JP2024513079A - コロナウイルス感染症およびその関連する疾患の経口治療のための抗ウイルス性化合物、化合物の製造のための方法、抗ウイルス性医薬組成物、それらの化合物および方法の使用 - Google Patents

コロナウイルス感染症およびその関連する疾患の経口治療のための抗ウイルス性化合物、化合物の製造のための方法、抗ウイルス性医薬組成物、それらの化合物および方法の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトおよび獣医学的コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＭＨＶによって表されるコロナウイルス感染症の予防的、治癒的（治療的）、または緩和的治療およびＣＯＶＩＤ－１９に曝露された可能性がある個体の治療のために、ウイルスＲＮＡ合成の阻害薬として、サイトカイニン、それらのヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ、ならびにそれらのプロドラッグから選択される抗ウイルス性化合物、またはそれらの塩、溶媒和物、誘導体、もしくはさらに前述の化合物の組合せに関する。本発明は、このような化合物の製造のための方法、本発明の化合物を含有する抗ウイルス性医薬組成物、加えて化合物の使用、化合物の組合せ、ならびにコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって表されるコロナウイルス感染症およびＣＯＶＩＤ－１９の患者、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したか、またはこのウイルスに曝露した可能性がある個体の予防的、治癒的（治療的）、または緩和的治療のための方法も含む。本発明の化合物のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス活性は、３’－５’－エキソヌクレアーゼを阻害することによって、大幅に増強された。本発明による化合物の相乗的結果は、転用された薬物との組合せから得られた。【選択図】図１Ａ

Description

[0001]本発明は、プリン塩基、それらのヌクレオシド、ヌクレオチドを包含する抗ウイルス性化合物および関連する製造方法であって、２０１９コロナウイルス病（ＣＯＶＩＤ－１９）を有する個体の予防、治療、および治癒を目標として、コロナウイルス科のメンバーにおけるウイルスＲＮＡ合成を妨げるための抗ウイルス性化合物および関連する製造方法を含む。本発明の化合物を含有する抗ウイルス性医薬組成物に加えて、ＣＯＶＩＤ－１９における化合物の使用、化合物と組成物の組合せ、および化合物の使用のための方法は、これ以降で主張される。特定の実施形態において、本開示は、ゼアチン（ＭＢ－９０７）、ゼアチンリボシド（ＭＢ－８０４）、カイネチン（ＭＢ－９０５）、カイネチンリボシド（ＭＢ－８０１）、それらのヌクレオチドおよびホスホルアミデートプロドラッグ（ＭＢ－７１１）、特に、カイネチンリボシド５’－三リン酸（ＭＢ－７１７）のようなサイトカイニンの部類を含む特定のプリン、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのプロドラッグ、それらの一リン酸エステルおよび二リン酸エステルおよび活性な三リン酸エステルまたはそれらの塩に関する。
[0002]病原性コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および２０１９コロナウイルス病（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因病原体である新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって実証されたとおり、世界的な公衆衛生にとっての大きな脅威である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝解析は、コウモリ由来のｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＣ４５およびｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＸＣ２１（１）のＳＡＲＳ様ベータコロナウイルスとのその類縁性を明らかにした。２０２１年の年間を通じて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、世界でおよそ１千８百万の人々の死を引き起こしたと考えられている。高病原性コロナウイルス（ＣｏＶ）に加えて、ウイルス種２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＨＫＵ１、およびＯＣ４３といったコロナウイルス科の他のメンバーは、ヒトにおいて季節性感染症を引き起こす。この科のメンバーは、宿主細胞内で転写され、複製されるプラス鎖のウイルスＲＮＡを有する。この科の全てのメンバーは、ウイルスゲノムを複製するための機構において、７０～１００％の相同性を共有している。
[0003]最近まで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックを制御するために最も効果的で、使用された対応は、感染者と非感染者の間の接触を避け、該ウイルスの伝播曲線を平らにする試みとして、ソーシャルディスタンスを保つことであった。社会的行動はウイルスの伝染速度を乱すことはできるが、それらが感染者の絶対数を減少させることは期待されない。さらに、これらの戦略は、世界的な経済活動の重大な低下も引き起こす。
[0004]いくつかのワクチンはすでに承認されており、他は開発中である。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、より伝染しやすい変異株に変異し、利用可能なワクチンの効率に抗っている。これらの変異は、ウイルスのスパイクタンパク質に、これまでのところ集中されている。さらに、３種の直接作用型小分子抗ウイルス剤が、臨床試験の段階を通過した。注入可能なレムデシビル（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および経口投与可能なモルヌピラビル（Ｍｅｒｃｋ）は、ＦＤＡによる緊急使用許可を得た。レムデシビルおよびモルヌピラビルは、ＲＮＡ合成を阻害するようにデザインされた。ウイルスの主要プロテアーゼ（Ｍｐｒｏ）の阻害薬であるバロキサビル（Ｐｆｉｚｅｒ）も、承認前に使用許可を得た。
[0005]Ｃｏｖｉｄ－１９パンデミックに対する予防接種が７０％を超え、集団免疫が期待される国々においてさえ、新規の変異株が絶えず出現し、公衆衛生システムを脅かしている。
[0006]ＣＯＶＩＤ－１９の臨床症状は、インフルエンザ様疾病から死亡を招く重度の全身合併症までに及ぶ。疾患の重症性の進行は、上気道から下気道へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の移動と重なって、数日間または数週間以内に生じることがある。気道の常在細胞またはこの器官系に移動する他の細胞のいずれかは、それらがウイルス侵入のための受容体：アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を有する限り、感染されやすい。ＣＯＶＩＤ－１９患者の死後サンプルからの検死によって判断されるように、肺のＩＩ型肺胞上皮細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症によって細胞死に至り、肺コンプライアンスを維持するためのＣ型サーファクタントを産生するその能力が制限されていることが知られている。感染症の自然史の過程において、呼吸障害および重度のＣＯＶＩＤ－１９の急性期における猛烈なウイルス産生は、危篤状態の患者における白血球減少および凝血異常と関連する非制御の炎症誘発性疾患に進行する。全身的な炎症誘発状態のみで、血管透過性を増強し、内皮細胞の細胞死を増加することが可能であり、これは、免疫系から肺への細胞の移動に関する正のフィードバックを生じ得て、末梢血中のこれらの細胞の結果的な細胞死および白血球減少を伴う。凝血障害は、ウイルス誘導細胞死の結果として、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子および組織因子（ＣＤ１４２）のような凝血促進シグナルを呈示し、血小板を動員して生じる。単球および他の細胞と血小板の相互作用も、炎症を悪化させる。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、主にＩＩ型肺胞上皮細胞内で活発に複製し、一部の個体においてサイトカインストームおよび血栓経路の病勢悪化を招く。重度のＣＯＶＩＤ－１９と関連するウイルス誘発性肺炎および敗血症様疾患以外に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、中枢神経系および肝臓に達する場合がある。直接作用型抗ウイルス薬によって、感染症の自然な臨床的進展を早期に妨害することは、重度のＣＯＶＩＤ－１９への疾患進行を予防できる可能性があるであろう。実際に、早期の抗ウイルス的介入を提供する臨床試験は、ウイルス量の減少を加速させ、疾患進行を遅らせた。ウイルスの排出を低下させることは、個体を保護し、伝染性を低下させ、ひいては全体としての集団の利益となる可能性があるため、ウイルス量の減少は、重要な検査パラメータであると予想される。
[0007]感染者および全体としての社会に対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が招いた世界的な負担に効果的に対処するため、即時使用（転用すること）のための新規の抗ウイルス薬を同定することに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の臨床スペクトルを予防し、治療するための中長期的な解決策のためのより有効で選択的な新規の化学物質およびワクチンを開発することは不可欠である。
[0008]近年、バイオインフォマティクスは、いくつか病状に対して見込みのある薬物を提案するための技術として使用されている。しかし、創薬は、依然として、集中的な科学的経験的調査を必要とする科学的挑戦である。
[0009]計算創薬またはコンピュータ内のデータに基づいた最近の科学的出版物および特許参考文献は、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するための公知の抗ウイルス薬の使用をすでに示唆していた。これらには、ドルテグラビル、ラルテグラビル、ダクラタスビル、オムビタスビル、およびピブレンタスビルが含まれていた。実験的証拠はないにもかかわらずである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する活性な候補物質を予測する計算論的アプローチは、具体化されることはないものの、カイネチンリボシドまたはゼアチンリボシドが抗ウイルス特性を有するであろうことを示唆していた。
[0010]世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに対処するため、既知の薬物を転用することを試みる緊急戦略を提案した。インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）と組み合わせたか、または組み合わせないロピナビル（ＬＰＶ）／リトナビル（ＲＴＶ）、クロロキン（ＣＱ）およびハイドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、ならびにレムデシビル（ＲＤＶ）は、順調な連帯試験下で初期に検討された。明白な臨床的利益の欠如は、ＣＱ、ＨＣＱ、およびＬＰＶ／ＲＴＶに対する熱意を冷めさせた。感染症の自然史と一致して、ＲＤＶは、疾病発症後の早期に提供される限り、ヒト以外の霊長類において、かつ限られた数の臨床研究において有望な結果を示した。ＣＯＶＩＤ－１９に対するＲＤＶの初期の肯定的な結果のために、この薬物は、食品医薬品局（ＦＤＡ）による緊急許可を得た。それにもかかわらず、一部はその製造手順における難しさの結果であるその価格のために、世界的なＲＤＶの利用機会は限られている。加えて、ＲＤＶは、経口バイオアベイラビリティが乏しく、高度の肝抽出を受けて、そこで優先的にその活性型に変換される。ＲＤＶは、コロナウイルスＲＮＡ合成の後半の停止を誘発するために、その三リン酸エステルに変換される必要のあるアデノシン様モノホスホルアミデートプロドラッグである。別のヌクレオシドアナログであるＮ－４－ヒドロキシシチジン－５’－イソプロピルエステル、ＥＩＤＤ－２８０１、またはＭＫ－４４８２は、経口で生物学的に利用可能であり、ＳＡＲＳ－、ＭＥＲＳ－、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルスに対して抗ウイルス活性を示すことが認められている。ＭＫ－４４８２は、Ｎ４－ヒドロキシシチジン（ＮＨＣ）のヌクレオチド三リン酸のプロドラッグであり、ウイルスゲノムへのその取込み後に、エラープローンウイルスＲＮＡ複製の導入を介したその抗ウイルス活性を発揮する。ＭＫ－４４８２は、ＵＫおよびＵＳにおいて、健常者を対象に「安全性、忍容性、および薬物動態」に関する予備的なヒトでの研究で試験されたが、ヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの毒性が認められたため、ある程度の懸念がある。それにもかかわらず、ＣＯＶＩＤ－１９に対する緊急対応という観点から、この薬物は、ＣＯＶＩＤ－１９のための治療に関する有効性臨床試験へと進められ、ＦＤＡから限定的使用の許可を得た。
[0011]ファビピラビルは、ＲＮＡウイルスに対する広範囲の活性を有するピラジンアナログである。このプロドラッグは、サルベージ経路によって取り込まれ、最初に、そのリボシド一リン酸に変換される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する効力が極めて低いことを示唆する初期の賛否両論の結果およびＣＯＶＩＤ－１９を用いた限定的な臨床研究にもかかわらず、感染動物は、高用量のファビピラビルを用いて寛解した。このため、投与量が１．５ｇ／日を超えるいくつかの臨床研究が、ＣＯＶＩＤ－１９に対して進行中である。
[0012]Ｃ６－アミノメチルグアノシンアナログであるＡＴ－５２７は、ＡＴＥＡ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の２’－フルオロ－２’－Ｃ－メチルグアノシン－５’－一リン酸の新規のホスホルアミデートプロドラッグであるＡＴ－５１１の半硫酸塩である。経口で生物学的に利用可能であるこのプロドラッグは、マイクロモル濃度範囲で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染肝細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力を示した。これは期待された評価項目に近年達することができず、新規の臨床研究が進行中である。
[0013]ＲＤＶ、ファビピラビル、モルヌピラビル、およびＡＴ－５２７は、それらの対応する三リン酸エステルのプロドラッグであって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって新生ウイルスＲＮＡに組み込まれるプロドラッグである。これらの薬物も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製サイクルにおけるオルソログ酵素であって、非構造タンパク質１２（ｎｓｐ１２）としても知られているオルソログ酵素を標的とする。さらに、転写および複製を行うために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２は、協調的な触媒複合体中の他のウイルス非構造タンパク質と関連する。この独自の複製酵素／転写複合体は、他の非構造タンパク質の同期活性を行う：ウイルスヘリカーゼ（ｎｓｐ１３）；ホロＲＮＡポリメラーゼ（その補因子ｎｓｐ７および８、ならびに主なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素であるｎｓｐ１２；３’，５’－エキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１３）、エンドヌクレアーゼ（ｎｓｐ１５）、およびメチルトランスフェラーゼ（ｎｓｐ１４およびｎｓｐ１６）。この多段階イベントは、ウイルス複製を阻害するいくつかの機会を示す。コロナウイルスの酵素機構が高度に保存されているため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、全体としてのコロナウイルス科に対する抗ウイルス性化合物を開発するための原型種とみなされ得る。
[0014]免疫応答を回避するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の能力、近年承認された抗ウイルス薬の限界、および全てではないが転用する取り組みの大半の失敗を含む上記の全てのことから、より有効で特異的な新規薬物の必要性は、引き続き差し迫った目的である。
[0015]数年にわたり、ピリミジン、プリン、それらのヌクレオシド、およびそれらのヌクレオチドのアナログは、抗ウイルス剤の豊富な供給源であることを証明してきた。ＲＤＶ、ＭＫ－４４８２、およびＡＴ－５２７は、この化合物のファミリーの優れた抗Ｃｏｖｉｄ－１９能を再確認するように思われる。したがって、このことは、経口で利用可能であり、強力な直接作用型の抗ウイルス療法を検索するにあたり、この供給源の可能性をさらに探索することと関連する。
[0016]本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症の治療および／または予防のための化合物、医薬組成物、および方法／使用であって、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害する能力のあるプリン、それらのヌクレオシド、およびそれらのヌクレオチドのアナログから選択された化合物、医薬組成物、および方法／使用を提供する。また、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的治療、曝露後（治療的）治療のための、およびコロナウイルスへの曝露の可能性がある個体または曝露の危険性がある個体の治療のための、それらの誘導体、塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、またはさらに化合物の組合せも含まれる。
[0017]本発明の他の実施形態は、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、およびＣＯＶＩＤ－１９の個体の治療のための、有効な抗ウイルス量の１種または複数の本発明の化合物、それらの誘導体、塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、またはさらに上記の化合物の組合せ、ならびに（ｉｉ）有効成分と適合する薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。
[0018]加えて、本発明は、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害するため、ならびに（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、およびＣＯＶＩＤ－１９の個体の治療のための、抗ウイルス薬の製造のための本発明の化合物および組成物の使用に関する。
[0019]本発明のある実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された可能性がある個体の予防的、治癒的、または緩和的治療のための方法であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された可能性がある個体が治療上有効な量の１種または複数の本発明の抗ウイルス性化合物を用いて治療される、方法でもある。さらに、リード化合物は、急性および２８日間反復投与毒性試験によると、遺伝毒性がなく安全であり（無毒性）、ｈＥＲＧおよび遠隔測定アッセイによると、心血管系に対して安全である。
[0020]図１Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する化合物の抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＶｅｒｏ細胞を、３７℃で１時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および表示された濃度の化合物を含有する新たなダルベッコ改変イーグル培地、すなわちＤＭＥＭを用いてインキュベートした。Ｖｅｒｏ細胞を、０．０１のＭＯＩで感染させ、２４時間後に細胞単層を溶解した。全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＮ遺伝子の領域におけるサブゲノムＲＮＡの検出によって、ウイルスＲＮＡ合成を定量化した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。アスタリスクは、Ｐ値が０．０５未満であることを示す。図１Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する化合物の抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＨｕＨ－７細胞を、３７℃で１時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および表示された濃度の化合物を含有する新たなダルベッコ改変イーグル培地、すなわちＤＭＥＭを用いてインキュベートした。ＨｕＨ－７細胞を、０．１のＭＯＩで感染させ、４８時間後に細胞単層を溶解した。全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＮ遺伝子の領域におけるサブゲノムＲＮＡの検出によって、ウイルスＲＮＡ合成を定量化した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。アスタリスクは、Ｐ値が０．０５未満であることを示す。図１Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する化合物の抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞を、３７℃で１時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および表示された濃度の化合物を含有する新たなダルベッコ改変イーグル培地、すなわちＤＭＥＭを用いてインキュベートした。Ｃａｌｕ－３細胞を、０．５のＭＯＩで感染させ、４８～７２時間後に細胞単層を溶解した。全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＮ遺伝子の領域におけるサブゲノムＲＮＡの検出によって、ウイルスＲＮＡ合成を定量化した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。アスタリスクは、Ｐ値が０．０５未満であることを示す。 同上。 同上。 [0021]図２Ａは、感染性ウイルス粒子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する化合物の抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を、丁度この時点で加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。ＭＢ－９０５、その対応するリボヌクレオシド（ＭＢ－８０１）、およびモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）を表示した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびＭＫ－４４８２を、陽性対照として使用した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。図２Ｂは、感染性ウイルス粒子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する化合物の抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を、丁度この時点で加え、その後数日間にも加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。ＭＢ－９０５、その対応するリボヌクレオシド（ＭＢ－８０１）、およびモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）を表示した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびＭＫ－４４８２を、陽性対照として使用した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 [0022]図３Ａは、化合物ＭＢ－９０５の抗コロナウイルス活性は、酵素アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）の関与を必要とすることを示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＨｕＨ－７細胞を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、表示された濃度のＭＢ－９０５を用いてアデニン１０μＭの存在下もしくは非存在下で処理するか、またはその９－テトラヒドピラニル誘導体（ＭＢ－９０６）を用いて処理した。４８時間後、細胞単層を溶解し、全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＮ遺伝子の領域におけるサブゲノムＲＮＡの検出によって、ウイルスＲＮＡ合成を定量化した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。図３Ｂは、化合物ＭＢ－９０５の抗コロナウイルス活性は、酵素アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）の関与を必要とすることを示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、表示された濃度のＭＢ－９０５を用いてアデニン１０μＭの存在下もしくは非存在下で処理するか、またはＭＢ－９０６を用いて処理した。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 [0023]ＩＩ型肺胞上皮細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連ＲＮＡ合成の減少を示す図である。Ｃａｌｕ－３細胞（４８－ウェルプレート中５×１０５細胞／ウェル）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された化合物を１０μＭで加えた。４８～７２時間後、細胞単層を溶解し、全ＲＮＡを抽出し、ＯＲＦ１およびＯＲＦＥ ｍＲＮＡの検出のために、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施した。このデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊溶媒（ＤＭＳＯ）との比較に関してＰ＜０．０５。＃ゲノムとサブゲノムＲＮＡにおける差異に関してＰ＜０．０５。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 [0024]化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成およびヒト初代単球においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘発される炎症メディエータの放出を妨げることを示す図である。ヒト初代単球を、０．０１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中の細胞関連ウイルスＲＮＡ量（Ａ）に加えて、ＴＮＦ－α（Ｂ）およびＩＬ－６（Ｃ）レベルを測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーからの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成およびヒト初代単球においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘発される炎症メディエータの放出を妨げることを示す図である。ヒト初代単球を、０．０１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中の細胞関連ウイルスＲＮＡ量（Ａ）に加えて、ＴＮＦ－α（Ｂ）およびＩＬ－６（Ｃ）レベルを測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーからの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成およびヒト初代単球においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘発される炎症メディエータの放出を妨げることを示す図である。ヒト初代単球を、０．０１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中の細胞関連ウイルスＲＮＡ量（Ａ）に加えて、ＴＮＦ－α（Ｂ）およびＩＬ－６（Ｃ）レベルを測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーからの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 [0025]図６Ａは、感染性ウイルス粒子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する化合物の抗ウイルス活性が、エキソヌクレアーゼによる共阻害によって増強されることを示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。ＭＢ－９０５、ＭＢ－８０１、ＭＢ－７１１、およびＭＢ－８０４を１０μＭで使用した。レムデシビル（ＲＤＶ）、ソフォスブビル、およびテノホビルを、陽性対照として、濃度１０μＭで使用した。ウイルスエキソヌクレアーゼの阻害は、５μＭのＨＩＶインテグラーゼ阻害薬であるラルテグラビルによって達成された。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊感染した細胞と無処理の細胞（ｎｉｌ）を比較した統計的差異であるＰ＜０．０５を示す。＃単独処理としての特定の薬物を、ラルテグラビルとの組合せ処理としてのその使用と比較した統計的差異であるＰ＜０．０５を示す。図６Ｂは、感染性ウイルス粒子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する化合物の抗ウイルス活性が、エキソヌクレアーゼによる共阻害によって増強されることを示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。ＭＢ－９０５、ＭＢ－８０１、ＭＢ－７１１、およびＭＢ－８０４を１０μＭで使用した。レムデシビル（ＲＤＶ）、ソフォスブビル、およびテノホビルを、陽性対照として、濃度１０μＭで使用した。ウイルスエキソヌクレアーゼの阻害は、５μＭのＨＩＶインテグラーゼ阻害薬であるドルテグラビルによって達成された。このデータは、実験毎に３回の技術的反復で実施された少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊感染した細胞と無処理の細胞（ｎｉｌ）を比較した統計的差異であるＰ＜０．０５を示す。＃単独処理としての特定の薬物を、ドルテグラビルとの組合せ処理としてのその使用と比較した統計的差異であるＰ＜０．０５を示す。 [0026]図７Ａは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおけるトランジションおよびトランスバージョンを誘発することを示す図である。密度２×１０６細胞のＨｕｈ－７細胞を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩで感染させ、初めに０．５μＭのＭＢ－９０５を用いて処理した。細胞を、細胞変性作用（ＣＰＥ）が観察されるまで毎日モニターした。ウイルスを、培養上清から回収し、力価を測定し、より高い薬物濃度の存在下での次回の感染に使用した。これらの継代培養を、３カ月の期間続け、０．５～９μＭのＭＢ－９０５濃度を用いた。対照として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、無処理で継代し、培養と関連する遺伝的浮動をモニターした。各継代培養において、全ＲＮＡを、Ｑｉａｍｐ ｖｉｒａｌ ＲＮＡによって培養上清から抽出し、ＭＧＩＥａｓｙ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔを使用したライブラリー構築のために、４．２ｎｇを使用した。全てのライブラリーを、ＲＮＡ－断片化（２５０ｂｐ）を介して構築し、続いて逆転写および第２鎖合成を行った。ＭＧＩＥａｓｙ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓを用いた精製後、ライブラリーを定量化し、フローセルにロードした（ＭＧＩ－２０００）。アラインメントおよび塩基統計（ｂａｓｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）のためにＭｅｇａ７．０ソフトウエアを使用した。サンプルを４通り使用した。ｐｈｒｅｄ（ｐｈｒｅａｄ）品質スコアがＱ３６を上回る配列のみを考慮に入れた。平均カバレッジは、１０，０００倍を上回った。塩基配列決定継代培養の進化史は、ブートストラップ（ｂｏｏｓｔｒａｐｓ）１０００回で、最尤法およびＫｉｍｕｒａ－２ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌを使用することによって推論された。この系統樹は、Ｗｕｈａｎ－０１ ｉｎｄｅｘ ｃａｓｅ（＃ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２５）によって根を付けられ、ＭＢ－９０５関連配列は赤色であり、対照配列（ｎｉｌ）は緑色である。配列は、アクセッションコード＃ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８００、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４５でＧＩＳＡＩＤに集積されている。図７Ｂは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおけるトランジションおよびトランスバージョンを誘発することを示す図である。密度２×１０６細胞のＨｕｈ－７細胞を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩで感染させ、初めに０．５μＭのＭＢ－９０５を用いて処理した。細胞を、細胞変性作用（ＣＰＥ）が観察されるまで毎日モニターした。ウイルスを、培養上清から回収し、力価を測定し、より高い薬物濃度の存在下での次回の感染に使用した。これらの継代培養を、３カ月の期間続け、０．５～９μＭのＭＢ－９０５濃度を用いた。対照として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、無処理で継代し、培養と関連する遺伝的浮動をモニターした。各継代培養において、全ＲＮＡを、Ｑｉａｍｐ ｖｉｒａｌ ＲＮＡによって培養上清から抽出し、ＭＧＩＥａｓｙ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔを使用したライブラリー構築のために、４．２ｎｇを使用した。全てのライブラリーを、ＲＮＡ－断片化（２５０ｂｐ）を介して構築し、続いて逆転写および第２鎖合成を行った。ＭＧＩＥａｓｙ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓを用いた精製後、ライブラリーを定量化し、フローセルにロードした（ＭＧＩ－２０００）。アラインメントおよび塩基統計（ｂａｓｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）のためにＭｅｇａ７．０ソフトウエアを使用した。サンプルを４通り使用した。ｐｈｒｅｄ（ｐｈｒｅａｄ）品質スコアがＱ３６を上回る配列のみを考慮に入れた。平均カバレッジは、１０，０００倍を上回った。無処理の対照に対するＭＢ－９０５処理配列における変化を比較しつつ、コドン位置との関連における塩基使用の統計の使用。ｃＤＮＡ塩基配列決定の代用として、Ｔとされている位置は、元のＲＮＡにおけるＵに相当する。２－および１．５－倍変化は、それぞれＰ＜０．０１およびＰ＜０．０５で統計的に有意である。配列は、アクセッションコード＃ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８００、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４５でＧＩＳＡＩＤに集積されている。 [0027]マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 マウス（図８Ａ～Ｃ）およびラット（図８Ｄ～Ｆ）の両方におけるＭＢ－９０５に関する経口および静脈内薬物動態を示す図である。動物の数は、各図の説明文に示される。垂直線は、平均値±標準誤差偏差を表す。 [0028]ＭＢ－９０５が、原型ベータ－コロナウイルスマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）に感染させたＳｗｉｓｓマウスの生存率を増加することを示す図である。３～６－月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交系マウスを、鼻腔内接種によって３×１０４ＰＦＵのＭＨＶに感染させ、感染後２日目から、経口胃管投与によって、２５０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５を用いて毎日処置した。対照として、ダクラタスビル（ＤＡＣ）を、ベータコロナウイルス複製を阻害するため、同じく感染後２日目から開始して６０ｍｇ／ｋｇ／日で使用した。（Ａ）ウイルス複製に関与する主な酵素であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２、ＹＰ＿００９９２４３５２．１対ＹＰ＿００９７２５３０７．１）およびエキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４、ＹＰ＿００９９２４３５４．１対ＹＰ＿００９７２５３０９．１）に関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＭＨＶの比較。（Ｂ）無処置（ｎｉｌ；黒色；ｎ＝１８）か、ＭＢ－９０５を用いて処置した（緑色；ｎ＝１０）か、またはＤＡＣを用いて処置した（赤色；ｎ＝１０）ＭＨＶ感染動物のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。（Ｃ）モック感染（非感染）対照と比較したＭＨＶ感染症におけるパーセント体重変化の進展。（Ｄ）細胞炎症の代用としての感染後１１日目における動物の気管支肺胞洗浄液中の合計細胞数。＊ｎｉｌ処置マウスと比較されたＰ＜０．０５を示す。 ＭＢ－９０５が、原型ベータ－コロナウイルスマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）に感染させたＳｗｉｓｓマウスの生存率を増加することを示す図である。３～６－月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交系マウスを、鼻腔内接種によって３×１０４ＰＦＵのＭＨＶに感染させ、感染後２日目から、経口胃管投与によって、２５０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５を用いて毎日処置した。対照として、ダクラタスビル（ＤＡＣ）を、ベータコロナウイルス複製を阻害するため、同じく感染後２日目から開始して６０ｍｇ／ｋｇ／日で使用した。（Ａ）ウイルス複製に関与する主な酵素であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２、ＹＰ＿００９９２４３５２．１対ＹＰ＿００９７２５３０７．１）およびエキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４、ＹＰ＿００９９２４３５４．１対ＹＰ＿００９７２５３０９．１）に関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＭＨＶの比較。（Ｂ）無処置（ｎｉｌ；黒色；ｎ＝１８）か、ＭＢ－９０５を用いて処置した（緑色；ｎ＝１０）か、またはＤＡＣを用いて処置した（赤色；ｎ＝１０）ＭＨＶ感染動物のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。（Ｃ）モック感染（非感染）対照と比較したＭＨＶ感染症におけるパーセント体重変化の進展。（Ｄ）細胞炎症の代用としての感染後１１日目における動物の気管支肺胞洗浄液中の合計細胞数。＊ｎｉｌ処置マウスと比較されたＰ＜０．０５を示す。 ＭＢ－９０５が、原型ベータ－コロナウイルスマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）に感染させたＳｗｉｓｓマウスの生存率を増加することを示す図である。３～６－月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交系マウスを、鼻腔内接種によって３×１０４ＰＦＵのＭＨＶに感染させ、感染後２日目から、経口胃管投与によって、２５０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５を用いて毎日処置した。対照として、ダクラタスビル（ＤＡＣ）を、ベータコロナウイルス複製を阻害するため、同じく感染後２日目から開始して６０ｍｇ／ｋｇ／日で使用した。（Ａ）ウイルス複製に関与する主な酵素であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２、ＹＰ＿００９９２４３５２．１対ＹＰ＿００９７２５３０７．１）およびエキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４、ＹＰ＿００９９２４３５４．１対ＹＰ＿００９７２５３０９．１）に関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＭＨＶの比較。（Ｂ）無処置（ｎｉｌ；黒色；ｎ＝１８）か、ＭＢ－９０５を用いて処置した（緑色；ｎ＝１０）か、またはＤＡＣを用いて処置した（赤色；ｎ＝１０）ＭＨＶ感染動物のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。（Ｃ）モック感染（非感染）対照と比較したＭＨＶ感染症におけるパーセント体重変化の進展。（Ｄ）細胞炎症の代用としての感染後１１日目における動物の気管支肺胞洗浄液中の合計細胞数。＊ｎｉｌ処置マウスと比較されたＰ＜０．０５を示す。 ＭＢ－９０５が、原型ベータ－コロナウイルスマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）に感染させたＳｗｉｓｓマウスの生存率を増加することを示す図である。３～６－月齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ非近交系マウスを、鼻腔内接種によって３×１０４ＰＦＵのＭＨＶに感染させ、感染後２日目から、経口胃管投与によって、２５０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５を用いて毎日処置した。対照として、ダクラタスビル（ＤＡＣ）を、ベータコロナウイルス複製を阻害するため、同じく感染後２日目から開始して６０ｍｇ／ｋｇ／日で使用した。（Ａ）ウイルス複製に関与する主な酵素であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２、ＹＰ＿００９９２４３５２．１対ＹＰ＿００９７２５３０７．１）およびエキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４、ＹＰ＿００９９２４３５４．１対ＹＰ＿００９７２５３０９．１）に関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＭＨＶの比較。（Ｂ）無処置（ｎｉｌ；黒色；ｎ＝１８）か、ＭＢ－９０５を用いて処置した（緑色；ｎ＝１０）か、またはＤＡＣを用いて処置した（赤色；ｎ＝１０）ＭＨＶ感染動物のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。（Ｃ）モック感染（非感染）対照と比較したＭＨＶ感染症におけるパーセント体重変化の進展。（Ｄ）細胞炎症の代用としての感染後１１日目における動物の気管支肺胞洗浄液中の合計細胞数。＊ｎｉｌ処置マウスと比較されたＰ＜０．０５を示す。 [0029]図１０Ａは、マウスの反復投与２８日間経口毒性試験における体重に対するＭＢ－９０５の作用を示す図である。４週間までの雌における週単位の体重増加。動物を、溶媒（１０ｍＬ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、ＭＢ－９０５（１０、８０、または２５０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を用いて毎日処置した。体重を、１週間に１回測定した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝１０匹。図１０Ｂは、マウスの反復投与２８日間経口毒性試験における体重に対するＭＢ－９０５の作用を示す図である。４週間までの雄における週単位の体重増加。動物を、溶媒（１０ｍＬ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、ＭＢ－９０５（１０、８０、または２５０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を用いて毎日処置した。体重を、１週間に１回測定した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝１０匹。 [0030]図１１Ａは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、収縮期血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１１Ｂは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、拡張期血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１１Ｃは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、平均血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１１Ｄは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、心拍数のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１１Ｅは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、体温のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１１Ｆは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、体温変化のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。 [0031]図１２Ａは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＴ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１２Ｂは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＴｃ間隔（Ｂ）のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１２Ｃは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＲＳ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１２Ｄは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＰＲ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた最初の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。 [0032]図１３Ａは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、収縮期血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１３Ｂは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、拡張期血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１３Ｃは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、平均血圧のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１３Ｄは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、心拍数のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１３Ｅは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、体温のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１３Ｆは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、体温変化心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。 [0033]図１４Ａは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＴ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１４Ｂは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＴｃ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１４Ｃは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＱＲＳ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。図１４Ｄは、あらかじめ、腹部大動脈へのＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの留置のための手術を受けた雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週）を、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置し、ＰＲ間隔のような心血管系パラメータを、処置前（ベースライン）ならびにＭＢ－９０５を用いた７日間の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した図である。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表示される。統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡによって実施され、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって実施された。１群あたり動物ｎ＝４～６匹。 [0034]図１５Ａは、ｈＥＲＧ型（ヒト急速活性型遅延整流カリウムチャネル）の電位依存性カリウムチャネルの阻害を示す図である。組換えヒトＥＲＧカリウムチャネル（急速活性型遅延整流カリウムチャネル遺伝子、Ｋｖ１１．１）を発現しているＨＥＫ２９３細胞株（４×１０ｅ５細胞）（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。チャネル活性を、ＦＬＩＰＲカリウムアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。細胞を、マイクロプレートで培養し、ローディング緩衝液と共に、暗所の室温で１時間インキュベートした。次に、ＭＢ－９０５（０．０１～３００μＭ）を、ウェルに加え、暗所の室温で３０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートを、自動ピペッティングを使用して、１ｍＭタリウム＋１０ｍＭカリウムの添加と共にＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。データ分析は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施された。結果は、ｈＥＲＧチャネルの阻害の百分率として表記され、平均阻害濃度（ＩＣ５０）が決定された。カリウムアッセイキットによるｈＥＲＧチャネルに対するＭＢ－９０５の濃度反応曲線。ｈＥＲＧをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、ＭＢ－９０５（０．０１～３００μＭ）と共に３０分間インキュベートした。その後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３装置内の自動ピペッティングを介して、１ｍＭタリウム＋１０ｍＭカリウムの添加が行われた。データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施された。結果は、ｈＥＲＧチャネルの阻害の百分率として表記され、蛍光強度値から得られたデータの非線形回帰を介して、阻害濃度（ＩＣ５０）が決定された。グラフ中のデータは、平均値±３つの独立した実験の平均値の標準誤差として表記された。垂直棒は、３つの独立した実験の平均値を表す。図１５Ｂは、ｈＥＲＧ型（ヒト急速活性型遅延整流カリウムチャネル）の電位依存性カリウムチャネルの阻害を示す図である。組換えヒトＥＲＧカリウムチャネル（急速活性型遅延整流カリウムチャネル遺伝子、Ｋｖ１１．１）を発現しているＨＥＫ２９３細胞株（４×１０ｅ５細胞）（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。チャネル活性を、ＦＬＩＰＲカリウムアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。細胞を、マイクロプレートで培養し、ローディング緩衝液と共に、暗所の室温で１時間インキュベートした。次に、ドフェチリド（０．０００１～１μＭ、陽性対照薬物として使用）を、ウェルに加え、暗所の室温で３０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートを、自動ピペッティングを使用して、１ｍＭタリウム＋１０ｍＭカリウムの添加と共にＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。データ分析は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施された。結果は、ｈＥＲＧチャネルの阻害の百分率として表記され、平均阻害濃度（ＩＣ５０）が決定された。カリウムアッセイキットによるｈＥＲＧチャネルに対する阻害薬（ドフェチリド）の濃度反応曲線。ｈＥＲＧをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、参照化合物（０．０００１～１μＭ；ドフェチリド）と共に３０分間インキュベートした。その後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３装置内の自動ピペッティングを介して、１ｍＭタリウム＋１０ｍＭカリウムの添加が行われた。陽性対照薬物ドフェチリドのインキュベーション後におけるｈＥＲＧチャネルの相対阻害。データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施された。結果は、ｈＥＲＧチャネルの阻害の百分率として表記され、蛍光強度値から得られたデータの非線形回帰を介して、阻害濃度（ＩＣ５０）が決定された。グラフ中のデータは、平均値±３つの独立した実験の平均値の標準誤差として表記された。垂直棒は、３つの独立した実験の平均値を表す。 [0035]図１６Ａは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ８、ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１００８３９）を、３３－ｍｅｒの鋳型、１０－ｍｅｒのプライマー、ＮＴＰ、およびＭｇＣｌ２と共に、３７℃で３時間インキュベートした。新たに合成された鎖へのヌクレオチド取込みは、ピロリン酸塩を放出するため、この生成物を、市販の発光アッセイ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＴ０７－６１０）によってさらに定量化した。ＭＢ９０５－リボース（８０１）三リン酸（８０１－ＴＰ）を、陽性対照としてのＧＳ－４４３９０２（レムデシビル三リン酸に相当）と共に分析した。図１６Ｂは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。Ｃａｌｕ－３細胞（４８－ウェルプレート中５×１０５細胞／ウェル）を、３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された化合物を１０μＭで加えた。４８～７２時間後、細胞単層を溶解し、全ＲＮＡを抽出し、ＯＲＦ１およびＯＲＦＮ ｍＲＮＡの検出のために、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施した。パネルＢにおいて、溶媒（ＤＭＳＯ）と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。図１６Ｃは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。ＭＢ－９０５を用いて処理されたか、または処理されていないモック感染Ｃａｌｕ－３細胞およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞からの細胞関連ウイルスＲＮＡを、磁気ビーズにコンジュゲートされたプロテインＡを結合させた抗カイネチン抗体（Ａｂ）または非特異的ＩｇＧ（アイソタイプ対照；Ｉｓｏ）と共にインキュベートした。洗浄後、ＯＲＦＮ ｍＲＮＡおよび細胞ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。パネルＣにおいて、特異的群との比較に関して＊Ｐ＜０．０５および＃Ｐ＜０．０５である。図１６Ｄは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。ＭＢ－９０５を用いて処理されたか、または処理されていないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞を、細胞変性作用（ＣＰＥ）が観察されるまで毎日モニターした。ウイルスを、培養上清から回収し、力価を測定し、より高い薬物濃度の存在下での次回の感染に使用した。これらの継代培養を、３カ月の期間続け、０．５～９μＭのＭＢ－９０５濃度を用いた。対照として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、無処理で継代し、培養と関連する遺伝的浮動をモニターした。各継代培養において、全ＲＮＡを、培養上清から抽出し、ＭＧＩＥａｓｙ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔを使用してライブラリーを構築し、塩基配列を解析した（ＭＧＩ－２０００）。アラインメントおよび塩基統計のためにＭｅｇａ７．０ソフトウエアを使用した。サンプルを４通り使用した。ｐｈｒｅｄ（ｐｈｒｅａｄ）品質スコアがＱ３６を上回る配列のみを考慮に入れた。平均カバレッジは、１０，０００倍を上回った。無処理の対照に対するＭＢ－９０５処理配列における変化を比較しつつ、コドン位置との関連における塩基使用の統計の使用は、＊Ｐ＜０．０５である場合に統計的有意性をもって記録される。ｃＤＮＡ塩基配列決定の代用として、Ｔとされている位置は、元のＲＮＡにおけるＵに相当する。図１６Ｅは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。感染したＣａｌｕ－３細胞を、ラルテグラビルと共に、表示された濃度のＭＢを用いて処理し、続いてＶｅｒｏ細胞における力価測定を行った。パネルＥにおいて、単独処理と組合せを比較した統計的差異に関して＊Ｐ＜０．０５であり、処理とｎｉｌ処理細胞を比較した統計的差異に関して＃Ｐ＜０．０５である。このデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。図１６Ｆは、ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することを示す図である。感染したＣａｌｕ－３細胞を、ドルテグラビルと共に、表示された濃度のＭＢを用いて処理し、続いてＶｅｒｏ細胞における力価測定を行った。パネルＦにおいて、単独処理と組合せを比較した統計的差異に関して＊Ｐ＜０．０５であり、処理とｎｉｌ処理細胞を比較した統計的差異に関して＃Ｐ＜０．０５である。このデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。 [0036]図１７Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＢの抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を、丁度この時点で加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。このデータは、Ｃａｌｕ－３細胞における少なくとも３つの独立した実験、続くＶｅｒｏ細胞における技術的反復を用いた力価測定の平均値±ＳＥＭを表す。図１７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＢの抗ウイルス活性を示す図である。９６－ウェルプレート中、密度５×１０４細胞／ウェルのＣａｌｕ－３細胞（ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞）を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。接種物を除去し、細胞を洗浄して、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たなＤＭＥＭを用いてインキュベートし、表示された濃度の化合物を、丁度この時点で加え、その後数日間にも加えた。４８～７２時間後、細胞上清を回収し、培養上清中の感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞におけるＰＦＵ／ｍＬによって測定した。このデータは、Ｃａｌｕ－３細胞における少なくとも３つの独立した実験、続くＶｅｒｏ細胞における技術的反復を用いた力価測定の平均値±ＳＥＭを表す。図１７Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＢの抗炎症活性を示す図である。ヒト初代単球を、０．１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中の細胞関連ウイルスＲＮＡ量を測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーの単球からの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。ＭＢ－９０５、その対応するリボヌクレオシド（ＭＢ－８０１）、およびモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）を表示した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびモルヌピラビル（ＭＫ－４４８２）を、陽性対照として使用した。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。図１７Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＢの抗炎症活性を示す図である。ヒト初代単球を、０．１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中のＩＬ－６レベルを測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーの単球からの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。ＭＢ－９０５、その対応するリボヌクレオシド（ＭＢ－８０１）、およびモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）を表示した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびモルヌピラビル（ＭＫ－４４８２）を、陽性対照として使用した。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。図１７Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＢの抗炎症活性を示す図である。ヒト初代単球を、０．１のＭＯＩで感染させ、表示された濃度の化合物を用いて処理した。２４時間後、培養上清中のＴＮＦ－αレベルを測定した。このデータは、少なくとも３名の健常ドナーの単球からの細胞を用いた実験の平均値±ＳＥＭを表す。ＭＢ－９０５、その対応するリボヌクレオシド（ＭＢ－８０１）、およびモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）を表示した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびモルヌピラビル（ＭＫ－４４８２）を、陽性対照として使用した。各特定の処理に対して無処理の細胞（ｎｉｌ）と比較した場合、Ｐ＜０．０５を有する差異が示される（＊）。 [0037]ＭＢ－９０５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにおけるトランジションおよびトランスバージョンを誘発することを示す図である。密度２×１０６細胞のＨｕｈ－７細胞を、３７℃で１時間、０．１のＭＯＩで感染させ、初めに０．５μＭのＭＢ－９０５を用いて処理した。細胞を、細胞変性作用（ＣＰＥ）が観察されるまで毎日モニターした。ウイルスを、培養上清から回収し、力価を測定し、より高い薬物濃度の存在下での次回の感染に使用した。これらの継代培養を、３カ月の期間続け、０．５～９μＭのＭＢ－９０５濃度を用いた。対照として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、無処理で継代し、培養と関連する遺伝的浮動をモニターした。各継代培養において、全ＲＮＡを、Ｑｉａｍｐ ｖｉｒａｌ ＲＮＡによって培養上清から抽出し、ＭＧＩＥａｓｙ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔを使用したライブラリー構築のために、４．２ｎｇを使用した。全てのライブラリーを、ＲＮＡ－断片化（２５０ｂｐ）を介して構築し、続いて逆転写および第２鎖合成を行った。ＭＧＩＥａｓｙ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓを用いた精製後、ライブラリーを定量化し、フローセルにロードした（ＭＧＩ－２０００）。アラインメントおよび塩基統計のためにＭｅｇａ７．０ソフトウエアを使用した。サンプルを４通り使用した。ｐｈｒｅｄ（ｐｈｒｅａｄ）品質スコアがＱ３６を上回る配列のみを考慮に入れた。平均カバレッジは、１０，０００倍を上回った。（Ａ）塩基配列決定継代培養の進化史は、ブートストラップ（ｂｏｏｓｔｒａｐｓ）１０００回で、最尤法およびＫｉｍｕｒａ－２ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌを使用することによって推論された。この系統樹は、Ｗｕｈａｎ－０１ ｉｎｄｅｘ ｃａｓｅ（＃ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２５）によって根を付けられ、ＭＢ－９０５関連配列は赤色であり、対照配列（ｎｉｌ）は緑色である。配列は、アクセッションコード＃ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７８８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３７９８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８００、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８０９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８１８、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２０、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２２、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２４、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２６、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８２９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３５、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３７、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８３９、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４３、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１０２３８４５でＧＩＳＡＩＤに集積されている。 [0038]図１９Ａは、互変異性カイネチンの無差別な対合の分子モデルを示す図である。カイネチンからのフルフリル基が、隣接するＡを用いて二本鎖高次構造に影響を与える３つの高次構造。このモデルは、ＲＮＡポリメラーゼの起こり得る立体障害と一致している。図１９Ｂは、互変異性カイネチンの無差別な対合の分子モデルを示す図である。カイネチンからのフルフリル基が、隣接するＣおよびＧを用いて二本鎖高次構造に影響を与える３つの高次構造。このモデルは、エラープローン機構と一致している。 [0039]図２０Ａは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。感染させ、処置した動物の７日間生存率の要約。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｂは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。感染させ、処置した動物の体重の変化。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｃは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。感染させ、処置した動物の臨床スコアの変動。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｄは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照を、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のウイルスＲＮＡレベルに関して分析した。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｅは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照を、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の力価に関して分析した。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｆは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照を、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＬＤＨ活性に関して分析した。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｇは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照を、肺実質のＨ＆Ｅ染色によって分析した。図２０Ｈは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＴＮＦを定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイが実施された。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｉは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＩＬ－６を定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイが実施された。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｊは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＫＣを定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイが実施された。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。図２０Ｋは、ＭＢ９０５が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ガンマに感染した遺伝子導入Ｋ１８マウスに対して抗ウイルス性、抗炎症性、および生存性であることを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入のためのｈＡＣＥ２受容体を発現する１０～１２週齢の遺伝子導入マウスを、１０５ＰＦＵで鼻腔内感染させた。１２～１８時間後、処置を実施し、毎日継続した。１４０ｍｇ／ｋｇ／日においてＭＢ９０５を、単独でか、ドルテグラビル（ＤＴＧ）との組合せで用いて処置された群、およびそれらの対照の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の細胞数（Ｋ）を定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイが実施された。＊Ｐ＜０．０５。１群あたりの動物の数は、３つの独立した実験に配分された８～２０匹で変動し、データは、平均値±ＳＥＭを表す。 [0040]図２１Ａは、マウスに対する３つの事前配合物中のＭＢ－９０５の薬物動態を示す図である。マウス血漿（ｎ＝２）中のＭＢ－９０５（５％ｔｗｅｅｎ８０＋９５％ポリエチレングリコール４００）の単回経口用量（３、３０、および３００ｍｇ／ｋｇ）薬物動態特性。データは、平均値±平均値の標準誤差として表示された。図２１Ｂは、マウスに対する３つの事前配合物中のＭＢ－９０５の薬物動態を示す図である。マウス血漿（ｎ＝１～２）中のＭＢ－９０５（５％カルボキシメチルセルロース）の単回経口用量（３、３０、および３００ｍｇ／ｋｇ）薬物動態特性。データは、平均値±平均値の標準誤差として表示された。図２１Ｃは、マウスに対する３つの事前配合物中のＭＢ－９０５の薬物動態を示す図である。マウス血漿（ｎ＝２～６）中のＭＢ－９０５（５％エタノール、３０％プロピレングリコール、４５％ポリエチレングリコール４００、および２０％水）の単回経口用量（３、３０、および５５０ｍｇ／ｋｇ）薬物動態特性。データは、平均値±平均値の標準誤差として表示された。
[0041]本発明は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的治療、治癒、または緩和のための、およびＣＯＶＩＤ－１９に曝露された可能性がある個体またはＣＯＶＩＤ－１９の危険性がある個体の治療のための、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＲＮＡ合成を阻害する能力を有する抗ウイルス性化合物、それらの誘導体、塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、またはさらに前述の化合物の組合せ、特に、ラルテグラビルおよびドルテグラビルとの組合せに関する。
[0042]最新技術において、「アナログ」という用語は、１つもしくは複数の原子または原子の群が、１つもしくは複数の原子または異なる原子の群によって置き換えられた化合物を好ましくは指すことが認められている。このため、「窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ」という用語は、１つもしくは複数の原子または原子の群が、ヌクレオシド／ヌクレオチド中に通常みられる原子または原子の群以外の１つもしくは複数の原子または原子の群によって置き換えられた窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログを指す。
[0043]最新技術において、「誘導体」または「バリアント」という用語は、化学反応を介して同様のものから得られる化合物または同様の出発化合物を起源とする化合物を好ましくは指すことが認められている。
[0044]本出願において、「アナログ」、「誘導体」、または「バリアント」という用語は、上記のとおりに含まれる。
[0045]本出願で使用される場合、「窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ」という用語は、プリン、それらのヌクレオシド、および／またはそれらのヌクレオチドに加えて、単独でか、または同時に見出されるある形態から別の形態への変換形態または誘導形態を指す。
[0046]本出願で使用される場合、「ウイルスＲＮＡ合成」という用語は、新規のウイルスＲＮＡを合成するための機構であって、以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非構造タンパク質（ｎｓｐ）：ヘリカーゼ（ｎｓｐ１３）、ＲＮＡポリメラーゼ（その補因子ｎｓｐ７および８、ならびに主なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素であるｎｓｐ１２で構成される）、エキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４／１０）、エンドヌクレアーゼ（ｎｓｐ１５）、およびメチルトランスフェラーゼ（ｎｓｐ１０／１４およびｎｓｐ１６／１０）を必要とすることがある機構を指す。
[0047]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療するための薬物が早急に必要であることは公知である。モルヌピラビルおよびバロキサビルは経口投与可能であるが、これらはその適応性に関する懸念がいまだに生じている。上記で検討されたとおり、モルヌピラビルは、細胞内にＮＨＣを与えるが、これは宿主に対する変異原性能を有する。バロキサビルは代謝が速く、リトナビルのようなシトクロムＰ４５０遮断薬の同時使用を必要とする。このため、バロキサビル／リトナビルは、ＣＯＶＩＤ－１９患者の支持治療および緩和治療で使用されるものを含む様々な化合物との極めて広範囲の薬物相互作用を有する。近年、この新規疾患の生物学を理解するため、さらには潜在的なウイルスの標的および有効な薬物の調査ならびに選択のための実験的ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを確立するための多大な努力がなされてきた。
[0048]コロナウイルス科のうちの１メンバーを超えるメンバー、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＭＨＶに対する本明細書に記載される本発明の抗ウイルス活性によって、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ウシコロナウイルス、イヌ呼吸器コロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、パフィノシスウイルス、ラットコロナウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、トリ感染性気管支炎ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ウシ呼吸器コロナウイルス、ヒト腸内コロナウイルス４４０８、腸内コロナウイルス、ウマコロナウイルス、および分類されていないコロナウイルスのような、生物医学的および獣医学的関心対象の他のコロナウイルスが、化合物および組合せの影響を受けやすいと推定される。
[0049]核酸、アミノ塩基、およびヌクレオシドの構成成分は、抗ウイルス性を含む抗微生物活性を示す。しかし、最新技術にすでに存在する知識、特に、予備的な計算論的研究から得られたものを使用する試みは、疾患の治療が、その病原体の遺伝情報に制限されるだけではなく、病原体－宿主の関係性に関連する情報にも制限されるため、注意と配慮を必要とする。この前提は、病原体が、宿主の細胞系にほぼ完全に依存するため、ウイルス感染症においてより顕著になる。
[0050]本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成が、本発明で開示される化合物によって、異なる細胞モデル（Ｖｅｒｏアフリカミドリザル腎細胞、Ｈｕｈ－７ヒト肝細胞癌細胞、Ｃａｌｕ－３ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞、ヒト初代単球）において阻害されることを明らかにしている。化合物は、Ｃａｌｕ－３ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞において、感染性ウイルス粒子の産生を一貫して阻害した。炎症メディエータのレベルは、化合物によって低下された。ＭＢ－９０５による阻害は、エキソヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼ阻害薬によって相乗作用を示した。ＭＢ－９０５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コドン使用を妨げ、ＭＨＶによる感染マウスの生存率を向上した。
[0051]特に、本発明は、ウイルスＲＮＡ合成を阻害する窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ抗ウイルス性化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療、予防、および緩和のため、かつ感染した可能性がある患者またはＣＯＶＩＤ－１９の危険性がある個体の治療のために有用であることを開示する。
[0052]本発明の抗ウイルス性化合物の構造、化学式、および分子量は、以下の表に列挙される。このようなデータは、化合物を明確に識別するために十分である。識別ＭＢプラス番号は、読解を容易にするために本文でのみ使用されるが、このことは、以下の表を含むデータに基づいて、当業者には明確に理解され得る。
[0053]
[0054]表１の化合物は、適用可能な場合、それらの活性な一リン酸エステル、二リン酸エステル、および三リン酸エステル誘導体またはそれらの塩、好ましくは、三リン酸エステル誘導体と共に本発明の範囲内に含まれる。
[0055]好ましい実施形態において、本発明は、化合物カイネチン－リボース５’－三リン酸（ＭＢ－７１７）について言及する。リン酸エステル誘導体、特に、三リン酸エステル形態は、ヌクレオチドアナログとして、ウイルスＲＮＡポリメラーゼを阻害することが可能であり、ウイルスＲＮＡへの取込みには、そのヌクレオチド三リン酸の形成を必要とすることが、驚くべきことに見出された。
[0056]以下の実施例で示される結果は、サイトカイニンがウイルス核酸に組み込まれることを示す。ウイルスＲＮＡへの取込みには、ｉｎ ｖｉｖｏ肺組織のモニタリングから実証されているとおり、そのヌクレオチド三リン酸の形成を必要とする。したがって、これは、本発明による化合物の代謝経路である。
[0057]本発明の化合物を形成するための一般的方法は、当該分野において公知であるか、または化学文献に記載されており、本明細書に記載されている方法またはその組合せを使用する。
[0058]本発明の代表的な化合物を調製するための一般的合成スキームは、以下に記載される。これらのスキームは、例示的なものであり、当業者が本明細書に開示される化合物を調製するために使用する可能性がある技法を限定することを意味するものではない。
[0059]本発明の化合物を調製する異なる方法は、当業者には明らかであろう。さらに、合成における種々のステップは、望ましい化合物または複数の化合物をもたらすために代替の順序で実施される場合がある。
[0060]以下の略記は、本明細書に詳述される合成スキームに使用される：
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｐｙ：ピリジン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＥｔＯＨ：エタノール
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｅｔ３Ｎ：トリエチルアミン
ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン
ＴｒＣｌ：トリフェニルメチルクロリド
ＬｉＡｌＨ４：水素化アルミニウムリチウム
Ｈ４Ｎ２．Ｈ２Ｏ：ヒドラジン水和物
ＰＴＳＡ：ｐ－トルエンスルホン酸
Ｍｅ２（ＯＭｅ）２：２，２－ジメトキシプロパン
ＣＳＡ：カンファースルホン酸
（ＣＨ２ＯＨ）２：エチレングリコール
[0061]スキーム１に示されるとおり、化合物は、例えば、６－クロロプリンまたは６－クロロプリンリボシドを、還流条件下で、エタノールまたはイソプロパノールのようなアルコール系溶媒中、トリエチルアミンとして、適当な第三級塩基の存在下で、適切なアリールまたはアルキルアミンとカップリングすることによって調製され得る。
[0062]［化１］本発明における化合物の調製のための７方法：
[0063]本発明による化合物の調製のための方法は、添付の実施例において例証されている。したがって、第２の実施形態において、本発明は、本発明による化合物の具体的な調製についても言及する。
[0064]ウイルス複製を阻害するためのウイルスＲＮＡ合成の窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ阻害薬の能力は、細胞培養物における減少したウイルスＲＮＡ量または低下した感染性ウイルス力価を測定するか、または実証することが可能な任意のアッセイによって実証され得る。
[0065]先行技術から、バイオインフォマティクス解析を介して、カイネチン－リボースが抗ウイルス薬として使用され得ることは理論的に予測されるが、予備的結果が、このような化合物は、宿主細胞上の侵入するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であるＡＣＥ２の発現を多少減少させることが可能であることを示すため、当業者がその調査に固執することはないであろう。プロドラッグとしてのカイネチン－リボースまたはゼアチン－リボースは、それがヌクレオシド、すなわち、そのリン酸エステル、特に、三リン酸エステル形態に変換されている必要があり、その後、ヌクレオチドアナログとしてウイルスＲＮＡポリメラーゼを阻害するであろうプロドラッグであることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼに十分に作用し得ないことが、驚くべきことに証明された。
[0066]発明は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、およびＣＯＶＩＤ－１９の患者またはＣＯＶＩＤ－１９の危険性がある個体の治療のための、（ｉ）有効量の窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ阻害薬のうちの１種または複数の抗ウイルス性化合物、または本発明によるそのような化合物の塩、溶媒和物、誘導体、もしくはプロドラッグ、および（ｉｉ）有効成分と適合する薬学的に許容される賦形剤、および（ｉｉｉ）本明細書に記載される化合物と、ラルテグラビル、ドルテグラビル、またはそれらのアナログのようなウイルスエキソヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼの阻害薬との組合せを含有する医薬組成物も特徴とする。
[0067]より具体的には、本発明は、カイネチン、カイネチンリボシド、カイネチンモノホスホルアミデート、ゼアチン、およびゼアチンリボシドに加えて、その活性な一リン酸エステル、二リン酸エステル、および三リン酸エステル、特に、カイネチン－リボース５’－三リン酸（ＭＢ７１７）を含むサイトカイニンを、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス複製を阻害するための抗ウイルス性化合物として、単独で、かつラルテグラビルおよびドルテグラビルまたはそれらのアナログと組み合わせて有する医薬組成物に関する。
[0068]代替の実施形態において、本発明は、（ｉ）ソフォスブビルもしくはテノホビルもしくはそれらのアナログならびに／または（ｉｉ）ラルテグラビル、ドルテグラビル、ピブレンタスビル、オムビタスビル、およびダクラタスビルもしくはそれらのアナログとの特定の組合せについても言及する。これらの特定の組合せは、本明細書に添付された図６Ａおよび６Ｂに示されるとおり、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療およびＣＯＶＩＤ－１９の患者またはＣＯＶＩＤ－１９の危険性がある個体の治療に関する驚くべきプロファイルを示した。
[0069]本発明による組成物は、１～３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇの抗ウイルス性化合物を含み得る。より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇである。
[0070]本発明の組成物は、本発明に記載される化合物と１種または複数の追加の治療剤または予防剤の組合せを含み得る。この場合、化合物は、単剤療法のレジメンで通常投与される投与量の約１０～１００％の割合で存在し得る。
[0071]追加の組み合わされる治療剤または予防剤には、以下に限定されないが、レムデシビル、ＡＴ－５２７、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アシクロビル、シドフォビル、ドコサノール、ファムシクロビル、ホスカルネット、ホミビルセン、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、ザナミビル、ペラミビル、イミキモド、ラミブジン、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、アバカビル、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、クイルキー（ｑｕｉｒｋｙ）、ｌｐｒｉｎａｖｉｒ、ロピナビル、テラプレビル、ファビピラビル、パリビズマブ、オムビタスビル、ピブレンタスビル、ベクラブビル、ダサブビル、ダクラタスビル、ラルテグラビル、ドルテグラビル、他のウイルスポリメラーゼ阻害薬、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体が含まれる。
[0072]追加の治療剤は、単回投与形態または複数回投与形態で投薬される本発明の化合物と組み合わされ得る。
[0073]別の態様において、本発明の医薬組成物は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス剤として、治療上有効な量の１種または複数の免疫調節剤をさらに含む。追加の免疫調節剤の例には、以下に限定されないが、アルファ、ベータ、ガンマインターフェロンおよびペグ化形態、糖質コルチコイド、コルチコイド、デクスクロルフェニラミン、ならびにプロメタジンが含まれる。
[0074]本発明の医薬組成物は、治療上有効な量の１種または複数の抗菌薬：アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン（ｂｓ）、アンサマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、カルバセフェム、ロラカルベフ、カルバペネム、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（ｂｓ）、オキサゾリジノン（ｂｓ）、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ピペラシリン、ペニシリンｇ、テモシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸塩、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンｂ、キノロン類／フルオロキノロン類、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド（ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ｔｍｐ－ｓｍｘ）、スルホンアミドクリソイジン（旧型）、テトラサイクリン（ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール（ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ｂｓ）、チニダゾール、トリメトプリム（ｂｓ）をさらに含む。
[0075]本組成物は、とりわけ、着色料、分散剤、甘味料、皮膚軟化剤、抗酸化剤、保存剤、ｐＨ安定剤、香料のような不活性物質およびそれらの混合物を含有してもよい。
[0076]加えて、本発明の組成物は、以下の成分を配合されているか、または配合されていない固体形態、好ましくは、錠剤またはカプセルとして、かつ液体形態、好ましくは、懸濁剤、溶液、またはシロップ剤として提供されてもよい：ポリエチレングリコール、リュープロリド酢酸塩およびポリマー（ＰＬＧＨ（ポリ（ＤＬ－ラクチド－コグリコリド））、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、リポソーム、リポソーム－タンパク質ＳＰ－ＢおよびＳＰ－Ｃ、ならびにミセル。
[0077]本組成物は、小児、成人、妊婦、およびＣＯＶＩＤ－１９の軽度から重度の症状を有する個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または他のコロナウイルスに感染した個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の可能性があるか、または曝露の危険性がある個体に、経口でか、または全身的に投与され得る。
[0078]本発明は、窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログ、それらの誘導体、もしくはこのような化合物の塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、または本発明の組成物によるウイルスＲＮＡ合成の阻害薬の使用であって、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、ならびにＣＯＶＩＤ－１９の患者およびＣＯＶＩＤ－１９に曝露された可能性がある個体またはＣＯＶＩＤ－１９の危険性がある個体の治療のための、医薬の製造のための使用をさらに含む。
[0079]本発明の抗ウイルス性化合物および抗ウイルス性医薬組成物、それらの多形体の使用であって、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２複製複合体の働きを阻害する医薬品の製造のための使用もまた本明細書で開示される。
[0080]前述の医薬品は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、およびＣＯＶＩＤ－１９に曝露された可能性がある個体の治療のための、１種または複数の抗ウイルス性または免疫調節性化合物をさらに含んでもよい。加えて、このような医薬品は、１～３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇの抗ウイルス性化合物を含んでもよい。より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇである。
[0081]本発明の抗ウイルス性化合物は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と他のウイルス因子に同時に感染した個体の予防的、治癒的、または緩和的治療に使用され得る。加えて、このような医薬品は、１～３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇの抗ウイルス性化合物を含んでもよい。より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇである。
[0082]本発明の抗ウイルス性化合物は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と他のウイルス因子に同時に感染した個体の予防的、治癒的、または緩和的治療に使用され得る。
[0083]特に、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連する感染症を予防的、治癒的、または緩和的に治療するため、かつＣＯＶＩＤ－１９に曝露された可能性がある個体を治療するための医薬品の製造のための本発明の化合物／組成物の使用は、妊婦、高齢者、感染症のより進行性の徴候を伴う個体を対象とする。
[0084]より具体的には、本発明は、ゼアチン、ゼアチンリボシド、カイネチン、カイネチンリボシド、およびカイネチンリボシドモノホスホルアミデートのようなサイトカイニンの使用であって、コロナウイルスに感染した個体またはこのウイルスに曝露された可能性がある個体のコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連する感染症を予防的、治癒的、または緩和的に治療するため医薬製品の製造のための使用を包含する。
[0085]さらに、本発明は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したか、またはこのウイルスに曝露された可能性がある個体の予防的、治癒的（治療的）、または緩和的治療の方法であって、本発明による前述の化合物と１種または複数の抗ウイルス性化合物および／または免疫調節剤および／または抗菌薬の組合せを、個体に投与することを含む、方法を含む。
[0086]本発明の治療方法は、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体への経口投与、全身的投与、もしくは鼻腔内投与またはコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された可能性がある個体への予防的投与が可能である。
[0087]経口投与において、本発明の組成物は、シロップ剤、カプセル、錠剤、または丸薬のような単位投与形態であって、ポリエチレングリコール、リュープロリド酢酸塩およびポリマー（ＰＬＧＨ（ポリ（ＤＬ－ラクチド－コグリコリド））、ポリ（アリルアミンヒドロクロリド）、リポソーム、リポソーム－タンパク質ＳＰ－ＢおよびＳＰ－Ｃ、ミセルを含む薬学的に許容される賦形剤中に、約１～約３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇの範囲にある既定量の有効成分、より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇの既定量の有効成分をそれぞれ含有する単位投与形態に製剤化され得る。
[0088]非経口投与において、本発明の組成物は、静脈内注入、皮下注入、鼻腔内注入、または筋肉内注入によって投与され得る。注入または鼻腔内による投与において、滅菌水性賦形剤の溶液中の化合物を含む組成物が好まれ、これは、緩衝液または保存剤のような他の溶質に加えて、その等張液を調製するために十分な量の薬学的に許容される塩またはグルコースを同様に含有してもよい。
[0089]前述の組成物のために使用され得る適当な薬学的に許容される溶媒、輸送体、または賦形剤は、薬学的文章、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５またはＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９版、２０１１に記載されている。
[0090]化合物の投与量は、投与の形態および選択された有効成分に応じて変動するであろう。概して、本発明に記載される化合物は、有効な抗ウイルス的結果をもたらすが、望まれないか、または有害なあらゆる副作用を回避する用量で投与される。
[0091]経口投与において、本発明に記載される化合物は、約０．０１～約３，０００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは、０．０３～６００ｍｇ、より好ましくは、０．０５～４００ｍｇの範囲で投与され得る。
[0092]また、好ましい範囲として、約０．０５～約１００ｍｇ／ｋｇ／日も言及され得る。
全身投与において、本発明に記載される化合物は、約０．０１～約１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の投与量で投与され得るが、各患者の個別の特性に注意力を払うべきである。望ましいモデルにおいて、投与量は、各患者の個別の特性に従って、約０．０５ｍｇ～約５０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内であり得る。
[0093]本発明の抗ウイルス性医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と他のウイルス因子に同時に感染した個体における疾病の治療的療法または緩和に使用され得る。
[0094]本発明は、以下に提供される実施例を介して詳細に説明される。本発明は、これらの実施例に限定されないが、その範囲内で生じ得る変形および修正も含むということを強調することが必要とされる。
[0095]これらの実施例で使用される方法および条件、ならびにこれらの実施例で調製される実際の化合物は、限定されることを意図されていないが、化合物がどのように調製され得るのかを実証することが意図されている。これらの実施例で使用される出発物質および試薬は、本明細書に記載される手順によって調製されない場合、一般に、市販されているか、化学文献に報告されているかのいずれかであるか、または化学文献に記載されている手順を使用することによって調製されてもよい。
実施例１
高純度グレードのＭＢ－９０５（カイネチン）の調製
[0096]２０Ｌの反応容器に、エタノール７．５Ｌおよび６－クロロプリン１．５ｋｇを入れた（９．７ｍｏｌ、１．０当量）。エタノール２５０ｍＬ中のフルフリルアミン（１．８Ｌ、２０．４ｍｏｌ、２．１当量）および４－ジメチルアミノピリジン（１１．９ｇ、０．０９７ｍｏｌ、０．０１当量）の溶液を、６－クロロプリンの溶液に滴下して加えた。この混合物を、８５℃に加熱し、４時間撹拌した。反応完了後、混合物を、５℃に冷却し、４０分間撹拌した。この結晶を、濾過し、エタノール３．０Ｌで洗浄した。次に、結晶を、エタノールと水が１：１の混合物４．５Ｌが入った２０Ｌの反応容器に移した。この懸濁液を３０分間撹拌した。この結晶を、濾過し、エタノール１．５Ｌで洗浄し、減圧下の６５℃で１２時間乾燥させて粗カイネチン（１．９２ｋｇ）を得た。
[0097]高純度グレードのカイネチンのために、粗カイネチンを、下記の続くステップによって精製した：
[0098]２０Ｌの反応容器に、エタノール９．３５Ｌおよび粗カイネチン１．８７ｋｇを入れた（８．６９ｍｏｌ、１．０当量）。蒸留水１．８７Ｌ中のＨＣｌ（７５０ｍＬ、９．０８ｍｏｌ、１．０４当量）の溶液を、カイネチンの溶液に滴下して加えた。この混合物を、７５℃に加熱し、固体の溶解が完了するまで撹拌した。次に、活炭１９ｇを、溶液に加え、この混合物を７５℃で１５分間撹拌した。混合物を、ｃｅｌｉｔｅ上で濾過し、高温のエタノール１．８７Ｌで洗浄した。次に、得られた濾液を、１０℃に冷却し、１時間撹拌した。この結晶を、濾過し、冷却したエタノール９４０ｍＬで洗浄した。このステップ後、結晶を、冷却したエタノール１．８７Ｌに懸濁させ、１５分間撹拌した。この結晶を、再度濾過し、冷却したエタノール９４０ｍＬで洗浄した。結晶を、エタノール：水が１：１の溶液４．６７Ｌに懸濁させ、撹拌し、１０℃に冷却した。次に、トリエチルアミン１．１８Ｌを、この混合物に滴下して加え、１０℃で３０分間撹拌した。この固体を、濾過し、エタノールと水が１：１の混合物１．８７Ｌで洗浄した。このステップ後、固体を、蒸留水４．６８Ｌに懸濁させ、３０分間撹拌した。次に、この固体を、濾過し、蒸留水１．８７Ｌ、１：１のエタノール：水１．８７Ｌ、およびエタノール１．８７Ｌで連続して洗浄した。
[0099]固体を、減圧下の６５℃で、恒量まで乾燥させ、白色の固体として高純度グレードのカイネチン（１．４８ｋｇ、６．８８ｍｏｌ、収率７１％、純度：９９．９面積％ＨＰＬＣ）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.99 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.11 (s, 2H), 7.54 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 4.69 (s, 2H) ppm; 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 154.0, 153.2, 152.3, 149.7, 141.8, 139.1, 119.0, 110.5, 106.6, 36.5 ppm.ＩＶ（λｍａｘ）：３２５１、３２０３、３１０４、３０５４、２９８２、２９５０、２９１１、２８２５、２７２０、２６８１、２５６５、１８９５、１６９６、１６２５、１５９０、１５３８、１５０３、１４８２、１４５９、１４３９、１４０４、１３６７、１３３７、１３２７、１３０８、１２８０、１２５３、１２１９、１１９９、１１５７、１１４９、１１２９、１０６９、１０１６、１００８、９３５、９１７、８９２、８６１、８４５、８１４、７９６、７５１、７２６、７０２、６７８、６６０、６３９、６０２；融点２６５～２７２℃ｄｅｃ；ＨＰＬＣ（Ｘ Ｔｅｒｒａ ＲＰ１８、２５０×４．６×５ｍｍ、アイソクラティック１０％フェーズＢ［ＭｅＯＨ：ＡＣＮ（１：１）］：９０％フェーズＡ［３．４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ２．５４（Ｈ３ＰＯ４）］、１．０ｍＬ／分、２１０ｎｍ、３０℃）保持時間＝８．７６８分間、λｍａｘ２７２ｎｍ；ＨＲＭＳ－ＭＡＬＤ－ＴＯＦ／ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：
Ｃ１０Ｈ１０Ｎ５Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に関する計算値２１６．０８７９９、実測値２１６．０８８１３。
実施例２
[0100]化合物ＭＢ－９０７は、例えば、スキーム２に例示される手順に従って調製され得る。
[0101]［化２］。化合物ＭＢ９０７の調製のための代表的な方法：
[0102]スキーム２：（ａ）ＴｒＣｌ、ＤＣＭ、Ｐｙ；（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨＣＯ２Ｅｔ、トルエン、還流；（ｃ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ；（ｄ）フタルイミド、ＤＩＡＤ、ＰＰｈ３、ＴＨＦ；（ｅ）Ｈ４Ｎ２．Ｈ２Ｏ、ＭｅＯＨ、還流；（ｆ）６－クロロプリン、Ｅｔ３Ｎ、ＥｔＯＨ、還流；（ｇ）ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、還流。
実施例３
[0103]化合物ＭＢ－７１１は、例えば、スキーム３に例示される手順に従って調製され得る。
[0104]［化３］。化合物ＭＢ７１１の調製のための代表的な方法：
[0105]スキーム３：（ａ）Ｍｅ２（ＯＭｅ）２、ＰＴＳＡ、アセトン、室温；（ｂ）フルフリルアミン、Ｅｔ３Ｎ、ＥｔＯＨ、還流；（ｃ）ｔ－ＢｕＭｇＣｌ、ＴＨＦ、５℃～室温；（ｄ）ＣＳＡ（触媒）、ＤＣＭ、（ＣＨ２ＯＨ）２、室温。
実施例４
[0106]アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ）、ヒト肝細胞癌（ＨｕＨ－７）、およびＣａｌｕ－３細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に許容性であり、実験室において高量で増殖する。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で補完された高グルコースＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下の３７℃で培養した。このため、これらは、生物学的活性を有する化合物のスクリーニングのための適当なモデルに相当する。細胞を、０．０１～０．５の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。培養物を、感染の１時間後に処理した。２４時間（Ｖｅｒｏ）および４８～７２時間（Ｈｕｈ－７およびＣａｌｕ－３）の時点で、細胞を溶解し、細胞関連ウイルスＲＮＡを定量化した。培養上清からの全ウイルスＲＮＡを抽出した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ワンステップリアルタイムＰＣＲシステムを使用して実施され、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）プロトコールによって推奨されるプライマー、プローブ、およびサイクル条件を用いた反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために使用された。
[0107]我々は、Ｖｅｒｏ細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害することを試験された化合物中の化合物ＭＢ－８０４およびＭＢ－９０７は、１．０μＭにおいて４０～７０％の範囲のウイルスＲＮＡ合成の阻害を示す最良の阻害プロファイルを提示した（図１Ａ）ことを見出した。生化学的経路中への窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドの侵入を可能にする、より可変性の高い系統のＨｕｈ－７細胞において、化合物ＭＢ－８０１、ＭＢ－８０３、ＭＢ－８０５、ＭＢ－８０６、ＭＢ－８０７、ＭＢ－９０５、ＭＢ－９０７、およびＭＢ－９１４のような、より多くの物質が、ウイルスＲＮＡ合成に影響を及ぼす良好なプロファイル、１．０μＭにおける阻害活性≧５０％を示した（図１Ｂ）。Ｃａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害するために、ＭＢ－７１１、ＭＢ－８０１、ＭＢ－８０３、ＭＢ－８０５、およびＭＢ－９０５は、１．０μＭにおいて最良のプロファイルを示した（図１Ｃ）。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成が、本明細書に記載される窒素性塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドのアナログによって阻害されることを明示している。
実施例５
[0108]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成および生産的な複製を阻害するための薬理学的パラメータは、最初のスクリーニングから出現した最も活性な化合物に関して特徴付けられた。それぞれ０．０１および０．１のＭＯＩで感染したＶｅｒｏおよびＨｕｈ－７細胞において、細胞関連ウイルスＲＮＡ合成が、実施例１に記載されるとおりに特徴付けられた。接種１時間後の単回で処理を実施した。レムデシビル（ＲＤＶ）およびＭＫ－４４８２を、陽性対照として使用した。
[0109]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成の段階における阻害活性が、ＣＯＶＩＤ－１９の生理病理学に関連する細胞系におけるウイルス複製を抑制する実際の能力を示したことを確認するため、我々は、０．５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を伴うＣａｌｕ－３ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞について検討した。接種１時間後の単回でか、または毎日処理を実施した。４８～７２時間後、培養上清を回収し、感染性ウイルス力価を、Ｖｅｒｏ細胞における力価測定によって決定した。Ｃａｌｕ－３細胞からの上清を用いた感染後、Ｖｅｒｏ細胞に、２．４％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含有する新たな半固体培地を上から載せ、培養を３７℃で７２時間継続した。細胞を、１０％ホルマリンを用いて、室温で２時間固定し、次に、クリスタルバイオレット（０．４％）を用いて染色した。したがって、我々は、化合物の存在下で増殖した子孫ウイルスは、次回の感染を生じる能力が制限されるのかどうかについて評価した。
[0110]並行して、細胞傷害性アッセイを実施した。９６－ウェルプレート中の１．５×１０４細胞の単層を、種々の濃度（１，０００～１０μＭかの半－対数希釈）の抗ウイルス薬を用いて３日間処理した。次に、ＤＭＥＭ中５ｍｇ／ｍＬの２，３－ビス－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキシアニリド（ＸＴＴ）を、０．０１％Ｎ－メチルジベンゾピラジンメチルサルフェート（ＰＭＳ）の存在下の細胞に加えた。３７℃で４時間インキュベートした後、プレートを、分光光度計で４９２ｎｍおよび６２０ｎｍにおいて測定した。
[0111]サイトカイニン（ＭＢ－９０５）およびＭＢ－９０７、ならびにヌクレオシドＭＢ－８０１は、Ｖｅｒｏ細胞においてよりもＨｕｈ－７において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害する効力が１０～８０倍高いことを示し、これは、ヒト細胞がこれらの活性な化合物に対してより機敏であることを意味する（表２）。同様に、ＭＫ－４４８２は、Ｈｕｈ－７肝細胞癌細胞において、ウイルス複製を阻害する効力も獲得した。１つの例外はヌクレオシドＭＢ－８０４であり、これは、Ｖｅｒｏ細胞においてウイルスＲＮＡ合成を阻害するより良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を示した（表２）。ウイルスＲＮＡ合成を阻害することにおいて、我々の化合物と比較して、ＲＤＶの方が少なくとも１０倍有利であった（表２）。一方、ＶｅｒｏおよびＨｕｈ－７細胞におけるＭＢの効力は、ＭＫ－４４８２と同程度であった（表２）。さらに、ＭＢは、ＭＫ－４４８２よりも細胞毒性が低いため、我々の最良の化合物は、ＭＫ－４４８２よりも桁違いに高い選択指数（ＳＩ）を示し（表２）、これは、ＭＢがこの参照化合物よりもｉｎ ｖｉｔｒｏ使用において安全性の限界がより高いことを意味する。表２に表示されるとおり、我々の化合物は、概して、ＲＤＶの２分の１の細胞毒性を示した。
[0112]
Figure 2024513079000006
Figure 2024513079000007
[0113]ＮＴ－未試験、ＮＤ－未決定、ＥＣ５０－（すなわち、試験化合物の非存在下におけるウイルス増殖に対して、一定時間のインキュベーションで単層の細胞に形成されたウイルスプラークの数を５０％減少させるために必要な試験化合物の濃度）、ＥＣ９０－９０％阻害活性、ＣＣ５０－５０％細胞毒性濃度、ＳＩ－選択指数（ＣＣ５０／ＥＣ５０の割合によって算出）。
[0114]Ｃａｌｕ－３ＩＩ型肺胞上皮細胞中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生産的な複製を阻害するために、ＲＤＶは、Ｈｕｈ－７肝細胞癌細胞における単回処理スキームによるその抗ウイルス活性と比較して、低下した効力を示した（表２）。ＲＤＶとは異なり、ＭＢの効力は、これらの細胞におけるウイルス複製を阻害することに対して、実質的に変化しなかったことは発明的である（表２）。単回処理スキームにおけるマイクロモル以下の範囲でのＭＢの低い細胞毒性および効力は、これらの検討された化合物に、参照化合物と同程度であるか、またはそれを上回るＳＩ値－それぞれＲＤＶおよびＭＫ－４４８２をもたらした（表２）。注目すべきことに、ＭＢは、ＭＫ－４４８２と比較した場合に、Ｃａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を１０μＭ未満で阻害する効率を示した（表２）。ＭＢ－９０５は、ＥＣ９０が２．８μＭであり、候補物質の中で最も強力な物質であった（表２）。阻害濃度反応曲線は、参照化合物ＲＤＶおよびＭＫ－４４８１と比較して、窒素性塩基ＭＢ－９０５、ヌクレオシドＭＢ－８０１、およびヌクレオチド（モノホスホルアミデート）ＭＢ－７１１の抗ウイルス性能を強調している（図２Ａ）。
[0115]次に、Ｃａｌｕ－３細胞におけるＭＢに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感受性を毎日処理スキームで試験した。これは、接種直後の処理以外に、続く数日間に処理を繰り返したということであり、細胞をさらに１回または２回処理したという意味である。このｉｎ ｖｉｔｒｏ処理スキームは、感染症に曝露された患者において常用される毎日投与療法レジメンに一致すると考えられ得る。これらの実験条件下で、ＭＢまたはＲＤＶのいずれかである分子の全ては、単回処理よりも、それぞれ１０倍および２倍高い効力および効率を示した（表２）。この手法は、ＲＤＶと比較した濃度依存的阻害曲線における差異を減少させた（図２Ｂおよび表２）。ＲＤＶもＭＢも、複数回処理において、より高い細胞毒性を示さなかった（表２）。逆に、ＭＫ－４４８２の細胞毒性は、毎日処理によってより高くなり、より多くの細胞死を伴い、ＭＫ－４４８２の効率は、２分の１に損なわれた（表２）。
[0116]まとめると、我々のデータは、窒素性塩基ＭＢ－９０５、ヌクレオシドＭＢ－８０１、およびヌクレオチドＭＢ－７１１が、原型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって明らかにされたとおり、抗コロナウイルス活性を付与され、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的パラメータが、気道の代表的な細胞においてより望ましくなっていることを明らかにしている。
実施例６
[0117]抗ウイルス活性を付与されたヌクレオシドアナログおよびヌクレオチド一リン酸アナログは、活性化されるために、それらの三リン酸エステル代謝産物に変換される必要がある。抗ウイルス性プロドラッグとしての窒素性塩基の使用頻度は少ない。アデニンとの構造的類似性によって、ＭＢ－９０５が、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）を介して細胞の代謝に取り込まれることを確認するため、実施例２に記載される実験が、アデニン（競合塩基として）の存在下または９位でブロックされたＭＢ－９０５のアナログ（ＭＢ－９０６）と共に実施された。Ｈｕｈ－７およびＣａｌｕ－３細胞の両方において、接種直後のＭＢ－９０５処理は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の濃度依存的阻害をもたらす（図３ＡおよびＢ）。１０μＭのアデニンを用いた同時処理は、ＭＢ－９０５の抗コロナウイルス活性を妨げた（図３ＡおよびＢ）。さらに、９位にリボース５’リン酸基を受け取ることができないＭＢ－９０６は、抗コロナウイルス活性を付与されなかった（図３ＡおよびＢ）。
実施例７
[0118]薬物が、生理学的に関連する細胞におけるウイルスＲＮＡ合成を阻害する合理性を確認するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡの細胞内レベルを、ＩＩ型肺胞上皮細胞であるＣａｌｕ－３細胞で測定した。Ｃａｌｕ－３細胞を、０．５のＭＯＩで感染させた。１時間の接種期間後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、境界のないウイルスを除去し、１μＭの表示された化合物を用いて処理した。感染の４８～７２時間後に、細胞の単層を溶解し、全ウイルスＲＮＡを抽出し、別の箇所に記載されるとおり、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施し、ゲノム（ＯＲＦ１）を検出し、サブゲノム（ＯＲＦＥ）を検出した。
[0119]最も活性なサイトカイニンおよびそれらの誘導体は、ウイルスＲＮＡ合成を阻害し、それぞれ、サブゲノムＲＮＡ合成よりも５０～７０％ゲノム複製を低下して、より有効である（図４）。比較のため、レムデシビル（ＲＤＶ）を陽性対照として使用した。
実施例８
[0120]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の３時間のプラスチック接着後、ヒト初代単球を得た。密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、健常ドナーからＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣ（２．０×１０６細胞）を、４８－ウェルプレート（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ）の血清を含まないＲＰＭＩ－１６４０に２～４時間プレーティングした。接着していない細胞を除去し、残った単球を、５％ヒト血清（ＨＳ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで維持した。単球を、０．１のＭＯＩで感染させた。１時間の接種期間後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、境界のないウイルスを除去し、１μＭの表示される化合物を用いて処理した。感染の２４時間後に、細胞の単層を溶解し、全ウイルスＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびハウスキーピング遺伝子ＲＮＡｓｅ Ｐを検出した。
[0121]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－に感染したヒト初代単球において、化合物ＭＢ－９０５、ＭＢ－８０１、およびＭＢ－８０４は、ウイルスＲＮＡレベル／細胞を低下させることができた（図５Ａ）。窒素性塩基（ＭＢ－９０５）とヌクレオシド（ＭＢ－８０１）の組合せは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－によって誘導された培養上清中のＴＮＦ－αおよびＩＬ－６レベルの増大も低下させた（図５ＢおよびＣ）。これらのデータは、患者において標的濃度を達成できた場合、ＣＯＶＩＤ－１９における検討した薬物による推定上の利益に関するさらなる証拠をもたらす。
実施例９
感染性ウイルス粒子のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生に対する化合物の抗ウイルス活性は、エキソヌクレアーゼの共阻害によって増強される
[0122]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エキソヌクレアーゼ活性は、その二量体であるｎｓｐ１４／１０によって触媒され、いくつかの部類の化合物によって阻害されることは明らかにされている。
特に、ＨＩＶインテグラーゼ阻害薬であるラルテグラビルは、ｎｓｐ１４活性を妨げる。我々は、ラルテグラビルまたはドルテグラビル（エキソヌクレアーゼの阻害薬として；ｉＥＸＯ）のいずれかと、ＭＢ－９０５、ＭＢ８０１、ＭＢ７１１、およびＭＢ－８０４との間に相乗的な結果を得た。ウイルス複製の１ｌｏｇ（９０％）阻害は、ＭＢを単独で用いて得られたが、ラルテグラビル（図６Ａ）またはドルテグラビル（図６Ｂ）のいずれかによって、さらなるｌｏｇに増強された（図６）。対照として、ソフォスブビルおよびテノホビルも、ラルテグラビルまたはドルテグラビル存在下で、Ｃａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害する効率の増強を示す（図６）。一方、遅延性－連鎖停止剤であるＲＤＶは、ｉＥＸＯによる影響を受けなかった（図６）。まとめると、ＭＢ、ソフォスブビル、およびテノホビルからの結果は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるｎｓｐ１２は、それらをウイルスＲＮＡ中に組み込むことがあるが、ｎｓｐ１４は、改変されたヌクレオチドを除去することがでるという概念に一致する。例外はＲＤＶであり、ｎｓｐ１２が、この薬物に対してＡＴＰを超える高い親和性を有することおよびその遅延された停止のため、この化合物は、ｎｓｐ１４による除去に対して抵抗性がより高い可能性がある。
実施例１０
ＭＢ－９０５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コドン使用に影響を及ぼす
[0123]我々が、ＭＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害することができ、エキソヌクレアーゼ活性によって除去され得ると説明したことから、ＭＢ－９０５の存在下におけるウイルスの増殖は、ウイルスＲＮＡへの取込みに基づくその作用機序を示唆する可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、ＭＢ－９０５の存在下および非存在下で増殖させた。各継代培養後に、増殖の新規の回を、より高濃度下で行った。ウイルスの亜群をモニターするための厳しい整合性とエラー率０．００１％未満で、この上清中のウイルスＲＮＡの塩基配列を解析した。ヌクレオチドのトランジションおよびトランスバージョンを熟考する場合、ＭＢ－９０５の存在下で生成されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、この圧力の非存在下で増殖したものから隔離される（図７Ａ）。ＭＢ－９０５によって誘発された多くの非同義変異が存在し、特に、Ｔ（Ｕ）＝ＣおよびＣ＝Ａの変更は、コドンバイアスを示唆する（図７Ｂ）。ＭＢ－９０５によるコドンバイアスが、エキソヌクレアーゼによって修正される得るため、これらの結果は実施例６と一致しており、したがって、校正活性の阻害は、我々の化合物と相乗作用を示す。さらに、コドンバイアスが、小さなフラグメントにおいてよりも、より大きな遺伝子配列において校正活性を回避するであろう可能性がより高いため、実施例７、６、および４は、一貫性に対して相互干渉する。実際に、サブゲノムよりもゲノムＲＮＡ合成に対するより顕著な阻害が認められた（図４）。
実施例１１
げっ歯類の血漿におけるＭＢ－９０５の薬物動態
[0124]Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＣＩＥｎＰ）動物飼養場からの雌雄両方のＣＤ１系統のマウス（２０～３０ｇ）またはＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２５０～３００ｇ）を使用して、薬物動態アッセイを実施した。全動物は、ＳＰＦ（特定病原体除去）動物条件下で維持され、ＣＩＥｎＰ施設から入手されており、その繁殖コロニーは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入された。ＭＢ－９０５を溶解するために使用された事前配合物は以下のとおりである：３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の用量：１％ＤＭＳＯ＋４％ＰＥＧ４００＋０．５％Ｔｗｅｅｎ８０ｅ９４．５％生理食塩水、３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の用量：１０％ＤＭＳＯ＋４０％ＰＥＧ４００＋５％Ｔｗｅｅｎ８０および４５％生理食塩水、５５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の用量：５％Ｔｗｅｅｎ８０＋９５％ＰＥＧ４００。試験は、ＭＢ－９０５を、１０、３０、または５５０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与するか、または３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与することからなる。経口または静脈内投与後、血液を、０．２５、０．５、１、２、４、８、および２４時間の時点で採取したが、静脈内投与後の採取時点は、０．０８３、０．２５、０．５、１、２、および４時間であった。各動物および各採取時点から採取されたサンプルを、個々に処理し、分析した。血漿および肺の分析のために、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置を使用したが、このシステムは、Ｗａｔｅｒｓからのトリプル四重極型質量分析計を搭載したＸｅｖｏ ＴＱＳ質量分析計からなる。質量分析計は、高速液体クロマトグラフ（Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ）に繋がれている。このデータの取得および処理は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエアを用いて行われた。評価された薬物動態パラメータは：ＡＵＣ（ＡＵＣ ０－ΤまたはＡＵＣ ０－∞）、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２、分布容積、クリアランス、消失定数、およびバイオアベイラビリティであった。バイオアベイラビリティの計算は、以下の方程式を使用して行われた：Ｆ（％）＝［（静脈内用量×経口ＡＵＣ）／（経口用量×静脈内ＡＵＣ）］×１００。
[0125]マウスに静脈内投与（３ｍｇ／ｋｇ）されたか、または経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ）された化合物ＭＢ－９０５の全身投与後、そのピーク血漿濃度は、それぞれ、１３５．１６および５６９．９７ｎｇ／ｍＬであり、最高濃度到達時間は、０．０８３および０．０８３時間であり、半減期は、０．２２および１．１時間であり、分布容積は、１９．４０および１０２．２１Ｌ／ｋｇであり、クリアランスは、９１８．３８および１０６０．１５ｍＬ／分／ｋｇであり、曲線下面積（最終）は、５５．５８および３６５．６３時間ｎｇ／ｍＬであり、曲線下面積（全て）は、６６．４１および３５５．６３時間ｎｇ／ｍＬであり、消失速度定数は、３．０９および０．６２ １／時間であった。マウスにおけるＭＢ－９０５のバイオアベイラビリティは、５３．５％であると推測された（図８Ａ～Ｂおよび表３）。ＭＢ－９０５が、マウスに極めて高用量（５５０ｍｇ／ｋｇ）ＮＯＡＥＬ（無毒性量）で経口投与された場合、その薬物動態パラメータは：それぞれ、ピーク血漿濃度が１，０５３．３７ｎｇ／ｍＬであり、最高濃度到達時間が０．５時間であり、クリアランスが１，８４３．１８ｍＬ／分／ｋｇであり、半減期が２．７２時間であり、分布容積が１，８４３．１８Ｌ／ｋｇであり、曲線下面積（最終）が４，３９２．２７時間ｎｇ／ｍＬであり、曲線下面積（全て）が４，３９２．２７時間ｎｇ／ｍＬであり、消失速度定数が０．２５ １／時間である。ＭＢ－９０５のバイオアベイラビリティは、３６．１％であった（図８Ｃおよび表３）。重要な点として、ヒト細胞におけるＭＢ－９０５のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学的パラメータは、０．１～２．８μＭの範囲であり（表２）、これは、それぞれ２１．５～６０２ｎｇ／ｍＬ（２１５ｇ／ｍｏｌの分子量）に相当する。薬物動態およびＮＯＡＥＬを踏まえると、血漿曝露量は、抗コロナウイルス活性を獲得するために必要とされる用量に一致する。
[0126]
Figure 2024513079000008
[0127]Ｃｍａｘ：ピーク濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：半減期；ＣＬ：クリアランス；Ｖｚ：分布容積；ＡＵＣｌａｓｔ：曲線下面積（最終）；ＡＵＣａｌｌ曲線下面積（全て）；Ｋｅ：消失速度定数；Ｆ：バイオアベイラビリティ；
[0128]ラットに静脈内投与経路でＭＢ－９０５（３ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合、得られた薬物動態パラメータは：それぞれ、ピーク血漿濃度が９９．３７ｎｇ／ｍＬであり、最高濃度到達時間が０．２５時間であり、半減期が０．１１時間であり、分布容積が１３．４３Ｌ／ｋｇであり、クリアランスが１，３３６．７７ｍＬ／分／ｋｇであり、曲線下面積（最終）が３４．７２時間ｎｇ／ｍＬであり、曲線下面積（全て）が３５．２０時間ｎｇ／ｍＬであり、消失速度定数が０．２５ １／時間であった（図８Ｄおよび表４）。
[0129]
Figure 2024513079000009
[0130]Ｃｍａｘ：ピーク濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：半減期；ＣＬ：クリアランス；Ｖｚ：分布容積；ＡＵＣｌａｓｔ：曲線下面積（最終）；ＡＵＣａｌｌ曲線下面積（全て）；Ｋｅ：消失速度定数；Ｆ：バイオアベイラビリティ；
[0131]ラットに経口投与（１０および３０ｍｇ／ｋｇ）した場合、ＭＢ－９０５は、以下の薬物動態パラメータで良好に吸収される：それぞれ、ピーク血漿濃度が５４４．９６および３７０．４７ｎｇ／ｍＬであり、最高血漿濃度到達時間が０．２５および０．２５時間であり、半減期が１．４６および３．８１時間であり、分布容積が３０．３７および１０９．１８Ｌ／ｋｇであり、クリアランスが２４１．０９および３３０．５７ｍＬ／分／ｋｇであり、曲線下面積（最終）が６６６．１４および１，４９８．０９時間ｎｇ／ｍＬであり、曲線下面積（全て）が７６１．９１および１，４９８．０９時間ｎｇ／ｍＬであり、消失速度定数が０．４７および０．１８ １／時間である。ラットにおけるＭＢ－９０５のバイオアベイラビリティは、１０および３０ｍｇ／ｋｇの用量に対して、それぞれ、９８．８および６４．７％であると推測された（図８Ｅおよび８Ｆならびに表４）。
実施例１２
３つの異なる配合物中のＭＢ－９０５の薬物動態
[0132]異なる事前配合物を用いた薬物動態プロファイルを評価するために、マウスを、５％ｔｗｅｅｎ８０＋９５％ＰＥＧ４００（図２１Ａおよび表５）または５％カルボキシメチルセルロース（図２１Ｂおよび表５）と事前に配合されたコンパウンドを伴うＭＢ－９０５（３、３０、および３００ｍｇ／ｋｇ）ならびに５％エタノール、３０％プロピレングリコール、４５％ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）、および２０％水中のＭＢ－９０５（３、３０、および５５０ｍｇ／ｋｇ）（図２１Ｃおよび表５）を用いて経口処置した。全ての事前配合物は、同様のＣｍａｘの結果を示したが、半減期（Ｔ１／２）は、ｔｗｅｅｎ８０＋９５％ＰＥＧ４００または５％カルボキシメチルセルロースと比較して、５％エタノール、３０％プロピレングリコール、４５％ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）、および２０％水に希釈された場合に、用量３０ｍｇ／ｋｇのＭＢ－９０５でより良好であった。
したがって、この事前配合物は、続くｉｎ ｖｉｖｏ試験に最も使用された。
[0133]
Figure 2024513079000010
[0134]Ｃｍａｘ：ピーク濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：半減期；ＡＵＣａｌｌ曲線下面積（全て）。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を使用して、ノンコンパートメントデータ解析を行った。データは、１群あたり１～６匹の動物の平均値を表す。
実施例１３
ＭＢ－９０５によるウイルス複製の阻害
[0135]ＭＢ－９０５が、その対応するヌクレオチド三リン酸のプロドラッグである可能性が最も高いということを考慮し、ウイルス複製の阻害が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼに対する直接作用に関連し得るかどうかを、さらに試験された（図１６Ａ）。カイネチンリボシド５’－三リン酸は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼを阻害するが、ＲＤＶ（ＧＳ－４４３９０２）の活性な三リン酸エステル形態と比較した場合、３倍高いＩＣ５０を有する（図１６Ａ）。ＲＤＶ、ＭＢ－９０５、およびそれらの対応するヌクレオチド三リン酸は、無細胞アッセイ（図１６Ａ）および細胞ベースアッセイ（図１７Ａ、Ｂおよび表６）を使用して、程度の順が同じ同様の効力を示した。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞中の細胞関連ゲノムウイルスＲＮＡおよびサブゲノムウイルスＲＮＡを測定することによって、我々は、本発明による化合物が、ウイルスＲＮＡ合成を妨げることに対して活性であることを見出した（図１６Ｂ）。ＲＤＶが、複製（ゲノムＲＮＡ）および転写（サブゲノムＲＮＡ）の指標の両方を、同様の程度で阻害したのに対して、本発明による化合物は、転写よりもむしろ複製の減少に対してより有効であった（図１６Ｂ）。ＭＢ－９０５および関連するプロドラッグが、宿主細胞内でリボシド５’－三リン酸を生み出し、後者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼの基質であることを考慮すると、Ｎ６－フルフリルアデニンは、ＭＢ－９０５処理されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞からのウイルスゲノムに組み込まれるであろう。この仮説を検討するために、高親和性抗Ｎ６－フルフリルアデニンＩｇＧを使用して、ウイルスＲＮＡの免疫沈降（ＩＰ）を行い、続いてＲＴ－ＰＣＲによる定量化を行った。ｎｉｌ処理細胞は、対照であるアイソタイプの免疫沈降反応と比較して、ウイルスＲＮＡ中の基礎レベルのカイネチンをすでに示しており（図１６Ｃ）、これは、ウイルスゲノムにおけるＮ６－フルフリルアデニンの自然発生を示唆している－このＮ６－フルフリルアデニンは、サンプル調製の間のＲＮＡ構成成分の自然酸化に起因する可能性がある。際立って、ＭＢ－９０５処理されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞に対する抗Ｎ６－フルフリルアデニンＩＰから得られたウイルスＲＮＡは、アイソタイプ対照およびｎｉｌ処理細胞と比較して、１０倍を上回る高レベルのＮ６－フルフリルアデニンを有していた（図１６Ｃ）。このため、Ｎ６－フルフリルアデニンは、ＭＢ－９０５を用いた処理において、ウイルスゲノムに組み込まれるように思われる。我々は、次に、ＭＢ－９０５およびｎｉｌ処理されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３細胞からの完全長ウイルスゲノムの塩基配列を解析し、最初の塩基レベル、特に、Ｔ（Ｕ）ＡおよびＣＡにおける増加した変換を認めた（図１６Ｄ）。このエラープローン複製は、ＭＢ－９０５の存在下および非存在下で増殖したウイルス集団を、系統学的に識別可能にした（図１８）。二本鎖核酸中のＮ６－フルフリルアデニンの存在をモデル化することで、Ｎ６－フルフリル部分が隣接するアデニンに衝突すること（図１９Ａ）；このため、鎖間の距離が広がり、ポリメラーゼ活性を妨げる可能性があることが強調されている。この非標準的な塩基解離（ｂａｓｅ ｐａｒｉｎｇ）（図１９Ｂ）は、エラープローン複製を引き起こす可能性がある。
[0136]
Figure 2024513079000011
[0137]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製複合体における校正機構は、ＭＢ－９０５由来の組み込まれたヌクレオチドを能動的に取り除いている可能性があることを知り、我々は、エキソヌクレアーゼの共阻害が、調査中の化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性を増強するかについて試験した。ＨＩＶインテグラーゼ１３およびＨＣＶ ＮＳ５Ａ阻害薬２８のいずれかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エキソヌクレアーゼを標的とするために提案された。したがって、ＭＢ－９０５または対照であるＲＮＡポリメラーゼ阻害薬は、ドルテグラビル（ＤＴＧ）、ラルテグラビル（ＲＴＧ）、ピブレンタスビル（ＰＩＢ）、オムビタスビル（ＯＭＢ）、またはダクラタスビルの準最適用量と組み合わされた（拡張表２）。我々は、ＲＮＡポリメラーゼとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１４の転用された阻害薬の組合せが、ＭＢ－９０５および対照である抗ウイルス薬のような、前者の効力を増強したことを観察した（表７）。ＭＢ－９０５の事例では、ＨＩＶインテグラーゼ阻害薬と組み合わせた場合に、ＥＣ９９レベルにおける効率的な阻害が得られた（表６）。ＭＢ－９０５、ＭＢ－８０１、またはＭＢ－７１１を５μＭのＤＴＧまたはＲＴＧと組み合わせることで得られた増強をより明らかにするために、結果は、無処理のウイルス感染細胞および処理されたウイルス感染細胞におけるウイルス生産力価として示されている（図１６ＥおよびＦ）。本発明の化合物が、１０μＭにおいて、ウイルス複製を１－ｌｏｇ１０で阻害したのに対して、５μＭのＲＴＧ（図１６Ｅ）またはＤＴＧ（図１６Ｆ）との組合せは、抗ウイルス阻害を２－ｌｏｇ１０に増強した。注目すべきことに、ＲＴＧおよびＤＴＧは、５μＭで試験された場合に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に対する限界効果を示した（図１６ＥおよびＦ）。薬物の組合せにおけるこれらの結果は、エラープローン分子としてのＭＢ－９０５作用機序の特性評価を裏付けるのみならず、我々のリード化合物が、転用された薬物と共に使用される得ることも指摘している。特に、ＤＴＧとの組合せは、極めて望ましい薬物動態を有する。
[0138]
Figure 2024513079000012
Figure 2024513079000013
[0139]加えて、ＭＢ－９０５は、遺伝子導入マウスが、致死的挑戦（１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶｏＣガンマ）からヒトＡＣＥ２（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）を発現することを防ぐことができるかを評価した。疾患発症後に患者が治療を求めるといった臨床的状況により類似させるため、鼻腔内ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の１２時間後にＭＢ－９０５を用いた経口処置を開始し、その後、１日１回継続した。ＤＴＧと組み合わせたか、または組み合わせていない１４０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５、およびＨＩＶインテグラーゼ阻害薬と組み合わせた７０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ－９０５において、より高い生存率が認められた（図２０Ａ）。死亡を除いて、体重減少が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の主な臨床イベントである。単独およびＤＴＧとの組合せで１４０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＢ９０５を用いた処置下において、感染したマウスは、安楽死の閾値を上回る質量を維持し（図２０Ｂ）、全体的な臨床スコアを改善した（図２０Ｃ）。ＤＴＧと組み合わせてか、または組み合わせないで投与されたＭＢ－９０５は、感染したマウスの肺におけるウイルスＲＮＡレベルを変化させなかった（図２０Ｄ）が、感染力価は、処置において顕著に低下した（図２０Ｅ）。これらの結果は、ウイルス複製のエラープローン阻害と一致する。
[0140]単独またはＤＴＧと組み合わせたＭＢ－９０５は、肺壊死を減少させた（図２０ＦおよびＧ）。感染／無処置マウスの肺組織像は、虚脱した肺胞の中隔および重度の出血を示すのに対して、処置された動物は、モック感染マウスにより近い肺実質を示した（図２０Ｇ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染単球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ結果と一致して、ＭＢ－９０５は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても顕著な抗炎症特性をも与えられている（図２０Ｈ～Ｋ）。サイトカインストームの指標であるＴＮＦ－α（図２０Ｈ）、ＩＬ－６（図２０Ｉ）、およびＫＣ（図２０Ｊ）のレベル、ならびに炎症細胞数（図２０Ｋ）は、無処置の動物と比較として、ＭＢ－９０５を用いて処置されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスの気管支肺胞上皮洗浄液（ＢＡＬ）中で減少していた。
実施例１４
ＭＢ－９０５によるベータコロナウイルス複製のｉｎ ｖｉｖｏ阻害
[0141]ベータコロナウイルス複製を維持するための酵素機構は、極めて保存されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の間のｎｓｐ１２およびｎｓｐ１４において７０％を上回る相同性を有する（図１４Ａ）。実際に、ＲＮＡ合成中に重要なこれらの両酵素における活性部位は、ｇｅｎｂａｎｋからの翻訳されたタンパク質（ｎｓｐ１２、ＹＰ＿００９９２４３５２．１とＹＰ＿００９７２５３０７．１；ｎｓｐ１４、ＹＰ＿００９９２４３５４．１とＹＰ＿００９７２５３０９．１）に基づいて同一である（図１４Ａ）。動物バイオセーフティレベル３（ＡＢＳＬ－３）の施設への国際的なアクセスが制限されていることを考慮して、原型ベータコロナウイルスＭＨＶは、ＡＢＳＬ－２におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験のための代替である。これは、複製機構を標的とする薬物に対して、特に整合性がある。鼻腔内接種において、我々は５０％の死亡を確認した（図１４Ｂ）。ＭＢ－９０５単独は、マウスの死亡を半分に減少したのに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡが二次構造をアンフォールディングし、ｎｓｐ１２活性を妨げるのに都合が良いダクラタスビル（ＤＡＣ）は、完全に死亡を防いだ（図１４Ｂ）。薬物は、完全な体重回復を果たせなかったが（図１４Ｃ）、炎症細胞の減少は、感染したマウスの気道で認められた（図１４Ｄ）。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を早期に妨げるＭＢの能力が、抗炎症活性をもたらす場合に、実施例５と一致する。
実施例１５
ＭＢ－９０５の遺伝毒性評価－ＡＭＥＳ試験
[0142]遺伝毒性試験は、遺伝物質への損傷を誘発する可能性を有する物質を検出するために開発され、化学物質の安全性評価の一環として、規制当局によって世界的に推奨されている。これらの試験は、ＤＮＡ損傷に関連する危険性を同定する。遺伝子組換えを検出するこれらの試験において、試験結果が陽性である物質は、ヒトに対して潜在的に発癌性および／または変異原性である。このため、細菌の変異原性試験は、可能性がある遺伝毒性活性、特に、点変異誘発活性を評価するための最初のスクリーニングとして、広く使用されている。細菌の復帰突然変異アッセイは、ＯＥＣＤ指針４７１－Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓの推奨に従って実施された。方法４７１「細菌の復帰突然変異試験」（採用：２０２０年６月２６日）。代謝活性化（Ｓ９）の非存在下または存在下におけるＴＡ１００株を用いた予備試験は、確定試験のためのＭＢ－９０５の適切な濃度を選択することを目的として実施された。この結果は、表８に示されている。
[0143]
Figure 2024513079000014
[0144]（－Ｓ９）＝代謝活性化系の非存在下；（＋Ｓ９）＝代謝活性化系の存在下（－）＝陰性；（＋）＝陽性。＃陽性対照＝４－ニトロキノリン－Ｎ－オキシド（４ＮＱＯ）０．５μｇ／プレート：ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、およびＴＡ１０２（－Ｓ９）；アジ化ナトリウム（ＡＺＳ）１．５μｇ／プレート：ＴＡ１００およびＴＡ１５３５（－Ｓ９）；２－アミノフルオレン（２－ＡＦ）５０μｇ／プレート：ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、およびＴＡ１００（＋Ｓ９）；２－アミノアントラセン（２－ＡＡ）：２．５および５μｇ／プレート：それぞれＴＡ１５３５およびＴＡ１０２（＋Ｓ９）。
[0145]この結果は、ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、およびＴＡ１５３５のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細菌における復帰突然変異試験において、代謝活性化系（Ｓ９）の非存在下および存在下のいずれにおいても、ＭＢ－９０５に対する変異原性活性が確認されなかったことを明らかにした。
実施例１６
ＭＢ－９０５の遺伝毒性評価－小核試験
[0146]小核試験は、ＯＥＣＤ指針４７４に従って、マウス骨髄において実施され、ＧＬＰの原則を順守して行われた。雄および雌Ｓｗｉｓｓマウス（５～１０週）を、５つの実験群に割り付け、溶媒（５％Ｔｗｅｅｎ＋９５％ＰＥＧ Ｅ４００）もしくは３つの異なる用量のＭＢ－９０５（３２、１２５、または５００ｍｇ／ｋｇ）を３日間連続、またはシクロホスファミド（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を２日間連続で経口処置した。骨髄細胞を、採取して、Ｓｃｈｍｉｄによって記載された方法（１９７５）に従って処理した。正染性赤血球に対する多染性赤血球の割合および小核の数を測定した。このアッセイは、ＧＬＰの原則を順守して行われた。この結果は、表９に示されている。
[0147]
Figure 2024513079000015
[0148]ｐ．ｏ．＝経口；ｉ．ｐ．＝腹腔内；ＰＣＥ＝多染性赤血球；ＮＣＥ＝正染性赤血球；ＭＮＰＣＥ＝小核を有する多染性赤血球；Ｓ．Ｄ．＝標準偏差。＊クラスカル－ウォリス検定による陰性対照からの有意差：＊ｐ＜０．０５。
[0149]評価された条件下および試験された用量において、ＭＢ－９０５は、マウスにおいて小核を有するＰＣＥの数の増加を促すことはなく、このため、遺伝毒性作用を有さないと結論付けられる。
実施例１７
ラットにおける最大耐量および用量選択
[0150]本アッセイは、ＭＢ－９０５の安全性および忍容性を検討するために設計された。ＭＴＤアッセイ（ＯＥＣＤ４２５）のために、マウス（各性別の動物３匹／群）を、５つの実験群に割り付け、上げ下げ法を適用し、１７５ｍｇ／ｋｇを初回用量として使用した。次に、ＭＴＤアッセイが、反復曝露に対する推奨用量として５５０ｍｇ／ｋｇを指摘したことから、ＭＢ－９０５の忍容性は、２つの実験群（各性別５匹／群）を、７日間連続で溶媒（１群）またはＭＢ－９０５（５５０ｍｇ／ｋｇ）を用いた経口処置に供することによって評価された。死亡率、罹患率、体重、摂餌量、毒性の全身的および詳細な臨床徴候が評価された。解剖時に、重要器官（脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および副腎）および生殖器官（卵巣、精巣、および精巣上体）を、慎重に摘出し、計量し、さらなる分析のために（必要であれば）保存した。
[0151]罹患率および死亡率－経口投与経路による１７５、５５０、および８５０ｍｇ／ｋｇの用量でＭＢ－９０５を用いた動物の経口処置は、処置期間全体の間、該動物の毒性を示唆するいかなる徴候も結果として示さなかった。しかし、１，１５０ｍｇ／ｋｇのＭＢ－９０５を用いて経口処置されたマウスは、化合物投与の４時間後に死亡する結果となった。
[0152]全身的および詳細な臨床徴候：詳細な臨床徴候を、処置の開始前に１回実施し、該動物の健康状態を確認し、その後、１週間に１回実施した。全身的な臨床徴候を、処置後４時間まで毎時間評価し、その後、毎日評価した。異なる用量レベル（１７５、５５０、および８５０ｍｇ／ｋｇ）のＭＢ－９０５を用いて経口処置された動物は、実験時期全体を通して、毒性を示唆する観察可能ないかなる臨床徴候も結果として示さなかった。１，１５０ｍｇ／ｋｇのＭＢ－９０５を用いた処置後に生き残ったマウスは、経口投与後４時間以内に、起毛、触反応の低下、虚脱、握力の喪失、体温の低下、および該動物の死亡を示した。
[0153]体重変化および摂餌量：体重および摂餌量を、処置の開始前（ベースライン）に１回測定し、その後、１週間に１回測定した。両パラメータに関して、実験プロトコールの終了時に、ＭＢ－９０５（１７５、５５０、または８５０ｍｇ／ｋｇ）を用いた単回処置に関連する有意な変化が全く認められなかった。
[0154]臓器重量：解剖手技後、全ての実験群の各動物に対して、主要臓器（副腎、脾臓、脳、心臓、腎臓、胸腺、肝臓、精巣、精巣上体、および卵巣）の重量（ｇ）を測定した。この結果は、ＭＢ－９０５（１７５、５５０、または８５０ｍｇ／ｋｇ）を用いた単回経口処置に関連するいかなる変化も示さなかった。
[0155]マウスに対するＭＢ－９０５の経口投与のためのＮＯＡＥＬ（無毒性量）は、５５０ｍｇ／ｋｇであると推測された。
実施例１８
毒物動態学を用いたマウスにおけるＭＢ－９０５の２８日間反復投与毒性試験
[0156]本試験の目的は、マウスにおいて経口投与経路で２８日間投与されたＭＢ－９０５を用いた処置後の潜在的毒性を評価することであった。雄および雌ＣＤ１マウス（６～８週、マウス１０匹／群／性別）を、溶媒（４５％ポリエチレングリコール４００－ＰＥＧ４００、３０％プロピレングリコール、２０％濾過水、および５％エタノール）または異なる用量のＭＢ－９０５（１０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、２８日間１日１回（主な動物）で経口処置した。加えて、同じ処置レジメンが適用されたが、試験品目の投与に関連した毒性作用の残留性、可逆性、または遅発的な発生を観察するために、動物（溶媒または２５０ｍｇ／ｋｇのＭＢ－９０５）をさらに１４日間無処理のまま留置した回復群（雄５匹および雌５匹）を設けた。これらの実験は、ＧＬＰの原則を順守して行われた。罹患率、死亡率、雄（図１０Ａ）および雌（図１０Ｂ）における体重、摂餌量に加えて全身的および詳細な臨床徴候を評価した。最後の週において、全ての動物からの尿サンプルを、分析のために採取した。解剖時に、血液学的分析、生化学的分析、および凝固分析のため、血液サンプルを採取し、続けて、肉眼的分析および組織病理学的分析のため、組織および臓器の採取を行った。
[0157]臨床化学および血液学：主要群：ＭＢ－９０５は、回復群の動物中で回復した雄（表１０および１２）および雌（表１１および１３）において、生化学的および血液学的パラメータにおける軽度の変化をもたらした。
[0158]
Figure 2024513079000016
[0159]＆標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＷＢＣ－合計細胞；ＲＢＣ－赤血球；ＨＧＢ－ヘモグロビン；ＨＣＴ－ヘマトクリット；ＭＣＶ－赤血球容積；ＭＣＨ－平均赤血球ヘモグロビン；ＭＣＨＣ－平均赤血球ヘモグロビン濃度；ＰＬＴ－血小板数；Ｗ－ＳＣＲ－小型白血球（リンパ球）指標；Ｗ－ＭＣＲ－平均白血球（単球）指標；Ｗ－ＬＣＲ－大型白血球（好中球）指標。
[0160]
Figure 2024513079000017
[0161]＆標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＷＢＣ－合計細胞；ＲＢＣ－赤血球；ＨＧＢ－ヘモグロビン；ＨＣＴ－ヘマトクリット；ＭＣＶ－赤血球容積；ＭＣＨ－平均赤血球ヘモグロビン；ＭＣＨＣ－平均赤血球ヘモグロビン濃度；ＰＬＴ－血小板数；Ｗ－ＳＣＲ－小型白血球（リンパ球）指標；Ｗ－ＭＣＲ－平均白血球（単球）指標；Ｗ－ＬＣＲ－大型白血球（好中球）指標。
[0162]
Figure 2024513079000018
[0163]標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＡＬＴ－アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＧＴ－ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ；ＴＲＩ－トリグリセリド；ＥＮ－総タンパク質；ＣＲＥ－クレアチニン；ＡＬＢ－アルブミン；ＡＳＴ－アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＴ－総ビリルビン；ＴＣ－総コレステロール；ＦＡ－アルカリフォスファターゼ；Ｐ－リン；Ｃａ－カルシウム。
[0164]
Figure 2024513079000019
[0165]標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＡＬＴ－アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＧＴ－ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ；ＴＲＩ－トリグリセリド；ＥＮ－総タンパク質；ＣＲＥ－クレアチニン；ＡＬＢ－アルブミン；ＡＳＴ－アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＴ－総ビリルビン；ＴＣ－総コレステロール；ＦＡ－アルカリフォスファターゼ；Ｐ－リン；Ｃａ－カルシウム。
[0166]
Figure 2024513079000020
[0167]標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＡＬＴ－アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＧＴ－ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ；ＴＲＩ－トリグリセリド；ＥＮ－総タンパク質；ＣＲＥ－クレアチニン；ＡＬＢ－アルブミン；ＡＳＴ－アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＴ－総ビリルビン；ＴＣ－総コレステロール；ＦＡ－アルカリフォスファターゼ；Ｐ－リン；Ｃａ－カルシウム。
[0168]
Figure 2024513079000021
[0169]標準偏差；Ｎ－動物の数；＊溶媒群に関して有意に異なる；ＡＬＴ－アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＧＴ－ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ；ＴＲＩ－トリグリセリド；ＥＮ－総タンパク質；ＣＲＥ－クレアチニン；ＡＬＢ－アルブミン；ＡＳＴ－アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＴ－総ビリルビン；ＴＣ－総コレステロール；ＦＡ－アルカリフォスファターゼ；Ｐ－リン；Ｃａ－カルシウム。
[0170]尿検査：尿パラメータ（量、比重、ｐＨ、タンパク質）における有意な変化は、主要群において認められなかった。
[0171]眼科：眼科的健康状態における変化は、最大用量（２５０ｍｇ／ｋｇ）におけるいずれの性別においても認められなかった。
[0172]肉眼的検査：解剖手技中に実施された肉眼的評価は、処置に関連する有意な変化を明らかにしなかった。
[0173]組織病理学：組織病理学的評価は、両性別において、２５０ｍｇ／ｋｇの用量でＭＢ－９０５を用いた処置に関連する腎臓における作用を明らかにした。腎臓における変化は、好塩基性近位尿細管および尿細管拡張の領域を特徴とし、これは、１０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇに加えて、回復群では認められなかった。
[0174]マウスに対するＭＢ－９０５の経口投与のためのＮＯＡＥＬ（無毒性量）は、８０ｍｇ／ｋｇであると推測された。
[0175]毒物動態パラメータ：試験の０日目および２８日目からのＡＵＣａｌｌおよびＣｍａｘデータを通して、雄および雌の両方において、ＭＢ－９０５の蓄積がないことを示唆しており、これは、化合物の可能性がある毒性作用が、処置の中断によって速やかに回復し得ることを示唆している（表１４）。
[0176]
Figure 2024513079000022
[0177]Ｃｍａｘ：ピーク濃度；Ｔｍａｘ：Ｃｍａｘ到達時間；Ｔ１／２：半減期；ＡＵＣｌａｓｔ：曲線下面積（最終）；ＡＵＣａｌｌ曲線下面積（全て）。
実施例１９
遠隔測定によるＭＢ－９０５の心血管安全性薬理学の評価
[0178]意識があり、自由に行動している雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（９～１２週間）であって、あらかじめ、ＤＳＩ（商標）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌハードウエアシステムインプラントの腹部大動脈への配置のための手術を受けたラットを、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）またはＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、７日間連続で１日１回経口処置した。収縮期血圧、拡張期血圧、心拍数、および心電図のような心血管パラメータを、処置前（ベースライン）ならびに１日目および７日目の処置の０．５、１、２、３、４、５、６、７、１２、および２４時間後に評価した。結果から、ＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与または反復投与は、溶媒処置動物と比較した場合、収縮期血圧、拡張期血圧、平均血圧、および心拍数（図１１および１３）のような心血管系の血行動態パラメータにおいて、いかなる変化も誘発しなかったことが示される。また、溶媒群と比較した場合、ＭＢ－９０５（５０または２５０ｍｇ／ｋｇ）は、単回投与（図１２）または反復投与（図１４）を行った場合の心電図パラメータ（ＱＴ間隔、ＱＴｃ間隔、ＱＲＳ間隔、ＰＲ間隔）において、いかなる変化も誘発しなかった。得られた結果、試験されたＭＢ－９０５の用量、および本実験が行われた条件を考慮すると、ＭＢ－９０５は、自由行動ラットの遠隔測定アッセイで評価した場合、心血管系に関する安全なプロファイルを示すと結論付けることが可能である。
実施例２０
ｈＥＲＧ型の電位依存性カリウムチャネル（ヒト急速活性型遅延整流カリウムチャネル）の阻害
[0179]ｈＥＲＧ型の電位依存性カリウムチャネル（ヒト急速活性型遅延整流カリウムチャネル）は、心臓の正常な電気的活動のために必須である。ｈＥＲＧチャネル機能不全は、心臓細胞の活動電位の遅延再分極およびＱＴ間隔の延長を特徴とし、心室性不整脈および突然死の危険性を増加するＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の原因となり得る。したがって、このチャネルに作用し、ＱＴ延長症候群を招く可能性がある化合物は、安全性試験における非臨床的開発過程の早期に除外された。
[0180]カリウムチャネルｈＥＲＧの阻害を評価することを目的とする研究は、パッチクランプ技術を使用した電気生理学的試験を介して従来行われており、これは、イオンチャネル研究のためのゴールドスタンダードと考えられている；しかし、他の方法は、不死化細胞にトランスフェクトされたイオンチャネルを介したイオンの流入を評価するために開発された。これらの方法のうちの１つは、ＦＬＩＰＲＲ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ａｓｓａｙと呼ばれる市販キットを使用することであり、ｈＥＲＧチャネルのようなイオンチャネルに対する化合物の評価および迅速で確実なスクリーニングのためにますます使用されている。この試験で使用された方法は、市販のＦＬＩＰＲＲ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ａｓｓａｙキット中に存在する成分であるタリウムに対するｈＥＲＧカリウムチャネルの透過性に基づいていた。ｈＥＲＧカリウムチャネルが、刺激によって開いた際に、外部環境からのタリウムの流入は、高感度の示指染料によって検出される。この蛍光シグナルは、タリウムに対して透過性であるｈＥＲＧイオンチャネルの活性を量的に反映する。ＦＬＩＰＲＲ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ａｓｓａｙを使用した方法の検証結果は、電気生理学的研究と比較した場合、どちらの方法もｈＥＲＧチャネルにおいて同等の結果をもたらすことを証明した。したがって、ｈＥＲＧとの相互作用を評価するため、市販のキットであるＦＬＩＰＲＲ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）が使用され、試験は、その製造業者の仕様書に従って実施された。
[0181]ヒトｈＥＲＧ遺伝子（Ｋｖ１１．１）の発現のための組換えＨＥＫ－２９３細胞株は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手された。本試験における使用のため、細胞を解凍し、供給業者の仕様書：ｈＥＲＧ（Ｋｖ１１．１）－ＨＥＫ－２９３組換え細胞株カタログ番号：６０６１９製品シートに従って培養した。細胞を、添加培養培地を含有するボトル内で、ＣＯ２インキュベーター中、５％および０．２％ＣＯ２を伴う３７℃で、本試験の時間まで保存した。これに対して、ヒトｈＥＲＧを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞を解凍した後、黒色９６－ウェル、透明平底プレート中、１ウェルあたり４×１０４細胞の密度でプレーティングした。細胞のコンフルエント後、このプレート培養培地を、吸引し、カルシウムおよびマグネシウム無添加のＨＢＳＳ５０μＬを用いて置き換えた。次に、細胞を、終濃度２．５ｍＭでプロベネシドを含有する市販キット中に存在する蛍光プローブ５０μＬと共にインキュベートした。室温および暗所での１時間のインキュベーション後、ＳＴ－０８０を含む処理薬２５μＬをウェルに加え、プレートを３０分間、再度インキュベートした。あらかじめ最適化された刺激緩衝液（５０μＬの１ｍＭタリウム＋１０ｍＭカリウム）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３装置に備えられた自動ピペッティングを介して、各カラムに加えた。シグナルを、１．５２秒間隔で、カラム毎に約１４０秒間取得した。ＳｏｆｔＭａｘＲＰｒｏソフトウエアを使用して、４８５ｎｍの励起波長および５３８ｎｍの発光波長において、データを取得した。データ分析は、ＳｏｆｔＭａｘ ＰｒｏソフトウエアおよびＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍＲ８を使用して行われた。結果は、ｈＥＲＧチャネルの阻害の百分率および平均阻害濃度（ＩＣ５０）として表記され、それぞれの９５％信頼区間は、線形回帰を使用して算出された。
[0182]図１５で見られるように、細胞中、げっ歯類の血漿で観察された濃度を大きく超える極めて高濃度（最大３００μＭ）でさえ、インキュベートされた化合物ＭＢ－９０５（Ａ）は、ｈＥＲＧチャネルを介したカリウム透過性の極めて低い阻害（約２０％）を呈した。一方、ｈＥＲＧチャネルの既報告の選択的阻害薬であるドフェチリドは、ｈＥＲＧの濃度依存的阻害をもたらした。ｈＥＲＧチャネル活性に対する推定されるドフェチリド（図１５Ｂ）の平均ＩＣ５０濃度（ＩＣ５０）は、０．０１２μＭであった。
[0183]本明細書に含まれる説明および実施例を通して、該当分野の熟練者は、速やかに本発明の利点を理解するであろうし、添付の発明の範囲から逸脱することのない、本発明と同等の実施形態を提案することが可能であろう。

Claims (38)

  1. コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する予防的、治療的または緩和的治療のための、ならびにＣＯＶＩＤ－１９の患者およびコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の可能性がある個体または曝露の危険性がある個体の治療のための、ウイルスＲＮＡ合成を阻害する抗ウイルス性化合物であって、カイネチン（ＭＢ－９０５）、カイネチンリボシド（ＭＢ－８０１）、カイネチンリボシドモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）、ゼアチン（ＭＢ－９０７）、およびゼアチンリボシド（ＭＢ－８０４）またはそれらの誘導体、塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの群から選択されることを特徴とする、上記抗ウイルス性化合物。
  2. カイネチン（ＭＢ－９０５）、カイネチンリボシド（ＭＢ－８０１）、カイネチンリボシドモノホスホルアミデート（ＭＢ－７１１）、ゼアチン（ＭＢ－９０７）、およびゼアチンリボシド（ＭＢ－８０４）またはそれらの誘導体、塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの活性な一リン酸エステルおよび二リン酸エステルおよび三リン酸エステルから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
  3. 化合物が、カイネチン－リボース５’－三リン酸（ＭＢ－７１７）であることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。
  4. （ｉ）有効量の１種または複数の請求項１～３のうちの一項で定義された抗ウイルス性化合物；および（ｉｉ）有効成分と適合する薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する予防的、治癒的（治療的）、または緩和的治療のための、ならびにＣＯＶＩＤ－１９の患者およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の可能性がある個体または曝露の危険性がある個体の治療のための、抗ウイルス性医薬組成物。
  5. （ｉｉｉ）相乗作用を示す量のラルテグラビル、ドルテグラビル、およびそれらのアナログをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  6. １～３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇ、より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇの抗ウイルス性化合物を含有することを特徴とする、請求項４または５に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  7. １種または複数の抗ウイルス性化合物が、単剤療法レジメンで通常投与される投与量の約１０～１００％の割合で存在することを特徴とする、請求項４～６のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  8. レムデシビル、ＡＴ－５２７、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アシクロビル、シドフォビル、ドコサノール、ファムシクロビル、ホスカルネット、ホミビルセン、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、ビダラビン、アマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、イミキモド、ラミブジン、テノホビル、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、インダルジ（ｉｎｄｕｌｇｅ）、アバカビル、ネビラビル（ｎｅｖｉｒａｖｉｒ）、ネバビル、ネバビルロピナビル、ダクラタスビル、クロロキン、ケルセチン、バニプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、ファビピラビル、パリビズマブ、オムビタスビル、ベクラブビル、ダサブビル、ピブレンタスビル、ダクラタスビル、レムデシビル、他のウイルス阻害薬、ＲＮＡ阻害薬、他のＲＮＡポリメラーゼ、他のＲＮＡ阻害薬、モノクローナルまたはポリクローナル抗体から選択される１種または複数の抗ウイルス性化合物を含むことを特徴とする、請求項４～７のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  9. アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン（ｂｓ）、アンサマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、カルバセフェム、ロラカルベフ、カルバペネム、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（ｂｓ）、オキサゾリジノン（ｂｓ）、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ピペラシリン、ペニシリンｇ、テモシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸塩、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンｂ、キノロン類／フルオロキノロン類、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド系（ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ｔｍｐ－ｓｍｘ）、スルホンアミドクリソイジン（旧型）、テトラサイクリン（ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール（ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ｂｓ）、チニダゾール、トリメトプリム（ｂｓ）から選択される１種または複数の抗菌薬をさらに含むことを特徴とする、請求項４～７のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  10. 治療上有効な量の１種または複数の免疫調節性化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項４～７のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  11. １種または複数の免疫調節性化合物が、アルファ、ベータ、ガンマインターフェロンおよびそれらのペグ化形態、糖質コルチコイド、ならびにコルチコイドから選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  12. とりわけ、着色料、分散剤、甘味料、皮膚軟化剤、抗酸化剤、保存剤、ｐＨ安定剤、香料のような不活性物質およびそれらの混合物も含むことを特徴とする、請求項４～１１のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  13. 固体形態または液体形態で提供されることを特徴とする、請求項３～１０のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  14. 固体形態が、錠剤またはカプセルとしてであることを特徴とする、請求項１３に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  15. 液体形態が、懸濁剤、溶液、またはシロップ剤としてであることを特徴とする、請求項１３に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  16. 経口投与または全身投与のためのものであることを特徴とする、請求項３～１０のうちの一項に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  17. 経口投与が、シロップ剤、錠剤、またはカプセルによることを特徴とする、請求項１６に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  18. 全身投与が、静脈内、皮下、または筋肉内であることを特徴とする、請求項１６に記載の抗ウイルス性医薬組成物。
  19. （ｉ）請求項１～３のうちの一項で定義された化合物、ならびに（ｉｉ）相乗作用を示す量のラルテグラビル、ドルテグラビル、およびそれらのアナログを含むことを特徴とする化合物の組合せ。
  20. （ｉ）ソフォスブビルもしくはテノホビルまたはそれらのアナログ、ならびに（ｉｉ）ラルテグラナビル（ｒａｌｔｅｇｒａｎａｖｉｒ）およびドルテグラビル、ピブレンタスビル、オムビタスビル、およびダクラタスビル、またはそれらのアナログを含むことを特徴とする化合物の組合せ。
  21. レムデシビル、ＡＴ－５２７、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、リバビリン、アシクロビル、シドフォビル、ドコサノール、ファムシクロビル、ホスカルネット、ホミビルセン、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、ビダラビン、アマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、イミキモド、ラミブジン、テノホビル、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、インダルジ、アバカビル、ネビラビル、ネバビル、ネバビルロピナビル、ダクラタスビル、クロロキン、ケルセチン、バニプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、ファビピラビル、パリビズマブ、オムビタスビル、ベクラブビル、ダサブビル、ピブレンタスビル、ダクラタスビル、他のウイルス阻害薬、ＲＮＡ阻害薬、他のＲＮＡポリメラーゼ、他のＲＮＡ阻害薬、モノクローナルまたはポリクローナル抗体から選択される１種または複数の抗ウイルス性化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の化合物の組合せ。
  22. アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン（ｂｓ）、アンサマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、カルバセフェム、ロラカルベフ、カルバペネム、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン（ｂｓ）、オキサゾリジノン（ｂｓ）、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ピペラシリン、ペニシリンｇ、テモシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸塩、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンｂ、キノロン類／フルオロキノロン類、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド系（ｂｓ）、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ｔｍｐ－ｓｍｘ）、スルホンアミドクリソイジン（旧型）、テトラサイクリン（ｂｓ）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール（ｂｓ）、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール（ｂｓ）、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ｂｓ）、チニダゾール、トリメトプリム（ｂｓ）から選択される１種または複数の抗菌薬をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の化合物の組合せ。
  23. 治療上有効な量の１種または複数の免疫調節性化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の化合物の組合せ。
  24. １種または複数の免疫調節性化合物が、アルファ、ベータ、ガンマインターフェロンおよびそれらのペグ化形態、糖質コルチコイド、ならびにコルチコイドから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の化合物の組合せ。
  25. 請求項１～３のうちの一項で定義された抗ウイルス性化合物またはそれらのアナログ、または請求項４～１８のうちの一項で定義された抗ウイルス性医薬組成物、または請求項１９～２４のうちの一項で定義された化合物の組合せの使用において、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防的、治癒的、または緩和的治療のための、ならびにＣＯＶＩＤ－１９の患者またはコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された可能性がある個体の治療のための、抗ウイルス性医薬の製造のためであることを特徴とする、使用。
  26. コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成を阻害する抗ウイルス薬の製造のためであることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
  27. 薬物が、１～３，０００ｍｇ、好ましくは、１～５００ｍｇ、より好ましくは、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、または８００ｍｇの請求項１～５のうちの一項に記載の抗ウイルス性化合物を含有することを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
  28. 妊婦、高齢者、感染症のより進行性の徴候を有する個体、感染症のより進行性の神経学的徴候を有する個体、ＣＯＶＩＤ－１９の軽度から重度の症状を有する個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または他のコロナウイルスに感染した個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の可能性があるか、または曝露の危険性がある個体を対象とすることを特徴とする、経口的または全身的な、請求項２５～２７に記載の使用。
  29. コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したか、またはこのウイルスに曝露された可能性がある個体の予防的、治癒的（治療的）、または緩和的治療の方法であって、個体に、請求項１～３のうちの一項で定義された治療上有効な量の１種または複数の抗ウイルス性化合物、請求項４～１８のうちの一項で定義された抗ウイルス性医薬組成物、または請求項１９～２４のうちの一項で定義された化合物の組合せが投与されることを特徴とする、治療の方法。
  30. 抗ウイルス性化合物の投与が、経口的または全身的であることを特徴とする、請求項２９に記載の治療の方法。
  31. 経口投与が、シロップ剤、カプセル、錠剤、または丸薬を介することを特徴とする、請求項３０に記載の治療の方法。
  32. 全身投与が、静脈内、皮下、または筋肉内投与によることを特徴とする、請求項３０に記載の治療の方法。
  33. 個体に、約０．０１～約３，０００ｍｇ／キログラム体重／日、好ましくは、０．０３～６００ｍｇ、より好ましくは、０．０５～４００ｍｇ、理想的には、２５ｍｇである治療上有効な量の請求項１～３のうちの一項に記載の化合物が投与されることを特徴とする、請求項２９～３２のうちの一項に記載の治療の方法。
  34. 治療上有効な量が、０．０５～１００ｍｇ／キログラム体重／日の化合物であることを特徴とする、請求項３３に記載の治療の方法。
  35. 治療上有効な量が、０．０５～５０ｍｇ／キログラム体重／日の化合物であることを特徴とする、請求項３３に記載の治療の方法。
  36. 請求項１～３のうちの一項で定義された化合物の製造のための方法であって、以下のステップ：
    で示されるとおり、６－クロロプリンまたは６－クロロプリンリボシドを、還流条件下で、エタノールまたはイソプロパノールのようなアルコール系溶媒中、トリエチルアミンとして、適当な第三級塩基の存在下で、適切なアリールまたはアルキルアミンとカップリングすることを含むことを特徴とする、請求項１～３のうちの一項で定義された化合物の製造のための方法。
  37. 以下のステップ：
    （式中、（ａ）ＴｒＣｌ、ＤＣＭ、Ｐｙ；（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨＣＯＯＥｔ、トルエン、還流；（ｃ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ；（ｄ）フタルイミド、ＤＩＡＤ、ＰＰｈ３、ＴＨＦ；（ｅ）Ｈ４Ｎ２．Ｈ２Ｏ、ＭｅＯＨ、還流；（ｆ）６－クロロプリン、Ｅｔ３Ｎ、ＥｔＯＨ、還流；（ｇ）ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、還流である）を含むことを特徴とする、ＭＢ－９０７化合物の製造のための方法。
  38. 以下のステップ：
    （式中、（ａ）Ｍｅ２（ＯＭｅ）２、ＰＴＳＡ、アセトン、室温；（ｂ）フルフリルアミン、Ｅｔ３Ｎ、ＥｔＯＨ、還流；（ｃ）ｔ－ＢｕＭｇＣｌ、ＴＨＦ、５℃～室温；（ｄ）ＣＳＡ（触媒）、ＤＣＭ、（ＣＨ２ＯＨ）２、室温である）を含むことを特徴とする、ＭＢ－７１１化合物の製造のための方法。
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