JP2024519513A - 細胞トランスクリプトームのコンビナトリアル標的化のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
１つ以上のｃｒＲＮＡ配列と、バーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）と連結された５’ダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む組成物が本明細書で提供され、ｂｃｇＲＮＡは、（ａ）バーコード配列と、（ｂ）逆転写ハンドルと、を５’から３’の順に含む。記載のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して１つ以上の摂動を単一細胞トランスクリプトームに導入することを含む方法も提供される。【選択図】なし
Description
政府の支援に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与されたＤＰ２ＨＧ０１００９９、ＤＰ２ＨＧ００９６２３－０１、ＲＭ１ＨＧ０１１０１４－０１、及びＲ０１ＣＡ２１８６６８の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与されたＤＰ２ＨＧ０１００９９、ＤＰ２ＨＧ００９６２３－０１、ＲＭ１ＨＧ０１１０１４－０１、及びＲ０１ＣＡ２１８６６８の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
遺伝的摂動のプールをｓｃＲＮＡ－ｓｅｑまたはマルチモーダルな特徴付けと組み合わせること（すなわち、Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、及びＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ）が最近の技術的進歩によって行われるようになったことで、遺伝子機能についての我々の理解に変化が訪れることが約束されている。具体的には、コンビナトリアル摂動を与える能力は、複雑な制御ネットワークを解読する機会になり、エピスタシス及び他の遺伝的相互作用を同定する能力が先駆的研究によって実証されている。一方で、プール型の単一細胞スクリーニングと関連する特定の技術的及び分析的な課題が存在しており、こうした課題は、コンビナトリアル摂動を考えた場合に深刻なものとなる。例えば、ｓｇＲＮＡが検出されないか、または誤って割り当てられることで最大で２０％の細胞に影響が及び得るが、このことは、各細胞において、複数の独立したｓｇＲＮＡが導入され、独立して検出される場合には一層ひどくなる。さらに、Ｃａｓ９によって導入される摂動は均一に効率的というわけではなく、標的細胞のかなりの割合が摂動の表現型効果を示し得ない。したがって、２つ以上の摂動を同時に与える場合、すべての摂動が共に成功裏に導入され、それらの検出に成功する細胞の割合は劇的に低くなり得る。
複数の遺伝的摂動を細胞に導入するための改良された組成物及び方法が必要とされている。
一態様では、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びｇＲＮＡ配列をそれぞれが含む１つ以上のｃｒＲＮＡ配列と、バーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）と連結された５’ダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸が本明細書で提供され、ｂｃｇＲＮＡは、（ａ）バーコード配列と、（ｂ）逆転写ハンドルと、を５’から３’の順に含む。
ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡは、（ａ）ＰＣＲハンドルと、（ｂ）バーコード配列と、（ｃ）逆転写ハンドルと、を５’から３’の順に含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のｃｒＲＮＡ配列はそれぞれ、標的ＲＮＡ配列と相補的な少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含むｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のｃｒＲＮＡ配列はそれぞれ、標的ＲＮＡ配列と相補的な２３個のヌクレオチドの配列であるｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在するｃｒＲＮＡはそれぞれ、異なるｇＲＮＡ配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在するｃｒＲＮＡの２つ以上は、同じｇＲＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在するｃｒＲＮＡ配列はそれぞれ、標的転写産物の異なる領域に特異的である。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、複数の転写産物を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の下流（３’）に位置する。ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲ
ＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の上流（５’）に位置する。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピートは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素と結合することが可能であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素は、任意選択で、Ｃａｓ１３ｄである。ある特定の実施形態では、逆転写ハンドルは、ポリＡ配列、ＣＳ１、またはＣＳ２を含む。ある特定の実施形態では、バーコードは、８～１５個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、その３’末端に安定化ＲＮＡエレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ＭＡＬＡＴ１エレメント、ＮＥＡＴ１（ＭＥＮβ）エレメント、ｓｐｎｐｒｅＱ１エレメント、ＺＩＫＶ ｘｒＲＮＡ１エレメント、ｍｐｋｎｏｔエレメント、またはｅｖｏｐｒｅＱ１エレメントである。
ＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の上流（５’）に位置する。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピートは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素と結合することが可能であり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素は、任意選択で、Ｃａｓ１３ｄである。ある特定の実施形態では、逆転写ハンドルは、ポリＡ配列、ＣＳ１、またはＣＳ２を含む。ある特定の実施形態では、バーコードは、８～１５個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、その３’末端に安定化ＲＮＡエレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ＭＡＬＡＴ１エレメント、ＮＥＡＴ１（ＭＥＮβ）エレメント、ｓｐｎｐｒｅＱ１エレメント、ＺＩＫＶ ｘｒＲＮＡ１エレメント、ｍｐｋｎｏｔエレメント、またはｅｖｏｐｒｅＱ１エレメントである。
別の態様では、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びｇＲＮＡ配列をそれぞれが含む１つ以上のｃｒＲＮＡ配列と、バーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）と連結された５’ダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸を含む発現カセットが本明細書で提供され、ｂｃｇＲＮＡは、（ａ）バーコード配列と、（ｂ）逆転写ハンドルと、を５’から３’の順に含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、（ａ）ＰＣＲハンドルと、（ｂ）バーコード配列と、（ｃ）逆転写ハンドルと、を５’から３’の順に含むｂｃｇＲＮＡを含む。発現カセットを含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。ある特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素をコードする配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、任意選択で、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素である。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素である。ある特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであるウイルスベクターである。
一態様では、記載のＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素と、を含む宿主細胞が本明細書で提供され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、任意選択で、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素である。
別の態様では、単一細胞トランスクリプトームへの１つ以上の遺伝子摂動の導入方法が本明細書で提供され、この方法は、宿主細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法が提供され、この方法は、（ａ）宿主細胞を取得することと、（ｂ）細胞からＲＮＡを単離することと、（ｃ）逆転写ハンドルに特異的なプライマーとＲＮＡとを接触させることを含む逆転写を実施することと、（ｄ）バーコード配列を同定することと、（ｅ）１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することと、を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が細胞トランスクリプトームに導入される。ある特定の実施形態では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法が提供され、この方法は、（ａ）請求項２１に記載の宿主細胞を取得し、フルオロフォア結合型抗体で細胞を標識し、フローサイトメトリーを使用して細胞を選別することと、（ｂ）細胞からＲＮＡを単離することと、（ｃ）逆転写ハンドルに特異的なプライマーとＲＮＡとを接触させることを含む逆転写を実施することと、（ｄ）バーコード配列を同定することと、（ｅ）１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することと、を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が細胞トランスクリプトームに導入される。別の実施形態では、方法は、バーコード配列を同定するステップ（ｄ）を含み、ステップ（ｄ）は、ＰＣＲハンドルに特異的なプライマーを使用してバーコード配列を増幅することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｅ）１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することを含み、この検出することは、フローサイトメトリー分析、細胞ハッシング（ｃｅｌｌ－ｈａｓｈｉｎｇ）、単一細胞シークエンシング分析、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－
ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ、トランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を含む。
ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ、トランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を含む。
本発明の他の態様及び利点は、本発明の下記の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
プール型のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを単一細胞ＲＮＡシークエンシングと組み合わせることで、遺伝子機能及び制御ネットワークを系統的に調べることが可能になっている。本明細書では、ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄ系を利用し、マルチモーダル
な単一細胞プロファイリングと共に効率的なコンビナトリアル摂動を可能にするＣａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ（ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ）（本明細書ではＣＡＲＰ－ｓｅｑとも称される）について記載される。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、検出可能なバーコード配列と結び付いた切断可能なアレイ上に複数の摂動をコードして、複数の遺伝子を同時に標的にすることを可能にする。本発明者らは、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを現存のＣａｓ９ベースの方法と比較し、コンビナトリアル摂動を与えた細胞を効率的にプロファイリングする上でＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑが特有の強みを有することを実証した。本発明はさまざまな細胞型を用いて使用できる共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を使用して標的とすることに適した任意の転写産物の標的化に使用できることを当業者なら認識するであろう。ＣＡＲＰ－ｓｅｑは、例えば、細胞ハッシング及び細胞表面タンパク質定量化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）と共に利用することができる。
な単一細胞プロファイリングと共に効率的なコンビナトリアル摂動を可能にするＣａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ（ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ）（本明細書ではＣＡＲＰ－ｓｅｑとも称される）について記載される。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、検出可能なバーコード配列と結び付いた切断可能なアレイ上に複数の摂動をコードして、複数の遺伝子を同時に標的にすることを可能にする。本発明者らは、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを現存のＣａｓ９ベースの方法と比較し、コンビナトリアル摂動を与えた細胞を効率的にプロファイリングする上でＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑが特有の強みを有することを実証した。本発明はさまざまな細胞型を用いて使用できる共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を使用して標的とすることに適した任意の転写産物の標的化に使用できることを当業者なら認識するであろう。ＣＡＲＰ－ｓｅｑは、例えば、細胞ハッシング及び細胞表面タンパク質定量化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）と共に利用することができる。
本明細書に別に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味、及び公開テキスト（本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に与える）への参照によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びその変形形態は、他の成分、要素、整数、ステップ、及び同様のものを含む。逆に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形形態は、他の成分、要素、整数、ステップ、及び同様のものを除外する。
「ａ」または「ａｎ」という用語は１つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「ＲＮＡ標的」は、１つ以上のＲＮＡ標的（複数可）を表すことが理解されよう。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される「約」という用語は、別段の指定がない限り、所与の言及値からの変動率が±１０％であることを意味する。
組成物
本明細書では、１つ以上のｃｒＲＮＡ（複数可）及びバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲアレイ、ならびにそれをコードする配列を含む核酸、発現カセット、及びベクターが提供される。本明細書で提供される「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、細胞トランスクリプトームに１つ以上の摂動を導入することが可能なｃｒＲＮＡ（複数可）及びバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）の配置を指す。ｂｃｇＲＮＡが存在することで、単一細胞リードアウトを含む下流分析の間にＣＲＩＳＰＲアレイを検出することが容易になる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡと、ＤＲ配列、バーコード配列、及び逆転写ハンドルを含むｂｃｇＲＮＡと、を５’から３’の順に含む。別の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡはＰＣＲハンドルも含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡと、ＤＲ配列、バーコード配列、及び逆転写ハンドルを含むｂｃｇＲＮＡと、を５’から３’の順に含む。さらに別の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイ中で１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の上流（５’）に位置する。
本明細書では、１つ以上のｃｒＲＮＡ（複数可）及びバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲアレイ、ならびにそれをコードする配列を含む核酸、発現カセット、及びベクターが提供される。本明細書で提供される「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、細胞トランスクリプトームに１つ以上の摂動を導入することが可能なｃｒＲＮＡ（複数可）及びバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）の配置を指す。ｂｃｇＲＮＡが存在することで、単一細胞リードアウトを含む下流分析の間にＣＲＩＳＰＲアレイを検出することが容易になる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡと、ＤＲ配列、バーコード配列、及び逆転写ハンドルを含むｂｃｇＲＮＡと、を５’から３’の順に含む。別の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡはＰＣＲハンドルも含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡと、ＤＲ配列、バーコード配列、及び逆転写ハンドルを含むｂｃｇＲＮＡと、を５’から３’の順に含む。さらに別の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイ中で１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の上流（５’）に位置する。
ｃｒＲＮＡ
本明細書で使用される「ｃｒＲＮＡ」は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡの略語であり、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ダイレクトリピ
ート（ＤＲ）ステムループ配列及びガイド配列から構成される核酸分子である。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」または「ガイド配列」または「スペーサー配列」という用語は本明細書で互換的に使用され、標的核酸（または標的配列）（例えば、標的ＲＮＡ）の配列（ハイブリダイゼーション領域または標的領域）とのハイブリダイゼーションが可能な核酸配列を指す。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２０ヌクレオチド（ｎｔ）～約３３ｎｔである。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔ、約３０ｎｔ、約３１ｎｔ、約３２ｎｔ、または約３３ｎｔである。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２３ｎｔである。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２７ｎｔである。ｇＲＮＡは、非天然起源のヌクレオチドを含み得る。
本明細書で使用される「ｃｒＲＮＡ」は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡの略語であり、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、ダイレクトリピ
ート（ＤＲ）ステムループ配列及びガイド配列から構成される核酸分子である。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」または「ガイド配列」または「スペーサー配列」という用語は本明細書で互換的に使用され、標的核酸（または標的配列）（例えば、標的ＲＮＡ）の配列（ハイブリダイゼーション領域または標的領域）とのハイブリダイゼーションが可能な核酸配列を指す。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２０ヌクレオチド（ｎｔ）～約３３ｎｔである。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔ、約３０ｎｔ、約３１ｎｔ、約３２ｎｔ、または約３３ｎｔである。一実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２３ｎｔである。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、約２７ｎｔである。ｇＲＮＡは、非天然起源のヌクレオチドを含み得る。
本明細書で使用される「標的配列」は、ガイド（スペーサー）配列が逆相補性を有するように設計される対象となる配列を指し、標的配列とスペーサー配列との間でハイブリダイゼーションが生じることで、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを構成し得る。「標的ＲＮＡ」という用語は、コード転写産物及び非コード転写産物を含めて、標的配列であるまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すれば、標的ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部（すなわち、スペーサー配列）が相補性を有するように設計される対象であり、かつＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む複合体によって媒介されるエフェクター機能の対象となるＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。ある特定の実施形態では、標的配列は、細胞の核中または細胞質中に位置し得る。一実施形態では、標的ＲＮＡは、少なくとも２０ｎｔ（または少なくとも２３ｎｔ、または少なくとも８７ｎｔ、または少なくとも１００ｎｔ）のＲＮＡ残基またはその改変物を含む。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、少なくとも２０ｎｔの連続するＲＮＡ残基またはその改変物を含む。標的ＲＮＡのうちで、ｃｒＲＮＡのガイドとのハイブリダイゼーションが可能な領域は、本明細書では潜在的ハイブリダイゼーション領域と称される。そのような標的ＲＮＡ、そこに含まれるハイブリダイゼーション領域、標的ＲＮＡのハイブリダイゼーション領域のハイブリダイゼーション対象であり得るｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡのガイドは、互いに対応する。
ｃｒＲＮＡの核酸配列は、標的配列とハイブリダイゼーションし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く上で十分な標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ＲＮＡ配列）との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、改変ｃｒＲＮＡのスペーサー配列とその対応標的配列との相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントをとった場合、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、もしくはそれを超える％、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超、もしくはそれを超える％超である。「相補性」という用語は、伝統的なワトソン・クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合形成（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）が可能な核酸分子中残基の割合を示す。本明細書で使用される「相補的」という用語は、配列が完全な相補性を有すること（すなわち、核酸配列のすべての連続残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合を形成することになる）を指すか、または配列が実質的に相補的であること（すなわち、配列が有する相補性が１００％未満であること）指し得るが、但し、厳密な条件の下で２つの核酸のハイブリダイゼーションが生じることが条件である。ハイブリダイゼーションについての「厳密な条件」という用語は、標的配列との相補性を有する核酸が標的配列と優位にハイブリダイゼーションし、非標的配列とは実質的にハイブリダイゼーションしない条件を指す。厳密な条件は、一般に、配列に依存し、いくつかの因子に応じて異なる。一般に、配列が長れば長い
ほど、温度が高くても配列はその標的配列と特異的にハイブリダイゼーションするようになる。厳密な条件の例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されているが、これに限定されない。最適なアライメントは、配列のアライメント用の任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、こうしたアルゴリズムの例としては、限定されないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列のヌクレオチド長は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれを超える数である。場合によっては、スペーサー配列のヌクレオチド長は約２０である。他の場合では、スペーサー配列のヌクレオチド長は２３である。他の場合では、スペーサー配列のヌクレオチド長は約２５である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くスペーサー配列の能力は任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、被験スペーサー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分が、（ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターのトランスフェクションなどによって）対応標的配列を有する宿主細胞へと供給され、その後に標的配列内が選択的に切断されるかが評価され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列と、被験スペーサー配列、及び被験スペーサー配列とは異なる対照スペーサー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分と、を供給し、被験スペーサー配列反応と対照スペーサー配列反応との間で標的配列への結合または標的配列の切断率を比較することによって試験管内で評価され得る。適切なｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列は、ｃａｓ１３ｄｅｓｉｇｎ．ｎｙｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇにおいてオンラインで利用可能な利用可能な、Ｓａｎｊａｎａ ｌａｂによって供給されるＣａｓ１３ガイドデザイナーを含めて、当該技術分野で知られるウェブベースのソフトウェアのいずれかを使用して選択され得る。Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｃａｓ１３ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．２０．２５９７６２及びＷｅｓｓｅｌｓ，ＨＨ．，Ｍｅｎｄｅｚ－Ｍａｎｃｉｌｌａ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ Ｃａｓ１３
ｓｃｒｅｅｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ
ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８，７２２－７２７（２０２０）も併せて参照のこと。これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ほど、温度が高くても配列はその標的配列と特異的にハイブリダイゼーションするようになる。厳密な条件の例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されているが、これに限定されない。最適なアライメントは、配列のアライメント用の任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、こうしたアルゴリズムの例としては、限定されないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列のヌクレオチド長は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれを超える数である。場合によっては、スペーサー配列のヌクレオチド長は約２０である。他の場合では、スペーサー配列のヌクレオチド長は２３である。他の場合では、スペーサー配列のヌクレオチド長は約２５である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くスペーサー配列の能力は任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、被験スペーサー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分が、（ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターのトランスフェクションなどによって）対応標的配列を有する宿主細胞へと供給され、その後に標的配列内が選択的に切断されるかが評価され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列と、被験スペーサー配列、及び被験スペーサー配列とは異なる対照スペーサー配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分と、を供給し、被験スペーサー配列反応と対照スペーサー配列反応との間で標的配列への結合または標的配列の切断率を比較することによって試験管内で評価され得る。適切なｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列は、ｃａｓ１３ｄｅｓｉｇｎ．ｎｙｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇにおいてオンラインで利用可能な利用可能な、Ｓａｎｊａｎａ ｌａｂによって供給されるＣａｓ１３ガイドデザイナーを含めて、当該技術分野で知られるウェブベースのソフトウェアのいずれかを使用して選択され得る。Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｃａｓ１３ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０８．２０．２５９７６２及びＷｅｓｓｅｌｓ，ＨＨ．，Ｍｅｎｄｅｚ－Ｍａｎｃｉｌｌａ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ Ｃａｓ１３
ｓｃｒｅｅｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ
ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８，７２２－７２７（２０２０）も併せて参照のこと。これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のｃｒＲＮＡ及びｂｃｇＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。ＤＲ配列は、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡと複合体を形成するショートヘアピン領域である。今日までに報告されたすべてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターと同様に、Ｃａｓ１３酵素はそれぞれ、その対応ｃｒＲＮＡ内のステムループ構造含有ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を認識する。ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄタンパク質と複合体を形成し、クラス２のＶＩ型タンパク質（Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントなど）に対して標的化特異性及び結合能力を付与することが可能である。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列はＣａｓ１３ｄ配列である。一方、Ｃａｓ１３サブタイプ間では、ＤＲ配列モチーフ、ＲＮＡフォールド、及びスペーサー配列に対するＤＲ位置はそれぞれ異なる。Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｄについては、ＤＲは５’末端上に位置する一方で、Ｃａｓ１３ｂのＤＲはスペーサー配列の３’に位置する。したがって、一実施形態では、ＤＲは、スペーサー配列の５’に位置する。別の実施形態では、ＤＲは、スペーサー配列の３’に位置する。例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ，Ｃｅｌｌ．２０１８ Ｓｅｐ ２０；１７５（１）：２１２－２２３．ｅ１７を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＤＲは、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列の５’に位置する。
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ，Ｃｅｌｌ．２０１８ Ｓｅｐ ２０；１７５（１）：２１２－２２３．ｅ１７を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＤＲは、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列の５’に位置する。
ｂｃｇＲＮＡ
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイは、使用されている特定のアレイの検出及び／または同定を可能にするバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）を必要とする。ｂｃｇＲＮＡは、バーコード配列及び逆転写ハンドルを含む。ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡはＰＣＲハンドルも含む。バーコードまたはバーコード配列は、それが含まれる特定のアレイに対応する特有のＤＮＡ配列であり、その結果、バーコードは、アレイに含まれる摂動の集約的アイデンティティーをコードする。バーコードは、典型的には、４つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、２個、１３個、１４個、または１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、８～１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるアレイを含むＣＲＩＳＰＲアレイのライブラリーが提供され、それぞれの特有のアレイは、異なるバーコードを含む。いくつかの実施形態では、提供されるＣＲＩＳＰＲアレイは、ｂｃｇＲＮＡの５’にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。ＤＲ配列は、使用されるＣａｓ酵素に特異的である。
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイは、使用されている特定のアレイの検出及び／または同定を可能にするバーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）を必要とする。ｂｃｇＲＮＡは、バーコード配列及び逆転写ハンドルを含む。ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡはＰＣＲハンドルも含む。バーコードまたはバーコード配列は、それが含まれる特定のアレイに対応する特有のＤＮＡ配列であり、その結果、バーコードは、アレイに含まれる摂動の集約的アイデンティティーをコードする。バーコードは、典型的には、４つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、２個、１３個、１４個、または１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、８～１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の異なるアレイを含むＣＲＩＳＰＲアレイのライブラリーが提供され、それぞれの特有のアレイは、異なるバーコードを含む。いくつかの実施形態では、提供されるＣＲＩＳＰＲアレイは、ｂｃｇＲＮＡの５’にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。ＤＲ配列は、使用されるＣａｓ酵素に特異的である。
「逆転写（ＲＴ）ハンドル」という用語は、ｂｃｇＲＮＡのうちで、逆転写を促進するためのプライマー結合部位である配列を指す。したがって、適切な逆転写反応では、プライマーの伸長によって、テンプレートｂｃｇＲＮＡと相補的な配列を含むポリヌクレオチドが形成される。ある特定の実施形態では、ＲＴハンドルは、少なくとも４ヌクレオチドの長さ、５ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチドの長さ、１５ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２５ヌクレオチドの長さ、３０ヌクレオチドの長さ、３５ヌクレオチドの長さ、４０ヌクレオチドの長さ、４５ヌクレオチドの長さ、５０ヌクレオチドの長さ、６０ヌクレオチドの長さ、７０ヌクレオチドの長さ、８０ヌクレオチドの長さ、９０ヌクレオチドの長さ、１００ヌクレオチドの長さ、またはこれらの長さのいずれか２つの範囲に含まれる長さを有する。ある特定の実施形態では、ＲＴハンドルはポリＡ配列（または尾部）を含み、この場合、オリゴ（ｄＴ）プライマーが適切であろう。ある特定の実施形態では、ＲＴハンドルは、基材（例えば、単離ビーズ）上のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能である。一実施形態では、ＲＴハンドルのヌクレオチド長は、７、１２、１７、または２２である。別の実施形態では、ＲＴハンドルは、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅまたはそのバリアントを含む。一実施形態では、ＲＴハンドルは、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＣＳ１を含む。別の実施形態では、ＲＴハンドルは、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＣＳ２を含む。
ある特定の実施形態では、ｂｃｇＲＮＡの逆転写によってＰＣＲハンドルの相補鎖が合成され、このＰＣＲハンドルは、ｂｃｇＲＮＡの５’に位置するＤＲと、バーコード配列との間に位置する。例えば、図１Ａを参照のこと。「ＰＣＲハンドル」という用語は、プライマーに結合してＰＣＲを促進することが可能なプライマー結合部位を指す。ある特定の実施形態では、ＰＣＲハンドルは、バーコード配列を含む相補鎖のＰＣＲにおける伸長を促進するためのプライマー結合部位である。ＰＣＲハンドルは、少なくとも４ヌクレオチドの長さ、５ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチドの長さ、１５ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２５ヌクレオチドの長さ、３０ヌクレオチドの長さ、３５ヌクレオチドの長さ、４０ヌクレオチドの長さ、４５ヌクレオチドの長さ、５０ヌクレオチドの長さ、６０ヌクレオチドの長さ、７０ヌクレオチドの長さ、８０ヌクレオチドの長さ、９０ヌクレオチドの長さ、１００ヌクレオチドの長さ、またはこれらの長さのいずれか
２つの範囲に含まれる長さを有する。一実施形態では、ＰＣＲハンドルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲハンドルである。
２つの範囲に含まれる長さを有する。一実施形態では、ＰＣＲハンドルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲハンドルである。
ＣＲＩＳＰＲアレイ
ＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ、及びｂｃｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡを含む。これらのｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ酵素と共に導入された場合、細胞トランスクリプトームに同じまたは異なる摂動（複数可）を与えるように設計され得る。これらのｃｒＲＮＡは、いくつかの実施形態では、同じｃｒＲＮＡであり、例えば、ｃｒＲＮＡ用量の効果を評価するためのものである。他の実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは異なる。いくつかの実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは、同じ遺伝子転写産物を標的とする（例えば、当該標的遺伝子転写産物の異なる領域／配列を標的とする）。他の実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは、異なる遺伝子転写産物を標的とする。
ＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ、及びｂｃｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡを含む。これらのｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ酵素と共に導入された場合、細胞トランスクリプトームに同じまたは異なる摂動（複数可）を与えるように設計され得る。これらのｃｒＲＮＡは、いくつかの実施形態では、同じｃｒＲＮＡであり、例えば、ｃｒＲＮＡ用量の効果を評価するためのものである。他の実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは異なる。いくつかの実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは、同じ遺伝子転写産物を標的とする（例えば、当該標的遺伝子転写産物の異なる領域／配列を標的とする）。他の実施形態では、これらのｃｒＲＮＡは、異なる遺伝子転写産物を標的とする。
ある特定の実施形態では、被験ｃｒＲＮＡのさまざまな組み合わせを含む複数のＣＲＩＳＰＲアレイが提供される。例えば、図２Ａを参照のこと。例えば、いくつかの実施形態では、コンビナトリアル標的化を試験するために、異なる遺伝子転写産物を標的とする２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡが含められる。他の実施形態では、単一のｃｒＲＮＡの１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のコピーを異なるＣＲＩＳＰＲアレイに含め、効果を評価することなどによって、用量依存性が試験され得る。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイ中のさまざまなｃｒＲＮＡの位置を変化させることによってｃｒＲＮＡの位置依存性が試験され得る。図２Ａは、３つのｃｒＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）が利用されるある特定の実施形態を示す。一方で、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡが利用される他の実施形態も企図される。本明細書に記載の成分に基づく他の組み合わせも企図される。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイは、適切な条件の下でＣａｓ酵素／系と共に提供された場合、酵素によるプロセシングを受けて１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数の成熟ｃｒＲＮＡ、及びｂｃｇＲＮＡになる。例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイは、任意のＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ１３ファミリーのメンバーなど）との使用に有用である。多様なＣａｓ１３ファミリーは、Ｃａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄを含む、少なくとも４つの既知のサブタイプを含む。Ｃａｓ１３ファミリーは、一本鎖ＲＮＡを排他的に標的とすることが知られる唯一のクラス２ Ｃａｓ酵素ファミリーである。Ｃａｓ１３酵素及び系については当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第１０，３６２，６１６号、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，ｅｔ ａｌ，Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，ａａｆ５５７３（２０１６）、Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ，ｅｔ ａｌ，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７（２０１５）、Ｓ．Ｓｈｍａｋｏｖ，ｅｔ
ａｌ，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，１６９－１８２（２０１７）、Ａ．Ａ．Ｓｍａｒｇｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｓ１３ｂ ｉｓ
ａ ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅ
ｄ ＲＮａｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０．ｅ７（２０１７）、Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８－４４２（２０１７）、Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３．Ｎａｔｕｒｅ ５５０，２８０－２８４（２０１７）を参照のこと。これらの文書はそれぞれ、本明細書に組み込まれる。
ａｌ，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，１６９－１８２（２０１７）、Ａ．Ａ．Ｓｍａｒｇｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｓ１３ｂ ｉｓ
ａ ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅ
ｄ ＲＮａｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６５，６１８－６３０．ｅ７（２０１７）、Ｊ．Ｓ．Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，４３８－４４２（２０１７）、Ｏ．Ｏ．Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３．Ｎａｔｕｒｅ ５５０，２８０－２８４（２０１７）を参照のこと。これらの文書はそれぞれ、本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ１３タンパク質は、ステムループを介してＣａｓ１３分子と相互作用し、Ｃａｓ１３分子の一連の立体配座変化を介して標的への結合及びその切断を促進するショートｃｒＲＮＡを使用する。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、またはＣａｓ１３ｄである。一実施形態では、Ｃａｓ１３は、ＨＥＰＮドメイン（複数可）に１つ以上の変異を含む。
Ｃａｓ１３タンパク質は、任意の生物に由来し得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａから選択される属の生物に由来する。一実施形態では、Ｃａｓ１３は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ
ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ、またはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓに由来する。
ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ、またはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓに由来する。
Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ｃｒＲＮＡによってガイドされるクラス２のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃａｓ１３ｄでは、ヘリックスドメインと隣接する２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインが発見されている。例えば、ＷＯ２０１９／０１０３８４Ａｌ、ＵＳ２０１９／０１６９５９５Ａ１、Ｚｈａｎｇ
Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ．Ｃｅｌｌ １７５，２１２－２２３．ｅ２１７、ｇｏｌｄｅｎ．ｃｏｍ／ｗｉｋｉ／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ、及びｚｌａｂ．ｂｉｏ／ｃａｓ１３を参照のこと。当該刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書を通じて、クラス２のＶＩ型という用語は幅広い属であり、その例としてＣａｓ１３ｄが示されているが、「Ｃａｓ１３ｄ」または「Ｃａｓ１３ｄ及びそのバリアント」という用語の使用は、他のクラス２のＶＩ型タンパク質も包含し、これらの用語は互換的に使用され得ることを当業者なら理解するであろう。Ｃａｓ１３ｄ及びそのバリアントには、例えば、野生型もしくは天然起源のＣａｓ１３ｄタンパク質、Ｃａｓ１３ｄのオルソログ、その機能性バリアント、または開示される別の改変バリアントが含まれる。
Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ．Ｃｅｌｌ １７５，２１２－２２３．ｅ２１７、ｇｏｌｄｅｎ．ｃｏｍ／ｗｉｋｉ／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ、及びｚｌａｂ．ｂｉｏ／ｃａｓ１３を参照のこと。当該刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書を通じて、クラス２のＶＩ型という用語は幅広い属であり、その例としてＣａｓ１３ｄが示されているが、「Ｃａｓ１３ｄ」または「Ｃａｓ１３ｄ及びそのバリアント」という用語の使用は、他のクラス２のＶＩ型タンパク質も包含し、これらの用語は互換的に使用され得ることを当業者なら理解するであろう。Ｃａｓ１３ｄ及びそのバリアントには、例えば、野生型もしくは天然起源のＣａｓ１３ｄタンパク質、Ｃａｓ１３ｄのオルソログ、その機能性バリアント、または開示される別の改変バリアントが含まれる。
オルソログは、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ株ＸＰＤ３００２
由来のＲｆｘＣａｓ１３ｄ、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｅｒメタゲノム１５７０６由来のＡｄｍＣａｓ１３ｄ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ＤＳＭ１５７０２由来のＥｓＣａｓ１３ｄ、腸メタゲノムアセンブリＰ１Ｅ０－ｋ２１由来のＰ１Ｅ０Ｃａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ属の難培養種由来のＵｒＣａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１由来のＲｆｆＣａｓ１３ｄ、及びＲｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来のＲａＣａｓ１３ｄから選択される。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲｆｘＣａｓ１３ｄまたはそのバリアントである。Ｃａｓ１３ｄオルソログのアミノ酸配列は公的に利用可能である。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）受入番号６ＯＡＷ＿Ｂもしくは６ＯＡＷ＿Ａもしくは６Ｅ９Ｆ＿Ａもしくは６Ｅ９Ｅ＿Ａもしくは６ＩＶ９＿Ａによって提供されるアミノ酸配列を有するか、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｂ０ＭＳ５０（Ｂ０ＭＳ５０＿９ＦＩＲＭ）もしくはＡ０Ａ１Ｃ５ＳＤ８４（Ａ０Ａ１Ｃ５ＳＤ８４＿９ＦＩＲＭ）によって提供されるアミノ酸配列を有する。これらの参照の配列はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
由来のＲｆｘＣａｓ１３ｄ、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｅｒメタゲノム１５７０６由来のＡｄｍＣａｓ１３ｄ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ＤＳＭ１５７０２由来のＥｓＣａｓ１３ｄ、腸メタゲノムアセンブリＰ１Ｅ０－ｋ２１由来のＰ１Ｅ０Ｃａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ属の難培養種由来のＵｒＣａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１由来のＲｆｆＣａｓ１３ｄ、及びＲｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来のＲａＣａｓ１３ｄから選択される。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲｆｘＣａｓ１３ｄまたはそのバリアントである。Ｃａｓ１３ｄオルソログのアミノ酸配列は公的に利用可能である。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）受入番号６ＯＡＷ＿Ｂもしくは６ＯＡＷ＿Ａもしくは６Ｅ９Ｆ＿Ａもしくは６Ｅ９Ｅ＿Ａもしくは６ＩＶ９＿Ａによって提供されるアミノ酸配列を有するか、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｂ０ＭＳ５０（Ｂ０ＭＳ５０＿９ＦＩＲＭ）もしくはＡ０Ａ１Ｃ５ＳＤ８４（Ａ０Ａ１Ｃ５ＳＤ８４＿９ＦＩＲＭ）によって提供されるアミノ酸配列を有する。これらの参照の配列はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄのバリアントは、Ｃａｓ１３ｄと同じ生物学的機能を共有するタンパク質またはポリペプチドであるＣａｓ１３ｄタンパク質の機能性バリアントであり得る。Ｃａｓ１３ｄタンパク質の機能性バリアントは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約２００個、約２２０個、約２４０個、約２６０個、約２８０個、約３００個、約３３０個、約３６０個、約３９０個、またはそれを超える数の保存的アミノ酸置換（複数可）を有するＣａｓ１３ｄタンパク質であり得る。保存的置換の対象となり得るアミノ酸の同定、置換されたアミノ酸の決定、ならびにタンパク質へのアミノ酸置換の導入に関する方法及び手法については、当業者によく知られている。ｓｉｆｔ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ 及び（Ｎｇ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２００６、Ｎｇ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｎｏｎ－ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＩＦＴ
ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，２００９、Ｎｇ ＰＣ，２００３、Ｎｇ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ Ａｆｆｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２００２、Ｓｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｓｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）を参照のこと。これらはそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２００６、Ｎｇ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｎｏｎ－ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＩＦＴ
ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，２００９、Ｎｇ ＰＣ，２００３、Ｎｇ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ Ａｆｆｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２００２、Ｓｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｓｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）を参照のこと。これらはそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ヒト細胞へのｃｒＲＮＡの送達は困難であり得、一過性の作用は、その半減期が限られ得る。したがって、ヒト細胞における標的化効率及び／または半減期を増加させる改変ｃｒＲＮＡが使用され得る。他の場合では、改変ｃｒＲＮＡは、その非改変配列均等物と比較して活性及び／または特異性を改善させる。ある特定の実施形態では、提供される核酸は、１つ以上のヌクレオチドに化学的改変を含む１つ以上のｃｒＲＮＡを含む。例えば、長さが約２３ヌクレオチドであるスペーサー配列は、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０個以上）の改変ヌクレオチドを有し得るか、または長さが約３０ヌクレオチドであるダイレクトリピート配列は、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０個以上）の改変ヌクレオチドを有し得る。「改変ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドの窒素含有塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の中または上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば
、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、６員の糖類似体、または開鎖糖類似体）の中または上に、あるいはリン酸に１つ以上の化学的改変（例えば、置換）を含むヌクレオチドを指す。場合によっては、スペーサー配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを超える数の改変ヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ配列の任意の核酸位置に位置し得る。化学的改変は、ダイレクトリピート中、スペーサー配列中、または両方に存在し得る。一実施形態では、改変ヌクレオチドは、スペーサー配列の最初（５’）及び／もしくは最後の（３’）ヌクレオチドにもしくはその付近に存在し、ならびに／またはそれらのヌクレオチドの間の任意の位置に存在し得る。特定の実施形態では、改変ヌクレオチドは、スペーサー配列の３’末端に存在する。いくつかの実施形態では、改変ｃｒＲＮＡは、そのリン酸骨格が改変されている。改変ｃｒＲＮＡは、１つ以上のホスホロチオエート（Ｓ）、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート（ＮＰ））、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、及び／またはメチルホスホン酸結合を含み得る。いくつかの実施形態では、改変ｃｒＲＮＡ中の１つ以上の改変ヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｓ）結合を含む。
、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、６員の糖類似体、または開鎖糖類似体）の中または上に、あるいはリン酸に１つ以上の化学的改変（例えば、置換）を含むヌクレオチドを指す。場合によっては、スペーサー配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを超える数の改変ヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ配列の任意の核酸位置に位置し得る。化学的改変は、ダイレクトリピート中、スペーサー配列中、または両方に存在し得る。一実施形態では、改変ヌクレオチドは、スペーサー配列の最初（５’）及び／もしくは最後の（３’）ヌクレオチドにもしくはその付近に存在し、ならびに／またはそれらのヌクレオチドの間の任意の位置に存在し得る。特定の実施形態では、改変ヌクレオチドは、スペーサー配列の３’末端に存在する。いくつかの実施形態では、改変ｃｒＲＮＡは、そのリン酸骨格が改変されている。改変ｃｒＲＮＡは、１つ以上のホスホロチオエート（Ｓ）、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート（ＮＰ））、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、及び／またはメチルホスホン酸結合を含み得る。いくつかの実施形態では、改変ｃｒＲＮＡ中の１つ以上の改変ヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｓ）結合を含む。
本明細書で使用されるｃｒＲＮＡ及びｂｃｇＲＮＡは、当業者に知られる任意の方法によって合成され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及び／またはｂｃｇＲＮＡは、化学的に合成される。方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３，１１５４０－１１５５６（２０１１）、Ｔｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０，７４６－７５４（２０１２）、及びＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５，９４０－９５０（２００３）に記載されている。本明細書で有用な化学的改変については、他のＣａｓ系での使用向けに報告されている。例えば、ＵＳ２０１８／０１１９１４０を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、安定化ＲＮＡエレメントを含む。本発明者らは、ｂｃｇＲＮＡの３’末端に安定化ＲＮＡエレメントを付加することで、核酸分解に対抗し、ｂｃｇＲＮＡの検出感度を改善し得ることを示している。安定構造を形成するＲＮＡエレメントについては当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ－Ｍａｎｃｉｌｌａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１－７（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０２１．０７．０１１を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ＭＡＬＡＴ１三重構造である（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，１９２０２－１９２０７（２０１２）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ＮＥＡＴ１（ＭＥＮβ）構造である（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，１９２０２－１９２０７（２０１２）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ｓｐｎｐｒｅＱ１構造である（Ｋａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，（２０１４）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ｍｐｋｎｏｔエレメントである（Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，４５３－４５８（２０１６）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ジカウイルス由来のｘｒＲＮＡ１ダンベルである（Ａｋｉｙａｍａ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５４，１１４８－１１５２（２０１６）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメ
ントは、ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノットである（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２１－０１０３９－７を参照のこと）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノットであり、安定化ＲＮＡエレメントを含まないＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、検出感度を少なくとも３倍、４倍、５倍、または６倍に改善する。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４に示される配列を含む。
ントは、ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノットである（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２１－０１０３９－７を参照のこと）。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノットであり、安定化ＲＮＡエレメントを含まないＣＲＩＳＰＲアレイと比較して、検出感度を少なくとも３倍、４倍、５倍、または６倍に改善する。ある特定の実施形態では、安定化ＲＮＡエレメントは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４に示される配列を含む。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、標的ＲＮＡを有するまたは標的ＲＮＡを有することが疑われる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイを含む原核細胞または真核細胞を指し、当該ＣＲＩＳＰＲアレイは、任意の手段によって細胞に導入されているものであり、こうした手段は、例えば、電気穿孔、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合手法、ＤＮＡ被覆ペレットの高速導入、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合である。本明細書に記載のある特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載の組成物をインビトロで評価するための任意の哺乳類種の培養細胞を指す。「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載のウイルススベクターまたは非ウイルスベクターを生成させるための産生プラスミドを含むパッケージング細胞も指し得る。
一実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。「初代細胞」と言う用語は、多細胞生物から直接的に単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には、集団倍加はほぼ生じておらず、それ故に、その由来元である組織の主な機能的要素を、連続継代性の（腫瘍または人為的不死化）細胞株と比較して色濃く代表するものである。場合によっては、初代細胞は、単離後すぐに使用されている細胞である。他の場合では、初代細胞は無限増殖が不可能なものであり、それ故に、インビトロで長期間培養することができない。他の実施形態では、細胞は、培養細胞（例えば、哺乳類細胞または細菌細胞）である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞株である。ある特定の場合では、初代細胞は、幹細胞または免疫細胞である。幹細胞の例としては、限定されないが、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）（ＣＤ３４＋ＨＳＰＣなど）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、臓器幹細胞、及びそれらの組み合わせが挙げられる。免疫細胞の例としては、限定されないが、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、単球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。他の実施形態では、初代細胞またはその子孫（例えば、初代細胞由来の細胞）は、ＣＲＩＳＰＲアレイ及びＣａｓポリペプチドを初代細胞に導入した後に、（例えば、任意の許容可能な送達系及び送達経路を介して投与することで）多細胞生物（例えば、ヒト）に戻される。
本明細書に記載の「核酸」または「ヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその改変物であり得、例えば、目的タンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、擬似相補的（ｐｓｅｕｄｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）など）を含む群から選択され得る。ある特定の実施形態では、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド残基」、及び「核酸残基」という用語は互換的に使用され、核酸ポリマー中のヌクレオチドを指す。別の実施形態では、連続ヌクレオチド残基は、核酸ポリマーの連続領域中のヌクレオチド残基を指す。
リボ核酸（ＲＮＡ）は、遺伝子のコード、デコード、調節、及び発現におけるさまざま
な生物学的役割に必須のポリマー分子である。本明細書で使用されるＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、成熟ｍＲＮＡ、一次転写産物ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、５．８Ｓ ｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、低分子ｒＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ロング（遺伝子間）非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ／ｌｎｃＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ヴォールトＲＮＡ（ｖＲＮＡ／ｖｔＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、カハール小体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ／ａｓＲＮＡ）、リボヌクレアーゼＲＮＡ（例えば、ＲＮａｓｅＰ）、非コード制御性ＲＮＡ（例えば、７ＳＫ ＲＮＡ）、ＲＮＡウイルス、または一本鎖ＤＮＡを指し得る。一実施形態では、標的ＲＮＡは、内在性ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。付加的または代替的に、標的ＲＮＡは、ＣＤＳを含む／である。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、ＵＴＲ（５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む）を含む／である。さらに別の実施形態では、標的ＲＮＡは、イントロンを含む／である。ある特定の実施形態では、標的ＲＮＡは、非コード転写産物である。
な生物学的役割に必須のポリマー分子である。本明細書で使用されるＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、成熟ｍＲＮＡ、一次転写産物ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、５．８Ｓ ｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、低分子ｒＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ロング（遺伝子間）非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ／ｌｎｃＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ヴォールトＲＮＡ（ｖＲＮＡ／ｖｔＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、カハール小体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ／ａｓＲＮＡ）、リボヌクレアーゼＲＮＡ（例えば、ＲＮａｓｅＰ）、非コード制御性ＲＮＡ（例えば、７ＳＫ ＲＮＡ）、ＲＮＡウイルス、または一本鎖ＤＮＡを指し得る。一実施形態では、標的ＲＮＡは、内在性ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。付加的または代替的に、標的ＲＮＡは、ＣＤＳを含む／である。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、ＵＴＲ（５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む）を含む／である。さらに別の実施形態では、標的ＲＮＡは、イントロンを含む／である。ある特定の実施形態では、標的ＲＮＡは、非コード転写産物である。
本明細書で使用されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、デオキシリボ核酸によって形成されるポリマー分子であり、こうしたものには、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ヒストンタンパク質と共にパッケージングされるＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、及び染色体ＤＮＡが含まれる。
本明細書に記載の核酸配列は、所定の分子生物学手法を使用してクローニングするか、またはＤＮＡ合成によってデノボ生成させることができ、こうしたことは、ＤＮＡ合成及び／または分子クローニングの領域でビジネスを行っているサービス企業（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって所定の手順を使用して実施され得る。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集系の態様をコードする核酸配列はアセンブリされ、保有配列を宿主細胞に導入する任意の適切な遺伝的エレメント（例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなど）中に配置される。こうした遺伝的エレメントは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、ネイキッドＤＮＡ、もしくは同様のもの）を生成させるためのもの、もしくはパッケージング宿主細胞においてウイルスベクターを生成させるためのもの、及び／または対象中の宿主細胞に送達するためのものである。一実施形態では、遺伝的エレメントは、ベクターである。一実施形態では、遺伝的エレメントは、プラスミドである。そのような操作されたコンストラクトの調製に使用される方法は、核酸操作の技能を有する当業者に知られており、そうした方法には、遺伝子操作、組換え操作、及び合成手法が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照のこと。
本明細書で使用される「発現カセット」は、遺伝子編集系の１つ以上のエレメント（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイ及び／またはＣａｓ酵素）をコードする核酸分子を指す。発現カセットはプロモーターも含み、宿主細胞における遺伝子編集系の１つ以上のエレメントの発現を制御する追加の調節エレメントも含み得る。一実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシド中にパッケージ
ングされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターを生成させるためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び他の発現制御配列（本明細書に記載のものなど）と隣接する。核酸分子もしくはベクターまたはその使用に関する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸分子は、例えば、ＲＮＡ
ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターと機能可能なように結び付いたものであり得る。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ機構による転写が正確に開始されるように導く上で十分なプロモーターであり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩＩ及びＰｏｌ ＩＩＩ）は、ＤＮＡを転写してリボソーム５ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ、及び他の低分子ＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼである。使用できるさまざまなポリメラーゼＩＩＩプロモーターは公的または商業的に利用可能であり、こうしたポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ６プロモーター、ヒト起源もしくはマウス起源または任意の他種由来のＨ１ ＲＮＡ遺伝子またはＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するプロモーター断片である。さらに、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、遍在性にまたは組織特異的様式で他の望ましい特性（化学低分子によって誘導される能力など）を含むように改変／操作され得る。例えば、一実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンによって活性化され得る。別の実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧ（ｌａｃＩ系）によって活性化され得る。ＵＳ５９０２８８０Ａ及びＵＳ７１９５９１６Ｂ２を参照のこと。別の実施形態では、さまざまな種（ヒト、マウス、またはラットなど）に由来するＰｏｌ
ＩＩＩプロモーターが利用され得る。
ングされ得る。一実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターを生成させるためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び他の発現制御配列（本明細書に記載のものなど）と隣接する。核酸分子もしくはベクターまたはその使用に関する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸分子は、例えば、ＲＮＡ
ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターと機能可能なように結び付いたものであり得る。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ機構による転写が正確に開始されるように導く上で十分なプロモーターであり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩＩ及びＰｏｌ ＩＩＩ）は、ＤＮＡを転写してリボソーム５ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ、及び他の低分子ＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼである。使用できるさまざまなポリメラーゼＩＩＩプロモーターは公的または商業的に利用可能であり、こうしたポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｕ６プロモーター、ヒト起源もしくはマウス起源または任意の他種由来のＨ１ ＲＮＡ遺伝子またはＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するプロモーター断片である。さらに、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、遍在性にまたは組織特異的様式で他の望ましい特性（化学低分子によって誘導される能力など）を含むように改変／操作され得る。例えば、一実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンによって活性化され得る。別の実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧ（ｌａｃＩ系）によって活性化され得る。ＵＳ５９０２８８０Ａ及びＵＳ７１９５９１６Ｂ２を参照のこと。別の実施形態では、さまざまな種（ヒト、マウス、またはラットなど）に由来するＰｏｌ
ＩＩＩプロモーターが利用され得る。
「調節エレメント」または「調節配列」という用語は、目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ１３ｄコード配列、またはＣＲＩＳＰＲアレイを発現させるための配列）と連続する発現制御配列と、目的の核酸配列を制御するためにトランスまたは遠隔で作用する発現制御配列とを指す。本明細書に記載の調節エレメントは、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子、転写ターミネーター、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）など）、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、ならびに必要に応じて、コード産物の分泌を増強する配列を含む。Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）も併せて参照のこと。調節配列には、多くの型の標的細胞において核酸配列の構成的発現を導くもの、及びある特定の標的細胞中でのみ核酸配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。さらに、ＣＲＩＳＰＲアレイまたはＣａｓ１３ｄは、特定の間隔でまたは特定の期間にわたってＣＲＩＳＰＲアレイまたはＣａｓ１３ｄの合成を導くために、調節配列を含むベクターによって送達され得る。ベクターの設計は、要因（標的細胞の選択、所望の発現のレベル、及び同様のものなど）に依存し得ることを当業者なら理解するであろう。
本明細書で使用される「機能可能なように連結された」配列または「機能可能なように結び付いた」配列は、目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ１３ｄコード配列、またはＣＲＩＳＰＲアレイを発現させるための配列）と連続する発現制御配列と、目的の核酸配列を制御するためにトランスまたは遠隔で作用する発現制御配列との両方を含む。
「発現」という用語は、その最も広い意味において本明細書で使用され、ＲＮＡの産生、タンパク質の産生、またはＲＮＡ及びタンパク質の両方の産生を含む。発現は一過性のものであり得るか、または安定的なものであり得る。
発現カセットは、任意の適切な送達系を介して宿主細胞に送達され得る。適切な非ウイ
ルス送達系については当該技術分野で知られており（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得る。こうした適切な非ウイルス送達系には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子、すなわちＬＮＰ）、またはキトサンベースの製剤が含まれ得る。
ルス送達系については当該技術分野で知られており（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得る。こうした適切な非ウイルス送達系には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子、すなわちＬＮＰ）、またはキトサンベースの製剤が含まれ得る。
ある特定の実施形態では、遺伝子編集系の１つ以上のエレメントは、ベクターまたはウイルスベクターによって宿主細胞に送達される核酸配列によってコードされ、こうしたベクターまたはウイルスベクターは、その多くが当該技術分野で知られており、利用可能である。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを含むベクターが提供される。
一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。「ウイルスベクター」は、目的の核酸配列を含む発現カセットがウイルスカプシド中またはエンベロープ中にパッケージングされる合成ウイルス粒子または人工ウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルス（Ａｄ）、レトロウイルス（γ－レトロウイルス及びレンチウイルス）、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルスが挙げられる。一実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠陥である。「複製欠陥ウイルス」は、ウイルスカプシド中またはエンベロープ中に併せてパッケージングされるウイルスゲノム配列がいずれも複製欠損であり、すなわち、子孫ビリオンは生成できないが、細胞に感染する能力は保持するウイルスベクターを指す。
一実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。「ウイルスベクター」は、目的の核酸配列を含む発現カセットがウイルスカプシド中またはエンベロープ中にパッケージングされる合成ウイルス粒子または人工ウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルス（Ａｄ）、レトロウイルス（γ－レトロウイルス及びレンチウイルス）、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルスが挙げられる。一実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠陥である。「複製欠陥ウイルス」は、ウイルスカプシド中またはエンベロープ中に併せてパッケージングされるウイルスゲノム配列がいずれも複製欠損であり、すなわち、子孫ビリオンは生成できないが、細胞に感染する能力は保持するウイルスベクターを指す。
一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の発現カセットを含む非ウイルスプラスミド（例えば、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）であり、こうした非ウイルスプラスミドは、さまざまな組成物及びナノ粒子と組み合わせられ、こうした組成物及びナノ粒子には、例えば、ミセル、リポソーム、陽イオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールベースの核酸複合体、ならびに他のコンストラクト（本明細書に記載のものなど）が含まれる。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開日：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照のこと。これらの文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明に従って使用することができるプラスミド、他のクローニングベクター及び発現ベクター、その特性、ならびにその構築／操作方法は、当業者には容易に明らかである。一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子編集系のエレメントまたは本明細書に記載の発現カセットは、ウイルスベクターの生成及び／または宿主細胞への送達に有用な適切な遺伝エレメント（ベクター）へと操作導入される。こうした適切な遺伝エレメント（ベクター）は、それが保有する配列を導入するものであり、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどである。選択されるベクターは、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合手法、ＤＮＡ被覆ペレットの高速導入、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含めて、任意の適切な方法によって送達され得る。そのようなコンストラクトの調製に使用される方法は、核酸操作の技能を有する当業者に知られており、そうした方法には、遺伝子操作、組換え操作、及び合成手法が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
本明細書で使用される「摂動」という用語は、標的配列の変異または改変の結果として
１つ以上の転写産物、遺伝子、または遺伝子産物（タンパク質を含む）に及ぶ作用を指す。変異または改変には、例えば、小さなヌクレオチド挿入もしくはヌクレオチド欠失（インデル）またはより大きな欠失、挿入、もしくは逆位が含まれる。ある特定の実施形態では、変異または改変の導入は、「編集」または「遺伝子編集」と称される。
１つ以上の転写産物、遺伝子、または遺伝子産物（タンパク質を含む）に及ぶ作用を指す。変異または改変には、例えば、小さなヌクレオチド挿入もしくはヌクレオチド欠失（インデル）またはより大きな欠失、挿入、もしくは逆位が含まれる。ある特定の実施形態では、変異または改変の導入は、「編集」または「遺伝子編集」と称される。
本明細書で使用される「遺伝子編集系」は、特定の遺伝子または核酸配列（すなわち、標的配列）に対する特異性を典型的には有する遺伝物質改変技術または遺伝物質改変分子機構を指す。ある特定の実施形態では、遺伝子編集系は、１つ以上のＲＮＡ標的配列に摂動を導入する規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）系である。
ある特定の実施形態では、適切なＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、Ｃａｓ酵素と、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイと、を最低限含む。ある特定の実施形態では、遺伝子編集系は、編集酵素としてのＣａｓ１３ｄと、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイとを含む。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸配列と、Ｃａｓ１３ｄ酵素をコードする核酸配列と、を含む発現カセットを有する核酸を含むベクターが提供される。したがって、ある特定の実施形態では、二重ベクター系（例えば、ＷＯ２０１６／１７６１９１に記載のもの）が提供され、遺伝子編集系は、発現を導く調節配列の制御下にあるＣａｓ１３遺伝子を含む発現カセットと、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイを含む第２の発現カセットと、を含む。
ＣＲＩＳＰＲアレイ、核酸分子、ベクター、組成物、任意の他の成分、方法、または使用に関して記載される実施形態はいずれも、ＣＲＩＳＰＲアレイ、核酸分子、ベクター、組成物、任意の他の成分、方法、または使用に関する任意の他の実施形態と組み合わせられ得ることにも留意されたい。
方法
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイ、核酸分子、ＲＮＰ、ベクター、細胞、及びライブラリーのうちの１つ以上はさまざまな方法に有用であり、こうした方法には、限定されないが、異常なＲＮＡと関連する疾患の治療；機能性ＲＮＡ（複数可）のスクリーニング；標的ＲＮＡのノックダウン、検出、または編集；あるいはスプライシング、選択的アイソフォーム、イントロンリテンション、もしくはＵＴＲ使用差異の検出もしくは編集、または分解を伴わない標的への結合が含まれる。一態様では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法が提供される。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイ、核酸分子、ＲＮＰ、ベクター、細胞、及びライブラリーのうちの１つ以上はさまざまな方法に有用であり、こうした方法には、限定されないが、異常なＲＮＡと関連する疾患の治療；機能性ＲＮＡ（複数可）のスクリーニング；標的ＲＮＡのノックダウン、検出、または編集；あるいはスプライシング、選択的アイソフォーム、イントロンリテンション、もしくはＵＴＲ使用差異の検出もしくは編集、または分解を伴わない標的への結合が含まれる。一態様では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法が提供される。
一態様では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法が提供される。方法は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイとＣａｓ酵素とを含む宿主細胞を提供することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が細胞トランスクリプトームに導入される。方法は、細胞からＲＮＡを単離することと、ＲＮＡ試料を逆転写ハンドルに特異的なプライマーと接触させることを含む逆転写を実施することと、バーコード配列を同定することと、をさらに含む。方法は、１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、フローサイトメトリー分析、細胞ハッシング、単一細胞シークエンシング分析、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ．、ならびにトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲハンドルに特異的なプライマーを使用してバーコード配列を増幅することを含む。
別の実施形態では、遺伝子摂動プロファイリングの実施方法は、本明細書に記載のＣＲ
ＩＳＰＲアレイとＣａｓ酵素とを含む宿主細胞を提供することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が細胞トランスクリプトームに導入され、宿主細胞は、１つ以上のフルオロフォア結合型抗体で標識され、フローサイトメトリーを使用して選別される。方法は、単離された細胞からＲＮＡを単離することと、ＲＮＡ試料を逆転写ハンドルに特異的なプライマーと接触させることを含む逆転写を実施することと、バーコード配列を同定することと、をさらに含む。方法は、１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、フローサイトメトリー分析、細胞ハッシング、単一細胞シークエンシング分析、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ．、ならびにトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲハンドルに特異的なプライマーを使用してバーコード配列を増幅することを含む。
ＩＳＰＲアレイとＣａｓ酵素とを含む宿主細胞を提供することを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が細胞トランスクリプトームに導入され、宿主細胞は、１つ以上のフルオロフォア結合型抗体で標識され、フローサイトメトリーを使用して選別される。方法は、単離された細胞からＲＮＡを単離することと、ＲＮＡ試料を逆転写ハンドルに特異的なプライマーと接触させることを含む逆転写を実施することと、バーコード配列を同定することと、をさらに含む。方法は、１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、フローサイトメトリー分析、細胞ハッシング、単一細胞シークエンシング分析、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ．、ならびにトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＣＲハンドルに特異的なプライマーを使用してバーコード配列を増幅することを含む。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイを使用する上では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする核酸と共に当該ＣＲＩＳＰＲアレイを提供することが望ましくあり得る。Ｃａｓ１３ｄをコードする核酸は、複製及び／または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換のための中間ベクターにクローニングされ得る。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ１３タンパク質バリアントをコードするその産生用核酸の保存または操作のための原核生物ベクター（例えば、プラスミドまたはシャトルベクターまたは昆虫ベクター）である。Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞（好ましくは、哺乳類細胞もしくはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与のための発現ベクターにもクローニングされ得る。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイと、Ｃａｓ１３ポリペプチド、Ｃａｓ１３ｄポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及び／またはそのＣａｓ１３ｄポリペプチドバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとは、任意の適切な方法（電気穿孔によるものなど）を使用して細胞に導入される。ある特定の場合では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３ｄポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片と複合体化されて、細胞（例えば、トランスクリプトーム摂動分析のためのインビトロの細胞）への導入のためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達系を形成する。他の場合では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３ｄポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡと共に細胞（例えば、トランスクリプトーム摂動分析のためのインビトロの細胞）に導入される。さらに他の場合では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと共に細胞（例えば、トランスクリプトーム摂動分析のためのインビトロの細胞）に導入される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡシークエンシングまたはＤＮＡシークエンシングが実施され、その実施方法には、限定されないが、全トランスクリプトーム解析、全ゲノム解析、ゲノムの全領域または標的領域のバーコードシークエンシング、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、（例えばフローサイトメトリーを使用して）細胞表面タンパク質を検出することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、当該技術分野で報告される方法を使用する追加の分子モダリティでのプロファイリングと共に、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲアレイを検出または同定することを含み、当該技術分野で報告される方法には、例えば、単一細胞シークエンシング分析（例えば、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｍｕｌｔｉｏｍｅプラットホーム）、単一細胞ＲＮＡ－シークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）（例えば、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆ
ｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：７５（２０１７）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１８ Ａｕｇ ７；５０（８）：９６を参照のこと）、細胞ハッシング（例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１８；１９：２２４を参照のこと）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ．（例えば、Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｌｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ．Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ １５；１６７（７）：１８５３－１８６６．ｅ１７を参照のこと）、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ（例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄｏｕｔ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｍａｒ；１４（３）：２９７－３０１を参照のこと）、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ（例えば、Ｊａｉｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｏｏｌｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ １５；１６７（７）：１８８３－１８９６．ｅ１５を参照のこと）、拡張型ＣＲＩＳＰＲ適合ＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（例えば、Ｍｉｍｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１９ Ｍａｙ；１６（５）：４０９－４１を参照のこと）、及びトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化－ｓｅｑ（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｓｅｐ；１４（９）：８６５－８６８を参照のこと）が含まれる。
ｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：７５（２０１７）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１８ Ａｕｇ ７；５０（８）：９６を参照のこと）、細胞ハッシング（例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１８；１９：２２４を参照のこと）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ．（例えば、Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｌｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ．Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ １５；１６７（７）：１８５３－１８６６．ｅ１７を参照のこと）、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ（例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄｏｕｔ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｍａｒ；１４（３）：２９７－３０１を参照のこと）、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ（例えば、Ｊａｉｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｏｏｌｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ １５；１６７（７）：１８８３－１８９６．ｅ１５を参照のこと）、拡張型ＣＲＩＳＰＲ適合ＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（例えば、Ｍｉｍｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１９ Ｍａｙ；１６（５）：４０９－４１を参照のこと）、及びトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化－ｓｅｑ（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）（例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｓｅｐ；１４（９）：８６５－８６８を参照のこと）が含まれる。
本明細書で使用される「逆転写」は、ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列をＤＮＡ分子にコピーするプロセスを指す。逆転写は、ＲＮＡテンプレートをＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としても知られる）と接触させることによって実施され得る。逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡに転写するＤＮＡポリメラーゼである。使用されるポリメラーゼに応じて、逆転写酵素は、その後にＲＮＡテンプレートを分解するためのＲＮａｓｅＨ活性も有し得る。
本明細書で使用される「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素の作用を介してＲＮＡから逆転写された合成ＤＮＡを指し得る。ｃＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得、ＲＮＡ配列の一部と実質的に同一である配列またはＲＮＡ配列の一部の相補鎖である配列、の一方または両方を有する鎖を含み得る。
いくつかの実施形態は、プライマーの使用を含む。本明細書で使用される「プライマー」は、試料中に存在する標的ポリヌクレオチドまたはテンプレートポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって当該標的またはテンプレートに結合する短いポリヌクレオチド（一般に、その３’－ＯＨ基は遊離の状態である）を指し得、このポリヌクレオチドは、結合後に当該プライマーの伸長を促進して当該標的またはテンプレートと相補的な
ポリヌクレオチドを形成する。プライマーは、５～１０００個またはそれを超える数のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、少なくとも４ヌクレオチドの長さ、５ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチドの長さ、１５ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２５ヌクレオチドの長さ、３０ヌクレオチドの長さ、３５ヌクレオチドの長さ、４０ヌクレオチドの長さ、４５ヌクレオチドの長さ、５０ヌクレオチドの長さ、６０ヌクレオチドの長さ、７０ヌクレオチドの長さ、８０ヌクレオチドの長さ、９０ヌクレオチドの長さ、１００ヌクレオチドの長さ、またはこれらの長さのいずれか２つの範囲に含まれる長さを有する。
ポリヌクレオチドを形成する。プライマーは、５～１０００個またはそれを超える数のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、少なくとも４ヌクレオチドの長さ、５ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチドの長さ、１５ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、２５ヌクレオチドの長さ、３０ヌクレオチドの長さ、３５ヌクレオチドの長さ、４０ヌクレオチドの長さ、４５ヌクレオチドの長さ、５０ヌクレオチドの長さ、６０ヌクレオチドの長さ、７０ヌクレオチドの長さ、８０ヌクレオチドの長さ、９０ヌクレオチドの長さ、１００ヌクレオチドの長さ、またはこれらの長さのいずれか２つの範囲に含まれる長さを有する。
発現を得るために、Ｃａｓ１３タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を導くためのプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌プロモーター及び真核生物プロモーターは当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の種、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２２：２２９－２３５）。そのような発現系向けのキットは商業的に利用可能である。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞向けの真核生物発現系は当該技術分野でよく知られており、商業的にも利用可能である。
一実施形態では、標的ＲＮＡはｍＲＮＡであり、調節または摂動は、標的ＲＮＡのタンパク質発現の抑制、排除、調整、または調節を含む。標的ＲＮＡには、限定されないが、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び他のＲＮＡが含まれる。
正しい転写産物調節の存在を機能的に試験するために、標的ＲＮＡは、当業者に知られる標準的な方法によって分析され得る。例えば、変性ゲル電気泳動を実施することで、標的ＲＮＡが断片化しているかどうかを決定することができる。標的ＲＮＡに対応するタンパク質に指向化された抗体を使用することで、ＦＡＣＳを含む他の手法を実施することができる。正しい転写産物調節の存在の試験に有用な他の方法には、限定されないが、ｑＰＣＲ及びＲＮＡ－ｓｅｑが含まれる。
一態様では、機能性スクリーニング法が提供される。方法は、開示の１つ以上のＣＲＩＳＰＲアレイ（複数可）及び／または核酸分子（複数可）及び／またはベクター（複数可）及び／またはライブラリーを細胞培養物、組織、または対象の標的細胞と接触させることを含む。一実施形態では、方法は、標的細胞中の核酸分子またはベクターを増幅することと、任意選択で、核酸分子またはベクターを定量化することと、を含む。
一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、標的細胞において核酸分子またはベクターによって発現する。したがって、標的細胞においては、ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓ１３ｄまたはその変形形態と複合体を形成し、この複合体を標的ＲＮＡに導く。別の実施形態では、核酸分子またはベクターは、ＣＲＩＳＰＲアレイ（複数可）を含むまたは発現するものと同じ核酸分子またはベクターである。別の実施形態では、核酸分子またはベクターは、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は発現するが、ＣＲＩＳＰＲアレイは発現せず、したがって、本明細書で使用されるように「Ｃａｓ１３ｄ分子」または「Ｃａｓ１３ｄベクター」と称される。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ分子（またはＣａｓ１３ｄベクター）とＣＲＩＳＰＲアレイ（またはｃｒＲＮＡを与える核酸分子及び／もしくはベクター）との比
は、約１００：１～約１：１００（それらの間の各比を含む）である。一実施形態では、比は、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、または約１：１０である。別の実施形態では、比は、モル比である。
は、約１００：１～約１：１００（それらの間の各比を含む）である。一実施形態では、比は、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、または約１：１０である。別の実施形態では、比は、モル比である。
一実施形態では、コードされるＣａｓ１３ｄタンパク質は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ株ＸＰＤ３００２由来のＲｆｘＣａｓ１３ｄである。他のＣａｓ１３ｄを利用することもでき、他のＣａｓ１３ｄは、例えば、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｅｒメタゲノム１５７０６由来のＡｄｍＣａｓ１３ｄ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ＤＳＭ１５７０２由来のＥｓＣａｓ１３ｄ、腸メタゲノムアセンブリＰ１Ｅ０－ｋ２１由来のＰ１Ｅ０Ｃａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ属の難培養種由来のＵｒＣａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１由来のＲｆｆＣａｓ１３ｄ、及びＲｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来のＲａＣａｓ１３ｄである。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）またはサイトゾルシグナルまたは核外移行シグナル（ＮＥＳ）をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは、標的ＲＮＡにニックを生じさせることが可能である。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは操作されており、ヌクレアーゼ活性は有さない。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、レポーター分子と複合体化される。
ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ株ＸＰＤ３００２由来のＲｆｘＣａｓ１３ｄである。他のＣａｓ１３ｄを利用することもでき、他のＣａｓ１３ｄは、例えば、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｅｒメタゲノム１５７０６由来のＡｄｍＣａｓ１３ｄ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ＤＳＭ１５７０２由来のＥｓＣａｓ１３ｄ、腸メタゲノムアセンブリＰ１Ｅ０－ｋ２１由来のＰ１Ｅ０Ｃａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ属の難培養種由来のＵｒＣａｓ１３ｄ、Ｒｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１由来のＲｆｆＣａｓ１３ｄ、及びＲｕｍｉｎｏｃｃｏｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来のＲａＣａｓ１３ｄである。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）またはサイトゾルシグナルまたは核外移行シグナル（ＮＥＳ）をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは、標的ＲＮＡにニックを生じさせることが可能である。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは操作されており、ヌクレアーゼ活性は有さない。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、レポーター分子と複合体化される。
一実施形態では、方法は、標的細胞中の標的ＲＮＡ（複数可）の１つ以上のレベルを低減する。別の実施形態では、方法は、標的ＲＮＡ（複数可）を発現する１つ以上の遺伝子（複数可）を機能的にノックダウンまたはノックアウトする。さらに別の実施形態では、方法は、複数の標的細胞中の１つ以上の遺伝子（複数可）を並行してノックダウンまたはノックアウトする。
ある特定の実施形態では、接触ステップ（摂動ステップと称される）の前、間、または後に、標的細胞に選択圧または刺激が加えられる。そのような選択圧または刺激には、例えば、化学的薬剤もしくは生物学的薬剤、または標的細胞（複数可）を能動的かつ物理的に乱すことが含まれる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞生存率、細胞増殖、細胞アポトーシス、細胞死、細胞表現型、分子（例えば、標的ＲＮＡ（複数可））の存在もしくは濃度、タンパク質もしくは細胞マーカーの発現、または標的細胞の刺激への応答、または標的細胞（複数可）を含む細胞培養物、組織、もしくは対象によって達成され得る機能、を評価することをさら含む。
方法は、生物学的試料を開示のＣＲＩＳＰＲアレイ（またはｃｒＲＮＡを発現する核酸もしくはベクター）と接触させることを含む。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、レポーター分子と複合体化される。別の実施形態では、方法は、ｃｒＲＮＡ（複数可）と接触させるステップの前、と同時、または後に生物学的試料をＣａｓ１３ｄまたはそのバリアントと接触させることをさらに含む。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはそのバリアントは、生物学的試料の標的細胞において本明細書に記載の核酸分子またはベクター（ＣＲＩＳＰＲアレイを与えるものと同じ核酸分子もしくはベクターであるか、または異なるものであり得る）によって発現する。
下記の実施例では、本明細書に記載の本開示の組成物及び方法の一般的な実施形態及び特定の実施形態の両方が開示されるが、こうした組成物及び方法は、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる変形形態のいずれか及びすべてを包含すると解釈すべき
である。
である。
実施例１：材料及び方法
細胞培養及びモノクローナル細胞株生成
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｒ７０００７）から入手し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＴＨＰ１細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６５８、ＴＩＢ－２０２）から入手した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞は５％ＣＯ２下、３７℃、ＤＭＥＭ中で維持した。このＤＭＥＭは、高濃度グルコース及び安定化Ｌ－グルタミン（Ｃａｉｓｓｏｎ ＤＭＬ２３）を含み、ウシ胎仔血清（Ｓｅｒｕｍ Ｐｌｕｓ ＩＩ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ １４００９Ｃ）が１０％添加されており、抗生物質は含まないものである。ＴＨＰ１細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、抗生物質を含まないＦＢＳ１０％添加ＲＰＭＩ中で増殖させた。ドキシサイクリン誘導性ＲｆｘＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＴＨＰ１細胞、及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３８１４９）、ならびにドキシサイクリン誘導性ヌクレアーゼ不活性ＲｆｘｄＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ ＨＥＫ２９３ＦＴは以前の報告のように生成させた（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。フローサイトメーター（ＳＯＮＹ ＳＨ８００）を使用して個々の浮遊ＴＨＰ１細胞を選別して単一クローン株を選択した。単一ｇＲＮＡのレンチウイルス組み込み、ピューロマイシン選択、及びフローサイトメトリーを使用して、均一に強力なＣＤ４６ノックダウンを生じさせるかについて各ＴＨＰ１－Ｃａｓ１３ｄクローンを評価した。
細胞培養及びモノクローナル細胞株生成
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｒ７０００７）から入手し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＴＨＰ１細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６５８、ＴＩＢ－２０２）から入手した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞は５％ＣＯ２下、３７℃、ＤＭＥＭ中で維持した。このＤＭＥＭは、高濃度グルコース及び安定化Ｌ－グルタミン（Ｃａｉｓｓｏｎ ＤＭＬ２３）を含み、ウシ胎仔血清（Ｓｅｒｕｍ Ｐｌｕｓ ＩＩ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ １４００９Ｃ）が１０％添加されており、抗生物質は含まないものである。ＴＨＰ１細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、抗生物質を含まないＦＢＳ１０％添加ＲＰＭＩ中で増殖させた。ドキシサイクリン誘導性ＲｆｘＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＴＨＰ１細胞、及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３８１４９）、ならびにドキシサイクリン誘導性ヌクレアーゼ不活性ＲｆｘｄＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ ＨＥＫ２９３ＦＴは以前の報告のように生成させた（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。フローサイトメーター（ＳＯＮＹ ＳＨ８００）を使用して個々の浮遊ＴＨＰ１細胞を選別して単一クローン株を選択した。単一ｇＲＮＡのレンチウイルス組み込み、ピューロマイシン選択、及びフローサイトメトリーを使用して、均一に強力なＣＤ４６ノックダウンを生じさせるかについて各ＴＨＰ１－Ｃａｓ１３ｄクローンを評価した。
モノクローナルＣａｓ９エフェクタータンパク質発現ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株は、希釈液を播種して上記のように得た（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。Ｃａｓ９エフェクター細胞株のそれぞれについて、一重ｓｇＲＮＡ発現カセットのレンチウイルス組み込み、ピューロマイシン選択、及びフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ５５の均一かつ完全なノックアウトまたはノックダウンを与える能力について複数のクローンを評価した。ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９コンストラクト及びＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２コンストラクトのクローニングについては以前に報告されている（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０７．４３８８８２（２０２１））。Ｃａｓ９ヌクレアーゼについては、ｌｅｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５２９６２）を以前にクローニングした（Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３－７８４（２０１４））。モノクローナルＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエフェクター発現細胞はすべて、５μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ１１１３９０３）を使用して維持した。
個々のＣａｓ１３ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ガイドＲＮＡのクローニング
Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡクローニングは、以前の報告のように実施した（Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３－７８４（２０１４））。具体的には、ｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３８１５０）にｇＲＮＡまたはバーコードオリゴをクローニングした。スペーサー配列の３’末端に逆転写ハンドルを有するガイドＲＮＡコンストラクトを合成し、一緒にクローニングした。図２Ａ～図２Ｄに示されるデータにおいて使用したＣＲＩＳＰＲアレイを使用するガイドＲＮＡコンストラクトは、ダイレクトリピート及び再構成ＢｓｍＢＩ制限酵素認識と共にガイドを導入することによって段階的にクローニングしてＣＲＩＳＰＲアレイの一連のクローニング及び伸長を行った。
Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡクローニングは、以前の報告のように実施した（Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３－７８４（２０１４））。具体的には、ｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３８１５０）にｇＲＮＡまたはバーコードオリゴをクローニングした。スペーサー配列の３’末端に逆転写ハンドルを有するガイドＲＮＡコンストラクトを合成し、一緒にクローニングした。図２Ａ～図２Ｄに示されるデータにおいて使用したＣＲＩＳＰＲアレイを使用するガイドＲＮＡコンストラクトは、ダイレクトリピート及び再構成ＢｓｍＢＩ制限酵素認識と共にガイドを導入することによって段階的にクローニングしてＣＲＩＳＰＲアレイの一連のクローニング及び伸長を行った。
直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑについては、すべてのｓｇＲＮＡ発現コンストラクトを段階的にクローニングした。最初に、以前の報告のように二重ｓｇＲＮＡオリゴをｐＪＲ８５及びｐＪＲ８９にクローニングした（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎ
ａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。さらに、一重ｓｇＲＮＡをカスタムｓｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングした。１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓのマニュアルＣＧ０００１８４ ＲｅｖＣに記載のヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター駆動型のｓｇＲＮＡスキャフォールド（内部ＣＳ１）（ｐＬＣＲ３６）、またはウシＵ６（ｂＵ６）プロモーター駆動型のｐＪＲ７３由来ｓｇＲＮＡカセット（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））（ｐＬＣＲ６７）のいずれかを使用した。その後、ｐＬＣＲ６７由来のｂＵ６及びｓｇＲＮＡカセットを二重ｓｇＲＮＡプラスミドにサブクローニングして三重ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを生成させた（図８Ｂも参照のこと）。直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑに向けて、１つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＬＣＲ３６一重ｓｇＲＮＡコンストラクト、２つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＪＲ８５／ｐＪＲ８９コンストラクト、３つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＪＲ８５／ｐＪＲ８９／ｐＬＣＲ６７コンストラクトを使用した。コンストラクトはすべて、サンガーシークエンシングによって確認した。プラスミド（ｐＬＣＲ３６及びｐＬＣＲ６７）は、刊行時までにはＡｄｄｇｅｎｅで利用可能になる。
ａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。さらに、一重ｓｇＲＮＡをカスタムｓｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングした。１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓのマニュアルＣＧ０００１８４ ＲｅｖＣに記載のヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター駆動型のｓｇＲＮＡスキャフォールド（内部ＣＳ１）（ｐＬＣＲ３６）、またはウシＵ６（ｂＵ６）プロモーター駆動型のｐＪＲ７３由来ｓｇＲＮＡカセット（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））（ｐＬＣＲ６７）のいずれかを使用した。その後、ｐＬＣＲ６７由来のｂＵ６及びｓｇＲＮＡカセットを二重ｓｇＲＮＡプラスミドにサブクローニングして三重ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを生成させた（図８Ｂも参照のこと）。直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑに向けて、１つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＬＣＲ３６一重ｓｇＲＮＡコンストラクト、２つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＪＲ８５／ｐＪＲ８９コンストラクト、３つのｓｇＲＮＡを想定するプールについてはｐＪＲ８５／ｐＪＲ８９／ｐＬＣＲ６７コンストラクトを使用した。コンストラクトはすべて、サンガーシークエンシングによって確認した。プラスミド（ｐＬＣＲ３６及びｐＬＣＲ６７）は、刊行時までにはＡｄｄｇｅｎｅで利用可能になる。
プール型のＣａｓ１３ｄライブラリーの設計及びクローニング
プール型クローニングのためのライブラリーを２つ設計する。１つは、ＴＨＰ１細胞分化を引き起こす遺伝子を同定するものであり、もう１つは、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを用いるコンビナトリアル標的化のためのものである。最初に、４３９個の個々の遺伝子を標的とする単一ｇＲＮＡ発現用のＲｆｘＣａｓ１３ｄ ｇＲＮＡライブラリーを設計した。ＴＬＲ４シグナル伝達に関与する１９９個の対照遺伝子に加えて、以前のＣａｓ９ベースのプール型スクリーニングにおいてＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の上方制御を引き起こした２４０個の標的遺伝子を選択した。それぞれについて、アイソフォーム発現が最も高い転写産物を選択し（ＣＣＬＥ－ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｄａｔａｓｅｔｓ）、本発明者らが以前に報告したＣａｓ１３設計アルゴリズム（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））を使用して潜在的ｇＲＮＡ配列をスコア付けした。各遺伝子について、コード領域に沿ってｇＲＮＡが均等に広がるようにしながら、効力四分位Ｑ４（または十分なＱ４ ｇＲＮＡが見出されなかった場合はＱ３）から１０個のｇＲＮＡを選択した。ｇＲＮＡ配列に対するミスマッチ数が０～２である二次標的部位を含まないｇＲＮＡのみを選択した（Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １，１００００１（２０２１））。全部で４３９０個のｇＲＮＡを設計し、４１０個の非標的化対照ｇＲＮＡ（いずれのｈｇ１９アノテーション転写産物に対してもミスマッチ数が３超のもの）を加えた。ｇＲＮＡライブラリーを以前の報告のようにクローニングした（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８））。オリゴヌクレオチドプールを合成し（Ｔｗｉｓｔ）、ダイレクトリピート特異的フォワードプライマーを使用して増幅サイクル数８回の８×ＰＣＲ反応を使用して増幅した。アンプリコンをｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１及びｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００２（Ａｄｄｇｅｎｅ１３８１５０、１３８１５１）にＧｉｂｓｏｎクローニングした。偏りが最小の完成ライブラリー代表物（両ライブラリーについて９０パーセンタイル／１０パーセンタイルｃｒＲＮＡリード比：１．８）をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング（ＭｉＳｅｑ）によって検証した。
プール型クローニングのためのライブラリーを２つ設計する。１つは、ＴＨＰ１細胞分化を引き起こす遺伝子を同定するものであり、もう１つは、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを用いるコンビナトリアル標的化のためのものである。最初に、４３９個の個々の遺伝子を標的とする単一ｇＲＮＡ発現用のＲｆｘＣａｓ１３ｄ ｇＲＮＡライブラリーを設計した。ＴＬＲ４シグナル伝達に関与する１９９個の対照遺伝子に加えて、以前のＣａｓ９ベースのプール型スクリーニングにおいてＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４の上方制御を引き起こした２４０個の標的遺伝子を選択した。それぞれについて、アイソフォーム発現が最も高い転写産物を選択し（ＣＣＬＥ－ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｄａｔａｓｅｔｓ）、本発明者らが以前に報告したＣａｓ１３設計アルゴリズム（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））を使用して潜在的ｇＲＮＡ配列をスコア付けした。各遺伝子について、コード領域に沿ってｇＲＮＡが均等に広がるようにしながら、効力四分位Ｑ４（または十分なＱ４ ｇＲＮＡが見出されなかった場合はＱ３）から１０個のｇＲＮＡを選択した。ｇＲＮＡ配列に対するミスマッチ数が０～２である二次標的部位を含まないｇＲＮＡのみを選択した（Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １，１００００１（２０２１））。全部で４３９０個のｇＲＮＡを設計し、４１０個の非標的化対照ｇＲＮＡ（いずれのｈｇ１９アノテーション転写産物に対してもミスマッチ数が３超のもの）を加えた。ｇＲＮＡライブラリーを以前の報告のようにクローニングした（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８））。オリゴヌクレオチドプールを合成し（Ｔｗｉｓｔ）、ダイレクトリピート特異的フォワードプライマーを使用して増幅サイクル数８回の８×ＰＣＲ反応を使用して増幅した。アンプリコンをｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１及びｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００２（Ａｄｄｇｅｎｅ１３８１５０、１３８１５１）にＧｉｂｓｏｎクローニングした。偏りが最小の完成ライブラリー代表物（両ライブラリーについて９０パーセンタイル／１０パーセンタイルｃｒＲＮＡリード比：１．８）をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング（ＭｉＳｅｑ）によって検証した。
ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑライブラリーを設計するために、上記のプール型スクリーニングライブラリーに由来するすべてのｇＲＮＡエンリッチメントを手動で調べた。２８個の選択標的遺伝子については、最もエンリッチされたｇＲＮＡ（またはＣＤ１４及びＡＴＸＮ７Ｌ３については、最も枯渇したｇＲＮＡ）を、重複ｇＲＮＡを回避しつつ２つ選択した。各遺伝子について、これら２つのｇＲＮＡをペアにし、非標的化ｇＲＮＡを加えた（ｎ＝２８一重摂動、ｎ＝５８アレイ）。１７個の遺伝子については、すべてのペアの組み
合せを設計した（ｎ＝１３２遺伝子ペア、ｎ＝２６４アレイ）。９つの遺伝子については、同じ複合体に含まれる可能性のある遺伝子ペアのサブセットを設計した（ｎ＝２２遺伝子ペア、ｎ＝４４アレイ）。１３個のアレイを非標的化対照アレイとして追加した。合計として、１８６種類の一重摂動コンストラクトまたは二重摂動コンストラクトを含む３８５個のアレイを設計しており、これらはそれぞれ、２つの独立した技術的反復ｇＲＮＡ組み合わせによって表される。ハミング距離が互いに４超であるランダムな１５ｍｅｒ配列を設計した。細胞増殖に対する標的遺伝子の作用によって相対的なＣＲＩＳＰＲアレイ存在量のバランスをとるようにし、プール中のアレイコピーの数を増やしてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験での脱落が最小になるようにした。合成用のオリゴは下記の方法で設計した：
ＰＣＲハンドル：：ＢｓｍＢＩ部位：：ＤＲ：：ｇＲＮＡ１：：ＤＲ：：ｇＲＮＡ２：：ＬｇｕＩ架橋：：バーコード：：ＢｓｍＢＩ部位：：ＰＣＲハンドル
オリゴヌクレオチドプールを合成し（Ｔｗｉｓｔ）、１ｎｇ／ｕｌに希釈してから増幅した。外側ＰＣＲハンドルによって、ＰＣＲでオリゴプールを増幅することが可能であった（９５Ｃ／２分、５×［９５Ｃ／２０秒、５８Ｃ／２０秒、７２Ｃ／１５秒］、７２Ｃ／３分の５０μｌ反応において１μｌの酵素及び２０ｎｇのオリゴプールを使用して製造者の推奨事項に従ってＰｆｕ－Ｕｌｔｒａ－ＩＩを使用した）。２×ＳＰＲＩクリーンアップを使用してアンプリコンを精製した後、ＢｓｍＢＩ消化及びＳＰＲＩクリーンアップに供した。Ｔ７－ＤＮＡリガーゼを使用してすべての精製産物をＢｓｍＢＩ消化ｐＬＣＲ６５にライゲーションし、以前の報告のようにクローニングし（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））、コンストラクト当たり１０００個超のコロニーを得た。得られたプラスミドプールをＬｇｕＩで消化して第３のＤＲ及び低分子ＲＮＡハンドルをライゲーションできるようにしてｂｃｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲアレイを完成させた。ｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００２プラスミドからすべてのＬｇｕＩ部位を除去し、ターミネーター配列の５’にＣＳ１捕捉配列を導入し、ＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ピューロマイシンでピューロマイシン遺伝子を置き換えることによってｐＬＣＲ６５を生成させた。第３のＤＲ及び低分子ＲＮＡハンドルを含むＬｇｕＩ挿入断片をｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１にクローニングし、ＬｇｕＩで消化し、ゲル（２％ｅＧｅｌ）で精製した。偏りが最小の完成ライブラリー代表物（９０パーセンタイル／１０パーセンタイルｃｒＲＮＡリード比：相対的存在量階層別では２．６～４．８、全体では５．０）及び遺伝子ペアとｂｃｇＲＮＡとの結合の正しさ（＞９４％）をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング（ＭｉＳｅｑ）によって検証した。ライブラリークローニングの間に、決定的な点が２つ認められた：代替のポリメラーゼとしてＫＡＰＡ及びＱ５を使用すると、相対的なアレイ存在量の偏りが強くなり得る。さらに、オリゴプールのインプット量を増やしてＰＣＲサイクル数を少なくすると、ｂｃｇＲＮＡの再編成が減少し得る。さらに、２段階クローニング方針を選択したが、１段階クローニング方針でも同様の結果を得ることができると考えられる。ｐＬＣＲ６５は、刊行時までにはＡｄｄｇｅｎｅに寄託されることになる。
合せを設計した（ｎ＝１３２遺伝子ペア、ｎ＝２６４アレイ）。９つの遺伝子については、同じ複合体に含まれる可能性のある遺伝子ペアのサブセットを設計した（ｎ＝２２遺伝子ペア、ｎ＝４４アレイ）。１３個のアレイを非標的化対照アレイとして追加した。合計として、１８６種類の一重摂動コンストラクトまたは二重摂動コンストラクトを含む３８５個のアレイを設計しており、これらはそれぞれ、２つの独立した技術的反復ｇＲＮＡ組み合わせによって表される。ハミング距離が互いに４超であるランダムな１５ｍｅｒ配列を設計した。細胞増殖に対する標的遺伝子の作用によって相対的なＣＲＩＳＰＲアレイ存在量のバランスをとるようにし、プール中のアレイコピーの数を増やしてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験での脱落が最小になるようにした。合成用のオリゴは下記の方法で設計した：
ＰＣＲハンドル：：ＢｓｍＢＩ部位：：ＤＲ：：ｇＲＮＡ１：：ＤＲ：：ｇＲＮＡ２：：ＬｇｕＩ架橋：：バーコード：：ＢｓｍＢＩ部位：：ＰＣＲハンドル
オリゴヌクレオチドプールを合成し（Ｔｗｉｓｔ）、１ｎｇ／ｕｌに希釈してから増幅した。外側ＰＣＲハンドルによって、ＰＣＲでオリゴプールを増幅することが可能であった（９５Ｃ／２分、５×［９５Ｃ／２０秒、５８Ｃ／２０秒、７２Ｃ／１５秒］、７２Ｃ／３分の５０μｌ反応において１μｌの酵素及び２０ｎｇのオリゴプールを使用して製造者の推奨事項に従ってＰｆｕ－Ｕｌｔｒａ－ＩＩを使用した）。２×ＳＰＲＩクリーンアップを使用してアンプリコンを精製した後、ＢｓｍＢＩ消化及びＳＰＲＩクリーンアップに供した。Ｔ７－ＤＮＡリガーゼを使用してすべての精製産物をＢｓｍＢＩ消化ｐＬＣＲ６５にライゲーションし、以前の報告のようにクローニングし（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））、コンストラクト当たり１０００個超のコロニーを得た。得られたプラスミドプールをＬｇｕＩで消化して第３のＤＲ及び低分子ＲＮＡハンドルをライゲーションできるようにしてｂｃｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲアレイを完成させた。ｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００２プラスミドからすべてのＬｇｕＩ部位を除去し、ターミネーター配列の５’にＣＳ１捕捉配列を導入し、ＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ピューロマイシンでピューロマイシン遺伝子を置き換えることによってｐＬＣＲ６５を生成させた。第３のＤＲ及び低分子ＲＮＡハンドルを含むＬｇｕＩ挿入断片をｐＬｅｎｔｉＲＮＡＧｕｉｄｅ＿００１にクローニングし、ＬｇｕＩで消化し、ゲル（２％ｅＧｅｌ）で精製した。偏りが最小の完成ライブラリー代表物（９０パーセンタイル／１０パーセンタイルｃｒＲＮＡリード比：相対的存在量階層別では２．６～４．８、全体では５．０）及び遺伝子ペアとｂｃｇＲＮＡとの結合の正しさ（＞９４％）をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング（ＭｉＳｅｑ）によって検証した。ライブラリークローニングの間に、決定的な点が２つ認められた：代替のポリメラーゼとしてＫＡＰＡ及びＱ５を使用すると、相対的なアレイ存在量の偏りが強くなり得る。さらに、オリゴプールのインプット量を増やしてＰＣＲサイクル数を少なくすると、ｂｃｇＲＮＡの再編成が減少し得る。さらに、２段階クローニング方針を選択したが、１段階クローニング方針でも同様の結果を得ることができると考えられる。ｐＬＣＲ６５は、刊行時までにはＡｄｄｇｅｎｅに寄託されることになる。
ウイルス産生及びウイルス形質導入
個々のｇＲＮＡ発現プラスミド及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドのウイルス産生については、６ウェル形式のウェル当たり１×１０６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種し、１２～１８時間経過後にトランスフェクションに供した。トランスフェクション反応当たり、７．５ｕｌの１ｍｇ／ｍＬポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び２．３２５μｇの総プラスミドＤＮＡ（８２５ｎｇのｐｓＰＡＸ２：Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０、５５０ｎｇのｐＭＤ２．Ｇ：Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９、１０００ｎｇのｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ発現プラスミド）を使用した。トランスフェクションから６～８時間後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと培地を交換した。さらに４８時間後、ウイルス上清を収集し、４℃、１０００×ｇで５分間遠沈して細胞デブリを除去し、使用まで－８０Ｃで保存した。
個々のｇＲＮＡ発現プラスミド及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドのウイルス産生については、６ウェル形式のウェル当たり１×１０６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種し、１２～１８時間経過後にトランスフェクションに供した。トランスフェクション反応当たり、７．５ｕｌの１ｍｇ／ｍＬポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び２．３２５μｇの総プラスミドＤＮＡ（８２５ｎｇのｐｓＰＡＸ２：Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０、５５０ｎｇのｐＭＤ２．Ｇ：Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９、１０００ｎｇのｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ発現プラスミド）を使用した。トランスフェクションから６～８時間後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと培地を交換した。さらに４８時間後、ウイルス上清を収集し、４℃、１０００×ｇで５分間遠沈して細胞デブリを除去し、使用まで－８０Ｃで保存した。
ウイルスプールの産生については、１０ｃｍデッシュ形成において上記のようにプラスミドプールをトランスフェクトした（１×１０７個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、７０μｌのＰＥＩ、６．４μｇのｐｓＰＡＸ２、４．４μｇのｐＭＤ２．Ｇ、及び９．２μｇのプラスミドプール）。細胞デブリを遠沈（３分、１０００×ｇ）することによってウイルスプールを清澄化し、孔径０．４５μｍのフィルターに通してから－８０℃で保存した。図１Ａ～図１Ｅ及び図２Ａ～図２Ｄに示されるＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験、ならびに図３Ａ～図３Ｅに示される直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ実験については、個々のプラスミドを等量でプールした。このようにして、１つ、２つ、または３つのｓｇＲＮＡの別々のｓｇＲＮＡプールを作成して全部で６つのプールを得た（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ向けに３つ、及びＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９（－ＭｅＣＰ２）向けに３つ）。
単一ｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲアレイを使用する実験については、１×１０６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞またはＴＨＰ１細胞の形質導入を０．２～０．５のＭＯＩで実施した。形質導入から２４時間後の時点で１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ１１１３８０３）を用いて細胞の選択を開始した。この選択は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞については少なくとも４８時間実施し、ＴＨＰ１については５日間実施した。ＣａＲＰｏｏｌｓｅｑ実験（図１Ａ～図１Ｅ及び図２Ａ～図２Ｄ）ならびに直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ実験（図３Ａ～図３Ｅ）については、３×１０６個の細胞（ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞）の形質導入を実施した。ＴＨＰ１細胞において実施したスクリーニングについては、条件当たり少なくとも１２×１０６個の細胞の形質導入を実施した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞の選択は少なくとも２日間実施し、ＴＨＰ１細胞の選択は少なくとも５日間実施した。単一細胞スクリーニングについては、ピューロマイシン選択から４８時間後の生存率が１０％未満となる条件、またはＧＦＰ陽性細胞の割合が１０％未満となる条件（ＭＯＩ＜０．１）を選択して、確実に、カバレッジが高くなり（＞１０００×相当量）、単一組み込み確率が９５％超となるようにした。プール型スクリーニングは、０．１３～０．４５のＭＯＩで実施して、＞１０００×のカバレッジを常に維持するようにした。Ｃａｓ１３ｄ発現の誘導は、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ Ｄ９８９１）を使用して実施した。細胞は、単一細胞実験を行うまで、ドキシサイクリン、ブラストサイジン、及びピューロマイシンと共に維持した。この期間の間、ドキシサイクリン、ブラストサイジン、及びピューロマイシンが添加された新鮮な培地へと細胞を２～３日ごとに継代した。
フローサイトメトリー
ピューロマイシンで選択した細胞を、選択開始（ＨＥＫ細胞）またはＣａｓ１３ｄ誘導（ＴＨＰ１細胞）から２～７日後に収集した。ｄＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの評価は、形質導入から７日後に実施した。細胞のそれぞれの細胞表面タンパク質を４℃で３０分間染色し、蛍光活性化細胞選別によって細胞を測定した（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：ＣＤ４６クローンＴＲＡ－２－１０ ＃３５２４０５－３μｌ／１×１０６個細胞；ＣＤ５５クローンＪＳ１１ ＃３１１３１１－５μｌ／１×１０６個細胞；ＣＤ７１
クローンＣＹＩＧ４ ＃３３４１０５－４μｌ／１×１０６個細胞、ＣＤ１１ｂクローンＩＣＲＦ４４ ＃３０１３２２－２μｌ／１×１０６個細胞）。フローサイトメトリー
分析（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０）については、前方散乱光及び側方散乱光ならびにシグナル強度によって細胞をゲートして潜在的なマルチプレットを除外した。存在する場合、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ
Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６３）を用いて細胞をさらにゲートした。各試料につき、少なくとも５，０００個の細胞を分析した。細胞数がばらつく場合、常に、すべての試料から副試料を（無作為に）採取して、実験内の細胞数が同じになるようにした。
ピューロマイシンで選択した細胞を、選択開始（ＨＥＫ細胞）またはＣａｓ１３ｄ誘導（ＴＨＰ１細胞）から２～７日後に収集した。ｄＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの評価は、形質導入から７日後に実施した。細胞のそれぞれの細胞表面タンパク質を４℃で３０分間染色し、蛍光活性化細胞選別によって細胞を測定した（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：ＣＤ４６クローンＴＲＡ－２－１０ ＃３５２４０５－３μｌ／１×１０６個細胞；ＣＤ５５クローンＪＳ１１ ＃３１１３１１－５μｌ／１×１０６個細胞；ＣＤ７１
クローンＣＹＩＧ４ ＃３３４１０５－４μｌ／１×１０６個細胞、ＣＤ１１ｂクローンＩＣＲＦ４４ ＃３０１３２２－２μｌ／１×１０６個細胞）。フローサイトメトリー
分析（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０）については、前方散乱光及び側方散乱光ならびにシグナル強度によって細胞をゲートして潜在的なマルチプレットを除外した。存在する場合、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ
Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６３）を用いて細胞をさらにゲートした。各試料につき、少なくとも５，０００個の細胞を分析した。細胞数がばらつく場合、常に、すべての試料から副試料を（無作為に）採取して、実験内の細胞数が同じになるようにした。
バルクガイドＲＮＡ検出
ピューロマイシンで選択した細胞を、選択開始から４８時間以上経過後に収集した。約１×１０６個の細胞からＲＮＡを抽出した（Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏＰｒｅｐ）。オリゴ（ｄＴ）Ｖ３０プライマーと共に捕捉配列特異的逆転写 プライマーを使用して全ＲＮＡを逆転写した（４００ｎｇ ＲＮＡ、４μｌ ５×ＲＴ緩衝液、１μｌ ＳｕｐｅｒａｓＩＮ、１μｌ ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）、１μｌ Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ ＲＴ酵素、１．５μｌ １０μＭテンプレートスイッチオリゴ、１μｌ １０μＭオリゴ（ｄＴ）Ｖ３０プライマー、１μｌ １０μＭ ｇＲＮＡ捕捉配列プライマー、反応体積２０μｌ；５３℃／９０分、７０℃／１５分）。部分的ＴＳＯ及び捕捉配列プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを使用して１：２希釈ｃＤＮＡからＣａｓ１３ ｃｒＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを増幅した（３μｌ ｃＤＮＡ、１０μｌ ＫＡＰＡ ２×マスターミックス、１μｌプライマー（各１０μＭ）、５μｌ Ｈ２Ｏ；ＰＣＲ条件：９８℃／４５秒、１８×［９８℃／２０秒、６０℃／１０秒、７２℃／１０秒］、７２℃／５分）。オリゴヌクレオチドは、補足の表２に示される。
ピューロマイシンで選択した細胞を、選択開始から４８時間以上経過後に収集した。約１×１０６個の細胞からＲＮＡを抽出した（Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏＰｒｅｐ）。オリゴ（ｄＴ）Ｖ３０プライマーと共に捕捉配列特異的逆転写 プライマーを使用して全ＲＮＡを逆転写した（４００ｎｇ ＲＮＡ、４μｌ ５×ＲＴ緩衝液、１μｌ ＳｕｐｅｒａｓＩＮ、１μｌ ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）、１μｌ Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ ＲＴ酵素、１．５μｌ １０μＭテンプレートスイッチオリゴ、１μｌ １０μＭオリゴ（ｄＴ）Ｖ３０プライマー、１μｌ １０μＭ ｇＲＮＡ捕捉配列プライマー、反応体積２０μｌ；５３℃／９０分、７０℃／１５分）。部分的ＴＳＯ及び捕捉配列プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを使用して１：２希釈ｃＤＮＡからＣａｓ１３ ｃｒＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを増幅した（３μｌ ｃＤＮＡ、１０μｌ ＫＡＰＡ ２×マスターミックス、１μｌプライマー（各１０μＭ）、５μｌ Ｈ２Ｏ；ＰＣＲ条件：９８℃／４５秒、１８×［９８℃／２０秒、６０℃／１０秒、７２℃／１０秒］、７２℃／５分）。オリゴヌクレオチドは、補足の表２に示される。
Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡオフターゲット予測
潜在的なＣａｓ１３ｄ ｇＲＮＡオフターゲット（代替結合部位）を同定するために、下記のパラメーター（－ｓｔｒａｎｄ ｍｉｎｕｓ－ｍａｘ＿ｔａｒｇｅｔ＿ｓｅｑｓ １００００－ｅｖａｌｕｅ １００００－ｗｏｒｄ＿ｓｉｚｅ ５－ｐｅｒｃ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙ ０．７）を用いてｂｌａｓｔｎ（ｍｅｇａｂｌａｓｔ）を使用してヒトトランスクリプトーム（Ｇｒｃｈ３８ ｃｄｎａ．ａｌｌ、及びｅｍｓｅｍｂｌリリース９７由来のｎｃＲＮＡ）へのｇＲＮＡのアライメントを最初に実施した。次に、少なくとも１７塩基がマッチするように（これよりもマッチ数が少ないと標的のノックダウンが生じないため）候補をさらにフィルタリングした。これらの候補は、１００未満のｂｌａｓｔｎ ｅ値を示す。図６Ｅでは、弱いオフターゲット結合が生じる可能性があるにもかかわらず、これらの遺伝子にトランスクリプトーム摂動は認められないことが実証されている。
潜在的なＣａｓ１３ｄ ｇＲＮＡオフターゲット（代替結合部位）を同定するために、下記のパラメーター（－ｓｔｒａｎｄ ｍｉｎｕｓ－ｍａｘ＿ｔａｒｇｅｔ＿ｓｅｑｓ １００００－ｅｖａｌｕｅ １００００－ｗｏｒｄ＿ｓｉｚｅ ５－ｐｅｒｃ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙ ０．７）を用いてｂｌａｓｔｎ（ｍｅｇａｂｌａｓｔ）を使用してヒトトランスクリプトーム（Ｇｒｃｈ３８ ｃｄｎａ．ａｌｌ、及びｅｍｓｅｍｂｌリリース９７由来のｎｃＲＮＡ）へのｇＲＮＡのアライメントを最初に実施した。次に、少なくとも１７塩基がマッチするように（これよりもマッチ数が少ないと標的のノックダウンが生じないため）候補をさらにフィルタリングした。これらの候補は、１００未満のｂｌａｓｔｎ ｅ値を示す。図６Ｅでは、弱いオフターゲット結合が生じる可能性があるにもかかわらず、これらの遺伝子にトランスクリプトーム摂動は認められないことが実証されている。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑ
Ｃａｓ１３がオフターゲット効果を導入する可能性を、より慎重に試験するために、バルクＲＮＡｓｅｑ実験を実施した。このバルクＲＮＡｓｅｑ実験では、低発現転写産物の発現差異を検出する上で追加の能力が得られると予想される。バルクＲＮＡ－ｓｅｑ実験については、３つの個別の標的化（ｓ）ｇＲＭＡ及び３つの個別の非標的化（ｓ）ｇＲＭＡを使用してＣＤ５５のノックダウン（Ｃａｓ１３ｄ細胞、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２細胞）またはノックアウト（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ細胞）を実施した。ガイドを発現するレンチウイルス（ＭＯＩ０．２～０．５）を用いてモノクローナルＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株の形質導入（３つの独立した形質導入）を行った。形質導入から２４時間後にピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）での選択を開始し、Ｃａｓ１３ｄ発現を誘導した（１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン）。形質導入から７日後、ＣＤ５５の標的化が効率的に生じたことを、フローサイトメトリーを使用して確認し、全ＲＮＡを抽出した（Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏＰｒｅｐ）。１００ｎｇの精製全ＲＮＡインプットを使用して改変バージョンのＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２プロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｉｏ／ｖｉｅｗ／ｂａｒｃｏｄｅｄ－ｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｒｎａ－ｓｅｑ－ｎｋｇｄｃｔｗ）を実施した。ｈｇ１９参照を使用してＤｒｏｐ－ｓｅｑ ｔｏｏｌｓ ｖ１．０ ２８でバルクＲＮＡ－ｓｅｑ試料を処理した。試料当たり平均で３５２６１１ ＵＭＩ（＋／－７２０６７ ＵＭＩ）が得られた。遺伝子発現差異は、ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓにおいてＳｅｕｒａｔ’ｓ ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４））を実行して評価した。
Ｃａｓ１３がオフターゲット効果を導入する可能性を、より慎重に試験するために、バルクＲＮＡｓｅｑ実験を実施した。このバルクＲＮＡｓｅｑ実験では、低発現転写産物の発現差異を検出する上で追加の能力が得られると予想される。バルクＲＮＡ－ｓｅｑ実験については、３つの個別の標的化（ｓ）ｇＲＭＡ及び３つの個別の非標的化（ｓ）ｇＲＭＡを使用してＣＤ５５のノックダウン（Ｃａｓ１３ｄ細胞、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２細胞）またはノックアウト（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ細胞）を実施した。ガイドを発現するレンチウイルス（ＭＯＩ０．２～０．５）を用いてモノクローナルＨＥＫ２９３ＦＴ細胞株の形質導入（３つの独立した形質導入）を行った。形質導入から２４時間後にピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）での選択を開始し、Ｃａｓ１３ｄ発現を誘導した（１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン）。形質導入から７日後、ＣＤ５５の標的化が効率的に生じたことを、フローサイトメトリーを使用して確認し、全ＲＮＡを抽出した（Ｚｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｍｉｃｒｏＰｒｅｐ）。１００ｎｇの精製全ＲＮＡインプットを使用して改変バージョンのＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２プロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｉｏ／ｖｉｅｗ／ｂａｒｃｏｄｅｄ－ｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｒｎａ－ｓｅｑ－ｎｋｇｄｃｔｗ）を実施した。ｈｇ１９参照を使用してＤｒｏｐ－ｓｅｑ ｔｏｏｌｓ ｖ１．０ ２８でバルクＲＮＡ－ｓｅｑ試料を処理した。試料当たり平均で３５２６１１ ＵＭＩ（＋／－７２０６７ ＵＭＩ）が得られた。遺伝子発現差異は、ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓにおいてＳｅｕｒａｔ’ｓ ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４））を実行して評価した。
ＴＨＰ１細胞におけるプール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニング
バルクでのマルチプレックス化Ｃａｓ１３ｄスクリーニングを実施するための実験手順は、以前の報告に軽微な改変を加えて実施した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。上記のようにＴＨＰ１細胞の形質導入及びピューロマイシン選択を実施した。細胞を完全に選択した後、Ｃａｓ１３ｄ発現を誘導した（１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン）。新たなピューロマイシン、ブラストサイジン、及びドキシサイクリンを含む増殖培地を２～４日ごとに補充し、必要に応じて細胞を分け、ガイド相当量が＞１０００×となるように常に維持した。
バルクでのマルチプレックス化Ｃａｓ１３ｄスクリーニングを実施するための実験手順は、以前の報告に軽微な改変を加えて実施した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。上記のようにＴＨＰ１細胞の形質導入及びピューロマイシン選択を実施した。細胞を完全に選択した後、Ｃａｓ１３ｄ発現を誘導した（１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン）。新たなピューロマイシン、ブラストサイジン、及びドキシサイクリンを含む増殖培地を２～４日ごとに補充し、必要に応じて細胞を分け、ガイド相当量が＞１０００×となるように常に維持した。
単一ガイドＲＮＡプール型スクリーニングについては、Ｃａｓ１３ｄの誘導から７日後及び１４日後に１０００×相当量を収集し、その後に選別した。２週間（１４～１６日）が経過後、ＦｃＸブロッキング緩衝液を使用し（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４２２３０２；室温で１０分）、その後にＣＤ１１ｂの染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローンＩＣＲＦ４４
＃３０１３２２－４μｌ／１×１０６個細胞）またはＣＤ１４の染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ クローンＨＣＤ１４ ＃３２５６０８－４μｌ／１×１０６個細胞）（４℃で３０分）のいずれかを実施して１５００万個の細胞（約３０００×相当量）を染色し、最終的に、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ９５４２－０．４μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳに細胞を再浮遊させて、すべてのアポトーシス細胞または死細胞を検出した。シグナル強度（ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４：最低１０～１５％、最高１０～１５％）に基づいて細胞を選別した（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）。細胞をＰＢＳで洗浄し、シークエンシングライブラリー調製まで－８０℃で凍結した。全部で４つの独立した形質導入物（２つのＭＯＩ及び２つの代替ダイレクトリピート）を調製し、４つすべての形質導入反復実験物についてＣＤ１４選別を実施し、３つの形質導入反復実験物についてＣＤ１１ｂ選別を実施して、ビン当たり１×１０６～１．５×１０６個の細胞を収集した。
＃３０１３２２－４μｌ／１×１０６個細胞）またはＣＤ１４の染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ クローンＨＣＤ１４ ＃３２５６０８－４μｌ／１×１０６個細胞）（４℃で３０分）のいずれかを実施して１５００万個の細胞（約３０００×相当量）を染色し、最終的に、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ９５４２－０．４μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳに細胞を再浮遊させて、すべてのアポトーシス細胞または死細胞を検出した。シグナル強度（ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４：最低１０～１５％、最高１０～１５％）に基づいて細胞を選別した（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）。細胞をＰＢＳで洗浄し、シークエンシングライブラリー調製まで－８０℃で凍結した。全部で４つの独立した形質導入物（２つのＭＯＩ及び２つの代替ダイレクトリピート）を調製し、４つすべての形質導入反復実験物についてＣＤ１４選別を実施し、３つの形質導入反復実験物についてＣＤ１１ｂ選別を実施して、ビン当たり１×１０６～１．５×１０６個の細胞を収集した。
コンビナトリアル標的化プール型スクリーニングについては、３つの形質導入反復実験物（ＭＯＩ ０．１３～０．２）を調製した。Ｃａｓ１３ｄの誘導から８日後、インプット相当量（＞１０００×カバレッジ）を収集し、ＦｃＸブロッキング、ＣＤ１１ｂ、及びＤＡＰＩを上記のように用いて２０００～３０００万個の細胞を染色した。ＣＤ１１ｂ シグナル強度（最低１５％、最高１５％）に基づいて細胞を選別した。細胞をＰＢＳで洗浄し、シークエンシングライブラリー調製まで－８０℃で凍結した。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングのライブラリー調製は、以前の報告のように実施した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。コンビナトリアル標的化プール型スクリーニングについては、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ ｂｃｇＲＮＡリードアウトと同様のＰＣＲ方針を採用した。プール型スクリーニングリードアウトＰＣＲ１は不変のままとした。ＰＣＲ２では、ＵＭＩ及び細胞バーコードを反映する任意選択の２８個の無作為化塩基を含む可溶性Ｎｅｘｔｅｒａ－Ｒｅａｄ１－ＣＳ１ ｆｅａｔｕｒｅ捕捉プライマー、ならびにＲＰＩｘ Ｒｅａｄ２ ｉ７インデックスプライマーを使用して１５ｂｐのバーコード配列を増幅した。ＰＣＲ３において、Ｆｅａｔｕｒｅ ＳＩプライマー２（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）及びＰ７プライマーを使用してアンプリコンを完成させた。
プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニング分析
ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用して、ＰＣＲ２リバースプライマー中に存在するＩｌｌｕｍｉｎａ ｉ７バーコードに基づいてリードをデマルチプレックスし、適用可能な場合は、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してリード中のカスタムｉ５バーコードによってリードをデマルチプレックスした。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してガイド配列に対して既知のアンカー配列を検索することによってリード１シークエンシングリードをトリミングして予想ｇＲＮＡ長とした。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、リード２中の最初の１５塩基を抽出した。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、処理済リードの重複除去
（ＦＡＳＴＸＴｏｏｌｋｉｔ）を行って完全な重複をカウントした後、ストリングマッチングによる参照との比較を行って、完全にマッチするユニークなアライメントのみを残した（平均マッピング率８２．３％、ｇＲＮＡカウント数中央値１６７）。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、パラメーターを－ｖ １－ｍ １－－ｂｅｓｔ－ｓｔｒａｔａとしてｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０，（２００９））（ｖ．１．１．２）を使用して前処理リードをバーコード参照にアライメントした（平均マッピング率９７％；バーコードリードカウント数中央値６３５；１つのバーコードはインプット試料中に検出されなかった）。各データセットについて、ＤＥＳｅｑ２ ２９のものと同様のメジアン・オブ・レイシオ（ｍｅｄｉａｎ
ｏｆ ｒａｔｉｏｓ）法を使用して生のカウント数を正規化し、ＳＶＡ Ｒパッケージにおいて実行されるコンバット（ｃｏｍｂａｔ）を使用してバッチ補正を行った（Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，８８２－８８３（２０１２））。選別ビンまたは時点と、示される参照試料との間のカウント数比を構築してガイドＲＮＡ及びバーコードのエンリッチメントを計算した後、ｌｏｇ２変換（ｌｏｇ２ＦＣ）に供した。単一ｇＲＮＡまたはｂｃｇＲＮＡごとに、反復物にまたがる平均ｌｏｇ２ＦＣを考慮した。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、標的遺伝子当たり４つの最良性能ｇＲＮＡを使用して平均ｌｏｇ２ＦＣを計算し、最良性能の決定は、１０個すべてのｇＲＮＡにまたがる平均エンリッチメントの符号に応じて最高または最低のいずれかとして実施した。本発明者らが以前に報告したように（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））、ｌｏｇ２ＦＣエンリッチメントは、一般に、増強ＤＲを使用した試料においてより顕著であることが認められた。反復物と選択ｇＲＮＡとの間の一貫性は、ロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）を使用して推定した（Ｋｏｌｄｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，５７３－５８０（２０１２））。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、遺伝子ペアにつき両方の反復アレイの平均を計算した。プール型スクリーニング及びＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験では、ＧＦＩ１ ｇ２は強い効果を与えないことが認められた。すべての分析において、ＧＦＩ１ ｇ２を含む技術的反復アレイは除外した。
ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用して、ＰＣＲ２リバースプライマー中に存在するＩｌｌｕｍｉｎａ ｉ７バーコードに基づいてリードをデマルチプレックスし、適用可能な場合は、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してリード中のカスタムｉ５バーコードによってリードをデマルチプレックスした。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してガイド配列に対して既知のアンカー配列を検索することによってリード１シークエンシングリードをトリミングして予想ｇＲＮＡ長とした。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、リード２中の最初の１５塩基を抽出した。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、処理済リードの重複除去
（ＦＡＳＴＸＴｏｏｌｋｉｔ）を行って完全な重複をカウントした後、ストリングマッチングによる参照との比較を行って、完全にマッチするユニークなアライメントのみを残した（平均マッピング率８２．３％、ｇＲＮＡカウント数中央値１６７）。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、パラメーターを－ｖ １－ｍ １－－ｂｅｓｔ－ｓｔｒａｔａとしてｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０，（２００９））（ｖ．１．１．２）を使用して前処理リードをバーコード参照にアライメントした（平均マッピング率９７％；バーコードリードカウント数中央値６３５；１つのバーコードはインプット試料中に検出されなかった）。各データセットについて、ＤＥＳｅｑ２ ２９のものと同様のメジアン・オブ・レイシオ（ｍｅｄｉａｎ
ｏｆ ｒａｔｉｏｓ）法を使用して生のカウント数を正規化し、ＳＶＡ Ｒパッケージにおいて実行されるコンバット（ｃｏｍｂａｔ）を使用してバッチ補正を行った（Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，８８２－８８３（２０１２））。選別ビンまたは時点と、示される参照試料との間のカウント数比を構築してガイドＲＮＡ及びバーコードのエンリッチメントを計算した後、ｌｏｇ２変換（ｌｏｇ２ＦＣ）に供した。単一ｇＲＮＡまたはｂｃｇＲＮＡごとに、反復物にまたがる平均ｌｏｇ２ＦＣを考慮した。単一ｇＲＮＡプール型スクリーニングについては、標的遺伝子当たり４つの最良性能ｇＲＮＡを使用して平均ｌｏｇ２ＦＣを計算し、最良性能の決定は、１０個すべてのｇＲＮＡにまたがる平均エンリッチメントの符号に応じて最高または最低のいずれかとして実施した。本発明者らが以前に報告したように（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））、ｌｏｇ２ＦＣエンリッチメントは、一般に、増強ＤＲを使用した試料においてより顕著であることが認められた。反復物と選択ｇＲＮＡとの間の一貫性は、ロバストランクアグリゲーション（ＲＲＡ）を使用して推定した（Ｋｏｌｄｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，５７３－５８０（２０１２））。コンビナトリアルプール型スクリーニングについては、遺伝子ペアにつき両方の反復アレイの平均を計算した。プール型スクリーニング及びＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験では、ＧＦＩ１ ｇ２は強い効果を与えないことが認められた。すべての分析において、ＧＦＩ１ ｇ２を含む技術的反復アレイは除外した。
直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ
６つのｓｇＲＮＡプール（ＫＯ－１、ＫＯ－２、ＫＯ－３またはＣＲＩＳＰＲｉ－１、ＣＲＩＳＰＲｉ－２、ＣＲＩＳＰＲｉ－３）のうちの１つをモノクローナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質発現細胞株（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２）に感染させて、単一のベクターにおいて１～３つのｓｇＲＮＡを供給し、細胞株とプールとの組み合わせを全部で９つ得た。選択後の細胞生存率を１．７～５．５％（ＭＯＩ＜０．１）として、単一の組み込みが生じる可能性が確実に高まるようにした。２つ以上のｓｇＲＮＡを保有するベクターが導入されているＢＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用してプールごとに測定することによってウイルス力価を確認した。各分割時にはピューロマイシン及びブラストサイジンを連続的に与えながら２～３日ごとに細胞を継代してｓｇＲＮＡの存在量が多くなるように維持した（＞１０００×カバレッジ）。１０×実験前には細胞の９８％超がＢＦＰ陽性であることが確認された。形質導入から１２日後に１０×Ｖ３．０を実施した（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖ３ ｗｉｔｈ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、＃１００００７４、＃１００００７５、＃１００００７９）。ＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコール（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７））に従って５つのＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ抗体のプール（０．７５ｕｇ／抗体／２×１０６個細胞）で細胞を染色した。さらに、細胞ハッシング（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８））を使用して、９つの細胞株プール組み合わせを追跡した。ラン前
に、細胞生存率を決定した（≧９６％）。１つの１０×レーンでのランを実行することで、本発明者らのハッシュタグ付け実験設計を活用して、３８，６００個の細胞をオーバーロードした。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ細胞ハッシング及びＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコールに従って、ｍＲＮＡライブラリー、ｓｇＲＮＡ特徴量ライブラリー、ハッシュタグ（ハッシュタグ由来オリゴ（ＨＴＯ））ライブラリー、タンパク質（抗体由来オリゴ（ＡＤＴ））ライブラリーを構築した。すべてのライブラリーを１回のＮｅｘｔＳｅｑ７５サイクル高アウトプットランで一緒にシークエンシングした。
６つのｓｇＲＮＡプール（ＫＯ－１、ＫＯ－２、ＫＯ－３またはＣＲＩＳＰＲｉ－１、ＣＲＩＳＰＲｉ－２、ＣＲＩＳＰＲｉ－３）のうちの１つをモノクローナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質発現細胞株（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９、ＫＲＡＢｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２）に感染させて、単一のベクターにおいて１～３つのｓｇＲＮＡを供給し、細胞株とプールとの組み合わせを全部で９つ得た。選択後の細胞生存率を１．７～５．５％（ＭＯＩ＜０．１）として、単一の組み込みが生じる可能性が確実に高まるようにした。２つ以上のｓｇＲＮＡを保有するベクターが導入されているＢＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用してプールごとに測定することによってウイルス力価を確認した。各分割時にはピューロマイシン及びブラストサイジンを連続的に与えながら２～３日ごとに細胞を継代してｓｇＲＮＡの存在量が多くなるように維持した（＞１０００×カバレッジ）。１０×実験前には細胞の９８％超がＢＦＰ陽性であることが確認された。形質導入から１２日後に１０×Ｖ３．０を実施した（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖ３ ｗｉｔｈ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、＃１００００７４、＃１００００７５、＃１００００７９）。ＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコール（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７））に従って５つのＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ抗体のプール（０．７５ｕｇ／抗体／２×１０６個細胞）で細胞を染色した。さらに、細胞ハッシング（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８））を使用して、９つの細胞株プール組み合わせを追跡した。ラン前
に、細胞生存率を決定した（≧９６％）。１つの１０×レーンでのランを実行することで、本発明者らのハッシュタグ付け実験設計を活用して、３８，６００個の細胞をオーバーロードした。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ細胞ハッシング及びＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコールに従って、ｍＲＮＡライブラリー、ｓｇＲＮＡ特徴量ライブラリー、ハッシュタグ（ハッシュタグ由来オリゴ（ＨＴＯ））ライブラリー、タンパク質（抗体由来オリゴ（ＡＤＴ））ライブラリーを構築した。すべてのライブラリーを１回のＮｅｘｔＳｅｑ７５サイクル高アウトプットランで一緒にシークエンシングした。
直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ分析
ｍＲＮＡライブラリーから得られたシークエンシングリードを、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ（ｖ３．１）を使用してｈｇ３８（ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ９７）ゲノムにマッピングした。同時に、ガイドＲＮＡリードをｓｇＲＮＡ特徴量参照にマッピングした。特徴量マッピングの前に、ｃｕｔａｄａｐｔを使用して５’アダプターのトリミングを実施して、特徴量の５’に位置する可変長のポリＧ区間を考慮し、得られるｓｇＲＮＡリードの長さが１８塩基となるようにトリミングした。ＨＴＯライブラリー及びＡＤＴライブラリーのカウントマトリックスを作成するために、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－ｃｏｕｎｔパッケージ（ｖ１．４．２）を使用した（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｈｏｏｈｍ／ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－Ｃｏｕｎｔ）。その後、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ４．０）（Ｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８４，３５７３－３５８７．ｅ２９（２０２１））へのインプットとしてカウントマトリックスを使用して下流の分析を実施した。１６８４２個の細胞が検出された。ｍａｒｇｉｎ＝２として（特徴量全体にわたる正規化の代わりに細胞全体にわたる正規化がなされるように）有心対数比変換手法を使用してＨＴＯ及びｓｇＲＮＡのカウント数を正規化した。実験条件を細胞に割り当てるアイデンティティー付与及び細胞ダブレットの除外を行うために、ＳｅｕｒａｔのＨＴＯＤｅｍｕｘ機能をデフォルトパラメーターで使用した。
ｍＲＮＡライブラリーから得られたシークエンシングリードを、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ（ｖ３．１）を使用してｈｇ３８（ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ９７）ゲノムにマッピングした。同時に、ガイドＲＮＡリードをｓｇＲＮＡ特徴量参照にマッピングした。特徴量マッピングの前に、ｃｕｔａｄａｐｔを使用して５’アダプターのトリミングを実施して、特徴量の５’に位置する可変長のポリＧ区間を考慮し、得られるｓｇＲＮＡリードの長さが１８塩基となるようにトリミングした。ＨＴＯライブラリー及びＡＤＴライブラリーのカウントマトリックスを作成するために、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－ｃｏｕｎｔパッケージ（ｖ１．４．２）を使用した（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｈｏｏｈｍ／ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－Ｃｏｕｎｔ）。その後、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ４．０）（Ｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８４，３５７３－３５８７．ｅ２９（２０２１））へのインプットとしてカウントマトリックスを使用して下流の分析を実施した。１６８４２個の細胞が検出された。ｍａｒｇｉｎ＝２として（特徴量全体にわたる正規化の代わりに細胞全体にわたる正規化がなされるように）有心対数比変換手法を使用してＨＴＯ及びｓｇＲＮＡのカウント数を正規化した。実験条件を細胞に割り当てるアイデンティティー付与及び細胞ダブレットの除外を行うために、ＳｅｕｒａｔのＨＴＯＤｅｍｕｘ機能をデフォルトパラメーターで使用した。
基本的なモデリング手法を変えずにＨＴＯＤｅｍｕｘをカスタマイズして、第２及び第３のｓｇＲＮＡの割り当てのアイデンティティーを復帰させた。ＨＴＯプールの割り当てに基づいて、予想ｓｇＲＮＡ数の数が正しくない細胞にフラグを立てた。さらに、細胞の形質導入に使用したｓｇＲＮＡプールに存在しないｓｇＲＮＡの予想外の組み合わせを含む細胞にもフラグを立てた。
図３Ａ～図３Ｅに示される分析については、ｓｇＲＮＡの数及びアイデンティティーが正しい細胞のみを残した。ＡＤＴカウント数を対数正規化してから、ｄｏ．ｓｃａｌｅ＝ＦＡＬＳＥ及びｖａｒｓ．ｔｏ．ｒｅｇｒｅｓｓ＝“ＰｅｒｔｕｒｂＳｅｑ．ａｐｐｒｏａｃｈ”としてＳｃａｌｅＤａｔａを実行した。対数正規化した回帰ＡＤＴ数に対して、５つすべての特徴量を使用してＰＣＡを実施した後、４次元を使用するＵＭＡＰ次元削減を実施した。ＮＴ細胞、及び３つすべての（ｓ）ｇＲＮＡ（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ７１）を受容した細胞についてＰｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ手法にわたって標的ノックダウンを評価するために、標的としなかったＡＤＴ特徴量（ＣＤ２９、ＣＤ５６）にわたる比の中央値を使用して細胞ごとのスケール係数を導き出して細胞ＡＤＴカウント数を正規化し、この正規化ＡＤＴカウント数を、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑごとにＮＴ細胞の平均ＡＤＴカウント数で割った。
Ｃａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ（ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ）ライブラリーの調製
図１Ａ及び図５に示されるＸ型のＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲアレイ構成（追加のＰＣＲハンドル）を使用した。具体的には、最後のアレイ位置にｂｃｇＲＮＡを配置し、５’ Ｉｌｌｕｍｉｎａ低分子ＲＮＡ ＰＣＲハンドルと、１５塩基対長のバーコードと、１０×Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと適合する３’捕捉配列
１（ＣＳ１）と、から構成されるスペーサー配列を当該ｂｃｇＲＮＡに含めた。この組成によって、フォワードプライマーとリバースプライマーとの特有の組み合わせを用いてｂｃｇＲＮＡアンプリコンを特異的に増幅することが可能であった。さらに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ５’ＰＣＲハンドルを使用することで、ｂｃｇＲＮＡアンプリコンを効率的にシークエンシングすることが可能であり、リード２の最初の塩基が最初のバーコード塩基になる。この構成は多くの利点を有するが、他のＰＣＲプライマー配列または捕捉配列も可能であり得る。
図１Ａ及び図５に示されるＸ型のＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲアレイ構成（追加のＰＣＲハンドル）を使用した。具体的には、最後のアレイ位置にｂｃｇＲＮＡを配置し、５’ Ｉｌｌｕｍｉｎａ低分子ＲＮＡ ＰＣＲハンドルと、１５塩基対長のバーコードと、１０×Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと適合する３’捕捉配列
１（ＣＳ１）と、から構成されるスペーサー配列を当該ｂｃｇＲＮＡに含めた。この組成によって、フォワードプライマーとリバースプライマーとの特有の組み合わせを用いてｂｃｇＲＮＡアンプリコンを特異的に増幅することが可能であった。さらに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ５’ＰＣＲハンドルを使用することで、ｂｃｇＲＮＡアンプリコンを効率的にシークエンシングすることが可能であり、リード２の最初の塩基が最初のバーコード塩基になる。この構成は多くの利点を有するが、他のＰＣＲプライマー配列または捕捉配列も可能であり得る。
１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’キット（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖ３ ｗｉｔｈ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、＃１００００７４、＃１００００７５、＃１００００７９）を使用してＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験を実施した。ｂｃｇＲＮＡ由来オリゴのライブラリーの構築については、その概要が図５に示され、改変をいくつか施したが、大筋はＦｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇのための１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓユーザーガイドＣＧ０００１８４ ＲｅｖＣに従って実施した。具体的には、ＧＥＭ－ＲＴを溶出して３３ｕｌ中に含め、０．４μＭのＡＤＴ添加プライマー（ｂｃｇＲＮＡ及びＡＤＴ用）ならびに０．２μＭのＨＴＯ添加プライマーを含む２μｌを添加し、その後にｃＤＮＡ増幅に供した。ｍＲＮＡ画分向けに０．６×ＳＰＲＩクリーンアップを使用してｃＤＮＡを精製した。さらに１．４×ＳＰＲＩを追加（０．６＋１．４＝２×ＳＰＲＩ）することによって、ＡＤＴ、ＨＴＯ、及びｂｃｇＲＮＡ ｃＤＮＡを含む上清を精製した後、追加の２×ＳＰＲＩクリーンアップに供した。この短い精製断片を３つのプールに均等に分割した（例えば、３×２０μｌ）。以下に記載のようにＨＴＯライブラリー及びＡＤＴライブラリーを構築するために、それぞれにつき１つのプールを使用した。残りのプールの半分（１０μｌ）を使用することで、２つのＰＣＲレシピを使用してｂｃｇＲＮＡライブラリーを構築した。ＰＣＲ１では、ｂｃｇＲＮＡアンプリコンにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５ハンドル及びＰ７ハンドルを付加する（１００μｌ
ＰＣＲ１：５０μｌ ２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＰＣＲマスターミックス、最大４５μｌ ｂｃｇＲＮＡ ＰＣＲテンプレート、２．５μｌ Ｆｅａｔｕｒｅ ＳＩプライマー２ １０μＭ、２．５μｌ ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡ ＲＰＩｘプライマー（ｉ７インデックスを含む）１０μＭ；９５℃ ３分、１２×［９５℃ ２０秒、６０℃ ８秒、７２℃ ８秒］、７２℃ １分）。ＰＣＲ２では、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーを用いて増幅を実施する（１００μｌ ＰＣＲ２：５０μｌ ２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＰＣＲマスターミックス、最大４５μｌの精製ＰＣＲ１産物、２．５μｌ Ｐ５プライマー １０μＭ、２．５μｌ Ｐ７プライマー １０μＭ；９５℃ ３分、４×［９５℃ ２０秒，６０℃ ８秒，７２℃ ８秒］、７２℃ １分）。最終的なｂｃｇＲＮＡアンプリコンは２０３ｂｐの長さを有し、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマーを用いて標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットホームでシークエンシングすることが可能なものである（≧２８サイクル リード１、≧１５サイクル リード２）（図５及び図６Ａ）。
ＰＣＲ１：５０μｌ ２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＰＣＲマスターミックス、最大４５μｌ ｂｃｇＲＮＡ ＰＣＲテンプレート、２．５μｌ Ｆｅａｔｕｒｅ ＳＩプライマー２ １０μＭ、２．５μｌ ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡ ＲＰＩｘプライマー（ｉ７インデックスを含む）１０μＭ；９５℃ ３分、１２×［９５℃ ２０秒、６０℃ ８秒、７２℃ ８秒］、７２℃ １分）。ＰＣＲ２では、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーを用いて増幅を実施する（１００μｌ ＰＣＲ２：５０μｌ ２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＰＣＲマスターミックス、最大４５μｌの精製ＰＣＲ１産物、２．５μｌ Ｐ５プライマー １０μＭ、２．５μｌ Ｐ７プライマー １０μＭ；９５℃ ３分、４×［９５℃ ２０秒，６０℃ ８秒，７２℃ ８秒］、７２℃ １分）。最終的なｂｃｇＲＮＡアンプリコンは２０３ｂｐの長さを有し、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマーを用いて標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットホームでシークエンシングすることが可能なものである（≧２８サイクル リード１、≧１５サイクル リード２）（図５及び図６Ａ）。
ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験
Ｃａｓ１３ｄ－ＮＬＳを発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、またはＴＨＰ１細胞の形質導入及び処理を上記のように実施した。種混合では、非標的化ｇＲＮＡと一緒に、種当たり３つのｂｃｇＲＮＡのプールを使用した。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験には、４つのｇＲＮＡを巡るさまざまなアレイ構成セットにバーコードを付与した２９個のＣＲＩＳＰＲアレイを含めた。こうすることによって、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のｇＲＮＡ位置、細胞当たりの相対的なｇＲＮＡ量の効果、及び複数のＲＮＡ転写産物のコンビナトリアル標的化を評価することが可能になった。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合及びＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑは、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’ｖ３キットの１つのレーンで同時に実施した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、
１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’ｖ３キットの４つのレーンを使用して、Ｃａｓ１３ｄの誘導（１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン）から５日後のＴＨＰ１細胞に対して実施した。ＴＨＰ１ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑライブラリーの設計及びクローニングは上記のように実施した。ランの実行前には、実験ごとに細胞生存率が３９５％であることを確認した。
Ｃａｓ１３ｄ－ＮＬＳを発現するＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、またはＴＨＰ１細胞の形質導入及び処理を上記のように実施した。種混合では、非標的化ｇＲＮＡと一緒に、種当たり３つのｂｃｇＲＮＡのプールを使用した。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験には、４つのｇＲＮＡを巡るさまざまなアレイ構成セットにバーコードを付与した２９個のＣＲＩＳＰＲアレイを含めた。こうすることによって、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のｇＲＮＡ位置、細胞当たりの相対的なｇＲＮＡ量の効果、及び複数のＲＮＡ転写産物のコンビナトリアル標的化を評価することが可能になった。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合及びＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑは、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’ｖ３キットの１つのレーンで同時に実施した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、
１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３’ｖ３キットの４つのレーンを使用して、Ｃａｓ１３ｄの誘導（１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン）から５日後のＴＨＰ１細胞に対して実施した。ＴＨＰ１ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑライブラリーの設計及びクローニングは上記のように実施した。ランの実行前には、実験ごとに細胞生存率が３９５％であることを確認した。
ＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験では、ＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコール（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７））に従って５つのＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ抗体のプール（０．７５ｕｇ／抗体／２×１０６個細胞）で染色を実施した。同様に、ＦｃＸブロッキング緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４２２３０２；室温で１０分）でＴＨＰ１細胞を最初に処理した後、２２個のＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ抗体のプールで細胞を染色した。実験アイデンティティーの追跡及びマルチプレットの同定を実施するために、細胞ハッシングプロトコール（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８））に従って（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体での染色後に）試料にハッシュタグを付加した。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ細胞ハッシングプロトコール及びＣＩＴＥ－ｓｅｑプロトコールに従ってｍＲＮＡライブラリー、ハッシュタグ（ハッシュタグ由来オリゴ（ＨＴＯ））ライブラリー、タンパク質（抗体由来オリゴ（ＡＤＴ））ライブラリーを構築した。
種混合実験ライブラリー及びＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験ライブラリーは、１回のＮｅｘｔＳｅｑ７５サイクル高アウトプットランで一緒にシークエンシングした。ＴＨＰ１ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑライブラリーは、ＸＰ Ｓ４ ２×１００ ｖ１．５ワークフローを使用してＮｏｖａＳｅｑ６０００でシークエンシングした。ｍＲＮＡライブラリーから得られたシークエンシングリードを、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒソフトウェア（ｖ３．０．１）を使用してｈｇ３８（アンサンブルｖ９７）とｍｍ１０との統合ゲノム参照にマッピングするか、またはＴＨＰ１実験についてはＣｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｖ６．０．０を使用してｈｇ３８にマッピングした。同時に、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒを使用してバーコードガイドＲＮＡライブラリーリードをバーコード参照にマッピングした。ＨＴＯライブラリー及びＡＤＴライブラリーのカウントマトリックスを作成するために、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－ｃｏｕｎｔパッケージ（ｖ１．４．２）を使用した（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｈｏｏｈｍ／ＣＩＴＥ－ｓｅｑ－Ｃｏｕｎｔ）。その後、すべての下流の解析を実施する上で、カウントマトリックスをＳｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ４．０）３３へのインプットとして使用した。
ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑデータ解析
種混合実験及びＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験から得られた細胞を一緒に処理した。ＵＭＩ数が２，５００未満の細胞は除外した。ｍａｒｇｉｎ＝２として（特徴量全体にわたる正規化の代わりに細胞全体にわたる正規化がなされるように）有心対数比変換手法を使用してＨＴＯ及びｓｇＲＮＡのカウント数を正規化した。細胞ダブレットの同定及び細胞への実験条件の割り当てにはＨＴＯＤｅｍｕｘ機能を使用した。ヒト細胞にのみハッシュタグを付加し、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ハッシュタグを有さない唯一の細胞集団とした。ＣａＲｐｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験（ＨＴＯ－０１～ＨＴＯ－０８）に含まれるすべてのハッシュタグダブレットを除外し、種混合実験のヒト細胞（ＨＴＯ－１０）に対してもこの除外を行った。さらに、単一のＨＴＯ－０１～ＨＴＯ－０８で標識された細胞については、マウスリードの割合が１０％超である場合はそうした細胞をすべて除外し、少なくとも１０％のマウスリードが存在しないとしても、いずれのＨＴＯも有さない細胞も除外した。このようにして、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合実験～ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験のダブレットはすべて除外した一方で、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合ブランチの一部としてのマウス細胞とヒト細胞との間の潜在的なコリジョン／ダブレットは残した。この点において、実験を２つの別々の目的に分けた。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合実験については、ＲＮＡ及び種特異的ｂｃｇＲＮＡについて
ヒトリードの割合を定量化することによって種アイデンティティーを決定した（ヒト：＞０．９、マウス：＜０．１、コリジョン：０．９～０．１）。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験については、マウスの特徴量及びＲＮＡカウント数をすべて除去した後に、標準的なＳｅｕｒａｔワークフローを使用してＲＮＡカウント数を対数正規化した。ＭｕｌｔｉＳｅｑＤｅｍｕｘ（ａｕｔｏＴｈｒｅｓｈ＝Ｔ）を使用してバーコードガイドＲＮＡアイデンティティーを決定した。割り当てられたｂｃｇＲＮＡを含まない細胞、及び複数のｂｃｇＲＮＡが割り当てられた細胞は除外した。
種混合実験及びＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ実験から得られた細胞を一緒に処理した。ＵＭＩ数が２，５００未満の細胞は除外した。ｍａｒｇｉｎ＝２として（特徴量全体にわたる正規化の代わりに細胞全体にわたる正規化がなされるように）有心対数比変換手法を使用してＨＴＯ及びｓｇＲＮＡのカウント数を正規化した。細胞ダブレットの同定及び細胞への実験条件の割り当てにはＨＴＯＤｅｍｕｘ機能を使用した。ヒト細胞にのみハッシュタグを付加し、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ハッシュタグを有さない唯一の細胞集団とした。ＣａＲｐｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験（ＨＴＯ－０１～ＨＴＯ－０８）に含まれるすべてのハッシュタグダブレットを除外し、種混合実験のヒト細胞（ＨＴＯ－１０）に対してもこの除外を行った。さらに、単一のＨＴＯ－０１～ＨＴＯ－０８で標識された細胞については、マウスリードの割合が１０％超である場合はそうした細胞をすべて除外し、少なくとも１０％のマウスリードが存在しないとしても、いずれのＨＴＯも有さない細胞も除外した。このようにして、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合実験～ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験のダブレットはすべて除外した一方で、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合ブランチの一部としてのマウス細胞とヒト細胞との間の潜在的なコリジョン／ダブレットは残した。この点において、実験を２つの別々の目的に分けた。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ種混合実験については、ＲＮＡ及び種特異的ｂｃｇＲＮＡについて
ヒトリードの割合を定量化することによって種アイデンティティーを決定した（ヒト：＞０．９、マウス：＜０．１、コリジョン：０．９～０．１）。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＣａＲＰｏｏｌ－ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験については、マウスの特徴量及びＲＮＡカウント数をすべて除去した後に、標準的なＳｅｕｒａｔワークフローを使用してＲＮＡカウント数を対数正規化した。ＭｕｌｔｉＳｅｑＤｅｍｕｘ（ａｕｔｏＴｈｒｅｓｈ＝Ｔ）を使用してバーコードガイドＲＮＡアイデンティティーを決定した。割り当てられたｂｃｇＲＮＡを含まない細胞、及び複数のｂｃｇＲＮＡが割り当てられた細胞は除外した。
ＴＨＰ１実験については、上記のようにＨＴＯｄｅｍｕｘを使用してＨＴＯでのデマルチプレックスを実施した後、５２，４９６個の単一細胞を検出した（ｎＦｅａｔｕｒｅ＿ＲＮＡ＞１０００、ｎＦｅａｔｕｒｅ＿ＲＮＡ＜８０００、ｐｅｒｃｅｎｔ．ｍｔ＜２０）。モデルベースのｂｃｇＲＮＡ割り当て（ＨＴＯＤｅｍｕｘまたはＭｕｌｔｉＳｅｑＤｅｍｕｘ）では、観察される表現型変化によって裏付けられる満足のいく結果が得られず、この理由は、ｂｃｇＲＮＡ特徴量の数が多いことによって強いられるモデル制限に起因するものであり得る。代わりに、下記のルールを適用することによってｂｃｇＲＮＡを単一細胞に割り当てた。
ＵＭＩカウント数が最も多いｂｃｇＲＮＡ（ｇ１）のＵＭＩカウント数と、存在する場合は、２番目の検出ｂｃｇＲＮＡ（ｇ２）のＵＭＩカウント数と、を比較した。ｇ２のｂｃｇＲＮＡカウント数は、ライブラリー調製から生じた偽のカウント数に由来するか、または複数のウイルスエレメントの組み込み（ｂｃｇＲＮＡマルチプレット）に由来するものであり得る。ｇ１＜５である細胞は陰性と見なした。１）ｇ１＝｛５～９｝であり、かつｇ２＝｛０－１｝である場合、または２）ｇ１＞９であり、かつｇ１／（ｇ１＋ｇ２）＞０．８であり、かつｇ２＜１１である場合は、ｇ１を割り当てた。他の細胞はすべて、ｂｃｇＲＮＡマルチプレットと見なした。単一のｂｃｇＲＮＡを含む３１，３０８個を割り当てた。ＣａＲＰｏｏｌｓｅｑライブラリーに含めた技術的反復の遺伝子発現差異の結果の比較から、ＧＦＩ１ ｇ２はＣＤ１１ｂ ＡＤＴの上方制御を引き起こさず、予想される遺伝子発現シグネチャーの上方制御を引き起こさないことが認められた。ＧＦＩ１ ｇ２を伴う細胞（ｎ＝６０１）はすべて除外した。遺伝子ペアまたは個々のＣＲＩＳＰＲアレイについての細胞表面タンパク質ＡＤＴレベルの変化は、ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓのウィルコクソンの順位和検定を使用して、ＮＴ対照細胞と対比で計算した。変化は、細胞群当たり無作為に選択した３０個以下の細胞を用いて発現差異分析を１０回繰り返して細胞数の差異を考慮することによって決定した。
直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ実験におけるｓｇＲＮＡ検出の推定
Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを介してｓｇＲＮＡを直接的に捕捉する一重ｓｇＲＮＡ標的化及び二重ｓｇＲＮＡ標的化のｓｇＲＮＡ割り当て率については、公開されているものを使用した（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。正確に１つのｓｇＲＮＡの割り当て率（一重ガイド実験での８０％）を平均化すると共に、細胞当たり正確に２つのｓｇＲＮＡの割り当て率（二重ガイド実験での６７％）の平方根をとることによって、平均ｓｇＲＮＡ割り当て率を８０．９％と決定した。本発明者らのシミュレーションでは、低いＭＯＩでの感染の間には細胞によって単一のウイルス粒子が取り込まれることになると想定される。以前に報告された２つのｓｇＲＮＡ実験と同様に、独立して発現する最大で３つのｓｇＲＮＡが単一の組み込み事象によって送達され得る（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。各ｓｇＲＮＡのｓｇＲＮＡ検出は独立事象であると想定される。これらは、検出及び編集の確率ｐにｓｇＲＮＡ特徴量の数ｎをかけること（ｐｎ）によってモデル化することができる。得られる曲線は、正確にｎ個のｓｇＲＮＡを受容した細胞の割合を示す（図３Ｂ）。
Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを介してｓｇＲＮＡを直接的に捕捉する一重ｓｇＲＮＡ標的化及び二重ｓｇＲＮＡ標的化のｓｇＲＮＡ割り当て率については、公開されているものを使用した（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。正確に１つのｓｇＲＮＡの割り当て率（一重ガイド実験での８０％）を平均化すると共に、細胞当たり正確に２つのｓｇＲＮＡの割り当て率（二重ガイド実験での６７％）の平方根をとることによって、平均ｓｇＲＮＡ割り当て率を８０．９％と決定した。本発明者らのシミュレーションでは、低いＭＯＩでの感染の間には細胞によって単一のウイルス粒子が取り込まれることになると想定される。以前に報告された２つのｓｇＲＮＡ実験と同様に、独立して発現する最大で３つのｓｇＲＮＡが単一の組み込み事象によって送達され得る（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））。各ｓｇＲＮＡのｓｇＲＮＡ検出は独立事象であると想定される。これらは、検出及び編集の確率ｐにｓｇＲＮＡ特徴量の数ｎをかけること（ｐｎ）によってモデル化することができる。得られる曲線は、正確にｎ個のｓｇＲＮＡを受容した細胞の割合を示す（図３Ｂ）。
単一細胞データにおける遺伝的相互作用（ＧＩ）のモデリング
二重摂動のトランスクリプトームプロファイルを紐解くために、以前に導入された線形回帰モデル（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））を使用し、この線形回帰モデルをＲにおいて実行した。最初に、すべての細胞について、対照群（非標的化細胞）の平均値及び標準偏差に対して対数正規化遺伝子発現カウント数をｚ標準化した。このようにして、各細胞由来のベースライン発現プロファイルを差し引いており、ＮＴ条件に対する各摂動由来の偏差の直接的な比較を実施することができる。次に、遺伝子ペアによって細胞を群化し、特徴量ごとに細胞全体の平均値を計算することによって疑似バルクｚ標準化プロファイル［一重摂動（ａ，ｂ）及び二重摂動（ａｂ）］を計算した。平均ＮＴ細胞プロファイルを、すべてがゼロのベクトルに戻した。平均ＵＭＩカウント数が０．５超の１，５３０個の遺伝子の平均プロファイルを生成させた。すべての細胞群が少なくとも２５個の細胞によって代表された場合に遺伝子ペアを含めた。
二重摂動のトランスクリプトームプロファイルを紐解くために、以前に導入された線形回帰モデル（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））を使用し、この線形回帰モデルをＲにおいて実行した。最初に、すべての細胞について、対照群（非標的化細胞）の平均値及び標準偏差に対して対数正規化遺伝子発現カウント数をｚ標準化した。このようにして、各細胞由来のベースライン発現プロファイルを差し引いており、ＮＴ条件に対する各摂動由来の偏差の直接的な比較を実施することができる。次に、遺伝子ペアによって細胞を群化し、特徴量ごとに細胞全体の平均値を計算することによって疑似バルクｚ標準化プロファイル［一重摂動（ａ，ｂ）及び二重摂動（ａｂ）］を計算した。平均ＮＴ細胞プロファイルを、すべてがゼロのベクトルに戻した。平均ＵＭＩカウント数が０．５超の１，５３０個の遺伝子の平均プロファイルを生成させた。すべての細胞群が少なくとも２５個の細胞によって代表された場合に遺伝子ペアを含めた。
以前に導入されたように（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９）、
δａｂ＝ｃ１δａ＋ｃ２δｂ＋ε
を使用して平均ｚ標準化プロファイルをモデリングした。
δａは、一重摂動ａに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルであり、δｂは、一重摂動ｂに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルであり、δａｂは、二重摂動ａｂに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルである。ｃ１及びｃ２は、データにフィッティングされた定数であり、ａδプロファイル及びδｂプロファイルの相対的な重みを示す。ベクトルεは、モデルフィットに対する残差を集めたものである。本発明者らのプロットでは、ａは遺伝子ペア中の第１の遺伝子であり、ｂは第２の遺伝子である。ｃ１はａに対応し、ｃ２はｂに対応する。
δａｂ＝ｃ１δａ＋ｃ２δｂ＋ε
を使用して平均ｚ標準化プロファイルをモデリングした。
δａは、一重摂動ａに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルであり、δｂは、一重摂動ｂに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルであり、δａｂは、二重摂動ａｂに割り当てられた細胞の疑似バルクｚ標準化プロファイルである。ｃ１及びｃ２は、データにフィッティングされた定数であり、ａδプロファイル及びδｂプロファイルの相対的な重みを示す。ベクトルεは、モデルフィットに対する残差を集めたものである。本発明者らのプロットでは、ａは遺伝子ペア中の第１の遺伝子であり、ｂは第２の遺伝子である。ｃ１はａに対応し、ｃ２はｂに対応する。
ＭＡＳＳパッケージ由来のｒｌｍ機能を使用して、以前に導入されたモデルフィッティング手順（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））を実行し、平均係数（ｃ１及びｃ２）ならびに残差εを抽出した。６つの尺度を集めて、以前の報告のようにフィッティングを評価した（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））（エネルギーパッケージ由来のｄｃｏｒ機能）：
モデルフィッティング：ｄｃｏｒ（ｃ１ａ＋ｃ２ａ，ａｂ）
ドミナンス：｜ｌｏｇ１０（ｃ１／ｃ２）｜
マグニチュード：（ｃ１２＋ｃ２２）１／２
一重プロファイルと二重プロファイルとの類似性：ｄｃｏｒ（［ａ，ｂ］，ａｂ）
一重プロファイルの類似性：ｄｃｏｒ（ａ，ｂ）
寄与の均等度：ｍｉｎ（ｄｃｏｒ（ａ，ａｂ），ｄｃｏｒ（ｂ，ａｂ））／ｍａｘ（ｄｃｏｒ（ａ，ａｂ），ｄｃｏｒ（ｂ，ａｂ））
モデルフィッティング：ｄｃｏｒ（ｃ１ａ＋ｃ２ａ，ａｂ）
ドミナンス：｜ｌｏｇ１０（ｃ１／ｃ２）｜
マグニチュード：（ｃ１２＋ｃ２２）１／２
一重プロファイルと二重プロファイルとの類似性：ｄｃｏｒ（［ａ，ｂ］，ａｂ）
一重プロファイルの類似性：ｄｃｏｒ（ａ，ｂ）
寄与の均等度：ｍｉｎ（ｄｃｏｒ（ａ，ａｂ），ｄｃｏｒ（ｂ，ａｂ））／ｍａｘ（ｄｃｏｒ（ａ，ａｂ），ｄｃｏｒ（ｂ，ａｂ））
各特徴量及びその解釈については、この文献（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））中に詳述されている。特徴量を標準化（ｍａｒｇｉｎ＝２）してから階層的クラスタリング（ｄｉｓｔ＝ｅｕｃｌｉｄｅａｎ、ｍｅｔｈｏｄｓ＝ｗａｒｄ）を行ってデンドログラムを作成した。
実施例２：Ｃａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑを用いる単一細胞でのＲＮＡ転写産物の効率的なコンビナトリアル標的化
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質（ＶＩ－ＤファミリーメンバーＲｆｘＣａｓ１３ｄなど）は、標的ＲＮＡをノックダウンすることができるプログラム可能なＲＮＡ依存
性ＲＮＡ標的化ヌクレアーゼである。注目すべきことに、ＲｆｘＣａｓ１３ｄは、ＣＲＩＳＰＲアレイをプロセシングして複数の成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にする能力も有しており（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８））、ＲＮＡレベルでコンビナトリアル摂動を生じさせる上で魅力的な選択肢となっている。最近、本発明者らは、ＲｆｘＣａｓ１３ｄが著しい標的ＲＮＡノックダウンを誘発し得ることを確認し、異なる転写産物を包括的にカバーする数千のｇＲＮＡから、最適に標的化を行う上での一連の規則を見出した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。したがって、プール型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３スクリーニングを単一細胞リードアウトと組み合わせて、コンビナトリアルかつマルチモーダルなプール型遺伝子スクリーニングを実施することを探求した。
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質（ＶＩ－ＤファミリーメンバーＲｆｘＣａｓ１３ｄなど）は、標的ＲＮＡをノックダウンすることができるプログラム可能なＲＮＡ依存
性ＲＮＡ標的化ヌクレアーゼである。注目すべきことに、ＲｆｘＣａｓ１３ｄは、ＣＲＩＳＰＲアレイをプロセシングして複数の成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にする能力も有しており（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８））、ＲＮＡレベルでコンビナトリアル摂動を生じさせる上で魅力的な選択肢となっている。最近、本発明者らは、ＲｆｘＣａｓ１３ｄが著しい標的ＲＮＡノックダウンを誘発し得ることを確認し、異なる転写産物を包括的にカバーする数千のｇＲＮＡから、最適に標的化を行う上での一連の規則を見出した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０））。したがって、プール型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３スクリーニングを単一細胞リードアウトと組み合わせて、コンビナトリアルかつマルチモーダルなプール型遺伝子スクリーニングを実施することを探求した。
Ｃａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ（ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ）を行うための本発明者らの方法は、個別または多重のｇＲＮＡ摂動を各細胞に送達し、単一細胞シークエンシング実験の間にそのアイデンティティーを検出する上での分子戦略を最適化することによって可能になっている。ＶＩ Ａ型、ＶＩ Ｃ型、及びＶＩ Ｄ型のＣａｓ１３
ｃｒＲＮＡは、短い５’ダイレクトリピート（ＤＲ）及び３’末端の可変スペーサー（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる）からなり、それ故に、逆転写のための共通プライミング部位を有さない。本発明者らは、２３ｎｔの標的スペーサーの３’末端に１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ適合性の「捕捉」配列を付加することによってｇＲＮＡを直接的に検出するための手法を開発した（図１Ａ）。本発明者らは「間接」捕捉方針（ＣＲＩＳＰＲアレイのうちの専用のｃｒＲＮＡがアレイ特異的バーコード（バーコードｇＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ））を含む）も探求し、ｂｃｇＲＮＡ及びｇＲＮＡの異なる位置構成を試験した（図１Ａ）。細胞表面タンパク質を標的とし、フローサイトメトリーを介してノックダウンを測定すると共に（図１Ｂ及び図４Ａ～図４Ｇ）、ＲＴ－ＰＣＲを介してｃｒＲＮＡ検出を定量化すること（図１Ｃ）によって各方法の能力を評価した。すべての方法において強固なノックダウンの誘導に成功したが（図１Ｂ）、最適化構成を有する間接的ガイド捕捉において、最も強いｃｒＲＮＡ転写産物検出能力が得られることを見出した（構成Ｘ；図１Ｃ）。
ｃｒＲＮＡは、短い５’ダイレクトリピート（ＤＲ）及び３’末端の可変スペーサー（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる）からなり、それ故に、逆転写のための共通プライミング部位を有さない。本発明者らは、２３ｎｔの標的スペーサーの３’末端に１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ適合性の「捕捉」配列を付加することによってｇＲＮＡを直接的に検出するための手法を開発した（図１Ａ）。本発明者らは「間接」捕捉方針（ＣＲＩＳＰＲアレイのうちの専用のｃｒＲＮＡがアレイ特異的バーコード（バーコードｇＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ））を含む）も探求し、ｂｃｇＲＮＡ及びｇＲＮＡの異なる位置構成を試験した（図１Ａ）。細胞表面タンパク質を標的とし、フローサイトメトリーを介してノックダウンを測定すると共に（図１Ｂ及び図４Ａ～図４Ｇ）、ＲＴ－ＰＣＲを介してｃｒＲＮＡ検出を定量化すること（図１Ｃ）によって各方法の能力を評価した。すべての方法において強固なノックダウンの誘導に成功したが（図１Ｂ）、最適化構成を有する間接的ガイド捕捉において、最も強いｃｒＲＮＡ転写産物検出能力が得られることを見出した（構成Ｘ；図１Ｃ）。
こうした結果は、共通ＲＴハンドルをｇＲＮＡに直接的に付加するか、またはＣＲＩＳＰＲアレイの一部としての個別ｂｃｇＲＮＡとして共通ＲＴハンドルを付加することによってＲｆｘＣａｓ１３ｄ ｃｒＲＮＡを改変することで、逆転写及び増幅を可能にし得ることを実証するものである。注目すべきことに、本発明者らの間接検出方針は、こうした摂動の集約的アイデンティティーをコードする検出可能なｂｃｇＲＮＡと共に複数のｇＲＮＡを単一細胞に送達する上で非常に適するものである。さらに、本発明者らの改変ｃｒＲＮＡにおいて逆転写ハンドルとＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲプライミング配列との特有のセットを利用することで（図５）、こうした摂動をｓｃＲＮＡ－ｓｅｑと並行して確実に検出できるだけなく、追加の分子モダリティでのプロファイリング（例えば、トランスクリプトーム及び表面タンパク質のプロファイリングを同時に行うためのＣＩＴＥ－ｓｅｑ）を行う際にも確実に検出できる。最終的に、本発明者らは、安定構造を形成するＲＮＡエレメント（「ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノット」）をｂｃｇＲＮＡの３’末端に導入することで、ｂｃｇＲＮＡの定量的回収がさらに６倍に改善することをさらに見出しており、この改善は、ｂｃｇＲＮＡの核酸分解への対抗に起因し得るものである（実施例３を参照のこと）。
原理の証明として、単一細胞種混合実験においてｂｃｇＲＮＡの検出及び割り当てを行う能力についてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを最初に試験した。非標的化（ＮＴ）ｇＲＮＡ及び種特異的ｂｃｇＲＮＡを含む３つのＣＲＩＳＰＲアレイのウイルスプールを、ＲｆｘＣａｓ１３ｄを発現するヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞に個別に
形質導入した。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ系（ｖ３）を用いてヒト細胞とマウス細胞との混合物をプロファイルして、両方の細胞トランスクリプトーム及びｂｃｇＲＮＡを検出することを目指した。２３８７個の細胞のうち、７８．５％が単一のｂｃｇＲＮＡを発現することが明らかになった（１つ超のｂｃｇＲＮＡを発現した細胞は１．１％、ｂｃｇＲＮＡが検出されなかった細胞は２０．４％）。さらに、シングレット細胞においてはＲＮＡとｂｃｇＲＮＡ標識との間の一致率が極めて高いこと（９９．２％）も認められた（図１Ｄ及び図１Ｅ）。こうした数値は、単一細胞リードアウトへと効率的かつ正確にデマルチプレックスできるプール型摂動スクリーニングがＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑによって可能になることを実証するものである。
形質導入した。１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ系（ｖ３）を用いてヒト細胞とマウス細胞との混合物をプロファイルして、両方の細胞トランスクリプトーム及びｂｃｇＲＮＡを検出することを目指した。２３８７個の細胞のうち、７８．５％が単一のｂｃｇＲＮＡを発現することが明らかになった（１つ超のｂｃｇＲＮＡを発現した細胞は１．１％、ｂｃｇＲＮＡが検出されなかった細胞は２０．４％）。さらに、シングレット細胞においてはＲＮＡとｂｃｇＲＮＡ標識との間の一致率が極めて高いこと（９９．２％）も認められた（図１Ｄ及び図１Ｅ）。こうした数値は、単一細胞リードアウトへと効率的かつ正確にデマルチプレックスできるプール型摂動スクリーニングがＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑによって可能になることを実証するものである。
次に、単一細胞分解能で複数の分子モダリティでのコンビナトリアル摂動を区別する能力についてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを試験した。３つの細胞表面タンパク質（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ７１）を標的とするｇＲＮＡ、ならびにＮＴ ｇＲＮＡを設計した。最大で３つのｇＲＮＡ及びｂｃｇＲＮＡをそれぞれが含む２９個のｃｒＲＮＡアレイを創出して、これらの遺伝子が個別にまたは組み合わせで摂動を受けるようにした。すべてのｃｒＲＮＡのウイルスプールをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に形質導入し、ＣＩＴＥ－ｓｅｑリードアウトと共にＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを実施することで（図２Ａ及び図６Ａ）、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ７１の表面タンパク質レベルと関連付けて細胞トランスクリプトーム及び抗体由来タグ（ＡＤＴ）の両方に対する各摂動を評価することが可能であった。
９，３５５個の単一細胞プロファイルを取得し、検出されたｂｃｇＲＮＡに基づいてそれらの単一細胞プロファイルを群へとデマルチプレックスした（図６Ｂ；７４．７％が単一のｂｃｇＲＮＡを発現し、８０．８％が少なくとも１つのｂｃｇＲＮＡを発現した）。摂動後に観察された各標的遺伝子のタンパク質レベルの平均低下率は平均で７６．５％（＋／－５．７％）であり、Ｃａｓ１３が強固な分子摂動を与える明確な証拠が得られた（図２Ｂ～図２Ｄ）。さらに、一重ｇＲＮＡ摂動と比較して多重ｇＲＮＡ ｃｒＲＮＡアレイのノックダウンの強度は同様であった（図２Ｂ及び図７Ｃ）。２６個すべての標的化ｇＲＮＡ群のトランスクリプトーム疑似バルクプロファイルを調べると、各標的転写産物のｍＲＮＡ発現は、３つの遺伝子の転写産物に同時に摂動を与えた場合でさえ減少することが認められた（図６Ｃ及び図６Ｄ中の１５個の例）。トランスクリプトームノックダウンの平均強度（平均１５％、ｓｄ５．２％）は、観察されたタンパク質減少と比較して一貫して低下していた。このことは、Ｃａｓ１３によって示されたノックダウンの様式と一致する。標的ＲＮＡは連続的に産生されており、標的がタンパク質へと翻訳され得る前には分解される。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる標的化の結果、ナンセンス変異依存分解によって分解されるＲＮＡが生じる頻度（Ｔｕｌａｄｈａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，１－１０（２０１９））と同様の頻度で、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって検出可能であるが、機能性タンパク質への翻訳は不可能なＲＮＡ分子がＣａｓ１３切断によって生じる可能性があり、このことは、測定されるＲＮＡノックダウンのレベルが、Ｃａｓ１３摂動の表現型効果を過小評価するものであることを示唆している。重要なことに、本発明者らは、Ｃａｓ１３ｄ介在性の遺伝子ノックダウンが高度に特異的であることを明らかにし、３つの標的遺伝子摂動のいずれにおいてもオフターゲット効果の証拠は存在しなかった（図６Ｅ及び図６Ｆ）。
次に、３つの異なるＣａｓ９エフェクター（Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、第一世代ＣＲＩＳＰＲ阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）系（ＫＲＡＢｄＣａｓ９（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２（２０１３）、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０７．４３８８８２（２０２１）））、及び第２世代二重エフェクターＣＲＩＳＰＲｉ系（ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０７．４３８８８２（２０２１
）、Ｙｅｏ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，６１１－６１６（２０１８）））を使用して直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））に対してＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑの能力をベンチマーク評価した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑでは、ｇＲＮＡアイデンティティーの組み合わせを１つのｂｃｇＲＮＡがコードする一方で、直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑでは、摂動当たり１つのｓｇＲＮＡ特徴量を独立して検出する必要がある（図３Ａ）。以前に報告した本発明者らの実験系を再現して、同じ３つの細胞表面マーカー（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ７１）を単独または組み合わせで標的とした。確立されたＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ（Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，１８４－１９１（２０１６））及びＣＲＩＳＰＲｉ（Ｓａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１５（２０１８））に由来する３つのｓｇＲＮＡを標的ごとに評価した。ｓｇＲＮＡライブラリー（図８Ａ）及び選択したＰｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ用の最良ｓｇＲＮＡ（図８Ｂ）。さらに、一重摂動、二重摂動、または三重摂動をコードするベクターの標的になる細胞を標識するために細胞ハッシング（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８））を利用した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑで行ったように、各細胞におけるｇＲＮＡ、ＲＮＡ、及びＡＤＴのレベルを定量化した。
）、Ｙｅｏ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，６１１－６１６（２０１８）））を使用して直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ（Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０））に対してＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑの能力をベンチマーク評価した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑでは、ｇＲＮＡアイデンティティーの組み合わせを１つのｂｃｇＲＮＡがコードする一方で、直接捕捉Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑでは、摂動当たり１つのｓｇＲＮＡ特徴量を独立して検出する必要がある（図３Ａ）。以前に報告した本発明者らの実験系を再現して、同じ３つの細胞表面マーカー（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ７１）を単独または組み合わせで標的とした。確立されたＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ（Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，１８４－１９１（２０１６））及びＣＲＩＳＰＲｉ（Ｓａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１５（２０１８））に由来する３つのｓｇＲＮＡを標的ごとに評価した。ｓｇＲＮＡライブラリー（図８Ａ）及び選択したＰｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ用の最良ｓｇＲＮＡ（図８Ｂ）。さらに、一重摂動、二重摂動、または三重摂動をコードするベクターの標的になる細胞を標識するために細胞ハッシング（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８））を利用した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑで行ったように、各細胞におけるｇＲＮＡ、ＲＮＡ、及びＡＤＴのレベルを定量化した。
本発明者らのベンチマーク分析から、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑとは対照的に、Ｃａｓ９ベースの代替手法ではコンビナトリアル摂動の効率的な同定及び検出に苦慮することが明らかになった（図３Ｂ）。例えば、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２実験では、３つの遺伝子を標的とするベクターを受容した細胞が１，５７０個回収された。こうした細胞のうちで、シークエンシング後に正しい３つのｓｇＲＮＡと紐づいたものはわずか７７９個（４９．６％）であった。残りの細胞では、摂動数が少なすぎるもの（ｇＲＮＡ数が０、１、もしくは２であったもの、３１．２％）、多すぎるもの（ｇＲＮＡ数が４以上であるもの、１０．０％）、または３つのｇＲＮＡの組み合わせが不適切なもの（９．２％）が検出された。こうした観察された下落は、複数のｇＲＮＡを独立して検出した場合の理論的予測回収率と完全に一致しており、現存する手法を用いて複数の摂動を効率的にプロファイリングすることが困難であることを強調するものである。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑはコンビナトリアル摂動を単一のｂｃｇＲＮＡと紐づけるものであるため、一重摂動と多重摂動との間で検出効率は不変である。
次に、摂動の強度を方法間で比較した。ｂｃｇＲＮＡ（ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ）に基づくか、またはｇＲＮＡの独立検出（Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ）に基づいて３つの摂動の検出に成功した細胞に最初に注目した。こうした細胞に注目した場合、すべての方法が、３つすべての表面タンパク質を同様かつ強力に枯渇させることに成功していた（Ｃａｓ１３ｄ：７４．５％、Ｃａｓ９；７５．５％、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９；７５．２％、ＫＲＡＢｄＣａｓ９－ＭｅＣＰ２；７７．３％）（図３Ｃ）。次に、すべての細胞をそのＡＤＴレベルに基づいて分析した。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ細胞及びＰｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ細胞は一緒にクラスターされ（図３Ｄ）、ｇＲＮＡアイデンティティーによっても群化され（図３Ｅ及び図８Ｃ）、このことによって、すべての方法の間で表現型タンパク質摂動の強度が同様であることが再び実証された。本発明者らは、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ及びＰｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑは両方共、コンビナトリアル摂動を効率的に単一細胞に導入し得ると結論付けている。一方で、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、これらの摂動を成功裏に同定及び検出する能力において明確な利点を有しており、それ故に、コンビナトリアル単一細胞ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施する上で魅力的な手法となる。
遺伝的相互作用を特徴付けるＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑのスループット及び潜在力を実証するために、１５８個のコンビナトリアル遺伝子ペアのマルチプレックス化スクリーニングを実施した。以前に同定された白血病分化調節因子の間の潜在的な相互作用（化学療法
及び小分子薬物に対する応答に影響を与え得る）を特徴付けることを目指した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ－Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｃａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２２．０２．０２．４７８８９４を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ１３ｄカセットを安定的に組み込んだヒトＭＬＬ－ＡＦ９ ＮＲＡＳＧ１２Ｄ ＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１細胞）をモデル系として生成させた。遺伝子当たり１０個のｇＲＮＡを含む４３９個の遺伝子の標的化ライブラリーを使用してバルクＣａｓ１３ｄ ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施した。Ｃａｓ１３ｄの誘導から１３～１６日目に、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂ（単球分化の免疫表現型マーカー）の表面発現に基づいて細胞をビンに選別した。低発現ビンと高発現ビンとの間でｇＲＮＡ相当量を比較することによって、分化に影響を与える２６個の遺伝子（及び、各遺伝子につき、２つの最良性能の非重複ｇＲＮＡ）を選択した。フローサイトメトリーリードアウトと共に個別の摂動を与えることで、これらの遺伝子のそれぞれがＣＤ１１ｂ発現を調節するかを検証した。これらの遺伝子の大半は、ＤＮＡ結合及びクロマチンリモデリング機能と関連するものであり、以前に同定されたＡＭＬ分化調節因子のサブセットを含むものである。
及び小分子薬物に対する応答に影響を与え得る）を特徴付けることを目指した（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ－Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｃａｓ１３ ＲＮＡ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２２．０２．０２．４７８８９４を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ１３ｄカセットを安定的に組み込んだヒトＭＬＬ－ＡＦ９ ＮＲＡＳＧ１２Ｄ ＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１細胞）をモデル系として生成させた。遺伝子当たり１０個のｇＲＮＡを含む４３９個の遺伝子の標的化ライブラリーを使用してバルクＣａｓ１３ｄ ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施した。Ｃａｓ１３ｄの誘導から１３～１６日目に、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｂ（単球分化の免疫表現型マーカー）の表面発現に基づいて細胞をビンに選別した。低発現ビンと高発現ビンとの間でｇＲＮＡ相当量を比較することによって、分化に影響を与える２６個の遺伝子（及び、各遺伝子につき、２つの最良性能の非重複ｇＲＮＡ）を選択した。フローサイトメトリーリードアウトと共に個別の摂動を与えることで、これらの遺伝子のそれぞれがＣＤ１１ｂ発現を調節するかを検証した。これらの遺伝子の大半は、ＤＮＡ結合及びクロマチンリモデリング機能と関連するものであり、以前に同定されたＡＭＬ分化調節因子のサブセットを含むものである。
次に、これらの調節因子に対するコンビナトリアル摂動の効果についてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを試験した。３８５個のｃｒＲＮＡアレイのプール型ライブラリーを細胞に感染させた。このライブラリーは、２８個の一重摂動（２６個の調節因子及び２つの陰性対照遺伝子）ならびに１５８個の摂動ペアをコードするものである。独立したｇＲＮＡを使用する各摂動向けの技術的反復、及びＮＴ対照も含めた。３１，３０８個のデマルチプレックス単一細胞についてトランスクリプトーム、細胞表面タンパク質レベル、及びｇＲＮＡ発現のプロファイリングを実施した。
最初に、各摂動について表面タンパク質発現のレベルをＮＴ対照と比較した。予想通り、各一重遺伝子摂動はＣＤ１１ｂ発現に影響を与えることが明らかになり、観察されたｌｏｇ２変化倍率はバルクＣＲＩＳＰＲスクリーニングのｇＲＮＡエンリッチメントのレベルと強く一致した（Ｒ＝０．８６）。すべての摂動について観察されたｌｏｇ２変化倍率もまた、技術的反復摂動にわたって再現性（Ｒ＝０．８２）を有していた。次に、１５８個の二重遺伝子摂動で観察された効果を２つの一重摂動から得られた効果と比較した。強力な相関が観察され、個別のノックダウンの平均と比較して典型的には二重摂動の方が強いが、二重摂動は積よりは弱いものであることが明らかになった。相乗効果及び減弱効果も共に観察された。例えば、ヒストン脱メチル化酵素ＫＤＭ１Ａ及びヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ３の個別ノックダウンは、ＣＤ１１ｂを、それぞれ強く（ｌｏｇ２ＦＣ２．４１）及び弱く（ｌｏｇ２ＦＣ０．５３）上方制御するが、二重摂動は相乗効果（ｌｏｇ２ＦＣ２．８５）を引き起こす。対照的に、ＥＰ３００の個別ノックダウンもまた、ＣＤ１１ｂを上方制御（ｌｏｇ２ＦＣ１．５７）するが、ＫＤＭ１Ａとの二重摂動（ｌｏｇ２ＦＣ２．０５）は個別のＫＤＭ１Ａノックダウンと比較して弱かった。こうした知見を、本発明者らのＣａｓ１３ｄ ＣＤ１１ｂプール型スクリーニングから得られたデータを使用して検証した。
次に、本発明者らのＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑデータセットにおいて一重摂動及び二重摂動の両方の転写プロファイルを探索した。予想通り、一重摂動を与えた細胞において上方制御された遺伝子モジュールは、典型的には、骨髄系細胞の分化及び機能と関連する遺伝的プログラムと関連していた。回帰モデルのフィッティングを行う最近の先駆的フレームワーク（Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６５，７８６－７９３（２０１９））を適用して、二重摂動を与えた細胞において観察された摂動応答を一重遺伝子摂動応答の線形結合として紐解いた。エピスタシス、遺伝的抑制、及び相乗関係を含
めて、このモデルのフィッティング及び係数は、複数の型の遺伝的相互作用を説明するものである。こうしたモデルを本発明者らの摂動ペアのそれぞれにフィッティングさせることで、多様な遺伝的相互作用が明らかになり、こうした遺伝的相互作用を４つの群に広くクラスター化した。クラスター１に含まれる３３個の遺伝子ペアについては、それぞれの個々の遺伝子のプロファイルが二重摂動応答に均等に寄与することが明らかになり、線形モデルは強いフィッティングを示した。陽性対照として、このクラスターに含まれるペアの多くが、同じ複合体に含まれる２つのタンパク質（すなわち、ＭＥＤ１４／ＭＥＤ２４；ＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＵＰＴ６Ｈ）の摂動に相当するものであった。このクラスターは、同様の摂動シグネチャーを共有する別々の複合体に存在するタンパク質のペア（メディエーター複合体及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のＭＥＤ２４／ＳＭＡＲＣＤ１）にも相当した。ＫＤＭ１Ａ及び転写リプレッサーＧＳＥ１の二重摂動もこのクラスターに分類され、このことは、抑制されるプロモーターへの共局在化によって骨髄分化を抑制する協同的相互作用を示唆する以前の研究と一致した。
めて、このモデルのフィッティング及び係数は、複数の型の遺伝的相互作用を説明するものである。こうしたモデルを本発明者らの摂動ペアのそれぞれにフィッティングさせることで、多様な遺伝的相互作用が明らかになり、こうした遺伝的相互作用を４つの群に広くクラスター化した。クラスター１に含まれる３３個の遺伝子ペアについては、それぞれの個々の遺伝子のプロファイルが二重摂動応答に均等に寄与することが明らかになり、線形モデルは強いフィッティングを示した。陽性対照として、このクラスターに含まれるペアの多くが、同じ複合体に含まれる２つのタンパク質（すなわち、ＭＥＤ１４／ＭＥＤ２４；ＳＵＰＴ１６Ｈ／ＳＵＰＴ６Ｈ）の摂動に相当するものであった。このクラスターは、同様の摂動シグネチャーを共有する別々の複合体に存在するタンパク質のペア（メディエーター複合体及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のＭＥＤ２４／ＳＭＡＲＣＤ１）にも相当した。ＫＤＭ１Ａ及び転写リプレッサーＧＳＥ１の二重摂動もこのクラスターに分類され、このことは、抑制されるプロモーターへの共局在化によって骨髄分化を抑制する協同的相互作用を示唆する以前の研究と一致した。
クラスター４では、一方の遺伝子の効果がもう一方よりも優位であると思われる遺伝的相互作用が同定された。一般に、ＫＤＭ１Ａノックダウンを異なるクロマチン調節因子とペアにした場合に転写応答が大きく異なることが認められた。例えば、両方の遺伝子にコンビナトリアル摂動を与えた場合、ＫＤＭ１Ａシグネチャーよりも強力にＥＰ３００シグネチャーが現れることから明らかになった。二重摂動を与えた細胞では、個別のＫＤＭ１Ａ摂動と比較して、前駆遺伝子（すなわち、前駆マーカーＡＺＵ１）の発現が高まり、分化マーカー遺伝子（骨髄マーカーＳ１００Ａ４）の発現が低下した。対照的に、ポリコーム抑制性複合体メンバーＲＩＮＧ１の摂動とペアにした場合はＫＤＭ１Ａ応答シグネチャーが優位になった。ＨＤＡＣ３との二重摂動では、ＫＤＭ１Ａ転写応答シグネチャーが増強され、このことは、こうした細胞の免疫表現型の結果についての以前の本発明者らの報告と一致した。こうした発見は、ＫＤＭ１ＡアンタゴニストとＨＤＡＣ阻害剤との併用療法が応答を増強するという最近の知見についての分子的な説明の裏付け及び付与にもなる。相互作用応答にわたる不均一性はＫＤＭ１Ａに特有のものであったわけはなく、本発明者らの研究における多くの遺伝的調節因子にも当てはまり、規模を拡大して複雑な遺伝的相互作用を強固に特徴付ける能力をＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑが有することを強調するものである。
まとめると、本発明者はＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを開発し、ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、単一細胞シークエンシングベースのリードアウトと共にＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ ＲＮＡ標的化スクリーニングを実施するための柔軟な方法である。本発明者らは、単一のＣＲＩＳＰＲアレイ（後に切断されて個別のｃｒＲＮＡとなる）の一部として複数のｇＲＮＡを送達するように最適化された方針を導入した。本発明者らは、この方針がコンビナトリアル摂動の実施によく適合することを実証しており、こうした摂動のアイデンティティーは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ及びＣＩＴＥ－ｓｅｑを含む複数の分子モダリティと共に確実に検出され得る単一のバーコードにコードされる。
複数の摂動を単一細胞に割り当てる場合、Ｃａｓ９ベースの技術と比較してＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑが効率的かつ正確であることを本発明者らはベンチマーク評価を介して示している。個別の摂動を用いた場合でさえ、使用者は、依然としてＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑから恩恵を受けることになる。具体的には、Ｃａｓ１３ｄは、ＲＮＡ標的化酵素として、特定のＲＮＡアイソフォーム、または環状ＲＮＡ分子、エンハンサーＲＮＡ分子、もしくはアンチセンスＲＮＡ分子でさえ標的とすることに比類なく適用することができる。ＲＮＡ指向化手法は、局所遺伝子クラスターの単一メンバーを標的とする場合にも最適であり得、こうした局所遺伝子クラスターでは、代替のＫＲＡＢ介在性抑制方針は「拡散」を招き、オフターゲット効果を導入し得る。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑは、追加の細胞モダリティ（細胞表面タンパク質レベルなど）をプロファイリングできるものであり、将来的には
、追加の分子モダリティ（細胞内タンパク質レベル及びクロマチン到達性を含む）への拡張も可能なものである。
、追加の分子モダリティ（細胞内タンパク質レベル及びクロマチン到達性を含む）への拡張も可能なものである。
コンビナトリアルスクリーニングは、遺伝的制御ネットワークの構造に実質的な新たな光を当てる潜在力を有するだけでなく、望ましい細胞表現型を達成するコンビナトリアル摂動を同定する潜在力も有する。ＡＭＬ分化調節因子の本発明者らのＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑ分析では、最近開発された計算フレームワークから恩恵を受けて、マルチプレックス化摂動スクリーニングから遺伝的相互作用が同定された。こうした型のデータは、複雑な経路及び細胞回路の系統的再構築に有用なリソースとなる。さらに、ＡＭＬ分化表現型を増強するコンビナトリアル摂動を本発明者らが同定したことは、効率的な多剤併用療法が以前に同定されたことと一致しており、このことは、薬物併用治療の候補を選ぶ上で将来の実験が役立ち得ることを示唆している。ＣａＲＰｏｏｌｓｅｑは、マルチプレックス化単一細胞摂動のための方法の増え続けるツールボックスに対する強力な追加要素となる。
実施例３：ｂｃｇＲＮＡの３’末端への安定な構造化ＲＮＡエレメントの付加
外部から投与したｃｒＲＮＡがＣａｓ１３ｄの存在下では急速な細胞ＲＮＡ分解機構から保護されることが最近示されており（Ｍｅｎｄｅｚ－Ｍａｎｃｉｌｌａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１－７（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０２１．０７．０１１）、この理由は、ｃｒＲＮＡがＣａｓ１３ｄ
ＲＮＰ複合体中に包埋されているときには、ＲＮＡｓｅによる分解をｃｒＲＮＡが受けなくなることにあり得る。本発明者らは、標準的な標的化ｇＲＮＡよりもｂｃｇＲＮＡが長いことに気が付いた。結果的に、逆転写ハンドルはＣａｓ１３ｄ ＲＮＰ複合体の外側に突出する可能性があり（Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１７５，２１２－２２３（２０１８））、それ故に、内在性ＲＮＡヌクレアーゼによる３’核酸分解を受ける可能性がある。したがって、ｂｃｇＲＮＡの３’末端に安定な構造化ＲＮＡエレメントを付加することで、核酸分解に対抗し、ｂｃｇＲＮＡの検出感度が改善され得るという仮説を立てた（図９Ａ）。
外部から投与したｃｒＲＮＡがＣａｓ１３ｄの存在下では急速な細胞ＲＮＡ分解機構から保護されることが最近示されており（Ｍｅｎｄｅｚ－Ｍａｎｃｉｌｌａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１－７（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０２１．０７．０１１）、この理由は、ｃｒＲＮＡがＣａｓ１３ｄ
ＲＮＰ複合体中に包埋されているときには、ＲＮＡｓｅによる分解をｃｒＲＮＡが受けなくなることにあり得る。本発明者らは、標準的な標的化ｇＲＮＡよりもｂｃｇＲＮＡが長いことに気が付いた。結果的に、逆転写ハンドルはＣａｓ１３ｄ ＲＮＰ複合体の外側に突出する可能性があり（Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１７５，２１２－２２３（２０１８））、それ故に、内在性ＲＮＡヌクレアーゼによる３’核酸分解を受ける可能性がある。したがって、ｂｃｇＲＮＡの３’末端に安定な構造化ＲＮＡエレメントを付加することで、核酸分解に対抗し、ｂｃｇＲＮＡの検出感度が改善され得るという仮説を立てた（図９Ａ）。
細胞表面タンパク質（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ７１）を標的としてＣＩＴＥ－ｓｅｑリードアウトと共にＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑを実施し、ｂｃｇＲＮＡ検出を評価することで、逆転写ハンドルの３’に配置した場合の６つの構造化ＲＮＡの効果を比較した（図９Ｂ）。タンパク質ＡＤＴ発現レベルに関する単一細胞類似性を評価し、標的遺伝子による細胞のクラスター化が再現されることが明らかになった（図９Ｃ）。用いた安定化ＲＮＡエレメントに由来するアイデンティティーが細胞のクラスター化に影響を与えることはなかった（図９Ｄ）。実際、安定化ＲＮＡエレメントの間で標的ノックダウンは同様であることが明らかになった（図９Ｅ）。ＭＡＬＡＴ１三重構造を使用した場合にのみ、標的のわずかな減少を引き起こし、この減少は、必要なヌクレオチド置換の結果としてフォールディングが不適切になったことに起因し得る。２つの構造（ジカウイルス由来ｘｒＲＮＡ１ダンベル；ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノット）はｂｃｇＲＮＡ検出量を強固に増加させた（図９Ｆ）。ｅｖｏｐｒｅＱ１シュードノットエレメントは以前に使用されており、これによってプライム編集効率が約２倍に改善されている（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２１－０１０３９－７）。ＣａＲＰｏｏｌ－ｓｅｑについては、ｅｖｏｐｒｅＱ１エレメントは、本発明者らの最初の設計と比較してｂｃｇＲＮＡ検出感度を６倍に高めた（図９Ｇ）。この感度上昇は、シグナル対ノイズ比を系統的に改善して、偽の二次的なｂｃｇＲＮＡ ＵＭＩカウント数から真のｂｃｇＲＮＡ ＵＭＩカウント数を区別するものでもある（図９Ｈ）。
参考文献
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３．Ｊａｉｔｉｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｏｏｌｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ．Ｃｅｌｌ １６７，１８８３－１８９６（２０１６）．
４．Ｍｉｍｉｔｏｕ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６，４０９－４１２（２０１９）．
５．Ａｄａｍｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ １６７，１８６７－１８８２（２０１６）．
６．Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０）．
７．Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｎｉｆｏｌｄｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｉｃｈ
ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．３６５，７８６－７９３（２０１９）．
８．Ｍｉｃｈｌｉｔｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｅｄ ＶＢＣ ｓｃｏｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｓｇＲＮＡｓ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７，（２０２０）．
９．Ｐａｐａｌｅｘｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ
ｓｃｒｅｅｎｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０）．
１０．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８）．
１１．Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ Ｃａｓ１３ ｓｃｒｅｅｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０）．
１２．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７）．
１３．Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ．Ｖ．，Ｌｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｚａｉｒｉｓ，Ｓ．，Ｒａｂａｄａｎ，Ｒ．＆ Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｇａｎｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，４５３－４５８（２０１６）．
１４．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｅｇＲＮＡｓ ｉ
ｍｐｒｏｖｅ ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２１－０１０３９－７
１５．Ｔｕｌａｄｈａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｐｒｏｖｏｋｅｓ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡ ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，１－１０（２０１９）．
１６．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２（２０１３）．
１７．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｕｓｉｎｇ ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０７．４３８８８２（２０２１）．
１８．Ｙｅｏ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，６１１－６１６（２０１８）．
１９．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，１８４－１９１（２０１６）．
２０．Ｓａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１５（２０１８）．
２１．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８）．
２２．Ｗａｎｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２８，７１８－７３１（２０２１）．
２３．Ｎｉｃｏｓｉａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＬＳＤ１ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＧＳＥ１ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＡＭＬ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１３８８－０２１－０２１２３－７
２４．Ｆｉｓｋｕｓ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＳＤ１（ＫＤＭ１Ａ）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ｐａｎ－ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ＡＭＬ ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２８，２１５５－２１６４（２０１４）．
２５．Ｌｅｎｓｃｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｐｌ．Ｔｅｋｎｏｌ．Ｐａｎｇａｎ（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．１１．０４．４６７２３７
２６．Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｉｍｐｒｏ
ｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３－７８４（２０１４）．
２７．Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｃａｓ１３ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ
ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １，１００００１（２０２１）．
２８．Ｍａｃｏｓｋｏ，Ｅ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ １６１，１２０２－１２１４（２０１５）．
２９．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．＆ Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４）．
３０．Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０，（２００９）．
３１．Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｈ．Ｓ．，Ｊａｆｆｅ，Ａ．Ｅ．＆ Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．Ｔｈｅ ｓｖａ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ
ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｕｎｗａｎｔｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，８８２－８８３（２０１２）．
３２．Ｋｏｌｄｅ，Ｒ．，Ｌａｕｒ，Ｓ．，Ａｄｌｅｒ，Ｐ．＆ Ｖｉｌｏ，Ｊ．Ｒｏｂｕｓｔ ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｌｉｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，５７３－５８０（２０１２）．
３３．Ｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｄａｔａ．Ｃｅｌｌ １８４，３５７３－３５８７．ｅ２９（２０２１）．
１．Ｄｉｘｉｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｒｂ－Ｓｅｑ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｏｌｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｃｒｅｅｎｓ．Ｃｅｌｌ １６７，１８５３－１８６６（２０１６）．
２．Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄｏｕｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４，２９７－３０１（２０１７）．
３．Ｊａｉｔｉｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｏｏｌｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ．Ｃｅｌｌ １６７，１８８３－１８９６（２０１６）．
４．Ｍｉｍｉｔｏｕ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，ｃｌｏｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６，４０９－４１２（２０１９）．
５．Ａｄａｍｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ １６７，１８６７－１８８２（２０１６）．
６．Ｒｅｐｌｏｇｌｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，９５４－９６１（２０２０）．
７．Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｎｉｆｏｌｄｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｉｃｈ
ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．３６５，７８６－７９３（２０１９）．
８．Ｍｉｃｈｌｉｔｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｅｄ ＶＢＣ ｓｃｏｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｓｇＲＮＡｓ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｌｌｅｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７，（２０２０）．
９．Ｐａｐａｌｅｘｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ
ｓｃｒｅｅｎｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０）．
１０．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １７３，６６５－６７６（２０１８）．
１１．Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ Ｃａｓ１３ ｓｃｒｅｅｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，７２２－７２７（２０２０）．
１２．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，８６５－８６８（２０１７）．
１３．Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ．Ｖ．，Ｌｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｚａｉｒｉｓ，Ｓ．，Ｒａｂａｄａｎ，Ｒ．＆ Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｇａｎｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，４５３－４５８（２０１６）．
１４．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｅｇＲＮＡｓ ｉ
ｍｐｒｏｖｅ ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２１－０１０３９－７
１５．Ｔｕｌａｄｈａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｐｒｏｖｏｋｅｓ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡ ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，１－１０（２０１９）．
１６．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２（２０１３）．
１７．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｕｓｉｎｇ ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．０７．４３８８８２（２０２１）．
１８．Ｙｅｏ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，６１１－６１６（２０１８）．
１９．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｍａｘｉｍｉｚｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，１８４－１９１（２０１６）．
２０．Ｓａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，１－１５（２０１８）．
２１．Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈａｓｈｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｒｃｏｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，１－１２（２０１８）．
２２．Ｗａｎｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２８，７１８－７３１（２０２１）．
２３．Ｎｉｃｏｓｉａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＬＳＤ１ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＧＳＥ１ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＡＭＬ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１３８８－０２１－０２１２３－７
２４．Ｆｉｓｋｕｓ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＳＤ１（ＫＤＭ１Ａ）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ｐａｎ－ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ＡＭＬ ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２８，２１５５－２１６４（２０１４）．
２５．Ｌｅｎｓｃｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｐｌ．Ｔｅｋｎｏｌ．Ｐａｎｇａｎ（２０２１）．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．１１．０４．４６７２３７
２６．Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｉｍｐｒｏ
ｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３－７８４（２０１４）．
２７．Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ Ｃａｓ１３ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ
ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １，１００００１（２０２１）．
２８．Ｍａｃｏｓｋｏ，Ｅ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ １６１，１２０２－１２１４（２０１５）．
２９．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．＆ Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５，５５０（２０１４）．
３０．Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０，（２００９）．
３１．Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｈ．Ｓ．，Ｊａｆｆｅ，Ａ．Ｅ．＆ Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．Ｔｈｅ ｓｖａ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ
ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｕｎｗａｎｔｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，８８２－８８３（２０１２）．
３２．Ｋｏｌｄｅ，Ｒ．，Ｌａｕｒ，Ｓ．，Ａｄｌｅｒ，Ｐ．＆ Ｖｉｌｏ，Ｊ．Ｒｏｂｕｓｔ ｒａｎｋ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｌｉｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，５７３－５８０（２０１２）．
３３．Ｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｄａｔａ．Ｃｅｌｌ １８４，３５７３－３５８７．ｅ２９（２０２１）．
本明細書で引用される特許及び非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０２１年３月１日出願の米国仮特許出願第６３／１５４，９８５号及び２０２２年２月３日出願の米国仮特許出願第６３／３０６，３４３号は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。「ＮＹＧ－ＬＩＰＰ－１３１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表が本明細書と共に提出され、そこに記載される配列及びテキストは、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を施せることが理解されよう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
Claims (29)
- ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びｇＲＮＡ配列をそれぞれが含む１つ以上のｃｒＲＮＡ配列と、バーコードガイドＲＮＡ（ｂｃｇＲＮＡ）と連結された５’ダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸であって、前記ｂｃｇＲＮＡが、
（ａ）バーコード配列と、
（ｂ）逆転写ハンドルと、
を５’から３’の順に含む、前記核酸。 - 前記ｂｃｇＲＮＡが、
（ａ）ＰＣＲハンドルと、
（ｂ）バーコード配列と、
（ｃ）逆転写ハンドルと、
５’から３’の順に含む、請求項１に記載の核酸。 - 前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える数のｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
- 前記１つ以上のｃｒＲＮＡ配列がそれぞれ、標的ＲＮＡ配列と相補的な少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含むｇＲＮＡを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記１つ以上のｃｒＲＮＡ配列がそれぞれ、標的ＲＮＡ配列と相補的な２３個のヌクレオチドの配列であるｇＲＮＡを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在する前記ｃｒＲＮＡがそれぞれ、異なるｇＲＮＡ配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在する前記ｃｒＲＮＡの２つ以上が、同じｇＲＮＡ配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ＣＲＩＳＰＲアレイ中に存在する前記ｃｒＲＮＡ配列がそれぞれ、標的転写産物の異なる領域に特異的である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、複数の転写産物を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を有するｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ｂｃｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲアレイの前記１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の下流（３’）に存在する、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ｂｃｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲアレイの前記１つ以上のｃｒＲＮＡ配列の上流（５’）に存在する、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ダイレクトリピートが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素と結合することが可能であり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３酵素が、任意選択で、Ｃａｓ１３ｄである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記逆転写ハンドルが、ポリＡ配列、ＣＳ１、またはＣＳ２を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記バーコードが、８～１５個のヌクレオチドを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸。
- 前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、その３’末端に安定化ＲＮＡエレメントをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸。
- 安定化ＲＮＡエレメントが、ＭＡＬＡＴ１エレメント、ＮＥＡＴ１（ＭＥＮβ）エレメント、ｓｐｎｐｒｅＱ１エレメント、ＺＩＫＶ ｘｒＲＮＡ１エレメント、ｍｐｋｎｏｔエレメント、またはｅｖｏｐｒｅＱ１エレメントである、請求項１５に記載の核酸。
- 前記安定化ＲＮＡエレメントが、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、または４４を含む、請求項１５または１６に記載の核酸。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の核酸を含む発現カセット。
- 請求項１８に記載の発現カセットを含むベクターであって、前記ベクターが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである、前記ベクター。
- 前記非ウイルスベクターが、プラスミドである、請求項１９に記載のベクター。
- 前記プラスミドが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素をコードする配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素が、任意選択で、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素である、請求項２０に記載のベクター。
- 前記Ｃａｓ酵素が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素である、請求項２１に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
- 請求項１～１７のいずれか１項に記載の核酸と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素と、を含む宿主細胞であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素が、任意選択で、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素である、前記宿主細胞。
- 単一細胞トランスクリプトームへの１つ以上の遺伝子摂動の導入方法であって、前記方法が、請求項２４に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 遺伝子摂動プロファイリングの実施方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞を取得することと、
（ｂ）前記細胞からＲＮＡを単離することと、
（ｃ）前記逆転写ハンドルに特異的なプライマーと前記ＲＮＡとを接触させることを含む逆転写を実施することと、
（ｄ）前記バーコード配列を同定することと、
（ｅ）１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することと、
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が前記細胞トランスクリプトームに導入される、前記方法。 - 遺伝子摂動プロファイリングの実施方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞を取得し、フルオロフォア結合型抗体で前記細胞を標識し、フローサイトメトリーを使用して前記細胞を選別することと、
（ｂ）前記細胞からＲＮＡを単離することと、
（ｃ）前記逆転写ハンドルに特異的なプライマーと前記ＲＮＡとを接触させることを含む逆転写を実施することと、
（ｄ）前記バーコード配列を同定することと、
（ｅ）１つ以上の転写産物または遺伝子産物の発現を検出することと、
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素によって、１つ以上の摂動が前記細胞トランスクリプトームに導入される、前記方法。 - （ｄ）が、前記ＰＣＲハンドルに特異的なプライマーを使用して前記バーコード配列を増幅することを含む、請求項２６または２８に記載の方法。
- （ｅ）が、フローサイトメトリー分析、細胞ハッシング、単一細胞シークエンシング分析、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ、ＣＲＯＰ－ｓｅｑ、ＣＲＩＳＰ－ｓｅｑ、ＥＣＣＩＴＥ－ｓｅｑ、トランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）のうちの１つ以上を含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
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| US202263306343P | 2022-02-03 | 2022-02-03 | |
| US63/306,343 | 2022-02-03 | ||
| PCT/US2022/018364 WO2022187262A1 (en) | 2021-03-01 | 2022-03-01 | Methods and compositions for combinatorial targeting of the cell transcriptome |
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-
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