JP2024519731A - 同種異系培養ケラチノサイト製品 - Google Patents

Abstract

本開示は、同種異系培養ケラチノサイト製品を対象とする。【選択図】図１

Description

本開示は、同種異系培養ケラチノサイト製品を対象とする。

重度の熱傷を負った患者は、長くかつ痛みを伴う回復に直面する。いくつかの深い部分的な厚さの火傷などの外科的介入が必要な場合、患者自身の皮膚、又は死体からの皮膚が、傷ついた領域に移植され得る。自家移植は、死体皮膚の使用に伴う拒絶反応の可能性を減少させるが、患者は更なる外傷に耐える必要がある。必要なものは、治癒を促進し、患者によって拒絶される可能性が低い移植片である。

本開示の様々な態様の中には、局所使用のための同種異系培養ケラチノサイトの組成物があり得、組成物は、同種異系細胞化足場を含み、足場は、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを更に含む。

ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞は、核型的に安定である。ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞は、固定非依存性成長を示さない。本組成物は、検出可能な病原体を含まない。本組成物は、ヒト成長因子及びサイトカインを分泌する。本組成物は、局所使用から１２ヶ月以内に免疫拒絶を誘発しない。皮膚線維芽細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞である。いくつかの態様において、組成物は、ヒト細胞外マトリックスタンパク質を更に含む。追加の態様において、組成物は、グリセリンを更に含む。ケラチノサイトは、４３継代培養され得る。皮膚線維芽細胞は、６継代培養され得る。本組成物は、検出可能な病原体を含有しない、ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞バンクに由来し得る。細胞化足場コンストラクトは、形状が長方形であるか、又は創傷床の形状にトリミングされ得る。細胞化足場コンストラクトは、単一の患者のみへの塗布のためのものであり得る。いくつかの態様において、本組成物は、熱傷を有する成人の治療のために、単位用量で処方され得、単位用量は約１００ｃｍ^２の長方形である。長方形の単位用量は、約８ｃｍ×１２．５ｃｍであり得る。いくつかの態様において、本組成物は、単位用量で、熱的に深い部分的な厚さの火傷を有する成人の治療のために処方され得、単位用量は、約１００ｃｍ^２の長方形である。長方形の単位用量は、約８ｃｍ×１２．５ｃｍであり得る。本組成物は、自家移植片配置を伴わずに、３ヶ月目に、熱傷治療部位における持続的な創傷閉鎖を提供する。本組成物は、異種移植製品であり得る。いくつかの態様において、マウス細胞は、組成物の製造に使用されない。本組成物は、３０．０ｋＧｙの目標最小投薬量で照射された包装材料ガンマを更に含み得る。本組成物は、ＵＳＰ＜８７＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験されており、細胞毒性を示さないことが見出された。本組成物は、ＵＳＰ＜８８＞（インビボ生物反応性）を使用して試験されており、クラスＶＩ基準を満たす。本組成物は、加湿した５％のＣＯ_２インキュベーター中で少なくとも２５日間、３７±２℃で保持され得る。いくつかの態様において、本組成物は、０．００３ｃｃ／１００ｉｎ^２／２４時間未満の酸素透過率を有する包装層を更に含む。いくつかの態様において、本組成物は、０．００６５ｇ／１００ｃｍ^２／２４時間未満の水分透過率を有する包装層を更に含む。いくつかの態様において、本組成物は、３０ゲージ層アルミホイルポーチを更に含む。いくつかの態様において、本組成物は、９９．７４％の不透明度パーセンテージを含む１８ｐｔ段ボールカートンを更に含む。本組成物は、臨床使用のための調製まで、ホイルポーチ内に保管され得る。ホイルポーチは、包装、出荷、又は臨床使用中に組成物に接触しない。本組成物は、臨床使用のための調製まで、ホイル内で凍結保存され得る。本組成物は、マフェニド酢酸塩、銀含有抗菌剤、クロルヘキシジン溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗菌組成物を実質的に含まなくてもよい。本組成物は、抗菌組成物の非存在下で成人の熱傷を治療する有効性が改善され得る。いくつかの態様において、免疫不全マウスへのケラチノサイトの単一皮下注射は、注射後２３週間までに腫瘍形成をもたらさない。いくつかの態様において、免疫不全マウスにおける全層切除創傷に対する組成物の局所塗布は、投薬後２０週までに腫瘍形成をもたらさない。いくつかの態様において、組成物と接触させた免疫不全無胸腺ヌードマウスにおいて、局所毒性又は全身毒性の証拠は観察されない。

本開示の他の態様は、同種異系培養ケラチノサイトを含む１つ以上の凍結保存されたコンストラクトの調製を必要とする患者の治療のための、それを行う方法を含む。本方法は、保持溶液を３５℃～３９℃の加温デバイスで加温することと、加温された保持溶液を無菌保持皿に注ぐことと、コンストラクトを収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、挿入トレイを保持皿に配置することと、コンストラクトを保持溶液中に１５分～４時間維持することと、を含み得る。

本方法は、挿入トレイのポリカーボネート膜からコンストラクトを取り出すことを更に含み得る。コンストラクトは、真皮側及び表皮側を含み得、コンストラクトは、真皮側がポリカーボネート膜と接触するように包装される。本方法は、コンストラクトを、メッシャーを使用して、最大１：１の比率でメッシュ化することを更に含み得る。メッシャーは、保持溶液、無菌０．９％生理食塩水、又は乳酸リンゲル溶液を使用して、接着を防止し、かつコンストラクト水分を維持するために、必要に応じて湿らせ得る。コンストラクトは、真皮側又は表皮側のいずれかを上にしてメッシュ化されるように操作可能であり得る。保持溶液は、ラミネートされたホイルポーチに保管されたボトル内に収容され得る。保持溶液は、使用前に少なくとも４５分間、３５℃～３９℃の加温オーブン／キャビネットで加温され得る。保持溶液は、使用前に少なくとも１５分間、３５℃～３９℃の水浴中で加温され得る。加温された保持溶液は、加温デバイスから取り出された直後に無菌保持皿に注がれ得る。保持皿は、最初にポーチに包装され得る。コンストラクトを収容する挿入トレイを保持する製品皿は、最初にホイルポーチ内に保管され、任意選択的に更にカートン内に保管され得る。本方法は、カートンを冷凍庫又はドライアイスから取り出すことを更に含み得る。本方法は、カートン及びホイルポーチを開放して、コンストラクトを収容する挿入トレイを保持する製品皿を再移動させることを更に含み得る。カートンを冷凍庫又はドライアイスから取り出すことと、挿入トレイを保持皿に配置することとの間の時間は、１０分以下であり得る。挿入トレイは、無菌鉗子又は無菌の手袋をした指のいずれかを使用して、製品皿から取り出され得る。挿入トレイは、一方の端部から始めて、反対側の端部まで下げて、挿入トレイの下に気泡を閉じ込めることを最小限に抑えて、保持皿に配置され得る。本方法は、切除又はデブリードマンを介して創傷床を調製することを更に含み得る。本方法は、解凍する必要があるコンストラクトの数を決定することを更に含み得る。２つ以上のコンストラクトが必要とされる場合、２つ以上のコンストラクトは、１つ以上のバッチで調製される。１つ以上のコンストラクトの調製は、約２０分かかる。

本開示の態様は、切除又はデブリードマンを介して創傷床を調製することと、１つ以上の解凍及びメッシュ化されたコンストラクトを、調製された創傷床と接触させて配置することであって、１つ以上のコンストラクトが、同種異系培養ケラチノサイトを含み、かつ真皮側及び表皮側を有し、コンストラクト真皮側が下である、配置することと、コンストラクトを創傷床及び／又は周囲の組織に固定することと、を含む、深い部分的な厚さの火傷を有する患者を治療する方法を更に含み得る。

本方法は、フィブリン糊をコンストラクトに塗布することを更に含み得る。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトに細胞死をもたらさない。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトにおける増殖、移動、又は分泌の１０％未満の変化をもたらし得る。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、皮膚移植片採取、創傷床接着、又はそれらの組み合わせのパーセンテージを増加させ得る。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、細菌感染、失血、術後疼痛、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される副作用を減少させ得る。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトの生存能力の１０％未満の減少をもたらし得る。フィブリン糊をコンストラクトに塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトの生存能力の３０％未満の減少をもたらし得る。本方法は、各コンストラクトを創傷床上に配置するときに、２つ以上のコンストラクトを当接させることを更に含み得る。２つ以上のコンストラクトは、使用され得る。治療される創傷床が１つのコンストラクトよりも小さい場合、本方法は、コンストラクトを創傷床に固定する前又は後に、余分なコンストラクトをトリミングすることを更に含み得る。１つ以上のコンストラクトは、創傷床の表面全体にわたって接触を有し得る。コンストラクトは、コンストラクトの構造的完全性を低下させないように、配置又は固定中に延伸又は拡張されない。コンストラクトは、ステープル、シアノアクリレートなどの組織接着剤、又は縫合糸で固定され得る。本方法は、１つ以上のコンストラクトの上に多孔質の非接着性接触包帯を配置することと、包帯を交換する前に１週間、所定の位置に放置することと、を更に含み得る。本方法は、銀を含有しない第２の層の包帯を配置することを更に含み得る。本方法は、１つ以上のコンストラクトを動かさないようにする外側ボルスター又はラップを配置することを更に含み得る。

本開示の態様は、外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法であって、それを必要とする成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法を更に含み得る。

過敏反応は、治療された成人患者の５％未満又は患者の１％未満で生じ得る。細胞化足場は、サインメッシュ化デバイスと互換性があり得る。本方法は、細胞化足場を、投与前に、最大１：１の比率でメッシュ化することを更に含み得る。投与するステップは、調製された創傷床への局所投与を含み得る。創傷床は、切除又はデブリードマンによって調製され得る。いくつかの態様において、細胞化足場コンストラクトのうちの２つ以上は、創傷床を覆うために塗布され得る。本組成物は、マウスコラーゲン又はウシ若しくはブタ由来の成分を含む製品に対して既知のアレルギーを有しない患者に好適であり得る。細胞化足場コンストラクトは、創傷床の形状にトリミングされ得る。細胞化足場コンストラクトは、単一の患者のみへの塗布のためのものであり得る。本方法は、細胞化足場が取り外された場合に医療提供者に連絡することを更に含み得る。本方法は、未使用の細胞化足場の、外科的バイオハザード廃棄物としての処分を更に含み得る。本方法は、マウス細胞が、細胞化足場の初期発達において使用されたことを成人患者に通知することを更に含み得る。本方法は、細胞化足場が、グリセリンを含み、患者がグリセリンに感受性がある場合に刺激を引き起こす可能性があることを成人患者に通知することを更に含み得る。

本開示の態様は、熱傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法を更に含み得る。

本開示の態様は、深い部分的厚さの火傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法を更に含み得る。

本開示の態様は、外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法であって、細胞化足場コンストラクトを含む同種異系培養ケラチノサイトの組成物を、外科的に調製された創傷床に塗布することを含み、足場コンストラクトが、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを更に含む、方法を更に含み得る。

本開示の態様は、皮膚線維芽細胞を含有するゲル化コラーゲン上で成長したケラチノサイトに由来する、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系細胞化足場製品の長方形シートを含む組成物を更に含み得る。

本開示の態様は、皮膚線維芽細胞を含有するゲル化コラーゲン上で成長したケラチノサイトに由来する、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系細胞化足場製品の２つ以上のシートを含む組成物であって、組成物が、シートの端部と重なることなく熱傷の治療に好適である、組成物を含み得る。

本開示の組成物のための外側カートン及びホイルポーチ包装を示す。 本開示の組成物を含有する製品皿を示す。 本開示の組成物を含有する製品皿及び挿入トレイを示す。 ボトルがラミネートされたホイルポーチ内の保持溶液を含有することを示す。 透明なポーチ内に収容された保持皿を示す。 無菌野で取り扱われた保持皿を示す。 無菌操作者（灰色の手袋）が、非無菌操作者（白色の手袋）によって提示された無菌保持皿を取り出すことを示す。 無菌操作者が保持皿を無菌野（灰色の長方形）に配置することを示す。 ホイルポーチの取り出しを示す。 ホイルポーチから、閉鎖された製品皿を取り出すことを示す。 非無菌領域における製品皿の配置を示す。 非無菌操作者が、保持溶液を保持皿に無菌で注ぐことを示す。 非無菌操作者（白色の手袋）が、製品皿を開放することを示す。 無菌操作者（灰色の手袋）が、挿入トレイを取り出すことを示す。 無菌操作者が、挿入トレイを保持皿に配置することを示す。 本開示の組成物をメッシュ化することを示す。 ＡＲＴＩＳＳフィブリン糊に曝露した組織パンチの生存能力を示すグラフを示す。黄色及び赤色の破線は、それぞれ、対照からの、生存能力の１０％及び３０％の低下を表す。データは、各条件のｎ＝５モデルの平均値±標準偏差である。 本開示の組成物のコンストラクト形態を示す。線維芽細胞を含有する真皮等価物に結合した表皮層。表皮は、有棘細胞のいくつかの層の下に、高秩序の基底ケラチノサイトの単層を有する。顕著な細胞内ケラトヒアリン顆粒を有する顆粒細胞の別個の層が、角質層と有棘細胞との間に存在する。 電子顕微鏡によって視覚化された本開示の組成物からの角質層脂質ラメラを示す。 ０～１週目の本開示の組成物を示す。 ２～３週目の本開示の組成物を示す。 ３～４週目の本開示の組成物を示す。

本開示は、同種異系培養ケラチノサイトを含む組成物、ヒト適用のためのそのような組成物を調製する方法、及びそのような組成物を投与する方法を包含する。具体的には、そのような組成物は、３ヶ月目で測定したときに、自家移植片配置を伴わずに、熱傷治療部位における持続的な創傷閉鎖を提供する。そのような組成物はまた、局所使用から１２ヶ月以内に免疫拒絶を誘発しない。

Ｉ．組成物
本開示の一態様は、同種異系培養ケラチノサイトの組成物を包含する。そのような組成物は、以下のセクションＩＩＩに詳述されるように、ヒトへの局所投与のために設計されている。特定の態様において、本発明の同種異系培養ケラチノサイト組成物は、同種異系細胞化足場であり得る。本明細書に開示される全ての実施形態において、組成物は、生存可能であり、生物工学によって作られている（例えば、非天然）。

本開示の同種異系培養ケラチノサイト組成物は、完全に層状化された表皮層及び真皮等価層（例えば、真皮層）を包含する。本開示の組成物は、有機型ヒト皮膚等価物として使用され得る。したがって、組成物は、内側真皮様層及び外側表皮様層の両方を有する天然のヒト皮膚を模倣するように設計された、生物工学によって作られた（非天然）二重層組織である。表皮層は、十分に発達しており、無傷のヒト皮膚のバリア機能に匹敵するバリア機能を示す完全に層状化されたヒトケラチノサイトを含む。

本開示の組成物の生存細胞（例えば、線維芽細胞、ＮＩＫＳ細胞など）は、代謝的に活性であり、組成物を創傷に塗布した後、創傷床を調節し、組織の再生及び修復を促進し、感染を低減し得る、成長因子、走化性因子、サイトカイン、炎症媒介物質、酵素、及び宿主防御ペプチドのスペクトルを分泌する。本開示の組成物の生存細胞、すなわち、ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞は、核型的に安定である。加えて、ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞は、固定非依存性成長を示す。

例示的な実施形態において、組成物は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ（登録商標）（商標）である。別の例示的な実施形態において、組成物は、ＥｘｐｒｅｓｓＧｒａｆｔ（商標）である。

一般的に言えば、本開示の組成物は、利用される培養プレートによってのみ制限される任意の所望の寸法及び表面積を含み得る。特定の実施形態において、本開示の組成物は、約２０ｃｍ^２～約２５０ｃｍ^２の表面積を有する。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、約２０ｃｍ^２～約８０ｃｍ^２、約８０ｃｍ^２～約１４０ｃｍ^２、約１４０ｃｍ^２～約２００ｃｍ^２、又は約２００ｃｍ^２～約２５０ｃｍ^２の表面積を有する。ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、約９０ｃｍ^２～約１１０ｃｍ^２の表面積を有する。一実施形態において、本開示の組成物は、約１００ｃｍ^２の表面積を有する。

本開示の組成物は、任意にメッシュ化され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、約１：１以上のメッシュ比（例えば、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１など）を有する。いくつかの実施形態において、組成物は、メッシュ化されない。

組成物の層の各々は、本組成物の他の定義特性とともに、以下に詳細に説明される。

完全に層状化された表皮層
本開示の組成物は、表皮様である完全に層状化された表皮層を含む。完全に層状化された表皮層は、ヒトケラチノサイトを含む。いくつかの実施形態において、完全に層状化された表皮層は、ＮＩＫＳ細胞を含む。ＮＩＫＳ（登録商標）細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１２１９１）で寄託され、米国特許第５，９８９，８３７号及び米国特許第６，９６４，８６９号に更に詳細に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

完全に層状化された表皮層は、様々な外因性核酸を発現するように操作されたＮＩＫＳ（登録商標）細胞を包含し得る。ＶＥＧＦタンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａなど）をコードする外因性遺伝子、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ－１Ａなど）をコードする外因性遺伝子、アンジオポエチン（例えば、ＡＮＧＰＴ１など）をコードする外因性遺伝子、カテリシジンペプチド又はその分解産物（例えば、ｈＣＡＰ－１８など）をコードする外因性遺伝子、ベータ－ディフェンシン（例えば、ｈＢＤ－３など）をコードする外因性遺伝子、ケラチノサイト成長因子（例えば、ＫＧＦ－２など）をコードする外因性遺伝子、金属タンパク質酵素（例えば、ＴＩＭＰ－１など）の組織阻害剤をコードする外因性遺伝子、外因性ＩＬ－１２遺伝子、並びに他の抗微生物、成長因子、転写因子、インターレウキン、及び細胞外マトリックスタンパク質をコードする外因性核酸配列を発現するように操作されたＮＩＫＳ（登録商標）細胞が明示的に企図される。非限定的な例として、例えば、米国特許第７４９８１６７号、同第７９１５０４２号、同第７８０７１４８号、同第７９８８９５９号、同第８８０８６８５号、同第７６７４２９１号、同第８０９２５３１号、同第８７９０６３６号、同第９５２６７４８号、同第９２１６２０２号、及び同第９１６３０７６号、並びにＵＳ２０１９／００３０１３０を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。所望のタンパク質をコードする外因性核酸を発現するように操作されたＮＩＫＳ細胞を含む組成物は、外因性核酸を含有しないＮＩＫＳ細胞を含む組成物よりも多くの量（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％など多く）のそのタンパク質を産生する。

いくつかの実施形態において、完全に層状化された表皮層は、組織学によって測定した場合、約７５μｍ～約１２０μｍの厚さを有する。例えば、完全に層状化された表皮層は、組織学によって測定した場合、約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、又は１２０μｍの厚さを有し得る。

（ｂ）真皮等価層
本開示の組成物は、真皮様である真皮等価層を包含する。真皮等価層は、上面及び底面を有し、マトリックス内にヒト皮膚線維芽細胞を含む。

皮膚線維芽細胞
本開示の組成物は、皮膚線維芽細胞を含む真皮等価層を包含する。ほとんどの実施形態において、皮膚線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞である。例示的な実施形態において、ヒト皮膚線維芽細胞は、初代正常ヒト皮膚線維芽細胞である。

マトリックス
本開示の組成物は、マトリックスを含む真皮等価層を包含する。真皮等価層のマトリックスは、ヒトコラーゲン及び任意選択的にマウスＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態において、真皮等価層のマトリックスは、ヒトＩ型コラーゲン、ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒトＩＶ型コラーゲン、ヒトＶＩ型コラーゲン、並びに任意選択的にマウスＩ型コラーゲンなどのヒト細胞外マトリックスタンパク質を含む。

真皮等価物中に存在するコラーゲンは、Ｉ型マウスコラーゲンを含み得る。代替的に、真皮等価物中に存在する唯一のコラーゲンは、皮膚代替物（例えば、ヒト皮膚線維芽細胞）の細胞によって産生され得る。マトリックスは、その中に含有される細胞によって産生される追加の生体分子を更に含み得る。例示的な実施形態において、真皮層は、線維芽細胞（例えば、細胞外マトリックス）によって産生され、かつ構成されるマトリックス内に埋め込まれた正常なヒト皮膚線維芽細胞から構成される。本実施形態のいくつかの反復では、真皮等価層に非ヒトコラーゲンは存在しない。本実施形態の他の反復では、真皮等価層中に最大約８５％の非ヒトコラーゲンが存在する。特定の反復において、非ヒトコラーゲンは、マウスである。別の反復では、非ヒトコラーゲンは、マウスコラーゲンからなり、他の非ヒトコラーゲン材料は含まない。別の例示的な実施形態において、真皮等価層は、精製されたマウスＩ型コラーゲンを含有するゲル化コラーゲンマトリックスに埋め込まれた正常なヒト皮膚線維芽細胞からなる。誤解を避けるために、本実施形態において、マウスＩ型コラーゲンをゲル化して、真皮層にその一次構造を与えるが、そこに埋め込まれた正常なヒト皮膚線維芽細胞は、コラーゲン（及び他の生体分子）を産生し、マトリックスに寄与し得る。したがって、コラーゲンマトリックスは、マウス１型コラーゲン及びヒトコラーゲン（ヒト皮膚線維芽細胞から産生される）の両方を含み得る。

本開示の組成物は、ヒトＩ型コラーゲン及びマウスＩ型コラーゲンを含み得、マウスＩ型コラーゲンは、組成物中の総コラーゲンの９０重量％以下である。例えば、いくつかの実施形態において、マウス１型コラーゲンは、組成物中の全型コラーゲンの約６０重量％～約９０重量％である。

生物学的反応性
一般的に言えば、本開示の組成物は、検出可能な病原体を含まない。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、検出可能な病原体を含有しない、ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞バンクに由来する。

特定の実施形態において、本開示の組成物は、ＵＳＰ＜８７＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験されており、細胞毒性を示さないことが見出された。別の特定の実施形態において、本開示の組成物は、ＵＳＰ＜８８＞（インビボ生物反応性）を使用して試験されており、クラスＶＩ基準を満たしている。好ましい実施形態において、本開示の組成物は、ＵＳＰ＜８７＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験されており、細胞毒性を示さないことが見出され、ＵＳＰ＜８８＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験されており、クラスＶＩ標準を満たしている。ＵＳＰ＜８７＞及びＵＳＰ＜８８＞のプロトコルは、当該技術分野で既知である。

本開示の組成物は、抗菌組成物の非存在下で成人の熱傷を治療するための改善された有効性を有する。すなわち、本開示の組成物は、実質的に抗菌組成物を含まず、成人の熱傷を治療する有効性のために抗菌組成物を必要としない。そのような抗菌組成物の例として、マフェニド酢酸塩、銀含有抗菌剤、クロルヘキシジン溶液、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

同種異系細胞化足場
本発明の同種異系培養ケラチノサイト組成物は、同種異系細胞化足場であり得る。本明細書で使用される場合、「同種異系細胞化足場」は、凍結保存され、患者に塗布するために調製され、任意選択的に、患者の創傷床の上に配置するために寸法決定された、本開示の無菌組成物である。「同種異系細胞化足場」という語句は、本明細書において「コンストラクト」という用語と互換的に使用され得る。

同種異系細胞化足場は、上記のように、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む。

製造
本開示の組成物を産生するための好適な製造プロセスは、当該技術分野において既に説明されている。例えば、米国特許第７４９８１６７号、同第７９１５０４２号、同第７８０７１４８号、同第７９８８９５９号、同第８８０８６８５号、同第７６７４２９１号、同第８０９２５３１号、同第８７９０６３６号、同第９５２６７４８号、同第９２１６２０２号、同第９１６３０７６号、同第１００９１９８３号、及びＵＳ２０１９／００３０１３０号を参照されたく、これらの開示は各々、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

上記実施形態の各々において、マウス細胞は、本開示の組成物の製造に使用されない。それにもかかわらず、本開示の組成物は、組成物の細胞が歴史的にどのように培養されたかに起因して、ある特定の規制上の定義の下で異種移植製品とみなされ得る。

凍結保存
本明細書に開示される組成物の各々は、凍結保存され得る。好適な凍結保存の方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ１０，０９１，９８３に開示される。凍結保存された組成物は、グリセリンを含み得る。

本開示の組成物が凍結保存後に解凍された後、組成物は、ヒト成長因子及びサイトカインを含む複数のタンパク質を分泌し得る。例えば、解凍された組成物は、ｂＦＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、ＰｌＧＦ、ＳＤＦ－１α、ＴＧＦ－β１、及びＶＥＧＦ－Ａから選択されるタンパク質を分泌し得る。

パッケージング
本明細書に開示される組成物の各々は、例えば、製造の部位からエンドユーザの部位に送達するために包装され得る。本明細書で使用される包装材料は、３０．０ｋＧｙの目標最小投薬量でガンマ線照射され得る。

いくつかの実施形態において、組成物は、０．００３ｃｃ／１００ｉｎ^２／２４時間未満の酸素透過率を有する包装層に包装され得る。

いくつかの実施形態において、組成物は、０．００６５ｇ／１００ｃｍ^２／２４時間未満の水分透過率を有する包装層に包装され得る。

特定の実施形態において、組成物は、０．００３ｃｃ／１００ｉｎ^２／２４時間未満の酸素透過率及び０．００６５ｇ／１００ｃｍ^２／２４時間未満の水分透過率を有する包装層に包装され得る。

ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、臨床使用のための調製まで包装され、ホイルポーチ内に保管され得る。そのようなホイルポーチは、３０ゲージ層のアルミホイルを含み得る。一般的に言えば、ホイルポーチは、包装、出荷、又は臨床使用中に組成物に接触しない。特定の実施形態において、組成物は、臨床使用のための調製までホイルポーチ内に凍結保存される。

いくつかの実施形態において、本開示の組成物を含むホイルポーチは、９９．７４％の不透明度パーセンテージを含む１８ｐｔの段ボールカートンに保管され得る。例えば、本開示の組成物は、臨床使用のための調製まで、ホイルポーチ内に凍結保存され、９９．７４％の不透明度パーセンテージを含む１８ｐｔの段ボールカートンに保管され得る。

投薬
概して、本明細書に記載の組成物の単位用量は、約１００ｃｍ^２の長方形である。しかしながら、当業者は、単位用量が、製造中に挿入トレイのサイズ及び／又は形状を変更することによって変更され得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、長方形の単位用量は、約８ｃｍ×１２．５ｃｍである。全ての実施形態において、単位用量は、創傷床の形状にトリミングされ得る。

患者は、１つ以上の単位用量を処方され得る。特定の実施形態において、熱傷の治療のための単位用量は、１つ以上の１００ｃｍ^２の長方形であり得る。例えば、深い部分的な厚さの熱傷の治療のための単位用量は、１つ以上の１００ｃｍ^２の長方形であり得る。

特定の実施形態において、単位用量は、単一の患者にのみ塗布するためのものである。

ＩＩ．調製する方法
本開示の別の態様は、患者に塗布するために本明細書に開示される組成物を調製する方法を包含する。本セクションに開示される全ての実施形態において、上記のセクションＩに詳述される同種異系培養ケラチノサイトの組成物を凍結保存し、エンドユーザへの出荷のために包装する。好適な凍結保存の方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ１０，０９１，９８３に開示される。

好適な包装については、上記のセクションＩに記載されている。一般的に言えば、本開示の組成物は、製品皿内に保持された挿入トレイに包装される。組成物の細胞は、挿入トレイとのみ接触するが、製品皿は、挿入トレイ内に保持された細胞に接触する液体を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入トレイは、同種異系培養ケラチノサイト組成物を担持するポリカーボネート膜を含む。ある特定の実施形態において、同種異系培養ケラチノサイト組成物は、真皮側及び表皮側を含む。これらの実施形態において、組成物は、真皮側がポリカーボネート膜と接触するように挿入トレイ内に配置される。ある特定の実施形態において、保持溶液は、ボトル又は同等の容器内に包装され、ホイルポーチなどのポーチ内に密封される。

いくつかの実施形態において、本開示は、熱傷の治療を必要とする患者に塗布するための、同種異系培養ケラチノサイトを含む１つ以上の凍結保存された組成物を調製するための方法を包含する。本方法は、一般に、保持溶液を加温デバイスで加温することと、加温された保持溶液を無菌保持皿に注ぐことと、同種異系培養ケラチノサイト組成物を収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、挿入トレイを保持皿に配置することと、組成物を保持溶液内に最大４時間維持することと、を含む。

保持溶液を加温するために使用される加温デバイスは、約３２℃～４１℃の温度を維持する必要がある。加温デバイスの好適な非限定的な例としては、水浴、加温オーブン、又は加温キャビネットが挙げられ得る。例えば、加温デバイスは、約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、又は４１℃の温度を維持し得る。いくつかの実施形態において、加温デバイスは、約３２℃～約４１℃、約３３℃～約４０℃、約３４℃～約４０℃、又は約３５℃～約３９℃の温度を維持する。特定の実施形態において、加熱デバイスは、約３５℃～３９℃の温度を維持し得る。

いくつかの実施形態において、組成物は、保持溶液中に、約１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１６５、１８０、１９５、２１０、２２５、又は２４０分間維持される。他の実施形態において、組成物は、最大１時間最大２時間、最大３時間、又は最大４時間維持される。更に他の実施形態において、組成物は、約１５分～４時間、保持溶液中に維持される。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、保持溶液を３５℃～３９℃の加温デバイスで加温することと、加温された保持溶液を無菌保持皿に注ぐことと、コンストラクトを収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、挿入トレイを保持皿内に配置することと、コンストラクトを保持溶液中に１５分～４時間維持することと、を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、同種異系培養ケラチノサイトを挿入トレイのポリカーボネート膜から取り出すことを更に含む。そのような実施形態において、本開示の方法は、保持溶液を３５℃～３９℃の加温デバイスで加温することと、加温された保持溶液を無菌保持皿に注ぐことと、コンストラクトを収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、挿入トレイを保持皿内に配置することと、コンストラクトを保持溶液中に１５分～４時間維持することと、同種異系培養ケラチノサイトを挿入トレイのポリカーボネート膜から取り出すことと、を含む。そのような取り出しは、例えば、手袋をした指、又は一対の非外傷性鉗子で行われ得る。

特定の実施形態において、本開示の同種異系培養ケラチノサイト組成物は、患者に塗布される前にメッシュ化され得る。例えば、組成物は、メッシャーを使用して、最大１：１の比率でメッシュ化され得る。いくつかの実施形態において、メッシャーは、保持溶液、無菌０．９％生理食塩水、又は乳酸リンゲル溶液を使用して、接着を防止し、かつ組成物の水分を維持するために、必要に応じて湿らせる。一般的に言えば、組成物が真皮側及び表皮側を含む場合、組成物は、真皮側又は表皮側のいずれかを上にしてメッシュ化され得る。

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、保持溶液を３５℃～３９℃の加温デバイスで加温することと、加温された保持溶液を直ちに無菌保持皿に注ぐことと、コンストラクトを収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、挿入トレイを保持皿内に配置することと、コンストラクトを保持溶液中に１５分～４時間維持することと、同種異系培養ケラチノサイトを挿入トレイのポリカーボネート膜から取り出すことと、を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、最初に、挿入トレイを保持する製品皿を冷凍庫又はドライアイスから取り出すことを含む。いくつかの場合において、製品皿は、上で詳述されるように、ホイルポーチ内に包装されている。ホイルポーチは、上で詳述したように、冷凍庫又はカートン内のドライアイスに保管され得る。かかる実施形態は、カートンを開放することと、製品皿を包含するホイルポーチを取り出すことと、を更に含む。一般的に言えば、冷凍庫又はドライアイスからカートンを取り出すことと、挿入トレイを保持皿に配置することとの間の時間は、１５分を超えてはならない。いくつかの実施形態において、時間は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５分以下である。好ましい実施形態において、時間は、１０分以下である。

挿入トレイは、無菌鉗子、無菌の手袋をした指、又は同様の無菌手段を使用して、製品皿から無菌的に取り出され得る。使用される無菌方法にかかわらず、挿入トレイは、一方の端部から始めて、反対側の端部まで下げて、挿入トレイの下に気泡を閉じ込めることを最小限に抑えるために、保持皿に優先的に配置される。気泡が存在する場合は、挿入トレイを保持皿からゆっくりと持ち上げ、ゆっくりと下げて保持皿に戻す。

熱傷の治療を必要とする患者に塗布するための、同種異系培養ケラチノサイトを含む１つ以上の凍結保存組成物を調製するための本開示の方法は、調製する必要がある組成物の数を決定することを更に含み得る。２つ以上の組成物を調製する必要がある場合、組成物を１バッチ、又は２つ以上のバッチで調製し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の組成物の調製は、約１８分～４時間かかり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の組成物の調製は、約２０分かかり得る。

同種異系培養ケラチノサイトを含む組成物を患者に塗布する前に、適切な創傷床を患者に調製する必要がある。例えば、創傷床は、切除又はデブリードマンを介して調製され得る。

ＩＩＩ．投与する方法
本開示の更に別の態様は、熱傷を治療するために、上記のセクションＩに記載の組成物を投与する方法を包含する。一実施形態において、本開示は、深い部分的な厚さの火傷を有する患者を治療する方法を包含する。例えば、本開示は、外科的介入が臨床的に必要な無傷の皮膚要素を含有する熱傷を有する患者を治療する方法を包含する。そのような方法は、切除又はデブリードマンを介して創傷床を調製することと、１つ以上の調製され、かつ任意選択的にメッシュ化された同種異系培養ケラチノサイト組成物を、調製された創傷床と接触させて配置することと、１つ以上の組成物を創傷床及び／又は周囲の組織に固定することと、を含む。

同種異系培養ケラチノサイト組成物を固定する好適な方法は、ステープル、シアノアクリレートなどの組織接着剤、縫合糸、及びフィブリン糊を含み得る。いくつかの実施形態において、フィブリン糊は、組成物が創傷床上に配置される前に、組成物に塗布される。これらの実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトに細胞死をもたらさない。いくつかの実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトにおける増殖、移動、又は分泌の１０％未満の変化をもたらす。特定の実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、皮膚移植片採取、創傷床接着、又はそれらの組み合わせのパーセンテージを増加させる。別の特定の実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、細菌感染、失血、術後疼痛、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の副作用を減少させる。更に別の好ましい実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトの生存能力の３０％未満、２０％未満、又は１０％未満の減少をもたらす。例えば、フィブリン糊を組成物に塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトの生存能力の３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％未満の減少をもたらし得る。特定の実施形態において、フィブリン糊を組成物に塗布することは、同種異系培養ケラチノサイトの生存能力を増加させ得る。

１つ以上の組成物は、本開示の方法において使用され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超える組成物を使用して、対象の１つ以上の創傷床を覆い得る。２つ以上の組成物を使用する場合、組成物は、互いに当接し得る。２つ以上の組成物が重なってもよいが、それは必要ではない。一般的に言えば、２つ以上の組成物を使用する場合、組成物は、創傷床の表面全体にわたって接触を有するように互いに当接している。特定の創傷床が単一の組成物よりも小さい場合、組成物は、固定する前又は後にトリミングされて、余分な組成物を除去し得る。本明細書で使用される場合、「余分な」は、創傷床を覆うため、又は組成物を創傷床に固定するために必要とされない組成物を指す。

典型的には、コンストラクトの構造的完全性を低下させないように、組成物を配置し、固定する。この点で、組成物の構造的完全性が低下させるような様態で組成物を延伸又は拡張させないように注意を払うべきである。

本発明の組成物は、配置され、固定された後、１つ以上の包帯、ボルスター、又はラップによって覆われ得る。例えば、本開示の方法は、１つ以上の組成物の上に多孔質の非接着性接触包帯を配置することを更に含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、第１の包帯の上に第２の層の包帯を再生することを更に含み得る。一般的に言えば、そのような包帯には銀を含めるべきではない。包帯は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０日間所定の位置に放置され得る。例えば、包帯は、約４～約８日間所定の位置に放置され得る。いくつかの場合において、包帯は、約１週間所定の位置に放置され得る。

本開示の方法はまた、１つ以上の包帯の上に、１つ以上の組成物が移動するのを防ぐ外側ボルスター又はラップを配置することを含み得る。本開示の方法は、配置された組成物が取り外された場合、医療提供者に連絡することを更に含み得る。

更なる実施形態において、本開示の方法は、未使用の組成物の、外科的バイオハザード廃棄物の処分を含み得る。

いくつかの実施形態において、組成物は、配置の前に最大１：１の比率でメッシュ化され得る。

ほとんどの実施形態において、本明細書に記載の組成物の配置後の過敏反応は、治療された成人患者の１０％未満で生じる。いくつかの実施形態において、過敏反応は、治療された成人患者の５％未満で生じる。他の実施形態において、過敏反応は、患者の１％未満で生じる。

本明細書に開示の組成物は、マウスコラーゲン又はウシ若しくはブタ由来の成分を含む製品に対して既知のアレルギーを有しない患者に好適であり得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、マウス細胞が細胞化足場の初期発達において使用されたことを成人患者に通知することを包含する。他の実施形態において、本開示の方法は、細胞化足場が、グリセリンを含み、患者がグリセリンに感受性がある場合に刺激を引き起こす可能性があることを成人患者に通知することを含み得る。そのような情報は、組成物を配置する前に、患者又は患者の代理人に中継され得る。

上記の実施形態の各々において、組成物は、上記のセクションＩで詳述した同種異系細胞化足場であり得る。

特定の実施形態において、本開示は、無傷の皮膚要素を含む創傷の治療のための外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法を包含し、本方法は、創傷に同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む。

他の具体的な実施形態において、本開示は、熱傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする成人患者の無傷の皮膚要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法を包含する。

更に他の具体的な実施形態において、本開示は、深い部分的厚さの火傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法を包含する。

更に他の具体的な実施形態において、本開示は、外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法であって、細胞化足場コンストラクトを含む同種異系培養ケラチノサイトの組成物を、外科的に調製された創傷床に塗布することを含み、足場コンストラクトが、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを更に含む、方法を包含する。

定義
本明細書で使用される場合、「保持溶液」は、栄養源及び浸透圧調節剤を含む細胞培地を指す。保持溶液は、本開示の凍結保存された組成物を解凍する、及び／又は組成物から凍結保護剤を除去するために使用される。いくつかの実施形態において、保持溶液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を含む。特定の実施形態において、保持溶液は、Ｆ－１２栄養素混合物を含む。好適な保持溶液は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第ｘｘｘ号に更に記載される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値が、エンドポイントを「少し上回って」又は「少し下回って」いてもよいことを提供することによって、数値範囲エンドポイントに柔軟性を提供するために使用される。例えば、エンドポイントは、リストされた値の１０％、８％、５％、３％、２％、又は１％以内であり得る。更に、利便性及び簡潔性のために、「約５０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬ」の数値範囲もまた、「５０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ」の範囲を支持することを理解されるべきであるエンドポイントはまた、ＦＤＡ、ＵＳＰなどの適切な規制機関によって許容される可変性に基づき得る。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰せられる意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得、概して、オープンエンド用語であると解釈される。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語は、クローズド用語であり、そのような用語と併せて具体的にリストされている構成要素、構造、ステップなど、及び米国特許法に準拠しているもののみを含む。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、米国特許法によって、概してそれらに帰属される意味を有する。具体的には、そのような用語は、それらに関連して使用されるアイテムの基本的及び新規の特性又は機能に実質的に影響を与えない追加のアイテム、材料、構成要素、ステップ、又は要素を含めることを許可することを除いて、概して、クローズド用語である。例えば、組成物中に存在するが、組成物の性質又は特徴に影響を与えない微量元素は、そのような用語に続くアイテムのリストに明示的に列挙されていなくても、言語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の下に存在する場合、許容されるであろう。本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のようなオープンエンド用語を使用する場合、明示的に記載されているかのように、言語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び言語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に直接的な支持が与えられるべきであり、その逆もまた同様であると理解されたい。

本明細書で使用される場合、「無菌」という用語は、検出可能な微生物又は真菌汚染が本質的に又は完全にない真皮等価物を指す。

本明細書で使用される場合、「ＮＩＫＳ細胞」という用語は、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２１９１として堆積された細胞の特徴を有する細胞を指す。「ＮＩＫＳ」は、ｎｅａｒ－ｄｉｐｌｏｉｄ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓの略であり、登録商標である。

本明細書で使用される場合、「生存可能」という用語は、皮膚等価物を参照して使用される場合、凍結保存後の皮膚等価物中の細胞の生存能力を指す。好ましい実施形態において、「生存可能」皮膚は、ＭＴＴアッセイによって測定したときの対照非凍結保存組織の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、又は同様の生存能力アッセイの読み出し値の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％のＡ５５０を有する。

本明細書で使用される場合、「組織容器」、「組織容器アセンブリ」、「製品皿」、及び「保持皿」という用語は、組織（例えば、同種異系細胞化足場製品）を保管、輸送、及び／又は解凍するために使用される容器を指すために互換的に使用される。複数の組織容器は、組織を保管及び解凍するプロセスで使用され得る。例えば、同種異系細胞化足場製品は、第１の組織容器に凍結保存及び保管され得、第２の組織容器は、第１の組織容器に接続して、第１の組織容器への蓋として機能するように構成され得、その結果、組織容器アセンブリは、同一の上部及び下部として機能する第１及び第２の容器を含む。加えて、保持皿は、その中に保管された同種異系細胞化足場製品のない組織容器であり得る。保持皿は、同一の上部及び下部として機能する２つの組織容器を含み得る。

本明細書で使用される場合、「トレイ」及び「挿入トレイ」という用語は、同種異系の細胞化足場製品を保持し、組織容器内に挿入されるか、組織容器内に収まるか、又は組織容器内部に置かれるように操作可能なトレイ又は皿を指すために互換的に使用される。

以下の実施例は、本発明の様々な反復を例示する。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表すことを当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において変更を行い得、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似又は同様の結果を得ることができることを理解すべきである。したがって、添付の図面に記載されるか、又は示される全ての事項は、例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。

実施例１：説明
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、単一のヒトドナーからの分化した多層の表皮ケラチノサイトからなる完全に層状化された表皮層を含有する、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系、細胞化足場製品である。ケラチノサイトは、第２のヒトドナーからの線維芽細胞で埋め込まれた精製されたマウスＩ型コラーゲンマトリックス上で成長させる（すなわち、別個に供給される）。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、検出可能な病原体を含有しない、十分に特徴付けられたヒトケラチノサイト及び線維芽細胞バンクから産生される。細胞は、代謝的に活性な同種異系ＮＩＫＳケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞である。一実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、４３継代及び６継代それぞれ培養されるＮＩＫＳケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞を含み得、固定非依存性成長（細胞形質転換の可能性を評価する標準アッセイ）を示さない。別の実施形態では、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ＮＩＫＳケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞を含み得、これらはそれぞれ、継代４０及び７にあり、固定非依存性成長を示さない。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに含有されるＮＩＫＳケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞は、核型的に安定であり得る。別の実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの表皮層は、新生児ヒト包皮から単離された正常なケラチノサイト（ＢＣ－１－Ｅｐ）に由来するＮＩＫＳケラチノサイトから生成される。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、検出可能な病原体を含有しない、十分に特徴付けられたヒトケラチノサイト及び線維芽細胞バンクから産生される。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの細胞成分は、腫瘍原性について広範囲に試験されている一実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの腫瘍形成能は、ＮＩＫＳケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞の核型安定性によって評価される。別の実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの腫瘍形成能は、免疫不全マウスへのＮＩＫＳケラチノサイトの単一の皮下注射によって評価され、これは、注射後２３週間までに腫瘍形成をもたらさない（すなわち、安全性の陽性表示）。更なる実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの腫瘍形成能は、免疫不全マウスの全層切除創傷にＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを局所適用することによって評価され、これは、投薬後２０週までに腫瘍形成をもたらさない（すなわち、安全性の陽性表示）。別の実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの毒性又は腫瘍形成能は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに曝露された免疫不全の無胸腺ヌードマウスによって評価される。より具体的には、一実施形態において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの毒性は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの無胸腺ヌードマウスに１４ｃｍ^２（約２５％の全身表面積）を全層切除創傷に投与／塗布することによって評価され、続いて９０～１４０日（１３～２０週間）の局所毒性又は全身毒性について評価され、局所毒性又は全身毒性の証拠は観察されない（すなわち、安全性の陽性表示）。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴのケラチノサイト成分が元々マウス細胞系の存在下で得られたため、異種移植製品であると考えられる。しかしながら、マウス細胞は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを製造するためにもはや使用されない。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴでは、マウス細胞又はマウス由来の感染性因子は検出不可能である。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品製造には、マウスコラーゲン、ウシ血清、ブタトリプシン、及び精製ウシ血清アルブミンを含む動物材料に由来する試薬が含まれる。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトは、支持ポリカーボネート膜挿入物にゆるやかに接着しており、グリセリン含有培地中で処理される。各凍結保存されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトには、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを調製するために使用される保持溶液及び保持皿が供給される。保持溶液は、増殖因子が補充されていない細胞培養培地である。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ヒト皮膚の毛包間表皮のいくつかの構造的及び生物学的特性を有する。ヒト皮膚の毛包間表皮によく似たＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの層状表皮層は、ＮＩＫＳケラチノサイトのインビトロ有機型培養によって産生される。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの免疫組織化学及び間接免疫蛍光分析は、高い核質対細胞質比を有する立方体細胞の単一の基底層を含有する典型的な表皮形態を明らかにした。基底層は、層状化された、有棘層、顆粒層、及び角化層の下に存在する。ヘマトキシリン及びエオシン染色後、顆粒層は、成熟した表皮の特徴である、明確に染色されたケラトヒアリン顆粒、及び明確に定義された除核した角質層を示した。図１８は、固定され、埋め込まれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトの形態を示す。

角質層内の有能な表皮透過性バリアの形成は、角膜細胞間の細胞外空間を満たす特化した脂質ラメラの集合体に依存する。四酸化ルテニウムで染色すると、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、脂質ラメラの特徴である、交互の高電子密度及び低電子密度染色パターンを示す（図１９）。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトのバリア機能の完全性を、皮膚ＳＥＩを測定することによって評価した。結果は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴが天然のヒト皮膚に匹敵するバリア機能を示したことを実証した。

製造
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに準拠して無菌条件下で有機型培養によって製造された。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを産生するためのプロセスは、表皮層状化及びバリア機能を促進するように最適化された。臨床使用の前に、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴロットを独自の試験に供して、品質、無菌性、同一性、純度、及び効力を確認した。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの凍結保存は、１２ヶ月の保存期間中、細胞生存能力及び代謝活性を維持する。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、解凍プロセスの開始まで、輸送、保管、及び手術室への移送中、超低温条件（例えば、－７０℃～－９０℃（－９４°Ｆ～－１３０°Ｆ）の冷凍庫内又はドライアイス上）で維持する必要がある。例えば、ドライアイス上に出荷され、－７０℃～－９０℃で保管される。保持溶液及び保持皿は、別々に包装され、周囲温度で出荷される。

アプリケーション
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系、細胞化足場製品である。各コンストラクトは、単一の患者にのみ塗布するためのものである。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、自家移植メッシュ化デバイス（破砕又は非破砕）と互換性があり、最大１：１の比率でメッシュ化することができる。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、構造的完全性を低下させる可能性があるため、延伸又は拡張されるべきではない。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、創傷床の表面全体にわたって接触を有する必要があり、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴが取り外されることを防ぐために、接着剤、ステープル、又は縫合糸を使用して固定することができる。大きな創傷領域を覆うために複数のコンストラクトが必要である場合、重ねるのではなくコンストラクトを当接させることが推奨される。

作用の機序
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、創傷修復及び再生に関与することが知られている、様々な成長因子、サイトカイン、及びヒト細胞外マトリックスタンパク質を産生及び分泌する、代謝活性細胞を含有する同種異系細胞化足場製品である（図２０Ａ～図２０Ｃ）。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、生着せず、時間が経つにつれて患者自身の細胞に置き換えられ、治療された創傷の大部分の最終的な閉鎖を得るための自家移植の必要性を排除又は低減する。

表皮成分の最上層は、微生物及び水分損失に対する物理的障壁としての役割を果たす。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、様々な成長因子、サイトカイン、及びペプチドを産生及び分泌するために、局所創傷環境と相互作用する生存細胞を提供する。表皮層中のＮＩＫＳケラチノサイトは、正常な接着タンパク質（例えば、インテグリン及びカドヘリン）を産生し、細胞間及び真皮等価物への密接な接着を可能にする。これらの接着は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに取り扱い特性を付与し、分層皮膚移植で定期的に行われるように、メッシュ化及び固定された配置が可能になる。しかしながら、前述したように、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、コンストラクトの構造的完全性を破壊する可能性があるため、延伸又は拡張すべきではない。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、生着によって治癒しない。第１ｂ相（ＳＴＲＡＴＡ２０１１）及び第３相（ＳＴＲＡＴＡ２０１６）試験中、配置後３ヶ月に採取された生検は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの同種異系細胞から検出可能なＤＮＡを含有しなかった。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位からのＤＮＡで検出された対立遺伝子は、以前の患者試料と一致し、対象自身の細胞による治癒、及び創傷治癒全体にわたるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの転換を示した。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ配置後３ヶ月のいずれの対象においても、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ ＤＮＡは治療部位に残存しなかった。

産生される生物活性因子
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴによって産生される多くの生物活性因子（成長因子、サイトカイン、ケモカイン、及びプロテイナーゼ）は、創傷治癒の様々な段階と関連している。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを臨床使用説明書に従って解凍した後、インビボ試験により、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの生存細胞による周囲の培地への成長因子、サイトカイン、及びプロテイナーゼ（ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰｌＧＦ、ＴＧＦ－β１、ＶＥＧＦ－Ａ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ８、ＩＬ－１０、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、及びＳＤＦ－１α［ＣＸＣＬ１２］）の分泌が同定された。

メッシュ化後、いくつかの成長因子、酵素、及びサイトカインの大きさの変化を、インビトロ再培養後、１時間から最大７日間観察した。

生体反応性
インビトロでのＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの物理的摂動に応答して、成長因子、サイトカイン、及びプロテイナーゼ分泌の大きさの変化が観察された。解凍後、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを、１：１の比率でメッシュ化するか、又は７日間のインビトロ実験の前に無傷のままにした。生物活性因子分泌を、メッシュ化後、１時間から開始し、最大７日間測定した。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、メッシュ化の外部機械的刺激に応答して、異なるレベルの生物活性因子を分泌した。ｂＦＧＦ、ＩＬ－１α、ＳＤＦ－１α、及びＭＭＰ－９などの因子の分泌の変化は、メッシュ化の１時間以内に観察され、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ内の細胞が外部刺激に応答して生物活性であることを示す。

免疫プロファイル
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、免疫学的応答について試験されている。第１／２相試験において、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、標準治療対照である同種移植片と比較して、追加の急性炎症細胞浸潤を誘導しなかった。同研究において、患者から採取したＰＢＭＣは、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴへの曝露後、ＮＩＫＳケラチノサイトに対する応答性の増加を示さなかった。患者ＰＢＭＣはまた、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴへの曝露の前及び後に、インビトロで同様のナチュラルキラー細胞媒介性のＮＩＫＳケラチノサイトの死滅を示した。健康で、火傷をしていない対象集団に対する試験では、これらの結果は、火傷患者の免疫不全状態に起因して誤って表されていないことが確認された。

第３相ピボタル試験（ＳＴＲＡＴＡ２０１６）では、治療前に、患者の４．３％が、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに見られる対立遺伝子に反応性を有し、患者の５．７％が、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに見られない対立遺伝子に反応性を有した。３ヶ月時点で、患者の２４．２％が、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに見られる対立遺伝子に対する反応性を有し、患者の３０．６％が、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに見られない対立遺伝子に対する反応性を有した。ＢＳＡに対する抗体の開発には既知の臨床的意義はないが、抗ＢＳＡ抗体レベルは、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療患者の２２．４％でベースラインから３．８月まで増加した。全体的に、観察された反応性は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの細胞の特定の対立遺伝子を標的としなかった。これらの観察は、重度の火傷の標準治療のために他の同種異系製品を投与することが多いため、火傷患者に見られる広範な感作及び／又は異種感作と一致していた。

ランゲルハンス細胞の非存在
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ランゲルハンス細胞などの樹状細胞を含有しない。ランゲルハンス細胞は、しばしば、主要な組織適合性複合体クラスＩＩ抗原を発現することができる健康な表皮内の唯一の細胞型とみなされる。ランゲルハンス細胞又は白血球（プロフェッショナル抗原提示細胞）を含有しない、操作された皮膚組織は、同種移植片抗原提示の可能性を大幅に低減する。

実施例２：使用法
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、外科的介入が臨床的に必要な無傷の皮膚要素を含有する熱傷（深い部分的な厚さの火傷）を有する成人の治療に必要な同種異系細胞化足場製品である。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、調製された創傷床（切除／デブリードマン）に局所塗布するためのものである。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトは、約１００ｃｍ^２（約８ｃｍ×１２．５ｃｍ）のオフホワイト長方形である。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトは、創傷領域の形状及びサイズに適合するようにトリミングされ得る。塗布されるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの表面積は、治療される創傷の表面積と等しくなければならない。複数のコンストラクトを塗布して、大きな創傷領域を覆うことができる。創傷領域を覆うために複数のコンストラクトが必要な場合、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトに当接するか、又は隣接し、端部を重ねる必要はない。各コンストラクトは、単一の患者にのみ塗布するためのものである。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、適切な外科的環境で調製する必要がある。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、以下のように供給される。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴカートンは、ラミネートされたホイルポーチを収容する（図１）。ポーチ内には、ポリスチレン挿入トレイにＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを収容するＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿がある（図２）。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿の内側には、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトを収容するポリスチレン挿入トレイがある（図３）。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ポリスチレン挿入トレイフレーム内に収容されるポリカーボネート膜にゆるやかに接着されている。保持溶液は、ラミネートされたホイルポーチに収容されたプラスチックボトルに提供されている（図４）。同一の上部及び下部からなる保持皿（図６）は、透明なポーチに収容されている（図５）。

以下の供給品は含まれていないが、調製に必要である：
－メッシャー：ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、自家移植メッシュ化デバイス（破砕又は非破砕）と互換性があり、最大１：１の比率でメッシュ化することができる
－加温オーブン／キャビネット又は水浴

創傷床調製（切除／デブリードマン）の後、解凍する必要があるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトの数を決定する。次の手順は、１つのＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトを調製するためのものである。２人の操作者（１人の無菌操作者及び１人の非無菌操作者）が必要である。２つ以上のＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトが必要な場合、それらを１つ以上のバッチで調製する。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクト調製は、単一のコンストラクト又はコンストラクトのグループについて約２０分かかるべきである。調製には次のステップが含まれる：
１．保持溶液ボトルを、ラミネートされたホイルポーチから取り出す。保持溶液は、透明な液体である。ボトルの内容物が濁っているか、又は不透明に見える場合は、保持溶液を使用しない。配置のために調製をしている１つのコンストラクトには、保持溶液のボトルを１本使用する。
２．保持溶液を加温オーブン／キャビネット又は水浴で加温する。
オプション１：
使用前に少なくとも４５分間、３５℃～３９℃（９５°Ｆ～１０２°Ｆ）で動作する加温オーブン／キャビネットに保持溶液ボトルを配置する。
オプション２：
保持溶液ボトルを、３５℃～３９℃（９５°Ｆ～１０２°Ｆ）の水浴中に少なくとも１５分間配置して、使用する。ボトルのキャップ又はねじ山を浸水させない。
３．非無菌操作者は、保持皿ポーチのシールを開放し、無菌野に配置するために保持皿を無菌操作者に無菌で提示する（図７）。無菌操作者は、非無菌操作者が提示した保持皿を無菌で取り出し（図７）、無菌野に配置する（図８）。
４．ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴカートンを冷凍庫又はドライアイスから取り出す。
注：ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを冷凍庫又はドライアイスから取り出してから１０分以内にステップ４～１１を完了する必要がある。
５．ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴカートンを開放し、ホイルポーチを取り出す（図９）。
６．ホイルポーチを剥がして、開放し、閉鎖されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿（図１０）を慎重に取り出す。
７．コンストラクトを収容する未開封のＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿は、無菌野の外側の平坦な表面上に配置され得る（図１１）。
８．非無菌操作者は、加温された保持溶液を加温デバイスから取り出した直後に、施設の手順に従って無菌技術を使用して、加温された保持溶液のボトル全体を１つの無菌保持皿に注ぐ（図１２）。
９．非無菌操作者は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿の蓋を取り外し、挿入トレイに接触せずにＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿を保持する（図１３）。
１０．無菌操作者は、無菌鉗子又は無菌の手袋をかけた指を使用して、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ挿入トレイをＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ製品皿から無菌で取り出す（図１４）。
１１．無菌操作者は、挿入トレイを、一方の端部から始まり、反対側の端部に下ろして、挿入トレイの下に気泡を閉じ込めることを最小限に抑えて、保持皿に配置する（図１５）。挿入トレイの下に気泡が閉じ込められた場合、挿入トレイをゆっくりと持ち上げ、保持溶液にゆっくりと戻す。
１２．ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトを保持溶液で最低１５分～最大４時間維持する。
１３．無菌の手袋をした指又は無傷鉗子を使用して、挿入トレイのポリカーボネート膜からＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを取り出し、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを最大１：１の比率でメッシュ化する。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを乾燥させない。保持溶液、無菌０．９％生理食塩水、又は乳酸リンゲル液を使用して、接着を防止し、かつＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ水分を維持するために、必要に応じてメッシャー／組織板を湿らせる。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、真皮（光沢のある）側がポリカーボネート膜と接触するように包装される。コンストラクトは、いずれかの側を上にしてメッシュ化され得る（図１６）。メッシュ化及び配置の前に、どちらの側が真皮（光沢あり）であり、どちらの側が表皮（光沢なし）であるかに注意する。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、訓練を受けた医療提供者によって適切な無菌状態で塗布される。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの局所塗布については、以下のステップに従う：
１．フィブリン糊を使用して、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを固定する場合は、メッシュ化されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを、調製された創傷床に配置する前に塗布する。フィブリン糊以外の固定方法を利用する場合は、ステップ２から開始する。
２．メッシュ化されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを、真皮（光沢のある）側を下にして、患者の調製された創傷床に接触させて配置する。表皮（光沢のない）側が上を向いていることを確認する。複数のＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクトを配置する場合のコンストラクトについて。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴコンストラクト端部を重ねることは必要ない。
注：治療する面積が１つのコンストラクトよりも小さい場合は、創傷床に固定する前又は後に、余分なＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴをトリミングする。
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴが創傷床の表面全体にわたって接触を有することを確認する。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの構造的完全性を低下させる可能性があるため、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを延伸又は拡張させない。
３．ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴをステープル、シアノアクリレートなどの組織接着剤、又は縫合糸で固定して、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴが取り外されることを防ぐ。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの上に多孔質の非接着性接触包帯を配置し、包帯を交換する前に１週間、所定の位置に放置する。
４．銀を含有しない第２の層の包帯を配置する。
５．ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴを臨床的に適切に動かさないようにする、外側のボルスター又はラップの配置は、医師の裁量に委ねられている。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、皮膚線維芽細胞を含有するゲル化コラーゲン上で成長したケラチノサイトに由来する生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系細胞化足場製品からなる約１００ｃｍ^２（約８ｃｍ×１２．５ｃｍ）のオフホワイトの長方形シートである。

マウスコラーゲン又はウシ若しくはブタ由来の成分を含有する製品に既知のアレルギーがある患者には使用しない。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、グリセリンを含有する。グリセリンに対する感受性（刺激反応）が既知である患者には、グリセリンを避ける。

重度の過敏反応が起こる可能性がある［禁忌（４）を参照］。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ塗布後の早期及び後期の症状及び過敏反応の徴候を監視し、標準的な医療行為に従って治療する。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ヒトドナー由来の細胞を含有し、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）又はバリアントＣＪＤとしても知られる）を引き起こす薬剤を含む、感染性疾患又は感染性因子、例えば、ウイルス、細菌、又は他の病原体を伝播し得る。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、ケラチノサイト細胞が、よく特徴付けられたマウス細胞に歴史的に曝露されているため、異種移植製品である。細胞バンクは、試験され、検出可能な外来性感染性物質が含まれていないことが判明しており、マウス細胞は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの製造にはもはや使用されていない［説明（１１）を参照］が、これらの措置は、感染性疾患及び病原体を伝播するリスクを完全に排除するものではない。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴによる感染性疾患又は感染性因子の伝播は報告されていない。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、異種移植製品であるため、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴレシピエントは、ヒトで使用するために全血、血液成分、血漿、白血球、組織、母乳、卵子、精子、又は他の身体部分を提供するべきではない。

実施例２：臨床研究
外科的切除及び自家移植が臨床的に必要であった無傷の皮膚要素を含有する熱傷を有する成人患者におけるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの有効性は、１２ヶ月間の２つの無作為化されたオープンラベルの患者内対照の多施設臨床研究（研究１及び研究２）で評価された。両方の研究において、各患者の２つの同等の創傷部位を選択し、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの局所付与又は自家移植のいずれかを受けるように無作為化した。自家移植片が患者内対照として機能した。

研究１は、３～３７％の全体表面積（ＴＢＳＡ）を含む、無傷の皮膚要素を含有する急性熱傷（深い部分的な厚さの火傷）を有する７１人の成人患者を登録した。火傷から研究治療までの時間は、１～１８日間であった。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療創傷のサイズは、１２～９６０ｃｍ^２であった。平均年齢は、４４歳（１９～７９歳）で、男性は７８％であった。患者の７８％は白人、２０％は黒人又はアフリカ系アメリカ人、残りは、アジア人又はその他であった。有効性は、以下に基づいて確立された：（１）治療後３ヶ月までに自家移植を必要としたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位及び対照自家移植治療部位の面積率の差、並びに（２）自家移植片配置を伴わずに３ヶ月目にＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の持続的な創傷閉鎖を達成した患者の割合。３ヶ月目における持続的な創傷閉鎖は、少なくとも２週間以上５ヶ月以内の間隔で、３ヶ月の時点を含む、又はそれを包含する２回の連続した研究来院での創傷閉鎖として定義された。

３ヶ月までに自家移植を必要としたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ及び対照自家移植治療部位の面積率の差は、９７．８％±１６．６％であった（ｐ＜０．０００１）。３人の患者は、３ヶ月までに、彼らのＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の一部又は全てを自家移植し、３人の患者のうちの２人もまた、彼らの自家移植対照研究部位の一部又は全てを再移植した。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療された火傷部位の９６％（６８／７１）について、ドナー部位採取を排除した。その結果、これらの潜在的なドナー部位で痛み及び瘢痕が有意に低減し、無傷のままであった（ｐ＜０．０００１）。コスメシスは、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位と自家移植治療部位との間で類似していた。

自家移植片配置を伴わずに３ヶ月目にＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の持続的閉鎖を達成した患者の割合は８３．１％（９５％ＣＩ：７４．４、９１．８）であった。追加の自家移植片配置を伴わずに３ヶ月目に自家移植対照治療部位の持続的閉鎖を達成した患者の割合は、８６％であった（９５％ＣＩ：７７．８、９４．０）であった。

人種、民族、性別、年齢、ＴＢＳＡのパーセンテージでの火傷サイズ、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療領域、及びＢａｕｘスコア（火傷による死亡率を推定するための採点システム）のサブグループでは、有効性結果は、全体的な研究１集団の結果と概して一致していた。

研究２は、無傷の皮膚要素を含有し、かつ３～４９％のＴＢＳＡを含む、急性熱傷（深い部分的な厚さの火傷）を有する３０人の成人患者を登録した。火傷から研究治療までの時間は、３～１３日間の範囲であった。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療創傷のサイズは、５２～４４０ｃｍ^２であった。平均年齢は、４１歳（２１～６３歳）であった。患者の９３％が白人であり、７％が黒人又はアフリカ系アメリカ人であった。男性は、集団の７０％を占めていた。

有効性は、以下に基づいて評価された：（１）ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療後２８日までに自家移植されたＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の面積率、及び（２）３ヶ月までに完全な創傷閉鎖を達成した治療部位の割合。完全な創傷閉鎖は、ドレナージの非存在下で９５％以上の再表皮化として定義された。

２８日までに自家移植を必要とするＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位はなかった。２８日～３ヶ月目で、１人の患者は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位及びその後自家移植で治療された自家移植部位の両方を有し、２人目の患者は、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の２５％を自家移植した。３ヶ月目に、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位の９３．１％及び自家移植治療部位の１００％が、完全な創傷閉鎖を達成した。３ヶ月目に完全な創傷閉鎖を達成した全てのＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位は、治療後６ヶ月及び１２ヶ月目に評価した場合、閉鎖したままであった。

実施例３：臨床薬理学
ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、様々な成長因子及びサイトカインを産生及び分泌する代謝活性細胞を含有する同種異系細胞化足場製品である。インビトロ研究により、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴがヒト成長因子及びサイトカインを分泌し、ヒト細胞外マトリックスタンパク質を含有することが示された。成長因子、サイトカイン、及び細胞外マトリックスタンパク質は、創傷修復及び再生に関与することが知られている。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴは、恒久的に移植されたままではなく、時間の経過とともに患者自身の細胞に置き換えられ、治療された創傷の大部分の最終的な閉鎖を得るための自家移植の必要性を排除又は低減する。研究１及び研究２の合計８５人の患者を、３ヶ月目に、治療部位における同種異系ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ ＤＮＡの持続性について評価した。具体的には、３ヶ月目に、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位からの組織試料を、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴからの同種異系ＤＮＡの存在について試験し、ベースラインからの血液参照試料からの結果と比較した。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ関連ＤＮＡは、これらの患者で検出されなかった。分析は、患者（ｎ＝５７）が３ヶ月目に、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ治療部位においてＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴからの残存同種遺伝子ＤＮＡの徴候を示さなかったことを示し、これは患者自身の細胞による創傷治癒と一致している。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの薬力学及び薬物動態効果は、知られていない。

実施例４：特定の集団における有害反応及び使用
最も一般的な有害反応（発生率２２％）は、かゆみ（掻痒）、水疱、肥厚性瘢痕、及び治癒障害であった。（表１）。

臨床試験は、大きく異なる条件下で実施されるため、ある薬物の臨床試験で観察された有害反応率は、別の薬物の臨床試験での有害反応率と直接比較することはできず、実際に観察された有害反応率を反映していない可能性がある。このセクションに記載されている安全性データは、米国で実施された４つの無作為化された被験者内対照研究におけるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴへの曝露を反映しており、これには、深い部分的な厚さの熱傷を有する患者を対象とした２つの臨床研究（研究１及び研究２）、及び熱傷又は他の原因による全層の複雑な皮膚欠陥を有する患者を対象とした２つの臨床研究が含まれる。合計１１９人の成人患者（１０１人の深い部分的な厚さの熱傷を有する患者、１８人の全層の複雑な皮膚欠損を有する患者）がＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの局所塗布を受けた。患者集団は、１９～７９歳（平均年齢４３歳）の範囲であった。各患者は、１つの創傷部位でＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの局所塗布を受け、別の創傷部位で患者内比較対象として自家移植（１０４人の患者）又は死体同種移植（１５人の患者）のいずれかを受けた。４つの研究で観察された最も頻繁な有害反応（発生率２２％）を表１に要約する。有害反応のために研究参加を中止した患者はいなかった。

全体的に、紅斑、腫脹、局所熱感、及び創傷部位感染を含む創傷関連事象に関するＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの安全性プロファイルは、これらの研究における自家移植のものと同様であった。

臨床研究では、ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴに対する拒絶反応の報告はなかった。１２ヶ月を超えるＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの安全性は、臨床試験では評価されなかった。

潜在的な薬物相互作用も評価した。ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴの塗布後、マフェニドアセテートの使用は推奨されない。この局所抗菌剤は、ケラチノサイト生存能力を低減させ、ＮＩＫＳ（登録商標）ケラチノサイト又は初代ケラチノサイトからなる組織操作されたヒト皮膚代替物の完全性を破壊することが示されている（Ｇｉｂｓｏｎ ＡＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．２００８ Ｍａｙ；１４（５）：６２９－３８を参照）。

インビトロデータは、銀がケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞の生存能力を減少させ得ることを示唆しているため、銀含有抗菌剤又は包帯の使用は推奨されない（Ｎｅｓｐｏｒｏｖａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０２０ Ｓｅｐ；１０（１）：１５２１６参照）。

ＳＴＲＡＴＡＧＲＡＦＴ塗布後の創傷に対する抗菌性クロルヘキシジン溶液の使用は推奨されない。この材料は、ケラチノサイト及びヒト皮膚線維芽細胞に対して毒性であることが示されている（Ｂｏｙｃｅ ＳＴ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ．１９９５ Ｍａｒ－Ａｐｒ；１６（２ Ｐｔ １）：９７－１０３参照）。

実施例５：
ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織は、切除された創傷床に配置された後、皮膚移植片を固定するために日常的に使用される様々な固定方法を使用して固定され得る。フィブリンシーラントは、従来の固定方法（すなわち、縫合糸又はステープル）の代替として、それらの迅速な塗布プロセス及び改善された創傷床接着のために調査されている^１。フィブリン糊の使用はまた、皮膚移植片採取のパーセンテージを改善することも示されており、これは、火傷が、移植又は固定することが困難である領域に位置する場合に特に当てはまる^２。加えて、フィブリンシーラントの接着性が、細菌感染、失血、及び術後の痛みの発生を低減させ得る証拠を示唆している^２、３。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ組織は、様々な創傷治癒因子を分泌する生存細胞を含有するため、組織生存能力に悪影響を及ぼすシーラントが、製品の有効性を低減させ得る可能性がある。

フィブリン糊によるＳｔｒａｔａｇｒａｆｔの固定は、これまでに、実験モデル又は臨床研究では評価されていない。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔで使用するためのフィブリン糊の適合性を確立するために、この研究は、組織生存能力に対するＡＲＴＩＳＳフィブリンシーラントの影響を評価するために実施された。

この研究の結果は、ＡＲＴＩＳＳフィブリン糊への曝露が組織生存能力に悪影響を及ぼさないことを示した。興味深いことに、実験群は、対照と比較して生存能力の統計的に有意な増加を実際に見たが、この結果は２つのパイロット研究では観察されなかった。これらの結果は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織とのＡＲＴＩＳＳの使用が、実質的な細胞死をもたらさないことを示しており、治療成果が損なわれる可能性は低い。

実験計画：
フィブリン糊の適合性を、Ｓｔｒａｔａｇｒａｆｔ組織及び生存不可能な簡易真皮等価物（ｓＤＥ）を使用して評価した。

これらの研究は、６ウェルフォーマットの組織培養挿入で産出された生存不可能なｓＤＥ層上で培養された組織パンチからなるインビトロ創傷モデル系を使用した。生存不可能なｓＤＥは、このプロジェクトのために特別に開発された改変バッチ記録を使用してＳｔｒａｔａｔｅｃｈ研究室で生成された。製造の終了時に、ｓＤＥを６ウェル挿入内で無菌６ウェル皿に無菌で移し、次いで標準的な手順を使用して最終製品ポーチ内に密封した。最終製品包装ステップに続いて、ｓＤＥを超低温冷凍庫で凍結し、使用のために解凍するまで－７０～－９０℃で保管した。凍結保護剤治療ステップがなかったため、ｓＤＥを凍結すると、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の生存能力が排除される。これらの生存不可能なｓＤＥは、フィブリン糊相互作用研究中にＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ組織の試料が配置された皮膚マトリックスを提供する。

解凍当日（０日目）、再培養チャンバを、無菌メッシュリフターをｐ１５０皿に入れ、各皿に５０ｍＬの緩衝液を添加することによって組み立てた。ｓＤＥを周囲温度で３～５分間解凍し、その後、６ウェル挿入内で再培養皿に移し、メッシュリフターの上に配置した。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ組織を周囲温度で３～６分間解凍し、解凍する各組織について、１５ｍＬのＳｔｒａｔａｔｅｃｈ保持溶液（３５～３９℃の水浴又は乾燥ブロック中で６０分間加温されたＮＬＴ）を新しい製品皿に添加した。組織を周囲温度で１５～２０分間保持した。ＡＲＴＩＳＳフィブリンシーラントを表２に示すようにｓＤＥに塗布し、各真皮に薄く均一な層を分散させるように注意した。各条件を５連で試験した。解凍後の保持ステップの後、組織から８ｍｍのパンチを取り出し、各パンチを再培養皿に移し、真皮側を下にしてシーラント層の上に配置した。ｓＤＥ／組織パンチアセンブリを加湿インキュベーターに移した。

１日目及び４日目に培地交換を実施した。合計５日間の接触時間後、組織パンチを、生存能力のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ安定性を示すアッセイについて分析した。フィブリン糊に曝露したパンチの結果を、対照群の結果と比較した。＜１０％の生存能力低減を生じさせるフィブリン糊曝露は、組織に無視できるほどの影響を及ぼすと考えられ、１０～３０％は中等度の影響と考えられ、＞３０％の低減は実質的な影響と考えられる。

生存能力結果の統計分析を実施して、各条件の影響を決定した。フィブリンシーラントグループのために一元配置分散分析試験を構築して、曝露の結果を対照群と比較した。統計的有意性をｐ＜０．０５として定義する。

結果：
分析結果の概要を以下に提示し、完全なデータセットを表３に提供する。組織をＡＲＴＩＳＳフィブリンシーラントに曝露する影響を評価した。

生存能力：
ＡＲＴＩＳＳフィブリン糊への曝露は、対照群と比較して組織生存能力にマイナスの影響を及ぼすことは見出されなかった。データを図１７に表す。分析は、得られた試料生存能力に対するフィブリンシーラント曝露の有意な影響を示し（ｐ＜０．００１）、実験群は対照よりも生存能力が３０％増加したことを示した。

これらの結果は、ＡＲＴＩＳＳの使用がＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ組織に悪影響を及ぼさないという立場を強く支持しているが、測定された生存能力の増加の理由は明らかではなかった。これは、組織パンチからのＮＨＤＦ細胞及び／又はＮＩＫＳ細胞の増殖及び移動の増加の結果である可能性があるが、染色パターンに基づいてこれは可能性が低いと思われる。生存後画像は、対照グループ及びＡＲＴＩＳＳグループの両方の試料が、組織パンチの堅牢なＭＴＴ染色を有していたが、パンチから離れたｓＤＥ領域でも拡散染色を示したことを示す。ＡＲＴＩＳＳに曝露されたモデルは、生存可能な細胞の存在を示す可能性がある対照モデルと比較して、ｓＤＥ領域にこの可視的な色素沈着の多くを有するように見えた。可能性は低いように思われるが、ｓＤＥ層の染色は、その層を不活性化することを意味する凍結／解凍サイクル中の細胞のいくつかの限定的な生存を示唆する可能性がある。その場合、グループ間の差は、それらの残留細胞に対するフィブリン糊のいくつかの保護効果を反映し得る。

考察：
これらの結果の解釈を助けるために、モデルパラメータを確立するために行われた以前の研究の結果も考慮した。この研究の実施の前に、２つのパイロット実験が実施されて、モデルで使用されるべきシーラントの量を決定し、操作者が塗布方法を習熟することを可能にした。これらの研究は、第１のパイロット研究において塗布されたＡＲＴＩＳＳの量を除いて、実験計画セクションに概説されているのと同じ手順に従った。表４で見ることができるように、どちらのパイロット研究も、組織生存能力に対するＡＲＴＩＳＳ曝露の統計的に有意な影響を示さず、ある研究は、ＡＲＴＩＳＳ使用による生存能力の適度な、有意でない増加を示した（パイロット研究１：ｐ＝０．５４１）が、第２の研究は、わずかな、有意でない減少を示した（パイロット研究２：ｐ＝０．２７４）。この研究で見られたｓＤＥ領域の染色は、いずれのパイロット実験でも見られなかったことは注目に値する。この染色の存在を完全に説明することはでないが、パイロット研究及び正式な研究の結果から、ＡＲＴＩＳＳは、組織生存能力に悪影響を及ぼさないことが示されている。

結論：
この実験の結果及びパイロット研究で見られたものに基づいて、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織とのＡＲＴＩＳＳフィブリンシーラントの使用が実質的な細胞死をもたらさないと結論付けることができる。興味深いことに、この研究でフィブリン糊に曝露したモデルは、対照群と比較して、統計的に有意で生存能力が増加した。これらの結果は、ＡＲＴＩＳＳの使用がＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ治療成果を損なう可能性が低いことを示している。

実施例６：元素分析
抽出可能な研究のために、成長チャンバ及び組織挿入アセンブリを２０％エタノール／８０％水を使用して抽出し、抽出物をプールし、５０ｍＬのプラスチック容積フラスコに移した。同様に、培地浸出性研究のために、試験材料をＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＳＰＤ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して消化し、消化した試料を５０ｍＬのプラスチック容積フラスコに移した。

この容積フラスコに、ベリリウム（Ｂｅ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、テルビウム（Ｔｂ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）を含有する内部標準物質を添加して、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。フラスコを５％硝酸で容積に充填した。外部標準物質を、０．５～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の元素濃度で調製した。標準物質は、以下の元素：リチウム（Ｌｉ）、ホウ素（Ｂ）、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）、モリブデン（Ｍｏ）、カドミウム（Ｃｄ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、バリウム（Ｂａ）、水銀（Ｈｇ）、鉛（Ｐｂ）の各々を含有した。ベリリウム（Ｂｅ）、スカンジウム（Ｓｃ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、及びテルビウム（Ｔｂ）からなる内部標準物質を、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度でこれらの標準物質に添加した。抽出試料中のこれらの元素の各々の含有量を、標準物質に照らして決定した。アッセイのシステム適合性要件の一部として、回収サロゲート化合物の回収率は、８０～１２０％でなければならない。研究の結果を、表５に提供する。

成長チャンバ及び組織挿入アセンブリ研究の結果
ＩＣＰ－ＭＳ法を使用して抽出可能かつ浸出可能な元素不純物を評価するとき、ほとんどの元素は検出されなかった（ＮＤ）か、又は方法のＬＯＱ（定量限界）を下回っていた。試料内の元素の応答が対照内のその元素の応答以下である場合、報告された結果は検出されない（ＮＤ）。分析の結果を、表６に提示する。ホウ素（Ｂ）及びアルミニウム（Ａｌ）は、抽出可能な研究ではサブｐｐｍ範囲で検出されたが、浸出可能な試験ではホウ素のみが検出された。浸出可能な研究中に１回の反復で低レベルのスズが検出されたが、検出されたレベルのスズは、許容される１日の許容限度を下回っているため、３０ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の用量を受けている患者にリスクをもたらさない。

製品皿／保持皿
ＩＣＰ／ＭＳ分析に使用した抽出物を別々に調製した。抽出を、ｐＨ３水及びｐＨ９水で実施した。１８ｍＬの前述の抽出溶媒を製品皿に添加し、製品皿を３７±１℃で２４時間インキュベートした。３つの製品皿で抽出を実施した。インキュベーション後、抽出物を容積フラスコにプールし、各条件に対して１回の反復をもたらした。ベリリウム（Ｂｅ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、テルビウム（Ｔｂ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）を含有する内部標準物質を各容積フラスコに添加して、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を達成した。フラスコを５％硝酸で容積に充填した。

外部標準物質を、０．５～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の元素濃度で調製した。標準物質は、以下の元素：リチウム（Ｌｉ）、ホウ素（Ｂ）、アルミニウム（Ａｌ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）、モリブデン（Ｍｏ）、カドミウム（Ｃｄ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、バリウム（Ｂａ）、水銀（Ｈｇ）、及び鉛（Ｐｂ）の各々を含有した。内部標準物質はまた、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度でこれらの標準物質に添加した。抽出試料中のこれらの元素の各々の含有量を、標準に照らして決定した（表１７）。

ＩＣＰ－ＭＳ分析のための標的元素は、ＵＳＰ＜２３２＞及びＩＣＨ Ｑ３Ｄガイドラインに基づいて選択した。３つのクラスのそれらの分類及びそれらに対応する許可された１日曝露限界（ＰＤＥ）は、ＩＣＨ Ｑ３Ｄガイドラインで推奨された。元素のほとんどは、表７に提供されるように、検出されなかった（ＮＤ）か、又はＬＯＱ未満であった。試料中の元素の応答が対照中の応答以下である場合、報告される結果は検出されない（ＮＤ）。Ｓｎは検出されたが、それぞれの限界をはるかに下回っていた。

Ｂ及びＡｌは、低ｐｐｂレベルで検出された。アルミニウムの場合、ＷＨＯは、飲料水から成人の場合は、１．８ｍｇ／日を超えないようにすることを推奨している。したがって、アルミニウムのｐｐｂレベルは無視することができ、患者にリスクをもたらさない。ホウ素は、おそらくＷＨＯによって人体に不可欠な元素である。米国ＥＰＡは、ホウ素の飲料水を３ｍｇ／Ｌ（子供が１日当たり１Ｌを摂取し、成人が１日当たり２Ｌを摂取すると仮定）に制限しているため、ホウ素摂取量の１日の安全レベルは１日３ｍｇ～６ｍｇである。したがって、浸出性研究におけるｐｐｂレベルのホウ素は無視することができ、患者にリスクをもたらすことはない。

ＩＣＨ Ｑ３Ｄ（Ｒ１）元素不純物ガイドラインの範囲は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織などの組織工学製品には適用されない。しかしながら、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の抽出可能及び浸出可能（Ｅ＆Ｌ）評価は、皮膚組織を培養するために使用されるプラスチック製造成分、及び臨床適用まで組織を凍結保存及び保管するために使用される一次包装成分からの元素不純物の潜在的な寄与を考慮している。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の製造プロセスは、２５日間の有機型培養期間中に複数の培地交換を組み込む。製造プラスチックウェア（すなわち、成長チャンバ及びトランスウェルインサート）から培地に導入された微量の元素不純物が、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の細胞成分内に蓄積するという科学的証拠はない。したがって、製造プラスチック製品から導入された元素不純物は、組織製造プロセス中に媒体交換によって希釈又は除去されると仮定することができる。同様に、一次包装成分から導入された元素不純物が完成医薬品内に蓄積するという科学的証拠はない。臨床適用の前に、皮膚組織をＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ保持溶液で洗浄する。したがって、臨床適用のための組織の調製は、これらの不純物を皮膚組織から希釈又は除去し得る。この研究で提供される元素不純物データは、代替標準物質がないため、ＩＣＨ Ｑ３Ｄ制限と比較され、情報提供を目的としている。元素不純物のリスク評価は、この研究で提供されるように、不純物の全量を患者に送達するリスクが、組織製造及び臨床調製手順に基づいて最小限であることを示唆している。

浸出性研究
本研究では、製品皿及び保持皿からの浸出物の可能性を考慮している。製品皿及び保持皿は同じコンポーネントであるが、各皿は長期保管及び臨床使用中に異なる媒体及び環境条件に曝される。製品皿は、医薬品の保管期間中、－７０～－９０℃で保管される。使用前に、保持溶液ボトルを３５～３９℃に予熱し、次いで、無菌保持皿に注ぐ。保持期間中、保持溶液の一部分が組織内に移動し、凍結保護剤を置き換え、組織水和を維持する。組織が臨床使用のために保持皿から取り出されると、保持溶液の容積の記載された部分は、組織適用時に、製品の一部として患者に送達される。保持皿の予熱した保持溶液への曝露時間は、少なくとも１５分から最大４時間である。

製品皿
製品皿の評価のために、各製品皿に３ｍＬのＣＰＳを添加した。３ｍＬのＣＰＳ曝露量は、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織を製品皿に移す間に、組織挿入を付着させて製品皿に移されると予想されるＣＰＳの最大量に近似している。ＣＰＳを添加した後、製品皿をホイルポーチに密封し、室温で３０分間保持した。次いで、製品皿を収容するポーチを、－７０～－９０℃で長期保管するために超低温冷凍庫に移した。ＣＰＳ関連成分を浸出性化合物と区別するために、時間ゼロ（Ｔ０）及び対照試料は、無菌テフロン（登録商標）ボトルに保管されたＣＰＳから構成された。浸出物の評価は、Ｔ０、並びに３、６、１２、１８、２４、及び３６ヶ月の時点で実施される。

ＣｒａｍｅｒクラスＩＩＩガイドラインをこの研究で使用して、ＡＥＴを定義し、これにより、ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の適用ごとに未知の化合物の最大９０個のジグを可能にする。抽出可能な浸出性研究の目的のために、１日当たり最大３０個の組織の最大適用を計算に考慮した。したがって、ＡＥＴは、組織当たり３つのジグ又は製品皿当たり３つのジグに設定される。

保持皿
臨床使用条件をシミュレートするために、保持皿浸出物の評価のために１回限りの研究を実施した。３ｍＬのＣＰＳ及び１５ｍＬの保持溶液を混合してから、各保持皿に添加した。混合培地を収容する保持皿を、臨床保持の最大許容持続時間である４時間、３７℃で条件付けした。実験は、各反復に３つの保持皿を用いて重複して実施した。条件付け後、試験溶液は３つの保持皿からプールされた材料で構成されていた。対照は、試験試料と同じように調製した。３ｍＬのＣＰＳ及び１５ｍＬの保持溶液をガラスボトル中で組み合わせ、３７℃で４時間条件付けした。

組織内に移動するＣＰＳ及び保持溶液混合物の体積の保存的推定値を使用して、患者に送達され得る保持皿当たりの浸出物の総量を計算した。ＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織の液量は、２．５ｍＬを超えてはならないため、保持皿の合計１８ｍＬから最大２．５ｍＬが患者に適用される組織に含まれる。したがって、保持皿からの潜在的な曝露は、次のように計算される：

組み合わされたＣＰＳ及び保持溶液を収容する保持皿の浸出物試験の結果は、製品皿のＣＰＳにおける医薬品の長期保管を評価する浸出物試験の結果と組み合わされる。例えば、浸出性化合物が保持皿研究及び長期保管製品皿浸出物研究の両方で検出された場合、総曝露は、１つの製品皿及び１つの保持皿からの浸出物の合計として計算される。その合計を３μｇ／皿のＡＥＴと比較する。

ＩＣＰ－ＭＳ分析のための浸出物試料の調製
同様に、培地浸出性研究のために、試験材料をＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＳＰＤ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して消化し、消化した試料を５０ｍＬのプラスチック容積フラスコに移した。このフラスコに、ベリリウム（Ｂｅ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、テルビウム（Ｔｂ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）を含有する内部標準物質を添加して、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度にした。フラスコを５％硝酸で容積に充填した。

外部標準物質を、０．５～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の元素濃度で調製した。標準物質は、以下の元素：リチウム（Ｌｉ）、ホウ素（Ｂ）、アルミニウム（Ａｌ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）、モリブデン（Ｍｏ）、カドミウム（Ｃｄ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、バリウム（Ｂａ）、タングステン（Ｗ）、水銀（Ｈｇ）、及び鉛（Ｐｂ）の各々を含有した。マグネシウム（Ｍｇ）及び鉄（Ｆｅ）は、ＣＰＳ及び保持溶液を製剤化するために使用される化合物から浸出物試料中に存在するため、研究から除外された。ベリリウム（Ｂｅ）、スカンジウム（Ｓｃ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、及びテルビウム（Ｔｂ）からなる内部標準物質を、５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度でこれらの標準物質に添加した。抽出試料中のこれらの元素の各々の含有量を、標準物質に照らして決定した。アッセイのシステム適合性要件の一部として、回収サロゲート化合物の回収率は、８０～１２０％でなければならない。研究の結果を、表８に提供する。

ＩＣＰ－ＭＳ分析に関しては、ＵＳＰ＜２３２＞及びＩＣＨ Ｑ３Ｄガイドラインに基づいて標的元素を選択した。製品皿長期保管浸出性試料及び保持皿サブ浸出性試料の両方について、試験された全ての元素がそれぞれの限界を下回っており、ほとんどの結果が検出されていない（ＮＤ）又はＬＯＱ未満（＜ＬＯＱ、表９。不純物が検出されない場合、試料中の応答は、対照中の応答以下である。

標的元素のＰＤＥ限界を、計算において、１日当たり３０組織、１皿（製品皿又は保持皿）当たり１組織、１皿当たりの溶媒の体積、及び希釈係数（ＤＦ）を使用して、濃度限界に変換した。この保守的なアプローチは、この研究で有機浸出物のＡＥＴを計算するために使用されたアプローチと同じである。例は、以下の表の脚注に提供される。

元素の濃度限界は、溶媒量の違いにより、保持皿浸出物研究と製品皿長期保管浸出物研究とでは異なる。長期保管浸出物研究では、ＣＰＳの体積は、製品皿当たり３ｍＬである。保持皿浸出物研究では、保持皿当たり２．５ｍＬのＣＰＳ及び保持溶液混合物を使用して、計算した。これは、患者に適用される単一のＳｔｒａｔａＧｒａｆｔ皮膚組織に含有される保持皿中の合計１８ｍＬからのＣＰＳ及び保持溶液混合物の最大容量である。

要素ごとの製品皿長期保管浸出性結果及びそれぞれの限界が、表１０に提供され、続いて、表１１に提供されるように、要素ごとの保持皿浸出性結果及びそれぞれの限界が提供される。全ての結果は、それぞれの元素限界を下回っていた。

アルミニウムは、Ｔ＝０製品皿浸出液対照試料中で０．５４ｐｐｂ及び０．８７ｐｐｂで検出され、後者は水対照試料中であった。ＷＨＯは、成人が飲料水から１．８ｍｇ／日を超えないように推奨している。したがって、アルミニウムのｐｐｂレベルは無視することができ、患者にリスクをもたらさない。リチウム（Ｌｉ）及び鉛（Ｐｂ）は、それぞれ０．１４及び０．１１ｐｐｂで検出され、それぞれの限界をはるかに下回っていた。ニッケルは、保持皿浸出物研究で０．２０ｐｐｂで検出され、それぞれの限界を下回っていた。

Ｔ＝０Ｍ安定性研究のための元素分析では、Ｐｂ、Ａｓ、Ｖ、Ｎｉ、及びＡｌが検出された。試料中の元素の応答が対照中のその応答以下であった場合は、結果は、結果が対照と区別されなかったため未検出（ＮＤ）として報告され、定量限界を下回る試料中に検出された元素についてはＬＯＱ（＜ＬＯＱ）未満と報告された。

元素分析では、Ｎｉ及びＡｌが検出された。試料中の元素の応答が対照中のその応答以下であった場合は、結果は、結果が対照と区別されなかったため未検出（ＮＤ）として報告され、定量限界を下回る試料中に検出された元素についてはＬＯＱ（＜ＬＯＱ）未満と報告された。浸出物は、製品皿試験の残りの全ての時点でモニタリングされ、結果は、本明細書に提供される保持皿浸出物結果とプールされる。

Claims (95)

1. 局所使用のための同種異系培養ケラチノサイトの組成物であって、同種異系細胞化足場を含み、前記足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを更に含む、組成物。
2. 前記ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞が、核型的に安定である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞が、固定非依存性成長を示さない、請求項１に記載の組成物。
4. 前記組成物が、検出可能な病原体を含まない、請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物が、ヒト成長因子及びサイトカインを分泌する、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物が、局所使用から１２ヶ月以内に免疫拒絶を誘発しない、請求項１に記載の組成物。
7. 前記皮膚線維芽細胞が、ヒト皮膚線維芽細胞である、請求項１に記載の組成物。
8. 前記組成物が、ヒト細胞外マトリックスタンパク質を更に含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記組成物が、グリセリンを更に含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記ケラチノサイトが、４３継代培養される、請求項１に記載の組成物。
11. 前記皮膚線維芽細胞が、６継代培養される、請求項１に記載の組成物。
12. 前記組成物が、検出可能な病原体を含有しない、ヒトケラチノサイト及び線維芽細胞バンクに由来する、請求項１に記載の組成物。
13. 細胞化足場コンストラクトが、形状が長方形であるか、又は創傷床の形状にトリミングされる、請求項１に記載の組成物。
14. 前記細胞化足場コンストラクトが、単一の患者のみへの塗布のためのものである、請求項１に記載の組成物。
15. 前記組成物が、熱傷を有する成人の治療のために、単位用量で処方され、前記単位用量が、約１００ｃｍ^２の長方形である、請求項１に記載の組成物。
16. 前記長方形の単位用量が、約８ｃｍ×１２．５ｃｍである、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記組成物が、熱的に深い部分的な厚さの火傷を有する成人の治療のために、単位用量で処方され、前記単位用量が、約１００ｃｍ^２の長方形である、請求項１に記載の組成物。
18. 前記長方形の単位用量が、約８ｃｍ×１２．５ｃｍである、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記組成物が、自家移植片配置を伴わずに、３ヶ月目に、熱傷治療部位における持続的な創傷閉鎖を提供する、請求項１に記載の組成物。
20. 前記組成物が、異種移植製品である、請求項１に記載の組成物。
21. マウス細胞が、前記組成物の製造に使用されない、請求項１に記載の組成物。
22. ３０．０ｋＧｙの目標最小投薬量で照射される包装材料ガンマを更に含む、請求項１に記載の組成物。
23. 前記組成物が、ＵＳＰ＜８７＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験され、細胞毒性を示さないことが見出された、請求項１に記載の組成物。
24. 前記組成物が、ＵＳＰ＜８８＞（インビトロ生物反応性）を使用して試験され、クラスＶＩ基準を満たす、請求項１に記載の組成物。
25. 前記組成物が、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーター中で少なくとも２５日間、３７±２℃で保持される、請求項１に記載の組成物。
26. ０．００３ｃｃ／１００ｉｎ^２／２４時間未満の酸素透過率を有する包装層を更に含む、請求項１に記載の組成物。
27. ０．００６５ｇ／１００ｃｍ^２／２４時間未満の水分透過率を有する包装層を更に含む、請求項１に記載の組成物。
28. ３０ゲージ層アルミホイルポーチを更に含む、請求項１に記載の組成物。
29. ９９．７４％の不透明度パーセンテージを含む１８ｐｔ段ボールカートンを更に含む、請求項１に記載の組成物。
30. 前記組成物が、臨床使用のための調製まで、ホイルポーチ内に保管されている、請求項１に記載の組成物。
31. 前記ホイルポーチが、包装、出荷、又は臨床使用中に、前記組成物に接触しない、請求項２２に記載の組成物。
32. 前記組成物が、臨床使用のための調製まで、前記ホイル内で凍結保存されている、請求項２２に記載の組成物。
33. 前記組成物が、マフェニド酢酸塩、銀含有抗菌剤、クロルヘキシジン溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗菌組成物を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
34. 前記組成物が、抗菌組成物の非存在下で成人の熱傷を治療する有効性が改善されている、請求項３３に記載の組成物。
35. 免疫不全マウスへの前記ケラチノサイトの単一皮下注射が、注射後２３週間までに腫瘍形成をもたらさない、請求項２に記載の組成物。
36. 免疫不全マウスにおける全層切除創傷に対する前記組成物の局所塗布が、投薬後２０週間までに腫瘍形成をもたらさない、請求項２に記載の組成物。
37. 前記組成物と接触させた免疫不全無胸腺ヌードマウスにおいて、局所毒性又は全身毒性の証拠は観察されない、請求項２に記載の組成物。
38. 同種異系培養ケラチノサイトを含む１つ以上の凍結保存されたコンストラクトの調製を必要とする患者の治療のための、それを行うための方法であって、
    保持溶液を３５℃～３９℃の加温デバイスで加温することと、
    前記加温された保持溶液を無菌保持皿に注ぐことと、
    前記コンストラクトを収容する挿入トレイを製品皿から無菌的に取り出すことと、
    前記挿入トレイを前記保持皿に配置することと、
    前記コンストラクトを前記保持溶液中に１５分～４時間維持することと、を含む、方法。
39. 前記挿入トレイのポリカーボネート膜から前記コンストラクトを取り出すことを更に含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記コンストラクトが、真皮側及び表皮側を含み、前記コンストラクトが、前記真皮側が前記ポリカーボネート膜と接触するように包装される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記コンストラクトを、メッシャーを使用して、最大１：１の比率でメッシュ化することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記メッシャーが、前記保持溶液、無菌０．９％生理食塩水、又は乳酸リンゲル溶液を使用して、接着を防止し、かつコンストラクト水分を維持するために、必要に応じて湿らせる、請求項４１に記載の方法。
43. 前記コンストラクトが、前記真皮側又は前記表皮側のいずれかを上にしてメッシュ化されるように操作可能である、請求項４１に記載の方法。
44. 前記保持溶液が、ラミネートされたホイルポーチに保管されたボトル内に収容される、請求項３８に記載の方法。
45. 前記保持溶液が、使用前に少なくとも４５分間、３５℃～３９℃の加温オーブン／キャビネットで加温される、請求項３８に記載の方法。
46. 前記保持溶液が、使用前に少なくとも１５分間、３５℃～３９℃の水浴中で加温される、請求項３８に記載の方法。
47. 前記加温された保持溶液が、前記加温デバイスから取り出された直後に前記無菌保持皿に注がれる、請求項３８に記載の方法。
48. 前記保持皿が、最初にポーチに包装される、請求項３８に記載の方法。
49. 前記コンストラクトを収容する前記挿入トレイを保持する前記製品皿が、最初にホイルポーチ内に保管され、任意選択的に更にカートン内に保管される、請求項３８に記載の方法。
50. 前記カートンを冷凍庫又はドライアイスから取り出すことを更に含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記カートン及びホイルポーチを開放して、前記コンストラクトを収容する前記挿入トレイを保持する前記製品皿を取り出すことを更に含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記カートンを前記冷凍庫又はドライアイスから取り出すことと、前記挿入トレイを前記保持皿に配置することとの間の時間が、１０分以下である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記挿入トレイが、無菌鉗子又は無菌の手袋をした指のいずれかを使用して、前記製品皿から取り出される、請求項３８に記載の方法。
54. 前記挿入トレイが、一方の端部から始めて、反対側の端部まで下げて、前記挿入トレイの下に気泡を閉じ込めることを最小限に抑えて、前記保持皿に配置される、請求項３８に記載の方法。
55. 切除又はデブリードマンを介して創傷床を調製することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
56. 解凍する必要のあるコンストラクトの数を決定することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
57. ２つ以上のコンストラクトが必要とされる場合、前記２つ以上のコンストラクトが、１つ以上のバッチで調製される、請求項５６に記載の方法。
58. １つ以上のコンストラクトの調製が、約２０分かかる、請求項３８に記載の方法。
59. 深い部分的な厚さの火傷を有する患者を治療する方法であって、
    切除又はデブリードマンを介して創傷床を調製することと、
    １つ以上の解凍及びメッシュ化されたコンストラクトを、前記調製された創傷床と接触させて配置することであって、前記１つ以上のコンストラクトが、同種異系培養ケラチノサイトを含み、かつ真皮側及び表皮側を有し、前記コンストラクト真皮側が下である、配置することと、
    前記コンストラクトを前記創傷床及び／又は周囲の組織に固定することと、を含む、方法。
60. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
61. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することが、前記同種異系培養ケラチノサイトに細胞死をもたらさない、請求項６０に記載の方法。
62. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することが、前記同種異系培養ケラチノサイトにおける増殖、移動、又は分泌の１０％未満の変化をもたらす、請求項６０に記載の方法。
63. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することが、皮膚移植片採取、創傷床接着、又はそれらの組み合わせのパーセンテージを増加させる、請求項６０に記載の方法。
64. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することが、細菌感染、失血、術後疼痛、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される副作用を減少させる、請求項６０に記載の方法。
65. フィブリン糊を前記コンストラクトに塗布することが、前記同種異系培養ケラチノサイトの生存能力の１０％未満の減少をもたらす、請求項６０に記載の方法。
66. 前記コンストラクトにフィブリン糊を塗布することが、前記同種異系培養ケラチノサイトの生存率の３０％未満の減少をもたらす、請求項６０に記載の方法。
67. 各コンストラクトを前記創傷床に配置する場合に、前記２つ以上のコンストラクトを当接させることを更に含む、請求項６０に記載の方法。
68. ２つ以上のコンストラクトが使用される、請求項５９に記載の方法。
69. 前記治療される創傷床が１つのコンストラクトよりも小さい場合、前記方法が、前記コンストラクトを前記創傷床に固定する前又は後に、余分なコンストラクトをトリミングすることを更に含む、請求項５９に記載の方法。
70. 前記１つ以上のコンストラクトが、前記創傷床の表面全体にわたって接触を有する、請求項５９に記載の方法。
71. 前記コンストラクトが、前記コンストラクトの構造的完全性を低下させないように、配置又は固定中に延伸又は拡張されない、請求項５９に記載の方法。
72. 前記コンストラクトが、ステープル、シアノアクリレートなどの組織接着剤、又は縫合糸で固定される、請求項５９に記載の方法。
73. 前記１つ以上のコンストラクトの上に多孔質の非接着性接触包帯を配置することと、前記包帯を、交換する前に１週間、所定の位置に放置することと、を更に含む、請求項５９に記載の方法。
74. 銀を含有しない第２の層の包帯を配置することを更に含む、請求項７３に記載の方法。
75. 前記１つ以上のコンストラクトを動かさないようにする外側ボルスター又はラップを配置することを更に含む、請求項７３に記載の方法。
76. 外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法であって、それを必要とする前記成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、前記足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法。
77. 過敏反応が、前記治療された成人患者の５％未満で生じる、請求項７６に記載の方法。
78. 過敏反応が、患者の１％未満で生じる、請求項７６に記載の方法。
79. 前記細胞化足場が、サインメッシュ化デバイスと互換性がある、請求項７６に記載の方法。
80. 前記細胞化足場を、投与前に、最大１：１の比率でメッシュ化することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
81. 前記投与するステップが、調製された創傷床への局所投与を含む、請求項７６に記載の方法。
82. 本明細書で、創傷床が、切除又はデブリードマンによって調製されている、請求項８１に記載の方法。
83. 細胞化足場コンストラクトのうちの２つ以上が、前記創傷床を覆うために塗布される、請求項８１に記載の方法。
84. 前記組成物が、マウスコラーゲン又はウシ若しくはブタ由来の成分を含む製品に対して既知のアレルギーを有しない患者に好適である、請求項７６に記載の方法。
85. 前記細胞化足場コンストラクトが、前記創傷床の形状にトリミングされる、請求項７６に記載の方法。
86. 前記細胞化足場コンストラクトが、単一の患者のみへの塗布のためのものである、請求項７６に記載の方法。
87. 細胞化足場が取り外された場合に医療提供者に連絡することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
88. 未使用の細胞化足場の、外科的バイオハザード廃棄物としての処分を更に含む、請求項７６に記載の方法。
89. マウス細胞が、前記細胞化足場の初期発達において使用されたことを前記成人患者に通知することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
90. 細胞化足場が、グリセリンを含み、前記患者がグリセリンに感受性がある場合に刺激を引き起こす可能性があることを前記成人患者に通知することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
91. 熱傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする前記成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、前記足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法。
92. 深い部分的な厚さの火傷のための成人患者を治療する方法であって、それを必要とする前記成人患者の無傷の真皮要素に、同種異系細胞化足場を投与することを含み、前記足場が、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを含む、方法。
93. 外科的介入を必要とする成人患者を治療する方法であって、細胞化足場コンストラクトを含む同種異系培養ケラチノサイトの組成物を、外科的に調製された創傷床に塗布することを含み、前記足場コンストラクトが、皮膚線維芽細胞及びマウスコラーゲンを更に含む、方法。
94. 皮膚線維芽細胞を含有するゲル化コラーゲン上で成長したケラチノサイトに由来する、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系細胞化足場製品の長方形シートを含む、組成物。
95. 皮膚線維芽細胞を含有するゲル化コラーゲン上で成長したケラチノサイトに由来する、生存可能な、生物工学によって作られた、同種異系細胞化足場製品の２つ以上のシートを含む組成物であって、前記組成物が、前記シートの端部と重なることなく熱傷の治療に好適である、組成物。