JP2024506007A - 眼の病態の治療に使用するためのngfアイソフォーム - Google Patents
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Abstract
本発明は、NGFの投与による眼の病態の治療の分野に関し、NGFは配列番号1のNGFアイソフォームを50重量%超含む。前記NGFは、NGFの増殖および生存効果が所望され、p75NTRのプロアポトーシス効果が有害である眼の病態の治療に特に有用である。
Description
本発明は、眼の病態の治療、特にNGFの特定のアイソフォームの投与による眼の病態の治療の分野に関する。
神経成長因子(NGF)は、進化的に十分に保存されたニューロトロフィン成長因子のファミリーのメンバーであり、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経栄養素-3(NT3)およびNT4/5も包含する。
それは、2つの構造的に無関係な細胞表面受容体、高親和性受容体チロシンキナーゼA(TrKA)および低親和性p75ニューロトロフィン受容体(p75NTR)と相互作用することによってその活性を発揮する。
これらの2つの受容体が、細胞に対して複雑かつしばしば反対のNGFの効果を仲介することが示されている。
TrKAは、NGFに対して選択的であり、PI3キナーゼ、Ras/細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)、Akt1およびプロテインキナーゼC(PKC)などの細胞の生存、増殖および分化を促進する異なるシグナル伝達経路を誘発する(非特許文献1、非特許文献2)。さらに、TrKAの活性化は、例えば、カプサーゼ3を阻害することにより、細胞内のアポトーシスシグナル伝達を阻害する(非特許文献3)。
p75ニューロトロフィン受容体(p75NTR)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属し、非特異的にすべてのニューロトロフィンに結合する。TrKA受容体に結合したときに観察されたものとは対照的に、p75NTRへのNGF結合は、腫瘍壊死因子(TNF)および、TNF受容体関連因子(TRAF)、核カッパB(NFkB)、カプサーゼおよびp53を含むFas受容体などの、細胞死受容体によって活性化されるものと同様の多数の細胞内メディエーターの活性化によってアポトーシスを誘導する(非特許文献4、非特許文献5)。
したがって、細胞へのNGFの最終的な作用は、発現レベルおよび上記の2つの受容体の活性化に著しく依存する。したがって、2つの受容体の比率の変化は、TrKAによって仲介される増殖、成長促進および生存効果のいずれか、またはp75NRTによって仲介されるアポトーシス応答の支配により、NGFによって誘導される保護効果および有害な効果の間でバランスを変化させることができ、したがって、細胞へのNGFの最終的な作用を変化させる(非特許文献6、非特許文献7)。
NGFのp75NTRに対する親和性はTrKAに対してよりも低いが、その細胞型分布はTrKAのものよりも広い。
両方のNGF受容体は、角膜、結膜、角膜縁上皮(limbal epithelium)、網膜および視神経を含む眼の前部および後部の両方で広く発現し、NGFは、眼の生理学および病理学の両方において、細胞生存、増殖、分化およびアポトーシスなどのプロセスを調節する重要な役割を有することが実証されている(非特許文献8、非特許文献9、非特許文献10)。いくつかの実証研究は、TrKA刺激が虚血性損傷、視神経切断、および高眼圧症後のRGCの生存を促進することを実証した(非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13、非特許文献14、非特許文献4、非特許文献15)。
上記にかかわらず、視覚系におけるNGFの効果は複雑であり、細胞状況並びに各NGF受容体の細胞分布および発現レベルに応じて、一義的ではない。例えば、網膜において、RGCはTrKAを発現し、グリア細胞はp75NTRを発現する。緑内障の動物モデルにおける研究では、生存促進性TrKA受容体の選択的アゴニストがRGCの死を予防するのに有効であるが、NGFもアポトーシス促進性p75受容体のアンタゴニストもRGCを保護しないことが示された(非特許文献16)。
その後の研究は、p75NTRの薬理学的阻害において、またはp75NTRノックアウトマウスにおいて、軸索切断されたRGCの生存率の向上を示した。加えて、NGFまたはTrKAアゴニストと、p75NTRアンタゴニストとの組み合わせは、インビボでのRGC神経保護をさらに増強した(非特許文献17)。
要約すると、いくつかのデータは、NGFがRGCのTrKA受容体に結合すると神経保護効果を発揮し、グリア細胞に作用するとp75NTRがこの効果に拮抗するという仮説を裏付けている(非特許文献18)。
これらの論争の的になっている発見は、NGFが、異なる状況での網膜におけるTrKAおよびp75NTRの相対的な発現が異なるために、RGCに対して異なる作用を有するという観察結果によって説明することができ、したがって、NGF栄養支持体の不具合は、TrKAに関連するp75NTRの進行性の上方制御に関連し得る(非特許文献15、非特許文献19)。
この証拠は、p75NTRの選択的活性化が正常な網膜におけるRGC死を誘導し、疾患眼におけるRGC死を加速させる一方で、選択的TrKAアゴニストが慢性および急性神経変性においてRGCを保護することを示す研究によって裏付けられる(非特許文献20、非特許文献21)。
いくつかの研究は、網膜において、TrKAは主に網膜神経節細胞(RGC)に発現する一方で、ミュラー細胞およびグリア細胞ではp75NRTが発現すること(非特許文献4)、およびグリアにおけるp75NRTの活性化は、RGCに対するTrKA活性化の保護効果を相殺する神経毒性経路を誘発することができることを実証している。
得られたデータの不整合のさらなる理由はまた、タンパク質投与の異なる経路またはレジメンの使用に起因し得る。実際、タンパク質が投与される濃度は、NGFに対する応答に影響を及ぼすようであり、より高い濃度は、p75NTRのより高い活性化をもたらす。したがって、高濃度のNGFを必要とする投与経路またはレジメンは、低濃度よりもNGFの生存活性を誘導するのに効果が低い場合がある。
眼の他の状態におけるNGFの他の潜在的な治療用途は、このニューロトロフィンの生存促進性効果および栄養効果に基づいており、したがって、その有効性は、TrKAとp75NTR活性化との間のバランスに大きく依存する。
特に、証拠は、NGFの抗アプトトーシス(antiaptototic)効果および栄養効果が以下に有用であり得ることを示す:
-角膜移植における角膜移植片拒絶反応の予防(非特許文献22)
-角膜縁上皮前駆細胞の保存および増殖(非特許文献23、非特許文献24、非特許文献25)、
-光毒性角膜症(phototoxic keratopathy)(非特許文献26)、角膜ジストロフィーおよび角膜変性(corneal degenerations)並びに角膜潰瘍(非特許文献27、非特許文献28、非特許文献29、非特許文献30、非特許文献31、非特許文献32、非特許文献9)、乾性角結膜炎(非特許文献15)、網膜剥離を含む網膜疾患(非特許文献33)、糖尿病性網膜症(非特許文献34)、網膜神経変性および/または虚血(非特許文献35)、光毒性網膜症(非特許文献26、非特許文献36)、網膜上膜(非特許文献37)、黄斑円孔(非特許文献38)、黄斑変性(非特許文献39)および視神経症(非特許文献40、非特許文献41)を含む、角膜および結膜疾患の治療。
-角膜移植における角膜移植片拒絶反応の予防(非特許文献22)
-角膜縁上皮前駆細胞の保存および増殖(非特許文献23、非特許文献24、非特許文献25)、
-光毒性角膜症(phototoxic keratopathy)(非特許文献26)、角膜ジストロフィーおよび角膜変性(corneal degenerations)並びに角膜潰瘍(非特許文献27、非特許文献28、非特許文献29、非特許文献30、非特許文献31、非特許文献32、非特許文献9)、乾性角結膜炎(非特許文献15)、網膜剥離を含む網膜疾患(非特許文献33)、糖尿病性網膜症(非特許文献34)、網膜神経変性および/または虚血(非特許文献35)、光毒性網膜症(非特許文献26、非特許文献36)、網膜上膜(非特許文献37)、黄斑円孔(非特許文献38)、黄斑変性(非特許文献39)および視神経症(非特許文献40、非特許文献41)を含む、角膜および結膜疾患の治療。
しかし、NGFによるp75NTR受容体の活性化は、上記の病態におけるNGFのインビボ効果を予測することを困難にする。
チャイニーズハムスター卵巣細胞においてタンパク質が120アミノ酸配列として発現されるとき、トリプシンおよび/またはカルボキシペプチダーゼによる部分的な酵素消化により、117および118アミノ酸の多数の異なるrhNGF変異が同定されている。これらの変異型は分析され、ニワトリ後根神経節細胞生存アッセイおよびラット褐色細胞腫軸索伸長アッセイの両方において等能である(equipotent)ことが見出されている(非特許文献42)。
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出願人は、眼におけるNGF活性に関する文献における多少議論の的になっているデータを明らかにすることを目的とした研究を実施している。
これらの研究は、市販のNGFが、単独または混合物のいずれかで、長さが異なるだけのアミノ酸配列によって特徴付けられる、異なるNGFのアイソフォームを含むことを示している。
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、これらのNGFのアイソフォームが、TrKAまたはp75NTR受容体によって誘導される経路を活性化する異なる能力を有し、異なる活性パターンをもたらすことを見出した。
特に、本発明者らは、配列番号1の118アミノ酸配列を有するNGFアイソフォームが、主に、TrKA仲介経路を活性化し、p75NTRによって仲介されるアポトーシス経路を阻害する一方で、配列番号2、3および4のそれぞれ120、117または119アミノ酸配列を有するアイソフォームが、p75NTR依存性アポトーシス経路を活性化するより高い能力を有することを見出した。NGFアイソフォームの異なる受容体選択性に関連するこれらの知見は、NGFの治療用途に関する文献に見られる矛盾を理解するのに役立ち得る。
上記を考慮すると、配列番号1のNGFアイソフォームは、増殖および生存に対するNGFの効果が所望され、p75NTRのアポトーシス促進効果が有害である病態の治療に特に有用である。
したがって、本発明の第1の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮(macular atrophy)、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症;角縁幹細胞欠乏(limbal stem cell deficiency);好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損(persistent epithelial defects)、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態;結膜の病態;好ましくは緑内障、虚血性、外傷性、変性性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の予防および/または治療に使用するための、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのNGFであり、前記NGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、50重量%超の配列番号1のNGFを含む。
本発明の第2の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症;角縁幹細胞欠乏;好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態;結膜の病態;好ましくは緑内障、虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の治療に使用するための、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するための、NGFを治療上有効な量で含む医薬組成物に関し、前記NGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、50重量%超の配列番号1のNGFアイソフォームと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
本発明の第3の対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択される網膜症;角縁幹細胞欠乏;好ましくは円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび角膜変性、並びに乾性角結膜炎から選択される角膜の病態;結膜の病態;好ましくは緑内障、虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性の視神経症から選択される視神経症、から選択される眼の病態の治療、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防の方法に関し、NGFを治療上有効な量で対象に投与することを含み、前記NGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総量に対して、50重量%超の配列番号1のNGFを含む。
本発明の第1の対象は、網膜症、角膜の病態、視神経症、結膜の病態、角縁幹細胞欠乏から選択される病態の治療および/または予防、並びに角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのNGFであり、前記NGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、50重量%超の配列番号1のNGFアイソフォームを含む。
本発明による「NGF」という用語は、機能的に活性なNGFアイソフォームまたは機能的に活性なNGFアイソフォームの混合物を指す。好ましくは、前記NGFアイソフォームは、ヒトNGFのアイソフォームである。
本文脈において、「NGFアイソフォーム」とは、異なるアミノ酸配列を有する2つ以上の機能的に活性なNGFタンパク質のうちのいずれかを意味し、そのような配列は、それらの長さにおいてのみ異なる。好ましくは、前記NGFアイソフォームは、配列番号2のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、または配列番号2とは長さが異なる配列、すなわち、追加のアミノ酸の存在、またはN末端もしくはC末端、好ましくはC末端におけるアミノ酸の欠失を有する。好ましくは、前記NGFアイソフォームは、配列番号1、2、3、4のアミノ酸配列を有するNGFタンパク質である。
特定のNGFアイソフォームを指す場合、酸化、糖化、またはグリコシル化などの翻訳後修飾の存在とは独立して、そのようなアイソフォームのアミノ酸配列を有するすべての形態のNGFが含まれる。
好ましい実施形態において、前記NGFに含まれる前記NGFアイソフォームは、配列番号1、2、3または4のNGFアイソフォームまたはそれらの混合物から選択される。
好ましくは、前記網膜症は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫、および網膜上膜から選択される。
好ましくは、前記角膜の病態は、円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび変性、並びに乾性角結膜炎から選択される。
好ましくは、前記視神経症は、緑内障並びに虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性視神経症から選択される。
特に好ましい実施形態によれば、上記の病態は、緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫および網膜上膜から選択され、より好ましくは、上記の病態は、緑内障である。
本発明による使用のためのNGFは、好ましくは、配列番号1の高純度NGFアイソフォームからなる。
好ましくは、本発明による使用のためのNGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、少なくとも60重量%、より好ましくは少なくとも70重量%、さらにより好ましくは少なくとも80重量%、さらに好ましくは少なくとも90重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、さらにより好ましくは少なくとも98重量%、さらにより好ましくは少なくとも99重量%、さらにより好ましくは100重量%の配列番号1のNGFアイソフォームを含む。
好ましくは、本発明による使用のためのNGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、少なくとも60重量%、より好ましくは少なくとも70重量%、さらにより好ましくは少なくとも80重量%、さらにより好ましくは少なくとも90重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、さらにより好ましくは少なくとも98重量%、さらにより好ましくは少なくとも99重量%、さらにより好ましくは100重量%の配列番号1のNGFアイソフォームを含み、前記NGFに含まれる前記NGFアイソフォームは、配列番号1、2、3もしくは4のNGFアイソフォームもしくはそれらの混合物を含むか、またはそれらから選択される。
好ましくは、本発明による使用のためのNGFは、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、配列番号2、3もしくは4のNGFアイソフォームまたはそれらの混合物を、20重量%未満、より好ましくは10重量%未満、さらにより好ましくは5重量%未満、さらにより好ましくは2重量%未満、さらにより好ましくは1重量%未満の総重量で含む。
好ましくは、前記配列番号1のNGFアイソフォームは、NGFの他のアイソフォームとの組み合わせで使用されない。
好ましくは、前記配列番号1のNGFアイソフォームは、配列番号2、3または4を有するNGFのアイソフォームとの組み合わせで使用されない。
好ましくは、本発明による使用のためのNGFは、NGFの1つのアイソフォームのみを含み、前記アイソフォームは、配列番号1の配列を有する。
好ましくは、前記配列番号1のNGFアイソフォームは、翻訳後修飾の合計において、15重量%を超えず、好ましくは10重量%を超えず、または5重量%を超えない。
より好ましくは、前記配列番号1のNGFアイソフォームは、いかなる翻訳後修飾も含まず、すなわち、非修飾アミノ酸のみからなる。
本発明による使用のためのNGFは、NGFの総重量に対して、好ましくは20重量%未満、より好ましくは10重量%未満、さらにより好ましくは5重量%未満の総量で、他の不純物を含み得る。
用語「他の不純物」は、NGFアイソフォームおよびそれらの翻訳後修飾とは異なる化合物を指す。
好ましくは、上記の配列番号1のNGFアイソフォームは、組換えヒトNGFである。これは、例えば、proNGF変異体SP174-101(国際公開第2013/092776号の配列番号5)の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、国際公開第2000/022119号および国際公開第2013/092776号に記載のプロセスに従って、E.Coliで製造されてもよい。
好ましくは、本発明の第1の態様による使用のための上記NGFは、眼科用途用医薬組成物の形態で投与される。
したがって、本発明のさらなる対象は、治療上有効な量の上記のような使用のためのNGFと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物である。
上記の病態の治療または予防における本NGFの投与の正しい用量およびレジメンは、例えば、投与経路および治療を受ける個人の疾患の重症度など、多くの要因に依存する。
好ましくは、前記医薬組成物は、眼科用途用医薬組成物である。
好ましくは、前記医薬組成物は、上記NGFおよび1つ以上の眼科的に許容可能な賦形剤を含む。
「眼科的に許容可能な賦形剤」は、眼に有害な影響を及ぼすことなく眼の疾患または状態を治療するために、薬剤を眼および/またはまぶたに送達することを可能にする不活性賦形剤である。
好ましくは、前記眼科用組成物は、液体眼科用組成物、好ましくは水性液体眼科用組成物、好ましくは水性点眼剤組成物である。この組成物は、前眼部への局所投与に特に適する。
前記液体組成物は、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であってもよい。前記液体組成物は、ミセルを含んでもよい。
好ましくは、前記液体組成物は、眼科的に許容可能な粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、防腐剤および界面活性剤から選択される眼科的に許容可能な賦形剤を含む。
粘度増強剤は、組成物の粘度を増加させ、結膜嚢におけるその保持を改善する機能を有し、好ましくは、セルロース誘導体、好ましくはヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース;ポリビニルピロリドン、並びにゲル化剤、好ましくはジェランガム、キサンタンガム、およびカーボポール-974から選択される。
浸透促進剤は、眼膜を越える薬物透過性を増強する機能を有し、好ましくは、シクロデキストリン、キレート剤、クラウンエーテル、胆汁酸および胆汁塩から選択される。
緩衝剤は、眼での使用に適合するように、好ましくは6~8のpHで、製剤の正しいpHを提供し、維持する機能を有する。好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液であるが、pHを所望の範囲内に維持することができる他の緩衝液、特に眼科用途に適した緩衝液も含まれる。
浸透圧調節剤は、眼液で液体組成物を等張にすることができる塩である。好ましい塩は塩化ナトリウム(NaCl)であるが、例えば、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)および塩化マグネシウム(MgCl2)並びにそれらの混合物など、他の生物学的に許容可能な塩を使用してもよい。
防腐剤は微生物活動を阻害する。好適な防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの第四級アンモニウム化合物が挙げられる。
界面活性剤は、組成物を安定させ、容器の様々な表面へのNGF吸着を低減または防止する機能を有し、好ましくは、Tweeeny 80などのポリソルベート、Pluronics F68などのポロキサマー、または血清アルブミンなどのタンパク質から選択される。
前記液体、点眼剤組成物は、組成物を含むキット、組成物を保持するための容器、および点眼剤ディスペンサーの一部であり得る。
NGF水性組成物は、正しい流体張力を提供し、NGFを溶液中に維持するのに十分な量の生物学的に許容可能な塩を含んでもよい。
医薬水性組成物に一般的に使用され、技術者に知られている他の添加剤、例えば糖、糖アルコール、アミノ酸、セルロース誘導体、ポリエチレングリコールなどが、NGF水性組成物中に存在してもよい。
NGF水性組成物は、組成物成分の適切な濃度を達成するのに十分な量の水を含む。
液体組成物は、NGFを治療上有効な濃度で含む。
好ましくは、液体組成物中に、上記NGFは、水性組成物の約0.0001%~約0.5%w/v、より好ましくは約0.001%~約0.1%w/v、最も好ましくは約0.002%w/vの範囲の濃度で存在する。
一実施形態によれば、本組成物は、好ましくは硝子体内注射または外科的移植によって、眼の後眼部への投与に適した組成物である。本発明による使用のためのNGFは、上記のように、p75NTRのより高い活性化に関連するより高い濃度のNGFの使用を必要とするため、このタイプの投与にとって特に有利である。したがって、これらの濃度では、配列番号1のNGFアイソフォームとは異なるアイソフォームの存在は、p75NTR活性化の顕著な増加、および結果として、より関連のある副作用の顕著な増加をもたらし得る。
したがって、本出願では、NGFは、好ましくは、配列番号2、3もしくは4のNGFアイソフォームまたはそれらの混合物を、前記NGFに含まれるすべてのNGFアイソフォームの総重量に対して、5重量%未満、より好ましくは2重量%未満、さらにより好ましくは1重量%未満の総重量で含む。
好ましくは、この実施形態によれば、本発明による使用のための組成物は、硝子体内注射または移植によって、眼の網膜、強膜、後眼房、硝子体腔、網膜下腔、脈絡膜上部(suprachoroidal segment)に投与される。
好ましくは、この実施形態によれば、NGFは、組成物中に、約0.01%~約0.1%w/v、より好ましくは約0.02%w/v~約0.05%w/v、最も好ましくは約0.03%~約0.04%w/vの範囲の濃度で存在する。
特に好ましい実施形態によれば、前記眼科用組成物は、眼への硝子体内投与のための制御放出組成物である。
この実施形態によれば、本組成物は、ポリマー微粒子の形態でもよく、前記ポリマーは、好ましくは、生分解性または水溶性ポリマーであり、上記NGFを眼に徐々に放出する特性を有する。
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1-さまざまなrhNGFの評価
a)材料
国際公開第2000/022119号および国際公開第2013/092776号に記載のプロセスに従い、ProNGF変異体SP174-101(国際公開第2013/092776号の配列番号5)の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、118個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する組換えヒトNGF(rhNGF)(配列番号1、以下、rhNGF-118)を大腸菌で製造した。
a)材料
国際公開第2000/022119号および国際公開第2013/092776号に記載のプロセスに従い、ProNGF変異体SP174-101(国際公開第2013/092776号の配列番号5)の配列を組み込んだ発現ベクターを使用して、118個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する組換えヒトNGF(rhNGF)(配列番号1、以下、rhNGF-118)を大腸菌で製造した。
4つの異なる市販のrhNGFを購入した:
-rhNGF-1:R&D Systems Incから購入した組換えヒトNGF(製品コード:256-GF/CF)、マウス骨髄腫細胞株で製造される。
-rhNGF2:Active Bioscienceから購入した組換えヒトNGF(製品コード 1745.955)、CHO細胞で製造される。
-rhNGF3:Sino Biologicalから購入した組換えヒトNGF(製品コード:11050-HNAC)、CHO細胞で製造される。
-rhNGF4:Peprotechから購入した組換えヒトNGF(製品コード:450-01)、大腸菌で製造される。
-rhNGF-1:R&D Systems Incから購入した組換えヒトNGF(製品コード:256-GF/CF)、マウス骨髄腫細胞株で製造される。
-rhNGF2:Active Bioscienceから購入した組換えヒトNGF(製品コード 1745.955)、CHO細胞で製造される。
-rhNGF3:Sino Biologicalから購入した組換えヒトNGF(製品コード:11050-HNAC)、CHO細胞で製造される。
-rhNGF4:Peprotechから購入した組換えヒトNGF(製品コード:450-01)、大腸菌で製造される。
b)さまざまなrhNGFのHPLC分析
異なる起源からの上記rhNGFの試料を、逆相HPLC-UV、分子量を決定するための逆相UHPLC-MS、およびペプチドマッピングのための逆相HPLC-MSによって分析した。HPLC分析の結果を図8~11に示し、以下の表1~5に報告する。
異なる起源からの上記rhNGFの試料を、逆相HPLC-UV、分子量を決定するための逆相UHPLC-MS、およびペプチドマッピングのための逆相HPLC-MSによって分析した。HPLC分析の結果を図8~11に示し、以下の表1~5に報告する。
逆相HPLC-UV分析
体積ポンプ勾配システム、冷却サンプル注入デバイス、およびUV検出器を備えるWaters HPLCシステムをこの分析に使用した。分析分離は、Phenomenexカラム、モデルJupiter C4、300A、250×4.6mm(5μm粒径)を使用して行った。
体積ポンプ勾配システム、冷却サンプル注入デバイス、およびUV検出器を備えるWaters HPLCシステムをこの分析に使用した。分析分離は、Phenomenexカラム、モデルJupiter C4、300A、250×4.6mm(5μm粒径)を使用して行った。
勾配溶出を、どちらも0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は1mL/分であり、カラム温度は37℃に維持し、波長は220nmに設定した。
この手順を、rhNGF-118および上記の市販のrhNGFに並行して適用した。
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、試験されるrhNGF試料を室温で解凍し、処理した。
HPLCシステムに注入する前に、すべての試料を製剤緩衝液(リン酸緩衝液50mM、NaCl 100mM、pH7.2)で、0.3~0.1mg/mLの範囲の最終濃度まで希釈した。
UHPLC-MS分析
加熱エレクトロスプレーイオン化源(HESI)を備えたOrbitrap QExactive質量分析計(Thermo Scientific)と結合したUHPLCシステムをこの分析に使用した。
加熱エレクトロスプレーイオン化源(HESI)を備えたOrbitrap QExactive質量分析計(Thermo Scientific)と結合したUHPLCシステムをこの分析に使用した。
分析分離は、Watersカラム、モデルAcquity UPLCタンパク質BEH C4 300A、100×2.1mm(1.7μm粒径)を使用して行った。勾配溶出を、どちらも0.05%のトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は0.3mL/分であり、カラム温度は33℃に維持した。無傷なタンパク質の特性評価は、Biopharma Finder Software(Thermo Scientific)を使用して質量分析データに行った。
この手順を、rhNGF-118および上記の市販のrhNGFに並行して適用した。
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、rhNGF試料を室温で解凍し、処理した。UHPLCシステムに注入する前に、すべての試料を製剤緩衝液で0.3~0.1mg/mLの範囲の最終濃度に希釈した。
異なる起源のrhNGFのペプチドマッピングのための逆相HPLC-MS
加熱エレクトロスプレーイオン化源(HESI)を備えたOrbitrap QExactive質量分析計(Thermo Scientific)と結合したUHPLCシステムをこの分析に使用した。
加熱エレクトロスプレーイオン化源(HESI)を備えたOrbitrap QExactive質量分析計(Thermo Scientific)と結合したUHPLCシステムをこの分析に使用した。
分析分離は、Phenomenexカラム、モデルJupiter C18 300A、250×2.1mm(5μm粒径)を使用して行った。勾配溶出を、どちらも0.1%のトリフルオロ酢酸を含有する、水およびアセトニトリルからなる移動相で行った。流速は0.2mL/分であり、カラム温度は53℃に維持した。
この手順を、rhNGF-118および上記の市販のrhNGFに並行して適用した。
詳細には、供給業者によって提供される指示に従って、NGF試料を室温で解凍し、処理した。
各NGF試料の合計300μgをトリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させ、4℃で20分間遠心分離した。試料を再懸濁し、グアニジン-HCl 5.92Mおよび炭酸水素アンモニウム100mM(pH7.8)で変性させた。ジチオスレイトール(DTT)50mMを添加し、続いて56℃で90分間インキュベートすることによって、還元を達成した。ヨードアセトアミド(IAA)75mMを添加し、続いて暗闇の中で30分間室温でインキュベートすることによってアルキル化を行った。過剰のIAAのクエンチは、50mMのDDTの溶液を試料に添加し、続いて37℃で30分間インキュベートすることによって行った。トリプシン(質量比1/17.5 w/wのトリプシン/タンパク質)を添加し、37℃で一晩(約18時間)インキュベートして、酵素消化を行った。インキュベート後、試料を遠心分離して分析した。ペプチド同定は、Biopharma Finder Software(Thermo Fisher)を使用してMS/MSデータに行った。
逆相HPLCクロマトグラムを図8~12に示し、対応するHPLC表の主なピークを表2~6に報告する。
見て分かるように、rhNGF-118の拡大クロマトグラム(図8)および表2は、21.860分の保持時間(RT)における主ピークおよび他の副ピークを示す。
RhNGF-118の質量分析から、すべてのピークが118個のアミノ酸の同じ配列を有することが確認され、主ピークは翻訳後修飾のないrhNGF-118に対応し、副ピークは翻訳後修飾を有するrhNGF-118に対応する。主ピークの分子量(MW)は13252.5Daである(表1)。
図9に、rhNGF-1のクロマトグラムを報告する。21.635、21.815および22.034分にRTを有する3つの主ピークを検出した(表3を参照)。質量分析から、rhNGF-1の3つの主ピークは、117、118、119、および120個のアミノ酸で構成される異なる長さの配列を示した(詳細は表1および表3を参照)。
rhNGF-2およびrhNGF-3(図10~11、表4および5)に関して、それらは、それぞれ22.091および22.050分のRTにおいて、主ピークを特徴とし、どちらも(質量分析によって確認される)117個のアミノ酸の配列に対応する。
それらの関連する翻訳後修飾形態を含む各アイソフォームに対応する保持時間および組成パーセンテージを、以下の表1(第2および第3の列)に要約する。
これらの結果を合わせると、市販製品のrhNGF-1、rhNGF-2、およびrhNGF-3は、均質な組成を有さないこと、および/またはrhNGFのより短いアイソフォームを含有することが実証される。
表1および表2~6に見られるように、rhNGF-118は、配列番号1のNGFの分子量に対応する分子量を有するが、分析された市販製品は、異なる分子量のアイソフォームまたはそれらの混合物を含む。
RhNGF-118は、配列番号1の118アミノ酸配列を有するNGFアイソフォーム100%からなり、場合によっては、翻訳後修飾を少量の割合で有するが、市販製品は、配列番号1の118アミノ酸の長さとは異なるアミノ酸長を有するNGFアイソフォームの存在を特徴とする。
特に、rhNGF-1は、117個(配列番号3)、118個(配列番号1)、119個(配列番号4)および120個(配列番号2)のアミノ酸を有し、大きな割合の119個および120個のアミノ酸のアイソフォームを有する、NGFの異なるアイソフォームの混合物を含む。
rhNGF-2およびrhNGF-3は、117個のアミノ酸(配列番号3)の配列を有するNGFのアイソフォームからなる。
rhNGF-4は、120個のアミノ酸(配列番号2)の配列を有するNGFのアイソフォームからなる。
また、117個(配列番号3)、118個(配列番号1)、119個(配列番号4)および120個(配列番号2)のアミノ酸を有する上記アイソフォームは、わずかな割合の翻訳後修飾タンパク質、例えば、酸化タンパク質または糖化タンパク質を含む。
実施例2-プロテオミクス分析
NGF応答性細胞内シグナル伝達経路を調節する能力を調べるために、rhNGF-118およびrhNGF-1についてプロテオミクス解析を行った。
NGF応答性細胞内シグナル伝達経路を調節する能力を調べるために、rhNGF-118およびrhNGF-1についてプロテオミクス解析を行った。
この目的のために、眼の異なる領域に由来する2つのヒト細胞株、ヒト網膜色素上皮細胞(RPE、hTERT-RPE-1、ATCC CLR-400)、ヒト角膜上皮細胞(HCEC、P10871-IM InnoProt)、およびラット副腎髄質の褐色細胞腫に由来する一細胞株(PC-12、Ceinge、cod.Art.CF017.04)を使用した。
NGFシグナル伝達は、2つの主要な受容体、TrKAおよびp75によって仲介され、したがって、分析を開始する前に、使用されるすべての細胞株におけるこれらの受容体の発現をFACS(蛍光活性化細胞選別)によって評価した。
図1に見られるように、両方の受容体は、異なる量であっても、すべての細胞株で発現される。
細胞を、50ng/mlのrhNGF-118またはrhNGF-1(主にrhNGF-119およびrhNGF-120によって構成される)で5、10または20分間処理し、次いで溶解させて一緒にプールした。
各試料からの25~50μgのプールされた溶解タンパク質を、ビオチンで共有結合標識した。次いで、ゲル濾過によって標識の完了時の遊離ビオチン分子を除去した。アレイ上の非特異的結合部位をブロックした後、インキュベーションチャンバーをマイクロアレイに取り付けて、2つの試料(通常、1つの対照および1つのマッチング処理された試料)を同じチップ上に並べてロードすることを可能にし、試料の混合を防止した。試料のインキュベーション後、非結合タンパク質を洗い流し、アレイを、Perkin-Elmer ScanArray Readerレーザーアレイスキャナで捕捉した独自の蛍光色素の組み合わせで標識された抗ビオチン抗体でプローブした。
シグナル定量化は、スポットセグメンテーションおよびバックグラウンド補正のための所定の設定を用いて、ImaGene9.0(BioDiscovery)を用いて行った。シグナルの強度は、重複測定で得られた、細胞内に見出される標的タンパク質の発現レベルまたはリン酸化状態の指標であった。
各rhNGFによる処理後の3つの細胞株間のタンパク質変化、次いで、各個々の細胞株における異なるrhNGF処理間のタンパク質変化を分析した。
そのようにして得られたデータは、3つの細胞株における2つの主なNGF受容体(TrKAおよびp75)について同定された異なる発現レベルに従って、試験されたNGFの両方が細胞依存的にタンパク質を調節することを示す(図2)。さらに、いくつかのタンパク質は、さまざまな試験されたrhNGFによって同一に調節されるが、他のタンパク質は、各rhNGFに特異的な調節パターンを示す(図2)。
調節されたタンパク質に基づいて、NGFによって調節される3つの主な細胞内経路、すなわちアポトーシス、生存/増殖、および分化を同定することができた。
解析の結果は、以下の表7に示される所見に沿って、細胞増殖および生存に関連する経路を促進し、アポトーシスに関連する経路の活性化を阻害するrhNGF-118の能力を示すが、rhNGF-1の能力は示さない:
表7から、rhNGF-1とは異なり、rhNGF-118がp53を下方制御し、p53発現を低下させ(RPEを参照)、p53の重要な負の調節因子であるMDM2発現を誘導する(HCECおよびPC12を参照)ことが明らかに示される。加えて、rhNGF-118は、全体的に、BADを非活性化する抗アポトーシス効果を示すPim2およびPim3タンパク質を上方制御することができた。一方、rhNGF-1処理は、p53の直接的な上方調節(HCECおよびPC12を参照)およびJunの上方調節をもたらし、アポトーシス効果に寄与し得る。得られた結果は、2つの試験されたNGFが同じ細胞内の異なる下流経路を活性化することを示唆している。全体として、rhNGF-118による細胞の処理は、アポトーシスの減少および細胞増殖の促進に向かうタンパク質の調節をもたらす。それに対して、rhNGF-1による細胞の処理は、潜在的に増加したアポトーシスに従うタンパク質の変化をもたらす。これらのデータは、以下の要約表8に示すように、rhNGF-118がTrKA仲介経路に対してより強い活性を発揮する一方で、rhNGF-1がp75NTRによって仲介される経路を活性化することを示唆する。
表8から分かるように、RPE、HCECおよびPC12細胞において、rhNGF-118による処理は、アポトーシスを阻害し、増殖を促進するが、rhNGF-1による処理は、アポトーシスを活性化し、増殖を変化または促進しない。2つのNGFはまた、PC12細胞分化に反対の効果を有する。
p53依存性アポトーシスを阻害するrhNGF-118の傾向は、網膜および角膜の眼の病理学的状態に対するこの分子の極めて重要な保護的な役割を支援する。
網膜、角膜および結膜細胞において、p53は、アポトーシスを促進し、いくつかの眼の病理学的状態と関連しているが、その発現および活性の低下は、網膜および角膜細胞を死から保護する。以前の研究では、A2E(主要なRPEリポフスシンフルオロフォアおよびRPE細胞への光損傷の媒介物)とのインキュベーションおよび高エネルギー可視(HEV)光への曝露後のヒトRPE細胞株ARPE-19において、p53の上方制御が見出された。代わりに、HEV光に曝露する前のTP53に対するsiRNAでのトランスフェクションは、細胞を保護し、アポトーシスを減少させ、明るい光媒介性損傷におけるp53の重要な役割を実証した。さらに、高齢者の失明の主な原因である加齢黄斑変性(AMD)は、しばしばRPE細胞におけるリポフスシンの蓄積およびRPE細胞死と関連している。したがって、インビトロでのリポフスシン関連細胞死におけるp53の役割、およびp53阻害剤Mdm2の阻害がヒトRPE細胞をアポトーシスに感作させることが示されているという事実を考慮すると、AMDにおけるRPE細胞死はp53経路を伴うと仮定するのが妥当である(Vuon et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci 2012,.53,1362-1371)。
実施例3-アポトーシスに対する効果の分析
a)正常状態におけるアポトーシスへの影響
プロテオミクスデータによって示唆されるように、アポトーシスを阻害するrhNGFアイソフォームの異なる能力を確認するために、Incucyte(登録商標)Caspase-3/7 Activation assayを使用して、HCECおよびRPE細胞において、アポトーシスの一般的に使用されるマーカーであるカスパーゼ3/7を誘導するNGFの能力を分析した。
a)正常状態におけるアポトーシスへの影響
プロテオミクスデータによって示唆されるように、アポトーシスを阻害するrhNGFアイソフォームの異なる能力を確認するために、Incucyte(登録商標)Caspase-3/7 Activation assayを使用して、HCECおよびRPE細胞において、アポトーシスの一般的に使用されるマーカーであるカスパーゼ3/7を誘導するNGFの能力を分析した。
Incucyte(登録商標)カスパーゼ-3/7試薬は、細胞の細胞膜を自由に通過する。アポトーシス細胞において、それらは活性化カスパーゼ-3/7によって切断されてDNA結合蛍光標識を放出し、したがって、これらの細胞を蛍光核として可視化することを可能にする。
上記のHCECおよびRPE細胞は、処理なし(NT)、またはPBS(PBS)、製剤緩衝液(FB)、rhNGF-118(50ng/ml)またはrhNGF-1(50ng/ml)で処理し、30分後および24時間後に各試料においてカスパーゼ3/7の誘導を評価した。
図3および4に見られるように、rhNGF-118による細胞の処理は、カスパーゼ3/7の有意な誘導をもたらさなかったが、rhNGF-1は、未処理の対照と比較して、このアポトーシスマーカーの上方調節を引き起こし、特に処理後24時間で明らかであった。
b)酸化ストレス条件下でのアポトーシスへの影響
i)tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)により誘導されるアポトーシス
RPE細胞を、製剤緩衝液(FB)、rhNGF-118(50ng/ml)、rhNGF-2(50ng/ml)またはrhNGF-3(50ng/ml)の存在下で、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレスであるtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)10μMと24時間インキュベートし、カスパーゼ-3/7の活性を評価した。
i)tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)により誘導されるアポトーシス
RPE細胞を、製剤緩衝液(FB)、rhNGF-118(50ng/ml)、rhNGF-2(50ng/ml)またはrhNGF-3(50ng/ml)の存在下で、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレスであるtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)10μMと24時間インキュベートし、カスパーゼ-3/7の活性を評価した。
tBHP曝露24時間後、rhNGF-118で処理した細胞は、FBで処理した対照と比較して、アポトーシスの有意な減少を示した。反対に、rhNGF-2およびrhNGF-3の両方での処理は、rhNGF-118と比較して、代わりに有意な増加をもたらしたtBHP誘導アポトーシスを減少させなかった(図5)。
ii)H 2 O 2 により誘導されるアポトーシス
rhNGF-118の抗アポトーシス活性をさらに評価するために、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレス誘導剤である100μMのH2O2を、50ng/mlのrhNGF-118またはrhNGF-1の非存在下または存在下で、RPE細胞の培地に添加した。該当する場合、試験したNGFをH2O2に同時に添加した。対照として、未処理またはPBS、H2O2、rhNGF-118もしくはrhNGF-1のみで処理した細胞を使用した。各試料におけるアポトーシスシグナルを、インキュベーションの30分後(図6A)および24時間後(図6B)に測定し、未処理試料と比較したアポトーシスの倍率増加を計算した。
rhNGF-118の抗アポトーシス活性をさらに評価するために、細胞内でアポトーシスを誘導するために一般的に使用されるストレス誘導剤である100μMのH2O2を、50ng/mlのrhNGF-118またはrhNGF-1の非存在下または存在下で、RPE細胞の培地に添加した。該当する場合、試験したNGFをH2O2に同時に添加した。対照として、未処理またはPBS、H2O2、rhNGF-118もしくはrhNGF-1のみで処理した細胞を使用した。各試料におけるアポトーシスシグナルを、インキュベーションの30分後(図6A)および24時間後(図6B)に測定し、未処理試料と比較したアポトーシスの倍率増加を計算した。
予想通り、H2O2処理は、アポトーシスレベルの増加をもたらした。驚くべきことに、この増加は、細胞をrhNGF-118とインキュベートしたときは防がれたが、rhNGF-1では防がれなかった(図6Aおよび6B)。反対に、rhNGF-1が細胞内に存在した場合、H2O2のみで処理した対照細胞と比較して、より高いレベルのアポトーシスが観察された。
これらのデータを合わせると、プロテオミクス解析結果が確認され、rhNGF-118が角膜および網膜上皮細胞におけるアポトーシスを防止することが示されている。さらに重要なことに、これらの結果はまた、H2O2によって誘導されるようなストレスに対するrhNGF-118の保護的役割を示している。
実施例4
神経分化への影響
次に、PC12細胞を用いた神経分化のインビトロ機能アッセイにおいて、rhNGF-120、rhNGF-118およびrhNGF-1を比較した。PC12細胞は神経成長因子(NGF)に応答し、神経突起を出す神経細胞の典型的な表現型を示すため、これはインビトロで神経分化を研究するための高度に検証されたモデルである。
神経分化への影響
次に、PC12細胞を用いた神経分化のインビトロ機能アッセイにおいて、rhNGF-120、rhNGF-118およびrhNGF-1を比較した。PC12細胞は神経成長因子(NGF)に応答し、神経突起を出す神経細胞の典型的な表現型を示すため、これはインビトロで神経分化を研究するための高度に検証されたモデルである。
PC12細胞は、高レベルのTrKAおよびp75受容体の両方を発現する(図1)。
PC12細胞を、未処理または各rhNGFで、異なる濃度(25ng/mlおよび50ng/ml)で、6日間処理した。処理されていない細胞と比較して、処理された細胞において、より大きな細胞体および神経突起の広範なネットワークの精緻化が観察され、これは用量依存的に増加した。NGFの非存在下では、細胞は比較的小さく丸みを帯びており、目に見える神経突起を有していなかった。
神経突起長は、IncuCyte Live-Cell Analysisを使用して取得した位相コントラスト画像を分析するNeuroTrackソフトウェアを使用して測定した。細胞体は、テクスチャおよび/または明るさに基づいて背景からセグメント化され、神経突起(線形特徴)は、幅および明るさに基づいてセグメント化された。全神経突起長さを画像面積(mm/mm2)に正規化した。
図7から分かるように、rhNGF-118による処理は、rh-NGF-1と比較して、特に25ng/mlで、神経突起生成の増加をもたらした。
図13から分かるように、rhNGF-118による処理は、rhNGF-4と比較して、神経突起生成の増加をもたらした。
実施例5
TrKAおよびp75受容体への結合
試験したrhNGFアイソフォームの異なる生物学的特性について1つの考えられる理由は、受容体TrKAおよびp75NTRに対する異なる結合親和性であり得る。
TrKAおよびp75受容体への結合
試験したrhNGFアイソフォームの異なる生物学的特性について1つの考えられる理由は、受容体TrKAおよびp75NTRに対する異なる結合親和性であり得る。
したがって、我々は、センサー表面上のTrKAまたはp75NTR受容体を固定化し、次いでさまざまなrhNGFアイソフォームを注入することによって、表面プラズモン共鳴(SPR)分析を行った。親和性値は、定常状態結合レベルの測定から得た。定常状態1:1のモデルは、分析物濃度に対する定常状態結合レベルのプロットから、1:1の相互作用の平衡解離定数Kdを計算する。
そのようにして得られた結果を以下の表9に示す。
データから分かるように、rhNGF-2およびrhNGF-3は、p75NTRに対してはるかに高い親和性を示すが、rhNGF-118およびrhNGF-1は、TrKAおよびp75NTR受容体に対して非常に類似した親和性を示す。
rhNGF-118とrhNGF-1の結合親和性の違いを観察できなかったため、これら2つのNGFの受容体への結合の動態に焦点を当てた。センサグラムの解析から、BIA評価ソフトウェアにより、速度論的パラメータ(Kon=結合速度定数、Koff=解離速度定数)および結合(Kd)値を運動速度定数の比(Koff/Kon)として評価した。
得られた結果を以下の表10に示す。
上記のデータから分かるように、2つのNGFは、2つの受容体への結合の異なる動態を示す。
特に、rhNGF-118はp75NTRに非常に速く結合および解離するが、rhNGF-1はp75NTRから解離するのがはるかに遅い。
これらのデータに基づいて、我々は、rhNGF-118がp75NTRから迅速に解離し、したがって、TrKAに結合し、その下流シグナル伝達を活性化するためにより利用可能であると結論付ける。
一方、p75NTRからのrhNGF-1のゆっくりとした解離は、長期化した下流のp75NTR仲介作用を説明することができる。
実施例6
ヒトTF-1細胞株における増殖誘導活性
rhNGF生物学的活性は、NGFなどの成長因子に応答して増殖するTF-1細胞株上で実施した。簡潔に言えば、細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン50U/50μg/mL、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)5ng/mLを追加した適切な培地(Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640)上で培養し、3×104/mL~5×105/mLの範囲の密度で維持した。細胞がおよそ3×105/mL~5×105/mLの範囲内にあったときに、継代培養した。
ヒトTF-1細胞株における増殖誘導活性
rhNGF生物学的活性は、NGFなどの成長因子に応答して増殖するTF-1細胞株上で実施した。簡潔に言えば、細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン50U/50μg/mL、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)5ng/mLを追加した適切な培地(Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640)上で培養し、3×104/mL~5×105/mLの範囲の密度で維持した。細胞がおよそ3×105/mL~5×105/mLの範囲内にあったときに、継代培養した。
アッセイは、解凍後(P#0)の継代2(P#2)、継代3(P#3)または継代4(P#4)を使用して実施した。試験で細胞を使用する前日に、新鮮な培地を使用して1:2で分割した。
rhNGF-4およびrhNGF-118の増殖効果は、GM-CSFを追加していない培養培地で、細胞を15000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種することによって、0.3pM~6.76nMの濃度範囲で評価した。細胞を、rhNGF-4またはrhNGF-118の存在下で、37°±2℃、5±2%CO2で48±1時間インキュベートした。インキュベート後、Cell Titer 96(登録商標)Aqueous One Cell Proliferation Assay Reagent(Promega)を使用し、490nmで吸光度を読み取ることによって、生細胞を測定した。
細胞の50%の増殖を誘導するために必要なrhNGFの濃度として、EC50を計算した。rhNGF-4の効力は、rhNGF-118のEC50をrhNGF-4のEC50で割った比率に100を掛けることによって計算した。
各試験を、rhNGFの種類ごとに3つの濃度応答曲線を並行して含む4つの異なるプレートで繰り返した。効力は、3~4回の反復の平均として計算した。
得られた結果を以下の表11に示す。
得られた結果に基づいて、rhNGF-4は、rhNGF-118に関して、TF-1細胞株の増殖を刺激する活性が約10倍低いと結論付けることができる。
実施例7
細胞生存率アッセイ
tBHPによって誘導される細胞アポトーシスを阻害するrhNGF-118またはrhNGF-4の能力を、ヒト網膜色素上皮細胞ARPE-19で評価した。細胞を最初に染色し、実施例2に記載のように、フローサイトメトリーによってTrkAおよびp75NTRの発現を評価した(図1参照)。
細胞生存率アッセイ
tBHPによって誘導される細胞アポトーシスを阻害するrhNGF-118またはrhNGF-4の能力を、ヒト網膜色素上皮細胞ARPE-19で評価した。細胞を最初に染色し、実施例2に記載のように、フローサイトメトリーによってTrkAおよびp75NTRの発現を評価した(図1参照)。
細胞を、ビヒクル、100ng/mlのrhNGF-118または100ng/mlのrhNGF-4で1時間前処理し、次いで、使用した前処理に従って、ビヒクル、またはビヒクルと組み合わせた50μMのtBHP、100ng/mlのrhNGF-118または100ng/mlのrhNGF-4で48時間処理した。細胞生存率は、Cell Counting Kit-8によって評価した。結果は、tBHPによる処理は、ビヒクルのみと比較して細胞生存率を有意に低下させることを示し、rhNGF-4による処理は、細胞生存率を完全に回復することはできない一方で、rhNGF-118は、ビヒクル試料に非常に近い細胞生存率を示す。これらの結果は、NGF-4ではなくNGF-118が、酸化ストレス後に細胞生存率を回復することができることを実証する。
配列番号1
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR
配列番号2
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA
配列番号3
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAV
配列番号4
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRR
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR
配列番号2
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配列番号3
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配列番号4
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Claims (15)
- 網膜症、角膜の病態、視神経症、結膜の病態、角縁幹細胞欠乏から選択される眼の病態の治療、および角膜移植における同種移植片拒絶反応の予防に使用するためのNGFであって、前記NGFが、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して50重量%超の配列番号1のNGFを含む、NGF。
- 前記NGFが、前記NGFに含まれる全てのNGFアイソフォームの総重量に対して、少なくとも60重量%、より好ましくは少なくとも70重量%、さらにより好ましくは少なくとも80重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、さらにより好ましくは少なくとも98重量%、さらにより好ましくは少なくとも99重量%、さらにより好ましくは100重量%の配列番号1のNGFアイソフォームを含む、請求項1に記載の使用のためのNGF。
- 前記NGFに含まれる前記NGFアイソフォームが、配列番号1、2、3もしくは4のNGFアイソフォームもしくはそれらの混合物を含むか、またはそれらから選択される、請求項1または2に記載の使用のためのNGF。
- 前記NGFが、前記NGFに含まれるすべてのNGFアイソフォームの総重量に対して、20重量%未満、より好ましくは10重量%未満、さらにより好ましくは5重量%未満の総重量で、配列番号2、3もしくは4のNGFアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 前記NGFが、前記NGFに含まれる全てのNGFの総重量に対して、2重量%未満、好ましくは1重量%未満の量で、配列番号2、3もしくは4のNGFアイソフォームまたはそれらの混合物を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 前記配列番号1のNGFアイソフォームが、いかなる翻訳後修飾も含まない、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 前記網膜症が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞、光毒性網膜症、網膜剥離、加齢黄斑変性、黄斑変性、黄斑萎縮、黄斑円孔、黄斑浮腫、および網膜上膜から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 前記角膜の病態が、円すい角膜、光毒性角膜症、遷延性上皮欠損、角膜潰瘍、角膜ジストロフィーおよび変性、並びに乾性角結膜炎から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 前記視神経症が、緑内障並びに虚血性、変性性、外傷性、遺伝性および先天性視神経症から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用のためのNGF。
- 治療上有効な量の請求項1~9のいずれか一項に記載の使用のためのNGFと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
- 眼科用途用医薬組成物である、請求項10に記載の医薬組成物。
- 液体眼科用組成物、好ましくは眼科用水性液体組成物である、請求項11に記載の組成物。
- 前眼部への局所投与用の水性点眼剤組成物である、請求項12に記載の組成物。
- 前記NGFを、前記水性組成物の約0.0001%~0.5%w/vの範囲、より好ましくは約0.001%~約0.1%w/vの範囲、より好ましくは約0.002%w/vの濃度で含む、請求項12または13に記載の組成物。
- 後眼部への投与のための請求項11に記載の組成物。
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