JP2024518821A - テトロドトキシン液体製剤 - Google Patents

Abstract

テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩を含む安定な製剤であって、前記製剤は、当該テトロドトキシン成分と、１つ以上の溶媒、ｐＨ調整剤、緩衝剤および安定化剤とを含む、安定な製剤。

Description

発明の詳細な説明

〔本明細書の分野〕
本明細書は、概して、テトロドトキシンを含む液体製剤に関する。一態様において、本明細書は、医薬製品として使用することに適した安定なテトロドトキシン製剤に関する。このような製品は、哺乳動物に注射するための形態であり得る。

〔背景〕
テトロドトキシンは、天然に存在する非タンパク質性海洋性神経毒である。テトロドトキシンは、高い特異性および高い親和性で、電位依存性ナトリウムチャネルのＳＳ１／ＳＳ２サブユニットに結合する。

テトロドトキシン（Ｃ_１１Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ_８）の化学名は、オクタヒドロ－１２－（ヒドロキシメチル）－２－イミノ－５，９：７，１０ａ－ジメタノ－１０ａＨ－（１，３）ジオキソシノ（６，５－ｄ）－ピリミジン－４，７，１０，１１，１２－ペンタノールである。分子量は３１９．２８であり、以下の構造を有する。

テトロドトキシン（または「ＴＴＸ」）は、２２０℃を超えると、白色からオフホワイトの結晶性粉末まで、分解することなく暗色化し、以下の特性を有する：［α］Ｄ２５－８．６４（希釈酢酸中でＣ＝８．５５）；水中ではｐＫａ８．７６、５０％アルコール中ではｐＫａ９．４。ＴＴＸは、水溶性であり、一般に有機溶媒には溶けない。ＴＴＸは、酸性ｐＨでは比較的安定であるが、アルカリ性溶液では速やかに分解する。

おそらく強力な神経毒であるために、ＴＴＸはあまり研究されてこなかった。しかしながら、テトロドトキシンは、薬理学的研究、特に神経生理学およびイオンチャネル電気生理学の研究のツールとして使用されていることが知られている。科学的研究における使用に加えて、ＴＴＸの治療への応用も報告されている。いくつかの場合において、注射用（すなわち、水溶液の形態）のテトロドトキシン組成物が報告されている。例えば、ＴＴＸおよびその誘導体は、化学療法誘発性神経障害性疼痛（ＣＩＮＰ）および癌関連疼痛（ＣＲＰ）の治療における非オピオイド鎮痛剤としての使用が報告されている。ＴＴＸのこれらおよび他の使用例は、例えば、米国特許第５，８４６，９７５号；第６，４０７，０８８号；第６，５９９，９０６号；第８，４８６，９０１号；第９，０１８，２２２号；および第１０，６２４，８９６号に記載されている。

治療薬としてＴＴＸを使用する際に遭遇する問題の１つは、液体溶液の形態にある場合、特に温度に対する分子の高い応答性の結果として、急速に分解する傾向があるということである。米国特許第８，１２４，６０８号では、ＨＰＬＣにより測定したテトロドトキシンの含有量は、水溶液の形態で４０℃に保存した場合、１日目に９１．９％、さらに３日目に８９．３７％にまで低下することが見出された。さらに、テトロドトキシンの含有量は、製剤を２５℃で１ヶ月間静置したときには９５．３４％にまで低下し、２５℃で３ヶ月間静置した後には８９．７７％にまで低下した。理解されるように、このような製剤の医薬品有効成分であるテトロドトキシンの含有量が表示量の９０％未満に減少すると、当該製剤はもはや臨床使用には適さない。

このように、許容可能な安定性がなく、その結果、貯蔵寿命も許容できないことから、現在知られているＴＴＸ製剤は、治療法への広範な用途には適していない。

テトロドトキシン分解生成物の特性、および水性媒体中でのテトロドトキシン分解機構は、広く研究されている。１９６５年、Ｇｏｔｏらは、テトロドトキシンが酸性媒体下でエピマーである４－エピ－テトロドトキシンに変換することを報告した。このエピマーは、さらに脱水して、４，９－アニドロ－テトロドトキシンを形成する（Tetrahedron. 1965, Vol 21, 2059-2088）。テトロドトキシンのエピマー化は、プロトンによって急速な開環中間体を介して促進される。

Ｔ．Ｇｏｔｏらは、テトロドトキシンの温和な水処理により、以下のようにテトロドン酸が生成することを発見した（Tetrahedron Lett., 1963, 4, 2105-2113）。

極端な酸性またはアルカリ性条件下では、テトロドトキシンは、他の複雑な分解生成物に分解する（Woodward, R. B. The structure of tetrodotoxin. Pure and Appl. Chemistry, 1964, 9(1), 49-74.）

水溶液中のテトロドトキシンの分解に伴う問題に対処するために、米国特許第８，１２４，６０８号；第８，２２２，２５８号；および第８，５３０，４８１号に記載されているような、凍結乾燥テトロドトキシン粉末製剤が提案されている。しかしながら、凍結乾燥粉末製剤にはいくつかの欠点がある。第１に、凍結乾燥工程は、工業的規模で検討する場合、用量当たりにかなりの製造コストが発生し、それにより治療用製品のコストが増加する。第２に、従来の凍結乾燥製剤の使用では、当該製剤は典型的には粉末状であるが、薬剤を投与するために、まず、注射用水（ＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）などの希釈剤に再構成する必要がある。再構成は無菌的技術であり、一般に、医療専門家の技術と、多くの場合、資格を有する薬局の調剤施設とを必要とする。第３に、上述したように、ＴＴＸは水に可溶であり、有機溶媒には所望の程度には溶解しない；しかしながら、同じく上述したように、水への曝露はＴＴＸの分解を促進する。その結果、ＴＴＸを水溶液に再構成することによって形成された製剤は、特別な条件下で保存しない限り、十分に安定ではない。

したがって、上述の欠点のうち少なくとも１つに対処する液体テトロドトキシン製剤が求められている。

〔本明細書の概要〕
一態様において、安定な液体製剤であって、テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体および賦形剤と、を含む、製剤が提供される。

一態様において、製剤は、１５％未満の水（ｗ／ｖ）を含む。別の一態様において、製剤は、最大９５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ｗ／ｖ）を含む。

一態様において、安定な製剤は、容器内に提供される。別の一態様において、安定な製剤は、テトロドトキシンの皮下投与に適合されているプレフィルドシリンジで提供される。別の一態様において、製剤は、５～１２０、または１５～６０、または約３０μｇのテトロドトキシン用量を対象に投与するように適合されている。

一態様において、疼痛の治療のための、ＴＴＸを含む安定な液体製剤の使用が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性神経障害性疼痛（ＣＩＮＰ）である。

別の一態様において、疼痛治療において使用するための、ＴＴＸを含む安定な液体製剤が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性神経障害性疼痛（ＣＩＮＰ）である。

別の一態様において、疼痛の治療のために、ＴＴＸを含む安定な液体製剤を、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性神経障害性疼痛（ＣＩＮＰ）である。

〔図面の簡単な説明〕
添付した図面を参照する以下の詳細な説明において、特定の実施形態の特徴がより明らかになるであろう。

図１は、有機溶媒として異なる比率のプロピレングリコール（「ＰＧ」）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含む製剤におけるテトロドトキシン（「ＴＴＸ」）の安定性を示す。

図２は、異なるｐＨを有し、酸／ＰＧ／ＰＥＧ４００の比率が５／５０／４５（ｖ／ｖ）である製剤におけるＴＴＸの安定性を示す。

図３は、異なるｐＨを有し、酸／ＰＧ／ＰＥＧ４００の比率が５／８０／１５（ｖ／ｖ）である製剤におけるＴＴＸの安定性を示す。

図４は、オキサリプラチン誘発性疼痛モデルラットにおける、疼痛閾値（ＰＷＴ）に対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。

図５は、投与１時間後のラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。

図６は、投与２時間後のラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。

図７は、ラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ベースラインＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。

〔詳細な説明〕
本明細書に記載されるように、テトロドトキシン、またはその誘導体もしくはアナログ、またはその薬学的に許容可能な塩の液体医薬製剤が提供される。本明細書から明らかになるように、本明細書に開示されるテトロドトキシン液体製剤は、公知の凍結乾燥製剤に対していくつかの利点を有する。例えば、本明細書に記載されるテトロドトキシン液体製剤は、凍結乾燥工程を必要とせず、その結果、製造コストが低減され、これは、工業的規模で用量を製造する場合に特に重要である。記載される液体製剤は、再構成される必要がなく、これにより、再構成に関連する費用、およびこのような再構成のために必要とされる医療従事者の必要性を回避する。したがって、本明細書に記載される製剤は、シリンジ、アンプル、バイアル、または自己注射器などの容器内に提供または包装され得る。このような容器は、ガラス、プラスチック、または当該技術分野で公知の別の他の材料で作製され得る。一態様において、記載されるテトロドトキシン液体製剤は、注射装置を使用する、患者による自己投与、または任意の他の人による投与のために、「すぐに使用できる」形態で提供され得る。この点に関して、本明細書に記載される製剤は、予め設定された用量のテトロドトキシンを有する、プレフィルドシリンジ、または他の公知の投与装置の形態で提供され得る。理解されるように、記載される液体製剤を使用する場合、製剤は再構成を必要としないので、投与の誤りも減少し得る。また、理解されるように、テトロドトキシンは非常に有毒な物質であるため、このような投与の誤りは患者にとって非常に有害となり得る。

〔定義〕

本明細書において別段の記載がない限り、要素を特定するために使用される場合、冠詞「ａ」または「ｔｈｅ」は、１つだけであるという限定を構成することを意図しておらず、代わりに、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると理解される。したがって、別段の記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数形を含むものと理解される。例えば、「容器」への言及は、１つ以上のそのような容器を含むと理解され、「賦形剤」への言及は、１つ以上のそのような賦形剤を含むと理解される。

本明細書中で使用される場合、用語「テトロドトキシン」は、上記で提供された一般式を有する天然、合成または半合成の化学物質、およびその薬学的に許容可能な塩を指す。

本明細書中で使用される場合、用語「テトロドトキシンの誘導体」および「テトロドトキシンのアナログ」は、これらに限定するものではないが、アンヒドロ－テトロドトキシン、テトロダミノトキシン、メトキシテトロドトキシン、エトキシテトロドトキシン、デオキシテトロドトキシン、テトロドン酸、６－エピ－テトロドトキシン、１１－ドエキシテトロドトキシン、ならびにヘミラクタール型テトロドトキシンアナログ（例えば、４－エピ－テトロドトキシン、６－エピ－テトロドトキシン、１’－デオキシ－テトロドトキシン、４－エピ－１１－デオキシ－テトロドトキシン、テトロドトキシン－８－Ｏ－ヘミコハク酸塩、チリキトキシン、１１－ノル－テトロドトキシン－６（Ｓ）－オール、１’－ノル－テトロドトキシン－６（Ｒ）－オール、１１－ノル－テトロドトキシン－６，６－ジオール、１１－オキソ－テトロドトキシン、およびテトロドトキシン－１１－カルボン酸）、ラクトン型テトロドトキシンアナログ（例えば、６－エピ－テトロドトキシン（ラクトン）、１１－デオキシ－テトロドトキシン（ラクトン）、１’－ノル－テトロドトキシン－６（Ｓ）－オール（ラクトン）、１１－ノル－テトロドトキシン－６（Ｒ）－オール（ラクトン）、１１－ノル－テトロドトキシン－６，６－ジオール（ラクトン）、５－デオキシ－テトロドトキシン、５，１１－ジデオキシ－テトロドトキシン、４－エピ－５，１１－ジデオキシ－テトロドトキシン、１－ヒドロキシ－５，１１－ジデオキシ－テトロドトキシン、５，６，１１－トリデオキシ－テトロドトキシン、および４－エピ－５，６，１１－トリデオキシ－テトロドトキシン）、および、４，９－アンヒドロ型テトロドトキシンアナログ（例えば、４，９－アンヒドロ－テトロドトキシン、４，９－アンヒドロ－６－エピ－テトロドトキシン、４，９－アンヒドロ－１１－デオキシ－テトロドトキシン、４，９－アンヒドロ－テトロドトキシン－８－Ｏ－ヘミコハク酸塩、４，９－アンヒドロ－テトロドトキシン－１１－Ｏ－ヘミコハク酸塩）、ならびに、その薬学的に許容可能な塩を指す。

本明細書において別段の記載がない限り、「テトロドトキシン」または「ＴＴＸ」への言及は、天然に存在する物質、またはその誘導体および／もしくはアナログを含むと理解される。

本明細書中で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、哺乳動物を指す。対象の例は、ヒトを含み、また、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、および水生哺乳動物などの他の動物も含み得る。本明細書は、如何なる特定の哺乳動物に限定されるものではないが、しかしながら、好ましい対象はヒトであることが理解されるであろう。

本明細書中で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、または「治療（treatment）」とは、対象、例えばヒトにおける疾患の治療を意味し、疾患を阻害すること（例えば、その進行速度を低下させること）；疾患を退行させること；疾患の１つ以上の症状の重症度を緩和または低下させること；および／または、疾患を治癒することを含む。

本明細書中で使用される場合、「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、または「予防（prevention）」とは、対象における疾患の予防を意味し、疾患の開始を阻害すること；疾患に対する素因を減少させること；および／または、疾患の少なくとも１つの症状の発症を遅延させることを含む。

本明細書中で使用される場合、「約（about）」という用語は「約（approximately）」と同義であり、所定の値が、記載された値より「少し上」または「少し下」であり得ることを提供することによって、数値、または範囲の始点および終点に柔軟性を提供するために使用される。「約」は、例えば、３標準偏差以内または３標準偏差以上を意味し得る。「約」は、所定の値のある割合の範囲内を意味し得る。例えば、当該範囲は、所定の値の±１％、±５％、±１０％、±２０％、±３０％、±４０％または±５０％であり得る。「約」は、例えば、ある値の２倍以内、３倍以内、４倍以内または５倍以内など、所定の値の１桁分を意味し得る。しかしながら、数値が用語「約」によって本明細書中で特徴付けられる場合であっても、用語「約」が存在しないかのように、少なくとも正確な数値について明示的な裏付けが提供されなければならないことを理解されたい。一態様において、約という用語は、それぞれの値の±１０％の範囲を包含すると理解される。

用語「および／または」は、「および」または「または」を意味する。

本明細書では、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、または「含むこと（comprising）」が使用されることがある。本明細書中（明細書および／または特許請求の範囲を含む）で使用される場合、これらの用語は、記載された特徴、整数、工程、または構成要素の存在を特定するものとして解釈されるが、関連技術において通常の技術知識を有する者には明らかであるような１つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素、またはそれらの群の存在を排除するものではない。したがって、本明細書で使用される用語「含むこと」は、「少なくとも部分的にからなること」を意味する。この用語を含む本明細書の記載を解釈する場合、各記載においてその用語で前置きされる特徴はすべて存在する必要があるが、他の特徴も存在してもよい。「含む（comprise）」および「含まれる（comprised）」などの関連用語も同じ様式で解釈される。

本明細書中で使用される場合、「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「含むこと（containing）」、および「有すること（having）」などは、一般的にそれらに付与される意味を有することがあり、「含む（includes）」、「含むこと（including）」などを意味することがあり、オープンエンドな用語であると一般に解釈される。用語「からなること（consisting of）」または「からなる（consists of）」は、クローズな用語であり、そのような用語と併せて具体的に列挙された構成要素、構造、工程などのみを含む。

表現「本質的にからなること（consisting essentially of）」または「本質的にからなる（consists essentially of）」は、それと共に使用される項目の基本的かつ新規な特性または機能に重大な影響を与えない付加的な項目、材料、構成要素、工程、または要素を包含することを許容する例外を除き、一般的にクローズな用語として理解される。例えば、組成物中に存在するが、組成物の性質または特性に影響を与えない微量要素は、「本質的にからなること（consisting essentially of）」という用語の下で存在する場合には、そのような用語に続く項目のリストに明示的に記載されていなくても、許容される。「含むこと（comprising）」または「含むこと（including）」などのオープンエンドな用語を使用する場合、「本質的にからなること（consisting essentially of）」という用語だけでなく、「からなること（consisting of）」という用語についても、明示的に記載されている場合と同様に直接的な裏付けが与えられただろうと理解され、その逆もまた同様に理解される。要するに、本明細書においてこれらの用語の１つを使用することは、他のすべての用語についての裏付けを提供することとなる。

本明細書中で使用される場合、複数の項目、構造的要素、成分的要素、および／または材料は、便宜上、共通のリストで示されることがある。しかしながら、これらのリストは、リストの各メンバーが、別個かつ固有のメンバーとして個々に識別されるものとして解釈されるべきである。したがって、このようなリストの個々のメンバーは、反対の指示がない限り、共通の群におけるそれらの表示のみに基づいて、同じリストの如何なる他のメンバーとも事実上等価であると解釈されるべきではない。

濃度、量、およびその他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現または表示され得る。このような範囲形式は、単に便宜性かつ簡潔性のために使用されるものであり、範囲の限界として明示的に記載された数値のみならず、あたかも各数値および副範囲が明示的に記載されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または副範囲も含むように柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示として、「約１～約５」という数値範囲は、明示的に記載された約（例えば、±１０％）１～約（例えば、±１０％）５の数値だけでなく、示された範囲内の個々の数値および副範囲も含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲に含まれるのは、約２、約３、約４などの個々の値、ならびに約１～約３、約２～約４、および約３～約５などの副範囲、ならびに１、２、３、４および５、それぞれである。この同一の原則は、最小値または最大値として１つの数値のみを記載する範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、範囲の広さ、または記載されている特性に関係なく、適用されるべきである。

〔テトロドトキシン液体製剤の安定性〕

本明細書中で使用される場合、用語「安定な」は、本発明のＴＴＸ製剤の文脈において、ＴＴＸ成分が所定の期間にわたって所定の値を超えて分解しない製剤に該当すると理解される。ＴＴＸ分解の公知の機構のいくつかは、上述されている。一態様において、製剤のＴＴＸ成分が、当技術分野で公知の液体製剤中（その例は、上記で提供される）のＴＴＸを超える程度まで分解しない場合に、当該液体ＴＴＸ製剤は安定であると記載され得る。ＴＴＸ液体製剤が、それを必要とする対象への即時投与または自己投与のために保存される場合に、この安定性基準は特に有利である。

一態様において、ある期間にわたって、予め定めた条件下（例えば、特定の温度および相対湿度）で、製剤中のＴＴＸのレベルまたは濃度を測定し、公知のＴＴＸ製剤に対するそのような観察または測定を比較することによって、ＴＴＸの安定性が評価または定量され得る。別の一態様において、所定の期間および特定の条件下で、製剤中の１つ以上のＴＴＸ分解生成物の存在、レベルまたは濃度を測定することによって、ＴＴＸ製剤の安定性が評価または定量され得る。したがって、分解生成物の存在を測定し、このような測定値を予め定めた閾値と比較することによって、ＴＴＸ製剤の安定性が定性的または定量的に測定され得る。

一態様において、安定なＴＴＸ製剤は、十分に有効であり（すなわち、所望のＴＴＸ応答を達成する）、予め定めた閾値未満の１つ以上のＴＴＸ分解生成物の濃度を有する製剤として、定義され得る。十分に有効とは、例えば、所望のＴＴＸ応答を達成するために約９０％、９１％、９２％、９４％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％有効であることであり得る。

例えば、一態様において、安定な液体ＴＴＸ製剤は、２５℃で３ヶ月間保存された後にＴＴＸ成分が１１％より多くは分解しないＴＴＸの製剤を含み得る。別の一態様において、安定なＴＴＸ製剤は、２５℃で１ヶ月間保存された後にＴＴＸ成分が５％より多くは分解しないＴＴＸの製剤を含み得る。一態様において、本明細書は、（ａ）２～８℃の温度で２４ヶ月間安定であり；および／または（ｂ）２５℃で１ヶ月間安定であり；および／または（ｃ）４０℃の温度で２８日間安定である、ＴＴＸ製剤を提供する。

したがって、一態様において、本明細書に係る安定なＴＴＸ製剤は、製剤が４０℃および７５％相対湿度（ＲＨ）で２８日間保存された後に、テトロドトキシンの５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満または３５％未満の分解を示す。一態様において、４０℃で２８日間保存された後に分解を受けるテトロドトキシンが１０％未満である場合に、安定であるものとして製剤が定義される。

別の一態様において、本明細書に係る安定なＴＴＸ製剤は、当該製剤が２５℃および４０％ＲＨで１２週間保存された場合に、テトロドトキシンの５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満または３５％未満の分解を示す。一態様において、２５℃および４０％ＲＨで１２週間保存された後に分解を受けるテトロドトキシンが１０％未満である場合に、安定であるものとして製剤が定義される。

別の一態様において、本明細書に係る安定なＴＴＸ製剤は、当該製剤が２～８℃および周囲ＲＨで６ヶ月間保存された場合に、テトロドトキシンの５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満または３５％未満の分解を示す。一態様において、２～８℃および周囲ＲＨで６ヶ月間保存された後に分解を受けるテトロドトキシンが５％未満である場合に、安定であるものとして製剤が定義される。

本分析の目的として、ＴＴＸ製剤中のＴＴＸおよびＴＴＸ分解生成物の定量のための分析方法が設計され、検証された。この方法は、上記の分解生成物、すなわち４－エピ－テトロドトキシンおよび４，９－アニドロ－テトロドトキシンのアッセイに適用された。したがって、ＴＴＸ製剤の安定性の指標は、これらの分解生成物の一方または両方の濃度を測定することによって、定量され得る。実施されたアッセイに基づいて、そして単なる一例として、予め定めた期間にわたって、４－エピ－テトロドトキシンの濃度が製剤中で約２％を超えない場合に、および／または４，９－アニドロ－テトロドトキシンの濃度が製剤中で約５％を超えない場合に、ＴＴＸ製剤は安定であるとみなされ得る。これらの分解生成物がこのような濃度に達するまでの時間は、製剤が曝される条件に依存することが理解されるであろう。例えば、ＴＴＸ分解は、より高い温度で加速されることが理解される。

〔テトロドトキシン液体製剤〕

本明細書中に記載されるのは、凍結乾燥されたＴＴＸを再構成することによって作製される公知の製剤などの、公知のＴＴＸ液体製剤よりも増強された安定性特性を有することが示された、テトロドトキシン、またはその誘導体もしくはアナログ、またはその薬学的に許容可能な塩の液体製剤である。用語「安定な」は、上記で定義されており、製剤中のＴＴＸ成分が所定量分解されないこと、および／または１つ以上のＴＴＸ分解生成物の濃度が所定量よりも大きくないことを意味すると理解される。

本明細書中に記載される製剤は、注射可能な形態および／またはすぐに投与できる組成物の形態で、製剤化され得る。したがって、本明細書において意図されるのは、例えば、対象への投与のための設定用量のＴＴＸを含むプレフィルドシリンジまたはプレフィルドアンプルを含む剤形である。

本明細書中に記載される液体ＴＴＸ製剤は、テトロドトキシン、水、溶媒、および本明細書中で議論される１つ以上の他の成分を含む。一態様において、製剤は、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤などをさらに含み得る。好ましくは、本明細書中に記載されるテトロドトキシン液体製剤は、テトロドトキシンの溶解性および安定性のバランスをとる最小量の水を含む。換言すれば、一態様において、本明細書中に記載される製剤は、ＴＴＸ成分を可溶化するために十分な量の水を含むが、このような成分の安定性に有害な影響を与えるために十分な量の水は含まない。

一実施形態において、液体ＴＴＸ製剤は、非経口投与に適合されており、以下を含む：

（ｉ）テトロドトキシン、またはテトロドトキシンの誘導体、またはテトロドトキシンのアナログ、またはその薬学的に許容可能な塩；

（ｉｉ）水；

（ｉｉｉ）１つ以上の薬学的に許容可能な溶媒；

（ｉｖ）１つ以上の薬学的に許容可能なｐＨ調整剤；

（ｖ）１つ以上の薬学的に許容可能な緩衝剤；および、

（ｖｉ）１つ以上の薬学的に許容可能な安定化剤。

本明細書中に記載される製剤に使用するために好適な溶媒は、これらに限定するものではないが、エチルアルコール（エタノール）（「ＥｔＯＨ」）、脱水エチルアルコール、変性エチルアルコール、ベンジルアルコール、ジメチルスルホキシド、グリセリン、イソプロピルアルコール、メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡ」）、ポリエチレングリコール２００（「ＰＥＧ２００」）、ポリエチレングリコール３００（「ＰＥＧ３００」）、ポリエチレングリコール４００（「ＰＥＧ４００」）、ポリエチレングリコール６００（「ＰＥＧ６００」）、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール（「ＰＧ」）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

本明細書中に記載される製剤に使用するために好適なｐＨ調整剤は、これらに限定するものではないが、塩酸、酢酸（「ＡＡ」）、無水酢酸、アジピン酸、無水クエン酸、ベンゼンスルホン酸、ホウ酸、クエン酸一水和物、乳酸、（ＤＬ）－乳酸、（Ｌ）－乳酸、マレイン酸、メタリン酸、メタンスルホン酸（「ＭＳＡ」）、硝酸、リン酸、コハク酸、硫酸、亜硫酸、酒石酸、（ＤＬ）－酒石酸、トリフルオロ酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、エデト酸、ギ酸、ラクトビオン酸、アスパラギン酸、カプリル酸、グルクロン酸、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、メチルボロン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペンテト酸、ステアリン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム十水和物、炭酸ナトリウム一水和物、ジエタノールアミン、メグルミン、トロメタミン、アンモニア、またはそれらの組み合わせを含む。

本明細書中に記載される製剤に使用される緩衝剤は、これらに限定するものではないが、リン酸ナトリウム、二塩基性、リン酸ナトリウム七水和物、二塩基性、リン酸ナトリウム、二塩基性、無水物、リン酸ナトリウム、二塩基性脱水物、リン酸ナトリウム、二塩基性十二水和物、リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム脱水物、リン酸ナトリウム、一塩基性、無水物、リン酸ナトリウム、一塩基性、脱水物、リン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物、二塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム、一塩基性、酢酸ナトリウム、無水酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、無水クエン酸三ナトリウム、クエン酸二ナトリウム１．５水和物、クエン酸三ナトリウム脱水物、乳酸ナトリウム、（Ｌ）－乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、エタノールアミン塩酸塩、またはそれらの組み合わせを含む。

本明細書中に記載される製剤に使用される安定化剤は、１つ以上の公知の薬学的に許容可能な抗酸化剤、界面活性剤、保存剤、糖類を含み得る。このような薬剤は、これらに限定するものではないが、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素カリウム、アルファ－トコフェロール、アセトン亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ゲンチシン酸、ゲンチシン酸エタノールアミド、グルタチオン、メチオニン、モノチオグリセロール、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム無水物、エデト酸ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム無水物、エデト酸、グルセプテートナトリウム、ペンテト酸五ナトリウム、ペンテト酸カルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、ポビドン、ポビドンＫ１２、ポビドンＫ１７、クロスポビドン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポロキサマー１８８、ポリビニルアルコール、ポリソルベート８０、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、スルホブチルエーテルベータシクロデキストリン（「ＳＢＥＣＤ」）、ソルビトール、ソルビトール溶液、乳糖一水和物、マンニトール、フルクトース、グルコノラクトン、スクロース、トレハロース、グアニジン、塩酸グアニジン、塩化ベンザルコニウム、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、ヘキシルレゾルシノール、サクシマー、ブチルパラベン、メタクレゾール、塩化ミリピリウム、フェノール、没食子酸プロピル、またはそれらの組み合わせを含む。

一態様において、本明細書中に記載される製剤は、容器内に包装される。一態様において、容器は、シリンジ、アンプル、バイアル、または自己注射器を含み得る。一態様において、製剤は、予め定められた体積および／またはＴＴＸ濃度でこのような容器内に提供され得、それにより、投与のために予め定められた用量のＴＴＸをもたらす。

別の一態様において、容器は、必要に応じて、容器および好適な投与装置を含むキットで提供され得る。例えば、当該キットは、ある体積の製剤を含むアンプルまたはバイアル、および対象に製剤を投与するためのシリンジを含み得る。キットはまた、ＴＴＸ製剤の投与または自己投与を補助するための好適な説明書および他の情報ならびに／または機器も含み得る。

主題となる製剤は、本明細書中に記載される技術を用いて調製され得る。例えば、製剤は、最初にＴＴＸ（またはその誘導体、アナログもしくは塩）を水に溶解することによって、調製され得る。１つ以上のｐＨ調整剤、および／または１つ以上の緩衝剤もまた、この水溶液中に配合され得る。次いで、１つ以上の安定化剤が配合され得、その後、１つ以上の溶媒が混合され得る。この組成物は、直接投与に適した容器に無菌的に充填され得る（すなわち、さらなる混合、希釈、再構成などを必要としない）。

本明細書中に要約される研究は、安定なＴＴＸ液体製剤を提供する能力を説明する。この製剤は、容器内に提供され得、後の使用のために、分解することなく、十分な期間、液体形態で保存され得る。したがって、本明細書中に提供される製剤は、商業的に実施可能な最初の安定な液体ＴＴＸ製剤であると考えられる。したがって、この製剤は、例えば皮下（「Ｓ．Ｃ．」）注射または筋肉内（「Ｉ．Ｍ．」）注射による投与のために、予め定められた用量で提供され得る。この点に関して、ＴＴＸ製剤は、プレフィルドシリンジ内に提供され得る。このようにして、製剤は、一態様において、自己投与のための形態で提供され得る。

本明細書中に記載されるＴＴＸ製剤は、任意の好適な濃度および／または用量の量で提供され得ることが理解されるであろう。理解されるように、必要なＴＴＸ用量および濃度は、送達されるべき用量の体積と密接に関連する。

一例において、本明細書中に記載されるＴＴＸ製剤は、約５～５０００μｇ／ｍｌのＴＴＸ濃度で提供され得る。この範囲に含まれるのは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、および５０００μｇ／ｍｌの濃度であり、これらの値の間の投与量も含まれる。

一例において、本明細書中に記載される製剤は、約５～約１２０μｇのＴＴＸ用量を含み得る。別の一例において、本明細書中に記載される製剤は、約１５～約６０μｇのＴＴＸ用量を含み得る。別の一例において、本明細書中に記載される製剤は、約３０μｇのＴＴＸ用量を含み得る。

理解されるように、必要なＴＴＸ用量および濃度は、送達されるべき用量の体積と密接に関連する。一例において、製剤は、約６０μｇ／ｍｌのＴＴＸを含み得、それにより、約０．５ｍｌの製剤で３０μｇのＴＴＸの投与が可能となり、Ｓ．Ｃ．投与に好適である。別の一例において、製剤は、約１００μｇ／ｍｌのＴＴＸを含み得、それにより、約０．３ｍｌの製剤で３０μｇのＴＴＸの投与が可能となり、Ｓ．Ｃ．投与に好適である。別の一例において、製剤は、約１５０μｇ／ｍｌのＴＴＸを含み得、それにより、約０．２ｍｌの製剤で３０μｇのＴＴＸの投与が可能となり、Ｓ．Ｃ．投与に好適である。

〔実施例〕

本明細書において提供される実施例は、単に説明目的のために含まれるものであり、本明細書において説明されるあらゆる発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例は、本明細書の特定の態様を説明するために役立つ。当業者は、本明細書の範囲が本明細書において提供される事実的根拠に基づいて合理的に予測され得る付加的な態様を含むことを理解するであろう。

実施例の目的は、３０μｇまでの固定されたＴＴＸ用量を提供する液体ＴＴＸ製剤に到達することであった。このため、前記目的は、３００μｇ／ｍｌのＴＴＸ濃度を有する製剤に到達することであった。これは、前記製剤のおよそ０．１～０．２ｍｌのＳ．Ｃ．またはＩ．Ｍ．投与を可能にする。

上述したように、ＴＴＸは熱に敏感であることが知られている；例えば、ＴＴＸは４０℃で急速に分解する。したがって、前記製剤の安定性を評価する場合、試験条件として４０℃を使用することがより良いスクリーニングを提供すると仮定した。言い換えれば、前記製剤を４０℃の条件に１ヶ月間曝露することは、５℃における２４ヶ月間の試験と同等であると仮定した。

また上述したように、ＴＴＸは酸性環境においてより優れた安定性特性を有することが知られている。特に、ＴＴＸは、アルカリ性、すなわちｐＨ＞６において不安定であるため、本研究は、好ましい製剤ｐＨを３～５にすることを目指した。いくつかの試験において、分析のためにｐＨ４を使用した。

また知られているように、ＴＴＸは水溶性であるが、そのような水性環境においても速やかに分解される。そこで本研究は、ＴＴＸの溶解を促進するための水の必要性と、水にさらされることによるＴＴＸの分解との最適なバランスをもたらす水の量を決定することを目指した。

Ａ）溶解性試験

実施例１ － 有機溶媒および酸へのＴＴＸの溶解性

この研究では、本質的に水を含まない環境におけるＴＴＸの溶解特性を決定するために、種々の酸と有機溶媒との組合せにおけるＴＴＸの溶解性を調べた。目標ＴＴＸ濃度は３０μｇ／ｍＬであった。検討した酸は、アスコルビン酸（「ＡＡ」）、クエン酸（「ＣＡ」）、およびメタンスルホン酸（「ＭＳＡ」）であった。検討した溶媒はエタノール（「ＥｔＯＨ」）およびベンジルアルコール（「ＢＡ」）であった。この研究の結果を以下の表１に示す。

前述のように、ＴＴＸは、ＡＡ／ＥｔＯＨおよびＡＡ／ＢＡ混合液には不溶性であることがわかった。ＥｔＯＨ中のＭＳＡは、極端に低いｐＨの観点から使用できなかった。ＣＡはＥｔＯＨにもＢＡにも不溶性であることが判明し、ＴＴＸ溶解用の混合液を形成できなかった。これらの所見は、いくつかの酸および溶媒の間に何らかの不適合性があることを示唆している。

ＴＴＸは水溶液中では双性イオンであるという事実のために、前述の結果は当然の結果であった。したがって、有機溶媒は、ＴＴＸのイオン化およびプロトン化を促進する媒体としては不適当である。実施した研究の結果は、予想通り、ＴＴＸ溶液を得るには水が必要であることを示している。

実施例２ － 水および酸へのＴＴＸの溶解性

この一連の試験では、酸水溶液中において、すなわち有機相を含まずに、ＴＴＸの溶解性について調査が行われた。この調査の目的は、水中でのＴＴＸの溶解性に及ぼすｐＨの影響も評価することであった。この目的のため、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、および３．０ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＴＴＸを酢酸（「ＡＡ」）水溶液に添加した。これらの溶解性試験の結果を表２に示す。

表２に記載したように、ＡＡ水溶液に対するＴＴＸの溶解性は、ｐＨが低くなるにつれて増加することがわかった。ｐＨ３．３０の０．０２Ｍ酢酸水溶液は、３．０ｍｇ／ｍｌまでのＴＴＸを容易に溶解することがわかった。

この研究により、ＴＴＸを目標濃度で溶解するためには、溶液中にある程度の水分の含有量が必要であることが確認された。

実施例３ － 水、酢酸および有機溶媒へのＴＴＸの溶解性

これらの試験では、ｐＨ３．３０の酢酸（「ＡＡ」）溶液を、１０％ＡＡ／９０％有機の体積比および５％ＡＡ／９５％有機の体積比で有機溶媒と混合した。検討した有機溶媒は、エタノール（「ＥｔＯＨ」）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡ」）、ポリエチレングリコール４００（「ＰＥＧ４００」）、およびプロピレングリコール（「ＰＧ」）であった。ＴＴＸは３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。試験の目的は、４．０±０．５のｐＨを有するＴＴＸ製剤に到達することであった。表３は、ＴＴＸ添加前後の溶液のｐＨ測定値を示している。

上述したように、ＴＴＸの添加は、製剤のｐＨを著しく上方へシフトさせた（およそ２ｐＨ単位）。ｐＨを望ましい値である４に下げるため、０．６９６ＭのＡＡ溶液を添加して製剤を滴定した。これらの滴定試験の結果を表４に示す。

これらの試験では、ＴＴＸ濃度３．０ｍｇ／ｍｌのＴＴＸのＡＡ溶液（０．０２Ｍ）を、１０％水性：９０％有機のｖ／ｖ量で有機溶媒に添加して、最終製剤中の総ＴＴＸ濃度を３００μｇ／ｍｌとした。前記製剤を、０．６９６ＭのＡＡ溶液の添加によってｐＨ４に滴定した。

上述のように、ＴＴＸの添加は、ｐＨ値を目標の４を超えて上昇させることがわかった。その結果、追加のＡＡが必要であり、必要なＡＡ量は使用する有機溶媒に基づき変化する。

実施例４ － 水およびＭＳＡおよび有機溶媒へのＴＴＸの溶解性

ＡＡの代わりにメタンスルホン酸（以下、ＭＳＡ）を用いて、実施例３と同様の溶解性試験を行った。知られているとおり、ＭＳＡのｐＫａは－１．８６であるのに対して、ＡＡのｐＫａは４．７６である。この研究では、ＴＴＸを１０％ＭＳＡ溶液の溶液に溶解して（０．０１Ｍ、ｐＨ２）、ＴＴＸ濃度を３ｍｇ／ｍｌとした。次いで、このＴＴＸ溶液を、１：９（ｖ／ｖ）の比率で有機溶媒と合わせて、１０％水性：９０％有機を有する製剤を得た（実施例３のように）。この結果、３００μｇ／ｍｌのＴＴＸ濃度を有する製剤が得られた。実施例３と同様に、各混合液の初期ｐＨを測定し、次いで、ＭＳＡで滴定してｐＨを４±０．５にした。この試験の結果を表５に示す。

（^＊この研究では、４℃で保存するとＴＴＸがＥｔＯＨ混合液中で沈殿することがわかったため、有機溶媒としてＥｔＯＨを使用しなかった）。

表５に記載されているように、それぞれのＴＴＸ製剤のｐＨは、ＡＡを用いて調製した製剤よりも低いことがわかった。その結果、製剤のｐＨを目標値まで下げるために必要なＭＳＡの追加量はごくわずかであった。有機溶媒としてＰＧを用いた場合、製剤の開始ｐＨは４±０．５の目標範囲内にあることが判明し、そのためＭＳＡ滴定は必要なかった。

この研究は、強酸（ｐＫａ＝－１．８６）であるＭＳＡを用いると、有機溶媒中でのＴＴＸ製剤のｐＨ制御がより容易に制御されることを示している。

溶解性試験の概要

実施した研究は、ＴＴＸが有機溶媒と酸との混合液に不溶性であることを確認した。本発明者によって実施された他の研究において、純粋な有機溶媒（ＥｔＯＨ、ＤＭＡ、ＰＥＧ、ＰＧなど）中のＴＴＸの溶解性は３０μｇ／ｍｌ未満であることがわかった。これは予想されたことである。上記の知見は、有機溶媒および酸の組合せにおけるＴＴＸの溶解性もまた３０μｇ／ｍｌ未満であることを示している。

これらの研究はまた、ＴＴＸの上記濃度値を得るためには、水は製剤において必要な成分であることを確認する。例えば、ＴＴＸは、酢酸水溶液に３ｍｇ／ｍｌまで容易に溶解することがわかった。

１０％水性＋９０％有機溶媒（すなわち、ＥｔＯＨ、ＤＭＡ、ＰＥＧ４００およびＰＧ）から構成された製剤を含み、ＡＡで滴定した実験では、ＴＴＸは、０．３ｍｇ／ｍＬで可溶化することがわかった。しかしながら、ＴＴＸの添加は、製剤のｐＨを約２ｐＨ単位上昇させることがわかった。約４．０の目標ｐＨに到達するには、１０％水性＋９０％ＥｔＯＨ、ＤＭＡ、ＰＥＧ４００、およびＰＧを有する製剤について、それぞれ、１．０％、２．０％、１．１％、および０．１％のＡＡ（すべてｗ／ｖ）の添加が必要であることがわかった。

１０％水性＋有機溶媒（ＥｔＯＨ、ＤＭＡ、ＰＥＧ４００およびＰＧ）を用い、代わりにＭＳＡで滴定した別の実験では、ＴＴＸは、０．３ｍｇ／ｍＬで可溶化することがわかった。約４．０の目標ｐＨを達成すために必要なＭＳＡの量は、ＡＡの場合よりも少なかった。これは、ＭＳＡがＡＡよりも強い酸であることに起因すると考えられる。

Ｂ）安定性試験

実施例５ － 水性酸（ＭＳＡ／ＡＡ）および有機溶媒（１０％水性：９０％有機（ｖ／ｖ））の製剤におけるＴＴＸの安定性

この研究では、有機溶媒（エタノール（「ＥｔＯＨ」）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡ」）、ポリエチレングリコール４００（「ＰＥＧ４００」）、またはプロピレングリコール（「ＰＧ」））、酸（ＭＳＡまたはＡＡ）、および水を含有する、７つの製剤を調製した。これらの製剤は、１０％水性成分：９０％有機成分の体積比で、目標ｐＨ４、ＴＴＸ濃度３００μｇ／ｍｌで調製した。サンプルを調製し、それぞれ、密閉バイアルに入れて安定性試験チャンバー（４０℃、７５％の相対湿度、「ＲＨ」）内で、２４時間、４８時間、および７日間保存した。サンプル中のＴＴＸ濃度の測定は、ＨＰＬＣを用いて行い、それぞれの曲線下の面積を計算した。ＴＴＸ測定値は、Ｔ０（すなわち、保存期間前）の定量化したＴＴＸ量に基づくパーセンテージとして報告される。より具体的には、サンプル溶液中のＴＴＸの安定性は、以下の式に従って、それぞれの時点におけるＴＴＸのピーク面積をＴ＝０で得られたＴＴＸのピーク面積と比較することによって、％回収率として計算した：

％回収率＝（ｒ_Ｕ／ｒ_Ｓ）×１００

ここで、ｒ_Ｕ＝異なる時点におけるサンプル溶液からのテトロドトキシンのピーク反応；およびｒ_Ｓ＝Ｔ＝０におけるサンプル溶液からのテトロドトキシンのピーク反応。

この研究の結果を表６に示し、ＴＴＸの％回収率データを示した。

表６に示したＴＴＸの濃度は、Ｔ０における濃度を基準として正規化した値として示した。

この研究では、ＴＴＸは、ｐＨ４でのそれぞれの製剤において、少なくとも３００μｇ／ｍｌの濃度まで十分に溶解することがわかった。見てのとおり、ＭＳＡを含む製剤は、ＡＡを用いた製剤よりも概ね良好な安定性結果をもたらすことがわかった。これは、ＭＳＡがより強い酸であることに起因すると考えられる。安定性の結果には若干のばらつきが見られたが、検討した４つの有機溶媒の間には明確な差異はなかった。このことは、本研究において観察されたＴＴＸの分解は、１０％水性成分の結果であることを示唆している。

この研究はまた、ＭＳＡと、ＰＥＧ４００またはＤＭＡと、を含む製剤が、最も高い安定性結果をもたらすことを明らかにした。

実施例６ － 水性酸（ＭＳＡ／ＡＡ）および有機溶媒（５％水性：９５％有機（ｖ／ｖ））の製剤におけるＴＴＸの安定性

実施例５において得られた知見に基づき、含水率１０％未満でのＴＴＸ溶解性および安定性を調査するための研究を実施した。この研究では、５％水性成分および９５％有機成分を含む製剤を用いて、上記と同様の試験を実施した。これらの研究では、有機溶媒としてＰＥＧ４００、ＤＭＡ、およびＰＧを使用し、酸としてＭＳＡおよびＡＡを使用した。

初めに、それぞれが酸／有機組成中に０．３ｍｇ／ｍｌ（または３００μｇ／ｍｌ）のＴＴＸを含む６つの製剤サンプルが試みられた。しかし、これらの溶液に関して、ＡＡまたは０．０１ＭのＭＳＡのいずれかと混合しても、ＴＴＸが完全に溶解しないことがわかった。３．４８ＭのＡＡと混合したＴＴＸを含むサンプルのみが、望ましいＴＴＸ濃度を達成することがわかった。したがって、最終製剤中のＴＴＸ濃度を０．１５ｍｇ／ｍｌに減らすことを決定した。

５％水性／９５％有機比率を達成するために、ＴＴＸ３ｍｇを１ｍｌのＡＡまたは０．０１ＭのＭＳＡのいずれかに溶解し、この水溶液をＤＭＡ、ＰＥＧ４００またはＰＧを含む有機成分１９ｍｌと混合した。ＴＴＸが完全に溶解しなかったＡＡサンプルについては、溶解が達成されるまで３．４８ＭのＡＡを添加した。サンプル中のＴＴＸの最終濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。

さらに、ＰＥＧ４００／ＭＳＡと、グアニジン、乳糖一水和物、およびメタ亜硫酸水素ナトリウムから選ばれた１つの安定化剤と、を含む３種類のさらなるサンプルを調製した。これらの安定化剤は１ｍＭの濃度まで提供された。

上記のサンプルを冷蔵下で一晩保存したが、少しの沈殿物も認められなかった。その後、サンプルを安定性チャンバー（４０℃、７５％ＲＨ）に移し、２４時間（Ｔ１）、１２０時間（Ｔ２）、１６８時間（Ｔ３）、または３１２時間（Ｔ４）にわたって保存した。その後、サンプルをＨＰＬＣによって分析して、ＴＴＸ量を測定した。上記のように、測定は、ピーク面積を計算し、Ｔ０での測定値と比較することによって行った。ＴＴＸ測定の結果（％回収率として表す）を表７に示す。

表７にあるように、ＤＭＡ／ＭＳＡサンプルは比較的安定であることがわかったが、ＰＥＧ４００／ＭＳＡおよびＰＥＧ４００／ＭＳＡ／グアニジンの結果は極めて低いことがわかった。このことが１０％水性／９０％有機試験の結果に反映されていなかったことを考えると、後者は予想外であった。これらのサンプルはいずれも同じ分解傾向を示したことから、これらの予想外の結果は、サンプルの混合が不十分であったこと、およびサンプル調製時の滴定過剰の問題に起因するのではないかと推測された。上記のとおり、酸は、最終製剤に添加されて、最終ｐＨを４にした。このことは、その後の試験サンプルのｐＨ測定によって確認され、ＰＥＧ４００／ＭＳＡおよびＰＥＧ４００／ＭＳＡ／グアニジンのサンプルのｐＨは、それぞれ０．９２および０．８１であることが決定された。このように、酸滴定工程では正確なｐＨ測定ができなかった。このため、ＰＥＧ４００／ＭＳＡおよびＰＥＧ４００／ＭＳＡ／グアニジンを含む試験を繰り返し、これらの結果を表７の下部に示した。ＰＥＧ４００／ＭＳＡの結果から、ＴＴＸ測定において再びいくらかの誤差を含むことがわかった。これは、５％の水性含量を考慮すると、製剤の高粘度に関連していると考えられる。その結果、ｐＨ滴定工程において、十分な混合を達成することに困難が生じた。さらに、このサンプルのＨＰＬＣピークは測定が困難であった。したがって、この結果は、対象製剤、または少なくともＭＳＡを含む製剤において高い有機溶媒含量（すなわち９５％）でＰＥＧ４００を単独で使用することは、製剤化が困難であることを示唆している。これらの結果は、ＰＥＧ４００のための希釈剤として製剤中にＰＧを含むことが好ましいことを示している。

表７の下部に示すように、ＰＥＧ４００／ＭＳＡ／グアニジン試験の繰返しは、望ましい結果をもたらすことがわかった。

この研究から、５％水性成分と９５％有機成分とを含む製剤について、３００μｇ／ｍｌのＴＴＸ濃度を得ることは不可能であると判断された。そのため、この種の製剤について、１５０μｇ／ｍｌを目標とすることが好ましい。

実施例７ － 水性酸（ＭＳＡ／ＡＡ）と有機溶媒との組合せ（５％水性：９５％有機（ｖ／ｖ））の製剤におけるＴＴＸの安定性

この試験では、５％水性／９５％有機の体積比を、サンプル製剤のために使用した。しかしながら、この例では、有機相は溶媒を組み合わせて形成した。この試験は、溶媒についての９５％の濃度制限を考慮して行なった。言い換えれば、製剤中の溶媒の濃度が９５％を超えることはできない。

この目的のために、以下の製剤が設計された：

Ｆ１：水性／ＤＭＡ／ＰＧ＝５％／２５％／７０％

Ｆ２：水性／ＤＭＡ／ＰＥＧ４００＝５％／２５％／７０％

Ｆ３：水性／ＰＧ／ＰＥＧ４００＝５％／５０％／４５％

水性酸成分については、ＡＡおよびＭＳＡを調査した。しかし、Ｆ１＋ＡＡおよびＦ２＋ＡＡを含む製剤は、ｐＨを所望のレベルまで下げるために必要なＡＡの量が多いため検討しなかった。検討した製剤を表８に示す。

これらの試験で使用したコントロールは、水相のみを含むサンプルを含んでいた。

これらのサンプルについての予備的な安定性データは、サンプルを２５℃および４０％ＲＨで１週間（Ｔ１）にわたって保持した後に得た。このデータは表９にまとめられている。

前述のように、すべてのサンプルは、上記の条件下で７日間までＴＴＸの安定性を維持することがわかった。

この研究の次のセクションのために、サンプル１、３、および４のみを使用し、これらのサンプルを、以下の３つの異なる条件および期間での安定性試験に供した：

１）［２５℃、４０％ＲＨ、７日間］＋［４０℃、７５％ＲＨ、７日間］；

２）［２５℃、４０％ＲＨ、７日間］＋［４０℃、７５％ＲＨ、１６日間］；

３）［２５℃、４０％ＲＨ、７日間］＋［４０℃、７５％ＲＨ、２４日間］；

４）２５℃、４０％ＲＨ、８週間；および、

５）２～８℃、周囲ＲＨ、６ヶ月間。

これらの試験結果は、表１０、１１、および１２において提供される。

上記の結果において、％ＴＴＸは、ＨＰＬＣを用いて測定し、これまでの実施例と同様にピーク面積によって定量した。ＴＴＸ量は、Ｔ０での量を基準として表した。

上記の研究では、コントロール（有機成分を含まない）におけるＴＴＸ量は、４０℃および７５％ＲＨの条件下で５～７日以内に９０％未満に低下することがわかった。対照的に、５％水性成分および９５％有機成分を用いて試験したサンプルは、このような加速条件下で約２０日間まで、Ｔ０に対して９０％のＴＴＸ量を有することがわかった。

実施例８ － 水性酸と有機溶媒との組合せ（２％水性：９８％有機（ｖ／ｖ））におけるＴＴＸの安定性

実施例７と同様に、水性成分を２％（ｖ／ｖ）に減らし、製剤の残りの９８％（ｖ／ｖ）が有機成分を含む製剤において、ＴＴＸの溶解性および安定性特性を決定するための研究を実施した。有機成分は、前の実施例と同様に有機溶媒の組合せから構成される。

本研究では、３つの緩衝溶液系、すなわち酢酸緩衝溶液系、クエン酸緩衝溶液系、およびリン酸緩衝溶液系を用いて製剤を調製した。製剤は、２％水溶液と、５０％（ｖ／ｖ）ＰＧおよび４８％（ｖ／ｖ）ＰＥＧを含む９８％有機溶媒と、を有するように調製した。水性ＭＳＡを用いて製剤をｐＨ４、５、および６に滴定した。その後、ＴＴＸサンプルを６０μｇ／ｍｌの濃度で調製した。製剤は、ＴＴＸ添加後に必要なＭＳＡの量を最小限にするために、約ｐＨ４に維持されるように緩衝溶液を用いて適合させた。

サンプルは、ｐＨ４の緩衝溶液にＴＴＸを溶解し、溶媒を加えることによって調製した。ＴＴＸの完全溶解後、水性ＭＳＡでｐＨ４または６に調整した。表１３は、本研究において調製したサンプルをまとめる。

対応するコントロールサンプルも調製した。その後、製剤を３つの異なる安定性チャンバーに移し、次の３つの条件下で製剤の安定性を評価した：４０℃／７５％ＲＨ；２５℃／４０％ＲＨ；および２～８℃。その後、サンプルを、条件によって異なる時間で分析した。表１４は、サンプルについての分析時間をまとめる。

表１５、１６、および１７は、これらの研究の結果をまとめる。

表１５～１７に記載されているように、ＴＴＸ－酢酸塩、ｐＨ４のサンプルは、時間の経過とともにｐＨの低下を示すことがわかった。これは、酢酸が比較的弱い酸であり、酢酸／酢酸塩緩衝溶液がｐＨ変動に対応することが比較的遅い結果であると考えられる。その結果、ｐＨ滴定の実施が困難になった。また、サンプルの混合が不十分だったことも、予想外のｐＨ測定値につながった可能性がある。対照的に、クエン酸およびリン酸はより強い酸であるため、ｐＨ平衡がより迅速に達成された。したがって、これらの研究は、より効率的なｐＨ制御を維持するためには、より強い酸（ＭＳＡなど）を使用することが望ましいことを示唆している。

本研究では、ＴＴＸのピーク形状が不完全であることに起因して、クロマトグラフィーの積分および定量の一部が信頼できないものがあることがわかった。これは、製剤中の高い有機溶媒濃度の結果であると考えられる。したがって、２％という低い水性成分を有するＴＴＸ製剤は安定であることが判明しているが（後述のとおり）、そのような高い有機濃度ではＴＴＸ濃度の測定は困難であろう。

この研究は、２％水性成分を有する製剤について、ＴＴＸ溶解性が少なくとも約６０μｇ／ｍｌであることを示している。さらに、加速条件下（すなわち、４０℃）に置いた２％水性サンプルのデータは、同じ条件下に置いた５％水性サンプルとの有意差を示さなかった。したがって、これは、２％という低い水性成分であっても、ＴＴＸの安定性を維持するためになお十分であることを示唆している。この結論は、２～８℃で実施した試験から得られた安定性データによってさらに支持される。したがって、これらのデータは、製剤中の少なくとも２％または５％の水性組成が、ＴＴＸの安定性を維持するために十分であるという結論を導く。

安定性研究の概要

１０％（ｖ／ｖ）の水性成分と９０％（ｖ／ｖ）の有機成分とを含む製剤を検討した。これらの製剤は、酸（ＡＡまたはＭＳＡ）溶液の水相を含む。有機相はＥｔＯＨ、ＤＭＡ、ＰＥＧ４００、またはＰＧを含む。製剤は、約４のｐＨで調製され、３００μｇ／ｍｌのＴＴＸ濃度が達成された。これらの製剤中のＴＴＸの安定性は、多少の変動はあるものの、約７日間持続した。有機溶媒含量が高いため、ピークスプリッティングなどのクロマトグラフィー効果が、採用したＨＰＬＣ法を用いて結果を得ることを困難にした。

これらの研究によって、ＭＳＡはより強い酸（ｐＫａによって示されるように）であるという観点において、ＭＳＡは、ＡＡよりも、使用するためにより良い酸であることも明らかになった。また、この研究によって、ＴＴＸの安定性に関しては、使用した有機溶媒の間に明確な差がないことも明らかになった。

１０％（ｖ／ｖ）水性試験から得られた良好な結果に基づき、より低い（５％および２％）水性成分を用いてさらなる試験を実施した。上記のように、５％水性および９５％有機の組成を有する製剤を用いて研究を実施した。ここでは、酸としてＡＡおよびＭＳＡを採用し、有機溶媒としてＰＥＧ４００、ＤＭＡ、およびＰＧを採用し、安定化剤としてグアニジンＨＣｌ、乳糖一水和物、およびメタ亜硫酸水素ナトリウムを採用した。これらの製剤では、ＴＴＸは約１５０ｕｇ／ｍＬまで溶解することがわかり、ＴＴＸの安定性は１０％水性試験と比較して向上していることがわかった。

５％（ｖ／ｖ）水性試験からの有望なデータに鑑み、ＡＡおよびＭＳＡを酸として用い、ＤＭＡ、ＰＥＧ、ＰＧおよび２つの溶媒の組合せを有機成分として用い、５％水性および９５％有機の組成を用いてさらに実験を行った。グアニジンＨＣｌ、ＳＢＥＣＤ、およびメタ亜硫酸水素ナトリウムを安定化剤として使用した。３つの安定性条件を調査した：４０℃／７５％ＲＨ（１ヵ月間）、２５℃／４０％ＲＨ（２ヵ月間）、および２～８℃（６ヵ月間）。ＴＴＸ値は、約２０日間まで安定である（すなわち９０％超を維持）ことがわかった。２～８℃における安定性データは、ＴＴＸが、温度対分解反応速度の従来のアレニウス推定に従わない可能性を示している。したがって、このデータは、ＴＴＸ製剤は低い水性含量において安定性を維持できることを示唆している。

良好な５％水性データに基づき、安定性の向上が達成できるかどうかを確認するために、２％（ｖ／ｖ）水性製剤を検討した。これらの試験において、ＴＴＸの溶解性は、約６０μｇ／ｍＬであることがわかった。４０℃で実施した安定性試験では、２％水性組成と５％水性組成との間に有意差は認められなかった。このことは、２％という低い水性濃度で、安定したＴＴＸ製剤が達成されることを示唆している。しかしながら、分析段階で直面したクロマトグラフィーの欠陥は、２％水性製剤にとって困難なものであった。

実施例９ － 種々のＰＧ／ＰＥＧ４００比率およびｐＨを有する製剤におけるＴＴＸの安定性

本研究では、異なるＰＧとＰＥＧ４００との比率（有機溶媒）がＴＴＸの安定性に及ぼす影響を調べるために実験を行った。また、製剤のｐＨがＴＴＸの安定性に及ぼす影響を調べるための実験も行った。これらの研究では、酸成分のために水性ＭＳＡを使用した。

製剤は、ＴＴＸ濃度１００μｇ／ｍｌで、表１８に示すＭＳＡ／ＰＧ／ＰＥＧ４００の体積比にしたがって調製した。ここで、ＭＳＡは、０．０１Ｍの水性ＭＳＡである。

表１８はまた、製剤の初期ｐＨも示す。サンプルを調製する過程において、ＰＧの量を増やすとｐＨが低下することがわかった。

サンプルを、４０℃および７５％ＲＨの条件下で安定性試験に供し、ｔ＝０週間、２週間、および４週間でサンプルを分析した。

これらの試験結果を図１、２および３に示す。驚くべきことに、ＰＥＧ４００の量が多いほど、両方の安定性試験環境についてＴＴＸ安定性が改善された。いかなる理論にも束縛されることなく、ＴＴＸ安定性が改善されたというこの発見は、ＰＥＧ４００が（ＰＧと比較して）水分子をよりよく結合することができ、それによって製剤中の水成分へのＴＴＸの曝露を減少させた結果であると考えられる。この点に関して、ＰＥＧ水溶液中で、水が高濃度で存在する場合は、１つの水分子がＰＥＧ鎖の１つのモノマーと水素結合を形成することが以前に示された。しかし、水濃度が低い場合には、１つの水分子はＰＥＧ鎖の２つのモノマーと水素結合を形成する。Ｐ．Ｍｏｌｙｎｅｕｘ（Synthetic polymers. In Water - A Comprehensive Treatise; Franks, F., Ed.; Plenum Press: New York, 1975; Vol. 4.）およびＳ．Ｌｕｓｓｅら（Macromolecules 1996, 29, 4251-4257）を参照。

また、約３～約６のｐＨを有する製剤も、ＴＴＸ安定性の向上を示すことも注目された。この範囲のうち、約４のｐＨがＴＴＸ安定性にとって理想的であることがわかった。

この研究では、上述の他の研究と同様に、２～８℃の条件下でも安定性を測定した。先のデータと同様に、これらの条件下で保存されたＴＴＸ製剤は安定であることがわかった。これらのデータは、ＴＴＸ製剤の安定性が保存温度に影響されることを示している。

実施した別の研究において、ＰＥＧ４００が製剤粘度を増加させ、５℃での製剤粘度が２５℃での製剤粘度のおよそ３～４倍であることも指摘された。したがって、ＴＴＸ製剤におけるＰＥＧの使用は好ましいことが判明しているが、ＰＥＧ濃度がより高い場合は、例えば、より大きなゲージの針を使用するなどして、製剤の投与方法を調節する必要があるかもしれない。

上記の要因を考慮すると、製剤２がさらなる調査に理想的であると判断された。この製剤は、ＭＳＡ／ＰＧ／ＰＥＧ４００を５／５０／４５（ｖ／ｖ）の比率で含む（ここで、ＭＳＡは０．０１Ｍの水性ＭＳＡである）。

不純物に関する補足データを提供するために、実施例９に記載した研究を繰り返した。ＴＴＸの種々の分解生成物の相対量を、記載された時点で測定した。ＴＴＸの分解生成物は、表１９に示されるように、不純物ｇ－ＴＴＸ、ｏ－ＴＴＸ、ｅ－ＴＴＸおよびａ－ＴＴＸとして同定される。

不純物の量を測定した繰返し試験の結果を以下の表２０に示す：

この試験の結果は、最初の試験と比較して、概ね一貫性を示した。特に、ＰＧ：ＰＥＧ４００：ＭＳＡ（５０：４５：５）を含む製剤は、観察した期間にわたって良好な安定性を示した。

実施例１０ － 異なる水性酸および異なるＰＥＧを用いた製剤におけるＴＴＸの安定性

この研究では、上記の製剤、すなわちＭＳＡ／ＰＧ／ＰＥＧを５／５０／４５（ｖ／ｖ）の比率で含む製剤について、使用する酸を変えて調査した。これらの試験について、製剤を１００μｇ／ｍｌのＴＴＸで構成した。以下の酸を検討した：ベンゼンスルホン酸、ギ酸、塩酸、リン酸、硫酸、亜硫酸、およびクエン酸。

これまでの研究は、ＰＥＧ４００に焦点を当てたものであったため、本研究ではさらに、異なるＰＥＧ成分、特にＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、およびＰＥＧ６００の調査を行った。これらの実験について、共通の酸成分として０．０１ＭのＭＳＡ水溶液を使用し、比較製剤を、以下のＭＳＡ／ＰＧ／ＰＥＧのｖ／ｖ比率で調製した：５／７０／２５（「低」ＰＥＧ）；５／５０／４５（「目標」ＰＥＧ）；および５／３０／６５（「高」ＰＥＧ）。

すべての場合において、４０℃および７５％ＲＨの条件下で安定性試験を実施し、ｔ＝０週間、２週間、および４週間でサンプルを分析した。

これらの研究の複合結果を表２１に示す。上記の以前のデータと同様に、ＴＴＸの％回収率を、Ｔ０でのＴＴＸ量に関して表２１に示した。

^＊これらのサンプルにおけるＴＴＸピークは、ＰＥＧ２００が存在するため、読み取ることができなかった。

見てのとおり、４週間の試験（加速条件下）の後、５：５０：４５のｖ／ｖ比率でＭＳＡ：ＰＧ：ＰＥＧ４００を含む以前に試験した製剤に対して、いずれの試験サンプルも増加したＴＴＸ安定性を示さないことがわかった。ほとんどの試験サンプルは、試験の最後の２週間で、ＴＴＸの約１０％を失うことがわかったが、クエン酸を含む製剤は例外であった。

ベンゼンスルホン酸は、ｐＨ測定において高いばらつきを示し、また概ね使用が困難であった（検討した他の酸と比較して、より多くの注意および制御を必要とする）。したがって、この酸は、主にｐＨ滴定の難しさのため、ＴＴＸ製剤のための理想的な候補ではないと結論づけられる。リン酸は、ＭＳＡと比較して、ＴＴＸの安定化を改善するように見えない。他の酸－ギ酸、塩酸、硫酸、亜硫酸、およびクエン酸－を含む製剤は、ＭＳＡと同様のＴＴＸの安定性を示した。これらの研究は、ＴＴＸの安定性は使用される酸には関連せず、安定なＴＴＸ液体製剤を調製するために種々の酸を使用できることを示している。

ＰＥＧ４００を含む製剤におけるＴＴＸの安定性を他のグレードのＰＥＧと比較すると、ＰＥＧ４００製剤は、ＰＥＧ２００またはＰＥＧ３００を含む製剤と比較して、より大きなＴＴＸの安定性をもたらすことが見出されたことに留意されたい。ＰＥＧ６００を使用した安定性はＰＥＧ４００を用いて達成されたものと同様であることがわかったが、製剤粘度はＰＥＧ４００を使用したものよりもはるかに大きいことがわかった。これは、ＰＥＧ６００の分子量がより高いことに起因するであろう。これらの知見、およびＰＥＧ４００が容易に入手可能であるという事実から、ＰＥＧ４００が、本発明の製剤のために好ましいと考えられる。

酸およびＰＥＧの種類が製剤に及ぼす影響をさらに検討するため、追加の実験を行った。以下の表２２に示すサンプルを、Ｔ０、２週間および４週間の時点における４０℃でのｐＨ／分析／ＲＳ安定性について、目標のｐＨ５で繰り返した。

以下の表において、用語「試験」は、安定性試験の各時点において、各サンプルに対して実施したすべての化学的試験をいう。用語「分析」は、ＴＴＸの含有量を測定する試験をいい、用語「ＲＳ」は、不純物の存在および量についての試験である「関連物質」試験をいう。

安定性の結果は、表２２の製剤について、表２３および表２４において提供される。表２３は、各時点での測定ｐＨ値およびＴ０でのＴＴＸに対するＴＴＸの相対パーセントを含み、表２４は、Ｔ０に対するＴＴＸ分解生成物の相対パーセンテージを含む。

この追加研究の結果は、当初の研究と概ね一致していた。強酸はＴＴＸに対して同様の安定化効果を有することがわかり、これは、製剤に対するｐＨの影響を示している。この研究はまた、製剤中にＰＥＧ４００を使用する利点を確認した。

実施例１１ － 二次パーセンテージＨ_２Ｏ研究

水性ＭＳＡ、ＰＧおよびＰＥＧの組合せを含む製剤について、製剤中のＨ_２Ｏ濃度の影響に関するさらなる研究を行なった。試験した製剤の概要を表２５に示す。安定性は、最後の列に記した温度および時点で評価した。表２５の最後の行に示した２％のＭＳＡを含む製剤については、ＴＴＸが完全に溶解しなかった場合には、ＴＴＸの量をわずかに減らしてもよい。

試験結果を、表２６および２７に示す。表２６は、各時点における各製剤についての測定ｐＨ値およびＴ０におけるＴＴＸに対するＴＴＸの相対パーセントを含み、表２７は、Ｔ０におけるこれらの物質の量に対するＴＴＸ分解生成物（ｇ－ＴＴＸ、ｏ－ＴＴＸ、ｅ－ＴＴＸ、ａ－ＴＴＸ）の相対パーセンテージを含む。

これらの結果から、含水率が高いほど、ＴＴＸ分解の度合いが高いという明確な傾向が浮かび上がった。

実施例１２ － 例示的なＴＴＸ製剤

本明細書から理解されるように、本明細書中に記載の液体ＴＴＸ製剤は、好ましくは、非経口投与用の形態である。例えば、本明細書中に記載される製剤は、３０μｇのテトロドトキシンの初期用量を患者に提供するために、Ｉ．Ｍ．経路によって、または好ましくはＳ．Ｃ．経路によって投与され得る。別の実施例において、本明細書に記載の液体非経口製剤はまた、６０μｇのテトロドトキシンの１日用量を患者に提供するために投与され得る。また、本明細書に記載の製剤はまた、当業者に公知の様々な他の用量および投与レジメンにも適していることが理解されるであろう。それらの増強された安定性プロフィールの観点から、本明細書に記載の製剤は、バイアル、アンプル、シリンジ、自動注射器などといった容器内で一定期間保存されることに十分に適している。したがって、製剤は、対象による使用または対象への投与のために、所定の投与量で包装され得る。この点に関して、製剤は、例えば、プレフィルドシリンジなどに包装することができる。

以下の実施例は、本明細書のいくつかの可能なＴＴＸ製剤を例示するために提供される。

処理容器に注射用水と酢酸とを加えて、ｐＨ２．０の溶液を得た。上記溶液にテトロドトキシンを加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じて酢酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水とメタンスルホン酸とを加えて、ｐＨ２．０の溶液を得た。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。ジメチルアセトアミドとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水とメタンスルホン酸とを加えて、ｐＨ２．０の溶液を得た。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水、酢酸ナトリウムおよび酢酸を加えて、緩衝溶液を調製した。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを６．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸を加えて、緩衝溶液を調製した。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸を加えて、緩衝溶液を調製した。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水、一塩基性リン酸ナトリウムおよびリン酸を加えて、緩衝溶液を調製した。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを４．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

処理容器に注射用水、一塩基性リン酸ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウムを加えて、緩衝溶液を調製した。テトロドトキシンを上記溶液に加え、溶解するまで混合した。プロピレングリコールとポリエチレングリコール４００とを加え、十分に混合した。必要に応じてメタンスルホン酸を加えることによって、溶液のｐＨを６．０±０．５に調整した。溶液をろ過し、容器に充填した。

実施例１３ － プレフィルドシリンジ内に保存されたＴＴＸ製剤の安定性

プレフィルドシリンジ内に保存されたＴＴＸ製剤の安定性特性を決定するための研究を実施した。メタンスルホン酸（ＭＳＡ）、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むＴＴＸ製剤を、上記のように調製した。サンプルをＢＤネオパック１ｍｌ ２７ｇガラスシリンジに充填した。サンプルの安定性を、表２８に示すように、以下の条件および期間で評価した：

ＴＴＸおよびＴＴＸ不純物の相対量は、表２９に示すように、上記の各条件および時間について決定した。不純物の相対量は、上述の方法によって、時間０（Ｔ０）のサンプルとの比較におけるＨＰＬＣによって決定した。

^＊最初に観測した値は５．７９であったが、サンプルの粘性に起因して追加攪拌することが、ｐＨ測定値の安定化を助けた。
^１最初のｐＨ測定値である６．９２は、２～８℃でのｐＨ分析用に４本のシリンジのうち２本からプールした溶液を用いて取得した。別の日に同じ溶液を分析した結果、ｐＨは６．７４であった。残りの２本のシリンジをｐＨ分析用の新しい溶液にプールした結果、ｐＨ値は６．００および６．１４であった。
^２ＴＴＸピークのテーリングにおけるピーク／ハンプ（ＲＲＴ約１．０４５）は観察されなかった。

実施例１４ － 添加試験の順序

成分の添加順序がＴＴＸ溶解性に及ぼす潜在的影響を調べるために、組成物の成分の添加順序を変えた一連の実験を行った。最初に、以下の賦形剤比率ＰＧ：ＰＥＧ４００：ＭＳＡ（５０：４５：５）（ここで、ＭＳＡは０．０１Ｍの水性ＭＳＡである）を有するＴＴＸ製剤を、標準品として調製した。各工程後に、ｐＨおよび外観を記録した。この実験の結果を表３０において報告する。実験Ａ～Ｇでは、標準品と同じ組成を有するＴＴＸ製剤を調製したが、添加工程の順序を変更した。各添加工程後に、ｐＨおよび外観を記録した。実験Ａ～Ｇの結果を、表３１～３７に示す。これらの表は、成分の添加順序、各工程におけるｐＨおよび外観を含んでいる。ＭＳＡ／Ｈ２Ｏ中のＴＴＸのストック溶液を調製し、表３２～３７に示す実験Ｂ～Ｇにおいて使用した。

標準手順によって調製したＴＴＸ製剤および実験Ａ～Ｇにおいて調製したＴＴＸ製剤（表３０～３７）を分析して、各処理によって得られたＴＴＸの量および不純物の量を測定した。分析結果および不純物試験結果を、以下の表３８に示す。パーセンテージはｗ／ｖである。

Ｃ）有効性試験

実施例１５ － 化学療法誘発性神経障害を有するラットにおけるＴＴＸ製剤の有効性

化学療法誘発性神経障害を有するラットの治療において、ＴＴＸ凍結乾燥製剤およびＴＴＸ液体製剤の有効性を比較する研究を実施した。この研究のために、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。化学療法誘発性神経障害性疼痛（ＣＩＮＰ）は、オキサリプラチン４ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、週２回、最長３週間によって誘発した。神経障害の誘発は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓを用いた機械的アロディニアの評価によって確認した（ＰＷＴ≦４ｇ）。機械的アロディニアが誘導されたラットを７群に分け、５日間にわたり関連治療を行った。詳細を以下の表３９に示す。左後肢の疼痛閾値（Ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：ＰＷＴ）は、治療コース開始前の３日間（プレ試験）にわたって毎日、５日間の治療コースの間は、投与前、投与１時間後および投与２時間後に毎日、ならびに投与コースの開始後７日目、１０日目および１４日目に１回、試験した。ＰＷＴは、平均値±ＳＥＭとして表した。一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて、同じ時点における異なる群を比較した。

この研究のために、凍結乾燥ＴＴＸ製剤は、８μｇ／ｍＬの濃度で水中に再構成された凍結乾燥ＴＴＸを含み、安定な液体製剤は、実施例１４に記載された標準調製法によって調製された、ＰＧ：ＰＥＧ４００：ＭＳＡ（５０：４５：５）（ここで、ＭＳＡは０．０１Ｍの水性ＭＳＡである）の賦形剤比率を有するＴＴＸの製剤である。凍結乾燥ＴＴＸは、８μｇ／ｋｇの用量で投与され、一方、安定な液体製剤は、８μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇの用量で試験された。

２種類のＴＴＸ製剤についてのＰＷＴ試験の結果を図４～７に示す。コントロールサンプルとして、通常の生理食塩水および液体製剤のビヒクルを用いた。図４は、すべての試験時点におけるＰＷＴ試験結果を示している。試験時点には、オキサリプラチン投与前３日間にわたる毎日の試験（Ｐｒｅ１、Ｐｒｅ２、Ｐｒｅ３）、オキサリプラチン投与後２週間にわたる毎週の試験（Ｗ１、Ｗ２）、ＴＴＸ投与コースの間の１日３回の試験（Ｄ－０、ＴＴＸ投与前、Ｄ－１ｈ、ＴＴＸ投与１時間後、およびＤ－２ｈ、ＴＴＸ投与２時間後）、ならびにＴＴＸ投与後７日目、１０日目および１４日目の１日１回の試験が含まれる。投与期間中の異なる時点におけるＴＴＸの効果を理解するために、グラフ５～７は、ＴＴＸ投与の１時間前、２時間前、および直前の各時点のデータを分けており、その結果、比較がより容易に観察され得る。

これらの結果から、通常の生理食塩水を用いて治療したＣＩＮＰラットと、液体ＴＴＸ製剤用ビヒクルを用いて治療したＣＩＮＰラットとの間で、ベースラインおよび投与後のＰＷＴに有意差は認められなかった。このことは、ビヒクルはＰＷＴの結果において有意な因子ではないことを示している。８μｇ／ｋｇの注射用凍結乾燥ＴＴＸ（ｓｃ、１日１回）、および８μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇの安定な液体ＴＴＸ製剤（ｓｃ、１日１回）はすべて、ＣＩＮＰラットにおけるベースラインおよび投与後のＰＷＴを有意に増加させた。これは、図４～７に示されている。しかしながら、ＴＴＸの凍結乾燥製剤および液体製剤のＰＷＴ試験結果は誤差の範囲内で重なっているように見えるため、異なるＴＴＸ製剤の有効性に有意差はないようである。この実験は、ＴＴＸ液体製剤の有用性を実証している。

上記の説明には特定の具体的な実施形態への言及が含まれているが、その様々な変更が当業者には明らかであろう。本明細書で提供されるいかなる実施例も、説明の目的のみのために含まれ、何らかの限定をすることを意図していない。本明細書において提供されるあらゆる図面は、本明細書の種々の態様を説明する目的のみのために記載され、縮尺通りに描かれること、または何らかの限定をすることを意図するものではない。本明細書に添付された特許請求の範囲は、上記の説明に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、本明細書全体と整合する最も広い解釈が与えられるべきである。本明細書において引用された全ての先行技術の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

図１は、有機溶媒として異なる比率のプロピレングリコール（「ＰＧ」）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含む製剤におけるテトロドトキシン（「ＴＴＸ」）の安定性を示す。 図２は、異なるｐＨを有し、酸／ＰＧ／ＰＥＧ４００の比率が５／５０／４５（ｖ／ｖ）である製剤におけるＴＴＸの安定性を示す。 図３は、異なるｐＨを有し、酸／ＰＧ／ＰＥＧ４００の比率が５／８０／１５（ｖ／ｖ）である製剤におけるＴＴＸの安定性を示す。 図４は、オキサリプラチン誘発性疼痛モデルラットにおける、疼痛閾値（ＰＷＴ）に対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。 図５は、投与１時間後のラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。 図６は、投与２時間後のラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。 図７は、ラットのオキサリプラチン誘発性疼痛モデルにおける、ベースラインＰＷＴに対する２つのＴＴＸ製剤の効果を示すグラフである。

おそらく強力な神経毒であるために、ＴＴＸはあまり研究されてこなかった。しかしながら、テトロドトキシンは、薬理学的研究、特に神経生理学およびイオンチャネル電気生理学の研究のツールとして使用されていることが知られている。科学的研究における使用に加えて、ＴＴＸの治療への応用も報告されている。いくつかの場合において、注射用（すなわち、水溶液の形態）のテトロドトキシン組成物が報告されている。例えば、ＴＴＸおよびその誘導体は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）および癌関連疼痛（ＣＲＰ）の治療における非オピオイド鎮痛剤としての使用が報告されている。ＴＴＸのこれらおよび他の使用例は、例えば、米国特許第５，８４６，９７５号；第６，４０７，０８８号；第６，５９９，９０６号；第８，４８６，９０１号；第９，０１８，２２２号；および第１０，６２４，８９６号に記載されている。

一態様において、疼痛の治療のための、ＴＴＸを含む安定な液体製剤の使用が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）である。

別の一態様において、疼痛治療において使用するための、ＴＴＸを含む安定な液体製剤が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）である。

別の一態様において、疼痛の治療のために、ＴＴＸを含む安定な液体製剤を、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。さらなる一態様において、疼痛は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）である。

化学療法誘発性神経障害を有するラットの治療において、ＴＴＸ凍結乾燥製剤およびＴＴＸ液体製剤の有効性を比較する研究を実施した。この研究のために、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）は、オキサリプラチン４ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、週２回、最長３週間によって誘発した。神経障害の誘発は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓを用いた機械的アロディニアの評価によって確認した（ＰＷＴ≦４ｇ）。機械的アロディニアが誘導されたラットを７群に分け、５日間にわたり関連治療を行った。詳細を以下の表３９に示す。左後肢の疼痛閾値（Ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：ＰＷＴ）は、治療コース開始前の３日間（プレ試験）にわたって毎日、５日間の治療コースの間は、投与前、投与１時間後および投与２時間後に毎日、ならびに投与コースの開始後７日目、１０日目および１４日目に１回、試験した。ＰＷＴは、平均値±ＳＥＭとして表した。一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて、同じ時点における異なる群を比較した。

この研究のために、凍結乾燥ＴＴＸ製剤は、水中に再構成されてから８μｇ／ｍＬの濃度に希釈された凍結乾燥ＴＴＸを含み、安定な液体製剤は、実施例１４に記載された標準調製法によって調製された、ＰＧ：ＰＥＧ４００：ＭＳＡ（５０：４５：５）（ここで、ＭＳＡは０．０１Ｍの水性ＭＳＡである）の賦形剤比率を有するＴＴＸの製剤である。凍結乾燥ＴＴＸは、８μｇ／ｋｇの用量で投与され、一方、安定な液体製剤は、８μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇの用量で試験された。

２種類のＴＴＸ製剤についての機械的アロディニア評価の結果を図４～７に示す。コントロールサンプルとして、通常の生理食塩水および液体製剤のビヒクルを用いた。図４は、すべての試験時点におけるＰＷＴ試験結果を示している。試験時点には、オキサリプラチン投与前３日間にわたる毎日の試験（Ｐｒｅ１、Ｐｒｅ２、Ｐｒｅ３）、オキサリプラチン投与後２週間にわたる毎週の試験（Ｗ１、Ｗ２）、ＴＴＸ投与コースの間の１日３回の試験（Ｄ－０、ＴＴＸ投与前、Ｄ－１ｈ、ＴＴＸ投与１時間後、およびＤ－２ｈ、ＴＴＸ投与２時間後）、ならびにＴＴＸ投与後７日目、１０日目および１４日目の１日１回の試験が含まれる。投与期間中の異なる時点におけるＴＴＸの効果を理解するために、グラフ５～７は、ＴＴＸ投与の１時間前、２時間前、および直前の各時点のデータを分けており、その結果、比較がより容易に観察され得る。

Claims (38)

1. 安定な液体製剤であって、
   テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩と、１つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体および賦形剤と、を含む、
   製剤。
2. 前記製剤は、１つ以上の：溶媒；ｐＨ調整剤；緩衝剤；および安定化剤をさらに含む、
   請求項１に記載の製剤。
3. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩は、約５～約５０００μｇ／ｍＬの濃度で前記製剤中に存在する、
   請求項１または２に記載の製剤。
4. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩は、約６０～約１５０μｇ／ｍＬの濃度で前記製剤中に存在する、
   請求項１または２に記載の製剤。
5. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩は、約３０μｇ／ｍＬの濃度で前記製剤中に存在する、
   請求項１または２に記載の製剤。
6. 前記製剤は、水性成分および非水性有機成分を含む、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の製剤。
7. 前記水性成分は、前記製剤の約２％～約１０％（ｖ／ｖ）で存在する、
   請求項６に記載の製剤。
8. 前記水性成分は、前記製剤の約２％～約５％（ｖ／ｖ）で存在する、
   請求項６に記載の製剤。
9. 前記有機成分は、前記製剤の約９０％～約９８％（ｖ／ｖ）で存在する、
   請求項６に記載の製剤。
10. 前記有機成分は、前記製剤の約９５％～約９８％（ｖ／ｖ）で存在する、
    請求項６に記載の製剤。
11. 前記水性成分は、酸水溶液を含む、
    請求項６～１０のいずれか１項に記載の製剤。
12. 前記酸水溶液は、塩酸、酢酸、無水クエン酸、ベンゼンスルホン酸、クエン酸一水和物、乳酸、（ＤＬ）－乳酸、（Ｌ）－乳酸、メタンスルホン酸、およびリン酸のうち１つ以上を含む、
    請求項１１に記載の製剤。
13. 前記酸水溶液は、メタンスルホン酸を含む、
    請求項１１に記載の製剤。
14. 前記有機成分は、エチルアルコール、脱水エチルアルコール、変性エチルアルコール、ベンジルアルコール、ジメチルスルホキシド、グリセリン、イソプロピルアルコール、メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールのうち１つ以上を含む、
    請求項６～１３のいずれか１項に記載の製剤。
15. 前記有機成分は、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールの組合せである、
    請求項１４に記載の製剤。
16. 前記ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）、ポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ３００）、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）、および／またはポリエチレングリコール６００（ＰＥＧ６００）である、
    請求項１４または１５に記載の製剤。
17. 前記製剤は、水性酸、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールを含む、
    請求項１４～１６のいずれか１項に記載の製剤。
18. 前記水性酸、前記プロピレングリコール（ＰＧ）、および前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、約５：８０：１５～５：２０：７５（ｖ／ｖ）の比率で前記製剤中に存在する、
    請求項１７に記載の製剤。
19. 前記水性酸、前記プロピレングリコール（ＰＧ）、および前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、約５：４０：５５（ｖ／ｖ）の比率で前記製剤中に存在する、
    請求項１７に記載の製剤。
20. 前記酸は、ＭＳＡである、
    請求項１７～１９のいずれか１項に記載の製剤。
21. 前記ＰＥＧは、ＰＥＧ４００である、
    請求項１７～２０のいずれか１項に記載の製剤。
22. 前記製剤のｐＨは、約３～約６である、
    請求項１～２１のいずれか１項に記載の製剤。
23. 前記製剤のｐＨは、約４～約５である、
    請求項１～２１のいずれか１項に記載の製剤。
24. 前記製剤のｐＨは、塩酸、酢酸、無水酢酸、アジピン酸、無水クエン酸、ベンゼンスルホン酸、ホウ酸、クエン酸一水和物、乳酸、（ＤＬ）－乳酸、（Ｌ）－乳酸、マレイン酸、メタリン酸、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、コハク酸、硫酸、亜硫酸、酒石酸、（ＤＬ）－酒石酸、トリフルオロ酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、エデト酸、ギ酸、ラクトビオン酸、アスパラギン酸、カプリル酸、グルクロン酸、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、メチルボロン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペンテト酸、ステアリン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム十水和物、炭酸ナトリウム一水和物、ジエタノールアミン、メグルミン、トロメタミン、および／またはアンモニアで調整されている、
    請求項２２または２３に記載の製剤。
25. 前記製剤は、約５～約１２０μｇ、約１５～約６０μｇ、または約３０μｇのテトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩の用量を提供するように適合されている、
    請求項１～２４のいずれか１項に記載の製剤。
26. 前記製剤は、容器内に提供される、
    請求項２５に記載の製剤。
27. 前記容器は、バイアル、アンプルまたはシリンジである、
    請求項２６に記載の製剤。
28. 前記製剤は、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）投与に適合されている、
    請求項１～２７のいずれか１項に記載の製剤。
29. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩のうち１０％未満は、４０℃で２８日間保存された後に分解する、
    請求項１～２８のいずれか１項に記載の製剤。
30. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩のうち１０％未満は、２５℃で４週間保存された後に分解する、
    請求項１～２８のいずれか１項に記載の製剤。
31. 前記テトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩のうち１０％未満は、２～８℃の温度で３ヶ月間保存された後に分解する、
    請求項１～２８のいずれか１項に記載の製剤。
32. 請求項１～３１のいずれか１項に記載の製剤を所定量含む、プレフィルドシリンジ。
33. 前記シリンジは、５～１２０μｇ、１５～６０μｇ、または約３０μｇのテトロドトキシン、および／またはその誘導体、アナログもしくは薬学的に許容可能な塩の用量を送達するように適合されている、
    請求項３２に記載のプレフィルドシリンジ。
34. 前記シリンジは、ＩＭまたはＳＣ投与に適合されている、
    請求項３２または３３に記載のプレフィルドシリンジ。
35. 化学療法誘発性神経障害性疼痛の治療または予防のための、請求項１～３１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤、または請求項３２～３４のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジの使用。
36. 化学療法誘発性神経障害性疼痛の治療または予防において使用するための、請求項１～３１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤、または請求項３２～３４のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジ。
37. それを必要とする対象における、化学療法誘発性神経障害性疼痛の治療または予防の方法であって、請求項１～３１のいずれか１項に記載の安定な液体製剤を前記対象に投与することを含む、方法。
38. 前記安定な液体製剤は、請求項３２～３４のいずれか１項に記載のプレフィルドシリンジにより投与される、
    請求項３７に記載の方法。

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