした後にγδＴ細胞によって媒介される、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の溶解を示したグラフである。データは、未処置対照に対して標準化される。 図９は、示された抗ＮＫＧ２Ａ抗体と共にインキュベートした後の、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ癌細胞の初代ヒトＮＫ細胞により媒介される殺滅のＥＣ５０（５０％効果濃度）（上）及び有効性（下）を示した、一対のグラフである。ＥＣ５０値並びに有効性のデータは、ＮＫ細胞殺滅アッセイから抽出され、比較のために要約された。 図１０は、６つの異なる腫瘍細胞株の表面における内因性ＨＬＡ－Ｅの発現（パネルＡ）、及びこれらの６つの腫瘍細胞株のＮＫにより媒介される殺滅に対する抗体２４２０８の効果を示した（パネルＢ）、一対のグラフである。 図１１は、抗体２４２０８又はＩｇＧ_１ＬＡＬＡで処置された初代ヒトＮＫ細胞と、Ａ５４９ＨＬＡＥ三量体細胞（上）又はＪＩＭＴ－１ＨＬＡＥ三量体細胞（下）の共培養時の、ＭＩＰ（マクロファージ炎症タンパク質）－１βの濃度を示した一対のグラフである。

発明の詳細な説明
本開示は、癌患者などの患者における、ＮＫＧ２Ａ活性を阻害するために使用することのできる、新規なアンタゴニスト作用性の抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体を提供する。特記されない限り、本明細書において使用する「ＮＫＧ２Ａ」は、ヒトＮＫＧ２Ａを指す。ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチド配列は、以下に示されるような、ＵｎｉｐＰｒｏｔアクセション番号Ｐ２６７１５（NKG2A_HUMAN）（配列番号６３）で入手可能である：

本明細書に使用する「抗体」（Ａｂ）又は「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された、２本の重鎖（Ｈ）（約５０～７０ｋＤａ）と２本の軽鎖（Ｌ）（約２５ｋＤａ）を含んでいる、四量体を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域の散在している、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性領域へとさらに細分され得る。各々のＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端へと並んだ、３つのＣＤＲ（本明細書におけるＨ－ＣＤＲは、重鎖のＣＤＲを示し、本明細書におけるＬ－ＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲを示す）、並びに４つのＦＲから構成される。重鎖又は軽鎖内のＦＲ領域及びＣＤＲ領域のアミノ酸番号の割り当ては、ＩＭＧＴ（登録商標）定義（Ｅｕ番号付け；Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)）、又はKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (アメリカ国立衛生研究所、べセスダ、メリーランド州 (1987及び1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；又はHonegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-70 (2001) の定義に従い得る。

「組換え抗体」という用語は、抗体をコードしているヌクレオチド配列（群）を含んでいる、細胞又は細胞株から発現される抗体を指し、ここでの該ヌクレオチド配列（群）は、細胞内に天然に会合していない。

「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」又は「単離された抗体」という用語は、その起源又は誘導源により、（１）その天然状態で不随している天然では会合している成分には会合せず、（２）同じ種に由来する他のタンパク質を含まず、（３）異なる種に由来する細胞によって発現され、及び／又は（４）天然には存在しない、タンパク質、ポリペプチド、又は抗体を指す。したがって、化学合成されるか又はその天然の起源の細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然に会合した成分から「単離」されているだろう。タンパク質はまた、当技術分野において周知であるタンパク質精製技術を使用して、単離によって、天然に会合した成分を実質的に含まないようにさせることができる。

「親和性」という用語は、抗原と抗体との間の誘引の尺度を指す。抗原に対する抗体の内在引力は典型的には、特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（Ｋ_Ｄ）として表現される。抗体は、結合のＫ_Ｄが、１μM以下、例えば１００nM以下又は１０nM以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。Ｋ_Ｄ結合親和性定数は、例えば、IBIS Technologies社のIBIS MX96 SPRシステム若しくはCarterra LSA SPRプラットフォームを使用した表面プラズモン共鳴（ビアコア（商標））によって、又は例えばフォルテバイオ社のOctet（商標）システムを使用したバイオレイヤー干渉法によって測定され得る。

本明細書において使用する「エピトープ」という用語は、二重特異的結合分子などの、抗体又は関連分子に特異的に結合する、抗原の部分（決定基）を指す。エピトープ決定基は一般的には、アミノ酸又は糖鎖又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子基からなり、一般的には、特定の３次元構造特徴、並びに、特定の荷電の特徴を有する。エピトープは、「鎖状」であっても、又は「立体構造的」であってもよい。鎖状エピトープでは、タンパク質（例えば抗原）と相互作用性分子（例えば抗体）の間の全ての相互作用点は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線上に存在する。立体構造的エピトープでは、相互作用点は、一次アミノ酸配列内で互いに離れている、タンパク質上のアミノ酸残基間に存在する。一旦、抗原上の所望のエピトープが決定されたら、当技術分野において周知である技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を作成することが可能である。例えば、鎖状エピトープに対する抗体は、例えば、動物を、鎖状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドを用いて免疫化することによって作製され得る。立体構造的エピトープに対する抗体は、例えば、動物を、立体構造的エピトープの関連するアミノ酸残基を含有しているミニドメインを用いて免疫化することによって作製され得る。特定のエピトープに対する抗体はまた、例えば、動物を、関心対象の標的分子（例えばＮＫＧ２Ａ）又はその関連部分を用いて免疫化し、その後、エピトープに対する結合についてスクリーニングすることによって作製され得る。

抗体が、競合アッセイ、エピトープビニング、及びアラニン走査を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知である方法を使用することによって、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれとの結合について競合するかどうかを決定することができる。いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、飽和条件下でＮＫＧ２Ａに結合することを可能とし、その後、試験抗体がＮＫＧ２Ａに結合する能力を測定する。試験抗体がリファレンス抗ＮＫＧ２Ａ抗体と同時にＮＫＧ２Ａに結合することができる場合、試験抗体は、リファレンス抗ＮＫＧ２Ａ抗体とは異なるエピトープに結合している。しかしながら、試験抗体が同時にＮＫＧ２Ａに結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重なっているエピトープ、又は本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体に結合するエピトープに近接するエピトープに結合している。この実験は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ビアコア（商標）、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はフローサイトメトリーを使用して実施され得る。抗ＮＫＧ２Ａ抗体が別の抗ＮＫＧ２Ａ抗体と交差競合するかどうかを試験するために、上記の競合法を２つの方向で使用し得、すなわち、公知の抗体が、試験抗体を遮断するか及びその逆かを決定し得る。このような交差競合実験は、例えば、IBIS MX96又はCarterra LSA表面プラズモン共鳴機器又はＯｃｔｅｔ（商標）システムを使用して実施され得る。

「ヒト抗体」という用語は、可変ドメイン及び定常領域の配列が、ヒト配列に由来する、抗体を指す。該用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、免疫原性を低減させるために、親和性を増加させるために、及び／又は安定性を増加させるために改変されている、配列を有する抗体を包含する。さらに、該用語は、ヒト細胞に典型的ではないグリコシル化を付与し得る、非ヒト細胞において組換え産生された抗体を包含する。該用語はまた、ヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト生物（例えばＯｍｎｉラット（登録商標）ラット）において産生された抗体も包含する。

本明細書において使用する抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばヒトＮＫＧ２Ａ又はその部分）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の部分又は断片を指す。完全長の抗体の特定の断片は、該抗体の抗原結合機能を遂行することができることが示されている。「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１のドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含んでいる二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；及び（ｖｉ）抗原に特異的に結合することのできる単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらを、ＶＬドメインとＶＨドメインが対を形成することにより一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている）、単一のタンパク質の鎖として作製されることを可能とする合成リンカーによって、組換え法を使用して接続させることができる。本開示内には、ＶＨ及び／又はＶＬを含んでいる、抗原結合分子もある。ＶＨの場合、該分子はまた、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、又はＣＨ３領域の中の１つ以上も含み得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることを意図する。他の形態の一本鎖抗体、例えばディアボディも包含される。ディアボディは、二価で二重特異的な抗体であり、ここでのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、一本のポリペプチド鎖上で、同じ鎖上の２つのドメインの間に対を形成することを可能とするには短すぎ、これによりドメインが別の鎖の相補性ドメインと対を形成することを強制し、２つの抗原結合部位を作り出すリンカーを使用して、発現される。

抗体部分、例えばＦａｂ断片及びＦ（ａｂ′）_２断片は、完全抗体のパパイン又はペプシンによる消化などの、従来の技術を使用して、完全抗体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分、及びイムノアドヘシン分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば本明細書において記載されているような技術を使用して得ることができる。

抗ＮＫＧ２Ａ抗体のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは、当技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一般的には、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに特異的である、抗体を使用して決定され得る。このような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット並びに他の技術によって決定され得る。あるいは、クラス及びサブクラスは、該抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の全部又は部分をシークエンスし、それらのアミノ酸配列を、免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、該抗体のクラス及びサブクラスを決定することによって決定され得る。

特記されない限り、本開示に言及された全ての抗体のアミノ酸残基の番号は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けスキーム（ＥＵ番号付け）下のものである。

抗ＮＫＧ２Ａ抗体
本開示は、ＮＫＧ２Ａに対して指向される抗体及びその抗原結合部分を提供する。特定の態様では、本明細書において開示される抗体は、再編成されたヒト抗体遺伝子によってコードされる抗体を産生することのできる、トランスジェニック動物（例えばラット）から生成されるヒト抗体である。特定の実施態様では、ヒト抗体は、例えば、プライマー由来の突然変異を生殖系列配列へと戻す、特定の突然変異を含有し得る（例えば、表１の「シンプレックス修正された」変異配列を参照）。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、Ｆｃ領域内に「ＬＡＬＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を有する。これらの突然変異は、抗体のヒトＦｃγＲ（Ｆｃガンマ受容体）への結合を妨害する。このような抗体は有利である。なぜなら、それらは低いレベルの二次エフェクター機能を有し、よって、エフェクターＴ細胞を枯渇させないか、又は他の非悪性腫瘍に標的化しないからである。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＮＫＧ２Ａへの結合について、
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）と、配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖
を含んでいる抗体と競合若しくは交差競合するか、又は前記を含んでいる抗体と同じヒトＮＫＧ２Ａのエピトープに結合する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、又は５７の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ配列番号５～７、１５～１７、２５～２７、３５～３７、４５～４７、又は５５～５７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖ＣＤＲ１－３（Ｈ－ＣＤＲ１－３）を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨを有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＶＨアミノ酸配列、及び、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖定常領域アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のＶＨアミノ酸配列、及び、配列番号６１のアミノ酸配列の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、又は６０の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ配列番号８～１０、１８～２０、２８～３０、３８～４０、４８～５０、又は５８～６０のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖ＣＤＲ１－３（Ｌ－ＣＤＲ１－３）を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬを有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＶＬアミノ酸配列；及び、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のＶＬアミノ酸配列、及び配列番号６２の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。

特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、上記の重鎖のいずれか１つと、上記の軽鎖のいずれか１つを含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、
ａ）それぞれ配列番号５～１０；
ｂ）それぞれ配列番号１５～２０；
ｃ）それぞれ配列番号２５～３０；
ｄ）それぞれ配列番号３５～４０；
ｅ）それぞれ配列番号４５～５０；又は
ｆ）それぞれ配列番号５５～６０
のＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である（例えば９０％同一である）ＶＨ及びＶＬを含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、
ａ）それぞれ配列番号３及び４；
ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
のアミノ酸配列を含む、ＶＨ及びＶＬを含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、
ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）と、配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；又は
ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖
を含む。

本開示はまた、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、又は２４１３５と結合について競合若しくは交差競合するか、又はそれと同じエピトープと結合する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を提供する。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、又は２４１３５のＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、又は２４１３５のＶＨ及びＶＬに対して、アミノ酸配列において少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＶＨ及びＶＬを含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、それぞれ抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、又は２４１３５のＶＨ及びＶＬである、ＶＨ及びＶＬを含む。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、若しくは２４１３５であるか、又は該抗体と同じアミノ酸配列を有する抗体である。

本明細書に記載の方法によって得られた抗ＮＫＧ２Ａ抗体のクラスは変化しても、又は別のクラス若しくはサブクラスと切り替えられてもよい。本開示のいくつかの実施態様では、ＶＬ又はＶＨをコードしている核酸分子は、当技術分野において周知である方法を使用して単離され、よって、それは、それぞれＣＬ又はＣＨをコードしている核酸配列を含まない。その後、ＶＬ又はＶＨをコードしている核酸分子は、異なるクラスの免疫グロブリン分子に由来する、ＣＬ又はＣＨをそれぞれコードしている、核酸配列に作動可能に連結される。これは、上記のようなＣＬ配列又はＣＨ配列を含む、ベクター又は核酸分子を使用して達成され得る。例えば、元来ＩｇＭであった抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＩｇＧへとクラススイッチされてもよい。さらに、クラススイッチを使用して、あるＩｇＧサブクラスを、別のサブクラスへと、例えばＩｇＧ_１からＩｇＧ_２へと変換してもよい。κ軽鎖定常領域は、例えば、γ軽鎖定常領域に変化させても、又はその逆でもよい。所望のＩｇアイソタイプを有する本開示の抗体を産生するための例示的な方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖をコードしている核酸分子及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖をコードしている核酸分子を単離する工程、重鎖の可変ドメインを得る工程、重鎖の可変ドメインのコード配列を、所望のアイソタイプの重鎖の定常領域のコード配列とライゲートする工程、細胞内のライゲートされた配列によってコードされる軽鎖及び重鎖を発現させる工程、並びに所望のアイソタイプを有する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を収集する工程を含む。

本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤ分子であり得るが、典型的には、例えばＩｇＧサブクラスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２ａ、又はＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４のＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施態様では、該抗体は、アイソタイプサブクラスＩｇＧ_１である。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、Ｆｃ領域内に少なくとも１つの突然変異を含み得る。多くの異なるＦｃ突然変異が公知であり、これらの突然変異は、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、エフェクター機能を低減させる、Ｆｃ領域内の少なくとも１つの突然変異、例えば、２２８、２３３、２３４及び２３５の位置の１つ以上における突然変異を含み、ここでのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け体系に従って番号が付される。

いくつかの実施態様では、例えば、該抗体がＩｇＧ_１サブクラスである場合、２３４位及び２３５位のアミノ酸残基の一方又は両方が、例えばロイシンからアラニン（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）に突然変異していてもよい。これらの突然変異は、ＩｇＧ_１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低減させる。アミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け体系に従って番号が付される。

いくつかの実施態様では、例えば、該抗体がＩｇＧ_４サブクラスである場合、それは、突然変異Ｓ２２８Ｐを含み得、ここではアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け体系に従って番号が付される。この突然変異は、望ましくないＦａｂアームの交換を低減させることが知られている。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、アンタゴニスト作用性である。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴によって測定されるような、１５、１０、７、５、４、３、２、又は１nM以下のＫ_ＤでヒトＮＧＫ２Ａに結合する。いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、それがヒトＮＫＧ２Ｃに結合するＫ_Ｄよりも少なくとも４０、３０、２０、１０、又は５倍低いＫ_Ｄで、ヒトＮＧＫ２Ａに結合する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＮＫＧ２Ｃ、カニクイザルＮＫＧ２Ａ、カニクイザルＮＫＧ２Ｃ、又はその任意の組み合わせに特異的に結合しないか、又は非常に僅かしか結合しない。いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、ヒトＮＫＧ２Ｃ、カニクイザルＮＫＧ２Ａ、カニクイザルＮＫＧ２Ｃ、又はその任意の組合せに特異的に結合する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、例えば３０μg/mL、２０μg/mL、１０μg/mL、５μg/mL、１μg/mL、５００ng/mL、２５０ng/mL、１００ng/mL、５０ng/mL、２５ng/mL、１０ng/mL、５ng/mL、１ng/mL、又は０．５ng/mL、又はそれ以下の濃度で、ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａに結合する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、例えば、１０μg/mL、３μg/mL、１μg/mL、０．４μg/mL、０．１μg/mL、４０ng/mL、１４ng/mL又はそれ以下の濃度で、ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４ヘテロ二量体に対する、ＨＬＡ－Ｅの結合を遮断する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、例えば、５０μg/mL、２５μg/mL、１２．５μg/mL、６．２５μg/mL、３．１μg/mL、１．７μg/mL、０．８５μg/mL、又は０．４１μg/mL、又はそれ以下の濃度で、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のＮＫ－９２細胞により媒介される殺滅を増強する。特定の実施態様では、例えば、該濃度の１つにおいて、殺滅は、未処置細胞と比較して、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００％又はそれ以上増強される。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、モナリズマブよりも効率的に、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のＮＫ－９２細胞により媒介される殺滅を増強する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、例えば、５０μg/mL、２５μg/mL、１２．５μg/mL、６．２５μg/mL、３．１μg/mL、１．７μg/mL、０．８５μg/mL、又は０．４１μg/mL、又はそれ以下の濃度で、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞の初代ＮＫ細胞により媒介される殺滅を増強する。特定の実施態様では、例えば、該濃度の１つにおいて、殺滅は、未処置細胞と比較して、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００％又はそれ以上増強される。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、モナリズマブ、ＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．９及び／又はＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．１１よりも効率的に、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞の初代ＮＫ細胞により媒介される殺滅を増強する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、例えば、５０μg/mL、２５μg/mL、１２．５μg/mL、６．２５μg/mL、３．１μg/mL、１．７μg/mL、０．８５μg/mL、又は０．４１μg/mL、又はそれ以下の濃度で、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のγδＴ細胞により媒介される殺滅を増強する。特定の実施態様では、例えば、該濃度の１つにおいて、殺滅は、未処置細胞と比較して、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００％、又はそれ以上増強される。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、モナリズマブよりも効率的に、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のγδＴ細胞により媒介される殺滅を増強する。

いくつかの実施態様では、ヒトＮＫＧ２Ａに対する抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の結合は、ヒトＮＫＧ２Ａの残基Ｓ１７０（場合によりＳ１６７及び／又はＩ１６８と組合せて）又は残基Ｅ１９７に依存する。

いくつかの実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、アミノ酸残基Ｓ１７０を含んでいるヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープに結合する。特定の実施態様では、該エピトープはさらに、アミノ酸残基Ｓ１６７及びＩ１６８を含む。いくつかの実施態様では、該エピトープ（これはアミノ酸残基Ｓ１６７、Ｉ１６８、及び／又はＳ１７０を含み得る）は、アミノ酸残基Ｅ１７９及び／又はＭ１８９を含まない。

本開示はまた、上記特性のいずれかの組合せを有する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分も考える。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、以下の特性の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、又は９つ全て）を有する：
ａ）表面プラズモン共鳴によって測定されるような、１５nM以下のＫ_Ｄで、ヒトＮＫＧ２Ａに結合する；
ｂ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａに結合する；
ｃ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４ヘテロ二量体に対するＨＬＡ－Ｅの結合を遮断する；
ｄ）ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のＮＫ－９２細胞により媒介される殺滅を増強する；
ｅ）ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞の初代ＮＫ細胞により媒介される殺滅を増強する；
ｆ）ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞のγδＴ細胞により媒介される殺滅を増強する；
ｇ）モナリズマブとは異なるヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープに結合する；
ｈ）ＨＴ－２９、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ａ２５３、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＣＡＬ－１２０及び／又はＦａＤｕ細胞の初代ＮＫ細胞により媒介される殺滅を増強する；及び
ｉ）ＭＩＰ－１βの分泌を誘導する。例えば、特定の実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、ａ）～ｆ）、ａ）～ｅ）、ａ）～ｇ）、ａ）～ｉ）、又はａ）～ｅ）及びｇ）の特性を有し得る。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、患者におけるＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の活性を増強し得る。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、インビボで、腫瘍増殖を阻害し得る、及び／又は腫瘍増殖の退縮を誘導し得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、癌患者における転移を減速し得るか又は逆行させ得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、癌患者の生存期間を延長し得る。上記特性のいずれかの組合せも考えられる。

特定の実施態様では、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と、１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的な又は非共有結合的な会合によって形成された、より大きなイムノアドヘシン分子の一部であってもよい。このようなイムノアドヘシン分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)）、並びに、二価でビオチニル化されたｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)）が挙げられる。他の例は、抗体に由来する１つ以上のＣＤＲが、共有結合的に又は非共有結合的にのいずれかで取り込まれることにより、それを、関心対象の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシン分子とする場合を含む。このような実施態様では、ＣＤＲ（群）は、より大きなポリペプチド鎖の一部として取り込まれ得るか、別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結され得るか、又は非共有結合的に取り込まれ得る。

別の態様では、別のポリペプチドに連結された本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の全部又は一部を含む、融合抗体又はイムノアドヘシンが作製され得る。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の可変ドメインのみが、ポリペプチドに連結される。特定の実施態様では、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のＶＨドメインは、第一のポリペプチドに連結されるが、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のＶＬドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるように、第一のポリペプチドと会合している第二のポリペプチドに連結されている。いくつかの実施態様では、ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによってＶＬドメインとは隔てられている（例えば一本鎖抗体）。その後、ＶＨ－リンカーーＶＬ抗体は、関心対象のポリペプチドに連結される。さらに、２つ（又はそれ以上）の一本鎖抗体が互いに連結されている、融合抗体が作製され得る。単一のポリペプチド鎖上に二価又は多価の抗体を作製したい場合、又は二重特異的抗体を作製したい場合には、これは有用である。

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードしているＤＮＡ断片は、可動性リンカーをコードしている、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ_４－Ｓｅｒ）_３（配列番号６４）をコードしている、別の断片に作動可能に連結され、これによりＶＨ配列及びＶＬ配列は、連続した一本鎖タンパク質として発現され得、ＶＬドメインとＶＨドメインは可動性リンカーによって接続されている。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及びMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照。一本鎖抗体は、たった１つのＶＨ及びＶＬが使用される場合には一価であり得るか；２つのＶＨ及びＶＬが使用される場合には二値であり得るか；又は２つを超えるＶＨ及びＶＬが使用される場合には多価であり得る。例えばヒトＮＫＧ２Ａ及び別の分子に特異的に結合する、二重特異的抗体又は多価抗体が作製されてもよい。

他の実施態様では、他の修飾された抗体が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体をコードしている核酸分子を使用して調製され得る。例えば、「カッパボディーズ」（Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)）、「ミニボディーズ」（Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)）、「ディアボディーズ」（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)）、又は「ヤヌシン（Janusins）」（Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)及びTraunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)）は、明細書の教義に従って、標準的な分子生物学的技術を使用して調製され得る。

本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分は、誘導体化され得るか、又は別の分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結され得る。一般的には、抗体又はその部分は、ＮＫＧ２Ａの結合が誘導体化又は標識化によって悪影響を受けないように誘導体化される。したがって、本開示の抗体及び抗体部分は、インタクト形又は修飾形の両方の本明細書に記載のヒト抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含むことを意図する。例えば、本開示の抗体又は抗体部分は、別の抗体（例えば二重特異的抗体又はディアボディ）、検出剤、医薬剤、及び／又は、抗体若しくは抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介し得るタンパク質若しくはペプチドなどの、１つ以上の他の分子実体に（化学結合、遺伝子的融合、非共有結合的会合又は別の方法によって）機能的に連結されていてもよい。

１種類の誘導体化抗体は、２つ以上の抗体（同じ種類のもの、又は例えば二重特異的抗体を作製するための異なる種類のもの）を架橋することによって生成される。適切な架橋剤は、適切なスペーサー（例えばｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって隔てられた２つの別個の反応性基を有するヘテロ二官能基性であるもの、又はホモ二官能基性であるもの（例えばジスクシンイミジルスベレート）を含む。このようなリンカーは、例えばピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州から入手可能である。

抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基若しくはエチル基、又は糖鎖基などの化学基で誘導体化されていてもよい。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するために、例えば血清中半減期を延長させるために有用であり得る。

本開示に記載の抗体又は抗原結合部分はまた標識されていてもよい。本明細書において使用する「標識」又は「標識された」という用語は、抗体内への別の分子の取り込みを指す。いくつかの実施態様では、標識は、検出可能なマーカー、例えば放射標識されたアミノ酸の取り込み、又は印を付けられたアビジンによって検出することのできるビオニチル部分のポリペプチドへの付着である（例えば蛍光マーカーを含有しているストレプトアビジン、又は光学的方法若しくは比色定量法によって検出することのできる酵素活性）。いくつかの実施態様では、標識又はマーカーは、治療剤、例えば薬物コンジュゲート又は毒素である。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法は当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタノイド、リン光体）、酵素標識（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁気物質、例えばガドリニウムキレート剤、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにその類似体又は相同体。いくつかの実施態様では、標識には、立体障害の可能性を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームが付着している。

いくつかの実施態様では、本開示に記載の抗体又は抗原結合部分は、細胞障害性薬剤にコンジュゲートさせることにより、イムノコンジュゲートを形成し得る。いくつかの実施態様では、本開示に記載の抗体又は抗原結合部分は、放射性同位体にコンジュゲートされ得る。

特定の実施態様では、本開示の抗体は、中性形で存在しても（双性イオン性形を含む）、又は正に荷電若しくは負に荷電した種として存在してもよい。いくつかの実施態様では、抗体は、対抗イオンと複合体を形成することにより、医薬的に許容される塩を形成し得る。

抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物
本開示はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を含む、組合せ療法（例えば組成物）も提供する。特定の実施態様では、組合せ療法（例えば組成物）は、２つの抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分を含む。組合せ療法は、例えば、該抗体若しくは抗原結合部分、又は該抗体若しくは抗原結合部分を含んでいる医薬組成物を使用した、処置法の形を取り得る。

いくつかの実施態様では、本開示は，第一の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分と第二の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を含んでいる組成物を提供し、ここでの第一及び第二の抗体は、
－それぞれ抗体２３７６５及び２３６８６；
－それぞれ抗体２３７６５及び２４２０８；
－それぞれ抗体２３７６５及び２３５６６；
－それぞれ抗体２３７６５及び２３９２５；
－それぞれ抗体２３７６５及び２４１３５；
－それぞれ抗体２３６８６及び２４２０８；
－それぞれ抗体２４６８６及び２３５６６；
－それぞれ抗体２３６８６及び２３９２５；
－それぞれ抗体２３６８６及び２４１３５；
－それぞれ抗体２４２０８及び２３５６６；
－それぞれ抗体２４２０８及び２３９２５；
－それぞれ抗体２４２０８及び２４１３５；
－それぞれ抗体２３５６６及び２３９２５；
－それぞれ抗体２３５６６及び２４１３５；又は
－それぞれ抗体２３９２５及び２４１３５である。

いくつかの実施態様では、前記組成物は、前記の第一の抗体及び第二の抗体と同じエピトープに結合するか、又は前記の第一の抗体及び第二の抗体と結合について競合する、抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの実施態様では、前記組成物は、前記の第一の抗体のＨ－ＣＤＲ１－３アミノ酸配列とＬ－ＣＤＲ１－３アミノ酸配列とを含む抗体又はその抗原結合部分、及び、前記の第二の抗体のＨ－ＣＤＲ１－３アミノ酸配列とＬ－ＣＤＲ１－３アミノ酸配列とを含む抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの実施態様では、前記組成物は、前記の第一の抗体のそれぞれＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合部分、並びに、前記の第二の抗体のそれぞれＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの実施態様では、前記組成物は、前記の第一の抗体のＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分、並びに、前記の第二の抗体のＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの実施態様では、前記組成物は、前記の第一の抗体のＨＣアミノ酸配列及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分、並びに、前記の第二の抗体のＨＣアミノ酸配列及びＬＣアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合部分を含む。

特定の実施態様では、前記組成物は、
ａ）それぞれ配列番号５～７、１５～１７、２５～２７、３５～３７、４５～４７、又は５５～５７のアミノ酸配列を含む、Ｈ－ＣＤＲ１－３を含む抗体；
ｂ）そのＶＨが配列において、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、抗体；
ｃ）そのＶＨが、配列番号３、１３、２３、３３、４３、又は５３のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｄ）そのＨＣが、配列番号３及び６１、１３及び６１、２３及び６１、３３及び６１、４３及び６１、又は５３及び６１のアミノ酸配列を含む、抗体；
ｅ）それぞれ配列番号８～１０、１８～２０、２８～３０、３８～４０、４８～５０、又は５８～６０のアミノ酸配列を含む、Ｌ－ＣＤＲ１－３を含んでいる抗体；
ｆ）そのＶＬが配列において、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である抗体；
ｇ）そのＶＬが、配列番号４、１４、２４、３４、４４、又は５４のアミノ酸配列を含む抗体；
ｈ）そのＬＣが、配列番号４及び６２、１４及び６２、２４及び６２、３４及び６２、４４及び６２、又は５４及び６２のアミノ酸配列を含む抗体；
ｉ）そのＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３がそれぞれ配列番号５～１０、１５～２０、２５～３０、３５～４０、４５～５０、又は５５～６０のアミノ酸配列を含む抗体；
ｊ）それぞれアミノ酸配列３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＶＨ及びＶＬを含んでいる抗体；
ｋ）それぞれアミノ酸配列３及び４、１３及び１４、２３及び２４、３３及び３４、４３及び４４、又は５３及び５４のアミノ酸配列を含む、ＶＨ及びＶＬを含んでいる抗体；及び
ｌ）それぞれ３及び６１、並びに４及び６２；１３及び６１、並びに１４及び６２；２３及び６１、並びに２４及び６２；３３及び６１、並びに３４及び６２；４３及び６１、並びに４４及び６２；又は５３及び６１、並びに５４及び６２のアミノ酸配列を含む、ＨＣ及びＬＣを含んでいる抗体
からなる群より選択される、１つ、２つ又はそれ以上の抗体又はその抗原結合部分を含み得る。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物は、インビボで、腫瘍増殖を阻害し得る、及び／又は腫瘍の退縮を誘導し得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物は、癌患者における転移を減速し得るか又は逆行させ得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物は、癌患者の生存期間を延長し得る。

本開示はまた、第一の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分及び第二の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分を準備する工程、そして２つの抗体又は部分を混合する工程を含む、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物を生成するための方法も提供する。

二重特異的結合分子
本開示はまた、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の結合特異性を有する（例えば、抗原結合部分、例えばＶＨ及びＶＬの６つのＣＤＲを含んでいる）二重特異的結合分子も提供する。いくつかの実施態様では、二重特異的結合分子はさらに、別の別個の抗ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば本明細書に記載の別の抗ＮＫＧ２Ａ抗体）、又は、その活性が癌などの疾患容態を媒介する癌抗原若しくは別の細胞表面分子などの異なるタンパク質に標的化する抗体への結合特異性を有する。このような二重特異的結合分子は当技術分野において公知であり、様々な種類の二重特異的結合分子の例が本明細書の何処かに示されている。

核酸分子及びベクター
本開示はまた、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分をコードしている核酸分子及び配列も提供する。いくつかの実施態様では、様々な核酸分子が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードしている。他の実施態様では、同じ核酸分子が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードしている。

ヌクレオチド配列への言及は、特記されない限り、その相補体も包含する。したがって、特定の配列を有している核酸への言及は、その相補配列を有するその相補鎖も包含すると理解されるべきである。本明細書に言及されるような「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のポリマー形のヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又は修飾形のいずれかの種類のヌクレオチドを意味する。該用語は、一本鎖又は二本鎖の形態を含む。

いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分の、重鎖若しくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、又は軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、又はその両方を含んでいる、核酸分子を提供する。

本開示はまた、本明細書に列挙された１つ以上のヌクレオチド配列に対して、例えば、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１、及び５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して、又は配列番号３、４、１３、１４、２３、２４、３３、３４、４３、４４、５３及び５４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一である、ヌクレオチド配列も提供する。核酸配列の脈絡における「配列同一率」という用語は、最大限対応するように整列させた場合に同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一率を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常では少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８又はそれ以上のヌクレオチドの区間にかけてであり得る。ヌクレオチド配列の同一率の測定に使用することのできる、多くの異なるアルゴリズムが当技術分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較され得、これはウィスコンシンパッケージバージョン１０．０、Genetics Computer Group（ＧＣＧ）、マジソン、ウィスコンシン州におけるプログラムである。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３を含む、ＦＡＳＴＡは、質問配列と検索配列の間で最善に重複する領域のアラインメント及び配列同一率を提供する（例えば、Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996)；及びPearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)参照；参照により本明細書に組み入れられる）。特記されない限り、特定のプログラム又はアルゴリズムについてのデフォールパラメーターが使用される。例えば、核酸配列間の配列同一率は、ＦＡＳＴＡとそのデフォールトパラメーター（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ計数）を使用して、又は参照により本明細書に組み入れられるＧＣＧバージョン６．１に提供されているようなＧａｐとそのデフォールトパラメーターを使用して決定され得る。

いくつかの実施態様では、本開示は、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１及び５２からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子を提供する。特定の実施態様では、核酸分子は、配列番号１及び２、１１および１２、２１及び２２、３１及び３２、４１及び４２、又は５１及び５２のヌクレオチド配列を含む。

上記のいずれかの実施態様では、核酸分子は単離されてもよい。本明細書において「単離された」又は「精製された」と言及される核酸分子は、（１）その入手源のゲノムＤＮＡ若しくは細胞内ＲＮＡの核酸から分離されている；及び／又は、（２）天然には存在しない、核酸である。

さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載のような抗体又はその抗原結合部分の一方又は両方の鎖を発現するのに適したベクターを提供する。本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することのできる、核酸分子を意味する。いくつかの実施態様では、ベクターはプラスミド、すなわち、環状二本鎖のＤＮＡ片であり、その中に、追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている、遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。

本開示は、本明細書に記載のような抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分の重鎖、軽鎖、又は重鎖と軽鎖の両方をコードしている、核酸分子を含んでいる、ベクターを提供する。特定の実施態様では、本開示のベクターは、本明細書に記載の核酸分子を含む。本開示はさらに、融合タンパク質、修飾された抗体、抗体断片、及びそのプローブをコードしている核酸分子を含んでいるベクターを提供する。該ベクターはさらに、発現制御配列を含み得る。

本明細書において使用する「発現制御配列」という用語は、ライゲートされているコード配列の発現及びプロセシングを起こすに必要とされる、ポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル；細胞質内ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわちコザック共通配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；並びに、所望であれば、タンパク質の分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主の生物に応じて異なり；原核生物では、このような制御配列は一般的には、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み；真核生物では、一般的には、このような制御配列は、プロモーター配列及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、最低限でも、その存在が発現及びプロセシングに必須である全ての成分を含むことを意図し；その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合対配列も含み得る。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載のような核酸分子は、任意の入手源に由来する重鎖定常領域をコードしているヌクレオチド配列にインフレームで接続された、本明細書に記載のような抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分に由来するＶＨドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む。同様に、本明細書に記載のような核酸分子は、任意の入手源に由来する軽鎖定常領域をコードしているヌクレオチド配列にインフレームで接続された、本明細書に記載のような抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分に由来するＶＬドメインをコードしているヌクレオチド配列を含み得る。

本開示のさらなる態様では、ＶＨ及び／又はＶＬをコードしている核酸分子は、完全長の抗体遺伝子へと「変換」され得る。いくつかの実施態様では、ＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードしている核酸分子は、それぞれ重鎖定常（ＣＨ）領域又は軽鎖定常（ＣＬ）領域をすでにコードしている発現ベクターへの挿入により、ＶＨセグメントが、ベクター内でＣＨセグメント（群）に作動可能に連結され、及び／又は、ＶＬセグメントがベクター内でＣＬセグメントに作動可能に連結されることにより完全長の抗体遺伝子へと変換される。別の態様では、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードしている核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を使用して、例えば、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードしている核酸分子を、ＣＨ領域及び／又はＣＬ領域をコードしている核酸分子に連結することによって、完全長の抗体遺伝子へと変換される。その後、完全長の重鎖及び／又は軽鎖をコードしている核酸分子は、それらが導入されている細胞から発現され得、抗ＮＫＧ２Ａ抗体が単離され得る。

いくつかの実施態様では、フレームワーク領域（群）は、結果として得られるフレームワーク領域（群）が対応する生殖系列の遺伝子のアミノ酸配列を有するように突然変異されている。突然変異は、例えば抗ＮＫＧ２Ａ抗体の半減期を延長するために、フレームワーク領域又は定常領域内に行なわれ得る。例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ００／０９５６０号を参照されたい。フレームワーク領域又は定常領域内の突然変異は、抗体の免疫原性を変化させるために、及び／又は、別の分子に対する共有結合的若しくは非共有結合的な結合のための部位を提供するために行なわれ得る。本開示によると、抗体は、可変ドメインのいずれかの１つ以上のＣＤＲ領域若しくはフレームワーク領域内に、又は定常領域内に突然変異を有し得る。

宿主細胞、並びに抗体及び抗体組成物の生成法
本開示はまた、本明細書に記載の抗体組成物、並びに抗体及びその抗原結合部分を生成するための方法も提供する。いくつかの実施態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の、重鎖又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、及び軽鎖又はその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる宿主細胞（例えば組換え宿主細胞）を準備する工程；前記宿主細胞を、抗体又は抗原結合部分の発現に適した条件下で培養する工程；及び、結果として得られた抗体又は抗原結合部分を単離する工程を含む、本明細書に記載のような抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分を生成するための方法に関する。このような組換え宿主細胞におけるこのような発現によって産生される抗体又は抗原結合部分は本明細書において、「組換え」抗体又は抗原結合部分と称される。本開示はまた、このような宿主細胞の子孫細胞、並びにそれによって産生された抗体又は抗原結合部分も提供する。

本明細書において使用する「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。定義によると、組換え宿主細胞は、天然には存在しない。本開示は、例えば本明細書に記載のようなベクターを含み得る、宿主細胞を提供する。本開示はまた、例えば、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分の重鎖若しくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、軽鎖若しくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、又は両方を含む、宿主細胞も提供する。「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。特定の修飾が、突然変異又は環境的な影響のいずれかに起因して後続の世代に起こり得るので、このような子孫は事実、親細胞と同一ではない可能性があるが、しかし依然として本明細書において使用する「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

抗ＮＫＧ２Ａ抗体及びその抗原結合部分をコードしている核酸分子、並びにこれらの核酸分子を含んでいるベクターは、適切な哺乳動物、植物、細菌又は酵母宿主細胞のトランスフェクションのために使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の公知の方法により得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入法は、当技術分野において周知であり、これには、デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレンにより媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームへのポリヌクレオチド（群）の封入、及び核内へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入されてもよい。

様々な細胞株によって又はトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有するであろう可能性が高い。しかしながら、本明細書において提供された核酸分子によってコードされるか、又は本明細書において提供されたアミノ酸配列を含んでいる、全ての抗体が、抗体のグリコシル化状態に関係なく、より一般的には、翻訳後修飾（群）の有無に関係なく、本開示の一部である。

医薬組成物
本開示の別の態様は、活性成分として（又は唯一の活性成分として）、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子を含んでいる医薬組成物である。該医薬組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。いくつかの実施態様では、該医薬組成物は、例えば本明細書に記載の癌などの癌の寛解、予防、及び／又は治療に意図される。特定の実施態様では、癌は、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血系、頭頚部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頚部、及び膵臓などの組織内にある。

本開示の医薬組成物は、本開示の１つ以上の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子、例えば１つ又は２つの抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗原結合部分、又は二重特異的結合分子を含むだろう。いくつかの実施態様では、該組成物は、本開示の単一の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を含む。別の態様では、該組成物は、本開示の２つの別個の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を含む。

いくつかの実施態様では、医薬組成物は、本開示の少なくとも１つの抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分、例えば１つの抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は部分、並びに１つ以上の関連した細胞表面受容体、例えば１つ以上の癌関連受容体に標的化する１つ以上の追加の抗体を含み得る。

いくつかの実施態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分、例えば１つの抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は部分、並びに例えば免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生生物剤、抗血管新生剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から選択された１つ以上の追加の薬剤を含み得る。

一般的には、本開示の抗体、抗原結合部分、及び二重特異的結合分子は、例えば以下に記載のような、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（群）と併せて製剤として投与されるに適している。

「賦形剤」という用語は本明細書において、本開示の化合物（群）以外の任意の成分を説明するために使用される。賦形剤（群）の選択は、具体的な投与様式、溶解性及び安定性に対する賦形剤の影響、並びに剤形の性質などの要因に大きく依存するだろう。本明細書において使用する「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性である、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、並びに同様な物質を含む。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びに、その組合せである。多くの場合、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを該組成物に含めることが好ましいだろう。薬学的に許容される物質の追加の例は、湿潤剤又は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、抗体の品質保持期限又は有効性を増強する保存剤又は緩衝剤である。

本開示の医薬組成物及びそれらの調製法は、当業者には容易に明らかであろう。このような組成物及びそれらの調製法は、例えば、レミントン薬科学、第１９版（Mack Publishing Company社、１９９５）に見られ得る。医薬組成物は好ましくは、ＧＭＰ（医薬品の製造管理及び品質管理の基準）条件下で製造される。

本開示の医薬組成物は、１回の単一単位用量として、又は複数回の単一単位用量として調製されても、包装されても、又はバルクで販売されてもよい。本明細書において使用する「単位用量」は、所定量の活性成分を含んでいる個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は一般的には、被検者に投与されるだろう活性成分の用量、又はこのような用量の簡便な分数、例えばこのような用量の半分又は三分の一に等しい。

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は典型的には、滅菌水又は無菌等張食塩水などの、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した剤形で、調製されても、包装されても又は販売されてもよい。注射用製剤は、アンプルなどの単位投与剤形で又は保存剤を含有している多回投与容器で調製されても、包装されても、又は販売されてもよい。非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性又は水性ビヒクル中エマルション、ペースト剤などが挙げられるがこれらに限定されない。このような製剤はさらに、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の追加の成分を含み得る。非経口投与用の製剤のいくつかの実施態様では、活性成分は、復元された組成物の非経口投与前に、適切なビヒクル（例えば無菌で発熱物質非含有の水）を用いて復元するために、乾燥（すなわち粉末又は顆粒）形で提供される。非経口製剤はまた、塩、炭水化物、及び緩衝化剤（好ましくはｐＨ３～９）などの賦形剤を含有し得る水溶液を含むが、いくつかの適用では、それらはより適切には、無菌の非水性溶液として、又は、無菌で発熱物質非含有の水などの適切なビヒクルと併せて使用するための乾燥形として製剤化されてもよい。例示的な非経口投与剤形としては、無菌水溶液、例えば水性プロピレングルコール又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液が挙げられる。このような剤形は、所望であれば、適切に緩衝化されていてもよい。有用である他の非経口的に投与可能な製剤としては、微結晶形又はリポソーム調製物中に活性成分を含むものが挙げられる。

本開示の抗体及び組成物の治療への使用
いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体及びその抗原結合部分、抗ＮＫＧ２Ａ抗体組成物、及び二重特異的結合分子を使用して、例えば、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞又はＴ細胞の活性を増強させることによって、それを必要とする患者（例えばヒトなどの哺乳動物）における免疫系を増強又は活性化する。特定の実施態様では、患者は、免疫抑制されている。特定の実施態様では、医師は、本明細書に記載のような抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子を投与することによって、患者自身の免疫系の抗癌活性をブーストすることができる。例えば、医師は、単独で又は他の治療剤と（連続的に又は同時に）組み合わせて、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子を投与することによって、患者における抗腫瘍活性をブーストすることができる。

特定の実施態様では、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子は、癌の処置に使用するためのものである。癌は、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血系、頭頚部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頚部、及び膵臓などの１つ以上の組織に存在し得る。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗原結合部分、組成物、及び二重特異的結合分子によって処置される癌としては、例えばメラノーマ（例えば進行した又は転移メラノ―マ）、基底細胞皮膚癌、神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、副腎皮質癌、頭頚部扁平上皮細胞癌、口腔癌、唾液腺癌、上咽頭癌、乳癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、及び扁平上皮細胞肺癌）、食道癌、食道胃接合部癌、胃癌、消化器癌、原発性腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、卵管癌、膀胱癌、上部尿路癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、子宮頸癌、前立腺癌、線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、組織球腫、膵臓癌、子宮体癌、虫垂癌、進行メルケル細胞癌、多発性骨髄腫、肉腫、絨毛癌、赤白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肥満細胞白血病、小リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、単球性リンパ腫、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、中皮腫、及び固形腫瘍が挙げられ得る。癌は、例えば、初期段階、中間期段階、後期段階、局所進行段階、又は転移段階であり得、再発性であっても、又は他の治療剤（例えば他の抗ＮＫＧ２Ａ治療剤、又はチェックポイント阻害剤）に対して難治性であっても、又は利用可能な標準的な治療法が存在しなくてもよい。

いくつかの実施態様では、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗原結合部分、組成物、及び二重特異的結合分子によって処置される容態としては、例えば、頭頚部癌、乳癌（例えばＨＥＲ２陽性乳癌）、結腸直腸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、食道癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられ得る。

いくつかの実施態様では、本開示の抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子は、免疫障害の処置に使用するためのものである。

いくつかの実施態様では、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子を使用して、免疫無防備状態（例えば化学療法剤又は放射線療法に因り）であるか、又はそのリスクがある患者を処置し得る。いくつかの実施態様では、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子を使用して、患者において幹細胞の移植後に幹細胞を増幅し得る。

いくつかの実施態様では、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子は、ウイルス感染及び／又は寄生虫感染（例えばここでは病原体が宿主免疫応答を抑制している）の処置に使用するためのものである。病原体は、例えば、免疫不全ウイルス、肝炎（Ａ型、Ｂ型又はＣ型）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、アデノウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、デング熱ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ジョン・カニンガム（ＪＣ）ウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、又は緑膿菌であり得る。

「処置する」、「処置している」及び「処置」は、生物学的障害及び／又はその付随する症状の１つを軽減又は消失する方法を指す。本明細書において使用する疾患、障害又は容態を「軽減する」ことは、該疾患、障害、又は容態の症状の重症度及び／又は発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書における「処置」への言及は、治癒的処置、対症療法的処置、及び予防的処置への言及を含む。

「治療有効量」は、処置される障害の症状の１つ以上をある程度緩和するであろう、投与される治療剤の量を指す。抗癌治療剤の治療有効量は、例えば、遅延した腫瘍の増殖、腫瘍の縮小、延長された生存期間、癌細胞の排除、減速又は低下した疾患の進行、転移の逆行、あるいは保健医療の専門家によって所望される他の臨床上の評価項目をもたらし得る。

本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、単独で、又は１つ以上の他の薬物若しくは抗体と組み合わせて（又はその任意の組合せとして）投与され得る。したがって、本明細書に記載の医薬組成物、方法及び使用は、以下に詳述されているような、他の活性物質との組み合わせ（共投与）の実施態様も包含する。

１つ以上の他の治療剤と共に、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物及び二重特異的結合分子に言及して、本明細書において使用する「共投与」、「共投与された」及び「と組み合わせて」という用語は、以下を意味することを意図し、以下に言及し、そして以下を含む：
ａ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異的結合分子と、治療剤（群）のこのような組み合わせの、処置を必要とする患者への同時投与であって、このような成分が単一の剤形へと一緒に製剤化されると、これは該成分を実質的に同時に該患者に放出する；
ｂ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異的結合分子と、治療剤（群）のこのような組み合わせの、処置を必要とする患者への実質的同時の投与であって、このような成分が互いに離れて別々の剤形へと製剤化され、これが実質的に同時に該患者によって服用されると、そうするとすぐに該成分は、実質的に同時に該患者に放出される；
ｃ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異的結合分子と、治療剤（群）のこのような組み合わせの、処置を必要とする患者への順次投与であって、このような成分が互いに離れて別々の剤形へと製剤化され、これがかなりの時間の投与間隔を置いて該患者によって連続的に服用されると、そうするとすぐに該成分は、該患者に実質的に異なる時間に放出される；及び
ｄ）本開示の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異的結合分子と、治療剤（群）のこのような組み合わせの、処置を必要とする患者への順次投与であって、このような成分が単一の剤形へと一緒に製剤化され、これが該成分を制御された様式で放出し、そうするとすぐにそれらは、該患者に同じ時間に及び／又は異なる時間に、同時に、連続的に、及び／又は重複して放出され、ここでは各々の部分は、同じ経路又は異なる経路のいずれによって投与されてもよい。

本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、追加の治療処置を伴わずに、すなわちスタンドアローン療法（単独療法）として投与されてもよい。あるいは、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的分子を用いての処置は、少なくとも１つの追加の治療処置（組合せ療法）、例えば別の免疫刺激剤、抗癌剤（例えば化学療法剤、抗新生生物剤、抗血管新生剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤）又はワクチン（例えば腫瘍ワクチン）を含んでいてもよい。

いくつかの実施態様では、抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、癌の処置のための別の医薬／薬物と共投与又は製剤化されてもよい。追加の治療処置は、例えば免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び／又は放射線療法を含み得る。いくつかの実施態様では、追加の治療処置は、異なる抗癌抗体を含み得る。

本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子と少なくとも１つの他の薬剤（例えば化学療法剤、抗新生生物剤、又は抗血管新生剤）とを含んでいる医薬品は、癌治療において同時投与、別々の投与、又は連続的な投与のための組合せ処置として使用されてもよい。他の薬剤は、問題の特定の癌の処置に適した任意の薬剤、例えば、アルキル化剤、例えば白金誘導体、例えばシスプラチン、カルボプラチン、及び／又はオキサリプラチン；植物アルカロイド、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、及び／又はイリノテカン；抗腫瘍性抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、及び／又はマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカン；代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル及び／又は他のフッ化ピリミジン；ＦＯＬＦＯＸ；オシメルチニブ；シクロホスファミド；アントラサイクリン；ダカルバジン；ゲムシタビン；あるいは、その任意の組合せからなる群より選択された、薬剤であり得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、他の薬剤に対する応答性を再確立する。

本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、ワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤、免疫刺激性化合物、及びＴ細胞療法などの他の抗癌療法と組み合わせて使用されてもよい。ワクチンの場合、それは例えば、処置される癌に関連のある１つ以上の抗原を含有している、タンパク質、ペプチド、若しくはＤＮＡのワクチン、又は抗原と一緒に樹状細胞を含んでいるワクチンであり得る。適切なサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－２、インターフェロン－γ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が挙げられる。抗癌活性を有する一種類の酵素阻害剤の一例は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴ）である。また、養子Ｔ細胞療法も考えられ、これは患者自身のＴ細胞を増幅又は工学操作して、患者の腫瘍を認識及び攻撃することを含む、様々な免疫療法技術を指す。

また、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、チロシンキナーゼ阻害剤と共に、補助療法において使用されてもよいことも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、例えば細胞内Ｍｇ－ＡＴＰ結合部位と競合することによって、リガンド誘導受容体リン酸化を阻害する、合成された、主にキナゾリン由来の、低分子量の分子である。

いくつかの実施態様では、抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、Ａ２ＡＲ、Ａ１ＡＲ、Ａ２ＢＲ、Ａ３ＡＲ、ＡＤＡ、ＡＬＰ、ＡＸＬ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１１６、ＣＤ１２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えばＣＥＡＣＡＭ－１及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２ＡＬ、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ－３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＭＥＴ、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＰＡＰ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＯＸ４０、ＳＴＩＮＧ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＲ－β、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９及びＴＬＲ１０、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、ＬＩＬＲＢ２、ＣＭＴＭ６及び／又は２Ｂ４の発現又は活性を調節する薬剤を含むがこれらに限定されない、免疫系の活性化を媒介する医薬／薬物と組み合わせて使用され得る。特定の実施態様では、薬剤は、低分子阻害剤である。特定の実施態様では、薬剤は、上記分子の１つに結合する、抗体又はその抗原結合断片である。また、本開示の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、サイトカイン（例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１）、上皮増殖因子受容体阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤などと組み合わせて使用してもよい。

いくつかの実施態様では、抗体若しくはその抗原結合分子、抗体組成物、又は二重特異的結合分子を、トラスツズマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、イブルチニブ、セツキシマブ、アベルマブ、リツキシマブ、マルゲツキシマブ、タファシタマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、デルクステカン、トリフルリジン、チピラシル、トリフルリジン／チピラシル、イリノテカン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ベンダムスチン、ＦＯＬＦＯＸ（ｍＦＯＬＦＯＸ６）、又はその任意の組合せと組み合わせて使用してもよい。

特定の実施態様では、抗体若しくはその抗原結合分子、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、ＣＤ９４の発現若しくは活性を調節する薬剤、ＨＬＡ－Ｅの発現若しくは活性を調節する薬剤、又はその両方と組み合わせて使用してもよい。

本開示はまた、ＣＡＲ－Ｔ技術における使用のためであり得る、キメラ抗原受容体の調製において、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の配列（例えば６つのＣＤＲ配列又はＶＨ配列及びＶＬ配列）の使用も考える。

本開示の抗体及びその抗原結合部分、抗体組成物、並びに二重特異的結合分子は、本明細書に記載のような処置法に使用され得、本明細書に記載のような処置おける使用のためであり得、及び／又は、本明細書に記載のような処置のための医薬品の製造における使用のためであり得ることが理解される。

用量及び投与経路
本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、問題の容態の処置のために有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するのに必要とされる用量及び期間で投与され得る。治療有効量は、処置される具体的な容態、患者の年齢、性別及び体重、並びに抗体がスタンドアローン処置として投与されるか又は１つ以上の追加の抗癌処置と組み合わせて投与されるかなどの要因に応じて変更され得る。

用量の処方計画は、最適な所望の応答をもたらすように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与しても、数回の分割用量を経時的に投与しても、又は用量を、治療状況の緊急性によって指示される通りに比例的に減少又は増加させてもよい。投与し易さ及び用量の均一性のために、用量単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用する用量単位剤形は、処置される予定の患者／被検者にとって単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各々の単位は、必要とされる薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じると計算された所定の量の活性化合物を含有している。本開示の用量単位剤形の詳細は、一般的には、（ａ）治療剤の固有の特徴、及び達成される予定の具体的な治療効果又は予防効果、並びに（ｂ）個体における過敏症の処置のためのこのような活性化合物を配合する技術分野に固有の限界によって指図され、そして直接それに依存する。

したがって、当業者は、本明細書に提供された開示に基づいて、用量及び用量処方計画が治療分野において周知である方法に従って調整されることを理解しているだろう。すなわち、最大耐用用量は容易に確立され得、患者に検出可能な治療利点をもたらす有効量も決定され得、患者に検出可能な治療利点をもたらす各薬剤を投与するための時間的な必要条件も同様に決定され得る。したがって、特定の用量及び投与処方計画が本明細書において例示されているが、これらの実施例は、いずれにしても、本開示を実践する際に患者に提供され得る、用量及び投与処方計画を制限しない。

用量の数値は、軽減しようとする容態の種類及び重症度と共に変更され得、これは１回用量又は複数回の用量を含み得ることを注記する。任意の特定の被検者についての具体的な用量の処方計画は、個々の必要性、及び該組成物の投与者又は投与の監督者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に示される用量範囲は単なる例示であり、具現化された組成物の範囲又は実践を限定する意図はないことをさらに理解されたい。さらに、本開示の組成物を含む用量処方計画は、疾患の種類、患者の年齢、体重、性別、健康状態、容態の重症度、投与経路、及び使用される具体的な抗体を含む、多種多様な要因に基づき得る。したがって、用量処方計画は幅広く変更され得るが、標準的な方法を使用して慣用的に決定することができる。例えば、用量は、薬力学的又は薬物動態的パラメーターに基づいて調整され得、これは毒性作用などの臨床効果及び／又は臨床検査値も含み得る。したがって、本開示は、当業者によって決定されるような患者内での用量漸増を包含する。適切な用量及び処方計画の決定は、関連分野において周知であり、本明細書に開示された教義が一旦提供されれば、当業者によって包含されることを理解するだろう。

腫瘍療法の有効量は、患者における疾患の進行を安定化させる及び／又は症状を寛解させる、好ましくは例えば腫瘍サイズを減少させることによって疾患の進行を逆行させるその能力によって測定され得る。本開示の抗体、抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子が、癌を抑制する能力は、例えば実施例に記載のような、インビトロでのアッセイによって、並びに、ヒト腫瘍における有効性を予測する適切な動物モデルにおいて評価され得る。各々の特定の状況において、例えば１つのボーラスとして投与されるか又は連続的な点滴として投与される状況において、各場合の緊急性によって指図されるような可能な用量の調整をしながら、最適な治療応答をもたらすように、適切な用量処方計画が選択されるだろう。

本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、抗体組成物、又は二重特異的結合分子は、当技術分野において認容されているペプチド、タンパク質、又は抗体の投与のための任意の方法によって投与され得、それは典型的には非経口投与に適している。本明細書において使用する「非経口投与」は、被検者の組織の物理的割れ目及び該組織内の割れ目を通した投与によって特徴付けられる任意の投与経路を含み、よって一般的に結果として、血流に、筋肉内に、又は内臓に直接投与される。よって、非経口投与は、注射による投与、外科的切開を通した適用、組織穿通性の非外科的創傷を通した適用などを含むがこれらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、嚢内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、及び滑膜内への注射又は注入を含むと考えられるがこれらに限定されない。特定の実施態様は、静脈内経路及び皮下経路を含む。

診断使用及び組成物
本開示の抗体及び抗原結合部分はまた、診断プロセスにおいても有用である（例えばインビトロ、生体外）。例えば、抗体及び抗原結合部分を使用して、患者に由来する試料（例えば組織試料、又は体液試料、例えば炎症性滲出物、血液、血清、腸液、唾液、又は尿）中のＮＫＧ２Ａレベルを検出及び／又は測定することができる。適切な検出法及び測定法としては、免疫学的方法、例えばフローサイトメトリー、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫組織化学的検査が挙げられる。本開示はさらに、本明細書に記載の抗体及び抗原結合部分を含んでいるキット（例えば診断キット）を包含する。

製品及びキット
本開示はまた、本明細書に記載の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子の医薬組成物、場合により追加の生物学的に活性な分子（例えば別の治療剤）、及び使用説明書を含有している、１つ以上の容器（例えば使い捨て容器又は複数回使用可能な容器）を含んでいる、製品、例えばキットも提供する。抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子、及び場合により追加の生物学的に活性な分子は、非反応性ガラス又はプラスチックから製造されたバイアル又はアンプルなどの適切な包装に別々に包装され得る。特定の実施態様では、バイアル又はアンプルは、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子、及び場合により生物学的に活性な分子の濃縮ストック（例えば２倍、５倍、１０倍又はそれ以上）を保持する。特定の実施態様では、キットなどの製品は、抗体若しくは抗原結合部分、組成物、又は二重特異的結合分子、及び／又は生物学的に活性な分子の投与のための医療用器具（例えばシリンジ及び針）；並びに／あるいは適切な希釈剤（例えば滅菌水及び通常の食塩水）を含む。本開示はまた、前記の品を製造するための方法も含む。

本明細書において違うと定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するだろう。例示的な方法及び材料は、以下に記載されているが、本明細書に記載のものと類似した又は等価な方法及び材料も、本開示の実践又は試験に使用することができる。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）が規制するだろう。

一般的には、本明細書に記載の細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品化学及び製薬化学、並びにタンパク質及び核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びその技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。酵素反応及び精製技術は、当技術分野において一般的に達成されているような又は本明細書に記載されているような製造業者の仕様書に従って実施される。

さらに、脈絡によって違うものが必要とされない限り、単数形の用語は複数形の用語を含み、複数形の用語は単数形の用語を含む。本明細書及び実施態様の全体を通して、「有する（have）」及び「含む(comprise)」という単語又は「有する（has）」、「有している（having）」、「含む（comprises）」又は「含んでいる（comprising）」などの変化形は、記載の整数又は整数群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数群の排除を意味するものではないと理解されるだろう。

本明細書に記載の全ての刊行物及び他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。多くの文書が本明細書に引用されているが、この引用は、これらのいずれかの文書が、当技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという承認を構成するものではない。

本開示をより良く理解し得るために、以下の実施例が示されている。これらの実施例は、説明のためだけのものであり、いずれにしても本開示の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。

実施例
実施例１．ラットＢ細胞からの抗ＮＫＧ２Ａ抗体のクローニング
材料及び方法
ヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体は、完全ヒトイディオタイプを有する抗体を産生するリガンド・ファーマシュティカルズ社のトランスジェニックラット株である、Ｏｍｎｉラット（登録商標）ラット（Osborn et al., J Immunol. 190(4):1481-90 (2013))に由来する抗体レパートリーから単離された。単一細胞選別された抗体分泌Ｂ細胞（ＡＳＣ）からのラット由来抗体遺伝子のクローニングは、シンプレックス（商標）抗体発見技術によって実施された（Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)）。

ＩｇＧ_１－ＬＡＬＡフォーマット（以下参照）において完全ヒト免疫グロブリンをコードしている抗体レパートリー構築物を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞上清を、ハイスループットフォーマットでフローサイトメトリーを使用して、ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＮＫＧ２Ａへの結合についてスクリーニングした。ＮＫＧ２Ａ反応性クローンは、ＤＮＡシークエンスによって分析され、抗体をコードしているＤＮＡ配列を抽出した。選択された抗体クローンは、以下に記載のように発現されそして機能的に試験された。

抗体をコードしているｃＤＮＡ断片のシンプレックス（商標）クローニングにおいて、変性プライマーの使用によって導入された重鎖及び軽鎖のアミノ末端におけるミスセンス突然変異は、生殖系列配列へと戻り修正された。表１は、２３７６５、２３６８６、２４２０８、２３５６６、２３９２５及び２４１３５と称される生殖系列の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインヌクレオチド配列を示す。修正プロセスは、生殖系列へのアミノ末端配列の修正、並びにコドン使用頻度の最適化を含む。ヒト生殖系列配列への一致のための標的は、重鎖及び軽鎖の可変領域についてのｂｌａｓｔ相同性探索によって同定された。

抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、及び２４１３５の可変ドメイン、定常領域、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のタンパク質配列が、それぞれ表２、表３、及び表４に示されている。

結果
表１は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５、及び２４１３５の可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列を示す。

表２は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５及び２４１３５の推定されるアミノ酸配列を示す。ＣＤＲは太字／下線である。

表３は、重鎖及び軽鎖の定常領域のアミノ酸配列（それぞれＣＨ及びＣＬ）を示す。「ＩｇＧ_１ＬＡＬＡ」は、ＩｇＧ_１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を低減させることが知られている、重鎖における「ＬＡＬＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け体系に従って番号付けされた）の存在を指す（Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161-68 (2001); Hessell et al., Nature 449(7158):101-04 (2007)）。

表４は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５及び２４１３５の重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を示し、ここでのＣＤＲはＩＭＧＴ（登録商標）体系に従って定義されている。

表５は、抗体２４２０８、２３７６５、２３６８６、２３５６６、２３９２５及び２４１３５の配列番号の情報を示す。特記しない限り、配列はアミノ酸配列である。

実施例２．抗ＮＫＧ２Ａリファレンス抗体類似体のクローニング
本実施例は、アミノ酸配列の入手源、及び抗ＮＫＧ２Ａリファレンス抗体類似体の生成のために使用される最終抗体フォーマットを列挙する。

材料及び方法
表６の抗体類似体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、列挙された特許刊行物から得られた。タンパク質配列は、ヒトコドン使用頻度を用いてＤＮＡ配列に逆翻訳された。対応するＤＮＡ配列は遺伝子合成され、ヒトの重鎖又は軽鎖の定常ドメインを含有している発現ベクターにクローニングされ、その結果、完全長の抗体の発現がもたらされた。発現のために選択されたヒト抗体アイソタイプは、Ｆｃ領域内に導入された追加の突然変異と共に、抗体フォーマットの列に列挙される。ＣＨＯ細胞を、標準的なタンパク質発現系を使用して、結果として得られた発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。抗体上清は、標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを使用して精製された。

実施例３．ヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４ヘテロ二量体に対する、抗体結合動態の測定
本実施例は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定されるような、組換えヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４ヘテロ二量体（細胞外ドメイン）に対する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の結合を測定する。

材料及び方法
抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の速度論的結合分析は、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ＳＰＲ機器（IBIS Technologies社、オランダ）と併用した連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics社、ソルトレイクシティ、米国）を使用して、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって実施された。ヒトヒスチジンタグ化ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ及びＦＬＡＧタグ化ＣＤ９４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系を使用して共発現され、標準的なＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー、続いて抗ＦｌａｇＭ２アフィニティゲル（Ａ２２２０、シグマ社）によって精製した。結合速度論は、Ｇ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）上にモノクローナル抗体を１５分間かけて、ＣＦＭを使用して捕捉することによって測定された。スポット後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサーに配置し、固定されたモノクローナル抗体をＳｅｎｓＥｙｅ Ｆｉｘｌｔキットによって固定した。速度論的分析を、１．６nMから４００nMの漸増濃度の抗原を２倍希釈液として注入する、一連の速度論的滴定を適用することによって実施した。各サイクルの抗原の注入後、表面は１００mMのＨ_３ＰＯ_４（ｐＨ３）によって再生された。抗原の結合と解離は、１５分間測定された。記録された結合応答は、結合速度定数（ｋ_ｏｎ又はｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ又はｋ_ｄ）及び親和性（Ｋ_Ｄ）定数の計算のためのＳｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェアを用いて、単純な１：１の結合モデルに当てはめられた。結合速度論的パラネーターは、３つの独立した測定点の平均値として測定された。

結果
ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４ヘテロ二量体に結合している抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体の結合親和性及び速度論的パラメーターが表７に示されている。ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４に対するモノクローナル抗体２４２０８、２３９２５、２３５６６及び２４１３５の結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、ＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４に対するそれらの結合親和性の３０～５０倍強かった。モノクローナル抗体２３６８６は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４に対して同じような結合親和性を有していた。どのモノクローナル抗体も、ＣＤ９４ホモ二量体に結合しなかった（データは示されていない）。

要約すると、抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体の２４２０８、２３９２５、２３５６６及び２４１３５は、ＮＫＧ２Ｃと比較して、ＮＫＧ２Ａに対して高い結合特異性を有する。モノクローナル抗体２３６８６は、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに同じような親和性で結合する。

実施例４．ヒト又はカニクイザルＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃを用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞に対する、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体のインビトロでの結合
本実施例は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現された、ヒト及びカニクイザルのＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃ受容体に対する、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体のインビトロでの結合を説明する。リファレンス抗体類似体及びアイソタイプ対照は、比較のために含められた。

材料及び方法
ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ヒトＮＫＧ２Ａ及びヒトＣＤ９４、ヒトＮＫＧ２Ｃ及びヒトＣＤ９４、カニクイザルＮＫＧ２Ａ及びカニクイザルＣＤ９４、又はカニクイザルＮＫＧ２Ｃ及びカニクイザルＣＤ９４の構築物を用いて一過性にトランスフェクトした。偽トランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞は、陰性対照としてアッセイに含められた。抗体を、３０μg/mLから０．５ng/mLの抗体までの３倍希釈液で、及び０μg/mLの抗体で、トランスフェクトされた細胞に対する結合について試験し、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄工程後、細胞を、蛍光ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖）二次抗体（Ａ－２１４４５、インビトロジェン社）と共に４℃で３０分間暗闇でインキュベートした。二回目の洗浄後、細胞を、ハイスループットフローサイトメトリー（IQueスクリーナー、ザルトリウス社）によって試験した。データはエクセルに移され、グラフをＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して作成した。

結果
図１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されたヒト又はカニクイザルのＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに結合している抗体の用量反応曲線を示す。全ての抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａに強力かつ用量依存的に結合した。抗体２３６８６は、４つの異なる全ての構築物に結合した。４つの抗体、すなわち２３５６６、２３９２５、２４１３５及び２４２０８は、ヒトＮＫＧ２Ｃに対して非常に弱い結合を示した。抗体２３７６５は、カニクイザルＮＫＧ２Ａに結合したが、ヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｃには弱くしか結合しなかった。モナリズマブ類似体は、カニクイザルＮＫＧ２Ａ及びカニクイザルＮＫＧ２Ｃの両方に結合した。

実施例５．抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体による、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対するＨＬＡ－Ｅの結合のインビトロでの遮断
本実施例は、ＣＨＯ－Ｓ細胞上に一過性に発現されたヒト及びカニクイザルのＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃに対する、ＨＬＡ－Ｅの結合の、６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体によるインビトロでの遮断を説明する。リファレンス抗体類似体及びアイソタイプ対照は、比較のために含められた。

材料及び方法
ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ヒトＮＫＧ２Ａ及びヒトＣＤ９４、ヒトＮＫＧ２Ｃ及びヒトＣＤ９４、カニクイザルＮＫＧ２Ａ及びカニクイザルＣＤ９４、又はカニクイザルＮＫＧ２Ｃ及びカニクイザルＣＤ９４の発現のための構築物を用いて一過性にトランスフェクトした。偽トランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞が、陰性対照としてアッセイに含められた。ＰＥ（フィコエリトリン）コンジュゲートＨＬＡ－Ｅ五量体を、１０μg/mLから１４ng/mLまでの３倍連続希釈液及び０μg/mLの抗体の抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の存在下において、ヘテロ二量体への結合について試験した。抗体を、４℃で３０分間かけて結合させ、その後、１：５０の希釈液でＨＬＡ－Ｅ五量体を添加した。トランスフェクトされた細胞に対するＨＬＡ－Ｅの結合の蛍光強度は、ハイスループットフローサイトメトリー（IQueスクリーナー、ザルトリウス社）によって測定された。データはエクセルに移され、グラフをＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して作成した。

結果
図２に示されるように、全ての抗体が、用量依存的にヒトＮＫＧ２Ａに対するＨＬＡ－Ｅの結合を阻害した（パネルＡ）。２３６８６及びモナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）のみが、カニクイザルＮＫＧ２Ａに対するＨＬＡ－Ｅの結合を完全に遮断した（パネルＢ）。ヒトＮＫＧ２Ｃに対するＨＬＡ－Ｅの結合は、２３６８６によって遮断され、２３５６６によってより低い効力で遮断された（パネルＣ）。モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）及び２３６８６のみが、カニクイザルＮＫＧ２Ｃに対するＨＬＡ－Ｅの結合を完全に遮断した（パネルＤ）。

実施例６．ＮＫＧ２Ａエピトープに対する抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の結合
本実施例は、異なるＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４ヘテロ二量体（ここではヒトＮＫＧ２Ａ細胞外ドメイン由来の１つの残基が、対応する位置のヒトＮＫＧ２Ｃの残基と交換されている）に対する、抗ヒトＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体のインビトロでの結合を説明する。１つのアミノ酸の置換を有するヘテロ二量体をコードしている６つの異なる構築物、及び３つのアミノ酸の置換を有するヘテロ二量体をコードしている１つの構築物を、ＣＨＯ－Ｓ細胞に一過性にトランスフェクトし、偽トランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞は、陰性対照として作用した。リファレンス抗体類似体及びアイソタイプ対照抗体が比較のために含められた。

材料及び方法
以下のＮＫＧ２Ａアミノ酸置換の１つ：Ｓ１６７Ａ、Ｉ１６８Ｓ、Ｓ１７０Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｅ１９７Ｋ、Ｉ２２５Ｍ、又は３つ置換されたＳ１６７Ａ＋Ｉ１６８Ｓ＋Ｓ１７０Ｌ（ＨＬＡ－Ｅの結合部位の一部である受容体上の残基に相当する）を有する、ヒトＮＫＧ２Ａ及びヒトＣＤ９４細胞外ドメインをコードしている核酸構築物を用いて、ＣＨＯ－Ｓ細胞を一過性にトランスフェクトした（Kaiser et al., Proc Natl Acad Sci USA (2008) 105(18):6696-701）。図３は、ＨＬＡ－Ｅと複合体を形成した、ヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４ヘテロ二量体の結晶構造上に強調された４つのアミノ酸置換を示す（タンパク質構造データベース：３ＣＤＧ）。

６つの抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体を、発現された様々なヘテロ二量体への結合について試験した。抗体を、１μg/mLの抗体からの３倍連続希釈液及び０μg/mLの抗体で、トランスフェクトされた細胞への結合について試験し、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄工程後、細胞を、蛍光ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖＋軽鎖）二次抗体（Ａ－２１４４５、インビトロジェン社）と共に４℃で３０分間暗闇でインキュベートした。２回目の洗浄後、細胞を、ハイスループットフローサイトメトリー（IQueスクリーナー、ザルトリウス社）によって試験した。データはエクセルに移され、グラフをＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して作成した。リファレンス抗体類似体及びアイソタイプ対照が比較のために含められた。

結果
図４に示されるように、４つの抗体（２３５６６、２３９２５、２４１３５及び２４２０８）は、ＮＫＧ２Ａ Ｓ１７０Ｌ置換を有するヘテロ二量体に対する、並びに、ＮＫＧ２Ａトリプル置換（Ｓ１６７Ａ、Ｉ１６８Ｓ、Ｓ１７０Ｌ）を有するヘテロ二量体に対する結合の低下を示した。このことは、そうした４つの抗体について、ヒトＮＫＧ２Ａに対する結合が、少なくともＳ１７０の残基に依存することを示す。２３９２５及び２４２０８に対する結合の減少は、単一のＳ１７０Ｌの置換よりもトリプル置換の方がより大きく、このことは、同時突然変異Ｓ１６７Ａ及びＩ１６８Ｓの相加的な影響を示す。抗体２３７６５及びモナリズマブ類似体は、ＮＫＧ２Ａ Ｅ１９７Ｋ置換を有するヘテロ二量体への結合の低下を示し、このことは、ヒトＮＫＧ２Ａに対するこれらの２つの抗体の適切な結合のために、１９７位のグルタミン酸が必要とされることを実証する。モナリズマブもまた、Ｍ１８９Ｉ置換を有するヘテロ二量体に対する結合の減少を示し、このことは、１８９位におけるメチオニンの幾分かの影響を示す。

実施例７．ＮＫ細胞により媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅における、抗ＮＫＧ２Ａ抗体のスクリーニング
一連の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、ＮＫ細胞株ＮＫ－９２による、又は健康ドナーに由来する初代ＮＫ細胞による、ＨＬＡ－ＥでトランスフェクトされたＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ）の殺滅を増強する能力について評価した。

材料及び方法
Ｋ５６２－ＨＬＡＥ細胞には、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドが負荷され、ＮＫ－９２細胞からＩＬ－２を一晩かけて枯渇させた。翌日、ＮＫ細胞を健康ドナーから単離し、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を２５μg/mLの濃度で、ＮＫ－９２又は初代ＮＫ細胞と共にインキュベートし、その後、カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ標的細胞が添加され、９０分間インキュベートした。ＮＫ－９２細胞又は初代ＮＫ細胞の殺滅能は、上清中へのカルセインの放出によって測定された。比溶解は、自然発生的な溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のみ）を差し引き、そして最大溶解（カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のトリトンＸ－１００による溶解）に対して標準化した。

結果
図５は、一連の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置後の、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の比溶解を示す。様々な抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置後の溶解レベルは、強く変化したことが明白であり、このことは、いくつかの抗体はこのアッセイにおいて全く機能を有さず、一方、他の抗体は、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅を、モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）よりも高いレベルまで強く増強したことを示す（パネルＡ及びＢ）。ＮＫ－９２細胞及び初代ＮＫ細胞を使用した殺滅レベルの間に正の相関が観察された（パネルＣ）。

実施例８．ＮＫ－９２細胞により媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅における、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の機能的活性
本実施例は、用量依存的なアンタゴニスト活性を実証する目的で、いくつかの抗ＮＫＧ２Ａ抗体（２４２０８、２３９２５、２３５６６、２３７６５、２３６８６）のインビトロでの機能的評価を説明する。抗体を、ＮＫ－９２細胞により媒介される、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ）の殺滅を増強するそれらの能力について評価した。モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）が比較のために含められた。

材料及び方法
Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞には、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドが負荷され、ＮＫ－９２細胞からＩＬ－２を一晩かけて枯渇させた。翌日、ＮＫ－９２細胞及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体を２５μg/mLから出発して示された抗体の２倍滴定液と共にインキュベートし、その後、カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ標的細胞が添加され、９０分間インキュベートした。ＮＫ－９２細胞の殺滅能は、上清へのカルセインの放出によって測定された。比溶解は、自然発生的な溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡＥ細胞のみ）を差し引き、そして最大溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡＥ細胞のトリトンＸ－１００による溶解）に対して標準化した。

結果
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置時のＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅が図６に示されている。いくつかの抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、モナリズマブ類似体と比較して優れた活性を示した。

実施例９．初代ＮＫ細胞により媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅における、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の機能的活性
本実施例は、用量依存的なアンタゴニスト活性を実証する目的で、いくつかの抗ＮＫＧ２Ａ抗体（２４２０８、２３９２５、２３５６６、２３７６５、２３６８６）のインビトロでの機能的評価を説明する。抗体を、初代ＮＫ細胞により媒介される、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ）の殺滅を増強するそれらの能力について評価した。モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）が比較のために含められた。

材料及び方法
Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞には、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドが負荷され、初代ＮＫ細胞を、健康ドナーに由来する新鮮な末梢血単核細胞から単離した。翌日、初代ＮＫ細胞及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体を２５μg/mLから出発して示された抗体の２倍滴定液と共にインキュベートし、その後、カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ標的細胞が添加され（１：１０のＥ（エフェクター）：Ｔ（標的）比）、９０分間インキュベートした。初代ＮＫ細胞の殺滅能は、上清へのカルセインの放出によって測定された。比溶解は、自然発生的な溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のみ）を差し引き、そして最大溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のトリトンＸ－１００による溶解）に対して標準化した。

結果
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置時のＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅が図７に示されている。いくつかの抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）と比較して優れた活性を示した。

実施例１０
γδＴ細胞により媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅における、抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体の機能的活性
本実施例は、用量依存的なアンタゴニスト活性を実証する目的で、選択された抗ＮＫＧ２Ａ抗体のインビトロでの機能的評価を説明する。抗体を、γδＴ細胞により媒介される、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ）の殺滅を増強するそれらの能力について評価した。モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）が比較のために含められた。

材料及び方法
Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞には、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドが負荷され、ＮＫＧ２Ａ陽性γδＴ細胞が単離された。翌日、ＮＫＧ２Ａ陽性γδＴ細胞及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体を２５μg/mLから出発して示された抗体の２倍滴定液と共にインキュベートし、その後、カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ標的細胞が添加され、３時間インキュベートした。γδＴ細胞の殺滅能は、上清へのカルセインの放出によって測定された。比溶解は、自然発生的な溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のみ）を差し引き、そして最大溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡＥ細胞のトリトンＸ－１００による溶解）に対して標準化した。

結果
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置時のＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅が図８に示されている。いくつかの抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、モナリズマブ類似体と比較して優れた活性を示した。

実施例１１．癌細胞の殺滅のＥＣ５０及び有効性
本実施例は、細胞障害活性を実証する目的で、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２４２０８のインビトロでの機能的評価を説明する。抗体を、初代ヒトＮＫ細胞により媒介される、ＨＬＡ－Ｅを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２―ＨＬＡ－Ｅ）の殺滅を増強するそれらの能力について評価した。モナリズマブ類似体（ＩｇＧ_４）及び２つのＢＭＳ類似体、すなわちＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．９（重鎖：配列番号６５、軽鎖：配列番号６６）及びＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．１１（重鎖：配列番号６５、軽鎖：配列番号６７）が比較のために含められた。

材料及び方法
Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞には、ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドが負荷され、初代ヒトＮＫ細胞からＩＬ２を一晩かけて枯渇させた。翌日、初代ヒトＮＫ細胞及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体を５０μg/mLから出発して示された抗体の２倍滴定液と共にインキュベートし、その後、カルセインの負荷されたＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ標的細胞が添加され、９０分間インキュベートした。初代ヒトＮＫ細胞の殺滅能は、上清へのカルセインの放出によって測定された。比溶解は、自然発生的な溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞のみ）を差し引き、そして最大溶解（カルセインの負荷された５６２－ＨＬＡＥ細胞のトリトンＸ－１００による溶解）に対して標準化した。

結果
抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いての処置後のＫ５６２－ＨＬＡ－Ｅ細胞の殺滅が表８及び図９に示されている。２４２０８の抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、モナリズマブ類似体及びＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．９及びＢＭＳ－ＮＫＧ２Ａ．１１類似体と比較して優れた活性を示した。

実施例１２．内因性ＨＬＡ－Ｅを発現している選択された細胞株における、２４２０８によって誘導されたＮＫ細胞により媒介される殺滅
本実施例は、腫瘍細胞株（ＨＴ－２９、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ａ２５３、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＣＡＬ－１２０、ＦａＤｕ）の表面上の内因性ＨＬＡ－Ｅの発現、及びＮＫ細胞により媒介されるこれらの腫瘍細胞株のインビトロでの殺滅に対する２４２０８の効果を説明する。

材料及び方法
６つの異なる細胞株（ＨＴ－２９、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ａ２５３、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＣＡＬ－１２０、及びＦａＤｕ）における内因性ＨＬＡ－Ｅの発現をフローサイトメトリーによって調べた。健常な個体から単離されたヒト初代ＮＫ細胞を、１０：１の比で内因性ＨＬＡ－Ｅ（ＨＬＡ－Ｂ^＊０７０１ペプチドの負荷された）を発現している６つの異なるカルセインで標識された標的細胞と共培養し、単一濃度の２４２０８又はアイソタイプ対照（ＩｇＧ_１ＬＡＬＡ）で処置した。カルセインの放出を１．５時間後に測定し、比溶解率を計算した。

結果
６つ全てのヒト腫瘍細胞株が、表面上に内因性ＨＬＡ－Ｅを発現することが示された（図１０、パネルＡ）。２４２０８を用いての処置はＩｇＧ_１ＬＡＬＡによる処置と比較して、ＮＫにより媒介されるこれらの腫瘍細胞株の殺滅を誘導した（図１０、パネルＢ）。

実施例１３．ＮＫ癌細胞共培養液中へのＭＩＰ－１βの放出
本実施例は、細胞障害活性を実証する目的で、抗ＮＫＧ２Ａ抗体２４２０８のインビトロでの機能的評価を説明する。抗体を、癌細胞株Ａ５４９及びＪＩＭＴ－１のいずれかと共に初代ヒトＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞の共培養時に、炎症誘発性サイトカインマクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）の分泌を誘導するそれらの能力について評価した。

材料及び方法
初代ヒトＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞を、２倍滴定液の２４２０８又はＩｇＧ_１ＬＡＬＡ（５０μg/mLから出発）と共にインキュベートし、ＨＬＡＥ－三量体を用いて形質導入された癌細胞を発現している安定なＨＬＡ－Ｅと共に培養した。４８時間共培養した後、共培養液の上清中のＭＩＰ－１β濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。

結果
２４２０８又はＩｇＧ_１ＬＡＬＡで処置された初代ヒトＮＫ細胞と、Ａ５４９ＨＬＡＥ－三量体細胞又はＪＩＭＴ－１ＨＬＡＥ－三量体細胞の共培養時の、共培養液の上清中のＭＩＰ－１βの濃度が図１１に示されている。２４２０８の抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＩｇＧ_１ＬＡＬＡ対照抗体と比較して、優れたＭＩＰ－１βの誘導を示した。

Claims (39)

1. 抗体が、
   ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）と、配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
   ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
   ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
   ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
   ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；又は
   ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖
   を含んでいる抗体と同じヒトＮＫＧ２Ａのエピトープに結合する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分。
2. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号８～１０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
3. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
4. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号２５～２７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号２８～３０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
5. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号３５～３７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号３８～４０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
6. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号４５～４７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号４８～５０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
7. ａ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の重鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号５５～４７のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖の相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
   ｉｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ；又は
   ｉｖ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）を含み；そして
   ｂ）前記の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の軽鎖が、
   ｉ）それぞれ配列番号５８～６０のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖の相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）－１－３；
   ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
   ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は
   ｉｖ）配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分。
8. 前記抗体が、
   ａ）それぞれ配列番号５～１０；
   ｂ）それぞれ配列番号１５～２０；
   ｃ）それぞれ配列番号２５～３０；
   ｄ）それぞれ配列番号３５～４０；
   ｅ）それぞれ配列番号４５～５０；又は
   ｆ）それぞれ配列番号５５～６０
   のＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３のアミノ酸配列を含む、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分。
9. 前記抗体が、
   ａ）それぞれ配列番号３及び４；
   ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
   ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
   ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
   ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
   ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
   のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項８の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
10. 前記抗体が、
    ａ）それぞれ配列番号３及び４；
    ｂ）それぞれ配列番号１３及び１４；
    ｃ）それぞれ配列番号２３及び２４；
    ｄ）それぞれ配列番号３３及び３４；
    ｅ）それぞれ配列番号４３及び４４；又は
    ｆ）それぞれ配列番号５３及び５４
    のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項８の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
11. 前記抗体がＩｇＧである、請求項１～１０のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
12. 前記抗体がＩｇＧ_１である、請求項１１の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
13. 前記抗体が、Ｆｃ領域内に少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１～１２のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
14. 前記抗体がＩｇＧ_１であり、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け体系に従って番号付けされる、重鎖アミノ酸の２３４位及び２３５位の１つ以上において１つの突然変異を含む、請求項１～１０のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
15. ２３４位及び２３５位におけるアミノ酸残基の一方又は両方が、ロイシンからアラニンに突然変異している、請求項１４の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
16. ａ）配列番号３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）と、配列番号４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
    ｂ）配列番号１３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号１４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
    ｃ）配列番号２３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号２４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
    ｄ）配列番号３３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号３４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；
    ｅ）配列番号４３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号４４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖；又は
    ｆ）配列番号５３及び６１のアミノ酸配列を含んでいる重鎖と、配列番号５４及び６２のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖
    を含む、抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
17. アミノ酸残基Ｓ１７０を含んでいるヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープに結合する、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分。
18. 前記エピトープがさらに、アミノ酸残基Ｓ１６７及びＩ１６８を含む、請求項１７の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
19. 前記エピトープが、アミノ酸残基Ｅ１９７、Ｍ１８９又はその両方を含まない、請求項１７又は１８の抗ＮＫＧ２Ａ抗体。
20. 前記抗体又は抗原結合部分が、
    ａ）表面プラズモン共鳴によって測定されるような、１５nM以下のＫ_ＤでヒトＮＧＫ２Ａに結合し；
    ｂ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＧＫ２Ａに結合し；
    ｃ）ＣＨＯ－Ｓ細胞上に発現されるヒトＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４ヘテロ二量体へのＨＬＡ－Ｅの結合を遮断し；
    ｄ）ＨＬＡ－ＥでトランスフェクトされたＫ５６２細胞のＮＫ－９２細胞により媒介される殺滅を増強し；
    ｅ）ＨＬＡ－ＥでトランスフェクトされたＫ５６２細胞の初代ＮＫ細胞により媒介される殺滅を増強し；
    ｆ）ＨＬＡ－ＥでトランスフェクトされたＫ５６２細胞のγδＴ細胞により媒介される殺滅を増強し；そして
    ｇ）モナリズマブとは異なるヒトＮＫＧ２Ａ上のエピトープに結合する、
    から選択された少なくとも１つの特性を有する、請求項１～１９のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
21. 前記抗体又は抗原結合部分が、前記特性の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は全てを有する、請求項２０の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分。
22. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分と薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
23. 免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生生物剤、抗血管新生剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤をさらに含んでいる、請求項２２の医薬組成物。
24. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の、重鎖をコードしているヌクレオチド配列、又は軽鎖をコードしているヌクレオチド配列、又はその両方を含んでいる、単離された核酸分子。
25. 前記核酸分子が、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１、４２、５１、及び５２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項２４の単離された核酸分子。
26. 前記ベクターがさらに、発現制御配列を含む、請求項２４又は２５の単離された核酸分子を含んでいるベクター。
27. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体又は抗原結合部分の、重鎖をコードしているヌクレオチド配列、及び軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる宿主細胞。
28. 請求項２７記載の宿主細胞を準備する工程、前記宿主細胞を、抗体又は部分の発現に適した条件下で培養する工程、及び結果として得られた抗体又は部分を単離する工程を含む、抗ＮＫＧ２Ａ抗体又はその抗原結合部分を産生するための方法。
29. 請求項１～２１のいずれか一項記載の１つ又は２つの別個の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の抗原結合ドメインを含んでいる二重特異的結合分子。
30. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は診断プロセスにおける請求項２９の二重特異的結合分子を使用する方法。
31. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は請求項２９の二重特異的結合分子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、該患者における免疫活性を増強させるための方法。
32. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は請求項２９の二重特異的結合分子の治療有効量を患者に投与する工程を含む、該患者における癌を処置するための方法。
33. 癌が、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟組織、造血系、頭頚部、肝臓、骨、膀胱、乳房、胃、子宮、子宮頸部、及び膵臓からなる群から選択された組織にある、請求項３２の方法。
34. 患者が、頭頚部癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、ホジキンリンパ腫、又は非ホジキンリンパ腫を有する、請求項３１～３３のいずれか一項の方法。
35. 免疫刺激剤、ワクチン、化学療法剤、抗新生生物剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、又は放射線療法を患者に投与する工程をさらに含んでいる、請求項３１～３４のいずれか一項の方法。
36. 請求項１～２１のいずれか一項の抗ＮＫＧ２Ａ抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は請求項２９の二重特異的結合分子の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、該患者における免疫障害を処置するための方法。
37. 請求項３１～３６のいずれか１つの方法に従って、
    ａ）患者における免疫活性を増強するための；
    ｂ）患者における癌を処置するための；又は
    ｃ）患者における免疫障害を処置するための
    医薬品の製造のための、請求項１～２１のいずれか一項の抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は請求項２９の二重特異的結合分子の使用。
38. 請求項３１～３６のいずれか一項の方法に従って、
    ａ）患者における免疫活性を増強するために；
    ｂ）患者における癌を処置するために；又は
    ｃ）患者における免疫障害を処置するために、使用するための、請求項１～２１のいずれか一項の抗体若しくは抗原結合部分、請求項２２若しくは２３の医薬組成物、又は請求項２９の二重特異的結合分子。
39. 患者がヒトである、請求項３１～３６のいずれか一項の方法；請求項３７の使用；又は請求項３８の使用のための抗体若しくは抗原結合部分、使用のための医薬組成物、又は使用のための二重特異的結合分子。

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