JP2024512520A - 治療薬の眼送達 - Google Patents

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ガヤトリ ラマスワミ
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Abstract

本発明は、個体における眼の疾患または障害のための装置および治療法を含む。治療薬、ならびに治療薬を個体に投与する方法および治療薬の電気的導入の方法を含む、治療薬（例えば、核酸ベクター）を標的眼細胞（例えば、網膜細胞）に送達する装置および方法が本明細書で提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年3月19日に出願された米国仮特許出願第63/163,350号、2021年3月29日に出願された米国仮特許出願第63/167,296号、2021年12月23日に出願された米国仮特許出願第63/293,297号、2021年3月29日に出願された米国仮特許出願第63/167,463号、2022年3月4日に出願された米国仮特許出願第63/316,699号、および2021年3月29日に出願された米国仮特許出願第63/167,437号に対する優先権を主張し、これらの各々は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子出願され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2022年3月21日に作成された前記ASCIIコピーの名称は51503-066WO4＿Sequence＿Listing＿3＿21＿22＿ST25.txtであり、サイズは392,761バイトである。
発明の分野
一般に、本発明は、眼治療薬ならびに眼細胞に治療薬を投与するための装置および方法を特徴とする。
背景
視覚障害および失明は、世界的な健康上の主要な懸念事項であり、多種多様な眼病変に苦しむ数百万人の患者に影響を及ぼしている。網膜ジストロフィは、例えば、網膜細胞構造（例えば、光受容体および/または網膜上皮細胞）ならびに視覚サイクル経路（例えば光エネルギーの知覚可能なニューロンシグナルへの変換を促進するために必要な光伝達および視覚サイクル経路）の遺伝的異常に起因して生じる、視覚機能の慢性および進行性障害である。網膜ジストロフィによって引き起こされる視覚障害は、周辺視野または暗視の不良から完全な失明まで様々であり、重症度は通常年齢と共に増加する。一部には、複雑な生物学的機構および網膜への限られたアクセスに起因して、多くの網膜ジストロフィに対する安全で効果的な治療は依然として不十分である。
遺伝子治療の最近の発展は、網膜ジストロフィの治療における可能性を示している。しかしながら、現在の送達方法は、しばしばアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどのビリオン粒子の指向性に依存する。そのような送達方法の成功は、標的組織の位置、ベクターの投与経路、および宿主応答などの様々な要因に左右される。さらに、AAVベクターは、送達される治療遺伝子のサイズ制約によって制限され、そのような方法を多くの網膜遺伝子の送達に適さないものにしている。したがって、眼細胞の効果的な標的化は依然として困難な取り組みであり、網膜細胞への治療薬の効果的な送達のために改善されたアプローチが必要である。
本発明は、治療薬（例えば、治療用置換タンパク質をコードする核酸ベクター）を眼細胞（例えば、網膜細胞）に送達するためのアプローチを提供する。いくつかの場合には、本明細書に記載のアプローチは、眼内電極（例えば、硝子体または網膜に配置された）を使用した眼組織（例えば、網膜）への電場の伝達が標的眼細胞（例えば、網膜細胞）への治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の送達を促進するプロセスである、電気的導入を含む。治療薬、例えばそのような方法で使用するための核酸ベクターも本明細書で提供される。
一局面では、本発明は、個体の標的網膜細胞に治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）を送達する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:（a）電極を眼の内部領域に接触させる工程であって、眼の網膜内の細胞外空間が治療薬を含む、工程;および（b）電極が眼の内部領域に接触している間に、治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数（例えば、4～12または6～10）のパルスの電気エネルギー（例えば、電流）を伝達する工程。いくつかの態様では、電極は単極電極（例えば、硝子体内に配置された単極正極、または網膜、網膜下腔、もしくは治療薬の網膜下注射によって作り出されたブレブ内に配置された単極負極）である。いくつかの態様では、電極は双極電極（例えば、負極が網膜、網膜下腔、または治療薬の網膜下注射によって作り出されたブレブに接触しており、正極が硝子体内にあるように配置された双極電極）である。他の態様では、治療薬は網膜下注射によって細胞外空間に送達された（例えば、治療薬は既に網膜下に投与されており、標的網膜細胞への電気的導入のための位置にある）。他の態様では、治療薬は硝子体内注射によって細胞外空間に送達された。いくつかの態様では、網膜の細胞外空間への治療薬の送達も、前述の方法の一部として含まれる。いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の送達は網膜下注射によるものである。他の態様では、治療薬の送達は硝子体内注射によるものである。治療薬が核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）であるいくつかの態様では、核酸は標的細胞（例えば、網膜細胞、例えば網膜色素上皮（RPE）細胞および/または光受容細胞）によって発現される。したがって、本明細書に記載される送達方法は、おそらく、関心対象の配列（例えば、治療配列）を発現させる方法であり得る。
いくつかの態様では、電極に接触している眼の内部領域は、硝子体液を含む（例えば、電極は完全に硝子体液内にある）。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から10mm以内にある（例えば、網膜から10mm、5mm、または1mm以内であるが、網膜に直接接触していない）。電極が硝子体液中にあるいくつかの態様では、電極は正の電極であり、印加される電圧は正の電圧である（例えば、電極は硝子体液中にあり、電極は単極正極であり、治療薬は核酸ベクター（例えば、DNAベクターまたはRNAベクター）、例えば、非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクターである。
いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜（および/または網膜下ブレブ）に直接接触している。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.1mm～10mmにある。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.5mm～10mmにある。
いくつかの態様では、電極に接触する眼の内部領域は網膜を含む。例えば、電極は完全に網膜下腔内にあってもよく、または部分的に網膜下腔内にあってもよい（例えば、網膜下ブレブに接触している）。電極が網膜、網膜下腔、または網膜下ブレブと接触しているいくつかの態様では、電極は負極（例えば、陰極）であり、印加される電圧は負の電圧である（例えば、電極は網膜、網膜下腔、または網膜下ブレブと接触しており、電極は単極負極（例えば、陰極）であり、治療薬は核酸ベクター（例えば、本明細書に記載のDNAベクターまたはRNAベクターのいずれか）、例えば、非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクターである。
いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件は、標的網膜細胞での1V/cm～1,500V/cm（1V/cm～10V/cm（例えば、約1V/cm、約2V/cm、約3V/cm、約4V/cm、約5V/cm、約6V/cm、約7V/cm、約8V/cm、約9V/cm、もしくは約10V/cm）、約10V/cm～約100V/cm（例えば、約10V/cm、約20V/cm、約30V/cm、約40V/cm、約50V/cm、約60V/cm、約70V/cm、約80V/cm、約90V/cm、もしくは約100V/cm）、約100V/cm～約1,000V/cm（例えば、約200V/cm、約300V/cm、約400V/cm、約500V/cm、約600V/cm、約700V/cm、約800V/cm、約900V/cm、もしくは約1,000V/cm）、または1,000V/cm～1,500V/cm（例えば、約1,000V/cm、約1,100V/cm、約1,200V/cm、約1,300V/cm、約1,400V/cm、もしくは約1,500V/cm））の電場強度を含む。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は、50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は約100V/cmである。
いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件は、10μA～1A（例えば、10μA～500mA、10μA～200mA、10μA～100mA、10μA～50mA、または10μA～25mA;例えば、50μA～500mA、100μA～200mA、または1mA～100mA;例えば、10μA～20μA、20μA～30μA、30μA～50μA、50μA～100μA、100μA～150μA、150μA～200μA、200μA～300μA、300μA～400μA、400μA～500μA、500μA～600μA、600μA～800μA、800μA～1mA、1mA～10mA、10mA～20mA、20mA～30mA、30mA～40mA、40mA～50mA、50mA～60mA、60mA～70mA、70mA～80mA、80mA～90mA、90mA～100mA、100mA～200mA、200mA～300mA、300mA～500mA、または500mA～1A;例えば、約1mA、約5mA約10mA、約15mA、約20mA、約25mA、約30mA、約35mA、約40mA、約45mA、約50mA、約60mA、約70mA、約80mA、約90mAまたは約100mA）のパルス電場から生じる電流を含む。
いくつかの態様では、1～3パルス（例えば、1パルス、2パルス、または3パルス）のエネルギーが伝達される。いくつかの態様では、4～12パルス（例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）のエネルギーが伝達される。いくつかの態様では、1～12パルスが施される。いくつかの態様では、10～20パルス（例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20パルス）が施される。いくつかの態様では、8パルスが施される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。電気エネルギーのパルスは、5V～1,500Vの振幅を有し得る。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V～500V、約500V～約1,000V、または約1,000V～約1,500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有する。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V、10V、15V、20V、25V、30V、40V、50V、100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5V～約250Vの振幅を有する。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは約20Vの振幅を有する。電気エネルギーのパルスが約20Vの振幅を有するいくつかの態様では、電流は、5mA～50mA（例えば、10mA～40mA、例えば、5mA～10mA、10mA～15mA、15mA～20mA、20mA～30mA、または40mA～50mA）である。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは約40Vの振幅を有する。電気エネルギーのパルスが約40Vの振幅を有するいくつかの態様では、電流は、10mA～100mA（例えば、20mA～80mA、または30mA～70mA、例えば、10mA～20mA、20mA～30mA、30mA～40mA、40mA～50mA、50mA～60mA、60mA～70mA、70mA～80mA、80mA～90mA、または90mA～100mA）である。
いくつかの態様では、パルス電場から生じる電流は、10μA～1A（例えば、10μA～500mA、10μA～200mA、10μA～100mA、10μA～50mA、または10μA～25mA;例えば、50μA～500mA、100μA～200mA、または1mA～100mA;例えば、10μA～20μA、20μA～30μA、30μA～50μA、50μA～100μA、100μA～150μA、150μA～200μA、200μA～300μA、300μA～400μA、400μA～500μA、500μA～600μA、600μA～800μA、800μA～1mA、1mA～10mA、10mA～20mA、20mA～30mA、30mA～40mA、40mA～50mA、50mA～60mA、60mA～70mA、70mA～80mA、80mA～90mA、90mA～100mA、100mA～200mA、200mA～300mA、300mA～500mA、または500mA～1A;例えば、約1mA、約5mA約10mA、約15mA、約20mA、約25mA、約30mA、約35mA、約40mA、約45mA、約50mA、約60mA、約70mA、約80mA、約90mA、または約100mA）である。
いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約0.01ms～約200ms、持続時間が約0.1ms～約200ms、または持続時間が約1ms～約200ms（例えば、持続時間が0.10ms～約200msである。例えば、パルスの各々は、約10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る）。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約20msである。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約50msである。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約0.01ms～約1ms（例えば、0.01ms～0.05ms、0.05ms～0.1ms、0.1ms～0.25ms、0.25ms～0.5ms、0.5ms～0.75ms、または0.75ms～1.0ms;例えば、約0.01ms、約0.05ms、約0.1ms、約0.2ms、約0.3ms、約0.4ms、約0.5ms、約0.6ms、約0.7ms、約0.8ms、約0.9ms、または約1.0ms）である。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内（例えば、6～12秒以内、例えば、1～3秒以内、3～6秒以内、6～10秒以内、10～15秒以内、または15～20秒以内、例えば、1秒以内、2秒以内、3秒以内、4秒以内、5秒以内、6秒以内、7秒以内、8秒以内、9秒以内、10秒以内、11秒以内、12秒以内、13秒以内、14秒以内、15秒以内、16秒以内、17秒以内、18秒以内、19秒以内、20秒以内）に伝達される。
いくつかの態様では、エネルギーのパルスは方形波形である。いくつかの態様では、エネルギーのパルスは、100V～500V（例えば、200V～400V、例えば、100V～200V、200V～300V、300V～400V、または400V～500V、例えば、約100V、約120V、約150V、約200V、約250V、約300V、約350V、約400V、約450V、または約500V）の振幅を有する。
いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は光受容体である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞および光受容体である。
いくつかの態様では、治療薬は、核酸ベクター、例えば、DNAベクターまたはRNAベクターである。いくつかの態様では、核酸ベクターは非ウイルス核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクターまたは非ウイルスRNAベクター;例えば、環状DNAベクターまたは環状RNAベクター）である。特定の場合には、非ウイルス核酸ベクターは裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター）または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター）である。DNAベクターが環状DNAベクターであるいくつかの態様では、環状DNAベクターは、複製起点（例えば、細菌複製起点）、薬物耐性遺伝子、および/または組換え部位を欠く。
いくつかの態様では、核酸ベクターは、健康な網膜細胞で内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、個体の標的細胞において内因的に発現されないかまたは個体の標的細胞において非機能性であるタンパク質と置き換わる。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はABCA4（例えば、ヒトABCA4（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性、例えば、SEQ ID NO:18と100％の配列同一性を有するABCA4））である。いくつかの態様では、本方法は、ABCA4関連網膜ジストロフィ（例えば、シュタルガルト病）を治療する方法である。
前述の態様のいずれかのいくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、もしくはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、もしくは組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、もしくは裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。いくつかの場合には、そのような核酸ベクターはCAGプロモータを含む。
いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19の核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むかまたはそれからなる裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、または組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、または裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はMYO7Aである。いくつかの態様では、本方法は、個体におけるアッシャー症候群1B型を治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はBEST1である。いくつかの態様では、方法は、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーを治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はCFHである。いくつかの態様では、方法は加齢黄斑変性症を治療する方法である。
別の局面では、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードするCAGプロモータによって駆動される核酸配列を含む核酸ベクター（またはその薬学的組成物）が本明細書で提供される。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、もしくはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、もしくは組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、もしくは裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸ベクター（またはその薬学的組成物）を提供する。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19の核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むかまたはそれからなる裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、または組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、または裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。
いくつかの態様では、治療配列または治療用タンパク質（例えば、治療用置換タンパク質）は表1に示されている。
別の局面では、本発明は、網膜タンパク質（例えば、ABCA4、MYO7AまたはCEP290）をコードする非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターを個体（例えば、ヒト）の標的網膜細胞に送達する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:（a）単極針電極（例えば、負極、例えば、陰極）を個体の網膜または網膜下ブレブに接触させる工程であって、網膜の細胞外空間が合成環状DNAベクターを含む、工程;および（b）電極が網膜または網膜下ブレブに接触している間に、それぞれが1秒～30秒間、例えば約8秒間にわたって10～30ms（例えば、約20ms）の持続時間を有する6～10（例えば、8）の20～40Vパルスを電極に印加する工程。いくつかの態様では、非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターを網膜下注射によって網膜の細胞外空間に送達した。いくつかの態様では、網膜の細胞外空間への非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターの送達も、前述の方法の一部として含まれる。いくつかの態様では、核酸は、標的細胞（例えば、網膜細胞、例えば、RPE細胞および/または光受容細胞）によって発現される。いくつかの態様では、本方法は、治療によって発現される網膜タンパク質に関連する眼障害を治療または予防する。
別の局面では、本発明は、網膜タンパク質（例えば、ABCA4、MYO7AまたはCEP290）をコードする非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターを個体（例えば、ヒト）の標的網膜細胞に送達する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:（a）単極針電極（例えば、単極の正針電極、例えば、陽極）を、電極の遠位端が網膜から1mm以内になるように個体の硝子体液に接触させる工程であって、網膜の細胞外空間が合成環状DNAベクターを含む、工程;および（b）電極が網膜から1mm以内で硝子体液に接触している間に、それぞれが1秒～30秒間、例えば約8秒間にわたって10～30ms（例えば、約20ms）の持続時間を有する6～10（例えば、8）の20～40Vパルスを電極に印加する工程。いくつかの態様では、非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターを網膜下注射によって網膜の細胞外空間に送達した。いくつかの態様では、網膜の細胞外空間への非ウイルス（例えば、裸の）合成環状DNAベクターの送達も、前述の方法の一部として含まれる。いくつかの態様では、核酸は、標的細胞（例えば、網膜細胞、例えば、RPE細胞および/または光受容細胞）によって発現される。いくつかの態様では、本方法は、治療によって発現される網膜タンパク質に関連する眼障害を治療または予防する。本発明はまた、上脈絡膜投与によって治療薬（例えば、治療用置換タンパク質をコードする核酸ベクター）を眼細胞（例えば、網膜細胞）に送達するまたは発現させるためのアプローチを提供する。いくつかの場合には、本明細書に記載のアプローチは、眼組織（例えば、網膜）への電場の伝達が標的眼細胞（例えば、網膜細胞）への治療薬の送達を促進するプロセスである電気的導入を含む。
別の局面では、本発明は、個体の標的網膜細胞に治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）を送達する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:（a）電極を眼の内部領域に接触させる工程であって、眼の網膜内の細胞外空間が上脈絡膜注射によって送達される治療薬を含む、工程;および（b）電極が眼の内部領域に接触している間に、治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギー（例えば、電流）を伝達する工程。いくつかの態様では、電極は単極電極である。いくつかの態様では、電極は双極電極である。
いくつかの態様では、網膜の細胞外空間への治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の送達も、前述の方法の一部として含まれる。いくつかの態様では、治療薬の送達は上脈絡膜注射（例えば、両側上脈絡膜注射）によるものである。いくつかの態様では、電気的導入は、治療薬の送達後に施される。いくつかの態様では、電気的導入は、治療薬の送達前に施される。
いくつかの態様では、電極に接触している眼の内部領域は、硝子体液を含む（例えば、電極は完全に硝子体液内にある）。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から10mm以内にある（例えば、網膜から10mm以内であるが、網膜に直接接触していない）。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜に直接接触している。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.1mm～10mmにある。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.5mm～10mmにある。
いくつかの態様では、電極に接触する眼の内部領域は網膜を含む。例えば、電極は完全に網膜下腔の中にあってもよく、または部分的に網膜下腔の中にあってもよい。
いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件は、標的網膜細胞での1V/cm～1,500V/cm（1V/cm～10V/cm（例えば、約1V/cm、約2V/cm、約3V/cm、約4V/cm、約5V/cm、約6V/cm、約7V/cm、約8V/cm、約9V/cm、もしくは約10V/cm）、約10V/cm～約100V/cm（例えば、約10V/cm、約20V/cm、約30V/cm、約40V/cm、約50V/cm、約60V/cm、約70V/cm、約80V/cm、約90V/cm、もしくは約100V/cm）、約100V/cm～約1,000V/cm（例えば、約200V/cm、約300V/cm、約400V/cm、約500V/cm、約600V/cm、約700V/cm、約800V/cm、約900V/cm、もしくは約1,000V/cm）、または1,000V/cm～1,500V/cm（例えば、約1,000V/cm、約1,100V/cm、約1,200V/cm、約1,300V/cm、約1,400V/cm、もしくは約1,500V/cm））の電場強度を含む。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は、50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は約100V/cmである。
いくつかの態様では、1～3パルス（例えば、1パルス、2パルス、または3パルス）のエネルギーが伝達される。いくつかの態様では、4～12パルス（例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）のエネルギーが伝達される。いくつかの態様では、1～12パルスが施される。いくつかの態様では、10～20パルス（例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20パルス）が施される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。電気エネルギーのパルスは、5V～1,500Vの振幅を有し得る。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V～500V、約500V～約1,000V、または約1,000V～約1,500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有する。例えば、電気エネルギーのパルスは、約100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5V～約250Vの振幅を有する。
いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約0.01ms～約200ms、持続時間が約0.1ms～約200ms、または持続時間が約1ms～約200ms（例えば、持続時間が0.10ms～約200msである。例えば、パルスの各々は、約10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る）。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約20msである。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約50msである。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約0.01ms～約1ms（例えば、0.01ms～0.05ms、0.05ms～0.1ms、0.1ms～0.25ms、0.25ms～0.5ms、0.5ms～0.75ms、または0.75ms～1.0ms;例えば、約0.01ms、約0.05ms、約0.1ms、約0.2ms、約0.3ms、約0.4ms、約0.5ms、約0.6ms、約0.7ms、約0.8ms、約0.9ms、または約1.0ms）である。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内（例えば、6～12秒以内、例えば、1～3秒以内、3～6秒以内、6～10秒以内、10～15秒以内、または15～20秒以内、例えば、1秒以内、2秒以内、3秒以内、4秒以内、5秒以内、6秒以内、7秒以内、8秒以内、9秒以内、10秒以内、11秒以内、12秒以内、13秒以内、14秒以内、15秒以内、16秒以内、17秒以内、18秒以内、19秒以内、20秒以内）に伝達される。
いくつかの態様では、エネルギーのパルスは方形波形である。いくつかの態様では、エネルギーのパルスは、100V～500V（例えば、200V～400V、例えば、100V～200V、200V～300V、300V～400V、または400V～500V、例えば、約100V、約120V、約150V、約200V、約250V、約300V、約350V、約400V、約450V、または約500V）の振幅を有する。
いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は光受容体である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞および光受容体である。
いくつかの態様では、治療薬は、核酸ベクター、例えば、DNAベクターまたはRNAベクターである。いくつかの態様では、核酸ベクターは非ウイルス核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクターまたは非ウイルスRNAベクター;例えば、環状DNAベクターまたは環状RNAベクター）である。特定の場合には、非ウイルス核酸ベクターは裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター）または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター）である。DNAベクターが環状DNAベクターであるいくつかの態様では、環状DNAベクターは、複製起点（例えば、細菌複製起点）、薬物耐性遺伝子、および/または組換え部位を欠く。
いくつかの態様では、核酸ベクターは、健康な網膜細胞で内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、個体の標的細胞において内因的に発現されないかまたは個体の標的細胞において非機能性であるタンパク質と置き換わる。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はMYO7Aである。いくつかの態様では、本方法は、個体におけるアッシャー症候群1B型を治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はBEST1である。いくつかの態様では、方法は、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーを治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はCFHである。いくつかの態様では、方法は加齢黄斑変性症を治療する方法である。
別の局面では、本発明は、網膜タンパク質の発現の欠如を特徴とする網膜ジストロフィを有する個体の眼に、環状DNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター）を上脈絡膜注射する工程を含む、網膜ジストロフィを治療する方法を提供する。いくつかの態様では、環状DNAベクターは、網膜タンパク質と置き換わるための治療用置換タンパク質をコードする1つまたは複数の治療遺伝子を含む。いくつかの態様では、環状DNAベクターは、細菌複製起点および/または薬物耐性遺伝子を欠く（例えば、環状DNAベクターは、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠く）。いくつかの態様では、本方法は、（a）電極を眼の内部領域に接触させる工程;および（b）電極が眼の内部領域に接触している間に、環状DNAベクターの標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギー（例えば、電流）を伝達する工程をさらに含む。いくつかの態様では、電極は単極電極である。いくつかの態様では、電極は双極電極である。
いくつかの態様では、電極に接触している眼の内部領域は、硝子体液を含む（例えば、電極は完全に硝子体液内にある）。いくつかの態様では、電極は、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.1mm～10mmにある。
いくつかの態様では、電極に接触する眼の内部領域は網膜を含む。例えば、電極は完全に網膜下腔の中にあってもよく、または部分的に網膜下腔の中にあってもよい。
いくつかの態様では、治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件は、標的網膜細胞での1V/cm～1,500V/cm（1V/cm～10V/cm（例えば、約1V/cm、約2V/cm、約3V/cm、約4V/cm、約5V/cm、約6V/cm、約7V/cm、約8V/cm、約9V/cm、または約10V/cm、）、約10V/cm～約100V/cm（例えば、約10V/cm、約20V/cm、約30V/cm、約40V/cm、約50V/cm、約60V/cm、約70V/cm、約80V/cm、約90V/cmまたは約100V/cm）、約100V/cm～約1,000V/cm（例えば、約200V/cm、約300V/cm、約400V/cm、約500V/cm、約600V/cm、約700V/cm、約800V/cm、約900V/cm、または約1,000V/cm）、または1,000V/cm～1,500V/cm（例えば、約1,000V/cm、約1,100V/cm、約1,200V/cm、約1,300V/cm、約1,400V/cm、または約1,500V/cm））の電場強度を含む。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は、50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は約100V/cmである。
いくつかの態様では、4～12パルス（例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）のエネルギーが伝達される。いくつかの態様では、10～20パルス（例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20パルス）が施される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。電気エネルギーのパルスは、5V～1,500Vの振幅を有し得る。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V～500V、約500V～約1,000V、または約1,000V～約1,500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有する。例えば、電気エネルギーのパルスは、約100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5V～約250Vの振幅を有する。
いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約0.01ms～約200ms、持続時間が約0.1ms～約200ms、または持続時間が約1ms～約200ms（例えば、持続時間が0.10ms～約200msである。例えば、パルスの各々は、約10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る）。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約20msである。いくつかの態様では、パルスの各々は、持続時間が約50msである。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内（例えば、6～12秒以内、例えば、1～3秒以内、3～6秒以内、6～10秒以内、10～15秒以内、または15～20秒以内、例えば、1秒以内、2秒以内、3秒以内、4秒以内、5秒以内、6秒以内、7秒以内、8秒以内、9秒以内、10秒以内、11秒以内、12秒以内、13秒以内、14秒以内、15秒以内、16秒以内、17秒以内、18秒以内、19秒以内、20秒以内）に伝達される。
いくつかの態様では、エネルギーのパルスは方形波形である。いくつかの態様では、エネルギーのパルスは、100V～500V（例えば、200V～400V、例えば、100V～200V、200V～300V、300V～400V、または400V～500V、例えば、約100V、約120V、約150V、約200V、約250V、約300V、約350V、約400V、約450V、または約500V）の振幅を有する。
いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は光受容体である。いくつかの態様では、標的網膜細胞は網膜上皮細胞および光受容体である。
いくつかの態様では、治療薬は、核酸ベクター、例えば、DNAベクターまたはRNAベクターである。いくつかの態様では、核酸ベクターは非ウイルス核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクターまたは非ウイルスRNAベクター;例えば、環状DNAベクターまたは環状RNAベクター）である。特定の場合には、非ウイルス核酸ベクターは裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター）または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター）である。DNAベクターが環状DNAベクターであるいくつかの態様では、環状DNAベクターは、複製起点（例えば、細菌複製起点）、薬物耐性遺伝子、および/または組換え部位を欠く。
いくつかの態様では、核酸ベクターは、健康な網膜細胞で内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、個体の標的細胞において内因的に発現されないかまたは個体の標的細胞において非機能性であるタンパク質と置き換わる。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる。いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はMYO7Aである。いくつかの態様では、本方法は、個体におけるアッシャー症候群1B型を治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はBEST1である。いくつかの態様では、方法は、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーを治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質はCFHである。いくつかの態様では、方法は加齢黄斑変性症を治療する方法である。
いくつかの態様では、治療用置換タンパク質は表1に示されている。
本発明はまた、電気的導入を介して標的細胞に治療薬（例えば、核酸ベクター）を送達するための装置および方法を提供する。そのような装置および方法は、一般に、組織内の標的細胞への治療薬の送達を促進する装置によるその組織内への電場の伝達を用いる。本装置は、標的組織界面の内部トポグラフィ（例えば、実質的に平坦な、湾曲した、または球状のトポグラフィ）に一致する形状の電場を伝達するように設計されており、それによって有効電場にさらされる標的細胞の数を増加させ、次に、治療薬の電気的導入の効率を改善する。そのような装置の特定の使用では、核酸ベクターを用いて高い効率で網膜細胞をトランスフェクトすることができる。
一局面では、装置は、近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有するシースを含む。装置は、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体をさらに含み、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料を含み、近位位置から遠位位置までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度（例えば、約10°～約170°、例えば、約20°～約160°、例えば、約30°～約150°、例えば、約45°～約135°、例えば、約60°～約120°、例えば、約70°～約110°、例えば、約80°～約100°、例えば、約85°～約95°、例えば、約10°、20°、30°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、71°、72°、73°、74°、75°、76°、77°、78°、79°、80°、81°、82°、83°、84°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、96°、97°、98°、99°、100°、101°、102°、103°、104°、105°、106°、107°、108°、109°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°、150°、160°、または170°）で配置された電極を形成する。いくつかの態様では、電極は、実質的に平坦な電極である。いくつかの態様では、予め形成された角度は実質的に直角である。いくつかの態様では、予め形成された角度は約70°または約110°である。
別の局面では、装置は、近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有するシースを含む。装置は、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体をさらに含み、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料を含み、近位位置から遠位位置までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対してほぼ垂直な電極を形成する。いくつかの態様では、電極は、実質的に平坦な電極である。
別の局面では、装置は、近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有するシースを含む。装置は、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体をさらに含み、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料を含み、近位位置から遠位位置までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して実質的に直角である電極を形成する。いくつかの態様では、電極は、実質的に平坦な電極である。いくつかの態様では、実質的に直角は、約70°または約110°である。
いくつかの態様では、装置は、近位端と遠位端とを有するハンドルをさらに含む。シースは、ハンドルに接続（例えば、固定化）され得る。
いくつかの態様では、シースの近位端は、ハンドルに接続（例えば、その中に配置）される。
いくつかの態様では、ハンドルの遠位部分は、ハンドルの内面とその中の細長い導体との間に中空領域を含み、シースの近位端は、ハンドル内の中空領域内に配置される。
いくつかの態様では、シースの近位端は、中空領域内に少なくとも1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、またはそれ以上配置される。
いくつかの態様では、ハンドルは円筒形である。
いくつかの態様では、ハンドルは、ハンドルの遠位端および/または近位端にキャップをさらに含む。
いくつかの態様では、装置は、近位位置と遠位位置との間で細長い導体を摺動させるように構成されるアクチュエータをさらに含む。
いくつかの態様では、シースの近位端および/または細長い導体は、アクチュエータに接続される。アクチュエータは、近位位置と遠位位置との間で細長い導体を摺動させるように構成され得る。いくつかの態様では、アクチュエータはスライダである。スライダは、近位端と遠位端とを有し、細長い導体に取り付けられている。スライダは、細長い導体をシースの長手方向軸に沿って遠位位置から近位位置に引き込むように構成される。
いくつかの態様では、スライダは、近位位置と遠位位置とを含む。近位位置では、シースの近位端は、スライダの遠位端に、または遠位端の近位に配置され得る。遠位位置では、シースの近位端は、スライダの近位端とスライダの遠位端との間に配置され得る。
いくつかの態様では、スライダは、遠位位置および/または近位位置に摺動すると停止するように構成される。
いくつかの態様では、スライダは遠位位置に配置され、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在している。細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度で実質的に平坦な電極を形成し得る。
いくつかの態様では、スライダは近位位置に配置され、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。
いくつかの態様では、スライダは、ハンドルの外部に配置された制御部材を含む。制御部材とスライダとは一体であってもよい。あるいは、制御部材とスライダとは一体でなくてもよい。
別の局面では、装置は、近位端と遠位端とを有するハンドルを含む。装置は、近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有するシースをさらに含む。シースは、ハンドルに接続（例えば、固定化）され得る。シースの近位端は、ハンドルに接続（例えば、その中に配置）され得る。装置はまた、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体を含み、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料を含み、近位位置から遠位位置までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度（例えば、約10°～約170°、例えば、約20°～約160°、例えば、約30°～約150°、例えば、約45°～約135°、例えば、約60°～約120°、例えば、約70°～約110°、例えば、約80°～約100°、例えば、約85°～約95°、例えば、約10°、20°、30°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、71°、72°、73°、74°、75°、76°、77°、78°、79°、80°、81°、82°、83°、84°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、96°、97°、98°、99°、100°、101°、102°、103°、104°、105°、106°、107°、108°、109°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°、150°、160°、または170°）で配置された実質的に平坦な電極を形成する。装置はまた、近位端と遠位端とを有し、細長い導体に取り付けられたスライダを含む。スライダは、細長い導体をシースの長手方向軸に沿って遠位位置から近位位置に引き込むように構成される。いくつかの態様では、予め形成された角度は約70°または約110°である。
いくつかの態様では、装置は、スライダに接続（例えば、固定化）されたシースをさらに含む。細長い導体は、スライダに接続されたシース内に存在し得る。いくつかの態様では、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続（例えば、固定化）されたシースと入れ子になっている。スライダに接続されたシースは、ハンドルまたはその一部に接続されたシースによって取り囲まれるように構成され得る。例えば、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続されたシースの直径よりも小さい直径を有し得る。あるいは、スライダに接続されたシースは、ハンドルまたはその一部に接続されたシースを取り囲み得る。例えば、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続されたシースの直径よりも大きい直径を有し得る。いくつかの態様では、スライダに接続されたシースは、例えば、細長い導体の近位端で細長い導体に接続される。
いくつかの態様では、シースの遠位端は針（例えば、皮下注射針）を含む。
いくつかの態様では、装置は、例えば、細長い導体の近位部分とシースとの間に絶縁体をさらに含む。
いくつかの態様では、シースは導電性材料を含む。
シースの内径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの内径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。いくつかの態様では、シースは、約0.1mm～約1mmの内径を有する。いくつかの態様では、シースは、約0.2mm～約0.3mmの内径を有する。
内径よりも大きいシースの外径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの内径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。
シースの厚さは、約0.01mm～約1mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mmであり得る。シースの厚さは、全体にわたって実質的に均一であってもよく、またはシースの異なる部分もしくは領域において異なる厚さを有してもよい。
導体の直径は、シースの内径の約50％～約99％であり得る。例えば、直径は、約55％～約95％、約60％～約90％、約65％～約85％、70％～約80％、または約75％であり得る。
細長い導体は、実質的に円筒形（例えば、円筒形ワイヤ）であり得る。シースの断面は、実質的に円形または楕円形であり得る。導体の直径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの内径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。いくつかの態様では、導体の直径は約0.2mmである。いくつかの態様では、細長い導体は、約100μm～約200μmの直径を有する。いくつかの態様では、細長い導体の直径は約150μmである。
導体の直径は、全体にわたって実質的に均一であってもよく、または導体の異なる部分もしくは領域において異なる厚さを有してもよい。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、長手方向軸に対して垂直な1つまたは複数の寸法（例えば、両方の寸法）で約2mm～約15mm（例えば、約2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、または15mm）である。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、長手方向平面に関して実質的に対称である。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は凸状である。
いくつかの態様では、細長い導体はワイヤであり、実質的に平坦な電極はワイヤの遠位部分を含む。
いくつかの態様では、ワイヤの遠位部分は、長手方向平面上に予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）を含み、ここで、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）は、実質的に平坦な電極とワイヤの近位部分との間にある。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は螺旋である。例えば、螺旋は、長手方向軸を中心に約1～約5（例えば、1、2、3、4、または5）回転を含み得る。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に3回転を含む（例えば、それからなる）。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に2回転を含む（例えば、それからなる）。例えば、図3は、その長手方向軸を中心に2回転を有する螺旋を示す。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位または近位に延在している。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位に延在している。いくつかの態様では、装置は、実質的に平坦な電極の遠位に何も含まない。
いくつかの態様では、装置は単極である。
いくつかの態様では、装置は双極であり、ここで、装置は、実質的に平坦な電極と電気的に連通する補助電極をさらに含む。補助電極は、シースの一部であってもよく、またはシースに接続されていてもよい。
いくつかの態様では、細長い導体の近位部分は、電圧源および/または波形コントローラに接続される。
別の局面では、本発明は、本明細書に記載の装置を使用して剤（例えば、関心対象の剤、例えば、治療薬）を患者の標的細胞に送達する方法を特徴とする。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の装置を使用して患者の標的細胞に剤（例えば、関心対象の剤（例えば、治療薬）または関心対象の配列（例えば、治療配列））を送達する方法を特徴とする。本方法は、対象の外部組織表面（例えば、強膜）からシース（または針を含むシース）を挿入する工程、および細長い導体を遠位位置に摺動させて実質的に平坦な電極を形成する工程を含む。本方法は、標的細胞を実質的に平坦な電極から分離している組織界面と電気的に連通するように実質的に平坦な電極を配置する工程をさらに含む。この方法はまた、剤（例えば、治療薬）の標的細胞への電気的導入に適した条件で、実質的に平坦な電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する工程を含む。治療薬が核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）であるいくつかの態様では、核酸は標的細胞（例えば、網膜細胞、例えば、RPE細胞および/または光受容細胞）によって発現される。したがって、本明細書に記載される送達方法は、おそらく、関心対象の配列（例えば、治療配列）を発現させる方法であり得る。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、組織界面から約10mm以内（例えば、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm、0.45mm、0.40mm、0.35mm、0.30mm、0.25mm、0.20mm、0.15mm、0.10mm、0.05mm以内、またはそれ以下）にある。実質的に平坦な電極は、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から0.05mm～5mm（例えば、約0.5mm、0.10mm、0.15mm、0.20mm、0.25mm、0.30mm、0.35mm、0.40mm、0.45mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、または5mm）にあり得る。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から約1mmにある。
標的細胞は、組織界面から約5mm（例えば、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm、0.45mm、0.4mm、0.35mm、0.30mm、0.25mm、0.20mm、0.15mm、0.10mm、または0.05mm）以内であり得る。例えば、標的細胞は、組織界面から約0.01mm～約1mm（例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm）であり得る。
いくつかの態様では、剤（例えば、治療薬）の標的細胞への電気的導入に適した条件は、標的細胞における約10V/cm～約1,500V/cm（例えば、約10V/cm～約100V/cm、例えば、約10V/cm、20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、または100V/cm、例えば、約100V/cm～約1,000V/cm、例えば、約200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、または1,000V/cm、例えば、約1,000V/cm～約1,500V/cm、例えば、約1,110V/cm、1,200V/cm、1,300V/cm、1,400V/cm、または1,500V/cm）の電場強度を含む。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は、50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、標的細胞における電場強度は約100V/cmである。
いくつかの態様では、1～12パルス（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが伝達される。いくつかの態様では、2～12パルス（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが伝達される。いくつかの態様では、3～12パルス（例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが伝達される。いくつかの態様では、4～12パルス（例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが伝達される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、5V～1,500Vの振幅を有する。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V～500V、約500V～約1,000V、または約1,000V～約1,500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有する。例えば、電気エネルギーのパルスは、約100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5V～約250Vの振幅を有する。
いくつかの態様では、標的細胞への剤の電気的導入に適した条件は、標的細胞における5V～100V（例えば、10V～80V、15V～70V、20V～60V、または30V～50V;例えば、約10V、約15V、約20V、約25V、約30V、約35V、約40V、約45V、約50V、約55V、約60V、約65Vまたは約70V）の電圧を含む。
いくつかの態様では、パルスの各々は、約1ms～約200ms、例えば約1ms～約100msである。例えば、パルスの各々は、約1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る。いくつかの態様では、パルスの各々は約50msからである。
いくつかの態様では、剤（例えば、治療薬）は、予め組織に投与されている。他の態様では、本方法は、剤（例えば、治療薬）を投与する工程をさらに含む。剤（例えば、治療薬）は、1つまたは複数のパルスと同時にまたは連続的に投与され得る。
前述の態様のいずれにおいても、剤（例えば、治療薬）は、核酸（例えば、非ウイルス核酸、例えば非ウイルス粒子核酸または裸の核酸）であり得る。核酸は、DNAまたはRNA（例えば、環状DNAまたは環状RNA）であり得る。
いくつかの態様では、標的細胞は網膜細胞である。網膜細胞は、例えば、網膜色素上皮（RPE）細胞、光受容細胞、または神経節細胞であり得る。
いくつかの態様では、治療薬は、硝子体内、網膜下、または局所的に眼に投与される。
いくつかの態様では、治療薬は、上脈絡膜に投与される。
本明細書に記載の方法に関連する構造を示す、眼の解剖学的断面図である。 図2A～2Dは、個体の標的網膜細胞に治療薬を送達する方法を示す図である。白線は電流の流れを表す。図2Aは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で単極針電極によって正の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。図2Bは、標的網膜細胞またはその近くの網膜下腔内（例えば、ブレブ内）で単極針電極によって負の電圧が伝達される網膜下パルス電場伝達を示す。図2Cは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で単極平面電極によって正の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。図2Dは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で単極平面電極によって負の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。 図3A～3Eは、個体の標的網膜細胞に治療薬を上脈絡膜送達する方法を示す図である。白線は電流の流れを表す。図3Aは、薬学的組成物の上脈絡膜注射を示す。白い矢印は、眼の後部領域に向かって（すなわち、標的網膜細胞に向かって、例えば、黄斑に向かって）上脈絡膜腔全体にわたる、注射時の薬学的組成物の分布経路を示す。図3Bは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で単極針電極によって正の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。図3Cは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で単極針電極によって負の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。図3Dは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で平面針電極によって正の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。図3Eは、標的網膜細胞の近くの硝子体液中で平面針電極によって負の電圧が伝達される硝子体内パルス電場伝達を示す。 図4Aおよび4Bは、本明細書に記載の装置を示す概略図である。図4Aは、細長い導体の遠位部分が実質的に直線状であるように、引き込み位置にあるシースおよび細長い導体を有する装置の断面を示す。細長い導体とシースとの間の絶縁体も示されている。図4Bは、細長い導体の遠位部分が半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して垂直な実質的に平坦な電極を形成するように、細長い導体が展開位置にある装置を示す。 図5は、細長い導体の遠位部分が半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して垂直な実質的に平坦な電極を形成するように、展開位置にある細長い導体を有する双極装置の概略図である。補助電極は、シースの遠位端に近位の、シースの外側表面で装置上に存在する。 図6は、展開位置にある実質的に平坦な電極を示す概略図である。細長い導体は、長手方向軸を中心に約2回転する螺旋形状である。細長い導体とシースとの間の絶縁体も示されている。 図7A～7Cは、硝子体液の後部に針電極を含む眼の横断面にわたる電圧分布（V/cm）を表す一連の電気シミュレーションプロットである。図7Aは、硝子体液-網膜界面から0.25mmだけオフセットされた針電極を示す。図7Bは、硝子体液-網膜界面の詳細を示す、図7Aの一部の拡大図である。図7Cは、硝子体液-網膜界面から0.95mmだけオフセットされた針電極を示す。 図8A～8Cは、硝子体液の後部に実質的に平坦な電極を含む眼の横断面にわたる電圧分布（V/cm）を表す一連の電気シミュレーションプロットである。図8Aは、硝子体液-網膜界面から0.95mmだけオフセットされた針電極を示す。図8Bは、硝子体液-網膜界面の詳細を示す、図8Aの一部の拡大図である。図8Cは、硝子体液-網膜界面から0.25mmだけオフセットされた実質的に平坦な電極を示す。 図9Aおよび9Bは、硝子体液の後部（硝子体液-網膜界面から0.4mm）に20V電極を含む眼の横断面にわたる電圧（例えば、電位）を表すシミュレーションプロットのセットである。図9Aは、針電極を示す。図9Bは、螺旋状の（実質的に平坦な）電極を示す。 図10は、シースの近位端がハンドルの遠位端の表面に配置されている、ハンドルおよびスライダを有する装置の概略図である。細長い導体は、ハンドル内の長手方向軸に沿って配置され、スライダに取り付けられている。 図11は、シースの近位端がハンドルの遠位端の表面を越えてハンドルの中空領域内に延びる、ハンドルおよびスライダを有する装置の概略図である。 図12A～12Cは、ハンドルおよびスライダを有する装置の概略図である。ハンドルは円筒形であり、遠位端および近位端の各々にキャップを含む。スライダは、ハンドル内に嵌合し、スライダを移動させる制御部材をさらに含む。図12Aは、細長い導体に接続された第1のシースを有する装置を示す。装置は、スライダに接続された第2のシースをさらに含む。図12Bは、ハンドルおよびスライダの分解図を示す。スライダは、ハンドルに接続された内部要素を含み得る。図12Cは、図12Bの斜視図を示す。 図13は、スライダの遠位端に位置するキャップの寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図14は、スライダの近位端に位置するキャップの寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図15は、例示的なハンドルの寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図16は、シース（18ゲージの皮下注射用針）の寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図17は、ハンドルの制御部材の寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図18は、絶縁体（ポリイミドチューブ）の寸法を示す概略図である。単位はインチで示されている。 図19は、スライダの寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図20は、シース（23ゲージの皮下注射針）の寸法を示す概略図のセットである。単位はインチで示されている。 図21Aおよび21Bは、GFP発現DNAの電気的導入後のブタ眼におけるGFP蛍光を測定する共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）画像である。図21Aは、鼻（左）または側頭（右）方向からのベースライン（電気的導入前）での蛍光を示す。図21Bは、鼻（左）または側頭（右）方向からの電気的導入後7日目（最終エンドポイント）の蛍光を示す。 図22A～22Dは、GFP発現DNAの電気的導入後のブタ眼における構造的完全性を示し、検出可能な炎症を示さない光干渉断層法（OCT）画像である。図22Aおよび22Bは、ベースライン（電気的導入前）からの画像である。図22Cおよび22Dは、鼻または側頭方向からの電気的導入後7日目（最終エンドポイント）の画像である。 図23Aおよび23Bは、電気的導入のために網膜下ブレブに配置された単極針電極を使用してGFPをコードする合成環状DNAベクターを電気的導入した後の成体ブタ眼の組織学を示す顕微鏡写真である。図23Aは、GFP発現（青色染色）が光受容体（PR）層および網膜色素上皮（RPE）層の両方で検出される免疫組織化学（IHC）を示す。錐体オプシンは黄色に染色される。図23Bは、網膜細胞構造の保存を示す、電気的導入後の網膜のH＆E染色を示す。 図24Aおよび24Bは、単極針電極を使用してGFPをコードする合成環状DNAベクターを電気的導入した後の成体ブタ眼のIHCを示す顕微鏡写真であり、その遠位端は網膜から1mm以内の硝子体内に配置された。図24Aにおいて、GFPは青色に染色され、RPE65は黄色に染色されている。図24Bにおいて、GFPは青色に染色され、錐体オプシンは黄色に染色されている。 図25は、双極針電極を使用してGFPをコードする合成環状DNAベクターを電気的導入した後の成体ブタ眼のIHCを示す顕微鏡写真であり、遠位端（負極）は網膜下ブレブに配置され、負極に近位の針上の正極は硝子体内に配置されている。GFPは青色に染色され、錐体オプシンは黄色に染色されている。 図26Aおよび26Bは、電気的導入を行わずにGFPをコードする合成環状DNAベクターを投与した後の成体ブタ眼の組織学を示す顕微鏡写真である。図26AはIHCを示し、有意なGFP発現（青色染色）は観察されなかった。錐体オプシンは黄色に染色される。図26Bは、網膜のH＆E染色を示す。 図27Aおよび27Bは、PBS対照の擬似電気的導入後の成体ブタ眼の組織学を示す顕微鏡写真である。図27AはIHCを示し、GFP発現（青色染色）は観察されなかった。図27Bは、網膜細胞構造の保存を示す、電気的導入後の網膜のH＆E染色を示す。 図28Aおよび28Bは、図6に示すような実質的に平坦な電極を使用してGFPをコードする合成環状DNAベクターを電気的導入した後の成体ブタ眼のIHC染色を示す顕微鏡写真である。図28Aは、青色のGFPおよび黄色のRPEの染色を示す。図28Bは、青色のGFPおよび黄色の錐体オプシンの染色を示す。 図29A～29Eは、培養誘導RPE細胞におけるGFP発現の時間経過を示す顕微鏡写真のセットである。各図は4つのパネルを有する;各図の左上のパネルは、電気的導入の非存在下でGFPをコードする合成環状DNAベクターと共にインキュベートした細胞におけるGFP蛍光を示す;各図の右上のパネルは、電気的導入の存在下でGFPをコードする合成環状DNAベクターと共にインキュベートした細胞におけるGFP蛍光を示す;各図の左下のパネルは、電気的導入の非存在下でGFPをコードする合成環状DNAベクターと共にインキュベートした誘導網膜色素上皮（iRPE）細胞の形態を示す明視野画像である;各図の右下のパネルは、電気的導入の存在下でGFPをコードする合成環状DNAベクターと共にインキュベートしたiRPE細胞の形態を示す明視野画像である。図29Aは、時間経過の4日目の細胞を示し、図29Bは、時間経過の21日目の細胞を示し、図29Cは、時間経過の32日目の細胞を示し、図29Dは、時間経過の40日目の細胞を示し、図29Eは、時間経過の49日目の細胞を示す。 図30は、qPCRによって測定した、インビボでブタ眼に電気的導入したABCA4導入遺伝子（C3-ABCA4）をコードする合成環状DNAベクターのmRNA発現を示す棒グラフである。内因性（endo）ブタABCA4を比較のために示す。PBSを注入し、陰性対照と同じPEF条件を使用して擬似電気的導入した。mRNA発現レベルを、神経網膜（NR）およびRPE/脈絡膜（RPE/Cho）において定量化した。 図31は、qPCRによって測定した、インビボで2つのブタ眼に電気的導入したGFPおよびMYO7A導入遺伝子をコードする合成環状DNAベクターのmRNA発現を示す棒グラフである。比較のために、内因性（endo）ブタMYO7Aを各眼で示す。mRNA発現レベルを、神経網膜（NR）およびRPE/脈絡膜（RPE/Cho）において定量化した。 図32Aおよび32Bは、ヒトABCA4（C3-ABCA4）をコードする8,656bpの合成環状DNAベクターの電気的導入の6日後のブタ網膜の組織学を示す顕微鏡写真である。図32Aは、青色に染色されたABCA4タンパク質（実線の矢印で示す）および褐色に染色されたRPE65（破線の矢印で示す）を示す。図32Bは、青色に染色されたABCA4タンパク質および黄色に染色されたロドプシンを示す。矢印は二重染色（緑色）を示す。 図33は、C3-ABCA4の電気的導入後の成体ブタ網膜の組織学を示す顕微鏡写真である。ABCA4タンパク質は青色に染色される（矢印で示す）。 図34は、ヒト網膜（未処理）の組織学を示す顕微鏡写真である。内因性ABCA4タンパク質は青色に染色される（矢印で示す）。 図35は、インビトロでのiRPE細胞におけるABCA4タンパク質発現を示すウェスタンブロットの写真である。レーン1は陰性対照である。レーン2～4に、プラスミド（レーン2および3）または合成環状DNAベクター（レーン3および4）でトランスフェクトした細胞からの試料を負荷した。導入遺伝子は、レーン1と3との間およびレーン2と4との間で、プラスミドと合成DNAベクターとの間で同じであった。 図36A～36Fは、インビトロでのABCA4をコードする合成環状DNAおよびABCA4をコードするプラスミドのエレクトロポレーション媒介トランスフェクション後のiRPE細胞の蛍光を示す顕微鏡写真である。図36A～36Cは、ABCA4をコードする合成環状DNAによるトランスフェクション後のZO-1/GFP（図36A）、ABCAA4（図36B）、ならびに重ね合わせたZO-1/GFPおよびABCA4（図36C）を示す。図36D～36Fは、プラスミドABCA4によるトランスフェクション後のZO-1/GFP（図36D）、ABCAA4（図36E）、ならびに重ね合わせたZO-1/GFPおよびABCA4（図36F）を示す。 図37は、インビトロでのiRPE細胞におけるMYO7Aタンパク質発現を示すウェスタンブロットの写真である。レーン1に、GFPをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞からの試料を負荷した。レーン2および3に、MYO7Aをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞からの試料を負荷した。レーン4に、レーン3と同じMYO7A導入遺伝子をコードする合成環状DNAベクターでトランスフェクトした細胞からの試料を負荷した。 図38A～38Fは、インビトロでのMYO7Aをコードする合成環状DNAおよびMYO7Aをコードするプラスミドのエレクトロポレーション媒介トランスフェクション後のiRPE細胞の蛍光を示す顕微鏡写真である。図38A～38Cは、MYO7Aをコードする合成環状DNAによるトランスフェクション後のZO-1/GFP（図38A）、MYO7A（図38B）、ならびに重ね合わせたZO-1/GFPおよびMYO7A（図38C）を示す。図38D～38Fは、プラスミドMYO7Aによるトランスフェクション後のZO-1/GFP（図38D）、MYO7A（図38E）、ならびに重ね合わせたZO-1/GFPおよびMYO7A（図38F）を示す。
詳細な説明
治療薬（およびその薬学的組成物）ならびに網膜細胞などの眼細胞へのその送達方法が本明細書で提供される。治療薬（例えば、治療用タンパク質をコードする核酸ベクター）は、治療薬の注射および/または標的組織（例えば、網膜）への電気エネルギー（例えば、電流）の伝達によって眼細胞（例えば、網膜細胞）に送達され得る。したがって、いくつかの場合には、本明細書に記載のアプローチは、眼組織（例えば、網膜）への電場の伝達が標的眼細胞（例えば、網膜細胞、例えば光受容体および/または網膜色素上皮細胞）への治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））の送達を促進するプロセスである電気的導入を含む。追加的または代替的に、本発明の方法は、個体への治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子、および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））の投与を含む。例えば、本明細書に記載の方法の特定の態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））は、個体に投与された（例えば、上脈絡膜投与によって）後、電気的導入によって標的細胞（例えば、網膜細胞）に送達される。
本発明はまた、網膜細胞（例えば、網膜色素上皮細胞、光受容細胞、または神経節細胞）などの標的細胞への治療薬の電気的導入のための装置および方法を特徴とする。装置は、実質的に平坦な電極を介して電気エネルギーを標的細胞に伝達する、引き込み可能な細長い導体を有するシースを含む。装置は、標的組織トポグラフィに適した電場を生成し、電場にさらされる細胞の領域を増加させ、平面構造を欠く電極（例えば、従来の針またはワイヤ電極）よりもミスアライメントに耐えることができる。次に、装置およびその使用方法のいくつかの態様は、有利には、例えば針または直線ワイヤ電極よりも低い電圧設定を必要とする。装置は、電極が、例えば直線ワイヤ電極と比較して、標的組織のより大きな深さおよびより大きな直径を覆う電場を生成するので、改善されたトランスフェクションを提供することができる。さらに、電極は、ワイヤ電極などの他の装置よりも大きな体積を覆う。装置はまた、ワイヤ電極ほど標的組織（例えば、網膜）からの位置の変化に敏感ではない。さらに、丸みを帯びた電極または螺旋状の電極を提供することによって、装置は、標的に向ける鋭い特徴とは対照的に、その標的（例えば、網膜）との非外傷性界面を有する。
I. 定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、および本出願で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する公開されたテキストを参照して、一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される定義と参照される刊行物の定義との間に矛盾する定義がある場合、本明細書に提供される定義が優先されるものとする。
本明細書で使用される場合、「上脈絡膜」および「上脈絡膜腔」という用語は、強膜と脈絡膜との間の眼の領域内の空間（もしくは体積）および/または潜在的な空間（もしくは潜在的な体積）を指すために交換可能に使用され、強膜棘の領域内で前方に結合し、脈絡膜への短い後毛様体血管の経強膜接続部によって後方に結合する。上脈絡膜腔は、主に、2つの隣接する組織のそれぞれに由来する長い色素性突起の密集した層から構成される;しかしながら、上脈絡膜腔および隣接組織における流体または他の物質の蓄積の結果として、この領域に空間が生じ得る。上脈絡膜腔は、眼の何らかの疾患状態のために、または何らかの外傷もしくは外科的介入の結果として、流体の蓄積によって拡張され得る。いくつかの態様では、上脈絡膜腔を作り出すおよび/またはさらに拡張するために、上脈絡膜腔への薬学的組成物の注入によって流体の蓄積が意図的に作り出される。
本明細書で使用される場合、「マイクロニードル」という用語は、強膜および/または他の眼組織への挿入に適した基部、シャフト、および先端を有する導管本体を指し、本明細書に記載される低侵襲性の挿入および製剤注入に適した寸法を有する。マイクロニードルの長さ（すなわち、マイクロニードルのシャフトの長さおよびマイクロニードルのベベル高さ）は2mmを超えず、マイクロニードルの直径は600ミクロンを超えない。
本明細書で使用される場合、「電気的導入」は、細胞が存在する微小環境（例えば、網膜）への電場（例えば、パルス電場）の伝達によって引き起こされる、標的細胞の膜を横切る（例えば、標的細胞、例えば網膜細胞の外側から内側へ）分子（例えば、核酸、例えば裸の核酸）の移動を指す。電気的導入は、分子の電荷に基づいて、電気泳動、すなわち、電場に沿った分子（例えば、核酸、例えば裸の核酸）の移動（例えば、電流の方向に）の結果として起こり得る。電気泳動は、例えば、生体内輸送プロセス（例えば、飲作用もしくは食作用を含むエンドサイトーシス）または受動輸送（例えば、拡散もしくは脂質分配）が分子を細胞内に運ぶことを可能にするために、分子（例えば、核酸、例えば裸の核酸）を細胞膜の近くに移動させることによって、電気的導入を誘導することができる。追加的または代替的に、電気的導入は、エレクトロポレーション、すなわち電場（例えば、パルス電場）の伝達によって引き起こされる標的細胞における細孔の生成の結果として起こり得、ここで、細孔のサイズ、形状、および持続時間は、標的細胞の外側から標的細胞の内側への分子（例えば、核酸、例えば裸の核酸）の移動に適応するのに適している。したがって、いくつかの場合には、電気的導入は、電気泳動とエレクトロポレーションの組合せの結果として起こる。
本明細書で使用される場合、「弛緩する」という用語およびその文法的派生語は、弾性ポテンシャルエネルギーの除荷によって駆動される、拘束形状から非拘束形状への構造の形状の変化を指す。形状記憶材料（例えば、形状記憶合金、例えばNiTi）は、構造的拘束が取り除かれると予め形成された形状へと弛緩することができる。例えば、剛性シース内に収容された予め形成された形状記憶ワイヤは、それが脱鞘されるまで直線状であり、その時点で、形状記憶材料はその予め形成された形状へと弛緩する。
本明細書で使用される場合、「螺旋」は、中心点から遠ざかるかまたは中心点に近づきながら中心点の周りを移動する平面内の点の経路を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に平坦な電極」は、その垂直寸法（例えば、デカルト寸法、例えば深さおよび幅）のうちの2つが、それぞれその第3の垂直寸法（例えば、長さ）の少なくとも2倍である電極を指す。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、その垂直寸法のうちの2つがそれぞれ、その第3の垂直寸法の少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、または少なくとも100倍、またはそれを超える電極を指す。
本明細書で使用される場合、「環状DNAベクター」という用語は、環状形態のDNA分子を指す。そのような環状形態は、典型的には、ローリングサークル増幅によってコンカテマーに増幅することができる。その末端に結合した鎖を有する直鎖状二本鎖核酸（例えば、例えばヘアピンループまたは他の構造によって、共有結合的にコンジュゲートされた骨格）は、本明細書で使用される環状ベクターではない。「環状DNAベクター」という用語は、本明細書では「共有結合的に閉じた環状DNAベクター」という用語と交換可能に使用される。当業者は、そのような環状ベクターが、本明細書に記載されるように、スーパーコイル化および複雑なDNAトポロジーで共有結合的に閉じられたベクターを含むことを理解するであろう。いくつかの態様では、環状DNAベクターは、スーパーコイル状ではない（例えば、開環状）。特定の態様では、環状DNAベクターは、スーパーコイル状である。特定の場合には、環状DNAベクターは、細菌複製起点を欠く。
本明細書で使用される場合、環状DNAベクターを作製する「無細胞」法は、鋳型DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター）を提供する工程から環状DNAベクターを作製する工程まで、方法の任意の工程を容易にするために、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））宿主細胞などの宿主細胞内でのDNAのいずれかの封じ込めに依存しない方法を指す。例えば、無細胞法は、DNAの増幅、修飾、および単離を容易にするために酵素および他の剤を添加し得る、適切な溶液（例えば、緩衝溶液）内の1つまたは複数の合成容器（例えば、ガラスもしくはプラスチックチューブ、バイオリアクタ、容器、タンク、または他の適切な容器）内で行われる。無細胞作製法は、細胞内で生成された鋳型DNAを使用し得る。
本明細書で使用される場合、「組換え部位」という用語は、部位特異的組換えの産物である核酸配列を指し、これは、第1のリコンビナーゼ結合部位の一部に対応する第1の配列および第2のリコンビナーゼ結合部位の一部に対応する第2の配列を含む。ハイブリッド組換え部位の一例はattRであり、これは部位特異的組換えの産物であり、attPの一部に対応する第1の配列およびattBの一部に対応する第2の配列を含む。あるいは、組換え部位は、Cre/Lox組換えから生成され得る。したがって、Cre/Lox組換えから生成されたベクター（例えば、LoxP部位を含むベクター）は、本明細書で使用される組換え部位を含む。組換え部位を生成する他の部位特異的組換え事象は、例えば、ラムダインテグラーゼ、FLPリコンビナーゼ、およびKwリコンビナーゼを含む。非部位特異的組換え事象（例えば、ITR媒介分子間組換え）から生じる核酸配列は、本明細書で定義される組換え部位ではない。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、非共有結合している多量体（例えば、二量体、三量体など）タンパク質（例えば、四次構造を有するタンパク質）を含む、ペプチド結合を介して（すなわち、一次構造として）互いに結合した複数のアミノ酸を指す。したがって、「タンパク質」という用語は、ペプチド、天然タンパク質、組換えタンパク質、およびそれらの断片を包含する。いくつかの態様では、タンパク質は、生理学的条件下で一次構造を有し、二次、三次、または四次構造を有さない。いくつかの態様では、タンパク質は、生理学的条件下で一次および二次構造を有し、三次または四次構造を有さない。特定の態様では、タンパク質は、生理学的条件下で一次構造、二次構造、および三次構造を有するが、四次構造を有さない（例えば、1つまたは複数の折り畳まれたアルファヘリックスおよび/またはベータシートを有する単量体タンパク質）。いくつかの態様では、本明細書に記載されるタンパク質のいずれも、少なくとも25アミノ酸（例えば、50～1,000アミノ酸）の長さを有する。
「治療配列」、「治療遺伝子」および「異種遺伝子」という用語は、投与される導入遺伝子（例えば、DNAベクターまたは自己複製RNA分子の一部として）を指すために交換可能に使用される。治療遺伝子は、治療遺伝子を受ける個体によって内因的に発現されるタンパク質または個体によって発現される非機能性変異タンパク質と置き換わるタンパク質をコードする哺乳動物遺伝子であり得る。
本明細書で使用される場合、「突然変異に関連する障害」、「障害に関連する突然変異」、またはタンパク質もしくは遺伝子「関連」障害（例えば、ABCA4関連網膜ジストロフィ）という用語は、障害と遺伝子またはタンパク質における突然変異との間の相関を指す。いくつかの態様では、突然変異に関連する障害は、突然変異によって全体的もしくは部分的に、または直接的もしくは間接的に引き起こされることが公知であるか、または疑われる。例えば、突然変異を有する対象は障害を発症するリスクがあり得、そのリスクは、さらに、他の（例えば、独立した）突然変異（例えば、同じもしくは異なる遺伝子における）などの他の因子、または環境因子に依存し得る。
「ABCA4」という用語は、特に明記されない限り、霊長動物（例えば、ヒトおよびカニクイザル）およびげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物、ならびに機能的に等価または改善された変異体（例えば、天然または合成変異体）、例えば突然変異体、ムテイン、類似体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、およびそれらの断片を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ABCA4を指す。機能的に等価および改善された変異体は、公知のABCA4シグナル伝達に基づいて決定することができる。ABCA4は、全長のプロセシングされていないABCA4、ならびに細胞における天然のプロセシングから生じる任意の形態のABCA4を包含する。例示的なヒトABCA4配列は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Reference Sequence:NG＿009073として提供される。いくつかの場合には、ABCA4は、SEQ ID NO:16と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:16と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する治療遺伝子によってコードされる。いくつかの場合には、ABCA4は、SEQ ID NO:17と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:17と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する治療遺伝子によってコードされる。いくつかの場合には、ABCA4タンパク質は、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する。
「MYO7A」という用語は、特に明記されない限り、霊長動物（例えば、ヒトおよびカニクイザル）およびげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物、ならびに機能的に等価または改善された変異体（例えば、天然または合成変異体）、例えば突然変異体、ムテイン、類似体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、およびそれらの断片を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のMYO7A（DFNB2、MYU7A、NSRD2、USH1B、DFNA11、またはMYOVIIAとしても公知）を指す。機能的に等価の変異体および改善された変異体は、公知のMYO7Aシグナル伝達に基づいて決定することができる。MYO7Aは、全長のプロセシングされていないMYO7A、ならびに細胞における天然のプロセシングから生じる任意の形態のMYO7Aを包含する。例示的なヒトMYO7A配列は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Gene ID:4647として提供される。いくつかの場合には、MYO7Aは、SEQ ID NO:1のいずれか1つと少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:1と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する治療遺伝子によってコードされる。いくつかの場合には、治療遺伝子によってコードされるMYO7Aは、SEQ ID NO:2～9のいずれか1つと少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:2～9のいずれか1つと少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性）を有する。
「ベストロフィン1（BEST1）」という用語は、特に明記されない限り、霊長動物（例えば、ヒトおよびカニクイザル）およびげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物、ならびに機能的に等価または改善された変異体（例えば、天然または合成変異体）、例えば突然変異体、ムテイン、類似体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、およびそれらの断片を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のBEST1（ARB、BMB、BEST、RP50、VMD2、TU15B、またはBest1V1デルタ2としても公知）を指す。機能的に等価および改善された変異体は、公知のBEST1シグナル伝達（例えば、RPE細胞におけるCa2＋シグナル伝達）に基づいて決定することができる。BEST1は、全長のプロセシングされていないBEST1、ならびに細胞における天然のプロセシングから生じる任意の形態のBEST1を包含する。例示的なヒトBEST1配列は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Gene ID:7439として提供される。いくつかの場合には、BEST1は、SEQ ID NO:10と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:10と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する治療遺伝子によってコードされる。いくつかの場合には、治療遺伝子によってコードされるBEST1は、SEQ ID NO:11～13のいずれか1つと少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:11～13のいずれか1つと少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性）を有する。
「補体因子H（CFH）」という用語は、特に明記されない限り、霊長動物（例えば、ヒトおよびカニクイザル）およびげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物、ならびに機能的に等価または改善された変異体（例えば、天然または合成変異体）、例えば突然変異体、ムテイン、類似体、サブユニット、受容体複合体、アイソタイプ、スプライス変異体、およびそれらの断片を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然のCFH（FH、HF、HF1、HF2、HUS、FHL1、AHUS1、AMBP1、ARMD4、ARMS1、またはCFHL3としても公知）を指す。機能的に等価および改善された変異体は、公知のCFHシグナル伝達（例えば、RPE細胞におけるCa2＋シグナル伝達）に基づいて決定することができる。CFHは、全長のプロセシングされていないCFH、ならびに細胞における天然のプロセシングから生じる任意の形態のCFHを包含する。例示的なヒトCFH配列は、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Gene ID:3075として提供される。いくつかの場合には、CFHは、SEQ ID NO:14と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:14と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％の配列同一性）を有する治療遺伝子によってコードされる。いくつかの場合には、治療遺伝子によってコードされるCFHは、SEQ ID NO:15と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:15と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性）を有する。
本明細書で使用される場合、治療遺伝子、レプリカーゼ、またはそれらの断片の「変異体」は、天然に存在するアミノ酸配列またはある1つのアミノ酸配列などの参照アミノ酸配列と少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる。これに関連して、少なくとも1つのアミノ酸残基の相違は、例えば、あるアミノ酸残基の別のアミノ酸への変異、欠失または挿入からなり得る。変異体は、本明細書で定義される治療用タンパク質またはその断片のホモログ、アイソフォームまたは転写変異体であり得、ここで、ホモログ、アイソフォームまたは転写変異体は、本明細書で定義される同一性または相同性の程度によってそれぞれ特徴付けられる。
いくつかの場合には、治療遺伝子の変異体またはその断片は、少なくとも1つのアミノ酸置換（例えば、1～100個のアミノ酸置換、1～50個のアミノ酸置換、1～20個のアミノ酸置換、1～10個のアミノ酸置換、例えば、1個のアミノ酸置換、2個のアミノ酸置換、3個のアミノ酸置換、4個のアミノ酸置換、5個のアミノ酸置換、6個のアミノ酸置換、7個のアミノ酸置換、8個のアミノ酸置換、9個のアミノ酸置換、または10個のアミノ酸置換）を含む。同じクラスからのアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正または負に帯電した側鎖、側鎖またはアミノ酸に芳香族基を有するアミノ酸であり、その側鎖は水素架橋を形成することができ、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖である。保存的性質により、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、対応する極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換され得るか、または例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、対応する疎水性側鎖を有する別のアミノ酸で置換され得る（例えば、トレオニン（セリン）によるセリン（トレオニン）またはイソロイシン（ロイシン）によるロイシン（イソロイシン））。特定の態様では、タンパク質またはその断片の変異体は、本発明による核酸によってコードされ得、ここで、アミノ酸配列の少なくとも1つのアミノ酸残基は、それぞれの天然に存在する配列などの参照配列と比較して少なくとも1つの保存的置換を含む。
いくつかの場合には、挿入、欠失、および/または非保存的置換も、例えばタンパク質の三次元構造の実質的な改変を引き起こさない位置で、変異体という用語に包含される。1つまたは複数の挿入または1つまたは複数の欠失による三次元構造の改変は、例えばCDスペクトル（円二色性スペクトル）を使用して、当業者によって容易に決定され得る。
2つの配列（例えば、核酸配列、例えば、DNA、RNAまたはアミノ酸配列）が同一であるパーセンテージを決定するために、その後互いに比較するために、配列を整列させることができる。この目的のために、ギャップを第1の配列の配列に挿入することができ、第2の配列の対応する位置の成分を比較することができる。第1の配列内の位置が第2の配列内の対応する位置の場合と同じ成分によって占有される場合、2つの配列はこの位置で同一である。2つの配列が同一であるパーセンテージは、同一の位置の数を位置の総数で除した関数である。2つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。使用することができる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、Karlin et al.（1993）,PNAS USA,90:5873-5877またはAltschul et al.（1997）,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、例えばBLASTプログラムに組み込むことができる。本発明の配列とある程度同一の配列をこのプログラムによって同定することができる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に生成され、天然の宿主ゲノムに組み込まれていないことを意味する。例えば、単離された核酸ベクターは、脂質エンベロープ（例えば、リポソーム）またはポリマーマトリックスに封入された核酸ベクターを含む。いくつかの態様では、「単離された」という用語は、（i）インビトロで（例えば、無細胞環境で）、例えばローリングサークル増幅もしくはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅された;（ii）分子クローニングによって組換え生産された;（iii）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分画、もしくはカラムクロマトグラフィなどによって精製された;または（iv）例えば化学合成によって合成された、DNAベクターを指す。単離された核酸ベクターは、当技術分野で周知の組換えDNA技術によって容易に操作可能なものである。したがって、5'および3'制限部位が公知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマ配列が開示されているベクターに含まれるヌクレオチド配列は単離されていると見なされるが、その天然宿主中にその天然状態で存在する核酸配列は単離されていると見なされない。単離された核酸ベクターは、実質的に精製されていてもよいが、精製されている必要はない。
本明細書で使用される場合、「裸の」という用語は、別の剤と複合体化して（例えば、別の剤に封入されて、コンジュゲートされて、または非共有結合されて）いない核酸分子（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター）を指す。したがって、エンベロープ（例えば、脂質エンベロープ）内の核酸または共有結合もしくは非共有結合したユニットのマトリックス（例えば、合成ポリマーマトリックスまたはペプチドもしくはタンパク質マトリックス）は、本明細書で使用される場合、裸の核酸分子ではない。裸の核酸分子は、緩衝剤などの裸の核酸分子と複合体化していない剤と共製剤化され得る（例えば、溶液に）。本発明のいくつかの場合には、薬学的組成物は裸の環状DNAベクターを含む。裸のDNAの一例は、本明細書に記載の共有結合閉環状DNA（C3-DNA）である。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、関心対象の配列（例えば、治療遺伝子、治療配列、または異種遺伝子）を担持することができる核酸分子であって、治療遺伝子がその後標的細胞内で複製され、プロセシングされ、および/または発現され得る標的細胞に連結されている核酸分子を指す。標的細胞または宿主細胞がベクターの関心対象の配列（例えば、ゲノム）をプロセシングした後、関心対象の配列（例えば、ゲノム）はベクターと見なされない。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントが連結され得る細菌骨格を含有する環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるDNAセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に、「組換えベクター」または「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、治療遺伝子によってコードされる調節タンパク質を発現する細胞を指す。いくつかの態様では、標的細胞は網膜細胞である。例えば、特定の態様では、標的細胞はRPE細胞である。他の態様では、標的細胞は光受容体である。特定の態様では、RPE細胞および光受容体が標的細胞である。
本明細書で使用される場合、「個体」という用語は、本明細書に記載の治療または予防方法を必要とする任意の哺乳動物（例えば、網膜ジストロフィを有する哺乳動物）を含む。いくつかの態様では、個体はヒトである。他の態様では、個体は、非ヒト哺乳動物（例えば、非ヒト霊長動物（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、またはイヌ）である。対象は、雄性であってもよく、または雌性であってもよい。一態様では、個体は、アッシャー症候群1B型を有する。いくつかの態様では、個体は、Best1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異、例えば、常染色体劣性ベストロフィノパチー、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィ、BEST1成人発症卵黄様黄斑ジストロフィ、または常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症に関連するベストロフィノパチーを有する。いくつかの態様では、個体は、加齢黄斑変性症を有する。
本明細書で使用される場合、治療薬（例えば、核酸ベクター）またはその組成物の「有効量」または「有効用量」は、例えば、選択された投与形態、経路および/またはスケジュールに従って個体に投与された場合に、所望の生物学的および/または薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。当業者に理解されるように、有効な特定の組成物の絶対量は、所望の生物学的または薬理学的エンドポイント、送達される剤、標的組織などの要因に依存して異なり得る。当業者は、「有効量」が、細胞と接触させることができるか、または単回用量でもしくは複数回用量の使用によって対象に投与することができることをさらに理解するであろう。眼疾患を治療するための組成物の有効量は、参照集団、例えば未処置もしくはプラセボ集団、または標準的ケア治療を受けている集団と比較して、疾患進行を遅延または停止させ得（例えば、視覚機能）、部分奏効または完全奏効を増加させ得る（例えば、視覚機能）。
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）とは、治療されている個体の自然経過を変化させようとする臨床介入を指し、これは、予防のために、または臨床病理の経過中に行われ得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および予後の改善が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、本発明の核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）は、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行を遅くするために使用される。
「低減するまたは阻害する」とは、好ましくは20％または20％超、より好ましくは50％または50％超、および最も好ましくは75％、85％、90％、95％、またはそれ以上の全体的な減少を生じさせる能力を意味する。
「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は交換可能に使用され、一般に、生物学的試料（例えば、網膜）中のポリヌクレオチドまたはアミノ酸産物またはタンパク質の量を指す。「発現」は、一般に、遺伝子にコードされた情報が、細胞内に存在し、細胞内で作動する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によれば、遺伝子の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、またはタンパク質の翻訳後修飾を指し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、または翻訳後修飾されたタンパク質の断片も、それらが選択的スプライシングによって生成された転写物もしくは分解された転写物に由来するか、または例えばタンパク質分解による、タンパク質の翻訳後プロセシングに由来するかにかかわらず、発現されたと見なされる。「発現遺伝子」には、mRNAとしてポリヌクレオチドに転写され、次いでタンパク質に翻訳されるもの、またRNAに転写されるがタンパク質に翻訳されないもの（例えば、転移およびリボソームRNA）も含まれる。
本明細書で使用される場合、「送達すること」、「送達する」、およびそれらの文法的変形は、剤（例えば、治療薬）を標的細胞にアクセスさせることを意味する。剤が、標的細胞が存在する器官または組織へのアクセスを獲得するように、剤は、標的細胞を有する個体への剤の投与（例えば、剤の全身投与または局所投与）によって送達され得る。追加的または代替的に、剤は、剤を保有する組織または器官に刺激を加えることによって送達され得、刺激は、剤を標的細胞に進入させる。したがって、いくつかの場合には、剤は、組織内の標的細胞への剤の電気的導入に適した条件で、剤を保有する組織に電場を伝達することによって標的細胞に送達される。
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、本発明の治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、核酸ベクターを含む薬学的組成物）の投与量を個体に与える方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、眼内、例えば、上脈絡膜に投与することができる。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、眼内、例えば、硝子体内、網膜下、または眼周囲に投与することができる。追加的または代替的に、組成物は、静脈内、皮下、皮内、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腹腔、結膜下、小胞内、粘膜、心臓内、臍内、経口、局所、経皮、結膜、腱下、前房内、網膜下、球後、小管内に、吸入によって、注射によって、移植によって、注入によって、連続注入によって、直接標的細胞を局所灌流浴することによって、カテーテルによって、洗浄によって、クリーム中で、または脂質組成物中で送達することができる。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、全身投与することができる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物または組成物および治療される状態、疾患または障害の重症度）に依存して異なり得る。
「と組み合わせて投与される」とは、同じ治療レジメンの一部としての複数の治療成分の投与を指す。本発明の治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））は、パルス電場療法と組み合わせて、例えば、同じ外来患者処置の一部として、または複数日間にわたって投与することができる。追加的または代替的に、本発明の核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）は、別の治療薬と組み合わせて（例えば、同じ薬学的組成物の一部として、または別々の薬学的組成物として、同時にまたは異なる時間に）投与することができる。
「1つの」という用語は、「1つまたは複数の」を意味する。例えば、「1つの細胞」は、1つまたは複数の細胞を表すと理解される。したがって、「1つの」、「1つまたは複数の」、および「の少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に指定されない限り、基準値から±10％以内の変動の値を指す。
II. 治療薬および組成物
本発明は、眼の疾患および障害を治療するための治療薬を含む。眼標的細胞（例えば、網膜細胞）への送達による眼疾患（例えば、網膜ジストロフィ）の治療に適した任意の治療薬が、本発明の一部として企図される。そのような治療薬には、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター）、治療用タンパク質、小分子薬物、およびそれらの薬学的組成物が含まれる。例示的な核酸ベクターとしては、環状DNAベクター（例えば、ABCA4、MYO7A、BEST1およびCFHを含む治療用置換タンパク質（例えば、健康な細胞において内因的に発現されるタンパク質と置き換わるタンパク質）をコードする環状DNAベクター）が挙げられる。本明細書に記載の核酸ベクターのいずれも、薬学的に許容される担体中の薬学的組成物の一部であり得る。
核酸ベクター
本発明の核酸ベクターには、非ウイルス核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクターまたは非ウイルスRNAベクター、例えば、環状DNAベクターおよび環状RNAベクター）が含まれる。特定の場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNA（例えば、裸の環状DNA（例えば、合成環状DNA）または裸の線状DNA（例えば、閉端DNAもしくはドギーギボーンDNA））または裸のRNA（例えば、裸の環状RNA）である。
本発明のいくつかの態様は、環状DNAベクターを含む。いくつかの場合には、本明細書に記載の治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）を担持するのに有用な環状DNAベクターは、プラスミドDNAベクターであり得る。本発明の特定の場合には、環状DNAベクターは、プラスミド骨格要素（例えば、（i）細菌複製起点および/または（ii）薬物耐性遺伝子などの細菌要素）を欠くという点で従来のプラスミドDNAベクターとは異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載の治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）のいずれかをコードする環状DNAベクターは、組換え部位（例えば、無細胞プロセスを用いて作製された合成環状DNAベクター）を欠く。代替的な態様では、本明細書に記載の環状DNAベクターは組換え部位を含む（例えば、ミニサークルDNAベクター）。
本発明の環状DNAベクターは、エピソームとして細胞内で（例えば、有糸分裂後細胞などの静止細胞内で）存続することができる。本明細書で提供されるベクターは、細菌プラスミドDNA成分、例えば免疫原性成分（例えば、免疫原性細菌シグネチャ（例えば、CpGモチーフ））、またはそれに加えてもしくはそれ以外に持続性の低下に関連する成分（例えば、CpGアイランド）を欠くことができる。例えば、いくつかの態様では、ベクターは、DNAの少なくとも50％（例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％、または本質的に全て）が、細菌プラスミドDNAの1つまたは複数の要素、例えば免疫原性成分（例えば、免疫原性細菌シグネチャ（例えば、CpGモチーフ））またはそれに加えてもしくはそれ以外に持続性の低下に関連する成分（例えば、CpGアイランド）を欠くDNAを含む。いくつかの態様では、DNAの少なくとも50％（例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％、または本質的に全て）がCpGメチル化を欠く。いくつかの態様では、ベクターは、DNAの少なくとも50％（例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、少なくとも99.9％、または本質的に全て）が、Damメチル化およびDcmメチル化などの細菌メチル化シグネチャを欠くDNAを含む。例えば、いくつかの態様では、ベクターは、GATC配列の少なくとも50％（例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または本質的に全て）がメチル化（例えば、Damメチラーゼによる）されていないDNAを含む。追加的または代替的に、ベクターは、CCAGG配列および/またはCCTGG配列の少なくとも50％（例えば、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または本質的に全て）がメチル化（例えば、Dcmメチラーゼによる）されていないDNAを含む。
前述のベクターのいずれかのいくつかの態様では、DNAベクターはインビボで持続性である（例えば、環状性および非細菌性（すなわち、インビトロ（例えば、無細胞）合成による）は、DNAベクターの治療遺伝子の長期転写または発現に関連する）。いくつかの態様では、環状DNAベクターの持続性は、参照ベクター（例えば、細菌中で産生されるか、または本発明のベクター中に存在しない1つもしくは複数の細菌シグネチャを有する環状ベクター）よりも5％～50％大きい、50％～100％大きい、1倍～5倍、または5倍～10倍（例えば、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、もしくはそれ以上）大きい。いくつかの態様では、本発明の環状DNAベクターは、1週間～4週間、1ヶ月間～4ヶ月間、4ヶ月間～1年間、1年間～5年間、5年間～20年間、または20年間～50年間（例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも5年、少なくとも10年、少なくとも20年、少なくとも30年、少なくとも40年、または少なくとも50年）持続する。
本発明の環状DNAベクターは、治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）の5'側に機能的に連結されたプロモータを含み得る。プロモータが治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）の転写を行うことができる場合、プロモータはその治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）に機能的に連結されている。環状DNAベクターの一部として使用することができるプロモータとしては、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、天然プロモータ、および組織特異的プロモータが挙げられる。構成的プロモータの例としては、サイトメガロウイルス（CMV）プロモータ（CMVエンハンサを有していてもよい）、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモータ（RSVエンハンサを有していてもよい）、SV40プロモータ、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモータ、β-アクチンプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモータ、およびEF1-アルファプロモータが挙げられる。本発明の特定の態様では、環状DNAベクターはCMVプロモータを含む。いくつかの態様では、環状DNAベクターはCAGプロモータを含む。
あるいは、本発明の環状DNAベクターは、誘導性プロモータを含む。誘導性プロモータは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製細胞のみにおいて調節され得る。外因的に供給されるプロモータによって調節される誘導性プロモータの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモータ、T7ポリメラーゼプロモータ系、エクジソン昆虫プロモータ、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、RU486誘導系、およびラパマイシン誘導系が挙げられる。これに関連して有用であり得るさらに他のタイプの誘導性プロモータは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて調節されるものである。誘導性プロモータおよび誘導系は、様々な商業的供給源から入手可能である。
本発明の環状DNAベクターはまた、自己複製RNA分子をコードする配列の3'側にポリアデニル化配列を含み得る。有用なポリアデニル化配列には、20nt超（例えば、25nt超、30nt超、35nt超、40nt超、50nt超、60nt超、70nt超、または80nt超、例えば、20～100nt、30～100nt、40～100nt、50～100nt、60～100nt、70～100nt、80～100nt、100～200nt、200～300nt、または300～400nt、またはそれ以上）の伸長したポリアデニル化配列が含まれる。
DNA複製起点および/または薬物耐性遺伝子などの細菌要素を欠く環状DNAベクターは、従来のDNAベクター（例えば、プラスミド）よりも長く、かつ裸のRNAよりも長く個体において存続することができる。
環状DNAベクターは、様々なサイズおよび形状を有することができる。本発明の治療遺伝子（例えば、治療用置換遺伝子）を担持する環状DNAベクターは、2.5kb～20kbの長さ（例えば、5kb～19kb、6kb～18kb、7kb～16kb、8kb～14kbまたは9kb～12kb、例えば5kb～6kb、6kb～7kb、7kb～8kb、8kb～9kb、9kb～10kb、10kb～11kb、11kb～12kb、12kb～13kb、13kb～14kb、14kb～15kb、15kb～16kb、16kb～18kb、または18kb～20kbの長さ、例えば、約3kb、約4kb、約5kb、約6kb、約7kb、約8kb、約9kb、約10kb、約10.5kb、約11kb、約11.5kb、約12kb、約12.5kb、約13kb、約14kb、約15kb、約16kb、約17kb、約18kb、約19kb、または約20kbの長さ）であり得る。
本発明の一部として有用な環状DNAベクターは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される様々な手段によって容易に合成することができる。例えば、プラスミド骨格要素（例えば、（i）細菌複製起点および/または（ii）薬物耐性遺伝子などの細菌要素）を欠く環状DNAベクターは、細菌に基づく方法と比較してより純粋な組成物を提供することができるインビトロ（無細胞）法を用いて作製することができる。そのようなインビトロ合成法は、例えばローリングサークル増幅を用いる複製ツールとして、Phi29ポリメラーゼなどのファージポリメラーゼの使用を含み得る。環状DNAベクターのインビトロ合成の特定の方法は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2019/178500号にさらに記載されている。
いくつかの場合には、核酸ベクターは非ウイルス核酸ベクターである（例えば、核酸ベクターはウイルスキャプシド内に封入されていない）。追加的または代替的に、いくつかの態様では、核酸ベクターは、エンベロープ（例えば、脂質エンベロープ）またはマトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）に封入されておらず、個体への投与前および投与後に固体構造体（例えば、微粒子構造体）と物理的に会合（例えば、共有結合的または非共有結合的に結合）していない。いくつかの態様では、核酸ベクターは、核酸ベクターの溶液中で、各核酸ベクターが隣接する核酸ベクターとは独立して自由に拡散するように、いずれの隣接する核酸ベクターにも束縛されない。いくつかの態様では、核酸ベクターは、電荷変更分子または安定化分子などの液体溶液中の別の剤と会合する。
核酸ベクターは、裸の核酸ベクター、すなわち別の剤と複合体化して（例えば、別の剤に封入されて、コンジュゲートされて、または非共有結合されて）いない核酸ベクターであり得る。裸の核酸分子は、裸の核酸分子と複合体化していない剤、例えば緩衝剤および/または米国食品医薬品局によって一般に安全と認められている（GRAS）剤と共製剤化され得る（例えば、溶液に）。
治療遺伝子
本明細書に記載の核酸ベクターは、治療遺伝子、例えば治療用置換タンパク質をコードする治療遺伝子または治療配列を含む。治療用置換タンパク質は、健康な細胞、例えば健康な網膜細胞で内因的に発現されるタンパク質、または治療されている個体によって発現される非機能性変異タンパク質と置き換わることができる。したがって、治療用置換タンパク質をコードする本発明の核酸ベクターは、遺伝子置換療法および/または遺伝子増強療法として投与することができることが理解されるであろう。
本発明の治療遺伝子には、眼遺伝子（例えば、網膜などの眼組織で発現されるタンパク質をコードする遺伝子）が含まれる。いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）は、MYO7A、BEST1、CFH、CEP290、USH2A、ADGRV1、CDH23、CRB1、PCDH15、RPGR、ABCA4、ABCC6、RIMS1、LRP5、CC2D2A、TRPM1、C3、IFT172、COL11A1、TUBGCP6、KIAA1549、CACNA1F、SNRNF200、PRPF8、VCAN、USH2A、HMCN1、RPE65、NR2E3、NRL、RHO、RP1、RP2、またはOFD1からなる群より選択される。いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）は常染色体優性遺伝子である。いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）は常染色体劣性遺伝子である。いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）はX連鎖遺伝子である。
いくつかの態様では、核酸ベクターによってコードされる治療用タンパク質は、網膜色素上皮特異的タンパク質、アドレナリン受容体アルファ2A、アミロイドベータ（A4）前駆体タンパク質、補体成分3、補体成分5、補体因子D（アディプシン）、トロンボスポンジン受容体、補体成分5受容体1、HIF1A、神経成長因子受容体、STAT3、VEGFA、PDGFR、VEGFR1/2、プラスミノーゲン、チロシンキナーゼ、mTOR、第III因子、カドヘリン、ケモカイン受容体（3/4）、インテグリンA5、胎盤成長因子、プロテインチロシンホスファターゼ、S1PR1、vRaf、TGFベータ、HtrAセリンペプチダーゼ1、TNF受容体10A、NOTCH4、インスリン様成長因子結合タンパク質7、Ras応答性エレメント結合タンパク質1、構成因子H、構成因子B、補体成分3、補体成分2、補体因子I、肝リパーゼ、コレステリルエステル転移タンパク質、ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ40、ミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼ2、テネイシンXB、X型コラーゲンアルファ1、ミエリン塩基性タンパク質、VIII型コラーゲンアルファ1、ベストロフィン1、炭水化物（N-アセチルグルコサミン6-0）スルホトランスフェラーゼ6、網膜色素変性症GTPアーゼ、グアニル酸シクラーゼ系（2D、A1A）、カルシウムチャネル（A2、LA1F）、ペリフェリン2、カドヘリン1、コロイデレミア（Rabエスコートタンパク質1）、グアニル酸シクラーゼ2D、ペリフェリン2、ミトコンドリアコードATPシンターゼ、ミトコンドリアコードシトクロム、ミトコンドリアコードNADHデヒドロゲナーゼ、ミトフシン2、視神経萎縮症1、3'修復エキソヌクレアーゼ1、3'修復エキソヌクレアーゼ1、DICER1、HIF-PHD、Hey 1、ドミナントネガティブCCR3、アンチエオタキシンmAb、Dcr1、Sema3E、VEGFトラップ、PDGFトラップNitrin1R、aAクリスタリン、aBクリスタリン、Hey 2、サーチュイン、例えばSIRT1、DR4-Fc、DR5-Fc、PD1R、RhoJ、sFLT-1、IGFR I-Fc、IGFBP7、PEDF、NPPB、CD59、PLEKHA1、RPE65、および/またはPDEである。
これらの治療配列（例えば、治療遺伝子）を担持する核酸ベクターは、眼疾患または眼障害（例えば、核酸ベクターによって担持される導入遺伝子に関連する網膜ジストロフィ（例えば、ABCA4関連網膜ジストロフィ、MYO7A関連網膜ジストロフィ、またはBEST1関連網膜ジストロフィ）の治療に有用であり、眼疾患または眼障害には、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群1B型）、網膜色素変性症（RP）、糖尿病性眼障害（例えば、糖尿病性網膜症または糖尿病性黄斑浮腫）、ドライアイ、白内障、網膜静脈閉塞症（例えば、網膜中心静脈閉塞症もしくは網膜静脈分枝閉塞症）、網膜動脈閉塞症、黄斑浮腫（例えば、網膜静脈閉塞後に生じる黄斑浮腫、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（AMD）、滲出型黄斑変性（例えば、滲出型AMD）、ドライ型黄斑変性（例えば、ドライ型AMD）、もしくは新生血管AMD）、地図状萎縮、屈折および調節障害、円錐角膜、弱視、緑内障、シュタルガルト病、眼内炎、結膜炎、ブドウ膜炎（例えば、後部ブドウ膜炎）、網膜剥離、角膜潰瘍、涙嚢炎、デュアン収縮症候群、視神経炎、脈絡膜血管新生、脈絡膜虚血、または高血圧性網膜症が含まれる。これらの治療遺伝子を担持する核酸ベクターは、上記の疾患もしくは障害のいずれかなどの眼の疾患もしくは障害の症状、または低血圧症、高血圧症、感染症、サルコイドもしくは鎌状赤血球症などのより広範な障害の眼の症状の治療に有用である。いくつかの態様では、治療遺伝子は、急性疾患の治療に有用である。他の態様では、治療遺伝子は、慢性疾患の治療に有用である。
本明細書に記載の核酸ベクター内で有用な他の治療配列または遺伝子（例えば、治療用タンパク質をコードする治療遺伝子）は、本明細書に列挙されるタンパク質のいずれか1つまたは複数以外の網膜タンパク質をコードする遺伝子を含む。
本明細書に記載の核酸ベクターのいずれかの治療配列または遺伝子（例えば、治療用置換タンパク質をコードする治療遺伝子）は、本明細書に記載のタンパク質のいずれかの機能的に等価な断片、またはその変異体をコードし得る。本発明による核酸ベクターによってコードされるタンパク質またはその変異体の断片は、参照アミノ酸配列（例えば、それぞれの天然に存在する全長タンパク質またはその変異体のアミノ酸配列）と少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性（例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも97％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様では、治療遺伝子は表1から選択される。
本明細書に記載のポリシストロニック核酸ベクターのいずれにおいても、タンパク質コード領域間に切断部位を設計することができる。例えば、フリン-P2A部位は、本明細書に記載のタンパク質コード遺伝子のいずれかを分離することができる。リボザイムをRNA分子に組み込んで、タンパク質コード遺伝子の下流の部位を切断することもできる。いくつかの態様では、T2A、E2A、F2A、または任意の他の適切な自己切断部位（例えば、ウイルス由来の切断部位）は、本明細書に記載のタンパク質コード遺伝子のいずれかを分離することができる。
いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）は、長さが4.5Kbを超える（例えば、1つまたは複数の治療遺伝子は、一緒にまたはそれぞれ単独で、長さが4.5Kb～25Kb、4.6Kb～24Kb、4.7Kb～23Kb、4.8Kb～22Kb、4.9Kb～21Kb、5.0Kb～20Kb、5.5Kb～18Kb、6.0Kb～17Kb、6.5Kb～16Kb、7.0Kb～15Kb、7.5Kb～14Kb、8.0Kb～13Kb、8.5Kb～12.5Kb、9.0Kb～12.0Kb、9.5Kb～11.5Kb、または10.0Kb～11.0Kb、例えば、長さが4.5Kb～8Kb、8Kb～10Kb、10Kb～15Kb、15Kb～20Kb、またはそれ以上、例えば、長さが4.5Kb～5.0Kb、5.0Kb～5.5Kb、5.5Kb～6.0Kb、6.0Kb～6.5Kb、6.5Kb～7.0Kb、7.0Kb～7.5Kb、7.5Kb～8.0Kb、8.0Kb～8.5Kb、8.5Kb～9.0Kb、9.0Kb～9.5Kb、9.5Kb～10Kb、10Kb～10.5Kb、10.5Kb～11Kb、11Kb～11.5Kb、11.5Kb～12Kb、12Kb～12.5Kb、12.5Kb～13Kb、13Kb～13.5Kb、13.5Kb～14Kb、14Kb～14.5Kb、14.5Kb～15Kb、15Kb～15.5Kb、15.5Kb～16Kb、16Kb～16.5Kb、16.5Kb～17Kb、17Kb～17.5Kb、17.5Kb～18Kb、18Kb～18.5Kb、18.5Kb～19Kb、19Kb～19.5Kb、19.5Kb～20Kb、20Kb～21Kb、21Kb～22Kb、22Kb～23Kb、23Kb～24Kb、24Kb～25Kb、またはそれ以上、例えば、約4.5Kb、約5.0Kb、約5.5Kb、約6.0Kb、約6.5Kb、約7.0Kb、約7.5Kb、約8.0Kb、約8.5Kb、約9.0Kb、約9.5Kb、約10Kb、約11Kb、約12Kb、約13Kb、約14Kb、約15Kb、約16Kb、約17Kb、約18Kb、約19Kb、約20Kb、またはそれ以上である）。いくつかの態様では、治療遺伝子は2.5Kbより大きい（例えば、2.5Kb～10Kb、2.5Kb～8Kb、または2.5Kb～6Kb）。
いくつかの態様では、治療配列（例えば、治療遺伝子）は8Kbより大きい（例えば、8Kb～15Kb、8Kb～12Kb、8Kb～10Kb、または8Kb～9Kb）。
いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードするCAGプロモータによって駆動される核酸配列を有する。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも99％の配列同一性、もしくはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、もしくは組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、もしくは裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:18と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:18と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:18と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:18と100％の配列同一性）を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。
追加的または代替的に、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含む。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19の核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの場合には、核酸ベクターは、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むかまたはそれからなる裸の核酸ベクター（例えば、裸のDNAベクター（例えば、裸の環状DNAベクター（例えば、プラスミドDNAベクター、ミニサークルDNAベクター、または組換え部位を欠く合成環状DNAベクター（例えば、スーパーコイル合成環状DNAベクター））、裸の閉端DNAベクター、または裸のドギーボーンDNAベクター）、または裸のRNAベクター（例えば、裸の環状RNAベクター））である。いくつかの場合には、核酸ベクター（例えば、非ウイルス核酸ベクター）は、SEQ ID NO:19と少なくとも95％の配列同一性（例えば、SEQ ID NO:19と少なくとも96％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも97％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも98％の配列同一性、SEQ ID NO:19と少なくとも99％の配列同一性、またはSEQ ID NO:19と100％の配列同一性）を有する核酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、核酸ベクターは、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、または脂質ナノ粒子に封入されている。
前述の治療配列または治療遺伝子（例えば、治療用核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）のいずれも、疾患または障害の治療に使用することができる（例えば、それを必要とする個体、例えば、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある個体において）。したがって、本明細書に記載の治療方法および用途（例えば、セクションIII）のいずれかによる任意の関連障害を治療または予防するための前述の治療配列または治療遺伝子（例えば、治療用核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）のいずれかの使用が本明細書で提供される。さらに、本明細書に記載の治療方法および用途（例えば、セクションIII）のいずれかによる任意の関連障害の治療または予防に使用するための前述の治療配列または治療遺伝子（例えば、治療用核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）のいずれかが本明細書で提供される。
薬学的組成物
本発明はまた、薬学的に許容される担体中に治療薬（例えば、本明細書に記載の核酸ベクターのいずれか（例えば、環状DNAベクター））を有する薬学的組成物の投与を含む方法を提供する。例えば、いくつかの場合には、本明細書に記載の方法に関連して投与される薬学的組成物は、健康な網膜細胞において内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする核酸ベクター（例えば例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター）ならびに薬学的に許容される担体を含む。
いくつかの場合には、薬学的組成物は非ウイルス核酸ベクターを含む（例えば、薬学的組成物はウイルスキャプシドを実質的に含まない）。追加的または代替的に、薬学的組成物は、エンベロープ（例えば、脂質エンベロープ）またはマトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）に封入されておらず、個体への投与前および投与後に固体構造体（例えば、微粒子構造体）と物理的に会合（例えば、共有結合的または非共有結合的に結合）していない核酸ベクターを含み得る。薬学的組成物のいくつかの態様では、核酸ベクターは、核酸ベクターの溶液中で、各核酸ベクターが隣接する核酸ベクターとは無関係に自由に拡散するように、いずれの隣接する核酸ベクターにも束縛されない。薬学的組成物のいくつかの態様では、核酸ベクターは、電荷変更分子または安定化分子などの液体溶液中の別の剤と会合する。
薬学的組成物は、裸の形態の核酸ベクターを含み得る、すなわち、核酸ベクターは別の剤と複合体化して（例えば、別の剤に封入されて、コンジュゲートされて、または非共有結合されて）いない。そのような薬学的組成物では、裸の核酸分子は、裸の核酸分子と複合体化していない剤、例えば緩衝剤および/または米国食品医薬品局によって一般に安全と認められている（GRAS）剤と共製剤化され得る（例えば、溶液に）。
本発明のいくつかの場合には、薬学的組成物は裸の環状DNAベクターを含む。
薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度で個体に対して非毒性である賦形剤および/または安定剤を含み得る。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、pH緩衝水溶液である。薬学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量（約10残基未満）ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;ならびに/またはトゥイーン、ポリエチレングリコール（PEG）およびプルロニクスなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本発明の治療薬（例えば、環状DNAベクターなどの核酸ベクター）を有する薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。組成物が液体形態で提供される場合、担体は、水（例えば、発熱物質を含まない水）、等張食塩水、または緩衝水溶液、例えば、リン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液であり得る。薬学的組成物の注射は、水または緩衝液、例えば、ナトリウム塩（例えば、少なくとも50mMのナトリウム塩）、カルシウム塩（例えば、少なくとも0.01mMのカルシウム塩）、またはカリウム塩（例えば、少なくとも3mMのカリウム塩）を含有する水性緩衝液などで行われ得る。特定の態様によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、またはカリウム塩は、それらのハロゲン化物、例えば、塩化物、ヨウ化物、または臭化物の形態で、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、または硫酸塩などの形態で存在し得る。限定されることなく、ナトリウム塩の例としては、NaCl、NaI、NaBr、Na2CO2、NaHCO2、およびNa2SO4が挙げられる。カリウム塩の例としては、例えば、KCl、KI、KBr、K2CO2、KHCO2、およびK2SO4が挙げられる。カルシウム塩の例としては、例えば、CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO2、CaSO4、およびCa（OH）2が挙げられる。さらに、上記カチオンの有機アニオンが緩衝液に含まれていてもよい。特定の態様によれば、上記で定義された注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カルシウム（CaCl2）または塩化カリウム（KCl）から選択される塩を含有してもよく、さらなるアニオンが存在してもよい。CaCl2は、KClなどの別の塩で置き換えることもできる。いくつかの態様では、注射緩衝液中の塩は、少なくとも50mMの塩化ナトリウム（NaCl）、少なくとも3mMの塩化カリウム（KCl）、および少なくとも0.01mMの塩化カルシウム（CaCl2）の濃度で存在する。注射緩衝液は、特定の参照媒体に対して高張性、等張性、または低張性であってもよく、すなわち、緩衝液は、特定の参照媒体に対してより高い、同一の、またはより低い塩含有量を有してもよく、好ましくは、浸透または他の濃度効果による細胞の損傷を引き起こさないそのような濃度の前述の塩が使用され得る。参照媒体は、血液、リンパ液、細胞質ゾル液、他の体液、または一般的な緩衝液などの液体であり得る。そのような一般的な緩衝液または液体は当業者に公知である。乳酸リンゲル液は液体基剤として特に好ましい。
1つまたは複数の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤、または封入化合物は、人への投与に適し得る。本発明による薬学的組成物の構成成分は、典型的な使用条件下で本発明による（薬学的）組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が起こらないような方法で、本明細書で定義される本発明による核酸ベクターと混合することができる。薬学的に許容される担体、充填剤および希釈剤は、それらを治療される個体への投与に適したものにするのに十分に高い純度および十分に低い毒性を有することができる。薬学的に許容される担体、充填剤またはそれらの構成成分として使用することができる化合物のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、トレハロースおよびスクロースなどの糖;コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどのデンプン;デキストロース;カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;トラガント粉末;麦芽;ゼラチン;獣脂;ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体流動促進剤;硫酸カルシウム;落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ脂由来の油などの植物油;ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール;またはアルギン酸である。
薬学的に許容される担体の選択は、薬学的組成物が投与される方法に従って決定することができる。
注射用の適切な単位用量形態としては、水、生理食塩水、およびそれらの混合物の滅菌溶液が挙げられる。そのような溶液のpHは、約7.4に調整され得る。注射用の適切な担体としては、ヒドロゲル、制御放出または遅延放出のための装置、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用のための適切な薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものが含まれる。薬学的組成物が経口投与される場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位用量形態である。
薬学的組成物に含まれ得るさらなる添加剤は、トゥイーンなどの乳化剤;ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤;着色剤;薬学的担体;安定剤;酸化防止剤;および防腐剤である。
本発明による薬学的組成物は、液体または乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供され得る。特定の態様では、薬学的組成物の核酸ベクターは、凍結乾燥形態で提供される。本発明の核酸ベクターを含む凍結乾燥組成物は、投与前に、有利には水性担体に基づいて、適切な緩衝液、例えば乳酸リンゲル液、リンゲル液またはリン酸緩衝液中で再構成され得る。
本発明の特定の態様では、本発明の核酸ベクターのいずれかは、1つまたは複数のカチオン性またはポリカチオン性化合物、例えばカチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性もしくはポリカチオン性ペプチドもしくはタンパク質、例えばプロタミン、カチオン性もしくはポリカチオン性多糖類、および/またはカチオン性もしくはポリカチオン性脂質と複合体化することができる。
特定の態様によれば、本発明の核酸ベクターは、脂質と複合体化して、1つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を形成し得る。したがって、一態様では、本発明の組成物は、治療薬（例えば、核酸ベクター、例えば環状DNAベクター）を含むリポソーム、リポプレックス、および/または脂質ナノ粒子を含む。
脂質ベースの製剤は、それらの生体適合性および大規模生産の容易さのために、核酸ベクターのための有効な送達系であり得る。カチオン性脂質は、核酸を送達するための合成材料として広く検討されてきた。一緒に混合した後、核酸はカチオン性脂質によって縮合されて、リポプレックスとして公知の脂質/核酸複合体を形成する。これらの脂質複合体は、ヌクレアーゼの作用から遺伝物質を保護し、負に帯電した細胞膜と相互作用することによって遺伝物質を細胞内に送達することができる。リポプレックスは、生理学的pHで正に帯電した脂質を負に帯電した核酸と直接混合することによって調製することができる。
従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性または中性のリン脂質およびコレステロールから構成され得る脂質二重層を含み、この層が水性コアを取り囲む。脂質二重層および水性空間の両方が、それぞれ疎水性または親水性化合物を組み込むことができる。インビボでのリポソームの特徴および挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えばポリエチレングリコール（PEG）をリポソーム表面に添加して立体安定化を付与することによって改変することができる。さらに、リポソームは、その表面または結合したPEG鎖の末端にリガンド（例えば、抗体、ペプチドおよび炭水化物）を結合することによって特異的標的化に使用することができる。
リポソームは、水性区画を取り囲むリン脂質二重層で構成されるコロイド脂質ベースおよび界面活性剤ベースの送達系である。それらは球状小胞として存在し得、20nmから数ミクロンのサイズにわたり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電相互作用を介して負に帯電した核酸と複合体化することができ、インビボ臨床用途に必要な生体適合性、低毒性、および大規模生産の可能性を提供する複合体をもたらす。リポソームは、取り込みのために原形質膜と融合することができる;細胞内に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介してプロセシングされ、次いで遺伝物質がエンドソーム/担体から細胞質に放出される。
カチオン性リポソームは、DNAおよび/またはRNAの送達系として役立ち得る。MAP（1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン）およびDOTMA（N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）などのカチオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合体またはリポプレックスを形成して、静電相互作用によってナノ粒子を形成することができ、高いインビトロトランスフェクション効率を提供する。さらに、例えば、中性の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）ベースのナノリポソームとして、核酸ベクター送達のための中性脂質ベースのナノリポソームが利用可能である。
したがって、本発明の一態様では、本発明の核酸ベクターは、カチオン性脂質および/または中性脂質と複合体化し、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックスまたは中性脂質ベースのナノリポソームを形成する。
特定の態様では、本発明による薬学的組成物は、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および/またはポリマー担体と共に製剤化される本発明の核酸ベクターを含む。したがって、本発明のさらなる態様では、本明細書で定義される核酸ベクターは、任意で核酸ベクターとカチオン性もしくはポリカチオン性化合物および/またはポリマー担体との約5:1（w/w）～約0.25:1（w/w）、例えば約5:1（w/w）～約0.5:1（w/w）、例えば約4:1（w/w）～約1:1（w/w）または約3:1（w/w）～約1:1（w/w）、例えば約3:1（w/w）～約2:1（w/w）の範囲から選択される重量比で、または任意で約0.1～10の範囲、例えば約0.3～4または0.3～1の範囲、例えば約0.5～1または0.7～1の範囲、例えば約0.3～0.9または0.5～0.9の範囲の核酸ベクターとカチオン性もしくはポリカチオン性化合物および/またはポリマー担体との窒素/リン酸（N/P）比で、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物またはポリマー担体と会合または複合体化される。例えば、核酸ベクターと1つまたは複数のポリカチオンとのN/P比は、約0.3～4、約0.5～2、約0.7～2および約0.7～1.5の範囲を含む、約0.1～10の範囲である。
本明細書に記載の核酸ベクターはまた、本発明による調節遺伝子のトランスフェクション効率および/または発現を増加させるためのビヒクル、トランスフェクション剤または複合体形成剤と会合することができる。
いくつかの場合には、薬学的組成物は、例えば粒子（例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子）として、1つまたは複数のポリカチオン（例えば、プロタミンまたはオリゴフェクタミン）と複合体化した核酸ベクターを含む。トランスフェクション剤、複合体形成剤または粒子（例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子）として使用することができるさらなるカチオン性またはポリカチオン性化合物としては、カチオン性多糖類、例えばキトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（PEI）、カチオン性脂質、例えばDOTMA:［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル）］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、DMRIE、ジ-C14-アミジン、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPE、LEAP、DOPE:ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS:ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、DIMRI:ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、MAP:ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモニオ）プロパン、DC-6-14:O,O-ジテトラデカノイル-N-（α-トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、CLIP1:rac-［（2,3-ジオクタデシルオキシプロピル）（2-ヒドロキシエチル）］-ジメチルアンモニウムクロリド、CLIP6:rac-［2（2,3-ジヘキサデシルオキシプロピル-オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、CLIP9:rac-［2（2,3-ジヘキサデシルオキシプロピル-オキシスクシニルオキシ）エチル］-トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、またはカチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、例えばβ-アミノ酸ポリマーまたは逆ポリアミドなどの修飾ポリアミノ酸、PVP（ポリ（N-エチル-4-ビニルピリジニウムブロミド））などの修飾ポリエチレン、pDMAEMA（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））などの修飾アクリレート、pAMAM（ポリ（アミドアミン））などの修飾アミドアミン、ポリベータアミノエステル（PBAE）または修飾PBAE（例えば、米国特許第8,557,231号に記載されているポリマー;米国特許出願第2018/0112038号に記載されているようなPEG化PBAE;Green et al.,Acc.Chem.Res.2008,41（6）:749-759に開示されている任意の適切なポリマー、例えばジアミン末端修飾1,4ブタンジオールジアクリレート-co-5-アミノ-1-ペンタノールポリマー;国際公開公報第2020/077159号または国際公開公報第2019/070727号に記載されている任意の適切な修飾PBAE;Shen et al.,Sci.Adv.2020,6:eaba1606に開示されているPBAE 457など）、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはpAMAMベースのデンドリマーなどのデンドリマー、PEI:ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）などのポリイミン（類）、ポリアリルアミン、シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなどの糖骨格ベースのポリマー、PMOXA-PDMSコポリマーなどのシラン骨格ベースのポリマー、1つまたは複数のカチオン性ブロック（例えば上記のカチオン性ポリマーから選択される）と1つまたは複数の親水性または疎水性ブロック（例えばポリエチレングリコール）との組合せからなるブロックポリマーなどが挙げられ得る。
いくつかの場合には、薬学的組成物は、ナノ粒子またはマイクロ粒子、例えば、生分解性ナノ粒子またはマイクロ粒子（例えば、カチオン性生分解性ポリマーナノ粒子またはマイクロ粒子、例えばPBAEまたは修飾PBAE（例えば国際公開公報第2019/070727号の式（I）のポリマー、またはShen et al.,Sci.Adv.2020,6:eaba1606に開示されているPBAE 457）、またはPEG-PBAE（または修飾PBAE）コポリマー）またはpH感受性ナノ粒子またはマイクロ粒子（例えば、米国特許第10,792,374号の式（I）のポリマーを有するナノ粒子（ECO））に封入された核酸ベクターを含む。
特定の態様によれば、本発明の薬学的組成物は、治療薬、例えば、ポリマー担体内に封入されるかまたはポリマー担体に結合された核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）を含む。本発明に従って使用されるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されたポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋されたカチオン性成分は、互いに同じであってもよく、または異なっていてもよい。ポリマー担体は、さらなる成分を含むこともできる。また、本発明に従って使用されるポリマー担体は、本明細書に記載のジスルフィド結合によって架橋された、カチオン性ペプチド、タンパク質またはポリマーおよび任意で本明細書で定義されるさらなる成分の混合物を含むことが特に好ましい。これに関連して、国際公開公報第2012/013326号の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。これに関連して、ジスルフィド架橋によってポリマー担体の基礎を形成するカチオン性成分は、典型的には、この目的に適した任意の適切なカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマー、特に本明細書で定義される核酸ベクターまたは組成物に含まれるさらなる核酸を複合体化し、それによって好ましくは核酸ベクターを縮合することができる任意のカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーから選択される。カチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーは、直鎖状分子であり得る;しかしながら、分岐したカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーも使用し得る。
本発明の薬学的組成物の一部として含まれる本発明による核酸ベクターを複合体化するために使用し得るポリマー担体の全てのジスルフィド架橋カチオン性またはポリカチオン性タンパク質、ペプチドまたはポリマーは、本明細書で言及されるポリマー担体のカチオン性成分としての少なくとも1つのさらなるカチオン性またはポリカチオン性タンパク質、ペプチドまたはポリマーとの縮合時にジスルフィド結合を形成することができる少なくとも1つのSH部分（例えば、少なくとも1つのシステイン残基またはSH部分を示す任意のさらなる化学基）を含み得る。
本発明の核酸ベクターを複合体化するために使用されるそのようなポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性（またはポリカチオン性）成分によって形成され得る。特に、少なくとも1つのSH部分を含むかまたは含むようにさらに修飾されたポリマー担体のそのようなカチオン性またはポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質またはポリマーは、複合体形成剤としてのタンパク質、ペプチドおよびポリマーから選択することができる。
他の態様では、本発明による薬学的組成物は、任意のさらなるビヒクル、トランスフェクション剤または複合体形成剤と会合することなく裸で投与され得る。
前述の薬学的組成物（例えば、前述の治療配列または治療遺伝子（例えば、治療用核酸ベクター、例えば非ウイルス核酸ベクター、例えば裸の核酸ベクター、例えば合成環状DNAベクター）のいずれかを含む薬学的組成物）のいずれも、疾患または障害の治療に使用することができる（例えば、それを必要とする個体、例えば、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある個体において）。したがって、本明細書に記載の治療方法および用途（例えば、セクションIII）のいずれかに従って任意の関連障害を治療または予防するための前述の薬学的組成物のいずれかの使用が本明細書で提供される。さらに、本明細書に記載の治療方法および用途（例えば、セクションIII）のいずれかによる任意の関連障害の治療または予防に使用するための前述の薬学的組成物のいずれかが本明細書で提供される。
III. 治療方法および用途
治療薬（例えば、治療用置換タンパク質をコードする核酸ベクター）を個体（例えば、ヒト患者）の眼細胞に送達する方法が本明細書で提供される。そのようなアプローチは、（a）個体における標的細胞への治療薬の送達を促進するための電気的導入、（b）個体への治療薬の投与、または（a）および（b）の両方を含み得る。そのような方法は、本明細書に記載される治療薬または薬学的組成物のいずれか、例えば核酸ベクターまたはその薬学的組成物（例えば、裸の核酸ベクターを含む薬学的組成物）の投与を含む。a）個体における標的細胞への治療薬の送達を促進するための電気的導入、（b）個体への治療薬の投与、または（a）および（b）の両方によって、個体における眼の疾患または障害を治療する方法も本明細書で提供される。そのような組成物および方法を使用して治療することができる特定の眼疾患としては、ABCA4関連網膜ジストロフィ（例えば、シュタルガルト病）、MYO7A関連網膜ジストロフィ（例えば、アッシャー症候群1B型）、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチー（例えば、常染色体劣性ベストロフィノパチー、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィ、BEST1成人発症卵黄様黄斑ジストロフィ、または常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症）、および加齢黄斑変性症が挙げられる。
眼疾患および個体
本明細書に記載の治療薬および薬学的組成物は、様々な眼の疾患または障害の治療に使用することができる。いくつかの場合には、眼の疾患または障害は、網膜の疾患または障害、例えば網膜ジストロフィ（例えば、参照（例えば、健康なレベルの機能的発現）と比較して個体における網膜タンパク質の機能的発現レベルの低下（例えば、機能的発現の欠如）を特徴とする網膜ジストロフィ）である。いくつかの態様では、眼の疾患または障害（例えば、網膜の疾患または障害）は、単一遺伝子障害である。いくつかの態様では、眼の疾患または障害（例えば、網膜の疾患または障害）は、劣性遺伝性障害である。いくつかの態様では、個体は、ヘテロ接合変異によって引き起こされる眼の疾患または障害（例えば、網膜の疾患または障害）を有するか、または発症すると予想される。他の態様では、個体は、ホモ接合変異によって引き起こされる眼の疾患または障害（例えば、網膜の疾患または障害）を有するか、または発症すると予想される。
いくつかの態様では（例えば、個体がABCA4関連網膜ジストロフィ、例えばシュタルガルト病または錐体桿体ジストロフィについて治療されている態様では）、網膜タンパク質はABCA4である。そのような態様では、個体は、ABCA4変異（例えば、二対立遺伝子ABCA4変異）による網膜変性を有する成人、十代の若者、または子供であり得る。いくつかの場合には、個体は、劣性二対立遺伝子ABCA4変異による黄斑変性を有する。個体は、二対立遺伝子ABCA4変異による任意の重症度の網膜変性を有し得る。
いくつかの態様では（例えば、個体がアッシャー症候群1B型について治療されている態様では）、網膜タンパク質はMYO7Aである。
いくつかの態様では（例えば、個体が、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチー、例えば、常染色体劣性ベストロフィノパチー、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィ、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症、BEST1成人発症卵黄様黄斑ジストロフィ、常染色体優性小角膜、錐体桿体ジストロフィ、早期発症白内障後極ブドウ膜腫症候群または網膜色素変性症について治療されている態様では）、網膜タンパク質はBEST1である。
いくつかの態様では（例えば、個体が加齢黄斑変性について治療されている態様では）、網膜タンパク質はCFHである。
いくつかの態様では、眼の疾患または障害は、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群1B型）、常染色体劣性ベストロフィノパチー、常染色体優性ベスト卵黄様黄斑ジストロフィ、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（AMD）、滲出型黄斑変性（例えば、滲出型AMD）、ドライ型黄斑変性（例えば、ドライ型AMD）もしくは新生血管AMD）、地図状萎縮、網膜色素変性（RP）、糖尿病性眼障害（例えば、糖尿病性網膜症または糖尿病性黄斑浮腫）、ドライアイ、白内障、網膜静脈閉塞症（例えば、網膜中心静脈閉塞症もしくは網膜静脈分枝閉塞症）、網膜動脈閉塞症、黄斑浮腫（例えば、網膜静脈閉塞後に生じる黄斑浮腫、屈折および調節障害、円錐角膜、弱視、緑内障、シュタルガルト病、眼内炎、結膜炎、ブドウ膜炎（例えば、後部ブドウ膜炎）、網膜剥離、角膜潰瘍、涙嚢炎、デュアン収縮症候群、視神経炎、脈絡膜血管新生、脈絡膜虚血、または高血圧性網膜症からなる群より選択される。
いくつかの態様では、眼の疾患または障害は、網膜ジストロフィ（例えば、メンデル遺伝性網膜ジストロフィ）である。いくつかの態様では、網膜ジストロフィは、レーバー先天性黒内障（LCA）、シュタルガルト病、弾性線維性仮性黄色腫、錐体桿体ジストロフィ、滲出性硝子体網膜症、ジュベール症候群、先天性静止性夜盲1C型（CSNB-1C）、加齢黄斑変性、網膜色素変性、スティックラー症候群、小頭症および網脈絡膜症、網膜色素変性、CSNB 2、アッシャー症候群、およびワーグナー症候群からなる群より選択される。
いくつかの場合には、本明細書で提供される方法は、上記の疾患もしくは障害のいずれかなどのそのような眼の疾患もしくは障害の症状、または低血圧症、高血圧症、感染症、サルコイドもしくは鎌状赤血球症などのより広範な障害の眼の症状の治療に有用である。いくつかの態様では、疾患は急性眼疾患である。他の態様では、疾患は慢性眼疾患である。
いくつかの態様では、治療される個体はヒト患者である。いくつかの態様では、個体は、小児ヒト患者、例えば、診断または治療時に21歳またはそれ以下の年齢の人である。いくつかの態様では、小児ヒト患者は、治療時に16歳またはそれ以下の年齢である。他の態様では、個体は、治療時に22歳～40歳の年齢である。他の態様では、個体は、治療時に41歳～60歳の年齢である。他の態様では、個体は、治療時に61歳またはそれ以上の年齢である。いくつかの場合には、個体は男性である。他の場合には、個体は女性である。
治療薬の投与
個体（例えば、ヒト患者）の標的網膜細胞に治療薬を送達する手段として、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、本明細書に記載の核酸ベクターのいずれか））、またはその薬学的組成物を眼に投与する方法が本明細書で提供される。参照のために、眼の解剖学的図を図1に示す。いくつかの場合には、核酸ベクターは、核酸ベクターが眼の後部領域（例えば、網膜（例えば、黄斑））の細胞外空間に入るように眼に投与される。投与時に核酸ベクターが後部細胞外空間に入ると（例えば、裸の製剤として、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子（例えば、脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子）に封入されて、またはナノ粒子もしくはマイクロ粒子から放出されて）、核酸ベクターは、その後、例えば硝子体腔または網膜下腔に配置された電極からの電気エネルギーの伝達を介して、眼の後部（例えば、網膜（例えば、黄斑））に到達する電気エネルギーの伝達時に標的網膜細胞に電気的導入され得る。いくつかの場合には、核酸ベクターは、核酸ベクターが眼の後部領域（例えば、後上脈絡膜または後脈絡膜）の細胞外空間に入るように眼に投与される。投与時に核酸ベクターが後部細胞外空間に入ると、その後、核酸ベクターは、その後、例えば硝子体腔または網膜下腔に配置された電極からの電気エネルギーの伝達を介して、眼の後部（例えば、後上脈絡膜または後脈絡膜）に到達する電気エネルギーの伝達時に標的網膜細胞に電気的導入され得る。
いくつかの態様では、核酸ベクターは、本明細書に記載の方法の前に（例えば、網膜組織に電場を伝達する方法の前に）投与される。例えば、核酸ベクターは、電場の伝達前の24時間以内に（例えば、電場の伝達前の20時間以内、18時間以内、16時間以内、14時間以内、12時間以内、10時間以内、8時間以内、6時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、90分以内、60分以内、45分以内、30分以内、20分以内、15分以内、10分以内、5分以内、4分以内、3分以内、2分以内、1分以内、45秒以内、30秒以内、20秒以内、15秒以内、10秒以内、または5秒以内に）投与することができる。いくつかの態様では、核酸ベクターは、本明細書に記載の方法の後に（例えば、網膜組織に電場を伝達する方法の後に）、例えば核酸ベクターが経時的にナノ粒子またはマイクロ粒子から放出される場合に投与される。例えば、核酸ベクターは、電場の伝達後24時間以内に（例えば、電場の伝達後20時間以内、18時間以内、16時間以内、14時間以内、12時間以内、10時間以内、8時間以内、6時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、90分以内、60分以内、45分以内、30分以内、20分以内、15分以内、10分以内、5分以内、4分以内、3分以内、2分以内、1分以内、45秒以内、30秒以内、20秒以内、15秒以内、10秒以内、または5秒以内に）投与することができる。いくつかの態様では、核酸ベクターは、本明細書に記載の方法の一部として投与される。
当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載される眼投与の任意の適切な手段が、本明細書で提供される方法の一部として使用され得る。治療薬を標的網膜細胞に送達する方法は、眼内注射（例えば、眼の後部もしくは眼の前部への注射、例えば、上脈絡膜注射、硝子体内注射、網膜下注射、眼周囲注射、テノン嚢下注射、後部強膜近傍注射、前房内注射、結膜下注射、もしくは球後注射）または眼内インプラントによって核酸ベクターを眼に投与する工程を含む。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの態様では、核酸ベクターの投与は、眼内インプラント（例えば、制御放出もしくはデポーインプラント、硝子体内インプラント、結膜下インプラント、または上強膜インプラント）を介する。他の態様では、核酸ベクターの投与は、眼内インプラント（例えば、制御放出もしくはデポーインプラント、硝子体内インプラント、結膜下インプラント、または上強膜インプラント）を介さない。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの態様では、核酸ベクターの投与はイオン導入を介する（例えば、この方法は、本明細書に記載されるように、イオン導入によって眼内空間に核酸ベクターを投与し、その後、眼の内部領域に接触している電極を介して電流を伝達することによって網膜に送達する工程を含む）。他の態様では、核酸ベクターの投与はイオン導入を含まない。
いくつかの場合には、核酸ベクターの投与は非外科的である。例えば、いくつかの態様では、核酸ベクターの投与は、全身麻酔を利用せず、および/または球後麻酔（すなわち、球後ブロック）を含まない。追加的または代替的に、核酸ベクターの投与は、28ゲージより大きい針を使用した注射を含まない。追加的または代替的に、核酸ベクターの投与は、シャントまたはカニューレを介した眼薬物送達に典型的に必要とされる誘導機構の使用を含まない。
いくつかの場合には、核酸ベクターの投与は、眼の外部組織、例えば、上脈絡膜腔、強膜、角膜、角膜実質、結膜、結膜下腔または網膜下腔への注射（例えば、マイクロニードル注射）によるものである。あるいは、核酸ベクターの投与は、小柱網、毛様体、房水または硝子体液などの外部組織に近位の部位への注射（例えば、マイクロニードル注射）によるものである。
核酸ベクターを眼に注射するためのマイクロニードルには、中空マイクロニードルが含まれ、これはマイクロニードルの近位端を保持するための細長い筐体を含み得る。マイクロニードルは、それを通して製剤を導くための手段をさらに含み得る。例えば、手段は、マイクロニードルの基部または近位端と流体接続した可撓性または剛性導管であり得る。この手段はまた、装置を通る流体の流れを誘導するための圧力勾配を作り出すためのポンプまたは他の装置を含み得る。導管は、製剤の供給源と機能的に接続し得る。供給源は、任意の適切な容器であり得る。一態様では、供給源は、従来のシリンジの形態であり得る。供給源は、使い捨てユニットの用量容器であり得る。一態様では、マイクロニードルは、約50μm～約2000μmの有効長を有する。別の特定の態様では、マイクロニードルは、約150μm～約1500μm、約300μm～約1250μm、約500μm～約1250μm、約500μm～約1500μm、約600μm～約1000μm、または約700μm～約1000μmの有効長を有する。一態様では、マイクロニードルの有効長は、約600μm、約700μm、約800μmまたは約1000μmである。様々な態様では、マイクロニードルの近位部分は、約50μm～600μm、約50μm～約400μm、約50μm～約500μm、約100μm～約400μm、約200μm～約600μm、または約100μm～約250μmの最大幅または断面寸法を有し、約5μm～約400μmの開口直径を有する。特定の態様では、マイクロニードルの近位部分は、約600μmの最大幅または断面寸法を有する。様々な態様では、マイクロニードルは、50μm～500μm、100μm～500μm、100μm～400μm、200μm～400μm、または300μm～500μmのベベル高さを有する。
マイクロニードルは、約1:1.5～約1:10のアスペクト比（幅:長さ）を有し得る。一態様では、マイクロニードルのアスペクト比は、約1:3～約1:5である。別の態様では、マイクロニードルのアスペクト比は、約1:4～約1:10である。
特定の態様では、マイクロニードルは、マイクロニードルの先端部分が眼組織内に挿入されるマイクロニードルの実質的に唯一の部分であるように設計され得る（すなわち、先端部分は、マイクロニードルの全長の75％超、マイクロニードルの全長の85％超、またはマイクロニードルの全長の約95％超である）。他の特定の態様では、マイクロニードルは、先端部分が眼組織に挿入されるマイクロニードルの一部のみであり、一般にマイクロニードルの全長の約75％未満、マイクロニードルの全長の約50％未満、またはマイクロニードルの全長の約25％未満の長さを有するように設計され得る。例えば、一態様では、マイクロニードルは、500μm～1500μmの総有効長を有し、ここで、先端部分は、約400μm未満、約300μm未満、または約200μm未満の長さを有する。
一態様では、ベベルの高さは100μm～約500μmである。別の態様では、ベベルの高さは、500μmもしくはそれ以下、450μmもしくはそれ以下、400μmもしくはそれ以下、または350μmもしくはそれ以下である。別の態様では、ベベルの高さは、200μm～500μm、100μm～700μm、または200μm～約700μmである。さらに他の態様では、ベベルの高さは、500μm～900μm、500μm～800μm、または500μm～700μmである。このようにして、ベベルの配置は、（i）標的組織を実質的に弾性変形させることなく、または（ii）眼の内部構造、例えば水晶体または網膜を損傷させることなく、遠位端が標的組織を穿刺し、硝子体内に貫通するように十分に鋭利であるものであり得る。
本方法において有用なマイクロニードルは、金属、ガラス、半導体材料、セラミック、またはポリマーを含む様々な生体適合性材料から作製することができる。適切な金属の例としては、医薬品グレードのステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、鉄、金、スズ、クロム、銅、白金、およびそれらの合金が挙げられる。適切なポリマーは、生分解性または非生分解性であり得る。適切な生体適合性生分解性ポリマーの例としては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド-コ-グリコリド（PLGA）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリウレタンならびにそれらのコポリマーおよびブレンドが挙げられる。代表的な非生分解性ポリマーとしては、医療機器の製造において公知の様々な熱可塑性物質または他のポリマー構造材料が挙げられる。例としては、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリレート、エチレン-ビニルアセテートおよび他のアシル置換セルロースアセテートのポリマー、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、これらのブレンドおよびコポリマーが挙げられる。生分解性マイクロニードルは、非生分解性マイクロニードルと比較して高いレベルの安全性を提供することができ、その結果、気付かずに眼組織内に脱落した場合でも本質的に無害である。
特定の例では、核酸ベクターの投与は上脈絡膜注射によるものであり、これは低侵襲性の非外科的方法で達成することができる。例えば、上脈絡膜注射は、他の種類の投与（例えば、網膜下注射）と比較して、1回の投与でより大きな組織領域にわたっておよびよりアクセスしにくい標的組織への核酸送達を提供することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、上脈絡膜腔に入ると、薬学的組成物は、後眼部の網膜脈絡膜組織、黄斑および視神経に向かって円周方向に流れることができる。さらに、注入された薬学的組成物の一部は、デポーとして上脈絡膜腔に留まり得るか、またはマイクロニードル挿入部位の近くで上脈絡膜腔を覆う組織、例えば強膜に留まり得、その後上脈絡膜腔および他の隣接する後部組織に拡散することができる薬学的組成物のさらなるデポーとして機能する。
上脈絡膜注射は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の適切な方法を用いて行うことができる。例えば、いくつかの場合には、核酸ベクターは、マイクロニードル（例えば、中空マイクロニードル）を介して上脈絡膜投与される。いくつかの場合には、核酸ベクターは、マイクロニードルアレイを介して上脈絡膜投与される。本明細書に記載の核酸ベクターの上脈絡膜投与における使用に適した例示的なマイクロニードルは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第2017/0273827号に記載されている。
上脈絡膜注射は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。例えば、製剤が上脈絡膜腔および上脈絡膜腔を取り囲む後眼組織に流れるように、マイクロニードル先端を眼内に配置することができる。一態様では、マイクロニードルの挿入は眼の強膜においてである。一態様では、上脈絡膜腔への薬物の流れは、脈絡膜および網膜組織などの下にある組織をマイクロニードルと接触させることなく達成される。いくつかの態様では、1つまたは複数のマイクロニードルは、眼内、例えば強膜内に垂直に、または80°～100°の角度で挿入され、短い貫通距離で上脈絡膜腔に到達する。本明細書に記載の核酸ベクターの上脈絡膜投与における使用に適した例示的な方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2014/074823号に記載されている。
いくつかの態様では、装置は、2つまたはそれ以上のマイクロニードルのアレイを含む。例えば、装置は、2～1000（例えば、2～100）のマイクロニードルのアレイを含み得る。一態様では、装置は、1～50のマイクロニードルを含む。マイクロニードルのアレイは、異なるマイクロニードルの混合物を含み得る。例えば、アレイは、様々な長さ、基部直径、先端部形状、マイクロニードル間の間隔、薬物コーティングなどを有するマイクロニードルを含み得る。マイクロニードル装置が2つまたはそれ以上のマイクロニードルのアレイを含む態様では、単一のマイクロニードルが基部から延びる角度は、アレイ内の別のマイクロニードルが基部から延びる角度とは無関係であり得る。
いくつかの場合には、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））を送達する本方法は、治療薬の硝子体内投与を含む。硝子体内投与は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の適切な方法を用いて行うことができる。例えば、InVitria Injection Assistant（FCI Ophthalmics, Pembroke, MA）、Rapid Access Vitreal Injection（RAVI）Gude（Katalyst Surgical, Chesterfield, MO）、Doi-Umeatsu Intravitreal Injection Guide（Duckworth＆Kent Ltd., England）、Malosa Intravitreal Injection Guide（Beaver-Visitec International, Waltham, MA）、または自動注射ガイドを含む硝子体内注射方法が本明細書で企図される。
本発明は、核酸ベクターが、カニューレおよび/またはマイクロニードル（例えば、上記のマイクロニードルのいずれか）を含む装置（例えば、マイクロインジェクタ装置）を介して上脈絡膜投与される方法を含む。本明細書に記載の核酸ベクターの上脈絡膜投与における使用に適した例示的な装置は、例えば、米国特許第10,722,396号、米国意匠特許第750223S1号、およびHancock et al., Expert Opinion on Drug Delivery 2021, DOI: 10.1080/17425247.2021.1867532に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの場合には、上脈絡膜注射は、例えば、角膜輪部から1～5mmの毛様体扁平部内で行われる。そのような注射に使用するためのマイクロニードルは、毛様体扁平部での強膜厚に実質的に一致する長さを有するように設計することができる（例えば、400μm～600μm、例えば約500μm）。
上脈絡膜注射を含む本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの態様では、上脈絡膜注射は両側上脈絡膜注射（例えば、2回の注射に分割された）である。他の態様では、上脈絡膜注射は、片側上脈絡膜注射（例えば、単回注射）である。
いくつかの場合には、治療薬を標的網膜細胞に送達する方法は、核酸ベクターを全身投与する（例えば、静脈内または経口）工程を含む。
任意の適切な用量の核酸ベクターを投与し得る。例えば、裸の核酸ベクターの網膜下投与を含む態様では、各眼に、それぞれ20～500μL（例えば、50～250μL;例えば、50～100μL、100～150μL、150～200μL、または200～250μL;例えば、約50μL、約75μL、約100μL、約150μL、または約200μL）の体積を有する1つまたは複数のブレブ、例えば、各眼あたり1つのブレブ、2つのブレブ、3つのブレブ、4つのブレブ、またはそれ以上で注射し得る。裸の核酸ベクターの網膜下投与を含む態様では、注入量（例えば、薬学的組成物）は、0.5mg/mL～5mg/mL（例えば、1.0mg/mL～2.5mg/mL;例えば、0.5mg/mL～1.0mg/mL、1.0mg/mL～1.5mg/mL、1.5mg/mL～2.0mg/mL、2.0mg/mL～2.5mg/mL、2.5mg/mL～3.0mg/mL、3.0mg/mL～4.0mg/mL、または4.0mg/mL～5.0mg/mL;例えば、約0.5mg/mL、約1.0mg/mL、約1.5mg/mL、約2.0mg/mL、約2.5mg/mL、約3.0mg/mL、約4.0mg/mL、または約5.0mg/mLの濃度で核酸ベクターを含む。特定の場合（例えば、裸の核酸ベクターが網膜下に投与される場合）には、注入量（例えば、薬学的組成物）は、1.5mg/mLの濃度で核酸ベクターを含む。網膜下投与を含むいくつかの態様では、裸の核酸ベクターは、20μg～2.0mg（例えば、100μg～1.0mg、または200μg～500μg;例えば、20μg～50μg、50μg～100μg、100μg～150μg、150μg～200μg、200μg～250μg、250μg～300μg、300μg～350μg、350μg～400μg、400μg～500μg、500μg～750μg、750μg～1.0mg、1.0mg～1.5mg、または1.5mg～2.0mg;例えば、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約75μg、約80μg、約90μg約100μg、約125μg、約150μg、約175μg、約200μg、約225μg、約250μg、約275μg、約300μg、約350μg、約400μg、約500μg、約600μg、約700μg、約800μg、約900μg、約1.0mg、約1.1.mg、約1.2mg、約1.3mg、約1.4mg、約1.5mg、約1.6mg、約1.7mg、約1.8mg、約1.9mg、または約2.0mg）の量で各眼に投与される。網膜下投与を含むいくつかの態様では、裸の核酸ベクターは、108～1015個のベクターコピー（例えば、DNAベクター分子、例えば環状DNAベクター分子）（例えば、108～109個、109～1010個、1010～1011個、1011～1012個、1012～1013個、1013～1014個、または1014～1015個のベクターコピー;例えば、約1x1011個のベクターコピー、約5x1011個のベクターコピー、約1x1012個のベクターコピー、約5x1012個のベクターコピー、約1x1013個のベクターコピー、約2.5x1013個のベクターコピー、または約5x1013個のベクターコピー）の量で各眼に投与される。特定の態様では、裸の核酸ベクターは、約2.5×1013個のベクターコピーの各眼あたりの総用量で網膜下投与される（例えば、各眼につき75μLのブレブを2つ）。他の態様では、裸の核酸ベクターは、約5×1012個のベクターコピーの各眼あたりの総用量で網膜下投与される（例えば、各眼につき75μLのブレブを2つ）。他の態様では、裸の核酸ベクターは、約5×1011個のベクターコピーの各眼あたりの総用量で網膜下投与される（例えば、各眼につき75μLのブレブを2つ）。
電場の伝達
治療薬（例えば、核酸ベクター）を眼に送達する方法は、標的眼細胞が存在する組織に電気エネルギーを伝達する工程を含む。そのような方法は、眼の後部の細胞外空間（例えば、上脈絡膜腔、脈絡膜、網膜または硝子体）から標的眼細胞（例えば、網膜細胞）への治療薬の電気的導入を含む。例えば、個体が網膜疾患または障害について治療されているいくつかの場合には、本方法は、網膜に電気エネルギーを伝達して、網膜の細胞外空間から1つまたは複数の網膜細胞型（例えば、光受容体および/または網膜色素上皮細胞）への治療薬（例えば、核酸ベクター）の電気的導入を生じさせる工程を含む。
本発明のいくつかの局面では、電極が個体の眼の内部に配置され、電場が電極を介して、治療薬（例えば、核酸ベクター）の標的細胞（例えば、標的網膜細胞）への電気的導入に適した条件で、標的眼組織（例えば、網膜）に伝達される。標的眼組織に伝達される電場（例えば、パルス電場（PEF））は、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）の標的眼細胞への転写を促進することができる。そのような電気的導入は、電気泳動、界面動電的に駆動される薬物取り込み、および/またはエレクトロポレーションを含むいくつかの機構（およびそれらの組合せ）のいずれか1つによって起こり得る。電場の伝達は、そのような機構に適した条件を含む。哺乳動物組織における核酸の電気的導入のための電場を生成する適切な手段は当技術分野で公知であり、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の適切な手段を本発明の一部として使用するために適合させることができる。
電場を生成し、組織内に伝達する様々な手段が、本方法の一部として本明細書で企図される。哺乳動物組織において電場を伝達するのに適した電極を有する装置およびシステムは市販されており、本明細書で開示される方法において有用であり得る。いくつかの場合には、電場は、針（例えば、硝子体液内または網膜下腔に配置された針）を含む電極を介して伝達される。適切な針電極としては、IGEA（登録商標）によって市販されているCLINIPORATOR（登録商標）電極およびAMBU（登録商標）によって市販されている針電極が挙げられる。電極（例えば、針電極）は、金属または金属合金、例えば白金、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、およびそれらの組合せ、例えば白金/イリジウム合金またはニチノールなどの任意の適切な導電性材料から作製することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法の一部として使用される電極は、米国特許出願第63/163,350号、同第63/167,296号、および同第63/293,297号に記載されている実質的に平坦な電極のいずれかなどの実質的に平坦な電極であり、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法の一部として使用される電極は、本明細書に記載の実質的に平坦な電極（例えば、以下の装置セクション参照）である。そのような実質的に平坦な電極は、細長い導体（例えば、ワイヤ電極）の構造が被覆されていないときに予め形成された実質的に平坦な電極へと弛緩することを可能にする形状記憶材料（例えば、形状記憶合金）から構成される。実質的に平坦な電極は、シースおよび/またはワイヤの近位部分（例えば、実質的に平坦な電極を含まない領域）の長手方向軸に対してほぼ垂直である。当業者は、いくつかの態様では、実質的に平坦な電極が完全に平坦でなくてもよいことを理解するであろう。例えば、いくつかの態様では、その垂直寸法（例えば、深さおよび幅などのデカルト寸法）のうちの2つは、それぞれその第3の垂直寸法（例えば、長さ）の少なくとも2倍である。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、その垂直寸法のうちの2つがそれぞれ、その第3の垂直寸法の少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、または少なくとも100倍、またはそれ以上である電極を指す。したがって、いくつかの場合には、実質的に平坦な電極の長手方向寸法は、実質的に平坦な電極の半径方向寸法（例えば、最も外側の半径方向の点）の10％未満である。いくつかの場合には、実質的に平坦な電極の長手方向寸法は、その半径方向寸法（例えば、最も外側の半径方向の点）の5％未満である。
特定の態様では、電極の空間構成は、その導電特性を最適化し、および/または細胞の標的領域に所望の電場を印加するように製造される。したがって、眼が湾曲を含む場合、電極の形状はまた、例えば、眼またはその一部（例えば、網膜）の形状に一致または近似する湾曲（例えば、凸形状）を含み得る。
いくつかの例では、細長い導体はワイヤであり、実質的に平坦な電極はワイヤの遠位部分である。いくつかの場合には、ワイヤの遠位先端（またはワイヤの遠位先端から5mm以内（例えば、4mm以内、3mm以内、2mm以内、1mm以内、0.5mm以内、または0.1mm以内）のワイヤに沿った点）は、実質的に平坦な電極の最も外側の半径方向の点にある。ワイヤの遠位部分は、長手方向平面上に予め形成された直角（または実質的に直角、例えば、約70°、75°、80°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、100°、105°、または110°）を含み得、ここで、予め形成された直角は、実質的に平坦な電極とワイヤの近位部分との間にある。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された直角から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位または近位に延在している。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された直角から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位に延在している。いくつかの態様では、装置は、実質的に平坦な電極の遠位に何も含まない（例えば、実質的に平坦な電極は組織表面に自由に接触する）。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、長手方向軸に対して垂直な1つまたは複数の寸法（例えば、両方の寸法）で約2mm～約15mm（例えば、約2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、または15mm）である。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、長手方向平面に関して実質的に対称である。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は螺旋である。例えば、螺旋は、長手方向軸を中心に1～5（例えば、1、1.5、2、2.5、3、2.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、またはそれ以上）回転を含み得る。いくつかの場合には、螺旋は、長手方向軸を中心に2～5回転を有する。いくつかの場合には、螺旋は、長手方向軸を中心に2～3回転を有する。特定の態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に2回転を有する。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に3回転を有する。他の適切な形状には、例えば、ループ、同心ループ、パドル、メッシュ、グリッド、または傘の形状が含まれる。
実質的に平坦な電極は、所定の刺激の存在下でその元の形状を回復することができる形状記憶材料（例えば、形状記憶合金、例えばNiTi）から全体的または部分的に作製することができる。例えば、形状記憶材料は、構造的拘束が取り除かれると予め形成された形状へと弛緩することができる。本明細書に記載されるように、剛性シース内に収容された予め形成された形状記憶ワイヤ（例えば、実質的に平坦な電極）は、それが脱鞘されるまで直線状であり、その時点で、形状記憶材料は螺旋などのその予め形成された形状へと弛緩する。形状記憶材料は当技術分野で公知である。いくつかの態様では、形状記憶材料は、NiTi、CuAlNi、またはCuZnAlなどの合金を含む。形状記憶材料は鉄系であり得る。いくつかの態様では、形状記憶材料はNiTiである。NiTiは、ニッケルとチタンとの合金（ニチノール）である。ニチノールは、例えば、約40％～約70％のニッケル（例えば、約40％、45％、50％、55％、60％、65％、または70％のニッケル）を含み得る。
本方法で使用するための電極（例えば、実質的に平坦な電極または実質的に平坦でない電極（例えば、実質的に軸方向のワイヤ電極））は、単極であり得る。単極電極を使用する電気的導入を含むいくつかの態様では、接地電極が眼以外の点で個体に取り付けられる（例えば、個体の皮膚に取り付けられる）。いくつかの態様では、接地電極は、個体の臀部、脚、胴体、頸部（例えば、後頸部）または頭部（例えば、後頭部）の皮膚に接触するパッドである。いくつかの態様では、単極電極は、正に帯電すると電気エネルギーを伝達する。いくつかの態様では、単極電極は、負に帯電すると電気エネルギーを伝達する。
あるいは、電極は双極であり得る（例えば、実質的に平坦な電極または実質的に平坦でない電極は双極であり得る（例えば、実質的に軸方向のワイヤ電極は双極であり得る））。双極態様では、補助電極は、一次電極（例えば、実質的に平坦な電極または実質的に平坦でない電極（例えば、実質的に軸方向のワイヤ電極））と電気的に連通し得る。補助電極は、一次電極に近位（すなわち、オペレータにより近い）であり得、例えば、一次ワイヤ電極を収容するシースの一部であり得るか、または該シースに接続され得る。双極電極を使用した電気的導入を含むいくつかの態様では、電気エネルギー（例えば、電流）は、一次電極に正の電圧を印加し、かつ補助電極に負の電圧を印加すると伝達される。双極電極を使用した電気的導入を含むいくつかの態様では、電気エネルギー（例えば、電流）は、一次電極に負の電圧を印加し、かつ補助電極に正の電圧を印加すると伝達される。
いくつかの場合には、本発明の方法は、電極から伝達される電気エネルギーが標的組織（例えば、網膜、例えば黄斑）で電気的導入を生じさせるのに十分であるように、電極（例えば、実質的に平坦な電極または実質的に平坦でない電極（例えば、実質的に軸方向のワイヤ電極））を眼の内部領域に接触させる工程を含む。したがって、本発明の方法は、電極を標的組織（例えば、網膜、例えば黄斑）と電気的に連通するように配置する工程を含み得る。特定の場合には、電極に接触する眼の内部領域は、硝子体液を含む。例えば、電極は、電場の伝達時に硝子体液内に全体的または部分的に配置され得る。電極が硝子体液内（例えば、完全に硝子体液内）に配置される場合、電極は、硝子体液と網膜との界面（例えば、黄斑における界面）と電気的に連通して配置され得る。
前述の態様のいずれにおいても、電極（例えば、実質的に平坦な電極または針電極の先端）が標的細胞に近接すると、印加エネルギーの波形の振幅の20％以内（例えば、印加エネルギーの波形の振幅の19％以内、18％以内、17％以内、16％以内、15％以内、14％以内、13％以内、12％以内、11％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、または1％以内）である、標的細胞における電圧（例えば、電位）をもたらす。
様々な適切な電気的パラメータおよびそのアルゴリズムを使用し得ることが理解されるであろう。電圧源は、例えば、標的細胞において、約10V/cm～約1,500V/cm（例えば、約10V/cm～約100V/cm、例えば、約10V/cm、20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、または100V/cm、例えば、約100V/cm～約1,000V/cm、例えば、約200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、または1,000V/cm、例えば、約1,000V/cm～約1,500V/cm、例えば、約1,110V/cm、1,200V/cm、1,300V/cm、1,400V/cm、または1,500V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電圧源は、例えば、標的細胞において、約10V/cm～約1,000V/cm（例えば、約10V/cm～500V/cmまたは約500V/cm～約1,000V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電場強度は50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、電場強度は、標的細胞において約100V/cmである。
いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、5V～100V（例えば、10V～80V、15V～70V、20V～60V、または30V～50V;例えば、約10V、約15V、約20V、約25V、約30V、約35V、約40V、約45V、約50V、約55V、約60V、約65V、約70V）である。いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、20V～60Vである。いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、30V～50V、例えば、約35V～45Vである。前述の態様のいずれにおいても、電極が標的細胞にごく近接すると、印加エネルギーの波形の振幅の20％以内（例えば、印加エネルギーの波形の振幅の19％以内、18％以内、17％以内、16％以内、15％以内、14％以内、13％以内、12％以内、11％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、または1％以内）である、標的細胞における電圧（例えば、電位）をもたらす。例えば、網膜の近くに配置された単極硝子体内電極からの40V振幅のパルスは、標的網膜細胞において35Vの電圧（例えば、電位）をもたらし得る。標的細胞で所与の電圧を達成するために必要な波形振幅は、電極構成（例えば、単極対双極）、電極形状、電極と標的細胞との間の距離、ならびに組織（例えば、硝子体および網膜）の材料特性（例えば、導電率）に依存することが理解されるであろう。
いくつかの態様では、パルス電場から生じる電流は、10μA～1A（例えば、10μA～500mA、10μA～200mA、10μA～100mA、10μA～50mA、または10μA～25mA;例えば、50μA～500mA、100μA～200mA、または1mA～100mA;例えば、10μA～20μA、20μA～30μA、30μA～50μA、50μA～100μA、100μA～150μA、150μA～200μA、200μA～300μA、300μA～400μA、400μA～500μA、500μA～600μA、600μA～800μA、800μA～1mA、1mA～10mA、10mA～20mA、20mA～30mA、30mA～40mA、40mA～50mA、50mA～60mA、60mA～70mA、70mA～80mA、80mA～90mA、90mA～100mA、100mA～200mA、200mA～300mA、300mA～500mA、または500mA～1A;例えば、約1mA、約5mA約10mA、約15mA、約20mA、約25mA、約30mA、約35mA、約40mA、約45mA、約50mA、約60mA、約70mA、約80mA、約90mA、または約100mA）である。
いくつかの態様では、電極は、網膜界面から約10mm以内（例えば、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、または0.5mm、0.45mm、0.40mm、0.35mm、0.30mm、0.25mm、0.20mm、0.15mm、または0.10mm以内）に配置される。電極は、1つまたは複数のパルスの伝達時に網膜界面から0.1～約0.5mm（例えば、約0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.30mm、0.35mm、0 40mm、0.45mm、もしくは0.5mm）、または約0.5mm～5mm（例えば、約0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、もしくは5mm）にあり得る。いくつかの態様では、電極（例えば、実質的に平坦な電極）は、1つまたは複数のパルスの伝達時に網膜界面から約1mm以内にある。
標的細胞（例えば、黄斑の網膜細胞であり得る標的網膜細胞）は、網膜界面（例えば、黄斑において）から約5mm（例えば、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、または0.5mm）以内にあり得る。例えば、標的細胞は、網膜界面から約0.01mm～約1mm（例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm）であり得る。
様々な適切な電気的パラメータおよびそのアルゴリズムを使用し得ることが理解されるであろう。電圧源は、例えば、標的細胞（例えば、網膜細胞）において、約10V/cm～約1,500V/cm（例えば、約10V/cm～約100V/cm、例えば、約10V/cm、20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、または100V/cm、例えば、約100V/cm～約1,000V/cm、例えば、約200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、または1,000V/cm、例えば、約1,000V/cm～約1,500V/cm、例えば、約1,110V/cm、1,200V/cm、1,300V/cm、1,400V/cm、または1,500V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電圧源は、例えば、標的細胞（例えば、網膜細胞）において、約10V/cm～約1,000V/cm（例えば、約10V/cm～500V/cmまたは約500V/cm～約1,000V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電場強度は50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、電場強度は、標的細胞（例えば、標的網膜細胞）において約100V/cmである。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～60秒以内（例えば、1～5秒、5～10秒、10～15秒、15～20秒、20～30秒、30～40秒、40～50秒、または50～60秒以内）に送達される。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1～5秒、5～10秒、10～15秒、または15～20秒以内、例えば、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有し得る。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、60V、70V、80V、90V、100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5～250V（例えば、約20V）の振幅を有する。前述の電圧のいずれも、方形波形の頂点、正弦波形のピーク、鋸歯状波形のピーク、正弦波形の二乗平均平方根（RMS）電圧、または鋸歯状波形のRMS電圧であり得る。
いくつかの態様では、約1～12パルス（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが使用中に伝達される。いくつかの態様では、約4～12パルスの電気エネルギーが使用中に伝達される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は、約10ms～約200msである。例えば、電気エネルギーのパルスの各々は、約10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は約50msからである。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は10ms未満である。例えば、電気エネルギーのパルスの各々は、約10μs～約10ms、例えば、約10μs～約100μs、例えば、約20μs、30μs、40μs、50μs、60μs、70μs、80μs、90μs、または100μs、例えば、約100μs～約1ms、例えば、約200μs、300μs、400μs、500μs、600μs、700μs、800μs、900μs、または1ms、例えば、約1ms～約10ms、例えば、約2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、または10msであり得る。
電気的導入に適した電場は、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター））またはその薬学的組成物の投与時または投与時付近に標的眼細胞に伝達され得る（例えば、同じ手順の一部として）。例えば、本発明は、電場が、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター））またはその薬学的組成物の投与後1時間以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与後55分以内、50分以内、45分以内、40分以内、35分以内、30分以内、25分以内、20分以内、15分以内、10分以内、5分以内、4分以内、3分以内、2分以内、90秒以内、60秒以内、45秒以内、30秒以内、20秒以内、15秒以内、10秒以内、9秒以内、8秒以内、7秒以内、6秒以内、5秒以内、4秒以内、3秒以内、2秒以内、または1秒以内に）（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与と同時に、または投与後であるが前記期間のいずれか以内に）伝達される方法を含む。いくつかの態様では、電場は、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与後24時間以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与後22時間以内、20時間以内、18時間以内、16時間以内、14時間以内、12時間以内、10時間以内、8時間以内、6時間以内、5時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、90分以内、60分以内、45分以内、30分以内、20分以内、15分以内、10分以内、8分以内、6分以内、5分以内、4分以内、3分以内、または2分以内に）伝達される。いくつかの態様では、電場は、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与後7日以内に（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター）またはその薬学的組成物の投与後6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、または2日以内に）伝達される。
電気的導入に適した電場は、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその薬学的組成物の投与（例えば、注射）部位またはその近くで伝達され得る。例えば、いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその薬学的組成物は硝子体内に投与され、電極は、電場の伝達のために硝子体内投与部位またはその近く（例えば、硝子体内投与部位から10mm以内、8mm以内、6mm以内、5mm以内、4mm以内、3mm以内、2mm以内、または1mm以内）に配置される。他の態様では、治療薬は網膜下に投与（例えば、注射）され、電極は、電場の伝達のために網膜下投与部位またはその近く（例えば、網膜下投与部位から10mm以内、8mm以内、6mm以内、5mm以内、4mm以内、3mm以内、2mm以内、または1mm以内）に配置される。他の態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその薬学的組成物は、上脈絡膜投与され、電極は、電場の伝達のために上脈絡膜投与部位またはその近く（例えば、上脈絡膜投与部位から10mm以内、8mm以内、6mm以内、5mm以内、4mm以内、3mm以内、2mm以内、または1mm以内）に配置される。
いくつかの場合には、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその薬学的組成物は、電場にさらされる（またはその後の電場伝達の際に電場にさらされることになる）位置に投与される。いくつかの態様では、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、環状DNAベクター））またはその薬学的組成物は、最大組織電圧の1％またはそれ以上（例えば、最大組織電圧の少なくとも5％、最大組織電圧の少なくとも10％、最大組織電圧の少なくとも20％、最大組織電圧の少なくとも30％、最大組織電圧の少なくとも40％、最大組織電圧の少なくとも50％、最大組織電圧の少なくとも60％、最大組織電圧の少なくとも70％、最大組織電圧の少なくとも80％、または最大組織電圧の少なくとも90％、例えば、最大組織電圧の1％～10％、最大組織電圧の10％～20％、最大組織電圧の20％～30％、最大組織電圧の30％～40％、最大組織電圧の40％～50％、最大組織電圧の50％～60％、最大組織電圧の60％～70％、最大組織電圧の70％～80％、最大組織電圧の80％～90％、最大組織電圧の90％～95％、または最大組織電圧の95％～100％）である電圧にさらされる（またはさらされることになる）位置に送達される。
あるいは、投与部位は、電場から離れた組織の領域にあり得る。例えば、治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））またはその薬学的組成物の投与は全身的（例えば、静脈内）であり得るが、電場は眼内（例えば、硝子体液中または網膜下腔内）に伝達される。
電気的導入（例えば、PEFによる）を含む本明細書に記載の方法のいずれにおいても、電気エネルギーの伝達時の筋収縮のリスクおよび/または重症度を軽減するのに役立ち得る標準的な手順に従って、麻痺薬を投与し得る。
治療の特徴付け
本明細書に記載の核酸ベクターから発現される眼タンパク質（例えば、網膜タンパク質）のレベルまたは濃度は、投与されたベクターの発現レベル、存在、非存在、切断、または変化であり得る。レベルを1つもしくは複数の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカのアッセイと相関させることが有利であり得る。アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリ、qRT-PCR、リアルタイムPCR、PCR、フローサイトメトリ、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実施され得、エキソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）法などの免疫組織化学的方法を使用して単離され得る。本明細書に記載の核酸ベクターによって送達される治療遺伝子は、紫外可視分光法（UV/Vis）などであるがこれに限定されるわけではない方法を使用して定量化され得る。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが適切なサイズであり得るかどうかを決定し、ポリヌクレオチドの分解が起こっていないことを確認するために分析され得る。ポリヌクレオチドの分解は、アガロースゲル電気泳動、強陰イオン交換HPLC、弱陰イオン交換HPLC、逆相HPLC（RP-HPLC）、疎水性相互作用HPLC（HIC-HPLC）、液体クロマトグラフィ-質量分析（LCMS）、キャピラリー電気泳動（CE）およびキャピラリーゲル電気泳動（CGE）などであるがこれらに限定されるわけではない、HPLCベースの精製方法などであるがこれらに限定されるわけではない方法によって確認され得る。
治療の有効性は、当技術分野で公知のまたは本明細書で提供される任意の適切な方法を使用してモニタリング、評価、および/または定量化することができる。例えば、網膜疾患または障害について治療された個体を定期的にモニタリングして、例えば、標準的な試験を使用して視力および視野を試験することによって、網膜変性の進行を評価し得る。追加的または代替的に、光干渉断層撮影法（OCT）（例えば、スペクトラルドメインOCT（SD-OCT））を実施して網膜構造の変化を評価することができる。いくつかの場合には、本明細書に記載の方法によって治療された個体は、眼底自発蛍光（FAF）および/またはSD-OCTなどのイメージングエンドポイントによって評価される網膜構造の改善を示すか、またはさらなる分解を示さない。
治療の安全性および忍容性は、当技術分野で公知のまたは本明細書で提供される任意の適切な方法を使用してモニタリング、評価、および/または定量化することができる。例えば、網膜の疾患または障害について治療された個体を定期的にモニタリングして、白内障形成、眼内炎症、またはRPE色素脱失などの網膜損傷を評価し得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法に従って治療された個体は、白内障形成を示さず、治療後2ヶ月まで眼内炎症を示さず（もしくは治療後2ヶ月までグレード2未満の眼内炎症を示す）、および/または最小の網膜/RPE損傷（例えば、RPE色素脱失）を示す。
いくつかの場合には、個体は、本明細書に記載される態様のいずれかによる核酸ベクターおよび電気的導入でその生涯に一度だけ治療される（例えば、疾患または障害の治療は数年間（例えば、3～5年間、5～10年間、10～15年間、または少なくとも15年間）継続される。あるいは、個体は、その生涯に厳密に2回治療され得る。追加的または代替的に、個体は、2～3年毎に1回、3～5年毎に1回、または5～10年毎に1回治療され得る。
IV. 装置
本明細書に記載の装置は、近位端と、遠位端と、それらの間の長手方向軸とを有するシースを含む。装置は、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体を含む。いくつかの態様（例えば、平面電極を含む態様）では、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料から構成され、導体が引き込み位置にある近位位置（図4A）から細長い導体が展開される遠位位置（図fB）までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は半径方向に弛緩する。半径方向に弛緩すると、細長い導体は、シースの長手方向軸に対してほぼ垂直である実質的に平坦な電極を形成する。
近位端と、遠位端と、それらの間の長手方向軸とを有するシースを含む装置も特徴とする。装置は、シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体をさらに含み、細長い導体は、予め形成された形状記憶材料を含み、近位位置から遠位位置までシース内に引き込み可能である。近位位置では、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。遠位位置では、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在しており、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度（例えば、約10°～約170°、例えば、約20°～約160°、例えば、約30°～約150°、例えば、約45°～約135°、例えば、約60°～約120°、例えば、約70°～約110°、例えば、約80°～約100°、例えば、約85°～約95°、例えば、約10°、20°、30°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、71°、72°、73°、74°、75°、76°、77°、78°、79°、80°、81°、82°、83°、84°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、96°、97°、98°、99°、100°、101°、102°、103°、104°、105°、106°、107°、108°、109°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°、150°、160°、または170°）で配置された電極を形成する。いくつかの態様では、電極は、実質的に平坦な電極である。いくつかの態様では、予め形成された角度は実質的に直角である。
本明細書に記載のそのような装置の構成要素は、例えば、図13～20に示されている。これらの図は、各構成要素の様々な寸法およびパラメータを示すが、当業者は、これらの寸法およびパラメータが例示的なものであり、本発明の範囲内で変更することができることを理解するであろう。
シース
装置は、細長い導体が展開されるシースを含む。シースは中空であり、導体がその中で展開し、引き込まれることを可能にする任意の適切なサイズまたは形状を含み得る。シースは、実質的に直線状であってもよく、または湾曲していてもよい。シースは、例えば、標的領域に到達するための容易な操作を提供するために、剛性であってもよく、または可撓性であってもよい。シースは、例えば引き込み位置にあるときに、細長い導体がその中に拘束されたままであることを可能にする実質的な剛性を有する。
シースは、約1mm～約100cm、例えば、約1cm～約75cm、約2cm～約50cm、約5cm～約40cm、約10cm～約35cm、または約15cm～約20cmの長さを有し得る。例えば、シースは、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約10mm、例えば、約2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、例えば、約10mm～約100mm、例えば、約20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、または100mm、例えば、約1cm～約10cm、例えば、約2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、または10cm、例えば、約10cm～約100cm、例えば、約15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、55cm、60cm、65cm、70cm、75cm、80cm、85cm、90cm、95cm、または100cmの長さを有し得る。
シースは、実質的に中空の管または他の適切な形状であり得、シースの厚さに依存する内径および外径を含む。シースの断面は、実質的に円形または楕円形であり得る。シースの断面は、多角形（例えば、三角形または正方形など）であり得る。いくつかの態様では、外側断面は第1の形状（例えば、円、楕円、または多角形、例えば三角形もしくは正方形）であり、内側断面は第2の形状（例えば、円、楕円、または多角形、例えば三角形もしくは正方形）である。シースの内径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの内径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、または5mmであり得る。
内径よりも大きいシースの外径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの外径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。
シースの厚さは、約0.01mm～約1mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mmであり得る。シースの厚さは、全体にわたって実質的に均一であってもよく、またはシースの異なる部分もしくは領域において異なる厚さを有してもよい。
シースは、金属または金属合金などの導電性材料で構成され得る。適切なシース材料としては、例えば、ステンレス鋼、チタン、PEEK（例えば、機械加工される、成形される、もしくは押出される）またはポリイミドなどのポリマー、例えばエポキシを含む織布ポリマーなどの複合材料、またはセラミックが挙げられる。いくつかの態様では、シースはステンレス鋼で作られる。いくつかの態様では、シースはニチノールで構成される。いくつかの態様では、シースはステンレス鋼で構成され、例えば電極ワイヤの引き込みを容易にするために、ポリマー先端を含む。
シースの遠位端は、電極が所望の標的細胞（例えば、網膜の表面付近の硝子体液中の）と適切に近接する（例えば、電気的に連通する）領域にアクセスできるように、眼に接触するように構成される。したがって、シースの遠位端は、眼を穿刺するための尖った先端などの鋭利な特徴を含み得る。先端部は傾斜していてもよい（例えば、標準ベベル、ショートベベル、またはトゥルーショートベベル）。シースの遠位端は、針（例えば、皮下注射針）を含み得る。針は、例えば所望する場合、細長い導体がそれを通ることを可能にし、かつ/またはシースの厚さと一致することを可能にする任意の適切なゲージまたは厚さであり得る。針のゲージは、例えば、約7～約33（例えば、約10～30、例えば、12～28、例えば、15～28、例えば、20～28、例えば、20～25、例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、または33であり得る。いくつかの態様では、針は19ゲージである。いくつかの態様では、針は23ゲージである。いくつかの態様では、針は25ゲージである。いくつかの態様では、針は30ゲージである。
いくつかの態様では、装置は第2のシースを含む。第2のシースは、第1のシースまたはその一部によって取り囲まれるように構成され得る。例えば、第2のシースは、第1のシースの直径よりも小さい直径を有し得る。いくつかの態様では、第2のシースは、例えば、細長い導体の近位端で細長い導体に接続される。いくつかの態様では、第2のシースは、本明細書に記載のアクチュエータ（例えば、スライダ）に接続される。
いくつかの態様では、装置（例えば、平面電極を有する装置、または非平面の針電極を有する装置）は、ハンドルに接続されたシースと、スライダに接続されたシース（例えば、第2のシース）とを含む（図13C）。細長い導体は、スライダに接続されたシース内に存在し得る。いくつかの態様では、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続されたシースと入れ子になっている。スライダに接続されたシースは、ハンドルまたはその一部に接続されたシースによって取り囲まれるように構成され得る。例えば、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続されたシースの直径よりも小さい直径を有し得る。あるいは、スライダに接続されたシースは、ハンドルまたはその一部に接続されたシースを取り囲み得る。例えば、スライダに接続されたシースは、ハンドルに接続されたシースの直径よりも大きい直径を有し得る。いくつかの態様では、スライダに接続されたシースは、例えば、細長い導体の近位端で細長い導体に接続される。
第2のシースの内径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、第2のシースの内径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、または5mmであり得る。
内径よりも大きい第2のシースの外径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、第2のシースの外径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。
第2のシースの厚さは、約0.01mm～約1mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mmであり得る。第2のシースの厚さは、全体にわたって実質的に均一であってもよく、または第2のシースの異なる部分もしくは領域において異なる厚さを有してもよい。
第2のシースは、針（例えば、皮下注射針）であってもよく、または針を含んでもよい。針は、例えば所望する場合、第1のシースおよび/または細長い導体がそれを通ることを可能にし、かつ/またはシースの厚さと一致することを可能にする任意の適切なゲージまたは厚さであり得る。針のゲージは、例えば、約7～約33（例えば、約10～30、例えば、12～28、例えば、15～28、例えば、20～28、例えば、20～25、例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、または33であり得る。いくつかの態様では、針は19ゲージである。いくつかの態様では、針は23ゲージである。いくつかの態様では、針は25ゲージである。いくつかの態様では、針は30ゲージである。
2つのシースを有する態様（例えば、平面電極を有する装置または非平面電極を有する装置）は、例えば第1のシース内の細長い導体の座屈を防止するのに特に有利であり得る。例えば、細長い導体が実質的に直線状であり、シース内にある場合、導体とシースとの間の接触力は、押されたときに細長い導体を座屈させる力よりも大きい（図10）。したがって、細長い導体は座屈する可能性があり、実質的に平坦な電極を含む細長い導体の遠位端は、シースを通して適切に展開することができない。第2のシースは、細長い導体を座屈させることなく実質的に平坦な電極のより効率的な展開を可能にし得る。特定の態様では、第2のシースを細長い導体および/またはスライダに直接接続することにより、座屈を防止し得る。
別の態様では、第1のシースおよび/または第2のシースの遠位端をハンドル内に延在させるまたは配置することによっても、座屈を防止し得る（図10、11、および12A）。
いくつかの態様では、シース（例えば、第1のシースおよび/または第2のシース）は、シースの内側および/または外側にコーティングを含む。コーティングは、例えば、シースおよび/または第2のシース（使用される場合）内の細長い導体などの摺動部分と第1のシースとの間の摩擦を低減するために使用され得る。
細長い導体
細長い導体は、シース内に配置され、シース内から展開され得る。導体は、約1mm～約100cm、例えば、約1cm～約75cm、約2cm～約50cm、約5cm～約40cm、約10cm～約35cm、または約15cm～約20cmの長さを有し得る。例えば、導体は、約1mm～約10mm、例えば、約2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、例えば、約10mm～約100mm、例えば、約20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、または100mm、例えば、約1cm～約10cm、例えば、約2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、または10cm、例えば、約10cm～約100cm、例えば、約15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、55cm、60cm、65cm、70cm、75cm、80cm、85cm、90cm、95cm、または100cmの長さを有し得る。
細長い導体は、実質的に円筒形（例えば、円筒形ワイヤ）であり得る。導体の断面は、実質的に円形または楕円形であり得る。導体の断面は、多角形、例えば三角形、正方形などであり得る。導体の直径は、約0.01mm～約5mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm～約0.5mm、例えば、約0.2mm～約0.3mmであり得る。例えば、シースの直径は、0.01mm～約5mm、例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm、例えば、約1mm～約5mm、例えば、約2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mmm、または5mmであり得る。いくつかの態様では、導体の直径は約0.2mmである。導体の直径は、全体にわたって実質的に均一であってもよく、または導体の異なる部分もしくは領域において異なる直径を有してもよい。
いくつかの態様では、装置は、例えばシース内で一緒に束ねられた複数の細長い導体を含む。一態様では、装置は2つの細長い導体を含み、各導体の断面は実質的に半円形、または楕円形の半分である。
導体の直径は、シースの内径の約50％～約99％であり得る。例えば、直径は、約55％～約95％、約60％～約90％、約65％～約85％、70％～約80％、または約75％であり得る。導体の直径は、例えば、シースの内径の50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％であり得る。
導体は、金属または金属合金などの当技術分野で公知の任意の適切な導電性材料から構成され得る。いくつかの場合には、導体はシースと同じ材料で構成される。他の場合には、導体はシースとは異なる材料である。導電体に有用な適切な導電性材料としては、例えば、白金、白金/イリジウム合金、ステンレス鋼、ニッケル、およびチタンが挙げられる。いくつかの態様では、導体は、ニッケルとチタン合金との合金（例えば、ニチノール）で作られる。ニチノールは、例えば、約40％～約70％のニッケル（例えば、約40％～約45％、約45％～約50％、約50％～約55％、約55％～約60％、約60％～約65％、または約65％～約70％、例えば、約40％、45％、50％、55％、60％、65％、または70％のニッケル）を含み得る。
実質的に平坦な電極
いくつかの態様では、細長い導体またはその一部（例えば、遠位部分）は、実質的に平坦な電極を含む。実質的に平坦な電極は、形状記憶材料（例えば、形状記憶合金）で構成される。形状記憶材料は、細長い導体の構造が、拘束（例えば、構造要素）が取り除かれると予め形成された形状へと弛緩することを可能にする。例えば、剛性シース内に収容された予め形成された形状記憶ワイヤは、それが脱鞘されるまで拘束され、その時点で、形状記憶材料は、図4～6に示すようにその予め形成された形状（例えば、実質的に平坦な電極）へと弛緩する。いくつかの態様では、アクチュエータを使用して実質的に平坦な電極を展開する（例えば、図10および11参照）。
本明細書に記載の装置では、予め形成された形状は、シースの長手方向軸および/または細長い導体の近位部分（例えば、実質的に平坦な電極を含まない領域）にほぼ垂直である実質的に平坦な電極であり得る。当業者は、いくつかの態様では、実質的に平坦な電極が完全に平坦でなくてもよいことを理解するであろう。例えば、いくつかの態様では、その垂直寸法（例えば、深さおよび幅などのデカルト寸法）のうちの2つは、それぞれその第3の垂直寸法（例えば、長さ）の少なくとも2倍である。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、その垂直寸法のうちの2つがそれぞれ、その第3の垂直寸法の少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、または少なくとも100倍、またはそれ以上である電極を指す。したがって、いくつかの場合には、実質的に平坦な電極の長手方向寸法は、実質的に平坦な電極の半径方向寸法（例えば、最も外側の半径方向の点）の10％未満である。いくつかの場合には、実質的に平坦な電極の長手方向寸法は、その半径方向寸法（例えば、最も外側の半径方向の点）の5％未満である。
特定の態様では、電極の空間構成は、その導電特性を最適化し、および/または細胞の標的領域に所望の電場を印加するように製造される。したがって、眼が湾曲を含む場合、電極の形状はまた、例えば、眼またはその一部（例えば、網膜）の形状に一致または近似する湾曲（例えば、凸形状）を含み得る。
いくつかの例では、細長い導体はワイヤであり、実質的に平坦な電極はワイヤの遠位部分である。いくつかの場合には、ワイヤの遠位先端（またはワイヤの遠位先端から5mm以内（例えば、4mm以内、3mm以内、2mm以内、1mm以内、0.5mm以内、または0.1mm以内）のワイヤに沿った点）は、実質的に平坦な電極の最も外側の半径方向の点にある。ワイヤの遠位部分は、長手方向平面上に予め形成された直角（または実質的に直角、例えば、約70°、75°、80°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、100°、105°、もしくは110°）;または、長手方向平面上で約45°～約135°（例えば、約45°、約50°、約55°、約60°、約65°、約115°、約120°、約125°、約130°、もしくは約135°）の予め形成された角度を含み得、ここで、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）は、実質的に平坦な電極とワイヤの近位部分との間にある。
いくつかの態様では、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度（例えば、約10°～約170°、例えば、約20°～約160°、例えば、約30°～約150°、例えば、約45°～約135°、例えば、約60°～約120°、例えば、約70°～約110°、例えば、約80°～約100°、例えば、約85°～約95°、例えば、約10°、20°、30°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、71°、72°、73°、74°、75°、76°、77°、78°、79°、80°、81°、82°、83°、84°、85°、86°、87°、88°、89°、90°、91°、92°、93°、94°、95°、96°、97°、98°、99°、100°、101°、102°、103°、104°、105°、106°、107°、108°、109°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°、150°、160°、または170°）で配置された電極を形成する。いくつかの態様では、電極は、実質的に平坦な電極である。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位または近位に延在している。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、予め形成された角度（例えば、予め形成された直角）から1mm以下（例えば、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、または0.1mm以下）遠位に延在している。いくつかの態様では、装置は、実質的に平坦な電極の遠位に何も含まない（例えば、実質的に平坦な電極は組織表面に自由に接触する）。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、例えば、長手方向軸に対して垂直な、または長手方向軸に対して予め形成された角度で、1つまたは複数の寸法（例えば、両方の寸法）で約2mm～約15mm（例えば、約2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、または15mm）である。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、長手方向平面に関して実質的に対称である。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は螺旋である（図6）。例えば、螺旋は、長手方向軸を中心に1～5（例えば、1、1.5、2、2.5、3、2.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、またはそれ以上）回転を含み得る。いくつかの場合には、螺旋は、長手方向軸を中心に2～5回転を有する。いくつかの場合には、螺旋は、長手方向軸を中心に2～3回転を有する。特定の態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に2回転を有する。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心に3回転を有する。他の適切な形状には、例えば、ループ、同心ループ、パドル、メッシュ、グリッド、または傘の形状が含まれる。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心とした3回転からなる。いくつかの態様では、螺旋は、長手方向軸を中心とした2回転からなる（図6）。
実質的に平坦な電極は、所定の刺激の存在下でその元の形状を回復することができる形状記憶材料（例えば、形状記憶合金、例えばNiTi）から全体的または部分的に作製することができる。例えば、形状記憶材料は、構造的拘束が取り除かれると予め形成された形状へと弛緩することができる。本明細書に記載されるように、剛性シース内に収容された予め形成された形状記憶ワイヤ（例えば、実質的に平坦な電極）は、それが脱鞘されるまで直線状であり、その時点で、形状記憶材料は螺旋などのその予め形成された形状へと弛緩する。形状記憶材料は当技術分野で公知である。いくつかの態様では、形状記憶材料は、NiTi、CuAlNi、またはCuZnAlなどの合金を含む。形状記憶材料は鉄系であり得る。いくつかの態様では、形状記憶材料はNiTiである。NiTiは、ニッケルとチタンとの合金（ニチノール）である。ニチノールは、例えば、約40％～約70％のニッケル（例えば、約40％、45％、50％、55％、60％、65％、または70％のニッケル）を含み得る。
絶縁体
装置は、細長い導体とシースとの間に配置された絶縁体を含み得る。絶縁体は、細長い導体の近位部分とシースとの間に配置され得る。絶縁体は、シースと細長い導体との間の電気的接触を防止する。絶縁体は、ガラス、磁器、またはポリマー（例えば、複合ポリマー）材料などの任意の適切な材料で作られ得る。いくつかの態様では、絶縁体は、ポリイミドまたはポリエーテルエーテルケトン（PEEK）から構成される。いくつかの態様では、絶縁体は、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）、低密度ポリエチレン（LDPE）、ポリオレフィンとエチレンアクリル酸コポリマーとのブレンド、高密度ポリエチレン（HDPE）、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）、ポリ塩化ビニル（PVC）、パリレンC、またはそれらの組合せから構成される。絶縁材料は、電極表面に堆積されてもよく、または例えば熱収縮チューブを介して作製されてもよい。絶縁体は、約1μm～約100μm、例えば約5μm～約90μm、約10μm～約80、約10μm～約50μm、または約20μm～約30μm、例えば、約25μmの厚さを有し得る。例えば、絶縁体は、約1μm～約10μm、例えば、約1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、または10μm、例えば、約10μm～約100μm、例えば、約15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、または50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、または100μmの厚さを有し得る。
いくつかの態様では、装置は、細長い導体と絶縁体との間に配置された接着剤、膠、またはエポキシをさらに含む。
ハンドル
いくつかの態様では、記載される装置はハンドルを含む。特定の態様では、装置の近位部分は、例えば容易な操作のためのハンドルを含む。ハンドルは、シース上に配置され得る。ハンドルは、例えば、細長い導体の近位部分に配置され得る。いくつかの態様では、装置は、シースを操作するためのハンドルと、例えばシース内の導体を操作するための、細長い導体の近位部分のハンドルとを含む。
ハンドルは、近位端と遠位端とを有し得る（図10、11、および15）。いくつかの態様では、シースの近位端はハンドルに接続される（例えば、ハンドルに接続され、ハンドル内に配置される）。いくつかの態様では、ハンドルの遠位部分は、ハンドルの内面とその中の細長い導体との間の中空領域を含む。シースの近位端は、少なくともハンドル内の中空領域内に延在していてもよい。いくつかの態様では、シースの近位端は、ハンドル内の中空領域内に少なくとも1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、またはそれ以上延在している（図11）。
いくつかの態様では、ハンドルは円筒形である（図12A～12C）。いくつかの態様では、ハンドルは、ハンドルの遠位端および/または近位端にキャップをさらに含む（図12B、13、および14）。例えば、ハンドルは、例えばハンドルの中空部分を閉じるために、遠位端および近位端のそれぞれにキャップを含み得る。
いくつかの態様では、ハンドルは、約3インチ～約10インチ、例えば、約3インチ～約9インチ、例えば、約3インチ、4インチ、5インチ、6インチ、7インチ、8インチ、9インチ、または10インチの長さを有し得る。いくつかの態様では、ハンドルの長さは、約5インチ～約6インチ、例えば、約5.5インチ、例えば、約5.425インチである（図15）。
いくつかの態様では、ハンドルの遠位端および/または近位端内に嵌合するキャップは、約0.1インチ～約1.0インチ、例えば、約0.1インチ、0.2インチ、0.3インチ、0.4インチ、0.5インチ、0.6インチ、0.7インチ、0.8インチ、0.9インチ、または1.0インチの長さを有する。いくつかの態様では、キャップの長さは、約0.2インチ～約0.3インチ、例えば、約0.28インチである（図13および14）。
アクチュエータ
本明細書に記載の装置は、アクチュエータ（例えば、スライダ）をさらに含み得る。アクチュエータ（例えば、スライダ）は、近位位置と遠位位置との間、例えばその弛緩位置と被覆位置との間で細長い導体を摺動させるように構成され得る。アクチュエータは、手動アクチュエータであってもよい。あるいは、アクチュエータは、電子制御アクチュエータであってもよい。いくつかの態様では、アクチュエータは圧電アクチュエータである。
いくつかの態様では、アクチュエータは、細長い導体に機能的に結合される。いくつかの態様では、アクチュエータは、装置のハンドル上に存在する。
いくつかの態様では、アクチュエータはスライダである。スライダは、近位端と遠位端とを有し、細長い導体に取り付けられる（例えば、直接的または間接的に）（例えば、図10～12および27参照）。スライダは、細長い導体をシースの長手方向軸に沿って遠位位置から近位位置に引き込むように構成され得る。いくつかの態様では、スライダは、近位位置と遠位位置とを含む。近位位置では、シースの近位端は、スライダの遠位端内に配置されるか、または少なくともスライダの遠位端まで延在している。遠位位置では、シースの近位端は、スライダの近位端と遠位端との間に配置されるか、またはスライダの近位端と遠位端との間まで延在している。いくつかの態様では、スライダは中空であり、細長い導体は、スライダ内に配置されるか、またはスライダ全体を通って延在している。
いくつかの態様では、スライダは、遠位位置および/または近位位置に達すると停止するように構成される。いくつかの態様では、スライダは遠位位置に配置され、細長い導体の遠位部分はシースの遠位端を越えて延在している。細長い導体の遠位部分の形状記憶材料は、半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度で実質的に平坦な電極を形成し得る。
いくつかの態様では、スライダは近位位置に配置され、細長い導体の遠位部分は実質的に直線状である。いくつかの態様では、スライダは、ハンドルの外部に配置された制御部材をさらに含む。制御部材は、スライダの容易な制御もしくは人間工学的設計のための突起部、ノブ、または他の機構を含み得る。制御部材とスライダとは一体であってもよい。あるいは、制御部材とスライダとは一体でなくてもよく、例えば、別個の部品であってもよい。
いくつかの態様では、スライダの長さは、約0.5インチ～約5.0インチ、例えば、約0.5インチ～約3.5インチ、例えば、約1.0インチ～約2.5インチ、例えば、約2.0インチ、例えば、約1.925インチである（図19）。
いくつかの態様では、制御部材の長さは、約0.1インチ～約2.0インチ、例えば、約0.2インチ、0.3インチ、0.4インチ、0.5インチ、0.6インチ、0.7インチ、0.8インチ、0.9インチ、1.0インチ、1.1インチ、1.2インチ、1.3インチ、1.4インチ、1.5インチ、1.6インチ、1.7インチ、1.8インチ、1.9インチ、または2.0インチ、例えば、約0.5インチ～約1.0インチ、例えば、約0.8インチである（図17）。
さらなる要素
本明細書に記載の装置は単極であってもよい。あるいは、装置は双極であってもよい。双極態様では、装置は、実質的に平坦な電極と電気的に連通する補助電極をさらに含む。補助電極は、シースの一部であってもよく、またはシースに接続されていてもよい。
装置は、電圧源をさらに含み得る。装置は、波形コントローラをさらに含み得る。いくつかの態様では、細長い導体の近位部分は、電圧源および/または波形コントローラに接続される。
装置は、内視鏡または気管支鏡と共に使用するように構成され得る。例えば、装置は、気管支鏡の内視鏡の遠位端に配置され得、例えば対象への挿入時に展開され得る。
V. 装置の使用方法
本発明は、本明細書に記載の装置のいずれかを使用する方法を特徴とする。いくつかの場合には、本発明は、本明細書に記載の装置を使用して個体の標的細胞に治療薬を送達する方法を提供する。この方法は、シースまたは針を個体の外部組織表面から挿入し、細長い導体を遠位位置に摺動させて、予め形成された形状記憶材料を半径方向に弛緩させ、それによって組織内に実質的に平坦な電極を形成する工程を含む。本方法は、スライダを作動させて（例えば、遠位位置まで）、その被覆位置から実質的に平坦な電極を展開する工程を含み得る。本方法は、標的細胞を実質的に平坦な電極から分離している組織界面と電気的に連通するように実質的に平坦な電極を配置する工程をさらに含む。この方法はまた、治療薬の標的細胞への電気的導入に適した条件で、実質的に平坦な電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する（例えば、電圧源を用いて）工程を含む。
いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、組織界面から約10mm以内（例えば、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、または0.5mm、0.45mm、0.40mm、0.35mm、0.30mm、0.25mm、0.20mm、0.15mm、または0.10mm以内）に配置される。実質的に平坦な電極は、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から0.1～約0.5mm（例えば、約0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.30mm、0.35mm、0 40mm、0.45mm、もしくは0.5mm）、または約0.5mm～5mm（例えば、約0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、もしくは5mm）にあり得る。いくつかの態様では、電極が標的細胞にごく近接すると、印加エネルギーの波形の振幅の20％以内（例えば、印加エネルギーの波形の振幅の19％以内、18％以内、17％以内、16％以内、15％以内、14％以内、13％以内、12％以内、11％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、または1％以内）である、標的細胞における電圧（例えば、電位）をもたらす。いくつかの態様では、実質的に平坦な電極は、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から約1mm以内にある。前述の態様のいずれにおいても、電極が標的細胞に近接すると、印加エネルギーの波形の振幅の20％以内（例えば、印加エネルギーの波形の振幅の19％以内、18％以内、17％以内、16％以内、15％以内、14％以内、13％以内、12％以内、11％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、または1％以内）である、標的細胞における電圧（例えば、電位）をもたらす。
標的細胞は、組織界面から約5mm（例えば、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、または0.5mm）以内であり得る。例えば、標的細胞は、組織界面から約0.01mm～約1mm（例えば、約0.01mm～約0.1mm、例えば、約0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、または0.1mm、例えば、約0.1mm～約1mm、例えば、約0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、または1mm）であり得る。
様々な適切な電気的パラメータおよびそのアルゴリズムを使用し得ることが理解されるであろう。電圧源は、例えば、標的細胞において、約10V/cm～約1,500V/cm（例えば、約10V/cm～約100V/cm、例えば、約10V/cm、20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、または100V/cm、例えば、約100V/cm～約1,000V/cm、例えば、約200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、または1,000V/cm、例えば、約1,000V/cm～約1,500V/cm、例えば、約1,110V/cm、1,200V/cm、1,300V/cm、1,400V/cm、または1,500V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電圧源は、例えば、標的細胞において、約10V/cm～約1,000V/cm（例えば、約10V/cm～500V/cmまたは約500V/cm～約1,000V/cm）の電場強度を生成するように構成され得る。いくつかの態様では、電場強度は50V/cm～300V/cmである。いくつかの態様では、電場強度は、標的細胞において約100V/cmである。
いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、5V～100V（例えば、10V～80V、15V～70V、20V～60V、または30V～50V;例えば、約10V、約15V、約20V、約25V、約30V、約35V、約40V、約45V、約50V、約55V、約60V、約65V、または約70V）である。いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、20V～60Vである。いくつかの態様では、標的細胞における電圧（例えば、電位）は、30V～50V、例えば、約35V～45Vである。前述の態様のいずれにおいても、電極が標的細胞にごく近接すると、印加エネルギーの波形の振幅の20％以内（例えば、印加エネルギーの波形の振幅の19％以内、18％以内、17％以内、16％以内、15％以内、14％以内、13％以内、12％以内、11％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、または1％以内）である、標的細胞における電圧（例えば、電位）をもたらす。例えば、網膜の近くに配置された単極硝子体内電極からの40V振幅のパルスは、標的網膜細胞において35Vの電圧（例えば、電位）をもたらし得る。標的細胞で所与の電圧を達成するために必要な波形振幅は、電極構成（例えば、単極対双極）、電極形状、電極と標的細胞との間の距離、ならびに組織（例えば、硝子体および網膜）の材料特性（例えば、導電率）に依存することが理解されるであろう。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～60秒以内（例えば、1～5秒、5～10秒、10～15秒、15～20秒、20～30秒、30～40秒、40～50秒、または50～60秒以内）に送達される。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの総数は、1～20秒以内に送達される。例えば、電気エネルギーのパルスの総数は、1～5秒、5～10秒、10～15秒、または15～20秒以内、例えば、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、または20秒以内に送達され得る。電気エネルギーのパルスは、例えば、方形波形であり得る。電気エネルギーのパルスは、5V～500Vの振幅を有し得る。例えば、電気エネルギーのパルスは、約5V、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、60V、70V、80V、90V、100V、125V、150V、175V、200V、225V、250V、275V、300V、325V、350V、375V、400V、425V、450V、475V、または500Vの振幅を有し得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスは、約5～250V（例えば、約20V）の振幅を有する。
いくつかの態様では、約1～12パルス（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12パルス）の電気エネルギーが使用中に伝達される。いくつかの態様では、約4～12パルスの電気エネルギーが使用中に伝達される。
いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は、約10ms～約200msである。例えば、電気エネルギーのパルスの各々は、約10ms、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、90ms、100ms、110ms、120ms、130ms、140ms、150ms、160ms、170ms、180ms、190ms、または200msであり得る。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は約50msからである。いくつかの態様では、電気エネルギーのパルスの各々は10ms未満である。例えば、電気エネルギーのパルスの各々は、約10μs～約10ms、例えば、約10μs～約100μs、例えば、約20μs、30μs、40μs、50μs、60μs、70μs、80μs、90μs、または100μs、例えば、約100μs～約1ms、例えば、約200μs、300μs、400μs、500μs、600μs、700μs、800μs、900μs、または1ms、例えば、約1ms～約10ms、例えば、約2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、または10msであり得る。
装置は、治療薬の送達と組み合わせて使用され得る。例えば、いくつかの態様では、治療薬は、予め組織に投与されている。他の態様では、方法は、電気エネルギーのパルスの送達と同時に治療薬を投与する工程をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、治療薬は電気エネルギーのパルスと同時に投与される。いくつかの態様では、治療薬は電気エネルギーのパルスと同時に投与される。いくつかの態様では、治療薬は、電気エネルギーのパルスの前に投与される。上記の態様のいずれにおいても、装置は、治療薬を送達する（例えば、シース上またはシース内のチャネルを介して、例えばシースと絶縁体との間のチャネルを介して）ように構成され得る。
治療薬は、核酸（例えば、非ウイルス核酸（例えば、裸の核酸ベクター）、例えば、非ウイルスDNAベクター（例えば、裸のDNAベクター））であり得る。核酸は、DNAまたはRNA（例えば、環状DNA（例えば、裸の環状DNA）または環状RNA（例えば、裸の環状RNA））であり得る。核酸は、ベクター、例えば導入遺伝子を含むベクターであり得る。ベクターは、例えば、非ウイルスベクター（例えば、裸の非ウイルスベクター、例えば裸の非ウイルスDNAベクター）であり得る。
いくつかの態様では、標的細胞は、眼内の細胞、例えば網膜細胞である。網膜細胞は、例えば、網膜色素上皮（RPE）細胞、光受容細胞、または神経節細胞であり得る。治療薬は、例えば、硝子体内、網膜下、上脈絡膜または眼に局所的に投与することができる。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、局所的（例えば、眼の上もしくは眼の中）または全身的（例えば、静脈内）に投与することができる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物または組成物および治療される状態、疾患または障害の重症度）に依存して異なり得る。特定の態様では、治療薬は硝子体内経路を介して送達される。特定の態様では、治療薬は上脈絡膜経路を介して送達される。いくつかの態様では、装置は眼の硝子体内腔を標的とする。
いくつかの態様では、装置は、本明細書に記載の任意の方法で使用され得る。
VI. キットおよび製品
本発明の別の局面では、上記の治療に有用な材料を含む製品またはキットが提供される。製品は、容器、および容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、単独で、または状態を治療、予防および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/もしくは組換え部位を欠く環状DNAベクター））または本発明の治療薬を含む薬学的組成物である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択される疾患または障害を治療するために使用されることを示す。製品は、組成物が特定の状態（例えば、アッシャー症候群1B型、常染色体劣性ベストロフィノパチー、常染色体優性ベスト卵黄様黄斑ジストロフィ、または黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（AMD））を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。代替的または追加的に、製品は、薬学的に許容される担体、例えば注射用静菌水（BWFI）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、または上記に開示される薬学的に許容される担体のいずれかなどを含む第2の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含む、商業的観点およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
本発明の特定の場合には、（i）上記の材料のいずれか1つまたは複数（例えば、本発明の前述の治療薬のいずれかおよび/または1つもしくは複数の薬学的に許容される担体）ならびに（ii）エネルギー送達装置（例えば、上記の任意の適切な装置またはシステムなどの、電場を組織（例えば、網膜）に伝達するための電極を含む装置）の1つまたは複数の要素を含むキットが提供される。いくつかの態様では、本発明の治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））ならびに電極を含むキットが本明細書で提供される。いくつかの態様では、本発明の治療薬（例えば、核酸ベクター（例えば、非ウイルスDNAベクター、例えば、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および/または組換え部位を欠く環状DNAベクター））を含む薬学的組成物ならびに電極を含むキットが本明細書で提供される。
以下は、上記の方法および組成物の非限定的な実施例である。以下の実施例はまた、上記の装置を具現化し、使用するための非限定的な方法を提供する。当業者は、以下の実施例の変形も本明細書の説明に包含されることを認識するであろう。
実施例1. 実質的に平坦な電極の計算モデリング
電場分布シミュレーションを実施して、網膜組織に対する実質的に平坦な電極によって伝達される電場の影響を、網膜組織に対する針電極によって伝達される電場の影響と比較し、各電極設計は、治療薬の網膜への電気的導入（すなわち、硝子体液を網膜の前方に接触させること）のために配置されている。図7A～7Cは針電極を示し、図8A～8Cは実質的に平坦な電極を示す。各電極は単極である。
図7A～7Cは、硝子体液（図7Aの円の下側セグメントとしてグラフ上に示されている）の後部に針電極を含む眼の横断面を示す。電圧が印加されると、針電極は、そのシースの軸に沿って楕円形の電場を生成する。針電極の遠位端を硝子体液-網膜界面から0.25mmに配置した場合（図7Aおよび7B）、＞50V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は0.5mm3であった;＞100V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は0.15mm3であった;＞150V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は0.075mm3であった。図7Cに示すように、針電極の遠位端を硝子体液-網膜界面からさらに離れて配置した場合（硝子体液-網膜界面から0.95mm）、＞50V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は0.4mm3に減少し、網膜組織のいずれも＞100V/cmの電場強度を受けなかった。したがって、針電極を0.7mm前方に移動させると、少なくとも100V/cmの電場強度を受ける網膜体積が100％減少した。
図8A～8Cは、実質的に平坦な電極による伝達時に網膜が受ける電場強度が電極位置に対して実質的により敏感でないことを示す。このシミュレーションでは、実質的に平坦な電極を0.7mm前方に移動させると、少なくとも100V/cmの電場強度を受ける網膜体積が8％だけ減少した。実質的に平坦な電極の遠位端を硝子体液-網膜界面から0.25mmに配置した場合（図8C）、＞50V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は1.87mm3であった;＞100V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は1.11mm3であった;＞150V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は0.77mm3であった。図8Bに示すように、実質的に平坦な電極の遠位端を硝子体液-網膜界面からさらに離れて配置した場合（硝子体液-網膜界面から0.95mm）、＞50V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は2.27mm3であった;＞100V/cmの電場強度を受ける網膜組織の体積は1.02mm3であった;網膜組織のいずれも＞150V/cmの電場強度を受けなかった。
したがって、網膜に対する電極位置の変化に対する耐性の改善に加えて、実質的に平坦な電極設計は、針電極設計に比べて、伝達される電場による網膜のより大きな体積へのアクセスを与える。
図9Aおよび9Bは、針電極（図9A）に比べて螺旋電極（図9B）を使用して電圧を印加した場合、網膜の電位が電極の電圧により密接に一致することを示す。20Vの電位を有する針電極の遠位端を硝子体液-網膜界面から0.4mmに配置した場合（図9A）、網膜の前部の電位は10.8Vであり、網膜の後部（脈絡膜-網膜界面）の電位は9.24であった。これと比較して、20Vの電位を有する螺旋電極を硝子体液-網膜界面から0.4mmに配置した場合（図9B）、網膜の前部の電位は19.0Vであり、網膜の後部（脈絡膜-網膜界面）の電位は17.9Vであった。このモデルは、平面電極設計が標的組織の体積にわたるエネルギー送達および電気的導入の一貫性をどのように改善することができるかを実証する。
実施例2. 実質的に平坦な電極を有する装置を用いた網膜への核酸ベクターの送達
図5に示す双極電極装置を使用して、網膜タンパク質をコードする遺伝子の突然変異を特徴とする遺伝性網膜障害を有する患者の診断後の個体の網膜色素上皮細胞の集団に核酸ベクターを送達する。患者は、網膜タンパク質をコードする非ウイルスDNAベクターを含む薬学的組成物を処方されており、例えば、20～150（例えば、50～150）マイクロリットルを含む薬学的組成物を網膜下注射または硝子体内注射によって患者の眼に投与する。同じ処置の一部として、シース内に引き込まれた細長い導体を有する装置を、非ウイルスDNAベクターを含む眼の硝子体液中に挿入する。アクチュエータを使用して、オペレータは、シースがその遠位位置になるまで、シースに対して遠位方向に細長い導体を摺動させ、それによって硝子体液内に実質的に平坦な電極を形成する。手術用顕微鏡を視覚的ガイドとして使用して、オペレータは、硝子体液-網膜界面から約0.5mmだけオフセットして、網膜の標的領域に対して実質的に同一平面方向に実質的に平坦な電極を配置する。オペレータは、毎秒1パルスで8秒にわたって、電極を介して8つの50V、20msのパルスを伝達する。あるいは、オペレータは、8つの20V、20msのパルスを伝達することを選択し得る。オペレータは、実質的に平坦な電極をシース内に近位方向に引き込み、装置を患者の眼から取り外す。処置を終了し、その後の数週間および数ヶ月にわたって、処置によって送達された遺伝子の発現の改善について患者をモニタリングする。
実施例3:ブタ網膜におけるGFPをコードする合成環状DNAベクターの電気的導入
GFPをコードし、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および組換え部位を欠くスーパーコイル合成共有結合閉環（C3）DNAベクター（C3-GFP）を、国際公開公報第2019/178500号に教示されている方法に従って無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅を用いて作製した。
225ugのベクターを、試験の1日目に、ゲッチンゲンミニブタの各眼の2つの網膜下ブレブ（それぞれ75μL）に単回両側網膜下注射によって投与した。簡潔には、動物を麻酔し、横臥位に置いた。局所プロパラカインを眼に適用した。結膜円蓋をベタジン溶液/生理食塩水の1:50希釈液で洗い流し、眼瞼縁を未希釈の5％ベタジン溶液で拭いた。眼にドレープをかけ、ワイヤ開瞼器を配置した。カリパスを使用して、上耳側および上鼻側強膜上の角膜輪部の3.0mm後方のスポットをマークした。両極性焼灼器を使用して、マークしたスポットの下の強膜を焼灼し、続いて未希釈の5％ベタジン溶液を局所適用した。25gの弁付きカニューレを備えた微小硝子体網膜ブレードを、結膜および強膜を通して各マークしたスポットに挿入し、硝子体液中に前進させながら、強膜固定鉗子を使用して眼球位置を固定した。トロカールを眼球の後軸に面するように配置し、次いで、引き込んで強膜ポートを所定位置に残した。次いで、31gの針を角膜輪部を通して前房に接線方向に挿入して、75μLの房水を除去した。外科用直接コンタクトレンズを、滅菌カップリングゲルを用いて角膜上に配置した。顕微鏡による後眼部の直接可視化を容易にするために、眼内照明プローブを強膜ポートの1つを通して挿入した。網膜下注射カニューレを第2のポートを通して挿入し、硝子体の中央に進めた。次いで、小径注射カニューレを網膜表面に接触するまで前進させた。次いで、投与溶液をゆっくりと送達して網膜下ブレブを誘導および充填した。適切なブレブ形成を可視化した後、注射を継続して、全用量体積（75μL/ブレブ）を網膜下腔に送達した。2つの注射ブレブを鼻および側頭部内に投与した。注射用量が送達されると、注射カニューレおよび眼内照明プローブを強膜ポートから取り出し、コンタクトレンズを角膜から取り外した。PEFが送達されたら、強膜ポートを除去した。
パルス電場（PEF）条件および結果のグループ特異的方法を以下に説明する。
単極針電極による網膜下PEF
注射の5分以内に、単極針電極（負極、0.2～2mmの長さ、25ゲージのトロカールに適合する大きさの直径）を網膜下ブレブ内に配置し（図2Bに示すように）、8つの20msの電気パルスを8秒にわたって20Vで伝達した。これらの条件で測定した平均電流は13.7mAであった。光干渉断層撮影法（OCT）および共焦点走査レーザー断層撮影法（cSLO）を、前処置時および7日目に実施した。7日目に、動物を安楽死させ、眼を解剖して、染色のために網膜および網膜色素上皮（RPE）ならびに脈絡膜を回収した。
7日目の共焦点走査レーザー検眼鏡（cSLO）画像は、ベースライン（図21A）と比較して、網膜下ブレブ内の広範で均一なGFP蛍光を示した（図21B）。光干渉断層撮影（OCT）画像は、トランスフェクションが安全であることを示唆した;構造変化または炎症は検出されなかった（図22A～22D）。H＆E染色は、構造変化を示さない点で一致していた（図23B）。組織学的画像（IHC）は、光受容体（PR）および網膜色素上皮（RPE）細胞の両方におけるGFP発現を示した（図23A）。
単極針電極による硝子体内PEF
単極針電極（正極;0.2～2mmの長さ、25ゲージのトロカールに適合する大きさの直径）を、電極の遠位端が網膜から1mm以内になるように硝子体内に配置した（図2Aに示すように）。8つの20msの電気パルスを8秒にわたって40Vで伝達した。これらの条件で測定した平均電流は26.7mAであった。6日目に、動物を安楽死させ、眼を解剖して、染色のために網膜および網膜色素上皮（RPE）ならびに脈絡膜を回収した。GFP発現はRPE層で観察された（図24Aおよび24B）。硝子体内に負極を配置した同様のPEF法では、RPE層のGFP染色が陰性になった（データは示していない）。
双極針電極による網膜下PEF
遠位端に負極を有し、遠位端に近位の針上の正極を有する双極針電極を、負極が網膜下ブレブ内にあり、正極が硝子体内にあるように配置した。8つの20msの電気パルスを8秒にわたって40Vで伝達した。6日目に、動物を安楽死させ、眼を解剖して、染色のために網膜および網膜色素上皮（RPE）ならびに脈絡膜を回収した。GFP発現はRPE層で観察された（図25）。
単極平面電極による硝子体内PEF
図6に示すような単極螺旋電極を標的網膜組織から1mm以内の硝子体液中に配置し、分散パッチを動物の腹部に配置した。＋40V（図2Cに示すように）または-40V（図2Dに示すように）の電気エネルギーを、各パルスが20msの持続時間を有する8つのパルスで単極電極から伝達した。これらの条件で測定した平均電流は32.1mAであった。7日目に、動物を安楽死させ、眼を解剖して、染色のために網膜および網膜色素上皮（RPE）ならびに脈絡膜を回収した。
両方の条件で、最小の網膜変性が観察された。＋40Vパルスを受けた眼（硝子体内正極）では、網膜の光受容細胞においてGFP染色が観察された（図28Aおよび28B）。-40Vパルスを受けた眼（硝子体内負極）では、GFP染色は陰性であった（データは示していない）。
対照
対照として、眼に、パルス電場による電気的導入なしでC3-GFPを網膜下に注射し（図26Aおよび26B）、パルス電場による電気的導入を伴ってPBSを網膜下に注射した（図27Aおよび27B）。電気的導入なしでC3-GFPを注射した眼では、RPEにおける有意なGFP標識は観察されなかった（図26A）。PBSで処理した眼では、非特異的標識は観察されなかった（図27A）。
実施例4:iRPE細胞における合成環状DNAベクターの持続的発現
網膜細胞における合成共有結合閉環（C3）DNAベクターの発現の持続性を評価するために、誘導した網膜色素上皮（iRPE）細胞を公知の方法に従って作製し、1日目にパルス電場ありおよびパルス電場なしでトランスフェクトし、GFP発現を経時的にモニタリングした。GFPをコードする合成C3 DNAベクターは実施例1に記載されているものであった。iRPE細胞を6.5mmトランスウェルプレートに播種し、20ugの合成C3 DNAベクターをトランスウェルあたり120uLの総体積で添加した（上部チャンバ）。双極プレート電極アセンブリを、電極棒間の距離4mmで各ウェルの細胞膜の上下に配置し、それぞれ5または20秒のパルス持続時間を有する300～450Vの2つのパルスを印加した。画像を、4日目（図29A）、21日目（図29B）、32日目（図29C）、40日目（図29D）、および49日目（図29E）に撮影した。GFP発現は、全ての時点で電気的導入によってトランスフェクトした細胞で観察され、低下の兆候はなかった。
実施例5:インビボ電気的導入によるブタ網膜におけるヒトABCA4 mRNAの発現
CAGプロモータによって駆動され、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠く全長ヒトABCA4をコードする合成共有結合閉環（C3）DNAベクター（C3-ABCA4;8656bp;SEQ ID NO:19）を、国際公開公報第2019/178500号に一般的に教示されている方法に従って無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅を用いて作製した。裸のC3-ABCA4を網膜下注射によってブタに投与し（225ug/眼）、網膜下PEFを単極針電極を使用して投与した（図2Bに示すように）。20Vの電気エネルギーを、各パルスが20msの持続時間を有する8つのパルスで単極電極（負極）から伝達した。眼を採取し、神経網膜（NR）層およびRPE/脈絡膜層を単離した。RNAを組織から単離し、ABCA4導入遺伝子および内因性ブタABCA4のmRNAレベルを、標準的な方法を用いてqPCRによって定量化した。
図30に示すように、ABCA4導入遺伝子のmRNA発現は、光受容体を含むNR層とRPE/脈絡膜層の両方で検出された。一般に、神経網膜層と比較してRPE/脈絡膜層でより高いABCA4導入遺伝子mRNA発現が検出された。この試験は、PEF媒介電気的導入によるC3-ABCA4の投与がインビボでABCA4導入遺伝子発現をもたらしたことを示す。
実施例6:インビボ電気的導入によるブタ網膜におけるヒトMYO7A mRNAの発現
細菌複製起点、薬物耐性遺伝子および組換え部位を欠く全長ヒトMYO7Aをコードする合成C3 DNAベクター（C3-MYO7A）を、国際公開公報第2019/178500号に一般的に教示されている方法に従って無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅を用いて作製した。裸のC3-MYO7Aを網膜下注射によって投与し（各眼あたり225ugのDNA;各眼あたり2.53×1013ベクターコピー）、網膜下PEFを単極針電極を使用して投与した（図2Bに示すように）。20Vの電気エネルギーを、各パルスが20msの持続時間を有する8つのパルスで単極電極（負極）から伝達した。眼を採取し、神経網膜（NR）層およびRPE/脈絡膜層を単離した。RNAを組織から単離し、ABCA4導入遺伝子および内因性ブタABCA4のmRNAレベルを、標準的な方法を用いてqPCRによって定量化した。
図31に示すように、MYO7A導入遺伝子のmRNA発現は、光受容体を含むNR層とRPE/脈絡膜層の両方で検出された。概して、神経網膜層と比較してRPE/脈絡膜層でより高いMYO7A導入遺伝子mRNA発現が検出された。この試験は、PEF媒介電気的導入によるC3-MYO7Aの投与がインビボでABCA4導入遺伝子発現をもたらしたことを示す。
実施例7:インビボ電気的導入によるブタ網膜におけるヒトABCA4タンパク質の発現
CAGプロモータによって駆動され、細菌複製起点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠くヒトABCA4をコードする合成共有結合閉環（C3）DNAベクター（C3-ABCA4;8656bp;SEQ ID NO:19）を、国際公開公報第2019/178500号に一般的に教示されている方法に従って無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅を用いて作製した。C3-ABCA4を1.5mg/mLの濃度で溶液に製剤化した。ゲッチンゲンミニブタの網膜下腔に、それぞれ75μLの2つのブレブを注射することによって、裸のC3-ABCA4を投与した（各眼あたり225ugのDNA;各眼あたり2.53×1013ベクターコピー）。注射後、単極針電極を各網膜下ブレブ内に配置し、8つの20msの電気パルスを20Vで伝達した。6日目に、動物を安楽死させ、眼を解剖して、染色のために網膜およびRPEならびに脈絡膜を回収した。
広範なヒトABCA4タンパク質発現が、RPEに隣接する光受容体層で観察された（図32A）。さらに、ヒトABCA4タンパク質は、光受容体外側セグメントで発現された（図32B、ロドプシンとの共局在化を示す）。これらのデータは、ブタにおけるC3-ABCA4のインビボ電気的導入が、所望の細胞型（PR）およびそれらの細胞内の所望の細胞内位置（外側セグメント）でヒトABCA4タンパク質の広範な発現をもたらしたことを示している。臨床的実現可能性を確認するために、図32および33は、ブタにおけるヒトABCA4導入遺伝子（図33）の、ヒト眼におけるヒト内因性ABCA4（図34）と同一の局在化を示す。
実施例8:iRPE細胞におけるC3-ABCA4とプラスミドABCA4との発現比較
誘導した網膜色素上皮（iRPE細胞）を公知の方法に従って作製し、無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅によって作製したプラスミドまたは合成環状DNAベクターによってコードされたABCA4を用いてインビトロでトランスフェクトした。簡潔には、iRPE細胞をラミニン被覆6ウェルプレートに播種し、100％コンフルエンスまで48時間培養した。細胞をTrypLEで採取し、計数し、24ウェルあたり＞2.5×105細胞で再プレートした。DNAベクターを1ug/ウェルで添加し、Neonトランスフェクションシステムを1100V、20msで使用して細胞をエレクトロポレーションした。細胞を48時間インキュベートした後、抗体染色を行った。タンパク質発現分析は、合成環状DNAベクターがプラスミドと比較してより多量のABCA4タンパク質を発現したことを明らかにした（図35）。合成環状DNAベクターによるABCA4発現を示す代表的な蛍光画像を、図36D～36Fに示すプラスミドベクターによる発現と比較して、図36A～36Cに示す。
実施例9:iRPE細胞におけるC3-MYO7AとプラスミドMYO7Aとの発現比較
iRPE細胞を公知の方法に従って作製し、無細胞プロセスでPhi29ポリメラーゼ媒介ローリングサークル増幅によって作製したプラスミドまたは合成環状DNAベクターによってコードされたMYO7Aを用いてインビトロでトランスフェクトした。簡潔には、iRPE細胞をラミニン被覆6ウェルプレートに播種し、100％コンフルエンスまで48時間培養した。細胞をTrypLEで採取し、計数し、24ウェルあたり＞2.5×105細胞で再プレートした。DNAベクターを1ug/ウェルで添加し、Neonトランスフェクションシステムを1100V、20msで使用して細胞をエレクトロポレーションした。細胞を48時間インキュベートした後、抗体染色を行った。タンパク質発現分析（図37）は、合成環状DNAベクター（レーン4）が、同じMYO7A導入遺伝子をコードするプラスミド（レーン3）と比較して、より多量のMYO7Aタンパク質を発現することを明らかにした。合成環状DNAベクターによるMYO7A発現を示す代表的な蛍光画像を、図38D～38Fに示すプラスミドベクターによる発現と比較して、図38A～38Cに示す。
実施例10:網膜下DNA注射および網膜下PEF投与によるシュタルガルト病の治療
患者は、シュタルガルト病による網膜変性を引き起こす二対立遺伝子ABCA4変異を有する成人である。実施例7に記載のC3-ABCA4を水性薬学的組成物中に裸の形態で提供し、網膜下送達装置に装填する。150μLの薬学的組成物を患者の各眼に網膜下投与する（各眼あたり225μgのDNA;各眼あたり2.53×1013ベクターコピー）。
患者をパルス電場（PEF）治療のために準備する。環状DNAベクターの網膜下注射後30分以内に、シース内に細長いワイヤ電極を有するエネルギー送達装置を、図2Aに示すように各眼の硝子体液中に挿入する。手術用顕微鏡を視覚的ガイドとして使用して、露出された電極を、黄斑を中心とする網膜から約0.5mmの硝子体液内に完全に配置する。各パルスが20ミリ秒の持続時間を有する、40ボルト波形の8つのパルスを電極によって伝達する。電極を各眼から取り出し、処置が完了する。
処置後、患者を毎週モニタリングして、網膜変性の進行を評価する。この目的のために、標準的な試験を使用して視力および視野をモニタリングする。OCTを行って網膜構造の変化を評価する。
実施例11:網膜下DNA注射および硝子体内PEF投与によるアッシャー症候群1B型の治療
患者は、アッシャー症候群1B型による網膜変性を引き起こす対立遺伝子MYO7A変異を有する成人である。
国際公開公報第2021/055760号に記載されている方法から適合されたphi-29媒介ローリングサークル増幅による無細胞法を用いて、MYO7Aをコードする共有結合閉環状DNAベクターを作製する。環状DNAベクターを水性緩衝薬学的組成物中に裸の形態で提供し、網膜下送達装置に装填する。
100μLの薬学的組成物を患者の各眼に網膜下投与する。
患者をPEF治療のために準備する。環状DNAベクターの網膜下注射後30分以内に、シース内に細長いワイヤ電極を有するエネルギー送達装置を、図2Aに示すように各眼の硝子体液中に挿入する。手術用顕微鏡を視覚的ガイドとして使用して、露出された電極を、黄斑を中心とする網膜から約1mmの硝子体液内に完全に配置する。各パルスが20ミリ秒の持続時間を有する、40ボルト波形の8つのパルスを電極によって伝達する。電極を各眼から取り出し、処置が完了する。
処置後、患者を毎週モニタリングして、網膜変性の進行を評価する。この目的のために、標準的な試験を使用して視力および視野をモニタリングする。OCTを行って網膜構造の変化を評価する。
実施例12:上脈絡膜DNAおよびPEF投与によるアッシャー症候群1B型の治療
患者は、アッシャー症候群1B型による網膜変性を引き起こす対立遺伝子MYO7A変異に起因する網膜変性を有する成人である。
国際公開公報第2021/055760号に記載されている方法から適合されたphi-29媒介ローリングサークル増幅による無細胞法を用いて、MYO7Aをコードする共有結合閉環状DNAベクターを合成する。環状DNAベクターを水性緩衝薬学的組成物中に裸の形態で提供し、国際公開公報第2014/074823号に記載されている装置などの上脈絡膜投与用に構成されたマイクロニードルを有する送達装置に装填する。
図3Aに示すように、100μLの薬学的組成物を患者の各眼に上脈絡膜投与する。環状DNAベクターは、上脈絡膜腔を通って眼の後方に向かって移動し、そこで網膜を取り囲む細胞外空間（網膜および/または網膜に隣接する上脈絡膜腔）を占有する。
患者をパルス電場治療のために準備する。環状DNAベクターの上脈絡膜注射後30分以内に、シース内に細長いワイヤ電極を有するエネルギー送達装置を、図3B～3Eに示すように各眼の硝子体液中に挿入する。手術用顕微鏡を視覚的ガイドとして使用して、露出された電極を、黄斑を中心とする網膜から約1mmの硝子体液内に完全に配置する。各パルスが20ミリ秒の持続時間を有する、40ボルト波形の8つのパルスを電極によって伝達する。電極を各眼から取り出し、処置が完了する。
処置後、患者を毎週モニタリングして、網膜変性の進行を評価する。この目的のために、標準的な試験を使用して視力および視野をモニタリングする。OCTを行って網膜構造の変化を評価する。
（表１）配列
Figure 2024512520000001
Figure 2024512520000002
Figure 2024512520000003
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Figure 2024512520000035
Figure 2024512520000036
他の態様
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ独立した刊行物または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明をその特定の態様に関連して説明してきたが、本発明はさらなる変更が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、および本発明が関係する技術分野内の公知のまたは慣習的な実施の範囲内に入り、上述した本質的な特徴に適用され得、特許請求の範囲内に続く、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適合を包含することを意図していることが理解されるであろう。
他の態様は特許請求の範囲内にある。

Claims (172)

  1. 個体の標的網膜細胞に治療薬を送達する方法であって、
    （a）電極を眼の内部領域に接触させる工程であって、眼の網膜内の細胞外空間が治療薬を含む、工程;および
    （b）電極が眼の内部領域に接触している間に、治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する工程
    を含む、方法。
  2. 治療薬を網膜の細胞外空間に送達する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 治療薬の送達が網膜下注射によるものである、請求項2記載の方法。
  4. 治療薬の送達が硝子体内注射によるものである、請求項2記載の方法。
  5. 治療薬が網膜下注射によって網膜の細胞外空間に送達された、請求項1記載の方法。
  6. 治療薬が硝子体内注射によって網膜の細胞外空間に送達された、請求項1記載の方法。
  7. 電極に接触する眼の内部領域が硝子体液を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 電極が、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から10mm以内にある、請求項7記載の方法。
  9. 電極に接触する眼の内部領域が網膜を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  10. 電極に接触する眼の内部領域が網膜下腔を含む、請求項9記載の方法。
  11. 治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件が、10V/cm～1,500V/cmの該標的網膜細胞における電場強度を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 1～12パルスの電気エネルギーが伝達される、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 電気エネルギーのパルスの総数が1～20秒以内に伝達される、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 電気エネルギーのパルスが方形波形である、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. 電気エネルギーのパルスが5V～250Vの振幅を有する、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 電気エネルギーのパルスの各々が、10～200ミリ秒の持続時間である、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 標的網膜細胞が網膜上皮細胞である、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 標的網膜細胞が光受容体である、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  19. 治療薬が核酸ベクターである、請求項1～17のいずれか一項記載の方法。
  20. 核酸ベクターが非ウイルス核酸ベクターである、請求項19記載の方法。
  21. 非ウイルス核酸ベクターが環状DNAベクターである、請求項20記載の方法。
  22. 非ウイルス核酸ベクターが、健康な網膜細胞において内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする、請求項19～21のいずれか一項記載の方法。
  23. 治療用置換タンパク質が、個体の標的細胞において内因的に発現されないかまたは個体の標的細胞において非機能性であるタンパク質と置き換わる、請求項22記載の方法。
  24. 治療用置換タンパク質が、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる、請求項22または23記載の方法。
  25. 治療用置換タンパク質がMYO7Aである、請求項22～24のいずれか一項記載の方法。
  26. 個体におけるアッシャー症候群1B型を治療する方法である、請求項25記載の方法。
  27. 治療用置換タンパク質がBEST1である、請求項22または23記載の方法。
  28. BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーを治療する方法である、請求項27記載の方法。
  29. 治療用置換タンパク質がCFHである、請求項22または23記載の方法。
  30. 加齢黄斑変性を治療する方法である、請求項29記載の方法。
  31. 治療用置換タンパク質がABCA4である、請求項22または23記載の方法。
  32. ABCA4関連網膜ジストロフィを治療する方法である、請求項31記載の方法。
  33. ABCA4関連網膜ジストロフィがシュタルガルト病である、請求項32記載の方法。
  34. 個体の標的網膜細胞に治療薬を送達する方法であって、
    （a）電極を眼の内部領域に接触させる工程であって、眼の網膜内の細胞外空間が、上脈絡膜注射によって送達される治療薬を含む、工程;および
    （b）電極が眼の内部領域に接触している間に、治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する工程
    を含む、方法。
  35. 治療薬を網膜の細胞外空間に送達する工程をさらに含む、請求項34記載の方法。
  36. 治療薬の送達が上脈絡膜注射によるものである、請求項35記載の方法。
  37. 電極に接触する眼の内部領域が硝子体液を含む、請求項34～36のいずれか一項記載の方法。
  38. 電極が、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から10mm以内にある、請求項37記載の方法。
  39. 電極に接触する眼の内部領域が網膜を含む、請求項34～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 電極に接触する眼の内部領域が網膜下腔を含む、請求項39記載の方法。
  41. 治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件が、10V/cm～1,500V/cmの該標的網膜細胞における電場強度を含む、請求項34～40のいずれか一項記載の方法。
  42. 1～12パルスの電気エネルギーが伝達される、請求項34～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 電気エネルギーのパルスの総数が1～20秒以内に伝達される、請求項34～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 電気エネルギーのパルスが方形波形である、請求項34～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 電気エネルギーのパルスが5V～250Vの振幅を有する、請求項34～44のいずれか一項記載の方法。
  46. 電気エネルギーのパルスの各々が、10～200ミリ秒の持続時間である、請求項34～45のいずれか一項記載の方法。
  47. 標的網膜細胞が網膜上皮細胞である、請求項34～46のいずれか一項記載の方法。
  48. 標的網膜細胞が光受容体である、請求項34～47のいずれか一項記載の方法。
  49. 治療薬が核酸ベクターである、請求項34～48のいずれか一項記載の方法。
  50. 核酸ベクターが非ウイルス核酸ベクターである、請求項49記載の方法。
  51. 非ウイルス核酸ベクターが環状DNAベクターである、請求項50記載の方法。
  52. 非ウイルス核酸ベクターが、健康な網膜細胞において内因的に発現されるタンパク質と置き換わる治療用置換タンパク質をコードする、請求項49～51のいずれか一項記載の方法。
  53. 治療用置換タンパク質が、個体の標的細胞において内因的に発現されないかまたは個体の標的細胞において非機能性であるタンパク質と置き換わる、請求項52記載の方法。
  54. 治療用置換タンパク質が、4.5kbを超えるコード配列によってコードされる、請求項52または53記載の方法。
  55. 治療用置換タンパク質がMYO7Aである、請求項52～54のいずれか一項記載の方法。
  56. 個体におけるアッシャー症候群1B型を治療する方法である、請求項55記載の方法。
  57. 治療用置換タンパク質がBEST1である、請求項52または53記載の方法。
  58. BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーを治療する方法である、請求項57記載の方法。
  59. 治療用置換タンパク質がCFHである、請求項52または53記載の方法。
  60. 加齢黄斑変性を治療する方法である、請求項59記載の方法。
  61. 網膜ジストロフィを治療する方法であって、
    網膜ジストロフィを有する個体の眼に環状DNAベクターを上脈絡膜注射する工程を含み、
    該網膜ジストロフィが網膜タンパク質の発現の欠如を特徴とし、該環状DNAベクターが、網膜タンパク質と置き換わるための治療用置換タンパク質をコードする1つまたは複数の治療遺伝子を含む、
    方法。
  62. 環状DNAベクターが裸の環状DNAベクターである、請求項61記載の方法。
  63. 環状DNAベクターが細菌複製起点および/または薬物耐性遺伝子を欠く、請求項61または62記載の方法。
  64. 環状DNAベクターが組換え部位を欠く、請求項61～63のいずれか一項記載の方法。
  65. （a）電極を眼の内部領域に接触させる工程;および
    （b）電極が眼の内部領域に接触している間に、環状DNAベクターの標的網膜細胞への電気的導入に適した条件で、電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する工程
    をさらに含む、請求項61～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 電極に接触する眼の内部領域が硝子体液を含む、請求項65記載の方法。
  67. 電極が、1つまたは複数のパルスの電気エネルギーの伝達時に網膜から0.5mm～10mmにある、請求項66記載の方法。
  68. 電極に接触する眼の内部領域が網膜を含む、請求項65～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 電極に接触する眼の内部領域が網膜下腔を含む、請求項68記載の方法。
  70. 治療薬の標的網膜細胞への電気的導入に適した条件が、10V/cm～1,500V/cmの該標的網膜細胞における電場強度を含む、請求項65～69のいずれか一項記載の方法。
  71. 4～12パルスの電気エネルギーが伝達される、請求項65～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 電気エネルギーのパルスの総数が1～20秒以内に伝達される、請求項65～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 電気エネルギーのパルスが方形波形である、請求項65～72のいずれか一項記載の方法。
  74. 電気エネルギーのパルスが5V～250Vの振幅を有する、請求項65～73のいずれか一項記載の方法。
  75. 電気エネルギーのパルスの各々が、10～200ミリ秒の持続時間である、請求項65～74のいずれか一項記載の方法。
  76. 標的網膜細胞が網膜上皮細胞である、請求項65～75のいずれか一項記載の方法。
  77. 標的網膜細胞が光受容体である、請求項65～76のいずれか一項記載の方法。
  78. 1つまたは複数の治療遺伝子が4.5kbより大きい、請求項61～77のいずれか一項記載の方法。
  79. 治療用置換タンパク質がMYO7Aである、請求項61～78のいずれか一項記載の方法。
  80. 網膜ジストロフィがアッシャー症候群1B型である、請求項61～79のいずれか一項記載の方法。
  81. 治療用置換タンパク質がBEST1である、請求項61～80のいずれか一項記載の方法。
  82. 網膜ジストロフィが、BEST1優性突然変異またはBEST1劣性突然変異に関連するベストロフィノパチーである、請求項61～78または81のいずれか一項記載の方法。
  83. 治療用置換タンパク質がCFHである、請求項61～78のいずれか一項記載の方法。
  84. 網膜ジストロフィが加齢黄斑変性である、請求項61～78または83のいずれか一項記載の方法。
  85. （a）近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有する、シースと；
    （b）該シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体であって、該細長い導体が、予め形成された形状記憶材料を含み、かつ近位位置から遠位位置まで該シース内に引き込み可能であり、
    （i）近位位置では、該細長い導体の遠位部分が実質的に直線状であり、かつ
    （ii）遠位位置では、該細長い導体の遠位部分が該シースの遠位端を越えて延在しており、該細長い導体の遠位部分の形状記憶材料が半径方向に弛緩して、該シースの長手方向軸に対して予め形成された角度で配置された実質的に平坦な電極を形成する、
    細長い導体と
    を含む、装置。
  86. 予め形成された角度が実質的に直角である、請求項85記載の装置。
  87. 予め形成された角度が約70°または約110°である、請求項85または86記載の装置。
  88. 予め形成された角度が約45°～約135°である、請求項85記載の装置。
  89. （a）近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有する、シースと；
    （b）該シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体であって、該細長い導体が、予め形成された形状記憶材料を含み、かつ近位位置から遠位位置まで該シース内に引き込み可能であり、
    （i）近位位置では、該細長い導体の遠位部分が実質的に直線状であり、かつ
    （ii）遠位位置では、該細長い導体の遠位部分が該シースの遠位端を越えて延在しており、該細長い導体の遠位部分の形状記憶材料が半径方向に弛緩して、該シースの長手方向軸に対して垂直な実質的に平坦な電極を形成する、
    細長い導体と
    を含む、装置。
  90. （a）近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有する、シースと；
    （b）該シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体であって、該細長い導体が、予め形成された形状記憶材料を含み、かつ近位位置から遠位位置まで該シース内に引き込み可能であり、
    （i）近位位置では、該細長い導体の遠位部分が実質的に直線状であり、かつ
    （ii）遠位位置では、該細長い導体の遠位部分が該シースの遠位端を越えて延在しており、該細長い導体の遠位部分の形状記憶材料が半径方向に弛緩して、実質的に平坦な電極を該シースの長手方向軸に対して実質的に直角で形成する、
    細長い導体と
    を含む、装置。
  91. 実質的に直角が約70°または約110°である、請求項90記載の装置。
  92. 近位端と遠位端とを有するハンドルをさらに含み、シースが該ハンドルに接続されている、請求項85～91のいずれか一項記載の装置。
  93. シースの近位端がハンドルに接続されている、請求項92記載の装置。
  94. ハンドルの遠位部分が、該ハンドルの内面とその中の細長い導体との間に中空領域を含み、シースの近位端が該中空領域内に配置される、請求項90～93のいずれか一項記載の装置。
  95. シースの近位端が中空領域内に少なくとも1mm配置される、請求項94記載の装置。
  96. ハンドルが円筒形である、請求項92～95のいずれか一項記載の装置。
  97. ハンドルが、ハンドルの遠位端および/または近位端にキャップをさらに含む、請求項92～96のいずれか一項記載の装置。
  98. アクチュエータをさらに含む、請求項85～97のいずれか一項記載の装置。
  99. シースの近位端および/または細長い導体がアクチュエータに接続され、該アクチュエータが近位位置と遠位位置との間で該細長い導体を摺動させるように構成される、請求項98記載の装置。
  100. アクチュエータがスライダである、請求項99記載の装置。
  101. スライダが、近位端と遠位端とを有し、かつ細長い導体に取り付けられ、スライダが、該細長い導体をシースの長手方向軸に沿って遠位位置から近位位置に引き込むように構成される、請求項100記載の装置。
  102. スライダが近位位置と遠位位置とを含み、
    （i）該近位位置では、シースの近位端が、スライダの遠位端に、またはスライドの遠位端の近位に配置され、かつ
    （ii）該遠位位置では、シースの近位端が、スライダの近位端とスライダの遠位端との間に配置される、
    請求項101記載の装置。
  103. スライダが、遠位位置および/または近位位置に摺動すると停止するように構成される、請求項102記載の装置。
  104. スライダが遠位位置に配置され、細長い導体の遠位部分がシースの遠位端を越えて延在し、細長い導体の遠位部分の形状記憶材料が半径方向に弛緩して、シースの長手方向軸に対して予め形成された角度で実質的に平坦な電極を形成する、請求項102または103記載の装置。
  105. スライダが近位位置に配置され、細長い導体の遠位部分が実質的に直線状である、請求項102または103記載の装置。
  106. スライダが、ハンドルの外部に配置された制御部材を含む、請求項100～105のいずれか一項記載の装置。
  107. 制御部材とスライダとが一体である、請求項106記載の装置。
  108. 制御部材とスライダとが一体ではない、請求項106記載の装置。
  109. （a）近位端および遠位端を有するハンドルと；
    （b）該ハンドルに接続されている、近位端、遠位端、およびそれらの間の長手方向軸を有するシースと；
    （c）該シース内の近位部分と遠位部分とを有する細長い導体であって、該細長い導体が、予め形成された形状記憶材料を含み、かつ近位位置から遠位位置まで該シース内に引き込み可能であり、
    （i）近位位置では、該細長い導体の遠位部分が実質的に直線状であり、かつ
    （ii）遠位位置では、該細長い導体の遠位部分が該シースの遠位端を越えて延在しており、該細長い導体の遠位部分の形状記憶材料が半径方向に弛緩して、該シースの長手方向軸に対して予め形成された角度で配置された実質的に平坦な電極を形成する、
    細長い導体と；
    （d）近位端と遠位端とを有し、かつ該細長い導体に取り付けられた、スライダであって、該細長い導体を該シースの長手方向軸に沿って遠位位置から近位位置まで引き込むように構成された、スライダと
    を含む、装置。
  110. 予め形成された角度が約70°または約110°である、請求項109記載の装置。
  111. 予め形成された角度が約45°～約135°である、請求項110記載の装置。
  112. スライダに接続されたシースをさらに含み、細長い導体が該スライダに接続されたシース内にある、請求項85～111のいずれか一項記載の装置。
  113. スライダに接続されたシースが、ハンドルに接続されたシースと入れ子になっている、請求項112記載の装置。
  114. スライダに接続されたシースが細長い導体に接続されている、請求項109～113のいずれか一項記載の装置。
  115. シースの遠位端が針を含む、請求項85～114のいずれか一項記載の装置。
  116. 細長い導体の近位部分とシースとの間に絶縁体をさらに含む、請求項85～115のいずれか一項記載の装置。
  117. シースが導電性材料を含む、請求項85～116のいずれか一項記載の装置。
  118. シースが約0.01mm～約1mmの内径を有する、請求項85～117のいずれか一項記載の装置。
  119. シースが約0.2mm～約0.3mmの内径を有する、請求項118記載の装置。
  120. 細長い導体が、シースの内径の約50％～約99％の直径を有する、請求項118または119記載の装置。
  121. 細長い導体が約100μm～約200μmの直径を有する、請求項85～120のいずれか一項記載の装置。
  122. 細長い導体が約0.2mmの直径を有する、請求項85～121のいずれか一項記載の装置。
  123. 細長い導体が約150μmの直径を有する、請求項121記載の装置。
  124. 実質的に平坦な電極が、長手方向軸に対して垂直な1つまたは複数の寸法が2mm～15mmである、請求項85～123のいずれか一項記載の装置。
  125. 実質的に平坦な電極が、長手方向軸に対して垂直な両方の寸法が2～15mmである、請求項124記載の装置。
  126. 実質的に平坦な電極が、長手方向平面に関して実質的に対称である、請求項85～125のいずれか一項記載の装置。
  127. 実質的に平坦な電極が凸状である、請求項85～126のいずれか一項記載の装置。
  128. 細長い導体がワイヤであり、実質的に平坦な電極が該ワイヤの遠位部分を含む、請求項85～127のいずれか一項記載の装置。
  129. ワイヤの遠位部分が、長手方向平面上に予め形成された角度を含み、該予め形成された角度が、実質的に平坦な電極とワイヤの近位部分との間にある、請求項128記載の装置。
  130. 実質的に平坦な電極が螺旋である、請求項85～129のいずれか一項記載の装置。
  131. 螺旋が、長手方向軸を中心に1～5回転を含む、請求項130記載の装置。
  132. 螺旋が、長手方向軸を中心に3回転を含む、請求項131記載の装置。
  133. 実質的に平坦な電極が、予め形成された直角に対して1mm以下遠位または近位に延在している、請求項129～132のいずれか一項記載の装置。
  134. 実質的に平坦な電極が、予め形成された直角に対して1mm以下遠位に延在している、請求項133記載の装置。
  135. 実質的に平坦な電極の遠位に何も含まない、請求項85～134のいずれか一項記載の装置。
  136. 単極である、請求項85～135のいずれか一項記載の装置。
  137. 双極であり、実質的に平坦な電極と電気的に連通する補助電極をさらに含む、請求項85～136のいずれか一項記載の装置。
  138. 補助電極が、シースの一部であるか、またはシースに接続されている、請求項137記載の装置。
  139. 細長い導体の近位部分が、電圧源および/または波形コントローラに接続されている、請求項85～138のいずれか一項記載の装置。
  140. 請求項85～139のいずれか一項記載の装置を使用して患者の標的細胞に剤を送達する方法であって、
    （i）患者の外部組織表面からシースを挿入する工程;
    （ii）細長い導体を遠位位置に摺動させて、実質的に平坦な電極を形成する工程;
    （iii）該実質的に平坦な電極を、該実質的に平坦な電極から標的細胞を分離している組織界面と電気的に連通するように配置する工程;および
    （iv）剤の標的細胞への電気的導入に適した条件で、該実質的に平坦な電極を介して1つまたは複数のパルスの電気エネルギーを伝達する工程
    を含む、方法。
  141. シースが針を含み、工程（i）が、患者の外部組織表面から該針を挿入することを含む、請求項140記載の方法。
  142. 実質的に平坦な電極が組織界面から10mm以内にある、請求項140または141記載の方法。
  143. 実質的に平坦な電極が、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から0.5mm～5mmにある、請求項142記載の方法。
  144. 実質的に平坦な電極が、1つまたは複数のパルスの伝達時に組織界面から約1mmにある、請求項143記載の方法。
  145. 標的細胞が組織界面から5mm以内にある、請求項140～144のいずれか一項記載の方法。
  146. 標的細胞が組織界面から0.01mm～1mmにある、請求項145記載の方法。
  147. 剤の標的細胞への電気的導入に適した条件が、10V/cm～1,500V/cmの標的細胞における電場強度を含む、請求項140～146のいずれか一項記載の方法。
  148. 標的細胞における電場強度が50V/cm～300V/cmである、請求項147記載の方法。
  149. 標的細胞における電場強度が約100V/cmである、請求項148記載の方法。
  150. 4～12パルスの電気エネルギーが伝達される、請求項140～149のいずれか一項記載の方法。
  151. 電気エネルギーのパルスの総数が1～20秒以内に送達される、請求項150記載の方法。
  152. 電気エネルギーのパルスが方形波形である、請求項151記載の方法。
  153. 電気エネルギーのパルスが5V～250Vの振幅を有する、請求項140～152のいずれか一項記載の方法。
  154. 電気エネルギーのパルスが約250Vの振幅を有する、請求項153記載の方法。
  155. 剤の標的細胞への電気的導入に適した条件が、5V～100Vの該標的細胞における電圧を含む、請求項140～154のいずれか一項記載の方法。
  156. 剤の標的細胞への電気的導入に適した条件が、10V～80Vの該標的細胞における電圧を含む、請求項155記載の方法。
  157. 電気エネルギーのパルスが約40Vの振幅を有する、請求項155または156記載の方法。
  158. パルスの各々が10～200msである、請求項140～157のいずれか一項記載の方法。
  159. パルスの各々が約50msである、請求項158記載の方法。
  160. 剤が以前に組織に投与されたことがある、請求項140～159のいずれか一項記載の方法。
  161. 剤を投与する工程をさらに含む、請求項140～159のいずれか一項記載の方法。
  162. 剤が、1つまたは複数のパルスと同時にまたは連続的に投与される、請求項161記載の方法。
  163. 剤が核酸である、請求項140～162のいずれか一項記載の方法。
  164. 核酸が非ウイルス核酸である、請求項163記載の方法。
  165. 非ウイルス核酸がDNAまたはRNAである、請求項164記載の方法。
  166. 剤が治療薬である、請求項140～165のいずれか一項記載の方法。
  167. 標的細胞が網膜細胞である、請求項140～166のいずれか一項記載の方法。
  168. 網膜細胞が網膜色素上皮（RPE）細胞である、請求項167記載の方法。
  169. 網膜細胞が光受容細胞である、請求項167記載の方法。
  170. 網膜細胞が神経節細胞である、請求項167記載の方法。
  171. 治療薬が、硝子体内、網膜下、または局所投与される、請求項140～170のいずれか一項記載の方法。
  172. 治療薬が上脈絡膜投与される、請求項140～171のいずれか一項記載の方法。
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US6825012B2 (en) * 1995-02-23 2004-11-30 Gencell S.A. DNA molecules, preparation and use in gene therapy
US9163259B2 (en) * 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
EP2967714B1 (en) * 2013-03-14 2022-05-11 Baylis Medical Company Inc. Electrosurgical device having a lumen
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