JP2024511413A - 思春期前の非ヒト動物およびヒトにおいて思春期を阻止するか、または遅延させるための組成物および方法 - Google Patents

思春期前の非ヒト動物およびヒトにおいて思春期を阻止するか、または遅延させるための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、ミュラー管抑制因子(MIS)をコードする核酸を含むベクターを含む組成物を投与することによって思春期前非ヒト対象(例えば、子ネコおよび子イヌ)において妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止する組成物および方法に関する。一部の態様において、投与は単回注射または複数回注射によるものである。他の局面は、組換えヒトMISバリアントタンパク質を投与することによってヒト女性対象において思春期を遅延させるための方法および組成物に関する。TIFF2024511413000036.tif29170

Description

関連出願の相互参照
本願は、2021年3月22日に出願された米国仮出願第63/164,254号、および2021年6月4日に出願された米国仮出願第63/197,061号の優先権の恩典を主張する。これらの内容は、あらゆる目的に対して、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
配列表
本願は電子フォーマットで配列表と一緒に出願されている。配列表は、2022年3月4日に作成され、サイズが62Kbの2022-03-03_01133-0001-00PCT_Seq_List_ST25というタイトルのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
分野
本願は、思春期前の非ヒト対象(例えば、子ネコおよび子イヌ)ならびにヒト対象における妊孕性を低下させるための、および/または思春期を阻止するか、もしくは遅延させるための、MISタンパク質およびMISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを投与する組成物および方法に関する。
背景
ミュラー管抑制因子(MIS)は抗ミュラー管ホルモン(AMH)とも知られ、糖タンパク質の大トランスフォーミング増殖因子-β(TGFβ)多重遺伝子ファミリーの140kDaジスルフィド結合ホモ二量体糖タンパク質メンバーである。この遺伝子ファミリーの中にあるタンパク質は全て二量体前駆体として産生され、活性化のために翻訳後プロセシングを受け、そのため、生理活性のあるC末端断片を放出するために切断と解離を必要とする。同様に、MISの140キロダルトン(kDa)ジスルフィド結合ホモ二量体はタンパク分解によって切断されて、その活性のあるC末端断片を生じる。
MISは胎児精巣において産生される生殖ホルモンであり、雄における雌性二次性徴構造の発達を阻害する。性分化前の胎児には両能性があり、雄では発達の際に雌ミュラー管(すなわち、ファロピウス管、子宮、膣)よりも雄ヴォルフ管(すなわち、前立腺、精管)が選ばれるのことが部分的にMISによって制御される。
ヒトMIS遺伝子は19番染色体に位置し、その発現は性的に二形性である。男性でのMIS発現は妊娠9週目から胎児精巣で始まり、発現レベルが劇的に落ちる思春期まで高レベルで持続する。女性ではMISは顆粒膜細胞において出生後になってようやく成人男性と同様のレベルで思春前期から閉経まで産生され、閉経後に発現が止まる。男性胎児ではMISは、ファロピウス管、子宮、子宮頸部、および膣上3分の1の前駆体であるミュラー管の退化を引き起こす。
内因的にはMISは顆粒膜細胞によって産生され、原始卵胞を成長中のプールに動員させる重要なゲートキーパーである。雌ではMISはミュラー管の性分化後に卵巣の顆粒膜細胞によって発現される。MISの産生と成長中の卵胞の数との間には相関関係があり、卵巣周期全体を通してMISが絶え間なく分泌されるので、MISは卵巣予備能(卵胞の全プール)のサイズを推定するのに臨床で用いられる(Kalaiselvi et al., 2012)。雄ではMISが過剰発現するとライディッヒ細胞におけるステロイド産生が阻害され、それにより、テストステロンレベルが著しく低下する(Teixeira et al, 1999)。
ヒトMISタンパク質は原始卵胞発達の初期段階で卵胞形成を止めることが以前に発見された。妊孕性マウスモデルにおいてヒトMISタンパク質を性成熟している雌マウスに、例えば、遺伝子導入を介して投与すると、卵胞成熟と卵母細胞放出を阻止することができ、従って、排卵を阻害できることが以前に証明された。ヒトMISタンパク質を性成熟雌マウスに投与すると繁殖率が有意に低下することがさらに証明された(WO2015/089321)。
現在、ペットオーナーおよびシェルターはネコおよびイヌを含む動物を卵巣摘出または去勢することが推奨されている。若い動物を外科的に卵巣摘出または去勢することは動物を世話する責任あるやり方だと考えられている。雌では、これは、典型的に、一方もしくは両方の卵巣および/または子宮を除去する腹部手術を伴う。雄では、これは典型的に精巣の外科的除去を伴う。卵巣摘出および去勢は、救助施設における望まれない動物の過密につながる望まれない同腹仔の出産を防ぐために推奨されている(一部の国では、譲渡される動物に必要とされる)。ASPCA(American Society for the Prevention of Cruelty to Animals(登録商標))は、米国では飼い主のないペットの問題で毎年、何百万匹もの健常なイヌおよびネコが安楽死させられる原因になっていることを示している。さらに、ACPCAはまた、ある特定の感染症または腫瘍(例えば、雌では子宮感染症および乳房腫瘍、雄では精巣癌および前立腺問題)を予防すること、雌のペットを発情させないこと、雄のペットが歩き回る可能性を小さくすること、より良い、しつけられた雄となる可能性があることを含めて動物の卵巣摘出および去勢に医学的および行動学的な利益があることも示している。卵巣摘出および去勢は一般的な外科手術であるが、例えば、全身麻酔を伴い、リスクがある場合がある。さらに、外科手術後に動物が治癒するのに時間がかかる。従って、入浴は、例えば、外科手術後少なくとも10日間、避けなければならない。外科手術後、動物は走ることも飛び上がることも控えなければならない。感染症の回避と適切な治癒のために切開部位をモニタリングしなければならない。
引き取りには成体ネコや成体イヌよりも子ネコや子イヌの方が望まれる。動物シェルターは、現在、引き取りの前には子ネコや子イヌを8週齢と早い段階で外科的に卵巣摘出または去勢する。勧告では、雌の子ネコを約5月齢に達する前に、雌の子イヌを約6月齢に達する前に外科的に卵巣摘出しなければならないことが示唆されている。従って、子ネコおよび子イヌを含む思春期前動物において妊孕性を低下させること、および/または思春期を阻止することが必要とされており、卵巣摘出または去勢に代わるものとして長期不妊を実現する簡単な方法が役立つ可能性がある。
本発明に従って、本明細書において開示される技術の一局面は、ミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む組成物に関し、思春期前対象(例えば、子ネコもしくは子イヌ、またはヒト対象)において妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止するか、もしくは遅延させる方法であって、有効量の組成物を対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
従って、本発明の一局面は、MISタンパク質を、例えば、遺伝子導入を介して投与することで、子ネコおよび子イヌを含む思春期前動物において妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止する方法を提供する。思春期前に子ネコおよび子イヌを含む思春期前動物にMISが投与されたら、たった一回の処置で思春期前動物が思春期に入るのが阻止されるか、または思春期前動物の妊孕性が低下する可能性がある。子ネコおよび子イヌを含む思春期前動物において長期不妊は外科的な卵巣摘出または去勢の代わりとなり得る。従って、本発明の一局面は、子ネコおよび子イヌなどの思春期前非ヒト対象において妊孕性を低下させるための、および/または思春期を阻止するための、(例えば、MISタンパク質をコードするウイルスベクターによって)MISタンパク質を投与する組成物および方法に関する。
本明細書に記載の技術の別の局面は、思春期前非ヒト対象において妊孕性を低下させる方法であって、本明細書において開示される組換えネコもしくはイヌMISタンパク質、または1つもしくは複数の調節エレメントに機能的に連結された、組換えネコもしくはイヌMISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む有効量の組成物を対象に投与する工程を含む、方法に関する。
本明細書に記載の技術の別の局面は、思春期前非ヒト対象において思春期を阻止する方法であって、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む有効量の組成物を対象に投与する工程を含む、方法に関する。
本明細書に記載の技術の別の局面は、思春期前ヒト対象、例えば、女性ヒト対象において思春期を遅延させる方法であって、本明細書において開示される組換えヒトMIS(rhMIS)タンパク質を含む有効量の組成物を対象に投与する工程を含む、方法に関する。一部の態様において、前記方法は、思春期前ヒト対象において思春期を可逆的に遅延させる。一部の態様において、組換えヒトMISタンパク質は少なくともQからRまたはRの保存的アミノ酸へのSEQ ID NO:4のアミノ酸450の変化(Q450R)を含む、ヒトMISタンパク質に由来するプレタンパク質から生成された成熟タンパク質である。一部の態様において、Rの保存的アミノ酸はKである。ヒト女性対象において思春期を遅延させるための、このような方法は、例えば、対象が、思春期を遅延させる必要がある時に、例えば、性別の再適正化の処置および/もしくは手術を始める前に、または女性対象が女性から男性に性別を転換する処置を始める前に、より多くの時間を対象に提供するために思春期を遅延させる必要がある時に有用である。一部の態様において、例えば、対象が、骨成長の低下に関連する疾患または障害を有する場合、および思春期によって骨の成長が止まる場合に、ヒト女性対象において思春期を遅延させるための方法は有用である。一部の態様において、例えば、対象が特発性思春期早発症を有する場合に、ヒト女性対象において思春期を遅延させるための方法は有用である。一部の態様において、例えば、対象が性発達差を有する場合に、ヒト女性対象において思春期を遅延させるための方法は有用であり、思春期の変化である第二次性徴に先だって、またはその前に性を肯定する処置を対象に投与できるようにするために、改変されたhMISタンパク質を投与することによって思春期を遅延させることは有用である。
一部の態様において、本開示はまた、改変されたネコMISタンパク質を含む組成物であって、改変されたネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むキメラネコMISタンパク質、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸22～575配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有する組換えネコMISタンパク質である、組成物も提供する。
一部の態様において、本開示はまた、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むキメラネコMISタンパク質をコードする核酸を含む組成物であって、核酸が、SEQ ID NO:6の核酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、組成物も提供する。
一部の態様において、本開示はまた、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む改変されたイヌMISタンパク質(clMIS)をコードする核酸を含む組成物であって、核酸が、SEQ ID NO:16の核酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、組成物も提供する。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は子ネコまたは子イヌである。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は雌である。一部の態様において、思春期前非ヒト対象は雄である。
一部の態様において、MISタンパク質は、
a)野生型ネコMISタンパク質、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列;
b)野生型イヌMISタンパク質、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列;あるいは
c)野生型ヒトMISタンパク質、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下の子ネコである。一部の態様において、思春期前非ヒト対象は、体重が2kg以下の子ネコである。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は、24月齢以下、22月齢以下、20月齢以下、18月齢以下、16月齢以下、14月齢以下、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下の子イヌである。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は離乳されている。一部の態様において、思春期前非ヒト対象は離乳されていない。
一部の態様において、前記ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、またはファージミドである。一部の態様において、前記ベクターはウイルスベクターである。一部の態様において、前記組成物は、前記ベクターを含む細胞をさらに含む。
一部の態様において、前記組成物は滅菌注射溶液を含む。一部の態様において、前記組成物は滅菌注射水溶液を含む。一部の態様において、前記組成物は、脂質、脂質エマルジョン、リポソーム、ナノ粒子、またはエキソソームを含む。
一部の態様において、前記ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ポックスウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。一部の態様において、前記ベクターはAAVベクターである。一部の態様において、前記ベクターはAAV9ベクターである。
一部の態様において、1つまたは複数の調節エレメントはプロモーターエレメントを含む。一部の態様において、1つまたは複数の調節エレメントはプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含む。一部の態様において、1つまたは複数の調節エレメントは構成的活性プロモーターを含む。
一部の態様において、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
一部の態様において、投与は注射を介するものである。一部の態様において、投与は静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与を介するものである。一部の態様において、投与は筋肉内投与を介するものである。一部の態様において、投与は単回注射を介するものである。一部の態様において、投与は1回限りの単回注射を介するものである。一部の態様において、投与は、複数回の注射に分割された単一用量を介するものである。一部の態様において、投与は、2回の注射に分割された単一用量を介するものである。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象に投与される組成物の有効量は、対象の体重1キログラムあたり1×1013ベクターゲノム以下、5×1012ベクターゲノム以下、1×1012ベクターゲノム以下、5×1011ベクターゲノム以下、または1×1011ベクターゲノム以下である。
一部の態様において、組成物の投与後、6ヶ月もしくは6ヶ月後、9ヶ月もしくは9ヶ月後、12ヶ月もしくは12ヶ月後、15ヶ月もしくは15ヶ月後、または24ヶ月もしくは24ヶ月後の思春期前非ヒト対象の血清中のMISタンパク質の濃度は、250ng/ml超、300ng/ml超、400ng/ml超、500ng/ml超、600ng/ml超、700ng/ml超、800ng/ml超、900ng/ml超、1μg/ml超、1.5μg/ml超、2μg/ml超、3μg/ml超、4μg/ml超、5μg/ml超、6μg/ml超、7μg/ml超、8μg/ml超、9μg/ml超、10μg/ml超、または11μg/ml超である。一部の態様において、MISタンパク質濃度はELISAによって決定される。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は雌であり、組成物の投与後に、(a)卵胞を発達させない、(b)成長可能な卵がある卵胞を発達させない、(c)思春期を経験しない、(d)発情期の徴候を示さない、および/または(e)不妊である。
一部の態様において、思春期前非ヒト対象は雄であり、組成物の投与後に、(a)思春期を経験しない、および/または(b)不妊である。
本開示はまた、ネコまたはイヌのミュラー管抑制因子(fcMISまたはclMIS)をコードする核酸を含むベクターも提供する。一部の態様において、前記ベクターは、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、ネコミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸であって、(a)ネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する野生型ネコMISタンパク質を含むか、あるいは(b)ネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するキメラネコMISタンパク質を含む、核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターの核酸は、SEQ ID NO:1の22～588またはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むネコMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:1の位置478またはSEQ ID NO:18の位置479にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている。一部の態様において、前記ベクターの核酸は、SEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むネコMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:3の位置465にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸、例えば、K(リジン)に変えられている。一部の態様において、Rの保存的アミノ酸はKである。
一部の態様において、前記ベクターは、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、イヌミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含み、イヌMISタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:2のアミノ酸22～588に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する野生型イヌMISタンパク質を含む。一部の態様において、前記ベクターの核酸は、SEQ ID NO:2のアミノ酸23～543に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むイヌMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:2の位置462にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている。一部の態様において、Rの保存的アミノ酸はKである。
一部の態様において、改変されたネコミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質は、(a)SEQ ID NO:1のアミノ酸1～21もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列を含み、SEQ ID NO:1のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ネコMISタンパク質、または(b)SEQ ID NO:3のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列を含み、かつSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、キメラネコMISタンパク質、または(c)SEQ ID NO:14もしくはSEQ ID NO:20のアミノ酸と、SEQ ID NO:14のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:20のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、改変されたネコMISタンパク質(LR-fcMIS)より選択されるネコMISプロタンパク質から生成される。一部の態様において、ネコMISタンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸22～588またはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:1の位置478またはSEQ ID NO:18の位置479にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている。一部の態様において、キメラネコMISタンパク質は、SEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:3の位置465にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸、例えば、K(リジン)に変えられている。一部の態様において、改変されたネコMISタンパク質の非リーダー配列は、SEQ ID NO:9～13のいずれかより選択される。
一部の態様において、改変されたイヌミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質はイヌMISプロタンパク質から生成され、イヌMISプロタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列と、SEQ ID NO:2のアミノ酸22～588に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む。一部の態様において、イヌMISは、SEQ ID NO:2のアミノ酸23～543に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:2の位置462にあるアミノ酸残基Qは、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている。一部の態様において、Rの保存的アミノ酸はKである。
本開示はまた、本明細書において開示される任意の改変されたネコMISタンパク質または本明細書において開示される任意の改変されたイヌMISタンパク質を含む薬学的組成物も提供する。
本開示はまた、思春期前ヒト女性対象において思春期を可逆的に遅延させる方法であって、組換えヒトミュラー管抑制因子(rhMIS)タンパク質を含む有効量の組成物を対象に投与する工程を含み、組換えヒトMISタンパク質が、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基25～560、またはSEQ ID NO:4に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基450が、QからRまたはRの保存的アミノ酸に変えられている、方法も提供する。一部の態様において、rhMISタンパク質は、SEQ ID NO:4のアミノ酸1～24の代わりに非MISリーダー配列と、SEQ ID NO:4のアミノ酸25～560に対して少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含むrhMISプロタンパク質から生成され、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基450は、QからRまたはRの保存的アミノ酸に変えられている。一部の態様において、Rの保存的アミノ酸はKである。一部の態様において、rhMISタンパク質は、SEQ ID NO:7の少なくとも19～554のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはSEQ ID NO:7に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含む。一部の態様において、rhMISタンパク質は、SEQ ID NO:7の少なくとも19～554のアミノ酸配列を有するタンパク質、または SEQ ID NO:7に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質と、SEQ ID NO:9～13のいずれかより選択される非MISリーダー配列、またはSEQ ID NO:9～13のいずれかに対して少なくとも85％の配列同一性を有する非リーダー配列とを含む。一部の態様において、組換えヒトMISタンパク質は、WO2015089321に開示される核酸によって製造または産生される。
一部の態様において、思春期前ヒト女性対象は、思春期を遅延させることを必要とする。一部の態様において、思春期を遅延させることを必要とする思春期前ヒト女性対象は、性別違和、間性、出生時の非定型生殖器(atypical genitalia at birth)、出生時の雄性生殖器と雌性生殖器(both male and female genitalia at birth)、モザイク遺伝学(mosaic genetics)、クラインフェルター症候群、中枢性思春期早発症(CPP)もしくは末梢性思春期早発症または先天性副腎過形成(CAH)より選択される1つまたは複数の状態を有する。
本開示はまた、fcMISまたはclMISを発現するウイルスベクターが投与された非ヒト対象において、抗fcMIS抗体または抗clMIS抗体を検出する方法であって、(a)fcMISまたはclMISをコードするウイルスベクターが投与された非ヒト対象から試料を入手する工程であって、任意で、fcMISまたはclMISが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む、工程;(b)任意で、組換えfcMISまたはclMISを単離する工程であって、任意で、組換えfcMISまたはclMISがFLAGタグを含む、工程;(c)fcMISまたはclMISを支持体に添加する工程であって、任意で、支持体がELISAプレートである、工程;(d)試験試料を支持体に添加する工程;(e)支持体を、検出可能な抗体とインキュベートする工程であって、任意で、検出可能な抗体がヤギ抗IgG HRPである、工程;および(f)酵素基質反応を実施する工程であって、任意で、酵素基質がHRPである、工程を含む、方法も提供する。一部の態様において、試験試料は支持体に添加される前にブロッキング緩衝液で希釈される。一部の態様において、前記方法は、試験試料を支持体に添加する工程の前に、支持体をウシ血清アルブミンとインキュベートする工程をさらに含む。一部の態様において、前記方法は、過剰なMISまたは過剰な検出可能な抗体を除去するために1つまたは複数の洗浄工程をさらに含む。
特定の配列の説明
表1は、本明細書において参照される特定の配列のリストを示す。
(表１)特定の配列の説明
Figure 2024511413000002
Figure 2024511413000003
Figure 2024511413000004
Figure 2024511413000005
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図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1Aは、イエネコゲノムリリース8.0からのネコMISタンパク質(fcMISv1; SEQ ID NO:3 位置361-467)およびバージョン9.0からのネコMISタンパク質(fcMISv2; SEQ ID NO:1、位置361-480)の分岐セクションの配列アラインメントを示す。 図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1Bは、インビトロプラスミン切断を伴う、または伴わない、Flag親和性精製Flag-fcMISv1およびFlag-fcMISv2タンパク質(2μg)のコロイダルブルー染色タンパク質ゲル電気泳動を示す。組換えヒトLR-hsMISおよびマウスFlag-mmMIS(切断および非切断)を対照として提供した。 図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1Cは、5e12vg/kgのAAV9-fcMISv1または5e12vp/kgのAAV9-空の負の対照、および正の対照である組換えLR-hsMIS(100ng)で処置したマウスからの組織溶解産物の代表的なウエスタンブロットを示す。ブロットを、MISのC末端、またはローディング対照としてB-アクチンおよびGAPDHに対する抗体でプローブした。 図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1Dは、5μg/mL(非トランスフェクトCHOコンディションドメディウム負の対照)のCHOネコMISタンパク質に調整した、精製Flag-fcMISv1(非切断もしくは切断)タンパク質、またはfcMISv1を含有するCHO細胞クローンコンディションドメディウムとインキュベートした後にH&E染色した代表的な胎児ラット泌尿生殖隆線切片を示す。MIS活性を、ミュラー管退化の程度を表すグレード0～5にスコア付けした。(F=ヴォルフ管;M=ミュラー管)。 図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1Eは、処置後50日目の、AAV9-fcMISv1(5e12vg/kg)または対照AAV9-空(5e12vp/kg)で処置したマウスの子宮角および卵巣の代表的な肉眼形態を示す。 図1A～1Hは、インビトロ、マウス、およびネコにおけるfcMISv1ネコトランスジーンを用いたパイロット研究を示す。図1F～1Hは、5e12vg/kg fcMISv1で処置した後の3匹のネコにおける血清MISおよび抗fcMISv1抗体価を示す。 図1Fの説明を参照のこと。 図1Fの説明を参照のこと。 図2は、fcMISv1で処置したネコの子宮および卵巣の組織学的分析を示す。AAV9-fcMISv1で処置して3年後に、3匹の雌ネコを卵巣摘出し、子宮および卵巣の組織学を調べた。対象11WBL24はfcMISv1トランスジーンに対して急速かつ強力な免疫を発症し、卵巣には複数の黄体があり、原始卵胞がほとんどなく、子宮には嚢胞状子宮内膜増殖症があることに留意のこと。対照的に、MISレベルをμg/ml範囲で維持した対象11WBL25には卵巣に豊富な原始卵胞集団があり、正常な黄体と正常な子宮内膜がある。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Aはコドン最適化ネコMISトランスジーンの設計を示す。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Bは、ヒト、マウス、およびネコのトランスジーンを過剰発現する安定したCHOクローンに由来するコンディションドメディウムと、Flag親和性によって精製され、プラスミンによってインビトロで切断された、または切断されなかったMISタンパク質(100ng)のウエスタンブロットを示す。ブロットをMISのC末端に対する抗体でプローブした。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Cは、5μg/mlのヒトMISタンパク質またはネコMISタンパク質に調整した、精製タンパク質またはコンディションドメディウムとインキュベートした後にH&E染色した代表的な胎児ラット泌尿生殖隆線切片を示す。MIS活性を、ミュラー管退化の程度を表すグレード0～5にスコア付けした。(F=ヴォルフ管、M=ミュラー管)。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Dは、5e12vg/kgのAAV9-fcMISv2または5e12vp/kgのAAV9-空の負の対照、および正の対照である組換えLR-hsMIS(100ng)で処置したマウスからの組織溶解産物の代表的なウエスタンブロットを示す。ブロットを、MISのC末端、またはローディング対照としてB-アクチンおよびGAPDHに対する抗体でプローブした。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Eは、5e12vg/kgまたは1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2で処置した後のマウスにおけるELISAによって測定したMISの血清濃度を示す。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3Fは、5e12vg/kgもしくは1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2または5e12vp/kgのAAV9-空の負の対照で処置して4週間後の卵巣の代表的な中央切片を示す。 図3A～3Gは、ネコMIS AAV9ベクターのクローニングおよびマウスにおける検証を示す。図3G：卵巣全体にある、それぞれの卵胞総数(N=5/群)。 図4は、実施例1.D.に記載のように、AAV9-キメラネコMIS(5e12ベクター粒子(vp)/kg)で処置したパイロット研究1からの成熟ネコ、および低(5e12vp/kg)または高(1e13vp/kg)用量のAAV9-wtネコMISを注射した後のパイロット研究2からのネコにおける平均血清MIS濃度(μg/ml)を示す。 図5A～5Cは、実施例1.D.に記載のように、低用量のAAV9-wtネコMIS(5e12vp/kg、n=3)(図5A)、高用量のAAV9-wtネコMIS(1e13vp/kg、n=3)(図5B)、または対照である空のベクター粒子(5e12vp/kg、n=3)(図5C)で注射した後のパイロット研究2からのそれぞれの成熟ネコにおける血清MIS濃度(μg/ml)(四角)および循環抗MIS抗体濃度(丸)の個々のプロファイルを示す。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図6A～6GはイエネコにおけるAAV9-fcMISv2の評価を示す。図6Aは、性成熟雌イエネコを、5e12vg/kg(低MIS)もしくは1e13vg/kg(高MIS)のAAV9-fcMISv2または5e12vp/kgのAAV9-空のベクター(対照)で筋肉内処置したことを示す。処置後1年および2年のマークで終わる2回の交尾研究の間に妊孕性を評価した。AAV9-fcMISv2処置後のネコにおいて、MIS(図6B)、黄体ホルモン(LH;図6Cおよび6E)、ならびにインヒビンB(図6Dおよび6E)の血清濃度をELISAによって測定した。図6Fは、処置前および処置後期間の全体を通してネコから採取した乾燥糞便ペレット中のエストラジオール(E2)およびプロゲステロン(P4)の濃度を示す。図6Gは、処置前および処置後期間における糞便ステロイドプロファイルに基づいた発情期および黄体期の頻度の評価を示す。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図7A～7Gは、AAV9-fcMISv2または空のベクター対照で処置したイエネコにおけるウイルスベクター排出評価ならびに個々の血清fcMISv2および抗薬物抗体プロファイルを示す。図7A～7Dは、処置後の血液(図7A)、大便(図7B)、尿(図7C)、および口腔スワブ(図7D)試料におけるqPCRによるウイルスゲノム定量を示す。図7E～7Gは、AAV9-fcMISv2処置(図7E～7F)または空のベクター対照処置(図7G)の後の個々のネコにおける血清MISおよび抗fcMISv2抗体価を示す。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図7Aの説明を参照のこと。 図8A～8Iは、AAV9-fcMISv2で処置したネコにおける性ステロイドおよび周期性評価を示す。E2およびP4の濃度は、処置前(左パネル)期間および処置後(右パネル)期間の全体を通してネコから採取した乾燥糞便ペレット中のものであった。ベースライン上にあるピークステロイド濃度を用いて発情期および黄体期を評価した。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図8A-1の説明を参照のこと。 図9A～9Dは、交尾研究中の繁殖行動、ならびに交尾中の、および対照子ネコにおけるMISレベルの評価を示す。図9A～9Bは、雄ブリーダーに引き合わせた、対照およびAAV9-fcMISv2雌ネコを示す。行動をビデオキャプチャによって記録し、繁殖試行の成功および失敗について評価した。 図9Aの説明を参照のこと。 図9A～9Dは、交尾研究中の繁殖行動、ならびに交尾中の、および対照子ネコにおけるMISレベルの評価を示す。図9Cは交尾時のMISレベルを示す。 図9A～9Dは、交尾研究中の繁殖行動、ならびに交尾中の、および対照子ネコにおけるMISレベルの評価を示す。図9Dは、対照雌に産まれた子ネコのMISレベルを示す。 図10は、CHO細胞におけるネコベクターおよびイヌベクターの一過的トランスフェクションのウエスタンブロットを示す。 図11は、COS7細胞におけるネコベクターおよびイヌベクターの一過的トランスフェクションのウエスタンブロットを示す。 図12は、COS7細胞におけるネコベクターおよびイヌベクターの一過的トランスフェクションのqPCRを示す。 図13A～13Bは、CHOクローンからの濃縮培地(図13A)および泌尿生殖隆線退化バイオアッセイ(図13B)を示す。 図14は、AAV9-fcMISv2で処置して30日後のマウスにおける卵胞総数とベクターの用量反応を示す。 図15A～15Dは、1e13vg/kgのAAV9-空、AAV9-fcMISv2、またはAAV9-LRclMISで処置して30日後のマウスにおける一次卵胞(図15A)、二次卵胞(図15B)、胞状卵胞(図15C)、および黄体(図15D)の数を示す。 図16は、1e13vg/kgで処置した後、4週間のELISA(ANSH)による循環misタンパク質の評価を示す。 図17A～17Bは、5e12vg/kgで処置して30日後のマウスの筋肉(図17A)および肝臓(図17B)におけるウイルスゲノムのqPCR定量を示す。 図18は、1e13vg/kgで処置して30日後の肝臓溶解産物におけるウエスタンブロットによるMISタンパク質切断の評価を示す。 図19は、fcMISv2(SEQ ID NO:1)を送達する、5e12vg/kgのAAV.MYOおよびAAV9-HRベクターで処置した後のELISAによるMISタンパク質発現の評価を示す。 図20は子ネコのMISおよびインヒビンBプロファイルを示す。 図20-1の説明を参照のこと。 図21A～21Bは、雌子ネコ(図21A)および雄子ネコ(図21B)における正規化されたインヒビンBを示す。 図22は、正の対照である対象11WBL24と比較した、子ネコにおける抗MIS中和抗体プロファイルを示す。 図23A～23Cは、対象M200586、M200667、およびM200756における23の糞便ステロイドプロファイルを示す。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図24～24Bは、経腹壁超音波によって行った子宮角測定値を示す。測定は、5e12vg/kg AAV9-fcMISv2(低)、1e13vg/kg AAV9-fcMISv2(高)、または5e12vp/kgのAAV9-空のベクター(対照)で処置したネコに対して行った。図24Aは全ての処置ネコの測定値を示す。図24Bにおいて「処置」は「低」用量および「高」用量で処置したネコの平均データ点を表す。 図25A～25Bは、処置して6～10ヶ月後に経腹壁超音波によって行った子宮角測定値を示す。示した測定値はネコの年齢に対して補正された。測定は、5e12vg/kg AAV9-fcMISv2(低)、1e13vg/kg AAV9-fcMISv2(高)、または5e12vp/kgのAAV9-空のベクター(対照)で処置したネコに対して行った。図25Aは全ての処置ネコの測定を示す。図25Bにおいて「処置」は「低」用量および「高」用量で処置したネコの平均データ点を表す。
詳細な説明
本発明は、思春期前非ヒト対象、例えば、子ネコおよび子イヌにおいて妊孕性を低下させるための、および/または思春期を阻止するための、および/または生殖を阻止するための、ミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を投与する(例えば、MISタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターを投与する)組成物および方法に関する。
本明細書において詳細に説明されるように、妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止することを目的とした遺伝子送達によるMIS投与が、現在、雄および雌の子ネコおよび子イヌを含む思春期前非ヒト対象において臨床開発されている。
A.非ヒト対象、例えば、子ネコおよび子イヌの妊孕性の長期低下および/または思春期の阻止のための薬剤としてのMIS
本明細書において議論されるように、本発明の一局面は、妊孕性の長期低下および/または思春期の阻止の方法として、例えば、外科的な卵巣摘出または去勢に代わるものとして、MISタンパク質をコードする核酸を(すなわち、遺伝子導入によって)思春期前非ヒト対象(例えば、子ネコまたは子イヌ)に投与することに関する。従って、MISタンパク質を発現するベクター(例えば、ウイルスベクター)の単回注射が、思春期前子ネコおよび子イヌにおける外科的な卵巣摘出または去勢の安全かつ有効な代替案になる可能性がある。本明細書において開示される方法は、子ネコおよび子イヌにおいて妊孕性を低下させるのに、ならびに/または子ネコおよび子イヌが思春期に達しないように阻止するのに使用することができる。
本明細書において使用する「思春期前の」とは、思春期に達しておらず、性的に未熟だとみなされる対象を指す。
一部の態様において、処置に適用できる対象には、任意の非ヒト思春期前対象、例えば、外科的な卵巣摘出または去勢を受けるであろう思春期前対象が含まれる。外科的な卵巣摘出または去勢は、例えば、子ネコ、ネコ、子イヌ、およびイヌにおいて一般的である。一部の態様において、思春期前対象は、子ネコもしくは子イヌまたは思春期を経ていない任意の動物である。一部の態様において、対象には、MISタンパク質をコードする核酸を単一用量として(例えば、ウイルスベクターによって)投与することができる。一部の態様において、前記用量は単回注射として投与されてもよく、複数回の注射に分割されてもよい。
一部の態様において、思春期前対象は子ネコである。他の態様において、思春期前対象は子イヌである。
一部の態様において、思春期前子ネコは雌子ネコである。一部の態様において、思春期前子ネコは雄子ネコである。一部の態様において、思春期前子ネコは、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下である。一部の態様において、思春期前子ネコの体重は2kg以下である。
一部の態様において、思春期前子イヌは雌子イヌである。一部の態様において、思春期前子イヌは雄子イヌである。一部の態様において、思春期前子イヌは、24月齢以下、22月齢以下、20月齢以下、18月齢以下、16月齢以下、14月齢以下、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下である。
B.精子数および/または精子濃度を増加させるための薬剤としてのMIS
本開示の一局面は、精子数および/または精子濃度を増加させる方法として、MISタンパク質またはMISタンパク質をコードする核酸を(すなわち、遺伝子導入によって)非ヒト雄対象(例えば、絶滅の危機に瀕している動物または稀少動物)に投与することに関する。一部のシナリオでは、将来の人工授精のための精子試料の採取および保管を助けるために、対象において精子数および/または精子濃度を増加させることが有益な場合がある。従って、MISタンパク質を発現するベクター(例えば、ウイルスベクター)の単回注射が、非ヒト雄対象において精子数および/または精子濃度を増加させるための安全かつ有効な方法になる場合がある。本明細書において開示される方法は、非ヒト雄対象において妊孕性を増加させるのに使用することができる。
一部の態様において、非ヒト雄対象は成体であるか、または性成熟している。非ヒト雄対象の成体または生殖成熟の決定に関する方法は当業者に公知である。これらの方法の例には、(1)性ホルモン(例えば、テストステロン、プロゲステロン、およびエストロゲン)の測定、ならびに(2)生殖成熟(すなわち、思春期)の形態学的徴候、例えば、陰茎および精巣の拡大、陰茎棘(penile spine)の存在、ならびに生殖器の他の形態学的変化の分析が含まれる。
C.ヒト対象において思春期を遅延させる薬剤としてのMISタンパク質
一部の態様において、対象は、思春期前ヒト対象、例えば、女性の思春期前ヒト対象であり、前記方法は、本明細書において開示される組換えヒトMISタンパク質を含む有効量の組成物を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、対象は、思春期を遅延させる必要があるヒト女性対象、例えば、性別の再適正化の処置および/もしくは手術を始める前に、または女性対象が女性から男性に性別を転換する処置を始める前により多くの時間を対象に提供するために、あるいは対象の性自認を完全に理解するためにより多くの時間を対象に与えるために思春期を遅延させる必要があるヒト女性対象である。単に説明として、「ヒト女性対象」という用語は、典型的には、出生時に女性の生物学的性だとされた対象を指す(例えば、XX染色体および/もしくは女性生殖器の外見を有するか、あるいは女性生物学的性の外見、または女性の外部および/もしくは内部の生殖解剖学的構造の存在を有する)。一部の態様において、本明細書において言及される「ヒト女性対象」はまた、出生時に間性と指定された対象、または出生時に非定型生殖器を有するか、もしくは男性生殖器と女性生殖器を両方とも有するか、または内部の(だが外部ではない)女性の生殖解剖学的構造しか有さないか、または外部の(だが内部ではない)女性の生殖解剖学的構造しか有さないか、またはモザイク遺伝学(XYと標識された染色体もあれば、XXと標識された染色体もある)、またはクラインフェルター症候群(個体がXXY染色体を有する)を有する対象も含んでよく、この場合、対象はノンバイナリージェンダーと呼ばれるか、または指定される。単に説明として、前記方法は、思春期を遅延させるために、本明細書において開示される組換えヒトMISタンパク質を含む有効量の組成物をヒト対象に投与する工程を含み、思春期の遅延は、ヒトMISが対象に投与される期間にわたる。一部の態様において、思春期は、約6ヶ月間、または約8ヶ月間、または約12ヶ月間、または約18ヶ月間、または約2年間、または約3年間、または約4年間、または約5年間、または5年より長く遅延される。一部の態様において、ヒト対象の思春期は阻止されない、もっと正確に言えば、ある期間にわたって可逆的に遅延され、対象に組換えヒトMISタンパク質が投与されるのを止めたら、思春期はヒト対象において進行するか、またはある時点で再開する。一部の態様において、対象が性別の再適正化を受けるのであれば、組換えヒトMISタンパク質による処置と処置の停止後に、再割り当てされた性別の思春期が再開する。
一部の態様において、ヒト女性対象は特発性思春期早発症を有し、思春期早発症は、子供の体が成人の体にあまりにも早く変化し始める病気である。思春期早発症では、通常、思春期(生殖能力の発達を含む、急速な身体的変化および生理的老化が起こる人生の時期)に起こる身体特徴の発達が早期に起こる。思春期は、通常、男児では13～15歳の間に起こり、女児では9～16歳の間に起こる。一部の態様において、ヒト女性対象は早発思春期、または中枢性思春期早発症(CPP)もしくは末梢性思春期早発症を有し、これは、女児の場合は思春期が8歳またはそれより以前に始まる病気である。思春期早発症の徴候および症状には、女児では7歳より前の、男児では9歳より前の以下:乳房の成長、女児では第一期(月経開始)、外生殖器の成熟、陰毛または脇の下の毛、急成長、ざ瘡、および成人の体臭の少なくとも1つまたは複数の発達が含まれる。一部の態様において、ヒト女性対象は出生時に非定型生殖器を有し、男性生殖器と女性生殖器を両方とも有する。CPPは、以下:脳もしくは脊髄(中枢神経系)の腫瘍、出生時に存在する脳の欠陥、例えば、過剰な体液増加(水頭症)もしくは非癌性腫瘍(過誤腫)、脳もしくは脊髄への放射線、脳もしくは脊髄への損傷、マックキューン-オールブライト症候群(骨および皮膚の色に影響を及ぼし、ホルモン問題を引き起こす遺伝病)、先天性副腎過形成(副腎による異常なホルモン産生が関与する遺伝障害の一群)、または甲状腺機能低下症の1つまたは複数によって引き起こされ得る。女児における末梢性思春期早発症は、卵巣嚢胞もしくは卵巣腫瘍、ならびにエストロゲンもしくはテストステロンを放出する、副腎もしくは下垂体の腫瘍、マックキューン-オールブライト症候群、またはエストロゲンもしくはテストステロンへの外部供給源、例えば、クリームまたは軟膏への曝露の1つまたは複数と関連付けられ得る。
一部の態様において、ヒト女性対象は性別違和を有する。一部の態様において、ヒト女性対象は先天性副腎過形成(CAH)を有する。
一部の態様において、ヒト女性対象は、骨成長の低下に関連する疾患または障害、および思春期によって骨の成長が止まる疾患または障害を有する。
D.ミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質
いかなる理論にも拘束されるものではないが、ミュラー管抑制因子(MIS)は、糖タンパク質のTGFβ多重遺伝子ファミリーのメンバーである。この遺伝子ファミリー内にあるタンパク質は全て二量体前駆体として産生され、活性化のために翻訳後プロセシングを受け、そのため、生理活性のあるC末端断片を放出するために切断と解離を必要とする 。MISは、同一の70kDaのジスルフィド結合した単量体からなる140kDa二量体であり、それぞれの単量体は57kDa N末端ドメインと12.5kDaカルボキシル末端(C末端)で構成される。従って、MISは2つの同一の単量体を含み(従って、「ホモ二量体」と呼ばれる)、それぞれの単量体は2つのドメイン、N末端ドメインとC末端ドメインを含み、これらは非共有結合で保たれている。精製されたC末端ドメインは生物学的に活性な部分であり、活性には切断が必要とされる。N末端ドメインはインビボでタンパク質フォールディングを助け、C末端ペプチドがその受容体、例えば、MISRIおよびMISRIIに送達されるのを促進する可能性がある。MISの切断不可能な変異体は生物学的に不活性である。
活性のあるカルボキシ末端ドメインは、他のTGFβファミリーメンバー、例えば、TGF-B1、2、および3、インヒビン、アクチビン、ならびに骨形成タンパク質、ならびに多数の増殖分化因子(GDF)とアミノ酸相同性を共有する。MISカルボキシ末端ドメインの構造は、分子モデリングを用いたTGFβ三次元構造に対する相同性によって明らかにされたように(Lorenzo, Donahoe, et al., 未発表データ)、その構造的安定性につながる分子内ジスルフィド結合と分子間ジスルフィド結合の両方に関与する7つのシステインによって支えられている。
他のTGFβファミリーメンバーと同様に、MISは、そのアミノ末端ドメインとカルボキシ末端ドメインを生じさせるプラスミンによって切断することができる。このタンパク質分解プロセスは生理学的活性に必要とされ、TGFβ配列中に見いだされる二塩基切断部位に似た位置にある部位で生じる。結果として生じた産物は、低pHで解離する非共有結合複合体の形できつく結合する。従って、アミノ末端からのカルボキシ末端の分離を強化または完了するためには、プラスミン処理と分子サイズ排除クロマトグラフィーによる技術的に複雑な、かつ時間がとられるプロトコールが必要とされる。
ネコMIS遺伝子は以前にクローニングされたが、古いネコゲノムバージョンのMIS配列の範囲は不完全であった可能性があると発見された。欠損している領域をクローニングする以前の取り組みは、おそらく、高GC含量と二次構造のせいで一部しか成功せず、これが構造再編成の人為的結果につながった。サンガーシークエンシングによって得られた部分配列をつなぎ合わせ、食肉目(Carnivora)におけるMISのC末端の高度相同性に頼ることで、本発明者らは、ウイルスパッケージングの構築を可能にするほど十分にGC含量を減らした同義コドン使用頻度を用いて合成された最新のキメラネコMISトランスジーンを入手した。ネコゲノムのより包括的な最新の(「バージョン9」)ビルドがリリースされた時に(GenBankアクセッション番号GCA_000181335.4を参照されたい)、このキメラネコMIS構築物(SEQ ID NO:3)は、17のアミノ酸置換を導入しており、合計30のアミノ酸ミスマッチの間に総計して13のAAになるペプチドモチーフを2つ省いていることが発見された(だが、UGRアッセイでは依然として生理活性があった)。ネコV9.0参照配列に対応し、GC含量を下げるように最適化コドン使用頻度を有する野生型ネコMIS構築物(SEQ ID NO:1)を調製した(SEQ ID NO:1および5)。その後にネコV9.0配列のアップデートがリリースされている(GenBankアクセッション番号GCA_000181335.5を参照されたい)。この最新のネコV9.0ゲノム配列情報は最新のネコMISタンパク質配列(SEQ ID NO:18)を含む。最新のネコv9.0 MIS配列(SEQ ID NO:18)はSEQ ID NO:1の370-375と比較してSEQ ID NO:18の位置370-376にあるアラニンリッチ領域内に1つのさらなるアラニン残基がある点でオリジナルのネコv9.0 MIS配列(SEQ ID NO:1)と異なる。このネコMIS領域にある1つのアラニン残基の違いは、そのプロセシング、活性、および/または抗原性に影響を及ぼすと予想されない。
一部の態様において、MISタンパク質は野生型ネコMIS(fMIS)タンパク質を含む。一部の態様において、MISタンパク質はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質はSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本開示は、キメラネコMISタンパク質を含む組成物を含む。一部の態様において、キメラネコMISタンパク質はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、キメラネコMISタンパク質は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、本開示は、少なくともSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572を含むキメラネコMISタンパク質、またはSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むキメラネコMISタンパク質を含む組成物を含み、SEQ ID NO:3の残基1-21の内因性キメラネコMISタンパク質リーダー配列は、本明細書において開示される非MISリーダー配列と交換されている。
一部の態様において、MISタンパク質は野生型イヌMISタンパク質を含む。一部の態様において、MISタンパク質はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本開示は、野生型イヌMISタンパク質を含む組成物を含む。一部の態様において、MISタンパク質はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、本開示は、少なくともSEQ ID NO:2のアミノ酸23～572を含むイヌMISタンパク質、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸23～573に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むイヌMISタンパク質を含む組成物を含み、SEQ ID NO:2の残基1-22の内因性イヌMISリーダー配列は、本明細書において開示される非MISリーダー配列と交換されている。
2つ以上のポリペプチド配列の文脈において本明細書において使用する「パーセント配列同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、または目視検査によって測定された時に、最大に一致するように比較およびアラインメントされた場合に、同一の2つ以上の配列もしくは部分配列、または特定のパーセントの同一のアミノ酸残基もしくはその保存的置換を有する2つ以上の配列もしくは部分配列を指す。例として、第1のアミノ酸配列が、第1の配列に含まれる数と同じ数のアミノ酸と比較された時に、または下記で議論されるように当技術分野において公知のコンピュータ類似性プログラムによってアラインメントされているポリペプチドのアラインメントと比較された時に、第2のアミノ酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、90％、もしくはさらには95％同一であるか、または保存的置換されている時には第2のアミノ酸配列と類似しているとみなすことができる。
MISタンパク質のアミノ酸配列を変えるように、クローニングされた遺伝子を容易に操作できることが当業者により理解さる。MISタンパク質のクローニングされた遺伝子を、特に、本明細書に記載の方法および組成物に従って使用され得る天然タンパク質のバリアントを生成するように、インビトロ変異誘発のための様々な周知の技法によって操作することができる。
本発明において有用なMISタンパク質の一次構造のバリエーションは、例えば、欠失、付加、および置換を含んでもよい。置換は保存的でも非保存的でもよい。天然タンパク質とバリアントとの間の違いによって、一般的に、望ましい特性が保存される、望ましくない特性が軽減または排除される、望ましいまたは新しい特性が付加される。
成熟した野生型MISタンパク質は、最初に、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:18の野生型ネコMISタンパク質のアミノ酸残基1～21、野生型SEQ ID NO:2の野生型イヌMISタンパク質のアミノ酸残基1～22、およびSEQ ID NO:4の野生型ヒトMISタンパク質のアミノ酸残基1～24に対応する、N末端リーダー配列を含むプロホルモンとして産生される。このリーダー配列は切断されて成熟MISタンパク質が生じる。さらに、成熟タンパク質はRAQ/Rフューリン切断部位において(SEQ ID NO:1の野生型ネコMISのアミノ酸残基476～479;SEQ ID NO:18の野生型ネコMISのアミノ残基477-480;またはSEQ ID NO:3のキメラネコMISタンパク質のアミノ酸残基463～466において)切断されて、N末端ドメインとC末端ドメインが生じる。N末端MISドメインとC末端MISドメインは、このN末端ドメインとC末端ドメインを含む別のWTネコMISタンパク質とホモ二量体化して、成熟タンパク質が形成する。一部の態様において、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:3のRAQ/Rフューリン切断部位は改変することができる。一部の態様において、SEQ ID NO:1の位置478、またはSEQ ID NO:18の位置479、またはSEQ ID NO:3の位置465にあるQアミノ酸残基を、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸、例えば、K(リジン)に変えることができる。
本発明の全局面において、本明細書において開示される方法および組成物において使用するための、MISタンパク質またはMISタンパク質をコードする核酸配列は非内因性MISリーダー配列を有してもよく、天然MISリーダー配列は非内因性MISリーダー配列を有してもよく、この場合、天然MISリーダー配列は、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)リーダー配列などの異なるリーダー配列と交換されている。一部の態様において、本明細書において開示される方法および組成物において使用するための、MISタンパク質またはMISタンパク質をコードする核酸配列は、一次RAQ/R切断部位(SEQ ID NO:1の野生型ネコMISのアミノ酸476～479に対応する、SEQ ID NO:18の野生型ネコMISのアミノ酸477～480に対応する、SEQ ID NO:2の野生型イヌMISのアミノ酸460～463に対応する、およびSEQ ID NO:4の野生型ヒトMISのアミノ酸448～451に対応する)がRAR/Rに変えられている、ならびに/または内因性MISリーダー配列がアルブミンリーダー配列と交換されている、改変されたMISタンパク質である。本明細書において開示される方法において有用なMISタンパク質は、野生型MIS、またはMISバリアント、例えば、その全体が本明細書に組み入れられるWO2015089321に開示されるような、LR-MIS、LRF-MISなどでもよい。
一部の態様において、本発明において使用するための非内因性リーダー配列は、それぞれが、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、WO2015089321、米国特許第5,759,802号、欧州特許2277889においてに開示されるHSAリーダー配列の機能的断片またはバリエーションである。本明細書において開示されるMISタンパク質において使用するために、例えば、内因性リーダー配列と交換するために他のリーダー配列が包含される。このようなリーダー配列は当技術分野において周知であり、その全体が参照として本明細書に組み入れられるUS2007/0141666において開示されるような、組織型プラスミノゲンアクチベータープロペプチド(IgSP-tPA)と融合した免疫グロブリンシグナルペプチドを含むリーダー配列を含む。分泌タンパク質の産生のために他の多数のシグナルペプチドが用いられる。これらのうちの1つがマウス免疫グロブリンシグナルペプチド(IgSP、EMBLアクセッション番号M13331)である。IgSPは、1983年に、Lohら(Cell. 33:85-93)によって最初に特定された。IgSPは哺乳動物細胞において良好な発現をもたらすことが知られている。例えば、欧州特許第0382762号は、IgSPと西洋ワサビペルオキシダーゼとの間で融合ポリペプチドを構築することによって西洋ワサビペルオキシダーゼを産生する方法を開示する。他のリーダー配列には、例えば、MPIF-1シグナル配列(例えば、GenBankアクセッション番号AAB51134のアミノ酸1～21);スタニオカルシンシグナル配列;インベルターゼシグナル配列;酵母接合因子αシグナル配列(例えば、K.ラクティス(K.lactis)キラートキシンリーダー配列);ハイブリッドシグナル配列;HSA/MFα-1ハイブリッドシグナル配列(HSA/kex2とも知られる);K.ラクティスキラー/MFα-1融合リーダー配列;免疫グロブリンIgシグナル配列;フィビュリンB前駆体シグナル配列;クラスタリン前駆体シグナル配列;およびインシュリン様増殖因子結合タンパク質4シグナル配列が含まれるが、これに限定されない。これらの例は、その全体が参照として本明細書に組み入れられるWO2015089321に開示される。
一部の態様において、本発明において使用するための非内因性リーダー配列は、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列に対して少なくとも85％、または少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するSEQ ID NO:9のバリアントまたは断片の、
Figure 2024511413000011
のアミノ酸を含む、アズロジシン(Azuroまたは「A」)リーダー配列の機能的断片またはバリエーションである。
一部の態様において、本発明において使用するための非内因性リーダー配列は、HSA配列であり、SEQ ID NO:10の機能的断片、例えば、または、SEQ ID NO:10の少なくとも23、または少なくとも22、または少なくとも21、または少なくとも20、または少なくとも19、または少なくとも18、または少なくとも17、または少なくとも16、または少なくとも15、または少なくとも14、または少なくとも13、または少なくとも12、または少なくとも11、または少なくとも10、または10未満の連続した、または非連続のアミノ酸である。HSAリーダー配列の改変されたバージョンも本発明において使用するために包含され、その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,759,802号において開示される。一部の態様において、HSAリーダー配列は、
Figure 2024511413000012
またはそのバリエーションであり、これらは、その全体が本明細書に組み入れられる欧州特許EP2277889において開示される。HSAシグナル配列
Figure 2024511413000013
のプレプロ領域のバリアントは、断片、例えば、HSAシグナル配列のプレ領域
Figure 2024511413000014
またはそのバリアント、例えば、
Figure 2024511413000015
を含む。
ネコ、イヌ、およびヒトMISタンパク質のある特定のホモログならびに機能的誘導体ならびに機能的な断片は当技術分野において公知であるか、または発現ライブラリーからのMIS発現によって当業者が特定することができる。
E.遺伝子導入を介したMISタンパク質の送達
従って、一局面において、本発明は、子ネコおよび子イヌならびに他の動物を含む思春期前非ヒト対象において妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止する方法であって、MISタンパク質(例えば、野生型MISタンパク質またはバリアントMISタンパク質)をコードする核酸を含むベクターを含む組成物を対象に投与する工程を含む、方法に関する。
一部の態様において、MISタンパク質をコードする核酸は、遺伝子導入を介して、思春期前非ヒト対象において妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止するのに効果的に使用することができる。一般原則は、核酸を対象の中にある標的細胞に導入するか(インビボ)、または対象の外にある標的細胞に導入し、細胞を対象に移入し(エクスビボ)、そこで核酸がMISタンパク質に転写されることである。
従って、一部の態様において、本明細書に記載の方法は、思春期前非ヒト対象において、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む組成物の単回注射後に妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止することができ、対象に投与された組成物は、閾値レベルに等しい、または閾値レベルを上回るMIS発現を維持することができる。閾値レベルは、妊孕性を低下させる、および/または思春期を阻止するのに必要とされ得る最小のMISレベルである。
閾値レベルは、対象、対象の種、および/または対象の年齢もしくは成熟に左右される場合があることに留意しなければならない。例えば、獣医学用途において、不妊が望ましい様々な実際の状況がある。
細胞への侵入は、適切なベクターの形をとる核酸の用意、またはリポソーム中への核酸のカプセル化などの当技術分野において公知の適切な技法によって容易にすることができる。
遺伝子導入の望ましい方式は、核酸が細胞内で複製して、望ましい効果を強化および延長するように核酸を提供する方式である。従って、核酸は、適切な調節エレメント、例えば、プロモーター、例えば、対応する遺伝子の天然プロモーター、肝臓、神経、骨、筋肉、皮膚、関節、もしくは軟骨の細胞において内因的に活性な異種プロモーター、または適切な薬剤によって誘導することができる異種プロモーターに機能的に連結される。
従って、一部の態様において、ベクター(例えば、ウイルスベクター)は、例えば、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む野生型MISタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:18のネコMISタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:2のイヌMISタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:4のヒトMISタンパク質をコードする核酸を含む。
一部の態様において、前記ベクターは、対象において天然に産生されたMISタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、もしくはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むMISタンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸を含む。
一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:3のMISタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様において、前記ベクターは、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むMISタンパク質をコードする核酸を含む。
一部の態様において、前記ベクターは、MISタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸は、SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:5の核酸配列に対して少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の態様において、前記ベクターは、MISタンパク質をコードする核酸配列を含み、核酸は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO:6の核酸配列に対して少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本発明の方法において使用するために、MISタンパク質をコードする核酸を含む様々なベクターを包含することができる。一部の態様において、前記ベクターは発現ベクターである。例えば、このようなMISタンパク質の組換え発現のための、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を有するウイルスベクターの産生するために組換え構築物を生成する目的で、真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを使用することができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、いくつかの商業的供給業者から入手可能である。
核酸は任意の適切な方法によって標的細胞に導入することができる。例えば、MISタンパク質をコードする核酸は、トランスフェクション(例えば、リン酸カルシウムまたはDEAE-デキストランを介したトランスフェクション)、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション(例えば、裸のDNAの直接注射による)、バイオリスティック、核酸を含有するウイルスベクターの感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、マイクロセルを介した遺伝子導入、核移入などによって細胞に導入することができる。
または、一部の態様において、プラスミド発現ベクターを使用することができる。プラスミド発現ベクターには、大腸菌（E. coli）宿主細胞、例えば、BL21、BL21(DE3)およびAD494(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、ならびにOrigami(DE3)(Novagen(登録商標))におけるタンパク質発現の場合は、pcDNA3.1、pETベクター(Novagen(登録商標))、pGEXベクター(GE Life Sciences)、およびpMALベクター(New England labs. Inc.);哺乳動物細胞株、例えば、CHO、COS、HEK-293、Jurkat、およびMCF-7における発現の場合は、強力なCMVプロモーターベースpcDNA3.1(Invitrogen(商標)Inc.)およびpCIneoベクター(Promega);哺乳動物細胞におけるアデノウイルスを介した遺伝子導入および発現の場合は、複製能力がないアデノウイルスベクターベクターpAdenoX、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV(Clontech(登録商標))、pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DESTベクター(Invitrogen(商標)Inc.); 哺乳動物細胞におけるレトロウイルスを介した遺伝子導入および発現ならびに発現のためにClontechからのRetro-X(商標)系と一緒に使用する場合は、pLNCX2、pLXSN、およびpLAPSNレトロウイルスベクター;哺乳動物細胞におけるレンチウイルスを介した遺伝子導入および発現の場合はpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ(INVITROGEN(商標)Inc.);哺乳動物細胞におけるアデノ随伴ウイルスを介した遺伝子導入および発現の場合は、アデノウイルス関連ウイルス発現ベクター、例えば、pAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP、およびpAAV-RCベクター(Stratagene(登録商標))が含まれるが、これに限定されない。
一部の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸(例えば、DNA、modRNA、またはRNAa)はベクター、例えば、ウイルスベクターとして適切に投与することができる。一部の態様において、前記ベクターはウイルスベクターである。
本発明において利用することができるウイルスベクター系には、(a)アデノウイルスベクター;(b)レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、マウスモロニー白血病ウイルスなど;(c)アデノ随伴ウイルスベクター;(d)単純ヘルペスウイルスベクター;(e)SV40ベクター;(f)ポリオーマウイルスベクター;(g)パピローマウイルスベクター;(h)ピコルナウイルスベクター;(i)ポックスウイルスベクター、例えば、オルトポックス、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリアポックスまたは鶏痘;および(j)ヘルパー依存性またはガットレス(gutless)アデノウイルスが含まれるが、これに限定されない。複製欠損ウイルスも有利な場合がある。好ましい態様において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。
一部の態様において、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターなどのウイルスベクターが使用される。AAVは、通常、ヒトを含む哺乳動物に感染するが、非病原性であり、米国および欧州での臨床試験において遺伝子療法ベクターとして開発および使用されてきた(Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews 2008, 21, 583-593)。AAVベクターは、当業者に利用可能な多数の方法のいずれか1つを用いて調製することができる。例示的なAAVベクターは、Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993);参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,146号; Gao et al., Gene Therapy 2005, 5, 285-297; Vandenberghe et al., Gene Therapy 2009, 16, 311-319; Gao et al., PNAS 2002, 99, 11854-11859; Gao et al., PNAS 2003, 100, 6081-6086; Gao et al., J. of Virology 2004, 78, 6381-6388において開示される。
特定のタイプのAAVベクターの選択は標的組織に左右されることがあることに留意しなければならない。一部の態様において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。一部の態様において、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.HR、AAVrh.10、AAVMYO、またはAAV2.5である。一部の態様において、AAVはAAV9である。一部の態様において、MISタンパク質を発現するためのAAVベクターは、本明細書中の実施例において開示されるようにAAV9である。
アデノウイルスは、遺伝子導入法において使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは呼吸上皮に自然感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染できるという利点がある。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)はアデノウイルスベースの遺伝子療法の総説を示している。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子療法におけるアデノウイルス使用の他の事例は、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT公報WO94/12649;およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)において見出される。
レトロウイルスベクターも使用することができる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要な成分を含有する。MISタンパク質をコードする核酸は、対象への遺伝子送達を容易にする1つまたは複数のベクターの中にクローニングされる。
別の態様において、前記ベクターは、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、例えば、弱毒化ワクシニア、例えば、改変ウイルスアンカラ(MVA)またはNYVAC、アビポックス、例えば、鶏痘もしくはカナリアポックスである。
別の態様において、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,143,520号;同第5,665,557号;および同第5,981,276号に記載のHIVベースベクターなどのレンチウイルスベクターが用いられる。
前記ベクターは細胞のゲノムの組み込まれてもよく、組み込まれなくてもよい。前記構築物は、所望であればトランスフェクションのためにウイルス配列を含んでもよい。または、前記構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、EPVおよびEBVベクターに組み込まれてもよい。
一般的に、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸、例えば、DNA、modRNA、またはRNAaを発現させるための構築物の発現を標的細胞において確かなものにするために、構築物を調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどに機能的に連結することができる。ベクターおよび構築物の他の細かな点は下記でさらに詳述される。
本明細書において使用する「組織特異的プロモーター」という用語は、プロモーターとして役立つ、すなわち、プロモーターに機能的に連結された選択された核酸配列の発現を調節し、かつ組織の特定の細胞において、例えば、卵巣由来の細胞において、選択された核酸配列の発現に選択的に影響を及ぼす核酸配列を意味する。
「構成的活性プロモーター」という用語は、ある特定の細胞内で常に発現している遺伝子のプロモーターを指す。哺乳動物細胞において使用するための例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、CMV初期エンハンサー/ニワトリβアクチン(CBA)プロモーターなどが含まれる。
「誘導性プロモーター」という用語は、ある特定のシグナルに応答して、例えば、薬剤の添加または低減に応答して発現することができる遺伝子のプロモーターを指す。誘導性プロモーターの非限定的な例は、「tet-on」および「tet-off」プロモーター、または特定の組織タイプにおいて調節されるプロモーターである。
一部の態様において、調節エレメントは構成的活性プロモーターを含む。一部の態様において、調節エレメントはCMV初期エンハンサー/ニワトリβアクチン(CBA)プロモーターを含む。
一部の態様において、投与されている組成物は誘導性ベクターを含む。遺伝子発現またはタンパク質合成を調節するための誘導性ベクターの使用は当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO1993022431、US20110301228、US6500647、WO2005053750、またはUS6784340を参照されたい。
一部の態様において、MISタンパク質は誘導性ベクターによって発現され、誘導性ベクターは、MISタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された、1つまたは複数の調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを含んでもよく、調節エレメントはMISの発現レベルを制御することができる。
典型的な調節エレメントには、転写プロモーター、誘導性プロモーターおよび転写エレメント、転写を制御するための任意の機能的配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および/または翻訳の終結を制御するための配列が含まれるが、これに限定されない。「調節エレメント」という用語には、機能的に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなどの核酸配列が含まれる。一部の例では、組換え遺伝子の転写は、発現が意図される細胞タイプにおける組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列(または他の転写調節配列)の制御下にある。組換え遺伝子は、同じ転写調節配列の制御下にあってもよく、天然型のタンパク質の転写を制御する配列とは異なる転写調節配列の制御下にあってもよいことも理解される。場合によっては、プロモーター配列は、特定の遺伝子の転写を介するのに必要な、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識される。
調節配列は1つの調節配列または複数の調節配列でもよく、改変された調節配列またはその断片でもよい。改変された調節配列とは、例えば、変異、メチル化などがあるが、これに限定されない、いくつかの手段によって核酸配列が変えられているか、または改変されている調節配列である。本明細書において開示される方法において有用な調節配列は、プロモーター依存性遺伝子発現を、細胞タイプ特異的な、組織特異的な、または外部のシグナルもしくは薬剤によって誘導可能な発現のために制御可能にするのに十分なプロモーターエレメント(例えば、エンハンサーまたはリプレッサー)である。このようなエレメントは天然遺伝子の5’領域または3’領域に配置されてもよく、イントロンの内部に配置されてもよい。
一部の態様において、ウイルスベクターによってコードされるMISタンパク質が対象において内因的に発現される場合、本明細書において開示されるMISタンパク質の発現レベルは、望ましい期間にわたって、例えば、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも1年、少なくとも5年、または対象の生涯を通じて一定の場合がある。一部の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質の発現は、望ましい期間にわたって、治療的に有効な投与量レベルで、またはそれより上回って維持することができる。
一部の態様では他の発現ベクターを使用することができる。例えば、プラスミド、エピソーム、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージ、およびこのようなベクターは宿主ゲノムに組み込まれるか、特定の細胞内で自律複製することができる。等価な機能を果たす当業者に公知の他の種類の発現ベクターも使用することができる。
別の遺伝子導入アプローチはエクスビボ遺伝子導入であり、これは、核酸を、組織培養されている細胞に導入し、形質導入された細胞を対象に送達することを伴う。核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって培養細胞に導入されてもよい。通常、導入方法は選択マーカーを細胞に導入することを含む。次いで、導入された核酸を取り込んでおり、これを発現している細胞を単離するために、細胞は選択下に置かれる。次いで、これらの細胞は対象に送達される。
ある特定の態様において、MISタンパク質をコードする核酸はエレクトロポレーション(例えば、Wong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87 (1982)を参照されたい)およびバイオリスティック(例えば、遺伝子銃; Johnston and Tang, Methods Cell Biol. 43 Pt A:353-65 (1994); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-82 (1993))によって細胞に導入することができる。
ある特定の態様において、MISタンパク質をコードする核酸配列はトランスフェクションまたはリポフェクションによって標的細胞に導入することができる。トランスフェクションまたはリポフェクション用の適切な薬剤には、例えば、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、リポフェクチン、リプフェクタミン(lipfectamine)、DIMRIEC、Superfect、およびEffectin(Qiagen)、ユニフェクチン(unifectin)、マキシフェクチン(maxifectin)、DOTMA、DOGS(トランスフェクタム(Transfectam);ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン)、DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、DOTAP(1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン)、DDAB(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、DHDEAB(N,N-ジ-n-ヘキサデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)、HDEAB(N-n-ヘキサデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)、ポリブレン、ポリ(エチレンイミン)(PEI)などが含まれる(例えば、Banerjee et al., Med. Chem. 42:4292-99 (1999); Godbey et al., Gene Ther. 6:1380-88 (1999); Kichler et al., Gene Ther. 5:855-60 (1998); Birchaa et al., J. Pharm. 183:195-207 (1999)を参照されたい)。
様々な送達系が公知であり、治療剤を直接投与するのに、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、および受容体を介したエンドサイトーシスに、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクターをカプセル化するのに使用することができる(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい)。(参照により本明細書に組み入れられる)米国特許第5,676,954号は、カチオン性リポソーム担体と複合体を形成した遺伝物質のマウスへの注射について報告する。米国特許第4,897,355号、同第4,946,787号、同第5,049,386号、同第5,459,127号、同第5,589,466号、同第5,693,622号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、および国際公開番号:WO94/9469(これらは参照により本明細書に組み入れられる)は、細胞および哺乳動物にDNAをトランスフェクトするのに使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第5,589,466号、同第5,693,622号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、および国際公開番号:WO94/9469(これらは参照により本明細書に組み入れられる)は、DNA-カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達するための方法を提供する。このようなカチオン性脂質複合体またはナノ粒子は、治療剤、例えば、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを投与するのに使用することができ、タンパク質、例えば、MISタンパク質を送達するのに使用することもできる。
F.MISに対する抗体の検出
本開示の一局面は、ネコMIS(fcMIS、例えば、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20)またはイヌMIS(cMIS、例えば、SEQ ID NO:3もしくはSEQ ID NO:15)に対する抗体を検出することに関する。一部の態様において、対象が、投与されたベクター組成物、例えば、fcMISまたはclMISを発現するAAVベクター、ポックスウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターに対して免疫学的応答を有するかどうか確かめることが有益な場合がある。一部の態様において、免疫学的応答の確認は、対象におけるfcMISまたはclMISに対するIgG抗体の検出を含む。fcMISv1またはclMISに対する抗体の検出において使用するために、試験試料が対象から採取されてもよい。一部の態様において、試験試料は血液または血清を含む。
一部の態様において、血清中のfcMISまたはclMISに対する抗体を検出する方法は、(a)任意で、組換えfcMISまたはclMIS、例えば、FLAGタグ付きfcMISまたはFLAGタグ付きclMISを単離する工程;(b)単離されたfcMISまたはclMISを支持体に添加する工程であって、任意で、支持体がELISAプレートである、工程;(c)試験試料を支持体に添加する工程;(d)支持体を検出可能な抗体とインキュベートする工程であって、任意で、検出可能な抗体がヤギ抗ネコIgG(H+L)HRPである、工程;および(e)酵素基質反応を行う工程であって、任意で、酵素基質がHRPである、工程を含む。
一部の態様において、単離されたfcMISまたはclMISは、当業者に公知の材料および方法に従って単離することができる。一部の態様において、単離されたfcMISは、本明細書において開示される任意の例示的なfcMISタンパク質、例えば、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:20である。一部の態様において、単離されたclMISは、本明細書において開示される任意のclMISタンパク質、例えば、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:15である。一部の態様において、組換えfcMISまたはclMISは、HisタグまたはFLAGタグなどの精製タグを有する。一部の態様において、組換えfcMISは、FLAGタグ付きfcMISv1またはFLAGタグ付きfcMISv2または組換えFLAGタグ付きclMISである。一部の態様において、単離されたfcMISまたはclMISは、細胞培養コンディションドメディウムから精製される。
一部の態様において、fcMISまたはclMISに対する抗体を検出する方法は、単離されたfcMISまたはclMISを、ELISAプレートなどの支持体の表面に付着させる工程を含む。一部の態様において、fcMISまたはclMISで支持体の表面を完全に被覆するために、過剰量の単離されたfcMISまたはclMISが支持体に添加される。一部の態様において、単離されたMISと支持体は約30分間、12時間、24時間、または一晩インキュベートされる。一部の態様において、単離されたfcMISまたはclMISと支持体は、ほぼ室温、4℃、20℃、25℃、30℃、または37℃でインキュベートされる。このインキュベーション工程後に、一部の態様では、支持体に付着しない過剰なfcMISまたはclMISが適切な緩衝液または洗浄溶液で洗い流される。
一部の態様において、単離されたfcMISまたはclMISで支持体がコーティングされた後に、ブロッキング工程が実施される。このブロッキング工程は、試験試料が支持体に添加される前に実施される。一部の態様において、ブロッキング工程は、fcMISまたはclMISでコーティングされた支持体をブロッキング溶液とインキュベートする工程を含む。一部の態様において、ブロッキング溶液は、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清、および/または低濃度のTween20界面活性剤を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)を含む。
対象(例えば、ベクター、例えば、fcMISまたはclMISを発現するウイルスベクターが投与される対象)に由来する試験試料が、fcMISまたはclMISでコーティングされた支持体に添加され得る。一部の態様において、試験試料は適切な緩衝液で希釈された後に、支持体に添加される。一部の態様において、試験試料は、上記のブロッキング緩衝液で希釈される。一部の態様において、試験試料は1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500、または1/1000に希釈される。一部の態様において、ブロッキング緩衝液または適切なコーティング緩衝液はブランクとなるように用いられる。
一部の態様において、抗fcMIS抗体または抗clMIS抗体は正の対照として用いられる。一部の態様において、抗fcMIS抗体またはclMIS抗体は適切な緩衝液で希釈された後に、支持体に添加される。一部の態様において、抗fcMISまたは抗clMIS抗体は、上記のブロッキング緩衝液で希釈される。一部の態様において、抗fcMIS抗体または抗clMIS抗体は1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500、または1/1000に希釈される。
一部の態様において、ネコまたはイヌIgG抗体などの全体分子IgG抗体は、ELISAによる検出用の抗体標準として用いられる。一部の態様において、全体分子IgG抗体は適切な緩衝液で希釈された後に、支持体に添加される。一部の態様において、全体分子IgG抗体は、上記のブロッキング緩衝液で希釈される。一部の態様において、全体分子IgG抗体は1/10、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500、または1/1000に希釈される。
fcMISでコーティングされた、またはclMISでコーティングされた支持体に、試験試料、抗fcMIS抗体または抗clMIS抗体、全体分子IgG抗体標準、およびブランクが添加された後に、支持体は、ある特定の量の時間にわたって適切な温度でインキュベートされる。一部の態様において、支持体は約30分間、1時間、12時間、24時間、または一晩インキュベートされる。一部の態様において、支持体はほぼ室温、4℃、20℃、25℃、30℃、または37℃でインキュベートされる。インキュベーション工程の後に、支持体は、適切な緩衝液または洗浄溶液を用いて3回、5回、またはそれより多い洗浄工程によって洗浄される。
一部の態様において、洗浄工程後に、支持体はヤギ抗IgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などの検出可能な抗体とインキュベートされる。ヤギ抗IgG HRPは製造業者の推奨に従って用いられる。一部の態様において、支持体は、約30分間、1時間、12時間、24時間、または一晩インキュベートされる。一部の態様において、支持体は、ほぼ室温、4℃、20℃、25℃、30℃、または37℃でインキュベートされる。一部の態様において、支持体は暗所でインキュベートされる。試験試料中の抗MIS抗体を検出するために、HRP酵素基質反応などの酵素基質反応が製造業者の推奨に従って行われる。
G.組成物の投与
一部の態様において、投与される組成物の量は、非ヒト動物において妊孕性を低下させるのに、および/もしくは思春期を阻止するのに十分な時に、またはヒト対象において思春期を遅延させるのに十分な時に「有効」である。一部の態様において、組成物の投与後、6ヶ月もしくは6ヶ月後、9ヶ月もしくは9ヶ月後、12ヶ月もしくは12ヶ月後、15ヶ月もしくは15ヶ月後、または24ヶ月もしくは24ヶ月後の思春期前非ヒト対象(例えば、子ネコまたは子イヌ)の血清中のMISタンパク質の濃度が、250ng/ml超、300ng/ml超、400ng/ml超、500ng/ml超、600ng/ml超、700ng/ml超、800ng/ml超、900ng/ml超、1μg/ml超、1.5μg/ml超、2μg/ml超、3μg/ml超、4μg/ml超、5μg/ml超、6μg/ml超、7μg/ml超、8μg/ml超、9μg/ml超、10μg/ml超、または11μg/ml超になるように、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む、前記量の組成物が(例えば、1回限りの投与として)対象に投与される。
MISタンパク質濃度は、抗体ベースのアッセイを含む、この分野において理解されている任意の数のタンパク質定量法によって決定され得る。例えば、AMH Gen II ELISA(Beckman Coulter, カタログ番号A73818)を含む市販キットなどの酵素結合免疫測定法(ELISA)法を利用してMISタンパク質濃度を定量することができる。抗ヒトMIS/AMH IgG抗体はネコMISタンパク質およびイヌMISタンパク質と交差反応し、これらに結合する場合がある。一部の態様において、MISタンパク質濃度はELISAによって決定される。
一部の態様において、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物は一度に投与することができる。一部の態様において、前記組成物を複数のサブドーズ、例えば、2～4のサブドーズに分け、ある期間にわたって、例えば、1日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することができる。一部の態様において、投与は長期にわたってもよく、例えば、数週間または数ヶ月にわたって1日に1つまたは複数の投薬および/または処置でもよい。投与量は有害な副作用を引き起こすほど大きくなってはならない。一部の態様において、投与は単一用量を含む。一部の態様において、投与は、単一用量を2つまたは複数の用量に分けることを含む。
一部の態様において、前記組成物は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:18に対応する天然(すなわち、野生型)ネコMISタンパク質であるMISタンパク質を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:2に対応する天然(すなわち、野生型)イヌMISタンパク質である。
一部の態様において、前記組成物は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、もしくはSEQ ID NO:3に対応する改変されたネコMISタンパク質、または少なくともSEQ ID NO:1のアミノ酸22～588に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質、少なくともSEQ ID NO: 18のアミノ酸22～589に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質、またはSEQ ID NO:3の22-572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:3のRAQ/Rフューリン切断部位は改変されている。一部の態様において、SEQ ID NO:1の残基478またはSEQ ID NO:18の残基479は、QからR(Q478R)またはK(Q478K)に変えられている。一部の態様において、SEQ ID NO:3の残基465は、QからR(Q465R)またはK(Q465K)に変えられており、任意で、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:3の1-21の内因性リーダー配列は、本明細書において開示される非MISリーダー配列と交換されている。
一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:2に対応する天然(すなわち、野生型)イヌMISタンパク質である。一部の態様において、前記組成物は、SEQ ID NO:2に対応する改変されたイヌMISタンパク質、または少なくともSEQ ID NO:2のアミノ酸23～573に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:2のRAQ/Rフューリン切断部位は改変されている。一部の態様において、SEQ ID NO:2の残基462は、QからR(Q462R)またはK(Q462K)に変えられており、任意で、SEQ ID NO:2の1-22の内因性リーダー配列は、本明細書において開示される非MISリーダー配列と交換されている。
一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:4に対応する天然(すなわち、野生型)ヒトMISタンパク質である。一部の態様において、組換えhMISタンパク質は、SEQ ID NO:4のアミノ酸1～25のMISリーダー配列の代わりとなる非MISリーダー配列またはその機能的断片と、改変の非存在と比較して切断を増加させるための、SEQ ID NO:4の残基448-452間での少なくとも1つのアミノ酸の改変の組み合わせを含み、組換えMISタンパク質は、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基に対応する野生型MISタンパク質と比較した時に切断が増加しており、インビトロでの生成量が増加している。一部の態様において、本明細書における方法および組成物において使用するための組換えhMISタンパク質はリーダー配列を欠いているが(すなわち、リーダー配列は切断されている)、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基1～25の内因性MISリーダー配列の代わりに非MISリーダー配列を含むhMISプレタンパク質のプロセシングから生成される。すなわち、一部の態様において、本明細書において開示される方法において使用するための組換えhMISタンパク質は、SEQ ID NO:4のアミノ酸1～25のMISリーダー配列の代わりに非MISリーダー配列またはその機能的断片を含むプレプロタンパク質から生成することができ、リーダー配列は生成中に切断される。一部の態様において、MISタンパク質は、SEQ ID NO:7に対応する組換え改変ヒトMISタンパク質である。一部の態様において、前記組成物は、少なくともSEQ ID NO:4のアミノ酸25～560に対して少なくとも85％の配列同一性を有する改変ヒトMISタンパク質を含み、SEQ ID NO:4のRAQ/Rフューリン切断部位は改変されている。一部の態様において、SEQ ID NO:4の残基450は、QからR(Q450R)またはK(Q450K)に変えられており、任意で、SEQ ID NO:4の1-24の内因性リーダー配列は、例えば、SEQ ID: 9-13のいずれかより選択されるリーダー配列などがあるが、これに限定されない、本明細書において開示される非MISリーダー配列と交換されている。一部の態様において、ヒトMISタンパク質などの組換えMISタンパク質はFLAGタグまたは他のタグを含まない。
一部の態様において、ヒト女性対象において思春期を遅延させるために、例えば、思春期を可逆的に遅延させるために、本明細書において開示されるヒト組換えMISタンパク質がヒト対象に投与される。一部の態様において、MISタンパク質(例えば、SEQ ID NO:4の25-560に対して少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質であり、SEQ ID NO:4の残基450は、QからR(Q450R)またはK(Q450K)に変えられており、任意で、SEQ ID NO:4の1-24の内因性リーダー配列は非MISリーダー配列と交換されている)は、GnRH(性腺刺激ホルモン放出ホルモン)、GnRHアゴニスト、GnRH類似体、メトホルミン、プロゲスチン、またはスーパーアゴニスト処置より選択される以下の処置のいずれか1つまたは複数などがあるが、これに限定されない、中枢性思春期早発症に対する処置と同時に、またはその前に、またはその後に女性対象に投与される。GnRH類似体には、リュープロリド酢酸塩(リュープロンデポー)、またはトリプトレリン(TRELSTAR(商標), Triptodur Kit)が含まれるが、これに限定されない。思春期を遅延させるための、または中枢性思春期早発症もしくは思春期早発症に対する他の処置には、SUPPRELIN LA(商標)(ヒストレリン)、LUPRON DEPOT-PED(商標)、TAMOXIFEN(商標)、LEUPROLIDE(商標)、SOLTAMOX(商標)、VANTAS(商標)、HISTRELIN(商標)、SYNAREL(商標)、TRIPTORELIN(商標)、TRIPTODUR(商標)、NAFARELIN(商標)、FENSOLVI(商標)が含まれる。一部の態様において、思春期を遅延させるための、女性対象への本明細書において開示されるrhMISバリアントタンパク質の投与は、1～3ヶ月、3～6ヶ月、6～12ヶ月、12～18ヶ月、18～24ヶ月、または2～3年、3～4年、または4～5年、または5～6年の期間、または6年より長く対象に投与される。処置は、例えば、ポンプ、インプラント、または経皮皮膚パッチを用いることで毎日でもよく、毎週でもよい。一部の態様において、思春期を遅延させるための、女性対象への本明細書において開示されるrhMISバリアントタンパク質の投与は、5歳と幼い年齢の中枢性思春期早発症または末梢性思春期早発症のある女性対象に投与され、対象は性別違和を有し、かつ対象の性自認を完全に理解するために、または性別の再適正化の処置および/もしくは手術などの前に、より多くの時間を対象に与えるために思春期を遅延させる必要があれば、6～16年の年齢の範囲内でもよい。rhMISタンパク質を投与する方法は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、米国出願US20200071376またはUS20160039898において開示される。
一部の態様において、前記組成物は、SEQ ID NO:3に対応するキメラネコMISタンパク質を含む。一部の態様において、MISタンパク質は、組換えタンパク質またはその機能的断片もしくは誘導体もしくはバリアントである。
一部の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物の投与は1回限りの投与でもよい。一部の態様において、本明細書において開示される組成物の投与はパルス投与(pulsed administration)によるものである。一部の態様において、有効な用量の組成物は、1日を通して適切な間隔で、任意で、単位剤形で別々に投与される、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれより多いサブドーズとして投与することができる。一部の態様において、体内で活性成分の望ましいレベルを維持するように投与は繰り返される。
一部の態様において、MISタンパク質をコードするウイルスベクターを含む有効量の組成物は、思春期前対象(例えば、子ネコまたは子イヌ)の体重1キログラムあたり1×1013ベクターゲノムの用量で、1×1013ベクターゲノム以下の用量で、5×1012ベクターゲノムの用量で、5×1012ベクターゲノム以下の用量で、1×1012ベクターゲノム以下の用量で、5×1011ベクターゲノム以下の用量で、または1×1011ベクターゲノム以下の用量で提供することができる。一部の態様において、MISタンパク質をコードするウイルスベクターを含む有効量の組成物は、思春期前対象(例えば、子ネコまたは子イヌ)の体重1キログラムあたり1×1011ベクターゲノム～1×1013ベクターゲノムの用量で提供することができる。一部の態様において、MISタンパク質をコードするウイルスベクターを含む有効量の組成物は、思春期前対象(例えば、子ネコまたは子イヌ)の体重1キログラムあたり1×1011ベクターゲノム～1×1012ベクターゲノムの用量で提供することができる。
ベクターゲノム(vg)およびベクター粒子(vp)の濃度は、当技術分野において理解されているゲノムコピー定量法によって、例えば、PCR(例えば、ドロップレットデジタル(droplet digital)PCR(ddPCR)技術)と標準品との比較によって求められてもよい。ウイルス粒子(vp)濃度は、当技術分野において理解されている定量方法によって、例えば、SDS-PAGEとそれに続くクーマシー染色または銀染色と標準品との比較によって求められてもよい。
投与しようとする、MISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物の有効量を決定する際に、MISタンパク質の循環血漿レベル、製剤毒性、および妊孕性の状態が評価される。治療効果を生じるのに有効な最低用量を含む、このような有効用量は、一般的に、上記の要因に左右される。選択される投与量レベルはまた、使用される本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、処置期間、使用される特定の化合物と併用される他の薬物、化合物、および/または材料、処置されている対象の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む様々な要因にも左右される。
例えば、有効量は、望ましい濃度範囲および投与経路を実現する動物モデルにおいて推定することができる。次いで、このような情報を用いて、他の対象における投与に有用な用量および経路を決定することができる。一般的に、治療有効量は望ましい治療効果に左右される。
一部の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物は、任意の適切な、および/または従来の注射投与経路(例えば、筋肉内、静脈内、皮下、または動脈内)によって思春期前対象に投与することができる。
本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物が投与される時に、一般的に、注射可能な単位剤形(例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョン)に処方される。注射に適した薬学的製剤には、滅菌水溶液または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)、適切なその混合物、および/または植物油を含有する溶媒または分散媒でもよい。
本明細書において使用する「単位剤」形という用語は、処置しようとする哺乳動物対象に対する単位剤形として適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体に関連して、望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、(a)本明細書において開示されるようなベクター(例えば、ウイルスベクター)の独特の特徴と、実現しようとする特定の生物学的効果、および/または(b)投与経路によって決められ、かつこれらに直接左右される。
H.薬学的組成物
一部の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)は、任意の適切な手段によって薬学的組成物として、例えば、滅菌注射溶液、例えば、前記組成物を、必要に応じて様々な他の成分と共に、必要とされる量の適切な溶媒の中に組み込むことで調製することができる滅菌注射溶液として処方することができる。
ある特定の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物は、薬学的に許容される担体と共に薬学的組成物として対象に投与することができる。ある特定の態様において、これらの薬学的組成物は、任意で、1種または複数種のさらなる治療剤をさらに含む。
薬学的に許容される担体は当業者によく知られている。液体溶液として処方される組成物の場合、許容される担体は食塩水および滅菌水を含み、任意で、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および他の一般的な添加物を含んでもよい。この技術分野の当業者は、適切なやり方で、かつ一般に認められている手法、例えば、Reming’on's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1990に開示される手法に従って本発明の化合物をさらに処方し得る。
本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物の薬理学的製剤は、任意の薬学的に許容される担体、例えば、様々なビヒクル、アジュバント、添加物、および希釈剤を含有する注射製剤に溶解して対象に投与することができる。
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を用いることによって維持することができる。非水性ビヒクル、例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油およびエステル、例えば、ミリスチン酸イソプロピルもまた化合物組成物の溶媒系として使用され得る。さらに、抗菌性防腐剤、抗酸化物質、キレート剤、および緩衝液を含む、前記組成物の安定性、無菌性、および等張性を強化する様々な添加物を添加することができる。微生物の働きの阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい。注射薬学的形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって引き起こすことができる。しかしながら、本発明によれば、使用される、いかなるビヒクル、希釈剤、または添加物も前記化合物と適合しなければならないだろう。
別の態様において、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物は脂質ベース製剤を含んでもよい。本発明の実施において、任意の公知の脂質ベース薬物送達系を使用することができる。例えば、カプセル化された活性化合物の持続放出速度を確立できる限り、多胞リポソーム(multivesicular liposome)、多重層リポソームおよび単層リポソームを全て使用することができる。徐放性多胞リポソーム薬物送達系を作る方法は、PCT出願公開番号:WO9703652、WO9513796、およびWO9423697において記載され、これらの内容は参照として本明細書に組み入れられる。
合成膜小胞の組成物は、通常、リン脂質の組み合わせを、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたものである。他のリン脂質または他の脂質も用いられる場合がある。合成膜小胞の生成において有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれ、好ましい態様には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエホリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、およびジオレオイルホスファチジルグリセロールが含まれる。
MISタンパク質をコードする核酸を含有する脂質ベース小胞を調製する際には、カプセル化効率、前記ベクターおよび/または核酸のラビアリティ、結果として生じた小胞集団の均一性およびサイズ、化合物と脂質の比、透過性、調製物の不安定性、ならびに製剤の薬学的許容性などの変数を考慮に入れるべきである。
本発明において利用される化合物、例えば、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸は徐放性皮下インプラントまたは標的送達系、例えば、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびマイクロスフェアの形で対象に非経口投与することができる。他のこのようなインプラント、送達系、およびモジュールは当業者に周知である。
導入前に、本明細書において開示されるものと同じものをコードする核酸を含むベクター(例えば、ウイルスベクター)を含む組成物は、濾過を含む、当技術分野の非常に多くの利用可能な技法のいずれでも滅菌することができる。
選択された投与経路に関係なく、適切な水和型で使用され得る本発明の化合物、および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来法によって薬学的に許容される剤形に処方される。
定義
特に定めのない限り、または文脈から暗に示されていない限り、以下の用語および句は、以下で示される意味を含む。特に明示的に述べられていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および句は、この用語および句が、これが属する当技術分野において獲得した意味を除外しない。定義は特定の態様の説明を助けるために示され、本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本発明を限定することを目的としない。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。
本明細書において使用する「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、一態様にとって有用な組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に関連して用いられるが、有用でも有用でなくても明記されていない要素の包含を受け入れる。
単数の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」とは、特に文脈によってはっきりと示されていない限り複数の指示物を含む。同様に、「または(or)」という単語は、特に文脈によってはっきりと示されていない限り「および(and)」を含むことが意図される。
実施例(operating example)にあるものを除き、または特に定めのない限り、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語により修飾されていると理解しなければならない。「約」という用語はパーセントに関連して用いられる時には、言及されている値の±5％を意味することがある。例えば、約100は95～105を意味する。
本開示の実施または試験では、本明細書に記載のものと類似するか、または等価な方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を下記で説明する。「含む(comprises)」という用語は「含む(includes)」を意味する。「例えば(e.g.)」という略語はラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。従って、「例えば(e.g.)」という略語は「例えば(for example)」という用語と同義である。
本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸およびその等価物の重合体を指し、特定の長さの生成物を指さない。従って、ポリペプチドの定義の中にはペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が含まれる。誘導体は、別の配列と比較した時に保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの改変を含む、タンパク質の他の改変をさらに含む。
「ミュラー管抑制因子」および「MIS」という用語は本明細書において同義で用いられ、抗ミュラー管ホルモンまたはAMH、ならびにMISまたはその断片と構造的に類似する化合物および材料も指す。「MIS」または「ミュラー管抑制因子」とは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO:2、または SEQ ID NO:4のアミノ酸残基に対して少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片を意味する。本発明は、野生型MISと実質的に同じか、またはそれより大きな生物学的活性を有するバリアント型のMISを含むことが意図される。このようなバリアントMIS分子の例には、野生型MISのアミノ酸配列における欠失、挿入、または変化が含まれる。さらに、MISタンパク質は組換えDNA技術を用いて得られてもよく、MISタンパク質の化学合成から得られてもよい。
「野生型」という用語は、インビボで通常存在するように、タンパク質をコードする天然ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはタンパク質配列もしくはその一部を指す。
従って、本明細書において開示されるように、ネコMISのプレプロタンパク質の野生型アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:18に対応する(アミノ酸残基1～21はリーダー配列に対応する)。イヌMISのプレプロタンパク質の野生型アミノ酸配列はSEQ ID NO:2に対応する(アミノ酸残基1～22はリーダー配列に対応する)。ヒトMISのプレプロタンパク質の野生型アミノ酸配列は、SEQ ID NO:4に対応する(アミノ酸残基1～24はリーダー配列に対応する)。ネコMISのプロタンパク質の野生型アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基22～588またはSEQ ID NO:18のアミノ酸残基22～589を含む。イヌMISのプロタンパク質の野生型アミノ酸配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基23～572を含む。ヒトMISのプロタンパク質の野生型アミノ酸配列は、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基25～560を含む。次いで、プロタンパク質は、本明細書において議論されるように切断によって翻訳後プロセシングされて、生理活性のあるMISホモ二量体を形成する。
「MISをコードする核酸」とは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、もしくはSEQ ID NO:4のポリペプチドをコードする核酸を含むか、またはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、SEQ ID NO:1のアミノ酸残基22～588、SEQ ID NO:18のアミノ酸残基22～589、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基23～572、もしくはSEQ ID NO:4のアミノ酸残基26～560に対して少なくとも60％、もしくは少なくとも70％、もしくは少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、もしくは少なくとも96％、もしくは少なくとも97％、もしくは少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを意味する。
「バリアント」という用語は、生物の遺伝物質における任意の変化、特に、野生型ポリヌクレオチド配列における変化(すなわち、欠失、置換、付加、もしくは変化)または野生型タンパク質配列における任意の変化を指す。「変異体」という用語は「バリアント」と同義で用いられる。遺伝物質の変化によってタンパク質の機能が変化すると想定されることが多いが、その変化がタンパク質の機能を変える(例えば、増加させる、減少させる、新たな機能を付与する)かどうかに関係なく、またはその変化がタンパク質の機能に影響を及ぼさない(例えば、変異またはバリエーションがサイレントである)かどうかに関係なく、「バリアント」および「変異体」という用語は野生型タンパク質の配列の変化を指す。変異という用語は、本願中の多型と本明細書において同義で用いられる。バリアントは、当技術分野において周知の方法を用いて単離または作製された、天然の、合成の、組換えの、または化学的に改変されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドでもよい。バリアントは、下記のように保存的アミノ酸変化または非保存的アミノ酸変化を含む場合がある。ポリヌクレオチド変化によって、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断が起こる場合がある。バリアントはまた、例えば、ヒトタンパク質中では通常起こらないオルニチンの挿入があるが、これに限定されない、バリアントの基礎であるペプチド配列中では通常起こらないアミノ酸および他の分子の挿入および置換を含むアミノ酸の挿入、欠失、または置換も含む場合がある。
「核酸」という用語は当技術分野において周知である。本明細書において使用する「核酸」とは、一般的に、核酸塩基を含む、DNA、RNA、またはその誘導体もしくは類似体の分子(すなわち、鎖)を指す。核酸塩基には、例えば、DNA中に見出される天然のプリン塩基もしくはピリミジン塩基(例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」、もしくはシトシン「C」)、またはRNA中に見出される天然のプリン塩基もしくはピリミジン塩基(例えば、A、G、ウラシル「U」、もしくはC)が含まれる。「核酸」という用語は「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、それぞれが「核酸」という用語の亜属である。「オリゴヌクレオチド」という用語は3～100核酸塩基長の分子を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、100核酸塩基長を超える少なくとも1つの分子を指す。「核酸」という用語はまた、デオキシリボ核酸(DNA)と、適切な場合はリボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドも指す。この用語はまた、同義語として、ヌクレオチド類似体から作られたRNAまたはDNAのいずれかの類似体、説明されている態様に適用可能な場合は、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されるはずである。「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語も本明細書において同義で用いられる。
本明細書において使用する「遺伝子」という用語は、エキソンと(任意で)イントロン配列を両方とも含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。「遺伝子」とは、遺伝子産物のコード配列、ならびに遺伝子産物の5’UTRおよび3’UTR領域、イントロン、ならびにプロモーターを含む遺伝子産物の非コード領域を指す。これらの定義は一般的に一本鎖分子を指すが、特定の態様では、一本鎖分子に部分的に、実質的に、または完全に相補的なさらなる鎖も包含する。従って、核酸は、二本鎖分子、または分子を構成する特定の配列の1つもしくは複数の相補鎖(complementary strand)もしくは「相補鎖(complement)」を含む二本鎖分子を包含することがある。本明細書において用いられる時、一本鎖核酸は接頭辞「ss」で表され、二本鎖核酸は接頭辞「ds」で表され、三本鎖核酸は「ts」で表されることがある。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するDNAセグメントを指す。「遺伝子」は、コード領域の前後にある領域ならびに個々のコーディングセグメント(エキソン)の間にある介在配列(イントロン)を含む。
「調節配列」という用語は、機能的に連結されている核酸配列の転写を調整する、従って、転写モジュレーターとして作用する、典型的にはDNAもしくはRNAまたはその類似体であるが、これに限定されない核酸のセグメントを指すために本明細書において「調節エレメント」と同義で用いられる。調節配列は、調節配列に機能的に連結されている遺伝子および/または核酸配列の発現を調整する。調節配列は「調節エレメント」を含むことが多く、「調節エレメント」とは、転写結合ドメインであり、かつ転写タンパク質および/もしくは転写因子の核酸結合ドメイン、リプレッサー、またはエンハンサーなどによって認識される核酸配列である。典型的な調節配列には、転写プロモーター、誘導性プロモーターおよび転写エレメント、転写を制御する任意の機能的配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および/または翻訳の終結を制御する配列が含まれるが、これに限定されない。調節配列は単一の調節配列または複数の調節配列でもよく、改変された調節配列またはその断片でもよい。改変された調節配列とは、例えば、変異、メチル化などがあるが、これに限定されないいくつかの手段によって核酸配列が変えられているか、または改変されている調節配列である。
本明細書において使用する「機能的に連結された」という用語は、核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列などのヌクレオチドの調節配列との機能的な関係を指す。例えば、核酸配列、典型的にDNAと調節配列またはプロモーター領域との機能的な連結とは、このようなDNAの転写が、DNAを特異的に認識し、結合し、転写するRNAポリメラーゼによって調節配列またはプロモーターから開始されるような、DNAと調節配列またはプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を指す。発現および/またはインビトロ転写を最適化するために、核酸またはDNAが発現される細胞タイプにおいて核酸またはDNAを発現するように調節配列を改変することが必要な場合がある。このような改変の望ましさ、すなわち必要性は経験的に確かめられ得る。エンハンサーは、エンハンサーによって転写が強化されるコード配列のすぐ近くに配置される必要はない。さらに、第2のプロモーターによって転写される因子によってトランスで調節されるプロモーターから転写される遺伝子は、第2のプロモーターに機能的に連結されていると言われることがある。このような場合、第1の遺伝子の転写は第1のプロモーターに機能的に連結されていると言われ、第2のプロモーターに機能的に連結されているとも言われる。
「プロモーター」とは、転写の開始および速度が制御される、核酸配列の領域である。「プロモーター」は、核酸配列の特異的転写を開始するために、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および調節分子が結合し得るエレメントを含有してもよい。
「エンハンサー」という用語は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す。エンハンサーはどちらの方向にも機能することができ、プロモーターの上流にあってもよく下流にあってもよい。
「機能的な」という用語は「バリアント」または「断片」と一緒に用いられる時には、前記ポリペプチドの生物学的活性に実質的に類似する、(機能的または構造的いずれかの)生物学的活性を有するポリペプチドを指し、これは、その機能的な誘導体、バリアント、または機能的断片である。機能的誘導体という用語は、分子の断片、類似体、または化学的誘導体を含むことが意図される。
この文脈において「実質的に類似する」という用語は、生物学的活性、例えば、受容体MISRIIの活性化が、参照ポリペプチド、例えば、対応する野生型MISポリペプチドの活性の25％または少なくとも35％、または少なくとも50％、好ましくは、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、100％、もしくはさらにそれより大きい(すなわち、バリアントまたは誘導体は野生型より大きな活性を有する)、例えば、110％、120％、またはそれより大きいことを意味する。別の言い方をすれば、この文脈においてMISタンパク質の「実質的に類似する」機能的断片は、対応する参照MISタンパク質(例えば、野生型MISタンパク質)の関連する、または望ましい生物学的活性の少なくとも25％、少なくとも35％、少なくとも50％が保持されていることを意味する。本明細書において開示されるMISタンパク質(例えば、SEQ ID NO:1、18、2、または4)の機能的断片またはペプチドの場合において、機能的断片は、MISRIIを活性化するための活性を保持する部分を含むタンパク質またはペプチドであろう。
「生物学的に活性なバリアント」または「生物学的に活性な断片」という用語は同義で用いられ、前記実体または分子の生物学的活性に実質的に類似する、(機能的または構造的いずれかの)生物学的活性を有する化合物を指し、これは、(例えば、野生型MISタンパク質)の機能的誘導体である。
「保存的置換」という用語はポリペプチドを説明する時には、ポリペプチドの活性を実質的に変えない、ポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。例えば、保存的置換とは、アミノ酸残基を、類似する化学的特性を有する異なるアミノ酸残基に置換することを指す。保存的アミノ酸置換には、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの交換、アスパラギン酸とグルタミン酸との交換、またはスレオニンとセリンとの交換が含まれる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸と、類似する構造的特性および/または化学的特性を有する別のアミノ酸との交換、例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの交換、アスパラギン酸とグルタミン酸との交換、またはスレオニンとセリンとの交換に起因する。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的置換」とは、ポリペプチド活性に重要でないアミノ酸の置換、または重要なアミノ酸を置換してもペプチドの活性が低下しないような、アミノ酸と、類似する特性(例えば、酸性、塩基性、正荷電または負荷電、極性または非極性など)を有する他のアミノ酸との置換を指す。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野において周知である。例えば、以下の6つのグループ:1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)はそれぞれが、互いの保存的置換であるアミノ酸を含んでいる(Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)も参照されたい)。
本明細書において使用する「非保存的置換」という用語は、アミノ酸残基を、異なる化学的特性を有する異なるアミノ酸残基に変えることを指す。非保存的置換には、アスパラギン酸(D)とグリシン(G)との交換;アスパラギン(N)とリジン(K)との交換;またはアラニン(A)とアルギニン(R)との交換が含まれるが、これに限定されない。
一部の態様において、変化によってMISタンパク質の活性が低下しなければ、1個のアミノ酸またはわずかなパーセントのアミノ酸を変えるか、付加するか、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加も「保存的置換」とみなすことができる。挿入または欠失は典型的に1～5アミノ酸の範囲である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチド内で置換しようとするアミノ酸の場所、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり、溶媒に対して露出している場合、または内側にあり、溶媒に対して露出していない場合に基づいて選択される場合がある。
「相同性」、「同一性」、および「類似性」という用語は、2つのペプチド間の、または2つの最適にアラインメントされた核酸分子間の配列類似性の程度を指す。相同性および同一性はそれぞれが、比較のためにアラインメントすることができる各配列中の位置を比較することによって求めることができる。例えば、これは、デフォルト位置で、BLASTなどの標準的な相同性ソフトウェアを使用することに基づいている。比較配列中の対応する位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められている時には、これらの分子はその位置で同一である。対応する部位が、類似するアミノ酸残基(例えば、立体的および/または電子的な性質の点で類似する、例えば、保存的アミノ酸置換)によって占められている時には、これらの分子はその位置で相同である(類似する)と呼ぶことができる。相同性/類似性または同一性のパーセントとしての表現は、それぞれ、比較配列によって共有される位置にある、類似するアミノ酸または同一のアミノ酸の数の関数を指す。「関連しない」または「非相同の」配列は、本明細書において開示される配列と40％未満の同一性を共有するが、好ましくは25％未満の同一性を共有する。
本明細書において使用する「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、(すなわち、ヌクレオチごとに、または残基ごとに)比較ウィンドウにわたって同一であることを意味する。「配列同一性パーセント」という用語は、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両配列中に、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、もしくはI)または残基が生じる位置の数を求め、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を、比較ウィンドウにある位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、その結果に100を掛けて配列同一性パーセントを得ることによって計算される。
本明細書において使用する「実質的な同一性」という用語は、少なくとも18ヌクレオチド(6アミノ酸)位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも24～48ヌクレオチド(8～16アミノ酸)位置のウィンドウにわたって参照配列と比較した時に、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％～95％の配列同一性、より通常は少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特徴を指し、配列同一性のパーセントは、比較ウィンドウにわたって参照配列を、総計して参照配列の20パーセント以下になる欠失または付加を含むことがある配列と比較することによって計算される。参照配列は、さらに大きな配列のサブセットでもよい。「類似性」という用語はポリペプチドを説明する時には、あるポリペプチドのアミノ酸配列および保存されたアミノ酸置換を第2のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。
本明細書において使用する「相同の」または「ホモログ」という用語は同義で用いられ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを説明するのに用いられる時には、2つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその指定された配列が、例えば、BLASTと、アラインメントのためのデフォルトパラメータを用いて最適にアラインメントおよび比較された場合に、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失またはアミノ酸挿入もしくは欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも70％において、通常、ヌクレオチドの75％～99％、より好ましくは少なくとも98～99％において同一であることを示す。本明細書において使用する「ホモログ」または「相同の」という用語はまた構造および/または機能に関する相同性も示す。配列相同性に関して、配列は、少なくとも50％、少なくとも60、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、少なくとも97％同一であるか、または少なくとも99％同一であればホモログである。本発明の遺伝子またはペプチドのホモログの判定は当業者によって容易に確かめることができる。
「実質的に相同の」という用語は、少なくとも90％、少なくとも95％同一の、少なくとも96％同一の、少なくとも97％同一の、少なくとも98％同一の、または少なくとも99％同一の配列を指す。相同配列は、異なる種における同じ機能的遺伝子である場合がある。本発明の遺伝子またはペプチドのホモログの判定は当業者によって容易に確かめることができる。
分子と別の分子が実質的に類似する構造を有するのであれば、または両分子が、類似する生物学的活性を有するのであれば、例えば、2つのMIS分子がMISRIIを活性化するか、または卵胞成熟を阻害できれば、分子は別の分子と「実質的に類似する」と言われる。従って、2つの分子が、類似する活性を有するのであれば、分子の一方の構造が他方に見出されなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくてもバリアントとみなされ、本明細書において開示される使用のために包含される。従って、2つの分子が、類似する生物学的活性を有するのであれば、分子の一方の構造が他方に見出されなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、この用語が本明細書において使用される時にはバリアントとみなされる。従って、MISタンパク質に対して類似性の程度は小さいが、同等の生物学的活性を有する核酸配列およびアミノ酸配列は等価だとみなされる。ポリヌクレオチド配列を決定する際に、実質的に類似するアミノ酸配列をコードすることができる、全ての本ポリヌクレオチド配列はコドン配列の違いに関係なく参照ポリヌクレオチド配列と実質的に類似するとみなされる。
「強化されたタンパク質分解安定性」とは、同じ条件下の(例えば、インビボ、または細胞もしくは細胞溶解産物などのインビトロ系における)対照配列と比較して、ペプチド配列のタンパク質分解の速度または程度が少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％低下していることを意味する。強化されたタンパク質分解安定性を有するペプチドは、特定の部位での、タンパク質分解切断を低下させるか、またはタンパク質分解切断を受けやすい部位を無くす任意の改変、例えば、挿入、欠失、または点変異を含有することがある。タンパク質分解切断部位は、公知の標的配列に基づいて、またはコンピュータソフトウェア(例えば、Gasteiger et al., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In John M. Walker, ed. The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)に記載のソフトウェア)を用いて特定され得る。または、タンパク質分解部位は、実験によって、例えば、細胞系または細胞溶解産物中での発現またはインキュベーション後のタンパク質のウエスタンブロットと、それに続く、切断部位を決定するための特定された断片の配列決定によって決定することができる。
核酸分子を説明するために本明細書において使用する「組換え」という用語は、その由来または操作によって、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成、および/または合成に由来するポリヌクレオチドを意味し、天然で結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する組換えという用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されたポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して使用する組換えという用語は、組換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞を意味する。組換えはまた、材料(例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクター)に関して、その材料が異種材料(例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクター)の導入によって改変されていることを指すために本明細書において用いられる。
「対象」という用語は非ヒト対象を指してもよく、ヒト対象を指してもよい。「非ヒト対象」は、本発明に従う組成物が提供される動物(例えば、子ネコまたは子イヌ)を指す。ある特定の態様において、動物は、哺乳動物、ネコ、イヌ、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物などがあるが、これに限定されない脊椎動物である。本明細書に記載の局面のある特定の態様において、対象はネコまたはイヌである。対象は雄でも雌でもよい。さらに,対象は成体でもよく、思春期前(例えば、子ネコまたは子イヌ)でもよい。
本明細書において使用する「投与する工程」、および「導入する工程」という用語は本明細書において同義で用いられ、本明細書において開示されるMISタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む組成物を、望ましい部位に少なくとも部分的に局在させる方法または経路によって、前記組成物を対象に配置することを指す。本発明の化合物は、対象において妊孕性を低下させる、および/もしくは思春期を阻止する、または思春期を遅延させる任意の適切な経路によって投与することができる。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、望ましい効果をもたらすのに十分な量の薬理学的組成物を指すために本明細書において同義に用いられる。本明細書において詳細に説明されるように、いかなる事例であっても、適切な「有効量」は当業者によって決定することができ、当業者によって判断することができる。
本明細書において使用する「阻止する」、「阻止する工程」および「阻止」という用語は、生物学的状態、症状、またはマーカー、例えば、思春期、発情期、または妊孕性の発現の回避または遅延を指す。「阻止する」、「阻止する工程」、および「阻止」という用語は、対照、未処置対象、または基準点における処置された対象の状態、症状、またはマーカーと比べた、生物学的状態、症状、またはマーカー(例えば、思春期、発情期、または妊孕性)の発現の回避または遅延を含む。「阻止する」、「阻止する工程」、および「阻止」という用語は回避または遅延を含むだけでなく、任意の生物学的状態、症状、またはマーカーの重篤度または程度の低下も含む。
思春期の遅延に関して本明細書において使用する「遅延させる」または「遅延させる工程」という用語は、対象における思春期が特定の期間にわたって延期または中止もしくは中断し、処置を止めた後に思春期が再開することを指す。
本明細書において使用する「低下させる」、「低下させる工程」、および「低下」という用語は、生物学的状態、症状、またはマーカーの重篤度または程度の低下を指す。「低下させる」、「低下させる工程」、および「低下」という用語は、対照、未処置対象、または基準点における処置された対象と比べた生物学的状態、症状、またはマーカー(例えば、思春期、発情期、または妊孕性)の重篤度または程度の低下を含む。
例えば、「低下させる」、「低下させる工程」、および「低下」とは統計的に有意な量の減少を意味し、状態、症状、または測定可能なマーカーの重篤度または程度が対照または参照と比べて少なくとも10％、例えば、少なくとも15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、90％～95％、90％～99％、10％～95％、10％～99％、または100％(すなわち、症状もしくは測定可能なマーカーがない)でさえ減少することを含む場合がある。
「組成物」または「薬学的組成物」は、通常、賦形剤、例えば、当技術分野において従来からあり、かつ細胞への投与に適している、薬学的に許容される担体を含有する組成物を指すために本明細書において同義に用いられる。例示的な組成物および薬学的組成物は本明細書において詳述される。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、適宜、哺乳動物に投与された時に、有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。
本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」という句は、本薬剤の活性を維持することに関与するか、または本薬剤を、ある臓器または身体の一部から別の臓器もしくは身体の一部に運搬もしくは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を意味する。本明細書において詳細に説明されるように、薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒の固体、半固体、または液体の増量剤、希釈剤、カプセル化材料、または製剤助剤を指す。この用語が本明細書において定義されるように「薬学的に許容される」ことに加えて、それぞれの担体は製剤の他の成分と適合するという意味でも「許容され」なければならない。
「ベクター」という用語は、「ベクター」に連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。プラスミドとは、「ベクター」に包含される属の一種である。ウイルスベクターとは、「ベクター」に包含される属の一種である。
「ウイルスベクター」という用語は、細胞への核酸構築物の担体としてのウイルスまたはウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、感染または細胞への形質導入のために、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、または単純ヘルペスウイルス(HSV)などのような非複製性の、欠損のあるウイルスゲノムに組み込まれ、パッケージされ得る。前記ベクターは細胞ゲノムに組み込まれてもよく、組み込まれなくてもよい。前記構築物は、所望であれば、トランスフェクションのためにウイルス配列を含んでもよい。または、前記構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、EPVおよびEBVベクターに組み込まれてもよい。
「誘導性ベクター」という用語は、遺伝子発現を制御することができるベクターを指す。例えば、遺伝子発現のレベルを増加させる、減少させる、またはゼロまで減らすことができる。一部の態様において、誘導性ベクターは、遺伝子発現を制御するスイッチを含んでもよい。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般的に、2標準偏差(2SD)以上の差を意味する。
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Merck Research Laboratoriesにより出版された「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」第19版, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Blackwell Science Ltd.VCH Publishers, Inc.により出版されたRobert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)に見られる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Jones & Bartlett Publishingにより出版された、Benjamin Lewin, Genes X, 2009 (ISBN-10: 0763766321); VCH Publishers, Inc. により出版されたKendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)、およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coliganら編にも見られる。
本開示は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されず、従って、変更してもよいことが理解されるはずである。本明細書において用いられる専門用語は特定の態様の説明のみを目的とし、本開示の範囲の限定を目的とせず、本開示の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
実施例1-成体雌ネコにおける長期非外科的避妊としてのAAV9-MIS遺伝子導入のパイロット研究
A.第一世代キメラネコMIS(fcMISv1)トランスジーンを用いたインビトロ研究、マウス研究、および成体ネコパイロット研究
ヒトMISトランスジーンを含有するAAV9ウイルスベクターを性成熟雌マウスに遺伝子送達すると、検出可能な副作用なく生涯にわたって避妊が誘導されることが示されている(WO2015/089321)。
材料および方法
第一世代キメラネコ（felis catus）MISトランスジーンであるfcMISv1(SEQ ID NO:3)を、コンセンサス食肉目配列を用いて完成させたネコゲノムバージョン8.0の部分的野生型MIS配列に基づいて合成した。この部分MIS配列は、受容体結合に関与しない、MISプロドメインのC末端にあるアミノ酸361～466をコードするGCリッチ領域に対応し、ネコゲノムバージョン9.0と比較した時に30のアミノ酸の違いを含むことが見出された(図1A)。本研究では、キメラネコMISトランスジーン(AAV9-fcMISv1)を含有するウイルスベクターを設計した。
組換えfcMISv1(SEQ ID NO:3)タンパク質およびFlagタグ付きバリアントをCHO細胞において産生し、その後に、精製した。CHO-K1(ATCC; # CCL-61)細胞を、5％FBSおよび1％ PenStrepを含むDMEM培養培地中で培養状態に保った。CHO-K1細胞をトランスフェクションのために6ウェルプレートにプレートした。80％コンフルエントになったら、CHO-K1細胞を、fcMISv1またはfcMISv2を発現するネコMISプラスミド(Genscript)でトランスフェクトした。合計で、5.1μgのプラスミドを各ウェルにおいて15.3μlのFugene6 (Promega、#E2691)(1:6の質量/体積比)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、同一のプレートをGFP発現プラスミド(PCDNA3-eGFP-N1)でトランスフェクトすることによって80％超になることが確認された。72時間後に培養コンディションドメディウムを採取し、泌尿生殖隆線退化アッセイ、ELISA、またはウエスタンブロットのために使用した。
マウスにおける実験は、マサチューセッツ総合病院(Massachusetts General Hospital)により承認された実験プロトコール2014N000275に従って、米国立衛生研究所とハーバードメディカルスクール動物実験委員会(Harvard Medical School Institutional Animal Care and Use Committee)により承認された6週齢Nu/Nuヌードマウス(Gnotobiotic Mouse Cox7 Core, Boston)を用いて行った。マウスを12時間明/12時間暗条件で飼育し、食物と水を自由に与えた。それぞれのマウスに、5e12vg/kg、1e13vg/kg、または5e12vg/kgのAAV9-fcMISv1または空のベクターの単回腹腔内(i.p.)注射を与えた。ベクター注射前と、その後毎週、マウス頬から血液を採取した。ベクター送達の1ヶ月後にマウスを安楽死させ、マウスの卵巣を収集し、ホルマリンで一晩固定した後にホルマリンに入れて標本にした。
ウエスタンブロットのために、新鮮な解剖マウス組織またはトランスフェクトされた細胞を、プロテアーゼインヒビターカクテルとPMSF(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を含むRIPA Lysis Buffer System 250μLに入れてホモジナイズし、11％振幅で15秒間、2回超音波処理し、20,800g、4℃で15分間遠心分離した。上清を採取し、タンパク質含有量を、Pierce BCA Protein Assay(ThermoFisher Scientific, Rockford, IL)を用いて測定した。50μgまたは100μgのタンパク質抽出物、4X試料緩衝液、およびRIPA緩衝液を用いて25μLの最終体積まで試料を調製し、Nupage 4-12％ Bis Tris 1.5mmゲル(ThermoFisher Scientific, Rockford, IL)において電気泳動した。タンパク質をNu-PAGE PVDF膜に転写し、5％乳で1時間ブロックした。5％乳に溶解した一次ヤギ抗MIS C末端抗体、MIS C-20(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)1:200の中で一晩インキュベートした後に、ロバ抗ヤギIgG HRP 1:2,000の中で1.5～2時間インキュベートした。ProSignal Dura ECL試薬を1～2分間適用し、膜を4分間曝露した。次いで、膜をはがし、乳の中で30分間ブロックし、ヤギ抗βアクチン(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)の中で2時間、ロバ抗ヤギ1:2,000の中で1.5～2時間インキュベートし、前と同じように画像化した。再度、膜をはがし、抗GAPDH抗体とインキュベートした。
雌ネコをAAV9-fcMISv1ベクターで処置した。本研究の0日目に、ケタミン/デクスメデトミジン組み合わせとアチパメゾールを用いた部分的逆転を用いてネコを麻酔した。単回注射(0.51～1.30ml総体積)を各個体の右尾側大腿筋肉に投与した。ネコをバイオセーフティレベル2(BSL-2)封じ込めの下で7日間、単独飼育した後に、群飼に戻した。
3匹の成体雌ネコに、5e12ベクター粒子(vp)/kgのAAV9-キメラネコMIS(AAV9-fcMISv1)を筋肉内注射した。表2は注射時の対象の体重と年齢を示す。大便、尿、直腸スワブ、および口腔スワブにおけるウイルス排出をウイルスゲノムqPCRによって評価した。
(表２)対象AAV9-キメラネコMIS
Figure 2024511413000016
場合によっては、以前に説明されたように(Saatcioglu et al, 2019)、RNAscope 2.5 HD Reagent Kit(RED, ACD Bio, # 322350)を用いてインサイチューハイブリダイゼーションを行った。ネコからの卵巣組織切片を、製造業者の説明書に従って、簡単に言うとキシレン脱パラフィンと熱誘導性エピトープ賦活化の後に、AMHおよびAMHR2を特定するように設計されたプローブとハイブリダイズさせた。次いで、組織を2時間ハイブリダイズさせ、標準的なシグナル増幅工程とクロモゲン発色のために処理した。最後に、スライドをヘマトキシリンによって対比染色し、風乾させ、EcoMountを用いてカバーガラスをかぶせた。
結果
キメラネコMISタンパク質(fcMISv1; SEQ ID NO:3)とflagタグ付きバージョン(flag-fcMISv1)は両方とも生物学的に活性であった。Flag-fcMISv1を発現させ、CHO細胞から精製し(図1B)、胎児ラット泌尿生殖隆線切片とインキュベートした。図1Dに示したように、flag-fcMISv1は、インビトロで胎児ラット泌尿生殖隆線においてミュラー管退化を誘導した。ヌードマウスにおいて、このタンパク質を、AAV9ベクターを用いて以下:(1)5e12vg/kgのAAV9-fcMISv1または(2)5e12vp/kgのAAV9-空の負の対照の通りに送達した。AAV9-fcMISv1ベクターからのfcMISv1(切断バージョンと非切断バージョンを両方とも含む;図1Cでは、それぞれ、MIScおよびプロMIS)の発現が処置マウスの四頭筋、体壁、腎臓、脾臓、膵臓、および肝臓において確認された(図1C)。図1Eに示したように、fcMISv1は50日目までに卵巣発育不全の誘導を証明したので(図1E)、インビボでも生物学的に活性であった。
しかしながら、5e12vg/kgのAAV9-fcMISv1で処置した雌ネコでは、キメラネコMISタンパク質は7日以内に急速に排出された。従って、炎症性マーカーであるC反応性タンパク質のレベルは7日目にピークに達したが、14日目までにベースラインに戻った。3匹全てのネコが血中に初期の高循環キメラネコMISタンパク質(7日目:6.44μg/ml+/-0.03)を示した。だが、2年の間に3匹のネコのうち2匹において発現は次第に失われた。これらの2匹のネコは血清MISレベルをμg/ml範囲で維持しなかった。さらに、処置して14日以内に高力価の抗MIS抗体を検出することができた(図1F～1H)。これは、おそらく、導入された配列ミスマッチの免疫原性のせいである。その一方で、MISを産生し続けたネコには卵巣機能抑制の証拠があった(図2)。
B.コドン最適化トランスジーンから発現させた野生型ネコMISタンパク質(fcMISv2)のインビトロ活性
材料および方法
野生型ネコMIS(wt-fcMISまたはfcMISv2; SEQ ID NO:1)を発現するAAV9ベクターをイエネコゲノムバージョン9.0に基づいて設計した(図3A)。ネコ翻訳と、効率的なウイルスパッケージングを可能にする低GC含量のためにコドン最適化トランスジーン(SEQ ID NO:5)を設計した。CHO細胞における産生および精製のためにFlagタグ付きバリアントも設計した(Flag-fcMISv2)。Flag-fcMISv2はプロMISの内因性活性化切断を阻害したが、MISN+C二量体を生成するようにインビトロでプラスミンによってプロセシングすることができた(図3B)。
CHO細胞およびウエスタンブロットに関連する材料および方法は、上記の実施例1.A.において説明された通りであった。
以前に説明されたように(Pepin 2013)、泌尿生殖隆線退化アッセイを行った。簡単に言うと、E14.5雌ラット胚泌尿生殖隆線を解剖し、寒天コーティングされたスチールグリッドの培地/空気境界面において培養状態にし、5μg/mlのヒトMISもしくはネコMISを含むコンディションドメディウムまたは負の対照としてモックによって、加湿5％CO2の中で37℃で72時間処理した。インキュベーション後に試料をザンボニ(Zamboni)緩衝液で固定し、ティッシュプロセッサーに入れて数工程で一晩脱水し、パラフィン包埋した。隆線切片(8μm)をヘマトキシリンとエオシンで染色した。次いで、2人の無関係の人物によって0(退化なし)～5(ミュラー管の完全退化)のスコアを付けた。
結果
精製されたFlag-fcMISv2と、酵素的に切断されたFlag-fcMISv2は両方とも、5μg/mlに調整された時に、胎児ラット泌尿生殖隆線バイオアッセイにおいて(5つのうち)グレード4へのミュラー管退化を誘導した(図3C)。安定したfcMISv2過剰発現を有するCHO細胞からの濃縮コンディションドメディウムも胎児ラット泌尿生殖隆線においてミュラー管退化を誘導した(図3C)。
C.AAV9-fcMISv2処置後のマウスにおけるMISレベルおよび活性
可能性のあるトランスジーン免疫原性を回避するために、ヌードマウスを用いた腹腔内注射でもAAV9-fcMISv2ベクターを評価した。
材料および方法
転写を強化するために、CMVエンハンサー、遍在性のニワトリβ-アクチンプロモーター、合成イントロン、および3’UTRを終結するためのウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナル(Gao et al, 2002)を用いることによってfcMISv2ベクター構築物をさらに最適化し、AAV9ウイルスベクター(AAV9-fcMISv2)にパッケージングした。AAV9血清型による筋肉組織への効率的な形質導入と、ネコにおける比較的少ない存在量のAAV9既存抗体(Adachi et al., 2020; Li et al., 2019)を考えて、この種にfcMISv2(SEQ ID NO:1)を送達するのに、このベクターを使用した。
それぞれのマウスに、5e12vg/kgもしくは1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2または5e12vg/kgの空のベクターの単回腹腔内(i.p.)注射を与えた。ベクター注射前と、その後毎週、マウス頬から血液を採取した。ベクター送達の1ヶ月後にマウスを安楽死させ、マウスの卵巣を収集し、ホルマリンで一晩固定した後に、ホルマリンに入れて標本にした。
マウスにおける卵胞数分析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋マウス卵巣を5ミクロンに連続切断し、以前に説明されたように卵胞定量のために、5枚の切片ごとに1枚の切片を保存した。ヘマトキシリン/エオシン染色の後に、スライドを一つ一つ写真撮影し、有核卵母細胞のある卵胞を定量した。1層の扁平顆粒膜細胞のある卵胞を原始卵胞とみなし、1層の立方顆粒膜細胞のある卵胞を一次卵胞とみなし、数層の立方顆粒膜細胞のある卵胞を二次卵胞とみなし、最後に、卵胞腔を示すものは三次卵胞または胞状卵胞とみなした。最終的な数の卵胞を得るためにファクターファイブを適用した。1群につき4～5匹のマウスから1つの卵巣を定量した。
結果
処置の1ヶ月後に、fcMISv2タンパク質(SEQ ID NO:1)は、四頭筋および体壁筋肉ならびに腹膜臓器、例えば、腎臓、脾臓、膵臓、および肝臓を含む、いくつかの組織において発現し、内因性プロテアーゼによって効率的に切断された(図3D)。5e12vg/kgまたは1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2による処置後に、形質導入された組織はMISタンパク質を循環中に分泌し、そして今度は、MISレベルを0.5μg/mlを超えて維持した。これは、マウスにおいて避妊を確かなものにするのに必要な0.25μg/ml標的レベルを上回る(Kano, 2017)(図3E)。5e12vg/kgまたは1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2で処置して1ヶ月後に、ヌードマウスの卵巣は既に、目に見える発育不全を示し(図3F)、卵胞成熟の全段階から卵胞数の有意な低下を示した(図3G)。
D.AAV9-fcMISv2で処置した成体雌ネコのパイロット研究
パイロット研究および結果の概要
ネコ生殖に対するAAV9-fcMISv2ベクターの効果をイエネコ(Felis silvestris catus)において研究した。成体雌ネコに、AAV9-wtネコMIS(AAV9-fcMISv2)または空のベクター対照を、以下:(1)高用量AAV9-fcMISv2(1e13vg/kg;n=3);(2)低用量AAV9-fcMISv2(5e12vg/kg;n=3);および(3)対照である空のベクター(5e12vp/kg;n=3)の通りに注射した。
処置の6ヶ月前から始めて3X/週採取した糞便試料から、エストラジオール(E2)およびプロゲステロン(P4)代謝産物を定量した。ネコを発情期の行動的徴候についてもモニタリングした。高用量群の1匹のネコが一過的な注射部位の浮腫を示した。他の注射部位反応は観察されなかった。他の点で、本研究全体を通して行った理学的検査、血液検査、および幸福評価は注目に値しなかった。注射後8ヶ月の観察研究の間に血清MIS濃度と抗トランスジーン抗体価をELISAによってモニタリングした。最初の8ヶ月観察期間の後にネコは4ヶ月繁殖トライアルにわたってモニタリングされ、妊娠が阻止されたかどうか確かめるために、ならびに持続するステロイド産生および卵巣タンパク質のレベルをモニタリングするために継続中の観察を受けた。
AAV9-fcMISv2で処置した全てのネコが交尾期間を含めて本研究全体を通して循環MISレベルを示した(図4)。全体的に見て、MISレベルは最初のうちは下がり、両処置群について観察した年にわたって安定したMIS発現レベルに達するように見えた。これは、AAV遺伝子導入後の持続性ウイルスゲノムからの発現の特徴的な安定化を反映している。MISの血清濃度は研究期間中に安定した状態で推移し、6ヶ月で、低い群では平均して2.88μg/ml+/-2.32であり、高い群では平均して11.78μg/ml+/-2.51であったのに対して対照では基底状態で推移した(5ng/ml+/-1)。この期間中に、AAV9-fcMISv2で処置したネコのいずれにおいても抗MIS抗体は検出されなかった。これらの結果とは対照的に、1回目のパイロット研究においてMIS遺伝子発現が消失した2匹のネコには、6ヶ月時点で58μg/ml±25の抗体価と0.07μg/ml±0.07のMISレベルがあった。
6匹の処置ネコのうち5匹が観察の最初の1年にわたって循環MIS濃度を1μg/mlを超えて維持した(図5Aおよび図5B)。1年の時点で、低用量(5e12vp/kg)群では、対象17LPY6の循環MIS濃度は3.34μg/mlであり、対象17LR06の循環MIS濃度は2.38μg/mlであり、対象17LRE4の循環濃度MISは0.82μg/mlであった(交尾期間中は1.65～0.82μg/ml)。高用量(1e13vp/kg)群では1年の時点で全てのネコの循環MIS濃度は高く、対象17LRI5は5.78μg/ml、対象17LRJ1は9.28μg/ml、対象17ERG2は5.36μg/mlであった。
図5A、5B、および5Cは、低用量のAAV9-wtネコMIS(5e12vp/kg、n=3)(図5A)、高用量のAAV9-wtネコMIS(1e13vp/kg、n=3)(図5B)、または対照である空のベクター粒子(5e12vp/kg、n=3)(図5C)で注射した後の、それぞれの成熟ネコにおける血清MIS濃度(μg/ml)(四角)および循環抗MIS抗体濃度(丸)の個々のプロファイルを経時的に示す。
AAV9-キメラネコMIS(AAV9-fcMISv1)を用いた1回目のパイロット研究とは対照的に、AAV9-野生型ネコMIS(AAV9-fcMISv2)は、ELISAによって試験した時に、どの処置ネコでもfcMISv2に対して検出可能な抗体を誘発しなかった。
卵巣機能抑制の証拠が、特に、低いE2/P4レベルとピークによって証明されたように高用量コホートにおいて観察された。低用量群および高用量群からの値をプールして、2つの期間:注射前6ヶ月対注射後6ヶ月の間で糞便E2代謝産物濃度の平均を比較した。分析から、注射後期間中に処置ネコではE2は対照(198.4ng/gm)と比べて有意に低下した(145.4ng/gm乾燥糞便)(p=0.048)ことが明らかになった。平均E2は注射前群間で差はなかった(P=0.262)。毎月発情期(E2>1.5xE2ベースラインがある2+の連続した糞便試料と定義される)の数は注射前または注射後のいずれにおいても群間で差はなかった(それぞれ、P=0.802、P=0.201)。しかしながら、処置ネコは発情期が注射前に対して注射後に少なくなる傾向があった(前:0.89;後:0.53;P=0.081)。
これらの結果に基づいて、4ヶ月繁殖トライアルを、9匹の雌と(8時間/日、5日/週)群飼した証明付きのブリーダー雄を用いて開始し、全ての繁殖のやり取りを記録するために連続してモニタリングした。以下の実施例1.E.を参照されたい。
材料および方法
ネコをシンシナティ動植物園(Cincinnati Zoo and Botanical Garden)の絶滅危惧野生動物保護研究センター(Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife)(CREW)にあるリサーチコロニーにおいて飼育した。全ての手順が動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(識別番号18-132)およびシンシナティ小児病院医療センターバイオセーフティ委員会(Cincinnati Children's Hospital Medical Center Institutional Biosafety Committee)(IBC 2018-0066)によって承認された。本研究において処置した全てのネコ(n=9)が、異なる雌親からの性的に無傷の雌であり、これにより研究集団間での遺伝的多様性が得られた。CREWに到着したら、環境と飼育員に慣れさせるために、関心対象のホルモンのベースラインレベルを確かめる目的で血液、糞便、および尿試料を採取するために、ならびに注射時にネコが性成熟していることを確かなものにするためにネコを数ヶ月間世話した。ネコを群飼し、市販のドライキャットフードを与え、新鮮な水を自由に飲めるようにした。繁殖トライアル中に使用した2匹の証明付きのブリーダー雄ネコ(2歳および13歳)を別々の部屋で単独飼育したが、他の点では同じ条件下で保った。研究登録前に、理学的検査および血液検査(全血球数(CBC)および血清生化学パネル)を行った。
成体雌ネコを、Microsoft Excelにある乱数発生器機能を用いて、これらの3つの処置群の1つに無作為に割り当てた。図6Aは研究デザインの模式図であり、表3は注射時の対象の年齢と体重を示す。
(表３)対象AAV9-wtネコMIS
Figure 2024511413000017
本研究の0日目に、ケタミン/デクスメデトミジン組み合わせとアチパメゾールを用いた部分的逆転を用いてネコを麻酔した。単回注射(0.51～1.30ml総体積)を一匹一匹のネコの右尾側大腿筋肉に投与した。ネコをバイオセーフティレベル2(BSL-2)封じ込めの下で7日間、単独飼育した後に、群飼に戻した。
最初の2週間の間に雌ネコを全般的な幸福について毎日評価した。有害事象は観察されなかった。理学的検査および血液検査を、処置の2週間前、0日目(MIS処置前)に行い、研究の1年目まで3ヶ月ごとに、その後は6ヶ月ごとに繰り返した。全ての結果が注目に値しなかった。注射部位を14日間毎日、次の2週間は毎週、次いで、その後は毎月調べた。1e13vg/kgのAAV9-fcMISv2を投与した群(すなわち、高用量群)の1匹のネコは3日目および4日目に注射部位に軽微な浮腫を示した。疼痛刺激行動、体温変化、または組織塊の形成の証拠は観察されず、浮腫は5日目までに消散した。他の注射部位反応は観察されなかった。
糞便および体液におけるウイルス排出を、フロリダ大学パウエル遺伝子治療センター毒物学コア(University of Florida Powell Gene Therapy Center Toxicology Core)において実施した定量PCRによって測定した。処置後7日の期間中にバイオレベルセーフティ-2ハウジングにおいて一匹一匹のネコから糞便試および尿試料を毎日採取した。口腔スワブを0日目(処置前)、2日目、7日目、および14日目に入手した。全血(頸静脈、橈側皮静脈、または外側伏在静脈)を、0日目(処置前)、2日目、21日目、28日目、その後は6ヶ月目まで採取してマイクロティナ(microtainer)EDTAチューブに入れた。糞便試料をプラスチックバッグに入れて密封した。尿、口腔スワブ、および血液試料を1.8mlクライオバイアルに移した。全試料を分析まで-20℃で保管した。
ネコMISタンパク質分析のために、静脈血試料を、0日目(処置前)、2日目、7日目、14日目、21日目、28日目、その後は2年目まで毎月、採取した。血液を採取して血清セパレーターチューブに入れ、約15分間凝固させ、1534gで10分間遠心分離した。回収した血清を1.8mlクライオバイアルに移し、分析まで-80℃で保管した。MISレベルを、AMH Gen II ELISA Ruo(Beckman Coulter, Miami, FL)を用いて測定した。簡単に言うと、ネコ血清を希釈剤で以下:全ての対照、0日目の低用量および0日目の高用量ネコ1:10;その後の低用量ネコ1:1000～1:500、対象17LRE4および例外では1:100;高用量ネコ1:2000～1:1000の通りに希釈した。ELISAの残りについては製造業者の説明書に従った。
抗体サンドイッチを用いることなくネコ血清中の抗fcMISv1/v2 IgGを測定するためにELISAアッセイを開発した。このELISAでは、コンディションドメディウムから組換えFLAGタグ付きfcMISv1(FLAG-fcMISv1)またはFLAGタグ付きfcMISv2(FLAG-fcMISv2)を精製した。FLAG-fcMISv1またはv2タンパク質(すなわち、捕獲タンパク質)を5μg/mlでELISAプレート(Immulon HB2 ELISA plate, Thermo Fisher Scientific, Rochester NY cat. 3455)に直接添加した。ELISAプレートを、ウサギ抗FLAG抗体を用いて固定化するのではなくFLAGタグ付きwtネコMISタンパク質で直接コーティングした。ウサギ抗FLAG抗体は、発生中の抗体との交差反応性により高バックグラウンドの源となる可能性がある。標準ウェルを、900ng/mlから始めてコーティング緩衝液(CB)で8回3倍希釈した全体分子ネコIgG(Rockland Antibodies and Assays, Limerick, PA cat. 002-0102-0002)でコーティングした。対照およびブランクウェルにはコーティング緩衝液だけを与えた(捕獲タンパク質の横列と対照の横列を交互に並べた)。次いで、プレートをRTで30分間、および4℃で一晩インキュベートした。2回のリンスを行い、プレートを、PBSTで溶解した200μL/ウェルの1％ウシ血清アルブミン(Jackson Laboratories cat. 001-000-162)+7.5％正常ヤギ血清(Abcam cat. Ab7481)で2.5時間ブロックした。試料をブロッキング緩衝液で100分の1に希釈し、添加し、プレートをRTで1時間インキュベートした。もう5回洗浄した後に、プレートを、PBSTで溶解したヤギ抗ネコIgG(H+L)HRP(Novus Biologicals cat. NBP73347)1:10,000と暗所で4℃で1時間インキュベートした。プレートを5回リンスし、酵素基質反応を行った。ホルモン代謝産物分析のために、糞便試料を、MIS処置の6ヶ月前から始めて処置の2年後まで、続けずに週3日採取した。群飼した雌からの糞便試料の特定を容易にするために、市販の食品用色素(Wilton Industries, Woodridge, IL, USA)および/または光沢材(Dixon Ticonderoga Company, Appleton, WI, USA)の独特の組み合わせを、少量の缶詰食品に入れて、それぞれのネコに試料採取日の前に毎日与えた。次いで、採取した糞便試料を用いて、色素の色または光沢材の存在によって、それぞれの一匹一匹のネコの身元を突き止めることができた。試料をプラスチックバッグに入れて密封し、名前と採取日を付けてラベルを貼り、処理まで-20℃で保管した。
糞便E2およびP4分析のために、糞便試料をプラスチックバッグに入れて凍結乾燥器(Labconoco Corp., Kansas City, MO, USA)によって凍結乾燥し、砕いて細粉にし、次いで秤量して(250±5mg)、ラベルを貼った15mlポリプロピレンコニカルチューブに入れた。次いで、2.5mlの90％エタノール(または1:10w:v)を添加することで、各試料をメカニカルロッカーで一晩(≧12時間)抽出した。次いで、抽出した試料を1000gで15分間遠心分離し、上清をピペットで取り出し、試料を2.0mlクライオバイアルに入れて分析まで-20℃で保管した。全ての酵素イムノアッセイ(EIA)の手順を、以前に公表された方法から変更した。エストロゲン(E2)を確かめるために、17β-エストラジオールに対して作製したポリクローナル抗体(R0008)を西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)リガンドと一緒に使用した。これに対して、プロゲストゲン(P4)を定量するために、Arbor Assays P4 mini-kit (ISWE003, Arbor Assays, Ann Arbor, MI, USA)を使用した。このキットは両抗体とHRPを備えた。両アッセイとも、このラボにおいて以前に用いられたことがあり、イエネコでの使用について検証されたことがある。両アッセイについて試料と標準を2回繰り返して分析した。
糞便ホルモン代謝産物の統計解析のために、処置前6ヶ月のサンプリング期間に基づいて、それぞれの雌のホルモンベースライン値を計算した。データをR statistical package hormLongを用いて分析した。一匹一匹のベースラインE2およびP4値を、平均+1.5標準偏差を超えた全ての点を除いて反復プロセスを用いて計算した。発情期は、E2値がベースラインの1.5倍を超える2つ以上の連続した糞便試料と定義した。黄体期は、P4値がベースラインの1.5倍を超える6つ以上の連続した糞便試料と定義した。2つの期間:処置前6ヶ月対2ヶ月の処置後移行期後の処置後22ヶ月の間で発情期の数、黄体期の数、および糞便代謝産物濃度の平均を比較した。妊娠および授乳の期間を分析から除外した。それぞれのサンプリング期間中の異なる時間の長さを説明するために、発情期を1ヶ月期間中の発情期の数(発情期の総数/サンプリング期間中の日数x30日)として報告し、黄体期を6ヶ月期間中の黄体期の数(黄体期の総数/サンプリング期間中の日数x180日)として報告した。データを乱塊法配置(randomized complete block design)としてANOVAを用いて分析した。この場合、期間および処置群(ならびにその交互作用)は固定効果であり、個々の動物を変量効果(ブロック(block))として含める。ペアワイズ比較のためにチューキーの多重平均比較検定(Tukey’s multiple mean comparison test)を使用した。分析を、SAS(登録商標) Studio software (Release: 3.8, Enterprise Edition, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて行った。
血清LH分析のために、希釈された血清試料(1:5)を、Graham et al., Zoo Biol, 20:227-236(2001)から変更した二重抗体EIAを利用して分析した。NIH-ウシLH標準、対照、および試料をプレートウェルに2回繰り返して添加した。一晩インキュベートした後に、ビオチン化NIH-ヒツジLHを全てのウェルに添加し、室温で4時間競合させた。次いで、競合後にプレートをストレプトアビジン-ペルオキシダーゼとインキュベートした。ネコ血清に対するEIAを、プール血清の希釈度と検量線との間の類似を証明することによって検証した。さらに、ウシLH(標準に使用した)をネコ血清試料に添加し、用量反応曲線を作成した。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は3.5％および8％であった。
血清LHの統計解析のために、血清LH試料を、3つの群:処置前/移行(処置直前～2ヶ月の移行期間;前/移行)、処置後早期(3～8ヶ月目、後早期)、および処置後後期(15～20ヶ月目、後後期)に分けた。これらの群は、繁殖トライアル、またはその後の妊娠および授乳の間のサンプリング期間を回避するために選択された。分析はSAS(登録商標) Studio software, Release: 3.8を用いて行った。処置ネコ対非処置ネコにおける時間(試料)間の血清LH変化を、MIXEDプロシージャの中で、一般化線形混合効果モデルと、固定効果として処置、時間(3つのレベル:前/移行、後早期、および後後期)、ならびに処置x時間の交互作用とランダムブロックとしてネコ(個体)を用いて、サタスウェイト自由度補正(Satterthwaite adjustment for degrees of freedom)を用いて評価した。チューキーの多重平均比較検定を使用して各処置群内での時間レベルを比較した。P<0.05の時に有意差を宣言した。
血中のインヒビンB分析のために、インヒビンBを、Cat INHB-B ELISA Kit (Mybiosource.com, San Diego, CA)を用いて測定した。無希釈ネコ血清試料を、製造業者のプロトコールを用いてアッセイした。
結果
ウイルスゲノムは血中に2日目に検出され、2ヶ月間、高い状態で推移した後、3～4ヶ月期間で急速に減少した。これは、無細胞DNAを放出する感染細胞ターンオーバー(例えば、肝臓細胞)を反映している可能性が高い(図7A)。ウイルス排出は尿中に1日目に検出され、7日間にわたって絶え間なく減少したのに対して、口腔スワブおよび大便試料における測定は個体間および群間でばらつきを示した(図7B～7D)。
循環MISレベルは最初のうちは強かったが、1年目の間に徐々に減少し、最終的に2年目には相対的なプラトーに達し、0.5μg/mlを超えたままであった(図7E～7G)。5e12vg/kgのAAV9-fcMISv2で処置した群(すなわち、低用量群)にいた1匹の処置ネコである対象17LRE4の循環MISレベルは、平均して1回目の交尾トライアル中に0.93μg/ml、2回目の交尾トライアル中に0.61μg/mlと最も低かった(図7E)。興味深いことに、対象17LRE4のウイルスゲノムも対象17LRE4の群にいる他のネコと比較して2日目までに1/100になった。このことから、誤注射または既存のベクター免疫が示唆される(図7E)。
重要なことに、fcMISv1で観察された強い抗トランスジーン抗体応答とは異なり(図1F～1H)、抗fcMISv2抗体は、AAV9-fcMISv2を与えたどのネコでも、直接捕獲ELISAを用いてバックグラウンドを超えて検出されなかった(図7E～G)。
以前に観察されたように、マウスではAAV9-MIS処置と完全な卵巣機能抑制との間には約1ヶ月の遅延があり、これは、成長している既存の卵胞のコホートが成熟を完了し、卵巣から除去されるのに必要な時間に対応している可能性が高い(Kano et al., 2019, 2017)。処置の最初の3ヶ月と注射後期間の残りの間にネコ生殖ホルモンを測定し、比較した。測定したホルモンは、下垂体フィードバックホルモンである黄体ホルモン(LH)(図6C)と、成長中の卵胞のマーカーであるインヒビンB(図6D)であった。
血清LHの平均を、3つの期間:(1)処置直前～2ヶ月の移行期間(前/移行)、(2)処置後早期(3～8ヶ月;後早期)、および処置後後期(15～20ヶ月;後後期)にわたって計算した。分析から、対照ネコでは、どの期間でもLHに差はなかったことが明らかになった。しかしながら、AAV9-MIS処置ネコでは、LHは両方の処置後期間において前/移行と比較して上昇した(P=0.0008、後早期;P=0.0036後後期)(表4;図6E)。処置ネコでは後早期の期間と後後期の期間との間に差はなかった。
(表４)血清LH
Figure 2024511413000018
データを平均(SEM)で示した。
逆に、インヒビンBは高用量群では全期間中に有意に低下した(図6D～6E)。これらのプロファイルから、特に高用量における高ゴナドトロピン性性腺機能低下が示唆される。
注射の6ヶ月前から研究終了(2年)まで週3回の糞便試料において糞便エストラジオール(E2)およびプロゲステロン(P4)を測定した(図8A～8Iおよび表5)。処置前に全ての雌において生殖周期性が確認された。マウスではAAV9-fcMISv2処置と完全な卵巣機能抑制との間には約1ヶ月の遅延があり、これは、既に発達している卵胞が完全に成熟し、卵巣から除去されるのに必要な時間に対応している可能性が高い(Kano et al., 2019, 2017; Meinsohn et al., 2021)。ネコにおけるMISによる卵巣機能抑制のタイミングは不確かであるが、MIS処置と効果の間に2ヶ月の遅延が推定される。従って、糞便E2およびP4代謝産物濃度の平均を、処置前6ヶ月と、2ヶ月の移行期後の処置後22ヶ月とで比較した(図6F)。対照では処置後の観察および繁殖期間の間にE2の有意な増加が観察された(P=0.0008)。低用量または高用量AAV9-fcMISv2群では期間の間で差は観察されなかった。処置後、高用量群においてP4代謝産物濃度の平均は低下した(P=0.0029)。低用量群は下向きになったが(P=0.0986)、対照群は時点の間で差はなかった。
(表５)糞便E2およびP4プロファイル
Figure 2024511413000019
データを平均(SEM)で示した。**はP<0.01を示す。
糞便E2およびP4レベルを使用して、発情期および黄体期のタイミングを推測した(図6F、9Aおよび9B、表6)。処置前6ヶ月と処置後24ヶ月(2ヶ月の移行期を除く)との間で1ヶ月あたりの発情期の頻度と6ヶ月あたりの黄体の頻度を比較した。どの群についても発情期頻度の差は観察されなかった(図6G)。黄体期頻度は高用量AAV9-fcMISv2群では低下したが(P=0.0263)、低用量群でも対照でも低下しなかった(図6G)。
血清LHの平均を、2つの期間:MIS処置前および2ヶ月の移行期間中に採取した試料(前/移行)と、処置後に採取した試料(繁殖トライアル、妊娠、および授乳期間を除く。Tx後)において計算した。2つの処置群からのデータをプールした。分析から、対照ネコではLHに差はなかったことが明らかになった(図6E)。しかしながら、MIS処置ネコではTx後のLHは前/移行のLHよりも有意に大きかった(P=0.0001)。
(表６)発情期および黄体期の評価
Figure 2024511413000020
データを平均(SEM)で示した。*はp>0.05を示す。
E.リピートブリーディングの延長
材料および方法
リピートブリーディング研究では、証明付きのブリーダー雄ネコを、9匹のAAV-MIS研究用雌(3匹の対照、6匹のAAV-MIS処置)がいる群飼室に移した。融合を容易にするために、雄を部屋の中で前もって、管理して雌にさらした(キャットキャリアに入れて飼育した)。雄を4ヶ月間連続して週5日、1日8時間、雌と一緒に飼育した。繁殖活動を直接観察とリモートオーディオ/ビデオモニタリングの組み合わせによって記録に残した。妊娠状態(すなわち、胎児の存在および生存)を確認するために、毎週、それぞれの雌を腹部触診と超音波検査によって評価した。最小限の拘束または妨害で、これらの手順を自発的に受け入れるように全ての雌に事前のオペラント条件付けを与えた。胎児の発達と生存をモニタリングするために3週間ごとに超音波検査によって、妊娠した雌を再評価した。雌を妊娠約50日目まで群飼のままにし、次いで、後の自然分娩(典型的に、繁殖後、約63～65日目)のための個別のケージングのある出産部屋に移した。妊娠した雌を、飼育員が毎日直接、予想された分娩時間まで、インターネットでアクセス可能なビデオカメラリンケージを介してリモートでモニタリングした。
ベクターで処置して8ヶ月後および20ヶ月後の時点で(図6A)、それぞれのトライアルについて異なる証明付きのブリーダー雄を用いて2回の4ヶ月繁殖トライアルを開始した。この雄を9匹の雌と8時間/日、5日/週、群飼し、全ての繁殖のやり取りを記録するために連続してビデオモニタリングした。妊娠状態を評価するために毎週の経腹壁超音波検査を行った。やり取りをビデオレビューによって評価し、繁殖成功(挿入と、雌からの適切な応答と定義した)または繁殖試行(雄が雌にマウンティングしようと試みる、または挿入なしでマウンティングすることに成功することと定義した)としてスコア付けした。やり取りについて、それぞれの雌の身元を動物飼育スタッフの一員が確認した。
本実施例では、「ブリーディングバウト(breeding bout)」とは、連続した反復性の繁殖行動期間と定義される。「ブリーディングバウト」は、クイーン(queen)が雄と首尾良く繁殖した(1日またはいくつかの連続した日)からなる。「ブリーディングバウト」とは、典型的に、雌が雄を受け入れる、ある発情期の期間であるが、まれに、本当に長いブリーディングバウトとなる長期の発情期(すなわち、8日以上)または複数の重複する発情期がある場合がある。例えば、対象17LRJ1では、33日にわたって約125回の確認された繁殖行動からなる典型的ではないブリーディングバウトが観察された。
繁殖トライアルの統計解析のために、帰無仮説が処置間の一様分布である等質性のカイ二乗検定を用いて、それぞれの繁殖トライアル内の処置間で繁殖した雌の数、ブリーディングバウトの総数、繁殖後の黄体期の数、妊娠した雌の数、および産まれた子ネコの総数を比較した。SAS(登録商標) Studio software(リリース:3.8, Enterprise Edition, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて分析を行った。
結果
両トライアルについて、全ての対照雌が最初のブリーディングバウトの後に妊娠した(表7および表9)。対照は、それぞれの同腹仔で2～4匹の健常子ネコを産んだ。対照的に、AAV9-MIS処置雌は、どちらのトライアル中にも出産せず、毎週の超音波検査で胎嚢も胎児も観察されなかった。
(表７)AAV9-fcMIS処置ネコ 対 対照における繁殖活動、排卵、および妊娠発生
Figure 2024511413000021
*それぞれの繁殖トライアルの中で対照と処置との間に差があった(P<0.05)
AAV9-MIS処置ネコのうち2匹がトライアル中に繁殖活動を示した(表7および表10)。対象17LRJ1(高用量AAV9-fcMISv2)は、それぞれのトライアル中に1回のブリーディングバウトを許した。対象17LRE4(低用量AAV9-fcMISv2)は、1回目のトライアル中に6回のブリーディングバウトを許し、2回目のトライアル中に1回のブリーディングバウトを許した。どのバウトの後でも、糞便ホルモン分析において黄体期は検出されなかった(表7)。他のAAV9-MIS処置雌から繁殖行動は観察されなかった。
等質性のカイ二乗検定を用いて、繁殖を許した雌の数の間にも、ブリーディングバウトの総数の間にも差は見られなかった。ブリーディングバウトに続く黄体期の数(P=0.0498)、妊娠した雌の数(P=0.0498)、および産まれた子ネコの総数(P<0.0001;表7)に有意差があった。
雄の導入が発情期中のE2レベルに影響を及ぼしたかどうか確かめるために、交尾期間中の糞便ペレットにおけるE2ピークを、雌が雄と同棲していなかった処置前期間中の糞便ペレットにおけるE2ピークと比較した。E2ピークの有意な増加は、雄を導入した後の対照ネコにのみ見出された(表8)。
(表８)交尾研究中のエストラジオールピーク
Figure 2024511413000022
データを(SEM)で表した
処置済み雌から子ネコは産まれなかったのでMISの母体-胎児伝播は評価しなかった。しかしながら、対照雌から産まれた雄子ネコの参照値は254ng/ml±72と確かめられた(図9D)。
(表９)1回目の繁殖トライアル
Figure 2024511413000023
Figure 2024511413000024
S:繁殖成功、A:繁殖未遂
(表１０)2回目の繁殖トライアル
Figure 2024511413000025
S:繁殖成功
A:繁殖未遂
*繁殖成功は、01/04/21(1)、01/13/21(1)、および01/14/21(2)にも見られた。発情期ピークは01/09/21に検出された(だが、妊娠中に発生したのでピーク分析から除外された)。
F.考察
マウスにAAV9を腹腔内投与すると主に骨格筋および肝臓細胞への形質導入が起こり、そして今度は、その骨格筋および肝臓細胞が、卵巣に全身送達するためのMISを分泌するインビボバイオリアクターとして働く(Kano et al., 2017)。ネコでは、サンプリングの初期の間のMISレベルは、相対的なプラトーに達するまで、急減する濃度の進展を経時的に辿った。この急激な低下は、最初の3ヶ月もわたって血中に観察されたウイルスゲノムの供給源でもあり得る短命の形質導入細胞(例えば、肝臓細胞)のターンオーバーが原因である可能性があり、fcMISv2トランスジーンの長期発現を維持する長命の筋肉繊維からの均衡の取れた分泌の増加によって相殺された。従って、トランスジーンを避妊薬レベルで一生涯産生するには筋肉向性ウイルスベクターが有益であり得ると仮定した。
AAV9-fcMISv2処置ネコでは、排卵が無いことを強く示唆するP4レベルと黄体期の有意な減少が観察された。しかしながら、インヒビンBの比較的わずかな低下が観察されたのに対してE2レベルに差はなかった。これらのデータは、循環インヒビンBを有意に減少させ、周期を阻害したが、E2レベルをベースラインのほぼ半分に維持したAAV9-MIS処置マウスにおいて以前に証明された前胞状卵胞の成熟阻害と一致する(Kano et al., 2017)。後の研究から、MISによる顆粒膜細胞分化の阻害に起因する前胞状卵胞成熟の失速が証明された(Meinsohn et al., 2021)。従って、このことから、排卵できない未熟卵胞のプールが処置動物において維持され、E2を産生し続けることが示唆される。このことは、これらの療法によってエストロゲンレベルが抑制されない可能性があり、従って、周期が無い状態でホルモン健康状態を維持できる可能性があることを意味するので、ヒトにおける避妊薬としての組換えMISまたはMISR2アゴニストの使用に重要な意味を持つ。
本実施例では避妊効果の開始のタイミングを直接試験しなかったが、避妊は処置の8ヶ月後に観察された。AAV9-fcMISv2処置ネコのホルモンプロファイルから、生殖ホルモンのほとんどの変化は3ヶ月までに安定することが分かる。このことはMISの避妊効果の可能性のある上限を示唆している。マウスにおいても同様に、AAV9-LRMISで処置し、証明付きの雄ブリーダーとつがいになった成体雌は最初の30日間は妊娠可能であったが、その後は不妊のままであった(Kano et al., 2019, 2017)。
興味深いことに、対照雌は処置後期間中に有意なE2上昇を示した(図6E)。この期間は、去勢されていない雄との8ヶ月の同棲を含んだ。ヒツジでは、去勢されていない雄を、季節的に発情していない雌に導入する社会性的刺激によってLHサージと排卵を誘導することができるラム効果(ram effect)がよく説明されている(Martin et al., 1986)。つい最近、LHサージはE2分泌の増加に起因することが示された(Fabre-Nys et al., 2015)。雄の存在によって雌の血清E2が急増し、思春期が加速するファンデンベルグ効果(Vandenbergh effect)がマウスにおいて最もよく説明されているが、いくつかの他のげっ歯類ならびにブタおよびウシを含む他の種でも起こる((deCatanzaro, 2015)によって概説されている)。同様の現象がネコでも記録に残されており、雄の非交尾的な存在によって自然排卵の割合を増加させることができる(Gudermuth et al., 1997)。従って、対照雌において観察されたE2増加は、雄が近くにいた効果に起因するかもしれない。両処置群とも、軽微だが有意でないE2増加を示した(図6E)。このことから、AAV9-fcMISv2処置は、この応答を減らした可能性があると示唆される。
以前に卵巣切除された雌ネコでは卵巣由来E2からの負のフィードバックの欠如が原因でLHが増加した(Bateman et al., 2017; Concannon et al., 1989; Johnson and Gay, 1981; Rohlertz et al., 2012)。E2は糞便ホルモンデータに基づいて抑制されているように見えなかったが、MIS処置ネコにおけるLH上昇(図6C)は、ある程度の卵巣機能障害を示唆している。糞便試料中の連続したE2上昇を評価することによって発情期の頻度が確かめられた時に、対照と比較してMIS処置ネコにおける差は観察されなかった(図6F)。しかしながら、マウンティングと性交を許す雌によって発情期が行動的に定義された時には、処置の効果をはっきりと観察することができる。3匹全ての対照雌が両方の雄と繰り返し交尾したが、6匹のMIS処置雌のうち4匹は両繁殖トライアル中にブリーダー雄による交尾試行ごとに拒絶した(表7および表10)。雌の間のつがいの選択が繁殖活動に影響を及ぼした可能性があるが、(大きく異なる表現型と年齢の)2匹の異なるブリーダー雄の使用と、両方の雄に対する無作為に割り当てられた対照雌の一貫した受容性は、そのことが主な要因であることを否定する。
卵巣子宮摘出に代わるものとしてAAV9-fcMISv2ベクターによる避妊が提唱されたので、保持された生殖器官の長期健康状態は重要な考慮すべき事項である。嚢胞状子宮内膜増殖症-子宮留膿症複合疾患は、無傷の雌ネコにおいて、臨床上の重要性があり、かつ潜在的に命にかかわる疾患である。卵巣ホルモンが発病に寄与し、P4が主な役割を果たしている。この疾患は、子宮内膜の過形成、子宮内膜腺の嚢状拡張、子宮炎症、および膿性分泌を特徴とする(Agudelo, 2005)。全体の発生率は不明である。しかしながら、選択的卵巣子宮摘出(elective ovariohysterectomy)のために提出している、臨床的に健常なネコに由来する106の生殖器系の組織病理学を評価した研究から、21個(約20％)に嚢胞状子宮内膜増殖症、2個(約2％)に子宮留膿症が検出された(Binder et al., 2019)。
本研究における6匹の処置済み雌は約3年前(2019年3月)にAAV9-fcMISv2注射を受けた。3ヶ月ごとに行った理学的検査および経腹壁超音波と6ヶ月ごとに評価した血液検査から、どの雌の全身血液パラメータにも嚢胞状子宮内膜増殖症-子宮留膿症の証拠も異常の証拠も見出されなかった。これらの雌はまだ無傷であるので、評価に利用可能な子宮病理組織学的データはない。しかしながら、パイロット研究中にAAV9-fcMISv1で処置した3匹の雌を、処置して40ヶ月後(9～10歳)に卵巣摘出し、組織学的に調べた。1匹の雌(対象11WBL25)がfcMISv1タンパク質(SEQ ID NO:3)に対して最小限の抗体を産生し、血清MISタンパク質レベルを、標的レベル(0.50μg/ml)を上回って保持した(図1F～1H)。その雌の生殖器系は正常な子宮内膜と、原始卵胞しか含まない静止状態の卵巣を示した(図2)。対照的に、最も高い抗fcMISv1抗体レベルと最も低い血清MISレベルのあった雌(対象11WBL24)の組織学的分析から、複数の黄体(この雌は一度も雄と一緒に飼育しなかったので自然排卵を示している)と嚢胞状子宮内膜増殖症が示された(図1F～1Hおよび2)。これらのデータから、高MISが無傷の雌において自然排卵を阻止することで子宮健康状態に対して保護効果をもたらす可能性があることが示唆される。
このMISによって誘導される保護の1つの重要な局面は、非妊娠黄体期に起こるような長期P4曝露の低下である可能性が高い。高用量群では、処置後に平均P4レベルと自然排卵が両方とも有意に低下した(図6E～6F)。自然排卵は、雄と直接接触していない群飼した雌ネコでは高率(>80％)で起こることがあり(Gudermuth et al., 1997)、子宮内膜に及ぼす長期のP4影響によって嚢胞状子宮内膜増殖症-子宮留膿症複合疾患に寄与する可能性がある。一症例研究では、炎症性子宮疾患または不妊について評価したネコの45％には、調査時の自然排卵に起因する活発な黄体があった(Lawler et al., 1991)。
同様に、2回の繁殖トライアルにおいて証明されたように、自然繁殖によって誘導される黄体期の発生を高MISレベルが阻害するように見える(表9～10)。
血清MISレベルがAAV9-fcMISv2用量反応の関係性を反映しているが(低用量ネコよりも高用量の値の方が約2倍大きい)(図9C)、繁殖誘導性排卵の阻害は両用量群において観察された。繁殖を許した、低い群の1匹の雌(対象17LRE4)には、それぞれのトライアル中に最も低いMISレベルがあった(トライアル1の場合は0.92μg/ml、トライアル2の場合は0.61μg/ml)。しかしながら、両MIS値とも、マウスにおける完全避妊に必要な0.25μg/ml閾値の2倍である0.50μg/mlを上回ったままであった(Kano et al., 2017)。対照的に、繁殖を許した高処置群の1匹の雌(対象17LRJ1)には、一貫して高い血清MISがあった(図9C)。2回目の繁殖トライアル中に、このネコの4.0μg/mlという平均MISレベルは、125回の記録に残された性交で構成される典型的ではない33日のブリーディングバウトと同時に起きた(表10)。比較のために、3匹の対照雌には、同じトライアル中に4.3(0.7)日続くバウトにおいて平均(SE)24.7(9.9)の繁殖成功があった。
これらの知見から、AAV9-fcMISv2処置後に、糞便P4濃度が全体的に減少し、自然排卵が低下し、性交誘導性排卵が完全に阻害されることが立証される。LHサージまたはLHサージの障害そのものに応答して卵胞が成熟を完了できず、排卵できないことで、これらの生殖変化が引き起こされるのかどうかは不明のままである。(基底LHが高い)卵巣子宮摘出されたネコは性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)処置後でもLHサージを発生することができる。このことから、下垂体は繁殖誘導性ホルモン刺激に依然として応答することが示唆される。しかしながら、他の研究では、高MISと共に起こることがあるように、主として低濃度のE2に起因して、発情期初期(1日目)での繁殖がLHサージを誘導する可能性は低い(約43％排卵率)ことが示されている。行動発情期のタイミングは卵胞発達の最終段階と比べて一定でない場合があるが、行動発情期に必要なE2閾値は、完全に成熟した卵胞によって産生されるものより低いように見える(Shille et al., 1979)。従って、持続性のE2上昇が、排卵反射を伴って性交に応答するように視床下部および/または下垂体を刺激するのに重要な必要条件であり(Banks and Stabenfeldt, 1982)、高いMIS濃度によって損なわれている可能性がある。
まとめると、これらのデータは、成体ネコにおける長続きする避妊薬としてのAAV9-fcMISv2の使用を支持する。継続した長期のトランスジーン発現がさらに調べられる必要があるが、低用量(5e12vg/kg)群および(1e13vg/kg)高用量群において2年の時点で避妊範囲以上のままである。さらに、MISで処置した成体ネコ(上記の実施例1.D.)で毒性は認められなかった。成体ネコにおける避妊のための遺伝子療法において証明されたMIS濃度(図7E～7F)および雄の新生仔ネコにおけるMIS濃度(0.5μg/ml; 図9D)は同じ桁の範囲内にある。この範囲の内因性MIS濃度は、男の赤ん坊を含む他の哺乳動物の種でも観察されている(Lee et al., 1997)。
興味深いことに、MISは下垂体ゴナドトロピンを調節してLH/FSH比を増やす可能性があることも示されている(Cimino et al., 2016; Garrel et al., 2016; Tata et al., 2018)。AAV9-fcMISv2処置ネコは、高ゴナドトロピン性性腺機能低下と一致する、初期のLH減少と、それに続く高いベースラインレベル(図6Cおよび6E)を示した。しかしながら、超物質的なMISが、主に、マウスにおいてゴナドトロピン非依存性の原始段階および初期前胞状段階で卵胞を阻害することを考えると、ゴナドトロピン調節が避妊にどのように寄与し得るかは不明である。全体的に見て、黄体期、P4レベル、交尾行動の観察された低下と受胎の欠如から、MISは、排卵段階への卵胞成熟をブロックすることによって排卵を阻止するが、卵巣ホルモンを産生できる卵胞プールを維持するという仮説が強く支持される。さらに、このホルモンデータから、抑制が軽度であり(E2、およびインヒビンBによる)、発情期および交尾事象が記録された低用量群の動物でも不妊であったことを考えると、MISによる完全な卵巣機能抑制は避妊に必要でないことが示唆される。
G.参考文献
Figure 2024511413000026
Figure 2024511413000027
Figure 2024511413000028
Figure 2024511413000029
Figure 2024511413000030
実施例2-MIS送達用のベクター設計
本実施例は、ネコおよびイヌにおけるMIS最適発現のためのベクター設計の取り組みについて説明する。fcMISv2タンパク質(SEQ ID NO:1)およびclMISタンパク質(SEQ ID NO:2)を以下の通りに改変した。(1)リーダー配列をヒトアルブミンリーダー配列と交換し、(2)MIS切断部位の中にあるグルタミン(Q)をアルギニン(R)と交換した。このようなリーダーおよび切断部位(「LR」)が改変されたfcMISv2ならびにLRが改変されたclMISトランスジーンを操作し、pcDNA3.1ベクターおよびpAAVベクターの両方にクローニングした。LR-fcMISv2トランスジーンのタンパク質配列はSEQ ID NO:14であり、LR-clMISトランスジーンのタンパク質配列はSEQ ID NO:15である。
A.CHO細胞およびCOS7細胞におけるLRベクター改変の効果
材料および方法
CHO細胞に関連する材料および方法は、上記の実施例1.A.に記載された通りである。
COS7細胞(アフリカミドリザル腎臓細胞株; American Type Culture Collection, Manassas, VA)を、37℃の加湿5％CO2インキュベーターに入れて、10％胎仔ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたDMEM中で培養した。COS7細胞を、(ウシMISを低下させるために)1％雌胎仔ウシ血清(FFBS)を含むDMEMが入っている6ウェル培養皿(Corning Life Sciences)にプレートし、fcMISv2、LR-fcMISv2、clMIS、またはLR-clMISを含有するpcDNA3.1発現プラスミドで、Fugene6(Promega)(1:6の質量/体積比)を用いて製造業者の説明書に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、同一のプレートをGFP発現プラスミド(PCDNA3-eGFP-N1)でトランスフェクトすることによって80％超になることが確認された。72時間後にコンディションドメディウムを採取し、ウエスタンブロット分析に使用した。
CHO細胞またはCOS7細胞を、fcMISv2またはclMISトランスジーンを含有するpcDNA3.1またはpAAVベクターでトランスフェクトした。一過的な、および安定したCHOクローンを使用して、fcMISv2(SEQ ID NO:1)、LR-fcMISv2(SEQ ID NO:14)、clMIS(SEQ ID NO:2)、およびLR-clMIS(SEQ ID NO:15)の転写物レベル、タンパク質レベル、および切断比を比較した。細胞、トランスフェクション、およびウエスタンブロットに関連する材料および方法は、上記の実施例1.A.に記載の通りであった。ELISAに関連する材料および方法は、上記の実施例1.D.に記載の通りであった。
結果
一過的にトランスフェクトされたCHO細胞では、LR-fcMISv2で48時間、条件付けされたCHO培地は、fcMISv2を産生するCHOクローンからの培地(図10; Fc-MIS 3dcsf 培地)と比較して、強力に切断された成熟MISバンドがある非常に高いレベルの切断を有した(図10; LR-Fc-MIS 48h)。この切断比は、精製ヒト組換えタンパク質(図10; LR-MIS 25ng)、FLAGタグ付きマウスMISまたはF-mmMIS(図10; MF-MIS 25ng切断)、LR-mmMIS コンディションドメディウム(図10; LR-MM-MIS)、および精製前のfcMISv2産生CHOクローン無血清培地(図10; Fc-MIS 3dcsf培地)、ならびにpCDNA-LR-fcMISv2(図10; LR-Fc-MIS 48h)、pCDNA-clMIS(図10; CL-MIS 48h)、およびpCDNA-LR-clMIS(図10; LR-CL-MIS 48h)をコードするpCDNA3.1プラスミドによる一過的トランスフェクション後に48時間、条件付けされたCHO細胞培地を含む、ウエスタンブロット上に存在する対象間で比較することができる。これは、ここで対照として示したヒトおよびマウストランスジーンにおいて観察された効果を再現する。同様に、clMISは大部分がインタクトであったが、LR-clMISはほぼ完全に切断された。これらのデータから、(1)LR改変によってタンパク質切断と種間の活性化が容易になり、(2)改変されていないトランスジーン、特に、イヌclMISはCHO細胞によって十分に切断されないという仮説が裏付けられる。
一定でない切断比がCHO細胞またはベクター(pcDNA3.1対pAAV-CB6-PI;図10)の人為的結果でないことを確かなものにするために、COS7細胞を用いて実験を繰り返した(図13)。COS7細胞でも、pcDNAベースのベクターからの強力なMIS発現が観察された(図13)。この場合でも、LRベース構築物からのMISの切断が非LRバリアントと比較され、LRベース構築物において切断強化が観察された(図11)。これらのデータから、活性化切断を強化するためのLR改変の使用が強く裏付けられる。RT-qPCRによって比較した時に、様々な構築物が比較的類似するレベルまで転写されたので、観察された切断効果は完全に翻訳後であるように見える(図12)。
最後に、生物学的活性を比較するために、組換えタンパク質をラット泌尿生殖隆線バイオアッセイにおいて評価した。安定にトランスフェクトされたCHOクローンを用いて、MISタンパク質の発現があるかどうかクローンをELISAによってスクリーニングした。高タンパク質発現を示したクローンを生産培養物において使用した。生産培養物からの培地を採取し、5μg/mlの総タンパク質濃度まで濃縮した。濃度をELISA値に基づいて調整した。ELISAは、場合によっては、起こり得る検出バイアス(以下の実施例2.Eにおいて議論される)に起因して非LRバリアントにおけるタンパク質の総量を過小評価することがあるので、LR改変と切断増加によって成し遂げられる効能増加の観察も過小評価される可能性がある。データから、安定した高発現CHOクローンがfcMISv2およびclMISのLRバリアントの切断強化を再現したことが証明される(図13A)。これは、ミュラー管退化を0～5にスコア付けするラット泌尿生殖隆線アッセイにおける活性増加につながった(図13B)。全体的に見て、これらのデータから、本実施例において議論されたトランスジーンは全て生物学的活性があったことが証明される。
B.マウスにおけるキャプシド血清型およびトランスジーン改変
ベクター活性のベンチマークを参照ベクターとしてAAV9-fcMISv2を用いて定めた。このベンチマークを用いると、当業者は無数のベクター間で比較を行うことが可能になり、結果を、同じウイルスバッチを用いたネコにおいて観察された結果にあてはめて推定することが可能になる。
材料および方法
CHO細胞ならびにマウスにおける実験に関連する材料および方法は、上記の実施例1.A.に記載の通りであった。マウスにおける卵胞数に関連する材料および方法は、上記の実施例1.C.に記載の通りであった。本実施例では、ベクターを注射によってマウスに投与し、概して実施例1.A.に記載のようにマウス実験を行った。投与して30日後にマウス卵巣を回収した。完全切片化および卵胞総数を、少なくとも2人の無関係の盲検観察者が卵巣切片に対して行った。
結果
マウスに投与した最初の2つのAAV9-fcMISv2濃度は5e12vg/kgおよび1e13vg/kgであり、ネコにおいて使用した濃度と同じであった。これらの濃度で、卵胞形成が用量非依存的に、おそらく、高用量のMISにおける飽和効果に起因して抑制された(図3G)。
キャプシド間およびトランスジーン間の活性を比較するために、非飽和用量のベクターを次回の実験において使用した。前記ベクターの抑制効果に対する改善を定量できるように、AAV9-fcMISv2を用いて用量反応実験を行った。AAV9-fcMISv2ベクターを1E10、1E11、5e11、および1e12vg/kgで投与した。成長中の卵胞の抑制において用量反応効果が観察され(図14)、1e11vg/kgは、部分的であるが強力な抑制をもつ、可能性のある用量であった。血中で高いMIS濃度につながるように、将来のウイルス試験では、この1e11vg/kg用量が使用され得る。
C.マウスにおけるAAV9-LR-clMIS活性
イヌを処置することを見越して、AAV9-clMISまたはAAV9-LR-clMISをマウスにいて活性があるかどうか試験した。本実施例の材料および方法は、上記の実施例2.A.および2.Bに記載の通りであった。両ベクターともマウスにおいて高用量(1e13vg/kg)で卵巣機能抑制することができた。血中に検出された低い発現にもかかわらず(図16;以下の実施例2.D.)、LR-clMISは、この用量で、AAV9-fcMISv2に匹敵する強力な抑制効果を示した(図15A～15D)。1e13vg/kgはイヌにおける高ベクター用量として、場合によっては、抑制効果を飽和させるのに十分に高いレベルのMISをもたらすのに使用され得る。
D.マウスにおけるネコMISレベルおよびイヌMISレベル
材料および方法
マウス実験に関連する材料および方法は、上記の実施例2.B.に記載の通りであった。ELISA法は、以下のようにBeckman AMH Gen II ELISAキットの代わりにAnsh Labs AMH ELISAキット(Ansh Labsカタログ番号AL-105)を使用したことを除けば上記の実施例1.D.に記載のように行った。
結果
5e12vg/kgのAAV9-clMISおよびAAV9-LR-clMISベクターによって、予想より低い、すなわち、100～200ng/ml範囲のMIS濃度が生じた。この実験を、さらに高い1e13vg/kgのベクター濃度を用いて繰り返した。またしても、AAV9-clMISについてはマウスにおけるMISレベルは予想より低かった(図16)。しかしながら、AAV9-LR-clMISについてはMIS濃度は、改変されていないAAV9-clMISのほぼ2倍であった。このデータによれば、イヌトランスジーンの翻訳プロセシングおよび翻訳後プロセシングはネコトランスジーンのプロセシングよりも低効率であるように見える。しかしながら、MISプロセシングはLR改変の導入によって改善し、そのため、循環MISはネコおよびイヌにおいて想定される避妊範囲内になる。
さらに、Ansh Labs ELISAはネコMISとイヌMISを両方とも検出でき、結果は概して(上記の実施例1.D.に上述した)Beckman ELISAと同等であったので、Ansh Labs ELISAを血中MISレベルの後の分析において使用した。
E.組織タイプ間のウイルス感染性
材料および方法
細胞、マウス、トランスフェクション、およびウエスタンブロットに関連する材料および方法は、上記の実施例2.A.に記載の通りであった。
結果
様々なベクター間で一定でない血清中MIS検出が、(ウイルス感染性に影響を及ぼす可能性がある)ウイルスバッチ品質の差によるものではなかったことを確かなものにするために、異なる組織におけるベクターDNAの存在を比較した。マウス四頭筋(図17Aの「筋肉」)および肝臓に由来する組織を、fcMISv2(SEQ ID NO:1)、LR-fcMISv2(SEQ ID NO:14)、clMIS(SEQ ID NO:2)、およびLR-clMIS(SEQ ID NO:15)を発現するベクターで処置して30日後に分析した。一般的に、全てのベクターについて組織中に等量のベクターDNAが存在した。肝臓には他のベクターと比較して過剰量のAAV9-fcMISv2ベクターDNAが見出されたが(図17A～17B)、DNA量は、あまりにも少なすぎて、ELISAによって測定した時の循環MIS中に観察された差を説明できない桁であった。従って、ベクターおよび/またはウイルス調製物の品質が動物におけるMISレベルに影響を及ぼす可能性があると認められた。
AAV9-fcMISv2、AAV9-LR-fcMISv2、AAV9-clMIS、またはAAV9-LR-clMISで処置したマウスに由来する標的組織(肝臓組織および筋肉組織)におけるMISの分泌および切断を評価した。使用した2つのベクター濃度は5e12vg/kgおよび1e13vg/kgであった。ウエスタンブロットにおいてマウス溶解産物と適合するかどうか、いくつかの抗体を評価した。1つの抗体、LSBioウサギ抗AMHはウエスタンブロットにおいて信頼性をもってMISを検出することができたが、AAV9-fcMISv2またはAAV9-LR-fcMISv2が高用量で存在した組織、すなわち、肝臓に高濃度のベクターがある条件で検出することができた。このウエスタンブロットは、肝臓においてfcMISv2(SEQ ID NO:1)およびLR-fcMISv2(SEQ ID NO:14)が両方ともclMISおよびLR-clMISよりも高レベルで産生されていることと一致する。さらに、肝臓ではLR-fcMISv2バリアント(SEQ ID NO:14)の切断はfcMISv2(SEQ ID NO:1)の切断を上回った(図18)。
ネコMISとイヌMISの切断比は血中でELISAによって定量することができる。切断比の分析によって、インビボでのLR改変の利益に関する情報と、本明細書に記載の筋肉向性ベクターにおいて特に重要であり得る、LR改変トランスジーンを効率的に切断する筋肉細胞の能力を得ることができる。
F.筋肉向性ベクターの評価
本実施例は、細胞ターンオーバー速度が遅い細胞タイプを感染させるとMISトランスジーンの長期産生が促進されるかどうか確かめる研究について説明する。例えば、一般的に筋肉細胞のターンオーバー速度は肝臓細胞よりも遅い。
材料および方法
AAV.MYOおよびAAV9.HR筋肉向性ベクターを使用してfcMISv2を送達した。5e12vg/kgのベクターをi.p.注射でヌードマウスに投与した。マウス実験に関連する材料および方法は、実施例1.A.に記載の通りであった。
結果
AAV.MYO-fcMISv2とAAV9.HR-fcMISv2筋肉向性ベクターは両方ともAAV9-fcMISv2よりも低い血清MISレベルを生じた(図19)。
実施例3-子ネコが思春期に入らないように阻止するための、および長期不妊を提供するためのAAV-wtネコMIS処置の有効性
G.ネコ(子ネコ)の思春期を阻止する
多数の動物シェルターは引き取りの前に子ネコを8週齢と早い段階で外科的に卵巣摘出または去勢する。勧告では、約5月齢に達する前に子ネコを外科的に卵巣摘出または去勢しなければならないことが示唆されている。しかしながら、思春期前子ネコ(および子イヌ)における、増加するMISレベルの長期的な発達上の影響は分かっていない。にもかかわらず、ネコ(子ネコ)における遺伝子送達を介したMIS処置が思春期を阻止する能力ならびに他の任意の関連する発達上の影響を評価した。さらに、子ネコにおける妊孕性の長期低下のために、および/または子ネコが思春期に入らないように阻止するために単回注射として与えた時にAAV-wtネコMISを使用するためのパラメータを評価した。例として、本研究はまた、ヒト対象において思春期を遅延させるための、遺伝子送達またはMISタンパク質送達を介したMIS処置を評価するための非ヒト動物モデルとしても役立つ。
材料および方法
本実施例において使用した子ネコおよびウイルス調製物は、上記の実施例1.D.および1.E.に記載のように繁殖研究において作製した。
子ネコにAAV-wtネコMIS(AAV9-fcMISv2)を注射するタイミングは分娩および離乳のタイミングに左右された。健常子ネコを8週齢までに離乳させた。約3月齢(例えば、10～12週齢)の健常子ネコ(例えば、9匹の雌、3匹の雄)を無作為化して対照と処置群にした。子ネコの尾側大腿筋肉に、AAV9-fcMISv2または空のベクター対照を以下:(1)高用量AAV9-fcMISv2(1e13vg/kg、例えば、3匹の雌および1匹の雄);(2)低用量AAV9-fcMISv2(5e12vg/kg、例えば、4匹の雌および1匹の雄);ならびに(3)対照である空のベクター(5e12vp/kg、例えば、2匹の雌および1匹の雄)の通りに筋肉内注射した。表11は子ネコのサンプリングおよびモニタリングの予定表を示す。
(表１１)子ネコモニタリングの予定表
Figure 2024511413000031
子ネコをケージの中で5日間飼育し(同じ処置群/ケージから2～3匹の子ネコ)、次いで、さらなるモニタリングのためにシングルグループエンクロージャ(single group enclosure)に移した。この期間中に、ウイルス排出を評価するために、群飼した子ネコから、プールした糞便および尿試料ならびに個々の口腔スワブを毎日採取した。ウイルス排出を分析するために、個々の血液、混合尿、混合糞便、および個々の口腔スワブの中にあるウイルスゲノムのqPCRをモニタリングした。注射後7日目、その月の残り期間は毎週、最初の1カ月の後は毎月、血液をサンプリングした。尿、糞便、および口腔スワブを最初の1週間、毎日採取した。
食用色素をキャットフードと混合し、注射の2週間前から始め、注射後9ヶ月間(例えば、約1歳)続けて、それぞれの一匹一匹の子ネコに別々に(週3回)与えた。同じ処置群に由来する子ネコを一緒に飼育したので、思春期および生殖成熟の開始を確かめるためにエストロゲンおよびプロゲステロン代謝産物(雌)またはテストステロン代謝産物(雄)があるかどうか糞便試料を評価した。実施例1.D.において上述したように、染料/ネコ専用の食用色素および/または光沢材をキャットフードと混合し、ネコ特有の糞便の特定を容易にするために一匹一匹のネコに別々に与えた。子ネコの体重を注射の2週間前から始めて1歳まで毎週測定した。
血清MIS、インヒビンB、抗MIS抗体、およびLH濃度を評価するために、注射の直前から始めて全血試料(1ml、最小)を、それぞれの子ネコから採取した(1X/月)。処置された子ネコおよび対照子ネコの両方について注射後7日目、14日目、21日目、および28日目に追加の血液試料を採取した。
安全性モニタリングは身体全体の健康の毎日評価と注射部位の定期評価(14日間は毎日、2ヶ月目まで毎週、次いで、その後は毎月)を含んだ。理学的検査およびCBC/生化学評価を、注射直前に、次いで1歳まで3ヶ月ごとに行った。
全ての子ネコの出生後の健康状態を思春期までの発育全体を通してモニタリングした。ビデオと直接観察を用いて行動発情期の徴候があるかどうか子ネコを評価した。未処置の子ネコが4～6ヶ月の間に思春期に入る可能性があるので、研究は10ヶ月まで続いた。10月齢までに発情周期のあるネコの徴候がなければフォローアップ繁殖研究を考慮に入れた。
糞便試料中の性ステロイドE2およびP4を測定した。糞便試料を凍結乾燥し、E2およびP4抽出のために処理した。雌の糞便ホルモン分析は、基底エストロゲンの経時的な漸増と、発情期と同時発生するエストロゲンスパイクの発生に基づいて卵巣周期性を示すことで思春期の証拠を示した。若い雌は典型的に自然排卵せず、従って、糞便プロゲステロンは情報を提供しない場合があるが、雌子ネコは年をとるにつれて自然排卵する能力を獲得するように見える場合がある。そのため、1年期間の終わりに近づくにつれて黄体期を回復する可能性がある。
雌の場合、経腹壁超音波を毎月行い、子宮角測定値を記録した。可能な限り分岐部の近くで、それぞれの子宮角に対して測定を行った。最も広い直径と最も狭い直径を測定し、2で割って、長軸および短軸を求めた。楕円として面積を計算し(πx長軸x短軸)、ある子宮角の平均面積(mm2)として報告した。
雄の場合、糞便テストステロンの上昇は思春期の指標であり、陰茎棘の存在と精子産生によって実証された。処置後3ヶ月毎に、標準化された電気射精プロトコールを用いた精液採取の試みのためにケタミン-デクスメデトミジンの組み合わせを用いて雄の子ネコを麻酔した。回収された試料を、精子の存在、体液の体積、精子濃度、運動率、および形態について評価した。精巣の寸法および陰茎の形態(すなわち、棘の存在)も評価した。
雄および雌の子ネコを1歳まで群飼するので、何らかの繁殖活動が後の方の月で、特に対照ネコの間で起こるかもしれない。6月齢から始めて、妊娠状態を確認するために腹部超音波検査によって雌を毎週評価した。ネコ間の、あらゆる観察された繁殖活動を記録に残す。
結果
本研究において使用した(実施例1.E.に記載のように以前に調製した)調製ウイルスは有効なことが確認された。子ネコの循環MIS濃度の平均を4ヶ月の時点で測定した。低用量群、すなわち、5e12vg/kgでは循環MIS濃度は12.93μg/mlであった。高用量群、すなわち、1e13vg/kgでは循環MIS濃度は18.49μg/mlであった。対照群では循環MIS濃度は8.36ng/mlであった。これらの値は、平均して低用量では3.48μg/ml、高用量では15.17μg/mlであった成体ネコにおいて同じ時点で測定したものより高かった。この強く、安定したトランスジーン発現は、子ネコの成長中に筋肉細胞が持続して、かつ比例して増加して寄与することに起因するのかもしれない(図20)。対照では、予想通り、内因性MISが若い子ネコ、特に雄では多く、雄が性的に成熟するにつれて低ng/mlレベルまでゆっくりと低下した。若い子ネコにおけるインヒビンBレベルは、このパターンの高MIS発現と、それに続く低下を反映すると予想された。しかしながら、MISとは対照的にインヒビンBの有意な増加が観察された。この増加は思春期と関連し、インヒビンBレベルは成体において維持された。初期分析から、処置後、最初の1ヶ月の間(約7月齢)に、特に、対照動物においてインヒビンBのわずかな低下が観察することができ、その後に、子ネコが思春期に近づくと予想される処置4ヶ月後(約10月齢)まで、わずかな増加が観察することができると示唆された(図21A～21B)。思春期中の継続中のモニタリングは、対照または低用量と比較して早すぎる相対的誘導を有するように見えた雌高用量群におけるホルモン、特にインヒビンBに対するMIS効果の情報を提供する(図21A)。
さらに、fcMISv2を発現するベクターを与えた子ネコに由来する血液試料において抗MIS抗体の有意な産生は観察されなかった(図22)。対照的に、1回目のパイロット研究の間にAAV9-fcMISv1を与えた対象11WBL24は同じ時間枠にわたって強力な抗MIS抗体誘導を示した(図22)。
雌子ネコに対するfcMISv2の効果を研究した。雌子ネコからの糞便P4レベルは経時的に徐々に増加した(図23A～C)。このP4増加は生殖成熟についての情報を提供する可能性がある。図23A～Cの3匹全ての子ネコ、対象M200586、M200667、およびM200756は同腹子であり、比較的同期に成熟すると予想された。思春期前ネコのP4値は、排卵と一緒に観察されるものよりかなり低く、その期間は正常黄体期よりかなり長かった。以前の研究では思春期を経ているネコにおけるP4変化は記録に残されていない。このP4上昇は思春期の開始を示しているかもしれない。これらの同じ3匹のネコ(対象M200586、M200667、およびM200756)を対象にした、(発情期を示す)糞便エストロゲンピークのさらなる特徴付けは、これらのネコの少なくとも一部が生殖周期性を示しているか示していないかを知らせる可能性がある。これらの結果および雌コホートの残りのプロファイルは保留中である。
5e12vg/kg AAV9-fcMISv2(低)、1e13vg/kg AAV9-fcMISv2(高)、または5e12vp/kgのAAV9-空のベクター(対照)で処置した後に処置済み雌ネコにおいて子宮角測定を行った。高用量または低用量のAAV9-fcMISv2(図24A～25B)で処置したネコでは子宮角面積の低下が観察された。このことは本研究の時間枠にわたるネコにおける避妊を示している可能性がある。処置6ヶ月後に(すなわち、ネコが約9月齢の時に)対照ネコと処置ネコとの間に子宮角面積の差はなかった。しかしながら、経時的には、対照ネコでは子宮面積がわずかに増加するように見えたのに対して、処置ネコはわずかな減少を示した。これらの結果は、対照雌には活発な周期があり、おそらく排卵しており、これが子宮腺の増殖と退化につながったのに対して、処置ネコがこれらの周期変化を示していなかった(卵巣機能抑制を示唆する)ことを示しているのかもしれない。対照の平均値の大きなSEMは、対照の子宮面積が経時的にかなり変化することを示しているのに対して、処置済み雌は個体間で面積がほとんど変動しないことを示す。糞便ホルモンアッセイは(完了時に)、子宮面積変化と卵巣ホルモンプロファイルとの間の関係により多くの洞察を提供するはずである。
雄子ネコに対するfcMISv2の効果も研究した。雄子ネコである対象21LRS71および21LRS72において低用量および高用量のAAV9-fcMISv2(すなわち、それぞれ、5e12vg/kgおよび1e13vg/kg)は両方とも8月齢まで精子数を有意に低下させず、性成熟が完了するにつれて、これらのパラメータは改善し続けた(表12)。さらに、雄子ネコの精子は、イエネコ卵母細胞を用いたIVM/IVFトライアルにおいて評価した時に完全に機能した(表13)。対照的に、対照雄ネコ(対象21LRS73)は、5月齢までに正しく成熟しているように見え、3匹の雄のうち最も大きな精巣と、完全に形成された包皮空洞と特徴的な陰茎棘(テストステロン産生を示す)を伴ったが、意味のある数の精子を産生しなかった。インビトロで妊孕性を評価するために対象21LRS73から十分でない量の運動性精子を採取した。対象21LRS73の不妊の原因は不明であったが、AAV9処置の結果だと想定されなかった。
対象21LRS71および21LRS72において精子数はAAV9-fcMISv2処置による悪影響を受けなかった。実際に、精子数と精子濃度は対照対象21LRS73において観察されたものより多かった(表13)。AAV9-fcMIMSv2処置ネコにおける、これらの増加は予想外であった。本実施例において開示されるデータから、絶滅の危機に瀕している動物または稀少動物の人工授精のための精子採取方法などの、精子数および/または精子濃度の増加が望ましい場合があるシナリオにおけるAAV9-fcMISv2の使用が支持される。
(表１２)AAV9-fcMISv2遺伝子療法による思春期前処置後の雄子ネコの生殖成熟
Figure 2024511413000032
Figure 2024511413000033
(表１３)AAV9-fcMISv2で思春期前に処置した雄子ネコにおいて精子機能を評価するためのインビトロ卵母細胞成熟/受精
Figure 2024511413000034
H.フォローアップ繁殖研究
材料および方法
1つまたは複数のフォローアップ繁殖研究を考慮に入れた。例えば、10月齢までに発情周期を有するネコの徴候がなければ、および/または本実施例の上記に示した期間中に雌が繁殖および/または妊娠をしなかったら、その後の繁殖トライアルは、証明付きのブリーダー雄を用いて保証されることがある。
一般的に、この繁殖研究のための材料および方法は、上記の実施例1.E.に記載の通りであり、以下の変更を加えた。この繁殖研究では、証明付きのブリーダー雄ネコ、対象18IDG51を、6匹のAAV9-fcMISv2研究用雌(1匹の対照、5匹のAAV-MIS処置)がいる群飼室に移した。ネコはMarshall BioResourcesから入手した。2番目の証明付きのブリーダー雄、対象17CCW45を、CREWで産まれた3匹のAAV9-fcMISv2雌(1匹の対照、2匹の処置)(対象18IDG51が父親となった)がいる2番目の部屋に移した。繁殖トライアルの開始に至るまでの週で、融合を容易にするために、両方の雄を、それぞれの部屋の中で管理して雌にさらした(キャットキャリアに入れて飼育した)。次いで、それぞれの雄を4ヶ月間連続して週5日(月曜日～金曜日)、1日8時間(8am～4pm)、それぞれの雌と一緒に飼育した。
初日にネコを初めて引き合わせた後に、ネコのやり取りをモニタリングし、雄と雌との間で過度の攻撃が起こらないことを確かなものにするためにネコの飼育員は部屋に10分間留まった。飼育員は部屋から出た後、ネコ部屋の窓を通して追加のモニタリング(約5分)を行い、次いで、初日を通して定期的に(30～60分ごと)、その週の残りでモニタリングを行った。初回の直接曝露中にネコの間で、雄または雌に対して軽い身体的外傷(例えば、引っ掻き傷)を含む何らかの攻撃が予想された。ネコがどの攻撃者からでも逃げることができるように、部屋の中に安全な避難空間(例えば、ドアのないキャットキャリア、キャットコンド、および棚)が利用できた。重大な、および/または連続した闘争反応は飼育員による介入とネコの物理的隔離を必要とした。飼育員は、外傷のどんな証拠でもネコを毎日評価し、獣医スタッフは、必要に応じて医学的処置を提供した。ネコの飼育員はネココロニーの他の場所で作業している時に1日を通してネコ部屋からの発声(繁殖活動または攻撃に関連する)を聞くためにリモートベビーモニターを使用した。それぞれのネコ部屋にある2台のビデオカメラが1日を通して(8am～4pm)連続して動物やり取りを記録した。可能性のあるどの繁殖活動も特定するために、全てのビデオ映像をCREWボランティアが確認した。これらの観察は、排卵および/または受胎とならなかった繁殖活動の発生を記録に残すのに、ならびにどの妊娠したネコについても予想される分娩データを確かめるのに役立った。ネコの飼育員が観察したどの繁殖活動も日誌に記録し、後でビデオレビューができるように雌の身元と時刻を書き留めた。
妊娠状態(すなわち、胎児の存在および生存)を確認するために、毎週、それぞれの雌を腹部触診と超音波検査によって評価した。最小限の拘束または妨害で、これらの手順を自発的に受け入れるように全ての雌に事前のオペラント条件付けを与えた。
胎児の発達と生存をモニタリングするために3週間ごとに超音波検査によって、どの妊娠した雌も再評価した。雌を妊娠約50日目まで群飼のままにし、次いで、後の自然分娩(典型的に、繁殖後、約63～65日目)のための個別のケージングのある出産部屋に移した。妊娠した雌を、毎日直接、予想された分娩時間まで、インターネットでアクセス可能なビデオカメラリンケージを介してリモートでモニタリングした。
妊娠した雌を、飼育員が毎日直接(すなわち、8am～4pm)、次いで、CREWボランティア観察員が予想された分娩時間まで連続して(すなわち、4pm～8pm)、インターネットでアクセス可能なビデオカメラリンケージを介してモニタリングした。どの雌も産気づいた時に飼育員および獣医スタッフは通知を受けた。難産が発生したら、選任獣医師の自由裁量で帝王切開によって子ネコを出産させた。生後24時間以内に子ネコに初回の理学的検査を行い、成長をモニタリングするために子ネコの体重を毎日(分娩後、最初の1ヶ月まで、次いで毎週)測定し、必要に応じてサポートケアを与えた。
あらゆる死産の子ネコまたは死亡した新生仔に対して、性別評価および生殖器系の解剖学的構造を含めて完全剖検を行った。生殖器系全体を回収し、子宮内生殖器系発達に対する、可能性のあるMIS効果を評価する後の組織学的評価のために固定した。
成長可能な子ネコは、離乳(典型的に約8週齢)まで優先的にクイーンによって育てられた。子ネコは、ある特定の場合、例えば、雌親による放棄、攻撃、またはオーバーグルーミングでは必要に応じて人工飼育されたか、または他のクイーンによって育てられた。
離乳後、子ネコはコンパニオンアニマルとして譲渡されてもよく、将来の研究のためにCREWコロニーに残されてもよい。成長可能な雌子ネコがAAV9-fcMISv2処置雌に産まれた場合には、これらの雌子ネコを思春期まで、すなわち、7～8月齢まで妊孕性について評価した。血清MISレベルを評価するために、処置済み雌に産まれた子ネコから生後12時間以内に血液試料を採取した。AAV9-fcMISV2K処置雌が自然繁殖から妊娠しなかった場合、これらの処置済み雌が有効に避妊されたかどうか確かめるために妊孕性状態を評価した。
繁殖トライアル中に、ホルモンモニタリングのためにそれぞれの雌から、排泄された糞便試料を週3回採取した。実施例1.D.および実施例3.A.において上述したように、染料/ネコ専用の食用色素および/または光沢材をキャットフードと混合し、ネコ特有の糞便の特定を容易にするために一匹一匹のネコに別々に与えた。同様に、血清MIS濃度を評価するためにそれぞれの雌から、血液試料(それぞれ1mlの最小体積)を月1回採取した。取り扱い上の苦痛を最小限にするために、血液試料(≧1ml)を、ケタミン、デクスメデトミジンの低用量組み合わせ、および/またはブトルファノール組み合わせを用いた鎮静後の内側伏在静脈穿刺または橈側皮静脈穿刺とアチパメゾールによる部分的逆転によって採取した。少量の血液量(<1ml)の回収および/または妊娠した雌からの採取のために、人手による拘束しか用いずに(すなわち、ネコをナイロンホールディングバッグの中に入れて動かないようにする)血液試料を静脈穿刺によって採取した。この処置にネコがストレスを感じているように見えたら処置を止めた。
実施例4-子イヌが思春期に入らないように阻止するための、および長期不妊を提供するためのAAV-wtイヌMIS処置の有効性
I.イヌ(子イヌ)の思春期を阻止する
遺伝子送達によるMIS処置がイヌ(子イヌ)において思春期を阻止する能力ならびに他の任意の関連する発達上の影響を評価する。さらに、子イヌにおいて妊孕性を長期低下させるために、および/または子イヌが思春期に入らないように阻止するために単回注射(例えば、遺伝子送達による)として与えた時にイヌMISを使用するためのパラメータを評価する。例として、これは、ヒト対象において思春期を遅延させるための遺伝子送達またはMISタンパク質送達を介したMIS処置を評価するための非ヒト動物モデル非ヒト動物モデルとしても役立つ。
子イヌにAAV-wtイヌMISを注射するタイミングは分娩および離乳のタイミングに左右される。健常子イヌを8週齢までに離乳させる。約3月齢(例えば、10～12週齢)の健常子イヌを無作為化して対照と処置群にする。子イヌの尾側大腿筋肉にAAV-wtイヌMISまたは空のベクター対照を以下:(1)高用量AAV-wtイヌMIS(1e13vg/kg);(2)低用量AAV-wtイヌMIS(5e12vg/kg);および(3)対照である空のベクター(5e12vp/kg)の通りにi.m.注射する。表14は子イヌのサンプリングおよびモニタリングの予定表を示す。
(表１４)子イヌモニタリングの予定表
Figure 2024511413000035
子イヌをケージの中で5日間飼育し(同じ処置群/ケージから2～3匹の子イヌ)、次いで、さらなるモニタリングのためにシングルグループエンクロージャに移す。この期間中に、ウイルス排出を評価するために、群飼した子イヌから、プールした糞便および尿試料ならびに個々の口腔スワブを毎日採取する。ウイルス排出を分析するために、個々の血液、混合尿、混合糞便、および個々の口腔スワブの中にあるウイルスゲノムのqPCRをモニタリングする。血液を、注射後7日目、その月の残り期間は毎週、最初の1カ月の後は毎月サンプリングする。尿、糞便、および口腔スワブを最初の1週間は毎日採取する。
食用色素をドッグフードと混合し、注射の2週間前から始め、例えば、注射後9ヶ月間(例えば、約1歳)続けて、それぞれの一匹一匹の子イヌに別々に(週3回)与える。同じ処置群に由来する子イヌが一緒に飼育される場合があるので、思春期および生殖成熟の開始を確かめるために、エストロゲンおよびプロゲステロン代謝産物(雌)またはテストステロン代謝産物(雄)があるかどうか糞便試料を評価する。子イヌの体重を、注射の2週間前から始めて研究期間の終了まで毎週測定する。
血清MIS、インヒビンB、抗MIS抗体、およびLH濃度を評価するために、注射の直前から始めて全血試料(1ml、最小)を、それぞれの子イヌから採取する(1X/月)。処置された子イヌおよび対照子イヌの両方について注射後7日目、14日目、21日目、および28日目に追加の血液試料を採取する。
安全性モニタリングは身体全体の健康の毎日評価と注射部位の定期評価(14日間は毎日、2ヶ月目まで毎週、次いで、その後は毎月)を含む。理学的検査およびCBC/生化学評価を、注射直前に、次いで研究期間の終了まで3ヶ月ごとに行う。
子イヌをビデオと直接観察を用いて行動発情期の徴候があるかどうか評価する。発情周期のあるイヌの徴候がなければフォローアップ繁殖研究が考慮される場合がある。
雌の糞便ホルモン分析は、基底エストロゲンの経時的な漸増と、発情期と同時発生するエストロゲンスパイクの発生に基づいて卵巣周期性を示すことで思春期の証拠を示す。若い雌は典型的には自然排卵せず、従って、糞便プロゲステロンは情報を提供しない場合があるが、雌子イヌは年をとるにつれて自然排卵する能力を獲得するように見える場合がある。そのため、研究期間の終わりに近づくにつれて黄体期を回復する可能性がある。
雄の場合、糞便テストステロンの上昇は思春期の指標であり、陰茎棘の存在と精子産生によって実証される。処置後3ヶ月毎に、標準化された電気射精プロトコールを用いた精液採取の試みのためにケタミン-デクスメデトミジンの組み合わせを用いて雄の子イヌを麻酔する。回収された試料を、精子の存在、体液の体積、精子濃度、運動率、および形態について評価する。精巣の寸法および陰茎の形態(すなわち、棘の存在)も評価する。
雄および雌の子イヌを研究期間の終わりまで群飼するので、何らかの繁殖活動が後の方の月で、特に対照イヌの間で起こるかもしれない。後の方の月の間に、妊娠状態を確認するために腹部超音波検査によって雌を毎週評価する。イヌ間の、あらゆる観察された繁殖活動を記録に残す。
J.フォローアップ繁殖研究
1つまたは複数のフォローアップ繁殖研究が考慮に入れられることがある。例えば、発情周期を有するイヌの徴候がなければ、および/または本実施例の上記に示した研究期間中に雌が繁殖および/または妊娠をしなかったら、その後の繁殖トライアルは、証明付きのブリーダー雄を用いて保証されることがある。
このようなフォローアップ繁殖研究では、証明付きのブリーダー雄イヌを、AAV-wtイヌMIS研究用雌がいる群飼室に移す。融合を容易にするために、雄を、部屋の中で前もって、管理して雌にさらす(ドッグキャリアに入れて飼育する)。雄を4ヶ月間連続して週5日、1日8時間、雌と一緒に飼育する。繁殖活動を直接観察とリモートオーディオ/ビデオモニタリングの組み合わせによって記録に残す。妊娠状態(すなわち、胎児の存在および生存)を確認するために、毎週、それぞれの雌を腹部触診と超音波検査によって評価する。最小限の拘束または妨害で、これらの手順を自発的に受け入れるように全ての雌に事前のオペラント条件付けを与えた。
胎児の発達と生存をモニタリングするために3週間ごとに超音波検査によって、どの妊娠した雌も再評価する。後の自然分娩のための個別のケージングのある出産部屋に移すのに適するまで雌を群飼のままにする。妊娠した雌を、毎日直接、予想された分娩時間まで、インターネットでアクセス可能なビデオカメラリンケージを介してリモートでモニタリングする。
実施例5-思春期に入らないようにヒト対象を遅延させる組換えhMISタンパク質処置の有効性
MIS処置によって思春期を遅延できることを証明するために、例として、実施例2および実施例3では例示的な非ヒト動物としてネコ(子ネコ)において思春期の遅延を評価し、イヌ(子ネコ)において思春期の遅延を評価する。
実施例4では、SEQ ID NO:7のプロタンパク質から生成された組換えヒトMISタンパク質がヒト女性対象において思春期を可逆的に遅延させる能力を評価する。すなわち、女性対象での思春期の遅延におけるLR-MISタンパク質の投与を評価し、可逆的であることが確かめられた。hMISタンパク質は、思春期が始まっていない年齢の、または約8～16歳の思春期前ヒト女性対象に投与することができる。
ヒトrhMISタンパク質、例えば、SEQ ID NO:7のLR-MISを、その全体が本明細書に組み入れられるUS出願US20200071376において開示される方法に従って産生した。CHO細胞を用いて高収率まで産生および精製することができる生物学的に活性なrhMISタンパクが入手できるようになったため、十分に切断されていない野生型タンパク質では以前は実現不可能であり、活性が無いことが見出された市販のC末端組換えMISタンパク質を用いても不可能であった多量かつ長期のインビボでの投薬が可能になった。例えば、本発明者らは、エクスビボ培養で胎児(E14.5)雌ラット泌尿生殖隆線を5μg/ml rhMISと72時間インキュベートするとミュラー管がほぼ完全に退化したことを以前に証明したが、R&D Systems(Minneapolis, Minn.)C末端MISにはミュラー管バイオアッセイ時に観察可能な活性が無い。このアッセイは、ホルモンの効能と特異性を試験するためのゴールドスタンダードである。
マウスをrhMISタンパク質で処置すると可逆的な卵巣静止が起こる。
rhMISタンパク質は皮下に(s.c.)、静脈内に(i.v.)、腹腔内に(i.p.)投与することができ、それぞれが約4時間の半減期をもたらし、それぞれ、4時間、30分、および2時間でピーク濃度(Cmax)に達する。rhMISタンパク質に好ましい送達経路は皮下であった。なぜなら、皮下の吸収キネティクスが最も好ましかったからである。しかしながら、浸透圧ポンプを使用した時に、腹腔内移植が1週間まで一定した送達を生じるので最適であることが見出された(例えば、US2020/0071376の図1Fを参照されたい)。rhMIS活性は著しく安定しており、マウスに1週間、移植されたポンプから回収された材料はラット泌尿生殖隆線バイオアッセイにおいて完全な生物学的活性を保っていた(データは示さない)。
女性対象へのrhMISの投与は、その全体が本明細書に組み入れられるUS出願US20200071376において開示されるどの手段を介するものでもよい。場合によっては、投与は、ポンプ(例えば、浸透圧ポンプ)または経皮パッチなどを介するものでもよい。
卵巣再覚醒の動態を解明する目的でrhMISタンパク質が原始卵胞を阻害できることを確かめるために、思春期前女性ヒトの代表的な動物モデルである思春期前雌マウスにおいて一過的なrhMISタンパク質処置の効果を測定する。rhMISタンパク質を、インシリコ薬物動態学的モデリングが循環rhMISレベルを0.25μg/ml標的レベルを上回って維持すると予測した1.5mg/kgで1日2回(12時間ごとに)s.c.投与する。実際の循環rhMISレベルは、トラフ値である注射12時間後にELISAで測定することができ、35日の処置の間に濃度は徐々に減っていったが0.25μg/mlの標的閾値を上回って維持された。処置マウスからの卵巣を評価することができ、著しいサイズ縮小を、35日の処置後に代表的な中央切片の分析によって評価する。卵巣に一次卵胞が少なくなり、二次卵胞も胞状卵胞も無かったら、卵胞の発達が阻害されたことが証明される。卵巣が静止から解放され、卵胞形成が再会したことを確かめるために、rhMISタンパク質処置を中止した後に卵巣を評価する。マウスにおける卵巣体積を15日にわたって評価することができる。サイズの増加から、一次卵胞のサイズが3日目から10日目に徐々に増加し、二次卵胞が5日目に現れ始め、15日目までに対照と同様のレベルまで増加し、この時にいくつかの胞状卵胞を観察できることが分かる。
思春期を可逆的に遅延させるためのrhMISタンパク質の効力を試験するために、C57BL/6N雌マウスにi.p.移植する浸透圧ポンプの使用を選択した。これにより、rhMISを非常に正確に送達することが可能になる(US20200071376の図1Fを参照されたい)。このモデルでは、食塩水で希釈した1200μg/mlのrhMIS溶液100μlを充填した浸透圧ポンプ、または食塩水を充填した対照ポンプを移植した。ポンプを7日または5日ごとに交換した(例えば、US20200071376の図5Eを参照されたい)。2週間後にマウスを屠殺し、卵巣を回収し、連続切片にし、卵胞数を数えた。rhMIS溶出ポンプを移植したマウスでは、食塩水ポンプのある対照と比較して有意に高い卵巣予備能が観察された。hrMISによる処置は、この短い期間内で原始卵胞にも、成長中の卵胞にも有意に影響を及ぼさなかった。しかしながら、食塩水のみの対照と比較して、成長中の卵胞の数が少なくなる傾向があった。
原始卵胞の活性化を減速するが完全には止めない、従って、思春期の開始を可逆的に遅延することができる低用量rhMISの用い方を想定できるかもしれない。
結論として、実施例1～3では高用量のAAV-wtネコMISまたはAAV-wtイヌMISの有効性によって、それぞれ、ネコの思春期およびイヌの思春期を不可逆的に阻止できることができ、実施例4ではrhMISの投与によってマウス動物モデルの思春期の開始を可逆的に遅延できることが本明細書において証明された。このことから、rhMISは原始卵胞活性化の強力な阻害剤であることが証明された。

Claims (61)

  1. 思春期前非ヒト対象において妊孕性を低下させる方法であって、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、ミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む有効量の組成物を該対象に投与する工程を含む、該方法。
  2. 思春期前非ヒト対象において思春期を阻止する方法であって、1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、ミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む有効量の組成物を該対象に投与する工程を含む、該方法。
  3. 思春期前非ヒト対象が子ネコまたは子イヌである、請求項1または請求項2記載の方法。
  4. 思春期前非ヒト対象が雌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  5. MISタンパク質が、
    a)野生型ネコMISタンパク質、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列;
    b)野生型イヌMISタンパク質、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列;
    c)野生型ヒトMISタンパク質、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいは
    (d)キメラネコMISタンパク質、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  6. 思春期前非ヒト対象が、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下の子ネコである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  7. 思春期前非ヒト対象が、体重が2kg以下の子ネコである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  8. 思春期前非ヒト対象が、24月齢以下、22月齢以下、20月齢以下、18月齢以下、16月齢以下、14月齢以下、12月齢以下、11月齢以下、10月齢以下、9月齢以下、8月齢以下、7月齢以下、6月齢以下、5月齢以下、4月齢以下、3月齢以下、または2月齢以下の子イヌである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  9. 思春期前非ヒト対象が離乳されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  10. 思春期前非ヒト対象が離乳されていない、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記ベクターが、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、またはファージミドである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  12. 前記ベクターがウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記組成物が、前記ベクターを含む細胞をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記組成物が滅菌注射溶液を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記組成物が滅菌注射水溶液を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記組成物が、脂質、脂質エマルジョン、リポソーム、ナノ粒子、またはエキソソームを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ポックスウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記ベクターがAAVベクターである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記ベクターがAAV9ベクターである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  20. 1つまたは複数の調節エレメントがプロモーターエレメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  21. 1つまたは複数の調節エレメントがプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  22. 1つまたは複数の調節エレメントが構成的活性プロモーターを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記組成物が、薬学的に許容される担体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  24. 前記投与が注射を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記投与が静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記投与が筋肉内投与を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記投与が単回注射を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記投与が1回限りの単回注射を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  29. 前記投与が、複数回の注射に分割された単一用量を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  30. 前記投与が、2回の注射に分割された単一用量を介するものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  31. 思春期前非ヒト対象に投与される組成物の有効量が、対象の体重1キログラムあたり1×1013ベクターゲノム以下、5×1012ベクターゲノム以下、1×1012ベクターゲノム以下、5×1011ベクターゲノム以下、または1×1011ベクターゲノム以下である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  32. 前記組成物の投与後、6ヶ月もしくは6ヶ月後、9ヶ月もしくは9ヶ月後、12ヶ月もしくは12ヶ月後、15ヶ月もしくは15ヶ月後、または24ヶ月もしくは24ヶ月後の思春期前非ヒト対象の血清中のMISタンパク質の濃度が、250ng/ml超、300ng/ml超、400ng/ml超、500ng/ml超、600ng/ml超、700ng/ml超、800ng/ml超、900ng/ml超、1μg/ml超、1.5μg/ml超、2μg/ml超、3μg/ml超、4μg/ml超、5μg/ml超、6μg/ml超、7μg/ml超、8μg/ml超、9μg/ml超、10μg/ml超、または11μg/ml超である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  33. MISタンパク質濃度がELISAによって測定される、請求項32記載の方法。
  34. 思春期前非ヒト対象が雌であり、前記組成物の投与後に、
    a)卵胞を発達させない、
    b)成長可能な卵がある卵胞を発達させない、
    c)思春期を経験しない、
    d)発情期の徴候を示さない、および/または
    e)不妊である、
    前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  35. 1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、ネコミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含むベクターであって、
    ネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する野生型ネコMISタンパク質を含むか、あるいは
    ネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するキメラネコMISタンパク質を含む、
    該ベクター。
  36. 前記核酸が、SEQ ID NO:1のアミノ酸22～588またはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むネコMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:1の位置478またはSEQ ID NO:18の位置479にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている、請求項35記載のベクター。
  37. 前記核酸が、SEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むネコMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:3の位置465にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸、例えば、K(リジン)に変えられている、請求項35記載のベクター。
  38. Rの保存的アミノ酸がKである、請求項36または37記載のベクター。
  39. 1つまたは複数の調節エレメントに機能的に連結された、イヌミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質をコードする核酸を含むベクターであって、
    イヌMISタンパク質が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸22～588に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する野生型イヌMISタンパク質を含む、
    該ベクター。
  40. 前記核酸が、SEQ ID NO:2のアミノ酸23～543に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含むイヌMISタンパク質をコードし、SEQ ID NO:2の位置462にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている、請求項39記載のベクター。
  41. Rの保存的アミノ酸がKである、請求項40記載のベクター。
  42. SEQ ID NO:1のアミノ酸1～21もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列と、SEQ ID NO:1のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、ネコMISタンパク質、または
    SEQ ID NO:3のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列を含み、かつSEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、キメラネコMISタンパク質、または
    SEQ ID NO:14もしくはSEQ ID NO:20のアミノ酸と、SEQ ID NO:14のアミノ酸22～588もしくはSEQ ID NO:20のアミノ酸22～589に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、改変されたネコMISタンパク質(LR-fcMIS)
    より選択されるネコMISプロタンパク質から生成された、改変されたネコミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質。
  43. ネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:1のアミノ酸22～588またはSEQ ID NO:18のアミノ酸22～589に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:1の位置478またはSEQ ID NO:18の位置479にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている、請求項42記載の改変されたネコMISタンパク質。
  44. キメラネコMISタンパク質が、SEQ ID NO:3のアミノ酸22～572に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:3の位置465にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸、例えば、K(リジン)に変えられている、請求項42記載の改変されたネコMISタンパク質。
  45. 非リーダー配列が、SEQ ID NO:9～13のいずれかより選択される、請求項42～44のいずれか一項記載の改変されたネコMISタンパク質。
  46. イヌMISプロタンパク質から生成された、改変されたイヌミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質であって、イヌMISプロタンパク質が、SEQ ID NO:2のアミノ酸1～21の代わりに非MISリーダー配列と、SEQ ID NO:2のアミノ酸22～588に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、該改変されたイヌミュラー管抑制因子(MIS)タンパク質。
  47. イヌMISが、SEQ ID NO:2のアミノ酸23～543に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:2の位置462にあるアミノ酸残基Qが、QからR(アルギニン)またはRの保存的アミノ酸に変えられている、請求項45記載の改変されたイヌMISタンパク質。
  48. Rの保存的アミノ酸がKである、請求項45記載の改変されたイヌMISタンパク質。
  49. 請求項44～47のいずれか一項記載の改変されたネコMISタンパク質、または請求項46～48のいずれか一項記載の改変されたイヌMISタンパク質を含む、薬学的組成物。
  50. 思春期前ヒト女性対象において思春期を可逆的に遅延させる方法であって、組換えヒトミュラー管抑制因子(rhMIS)タンパク質を含む有効量の組成物を該対象に投与する工程を含み、組換えヒトMISタンパク質が、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基25～560、またはSEQ ID NO:4に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基450が、QからRまたはRの保存的アミノ酸に変えられている、該方法。
  51. rhMISタンパク質が、SEQ ID NO:4のアミノ酸1～24の代わりに非MISリーダー配列と、SEQ ID NO:4のアミノ酸25～560に対して少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含むrhMISプロタンパク質から産生され、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基450が、QからRまたはRの保存的アミノ酸に変えられている、請求項50記載の方法。
  52. Rの保存的アミノ酸がKである、請求項50または51記載の方法。
  53. rhMISタンパク質が、SEQ ID NO:7の少なくとも19～554のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはSEQ ID NO:7に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項50記載の方法。
  54. rhMISタンパク質が、SEQ ID NO:7の少なくとも19～554のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはSEQ ID NO:7に対して少なくとも85％の配列同一性を有するタンパク質と、SEQ ID NO:9～13のいずれかより選択される非MISリーダー配列、またはSEQ ID NO:9～13のいずれかに対して少なくとも85％の配列同一性を有する非リーダー配列とを含む、請求項50～53のいずれか一項記載の方法。
  55. 組換えヒトMISタンパク質が、WO2015089321に開示される核酸によって製造または産生される、請求項50記載の方法。
  56. 思春期前ヒト女性対象が思春期の遅延を必要とする、請求項52記載の方法。
  57. 思春期の遅延を必要とする思春期前ヒト女性対象が、性別違和、間性、出生時の非定型生殖器、出生時の雄性生殖器と雌性生殖器、モザイク遺伝学、クラインフェルター症候群、中枢性思春期早発症(CPP)もしくは末梢性思春期早発症、または先天性副腎過形成(CAH)より選択される1つまたは複数の状態を有する、請求項56記載の方法。
  58. fcMISまたはclMISを発現するウイルスベクターが投与された非ヒト対象において抗fcMIS抗体または抗clMIS抗体を検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
    a)fcMISまたはclMISをコードするウイルスベクターが投与された非ヒト対象から試料を入手する工程であって、任意で、fcMISまたはclMISが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、またはSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む、該工程;
    b)任意で、組換えfcMISまたはclMISを単離する工程であって、任意で、組換えfcMISまたはclMISがFLAGタグを含む、該工程;
    c)fcMISまたはclMISを支持体に添加する工程であって、任意で、支持体がELISAプレートである、該工程;
    d)試験試料を支持体に添加する工程;
    e)支持体を、検出可能な抗体とインキュベートする工程であって、任意で、検出可能な抗体がヤギ抗IgG HRPである、該工程;および
    f)酵素基質反応を実施する工程であって、任意で、酵素基質がHRPである、該工程。
  59. 試験試料が支持体に添加される前にブロッキング緩衝液で希釈される、請求項58記載の方法。
  60. 試験試料を支持体に添加する工程の前に支持体をウシ血清アルブミンとインキュベートする工程をさらに含む、請求項58または59記載の方法。
  61. 過剰なMISまたは過剰な検出可能な抗体を除去するために1つまたは複数の洗浄工程をさらに含む、請求項58～60のいずれか一項記載の方法。
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