JP2024505676A

JP2024505676A - 家禽病原体に対して家禽を防御するためのワクチン接種

Info

Publication number: JP2024505676A
Application number: JP2023547395A
Authority: JP
Inventors: プルスケンス，ウィレム・ピーター・コルネリス; フェルメイ，ポール; ヤンセン，セオドルス; デゲン，ヴィルヘルムス・ゲラルドゥス・ヨハネス; シュリアー，カーラ・クリスティーナ
Original assignee: インターベットインターナショナルベー．フェー．
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2024-02-07
Also published as: US20240041760A1; CN116867516A; EP4288094A1; WO2022167630A1

Abstract

本発明は、ワクチンを家禽動物に粘膜投与することによって家禽病原体に対する家禽動物における免疫応答を増強する際の使用のための、家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンに関する。本発明はまた、薬学的に許容される液体担体、家禽病原体の非生抗原および粘膜付着性アジュバントを含むワクチン、ならびに家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンを家禽動物に粘膜投与することによる、家禽病原体に対する家禽動物における免疫応答を増強する方法に関する。

Description

発明の全般的分野
本発明は、全般的には、ワクチン接種によって家禽病原体に対して家禽を防御するための方法、およびそれらの方法における適用に適したワクチンに関する。

家禽動物（「家禽」とも称される）は動物性タンパク質の供給源として世界中で飼育されている。更に、家禽はほとんどの地域および条件に適応可能であり、安価で購入でき、短い世代時間および高い生産性を有し、広い土地を必要としない。家禽の生産システムは、農村部での飼養から、高度に産業化され垂直的に統合されたシステムまで、多岐にわたる。裏庭での家禽生産は世界のほとんどの農村部および都市近郊地域に分布しており、主に、陸生および水生の両方の家禽の飼育に基づいている。集約的な家禽生産は先進国において最も一般的であるが、ここ数十年で、多数の発展途上国も、増加しつつある動物性タンパク質需要を満たすために、このシステムを採用している。近年、グローバル化と、家畜感染源および野生感染源を介して感染病原体（家禽病原体）が残存し拡散しうることとの結果として、これまで影響を受けていなかった地域への特定の越境家禽疾患の伝播リスクが増加している。過去２０年間に発生したニューカッスル病（ＮＤ）、伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）および鳥インフルエンザ（ＡＩ）の広範囲にわたる蔓延は、そのような疾患が家禽生産部門および社会全体に悪影響を及ぼしている例を示している。国際的レベル、国家レベルおよび農場レベルで動物疾患の蔓延を有効に予防し制御（防除）するために種々の戦略が実施可能であり、家禽疾患防除計画は、しばしば、ワクチン接種の使用を含む。実際、ワクチンは世界中の家禽疾患の予防および制御の重要な要素である。家禽生産におけるそれらの使用は伝統的に、農場レベルでの臨床疾患の出現を回避または最小化して生産を増加させることを目的としている。ワクチンおよびワクチン接種プログラムは幾つかの地域的要因（例えば、生産の種類、バイオセキュリティのレベル、疾患の地域パターン、母体免疫の状態、利用可能なワクチン、コストおよび潜在的損失）に応じて大きく変動する。家禽ワクチン接種は、通常、養鶏業界によって管理されているが、それは、少数の主要家禽疾患（例えば、ＡＩおよびＮＤ）を防除するために国または地域レベルでの疾患撲滅プログラムの枠組みに適用されることはほとんどない。家禽ワクチンの投与で最初に期待される結果は、トリが病原体に対する免疫を発生させて疾患に対して防御されることである。ワクチン接種の使用によって達成されうる結果は様々でありうる［例えば、臨床型の疾患に対する防御、感染に対する感受性の低下（ワクチン接種されたトリにおいては、ワクチン接種されていないトリの場合より高い感染量が、感染を誘発するために必要である）および感染した場合の感染力（例えば、排出）の低下］。

家禽疾患の防除用のワクチン接種のためのワクチンの使用は、一般に、ワクチン接種プログラムの戦略、設計およびその実施後の有効性に影響を与えうる地域的要因に従って適合され調整される。家禽生産の種類（例えば、商業的なもの、または農村部のもの）、産業の体制（例えば、垂直的統合）、種々の鳥種の密度、蔓延疾患状況、ワクチン入手可能性、他のワクチンの使用、他の疾患の蔓延、利用可能な資源（例えば、人的資源および設備）、そしてまた、関連コストを含む、幾つかの異なる要因を考慮すべきである。家禽ワクチン接種には多数の方法およびワクチンタイプが利用可能であり、それらとしては、例えば、卵内ワクチン接種、噴霧（スプレー）ワクチン接種、ＳＣ（皮下）およびＩＭ（筋肉内）ワクチン接種、翼－水掻きワクチン接種および飲料水による投与が挙げられる。サブユニットワクチンから生ワクチンまでに及ぶあらゆる種類のワクチンが適用可能である。不活化ワクチンを使用する非経口ワクチン接種（典型的には筋肉内注射による）がしばしば適用され、典型的には非常に有効であるが、各動物を個別に取り扱い処置する必要があるため、実施に高い費用を要する。眼および／または気道および／または胃腸管の粘膜表面に送達することを目的とした噴霧による集団ワクチン接種は簡便であり、安価に実施できるが、一般に、抗原が生きている必要があり、このことは安全性に悪影響を及ぼす。

発明の目的
安全であり、有効であり、容易に実施でき、特に集団ワクチン接種に適した新規家禽ワクチン接種戦略を案出することが、本発明の目的である。

発明の概括
本発明の目的を達成するために、家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンを家禽動物に粘膜投与することによって家禽病原体に対する家禽動物における（既存）免疫応答を増強するために該ワクチンを使用するワクチン接種方法を、本発明において案出した。

当技術分野においては、非生抗原を使用して家禽動物において適切な免疫応答を誘導することは非経口投与によってのみ達成されうることが一般に認識されている。簡便性および経済性の観点からは粘膜投与が好ましいが、非生抗原を粘膜表面に適用すると、典型的には、家禽病原体に対する適切な免疫応答が得られず、したがってその病原体に対する適切な防御が得られない。この理由は完全には明らかでないが、実際、粘膜免疫系は複雑であり、人間および動物の両方の健康において未だ完全には理解されていない。粘膜（免疫）部位は環境からの外来粒子に絶えずさらされており、これらの粒子の存在に適応している。したがって、粘膜免疫系は免疫応答よりも寛容を好むと考えられている。これは、特に非生抗原（例えば、不活化）抗原を使用する場合、免疫応答を誘導することをより困難にする。

しかし、本出願人は、病原体に対する適切な防御が達成されうるように、動物に既に存在する免疫応答を増強するために、粘膜投与が非常に有効であることを見出した。このためには、使用されるワクチンが、非生抗原に加えて、いわゆる粘膜付着性アジュバントを含むことが必須であるようである。このアジュバントは、粘膜への抗原の付着を改善するために、抗原の送達系および担体として使用され、それによって、抗原の局所粘膜滞留時間および制御された局所放出を改善する。どうやら、粘膜付着特性を有するアジュバントの添加によってワクチン製剤を適合させることにより、局所滞留時間が延長され、それによって、抗原の取り込み、および基礎免疫系への後続曝露が改善され、流動による流出またはプロテアーゼによる局所分解が減少するようである。

ある範囲の幾つかの家禽病原体に関して、この方法で、２回目の非経口ワクチン接種による増強（ブースト）に近いレベルまで免疫応答が増強されうることが判明した。したがって、少なくとも二次免疫化としてこのタイプの投与を用いることによって、安全な（非生）抗原および簡便な投与経路を用いて非常に良好な免疫応答が得られうることが示された。すなわち、粘膜投与は、当技術分野で公知のとおり、例えば噴霧ワクチン接種器を使用する集団ワクチン接種によって達成されうる。初回免疫応答は、家禽に有効であることが公知である任意のタイプの免疫化、例えば、卵内ワクチン接種、生ワクチンによる１日齢の雛への噴霧ワクチン接種、非経口ワクチン接種、野生型感染、または更には本発明ワクチンでの粘膜ワクチン接種の結果でありうる。本発明の要点は、抗原を運搬し送達するための粘膜付着性アジュバントがワクチン中に存在する限り、追加（ブースター）ワクチン接種が、粘膜ワクチン接種によって、したがって所望により、非生抗原を使用する集団ワクチン接種によって、有効に達成されうることである。このようにして、免疫応答は増強されることが可能であり、家禽動物に関して一般に公知のとおり、家禽病原体に対する防御をもたらし、すなわち、実際の感染またはその感染から生じる疾患を予防し、軽減させ、または治癒させうる。

本発明はまた、薬学的に許容される液体担体、家禽病原体の非生抗原および粘膜付着性アジュバントを含むワクチン、ならびに家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンを家禽動物に粘膜投与することによる、家禽病原体に対する家禽動物における免疫応答を増強する方法に関する。

定義
ワクチンは、宿主に安全に投与される組成物であって、ワクチン接種後の病原体（病原性微生物、例えばウイルスまたは細菌）感染に対してこの宿主を防御する組成物であり、すなわち、典型的には、ワクチン接種宿主において病原体自体に例えば抗体を介して干渉することによって、病原体によるこの感染を予防もしくは軽減し、または感染から生じる臨床疾患を予防もしくは軽減する組成物である。したがって、ワクチン接種は、感染のレベルを予防もしくは少なくとも軽減し、および／またはその感染から生じる臨床疾患のレベルを予防もしくは少なくとも軽減する。典型的には、ワクチンは、水性の、しばしば緩衝化された溶液、または任意の他の液体担体のような薬学的に許容される担体中に抗原を含む。

病原体の非生抗原は、生きた病原体自体（野生型または弱毒化形態）以外の、免疫応答を誘発する任意の物質または化合物であり、この免疫応答の結果として、対応する病原性病原体、またはその病原性因子の１以上が、宿主免疫系によって認識され、最終的には少なくとも部分的に中和される。病原体の非生抗原の典型例は不活化野生型病原体（例えば、死滅ウイルスまたは細菌）、病原体のサブユニット、例えば表面発現タンパク質および毒素である。後者の２つは組換え的に発現される場合もあれば、されない場合もある。家禽病原体に関しては、多数の非生抗原が当技術分野で一般に公知である。

アジュバントは、免疫応答を非特異的に刺激しうる物質である。原則として、免疫学的事象のカスケードにおける特定のプロセスを促進または増幅して、最終的に、より良好な免疫応答（すなわち、抗原に対する統合された身体的応答、特に、リンパ球によって媒介されるもの、典型的には、特異的抗体または既に感作されているリンパ球による抗原の認識を含むもの）をもたらしうる各物質は、アジュバントとして定義されうる。アジュバントは、原則として、前記の特定の免疫学的プロセスが生じるのに必要ではないが、前記プロセスを促進または増幅する。

粘膜付着性アジュバントは、少なくとも２，０００（２千）Ｄａ、好ましくは少なくとも５，０００（５千）Ｄａの分子量を有する親水性ポリマー（例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、アミンまたはスルファート基を有する）であり、これは、抗原の局所粘膜滞留時間および制御された局所放出を改善する粘膜への付着を改善するために、ワクチン抗原の送達系および担体として使用される。好ましくは、ポリマーは、粘膜表面との接触に際してポリマーのイオン化が誘導されるように、ワクチン接種される宿主動物の標的粘膜のｐＨとは異なるｐＫ値を有する。眼および口腔の家禽粘膜表面のｐＨは、健康な動物の場合、典型的には、中性付近であり、６．５～７．５である。好ましくは、粘膜アジュバントは生分解性ポリマー、すなわち、標的生物によって分解されうるポリマーである。

粘膜付着に影響を及ぼす因子は親水性、分子量およびｐＫ値である。粘膜付着性ポリマーは多数の親水性官能基、例えばヒドロキシルおよびカルボキシルを有する。これらの基は基質との水素結合を可能にして、水性媒体中で膨潤し、それにより、潜在的なアンカー部位の最大限の露出を可能にする。また、膨潤したポリマーはそれらの鎖間の最大距離を有していて、鎖の柔軟性の増加および基質の効率的な浸透をもたらす。分子量に関しては、ポリマー分子の相互浸透は低分子量ポリマーによって促進されるが、絡み合いは高分子量ポリマーによって促進される。最大の粘膜付着力のための最適分子量はポリマーのタイプによって異なり、付着力は、１００，０００～３００，０００Ｄａまでは、ポリマーの分子量と共に増加する。このレベルを超えると、それ以上の利益は得られない。ｐＫ値に関しては、粘膜付着物質と粘膜表面との境界におけるｐＨは、イオン化可能基を有する粘膜付着物質の付着に影響を及ぼしうる。薬物送達に使用される多数の粘膜付着物質は、カルボン酸官能基を有するポリアニオンである。酸性粘膜付着性ポリマーの場合、局所的ｐＨがポリマーのｐＫａ以上であれば、それは大部分がイオン化される。該ｐＨがポリマーのｐＫａより低ければ、それは大部分が非イオン化される。例えば、ポリ（アクリル酸）ファミリーのポリマーのおおよそのｐＫａは４～５である。これらのポリマーの最大付着強度はｐＨ４～５付近で観察され、ｐＨ６を超えると徐々に低下する。粘膜付着性アジュバントの濃度は重要でないと考えられているが、一般に、最終製剤における各粘膜付着性アジュバントに関する最適値は１～３０％ｗ／ｗであり、ほとんどの場合は１～１５％ｗ／ｗである。

宿主動物および標的粘膜表面に応じて、典型的には、粘膜付着性アジュバントとしては以下の物質が使用される：天然ポリマー（またはその誘導体）、例えばアルブミン、ペクチン、セルロース、ゼラチン、アルギナート（Ｇ－Ｃブロックの種々の組合せの一連のポリマー；最終重量は６０～６００ｋＤａの範囲で変動する）、キトサン（１１０～３６０ｋＤａの範囲の一連のキトサンポリマー）、ヒアルロン酸；合成ポリマー、例えばポロキサマー（ポリアルキレンオキシドブロックコポリマー；ＣｒｏｄａＨｅａｌｔｈＣａｒｅからＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃＦ１２７として商業的に入手可能である１２ｋＤａのエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＡＡ［ポリアクリル酸、カルボマー、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、７０～４０００ｋＤａ）、ＰＬＧＡ（ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）、ＰＬＡ（ポリＤ，Ｌ－乳酸）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）およびＰＶＡ（ポリビニルアルコール）。

家禽動物は、卵（産卵鶏）、肉（ブロイラー）および／または羽毛を得るために飼育されうる家畜化されたトリ種の動物である。「家禽動物」なる語は、在来種および市販品種のニワトリから、ノバリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙｄｕｃｋ）、マガモ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ウズラ、ハト、ダチョウおよびキジに至る、広範囲の鳥類を含む。

組成物を動物に粘膜投与する、は、組成物を、動物の粘膜表面の１以上、例えば、眼、口腔または鼻腔の粘膜表面に接触するように供与することを意味する。

病原体に対する免疫応答は、その病原体による感染および／またはその感染から生じる疾患を予防し、軽減し、または治癒させうる応答である。

本発明の更に詳細な実施形態
粘膜投与用ワクチンのもう１つの実施形態においては、家禽動物における免疫応答は、家禽病原体による自然感染、または病原体に対する以前のワクチンの投与の結果である。好ましくは、家禽動物における免疫応答は、以前のワクチンを非経口または粘膜投与することによる、病原体に対する以前のワクチン接種の結果である。例えば、家禽動物における免疫応答は、家禽病原体の非生抗原を含む以前のワクチンを非経口投与することによる、または家禽病原体の生抗原もしくは非生抗原を含む以前のワクチンを粘膜投与することによる以前のワクチン接種の結果である。１つの実施形態においては、家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンは、以前のワクチンの投与後２～６週間以内、例えば２、３、４、５または６週間以内に投与される。

更にもう１つの実施形態においては、ワクチンは眼内（ＯＣ）および／または鼻腔内（ＩＮ）に投与される。これらの粘膜表面は本発明における粘膜ワクチン接種に理想的に適していることが示されている。

更にもう１つの実施形態において、ワクチンは、家禽動物にワクチンを噴霧することによって投与される。噴霧は眼または鼻腔における直接投与または間接投与（動物への最初の噴霧の後に、例えば、くちばしでつつく、呼吸する、などによる）をもたらしうる。

更にもう１つの実施形態においては、粘膜付着性アジュバントは、１０，０００Ｄａを超える分子量を有する。ポリマー鎖が長ければ長いほど、粘膜表面への付着および抗原の持続的送達が良好になると考えられている。分子量の実用的な上限は１，０００，０００（１００万）Ｄａであるが、３００，０００Ｄａを超えるいずれの分子量においても、付着性および持続的送達の向上はそれほど期待されない。

更にもう１つの実施形態においては、粘膜付着性アジュバントは６未満のｐＫａ値を有する。酸性粘膜付着性アジュバントは家禽の粘膜表面に対する刺激が弱く、６未満のｐＫａは、表面への付着を改善する少なくとも有意なイオン化が生じることを保証する。好ましくは、粘膜付着性アジュバントは３～５のｐＫａ値を有する。

更にもう１つの実施形態においては、粘膜付着性アジュバントは、アルギン酸塩（アルギナート）（すなわち、アルギン酸の塩）およびポリアルキレンオキシドブロックコポリマーから選択される。

ワクチンの実施形態においては、粘膜付着性アジュバントは１～１０％ｗ／ｗの量で存在するが、より多い量も排除されない。しかし、１０％を超える量は実用的（例えば、粘度の増加）および経済的（例えば、原価）な理由から好ましくない。

本発明の１つの実施形態においては、家禽病原体はウイルス病原体である。ウイルス病原体は、非経口的ワクチン接種が容易でない家禽の群れに豊富に存在し、したがって、本発明は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アビアレオウイルス（ＡＲＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のようなウイルス家禽病原体に対処するのに理想的に適しているが、それだけでなく、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような細菌病原体に対処するのにも適している。

前記実施形態の全てはまた、本発明によるワクチンおよび家禽動物の任意の治療方法に関する。

次に、以下の特定の実施例を用いて、本発明を更に例示することとする。

実施例１
研究の目的
ニューカッスル病（ＮＤ）は、世界中で経済的損失を引き起こす、高伝染性の家禽ウイルス性疾患である。野外飼育場においては、大多数のトリは、生抗原での初回抗原刺激およびそれに続く追加（ブースター）免疫化によって、このウイルスに対してワクチン接種される。生抗原での初回ワクチン接種には大量噴霧適用が一般に行われる。追加ワクチン接種は、一般に、筋肉内経路で適用される。追加ワクチン接種のための粘膜法、好ましくは噴霧法における不活化抗原は、農家がトリ集団に適用するのに最も簡便であろう。

本研究は、粘膜経路、例えば噴霧適用によって適用されうる不活化抗原を含む、初回生ワクチンおよびそれに続く追加ワクチンでのワクチン接種計画を確立することを目的とするものであった。特に、噴霧ワクチン接種の有効性を評価する必要がある。なぜなら、実際に有効な噴霧適用される有用抗原画分は沈降、浮遊および蒸発による損失によって大きな影響を受けるからである。したがって、粘膜付着性アジュバントと組合された不活化抗原を含む種々のワクチン製剤を試験した。この研究で使用したモデル抗原はＮＤＶクローン３０である。なぜなら、ＮＤＶは、粘膜（特に噴霧）ワクチン接種に関心が持たれる呼吸器ウイルス疾患であるからである。

材料および方法
本研究においては、１日齢のＳＰＦニワトリの７つの群（ｎ＝１３／群）を用いた。また、Ｔ＝０における実験開始時に、参照サンプルを得るために追加的な５羽の孵化相手（ハッチメイト）を用いた。Ｔ＝０のワクチン接種後経過週（ｗｋｐｖ）において、全ての群が生ＮＤＶクローン３０（眼経路による０．１ｍｌ）での初回ワクチン接種を受けた。Ｔ＝６ｗｋｐｖにおいて、群２～７の動物が追加ワクチン接種を受けた。群２は対照として用い、これにおける動物は、ＧＮＥアジュバント（ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ）を含有する死滅（「ｉｎａｃ」）ＮＤＶの全用量（「１００％」）での０．５ｍｌの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射による追加接種を受けた。群３は、眼鼻経路によって適用される追加接種製剤［５％ｗ／ｖのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃＦ１２７（ポロキサマー４０７；ＣｒｏｄａｈｅａｌｔｈＣａｒｅ）粘膜付着性アジュバントを含有する４０％ｉｎａｃＮＤＶ；０．２ｍｌ／動物］の投与を受けた。噴霧適用による損失（蒸発、沈降）の潜在的影響を低減するために、群４～７は、異なる投与体積で混合された追加接種製剤ごとの同じ抗原の投与を受けた。群４および５の動物は、動物当たり１ｍＬの総体積の、微細噴霧によって適用される異なる追加接種製剤の投与を受けた。群６および７の動物は動物当たり２ｍＬの投与を受けた。群および処置を表１に示す。

ワクチン製剤の有効性を判定するために、Ｔ＝０の追加接種後経過週（ｗｋｐｂ）、Ｔ＝２ｗｋｐｂ、Ｔ＝４ｗｋｐｂの時点で、全ての動物から血液を採取した。血清学的検査を行うために、抗ＮＤＶ赤血球凝集阻害抗体の存在に関して血清サンプルを分析した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の特徴付けのために、Ｓｅｐｍａｔｅ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１５ｍＬチューブを使用して該細胞を単離し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバーを使用して計数した。ＣＤ４およびＣＤ８α細胞を、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈのＡＰＣおよびＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ蛍光色素を使用して評価した。

結果
血清学的検査の結果を以下の表２に示す。認められうるとおり、群１の２ｌｏｇ抗体価は約５の低レベルのままであったが、追加接種群の抗体レベルは、予想どおり、ＩＭ群では約１２の非常に高いレベルまで上昇した。しかし、粘膜適用された死滅ワクチンで追加接種された群のそれぞれも、ＮＤＶに対する適切な防御のレベルに相当する約７～８のレベルまでの有意な増強効果を示した。

表３には、全細胞集団に対するＣＤ４およびＣＤ８α細胞の割合（％）が示されている。これは、本発明のワクチンを適用することによって、免疫の有意な増強効果が誘導されうることを示す別の指標である。

実施例２
研究の目的
目的は、研究１の粘膜付着性アジュバントに加えて、２つの他の粘膜付着性アジュバントを使用することによって、家禽ワクチン接種における粘膜付着性アジュバントの効果を更に評価することであった。別の家禽抗原に関する有効性を評価するために、抗原を不活化ＩＢＤＶに変更した。

材料および方法
この第２の研究においては、３週齢のＳＰＦニワトリの５つの群（Ｎ＝１０／群）を用いた。群１は、ワクチン接種を受けなかった対照群として用いた。Ｔ＝０において、群２～５の全ての動物は、ＩＢＤＶの不活化株Ｄ７８を抗原として使用して、表４に示されている情報に従い初回ワクチン接種を受けた。これらのワクチンを脚の筋肉内に０．５ｍｌ／用量（１００単位）で適用し（群２）、または眼／鼻に０．２ｍｌ／用量（５０００単位）で適用した（群３～５）。群３～５の全てのニワトリは、表４に示される製剤および経路に従い追加ワクチン接種を受け、同時に血清学的分析のために血液を採取した。群２は初回ワクチン接種のみを受けた。なぜなら、ＧＮＥアジュバントは持続的な抗原放出に関して公知であり、追加ワクチン接種の必要がないからである。追加ワクチン接種の２週間後、全てのニワトリをＩＢＤＶＣＳ８９株ウイルスでのチャレンジ感染に付し、これは点眼で投与した。同時に、血清学的分析のために血液を採取した。チャレンジ後、チャレンジの日を含む１１日間にわたって、ニワトリの疾患または死亡の臨床徴候に関してモニターした。

結果
血清学的検査の結果を以下の表５に示す。認められうるとおり、群１の２ｌｏｇ抗体価は４．０の検出レベル未満のままであったが、追加接種群の抗体レベルは、予想どおり、ＩＭでは約１０の非常に高いレベルまで上昇した。しかし、粘膜適用された死滅ワクチンで追加接種された群のそれぞれも、ＩＢＤＶに対する適切な防御のレベルに相当する約７～９のレベルまでの有意な増強効果を示した。

表６に、チャレンジ後の生存データを示す。認められうるとおり、血清学的結果は生存データに対応しており、血清学がウイルス感染に対する防御に対応することを証明している。

実施例３
研究の目的
目的は、研究２の２つの最も有望な粘膜付着性アジュバント（すなわち、アルギン酸塩およびポリアルキレンオキシドＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）を使用し、抗原を不活化ＡＲＶに変更し、それと同時に、直接的なＯＣ／ＩＮワクチン接種の代わりに噴霧ワクチン接種を用いることによって、家禽ワクチン接種における粘膜付着性アジュバントの効果を更に評価することであった。

材料および方法
合計３つの群がこの研究に含まれ、１週齢のＳＰＦ産卵ニワトリ（ｎ＝１０／群）を使用する。Ｄ０において、群１～３の全動物が、表７に示されている情報に従い、市販ワクチンＮｏｂｉｌｉｓＲｅｏ２１７７（ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ）を使用するＲｅｏ２１７７生ワクチン接種を受ける。この初回ワクチンは脚の筋肉内に適用する。Ｄ２８において、表に示されているとおり、全ての群が追加ワクチン接種を受ける。噴霧ワクチン中の抗原の用量は、ニワトリの粘膜表面に到達しない（その代わりに羽毛、地面、壁などに到達する）抗原を考慮して、１０倍高い。追加ワクチン接種の結果としての血清学的反応を確立することによって有効性を測定するために、Ｄ２８（追加ワクチン接種時）、Ｄ４２（追加ワクチン接種の２週間後）およびＤ５６（追加ワクチン接種の４週間後）に、全ての動物から血液を採取する。

結果
ＡＲＶに対する抗体の血清学的結果を以下の表８に示す。認められうるとおり、群１の２ｌｏｇ抗体価は非常に高いが、噴霧による追加ワクチン接種を受けた群２および３の抗体価は対応レベルであり、このことは、ＡＲＶに対する適切な免疫応答が誘導されることを示している。特に、粘膜付着性ポリアルキレンオキシドを使用したデータは、防御のレベルが、ＩＭワクチン接種によって達成される防御と同等のものに到達しうることを示している。

実施例４
研究の目的
目的は、研究２および３のアルギン酸塩粘膜付着性アジュバントを使用して、家禽ワクチン接種における粘膜付着性アジュバントの効果を更に評価することであったが、今回は、不活化多価サルモネラワクチンを眼／鼻経路で使用する初回接種－追加接種の計画において、細菌感染、すなわちサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に対する防御を評価するための設定におけるものであった。

材料および方法
合計２つの群がこの研究に含まれ、４０羽の１日齢のＳＰＦニワトリ（ｎ＝２０／群）を使用する。Ｄ０において、群２の動物が、血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、チフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびインファンティス（Ｉｎｆａｎｔｉｓ）の不活化サルモネラ細菌と１％アルギン酸塩とを含有する多価サルモネラワクチンでの初回ワクチン接種をＯＣ／ＩＮ経路で受ける。Ｄ１４において、群２の動物が追加ワクチン接種を受ける（同じワクチン、同じ経路）。Ｄ２１において、群１（対照）および群２の動物を強制経口投与によって病原性サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）でチャレンジする。第２４日、第２６日、第２８日、第３１日および第３５日に、総排出腔スワブを全てのトリから採取する。チャレンジの７日後に、トリの半数を安楽死させて、脾臓および肝臓のサンプルならびに盲腸スワブを採集する。チャレンジの１４日後に、残り半数を安楽死させて、同じものを採集する。

結果
サンプル採集の全ての日の平均としての結果を、サンプル総数に対する陽性サンプルの割合（％）として、以下の表９に示す。サルモネラ感染に対する防御が示されている。

Claims

ワクチンを家禽動物に粘膜投与することによって家禽病原体に対する家禽動物における免疫応答を増強する際の使用のための、家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチン。
家禽動物における免疫応答が、家禽病原体による自然感染、または病原体に対する以前のワクチンの投与の結果である、請求項１記載の使用のためのワクチン。
家禽動物における免疫応答が、以前のワクチンを非経口または粘膜投与することによる、病原体に対する以前のワクチン接種の結果である、請求項１または２記載の使用のためのワクチン。
家禽動物における免疫応答が、家禽病原体の非生抗原を含む以前のワクチンを非経口投与することによる、または家禽病原体の生抗原もしくは非生抗原を含む以前のワクチンを粘膜投与することによる、病原体に対する以前のワクチン接種の結果である、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンを以前のワクチンの投与後２～６週間以内に投与する、請求項２～４のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
ワクチンを眼内（ＯＣ）および／または鼻腔内（ＩＮ）に投与する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
家禽動物にワクチンを噴霧することによってワクチンを投与する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが、１０，０００Ｄａを超える分子量を有する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが、１０，０００Ｄａを超える、かつ、１，０００，０００Ｄａ未満である分子量を有する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが、１０，０００Ｄａを超える、かつ、３００，０００Ｄａ未満である分子量を有する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが６未満のｐＫａ値を有する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが３～５のｐＫａ値を有する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントがアルギン酸塩およびポリアルキレンオキシドブロックコポリマーから選択される、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
粘膜付着性アジュバントが１～１０％ｗ／ｗの量でワクチン中に存在する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
家禽病原体がウイルス病原体である、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
家禽病原体がニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アビアレオウイルス（ＡＲＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から選択される、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
薬学的に許容される液体担体、家禽病原体の非生抗原および粘膜付着性アジュバントを含むワクチン。
家禽病原体の非生抗原と粘膜付着性アジュバントとを含むワクチンを家禽動物に粘膜投与することによる、家禽病原体に対する家禽動物における免疫応答を増強する方法。