JP2024509868A - システインのための高度に水溶性で安定な化学センサー - Google Patents
システインのための高度に水溶性で安定な化学センサー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024509868A JP2024509868A JP2023553973A JP2023553973A JP2024509868A JP 2024509868 A JP2024509868 A JP 2024509868A JP 2023553973 A JP2023553973 A JP 2023553973A JP 2023553973 A JP2023553973 A JP 2023553973A JP 2024509868 A JP2024509868 A JP 2024509868A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- formula
- compound
- absorbance
- alkyl
- cysteine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 15
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 12
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000012453 solvate Substances 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N acryloyl chloride Chemical compound ClC(=O)C=C HFBMWMNUJJDEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 claims description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 46
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003647 acryloyl group Chemical class O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- -1 fluorometry Chemical compound 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 3
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- MILUBEOXRNEUHS-UHFFFAOYSA-N iridium(3+) Chemical class [Ir+3] MILUBEOXRNEUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical class C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000011903 deuterated solvents Substances 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
- G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
- C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
- C07C259/06—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
- C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
- C07D209/12—Radicals substituted by oxygen atoms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本発明は、試験試料、好ましくは水性試験試料中のシステインの改善された検出のための化学プローブ、ならびにそれぞれの使用およびキットに関する。
Description
本発明は、試験試料、好ましくは水性試験試料中のシステインの改善された検出のための化学プローブの他に、それぞれの使用およびキットに関する。
発明の背景
システイン（Ｃｙｓ）は、生合成、解毒、および代謝において重要である。総システインの上昇したレベルは、心臓血管疾患およびメタボリックシンドロームを予測することができる。システイン欠乏症は加齢の帰結の１つであることが公知である。構造的に類似したホモシステイン（Ｈｃｙ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）に対してＣｙｓを選択的に検出することは、依然として非常に大きな課題となっている。Ｃｙｓを検出するための多くの方法があるが、光ルミネッセンス（ＰＬ）および電気化学発光（ＥＣＬ）技術は、それらの高い感度のために臨床診断および分析技術によく適する。
システイン（Ｃｙｓ）は、生合成、解毒、および代謝において重要である。総システインの上昇したレベルは、心臓血管疾患およびメタボリックシンドロームを予測することができる。システイン欠乏症は加齢の帰結の１つであることが公知である。構造的に類似したホモシステイン（Ｈｃｙ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）に対してＣｙｓを選択的に検出することは、依然として非常に大きな課題となっている。Ｃｙｓを検出するための多くの方法があるが、光ルミネッセンス（ＰＬ）および電気化学発光（ＥＣＬ）技術は、それらの高い感度のために臨床診断および分析技術によく適する。
組換えモノクローナル抗体におけるトリスルフィド形成は、一貫した製造物品質のために制御される必要がある不均質性の原因である。Ｒｙｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ，Ｒ．；ＭｃＥｌｅａｒｎｅｙ，Ｋ．；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ａ．；Ｓｉｎａｃｏｒｅ，Ｍ．；Ｒｙｌｌ，Ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１０９，２５２３）は、フィード培地中のＬ－システイン（Ｃｙｓ）濃度は製造物（ＩｇＧ１ ｍＡｂ）中のトリスルフィドレベルと直接的に相関することを示している。したがって、Ｃｙｓフィード戦略の制御が、トリスルフィド形成を許容され得るレベルまで低下させるために要求される。
現在までに、Ｃｙｓの検出は様々な生化学的応用のために多くの注目を集めている。Ｃｙｓを検出するための多数の方法が開発されており、これは例えば蛍光光度法、電位差測定法、電気化学ボルタメトリー、およびエルマン試薬と組み合わせたまたは蛍光と連結したＨＰＬＣである。これらの方法は、複雑な計測手段を要求するか、面倒な実験室手順を伴うか、または低いスループットである。
Ｋｉｍ ａｎｄ Ｈｏｎｇ（Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｕａｌ－Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｒｉｄｉｕｍ（ＩＩＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１９，４，７，１２６１６－１２６２５）は、ＨｃｙおよびＧＳＨからのＣｙｓの識別のためのシクロメタル化イリジウム（ＩＩＩ）錯体を使用するＰＬおよびＥＣＬデュアルチャネルセンサーを報告している。
ＵＶ－ｖｉｓ分光法は迅速かつ単純な測定手順を提供する。そのため、バイオプロセスにおいて必須の代謝物を定量化するために、自動化分析装置、例えばＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する測光アッセイが用いられる。しかし、わずかな候補のみがＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ Ａｎａｌｙｚｅｒ（「Ｃｅｄｅｘ」）上での比色Ｃｙｓ検出のために利用可能であり、分析デバイスは限られた波長のセット：３４０、３７８、４０９、４８０、５１２、５２０、５５２、５８３、６２９、６５２、６５９、および８００ｎｍのみを提供する。追加的に、Ｃｅｄｅｘシステムのための理想的なプローブは、高い感度、迅速な応答、水溶解性および安定性、ならびに使用の容易性を含まなければならない。
現在までに、Ｃｙｓのための指標のほとんどはチオール基の強い求核性に基づく。マイケル付加および切断反応を含む、様々な機序が用いられている。アクリレート基に基づく感知戦略は有望であると思われ、その理由は、それは他のアミノ酸およびチオールからＣｙｓを識別することを可能としたからである（Ｈａｎ，Ｑ．；Ｓｈｉ，Ｚ．；Ｔａｎｇ，Ｘ．；Ｙａｎｇ，Ｌ．；Ｍｏｕ，Ｚ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｓｈｉ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．；Ｌｉｕ，Ｗ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｗ．Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，１２，５０２３）。感知機序は図１に与えられる。この戦略は、チオエステルを生成するためのアクリレートへのＣｙｓの共役付加、続いて分子内環化を伴う。チオール活性化部位としてのアクリレート部分はＣｙｓとのみ迅速な環化を起こし、その理由は、反応速度は得られるラクタムの環サイズに強く依存するからである。マスキングアクリレート基が除去された後に、発色団の共役されたπ電子系は回復され、これは比色応答を可能にする。
不利なことに、少数のアクリレートベースプローブのみが、Ｃｅｄｅｘ上での使用のために要求される波長において激しい比色応答を特徴とする。それらの発色団は、キサンテン、メロシアニン、ヘプタメチンおよびフルオレセインに基づく。報告されたアクリレートのほとんどは有機溶媒－水混合物において応用されたという事実は、水性培地中でのそれらの不良な溶解性により自明に必要とされる。しかしながら、プローブが水に可溶性であることはＣｅｄｅｘ上での応用のために必須であり、その理由は機器のパーツは有機溶媒に不安定であるからである。また、アッセイ溶液が合理的な長さの時間にわたりＣｅｄｅｘ中に貯蔵され得ることを確実にするために、既存のプローブの安定性が評価される必要がある。
これらおよび他の欠点を考慮して、水性溶液において使用可能であり、かつ要求される波長の１つにおいて十分な比色応答を提供するＣｙｓプローブを提供することが本発明の目的である。他の目的および利点は、本発明の本明細書を検討する際に当業者に明らかになるであろう。
本発明の第１の態様において、上記の目的は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３ －、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃは、式ＩＩ
（式中、Ｘは、－Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－Ｏ－、および－Ｃ（ＣＨ３）２－から選択される）、
式ＩＩＩ
式ＩＶ
および
式Ｖ
（ここで、式ＩＩ～Ｖの各々において、芳香環は１、２または３個のＳＯ３
－基で置換されていてもよく、
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －の群から選択され、ｍは、１～１８から選択される整数である）
から選択される基から選択され、
ｎは、１、２および３から選択される）
による化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物により解決される。
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３ －、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃは、式ＩＩ
式ＩＩＩ
式Ｖ
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －の群から選択され、ｍは、１～１８から選択される整数である）
から選択される基から選択され、
ｎは、１、２および３から選択される）
による化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物により解決される。
本発明者らは、メロシアニン発色団に基づいてアクリロイルエステルのシリーズを合成し（図２、下記を参照）；プローブＬＺ０７は、対照としてかつ比較のために調製され、文献（Ｈａｎ，Ｑ．；Ｓｈｉ，Ｚ．；Ｔａｎｇ，Ｘ．；Ｙａｎｇ，Ｌ．；Ｍｏｕ，Ｚ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｓｈｉ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．；Ｌｉｕ，Ｗ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｗ．Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，１２，５０２３）から公知である。本発明者らは次に、アクリロイルエステルのスペクトル特性、水溶解性および安定性を研究し、Ｃｙｓに対する応答を評価した。化学的な設計は、特にＣｅｄｅｘのための、特化したプローブを提供することが実証できた。
好ましいのは、Ｒ１およびＲ２が、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３
－、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃが、式ＩＩ
（式中、Ｘは、－Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、－Ｏ－、および－Ｃ（ＣＨ３）２－から選択され、芳香環は１、２または３個のＳＯ３
－基で置換されていてもよく、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３
－から選択され、ｍは１～６の整数である）
であり、
ｎが１である、本発明による式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物である。
Ａｃｃが、式ＩＩ
であり、
ｎが１である、本発明による式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物である。
さらに好ましいのは、Ｒ１およびＲ２が、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３
－、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃが、式ＩＩ
（式中、Ｘは－Ｃ（ＣＨ３）２－であり、芳香環は１、２または３個のＳＯ３
－基で置換されていてもよく、Ｒ４は（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３
－であり、ｍは１～６の整数である）
であり、
ｎが１である、本発明による式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物である。
Ａｃｃが、式ＩＩ
であり、
ｎが１である、本発明による式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物である。
さらに好ましいのは、以下の式ＶＩ～ＩＸ
の本発明による式Ｉによる化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物である。
本発明の文脈において、好適な塩は、通常は、本発明による化合物の溶解性に、特に水性培地中での溶解性に干渉しないか、または実質的に干渉しないものである。例は、第Ｉ族元素（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋）、アンモニウムイオン（ＮＨ４
＋）、硝酸イオン（ＮＯ３
－）を含有し、Ｃｌ－、Ｂｒ－、もしくはＩ－を含有する塩、または硫酸塩である。
本発明のさらに別の態様は次に、本発明による式Ｉによる化合物を調製するための方法であって、
ａ）式ＶＩ
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記に定義されるとおりであり、ｎは１または２である）
の化合物を、
式ＩＩ
の化合物か、または
式ＩＩＩ
の化合物か、または
式ＩＶ
の化合物か、または式Ｖ
の化合物
（ここで、式ＩＩ～Ｖの各々において、芳香環は１、２または３個のＳＯ３ －基で置換されていてもよく、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －から選択され、ｍは１～１８の整数である）
と好適に反応させて、式ＶＩＩＩ
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＡｃｃは上記に定義されるとおりであり、ｎは１または２である）
の化合物を得る工程、ならびに
ｂ）式ＶＩＩＩの化合物を塩化アクリロイルと好適に反応させる工程
を含む、方法に関する。上記の方法を行うための好適な条件は当業者に公知であり、以下の実施例およびスキームにおいて例示的に開示されている。
ａ）式ＶＩ
の化合物を、
式ＩＩ
式ＩＩＩ
式ＩＶ
（ここで、式ＩＩ～Ｖの各々において、芳香環は１、２または３個のＳＯ３ －基で置換されていてもよく、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －から選択され、ｍは１～１８の整数である）
と好適に反応させて、式ＶＩＩＩ
の化合物を得る工程、ならびに
ｂ）式ＶＩＩＩの化合物を塩化アクリロイルと好適に反応させる工程
を含む、方法に関する。上記の方法を行うための好適な条件は当業者に公知であり、以下の実施例およびスキームにおいて例示的に開示されている。
本発明のさらに別の態様は次に、試験試料中のシステインを検出するための方法であって、以下：ａ）システインを含有することが予期される試験試料と接触させる前および後に、好適な溶媒中の本発明にしたがって定義される化合物の溶液のＵＶ／Ｖｉｓ吸光度を測定する工程、ｂ）工程ａ）において測定されたＵＶ／Ｖｉｓスペクトルの比較により吸光度における差異を決定する工程、ならびにｃ）工程ｂ）において決定された吸光度における前記差異に基づいて前記試験試料中のシステインを検出する工程を含む、方法に関する。
本発明による試験試料は、システインを含むか、またはシステインを含むことが予期される任意の試料を含むことができる。例は、例えば、血漿中、患者から得られた試料中、異なる種類の細胞株中の全タンパク質、組織試料中、細胞溶解液中、血清中、唾液中または尿中、抗体試料中、およびバイオテクノロジー応用において使用される試料中の生体チオールの検出である。好ましいのは、Ｃｅｄｅｘシステムにおいて分析される水性生物学的試料である。
Ｃｙｓの存在下で記録されたスペクトルは、アクリロイルエステルの切断を通じた比色応答を裏付けた。合成されたプローブは、緑色および黄色範囲の可視スペクトルへの有意な深色性シフトを示した（表２）。好ましいのは、ＵＶ／Ｖｉｓ吸光度が、２００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内の離散波長において測定される、本発明による方法である。さらに、それらのスペクトルプロファイルは、ＣｅｄｅｘシステムにおけるＣｙｓ感知応用のための波長要求（３４０、３７８、４０９、４８０、５１２、５２０、５５２、５８３、６２９、６５２、６５９および８００ｎｍ）を有利なことに満たしていた。
より好ましいのは、溶媒が水性溶媒である、本発明による方法である。
本発明の好ましい態様において、吸光度における差異の前記決定が、色変化、例えば、緑色および黄色範囲の可視スペクトルへの有意な深色性シフト等の目視検査によるものである、本発明による方法である。例として、わずかに異なるアプローチにおいて、Ｈａｉ－Ｆｅｎｇ Ｙｉｎ，ｅｔ ａｌ．（ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｂｅ ｗｉｔｈ ｖｉｓｉｂｌｅ ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（２０２０）ＤＯＩ：１０．１０８０／００３８７０１０．２０２０．１８２１０６３）は、システインを選択的に検出することができる蛍光プローブを合成した。システインの添加と共に、プローブ溶液は、肉眼により著明なペールイエローから橙色への色変化を示した。
吸光度における差異の前記決定がＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるものである、本発明による方法。
本発明のさらに別の態様は次に、試験試料中のシステインを検出するためのキットであって、予め決定された量の本発明による化合物を含むバイアルまたは容器を、前記キットを使用するためのマニュアルと共に含む、キットに関する。含まれる材料の例は、例えば、標準品、本発明によるプローブ、および緩衝液である。
本発明のさらに別の態様は次に、試験試料、好ましくは本明細書に開示されている水性試験試料中のシステインを検出するための、本発明による化合物、または本発明によるキットの使用に関する。
本発明は、以下の実施例において、そしてまた図面を参照して、さらに説明されるが、それに限定されるわけではない。本発明の目的のために、本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
メロシアニン発色団に基づくアクリロイルエステルのシリーズを合成し（図２）、文献（Ｈａｎ，Ｑ．；Ｓｈｉ，Ｚ．；Ｔａｎｇ，Ｘ．；Ｙａｎｇ，Ｌ．；Ｍｏｕ，Ｚ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｓｈｉ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．；Ｌｉｕ，Ｗ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｗ．Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，１２，５０２３）から公知のプローブＬＺ０７と比較した。スペクトル特性、水溶解性および安定性を研究し、Ｃｙｓに対する応答を評価した。本発明による化学的な設計はＣｅｄｅｘ用の特化したプローブを提供することを本発明者らは実証した。
以下は、既知のＣｙｓプローブおよびそれらの特性に関する当技術分野の現状の簡単な要約である。
実験手順
材料および方法
試薬および溶媒をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから最高商用品質で購入し、さらなる精製なしで使用した。ＣＨＲＯＭＡＳＯＬＶ溶媒をＨＰＬＣにおける溶出液として使用した。収率は、他に記載されなければ、クロマトグラフィー的に（ＨＰＬＣ－ＭＳ）および分光学的に（１Ｈ ＮＭＲ）均質な材料を指す。対となる陰イオンは明確性のために省略している。
材料および方法
試薬および溶媒をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから最高商用品質で購入し、さらなる精製なしで使用した。ＣＨＲＯＭＡＳＯＬＶ溶媒をＨＰＬＣにおける溶出液として使用した。収率は、他に記載されなければ、クロマトグラフィー的に（ＨＰＬＣ－ＭＳ）および分光学的に（１Ｈ ＮＭＲ）均質な材料を指す。対となる陰イオンは明確性のために省略している。
分析ＨＰＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ）
化合物の純度を、以下の構成要素：２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ、２６９６ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙおよびＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ（ＥＳＣＩイオン化モード）検出器を含有するＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）からのＨＰＬＣ－ＭＳ装置の助けと共に決定した。データ取得はＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｖ４．１）ソフトウェアにより実行した。
化合物の純度を、以下の構成要素：２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ、２６９６ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙおよびＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ（ＥＳＣＩイオン化モード）検出器を含有するＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）からのＨＰＬＣ－ＭＳ装置の助けと共に決定した。データ取得はＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｖ４．１）ソフトウェアにより実行した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８ ３μＭ（４．６×１５０ｍｍ）／Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｒ．ＴＡ１２Ｓ０３－１５４６ＷＴ。
流量：０．７ｍＬ／分。
相Ａ：脱イオン水中のトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡｃ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）。
相Ｂ：ＭｅＣＮ。
勾配 ８０：５－８０Ｂ（７分）；８０－８０Ｂ（２分）；８０－５Ｂ（０．５分）；５－５Ｂ（２．５分）。
勾配 １００：５－１００Ｂ（７分）；１００－１００Ｂ（２分）；１００－５Ｂ（０．５分）；５－５Ｂ（２．５分）。
流量：０．７ｍＬ／分。
相Ａ：脱イオン水中のトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡｃ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）。
相Ｂ：ＭｅＣＮ。
勾配 ８０：５－８０Ｂ（７分）；８０－８０Ｂ（２分）；８０－５Ｂ（０．５分）；５－５Ｂ（２．５分）。
勾配 １００：５－１００Ｂ（７分）；１００－１００Ｂ（２分）；１００－５Ｂ（０．５分）；５－５Ｂ（２．５分）。
ＮＭＲ
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ（５００および６００ＭＨｚ）ならびにＡｇｉｌｅｎｔ ４００ ＭＲ ＤＤ２（４００ＭＨｚ）機器上で記録し、内部参照として残留非重水素化溶媒を使用して軟正した。１ＮＭＲピーク多重度を説明するために以下の略語を使用した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード。
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ（５００および６００ＭＨｚ）ならびにＡｇｉｌｅｎｔ ４００ ＭＲ ＤＤ２（４００ＭＨｚ）機器上で記録し、内部参照として残留非重水素化溶媒を使用して軟正した。１ＮＭＲピーク多重度を説明するために以下の略語を使用した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード。
ＨＲＭＳ
ＨＲＭＳ（高分解能質量スペクトル）のために、試料をＭｅＣＮに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－ＴｏＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ機器上でのポジティブイオンモードにおける直接フロー注入（注入体積＝５μＬ）エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ－ＴＯＦ）質量分析により分析した。
ＨＲＭＳ（高分解能質量スペクトル）のために、試料をＭｅＣＮに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－ＴｏＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ機器上でのポジティブイオンモードにおける直接フロー注入（注入体積＝５μＬ）エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ－ＴＯＦ）質量分析により分析した。
一般的手順Ｉ
メロシアニン色素の調製
エタノール中のそれぞれのアルデヒド（１当量）およびインドリウム塩（１当量）の混合物をＡｒ下でピペリジン（０．１～２当量）の存在下で１～１６ｈ還流させた。反応混合物を室温まで緩徐に冷却させた後に、溶媒を真空中で除去し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、ＴＥＡＢ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）／ＭｅＣＮまたはＨ２Ｏ（０．１％ ＴＦＡ）／ＭｅＣＮ）により精製した。
メロシアニン色素の調製
エタノール中のそれぞれのアルデヒド（１当量）およびインドリウム塩（１当量）の混合物をＡｒ下でピペリジン（０．１～２当量）の存在下で１～１６ｈ還流させた。反応混合物を室温まで緩徐に冷却させた後に、溶媒を真空中で除去し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、ＴＥＡＢ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）／ＭｅＣＮまたはＨ２Ｏ（０．１％ ＴＦＡ）／ＭｅＣＮ）により精製した。
一般的手順ＩＩ
アクリロイルエステルの調製
塩化アクリロイル（４～５当量）をＡｒ下で０℃で乾燥ＤＣＭ中のそれぞれのメロシアニン色素（１当量）およびＥｔ３Ｎ（４～５当量）の混合物に加えた。０℃で１ｈの撹拌後に、水性ＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、有機材料をＤＣＭで２回抽出した。合わせた抽出物をＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ）により精製した。
アクリロイルエステルの調製
塩化アクリロイル（４～５当量）をＡｒ下で０℃で乾燥ＤＣＭ中のそれぞれのメロシアニン色素（１当量）およびＥｔ３Ｎ（４～５当量）の混合物に加えた。０℃で１ｈの撹拌後に、水性ＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、有機材料をＤＣＭで２回抽出した。合わせた抽出物をＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ）により精製した。
一般的手順ＩＩＩ
アクリロイルエステルの調製
塩化アクリロイル（４～５当量）をＡｒ下で０℃で乾燥ＤＣＭ中のそれぞれのメロシアニン色素（１当量）およびＥｔ３Ｎ（４～５当量）の混合物に加えた。０℃で１ｈの撹拌後に、水性ＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、水溶性生成物をＨ２Ｏで２回抽出した。合わせた抽出物をＤＣＭで洗浄し、真空中（２０ミリバール、２０℃）で濃縮し、次に逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ）により精製した。
アクリロイルエステルの調製
塩化アクリロイル（４～５当量）をＡｒ下で０℃で乾燥ＤＣＭ中のそれぞれのメロシアニン色素（１当量）およびＥｔ３Ｎ（４～５当量）の混合物に加えた。０℃で１ｈの撹拌後に、水性ＮＨ４Ｃｌ（０．１Ｍ）を加えることにより反応をクエンチし、水溶性生成物をＨ２Ｏで２回抽出した。合わせた抽出物をＤＣＭで洗浄し、真空中（２０ミリバール、２０℃）で濃縮し、次に逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ－１８、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ）により精製した。
分光学的材料および方法
吸収スペクトルをＶａｒｉａｎからのＣａｒｙ ５０ ＵＶ－ｖｉｓ分光計上で記録した。すべての測定は１ｃｍ ＵＶ－ｖｉｓ使い捨てキュベット（ＢＲＡＮＤ ｓｅｍｉ－ｍｉｃｒｏ）および空気平衡化溶液中２５±０．１℃で行った。１．０ｍＬの全アッセイ体積を各々の測定のために使用した。以下のパラメーターを使用してＵＶ－ｖｉｓスキャンスペクトルを記録した：平均時間０．０５ｓ；データ間隔１ｎｍ；スキャン速度１２００ｎｍ／分；ベースライン補正あり。
吸収スペクトルをＶａｒｉａｎからのＣａｒｙ ５０ ＵＶ－ｖｉｓ分光計上で記録した。すべての測定は１ｃｍ ＵＶ－ｖｉｓ使い捨てキュベット（ＢＲＡＮＤ ｓｅｍｉ－ｍｉｃｒｏ）および空気平衡化溶液中２５±０．１℃で行った。１．０ｍＬの全アッセイ体積を各々の測定のために使用した。以下のパラメーターを使用してＵＶ－ｖｉｓスキャンスペクトルを記録した：平均時間０．０５ｓ；データ間隔１ｎｍ；スキャン速度１２００ｎｍ／分；ベースライン補正あり。
Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを使用して溶液を１．５ｍＬバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）マイクロチューブ３８１０Ｘ）中に調製した。
アッセイされる化合物（２～５ｍＭ）のストック溶液をＨ２Ｏ－ＤＭＳＯ（１：１）中に調製し、－２０℃で貯蔵し、使用前に緩衝液で１．０ｍＭに希釈した。Ｌ－Ｃｙｓストック溶液（２０．０ｍＭ）を測定前に緩衝液中に新たに調製した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）をすべての測定のために使用した。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを使用して得られた、１８ＭΩ ｃｍ－１以上の抵抗を有する脱イオン水（ＭＱ水）中にすべての水性溶液を作製した。２
消光係数
測定のために、１０００μＬの緩衝液および１～５０μＬのプローブ（１．０ｍＭ）を混合し、次にキュベットに移した。吸光度スペクトル（２５０～８００ｎｍ）を緩衝液のブランクに対して測定した。ＭＳ Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して、各々の化合物の少なくとも６つの濃度を使用してプローブ濃度ｖｓ吸光度プロットの勾配から消光係数を算出した。
測定のために、１０００μＬの緩衝液および１～５０μＬのプローブ（１．０ｍＭ）を混合し、次にキュベットに移した。吸光度スペクトル（２５０～８００ｎｍ）を緩衝液のブランクに対して測定した。ＭＳ Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して、各々の化合物の少なくとも６つの濃度を使用してプローブ濃度ｖｓ吸光度プロットの勾配から消光係数を算出した。
同様に、過剰なＣｙｓ（１００μＭ）と反応させたプローブの溶液からεＣｙｓを決定した。反応は３７℃（インキュベーション時間１５分）で行った。ブランク反応をＣｙｓの添加なしで行った。
安定性の評価
測定のために、１０００μＬの緩衝液および１６μＬのプローブ（１．０ｍＭ）を混合し、次に＋４℃および＋３７℃で５ｈインキュベートした。得られた混合物をキュベットに移し、吸光度（２５０～８００ｎｍ）を測定した。各々の測定を３連で行った。
測定のために、１０００μＬの緩衝液および１６μＬのプローブ（１．０ｍＭ）を混合し、次に＋４℃および＋３７℃で５ｈインキュベートした。得られた混合物をキュベットに移し、吸光度（２５０～８００ｎｍ）を測定した。各々の測定を３連で行った。
溶解性の評価
実験において、５～１０ｍｇの乾燥した材料を室温で２５０～５００μＬのＨ２Ｏに懸濁した。得られた懸濁液を室温で１０分間遠心分離した（１６０００ｒｃｆ）。上清のＵＶ－ｖｉｓを室温で緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中で記録した。各々の測定を３連で行った。ペレットを真空中で１６ｈ乾燥させ、次に計量した。
実験において、５～１０ｍｇの乾燥した材料を室温で２５０～５００μＬのＨ２Ｏに懸濁した。得られた懸濁液を室温で１０分間遠心分離した（１６０００ｒｃｆ）。上清のＵＶ－ｖｉｓを室温で緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中で記録した。各々の測定を３連で行った。ペレットを真空中で１６ｈ乾燥させ、次に計量した。
上記のように、最終生成物を２工程合成（縮合およびアクリル化；スキーム１～３）において得た。ＭＦ６５の場合の６％を除いて、全体的な収率は２１～５９％。生成物をＨＰＬＣ－ＭＳ、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ、およびＵＶ－Ｖｉｓにより特徴付けた。
スキーム１．試薬および条件：（ｉ）ピペリジン（触媒）、ＥｔＯＨ、還流、Ａｒ；（ｉｉ）Ｅｔ３Ｎ（４当量）、ＤＣＭ、０℃、ｔ＜２ｈ、Ａｒ。
スキーム２．試薬および条件：（ｉ）ピペリジン（触媒）、ＥｔＯＨ、還流、Ａｒ；（ｉｉ）Ｅｔ３Ｎ（４当量）、ＤＣＭ、０℃、ｔ＜２ｈ、Ａｒ。
スキーム３．試薬および条件：（ｉ）ピペリジン（触媒）、ＥｔＯＨ、還流、Ａｒ；（ｉｉ）Ｅｔ３Ｎ（４当量）、ＤＣＭ、０℃、ｔ＜２ｈ、Ａｒ。
ＵＶ－ｖｉｓおよびＣｙｓ応答
ＵＶ－ｖｉｓおよびＣｙｓ応答
得られた色素のＵＶ－ｖｉｓを評価した。ベンゼン環上の選択された置換基は、初期メロシアニン色素についての値を増加させることを助けた。最も顕著な結果は、好ましい中間体化合物ＭＦ５６、ＭＦ５７およびＭＦ６６について観察された。
Ｃｙｓの存在下で記録されたスペクトルは、アクリロイルエステルの切断を通じた比色応答を裏付けた。合成されたプローブは、緑色および黄色範囲の可視スペクトルへの有意な深色性シフトを示した（表２）。さらに、それらのスペクトルプロファイルは、ＣｅｄｅｘシステムにおけるＣｙｓ感知応用のための波長要求（３４０、３７８、４０９、４８０、５１２、５２０、５５２、５８３、６２９、６５２、６５９および８００ｎｍ）を有利なことに満たしていた。
安定性
安定性は、生物学的アッセイ用の比色プローブの評価のための別の重要なパラメーターである。商用応用のためのプローブは４℃で数か月間貯蔵可能である必要がある。追加的に、安定性は、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ分析装置のアッセイ条件（３７℃）下で調べられる必要がある。
安定性は、生物学的アッセイ用の比色プローブの評価のための別の重要なパラメーターである。商用応用のためのプローブは４℃で数か月間貯蔵可能である必要がある。追加的に、安定性は、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ分析装置のアッセイ条件（３７℃）下で調べられる必要がある。
本発明者らは、貯蔵およびアッセイの通常の条件をシミュレートするために４℃および３７℃の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中でプローブの安定性を定性的に調べた。各々のプローブの溶液をＵＶ－ｖｉｓにより５ｈモニターした。すべての分光学的評価の結果を表３に要約する。
溶解性
プローブの水溶解性は、生物学的アッセイにおける化合物の性能のための別の重要な特性である。本発明者らは、ＵＶ－ｖｉｓを使用して本発明によるプローブの水中での溶解性を決定した。最初に、各々のプローブの過飽和の混合物を調製した。混合物を遠心分離し、次に上清のプローブにおける濃度をＵＶ－ｖｉｓにより調べた。結果をさらに検証するために、単離されたペレット重量から濃度を算出した。表４に見られるように、両方のアプローチで決定された結果は同じ範囲内にあり、同じ傾向に従った。２つのスルホ基を含有する好ましいプローブＭＦ７０は、そのアナログＬＺ０５および１つのスルホ基のみを含有するＭＦ５９と比較して高度に水溶性である。また、ＭＦ７０の溶解性は、文献から公知の化合物ＬＺ０７よりも優れている。
Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴにおけるプローブＭＦ７０の性能
得られたような迅速な動態プロファイル、安定性および低いバックグラウンドシグナルは、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴにおけるＣｙｓ感知のためにＭＦ７０をさらに使用することを促すものであった。試薬溶液を、モノクローナル抗体製造のために使用されるフィード培地中で様々なＣｙｓ濃度（０．５～７．６ｍＭ）で処理した。図３に示されるように、漸進的に増強された吸光度がＣｙｓの量の増加と共に観察された。これらの条件下で、信頼できる応答が１週の期間にかけて得られ（表５）、３．６μＭ Ｃｙｓの対応する検出限度、およびブランク２．２μＭ Ｃｙｓの限度であった。
得られたような迅速な動態プロファイル、安定性および低いバックグラウンドシグナルは、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴにおけるＣｙｓ感知のためにＭＦ７０をさらに使用することを促すものであった。試薬溶液を、モノクローナル抗体製造のために使用されるフィード培地中で様々なＣｙｓ濃度（０．５～７．６ｍＭ）で処理した。図３に示されるように、漸進的に増強された吸光度がＣｙｓの量の増加と共に観察された。これらの条件下で、信頼できる応答が１週の期間にかけて得られ（表５）、３．６μＭ Ｃｙｓの対応する検出限度、およびブランク２．２μＭ Ｃｙｓの限度であった。
結論として、本発明によるプローブ、および好ましくはプローブＭＦ７０は、商用アッセイのための要求を満たす。メロシアニン色素スキャフォールドは、明るい色素産生性シグナルを確実にする。オルト位におけるメチル基、およびスルホン酸基は、それぞれ加水分解に対する安定性および水溶解性を確実としているようである。
Claims (13)
- 式Ｉ
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３ －、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃは、式ＩＩ
式ＩＩＩ
式Ｖ
Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －の群から選択され、ｍは、１～１８から選択される整数である）
から選択される基から選択され、
ｎは、１、２および３から選択される）
による化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物。 - Ｒ１およびＲ２が、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３ －、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃが、式ＩＩ
であり、
ｎが１である、請求項１に記載の式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物。 - Ｒ１およびＲ２が、Ｒ３、Ｏ－Ｒ３、Ｓ－Ｒ３、ＳＯ３ －、ＳＯ３－Ｒ３から独立して選択され、Ｒ３が、Ｃ１～Ｃ３アルキル、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基から選択され、
Ａｃｃが、式ＩＩ
であり、
ｎが１である、請求項１に記載の式Ｉの化合物、ならびにその好適な塩および溶媒和物。 - 以下の式ＶＩ～ＩＸ
- 請求項１に記載の式Ｉの化合物を調製するための方法であって、
ａ）式ＶＩ
の化合物を、
式ＩＩ
式ＩＩＩ
式ＩＶ
式Ｖ
（ここで、式ＩＩ～Ｖの各々において、芳香環は１、２または３個のＳＯ３ －基で置換されていてもよく、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１８アルキル、Ｃ１～Ｃ６シクロアルキル、および（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ３ －から選択され、ｍは１～１８の整数である）
と好適に反応させて、式ＶＩＩＩ
の化合物を得る工程、ならびに
ｂ）式ＶＩＩＩの前記化合物を塩化アクリロイルと好適に反応させる工程
を含む、方法。 - 試験試料中のシステインを検出するための方法であって、以下：
ａ）システインを含有することが予期される試験試料と接触させる前および後に、好適な溶媒中の請求項１～４のいずれか一項に記載される化合物の溶液のＵＶ／Ｖｉｓ吸光度を測定する工程、
ｂ）工程ａ）において測定されたＵＶ／Ｖｉｓスペクトルの比較により吸光度における差異を決定する工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）において決定された吸光度における前記差異に基づいて前記試験試料中のシステインを検出する工程
を含む、方法。 - 前記ＵＶ／Ｖｉｓ吸光度が、２００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内の離散波長において測定される、請求項５に記載の方法。
- 前記波長が、３４０、３７８、４０９、４８０、５１２、５２０、５５２、５８３、６２９、６５９および８００ｎｍからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 前記溶媒が水性溶媒である、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
- 吸光度における前記差異の前記決定が、色変化の目視検査によるものである、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
- 吸光度における前記差異の前記決定が、Ｃｅｄｅｘによるものである、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
- 試験試料中のシステインを検出するためのキットであって、予め決定された量の請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物を含むバイアルまたは容器を、前記キットを使用するためのマニュアルと共に含む、キット。
- 試験試料、好ましくは水性試験試料中のシステインを検出するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１２に記載のキットの使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21162688 | 2021-03-15 | ||
| EP21162688.2 | 2021-03-15 | ||
| PCT/EP2022/056065 WO2022194645A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-03-09 | Highly water-soluble and stable chemosensor for cysteine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024509868A true JP2024509868A (ja) | 2024-03-05 |
Family
ID=74874779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023553973A Pending JP2024509868A (ja) | 2021-03-15 | 2022-03-09 | システインのための高度に水溶性で安定な化学センサー |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240103006A1 (ja) |
| EP (1) | EP4308547A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024509868A (ja) |
| CN (1) | CN117015529A (ja) |
| WO (1) | WO2022194645A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015198341A1 (en) * | 2014-06-25 | 2015-12-30 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for selective detection and estimation of histidine and cystein |
| US10030002B2 (en) * | 2015-04-16 | 2018-07-24 | Council Of Scientific & Industrial Research | Coumarin derivative for detection of cysteine and process for the synthesis thereof |
| ES2726476A1 (es) * | 2018-04-04 | 2019-10-04 | Consejo Superior Investigacion | Quimioteca combinatoria dinamica basada en pseudopeptidos y su uso para la deteccion de cisteina y otros biotioles |
-
2022
- 2022-03-09 CN CN202280020257.6A patent/CN117015529A/zh active Pending
- 2022-03-09 EP EP22712368.4A patent/EP4308547A1/en active Pending
- 2022-03-09 JP JP2023553973A patent/JP2024509868A/ja active Pending
- 2022-03-09 WO PCT/EP2022/056065 patent/WO2022194645A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-09-15 US US18/468,249 patent/US20240103006A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022194645A1 (en) | 2022-09-22 |
| CN117015529A (zh) | 2023-11-07 |
| EP4308547A1 (en) | 2024-01-24 |
| US20240103006A1 (en) | 2024-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | A series of BODIPY-based probes for the detection of cysteine and homocysteine in living cells | |
| US9201075B2 (en) | Colorimetric and fluorometric determination of homocysteine and cysteine | |
| CN108484622B (zh) | 多信号荧光探针的合成及其同时区分检测Hcy、Cys和GSH的应用 | |
| Wang et al. | Thiazolyl substituted NBD as fluorescent probe for the detection of homocysteine and cysteine | |
| Yang et al. | A novel mitochondria-targeted ratiometric fluorescent probe for endogenous sulfur dioxide derivatives as a cancer-detecting tool | |
| CN103842818A (zh) | 具有增强的ms信号的聚糖和其它生物分子的快速荧光标记 | |
| Gao et al. | BODIPY-based turn-on fluorescent probes for cysteine and homocysteine | |
| Zhang et al. | Endoplasmic reticulum targeted fluorescent probe for the detection of hydrogen sulfide based on a twist-blockage strategy | |
| Wu et al. | A highly selective visible light excitable boron dipyrromethene probe for cysteine over homocysteine and glutathione based on a Michael addition reaction | |
| CN113185506B (zh) | 多信号荧光探针的合成及其在检测Cys、GSH和Hcy中的应用 | |
| Fu et al. | Quinolone-based fluorescent probes for distinguished detection of Cys and GSH through different fluorescence channels | |
| Wang et al. | A water-soluble turn-on fluorescent probe for rapid discrimination and imaging of Cys/Hcy and GSH in cells and zebrafish through different fluorescent channels | |
| Chen et al. | A coumarin-based fluorescent probe with 4-phenylselenium as the active site for multi-channel discrimination of biothiols | |
| Wei et al. | Mitochondria-targeted ratiometric fluorescent imaging of cysteine | |
| Wang et al. | A new fluorescence turn-on probe for biothiols based on photoinduced electron transfer and its application in living cells | |
| Zhang et al. | Dimethylamino naphthalene-based fluorescent probes for hydrogen sulfide detection and living cell imaging | |
| US11821902B2 (en) | Quantitative peptide or protein assay | |
| Nie et al. | Specific and sensitive imaging of basal cysteine over homocysteine in living cells | |
| CN111233928B (zh) | 一种香豆素衍生物Mito-Cys及其制备方法和应用 | |
| Li et al. | A long wavelength fluorescent probe for biothiols and its application in cell imaging | |
| JP2024509868A (ja) | システインのための高度に水溶性で安定な化学センサー | |
| CN111087362B (zh) | 一种高选择性检测甲醛的荧光探针及其合成方法与应用 | |
| Li et al. | Preparation for nitrocellulose membrane-poly (vinyl alcohol)-ionic imprinting and its application to determine trace copper by room temperature phosphorimetry | |
| Yue et al. | Three asymmetric BODIPY derivatives as fluorescent probes for highly selective and sensitive detection of cysteine in living cells | |
| CN114249743B (zh) | 多信号荧光探针的合成及其同时区分Hcy、Cys、SO2和GSH的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230913 |