JP2024512917A - 等温相補的ｄｎａ及びライブラリ調製の改善された方法 - Google Patents
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Abstract
ＲＮＡから二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製するための組成物及び方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、これらの方法は、ｃＤＮＡの等温調製を可能にする。いくつかの実施形態では、これらの方法は、ｃＤＮＡの中温性又は熱安定性調製を可能にする。単一の反応容器中でｃＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための組成物及び方法もまた、本明細書中に記載される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１６７，９０９号、及び２０２１年８月１７日に出願された出願第６３／２３４，１１４号の優先権の利益を請求し、これらの各々は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１６７，９０９号、及び２０２１年８月１７日に出願された出願第６３／２３４，１１４号の優先権の利益を請求し、これらの各々は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、「２０２２－０３－２５＿０１２４３－００２６－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたファイル（２０２２年３月２５日作成、６，１６０バイトのサイズ）として提供されている。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、「２０２２－０３－２５＿０１２４３－００２６－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたファイル（２０２２年３月２５日作成、６，１６０バイトのサイズ）として提供されている。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、二本鎖相補的ＤＮＡ（double-stranded complementary DNA、ｄｓ－ｃＤＮＡ）調製のための改善された組成物及び方法に関する。これらの組成物は、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製するための等温方法を可能にし得る。本開示は、ｄｓ－ｃＤＮＡ及びｄｓ－ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための組成物及び方法にも関する。
ＲＮＡは、その研究が細胞内の機能的生物学的プロセスの理解（すなわち、トランスクリプトーム又はトランスクリプトミクスの研究）及び調節エレメント（長い非コードＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）など）の理解を容易にするため、重要な生物学的分子である。ＲＮＡの分析はまた、感染性薬剤（例えば、ＲＮＡウイルス）の検出に有用であり得る。ＲＮＡの研究のための必要条件は、多くの場合、ＲＮＡからＤＮＡコピーへの変換である。なぜなら、ＤＮＡは、その化学的安定性を増強し、一般的な分子生物学ツール及び試薬を使用する操作に適するようにする特性を有するためである。更に、多くの型の配列決定ライブラリ調製のために、二本鎖ＤＮＡは、アダプターライゲーションに使用されるリガーゼ又はタグメンテーションによるアダプター付加に使用されるトランスポソームのために必要とされる。したがって、一本鎖ＲＮＡは、多くの場合、ライブラリ調製の前に二本鎖相補的ＤＮＡ（ｄｓ－ｃＤＮＡ）への変換を受けなければならず、これは、ＲＮＡワークフローにおけるターンアラウンド時間及びハンズオン時間を著しく増加させる。
更に、ＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡへの変換は、図１に示されるように、プログラム可能なサーマルサイクラでの協調的な温度調節を必要とする。従来法において、ＲＮＡからＤＮＡへの変換は、逆転写による第１の鎖のｃＤＮＡ合成のプロセスを介して行われ、ここで、ＲＮＡ分子は、逆転写酵素によって直接的にコピーされる。第２の鎖のｃＤＮＡは、元のＲＮＡ分子の直接置換によって形成される。ほとんどの実施形態では、このことは、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ Ｇｅｎｅ２５：２６３－２６９（１９８３）によって開発された手順と類似の手順を介して達成される。多くのライブラリ調製プロトコル（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリ調製）は、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎと同様の方法を使用して、アダプター付加に適した平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する。
Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎの手順は、１９８０年代に利用可能な方法を使用して更なる研究を可能にするために、クローニングベクターへの容易なライゲーションのための平滑末端を有する効率的な完全転写物長の二本鎖ｃＤＮＡのために設計された。しかしながら、多くの次世代配列決定（next generation sequencing、ＮＧＳ）ライブラリ調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリ調製など）の目標は異なっており、効率的な配列決定を可能にするために、ＲＮＡ分子の断片化された提示（単一の長いｃＤＮＡではない）が必要とされる。更に、タグメンテーション（以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（研究用途のみ、ＲＵＯ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）技術、及びＴｎ５トランスポソームを使用する関連製品など）などのより新しいライブラリ構築方法は、アダプター付加のために末端修復分子を必要としない。したがって、時間を節約し、ワークフローを単純化する新しいｄｓ－ｃＤＮＡ合成手順は、ＲＮＡライブラリ調製プロトコルにとって有益であろう。
したがって、ＲＮＡから、ライブラリ調製に適合する形態へのより迅速な変換は、非常に興味深い。Ｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１７：２８８６－２８９３（２０２０）による近年の刊行物は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド（約４０分の第１の鎖のｃＤＮＡ合成の産物）を、Ｔｎ５トランスポソームによってタグメンテーションすることができ、ＲＮＡ配列決定ライブラリへと迅速に変換することができるが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの使用が、より低いライブラリ収率をもたらす可能性があることを示唆している。
本明細書に記載される方法は、一本鎖ＲＮＡ試料から二本鎖ｃＤＮＡへの変換を促進する。この方法は、（１）ｃＤＮＡの第１の鎖を調製し、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を生成するための逆転写酵素、及び（２）このＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を「ニッキング」して、ＲＮＡ断片をｃＤＮＡの第２の鎖の合成を開始するためのプライマーとして使用することを可能にすることができる、ＲＮＡニッカーゼ（ＲＮＡｓｅ Ｈなど）を含む、酵素の混合物を含む組成物を用いて実施され得る。
これらの本発明の方法は、コンピュータ制御されたプログラム可能なサーマルサイクラの必要性を排除して、ハンズオン工程を減少させ、総ターンアラウンド時間を改善し、ＲＮＡ試料からのライブラリ調製の自動化を単純化し得る。更に、これらの単純化された方法は、等温ｃＤＮＡ調製を可能にしてもよく、酵素を含む中温性組成物及び熱安定性組成物が記載される。本明細書に記載されるいくつかの方法は、単一の温度で（すなわち、等温反応によって）行われる単一の１０分間の反応におけるｃＤＮＡ調製を可能にする。加えて、本明細書に記載される方法は、より短いインキュベーション時間及びより単純なワークフローでのＲＮＡ試料からのライブラリ調製を可能にする。
いくつかの場合では、ｃＤＮＡ調製の本発明の方法は、ランダムプライマー（すなわち、ランダマー）を使用し、ＰＣＲ様増幅の工程を省略して、欧州特許第１９２９０４５号などの他の方法で見られ得る配列特異的バイアスの導入を回避する。更に、ＲＮＡｓｅ Ｈなどの特定のＲＮＡニッカーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖をランダムにニッキングすることが知られており、したがって、ＲＮＡをニッキングする工程もまた、配列特異的バイアスを導入しない。
本発明のｄｓ－ｃＤＮＡ及びライブラリ調製方法の適用は、疾患監視及びＲＮＡ分子の迅速な定量的同定のための他のアッセイを含み、単純化されたワークフロー及び容易に自動化される手順が非常に所望される。例えば、目的のウイルス又は病原体についてメタゲノムＲＮＡを濃縮するなどの適用のためのワークフローは、この手順によって単純化することができ、病原体監視により適したものにする。
いくつかの場合では、ｃＤＮＡ調製の本発明の方法は、ランダムプライマー（すなわち、ランダマー）を使用し、ＰＣＲ様増幅の工程を省略して、欧州特許第１９２９０４５号などの他の方法で見られ得る配列特異的バイアスの導入を回避する。更に、ＲＮＡｓｅ Ｈなどの特定のＲＮＡニッカーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖をランダムにニッキングすることが知られており、したがって、ＲＮＡをニッキングする工程もまた、配列特異的バイアスを導入しない。
本発明のｄｓ－ｃＤＮＡ及びライブラリ調製方法の適用は、疾患監視及びＲＮＡ分子の迅速な定量的同定のための他のアッセイを含み、単純化されたワークフロー及び容易に自動化される手順が非常に所望される。例えば、目的のウイルス又は病原体についてメタゲノムＲＮＡを濃縮するなどの適用のためのワークフローは、この手順によって単純化することができ、病原体監視により適したものにする。
Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ Ｇｅｎｅ２５：２６３－２６９（１９８３）
Ｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１７：２８８６－２８９３（２０２０）
本説明によれば、二本鎖相補的ＤＮＡ（complementary DNA、ｃＤＮＡ）を調製するための組成物及び方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、これらの組成物及び方法は、試料中に含まれるＲＮＡからのｃＤＮＡの等温調製を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、組成物及び方法は、試料中に含まれるＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製することを可能にする。
実施形態１．等温反応によってＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための組成物であって
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、を含む、組成物。
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、を含む、組成物。
実施形態２．逆転写酵素の活性が、ＲＮＡニッカーゼの活性よりも大きい、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３．逆転写酵素及びＲＮＡニッカーゼが単一の酵素に含まれる、実施形態１又は実施形態２に記載の組成物。
実施形態４．逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を有する単一の酵素に含まれる、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５．単一の酵素が、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの間の競合を減少させる、実施形態４に記載の組成物。
実施形態６．ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７．ＤＮＡポリメラーゼが５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８．逆転写酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼであり、任意選択的に、逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、ＭＭＬＶ）逆転写酵素、レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９．ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０．ＲＮＡｓｅ ＨがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１１．ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１２．逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼが、中温性酵素である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１３．中温性酵素が３７℃～４９℃で活性を有する、実施形態１２に記載の組成物。
実施形態１４．中温性酵素が３７℃で活性を有する、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１５．中温性の逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６．中温性のＲＮＡニッカーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７．中温性のポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、実施形態１２～１６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８．逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性酵素である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９．熱安定性酵素が５０℃～７２℃で活性を有する、実施形態１８に記載の組成物。
実施形態２０．熱安定性酵素が５０℃で活性を有する、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１．熱安定性の逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアント、又はレトロトランスポゾンに由来する熱安定性逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２２．熱安定性のＲＮＡニッカーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡｓｅ Ｈである、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２３．熱安定性のＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１８～２２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２４．ＲＮＡが、二本鎖ｃＤＮＡを調製する前にプライマーに結合される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５．組成物が、ＤＴＴ、ＢＳＡ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＫＣｌ、及び／又はＭｇＣｌ２から選択される１つ以上の添加剤を更に含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６．組成物が、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌと比較して、より低い単位／μｌのＲＮＡニッカーゼを有する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２７．組成物が、ＲＮＡニッカーゼ阻害剤を更に含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２８．ＲＮＡニッカーゼ阻害剤が、ＲＮＡニッカーゼの活性を低下させる、実施形態２７に記載の組成物。
実施形態２９．組成物中のＲＮＡニッカーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌが重複する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３０．組成物中のＤＮＡポリメラーゼの活性が、組成物中のＲＮＡニッカーゼの活性よりも２倍～１００倍高い、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３１．組成物中の逆転写酵素の活性が、組成物中のＲＮＡニッカーゼの活性よりも１０倍～１，０００倍高い、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３２．組成物中の逆転写酵素活性が０．３２Ｕ／μｌ～４．８Ｕ／μｌである、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３３．組成物中のＤＮＡポリメラーゼ活性が０．０４Ｕ／μｌ～０．３７Ｕ／μｌである、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３４．組成物中のＲＮＡニッカーゼ活性が０．００４Ｕ／μｌ～０．０４Ｕ／μｌである、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３５．組成物中のＲＮＡニッカーゼ活性が０．０４Ｕ／μｌより大きい、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３６．組成物中のＲＮＡニッカーゼ活性が０．０５Ｕ／μｌ～０．３Ｕ／μｌである、実施形態３５に記載の組成物。
実施形態３７．二本鎖ｃＤＮＡを調製する方法であって、
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．試料を実施形態１～３６のいずれか１つに記載の組成物と合わせ、等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、を含む、方法。
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．試料を実施形態１～３６のいずれか１つに記載の組成物と合わせ、等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、を含む、方法。
実施形態３８．プライマーがランダマープライマーを含む、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．プライマーが、ＲＮＡに含まれる配列に特異的に結合するプライマーを含む、実施形態３７又は３８に記載の方法。
実施形態４０．プライマーがヘキサマープライマーを含む、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１．プライマーが、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む、実施形態３７～４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２．化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーが、プライマーによって結合されたＲＮＡを、ＲＮＡニッカーゼによる切断に対して耐性にする、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈであり、プライマーによって結合されたＲＮＡが、ＲＮＡｓｅ Ｈによる切断に耐性である、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４．化学修飾されたヌクレオチドが、メチルホスホネート残基を含む、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖を産生する、実施形態３７～４４に記載の方法。
実施形態４６．逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの鎖を含むＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．ＲＮＡｓｅ Ｈが、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖をニッキングし、ＲＮＡ断片を産生する、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ断片からプライミングすることによってＤＮＡの第２の鎖を伸長させる、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．ＲＮＡニッカーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼの５’－３’活性が、ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡオーバーハングを除去する、実施形態４７又は実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０．ＤＮＡポリメラーゼが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性が平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する、実施形態３７～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１．ｄＮＴＰが、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方によって使用される、実施形態３７～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２．等温反応が、３０℃～４９℃の温度である、実施形態３７～５１のいずれか１つの方法。
実施形態５３．等温反応が、３７℃の温度である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．等温反応が、５０℃～７２℃の温度である、実施形態３７～５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．等温反応が、５０℃の温度である、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６．ＲＮＡが、５０℃未満の温度で第１の鎖の合成を正常に阻害する二次構造を示す、実施形態５４又は実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．逆転写酵素によるｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度が、ＲＮＡニッカーゼによるＲＮＡのニッキング速度よりも大きい、実施形態３７～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．逆転写酵素の活性が、ＲＮＡニッカーゼの活性を超える、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．等温反応が、６０分以下、４５分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、又は１０分以下にわたってインキュベートされる、実施形態３７～５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．等温反応が、１５分間以下にわたってインキュベートされる、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１．少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、又は少なくとも６０分間のインキュベーションが、ライブラリ調製のための二本鎖ｃＤＮＡを与える、実施形態３７～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせる前に、ＲＮＡを含む試料を用いて、オフターゲットＲＮＡの枯渇又はｍＲＮＡの濃縮を行うことを更に含む、実施形態３７～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．オフターゲットＲＮＡがリボソームＲＮＡである、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．ｍＲＮＡの濃縮が、ポリＴプライマーを用いた増幅又は捕捉ビーズへのｍＲＮＡの結合を含む、実施形態６２又は実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．捕捉ビーズが、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面を含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための組成物であって、
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、
ｅ．トランスポソーム複合体であって、トランスポソーム複合体が
ｉ．トランスポザーゼ、
ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾン、
ｉｉｉ．トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン、を含む、トランスポソーム複合体と、を含む、組成物。
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、
ｅ．トランスポソーム複合体であって、トランスポソーム複合体が
ｉ．トランスポザーゼ、
ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾン、
ｉｉｉ．トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン、を含む、トランスポソーム複合体と、を含む、組成物。
実施形態６７．組成物がＭｇ２＋を更に含む、実施形態６６に記載の組成物。
実施形態６８．Ｍｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度が８ｍＭである、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態６９．ライブラリが等温反応によって調製される、実施形態６６～６８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７０．ＲＮＡが、ライブラリを調製する前にプライマーに結合される、実施形態６６～６９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７１．トランスポソーム複合体が、固体支持体に固定化されている、実施形態６６～７０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７２．固体支持体がビーズである、実施形態７１に記載の組成物。
実施形態７３．第１のトランスポゾンが親和性エレメントを含む、実施形態７１又は実施形態７２に記載の組成物。
実施形態７４．親和性エレメントが、第１のトランスポゾンの５’末端に結合されている、実施形態７３に記載の組成物。
実施形態７５．第１のトランスポゾンがリンカーを含む、実施形態７１又は７２に記載の組成物。
実施形態７６．リンカーが、第１のトランスポゾンの５’末端に結合された第１の末端と、親和性エレメントに結合された第２の末端とを有する、実施形態７５に記載の組成物。
実施形態７７．第２のトランスポゾンが親和性エレメントを含む、実施形態７１又は７２に記載の組成物。
実施形態７８．親和性エレメントが、第２のトランスポゾンの３’末端に結合されている、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態７９．第２のトランスポゾンがリンカーを含む、実施形態７１又は７２に記載の組成物。
実施形態８０．リンカーが、第２のトランスポゾンの３’末端に結合された第１の末端と、親和性エレメントに結合された第２の末端とを有する、実施形態７９に記載の組成物。
実施形態８１．親和性エレメントがビオチン又は二重ビオチンである、実施形態７３～７４、７６～７８、又は８０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８２．トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する、実施形態６６～８１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８３．第１のトランスポゾンが、１つ以上のアダプター配列を更に含む、実施形態６６～８２に記載の組成物。
実施形態８４．第１のトランスポゾンが、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む、実施形態８３に記載の組成物。
実施形態８５．トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、実施形態６６～８４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８６．Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、実施形態８５に記載の組成物。
実施形態８７．逆転写酵素の活性が、ＲＮＡニッカーゼの活性よりも大きい、実施形態６６～８６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８８．逆転写酵素及びＲＮＡニッカーゼが単一の酵素に含まれる、実施形態６６～８７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８９．逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を有する単一の酵素に含まれる、実施形態６６～８８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９０．単一の酵素が、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの間の競合を減少させる、実施形態８９に記載の組成物。
実施形態９１．ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、実施形態６６～９０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９２．ＤＮＡポリメラーゼが５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、実施形態６６～９１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９３．逆転写酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼであり、任意選択的に、逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素、レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、実施形態６６～９２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９４．ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、実施形態６６～９３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９５．ＤＮＡポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、実施形態６６～９４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９６．逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼが、中温性酵素である、実施形態６６～９５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９７．中温性酵素が３７℃～４９℃で活性を有する、実施形態９６に記載の組成物。
実施形態９８．中温性酵素が３７℃で活性を有する、実施形態９７に記載の組成物。
実施形態９９．中温性逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１００．中温性ＲＮＡニッカーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈである、実施形態９６～９９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０１．中温性ポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、実施形態９６～１００のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０２．逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性酵素である、実施形態６６～９５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０３．熱安定性酵素が５０℃～７２℃で活性を有する、実施形態１０２に記載の組成物。
実施形態１０４．熱安定性酵素が５０℃で活性を有する、実施形態１０３に記載の組成物。
実施形態１０５．熱安定性逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアント、又はレトロトランスポゾンに由来する熱安定性逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、実施形態１０２～１０４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０６．熱安定性ＲＮＡニッカーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡｓｅ Ｈである、実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０７．熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１０２～１０６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０８．（１）逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼが熱安定性酵素であり、かつ（２）Ｍｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的にＭｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的にＭｇ２＋濃度が８ｍＭである、実施形態１０２～１０７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０９．二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．試料を実施形態６６～１０８のいずれか１つの組成物と合わせ、（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製し、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．試料を実施形態６６～１０８のいずれか１つの組成物と合わせ、（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製し、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。
実施形態１１０．等温反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製と二本鎖ｃＤＮＡ断片の調製との間に、固相可逆的固定化精製を行わない、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１．プライマーを試料と合わせることと、試料を実施形態６６～１０８のいずれか１つの組成物と合わせることが、同じ工程で行われる、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
実施形態１１２．（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、単一の等温反応によって行われる、実施形態１０９～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが異なる温度で行われる、実施形態１０９～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、単一の反応容器中で行われる、実施形態１０９～１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、ＲＮＡを含む試料を、溶出液、プライマー、及び断片化ミックスと混合することを含む、実施形態１０９～１１４のいずれか１つの方法。
実施形態１１６．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、５５℃以上で行われる、実施形態１０９～１１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１７．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、６５℃で行われる、実施形態１０９～１１６に記載の方法。
実施形態１１８．プライマーがランダマープライマーを含む、実施形態１０９～１１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．プライマーが、ＲＮＡに含まれる配列に特異的に結合するプライマーを含む、実施形態１０９～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０．プライマーがヘキサマープライマーを含む、実施形態１０９～１１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１．プライマーが、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む、実施形態１０９～１２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２２．化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーが、プライマーによって結合されたＲＮＡを、ＲＮＡニッカーゼによる切断に対して耐性にする、実施形態１２１に記載の方法。
実施形態１２３．ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈであり、プライマーによって結合されたＲＮＡが、ＲＮＡｓｅ Ｈによる切断に耐性である、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４．化学修飾されたヌクレオチドが、メチルホスホネート残基を含む、実施形態１２１～１２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５．逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖を産生する、実施形態１０９～１２４に記載の方法。
実施形態１２６．逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの鎖を含むＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する、実施形態４５に記載の方法。
実施形態１２７．ＲＮＡｓｅ Ｈが、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖をニッキングし、ＲＮＡ断片を産生する、実施形態４６に記載の方法。
実施形態１２８．ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ断片からプライミングすることによってＤＮＡの第２の鎖を伸長させる、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１２９．ＲＮＡニッカーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼの５’－３’活性が、ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡオーバーハングを除去する、実施形態１２７又は実施形態１２８に記載の方法。
実施形態１３０．ＤＮＡポリメラーゼが、５’－３’及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性が平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する、実施形態１０９～１２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１．ｄＮＴＰが、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方によって使用される、実施形態１０９～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２．二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応が、３０℃～４９℃の温度である、実施形態１０９～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３．二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応が、３７℃以上の温度である、実施形態１３２に記載の方法。
実施形態１３４．二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応が、３７℃の温度である、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５．二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応が、５５℃の温度である、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３６．（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、３７℃での単一の等温反応によって行われる、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３７．二本鎖ｃＤＮＡを調製すること、及び／又は二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、３７℃超で行われる、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３８．二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、５５℃で行われる、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９．二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、３０分以下又は１５分以下で行われる、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０．二本鎖ｃＤＮＡを調製することが、３７℃で行われ、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、５５℃で行われる、実施形態１３８又は１３９に記載の方法。
実施形態１４１．本方法に使用される組成物のＭｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度が８ｍＭである、実施形態１０９～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２．逆転写酵素によるｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度が、ＲＮＡニッカーゼによるＲＮＡのニッキング速度よりも大きい、実施形態１０９～１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３．逆転写酵素の活性が、ＲＮＡニッカーゼの活性を超える、実施形態１０９～１４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４４．（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、６０分以下又は３０分以下の全インキュベーションで行われる、実施形態１０９～１４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４５．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせる前に、ＲＮＡを含む試料を用いて、オフターゲットＲＮＡの枯渇又はｍＲＮＡの濃縮を行うことを更に含む、実施形態１０９～１４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６．オフターゲットＲＮＡがリボソームＲＮＡである、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４７．ｍＲＮＡの濃縮が、ポリＴプライマーを用いた増幅又は捕捉ビーズへのｍＲＮＡの結合を含む、実施形態１４５又は１４６に記載の方法。
実施形態１４８．捕捉ビーズが、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面を含む、実施形態１４７に記載の方法。
実施形態１４９．二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、濃縮によって行われる、実施形態１０９～１４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５０．濃縮が、ハイブリッド捕捉を用いて行われる、実施形態１４９に記載の方法。
実施形態１５１．ハイブリッド捕捉が、標的特異的ビオチン化プローブを用いて行われる、実施形態１５０に記載の方法。
実施形態１５２．標的特異的ビオチン化プローブが、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する、実施形態１５１に記載の方法。
実施形態１５３．１つ以上の感染性疾患が、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５４．本方法が、二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅してアンプリコンを調製することを更に含む、実施形態１０９～１５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５５．増幅が、標的特異的プライマーを用いて行われる、実施形態１５４に記載の方法。
実施形態１５６．標的特異的プライマーが、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する、実施形態１５５に記載の方法。
実施形態１５７．１つ以上の感染性疾患が、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８．アンプリコンが、固相可逆的固定化精製に供される、実施形態１５４～１５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５９．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることから、アンプリコンの精製までの総反応時間が、２時間以下、２．５時間以下、又は３時間以下である、実施形態１５８に記載の方法。
実施形態１６０．第１のトランスポゾンが、モザイク末端配列を含む修飾トランスポゾン末端配列を含み、モザイク末端配列が、野生型モザイク末端配列と比較して１つ以上の変異を含み、変異が、
ａ．ウラシル、
ｂ．イノシン、
ｃ．リボース、
ｄ．８－オキソグアニン、
ｅ．チミングリコール、
ｆ．修飾プリン、又は
ｇ．修飾ピリミジンによる置換を含む、実施形態１０９～１５９のいずれか１つに記載の方法。
ａ．ウラシル、
ｂ．イノシン、
ｃ．リボース、
ｄ．８－オキソグアニン、
ｅ．チミングリコール、
ｆ．修飾プリン、又は
ｇ．修飾ピリミジンによる置換を含む、実施形態１０９～１５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６１．野生型モザイク末端配列が配列番号１を含み、更に、１つ以上の変異が、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における置換を含む、実施形態１６０に記載の方法。
実施形態１６２．
ａ．Ａ１６における置換が、Ａ１６Ｔ、Ａ１６Ｃ、Ａ１６Ｇ、Ａ１６Ｕ、Ａ１６イノシン、Ａ１６リボース、Ａ１６－８－オキソグアニン、Ａ１６チミングリコール、Ａ１６修飾プリン、若しくはＡ１６修飾ピリミジンであり、
ｂ．Ｃ１７における置換が、Ｃ１７Ｔ、Ｃ１７Ａ、Ｃ１７Ｇ、Ｃ１７Ｕ、Ｃ１７イノシン、Ｃ１７リボース、Ｃ１７－８－オキソグアニン、Ｃ１７チミングリコール、Ｃ１７修飾プリン、若しくはＣ１７修飾ピリミジンであり、
ｃ．Ａ１８における置換が、Ａ１８Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ａ１８Ｃ、Ａ１８Ｕ、Ａ１８イノシン、Ａ１８リボース、Ａ１８－８－オキソグアニン、Ａ１８チミングリコール、Ａ１８修飾プリン、若しくはＡ１８修飾ピリミジンであり、かつ／又は
ｄ．Ｇ１９における置換は、Ｇ１９Ｔ、Ｇ１９Ｃ、Ｇ１９Ａ、Ｇ１９Ｕ、Ｇ１９イノシン、Ｇ１９リボース、Ｇ１９－８－オキソグアニン、Ｇ１９チミングリコール、Ｇ１９修飾プリン、若しくはＧ１９修飾ピリミジンである、実施形態１６１に記載の方法。
ａ．Ａ１６における置換が、Ａ１６Ｔ、Ａ１６Ｃ、Ａ１６Ｇ、Ａ１６Ｕ、Ａ１６イノシン、Ａ１６リボース、Ａ１６－８－オキソグアニン、Ａ１６チミングリコール、Ａ１６修飾プリン、若しくはＡ１６修飾ピリミジンであり、
ｂ．Ｃ１７における置換が、Ｃ１７Ｔ、Ｃ１７Ａ、Ｃ１７Ｇ、Ｃ１７Ｕ、Ｃ１７イノシン、Ｃ１７リボース、Ｃ１７－８－オキソグアニン、Ｃ１７チミングリコール、Ｃ１７修飾プリン、若しくはＣ１７修飾ピリミジンであり、
ｃ．Ａ１８における置換が、Ａ１８Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ａ１８Ｃ、Ａ１８Ｕ、Ａ１８イノシン、Ａ１８リボース、Ａ１８－８－オキソグアニン、Ａ１８チミングリコール、Ａ１８修飾プリン、若しくはＡ１８修飾ピリミジンであり、かつ／又は
ｄ．Ｇ１９における置換は、Ｇ１９Ｔ、Ｇ１９Ｃ、Ｇ１９Ａ、Ｇ１９Ｕ、Ｇ１９イノシン、Ｇ１９リボース、Ｇ１９－８－オキソグアニン、Ｇ１９チミングリコール、Ｇ１９修飾プリン、若しくはＧ１９修飾ピリミジンである、実施形態１６１に記載の方法。
実施形態１６３．
ａ．二本鎖ｃＤＮＡ断片を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせ、モザイク末端配列内のウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで第１のトランスポゾン末端を切断して、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、
ｂ．断片の５’末端及び／又は３’末端にアダプターをライゲーションすることとを更に含む、実施形態１６０～１６２のいずれか１つに記載の方法。
ａ．二本鎖ｃＤＮＡ断片を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせ、モザイク末端配列内のウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで第１のトランスポゾン末端を切断して、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、
ｂ．断片の５’末端及び／又は３’末端にアダプターをライゲーションすることとを更に含む、実施形態１６０～１６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６４．修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６５．修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、実施形態１６３に記載の方法。
実施形態１６６．切断される第１のトランスポゾン末端の全て又は一部が、試料の残りから分配される、実施形態１６３～１６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６７．断片の３’末端において充填することと、ライゲーション前に、断片の３’末端をキナーゼでリン酸化することと、を更に含む、実施形態１６３～１６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６８．充填が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９．断片の３’末端に単一のＡオーバーハングを付加することを更に含む、実施形態１６８に記載の方法。
実施形態１７０．ポリメラーゼが単一のＡオーバーハングを付加する、実施形態１６９に記載の方法。
実施形態１７１．ポリメラーゼが、（ｉ）Ｔａｑ又は（ｉｉ）Ｋｌｅｎｏｗ断片、エキソ－である、実施形態１７０に記載の方法。
実施形態１７２．断片が、モザイク末端配列の０～３塩基を含む、実施形態１６３～１７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７３．アダプターをライゲーションした後に、断片を配列決定することを更に含む、実施形態１６３～１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７４．本方法が、配列決定の前に断片の増幅を必要としない、実施形態１７３に記載の方法。
実施形態１７５．配列決定の前に断片が増幅される、実施形態１７４に記載の方法。
実施形態１７６．修飾トランスポゾン末端配列がウラシルを含み、ＤＮＡグリコシラーゼと脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼとの組み合わせが、ウラシル特異的切除試薬（uracil-specific excision reagent、ＵＳＥＲ）である、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７７．ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物である、実施形態１７６に記載の方法。
実施形態１７８．修飾トランスポゾン末端配列がイノシンを含み、エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶである、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７９．修飾トランスポゾン末端配列がリボースを含み、エンドヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ ＨＩＩである、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８０．修飾トランスポゾン末端配列が８－オキソグアニンを含み、エンドヌクレアーゼがホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｏｒｍａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ＦＰＧ）又はオキソグアニングリコシラーゼ（ｏｘｏｇｕａｎｉｎｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ＯＧＧ）である、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８１．修飾トランスポゾン末端配列がチミングリコールを含み、ＤＮＡグリコシラーゼがエンドヌクレアーゼＥｎｄｏＩＩＩ（Ｎｔｈ）又はＥｎｄｏ ＶＩＩＩである、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８２．修飾トランスポゾン末端配列が修飾プリンを含み、ＤＮＡグリコシラーゼがヒト３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼであり、エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＩＩＩ又はＶＩＩＩである、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８３．修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、実施形態１８２に記載の方法。
実施形態１８４．修飾トランスポゾン末端配列が修飾ピリミジンを含み、
ａ．ＤＮＡグリコシラーゼが、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ｔｈｙｍｉｎｅ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ＴＤＧ）又は哺乳動物ＤＮＡグリコシラーゼ－メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質４（ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ－ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＢＤ４）であり、脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼが、エンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼＩＩＩ若しくはＶＩＩＩであるか、又は
ｂ．エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼＲＯＳ１（ＲＯＳ１）である、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
ａ．ＤＮＡグリコシラーゼが、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ｔｈｙｍｉｎｅ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ＴＤＧ）又は哺乳動物ＤＮＡグリコシラーゼ－メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質４（ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ－ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＢＤ４）であり、脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼが、エンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼＩＩＩ若しくはＶＩＩＩであるか、又は
ｂ．エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼＲＯＳ１（ＲＯＳ１）である、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８５．修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、実施形態１８４に記載の方法。
実施形態１８６．第１のトランスポゾンが、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、又は修飾ピリミジンから選択される１つより多い変異を含む修飾トランスポゾン末端配列を含み、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせが、酵素混合物である、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８７．修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１８８．修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１８９．第１のトランスポゾン末端を切断することが、アダプターをライゲーションするための付着末端を生成する、実施形態１７２～１８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９０．付着末端が、１塩基より長い、実施形態１８９に記載の方法。
実施形態１９１．アダプターが、二本鎖アダプターを含む、実施形態１６３～１９０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９２．アダプターが、断片の５’及び３’末端に付加される、実施形態１６３～１９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９３．断片の５’及び３’末端に付加されるアダプターが、異なっている、実施形態１９２に記載の方法。
実施形態１９４．アダプターが、ユニーク分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、配列決定関連配列、及びそれらの組み合わせを含む、実施形態１６３～１９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９５．アダプターがＵＭＩを含む、実施形態１６３～１９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９６．ＵＭＩを含むアダプターが、断片の３’及び５’末端の両方にライゲーションされる、実施形態１９５に記載の方法。
実施形態１９７．アダプターが、フォーク型アダプターである、実施形態１６３～１９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９８．ライゲーションが、ＤＮＡリガーゼを用いて行われる、実施形態１６３～１９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９９．二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製した後に、タグメンテーション停止緩衝液が添加される、実施形態１０９～１９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２００．調製された二本鎖ｃＤＮＡ断片が精製される、実施形態１０９～１９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０１．二本鎖ｃＤＮＡ断片が配列決定される、実施形態１０９～２００のいずれか１つに記載の方法。
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から理解されるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
配列の説明
以下の表は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを提供する。
以下の表は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを提供する。
Ｉ．等温反応によってＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための組成物
本明細書に記載されるように、特殊な酵素の混合物は、Ｔｎ５によるタグメンテーション（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ技術及びビーズ連結トランスポソーム）などのＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製技術に適した効率的なｄｓ－ｃＤＮＡ変換を達成することができる。この方法は、単一温度で１０分という短い単一工程で行うことができる。このような単一工程でのｃＤＮＡの調製は、１工程ｃＤＮＡ法（本明細書ではｃＤＮＡ調製の「本発明の方法」とも記載される）と称され得る。中温性（約３７℃）及び熱安定性（約５０℃）酵素を有する配合物が可能である。従来法に対して、より短い時間の利点を図１に示す（ここで、ＲＮＡをｄｓ－ｃＤＮＡに変換するプロセスは、従来モデルでの１１０分から本発明の方法での１５分に短縮される）。本発明の方法の潜在的な用途は、迅速な感染症の監視、並びに遺伝子型決定のための迅速なＲＮＡ及びＤＮＡ同時アッセイである。
本明細書に記載されるように、特殊な酵素の混合物は、Ｔｎ５によるタグメンテーション（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ技術及びビーズ連結トランスポソーム）などのＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製技術に適した効率的なｄｓ－ｃＤＮＡ変換を達成することができる。この方法は、単一温度で１０分という短い単一工程で行うことができる。このような単一工程でのｃＤＮＡの調製は、１工程ｃＤＮＡ法（本明細書ではｃＤＮＡ調製の「本発明の方法」とも記載される）と称され得る。中温性（約３７℃）及び熱安定性（約５０℃）酵素を有する配合物が可能である。従来法に対して、より短い時間の利点を図１に示す（ここで、ＲＮＡをｄｓ－ｃＤＮＡに変換するプロセスは、従来モデルでの１１０分から本発明の方法での１５分に短縮される）。本発明の方法の潜在的な用途は、迅速な感染症の監視、並びに遺伝子型決定のための迅速なＲＮＡ及びＤＮＡ同時アッセイである。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ調製の方法は、核酸内容物を増幅せず、代わりにＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡに含まれる所与の配列から複数のアンプリコンを調製するためのＰＣＲ増幅又はＰＣＲ様プロセスの工程を含まない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖ｃＤＮＡを調製する前にプライマーに結合される。
いくつかの実施形態では、組成物は、等温反応によるｄｓ－ｃＤＮＡの調製のためのものである。本明細書で使用される場合、「等温反応」は、実質的に一定の温度で、すなわち、酵素反応がベースライン温度から１５％を超えて起こる反応温度を変化させることなく行われる反応を指す。したがって、等温反応は、一定温度で、又は１５％以下の温度からのベースラインからの変化を伴って行われる。いくつかの更なる実施形態では、反応は、更により少ない温度変動を有し、１０％以下、又は５％以下のベースラインからの変化を有する温度で行われ得る。いくつかの実施形態では、反応は、温度変化なく行われる。いくつかの実施形態では、反応は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要とせずに等温的に行うことができる。サーマルサイクラにおいてコンピュータ制御された調節を必要とせずに等温的に行うことができる反応のいくつかの場合では、温度は、３７℃又は５０℃であってもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、組成物が、ＲＮＡを含む試料に添加される前に、ＲＮＡに結合されている。いくつかの実施形態では、反応は、中温性反応又は熱安定性反応である。
いくつかの実施形態では、等温反応によってＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための組成物は、（ｉ）逆転写酵素と、（ｉｉ）ＲＮＡニッカーゼと、（ｉｉｉ）鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｖ）ｄＮＴＰと、を含む。かかる組成物は、以下及び図３に記載されるようなｄｓ－ｃＤＮＡの方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、組成物中の酵素の配合物は、タグメンテーション（例えば、ビーズ連結トランスポソーム（bead-linked transposome、ＢＬＴ）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（研究用途のみ、ＲＵＯ）技術製品に適したｄｓ－ｃＤＮＡを生成するための協調的な作用を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡニッカーゼ阻害剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｅ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡを含む試料に組成物を添加する前に、ＲＮＡに結合しているプライマーに結合することができる。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼは、ＲＮＡをニッキングすることができ、これは「ＲＮＡニッカーゼ」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼは、リボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、リボヌクレアーゼは、ＲＮＡｓｅ Ｈである。したがって、ＲＮＡｓｅが代表的なＲＮＡニッカーゼであるため、ＲＮＡニッカーゼは、「ＲＮＡｓｅ－Ｈ様活性を有する酵素」と称され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼは、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素に含まれる。多くの市販の逆転写酵素は、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を欠くように操作されているが（これにより、ｃＤＮＡ合成収率を改善し得るため）、多くの操作されていない逆転写酵素は、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに含まれるＲＮＡをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼは、ｃＤＮＡの第１の鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの鎖をニッキングすることができる。例えば、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡをおよそ７～２１塩基ごとに消化することが報告されている（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１：１９４３－１９５５；Ｃｈａｍｐｏｕｘ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＦＥＢＳ Ｊ．２００９，２７６：１５０６－１５１６）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼによって生成されたＲＮＡ断片を使用して、ｃＤＮＡの第１の鎖からｃＤＮＡの第２の鎖をプライミングすることができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖をニッキングすることができ、次いで、ＤＮＡポリメラーゼは、ニッキングされたＲＮＡ断片の３’ＯＨ末端をプライマーとして使用して、第２のｃＤＮＡ鎖の合成を開始し得る。このようなプロセスは、ＲＮＡ断片が３’リン酸を有し、ポリメラーゼがこのような末端を使用して第２のｃＤＮＡ鎖の合成をプライミングすることができないので、他の方法で調製された分解又は断片化されたＲＮＡを用いて実施することができない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼはまた、ｃＤＮＡの第２の鎖の生成後にＲＮＡプライマー及び３’オーバーハングを除去することもできる。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素の活性は、ＲＮＡニッカーゼの活性よりも大きい。いくつかの実施形態では、逆転写酵素によるｃＤＮＡの第１の鎖の生成は、ＲＮＡニッカーゼによるＲＮＡのニッキングの速度よりも速い。このようにして、ＲＮＡ鋳型をニッキングする前に、ｃＤＮＡの第１の鎖を生成することができる。いくつかの実施形態では、逆転写酵素及びＲＮＡニッカーゼが単一の酵素に含まれる。いくつかの実施形態では、逆転写酵素及びＲＮＡニッカーゼを含む単一の酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase、ＡＭＶ ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ逆転写酵素）、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である。あるいは、いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼ活性を有さないか、又はＲＮＡニッカーゼ活性が大幅に低下したＭＭＬＶを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を有する単一の酵素に含まれる。いくつかの実施形態では、この単一の酵素は、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの間の競合を減少させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を含む単一の酵素は、逆転写酵素によるＤＮＡポリメラーゼ結合の立体的阻害を排除する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、第２の鎖のｃＤＮＡ合成を媒介する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鎖を破壊する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、生成されたｃＤＮＡの第１の鎖を置換することができる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、その５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によってＲＮＡを除去することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、その５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性及び／又は３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性によって平滑末端ｄｓ－ｃＤＮＡを産生することができる。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼである。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼである任意のこのような逆転写酵素が使用されてもよく、当業者は、広範な種々のこのような酵素を知っている。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素、又はレトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））、制限されたＲＮＡｓｅ Ｈ活性及び増加した熱安定性を有する組換えＭＭＬＶ逆転写酵素である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼはＲＮＡｓｅ Ｈである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ Ｈは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、組成物は、酵素及びｄＮＴＰに加えて１つ以上の添加剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＫＣｌ、及び／又はＭｇＣｌ２から選択される１つ以上の添加剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＴＴ及びＢＳＡを含む。当業者は、このような添加剤が種々の酵素組成物の機能を改善してもよく、異なる添加剤の分析が通常のアッセイ開発に含まれることを十分に承知している。したがって、代表的な添加剤のこのリストは、単に例としての役割を果たし、当業者は、そのような添加剤を除外又は置換することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、等温中温性反応又は等温熱安定性反応のためのものである。
Ａ．中温性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物
いくつかの実施形態では、組成物は、等温中温性反応によってｄｓ－ｃＤＮＡを調製するためのものであってもよい。本明細書で使用される場合、中温性反応は、３７℃～４９℃で行われる反応を指す。いくつかの実施形態では、中温性反応は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要とせずに等温的に３７℃で行うことができる。図４～図１０のデータは、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）における中温性ｄｓ－ＤＮＡ調製のための組成物を使用した結果を示す。
いくつかの実施形態では、組成物は、等温中温性反応によってｄｓ－ｃＤＮＡを調製するためのものであってもよい。本明細書で使用される場合、中温性反応は、３７℃～４９℃で行われる反応を指す。いくつかの実施形態では、中温性反応は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要とせずに等温的に３７℃で行うことができる。図４～図１０のデータは、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）における中温性ｄｓ－ＤＮＡ調製のための組成物を使用した結果を示す。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼは、中温性酵素である。いくつかの実施形態では、中温性酵素は、３７℃～４９℃で活性を有する。いくつかの実施形態では、中温性酵素は、３７℃で活性を有する。
いくつかの実施形態では、中温性逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、中温性ＲＮＡニッカーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである。いくつかの実施形態では、中温性ポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである。
表１は、中温性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物中に含まれる代表的な酵素を提供する。
Ｂ．熱安定性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物
いくつかの実施形態では、組成物は、等温熱安定性反応によってｄｓ－ｃＤＮＡを調製するためのものであってもよい。本明細書で使用される場合、熱安定性反応は、５０℃以上で行われる反応を指す。いくつかの実施形態では、熱安定性反応は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要とせずに等温的に５０℃以上で行うことができる。図１１～図１２Ｂのデータは、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）における熱安定性ｄｓ－ＤＮＡ調製のための組成物を使用した結果を示す。
いくつかの実施形態では、組成物は、等温熱安定性反応によってｄｓ－ｃＤＮＡを調製するためのものであってもよい。本明細書で使用される場合、熱安定性反応は、５０℃以上で行われる反応を指す。いくつかの実施形態では、熱安定性反応は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要とせずに等温的に５０℃以上で行うことができる。図１１～図１２Ｂのデータは、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）における熱安定性ｄｓ－ＤＮＡ調製のための組成物を使用した結果を示す。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性酵素である。いくつかの実施形態では、熱安定性酵素は、５０℃～７２℃で活性を有する。いくつかの実施形態では、熱安定性酵素は、５０℃で活性を有する。いくつかの実施形態では、熱安定性逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアント、又はレトロトランスポゾンに由来する熱安定性逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアントは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）である。いくつかの実施形態では、熱安定性ＲＮＡニッカーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡｓｅ Ｈである。
いくつかの実施形態では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、中温性組成物由来のＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼで置換される。いくつかの実施形態では、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ３．０ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
表２は、熱安定性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物中に含まれる代表的な酵素を提供する。
Ｃ．組成物中の酵素単位のバランス
本発明の組成物は、酵素活性のバランスを用いて単一の等温反応における二本鎖ｃＤＮＡ調製を改善する。例えば、ＲＮａｓｅの活性が組成物中の他の酵素と比較して相対的に高い場合、ＲＮＡ鋳型（元の試料由来）は、十分な量のｃＤＮＡの第１の鎖が調製される前に分解される。このようなシナリオでは、ｃＤＮＡはほとんど産生されない。
本発明の組成物は、酵素活性のバランスを用いて単一の等温反応における二本鎖ｃＤＮＡ調製を改善する。例えば、ＲＮａｓｅの活性が組成物中の他の酵素と比較して相対的に高い場合、ＲＮＡ鋳型（元の試料由来）は、十分な量のｃＤＮＡの第１の鎖が調製される前に分解される。このようなシナリオでは、ｃＤＮＡはほとんど産生されない。
１工程のｃＤＮＡ調製（すなわち、本発明の方法）のための酵素活性の適切なバランスを有する組成物は、「マスターミックス」と呼ばれ得る。
したがって、酵素活性の適切なバランスを有する組成物は、二本鎖ｃＤＮＡ調製の収率を改善する。
市販の酵素の単位範囲は、当業者に周知であり、供給業者のウェブサイト又は市販の酵素とともに提供される技術文書から容易にレビューすることができる。表３は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）からの特定の酵素及びそれらの特徴に関する情報を、単位定義とともに提供する。本発明の方法は、これらの特定の酵素に限定されないが、この表は、市販の代表的な酵素（ＮＥＢから市販されている酵素について記載されているものなど）の周知の特徴に関する情報を提供するのに役立つ。当業者は、本組成物において使用され得る広範囲の異なる酵素を認識しており、本明細書に記載される方法を実施するための所望の条件に基づいて酵素を選択することができる。表３では、ＲＮＡｓｅ Ｈは、ＲＮＡニッカーゼを表す。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼの正しいバランスは、単一の等温反応において本明細書に記載される組成物を使用したＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの調製を可能にする。
いくつかの実施形態では、組成物は、逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌと比較して、より低い単位／μｌのＲＮＡニッカーゼ（ＲＮＡｓｅ Ｈなど）を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＲＮＡニッカーゼの活性を低下させるように機能するＲＮＡニッカーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｅ阻害剤である。
いくつかの実施形態では、組成物は、外因性ＲＮＡｓｅによる汚染を制限するように機能するＲＮＡｓｅ阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ阻害剤は、ＲＮＡニッカーゼとして機能しない一般的な実験室汚染であるＲＮＡｓｅ Ａを阻害するように機能する。
いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡニッカーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌは、ＤＮＡポリメラーゼと重複する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡニッカーゼの活性より２倍～１００倍高い活性を有する。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素の単位／μｌは、ＲＮＡニッカーゼの単位／μｌよりも１０倍～１，０００倍高い。
いくつかの実施形態では、組成物中の逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌは重複する。いくつかの実施形態では、組成物中の逆転写酵素の単位／μｌは、ＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌよりも高い。
いくつかの実施形態では、組成物中の逆転写酵素活性は、０．３２Ｕ／μｌ～４．８Ｕ／μｌである。いくつかの実施形態では、組成物中のＤＮＡポリメラーゼ活性は、０．０４Ｕ／μｌ～０．３７Ｕ／μｌである。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡニッカーゼ活性は、０．００４Ｕ／μｌ～０．０４Ｕ／μｌである。いくつかの実施形態では、このＲＮＡニッカーゼは、ＲＮＡｓｅ Ｈである。
いくつかの実施形態では、熱安定性組成物中のＲＮＡニッカーゼ活性は、中温性組成物のＲＮＡニッカーゼ活性よりも相対的に高い。いくつかの実施形態では、熱安定性組成物中のＲＮＡニッカーゼの活性は、０．０４Ｕ／μｌより大きい。いくつかの実施形態では、熱安定性組成物中のＲＮＡニッカーゼの活性は、０．０５Ｕ／μｌ～０．３Ｕ／μｌである。
ＩＩ．ＲＮＡからライブラリを調製するための組成物
本明細書中に記載されるように、特殊な酵素の混合物を使用して、試料中のＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、単一の反応容器中でｃＤＮＡ断片のライブラリの調製を可能にする。いくつかの実施形態では、これらの断片は、配列決定のために使用され得る。
本明細書中に記載されるように、特殊な酵素の混合物を使用して、試料中のＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、単一の反応容器中でｃＤＮＡ断片のライブラリの調製を可能にする。いくつかの実施形態では、これらの断片は、配列決定のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製のための（ｃＤＮＡ及びライブラリ調製の組み合わせのための）組成物は、ＢＬＴと一緒になったｃＤＮＡ調製物「マスターミックス」であり得る。
いくつかの実施形態では、ライブラリは、等温反応によって調製される。いくつかの実施形態では、単一の温度が、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための反応及びｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための反応に使用される。したがって、本明細書中に記載されるｃＤＮＡを調製するために使用される任意の組成物はまた、トランスポソーム複合体が組成物中に含まれる限り、ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ライブラリを調製する前にプライマーに結合される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための組成物は、逆転写酵素と、ＲＮＡニッカーゼと、鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、トランスポソーム複合体と、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、第１及び第２の鎖のｃＤＮＡ調製を可能にし、続いてこの二本鎖ＤＮＡの断片化を可能にする。いくつかの実施形態では、組成物は、中温性ｃＤＮＡ合成のための酵素を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、熱安定性ｃＤＮＡ合成のための酵素を含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリを調製するための組成物は、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための組成物について記載された構成要素を含み、トランスポソーム複合体を更に含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製することによって生成される二本鎖ｃＤＮＡの断片の生成を可能にする。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、組成物の構成要素又は反応容器の変更を必要とすることなく、ｃＤＮＡがＲＮＡから調製される際にトランスポソーム複合体によって断片化され得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、本組成物を使用してｃＤＮＡの断片が調製される前に精製される必要はない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡのライブラリを調製するための組成物は、マグネシウムを含む。マグネシウムは、トランスポザーゼ活性を促進することが知られている（Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２４：２０３３－２０４０（２０１４）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、組成物のＭｇ２＋濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物のＭｇ２＋濃度は、５ｍＭ～２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物のＭｇ２＋濃度は、８ｍＭである。
Ａ．トランスポソーム複合体
トランスポゾンベースの技術は、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）トランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列でタグ付けされた断片化核酸分子の集団を生成する。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のタグ（アダプター配列など）で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を含む。したがって、タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
トランスポゾンベースの技術は、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）トランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列でタグ付けされた断片化核酸分子の集団を生成する。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のタグ（アダプター配列など）で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を含む。したがって、タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載される核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素、例えば、インテグラーゼ）、及び酵素に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾンエレメント、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに結合されたアダプター配列が含まれ得る。二本鎖トランスポゾン末端配列のうちの一本鎖は、標的核酸の一本鎖に転移され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は、転移されない（すなわち、非転移トランスポゾン配列）。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列（例えば、プライマー配列）を含み得る。
「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのような系では、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの側面では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転写され、切断事象が生じる。例示的な転位手順及び系は、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。
「トランスポザーゼ」は、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつ二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を意味する。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。
本明細書に提供される特定の実施形態で使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ、Ｒ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙ１、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ、Ｔｃ１、Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｔｎ３、細菌挿入配列、レトロウイルス、及び酵母のレトロトランスポゾンが挙げられる（又はそれによってコードされる）。より多くの例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の操作されたバージョンが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、トランスポザーゼの組み合わせを含み、単一のトランスポザーゼのみを含むのではない。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ７、ＭｕＡ、若しくはＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉトランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する５４、５６、３７２、２１２、２１４、２５１、及び３３８位での変異を有する、高活性Ｔｎ５である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対して、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｋ２１２Ｒ、Ｐ２１４Ｒ、Ｇ２５１Ｒ、及びＡ３３８Ｖの変異を有する高活性Ｔｎ５である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対するアミノ酸５４、５６、及び３７２における変異を含む高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質であり、任意選択的に、融合タンパク質は伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型トランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼの２つの分子のダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、同じ型の第１及び第２のトランスポゾンに結合している（例えば、各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は同じであり、「ホモダイマー」を形成する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を採用する。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポゾンは同じである。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、第１の集団は、各モノマーにおいて第１のアダプター配列を有し、第２の集団は、各モノマー中に異なるアダプター配列を有する。
「トランスポゾン末端」という用語は、インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖核酸ＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能的複合体を形成することができる。非限定的な例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に記載されるように、トランスポゾン末端は、１９－ｂｐの外側末端（「outer end、ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「inner end、ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「mosaic end、ＭＥ」）トランスポゾン末端、又はＲ１及びＲ２トランスポゾン末端を含み得る。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能的複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示全体を通して使用されるが、任意の好適な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることを理解すべきである。
同様に、「転移鎖」という用語は、両方のトランスポゾン末端の転移部分を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、両方の「トランスポゾン末端」の非転移部分を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移されない。
いくつかの実施形態では、転移鎖及び非転移鎖は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、転移及び非転移鎖配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に、例えば、ヘアピン構成で提供される。したがって、非転移鎖の遊離末端は、転位反応によって標的ＤＮＡに直接的には結合されないが、非転移鎖は、ヘアピン構造のループによって転移鎖に連結されているため、非転移鎖は、ＤＮＡ断片に間接的に付着することになる。トランスポソーム構造並びにトランスポソームを調製及び使用する方法の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に見出すことができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、固有の分子識別子（ＵＭＩ）又はインデックス配列を組み込むように設計される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、修飾モザイク末端配列を含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製のための組成物は、ライブラリ収量を増加させるために最適化される。いくつかの実施形態では、組成物は、熱安定性酵素を含むことによって収率を増加させ、その結果、３７℃を超えるインキュベーション、例えば５５℃でのインキュベーションを行って、タグメンテーション収率を増加させることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、タグメンテーション収率を増加させるために８ｍＭ以上のＭｇ２＋を含む。いくつかの実施形態では、（１）逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性酵素であり、かつ（２）Ｍｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的にＭｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的にＭｇ２＋濃度が８ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物は、熱安定性酵素と、８ｍＭ以上のＭｇ２＋と、を含む。
Ｂ．ＵＭＩ又はインデックス配列を組み込むためのトランスポソーム
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製するときに断片に組み込まれるＵＭＩ又はインデックス配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製するときに断片に組み込まれるＵＭＩ又はインデックス配列を更に含む。
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、非ランダム配列を含む。いくつかの実施形態では、非ランダムＵＭＩ（nonrandom UMI、ｎｒＵＭＩ）は、特定の実験又は適用のために事前定義される。ある特定の実施形態では、規則を使用して、セットの配列を生成するか、又はセットから試料を選択してｎｒＵＭＩを得る。例えば、セットの配列は、配列が特定のパターンを有するように生成され得る。いくつかの実施形態では、各配列は、特定の数（例えば、２、３、又は４）のヌクレオチドだけ、セット中の他の全ての配列と異なる。すなわち、ｎｒＵＭＩ配列は、特定の数より少ないヌクレオチドを置き換えることによって、任意の他の利用可能なｎｒＵＭＩ配列に変換され得ない。いくつかの実装形態では、配列決定プロセスで使用されるＵＭＩのセットは、特定の配列長を与えられた全ての可能なＵＭＩよりも少ないＵＭＩを含む。例えば、６個のヌクレオチドを有するｎｒＵＭＩのセットは、合計４Ａ６＝４０９６個の可能な異なる配列の代わりに、合計９６個の異なる配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、１２０個の非ランダム配列を含む。
ｎｒＵＭＩが全ての可能な異なる配列よりも少ない配列を有するセットから選択されるいくつかの実施において、ｎｒＵＭＩの数は、ソースＤＮＡ分子の数よりも少なく、場合によっては著しく少ない。このような実施では、ｎｒＵＭＩ情報を、仮想ＵＭＩ、参照配列上のリード位置、及び／又はリードの配列情報などの他の情報と組み合わせて、同じソースＤＮＡ分子に由来する配列リードを同定することができる。
いくつかの実施形態では、ｒＵＭＩのライブラリは、１つ以上の配列長を与えられた全ての可能な異なるオリゴヌクレオチド配列からなるＵＭＩのセットから、置き換えあり又はなしで、ランダム試料として選択されるランダムＵＭＩ（ｒａｎｄｏｍ ＵＭＩ、ｒＵＭＩ）を含み得る。例えば、ＵＭＩのセット中の各ＵＭＩがｎ個のヌクレオチドを有する場合、セットは、互いに異なる配列を有する４ｎ個のＵＭＩを含む。４Ａｎ個のＵＭＩから選択されたランダム試料は、ｒＵＭＩを構成する。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩのライブラリは、擬似ランダム又は部分的にランダムであり、ｎｒＵＭＩとｒＵＭＩとの混合物を含み得る。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、各ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列を表す核酸の配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に位置してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、当該核酸のタグメンテーション中又はその後に、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを使用して、標的二本鎖核酸に付加される。多くの実施形態では、ＵＭＩは、ライブラリ増幅工程の前に標的二本鎖核酸に付加される。
いくつかの実施形態では、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２４５８６）からのＵＭＩ試薬が、本開示に従って利用され得る。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリ中の二本鎖核酸分子はそれぞれ、１つの固有のＵＭＩ配列、又は単一のＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡのいずれかの側に位置してもよい。いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリは、二重鎖ＵＭＩを含み、このことは、単一のＵＭＩの使用と比較して検出誤差範囲を低下させる可能性がある。二重鎖ＵＭＩは、当業者が、配列決定反応において生じ得るエラーにもかかわらず、プラス鎖をそのマイナス鎖と対合させることを可能にする。このような配列決定ミスマッチは、配列決定の間に同定され、核酸断片の配列は、ミスマッチを有するにもかかわらず、依然として正確に再構成され得る。いくつかの実施形態では、二重鎖ＵＭＩを含むＵＭＩライブラリを作製する方法は、フォーク型アダプターを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、ＢＬＴフォークアダプターである。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩライブラリ中の各二本鎖核酸断片は、２つ、３つ、又は４つのＵＭＩ配列を含む。ＵＭＩ配列は、互いに相補的な配列を有してもよく、又はそれぞれ異なる配列を有してもよい。
いくつかの実施形態では、アダプター配列又は他のヌクレオチド配列は、各ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの５’に位置する。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列を表す核酸の配列は、ＵＭＩと挿入ＤＮＡとの間に位置してもよい。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、アダプター配列とトランスポゾン末端配列との間に位置する。
いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖、第２の鎖、又は両方の鎖上にあってよい。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、第１の鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＵＭＩの第１のコピーは、二本鎖標的核酸断片の第１の鎖上にあり、ＵＭＩの第２のコピーは、二本鎖標的核酸断片の第２の鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１のＵＭＩは第１の鎖上にあり、第２のＵＭＩは第２の鎖上にある。
１．インラインＵＭＩ及びインデックス配列
ＵＭＩは、二本鎖核酸分子上のどこに位置してもよい。多くの実施形態では、二本鎖核酸分子上のＵＭＩの位置は様々である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡに直接隣接して位置し、すなわち、ＵＭＩは、「インラインＵＭＩ」である。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの５’末端に隣接する。
ＵＭＩは、二本鎖核酸分子上のどこに位置してもよい。多くの実施形態では、二本鎖核酸分子上のＵＭＩの位置は様々である。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは、挿入ＤＮＡに直接隣接して位置し、すなわち、ＵＭＩは、「インラインＵＭＩ」である。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩは、挿入ＤＮＡの５’末端に隣接する。
ＵＭＩは、二本鎖核酸中のＰＣＲ複製物の除去及び低頻度バリアントの検出に有用であるが、ＵＤＩは、ライブラリ配列決定及び逆多重化におけるインデックスホッピングに起因する試料の不正確なアサインメントを軽減するのに有用である。ＵＤＩは、両方の末端がＵＤＩを含有するように、標的核酸の末端に付加される固有のｉ５及びｉ７インデックス配列である。ＵＤＩは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムなどのパターン化されたフローセルとともに使用される（例えば、国際公開第２０１８／２０４４２３号、同第２０１８／２０８６９９号、同第２０１／９０５５７１５号、及び同第２０１６／１７６０９１号参照、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。当業者は、インラインＵＭＩが、ＵＭＩライブラリと、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ（商標）及びＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ワークフローにおける試料多重化ＰＣＲ及び配列決定化学レシピなどのＵＤＩを利用する標準的な下流のライブラリ調製との適合性を可能にすることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、インラインＵＭＩとともに使用される配列決定方法は、カスタムプライマー又はカスタムリードを必要としない。
いくつかの実施形態では、標準的な配列決定方法を使用して、インラインＵＭＩを用いてＵＭＩライブラリを配列決定する。これらの実施形態では、ＵＭＩは、挿入核酸の３’末端に直接隣接する。したがって、各ＵＭＩ及び挿入核酸配列は、それらの間の追加の配列を配列決定する必要なく、標準的な配列決定プライマーを使用して捕捉される。
いくつかの実施形態では、「インラインＵＭＩ」は、挿入ＤＮＡとアダプター配列との間に位置する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、第２のアダプター配列である。
Ｃ．モザイク末端配列中に変異を有する修飾トランスポゾン末端を組み込むためのトランスポソーム
米国特許出願第６３／２２４，２０１号、同第６３／１６７，１５０号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２２／２２１６７に開示されるものを含む、モザイク末端配列を含む修飾トランスポゾン末端配列が本明細書に記載され、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、これらの修飾トランスポゾン末端配列は、転移後にモザイク末端配列の切断及び除去を可能にするモザイク末端配列を含む。転移のための重要な要件は、Ｔｎ５によって特異的に認識され、かつその転移活性に必要とされる「モザイク末端」（ＭＥ）である。Ｔｎ５は、変異に対して非常に不耐性であることが示されている「外側末端」（ＯＥ）及び「内側末端」（ＩＥ）配列を天然に認識し（表４に示されるように）、大部分の変異は、活性の低下を引き起こす（Ｊ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８５（７）：２２２４－２８（１９８８）を参照されたい）。後の研究は、「モザイク末端」と呼ばれるＩＥ及びＯＥに由来するキメラ配列（表４）が、変異体Ｔｎ５酵素とともに、天然系と比較して転位活性をおよそ１００倍増加させることを示した（Ｍａｇｇｉｅ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７６（５）：９１３－２５（１９９８）を参照されたい）。この高活性の系は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（ＲＵＯ）製品において使用される。ＤＮＡ基質との複合体中のＴｎ５の結晶構造は、１９塩基対のうちの１３塩基対が核酸塩基特異的結晶接触を有することを示している（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９ ５４７６：７７－８５（２０００）を参照されたい）が、他の塩基が、触媒作用においてある役割を果たすことが示されている（Ｍｉｎｄｙ Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ３２２（５）：９７１－８２（２００２）を参照されたい）。典型的には、Ｔｎ５の活性は、インビボレポーター系によって評価されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：９１３－９２５（１９９８）に記載されるようなパピレーションアッセイ）。
米国特許出願第６３／２２４，２０１号、同第６３／１６７，１５０号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２２／２２１６７に開示されるものを含む、モザイク末端配列を含む修飾トランスポゾン末端配列が本明細書に記載され、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、これらの修飾トランスポゾン末端配列は、転移後にモザイク末端配列の切断及び除去を可能にするモザイク末端配列を含む。転移のための重要な要件は、Ｔｎ５によって特異的に認識され、かつその転移活性に必要とされる「モザイク末端」（ＭＥ）である。Ｔｎ５は、変異に対して非常に不耐性であることが示されている「外側末端」（ＯＥ）及び「内側末端」（ＩＥ）配列を天然に認識し（表４に示されるように）、大部分の変異は、活性の低下を引き起こす（Ｊ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８５（７）：２２２４－２８（１９８８）を参照されたい）。後の研究は、「モザイク末端」と呼ばれるＩＥ及びＯＥに由来するキメラ配列（表４）が、変異体Ｔｎ５酵素とともに、天然系と比較して転位活性をおよそ１００倍増加させることを示した（Ｍａｇｇｉｅ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７６（５）：９１３－２５（１９９８）を参照されたい）。この高活性の系は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ（ＲＵＯ）製品において使用される。ＤＮＡ基質との複合体中のＴｎ５の結晶構造は、１９塩基対のうちの１３塩基対が核酸塩基特異的結晶接触を有することを示している（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９ ５４７６：７７－８５（２０００）を参照されたい）が、他の塩基が、触媒作用においてある役割を果たすことが示されている（Ｍｉｎｄｙ Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ３２２（５）：９７１－８２（２００２）を参照されたい）。典型的には、Ｔｎ５の活性は、インビボレポーター系によって評価されている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：９１３－９２５（１９９８）に記載されるようなパピレーションアッセイ）。
表４では、通常フォントの配列は、共有配列を示し、二重下線を付したイタリック体の配列は、天然ＯＥ基質に由来し、太字のイタリック体の配列は、天然ＩＥ基質に由来する。
代表的な野生型モザイク末端配列（転移鎖）は、配列番号１である。様々な変異体Ｔｎ５及びトランスポゾン末端は、国際公開第２０１５／１６０８９５号及び米国特許第９０８０２１１号に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に記載される方法における使用に適切であり得る。
いくつかのＤＮＡ酵素又は酵素の組み合わせは、とりわけ、ウラシル、イノシン、リボース塩基、８－オキソＧ、チミングリコール、修飾プリン、及び修飾ピリミジンなどの修飾塩基の選択的除去を媒介することができる（表５、及びＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ－ａｎｄ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｃｈａｒｔｓから２０２２年１月２０日にダウンロードされた、及びＪａｃｏｂｓ ａｎｄ ＳｃｈａｒＣｈｒｏｍｏｓｏｍａ１２１：１－２０（２０１２）を参照されたい）。そのような酵素には、修飾特異的エンドヌクレアーゼ又は修飾特異的グリコシラーゼが含まれる。修飾特異的グリコシラーゼとともに使用するための修飾プリンとしては、３－メチルアデニン（３ｍＡ）及び７－メチルグアニン（７ｍＧ）が挙げられる。修飾特異的グリコシラーゼとともに使用するための修飾ピリミジンは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）を含んでもよい。ＤＮＡ修復酵素を使用するウラシル及び８－オキソＧの選択的除去は、特定の配列決定プラットフォームにおいて既に使用されている。
「転移鎖」と呼ばれるモザイク末端の１つの鎖のみが、転位の間にライブラリ挿入物に共有結合的に付加されるので、このような修飾塩基の、特にモザイク末端転移鎖への組み込みは、モザイク末端転移鎖の選択的切断及び除去を可能にし得る。しかしながら、この型のモザイク末端切断及び除去は、そのカノニカル配列（配列番号１）からのモザイク末端配列の変異を必要とする。
表５では、Ｅｎｄｏ＝エンドヌクレアーゼ、ＦＰＧ＝ホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＯＧＧ＝オキソグアニングリコシラーゼ（ＯＧＧ）、ｈＡＡＧ＝ヒト３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、ＵＮＧ＝ウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ、Ｎｔｈ＝クローン化されたｎ番目の遺伝子、ＴＤＧ＝チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＢＤ４＝哺乳動物ＤＮＡグリコシラーゼ－メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質４、及びＲＯＳ１＝エンドヌクレアーゼＲＯＳ１（二機能性ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼ活性を有する）。
モザイク末端配列を含む修飾トランスポゾン末端配列であって、モザイク末端配列が、野生型モザイク末端配列と比較して１つ以上の変異を含み、変異が、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン（例えば、３ｍＡ若しくは７ｍＧ）、又は修飾ピリミジンによる置換を含む、修飾トランスポゾン末端配列が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、これらの置換は、以下に記載されるように、転位後にトランスポゾン末端を切断するための方法において使用される。
いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ｔｎ５トランスポザーゼとともに使用するためのモザイク末端配列であり得る。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、配列番号１と比較して、モザイク末端配列中に変異を有する。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、配列番号１と比較して１つ以上の変異を含むモザイク末端配列を含み、１つ以上の変異は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１６における置換を含むモザイク末端配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ｃ１７における置換を含むモザイク末端配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１８における置換を含むモザイク末端配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ｇ１９における置換を含むモザイク末端配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、配列番号５、７、９、又は１６～２４を含む。
いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、１つより多い変異を含む。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、野生型配列（いくつかの実施形態では配列番号１）と比較して、８個以下の変異を含む。
Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、更なる変異もまた、モザイク末端配列中に存在し得る。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して１～４つの置換変異を含む。
いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して１つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して２つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して３つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における１つ以上の変異に加えて、配列番号１と比較して４つの置換変異を有する。
いくつかの実施形態では、Ａ１６における置換は、Ａ１６Ｔ、Ａ１６Ｃ、Ａ１６Ｇ、Ａ１６Ｕ、Ａ１６イノシン、Ａ１６リボース、Ａ１６－８－オキソグアニン、Ａ１６チミングリコール、Ａ１６修飾プリン、若しくはＡ１６修飾ピリミジンであり、Ｃ１７における置換は、Ｃ１７Ｔ、Ｃ１７Ａ、Ｃ１７Ｇ、Ｃ１７Ｕ、Ｃ１７イノシン、Ｃ１７リボース、Ｃ１７－８－オキソグアニン、Ｃ１７チミングリコール、Ｃ１７修飾プリン、若しくはＣ１７修飾ピリミジンであり、Ａ１８における置換は、Ａ１８Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ａ１８Ｃ、Ａ１８Ｕ、Ａ１８イノシン、Ａ１８リボース、Ａ１８－８－オキソグアニン、Ａ１８チミングリコール、Ａ１８修飾プリン、若しくはＡ１８修飾ピリミジンであり、かつ／又はＧ１９における置換は、Ｇ１９Ｔ、Ｇ１９Ｃ、Ｇ１９Ａ、Ｇ１９Ｕ、Ｇ１９イノシン、Ｇ１９リボース、Ｇ１９－８－オキソグアニン、Ｇ１９チミングリコール、Ｇ１９修飾プリン、若しくはＧ１９修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、修飾プリンは、３ｍＡ又は７ｍＧである。いくつかの実施形態では、修飾ピリミジンは、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである。
いくつかの実施形態では、変異は、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンによる置換を含む。いくつかの実施形態では、これらの変異は、転移後にモザイク末端配列を切断する方法を可能にする。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、又はＧ１９における変異を含む。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、又はＧ１９における変異から選択される２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、又はＧ１９における変異から選択される３つの変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及びＧ１９における４つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、配列番号１と比較して、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９に１～４つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、野生型配列（いくつかの実施形態では配列番号１）と比較して１つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、野生型配列（いくつかの実施形態では配列番号１）と比較して２つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、野生型配列（いくつかの実施形態では配列番号１）と比較して３つの置換変異を有する。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は、野生型配列（いくつかの実施形態では配列番号１）と比較して４つの置換変異を有する。
Ｄ．固定化トランスポソーム
本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
本明細書に提示される方法及び組成物では、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドなどの１つ以上のポリヌクレオチドを介して支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に結合するリンカーを介して固定化され得る。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ酵素及びポリヌクレオチドの両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸）の固定化に言及する場合、「固定化された」及び「結合された」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方の用語は、明示的に又は文脈によってのいずれかで別段指示されない限り、直接的又は間接的、共有結合、又は非共有結合を包含することが意図される。いくつかの実施形態では、共有結合が使用され得るが、一般的に、必要とされるのは、例えば、核酸増幅及び／又は核酸配列決定を必要とする用途において、支持体を使用することが意図される条件下で、分子（例えば、核酸）が、支持体に固定化されたままである又は結合したままであるということである。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体組成物は、トランスポゾン配列に加えて、１つ以上の他のヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのトランスポゾンを含むか、又はそれからなる。このようなヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドと称され得る。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のタグと、を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のタグと、を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、トランスポゾン組成物は、転移トランスポゾン配列の１つ以上の５’に他のヌクレオチド配列、例えば、タグ配列又はアダプター配列を有する転移鎖を含む。いくつかの実施形態では、転移トランスポゾン配列に加えて、トランスポゾンは、１つ以上の他のタグ部分又はタグドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、転移トランスポゾン配列に加えて、トランスポゾンは、１つ以上のアダプターを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列に対して相補的である領域を含む第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第２のポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。
いくつかの実施形態では、固定化ライブラリ中の二本鎖断片の長さは、固体支持体上のトランスポソーム複合体の密度を増加又は減少させることによって調整される。
トランスポソーム複合体を固定化する手段は、米国特許第１０９２０２１９号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、親和性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、第１のトランスポゾンの５’末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１のトランスポゾンの５’末端に結合した第１の末端と、親和性エレメントに結合した第２の末端とを有する。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な第２のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、親和性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、第２のトランスポゾンの３’末端に結合される。いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、第２のトランスポゾンの３’末端に結合した第１の末端と、親和性エレメントに結合した第２の末端とを有する。
いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、ビオチン又はデュアルビオチンである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジンでコーティングされている。
いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズであり、方法はＤＮＡ ＢＬＴ（ビーズ連結トランスポソーム）を使用する。表面に結合したトランスポソーム（例えば、ＢＬＴ）は、二本鎖ＤＮＡの長い分子をタグメンテーションし、ビーズ又は他の表面上で鋳型ライブラリを作製することができる（米国特許第９６８３２３０号）。トランスポソームをビーズに固定することにより、制御可能な挿入サイズ及び収量などの新規の特性が得られる。これは、以前はＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ技術として知られていたＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ技術の基礎である。
トランスポゾン末端はＤＮＡに対する親和性を有するため、ＤＮＡ ＢＬＴは、ビーズ上への固定化のための捕捉オリゴヌクレオチドを必要とせず、その代わりに、ＤＮＡは、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチドを使用して固定化され得る。代替的に、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子を捕捉するために使用され得る。
固定化トランスポソーム（すなわち、ビーズ連結トランスポソーム）を使用する代表的な製品としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｒｅｐ、（Ｓ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ及びＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｒｅｐ、（Ｌ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ又はＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｒｅｐ、（Ｌ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎが挙げられる。
１．固定化トランスポソームのための固体支持体
特定の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって機能化された不活性基質又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成される固体支持体を利用し得る。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。そのような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有付着してもよいが、中間材料は、それ自体が基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合してもよい。「固体支持体への共有結合」という用語は、この種類の配列を包含するように適宜解釈されるべきである。
特定の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって機能化された不活性基質又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成される固体支持体を利用し得る。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。そのような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有付着してもよいが、中間材料は、それ自体が基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合してもよい。「固体支持体への共有結合」という用語は、この種類の配列を包含するように適宜解釈されるべきである。
「固体表面」、「固体支持体」という用語、及び本明細書の他の文法的均等物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、又は適切であるように修飾され得る任意の材料を指す。当業者によって理解されるように、可能な基質の数は非常に多い。可能な基質としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）などを含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ又はケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、並びに様々な他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特に有用な固体支持体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。例示的なフローセルは、以下に更に詳細に示される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則的なパターンでのトランスポソーム複合体の固定に好適なパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。例えば、領域のうちの１つ以上は、１つ以上のトランスポソーム複合体が存在する特徴であり得る。この特徴は、トランスポソーム複合体が存在しない間質領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、特徴及び／又は間質領域の反復配置であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは、特徴及び／又は間質領域のランダム配置であり得る。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、固体支持体上にランダムに分布している。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、パターン化された表面上に分布している。本明細書に示される方法及び組成物において使用され得る例示的なパターン化された表面は、米国出願第１３／６６１５２４号又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に既知であるように加工することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成物及び形状に依存する。
固体支持体の組成及び幾何学的形状は、その使用によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び／又はアレイなどの平面構造である。したがって、基質の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用するとき、「フローセル」という用語は、１つ又はそれ以上の流体試薬を流通させることができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用することができるフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体又はその表面は、チューブ又は容器の内面又は外面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェア又はビーズを含む。本明細書における「ミクロスフェア」又は「ビーズ」又は「粒子」又は文法的均等物は、小さな離散粒子を意味する。好適なビーズ組成物としては、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロン（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されず、並びに固体支持体について本明細書に概説される任意の他の材料を全て使用することができる。Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄ．の「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」は、有用なガイドである。ある特定の実施形態では、ミクロスフェアは、磁気ミクロスフェア又はビーズである。
ビーズは球状である必要はない。不規則な粒子を使用してもよい。代替的に又は追加的に、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズサイズは、ナノメートル、すなわち、１００ｎｍから、ミリメートル、すなわち、１ｍｍまでの範囲であり、ビーズは約０．２ミクロン～約２００ミクロン、又は約０．５～約５マイクロメートルであるが、いくつかの実施形態では、より小さな又はより大きなビーズが使用されてもよい。
これらの表面結合トランスポソームの密度は、第１のポリヌクレオチドの密度を変化させることによって、又は固体支持体に付加されるトランスポザーゼの量によって、調節することができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で固体支持体上に存在する。
固体支持体（例えば、ＢＬＴ）上のトランスポソーム上でタグメンテーションするために二本鎖ＤＮＡが合成される場合、トランスポソーム複合体は、タグメンテーションにより、両末端で表面に結合したｄｓ断片を生成する。いくつかの実施形態では、架橋断片の長さは、表面上のトランスポソーム複合体の密度を変えることによって変化させることができる。ある特定の実施形態では、得られる架橋断片の長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、３６００ｂｐ、３７００ｂｐ、３８００ｂｐ、３９００ｂｐ、４０００ｂｐ、４１００ｂｐ、４２００ｂｐ、４３００ｂｐ、４４００ｂｐ、４５００ｂｐ、４６００ｂｐ、４７００ｂｐ、４８００ｂｐ、４９００ｂｐ、５０００ｂｐ、１００００ｂｐ、３００００ｂｐ未満、又は１０００００ｂｐ未満である。そのような実施形態では、次に、架橋断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、標準的なクラスタ化学を使用して、クラスタ内に増幅され得、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
支持体への核酸の結合は、剛性又は半剛性にかかわらず、共有結合又は非共有結合を介して起こり得る。例示的な連結は、米国特許第６，７３７，２３６号、同第７，２５９，２５８号、同第７，３７５，２３４号、及び同第７，４２７，６７８号、並びに米国特許公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸又は他の反応成分は、ゲル又は他の半固体支持体に結合され得、これは次に、固相支持体に結合又は接着される。このような実施形態では、核酸又は他の反応成分は、固相であると理解される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、微小粒子、ビーズ、平面支持体、パターン化された表面、又はウェルを含む。いくつかの実施形態では、平面支持体は、チューブの内面又は外面である。
いくつかの実施形態では、この固体支持体は、ＤＮＡをタグメンテーションするためのものであり、ＤＮＡビーズ連結トランスポソーム（DNA bead-linked transposome、ＤＮＡ ＢＬＴ）と称される。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、トランスポソーム複合体を形成するために第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを更に含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従って調製された、その上に固定化されたタグ付き断片のライブラリを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、トランスポザーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような組成物を更に含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第９，６８３，２３０号に記載されているものなどの溶液相トランスポソーム複合体であってもよい。いくつかの実施形態では、液相トランスポソーム複合体を使用して、溶液中でタグ付き断片を生成する。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ断片が液相トランスポソーム複合体によって更に断片化される条件下で、液相トランスポソーム複合体を固定化ＤＮＡ断片と接触させることであって、それによって、溶液中に１つの末端を有する固定化核酸断片を得ることを更に含み得る。
２．例示的なＢＬＴ
本明細書で使用される場合、ＢＬＴは、その表面上にトランスポソーム複合体が固定化された任意の型のビーズを指し得る。様々なＢＬＴが当該技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、ＢＬＴは、その表面上にトランスポソーム複合体が固定化された任意の型のビーズを指し得る。様々なＢＬＴが当該技術分野で公知である。
例示的なＢＬＴは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）製品である（ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ，Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃ １００００００１２４４３５ ｖ０２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０２０（「Ｄｏｃｕｍｅｎｔ １００００００１２４４３５」）を参照されたい）。そのようなＢＬＴは、より大きな挿入部を有する断片を産生する能力に起因して、多くの場合、ＲＮＡライブラリ（すなわち、ＲＮＡ試料から生成されたｃＤＮＡ断片のライブラリ）の調製方法に現時点で好まれる。
別の例示的なＢＬＴは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｒｅｐ、（Ｓ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎである。いくつかの実施形態では、そのようなＢＬＴは、他のＢＬＴと比較して、ビーズ上のトランスポソームのより高い密度に基づいて、より小さい挿入部を有する断片を生成する。
いくつかの実施形態では、ＢＬＴは、（ｃＤＮＡとライブラリ調製物とを組み合わせた）１ポットライブラリ調製物において使用される。いくつかの実施形態では、より高いトランスポソーム活性を有するＢＬＴは、１ポットライブラリ調製物におけるライブラリ収率を改善する（例えば、ビーズ上のトランスポソームの密度がより高い）。当業者は、標準的な実験を使用して、本発明の方法において所与のＢＬＴを使用するための最良の条件を決定し得る。
Ｅ．アダプター及びタグ
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、１つ以上のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、５’アダプター配列は、タグ配列である。３’トランスポゾン末端配列及び５’タグを含む第１のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体によって媒介される断片化は、タグ付き断片のライブラリを生成する方法において使用することができる。
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、１つ以上のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、５’アダプター配列は、タグ配列である。３’トランスポゾン末端配列及び５’タグを含む第１のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体によって媒介される断片化は、タグ付き断片のライブラリを生成する方法において使用することができる。
いくつかの実施形態では、タグは、アダプター配列である。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、配列決定関連配列は、後の配列決定工程に関連する任意の配列であり得る。配列決定関連配列は、下流の配列決定工程を単純化するように作用し得る。例えば、配列決定関連配列は、他の点でアダプターを核酸断片にライゲーションする工程を介して組み込まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、特定の配列決定方法においてフローセルへの結合を容易にするために、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。本開示は、使用することができるアダプター配列の種類に限定されず、当業者であれば、ライブラリ調製及び次世代配列決定に使用することができる追加の配列を認識するであろう。
本明細書で使用されるとき、「タグ」という用語は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。タグドメインは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、タグドメインは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、クラスタ増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグドメインに組み込まれ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５ｂｐ～２００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、１０ｂｐ～１００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、２０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
タグは、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、又はインデックスタグ配列）を含み得る。
いくつかの実施形態では、タグは、クラスタ増幅のための領域を含む。いくつかの実施形態では、タグは、配列決定反応をプライミングするための領域を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼと第１のトランスポゾンの一部に対応する増幅プライマーとを反応させることによって、固体支持体上の断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンの一部は、増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンのタグは、増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態では、タグは、Ａ１４プライマー配列（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態では、タグは、Ｂ１５プライマー配列（配列番号１２）を含む。
いくつかの実施形態では、個々のビーズ上のトランスポソームは、固有のインデックスを保持し、多数のそのようなインデックス付きビーズが用いられる場合、位相化された転写物が生じる。
ＩＩＩ．ｃＤＮＡの調製方法
ＲＮＡ配列決定（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析における困難は、ライブラリ調製の前にＲＮＡをＤＮＡに変換する必要があることであり、手順にかなりの時間及び複雑さを加える。しかしながら、ＲＮＡは重要な分子であり、トランスクリプトーム及びメタトランスクリプトームに関する定量的な機能的情報を提供する。重要なことに、疾患監視のための多くの場合では、ウイルスの最も病原性の高いファミリーは、ＲＮＡゲノムを有するため、ＲＮＡは、最も重要な関心事である（「Ｓｅｌｅｃｔ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｘｉｎｓ Ｌｉｓｔ，」ＣＤＣ／ＵＳＤＡ（２０２０）又はｗｗｗ．ｓｅｌｅｃｔａｇｅｎｔｓ．ｇｏｖを参照されたい）。本明細書に提示されるＲＮＡライブラリ調製のためのより容易な方法は、ユーザ、特にＮＧＳプロトコルにあまり精通していない可能性があるユーザによって好まれ得る。更に、本発明の方法は、複数の試料を処理するための単純で費用効果の高い自動化を可能にし得る。図４～図１０は、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）におけるｃＤＮＡ調製の本発明の中温性方法からのデータを示す。図１１～図１２Ｂは、１工程プロセスにおけるｃＤＮＡ調製の本発明の熱安定性方法からのデータを示す。
ＲＮＡ配列決定（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析における困難は、ライブラリ調製の前にＲＮＡをＤＮＡに変換する必要があることであり、手順にかなりの時間及び複雑さを加える。しかしながら、ＲＮＡは重要な分子であり、トランスクリプトーム及びメタトランスクリプトームに関する定量的な機能的情報を提供する。重要なことに、疾患監視のための多くの場合では、ウイルスの最も病原性の高いファミリーは、ＲＮＡゲノムを有するため、ＲＮＡは、最も重要な関心事である（「Ｓｅｌｅｃｔ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｘｉｎｓ Ｌｉｓｔ，」ＣＤＣ／ＵＳＤＡ（２０２０）又はｗｗｗ．ｓｅｌｅｃｔａｇｅｎｔｓ．ｇｏｖを参照されたい）。本明細書に提示されるＲＮＡライブラリ調製のためのより容易な方法は、ユーザ、特にＮＧＳプロトコルにあまり精通していない可能性があるユーザによって好まれ得る。更に、本発明の方法は、複数の試料を処理するための単純で費用効果の高い自動化を可能にし得る。図４～図１０は、１工程プロセス（すなわち、本発明の方法）におけるｃＤＮＡ調製の本発明の中温性方法からのデータを示す。図１１～図１２Ｂは、１工程プロセスにおけるｃＤＮＡ調製の本発明の熱安定性方法からのデータを示す。
本明細書に記載される方法は、試料からのＲＮＡをわずか１５分で二本鎖ｃＤＮＡに変換することができる。これは、従来のプロトコル（図１に示されるような、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ又はＩｌｌｕｍｉｎａ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｅｐなど）における１１０分と比較して有意な短縮である。追加的に、タッチポイント（すなわち、ユーザによるアクション）の数が低下し、プロトコルをエンドユーザにとってより容易にする。本発明の１工程法に対する、ｃＤＮＡ調製の標準的な２工程法についてのタイムラインの違いのより詳細な概要を図１４Ｂに示す。
二本鎖ｃＤＮＡを調製する方法であって、（ｉ）プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、ＲＮＡへのプライマーの結合を可能にすることと、（ｉｉ）試料を、本明細書に記載されるｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物と合わせ、等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、を含む、方法が本明細書に記載される。
図３は、本方法のモデルを示す。いくつかの実施形態では、個々の酵素構成要素のバランスを有する組成物は、ｄｓ－ｃＤＮＡの調製を助ける。いくつかの実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡの生成は、ＲＮＡがＲＮＡｓｅ Ｈによってニッキングされる速度を上回る。いくつかの実施形態では、逆転写酵素の活性は、ＲＮＡｓｅ Ｈの活性を超える。
いくつかの実施形態では、試料は、１０ｎｇ以上のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、１０ｎｇ未満のＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡの第１の鎖を産生する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの鎖を含むＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ Ｈは、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖をニッキングし、ＲＮＡ断片を産生する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ断片からプライミングすることによってＤＮＡの第２の鎖を伸長させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼの５’－３’及び３’から５’への活性は、ＲＮＡ断片及びＲＮＡオーバーハングを除去する。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素によるｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度は、ＲＮＡニッカーゼによるＲＮＡのニッキングの速度よりも大きい。いくつかの実施形態では、逆転写酵素の活性は、ＲＮＡニッカーゼの活性を超える。このようにして、ＲＮＡがＲＮＡニッカーゼによって分解される前に、ｃＤＮＡの第１の鎖が産生される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性が平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。
いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼの両方によって使用される。
いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡの枯渇は、ｃＤＮＡを調製する前に実施される。いくつかの実施形態では、この望ましくないＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、本方法は、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせる前に、ＲＮＡを含む試料を用いてオフターゲットＲＮＡの枯渇を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、所望のＲＮＡの濃縮は、ｃＤＮＡを調製する前に行われる。いくつかの実施形態では、所望のＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
Ａ．プライマー
種々の異なるプライマーが、この方法において使用され得る。
種々の異なるプライマーが、この方法において使用され得る。
いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダムプライマー（ランダマープライマーとしても知られる）を含む。いくつかの実施形態では、ランダマープライマーは、特定の配列を標的としない（すなわち、プライマーは、標的化されない）。いくつかの実施形態では、ユーザが、ランダマープライマーが結合するための特定の配列を選択していないため、ランダマープライマーは、ＲＮＡからのｄｓ－ｃＤＮＡの偏りのない産生を可能にする。いくつかの実施形態では、ランダマープライマーを用いる方法は、本方法がＲＮＡ内の特定の配列に結合するように設計されたプライマーを含まないので、ｃＤＮＡの偏った調製又は不均一な調製を回避する。いくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマー又は転写物特異的プライマーは、本方法に必要とされない。代わりに、ランダムプライマーを使用して、ｃＤＮＡの第１の鎖の合成をプライミングして、本明細書に記載されるように、ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに形質転換する協調的なプロセスを開始することができる。いくつかの実施形態では、ランダムプライマーは、標的化プライマーの結合を促進するために必要とされ得る、ＡＴリッチプライマーなどの特殊なプライマーの必要性を回避する。
いくつかの実施形態では、プライマーは、ＲＮＡに含まれる１つ以上の配列に特異的に結合する。ＲＮＡに含まれる１つ以上の配列に特異的に結合するこのようなプライマーは、「標的化プライマー」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、標的化プライマーは、ＲＮＡの特定の領域からのｄｓ－ｃＤＮＡの産生を可能にする。ｄｓ－ｃＤＮＡのこの標的化された産生は、ｃＤＮＡの第１の鎖が、標的化プライマーが結合する領域に基づいてのみ生成されるという事実に基づく。
いくつかの実施形態では、プライマーは、ヘキサマープライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダムヘキサマープライマーを含む。
いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダマープライマー及び標的化プライマーを含む混合物を含む。
いくつかの実施形態では、プライマーは、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーは、プライマーによって結合されたＲＮＡを、ＲＮＡニッカーゼによる切断に対して耐性にする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡニッカーゼはＲＮＡｓｅ Ｈであり、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーによって結合されたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ｈによる切断に耐性である。
いくつかの実施形態では、化学修飾されたヌクレオチドは、メチルホスホネート残基を含む。
Ｂ．等温反応
当該分野で公知の方法と比較して、本発明の方法の利点は、温度変化を必要とせずにＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡを産生する能力である。図１に示されるように、従来技術の方法は、最大５回の温度変化を必要とする。これらの温度変化は、現在の等温方法と比較して、より洗練された装置（プログラム可能なサーモサイクラなど）及びユーザの入力を必要とする。
当該分野で公知の方法と比較して、本発明の方法の利点は、温度変化を必要とせずにＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡを産生する能力である。図１に示されるように、従来技術の方法は、最大５回の温度変化を必要とする。これらの温度変化は、現在の等温方法と比較して、より洗練された装置（プログラム可能なサーモサイクラなど）及びユーザの入力を必要とする。
いくつかの実施形態では、ｄｓ－ｃＤＮＡを調製するための等温反応は、上述のように、中温性組成物又は熱安定性組成物を用いて行われ得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、バーコードを必要としない。いくつかの実施形態では、本方法は、サーマルサイクラにおけるコンピュータ制御された温度調節を必要としない。いくつかの実施形態では、反応温度は、本明細書に記載される組成物が添加された後に変更される必要はない。いくつかの実施形態では、プライマー結合は、異なる温度で行われてもよく、反応温度は、組成物が添加されるときに変化するが、反応は、プライマーによって結合されたＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡを調製するときに温度変化を必要としない。
いくつかの実施形態では、等温反応は、３０℃～４９℃の温度である。いくつかの実施形態では、等温反応は、３７℃の温度である。いくつかの実施形態では、３０℃～４９℃の温度での等温反応は、本明細書に記載されるように、中温性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、等温反応は、５０℃～７２℃の温度である。いくつかの実施形態では、等温反応は、５０℃の温度である。いくつかの実施形態では、５０℃～７２℃の温度での等温反応は、本明細書に記載されるように、熱安定性ｄｓ－ｃＤＮＡ調製のための組成物を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５０℃未満の温度で第１の鎖の合成を正常に阻害する二次構造を示す。いくつかの実施形態では、５０℃～７２℃で行われる等温反応は、５０℃未満の温度で行われる等温反応と比較して、改善されたｄｓ－ｃＤＮＡ収率又はカバレッジを示す。ヘアピンなどのＲＮＡの二次構造は、当業者に周知であろう。
Ｃ．インキュベーション時間
本発明の方法の利点は、当該技術分野で公知の方法と比較して反応時間が短縮されることであり得る。図１に示されるように、従来技術の方法は最大１１０分を必要とするが、本発明の方法は１５分以下で実施することができる。
本発明の方法の利点は、当該技術分野で公知の方法と比較して反応時間が短縮されることであり得る。図１に示されるように、従来技術の方法は最大１１０分を必要とするが、本発明の方法は１５分以下で実施することができる。
いくつかの実施形態では、等温反応は、６０分以下、４５分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、又は１０分以下にわたってインキュベートされる。いくつかの実施形態では、等温反応は、１５分間以下にわたってインキュベートされる。いくつかの実施形態では、等温反応は、１０分間以下にわたってインキュベートされる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、又は少なくとも６０分間のインキュベーションは、ライブラリ調製のためのｄｓ－ｃＤＮＡを与える。
Ｄ．ｒＲＮＡの枯渇又はｍＲＮＡの濃縮
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ調製を開始する前に（例えば、プライマーをＲＮＡに結合させる前に）、所望のＲＮＡを濃縮するか、又は望ましくないＲＮＡを枯渇させる。このようにして、ｃＤＮＡは所望のＲＮＡからのみ産生される。そのような方法は、試薬の浪費及び不必要なデータ分析を回避することができる。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ調製を開始する前に（例えば、プライマーをＲＮＡに結合させる前に）、所望のＲＮＡを濃縮するか、又は望ましくないＲＮＡを枯渇させる。このようにして、ｃＤＮＡは所望のＲＮＡからのみ産生される。そのような方法は、試薬の浪費及び不必要なデータ分析を回避することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ｃＤＮＡを調製する前に、望ましくないＲＮＡを除去することを含む。このようにして、ｃＤＮＡは、望ましくないＲＮＡからは作製されない。いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡは、そうでなければ望ましくないＲＮＡに関連する有意な量のｃＤＮＡの生成をもたらすであろう豊富なＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡの除去は、酵素的枯渇による。いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡの枯渇後の残りのＲＮＡは、次いで、本明細書に記載される方法によってｃＤＮＡに変換される。
いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡは、リボソームＲＮＡ又はベータグロビン転写物を含む。いくつかの異なる型のｒＲＮＡ枯渇方法が知られており、米国特許第９，７４５，５７０号及び国際公開第２０２０／１３２３０４号に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ｒＲＮＡは、細胞質又はミトコンドリアである。いくつかの実施形態では、ｒＲＮＡは、ヒト、マウス、ラット、グラム（－）細菌、又はグラム（＋）細菌のｒＲＮＡである。いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡは、ベータグロビン転写物を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡは、ヒトベータグロビン転写物である。
いくつかの実施形態では、ｒＲＮＡ枯渇は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット又は他の類似のキット若しくは方法を用いて実施することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ｃＤＮＡを調製する前に所望のＲＮＡを濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、所望のＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ濃縮は、ポリＴプライマーを用いた増幅又は捕捉ビーズへのｍＲＮＡの結合を含む。いくつかの実施形態では、捕捉ビーズは、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面を含む。
ＩＶ．ライブラリ調製の方法
いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡを含む試料から単一の反応容器中で二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製することを可能にする。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片は、上述のように調製された二本鎖ｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、本明細書に記載されるように、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製する方法を含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ及びライブラリ調製の組み合わせは、単一の反応容器中で行われてもよく、これは、本明細書で「１ポット」法と称され得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ及びライブラリ調製の１ポット法は、同じ反応容器中でのライブラリ断片の調製を合わせたｃＤＮＡ調製の１工程法を含む。いくつかの実施形態では、１ポット法におけるライブラリ断片の調製は、ＢＬＴを使用するタグメンテーションによる。
いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡを含む試料から単一の反応容器中で二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを調製することを可能にする。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片は、上述のように調製された二本鎖ｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、本明細書に記載されるように、ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製する方法を含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ及びライブラリ調製の組み合わせは、単一の反応容器中で行われてもよく、これは、本明細書で「１ポット」法と称され得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ及びライブラリ調製の１ポット法は、同じ反応容器中でのライブラリ断片の調製を合わせたｃＤＮＡ調製の１工程法を含む。いくつかの実施形態では、１ポット法におけるライブラリ断片の調製は、ＢＬＴを使用するタグメンテーションによる。
ｃＤＮＡ及びライブラリ調製を組み合わせた、ライブラリ調製の１ポット法の代表的な概要を図１３に示す。図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、ＢＬＴによるライブラリ調製は、中温性又は熱安定性の二本鎖ｃＤＮＡ合成も含む方法に含めることができる。このようにして、ユーザは、単一の反応容器中でＲＮＡから配列決定するためのライブラリを生成することができる。１ポットライブラリ調製による時間の利点は、図１４Ｃに示されており、１ポットライブラリ調製は、他の調製方法に対して１～１．５時間の時間を節約することができ、かつユーザのための複数のハンズオン工程を回避することができる。図１６Ｃは、図１６Ｄに要約されているような、２工程ｃＤＮＡ調製（図１６Ａ）又は１工程ｃＤＮＡ調製（図１６Ｂ）とそれに続く別個のタグメンテーションと比較して、同等の断片が１ポット（ｃＤＮＡ調製及びタグメンテーションの組み合わせ）で生成されることを示す。図１７Ａ～図１８Ｂ及び図２０Ａ～図２４は、１ポットタグメンテーションライブラリに関する更なるデータ及び他のライブラリ調製物との比較データを提供する。
図２５は、１ポットライブラリ調製の利点を概説しており、２工程のｃＤＮＡ調製後に別個のタグメンテーションを行う４時間、又は１工程のｃＤＮＡ調製後に別個のタグメンテーションを行う３時間から、およそ２時間へと時間が短縮される。いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製法は、単一のクリーンアップ工程（ＳＰＲＩビーズを用いるものなど）のみを必要とする。いくつかの実施形態では、ＳＰＲＩ又は他のクリーンアップは、等温反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製と二本鎖ｃＤＮＡ断片の調製との間に行われない。したがって、１ポットライブラリ調製は、全体的な時間及びユーザのためのハンズオン時間を節約することができる。
ＤＮＡなどの標的核酸を、次世代配列決定の準備が整ったアダプター修飾鋳型に変換するために必要とされる工程の数は、タグメンテーションによって最小限に抑えることができる。タグメンテーションにより、標的核酸の断片化と二重鎖核酸断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションが同時にもたらされる。トランスポソーム錯体が支持体結合している（すなわち、固体支持体に固定化されている）場合、得られた断片は、タグメンテーション反応後に、固体支持体に結合される（５’結合型トランスポソーム複合体の場合には直接、又は３’結合型トランスポソーム複合体の場合にはハイブリダイゼーションを介して）。
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡの調製後にタグメンテーションが実施される。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、ビーズ連結トランスポソーム（ＢＬＴ）上で実施される。ＢＬＴはＲＮＡ自体に結合せず、したがって、反応中のＢＬＴは、ＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡを断片化する。いくつかの実施形態では、ＢＬＴを使用する方法は、ビーズに固定化されたｃＤＮＡ断片のライブラリをもたらす。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製するための反応及びｃＤＮＡの断片を調製するための反応は、同時に行われる。いくつかの実施形態では、ライブラリ断片の調製は、ｃＤＮＡが調製されているときに、反応容器の変更を必要とせずに行うことができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、断片化の前にｃＤＮＡを精製することなく、調製されているときに断片化され得る。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の全ての工程は、単一の反応容器中で行われる。
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法は、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、ＲＮＡへのプライマーの結合を可能にすることと、試料を、本明細書に記載される組成物と合わせ、（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の前に、望ましくないＲＮＡを枯渇させるか、又は所望のＲＮＡを濃縮する。いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡはｒＲＮＡであり、所望のＲＮＡはｍＲＮＡである。１ポットライブラリ調製を用いたｒＲＮＡ枯渇による代表的なデータを図１９Ａ～図１９Ｂに示す。
いくつかの実施形態では、プライマーを試料と合わせることと、試料を組成物と合わせることは、同じ工程で実施される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、単一の等温反応によって行われる。
いくつかの実施形態では、（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、異なる温度で行われる。
いくつかの実施形態では、（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、単一の反応容器中で行われる。
いくつかの実施形態では、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることは、ＲＮＡを含む試料を、溶出液、プライマー、及び断片化ミックスと混合することを含む。例示的な溶出液、プライマー、及び断片化ミックスは、ＥＰＨ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））であろう。
いくつかの実施形態では、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることは、５５℃以上で行われる。いくつかの実施形態では、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることは、６５℃で行われる。
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡライブラリの断片は、タグメンテーションによって調製される。いくつかの実施形態では、タグメンテーションの効率を増加させるために、二本鎖ｃＤＮＡ調製後に反応温度を上昇させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、単一の反応容器中で二本鎖ｃＤＮＡに変換され、次いで二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリに変換され、ここで、二本鎖ｃＤＮＡは、等温反応を介して調製され、反応容器の温度を、断片を調製するためのタグメンテーションの効率を改善するために上昇させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、単一の等温反応を介して単一の反応容器中で二本鎖ｃＤＮＡに変換され、次いで二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリに変換される。
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応は、３０℃～４９℃の温度である。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応は、３７℃以上の温度である。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応は、３７℃の温度である。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡを調製するための等温反応は、５５℃の温度である。
いくつかの実施形態では、（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、３７℃での単一の等温反応によって行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製すること及び／又は二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することは、３７℃超で行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することは、５５℃で行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡを調製することは、３７℃で行われ、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することは、５５℃で行われる。
いくつかの実施形態では、本方法に使用される組成物のＭｇ２＋濃度は１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度は５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に、Ｍｇ２＋濃度は８ｍＭである。いくつかの実施形態では、（１）逆転写酵素、ＲＮＡニッカーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性酵素であり、かつ（２）本方法で使用される組成物のＭｇ２＋濃度は１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的にＭｇ２＋濃度は５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的にＭｇ２＋濃度は８ｍＭである。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素によるｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度は、ＲＮＡニッカーゼによるＲＮＡのニッキングの速度よりも大きい。いくつかの実施形態では、逆転写酵素の活性は、ＲＮＡニッカーゼの活性を超える。いくつかの実施形態では、（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することは、６０分以下又は３０分以下の全インキュベーションで行われる。
いくつかの実施形態では、ギャップ充填ライゲーションは、二本鎖ＤＮＡ断片の調製後に行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片が増幅される。
いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片が配列決定される。いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのアダプターを組み込む。いくつかの実施形態では、配列決定前に二本鎖ＤＮＡ断片が増幅される。いくつかの実施形態では、配列決定前に二本鎖ＤＮＡ断片が増幅されない。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＲＮＡを含む出発試料からの配列決定のためのライブラリのより迅速かつ単純な調製を可能にする。例えば、本発明の方法は、ＲＮＡウイルスの増強された病原体監視を可能にすることができるが、任意の型のＲＮＡ試料からの配列決定は、本発明の方法を用いて増強することができる。
いくつかの実施形態では、望ましくないＲＮＡの枯渇又は所望のＲＮＡの濃縮は、上述のように、ライブラリ調製の前に実施され得る。
いくつかの実施形態では、タグメンテーション停止緩衝液は、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製した後に添加される。いくつかの実施形態では、調製された二本鎖ｃＤＮＡ断片は、精製される。いくつかの実施形態では、調製された二本鎖ｃＤＮＡ断片は、配列決定される。いくつかの実施形態では、調製された二本鎖ｃＤＮＡ断片は、精製され、次いで配列決定される。
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、修飾トランスポゾン末端を断片化する工程を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、ＵＭＩを組み込む工程を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、ギャップ充填ライゲーション、増幅、及び／又は断片の配列決定などの工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、標的化濃縮を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製する工程は、標的断片の濃縮を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片の増幅は、標的断片に結合してその増幅を可能にする標的特異的プライマーを用いて実施される。
Ａ．タグメンテーション反応の最適化
いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製の方法は、タグメンテーション反応の収率を増加させるための最適化を含む。このような最適化の結果を図２６～図３０Ｂに示す。
いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製の方法は、タグメンテーション反応の収率を増加させるための最適化を含む。このような最適化の結果を図２６～図３０Ｂに示す。
いくつかの実施形態では、３７℃を超えるインキュベーションの工程は、１ポットライブラリ調製に含まれる。タグメンテーションは、好ましくは３７℃超、例えば５５℃で起こることが当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ法は、５５℃での反応物のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、５５℃でのインキュベーションは、１５分又は３０分である。いくつかの実施形態では、５５℃でのインキュベーションは、３７℃でのインキュベーションの後に行われる（すなわち、反応温度は、３７℃での二本鎖ｃＤＮＡ調製を可能にした後に上昇される）。
いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製全体が、３７℃を超える等温反応によって行われる。いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製全体が、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、又は５５℃以上での等温反応によって行われる。いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製全体が、５５℃で行われる。５５℃でのそのようなライブラリ調製は、本明細書に記載される熱安定性酵素を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、１ポットライブラリ調製は、比較的高いＭｇ２＋濃度で行われる。Ｔｎ５などのトランスポザーゼは、タグメンテーション反応における補因子としてマグネシウムイオンを使用することが知られている。図２６～図３０Ｂの実験は、Ｍｇ２＋の増加が１ポットライブラリ調製のライブラリ収率の改善に役立つことを示した。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋濃度は、５ｍＭ～２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋濃度は、８ｍＭである。いくつかの実施形態では、ユーザは、最適な収率をもたらすＭｇ２＋濃度を経験的に決定する。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋濃度は、ＲＮＡ分解の可能性を最小限に抑えながら、タグメンテーション反応を増加させるように最適化される。
Ｂ．断片化のための転位反応
転位は、ＤＮＡ配列がゲノム内に挿入され、欠失され、複製される酵素媒介性プロセスである。このプロセスは、断片化された二本鎖核酸（二本鎖ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖など）における広範な使用に適合されている。転位は、標準的なフラグメンターゼプロトコルを使用することなく、ＤＮＡ断片を生成し得る。
転位は、ＤＮＡ配列がゲノム内に挿入され、欠失され、複製される酵素媒介性プロセスである。このプロセスは、断片化された二本鎖核酸（二本鎖ＤＮＡ及びＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖など）における広範な使用に適合されている。転位は、標準的なフラグメンターゼプロトコルを使用することなく、ＤＮＡ断片を生成し得る。
十分に研究されたＥ．ｃｏｌｉ Ｔｎ５トランスポゾンは、「カットアンドペースト」転位機構によって移動する。まず、Ｔｎ５トランスポザーゼＴｎｐ（以下、Ｔｎ５と称する）は、トランスポゾンＤＮＡのいずれかの側の保存された基質配列を認識し、次いでこれがゲノムから切り出されるか、又は「切断」される。次いで、Ｔｎ５は、このトランスポゾンＤＮＡを標的ＤＮＡに挿入又は「ペースト」する。
Ｔｎ５は、多くのライブラリ調製試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａのものなど）において、ゲノムＤＮＡを「タグメンテーションする」、すなわち、同時に「タグ付け」して「断片化する」その能力が活用されており、したがって、従来の超音波処理／ライゲーションベースのライブラリ調製プロトコルに関与する時間及び複雑性を大幅に減少させる。ライブラリ調製でのその使用を補助するために、Ｔｎ５は、アダプター配列（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＡ１４及びＢ１５アダプター配列）に付加された「モザイク末端」又は「末端配列」と呼ばれる保存された基質配列からなるトランスポゾンでプレロードされる。次いで、Ｔｎ５トランスポザーゼ及びアダプターを有するトランスポゾン配列を含むこのトランスポソーム複合体を、ゲノムＤＮＡ試料と混合する。得られたライブラリ調製トランスポゾンは、短いアダプター配列のみを有し、したがって、ゲノムＤＮＡの断片化及び短いアダプター配列によるタグ化を同時にもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾トランスポゾン末端による転位は、野生型（すなわち、本明細書に記載の変異を含まないトランスポゾン末端）による転位と同等の結果を与える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるトランスポソーム複合体を用いて断片を調製することは、配列番号１を含む野生型モザイク末端配列を含むトランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体を用いて断片を調製することと比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の断片の数の調製をもたらす。
１．モザイク末端の除去
いくつかの実施形態では、酵素を使用するモザイク末端の選択的切断は、Ｔｎ５をフラグメンターゼ系に形質転換する（すなわち、モザイク末端を欠く断片を生成する）ための非常に魅力的な機構である。本明細書中で使用される場合、「塩基修飾」又は「ＤＮＡ塩基修飾」とは、酵素（例えば、（ａ）エンドヌクレアーゼ、又は（ｂ）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせ）によって認識され、この修飾塩基での切断の引き金となる、二本鎖核酸中の修飾塩基（例えば、表３に記載されるもの）の位置を指す。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡグリコシラーゼは、修飾特異的である。
いくつかの実施形態では、酵素を使用するモザイク末端の選択的切断は、Ｔｎ５をフラグメンターゼ系に形質転換する（すなわち、モザイク末端を欠く断片を生成する）ための非常に魅力的な機構である。本明細書中で使用される場合、「塩基修飾」又は「ＤＮＡ塩基修飾」とは、酵素（例えば、（ａ）エンドヌクレアーゼ、又は（ｂ）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせ）によって認識され、この修飾塩基での切断の引き金となる、二本鎖核酸中の修飾塩基（例えば、表３に記載されるもの）の位置を指す。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡグリコシラーゼは、修飾特異的である。
いくつかの実施形態では、塩基修飾は、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせを使用して切断される。例えば、ＤＮＡグリコシラーゼは、次に熱、塩基性条件、又は脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼによって作用される脱塩基部位を産生し得る。ＵＳＥＲ試薬は、ＤＮＡグリコシラーゼと、脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼと、を含む例示的な酵素混合物である。ユーザは、その好ましいワークフローに応じて、脱塩基部位で切断する方法を選択し得る。修飾特異的エンドヌクレアーゼは、１工程反応で修飾塩基を切断することができ、又は修飾特異的グリコシラーゼとその後のＡＰリアーゼ／エンドヌクレアーゼ若しくは熱は、２工程反応で修飾塩基を切断することができる。
そのような転位反応とそれに続く修飾塩基での切断から調製された断片は、配列番号１の１６～１９位の１つ以上の修飾部位に応じて、５’リン酸及び３’－ＯＨを有する５’オーバーハング、並びにＭＥ配列の０～３塩基を有する挿入部を含む。
いくつかの実施形態では、修飾モザイク末端配列の切断は、（ａ）エンドヌクレアーゼ、又は（ｂ）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせによって媒介される。いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼ、又は（ｂ）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせは、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンでの切断を媒介し得る。
いくつかの実施形態では、（ａ）エンドヌクレアーゼ、又は（ｂ）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせは、ＵＳＥＲ、エンドヌクレアーゼＶ、ＲＮＡｓｅ ＨＩＩ、ホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）、オキソグアニングリコシラーゼ（ＯＧＧ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ若しくはエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）若しくは哺乳動物ＤＮＡグリコシラーゼ－メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質４（ＭＢＤ４）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ若しくはエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物及びいずれか、又はＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼＲＯＳ１（ＲＯＳ１）である。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ１は、その二官能性グリコシラーゼ／リアーゼ活性に基づいて修飾エンドヌクレアーゼとして機能することができる。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列はウラシルを含み、混合物はＮ－グリコシラーゼであり、脱プリン又は脱ピリミジン部位（ＡＰ）リアーゼ／エンドヌクレアーゼは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）である。いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物である。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列はイノシンを含み、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶである。いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列はリボースを含み、エンドヌクレアーゼはＲＮＡｓｅ ＨＩＩである。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は８－オキソグアニンを含み、エンドヌクレアーゼは、ホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）又はオキソグアニングリコシラーゼ（ＯＧＧ）である。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列はチミングリコールを含み、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）又はエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は修飾プリンを含み、脱塩基部位を認識するＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼ／リアーゼは、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（human alkyl adenine DNA glycosylase、ｈＡＡＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物である。
いくつかの実施形態では、修飾トランスポゾン末端配列は修飾ピリミジンを含み、ＤＮＡグリコシラーゼはＴＤＧ又はＭＢＤ４であり、脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼは、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩである。修飾ピリミジンを含む修飾トランスポゾン末端とともに使用するための代替的な修飾特異的エンドヌクレアーゼは、ＲＯＳ１である。
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンから選択される１つより多い変異を含む修飾トランスポゾン末端配列を含み、エンドヌクレアーゼ、又はＤＮＡグリコシラーゼ、及び脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼは、混合物中に含まれる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ、又はＤＮＡグリコシラーゼ、及び脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼは、ＵＳＥＲ、エンドヌクレアーゼＶ、ＲＮＡｓｅ ＨＩＩ、ホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）、オキソグアニングリコシラーゼ（ＯＧＧ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ｈＡＡＧとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ／エンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物、又はＴＤＧ若しくはＭＢＤ４をエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ／エンドヌクレアーゼＩＩＩと合わせた混合物、又はＲＯＳ１から選択される１つより多い酵素を含む。いくつかの実施形態では、１つより多い変異を含む修飾トランスポゾン末端配列、並びにエンドヌクレアーゼ、及び／又はＤＮＡグリコシラーゼ、及び脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせを用いた方法は、単一の変異を含む修飾トランスポゾン末端配列及び単一のエンドヌクレアーゼ、又はＤＮＡグリコシラーゼ、及び脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせを用いた方法と比較して、モザイク末端配列の切断効率を改善する。ＲＯＳ１については、単一のエンドヌクレアーゼがグリコシラーゼ及びリアーゼ機能の両方を有する。
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸を断片化する方法は、二本鎖核酸を含む試料をトランスポソーム複合体と合わせることと、断片を調製することと、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を欠く二本鎖核酸断片を調製する方法は、核酸を含む試料をトランスポソーム複合体と合わせることと、断片を調製することと、試料を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせることと、モザイク配列内のウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで第１のトランスポゾン末端を切断して、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、を含む。いくつかの実施形態では、修飾プリンは、３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである。いくつかの実施形態では、修飾ピリミジンは、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである。いくつかの実施形態では、この方法は、断片から第１のトランスポゾン末端（転移鎖）の全て又は一部を切断する。
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾン末端を切断することは、アダプターをライゲーションするための付着末端を生成する。本明細書中で使用される場合、「付着末端」は、二本鎖断片の末端であって、一方の鎖が、他方より長く（すなわち、オーバーハングが存在する）、オーバーハングが、相補的なオーバーハングを含むアダプターのライゲーションを可能にするものである。
いくつかの実施形態では、アダプターは、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去した後に付加される。いくつかの実施形態では、アダプターは、ライゲーションによって付加される。いくつかの実施形態では、末端修復及びＡ－テーリングミックスは、アダプターのライゲーションを可能にする。当業者は、アダプターを付加するための他の手段（例えば、ＰＣＲ増幅又はクリック化学）を承知している。
２．アダプターのライゲーション
いくつかの実施形態では、アダプターを含む二本鎖核酸断片を調製する方法は、核酸を含む試料を、本明細書に記載のトランスポソーム複合体と合わせることと、断片を調製することと、試料を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせることと、モザイク末端配列内のウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで第１のトランスポゾン末端を切断して、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、断片の５’末端及び／又は３’末端にアダプターをライゲーションすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、アダプターを含む二本鎖核酸断片を調製する方法は、核酸を含む試料を、本明細書に記載のトランスポソーム複合体と合わせることと、断片を調製することと、試料を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせることと、モザイク末端配列内のウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで第１のトランスポゾン末端を切断して、断片から第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、断片の５’末端及び／又は３’末端にアダプターをライゲーションすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、配列を含むアダプターは、モザイク末端配列の全て又は一部の除去後に、ライブラリ断片上にライゲーションされる。断片の５’及び／又は３’末端へのアダプターのライゲーションに供された断片は、「タグ化断片」と呼ばれ得る。
いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ＤＮＡリガーゼを用いて行われる。
いくつかの実施形態では、アダプターは、二本鎖アダプターを含む。
いくつかの実施形態では、アダプターは、断片の５’及び３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、断片の５’及び３’末端に付加されるアダプターは、異なっている。
ＴｒｕＳｅｑ及びＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５００など、アダプターライゲーションの工程を含む多種多様なライブラリ調製方法が当技術分野で公知である（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｖ２ Ｇｕｉｄｅ，１５０２６４９５ Ｒｅｖ．Ｆ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０１４を参照されたい）。他のライゲーション方法とともに使用されるアダプターを、本発明方法において使用してもよい（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０２１を参照されたい）。本発明における使用のためのアダプターはまた、国際公開第２００８／０９３０９８号、国際公開第２００８／０９６１４６号、国際公開第２０１８／２０８６９９号、及び国際公開第２０１９／０５５７１５号に記載されているものを含み、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、アダプターライゲーションは、タグメンテーションを介して断片をタグ付けする方法（アダプター配列が転位反応中に断片に組み込まれる）と比較して、アダプター（より長い長さを有するアダプターなど）のより柔軟な組み込みを可能にし得る。タグメンテーションを含むいくつかの方法では、追加のアダプター配列をＰＣＲ反応（米国特許出願公開第２０１８／０２０１９９２（Ａ１）号に記載されているものなど）によって組み込むことができ、本発明の方法は、追加のアダプター配列を組み込むための追加のＰＣＲ工程の必要性をなくすことができる。
ライゲーション技術は、配列決定のためのＮＧＳライブラリを調製するために一般的に使用される。いくつかの実施形態は、ライゲーション工程は、酵素を使用して、特殊なアダプターをＤＮＡ断片の両端に接続する。いくつかの実施形態では、Ａ塩基は、各鎖の平滑末端に付加され、配列決定アダプターへのライゲーションのためにそれらを調製する。いくつかの実施形態では、各アダプターはＴ塩基オーバーハングを含有し、アダプターをＡテール断片化ＤＮＡにライゲーションするための相補的オーバーハングを提供する。
アダプターライゲーションプロトコルは、他の方法よりも有利であることが知られている。例えば、アダプターライゲーションを使用して、シングルリード、ペアエンドリード、及びインデックスリードのための配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位の完全な相補体を生成することができる。いくつかの実施形態では、アダプターライゲーションは、インデックスタグ及びインデックスプライマー部位を付加するための追加のＰＣＲ工程の必要性を排除する。
いくつかの実施形態では、アダプターは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、配列決定関連配列、及びそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、「バーコード配列」は、試料を区別するために使用され得る配列を指す。本明細書で使用される場合、配列決定関連配列は、後の配列決定工程に関連する任意の配列であり得る。配列決定関連配列は、下流の配列決定工程を単純化するように作用し得る。例えば、配列決定関連配列は、他の点でアダプターを核酸断片にライゲーションする工程を介して組み込まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、特定の配列決定方法においてフローセルへの結合を容易にするために、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。
いくつかの実施形態では、アダプターは、ＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、ＵＭＩを含むアダプターは、断片の３’及び５’末端の両方にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、アダプターは、フォーク型アダプターであり得る。本明細書で使用される場合、「フォーク型アダプター」は、核酸の２つの鎖を含むアダプターを指し、２つの鎖はそれぞれ、他方の鎖に相補的である領域及び他方の鎖に相補的ではない領域を含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプター中の２つの鎖の核酸は、ライゲーションの前に一緒にアニーリングされ、アニーリングは、相補的領域に基づく。いくつかの実施形態では、相補的領域は、それぞれ１２ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の末端で両方の鎖にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の両端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、断片の対向する末端上のフォーク型アダプターは、異なっている。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、断片へのライゲーションを促進するために、その５’でリン酸化される。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、３’Ｔの直前にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、３’Ｔはオーバーハングである（すなわち、フォーク型アダプターの他方の鎖中のヌクレオチドと対形成していない）。いくつかの実施形態では、３’Ｔオーバーハングは、ライブラリ断片上に存在するＡテールと塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、３’Ｔオーバーハングのエキソヌクレアーゼ消化をブロックする。いくつかの実施形態では、部分的に相補的なプライマーを用いるＰＣＲは、末端を伸長し、フォークを分解するためのアダプターライゲーションの後に使用される。
いくつかの実施形態では、アダプターは、タグを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タグ」という用語は、所望の意図された目的又は用途のための配列を示すポリヌクレオチドの部分又はドメインを指す。タグドメインは、任意の所望の目的のために提供される任意の配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、タグドメインは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、クラスタ増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに好適な１つ以上の領域を含む。任意の他の好適な特徴がタグドメインに組み込まれ得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５ｂｐ～２００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、１０ｂｐ～１００ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、２０ｂｐ～５０ｂｐの長さを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、タグドメインは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００ｂｐの長さを有する配列を含む。
タグは、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、又はインデックスタグ配列）を含み得る。
いくつかの実施形態では、タグは、クラスタ増幅のための領域を含む。いくつかの実施形態では、タグは、配列決定反応をプライミングするための領域を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ポリメラーゼとタグの一部に対応する増幅プライマーとを反応させることによって、固体支持体上の断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、モザイク末端配列の全部又は一部の除去後に断片上にライゲーションされたアダプターの一部は、増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンのタグは、増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態では、タグは、Ａ１４プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、タグは、Ｂ１５プライマー配列を含む。
いくつかの実施形態では、個々のビーズ上のトランスポソームは、固有のインデックスを保持し、多数のそのようなインデックス付きビーズが用いられる場合、位相化された転写物が生じる。
ライブラリ断片上にライゲーションされるアダプターは、タグメンテーションの間に組み込まれるアダプターを超える利点を有し得る。例えば、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、ＰＣＲの前にユニーク配列タグで単一断片を標識することによって、高感度バリアント検出を可能にすることができる（Ｊｅｓｓｅ Ｊ．Ｓａｌｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（５）：２６９－８５（２０１８）を参照されたい）。ＴＳＯ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などのいくつかのライブラリ調製産物は、ＵＭＩ配列がライブラリ挿入物に隣接して組み込まれ、挿入リードの一部として同時配列決定を可能にするライゲーションベースのＵＭＩオファリングを含む。したがって、ｆＢＬＴの開発は、既存のライゲーションベースの産物が活用されることを可能にし（既存のアダプター及びプロトコルの使用など）、同時に、既存の濃縮ワークフロー及びオンボード配列決定プライマーとの適合性を可能にする。
Ｃ．ギャップ充填ライゲーション
いくつかの実施形態では、転位事象後に残ったＤＮＡ配列中のギャップはまた、鎖置換伸長反応を使用することにおいて充填することができ、そのようなものはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックスを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ充填ライゲーションは、伸長－ライゲーション混合緩衝液を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、転位事象後に残ったＤＮＡ配列中のギャップはまた、鎖置換伸長反応を使用することにおいて充填することができ、そのようなものはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックスを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ充填ライゲーションは、伸長－ライゲーション混合緩衝液を使用して行われる。
次いで、二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリは、任意選択的に増幅され得（クラスタ増幅を用いてなど）、配列決定プライマーを用いて配列決定され得る。
Ｄ．増幅
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生されるＤＮＡ断片（すなわち、ｃＤＮＡ断片）の増幅に関する。いくつかの実施形態では、表面結合トランスポソームによって産生される固定化ＤＮＡ断片は、当該技術分野で既知の任意の好適な増幅方法論に従って増幅され得る。いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ断片は、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こる同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的に配列決定工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
本開示は更に、本明細書に提供される方法に従って産生されるＤＮＡ断片（すなわち、ｃＤＮＡ断片）の増幅に関する。いくつかの実施形態では、表面結合トランスポソームによって産生される固定化ＤＮＡ断片は、当該技術分野で既知の任意の好適な増幅方法論に従って増幅され得る。いくつかの実施形態では、固定化されたＤＮＡ断片は、固体支持体上で増幅される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面結合タグメンテーションが起こる同じ固体支持体である。このような実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、試料調製物が、最初の試料導入工程から、増幅まで、及び任意選択的に配列決定工程まで、同じ固体支持体上で進行することを可能にする。
例えば、いくつかの実施形態では、固定化ＤＮＡ断片は、米国特許第７，９８５，５６５号及び第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスタ増幅方法論を使用して増幅され、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定化された核酸分子のクラスタ又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスタ又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスタ化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅｄ）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの実施形態では、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスタ増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法論を使用して、本明細書で提供される方法に従って産生された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを産生することもできる。例えば、１つ以上のクラスタ又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかにかかわらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
他の実施形態では、ＤＮＡ断片は、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、切断されるか、又は別の方法で固体支持体から遊離され、次いで増幅プライマーは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズされる。他の実施形態では、増幅プライマーを、１つ以上の初期の増幅工程のために固定化されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、その後溶液中での後続の増幅工程を行う。したがって、いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを産生することができる。
本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において一般に既知である増幅方法論のいずれも、固定化ＤＮＡ断片を増幅するために、ユニバーサル又は標的特異的プライマーとともに利用され得ることを理解されたい。増幅に適切な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）、転写増幅法（transcription mediated amplification、ＴＭＡ）及び核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence based amplification、ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定化ＤＮＡ断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。
ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる。）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０３２０３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０３３６７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０４３９１８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、及び国際公開第８９／０９８３５号、その全てが参照により組み込まれる）技術、を挙げることができる。これらの増幅方法論は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するように設計され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。関心対象の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に使用されるプライマーを含み得る。
本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅方法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲベースの方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片５’→３’エキソ－とともに使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０～２０ｋｂの長さの断片を産生することが可能になる。上記のように、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件、及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されるように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマーの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の第１のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡ上で多数の開始を可能にするために実施される。３’領域の性質により、開始部位は、ゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマーを除去し、定常５’領域に対して相補的であるプライマーを使用して、更なる複製を行うことができる。
いくつかの実施形態では、増幅は、１つ以上の二次アダプター配列を完全に二重鎖化された５’タグ付き標的断片に付加して、配列決定断片を形成する機能を有する。増幅は、標的断片を増幅し、二次アダプターキャリア（又はその相補体）を組み込むのに十分な条件下で、各末端にプライマー配列を含む完全に二重鎖化された５’タグ付き標的断片を、二次アダプターキャリア、単一のヌクレオチド、及びポリメラーゼとともにインキュベートすることによって達成され、当該二次アダプターキャリアは、プライマー配列及び二次アダプター配列に対する相補体を含む。
いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、プライマー配列、インデックス配列、バーコード配列、精製タグ、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、インデックス配列を含む。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、インデックス配列及びプライマー配列を含む。
いくつかの実施形態では、完全に二重鎖化された５’タグ付き標的断片は、各末端に異なるプライマー配列を含む。このような実施形態では、各二次アダプターキャリアは、２つのプライマー配列のうちの１つに対する相補体を含む。いくつかの実施形態では、２つのプライマー配列は、Ａ１４プライマー配列及びＢ１５プライマー配列である。
いくつかの実施形態では、複数の二次アダプターが増幅によって付加される。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、各々２つのプライマー配列のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、各々複数のインデックス配列のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、二次アダプターキャリアは、Ｐ５プライマー配列（配列番号１３）を有する二次アダプター、及びＰ７プライマー配列（配列番号１４）を有する二次アダプター、又はそれらの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定断片を、フローセルに付着させる。いくつかの実施形態では、配列決定断片を、フローセル又は表面にグラフトされた相補的プライマーにハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態では、配列決定断片の配列は、アレイ配列決定方法又は合成しながらの配列決定などの次世代配列決定方法によって検出される。
Ｐ５及びＰ７プライマーは、様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定するためにＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．が販売している市販のフローセルの表面に使用される。このようなプライマー配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されている。Ｐ５及びＰ７プライマーを例示するが、本明細書に提示される例では、任意の好適な増幅プライマーを使用できることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、方法の増幅工程は、ＰＣＲ又は等温増幅を含む。いくつかの実施形態では、方法の増幅工程は、ＰＣＲを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定は、増幅後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定前に行われない。多数の異なる配列決定方法が当業者に既知であり、例えば、米国特許第９，６８３，２３０号及び同第１０，９２０，２１９号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本方法は、二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅して、そのアンプリコンを調製することを含む。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、固相可逆的固定化精製に供される。
いくつかの実施形態では、プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることから、アンプリコンの精製までの総反応時間は、２時間以下、２．５時間以下、又は３時間以下である。
以下に記載されるように、増幅はまた、標的濃縮の一種として目的のライブラリ断片を濃縮するために行われ得る。
Ｅ．標的濃縮
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製は、目的の標的を含む断片（すなわち、標的ライブラリ断片）を濃縮するための１つ以上の工程で実施される。そのような方法は、ライブラリ内の関心の低いライブラリ断片の数を減少させることができる。このようにして、ユーザは、目的のものではないライブラリ断片の配列決定に関連する時間及びコストの浪費を低減することができる。
いくつかの実施形態では、ライブラリ調製は、目的の標的を含む断片（すなわち、標的ライブラリ断片）を濃縮するための１つ以上の工程で実施される。そのような方法は、ライブラリ内の関心の低いライブラリ断片の数を減少させることができる。このようにして、ユーザは、目的のものではないライブラリ断片の配列決定に関連する時間及びコストの浪費を低減することができる。
例えば、ユーザは、患者試料からライブラリ断片を調製し、配列決定することを望む場合があり、目的のライブラリ断片は、１つ以上の感染性疾患を引き起こす薬剤の核酸から生成されたものである。そのような実施形態では、患者試料は、患者自身の核酸から多くのライブラリ断片（すなわち、宿主からのライブラリ断片）を生成するが、これらはユーザにとって、目的のものではない。１つ以上の感染性疾患由来の配列を濃縮することによって、ユーザは、患者特異的配列を含むライブラリ断片（又はそのアンプリコン）の配列決定を減少させて、１つ以上の感染性疾患由来の配列を含むライブラリ断片（又はそのアンプリコン）のより深い配列決定を可能にすることができる。例えば、ユーザは、（ＣＯＶＩＤ－１９の存在又は非存在を決定するために、及び／又は特定のＣＯＶＩＤ－１９バリアントを評価するために）患者由来のＣＯＶＩＤ－１９関連配列を決定することを望む場合があり、患者（すなわち、宿主）由来の配列にほとんど関心がない場合がある。
いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ウイルス、細菌、寄生虫、又は真菌によって引き起こされる。
標的の濃縮は、ライブラリ調製及び下流工程内の種々の異なる工程で行ってもよい。いくつかの実施形態では、標的の濃縮は、ライブラリ調製方法における二本鎖ｃＤＮＡ断片の調製と同時に、又はその直後に行われる。いくつかの実施形態では、標的の濃縮は、二本鎖ｃＤＮＡ断片の調製後の増幅の間に行われる。
いくつかの実施形態では、二本鎖ｃＤＮＡ断片は、濃縮を用いて調製される。いくつかの実施形態では、濃縮は、ライブラリ調製におけるタグメンテーションの間又はその直後に行われる。いくつかの実施形態では、濃縮は、ハイブリッド捕捉を用いて行われる。ヒト感染性疾患に対するハイブリッド捕捉の利点及び適用は、周知である（例えば、Ｇａｕｄｉｎ ａｎｄ Ｄｅｓｎｕｅｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：Ａｒｔｉｃｌｅ ２９２４（２０１８）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ハイブリッド捕捉は、標的特異的ビオチン化プローブを用いて行われる。いくつかの実施形態では、標的特異的ビオチン化プローブは、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の感染性疾患は、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む。そのような濃縮ワークフローは、ＣＯＶＩＤ－１９などの呼吸器ウイルスについて記載されている。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ １２７０－２０２０－００２－Ａ（２０２０）に記載されるようなウイルス標的化パネルを組み込む。いくつかの実施形態では、ウイルス標的化パネルは、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏ Ｐａｎｅｌ（ＲＶＯＰ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）である。ＲＶＯＰの複数のバージョンが文献で知られている。図２６～図３０Ｂは、ＲＶＯＰ濃縮（バージョン１又はバージョン２のいずれか）を用いて行った実験に関するデータを示す。
標的の濃縮はまた、二本鎖ｃＤＮＡ断片の増幅の間に実施され得る。いくつかの実施形態では、ライブラリ調製の方法は、アンプリコンを調製するために二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅は、標的特異的プライマーを用いて行われる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の感染性疾患は、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む。
実施例１．ｄｓ－ｃＤＮＡ調製の等温方法の概要
等温方法を使用して、単一の等温反応においてＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡを調製することができる。この反応を実施する多くの異なる方法が提示され、ここで、類似の方法が、ＲＮＡ（例えば、ランダムヘキサマー）へのプライマーの結合後に実施される。プライマー結合後、以下の構成要素を含む反応ミックス（「マスターミックス」と呼ぶことができる）を添加することができる。
１．ｃＤＮＡの第１の鎖を形成するための逆転写酵素、
２．ＲＮＡをニッキングし、第２の鎖のｃＤＮＡ合成のためのプライミング部位を生成するためのＲＮＡｓｅ Ｈ、
３．第２の鎖のｃＤＮＡを生成するための、鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを有するＤＮＡポリメラーゼ、及び
４．逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの間で共有され、第１の鎖及び第２の鎖を生成するｄＮＴＰ。
等温方法を使用して、単一の等温反応においてＲＮＡからｄｓ－ｃＤＮＡを調製することができる。この反応を実施する多くの異なる方法が提示され、ここで、類似の方法が、ＲＮＡ（例えば、ランダムヘキサマー）へのプライマーの結合後に実施される。プライマー結合後、以下の構成要素を含む反応ミックス（「マスターミックス」と呼ぶことができる）を添加することができる。
１．ｃＤＮＡの第１の鎖を形成するための逆転写酵素、
２．ＲＮＡをニッキングし、第２の鎖のｃＤＮＡ合成のためのプライミング部位を生成するためのＲＮＡｓｅ Ｈ、
３．第２の鎖のｃＤＮＡを生成するための、鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを有するＤＮＡポリメラーゼ、及び
４．逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとの間で共有され、第１の鎖及び第２の鎖を生成するｄＮＴＰ。
このような方法は、第１の鎖及び第２の鎖のｃＤＮＡが単一の反応容器中で同時に生じるので、「単一工程」又は「１工程」法（すなわち、本発明の方法）と呼ばれ得る。単一工程の二本鎖ｃＤＮＡ合成を可能にする適切な配合物が必要とされ得る。この反応の仮説機構を図３に示す。
実施例２．中温性ｄｓ－ｃＤＮＡの調製方法
中温性ｄｓ－ｃＤＮＡの調製方法を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）製品の観点で評価した（ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ，Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃ １００００００１２４４３５ ｖ０２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０２０（「Ｄｏｃｕｍｅｎｔ １００００００１２４４３５」）を参照されたい）。基本実験では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌキットを用いて濃縮する、１０～１２ｎｇのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ＵＨＲ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＮ ７４００００）。いくつかの場合では、バクテリオファージＭＳ２（ＭＳ２、Ｒｏｃｈｅ ＰＮ １０１６５９４８００１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＣ＿００１４１７．２）由来の約３．５ｋｂのゲノムＲＮＡを対照物質として使用して、ライブラリ調製性能を評価した。以下に示すように、純粋なＵＨＲ、ＭＳ２、又はＵＨＲ及びＭＳ２ ＲＮＡの混合物（質量で８０％ＵＨＲ／２０％ＭＳ２）のいずれかを使用して、約１０～１２ｎｇの全ＲＮＡインプットを用いて、ライブラリを調製した。
中温性ｄｓ－ｃＤＮＡの調製方法を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）製品の観点で評価した（ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｌ）Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ，Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃ １００００００１２４４３５ ｖ０２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，２０２０（「Ｄｏｃｕｍｅｎｔ １００００００１２４４３５」）を参照されたい）。基本実験では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌキットを用いて濃縮する、１０～１２ｎｇのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ＵＨＲ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＮ ７４００００）。いくつかの場合では、バクテリオファージＭＳ２（ＭＳ２、Ｒｏｃｈｅ ＰＮ １０１６５９４８００１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＣ＿００１４１７．２）由来の約３．５ｋｂのゲノムＲＮＡを対照物質として使用して、ライブラリ調製性能を評価した。以下に示すように、純粋なＵＨＲ、ＭＳ２、又はＵＨＲ及びＭＳ２ ＲＮＡの混合物（質量で８０％ＵＨＲ／２０％ＭＳ２）のいずれかを使用して、約１０～１２ｎｇの全ＲＮＡインプットを用いて、ライブラリを調製した。
等体積の試料ＲＮＡ及びＥＰＨ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）緩衝液（各８．５μｌ）を混合し、５分間で６５℃まで加熱し、次いでサーマルサイクラ中で４℃まで冷却した。この工程は、ＥＰＨ３緩衝液に含まれるプライマーのＲＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にした。
プライマー結合インキュベーション後、３３μｌの約１．５×「単一工程」ｃＤＮＡ合成緩衝液（すなわち、ｃＤＮＡ合成マスターミックス）を１７μｌのＲＮＡ＋ＥＰＨ３ミックスに直接添加した。インキュベーション時間が性能にどのように影響するかを決定するために、単一工程配合物を１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、又は６０分間のいずれかでインキュベートした。単一工程のｃＤＮＡ合成反応は、図中で「本発明の方法」と称され得る。
ｃＤＮＡを、１２ｎｇの８０％ＵＨＲ／２０％ＭＳ２ ＲＮＡから、単一工程手順を使用して生成し、その後、ｅＢＬＴによるタグメンテーション、及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｄｏｃｕｍｅｎｔ １００００００１２４４３５（２０２０））に記載されるようにＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌキットパネルによる濃縮を行った。配列決定されたライブラリを、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌキットの一部として含まれる、ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｏｌｉｇｏｓによる濃縮を用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを使用して、１０ｎｇ又は１００ｎｇのＵＨＲから生成された類似のライブラリと比較した（ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃ １００００００００１６３２－ｖ０１（２０１６）を参照されたい）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｕｂ（ＢＳＳＨ）ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｐｐ ｖ．１．１．１を使用してデータを分析した。
Ａ．複製物リードのパーセンテージの分析
複製物リードのパーセンテージは、試料のライブラリへの変換の尺度である。複製物リードのパーセンテージはより低いことが好ましい。複製物に関して、結果は、単一工程法が、標準手順と同等又はそれよりも良好な性能を有することを示唆している（図４）。単一工程ワークフローでは、１０分～６０分のインキュベーション時間は、性能にほとんど影響を与えなかった。
複製物リードのパーセンテージは、試料のライブラリへの変換の尺度である。複製物リードのパーセンテージはより低いことが好ましい。複製物に関して、結果は、単一工程法が、標準手順と同等又はそれよりも良好な性能を有することを示唆している（図４）。単一工程ワークフローでは、１０分～６０分のインキュベーション時間は、性能にほとんど影響を与えなかった。
Ｂ．挿入サイズの分析。
モデルに従って予想されるように（図３）、本発明の単一工程法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを用いる標準的な手順よりも短いライブラリ断片を産生する（図５）。本発明の単一工程法で生成された約１５０～１７０ｂｐの挿入サイズ平均は、ほとんどのＲＮＡ－Ｓｅｑ適用に許容可能である。インキュベーション時間（１０分まで）は、単一工程ワークフローにおいて性能にほとんど影響を与えなかった。
モデルに従って予想されるように（図３）、本発明の単一工程法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを用いる標準的な手順よりも短いライブラリ断片を産生する（図５）。本発明の単一工程法で生成された約１５０～１７０ｂｐの挿入サイズ平均は、ほとんどのＲＮＡ－Ｓｅｑ適用に許容可能である。インキュベーション時間（１０分まで）は、単一工程ワークフローにおいて性能にほとんど影響を与えなかった。
Ｃ．カバレッジの中央値ＣＶ
カバレッジの中央値変動係数（ＣＶ）は、ライブラリ品質を反映しており、試料のライブラリへのより均一な変換は、より低いＣＶをもたらす。結果を表６に示す。インキュベーション時間は、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、及び６０分間のインキュベーションで測定されるように、単一工程ワークフローにほとんど影響を及ぼさなかった。
カバレッジの中央値変動係数（ＣＶ）は、ライブラリ品質を反映しており、試料のライブラリへのより均一な変換は、より低いＣＶをもたらす。結果を表６に示す。インキュベーション時間は、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、及び６０分間のインキュベーションで測定されるように、単一工程ワークフローにほとんど影響を及ぼさなかった。
Ｄ．遺伝子発現相関
ＲＮＡ－Ｓｅｑ産物の重要な特徴は、技術的複製物間の遺伝子発現推定の高い再現性である。遺伝子発現再現性は、２０分間の酵素インキュベーションのみを用いた単一工程法の技術的複製物について高い（図７Ａ、示される例示的なデータは、０．９９８のＲ２値を有する）。１０分間のインキュベーションでも同様の結果が得られた（図示せず）。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ産物の重要な特徴は、技術的複製物間の遺伝子発現推定の高い再現性である。遺伝子発現再現性は、２０分間の酵素インキュベーションのみを用いた単一工程法の技術的複製物について高い（図７Ａ、示される例示的なデータは、０．９９８のＲ２値を有する）。１０分間のインキュベーションでも同様の結果が得られた（図示せず）。
定量的アッセイとして、ＲＮＡ－Ｓｅｑは、プロトコル及び試薬の変化に対して非常に感受性である。驚くべきことではないが、単一工程法は、比較の一例において示されるように、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコルに対して、より低い相関を示す（図７Ｂ）。この交差手順比較は、１００万のマッピングされたリード当たりのキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ、配列決定深度及び遺伝子長について正規化するための尺度）のより低いＲ２値（０．８４６）を示すが、スピアマンρ（順位）は高く（ρ＝０．９３４）、このことは、単一工程法が定量的情報を保持することを示している。
標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃＤＮＡ手順、及び異なるインキュベーション時間を用いた単一工程ｃＤＮＡ法の両方を使用した複数ライブラリ調製にわたるＦＰＫＭ比較のＲ２値を比較する箱ひげ図は、各方法内で高い再現性を示し、予想通り、２つの方法間でより低い一致を示す（図８）。
Ｅ．ＭＳ２対照ＲＮＡのカバレッジ特徴
ＭＳ２ゲノムＲＮＡは、ヒトトランスクリプトミクス及び濃縮分析の複雑さを伴わずに、アッセイ性能を可視化し、分析することが容易であるため、代替的なライブラリ調製を探索する際に有用な鋳型である。ここで、ＭＳ２ゲノム内の塩基を、それらの生のリードカバレッジについて評価し、ＭＳ２ゲノムにわたるカバレッジのＣＶ及び実験にわたる比較のためのカバレッジのリード深度の正規化値の計算を可能にした。視覚的に、ＭＳ２のリードカバレッジは、標準プロトコルと単一工程プロトコルとの間で類似しているが（図９）、データは、単一工程プロトコルがわずかに高いカバレッジのＣＶを有することを示唆している（図１０及び表６）。
ＭＳ２ゲノムＲＮＡは、ヒトトランスクリプトミクス及び濃縮分析の複雑さを伴わずに、アッセイ性能を可視化し、分析することが容易であるため、代替的なライブラリ調製を探索する際に有用な鋳型である。ここで、ＭＳ２ゲノム内の塩基を、それらの生のリードカバレッジについて評価し、ＭＳ２ゲノムにわたるカバレッジのＣＶ及び実験にわたる比較のためのカバレッジのリード深度の正規化値の計算を可能にした。視覚的に、ＭＳ２のリードカバレッジは、標準プロトコルと単一工程プロトコルとの間で類似しているが（図９）、データは、単一工程プロトコルがわずかに高いカバレッジのＣＶを有することを示唆している（図１０及び表６）。
＊＊２つのライブラリは、１００％ＭＳ２であり、２つのライブラリは、８０％ＵＨＲ／２０％ＭＳ２混合物であった。インプットは、１０ｎｇ～１００ｎｇで変化した。
したがって、本発明の単一工程プロトコルは、より速い調製時間で十分なｃＤＮＡ品質を提供した。
実施例３．熱安定性ｄｓ－ｃＤＮＡの調製方法
二本鎖ｃＤＮＡの協調的合成はまた、それらの中温性対応物ではなく、熱安定性酵素から構成される代替配合物を使用して生じ得る（表２）。そのような配合物の熱安定性酵素は、熱安定性マスターミックスと称され得る。
二本鎖ｃＤＮＡの協調的合成はまた、それらの中温性対応物ではなく、熱安定性酵素から構成される代替配合物を使用して生じ得る（表２）。そのような配合物の熱安定性酵素は、熱安定性マスターミックスと称され得る。
等体積の試料ＲＮＡ及びＥＰＨ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）緩衝液（各８．５μｌ）を混合し、５分間で６５℃まで加熱し、次いでサーマルサイクラ中で４℃まで冷却した。この工程は、ＥＰＨ３緩衝液に含まれるプライマーのＲＮＡへのハイブリダイゼーションを可能にした。次いで、ハイブリダイズしたプライマーを有する１５μｌの反応物を、単一工程のｃＤＮＡ調製のために熱安定性酵素及び緩衝液構成要素に添加した。
熱安定性配合物を約５０℃で等温的に実施した。得られたｄｓ－ｃＤＮＡ結果のタグメンテーション、及びＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌによる濃縮（ＴｒｕＳｉｇｈｔ ＲＮＡ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃ １００００００００９１５５ ｖ００（２０１６）に記載されるような）は、品質ライブラリをもたらす（図１１）。図１１に示されるように、熱安定性配合物は、およそ２５０ｂｐの挿入サイズを産生し、これは、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ方法論を用いて産生された挿入サイズ（例えば、図５に示される、およそ２１０ｂｐ）と同様である。ライブラリは定量的であり、両方とも妥当な複製物間の技術的再現性を有し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを使用する方法との妥当な一致を有する（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。熱安定性配合物は、ＲＮＡ二次構造に関心があり、さもなければ３７℃で起こる第１の鎖のｃＤＮＡ合成を阻害し得る場合に好ましい場合がある。
この実験では、インキュベーションを６０分間行ったが、はるかに短いインキュベーション時間も可能である。更に、ＭＭＬＶ逆転写酵素をレトロトランスポゾンに由来する代替的な熱安定性逆転写酵素で置き換えることにより、性能及びアッセイ速度を改善し得る。
実施例４．２工程対１ポットｃＤＮＡ調製の要約。
図１３は、代表的な１ポットタグメンテーションプロトコルの概要を提供する。代表的な２工程及び１工程のｃＤＮＡ調製プロトコルを図１４Ａに示すが、ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するためにいずれかのプロトコルにＢＬＴを加える選択肢がある。図１４Ｂは、１工程ｃＤＮＡ調製プロトコル（本明細書では本発明の方法とも呼ばれる）がどのように反応時間をおよそ１時間短縮し、複数の温度変化も回避するかの概要を強調する。ＳＴ２（タグメンテーション停止緩衝液）は、ユーザがｃＤＮＡを調製することのみを望む場合には必要とされないが、ＢＬＴがライブラリ調製のために図１４Ｂに概説されるプロトコルに含まれる場合、タグメンテーションを停止するために使用することができるので、含まれる。
図１３は、代表的な１ポットタグメンテーションプロトコルの概要を提供する。代表的な２工程及び１工程のｃＤＮＡ調製プロトコルを図１４Ａに示すが、ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するためにいずれかのプロトコルにＢＬＴを加える選択肢がある。図１４Ｂは、１工程ｃＤＮＡ調製プロトコル（本明細書では本発明の方法とも呼ばれる）がどのように反応時間をおよそ１時間短縮し、複数の温度変化も回避するかの概要を強調する。ＳＴ２（タグメンテーション停止緩衝液）は、ユーザがｃＤＮＡを調製することのみを望む場合には必要とされないが、ＢＬＴがライブラリ調製のために図１４Ｂに概説されるプロトコルに含まれる場合、タグメンテーションを停止するために使用することができるので、含まれる。
図１４Ｃは、２工程ｃＤＮＡ調製とそれに続く別個のタグメンテーションの現在の方法のためのプロトコルを、１工程ｃＤＮＡ（すなわち、本発明の方法）とそれに続く別個のタグメンテーションのための、又はｃＤＮＡとライブラリ調製を組み合わせた１ポットライブラリ調製のための更に短いプロトコルとともに示す。１ポットライブラリは、現在の方法と比較して、１時間節約することができる。
ｃＤＮＡ収率を比較するために、１ポット又は２工程ｃＤＮＡプロトコルで調製したｃＤＮＡを、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズで精製し、溶出した。図４に示されるように、本発明（１工程）及び２工程（標準）プロトコルの両方でｃＤＮＡが得られた。
実施例５．別個のタグメンテーションを用いた方法に対する、１ポットライブラリ調製の比較
図１４Ｃに要約した様々な異なるライブラリ調製プロトコルを評価した。
図１４Ｃに要約した様々な異なるライブラリ調製プロトコルを評価した。
実験は、１０ｎｇのインプットＲＮＡ（ｒＲＮＡ枯渇なし）を用いた２工程ｃＤＮＡ調製後にＢＬＴを用いて生成された断片を評価した。これらの結果は、ＢＬＴが、２工程ｃＤＮＡ調製後におよそ３２５塩基対のサイズを有する断片を首尾よく生成することを示した（図１５）。
１ポットライブラリ調製は、ＲＮＡを含む出発試料からの二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリの調製を可能にした。このプロトコルでは、ＲＮＡを含む試料を、プライマー（ＥＰＨ３）を含むミックスと混合した。この反応ミックス（総体積１７μｌ）は、以下の通りであった。
・７．５μｌのヌクレアーゼフリー水
・１μｌの１０ｎｇ／μｌ ＵＨＲ全ＲＮＡ
・８．５μｌのＥＰＨ３。
・７．５μｌのヌクレアーゼフリー水
・１μｌの１０ｎｇ／μｌ ＵＨＲ全ＲＮＡ
・８．５μｌのＥＰＨ３。
反応ミックスを加熱蓋付きサーモサイクラに入れ、反応物を５分間で６５℃まで加熱し、続いて４℃で保持した。
プレートをサーモサイクラから取り出し、３３μｌの１ポットマスターミックスを添加して、５０μｌの総体積を生成した。１ポットマスターミックスは、ＢＬＴとともに、セクションＩ．Ｃで論じた範囲の酵素単位のバランスを含んでいた。使用した１ポットマスターミックス中の酵素は、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（０．０４Ｕ／μｌ～０．３７Ｕ／μｌの範囲内）、ＲＮＡｓｅ Ｈ（０．００４Ｕ／μｌ～０．０４Ｕ／μｌの範囲内）、及びＰｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（０．３２Ｕ／μｌ～４．８Ｕ／μｌの範囲内）であった。反応物をよく混合した。
合計１０μｌのＢＬＴ（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００２４５９４）をプレートのウェルに等分した。プレートをスピンダウンして、ウェルの底部でＢＬＴを収集した。次いで、プレートを磁石上におよそ２分間置いた。次に、およそ１０μｌの上清を除去した。この工程は、ＢＬＴとともに供給された緩衝液を除去した。
次いで、ＢＬＴを、１ポットマスターミックスとともに５０μｌの試料で再懸濁した。このプレートを、加熱蓋を４５℃に設定したサーモサイクラ中、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１０μｌのＳＴ２緩衝液を添加して、タグメンテーション反応を停止させた。プレートを室温でおよそ５分間放置した。次いで、プレートを磁石上に２分間置き、その後、上清を除去し、廃棄した。ビーズを１００μｌのＴＷＢ洗浄緩衝液で再懸濁した。ＴＷＢでの洗浄を合計３回繰り返し、次いで過剰のＴＷＢを除去した。
次いで、ＰＣＲを行った。各試料に、２０μｌのエンハンスドＰＣＲミックス（ＥＰＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）緩衝液及び２０μｌのヌクレアーゼフリー水を添加した。次いで、１０μｌのユニークデュアルインデックスＰＣＲプライマーを添加した（総体積５０μｌ）。プレートをサーモサイクラに入れ、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の１５サイクルで増幅させた。
試料を８１μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ（ＩＰＢ）で精製した。ＤＮＡを、３０μｌの再懸濁緩衝液（ＲＳＢ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてビーズから溶出させた。Ｑｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ライブラリ収率を定量化した。
異なるプロトコル条件からの結果を図１６Ａ～図１６Ｄに示す。１ポットライブラリ調製（１ポットのｃＤＮＡ及びタグメンテーション反応の組み合わせ、図１６Ｃ）は、別個のタグメンテーションを用いた２工程ｃＤＮＡ調製（図１６Ａ）及び別個のタグメンテーションを用いた１ポットｃＤＮＡ調製（図１６Ｂ）と同様の結果をもたらした。異なるプロトコルによる結果の比較を図１６Ｄに要約する。要約すると、１ポットライブラリ調製は、他の試験されたプロトコルと比較して、有意に迅速かつ単純なプロトコルで同様のライブラリ収率をもたらした。
図１７Ａは、１００ｎｇのＵＨＲ及び１ポットライブラリ調製（単一反応におけるｃＤＮＡ調製及びタグメンテーションを含む）を用いた結果を示す。比較すると、図１７Ｂは、鋳型なし対照（ＮＴＣ、出発ＲＮＡなし）の結果を示し、図１７Ｃは、逆転写酵素（ＲＴ）を欠く対照の結果を示す。これらの結果は、１ポットライブラリの結果が、二本鎖ｃＤＮＡの首尾よい調製及びこのｃＤＮＡのタグメンテーションに基づくことを示す。
１００ｎｇのＲＮＡを含む出発試料（図１８Ａ）及び１０ｎｇのＲＮＡを含む出発試料（図１８Ｂ）の両方について、ＢＬＴはライブラリ断片を首尾よく調製した。
実施例６．ｒＲＮＡの枯渇を伴うライブラリ調製の評価
実験は、プライマー結合の前にＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔの標準条件を使用して、ｒＲＮＡの枯渇を伴うＢＬＴを使用して、異なるライブラリ調製を評価した。１００ｎｇの試料について、１３サイクルのＰＣＲを使用した。１０ｎｇの試料について、１５サイクルのＰＣＲを使用した。
実験は、プライマー結合の前にＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔの標準条件を使用して、ｒＲＮＡの枯渇を伴うＢＬＴを使用して、異なるライブラリ調製を評価した。１００ｎｇの試料について、１３サイクルのＰＣＲを使用した。１０ｎｇの試料について、１５サイクルのＰＣＲを使用した。
ｒＲＮＡの枯渇を用いた実験の結果を図１９Ａ～図１９Ｂに示す。１ポットライブラリ調製での収率は、他の調製での収率よりも低かったが、これは、ｒＲＮＡの枯渇後の出発ＲＮＡの量が比較的少ないことに起因する可能性がある。逆転写酵素を含まない対照実験（Ｎｏ ＲＶＴ）は、ライブラリ収率を示さなかった。
アラインメント及び一般的な性能尺度を図２０Ａ～図２０Ｃに示す。アラインメントのパーセンテージは、全ておよそ９４～９５％であった（図２０Ａ）。カバレッジの変動係数中央値（ＣＶ中央値）及び重複物パーセンテージは、別個のタグメンテーション反応を用いたプロトコルと比較して、１ポットライブラリ調製について、より高かった（図２０Ｂ及び図２０Ｃ）。これらの結果は、他の条件と比較して、１ポットライブラリ調製を用いたタグメンテーションの比較的低い効率を示し得る。存在パーセンテージは、全ての調製について、およそ１～２％であった（データは示さず）。
挿入長及びアラインメント分布は、全てのライブラリ調製について同様であった（図２１Ａ～図２１Ｂ）。更に、遺伝子発現相関は、１００ｎｇ（図２２Ａ）及び１０ｎｇ（図２２Ｂ）の両方の出発材料を用いた、対照ライブラリ調製（すなわち、別個のタグメンテーションを用いた２工程ｃＤＮＡ調製）と１ポットライブラリ調製との間で良好であった。遺伝子発現相関はまた、１ポットライブラリ調製を、別個のタグメンテーションを用いた１ポットｃＤＮＡプロトコルと比較した場合にも、良好であった（図２２Ｃ）。
別個のタグメンテーションを用いた２工程ｃＤＮＡ調製物に対して、１ポットライブラリ調製を用いた発現において比較的大きな差異を有するいくつかの外れ値遺伝子を表７に列挙する。しかしながら、これらの遺伝子は、全ライブラリのうちの少量のみを表す。
１０×カバレッジ（１８００万リード）で検出された遺伝子の数は、１０ｎｇの出発ＲＮＡを用いた１ポットライブラリ調製プロトコルでは低かったが、１００ｎｇの出発ＲＮＡを用いた場合には差がなかった（図２３）。これらの結果は、１ポットライブラリ調製が、より低いインプット範囲で比較的非効率的なタグメンテーションをもたらし得ることを示す。リード分布は、全ての条件について正常であり、ライブラリ調製において５’又は３’バイアスがないことを示唆している（図２４）。
これらの結果は、タグメンテーション効率が、１ポットライブラリ調製の収率を決定する際の制限因子であり得ることを示す。
タグメンテーション効率を改善する効果を試験するために、ほぼ２倍の量のＭｇＣｌ２（標準的な４．３ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して８．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いる条件を使用して、ＲＮＡ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ及びＲｉｂｏ－Ｚｅｒｏ Ｐｌｕｓ ｒＲＮＡ枯渇キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて反応を行い、これらの条件は、収率を改善した（データは示さず）。これらの結果は、より高いマグネシウム濃度を有する１ポットライブラリ調製組成物が、おそらくトランスポザーゼ効率を増加させることによって、ライブラリ断片の収率を増加させることができることを示す。
同様に、１ポットライブラリ調製のための反応インキュベーションの終わりに温度を上昇させることで、より高いライブラリ収率を生じ得る。５５℃がＴｎ５の最適温度であることが知られているので、より高い反応温度は、トランスポザーゼ活性を増加させ得る。
実施例７．１ポットライブラリ調製条件の最適化
結果（実施例５に記載されるような）は、同時ｃＤＮＡ合成及びタグメンテーションを用いる１ポットライブラリ調製が、強固なライブラリを強固に生成し得ることを示した。次に、（図２５に示されるように）ライブラリ調製時間及びハンズオン工程を減少させるその能力を考慮して、１ポットライブラリ調製によるタグメンテーション効率を増加させることを試みるためのプロトコル改変に焦点を当てて、ライブラリ収率を潜在的に改善するために、様々な異なる条件を評価した。しかしながら、多くの用途（濃縮を伴うライブラリ調製など）では、１ポットプロトコルによるライブラリ調製効率の潜在的な低下は、配列決定などの下流工程に影響を与えない可能性が高いことに留意すべきである。
結果（実施例５に記載されるような）は、同時ｃＤＮＡ合成及びタグメンテーションを用いる１ポットライブラリ調製が、強固なライブラリを強固に生成し得ることを示した。次に、（図２５に示されるように）ライブラリ調製時間及びハンズオン工程を減少させるその能力を考慮して、１ポットライブラリ調製によるタグメンテーション効率を増加させることを試みるためのプロトコル改変に焦点を当てて、ライブラリ収率を潜在的に改善するために、様々な異なる条件を評価した。しかしながら、多くの用途（濃縮を伴うライブラリ調製など）では、１ポットプロトコルによるライブラリ調製効率の潜在的な低下は、配列決定などの下流工程に影響を与えない可能性が高いことに留意すべきである。
濃縮実験を、合成対照とともに「宿主ＲＮＡ」として１０ｎｇのＵＨＲを使用して、様々な異なるプロトコルで行った。合成対照（「Ｔｗｉｓｔ」）は、ＵＨＲ試料にスパイクされた０、１ｋ、１０、又は１００ｋのＴｗｉｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であった。濃縮は、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｓ Ｐａｎｅｌ Ｖ１（ＲＶＯＰ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。図２６に示すデータのプロトコルは、以下を含んでいた。
・濃縮を伴う標準的なライブラリ調製（ＬＰ）（すなわち、２工程ｃＤＮＡ調製後、対照としてのタグメンテーション、ＳｔｄＬＰ）。
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間（４ｍＭのＭｇ２＋）－実施例５に概説した条件（１ポット）
・１ポットＬＰ：３７℃で４５分間続いて５５℃で１５分間（５５Ｃ）
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間、Ｍｇ２＋を最終の８ｍＭまで増加させる（Ｍｇ）
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間、添加ＳＴ２（ＳＤＳを含むタグメンテーション停止溶液）及び洗浄を省く（ＮｏＳＴ２）。
・濃縮を伴う標準的なライブラリ調製（ＬＰ）（すなわち、２工程ｃＤＮＡ調製後、対照としてのタグメンテーション、ＳｔｄＬＰ）。
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間（４ｍＭのＭｇ２＋）－実施例５に概説した条件（１ポット）
・１ポットＬＰ：３７℃で４５分間続いて５５℃で１５分間（５５Ｃ）
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間、Ｍｇ２＋を最終の８ｍＭまで増加させる（Ｍｇ）
・１ポットＬＰ：３７℃で１時間、添加ＳＴ２（ＳＤＳを含むタグメンテーション停止溶液）及び洗浄を省く（ＮｏＳＴ２）。
図２６の結果は、標準ＬＰ（ＳｔｄＬＰ群）が最良の収率を有していたことを示す。５５℃でのインキュベーションの追加（５５Ｃ群）又は追加のＭｇ２＋（Ｍｇ）は、元の１ポットＬＰプロトコル（１ポット）よりも収率を改善した。ＳＤＳ及び洗浄を省くこと（ＮｏＳＴ２）は、収率に有害であった。
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｓ Ｐａｎｅｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ １（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて１００万個のリードにおけるＴｗｉｓｔ対照のカバレッジ中央値を決定することによってもカバレッジを評価した（図２７）。１ポットライブラリ調製プロトコルは、一般に、標準的なライブラリ調製プロトコルほど良好に機能しなかったが、追加のＭｇ２＋の添加（８ｍＭの最終濃度まで）は、１ポットライブラリ調製の性能に対して有意な増強を与えた。活性の最大の増加は、Ｍｇ２＋濃度の増加に起因するようであり、ＳＤＳ及び洗浄を省いた後に見られた場合には、カバレッジがほとんどない（図２７のＮｏＳＴ２試料）。一般に、標的の濃縮が、ライブラリ調製の間に行われる場合、ユーザは、濃縮されていないライブラリに関して、所望の標的配列の高いカバレッジを必要としない場合がある。したがって、図２７に示されるカバレッジは、多くの種類の配列決定分析に十分であり得る。
次に、１ポットライブラリ調製の性能を増強し得る条件を組み合わせるために実験を行った（図２８）。試験群は、５５℃及び８ｍＭ Ｍｇ２＋濃度でのインキュベーションを有するいくつかの組み合わせプロトコルを含み、組み合わせプロトコルは、４ｍＭ Ｍｇ２＋を用いた３７℃での１ポットＬＰよりも高いライブラリ収率を有していた。
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｓ Ｐａｎｅｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ １（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（図２７）と比較して、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｏｌｉｇｏｓ Ｐａｎｅｌ Ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（図２９）での濃縮により、より良好なカバレッジが見られた。５５℃で１５分間のインキュベーションを含む方法は、一般に、３７℃でのインキュベーションよりも良好な結果を有したが、全ての反応が８ｍＭのＭｇ２＋濃度を有していた場合、インキュベーションの異なる時間についての結果の間にほとんど差がなかった（図２９）。これらのデータは、ライブラリ調製がわずか３０分（例えば、３７℃で１５分及び５５℃で１５分）で実施され得ることを示す。
１０ｎｇのＵＨＲを有する試料のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）枯渇試料についても、ライブラリ調製条件を調査した。異なるライブラリ調製条件は、以下の通りであった。
・３７℃で１時間
・３７℃でのインキュベーション後、５５℃で１５分間又は３０分間
・追加のＭｇ２＋条件（８ｍＭ）
・３７℃で１時間
・３７℃でのインキュベーション後、５５℃で１５分間又は３０分間
・追加のＭｇ２＋条件（８ｍＭ）
図３０Ａは、８ｍＭのＭｇ２＋で５５℃で１５分（３７１５）又は３０分（３７３０）のインキュベーションを追加することが、４ｍＭのＭｇ２＋を用いた３７℃で１時間の標準的な１ポットライブラリ調製と比較して、複製物のパーセンテージを劇的に減少させたことを示す。例えば、複製物は、４ｍＭのＭｇ２＋中、３７℃で１時間の１ポットライブラリ調製についてのおよそ５０％から、８ｍＭのＭｇ２＋中、３７℃で１時間の全反応実行後、５５℃で１５分間（３７１５）又は３０分間（３７３０）のインキュベーションによる１ポットライブラリ調製についてのおよそ６％まで低下した。
異なるライブラリ調製後に検出された遺伝子の数も評価した（図３０Ｂ）。標準的な１ポットライブラリ調製条件下（４ｍＭのＭｇ２＋、３７℃で１時間）では、標準的な２工程ｃＤＮＡ調製後のタグメンテーション（２ｓｔ）と比較して、およそ２２００少ない遺伝子が検出された。しかしながら、３７１５及び３７３０プロトコルでは、２ｓｔプロトコルと比較して、およそ７５０個少ない遺伝子しか検出されなかった。したがって、５５℃インキュベーション及びより高いＭｇ２＋濃度を用いたプロトコルは、標準的な２工程ｃＤＮＡ調製後のタグメンテーションプロトコルと比較して、１ポットプロトコルについて検出された最大数の遺伝子を示した。
したがって、重複物及び検出された遺伝子の数の測定のために、５５℃インキュベーション及びより高いＭｇ２＋濃度（８ｍＭなど）を組み込むことによって、１ポットプロトコルを改善した。これらの改善は、ｒＲＮＡ枯渇試料及び濃縮試料の両方について、これらの条件で見られた。これらの結果は、タグメンテーション効率が、１ポットプロトコルについてのライブラリ収率についての制限工程であることを示し得る。
ユーザが所与の試料のライブラリ調製について最大収率を必要としない場合、１ポットプロトコルは、ライブラリ調製のための合計３０分までのそれらのより短い時間のために好まれ得る。更に、ユーザはまた、ハンズオン工程の数を低減するために１ポットプロトコルを好む場合がある。例えば、１ポットプロトコルは、（図２５に示されるように）ｃＤＮＡ合成とタグメンテーションとの間のＳＰＲＩビーズによるクリーンアップ工程を省略することができる。１ポットプロトコルはまた、試料ピペット操作を必要とする工程に固有の試料損失を排除することができる。
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。
Claims (201)
- 等温反応によってＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製するための組成物であって
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、を含む、組成物。 - 前記逆転写酵素の活性が、前記ＲＮＡニッカーゼの活性よりも大きい、請求項１に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素及び前記ＲＮＡニッカーゼが単一の酵素に含まれる、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素及び前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を有する単一の酵素に含まれる、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記単一の酵素が、前記逆転写酵素と前記ＤＮＡポリメラーゼとの間の競合を減少させる、請求項４に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼであり、任意選択的に、前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡｓｅ ＨがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素、前記ＲＮＡニッカーゼ、及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼが、中温性酵素である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記中温性酵素が３７℃～４９℃で活性を有する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記中温性酵素が３７℃で活性を有する、請求項１３に記載の組成物。
- 中温性の前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
- 中温性の前記ＲＮＡニッカーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の組成物。
- 中温性の前記ポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素、前記ＲＮＡニッカーゼ、及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性酵素である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記熱安定性酵素が５０℃～７２℃で活性を有する、請求項１８に記載の組成物。
- 前記熱安定性酵素が５０℃で活性を有する、請求項１９に記載の組成物。
- 熱安定性の前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアント、又はレトロトランスポゾンに由来する熱安定性逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
- 熱安定性の前記ＲＮＡニッカーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
- 熱安定性の前記ＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡが、前記二本鎖ｃＤＮＡを調製する前にプライマーに結合される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＤＴＴ、ＢＳＡ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＫＣｌ、及び／又はＭｇＣｌ２から選択される１つ以上の添加剤を更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記逆転写酵素及び／又はＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌと比較して、より低い単位／μｌの前記ＲＮＡニッカーゼを有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＲＮＡニッカーゼ阻害剤を更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡニッカーゼ阻害剤が、前記ＲＮＡニッカーゼの活性を低下させる、請求項２７に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの単位／μｌが重複する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が、前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼの活性よりも２倍～１００倍高い、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記逆転写酵素の活性が、前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼの活性よりも１０倍～１，０００倍高い、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記逆転写酵素活性が０．３２Ｕ／μｌ～４．８Ｕ／μｌである、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が０．０４Ｕ／μｌ～０．３７Ｕ／μｌである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼ活性が０．００４Ｕ／μｌ～０．０４Ｕ／μｌである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼ活性が０．０４Ｕ／μｌより大きい、請求項１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ＲＮＡニッカーゼ活性が０．０５Ｕ／μｌ～０．３Ｕ／μｌである、請求項３５に記載の組成物。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製する方法であって、
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、前記プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．前記試料を請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物と合わせ、等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、を含む、方法。 - 前記プライマーがランダマープライマーを含む、請求項３７に記載の方法。
- 前記プライマーが、前記ＲＮＡに含まれる配列に特異的に結合するプライマーを含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
- 前記プライマーがヘキサマープライマーを含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーが、前記プライマーによって結合された前記ＲＮＡを、ＲＮＡニッカーゼによる切断に対して耐性にする、請求項４１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈであり、前記プライマーによって結合された前記ＲＮＡが、ＲＮＡｓｅ Ｈによる切断に耐性である、請求項４２に記載の方法。
- 前記化学修飾されたヌクレオチドが、メチルホスホネート残基を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖を産生する、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの鎖を含むＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する、請求項４５に記載の方法。
- 前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中の前記ＲＮＡ鎖をニッキングし、ＲＮＡ断片を産生する、請求項４６に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＲＮＡ断片からプライミングすることによってＤＮＡの第２の鎖を伸長させる、請求項４７に記載の方法。
- 前記ＲＮＡニッカーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼの５’－３’活性が、前記ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡオーバーハングを除去する、請求項４７又は４８に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性が平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
- ｄＮＴＰが、前記逆転写酵素及び前記ＤＮＡポリメラーゼの両方によって使用される、請求項３７～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記等温反応が、３０℃～４９℃の温度である、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記等温反応が、３７℃の温度である、請求項５２に記載の方法。
- 前記等温反応が、５０℃～７２℃の温度である、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記等温反応が、５０℃の温度である、請求項５４に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、５０℃未満の温度で第１の鎖の合成を正常に阻害する二次構造を示す、請求項５４又は５５に記載の方法。
- 前記逆転写酵素による前記ｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度が、前記ＲＮＡニッカーゼによる前記ＲＮＡのニッキング速度よりも大きい、請求項３７～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素の活性が、前記ＲＮＡニッカーゼの活性を超える、請求項５７に記載の方法。
- 前記等温反応が、６０分以下、４５分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、又は１０分以下にわたってインキュベートされる、請求項３７～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記等温反応が、１５分間以下にわたってインキュベートされる、請求項５９に記載の方法。
- 少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、又は少なくとも６０分間のインキュベーションが、ライブラリ調製のための二本鎖ｃＤＮＡを与える、請求項３７～６０のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーを、前記ＲＮＡを含む試料と合わせる前に、前記ＲＮＡを含む試料を用いて、オフターゲットＲＮＡの枯渇又はｍＲＮＡの濃縮を行うことを更に含む、請求項３７～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オフターゲットＲＮＡがリボソームＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡの濃縮が、ポリＴプライマーを用いた増幅又は捕捉ビーズへのｍＲＮＡの結合を含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
- 前記捕捉ビーズが、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面を含む、請求項６４に記載の方法。
- ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製するための組成物であって、
ａ．逆転写酵素と、
ｂ．ＲＮＡニッカーゼと、
ｃ．鎖置換活性又は５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
ｄ．ｄＮＴＰと、
ｅ．トランスポソーム複合体であって、前記トランスポソーム複合体が
ｉ．トランスポザーゼ、
ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む第１のトランスポゾン、及び
ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列に対して完全に又は部分的に相補的である配列を含む第２のトランスポゾン、を含む、トランスポソーム複合体と、を含む、組成物。 - 前記組成物がＭｇ２＋を更に含む、請求項６６に記載の組成物。
- 前記Ｍｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に、前記Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に、前記Ｍｇ２＋濃度が８ｍＭである、請求項６７に記載の組成物。
- 前記ライブラリが等温反応によって調製される、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡが、前記ライブラリを調製する前にプライマーに結合される、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記トランスポソーム複合体が、固体支持体に固定化されている、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記固体支持体がビーズである、請求項７１に記載の組成物。
- 前記第１のトランスポゾンが親和性エレメントを含む、請求項７１又は７２に記載の組成物。
- 前記親和性エレメントが、前記第１のトランスポゾンの５’末端に結合されている、請求項７３に記載の組成物。
- 前記第１のトランスポゾンがリンカーを含む、請求項７１又は７２に記載の組成物。
- 前記リンカーが、前記第１のトランスポゾンの５’末端に結合された第１の末端と、親和性エレメントに結合された第２の末端とを有する、請求項７５に記載の組成物。
- 前記第２のトランスポゾンが親和性エレメントを含む、請求項７１又は７２に記載の組成物。
- 前記親和性エレメントが、前記第２のトランスポゾンの３’末端に結合されている、請求項７７に記載の組成物。
- 前記第２のトランスポゾンがリンカーを含む、請求項７１又は７２に記載の組成物。
- 前記リンカーが、前記第２のトランスポゾンの３’末端に結合された第１の末端と、親和性エレメントに結合された第２の末端とを有する、請求項７９に記載の組成物。
- 前記親和性エレメントがビオチン又は二重ビオチンである、請求項７３～７４、７６～７８、又は８０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記トランスポソーム複合体が、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、又は１０６個の複合体の密度で前記固体支持体上に存在する、請求項６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第１のトランスポゾンが、１つ以上のアダプター配列を更に含む、請求項６６～８２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第１のトランスポゾンが、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む、請求項８３に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｔｎ５トランスポザーゼが、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項８５に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素の活性が、前記ＲＮＡニッカーゼの活性よりも大きい、請求項６６～８６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素及び前記ＲＮＡニッカーゼが単一の酵素に含まれる、請求項６６～８７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素及び前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方を有する単一の酵素に含まれる、請求項６６～８８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記単一の酵素が、前記逆転写酵素と前記ＤＮＡポリメラーゼとの間の競合を減少させる、請求項８９に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項６６～９０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項６６～９１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼであり、任意選択的に、前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素、レトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項６６～９２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項６６～９３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項６６～９４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素、前記ＲＮＡニッカーゼ、及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼが、中温性酵素である、請求項６６～９５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記中温性酵素が３７℃～４９℃で活性を有する、請求項９６に記載の組成物。
- 前記中温性酵素が３７℃で活性を有する、請求項９７に記載の組成物。
- 中温性の前記逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項９６～９８のいずれか一項に記載の組成物。
- 中温性の前記ＲＮＡニッカーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項９６～９９のいずれか一項に記載の組成物。
- 中温性の前記ポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項９６～１００のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素、前記ＲＮＡニッカーゼ、及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性酵素である、請求項６６～９５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記熱安定性酵素が５０℃～７２℃で活性を有する、請求項１０２に記載の組成物。
- 前記熱安定性酵素が５０℃で活性を有する、請求項１０３に記載の組成物。
- 熱安定性の前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素の熱安定性バリアント、又はレトロトランスポゾンに由来する熱安定性逆転写酵素、又はグループＩＩイントロン逆転写酵素である、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の組成物。
- 熱安定性の前記ＲＮＡニッカーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の組成物。
- 熱安定性の前記ＤＮＡポリメラーゼがＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
- （１）前記逆転写酵素、前記ＲＮＡニッカーゼ、及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性酵素であり、かつ（２）前記Ｍｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に前記Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に前記Ｍｇ２＋濃度が８ｍＭである、請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の組成物。
- 二本鎖ｃＤＮＡ断片のライブラリを調製する方法であって、
ａ．プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせ、前記プライマーをＲＮＡに結合させることと、
ｂ．前記試料を請求項６６～１０８のいずれか一項に記載の組成物と合わせ、（ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製し、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することと、を含む、方法。 - 等温反応による二本鎖ｃＤＮＡの調製と二本鎖ｃＤＮＡ断片の調製との間に、固相可逆的固定化精製を行わない、請求項１０９に記載の方法。
- 前記プライマーを試料と合わせることと、前記試料を請求項６６～１０８のいずれか一項に記載の組成物と合わせることが、同じ工程で行われる、請求項１１０に記載の方法。
- （ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、単一の等温反応によって行われる、請求項１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- （ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが異なる温度で行われる、請求項１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、単一の反応容器中で行われる、請求項１０９～１１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、前記ＲＮＡを含む試料を、溶出液、プライマー、及び断片化ミックスと混合することを含む、請求項１０９～１１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、５５℃以上で行われる、請求項１０９～１１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることが、６５℃で行われる、請求項１０９～１１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーがランダマープライマーを含む、請求項１０９～１１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、前記ＲＮＡに含まれる配列に特異的に結合するプライマーを含む、請求項１０９～１１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーがヘキサマープライマーを含む、請求項１０９～１１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーを含む、請求項１０９～１２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化学修飾されたヌクレオチドを含むプライマーが、前記プライマーによって結合された前記ＲＮＡを、ＲＮＡニッカーゼによる切断に対して耐性にする、請求項１２１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡニッカーゼがＲＮＡｓｅ Ｈであり、前記プライマーによって結合された前記ＲＮＡが、ＲＮＡｓｅ Ｈによる切断に耐性である、請求項１２２に記載の方法。
- 前記化学修飾されたヌクレオチドが、メチルホスホネート残基を含む、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、ｃＤＮＡの第１の鎖を産生する、請求項１０９～１２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの鎖を含むＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を産生する、請求項１２５に記載の方法。
- 前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、前記ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中の前記ＲＮＡ鎖をニッキングし、ＲＮＡ断片を産生する、請求項１２６に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＲＮＡ断片からプライミングすることによってＤＮＡの第２の鎖を伸長させる、請求項１２７に記載の方法。
- 前記ＲＮＡニッカーゼ及び／又は前記ＤＮＡポリメラーゼの５’－３’活性が、前記ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡオーバーハングを除去する、請求項１２７又は１２８に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’－３’及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性が平滑末端二本鎖ｃＤＮＡを産生する、請求項１０９～１２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｄＮＴＰが、前記逆転写酵素及び前記ＤＮＡポリメラーゼの両方によって使用される、請求項１０９～１３０のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製するための前記等温反応が、３０℃～４９℃の温度である、請求項１０９～１３１のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製するための前記等温反応が、３７℃以上の温度である、請求項１３２に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製するための前記等温反応が、３７℃の温度である、請求項１３３に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製するための前記等温反応が、５５℃の温度である、請求項１３３に記載の方法。
- （ｉ）二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することの両方が、３７℃での単一の等温反応によって行われる、請求項１３４に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製すること、及び／又は二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、３７℃超で行われる、請求項１３３に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、５５℃で行われる、請求項１３７に記載の方法。
- 前記二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、３０分以下又は１５分以下で行われる、請求項１３８に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡを調製することが、３７℃で行われ、二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、５５℃で行われる、請求項１３８又は１３９に記載の方法。
- 前記方法に使用される前記組成物のＭｇ２＋濃度が１ｍＭ～５０ｍＭであり、任意選択的に、前記Ｍｇ２＋濃度が５ｍＭ～２０ｍＭであり、更に任意選択的に、前記Ｍｇ２＋濃度が８ｍＭである、請求項１０９～１４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素による前記ｃＤＮＡの第１の鎖の産生速度が、前記ＲＮＡニッカーゼによる前記ＲＮＡのニッキング速度よりも大きい、請求項１０９～１４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素の活性が、前記ＲＮＡニッカーゼの活性を超える、請求項１０９～１４２のいずれか一項に記載の方法。
- （ｉ）等温反応によって二本鎖ｃＤＮＡを調製することと、（ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、６０分以下又は３０分以下の全インキュベーションで行われる、請求項１０９～１４３のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーを、前記ＲＮＡを含む試料と合わせる前に、前記ＲＮＡを含む試料を用いて、オフターゲットＲＮＡの枯渇又はｍＲＮＡの濃縮を行うことを更に含む、請求項１０９～１４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オフターゲットＲＮＡがリボソームＲＮＡである、請求項１４５に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡの濃縮が、ポリＴプライマーを用いた増幅又は捕捉ビーズへのｍＲＮＡの結合を含む、請求項１４５又は１４６に記載の方法。
- 前記捕捉ビーズが、ポリＴ配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを有する表面を含む、請求項１４７に記載の方法。
- 前記二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製することが、濃縮によって行われる、請求項１０９～１４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮が、ハイブリッド捕捉を用いて行われる、請求項１４９に記載の方法。
- 前記ハイブリッド捕捉が、標的特異的ビオチン化プローブを用いて行われる、請求項１５０に記載の方法。
- 前記標的特異的ビオチン化プローブが、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する、請求項１５１に記載の方法。
- 前記１つ以上の感染性疾患が、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む、請求項１５２に記載の方法。
- 前記方法が、前記二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅してアンプリコンを調製することを更に含む、請求項１０９～１５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、標的特異的プライマーを用いて行われる、請求項１５４に記載の方法。
- 前記標的特異的プライマーが、１つ以上の感染性疾患由来の配列に結合する、請求項１５５に記載の方法。
- 前記１つ以上の感染性疾患が、１つ以上の呼吸器ウイルスを含む、請求項１５６に記載の方法。
- 前記アンプリコンが、固相可逆的固定化精製に供される、請求項１５４～１５７のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーを、ＲＮＡを含む試料と合わせることから、アンプリコンの精製までの総反応時間が、２時間以下、２．５時間以下、又は３時間以下である、請求項１５８に記載の方法。
- 前記第１のトランスポゾンが、モザイク末端配列を含む修飾トランスポゾン末端配列を含み、前記モザイク末端配列が、野生型モザイク末端配列と比較して１つ以上の変異を含み、前記変異が、
ａ．ウラシル、
ｂ．イノシン、
ｃ．リボース、
ｄ．８－オキソグアニン、
ｅ．チミングリコール、
ｆ．修飾プリン、又は
ｇ．修飾ピリミジンによる置換を含む、請求項１０９～１５９のいずれか一項に記載の方法。 - 前記野生型モザイク末端配列が配列番号１を含み、更に前記１つ以上の変異が、Ａ１６、Ｃ１７、Ａ１８、及び／又はＧ１９における置換を含む、請求項１６０に記載の方法。
- ａ．前記Ａ１６における置換が、Ａ１６Ｔ、Ａ１６Ｃ、Ａ１６Ｇ、Ａ１６Ｕ、Ａ１６イノシン、Ａ１６リボース、Ａ１６－８－オキソグアニン、Ａ１６チミングリコール、Ａ１６修飾プリン、若しくはＡ１６修飾ピリミジンであり、
ｂ．前記Ｃ１７における置換が、Ｃ１７Ｔ、Ｃ１７Ａ、Ｃ１７Ｇ、Ｃ１７Ｕ、Ｃ１７イノシン、Ｃ１７リボース、Ｃ１７－８－オキソグアニン、Ｃ１７チミングリコール、Ｃ１７修飾プリン、若しくはＣ１７修飾ピリミジンであり、
ｃ．前記Ａ１８における置換が、Ａ１８Ｇ、Ａ１８Ｔ、Ａ１８Ｃ、Ａ１８Ｕ、Ａ１８イノシン、Ａ１８リボース、Ａ１８－８－オキソグアニン、Ａ１８チミングリコール、Ａ１８修飾プリン、若しくはＡ１８修飾ピリミジンであり、かつ／又は
ｄ．前記Ｇ１９における置換が、Ｇ１９Ｔ、Ｇ１９Ｃ、Ｇ１９Ａ、Ｇ１９Ｕ、Ｇ１９イノシン、Ｇ１９リボース、Ｇ１９－８－オキソグアニン、Ｇ１９チミングリコール、Ｇ１９修飾プリン、若しくはＧ１９修飾ピリミジンである、請求項１６１に記載の方法。 - ａ．前記二本鎖ｃＤＮＡ断片を、（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせと合わせ、前記モザイク末端配列内の前記ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、及び／又は修飾ピリミジンで前記第１のトランスポゾン末端を切断して、前記断片から前記第１のトランスポゾン末端の全部又は一部を除去することと、
ｂ．前記断片の５’末端及び／又は３’末端にアダプターをライゲーションすることと、を更に含む、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、請求項１６３に記載の方法。
- 前記修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、請求項１６３に記載の方法。
- 切断される前記第１のトランスポゾン末端の全て又は一部が、前記試料の残りから分配される、請求項１６３～１６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片の３’末端において充填することと、ライゲーション前に、前記断片の３’末端をキナーゼでリン酸化することと、を更に含む、請求項１６３～１６６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記充填が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項１６７に記載の方法。
- 前記断片の３’末端に単一のＡオーバーハングを付加することを更に含む、請求項１６８に記載の方法。
- ポリメラーゼが前記単一のＡオーバーハングを付加する、請求項１６９に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、（ｉ）Ｔａｑ又は（ｉｉ）Ｋｌｅｎｏｗ断片エキソ－である、請求項１７０に記載の方法。
- 前記断片が、前記モザイク末端配列の０～３塩基を含む、請求項１６３～１７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターをライゲーションした後に、前記断片を配列決定することを更に含む、請求項１６３～１７２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、配列決定の前に断片の増幅を必要としない、請求項１７３に記載の方法。
- 配列決定の前に断片が増幅される、請求項１７４に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列がウラシルを含み、ＤＮＡグリコシラーゼと脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼとの前記組み合わせが、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）である、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＩＩとの混合物である、請求項１７６に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列がイノシンを含み、前記エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶである、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列がリボースを含み、前記エンドヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ ＨＩＩである、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列が８－オキソグアニンを含み、前記エンドヌクレアーゼがホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）又はオキソグアニングリコシラーゼ（ＯＧＧ）である、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列がチミングリコールを含み、前記ＤＮＡグリコシラーゼがエンドヌクレアーゼＥｎｄｏＩＩＩ（Ｎｔｈ）又はＥｎｄｏ ＶＩＩＩである、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列が修飾プリンを含み、前記ＤＮＡグリコシラーゼがヒト３－アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＩＩＩ又はＶＩＩＩである、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、請求項１８２に記載の方法。
- 前記修飾トランスポゾン末端配列が修飾ピリミジンを含み、
ａ．前記ＤＮＡグリコシラーゼが、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）若しくは哺乳動物ＤＮＡグリコシラーゼ－メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質４（ＭＢＤ４）であり、前記脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼが、前記エンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼＩＩＩ若しくはＶＩＩＩであるか、又は
ｂ．前記エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡグリコシラーゼ／リアーゼＲＯＳ１（ＲＯＳ１）である、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、請求項１８４に記載の方法。
- 前記第１のトランスポゾンが、ウラシル、イノシン、リボース、８－オキソグアニン、チミングリコール、修飾プリン、又は修飾ピリミジンから選択される１つより多い変異を含む修飾トランスポゾン末端配列を含み、前記（１）エンドヌクレアーゼ、又は（２）ＤＮＡグリコシラーゼ及び熱、塩基性条件、若しくは脱塩基部位を認識するエンドヌクレアーゼ／リアーゼの組み合わせが、酵素混合物である、請求項１６３～１７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾プリンが３－メチルアデニン又は７－メチルグアニンである、請求項１８６に記載の方法。
- 前記修飾ピリミジンが、５－メチルシトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシシトシンである、請求項１８６に記載の方法。
- 前記第１のトランスポゾン末端を切断することが、前記アダプターをライゲーションするための付着末端を生成する、請求項１７２～１８８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記付着末端が、１塩基より長い、請求項１８９に記載の方法。
- 前記アダプターが、二本鎖アダプターを含む、請求項１６３～１９０のいずれか一項に記載の方法。
- アダプターが、断片の５’及び３’末端に付加される、請求項１６３～１９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片の５’及び３’末端に付加される前記アダプターが、異なっている、請求項１９２に記載の方法。
- 前記アダプターが、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、配列決定関連配列、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１６３～１９３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターがＵＭＩを含む、請求項１６３～１９４のいずれか一項に記載の方法。
- ＵＭＩを含むアダプターが、断片の３’及び５’末端の両方にライゲーションされる、請求項１９５に記載の方法。
- 前記アダプターが、フォーク型アダプターである、請求項１６３～１９６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションが、ＤＮＡリガーゼを用いて行われる、請求項１６３～１９７のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖ｃＤＮＡ断片を調製した後に、タグメンテーション停止緩衝液が添加される、請求項１０９～１９８のいずれか一項に記載の方法。
- 調製された前記二本鎖ｃＤＮＡ断片が精製される、請求項１０９～１９９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖ｃＤＮＡ断片が配列決定される、請求項１０９～２００のいずれか一項に記載の方法。
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