JP2024519129A - 肥満症に罹患している患者が超低カロリーケトン食療法（ｖｌｃｋｄ）に応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、そのメチル化状態が、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否かを示す遺伝子をスクリーニングおよび／または選択するためのインビトロ方法に関する。さらに、本発明は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するためのインビトロ方法に関する。
Description
本発明は、医療の分野に関する。特に、本発明は、そのメチル化状態が、肥満症に罹患している患者が超低カロリーケトン食療法（ＶＬＣＫＤ）での処置に応答しているか否かまたは応答するか否かを示す遺伝子をスクリーニングおよび／または選択するためのインビトロ方法に関する。さらに、本発明は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するためのインビトロ方法に関する。
ケトーシスがいくつかの健康状態に対して与えるその誘発効果のために、ケトーシスは近年関心を集めている。ケトーシスは、疾患の発症の遅延および寿命の伸長に関連する。同様に、ケトーシスは、運動選手の身体的持久力の増加から老化の遅延まで、広範囲の健康上の利益を有することが示唆されている。また、神経変性疾患癌、心血管疾患および肥満症などの症状を改善する。これらの研究のいくつかは、高脂肪ケトン食療法を含んでおり、ケトン食療法の主な特徴が炭水化物制限であるとしても、臨床診療における影響に関して、主要栄養素の具体的な組成およびカロリーを考慮に入れるべきである。
ＶＬＣＫＤは、体重減少および維持、筋肉量の保存の増加および安静時代謝率の向上を含め、肥満症を管理する上で有効な戦略であることが実証された。さらに、ＶＬＣＫＤは、肥満症および２型糖尿病を有する患者における代謝パラメータを改善することができる。さらに、ＶＬＣＫＤは、肥満症を有する患者の生活の質を改善することを支援するために、食欲を低下させ、心理生物学的パラメータを改善することができることが実証された。しかしながら、ケトン食療法のこれらの利点の基礎に存在する分子機構はなお不明なままである。
このため、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否か、特にＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が起こったか否かを監視または予測するための分子的方法を見出すという、満たされていない医学的要望が存在する。本発明は、この要望を解決することを目的とし、ＶＬＣＫＤが肥満症メチロームにどのように影響を及ぼし得るかに関する評価が本明細書において提供される。肥満症に関連するメチローム変化が本発明において同定され、この変化はＶＬＣＫＤでの処置による誘発された体重減少またはケトーシスによって媒介される。したがって、本明細書において、前記メチローム変化は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否かの指標として提案される。
発明の簡単な説明
本発明は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予想するための、特にＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が起こったか否かを監視または予測するための方法に関する。
本発明は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予想するための、特にＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が起こったか否かを監視または予測するための方法に関する。
特に、６ヶ月のＶＬＣＫＤ後の２１人の肥満症を有する患者（ｎ＝１２人の女性、４７．９±１．０２歳、３３．０±０．２ｋｇ／ｍ２）および１２人の正常体重のボランティア（ｎ＝６人の女性、５０．３±６．２歳、２２．７±１．５ｋｇ／ｍ２）を研究した。ＶＬＣＫＤ中のケトーシス相の複数の時点（基礎、最大ケトーシスおよびケトーシスから脱出）（ｎ＝１０）およびボランティアのベースライン（ｎ＝１２）で、血液白血球のＩｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐメチロームからのデータを得た。ＶＬＣＫＤを受けた患者の代表コホート（ｎ＝１８）におけるパイロシーケンシングによって結果をさらに検証し、遺伝子発現と相関させた。
ＶＬＣＫＤによる体重低下後、９８８のＣｐＧ部位（７８６のユニークな遺伝子）において差が見出された。ＶＬＣＫＤは肥満症を有する患者におけるメチル化レベルを変化させ、正常体重ボランティアのメチル化レベルと高い類似性を有し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）１、３ａおよび３ｂの下方制御を伴っていた。コードされる遺伝子のほとんどは、代謝プロセス、タンパク質代謝ならびに筋肉、器官および骨格系の発達に関与していた。ＺＮＦ３３１、ＦＧＦＲＬ１（ＶＬＣＫＤ誘導性体重減少）ならびにＣＢＦＡ２Ｔ３、Ｃ３ｏｒｆ３８、ＪＳＲＰ１およびＬＲＦＮ４（ＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス）を含む、事象に関連するスコアリングが上位の新規遺伝子が同定された。興味深いことに、ＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１は、独立したコホートにおいて検証され、遺伝子発現と逆相関した。
したがって、ケトン食療法の潜在的な健康上の利益の基礎に存在する分子機構は依然として未知であるので、本発明は先行技術と比較して明確な貢献をしている。したがって、本発明は、メチローム状態が、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否か、特に、ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が起こったか否かを示すことを初めて示している。
それ故、先行技術を超える寄与を規定し、本発明に単一性を付与する特別な技術的特徴は、メチル化状態が、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否か、特にＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が起こったか否かを示すことである。
したがって、本発明の第１の態様は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するためのインビトロ方法であって、表Ｓ２、Ｓ３またはＳ４から選択される少なくとも１種の遺伝子またはＣｐＧのメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較した、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離は、対象がＶＬＣＫＤに応答しているかまたは応答するであろうことの指標である、インビトロ方法に関する。
好ましい態様において、本発明は、以下の工程に従うことによって、そのメチル化状態が、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否かを示す遺伝子をスクリーニングおよび／または選択することを含む：
ａ．食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者と１２０日目～１８０日目に生じる食事療法の終わりにある患者との間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧを選択する工程；ならびに／または
ｂ．食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧを選択する工程、および食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者と１２０日目～１８０日目に生じる食事療法の終わりにある患者との間で可変的にメチル化されているＣｐＧを破棄する工程；ならびに
ｃ．工程ａ）および／もしくはｂ）に従って選択された可変的にメチル化されたＣｐＧ部位の少なくとも２つをプロモーター領域中に含む遺伝子を選択する工程。
ａ．食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者と１２０日目～１８０日目に生じる食事療法の終わりにある患者との間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧを選択する工程；ならびに／または
ｂ．食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧを選択する工程、および食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者と１２０日目～１８０日目に生じる食事療法の終わりにある患者との間で可変的にメチル化されているＣｐＧを破棄する工程；ならびに
ｃ．工程ａ）および／もしくはｂ）に従って選択された可変的にメチル化されたＣｐＧ部位の少なくとも２つをプロモーター領域中に含む遺伝子を選択する工程。
好ましい態様において、工程ａ）およびｃ）に従って選択される遺伝子およびＣｐＧ部位は、表２もしくは表Ｓ２中に含まれており、それらのメチル化状態は、肥満症に罹患している患者が、ＶＬＣＫＤに応答しておりもしくは将来応答して体重減少および栄養学的ケトーシス誘導の両方を生じさせるか否かを示し、ならびに／または工程ｂ）およびｃ）に従って選択される遺伝子およびＣｐＧ部位は、表３もしくは表Ｓ３中に含まれており、それらのメチル化状態は、肥満症に罹患している患者が、栄養学的ケトーシスの誘導によってＶＬＣＫＤに応答しているか否かもしくは将来応答するか否かを示す。
好ましい態様において、本発明は、肥満症に罹患している患者が、ＶＬＣＫＤに応答しておりもしくは将来応答して体重減少および栄養学的ケトーシス誘導の両方を生じさせるか否かを監視または予測するための方法であって、表２またはＳ２から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較した、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離は、対象がＶＬＣＫＤに応答しているかまたは将来応答することの指標である、方法に関する。
好ましい態様において、遺伝子のメチル化状態は、表２または表Ｓ２から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位において決定される。
好ましい態様において、本発明は、ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が生じたか否かを監視または予測するための方法であって、前記患者から得られた生物学的試料中の表３または表Ｓ３から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較して、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離が、ケトーシスの低下が生じたという指標である、方法に関する。
好ましい態様において、遺伝子のメチル化状態は、表３または表Ｓ３から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位において決定される。
好ましい態様において、患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているかまたは将来応答するであろう場合には、これらの遺伝子の全体的な低メチル化が観察される。
好ましい態様において、メチル化状態の検出は、メチル化特異的ＰＣＲ、バイサルファイトシーケンシング、制限消化に基づく技術、パイロシーケンシング、アッセイＣｈＩＰオンチップ、メチル化された部位の可変的変換、可変的制限および／または可変的重量からなる群より選択される技術によって行われる。
好ましい態様において、患者から単離された生物学的試料は全血、好ましくは血液白血球である。
本発明の第２の態様は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するための、表Ｓ２、Ｓ３またはＳ４から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態のインビトロ使用に関する。
好ましい態様において、本発明は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しておりまたは将来応答して体重減少および栄養学的ケトーシス誘導の両方を生じさせるか否かを監視または予測するための、表２またはＳ２から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態のインビトロ使用に関する。
好ましい態様において、本発明は、表２または表Ｓ２から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位のメチル化状態のインビトロ使用に関する。
好ましい態様において、本発明は、ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が生じたか否かを監視または予測するための、表３または表Ｓ３から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態のインビトロ使用に関する。
好ましい態様において、本発明は、表３または表Ｓ３から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位のメチル化状態のインビトロ使用に関する。
他方で、本発明は、表２、Ｓ２、３、Ｓ３またはＳ４から選択される少なくとも１種の遺伝子の高メチル化または低メチル化を検出するための方法であって、ａ）対象からＤＮＡを得る工程と、ｂ）表２、Ｓ２、３、Ｓ３またはＳ４から選択されるＣｐＧ部位における高メチル化または低メチル化を検出する工程とを含む、前記（ｂ）検出する工程は、メチル化特異的ＰＣＲ、バイサルファイトシーケンシング、制限消化に基づく技術、パイロシーケンシング、アッセイＣｈＩＰオンチップ、メチル化された部位の可変的変換、可変的制限および可変的重量からなる群より選択される技術によって行われる、方法にも関する。
本発明は、コンピュータを実装された発明であって、処理ユニット（ハードウェア）およびソフトウェアが、表２、Ｓ２、３、Ｓ３またはＳ４から選択される遺伝子のいずれかのメチル化レベル値を受け取り、実質的な変動または乖離を見出すために、受け取られたメチル化レベル値を処理し、およびメチル化レベルの変動または乖離に関して端末を通じて出力を提供するように設定されており、メチル化レベルの変動または乖離は、肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤでの処置に応答しているか否かまたは応答するか否か、特に、ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が生じたか否かを示す、コンピュータを実装された発明にも関する。
本発明の最後の態様は、肥満症に罹患している患者をＶＬＣＫＤで処置するための方法であって、本明細書に記載されている方法に従って、表２、Ｓ２、３、Ｓ３またはＳ４から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態を決定することによって、患者がＶＬＣＫＤに応答するか否かを予測する第１の工程を含む方法に関する。
本発明において、以下の略語リストが含まれる。
・ＡＣＡＣＢ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼβ
・ＡＥＢＰ１、ＡＥ結合タンパク質１
・ＡＮＯＶＡ、分散分析
・ＢＭＩ、肥満度指数
・Ｃ３ｏｒｆ３８、第３染色体オープンリーディングフレーム３８
・ＣＡＣＮＡ１Ｈ、カルシウム電位開口型チャネルサブユニットα１Ｈ
・ＣＡＭＫＫ１、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ１
・ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＡ２／ＲＵＮＸ１パートナー転写補助抑制因子３
・ｃＤＮＡ、相補的ＤＮＡ
・ＣＥＮＰＦ、セントロメアタンパク質Ｆ
・ＣＨＡＴ、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ
・ＣＨＵＫ、核因子κＢキナーゼ複合体の阻害剤の成分
・ＣＯＬ１Ａ１、コラーゲン、Ｉ型、α１
・ＣＯＬ５Ａ１、Ｖ型コラーゲンα１鎖
・ＣＯＬ９Ａ２、コラーゲン、ＩＸ型、α２
・ＣＶ、変動係数
・ＤＭＣｐＧ、可変的にメチル化されたＣｐＧ
・ＤＮＭＴ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ
・ＤＮＡ、デオキシリボ核酸
・ＥＷＡＳ、エピゲノムワイド関連解析
・ＦＤＲ、偽発見率
・ＦＦ、新鮮凍結
・ＦＧＦＲＬ１、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）様タンパク質１
・ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ
・ＧＯ、ジーンオントロジー
・ＨＲＡＳ、ＨＲａｓ癌原遺伝子、ＧＴＰアーゼ
・ＩＮＳＲ、インスリン受容体
・ＪＳＲＰ１、接合部筋小胞体タンパク質１
・ＬＡＭＡ２、ラミニンサブユニットα２
・ＬＲＦＮ４、ロイシンリッチリピートおよびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有４
・ＭＫＮＫ２、ＭＡＰＫ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２
・ＰＲＫＡＧ２、タンパク質キナーゼＡＭＰ活性化非触媒性サブユニットγ２
・ＰＲＫＣＺ、タンパク質キナーゼＣζ
・ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
・ＲＥＬＡ、ｖ－ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ
・ＲＮＡ、リボ核酸
・ＲＰＴＯＲ、ＭＴＯＲ複合体１の調節関連タンパク質
・ＳＤ、標準偏差
・ＳＥＭ、平均の標準誤差
・ＳＧＣＢ、βサルコグリカン
・ＳＭＴＮ、スムーズリン
・ＴＲＡＦ２、ＴＮＦ受容体関連因子２
・ＴＳＣ２、結節性硬化症２
・ＴＳＳ２００、転写開始部位２００
・ＶＬＣＫＤ、超低カロリーケトン食療法
・ＷＣ、胴囲
・ＺＦＨＸ３、ジンクフィンガーホメオボックス３
・ＺＮＦ３３１、ジンクフィンガータンパク質３３１
・β－ＯＨＢ、β－ヒドロキシブチラート
・ＡＣＡＣＢ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼβ
・ＡＥＢＰ１、ＡＥ結合タンパク質１
・ＡＮＯＶＡ、分散分析
・ＢＭＩ、肥満度指数
・Ｃ３ｏｒｆ３８、第３染色体オープンリーディングフレーム３８
・ＣＡＣＮＡ１Ｈ、カルシウム電位開口型チャネルサブユニットα１Ｈ
・ＣＡＭＫＫ１、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ１
・ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＡ２／ＲＵＮＸ１パートナー転写補助抑制因子３
・ｃＤＮＡ、相補的ＤＮＡ
・ＣＥＮＰＦ、セントロメアタンパク質Ｆ
・ＣＨＡＴ、コリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ
・ＣＨＵＫ、核因子κＢキナーゼ複合体の阻害剤の成分
・ＣＯＬ１Ａ１、コラーゲン、Ｉ型、α１
・ＣＯＬ５Ａ１、Ｖ型コラーゲンα１鎖
・ＣＯＬ９Ａ２、コラーゲン、ＩＸ型、α２
・ＣＶ、変動係数
・ＤＭＣｐＧ、可変的にメチル化されたＣｐＧ
・ＤＮＭＴ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ
・ＤＮＡ、デオキシリボ核酸
・ＥＷＡＳ、エピゲノムワイド関連解析
・ＦＤＲ、偽発見率
・ＦＦ、新鮮凍結
・ＦＧＦＲＬ１、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）様タンパク質１
・ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ
・ＧＯ、ジーンオントロジー
・ＨＲＡＳ、ＨＲａｓ癌原遺伝子、ＧＴＰアーゼ
・ＩＮＳＲ、インスリン受容体
・ＪＳＲＰ１、接合部筋小胞体タンパク質１
・ＬＡＭＡ２、ラミニンサブユニットα２
・ＬＲＦＮ４、ロイシンリッチリピートおよびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有４
・ＭＫＮＫ２、ＭＡＰＫ相互作用セリン／スレオニンキナーゼ２
・ＰＲＫＡＧ２、タンパク質キナーゼＡＭＰ活性化非触媒性サブユニットγ２
・ＰＲＫＣＺ、タンパク質キナーゼＣζ
・ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
・ＲＥＬＡ、ｖ－ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ
・ＲＮＡ、リボ核酸
・ＲＰＴＯＲ、ＭＴＯＲ複合体１の調節関連タンパク質
・ＳＤ、標準偏差
・ＳＥＭ、平均の標準誤差
・ＳＧＣＢ、βサルコグリカン
・ＳＭＴＮ、スムーズリン
・ＴＲＡＦ２、ＴＮＦ受容体関連因子２
・ＴＳＣ２、結節性硬化症２
・ＴＳＳ２００、転写開始部位２００
・ＶＬＣＫＤ、超低カロリーケトン食療法
・ＷＣ、胴囲
・ＺＦＨＸ３、ジンクフィンガーホメオボックス３
・ＺＮＦ３３１、ジンクフィンガータンパク質３３１
・β－ＯＨＢ、β－ヒドロキシブチラート
本発明において、以下の用語が定義される。
・「予め確立された閾値レベル」または「対照レベル」という用語は、ＶＬＣＫＤで処置される前に、肥満症に罹患している患者において測定されたメチル化レベルを指す。典型的には、このレベルは、実験的に、経験的に、または理論的に決定され得る。この値はまた、当業者によって認識されるように、既存の実験条件および／または臨床条件に基づいて任意に選択され得る。
・本明細書で使用される場合、「メチル化」という用語は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によって、核酸、例えばゲノムＤＮＡの領域中の１または複数のシトシン塩基に付加されたメチル基の存在を意味すると理解される。
・したがって、本明細書で使用される「メチル化状態」という用語は、特定の核酸領域、例えばゲノム領域におけるメチル化の存在または非存在を指す。
・メチル化の「より高い」または「より低い」レベルという表現は、対照として使用される患者と比較した場合の、核酸、例えばゲノムＤＮＡのメチル化の相対的な量の増加または減少を指す。
・本明細書で使用される場合、「ＣｐＧジヌクレオチド」、「ＣｐＧメチル化部位」または同等の用語は、ホスホジエステル結合によってグアニンに結合されたシトシンを表すと解釈されるものとする。ＣｐＧジヌクレオチドは、シトシン残基のメチル化に対する標的であり、コード核酸または非コード核酸内に存在し得る。非コード核酸は、イントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ゲノム遺伝子のプロモーター領域または遺伝子間領域を含むものと当技術分野で理解されている。
・「を含む／備える」という用語は、「を含む／備える」という単語に続くものを包含するが、それに限定されないことを意味する。したがって、「を含む／備える」という用語の使用は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもよく、または存在しなくてもよいことを示す。
・「のみからなる」という用語は、「のみからなる」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「のみからなる」という語句は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
・「β値」は、各シトシンのメチル化レベルを指し、プローブのメチル化された型の、メチル化されていない型に対する蛍光強度比として計算される。β値は、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光強度の組み合わせに従って、０（メチル化されていない）と１（完全にメチル化されている）の間の範囲にあった［Ｐａｎ Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ－ｖａｌｕｅ ａｎｄ Ｍ－ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０ Ｎｏｖ ３０；１１：５８７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－５８７．ＰＭＩＤ：２１１１８５５３ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０１２６７６ ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－５８７］。
・「ＦＤＲ」は、偽発見率を指す。ＦＤＲは、多重比較を補正するために多重仮説検定において使用される統計的アプローチである。ＦＤＲは、誤って有意に見える無作為な事象を補正するためにハイスループット実験において典型的に使用される。観察されたスコアが統計学的に有意であるか否かを決定するために帰無仮説を検定する場合、信頼の尺度ｐ値が計算され、信頼閾値αと比較される。ｋ個の仮説が信頼水準αと同時に検定される場合、偽陽性（すなわち、帰無仮説が実際には真である場合に帰無仮説を棄却すること）の発生の可能性は１－（１－α）ｋに等しく、これは実験において高い過誤率をもたらし得る。したがって、行われた検定の数に基づいて我々の統計的信頼度尺度を調整するために、ＦＤＲなどの複数の検定補正が必要とされる。
・「可変的にメチル化された」という表現は、異なる生物学的試料にわたる異なるＤＮＡメチル化状態の存在を指し、遺伝子転写制御に関与する可能性のある機能的領域と見なされる。生物学的試料は、同じ個体内の異なる細胞／組織、異なる時間での同じ細胞／組織、異なる個体からの細胞／組織、さらには同じ細胞内の異なる対立遺伝子であり得る。
・「超低カロリーケトン食療法」（ＶＬＣＫＤ）は、一般常識に属する用語であり、低脂肪消費、好ましくは８００ｋｃａｌ／日未満の消費を特徴とする［Ｍａｒｃｏ Ｃａｓｔｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０２０．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｃａｌｏｒｉｅ ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ ｄｉｅｔ（ＶＬＣＫＤ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ．２０２０ Ｍａｒ；２１（１）：５－１６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１１５４－０１９－０９５１４－ｙ］。
・「予め確立された閾値レベル」または「対照レベル」という用語は、ＶＬＣＫＤで処置される前に、肥満症に罹患している患者において測定されたメチル化レベルを指す。典型的には、このレベルは、実験的に、経験的に、または理論的に決定され得る。この値はまた、当業者によって認識されるように、既存の実験条件および／または臨床条件に基づいて任意に選択され得る。
・本明細書で使用される場合、「メチル化」という用語は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によって、核酸、例えばゲノムＤＮＡの領域中の１または複数のシトシン塩基に付加されたメチル基の存在を意味すると理解される。
・したがって、本明細書で使用される「メチル化状態」という用語は、特定の核酸領域、例えばゲノム領域におけるメチル化の存在または非存在を指す。
・メチル化の「より高い」または「より低い」レベルという表現は、対照として使用される患者と比較した場合の、核酸、例えばゲノムＤＮＡのメチル化の相対的な量の増加または減少を指す。
・本明細書で使用される場合、「ＣｐＧジヌクレオチド」、「ＣｐＧメチル化部位」または同等の用語は、ホスホジエステル結合によってグアニンに結合されたシトシンを表すと解釈されるものとする。ＣｐＧジヌクレオチドは、シトシン残基のメチル化に対する標的であり、コード核酸または非コード核酸内に存在し得る。非コード核酸は、イントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ゲノム遺伝子のプロモーター領域または遺伝子間領域を含むものと当技術分野で理解されている。
・「を含む／備える」という用語は、「を含む／備える」という単語に続くものを包含するが、それに限定されないことを意味する。したがって、「を含む／備える」という用語の使用は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもよく、または存在しなくてもよいことを示す。
・「のみからなる」という用語は、「のみからなる」という語句に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「のみからなる」という語句は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
・「β値」は、各シトシンのメチル化レベルを指し、プローブのメチル化された型の、メチル化されていない型に対する蛍光強度比として計算される。β値は、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光強度の組み合わせに従って、０（メチル化されていない）と１（完全にメチル化されている）の間の範囲にあった［Ｐａｎ Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ－ｖａｌｕｅ ａｎｄ Ｍ－ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０ Ｎｏｖ ３０；１１：５８７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－５８７．ＰＭＩＤ：２１１１８５５３ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０１２６７６ ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１１－５８７］。
・「ＦＤＲ」は、偽発見率を指す。ＦＤＲは、多重比較を補正するために多重仮説検定において使用される統計的アプローチである。ＦＤＲは、誤って有意に見える無作為な事象を補正するためにハイスループット実験において典型的に使用される。観察されたスコアが統計学的に有意であるか否かを決定するために帰無仮説を検定する場合、信頼の尺度ｐ値が計算され、信頼閾値αと比較される。ｋ個の仮説が信頼水準αと同時に検定される場合、偽陽性（すなわち、帰無仮説が実際には真である場合に帰無仮説を棄却すること）の発生の可能性は１－（１－α）ｋに等しく、これは実験において高い過誤率をもたらし得る。したがって、行われた検定の数に基づいて我々の統計的信頼度尺度を調整するために、ＦＤＲなどの複数の検定補正が必要とされる。
・「可変的にメチル化された」という表現は、異なる生物学的試料にわたる異なるＤＮＡメチル化状態の存在を指し、遺伝子転写制御に関与する可能性のある機能的領域と見なされる。生物学的試料は、同じ個体内の異なる細胞／組織、異なる時間での同じ細胞／組織、異なる個体からの細胞／組織、さらには同じ細胞内の異なる対立遺伝子であり得る。
・「超低カロリーケトン食療法」（ＶＬＣＫＤ）は、一般常識に属する用語であり、低脂肪消費、好ましくは８００ｋｃａｌ／日未満の消費を特徴とする［Ｍａｒｃｏ Ｃａｓｔｅｌｌａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０２０．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｃａｌｏｒｉｅ ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ ｄｉｅｔ（ＶＬＣＫＤ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ：Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ．２０２０ Ｍａｒ；２１（１）：５－１６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１１５４－０１９－０９５１４－ｙ］。
実施例１．材料および方法
実施例１．１．患者コホート
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｏｆ Ｖａｌｌａｄｏｌｉｄにおいて行われた６ヶ月の栄養学的介入研究からの患者の血液試料から、メチル化および遺伝子発現アッセイのためのＤＮＡおよびＲＮＡを単離した。患者は肥満症に対する処置を受けていた。さらに、健康なボランティアの群からの試料も分析した。組み入れ基準は、１８歳～６５歳の年齢、肥満度指数（ＢＭＩ）≧３０ｋｇ／ｍ２、過去３ヶ月にわたる安定した体重、減量への欲求および食事療法の取り組みに失敗した経歴であった。主な除外基準は、甲状腺の変化、真性糖尿病、他の内分泌障害または薬物によって誘導された肥満症および過去３ヶ月に何らかの能動的な減量プログラムに参加したことであった。さらに、以前に減量手術を受けたことがある患者、麻薬またはアルコールの乱用、重篤な鬱病または任意の他の精神疾患、重篤な肝不全、任意の種類の腎不全または痛風エピソード、腎結石症、新生物、心血管または脳血管疾患の前例、管理されていない高血圧、起立性低血圧および水電解質または心電図変化が報告されたまたは疑われる患者を除外した。妊娠している女性、授乳している女性または妊娠する予定がある女性および適切な避妊法を使用していない出産可能な女性も除外した。肥満症およびメタボリックシンドローム以外には、参加者は一般に健康な個体であった。これらの基準の下で、２１人の肥満症を有する患者および１２人の正常体重を有するボランティアを本研究に組み入れた。研究プロトコルはヘルシンキ宣言に従っており、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｄｅ Ｖａｌｌａｄｏｌｉｄ、Ｓｐａｉｎによって承認された（Ｃ．Ｉ：４０／１３、ＰＮＫ－ＤＨＡ２０１３－０１）。参加者は、研究に関連する任意の介入の前に書面によるインフォームドコンセントを交付した。参加者は、金銭的インセンティブを受けなかった。
実施例１．１．患者コホート
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｏｆ Ｖａｌｌａｄｏｌｉｄにおいて行われた６ヶ月の栄養学的介入研究からの患者の血液試料から、メチル化および遺伝子発現アッセイのためのＤＮＡおよびＲＮＡを単離した。患者は肥満症に対する処置を受けていた。さらに、健康なボランティアの群からの試料も分析した。組み入れ基準は、１８歳～６５歳の年齢、肥満度指数（ＢＭＩ）≧３０ｋｇ／ｍ２、過去３ヶ月にわたる安定した体重、減量への欲求および食事療法の取り組みに失敗した経歴であった。主な除外基準は、甲状腺の変化、真性糖尿病、他の内分泌障害または薬物によって誘導された肥満症および過去３ヶ月に何らかの能動的な減量プログラムに参加したことであった。さらに、以前に減量手術を受けたことがある患者、麻薬またはアルコールの乱用、重篤な鬱病または任意の他の精神疾患、重篤な肝不全、任意の種類の腎不全または痛風エピソード、腎結石症、新生物、心血管または脳血管疾患の前例、管理されていない高血圧、起立性低血圧および水電解質または心電図変化が報告されたまたは疑われる患者を除外した。妊娠している女性、授乳している女性または妊娠する予定がある女性および適切な避妊法を使用していない出産可能な女性も除外した。肥満症およびメタボリックシンドローム以外には、参加者は一般に健康な個体であった。これらの基準の下で、２１人の肥満症を有する患者および１２人の正常体重を有するボランティアを本研究に組み入れた。研究プロトコルはヘルシンキ宣言に従っており、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｄｅ Ｖａｌｌａｄｏｌｉｄ、Ｓｐａｉｎによって承認された（Ｃ．Ｉ：４０／１３、ＰＮＫ－ＤＨＡ２０１３－０１）。参加者は、研究に関連する任意の介入の前に書面によるインフォームドコンセントを交付した。参加者は、金銭的インセンティブを受けなかった。
実施例１．２．超低カロリーケトン食療法プロトコル
本研究に組み入れられた患者は、超低カロリーケトン食療法におけるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）補充の効果を調査する無作為化臨床試験から引き継がれた。この臨床試験は、患者がＶＬＣＫＤに従う１種の群および患者がＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡに従う他の群という２つの群で構成された。栄養学的介入は、商業的な減量プログラム（ＰＮＫ法（登録商標））に基づいた。手短に言えば、介入には、研究を実施する専門医師による評価、専門栄養士による判定および運動の推奨が含まれた。この方法は、牛乳、大豆、鳥の卵、グリーンピースおよび穀類から得られる高生物価のタンパク質調製物に基づく。各タンパク質調製物は、１５ｇのタンパク質、４ｇの炭水化物、３ｇの脂肪を含有し、９０～１００ｋｃａｌを提供した。ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ群は、５００ｍｇのＤＨＡを補充された。減量プログラムは５つの段階を有し、総炭水化物摂取量に関するＥＦＳＡの最新ガイドライン（２０１５）を遵守する。最初の３つの段階は、炭水化物（野菜から１日当たり５０ｇ未満）および脂質（１日当たりわずか１０ｇのオリーブ油）が少ないＶＬＣＫＤ（６００～８００ｋｃａｌ／日）からなる。患者が最低身体要件を確実に満たし、除脂肪量の喪失を防ぐために、高生物価のタンパク質の量は、理想体重１ｋｇ当たり０．８～１．２ｇの範囲であった。段階１では、患者は、高生物価のタンパク質調製物を１日に５回食べ、低い血糖インデックスを有する野菜を食べた。段階２では、昼食時または夕食時のいずれかに、タンパク質１食分の１種を天然タンパク質（例えば、肉または魚）で置き換えた。段階３では、生物学的タンパク質調製物の第２の１食分に代えて、低脂肪天然タンパク質の第２の１食分にした。これらのケトン体産生相全体を通して、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａなどのビタミンおよびミネラルならびにω－３脂肪酸のサプリメントが、国際的な推奨に従って提供された。これらの３つの段階は、患者が目標体重量を失うまで、理想的には８０％まで維持された。このため、ケトン体産生段階は、個体および減量目標に応じて、時間的に変動した。総ケトーシス状態は最長６０日間持続した。段階４または５のいずれかでは、減量した体重の量に基づいて、患者の担当医によってケトーシスが終了され、患者は低カロリー食（８００～１５００ｋｃａｌ／日）を開始した。この時点で、患者は、異なる食物群を徐々に組み込み、体重減少の長期的な維持を保証するために食事再教育のプログラムに参加した。維持食は、炭水化物、タンパク質および脂肪のバランスがとれた食事計画からなった。個体に応じて、摂取カロリーは、体重減少を維持し、健康的な生活様式を促進することを目標として、１５００～２０００ｋｃａｌ／日の範囲であった。この研究中、患者は、目標体重に達するまで、または最長４ヶ月の経過観察の間、方法の段階に従ったが、患者はその後数ヶ月間医学的管理下に留まった。患者は、順守および潜在的な副作用を評価するために、１５±２日ごとに研究チームを訪問した。完全な人体計測、身体組成および生化学的評価を４つの訪問において実施し、これらは、ケトーシスおよび体重減少の段階：訪問１（ベースライン）、訪問２（最大ケトーシス）、訪問３（低下したケトーシス）および訪問４（終点）を通した各患者の進展に従って決定された。ＤＮＡメチル化および遺伝子発現は、訪問１、２および４において行われた。
本研究に組み入れられた患者は、超低カロリーケトン食療法におけるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）補充の効果を調査する無作為化臨床試験から引き継がれた。この臨床試験は、患者がＶＬＣＫＤに従う１種の群および患者がＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡに従う他の群という２つの群で構成された。栄養学的介入は、商業的な減量プログラム（ＰＮＫ法（登録商標））に基づいた。手短に言えば、介入には、研究を実施する専門医師による評価、専門栄養士による判定および運動の推奨が含まれた。この方法は、牛乳、大豆、鳥の卵、グリーンピースおよび穀類から得られる高生物価のタンパク質調製物に基づく。各タンパク質調製物は、１５ｇのタンパク質、４ｇの炭水化物、３ｇの脂肪を含有し、９０～１００ｋｃａｌを提供した。ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ群は、５００ｍｇのＤＨＡを補充された。減量プログラムは５つの段階を有し、総炭水化物摂取量に関するＥＦＳＡの最新ガイドライン（２０１５）を遵守する。最初の３つの段階は、炭水化物（野菜から１日当たり５０ｇ未満）および脂質（１日当たりわずか１０ｇのオリーブ油）が少ないＶＬＣＫＤ（６００～８００ｋｃａｌ／日）からなる。患者が最低身体要件を確実に満たし、除脂肪量の喪失を防ぐために、高生物価のタンパク質の量は、理想体重１ｋｇ当たり０．８～１．２ｇの範囲であった。段階１では、患者は、高生物価のタンパク質調製物を１日に５回食べ、低い血糖インデックスを有する野菜を食べた。段階２では、昼食時または夕食時のいずれかに、タンパク質１食分の１種を天然タンパク質（例えば、肉または魚）で置き換えた。段階３では、生物学的タンパク質調製物の第２の１食分に代えて、低脂肪天然タンパク質の第２の１食分にした。これらのケトン体産生相全体を通して、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａなどのビタミンおよびミネラルならびにω－３脂肪酸のサプリメントが、国際的な推奨に従って提供された。これらの３つの段階は、患者が目標体重量を失うまで、理想的には８０％まで維持された。このため、ケトン体産生段階は、個体および減量目標に応じて、時間的に変動した。総ケトーシス状態は最長６０日間持続した。段階４または５のいずれかでは、減量した体重の量に基づいて、患者の担当医によってケトーシスが終了され、患者は低カロリー食（８００～１５００ｋｃａｌ／日）を開始した。この時点で、患者は、異なる食物群を徐々に組み込み、体重減少の長期的な維持を保証するために食事再教育のプログラムに参加した。維持食は、炭水化物、タンパク質および脂肪のバランスがとれた食事計画からなった。個体に応じて、摂取カロリーは、体重減少を維持し、健康的な生活様式を促進することを目標として、１５００～２０００ｋｃａｌ／日の範囲であった。この研究中、患者は、目標体重に達するまで、または最長４ヶ月の経過観察の間、方法の段階に従ったが、患者はその後数ヶ月間医学的管理下に留まった。患者は、順守および潜在的な副作用を評価するために、１５±２日ごとに研究チームを訪問した。完全な人体計測、身体組成および生化学的評価を４つの訪問において実施し、これらは、ケトーシスおよび体重減少の段階：訪問１（ベースライン）、訪問２（最大ケトーシス）、訪問３（低下したケトーシス）および訪問４（終点）を通した各患者の進展に従って決定された。ＤＮＡメチル化および遺伝子発現は、訪問１、２および４において行われた。
全ての訪問において、患者は、食事指導、個別的な支援的助言および正式な運動プログラムを用いて定期的に運動することの奨励を受けた。さらに、電話による励ましのプログラムが設けられ、あらゆる心配事に対処するために全ての参加者に電話番号が提供された。
実施例１．３．人体計測評価
全ての人体計測測定は、一晩の絶食（８～１０時間）後に、安静条件下で２度繰り返して実施され、十分に訓練された医療従事者によって行われた。各訪問時に、患者は、同一の較正された体重計（Ｓｅｃａ ２００ ｓｃａｌｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＥＰＩ Ｉｎｃ ＯＨ，ＵＳＡ）で秤量された。ＢＭＩは、ｋｇで表した体重をｍで表した身長の二乗で割ったものとして計算された（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長２（ｍ））。胴囲（ＷＣ）は、患者を立たせて息を吐かせながら、最後の肋骨と腸骨稜間の中間点上に配置された標準的な柔軟な非弾性メートルテープを使用して測定された。
全ての人体計測測定は、一晩の絶食（８～１０時間）後に、安静条件下で２度繰り返して実施され、十分に訓練された医療従事者によって行われた。各訪問時に、患者は、同一の較正された体重計（Ｓｅｃａ ２００ ｓｃａｌｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＥＰＩ Ｉｎｃ ＯＨ，ＵＳＡ）で秤量された。ＢＭＩは、ｋｇで表した体重をｍで表した身長の二乗で割ったものとして計算された（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長２（ｍ））。胴囲（ＷＣ）は、患者を立たせて息を吐かせながら、最後の肋骨と腸骨稜間の中間点上に配置された標準的な柔軟な非弾性メートルテープを使用して測定された。
実施例１．４．ケトン体のレベルの決定
ケトーシスは、携帯型メータ（ＧｌｕｃｏＭｅｎ ＬＸ Ｓｅｎｓｏｒ，Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ；感度＜０．２ｍｍｏｌ／ｌ）を使用して毛細管血中のケトン体、特にβ－ヒドロキシ－ブチラート（β－ＯＨＢ）を測定することによって決定された。人体計測評価と同様に、毛細血管のケトン血症の全ての決定は、８～１０時間の一晩の絶食後に行われた。これらの測定は、ＶＬＣＫＤ全体の間、各患者によって毎日実行され、対応する値は、順守を管理するために研究チームによって機械メモリを使用して再検討された。さらに、β－ＯＨＢレベルは、患者の担当医によって各訪問時に決定された。
ケトーシスは、携帯型メータ（ＧｌｕｃｏＭｅｎ ＬＸ Ｓｅｎｓｏｒ，Ａ．Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ；感度＜０．２ｍｍｏｌ／ｌ）を使用して毛細管血中のケトン体、特にβ－ヒドロキシ－ブチラート（β－ＯＨＢ）を測定することによって決定された。人体計測評価と同様に、毛細血管のケトン血症の全ての決定は、８～１０時間の一晩の絶食後に行われた。これらの測定は、ＶＬＣＫＤ全体の間、各患者によって毎日実行され、対応する値は、順守を管理するために研究チームによって機械メモリを使用して再検討された。さらに、β－ＯＨＢレベルは、患者の担当医によって各訪問時に決定された。
実施例１．５．ＤＮＡメチル化分析
ＤＮＡ調製および亜硫酸水素塩変換
わずかな修正を加えて製造者の説明書に従って、標準的なフェノール－クロロホルム／プロテイナーゼ－ｋプロトコルを使用して新鮮凍結（ＦＦ）血液試料からのＤＮＡを単離した。ＭａｓｔｕｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを白血球から単離した。４５℃で１時間、単離されたＤＮＡをＲＮａｓｅ Ａで、処理した。蛍光定量法（Ｑｕａｎ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全てのＤＮＡ試料を定量し、２６０／２８０および２６０／２３０比の測定値を決定するためにＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して純度について評価した。１．３％アガロースゲル中での電気泳動によって、ＦＦ ＤＮＡの完全性を確認した。製造者の説明書に従って、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するＥＺ ＤＮＡメチル化キットＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＤＮＡ（５００ｎｇ）を亜硫酸水素塩に変換した。
ＤＮＡ調製および亜硫酸水素塩変換
わずかな修正を加えて製造者の説明書に従って、標準的なフェノール－クロロホルム／プロテイナーゼ－ｋプロトコルを使用して新鮮凍結（ＦＦ）血液試料からのＤＮＡを単離した。ＭａｓｔｕｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用してゲノムＤＮＡを白血球から単離した。４５℃で１時間、単離されたＤＮＡをＲＮａｓｅ Ａで、処理した。蛍光定量法（Ｑｕａｎ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全てのＤＮＡ試料を定量し、２６０／２８０および２６０／２３０比の測定値を決定するためにＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して純度について評価した。１．３％アガロースゲル中での電気泳動によって、ＦＦ ＤＮＡの完全性を確認した。製造者の説明書に従って、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するＥＺ ＤＮＡメチル化キットＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＤＮＡ（５００ｎｇ）を亜硫酸水素塩に変換した。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＤメチル化プロトコルに従って、亜硫酸水素塩変換（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＥＺ－９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ）およびＩｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）へのハイブリダイゼーションのために、臨床試験のＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ群に含まれる患者（発見コホート；ｎ＝１０人の患者、３つの対をなす試料／患者）の血液白血球から得られた高品質のＤＮＡ試料（５００ｎｇ）を選択した。ＤＮＡ品質チェック、亜硫酸水素塩修飾、ハイブリダイゼーション、データ正規化、統計的フィルタリングおよび値の計算は、以前に記載したように行った。次いで、ＢｅａｄＣｈｉｐで全ゲノム増幅およびハイブリダイゼーションを行った後、一塩基伸長およびＨｉＳｃａｎ ＳＱモジュール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での分析を行って、シトシンメチル化状態を評価した。ＣＧアイランド（ＣＧＩ）の注釈付けは、以下の分類を使用した：１）ショア、ＣＧＩに隣接する２ｋｂ配列のそれぞれに対して、２）シェルフ、ショアに隣接する２ｋｂ配列のそれぞれに対して；３）オープンシー、前記配列のいずれかまたはＣＧＩに含まれないＤＮＡに対して。転写開始部位２００および転写開始部位１５００は、それぞれ、転写開始部位から２００ｂｐまたは１５００ｂｐのいずれかの領域を示す。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＤメチル化プロトコルに従って、亜硫酸水素塩変換（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＥＺ－９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ）およびＩｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）へのハイブリダイゼーションのために、臨床試験のＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ群に含まれる患者（発見コホート；ｎ＝１０人の患者、３つの対をなす試料／患者）の血液白血球から得られた高品質のＤＮＡ試料（５００ｎｇ）を選択した。ＤＮＡ品質チェック、亜硫酸水素塩修飾、ハイブリダイゼーション、データ正規化、統計的フィルタリングおよび値の計算は、以前に記載したように行った。次いで、ＢｅａｄＣｈｉｐで全ゲノム増幅およびハイブリダイゼーションを行った後、一塩基伸長およびＨｉＳｃａｎ ＳＱモジュール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での分析を行って、シトシンメチル化状態を評価した。ＣＧアイランド（ＣＧＩ）の注釈付けは、以下の分類を使用した：１）ショア、ＣＧＩに隣接する２ｋｂ配列のそれぞれに対して、２）シェルフ、ショアに隣接する２ｋｂ配列のそれぞれに対して；３）オープンシー、前記配列のいずれかまたはＣＧＩに含まれないＤＮＡに対して。転写開始部位２００および転写開始部位１５００は、それぞれ、転写開始部位から２００ｂｐまたは１５００ｂｐのいずれかの領域を示す。
パイロシーケンシング分析
パイロシーケンシングを使用して、１８人の患者（検証コホート：（発見コホートに由来するｎ＝７および患者の独立コホートからのｎ＝１１；３つの対をなす試料／患者）において、選択されたマーカーを評価した。検証コホートにおいて分析されたＤＮＡ試料は、臨床試験の２つの群に含まれる患者に由来し、統計解析のために合わせられた（ＶＬＣＫＤ：ｎ＝１０；ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ：ｎ＝８）。この分析において使用されたプライマー配列は、ＱｉａｇｅｎのＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ２．０ソフトウェアを使用して、ＣｐＧ非含有部位にハイブリダイズしてメチル化非依存性増幅が確実に起こるように設計された。ＭａｓｔｕｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して、ゲノムＤＮＡをＦＦ血液白血球から単離した。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＥＺ－９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ）を使用してＤＮＡメチル化分析を行った後、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ２４ Ｓｙｓｔｅｍバージョン２．０．７（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲベースのパイロシーケンシングに基づく高度に定量的な分析を行った。メチル化レベルは、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの合計に対するメチル化されたシトシンのパーセンテージとして表された。亜硫酸水素塩変換を検証するために、非ＣｐＧシトシン残基を組み込まれた対照として使用した。値は、全ての部位についての平均として表される。本発明者らはまた、各実行において対照としてヒト非メチル化およびメチル化ＤＮＡセット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含めた。アッセイ間精度（％ＣＶ）は＜２．５％であり、アッセイ内精度（％ＣＶ）は＜１．０％であった。
パイロシーケンシングを使用して、１８人の患者（検証コホート：（発見コホートに由来するｎ＝７および患者の独立コホートからのｎ＝１１；３つの対をなす試料／患者）において、選択されたマーカーを評価した。検証コホートにおいて分析されたＤＮＡ試料は、臨床試験の２つの群に含まれる患者に由来し、統計解析のために合わせられた（ＶＬＣＫＤ：ｎ＝１０；ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡ：ｎ＝８）。この分析において使用されたプライマー配列は、ＱｉａｇｅｎのＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ２．０ソフトウェアを使用して、ＣｐＧ非含有部位にハイブリダイズしてメチル化非依存性増幅が確実に起こるように設計された。ＭａｓｔｕｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して、ゲノムＤＮＡをＦＦ血液白血球から単離した。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＥＺ－９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ）を使用してＤＮＡメチル化分析を行った後、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ２４ Ｓｙｓｔｅｍバージョン２．０．７（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲベースのパイロシーケンシングに基づく高度に定量的な分析を行った。メチル化レベルは、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの合計に対するメチル化されたシトシンのパーセンテージとして表された。亜硫酸水素塩変換を検証するために、非ＣｐＧシトシン残基を組み込まれた対照として使用した。値は、全ての部位についての平均として表される。本発明者らはまた、各実行において対照としてヒト非メチル化およびメチル化ＤＮＡセット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含めた。アッセイ間精度（％ＣＶ）は＜２．５％であり、アッセイ内精度（％ＣＶ）は＜１．０％であった。
実施例１．６．ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現アッセイ
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用して、血液白血球からのＲＮＡ（ｎ＝１８人の患者）を抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡ濃度を測定した。抽出された全ＲＮＡから、鋳型としてＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、２μｇをＤＮａｓｅ処理して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳｔｅｐ ＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。全ての実験は２つ組で行われ、遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルに対して正規化された。遺伝子発現の倍数変化は、製造者のガイドライン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って２－ΔΔＣｔ相対定量法を用いて計算され、データは幾何平均（ＳＥＭ）として報告される。ｑＲＴ－ＰＣＲ実験は、ＭＩＱＥ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ガイドライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｄｍｌ．ｏｒｇ／ｍｉｑｅ）に準拠して行われた。
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用して、血液白血球からのＲＮＡ（ｎ＝１８人の患者）を抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡ濃度を測定した。抽出された全ＲＮＡから、鋳型としてＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、２μｇをＤＮａｓｅ処理して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳｔｅｐ ＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。全ての実験は２つ組で行われ、遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルに対して正規化された。遺伝子発現の倍数変化は、製造者のガイドライン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って２－ΔΔＣｔ相対定量法を用いて計算され、データは幾何平均（ＳＥＭ）として報告される。ｑＲＴ－ＰＣＲ実験は、ＭＩＱＥ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ガイドライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｄｍｌ．ｏｒｇ／ｍｉｑｅ）に準拠して行われた。
実施例１．７．統計解析
肥満症の分野におけるエピゲノムワイド分析の公表された値を考慮に入れてメチル化レベルについての差を検出するために、本研究の標本サイズを計算した。２つの独立したコホートにおいて介入の差を調べた。マイクロアレイに基づくＤＮＡメチル化分析を発見コホート（ｎ＝１０人の患者；３つの対をなす試料／患者）において実施し、次いで、同定された遺伝子を患者の独立したコホート（検証コホート；ｎ＝１８人の患者；３つの対をなす試料／患者）において検証した。最後に、本研究に組み入れられた患者のグローバルコホート（ｎ＝２８）において、同定されたＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化レベルと人体計測的または生化学的パラメータとの間の関連を評価した。各シトシンのメチル化レベルはβ値で表され、β値は、プローブのメチル化された型の、メチル化されていない型に対する蛍光強度比として計算された。β値は、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光強度の組み合わせに従い、０（メチル化されていない）と１（完全にメチル化されている）の間の範囲であった。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェア（Ｖ２０１０．３）を使用して２色チャネル間で試料を正規化するために、カラーバランス調整および正規化を行った。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ上に存在する異なる内部対照を使用してデータを正規化する。このソフトウェアはまた、内部バックグラウンドプローブに応じてデータを正規化した。検出されたｐ値＞０．０１を有するβ値は、最小強度および閾値を下回ると考えられ、その結果、これらのＣｐＧはさらなる分析から除外された。さらに、問い合わせプローブの３’末端から１０ｂｐに一塩基多型（ＳＮＰ）を含有するプローブを除外した。栄養学的介入によるＤＭＣｐＧの一貫したパターンを特定するために、Ｂスプライン近似を使用して線形モデルをフィッティングした。３つの線形モデルがフィッティングされた：モデル１は、ＶＬＣＫＤの一般的な効果を評価するために栄養学的介入の３つの点を含めることによってフィッティングされた；モデル２は、ケトーシスおよび体重減少の効果を評価するためにベースラインおよび最大ケトーシスを含む；モデル３は、ケトーシスなしの、体重減少のみの効果を評価するために最大ケトーシスおよび終点におけるメチル化レベルを含む。ベンジャミーニおよびホッホベルクの偽発見率（ＦＤＲ）手順を使用して、多重比較のためにＰ値を調整し、ＦＤＲ＜０．１０の場合に結果を統計学的に有意と考えた。さらに、本発明者らは、±０．０２の最小β値変化を有する訪問間の平均差に基づいて、有意な部位に対する閾値を適用した。ヒートマップ関数を使用して、有意なＣｐＧのユークリッドクラスタ分析を行った。一変量ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析によって、栄養学的介入訪問間で全体的なメチル化レベルを比較した。上記の統計解析は全て、Ｒソフトウェア（バージョン３．２．０）を使用して行った。生物学的プロセスにおける濃縮を推定するために、ジーンオントロジー（ＧＯ）によって定義された生物学的プロセスに対してＧＯｓｔａｔｓパッケージを使用して超幾何検定を実施した。この解析は、全ゲノムに対して１つのセット（すなわち、同定された遺伝子のリスト）におけるＧＯタームの有意な過剰提示を検出した。調整されたｐ値＜０．０５を有するＧＯタームを有意と考えた。Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）用のＳＰＳＳバージョン２１．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて、可変的にメチル化されたＣｐＧのゲノム分布を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ上の全ての分析された部位からのＣｐＧの分布と比較した。ＣｐＧの過剰提示または過小提示を決定するためにカイ二乗検定を使用してＰ値を計算した。人体計測パラメータまたは生化学パラメータとＤＮＡメチル化レベル（β値）との間の潜在的関連性は、スピアマン係数検定を使用して評価された。介入の時間経過中および栄養学的介入訪問間のＤＮＡメチル化レベルおよび同定された遺伝子の発現の差は、それぞれ、ノンパラメトリック検定、クラスカル・ウォリスおよびマン・ホイットニーＵによって判定された。Ｐ≦０．０５を統計学的に有意と考えた。
肥満症の分野におけるエピゲノムワイド分析の公表された値を考慮に入れてメチル化レベルについての差を検出するために、本研究の標本サイズを計算した。２つの独立したコホートにおいて介入の差を調べた。マイクロアレイに基づくＤＮＡメチル化分析を発見コホート（ｎ＝１０人の患者；３つの対をなす試料／患者）において実施し、次いで、同定された遺伝子を患者の独立したコホート（検証コホート；ｎ＝１８人の患者；３つの対をなす試料／患者）において検証した。最後に、本研究に組み入れられた患者のグローバルコホート（ｎ＝２８）において、同定されたＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化レベルと人体計測的または生化学的パラメータとの間の関連を評価した。各シトシンのメチル化レベルはβ値で表され、β値は、プローブのメチル化された型の、メチル化されていない型に対する蛍光強度比として計算された。β値は、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光強度の組み合わせに従い、０（メチル化されていない）と１（完全にメチル化されている）の間の範囲であった。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェア（Ｖ２０１０．３）を使用して２色チャネル間で試料を正規化するために、カラーバランス調整および正規化を行った。Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｔｕｄｉｏは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ上に存在する異なる内部対照を使用してデータを正規化する。このソフトウェアはまた、内部バックグラウンドプローブに応じてデータを正規化した。検出されたｐ値＞０．０１を有するβ値は、最小強度および閾値を下回ると考えられ、その結果、これらのＣｐＧはさらなる分析から除外された。さらに、問い合わせプローブの３’末端から１０ｂｐに一塩基多型（ＳＮＰ）を含有するプローブを除外した。栄養学的介入によるＤＭＣｐＧの一貫したパターンを特定するために、Ｂスプライン近似を使用して線形モデルをフィッティングした。３つの線形モデルがフィッティングされた：モデル１は、ＶＬＣＫＤの一般的な効果を評価するために栄養学的介入の３つの点を含めることによってフィッティングされた；モデル２は、ケトーシスおよび体重減少の効果を評価するためにベースラインおよび最大ケトーシスを含む；モデル３は、ケトーシスなしの、体重減少のみの効果を評価するために最大ケトーシスおよび終点におけるメチル化レベルを含む。ベンジャミーニおよびホッホベルクの偽発見率（ＦＤＲ）手順を使用して、多重比較のためにＰ値を調整し、ＦＤＲ＜０．１０の場合に結果を統計学的に有意と考えた。さらに、本発明者らは、±０．０２の最小β値変化を有する訪問間の平均差に基づいて、有意な部位に対する閾値を適用した。ヒートマップ関数を使用して、有意なＣｐＧのユークリッドクラスタ分析を行った。一変量ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ事後分析によって、栄養学的介入訪問間で全体的なメチル化レベルを比較した。上記の統計解析は全て、Ｒソフトウェア（バージョン３．２．０）を使用して行った。生物学的プロセスにおける濃縮を推定するために、ジーンオントロジー（ＧＯ）によって定義された生物学的プロセスに対してＧＯｓｔａｔｓパッケージを使用して超幾何検定を実施した。この解析は、全ゲノムに対して１つのセット（すなわち、同定された遺伝子のリスト）におけるＧＯタームの有意な過剰提示を検出した。調整されたｐ値＜０．０５を有するＧＯタームを有意と考えた。Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）用のＳＰＳＳバージョン２１．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて、可変的にメチル化されたＣｐＧのゲノム分布を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ上の全ての分析された部位からのＣｐＧの分布と比較した。ＣｐＧの過剰提示または過小提示を決定するためにカイ二乗検定を使用してＰ値を計算した。人体計測パラメータまたは生化学パラメータとＤＮＡメチル化レベル（β値）との間の潜在的関連性は、スピアマン係数検定を使用して評価された。介入の時間経過中および栄養学的介入訪問間のＤＮＡメチル化レベルおよび同定された遺伝子の発現の差は、それぞれ、ノンパラメトリック検定、クラスカル・ウォリスおよびマン・ホイットニーＵによって判定された。Ｐ≦０．０５を統計学的に有意と考えた。
実施例２．結果
実施例２．１．患者の特徴
ＶＬＣＫＤに基づく栄養学的介入に従った合計２１人の患者からの試料を、正常体重を有する１２人の健康なボランティアからの試料と比較し、この研究において評価した。本発明者らは、まず、発見コホート（ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡに従った、肥満症を有する参加者ｎ＝１０（ｎ＝５の女性）および正常体重を有するボランティアｎ＝１２（６人の女性））を評価した。ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡまたはＶＬＣＫＤ－ＤＨＡに従った、肥満症を有する１１人の患者（７人の女性）で構成される拡張検証コホートも分析した。年齢、性別、身長、体重、ＢＭＩ、胴囲、ケトーシスまたは体重減少処置に対する応答において、いずれのコホート間でも統計学的に有意な差は観察されなかった（表１）。統計学的に有意な差は、肥満症を有する患者と正常体重を有する対象との間で、体重、ＢＭＩおよび胴囲においてのみ検出された（表１）。全ての患者は、ＢＭＩ（２１．９±５．１％）および胴囲（１９．３±４．４％）の低下とともに、栄養学的介入後に体重が減少した（２１．８±４．９％）。
実施例２．１．患者の特徴
ＶＬＣＫＤに基づく栄養学的介入に従った合計２１人の患者からの試料を、正常体重を有する１２人の健康なボランティアからの試料と比較し、この研究において評価した。本発明者らは、まず、発見コホート（ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡに従った、肥満症を有する参加者ｎ＝１０（ｎ＝５の女性）および正常体重を有するボランティアｎ＝１２（６人の女性））を評価した。ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡまたはＶＬＣＫＤ－ＤＨＡに従った、肥満症を有する１１人の患者（７人の女性）で構成される拡張検証コホートも分析した。年齢、性別、身長、体重、ＢＭＩ、胴囲、ケトーシスまたは体重減少処置に対する応答において、いずれのコホート間でも統計学的に有意な差は観察されなかった（表１）。統計学的に有意な差は、肥満症を有する患者と正常体重を有する対象との間で、体重、ＢＭＩおよび胴囲においてのみ検出された（表１）。全ての患者は、ＢＭＩ（２１．９±５．１％）および胴囲（１９．３±４．４％）の低下とともに、栄養学的介入後に体重が減少した（２１．８±４．９％）。
実施例２．２．全体的なＶＬＣＫＤ介入中のＤＮＡメチル化の変化
約８５万のＣｐＧを含む血液白血球のＤＮＡメチル化プロファイルを、ＶＬＣＫＤ介入後に分析した。この分析により、合計７３９，２２２の有効なＣｐＧから、９８８のＣｐＧ部位において統計学的に有意な差（カットオフ点Δ≧０．０２；ＦＤＲ≦０．１０）が明らかになった（表Ｓ２）。可変的にメチル化されたＣｐＧは、主に、総ＤＭＣｐＧ中（図１Ａ）およびプロモーターおよびアイランドまたはショアに位置するＤＭＣｐＧ中（図１Ｂ）の両方において、栄養学的介入後に生じるＣｐＧ低メチル化方向への変化として特徴付けられた。全体的な低メチル化というこの結果は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）１ならびにデノボメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂの発現の下方制御と相関していた（図１Ｃ）。同定されたＣｐＧ部位は７８６のユニークな遺伝子にマッピングされ、本発明者らは階層的クラスタアプローチを使用して、栄養学的介入訪問に従って試料を分離することができた（図１Ｄ）。栄養学的介入後に可変的にメチル化された９８８のＣｐＧ部位のメチル化レベルは、正常体重を有する対象からの試料において観察されたメチル化レベルに類似するように変更されたことに留意すべきである（図１Ｃ）。２つより多いＣｐＧによって表される遺伝子のうち、ベースラインに対して最も高い差を有する２０個のＤＭＣｐＧが表２に表されている。機能的分布に関しては（図２）、ＤＮＡメチル化の差は主にオープンシー領域において観察され（図２Ａ）、ＤＭＣｐＧ部位の４３．２％がプロモーター領域中に位置し、ＤＭＣｐＧの大部分が本体内にある（図２Ｂ）。さらに、ＤＭＣｐＧは、分析された全てのＣｐＧと比較すると、主に２番、９番、１６番、１７番、１９番および２２番染色体中に見出された（図２Ｃ）。９８８のＤＭＣｐＧのうち、本発明者らは、栄養学的介入後に、８８６（８９．７％）が減少したＤＮＡメチル化のレベルを有し、１０２（１０．３２％）が増加したＤＮＡメチル化のレベルを有することを見出した。さらに、ベースラインに対してメチル化を失ったＤＭＣｐＧは、主にオープンシー（図２Ｄ）および本体（図２Ｅ）中に位置していた。対照的に、栄養学的介入後にメチル化を獲得したＤＭＣｐＧは、ほとんどがプロモーター中（ＴＳＳ２００および第１のエクソン）（図２Ｄ）およびＣｐＧアイランド中（図２Ｅ）に位置していた。染色体分布に関しては、栄養学的処置後に減少したメチル化レベルを有するＤＭＣｐＧは、１番、４番、６番、７番、８番、９番、１４番および１６番染色体上に見出されたのに対して、増加したメチル化レベルを有するＤＭＣｐＧは、主に３番、５番、１０番、１１番、１２番、１７番、２１番および２２番染色体中に見出された（図２Ｆ）。
約８５万のＣｐＧを含む血液白血球のＤＮＡメチル化プロファイルを、ＶＬＣＫＤ介入後に分析した。この分析により、合計７３９，２２２の有効なＣｐＧから、９８８のＣｐＧ部位において統計学的に有意な差（カットオフ点Δ≧０．０２；ＦＤＲ≦０．１０）が明らかになった（表Ｓ２）。可変的にメチル化されたＣｐＧは、主に、総ＤＭＣｐＧ中（図１Ａ）およびプロモーターおよびアイランドまたはショアに位置するＤＭＣｐＧ中（図１Ｂ）の両方において、栄養学的介入後に生じるＣｐＧ低メチル化方向への変化として特徴付けられた。全体的な低メチル化というこの結果は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）１ならびにデノボメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂの発現の下方制御と相関していた（図１Ｃ）。同定されたＣｐＧ部位は７８６のユニークな遺伝子にマッピングされ、本発明者らは階層的クラスタアプローチを使用して、栄養学的介入訪問に従って試料を分離することができた（図１Ｄ）。栄養学的介入後に可変的にメチル化された９８８のＣｐＧ部位のメチル化レベルは、正常体重を有する対象からの試料において観察されたメチル化レベルに類似するように変更されたことに留意すべきである（図１Ｃ）。２つより多いＣｐＧによって表される遺伝子のうち、ベースラインに対して最も高い差を有する２０個のＤＭＣｐＧが表２に表されている。機能的分布に関しては（図２）、ＤＮＡメチル化の差は主にオープンシー領域において観察され（図２Ａ）、ＤＭＣｐＧ部位の４３．２％がプロモーター領域中に位置し、ＤＭＣｐＧの大部分が本体内にある（図２Ｂ）。さらに、ＤＭＣｐＧは、分析された全てのＣｐＧと比較すると、主に２番、９番、１６番、１７番、１９番および２２番染色体中に見出された（図２Ｃ）。９８８のＤＭＣｐＧのうち、本発明者らは、栄養学的介入後に、８８６（８９．７％）が減少したＤＮＡメチル化のレベルを有し、１０２（１０．３２％）が増加したＤＮＡメチル化のレベルを有することを見出した。さらに、ベースラインに対してメチル化を失ったＤＭＣｐＧは、主にオープンシー（図２Ｄ）および本体（図２Ｅ）中に位置していた。対照的に、栄養学的介入後にメチル化を獲得したＤＭＣｐＧは、ほとんどがプロモーター中（ＴＳＳ２００および第１のエクソン）（図２Ｄ）およびＣｐＧアイランド中（図２Ｅ）に位置していた。染色体分布に関しては、栄養学的処置後に減少したメチル化レベルを有するＤＭＣｐＧは、１番、４番、６番、７番、８番、９番、１４番および１６番染色体上に見出されたのに対して、増加したメチル化レベルを有するＤＭＣｐＧは、主に３番、５番、１０番、１１番、１２番、１７番、２１番および２２番染色体中に見出された（図２Ｆ）。
実施例２．３．食事介入関連ＤＭＣｐＧ部位および関連遺伝子の生物学的意義
興味深いことに、ほとんどの可変的にメチル化された遺伝子は、ＳＴＲＩＮＧ分析によると、タンパク質相互作用が有意に濃縮されたネットワークに属していた（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。ある分子機能または生物学的プロセスが、ＶＬＣＫＤ介入を通じて発見された９８８のＤＭＣｐＧに関連する７８６の遺伝子内で有意に濃縮されているか否かを試験するために、ＧＯ解析を行った（図３Ｂ）。統計学的有意性（ＦＤＲ＜０．０５）を示した機能的プロセスのカテゴリーの中で、本発明者らは、転写の制御、シグナル伝達、細胞分化、増殖およびアポトーシス、代謝プロセス、低酸素に対する応答、タンパク質プロセシング、筋肉器官および骨格系の発達、神経系の発達および軸索誘導に関連するプロセスを見出した（図３Ｂ）。これらの中で、本発明者らは、インスリンシグナル伝達、タンパク質消化および吸収、アディポサイトカインシグナル伝達および筋肉発達などの肥満症生理病理学の分野における関連性のある経路に焦点を当てた（図４Ａ～Ｄ）。生物学的関連性を調べるために、ＣｐＧアイランド／ショアにおけるプロモーター領域（ＴＳＳ１５００、ＴＳＳ２００、５’ＵＴＲおよび第１のエクソン）を代表するＣｐＧ部位を選択した。この選択により、１５０のユニークな遺伝子を代表する１４１個のＣｐＧが得られた。このフィルタに基づいて、本発明者らは、そのメチル化がＶＬＣＫＤ応答に関連する遺伝子標的であり得るＣｐＧ部位を同定した。これらのうち、最も代表的な遺伝子はＺＮＦ３３１であり、ベースラインに対して最も高い差を有するプロモーターおよびアイランド中に位置する２つのＣｐＧ部位によって表された。さらに、代謝経路および肥満症病態形成におけるその生物学的関連性のために、ならびに白血球におけるこの遺伝子のメチル化レベルが、肥満症における機能不全の脂肪組織のメチル化レベルを反映するエピシグネチャとして以前に提案されたので、ＤＭＣｐＧ部位の中からＦＧＦＲＬ１も選択された。
興味深いことに、ほとんどの可変的にメチル化された遺伝子は、ＳＴＲＩＮＧ分析によると、タンパク質相互作用が有意に濃縮されたネットワークに属していた（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。ある分子機能または生物学的プロセスが、ＶＬＣＫＤ介入を通じて発見された９８８のＤＭＣｐＧに関連する７８６の遺伝子内で有意に濃縮されているか否かを試験するために、ＧＯ解析を行った（図３Ｂ）。統計学的有意性（ＦＤＲ＜０．０５）を示した機能的プロセスのカテゴリーの中で、本発明者らは、転写の制御、シグナル伝達、細胞分化、増殖およびアポトーシス、代謝プロセス、低酸素に対する応答、タンパク質プロセシング、筋肉器官および骨格系の発達、神経系の発達および軸索誘導に関連するプロセスを見出した（図３Ｂ）。これらの中で、本発明者らは、インスリンシグナル伝達、タンパク質消化および吸収、アディポサイトカインシグナル伝達および筋肉発達などの肥満症生理病理学の分野における関連性のある経路に焦点を当てた（図４Ａ～Ｄ）。生物学的関連性を調べるために、ＣｐＧアイランド／ショアにおけるプロモーター領域（ＴＳＳ１５００、ＴＳＳ２００、５’ＵＴＲおよび第１のエクソン）を代表するＣｐＧ部位を選択した。この選択により、１５０のユニークな遺伝子を代表する１４１個のＣｐＧが得られた。このフィルタに基づいて、本発明者らは、そのメチル化がＶＬＣＫＤ応答に関連する遺伝子標的であり得るＣｐＧ部位を同定した。これらのうち、最も代表的な遺伝子はＺＮＦ３３１であり、ベースラインに対して最も高い差を有するプロモーターおよびアイランド中に位置する２つのＣｐＧ部位によって表された。さらに、代謝経路および肥満症病態形成におけるその生物学的関連性のために、ならびに白血球におけるこの遺伝子のメチル化レベルが、肥満症における機能不全の脂肪組織のメチル化レベルを反映するエピシグネチャとして以前に提案されたので、ＤＭＣｐＧ部位の中からＦＧＦＲＬ１も選択された。
実施例２．４．食事誘発性ケトーシスの影響に関連するＤＮＡメチル化の変化
ベースライン（０日目）を最大ケトーシス（３０日目）と比較する分析により、１３６５のＤＭＣｐＧが得られた。分析された全てのＣｐＧに関して、これらのＣｐＧは主にオープンシー（図５Ａ）および本体（図５Ｂ）ならびに１番、１０番、１１番、１７番、１９番および２２番染色体（図５Ｃ）中に見出された。メチル化を獲得したＤＭＣｐＧは、アイランドおよびプロモーター中ならびに１番、２番、３番、４番および７番染色体中に見出された。メチル化を失ったＤＭＣｐＧは、オープンシーおよび本体中ならびに９番、１０番、１１番、１２番、１７番、２１番、２２番染色体中に見出された（図５Ｄ～５Ｆ）。メチル化プロファイルに対するケトーシスの特異的効果を単離する目的で、さらなる分析を行った。ＤＭＣｐＧベースライン－最大ケトーシス＝１３６５、ＤＭＣｐＧベースライン－終点＝４０５およびＤＭＣｐＧ最大ケトーシス－終点＝２１を含めることによってベン図を作成した。これらの条件を使用して、本発明者らは、誘導された体重減少自体によってそのメチル化が影響を受けた２８０のＣｐＧを同定し（表Ｓ４）、１２３９のＣｐＧをＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧとして同定した（図６Ａ）。これらのＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧは９６６のアノテーションが付与された遺伝子に対応し、これらのうち１６１はプロモーターおよびアイランドまたはショア中に位置する１３７のＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧによって表された（表Ｓ３）。統計学的有意性（ＦＤＲ＜０．０５）を示した機能的プロセスのカテゴリーの中で、本発明者らは、転写の制御、シグナル伝達、細胞接着、細胞分化、増殖およびアポトーシスならびに神経系の発達および軸索誘導に関連するプロセスを見出した。さらに、これらのケトーシスに関連する可変的にメチル化された遺伝子は、接着斑、インスリンおよびアディポサイトカインシグナル伝達経路、ＭＡＰＫおよびＰ５３シグナル伝達経路ならびに癌およびＩＩ型糖尿病関連経路に関与する経路に属していた（図６Ｂ）。肥満症の生理病理学に関連する全体的な経路。これらの中で、本発明者らは、インスリンシグナル伝達、タンパク質消化および吸収、アディポサイトカインシグナル伝達および筋肉発達などの肥満症生理病理学の分野における関連性のある経路に焦点を当てた。ＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシスに関連するＤＮＡメチル化の潜在的に新規なシグネチャを同定するために、ＣｐＧアイランドおよびショア内に位置する２つより多いＣｐＧ部位を有し、β値の差が≧｜２｜％である遺伝子を選択した。これらの基準に基づいて、１２の遺伝子が同定され、表３に列挙されている。プロモーター領域によってリストをさらにフィルタリングすると、遺伝子ＣＢＦＡ２Ｔ３、Ｃ３ｏｒｆ３８、ＪＳＲＰ１およびＬＲＦＮ４は、プロモーターおよびアイランド／ショア中に位置する少なくとも１つのＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧを示した。
ベースライン（０日目）を最大ケトーシス（３０日目）と比較する分析により、１３６５のＤＭＣｐＧが得られた。分析された全てのＣｐＧに関して、これらのＣｐＧは主にオープンシー（図５Ａ）および本体（図５Ｂ）ならびに１番、１０番、１１番、１７番、１９番および２２番染色体（図５Ｃ）中に見出された。メチル化を獲得したＤＭＣｐＧは、アイランドおよびプロモーター中ならびに１番、２番、３番、４番および７番染色体中に見出された。メチル化を失ったＤＭＣｐＧは、オープンシーおよび本体中ならびに９番、１０番、１１番、１２番、１７番、２１番、２２番染色体中に見出された（図５Ｄ～５Ｆ）。メチル化プロファイルに対するケトーシスの特異的効果を単離する目的で、さらなる分析を行った。ＤＭＣｐＧベースライン－最大ケトーシス＝１３６５、ＤＭＣｐＧベースライン－終点＝４０５およびＤＭＣｐＧ最大ケトーシス－終点＝２１を含めることによってベン図を作成した。これらの条件を使用して、本発明者らは、誘導された体重減少自体によってそのメチル化が影響を受けた２８０のＣｐＧを同定し（表Ｓ４）、１２３９のＣｐＧをＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧとして同定した（図６Ａ）。これらのＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧは９６６のアノテーションが付与された遺伝子に対応し、これらのうち１６１はプロモーターおよびアイランドまたはショア中に位置する１３７のＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧによって表された（表Ｓ３）。統計学的有意性（ＦＤＲ＜０．０５）を示した機能的プロセスのカテゴリーの中で、本発明者らは、転写の制御、シグナル伝達、細胞接着、細胞分化、増殖およびアポトーシスならびに神経系の発達および軸索誘導に関連するプロセスを見出した。さらに、これらのケトーシスに関連する可変的にメチル化された遺伝子は、接着斑、インスリンおよびアディポサイトカインシグナル伝達経路、ＭＡＰＫおよびＰ５３シグナル伝達経路ならびに癌およびＩＩ型糖尿病関連経路に関与する経路に属していた（図６Ｂ）。肥満症の生理病理学に関連する全体的な経路。これらの中で、本発明者らは、インスリンシグナル伝達、タンパク質消化および吸収、アディポサイトカインシグナル伝達および筋肉発達などの肥満症生理病理学の分野における関連性のある経路に焦点を当てた。ＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシスに関連するＤＮＡメチル化の潜在的に新規なシグネチャを同定するために、ＣｐＧアイランドおよびショア内に位置する２つより多いＣｐＧ部位を有し、β値の差が≧｜２｜％である遺伝子を選択した。これらの基準に基づいて、１２の遺伝子が同定され、表３に列挙されている。プロモーター領域によってリストをさらにフィルタリングすると、遺伝子ＣＢＦＡ２Ｔ３、Ｃ３ｏｒｆ３８、ＪＳＲＰ１およびＬＲＦＮ４は、プロモーターおよびアイランド／ショア中に位置する少なくとも１つのＶＬＣＫＤ誘導性ケトーシス関連ＤＭＣｐＧを示した。
実施例２．５．代表コホートにおける候補遺伝子の検証
本発明者らは、病院内の患者の研究に対して最も実行可能な技術であるパイロシーケンシングを使用して、白血球由来の試料の独立コホート（検証コホート；ｎ＝ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡまたはＶＬＣＫＤ－ＤＨＡを合わせた表１に従う１８人の患者）におけるＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１のＤＮＡメチル化レベルを評価した。栄養学的介入後に、ベースラインに対してメチル化レベルに統計学的に有意な差が見出された（図７Ａ）。体重減少処置後に、ベースラインと比較して統計学的に有意な増加が、評価された４つのＣｐＧにおいて最大ケトーシスの間に観察された（ｐ＝０．０４９）。しかしながら、体重減少処置後のＦＧＦＲＬ１メチル化レベルには、統計学的に有意な変化は観察されなかった（図７Ｂ）。ＤＮＡメチル化は、以前に転写抑制に関連付けられていた。したがって、ＺＮＦ３３１（図７Ｃ）およびＦＧＦＲＬ１（図７Ｄ）の発現を評価した。栄養学的介入後にＺＮＦ３３１の発現の統計学的に有意な下方制御が見出されたが、ＦＧＦＲＬ１の発現は、ベースラインと比較して特に最大ケトーシスにおいて上方制御された。ＦＧＦＲＬ１のメチル化レベルについての結果が独立コホートにおいて検証されなかったとしても、この遺伝子の発現は、発見コホートにおいて観察されたメチル化レベルと逆相関した。全体として、これらの結果は、体重減少に関連するＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１のエピジェネティックな制御が関連性のある生物学的機能を有し得ることを示唆している。初期の結果は、両群がメチロームの変化を評価するために使用された主な結果である体重減少およびケトーシスを同様に誘発することを明らかにしたので、本研究の検証部分は、臨床試験の２つの群を統合することによって実施された。実際、２つの群を分離したままの検証コホートにおけるさらなる分析は、介入を通じたメチル化レベルの傾向が、研究された遺伝子、ＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１に対する併合された分析において観察されたものと同様であることを示した。介入を通じた差は、ＶＬＣＫＤ群よりＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡにおいてより高いように見受けられたが、群に応じた反復測定ＡＮＯＶＡ解析は、ＺＮＦ３３１メチル化レベルにおいて、介入の時間経過についてのみ統計学的に有意性を示し（ｐ＜０．０１）、時間ｘ群間の相互作用についても、および両群間の相互作用についても統計学的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。
本発明者らは、病院内の患者の研究に対して最も実行可能な技術であるパイロシーケンシングを使用して、白血球由来の試料の独立コホート（検証コホート；ｎ＝ＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡまたはＶＬＣＫＤ－ＤＨＡを合わせた表１に従う１８人の患者）におけるＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１のＤＮＡメチル化レベルを評価した。栄養学的介入後に、ベースラインに対してメチル化レベルに統計学的に有意な差が見出された（図７Ａ）。体重減少処置後に、ベースラインと比較して統計学的に有意な増加が、評価された４つのＣｐＧにおいて最大ケトーシスの間に観察された（ｐ＝０．０４９）。しかしながら、体重減少処置後のＦＧＦＲＬ１メチル化レベルには、統計学的に有意な変化は観察されなかった（図７Ｂ）。ＤＮＡメチル化は、以前に転写抑制に関連付けられていた。したがって、ＺＮＦ３３１（図７Ｃ）およびＦＧＦＲＬ１（図７Ｄ）の発現を評価した。栄養学的介入後にＺＮＦ３３１の発現の統計学的に有意な下方制御が見出されたが、ＦＧＦＲＬ１の発現は、ベースラインと比較して特に最大ケトーシスにおいて上方制御された。ＦＧＦＲＬ１のメチル化レベルについての結果が独立コホートにおいて検証されなかったとしても、この遺伝子の発現は、発見コホートにおいて観察されたメチル化レベルと逆相関した。全体として、これらの結果は、体重減少に関連するＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１のエピジェネティックな制御が関連性のある生物学的機能を有し得ることを示唆している。初期の結果は、両群がメチロームの変化を評価するために使用された主な結果である体重減少およびケトーシスを同様に誘発することを明らかにしたので、本研究の検証部分は、臨床試験の２つの群を統合することによって実施された。実際、２つの群を分離したままの検証コホートにおけるさらなる分析は、介入を通じたメチル化レベルの傾向が、研究された遺伝子、ＺＮＦ３３１およびＦＧＦＲＬ１に対する併合された分析において観察されたものと同様であることを示した。介入を通じた差は、ＶＬＣＫＤ群よりＶＬＣＫＤ＋ＤＨＡにおいてより高いように見受けられたが、群に応じた反復測定ＡＮＯＶＡ解析は、ＺＮＦ３３１メチル化レベルにおいて、介入の時間経過についてのみ統計学的に有意性を示し（ｐ＜０．０１）、時間ｘ群間の相互作用についても、および両群間の相互作用についても統計学的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。
Claims (15)
- 肥満症に罹患している患者が超低カロリーケトン食療法（ＶＬＣＫＤ）での処置に応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するためのインビトロ方法であって、前記患者から得られた全血中の、表Ｓ２、表Ｓ３または表Ｓ４から選択される少なくとも１種の遺伝子またはＣｐＧのメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較した、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離は、前記対象がＶＬＣＫＤに応答しているかまたは応答するであろうことの指標である、インビトロ方法。
- 前記方法が、
ａ．前記食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、前記食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者と１２０日目～１８０日目に生じる前記食事療法の終わりにある患者との間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧ部位を選択する工程；ならびに／または
ｂ．前記食事療法の開始時に生じるベースライン状態にある患者におけるメチル化のレベルによって表される対照値に関して、前記食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある患者間で可変的β値≧２％およびＦＤＲ＜０．１０を示す、可変的にメチル化されていることを特徴とするＣｐＧ部位を選択する工程、および前記食事療法の３０日目～９０日目に生じる最大ケトーシスの期間にある前記患者と１２０日目～１８０日目に生じる前記食事療法の終わりにある前記患者との間で可変的にメチル化されているＣｐＧ部位を破棄する工程；ならびに
ｃ．工程ａ）および／もしくはｂ）に従って選択された可変的にメチル化されたＣｐＧ部位の少なくとも２つをプロモーター領域中に含む遺伝子を選択する工程
を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。 - 請求項２の工程ａ）およびｃ）に従って選択された前記遺伝子およびＣｐＧ部位が、表２中に含まれており、およびそれらのメチル化状態は、肥満症に罹患している患者が、ＶＬＣＫＤに応答しておりもしくは将来応答して体重減少および栄養学的ケトーシス誘導の両方を生じさせるか否かを示し、ならびに／または請求項２の工程ｂ）およびｃ）に従って選択された前記遺伝子およびＣｐＧ部位は、表３中に含まれており、およびそれらのメチル化状態は、肥満症に罹患している患者が、栄養学的ケトーシスの誘導によってＶＬＣＫＤに応答しているか否かもしくは将来応答するか否かを示す、請求項２に記載のインビトロ方法。
- 表２から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較した、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離は、前記対象がＶＬＣＫＤに応答しているかまたは将来応答することの指標である、肥満症に罹患している患者が、ＶＬＣＫＤに応答しておりもしくは将来応答して体重減少と低脂肪消費を特徴とする栄養学的ケトーシス誘導との両方を生じさせるか否かを監視または予測するための、請求項１～３のいずれかに記載のインビトロ方法。
- 前記遺伝子の前記メチル化状態が、表２から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位において決定される、請求項４に記載のインビトロ方法。
- 表３から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態を決定する工程を含み、予め確立されたメチル化のレベルと比較して、メチル化のレベルの統計学的に有意な変動または乖離は、ケトーシスの低下が生じたという指標である、ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が生じたか否かを監視または予測するための、請求項１～３のいずれかに記載のインビトロ方法。
- 前記遺伝子の前記メチル化状態が、表３から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位において決定される、請求項６に記載のインビトロ方法。
- 前記患者がＶＬＣＫＤでの前記処置に応答しているかまたは将来応答する場合に、前記遺伝子の全体的な低メチル化が観察される、請求項１～７のいずれかに記載のインビトロ方法。
- 前記メチル化状態の検出が、メチル化特異的ＰＣＲ、バイサルファイトシーケンシング、制限消化に基づく技術、パイロシーケンシング、アッセイＣｈＩＰオンチップ、メチル化された部位の可変的変換、可変的制限および／または可変的重量からなる群より選択される技術によって行われる、請求項１～８のいずれかに記載のインビトロ方法。
- 血液白血球において実施されることを特徴とする、請求項１～９のいずれかに記載のインビトロ方法。
- 肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しているか否かまたは応答するか否かを監視または予測するための、表Ｓ２、表Ｓ３または表Ｓ４から選択される少なくとも１種の遺伝子またはＣｐＧのメチル化状態のインビトロ使用。
- 肥満症に罹患している患者がＶＬＣＫＤに応答しておりまたは将来応答して体重減少と低脂肪消費を特徴とする栄養学的ケトーシス誘導との両方を生じさせるか否かを監視または予測するための、表２から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態の、請求項１１に記載のインビトロ使用。
- 表２から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位のメチル化状態の、請求項１２に記載のインビトロ使用。
- ＶＬＣＫＤでの処置による栄養学的ケトーシスの誘導後に、肥満症に罹患している患者において代謝パラメータの改善が生じたか否かを監視または予測するための、表３から選択される少なくとも１種の遺伝子のメチル化状態の、請求項１１に記載のインビトロ使用。
- 表３から選択される少なくとも１種のＣｐＧ部位のメチル化状態の、請求項１４に記載のインビトロ使用。
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