JP2024505078A - 成体哺乳動物の内耳において有毛細胞を再生するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

成体哺乳動物の内耳において有毛細胞を再生するための方法であって、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸、Ｗｎｔ経路活性化因子およびｃＡＭＰ活性化因子からなる群から選択される薬剤の新規組合せを使用する、方法が本明細書で提供される。方法および組成物は、難聴または前庭機能障害を有する対象を処置するために使用され得る。

Description

優先権の主張
本出願は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる２０２１年２月２日出願の、米国仮特許出願第６３／１４４，８８３号明細書の利益を主張する。

連邦支援の研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって与えられた助成番号Ｒ０１ＤＣ００６９０８およびＵＨ３ＴＲ００２６３６ならびにＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅによって与えられた助成番号Ｗ８１ＸＷＨ１８１０３３１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

本明細書において開示される主題は、一般に、成体哺乳動物の内耳において有毛細胞を再生するための方法に関し、さらに具体的には臨床診療における使用に受け入れられる薬剤の固有の組合せの使用に関する。

世界中で難聴は、新生児５００名の内の１名および７０歳を超える人口の半数が発症する。ヒトの感覚の最も一般的な機能不全であるにも関わらず、難聴のための薬理学的治療は現在ない。音シグナルを電気的刺激に変換することを担っている成体哺乳動物の蝸牛の有毛細胞（ＨＣ）は、損傷後に自発的に再生する能力を完全に失っている。成体蝸牛の有毛細胞の減少は、難聴の主な原因と考えられている。

本開示は、難聴のトランスジェニックマウスモデルにおいて有毛細胞の再生を誘導する小分子と阻害性核酸との新規組合せの発見に、少なくとも一部基づく。本明細書に記載の新規組合せが、化学的に誘導された有毛細胞損傷を有する成体野生型マウスにおいて有毛細胞を再生するために使用され得ることも実証された。

したがって、本開示の態様は、有毛細胞再生のために成体哺乳動物の内耳を再プログラムするための方法であって、成体哺乳動物の内耳を、有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸に、成体哺乳動物の内耳において前駆細胞の集団を産生するための条件下で、その産生に十分な時間、接触させることを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、脂肪酸化合物、ピロキサミド（pyroxamide）、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、ロミデプシン、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＩ－９９４（Ｎ－アセチルジナリン（acetyldinaline）、タセジナリン（tacedinaline）とも）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５；以前はＭＳ－２７５）、ＥＶＰ－０３３４、ＳＲＴ５０１、ＣＵＤＣ－１０１、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＰＣＩ２４７８１、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、トリコスタチン（Trichosatin）Ａ、ボリノスタット（vorinostate）（ＳＡＨＡ）またはベリノスタット（ＰＸＤ１０１）である。

一部の実施形態では、１つまたは複数の阻害性核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の阻害性核酸は、ＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする阻害性核酸を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、哺乳動物の蝸牛をＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストに接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子は、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である、および／またはｃＡＭＰ活性化因子はフォルスコリンである。

一部の実施形態では、集団の前駆細胞は、Ｓｉｘ１、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｈｅｓ５またはこれらの組合せを発現する。

一部の実施形態では、接触は、対象の内耳において生じる。

本開示の態様は、対象において難聴または前庭機能障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象の内耳に有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸を投与すること；ならびに対象の内耳に有効量のＡｔｏｈ１活性化因子を投与することを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、脂肪酸化合物、ピロキサミド、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、ロミデプシン、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＩ－９９４（Ｎ－アセチルジナリン、タセジナリンとも）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５；以前はＭＳ－２７５）、ＥＶＰ－０３３４、ＳＲＴ５０１、ＣＵＤＣ－１０１、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＰＣＩ２４７８１、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）またはベリノスタット（ＰＸＤ１０１）である。

一部の実施形態では、１つまたは複数の阻害性核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、１つまたは複数の阻害性核酸は、ＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする。

一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１活性化因子は、Ａｔｏｈ１をコードする核酸である。一部の実施形態では、Ａｔｏｈ１をコードする核酸は、ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象にＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子は塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である、および／またはｃＡＭＰ活性化因子はフォルスコリンである。

一部の実施形態では、対象は、騒音性永久聴覚消失、薬物誘発性難聴、加齢性難聴、突発性感音性難聴、ウイルス感染による難聴、耳鳴症、前庭機能障害、またはこれらの組合せを有するヒト患者である。一部の実施形態では、対象はヒトである。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料も使用され得る。材料、方法および例は単に例示的であり、限定を意図しない。本明細書で述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。

本発明の他の特性および有利点は、以下の詳細な記載および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。

ＶＰＡ／ｓｉＦＭが成体マウス蝸牛中の感覚細胞を再プログラムできることを示すデータを示す図である。図１Ａ：ＷＴマウスにおいてＶＰＡ／ｓｉＦＭを使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍｃｈｅｒｒｙが続く実験手順を例示する模式図。 ＶＰＡ／ｓｉＦＭが成体マウス蝸牛中の感覚細胞を再プログラムできることを示すデータを示す図である。図１Ｂ：ＶＰＡ／ｓｉＦＭまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）処置、およびａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍｃｈｅｒｒｙ処置成体（Ｐ３０）ＷＴマウス蝸牛試料は、ＭＹＯ７Ａ／ｍｃｈｅｒｒｙで標識された。 ＶＰＡ／ｓｉＦＭが成体マウス蝸牛中の感覚細胞を再プログラムできることを示すデータを示す図である。図１Ｃ：定量および比較は、ＶｓｉＦｓｉＭ／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置またはビヒクル／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置群間で、培養された蝸牛中で再生されたＨＣの有意な増加を示した。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群についてｎ＝５。ＳＥ：感覚領域；Ｌｉｂ：周辺領域。Ｖ：ＶＰＡ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。各群においてＮ＝５。スケールバー：１０μｍ。 図２Ａ：培養された成体マウス蝸牛中で有毛細胞を再プログラムおよび再生できなかった小分子とｓｉＲＮＡとの種々の組合せを例示する模式図である。 図２Ｂ：培養された成体マウス蝸牛中で有毛細胞を再プログラムおよび再生できなかった小分子とｓｉＲＮＡとの種々の組合せを例示する模式図である。 図２Ｃ：培養された成体マウス蝸牛中で有毛細胞を再プログラムおよび再生できなかった小分子とｓｉＲＮＡとの種々の組合せを例示する模式図である。 カクテル（ＶＰＡ／ｓｉＦＩＲ／ｓｉＭｘｉ１）処置が、ネオマイシン損傷後の培養された成体マウス卵形嚢中のＨＣを再生することを示すデータを示す図である。図３Ａ：ネオマイシンを用いて処置した卵形嚢試料の実験手順を例示する模式図。図３Ｂ：ネオマイシン処置成体野生型マウス卵形嚢試料は、未処置卵形嚢試料と比較して有毛細胞（ＭＹＯ７Ａを用いて染色）の減少を示した。 カクテル（ＶＰＡ／ｓｉＦＩＲ／ｓｉＭｘｉ１）処置が、ネオマイシン損傷後の培養された成体マウス卵形嚢中のＨＣを再生することを示すデータを示す図である。図３Ｃ：ネオマイシンおよびカクテル（ＶＰＡ／ｓｉＦＩＲ／ｓｉＭｘｉ１）を用いて処置した卵形嚢試料の実験手順を例示する模式図。図３Ｄ：５日間のネオマイシン処置後、続いてＶＰＡ／ｓｉＦＩＲ／ｓｉＭｘｉ１を用いて処置した培養卵形嚢は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処置卵形嚢よりも有毛細胞（ＭＹＯ７Ａ陽性）の増加を示した。ＳＯＸ２は有毛細胞および支持細胞の両方を標識する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカクテルの再プログラム効果を示すデータを示す図である。図４Ａ：小分子（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）の組合せによって処置された蝸牛試料の実験手順を例示する模式図。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカクテルの再プログラム効果を示すデータを示す図である。図４Ｂ：４日間カクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）処置後の培養された成体ＷＴマウス蝸牛でのｑＲＴ－ＰＣＲ。内耳前駆細胞遺伝子の選択された群は、Ｓｉｘ１、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３およびＳｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ１およびその標的Ｈｅｓ５を含んで上方制御された。一部の内耳前駆細胞遺伝子（Ｈｅｓ１、Ｆｏｘｇ１およびＤｌｘ５）は、発現レベル変化をほとんど示さなかった。幹細胞遺伝子（Ｆｕｔ４、ＮａｎｏｇおよびＡｌｐｌ）または分化遺伝子（Ｐｒｏｘ１、Ｐ２７^ｋｉｐ１もしくはＣｄｋｎ１ｂ）は、上方制御されなかった。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３。ｎは生物学的に独立した試料の数である。Ｖ：ＶＰＡ；Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｔｏｈ１－ＧＦＰマウスにおける小分子とｓｉＲＮＡとの組合せ（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）の適用、およびａｄ－Ａｔｏｈ１によるＨＣ誘導によって処置された蝸牛試料の実験手順を例示する模式図。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ｂ～５Ｃ：ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ（またはビヒクルＤＭＳＯ）／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置成体（Ｐ３０）Ａｔｏｈ１－ＧＦＰマウス蝸牛試料を、感覚上皮領域においてＭＹＯ７Ａ（濃い灰色）／Ａｔｏｈ１－ＧＦＰ（薄い灰色）を用いて標識した。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ｄ～５Ｇ：定量および比較は、ビヒクル／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置試料と比較してＤＬＦｓｉＦｓｉＭ／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置試料での、培養された蝸牛の感覚上皮（ＳＥ）または周辺領域（Ｌｉｂ）での再生されたＨＣ（ＧＦＰ＋ＭＹＯ７Ａ標識）の増加を示した。感染細胞（ＧＦＰ陽性）の数は、２群間で同じであった。Ｔ、Ｔａｍｏ：４－ヒドロキシタモキシフェン。Ｖ：ＶＰＡ；Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５～６。スケールバー：１０μｍ。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ｈ～５Ｉ：ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置成体（Ｐ３０）Ａｔｏｈ１－ＧＦＰマウス蝸牛試料を、有毛細胞が機能性であることの指標、Ａｔｏｈ１－ＧＦＰ／ＦＭ１－４３／ＭＹＯ７Ａを用いて標識した。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ｊ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＬＦｓｉＦｓｉＭを加えたＳｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴのＴａｍｏ誘導およびａｄ－Ａｔｏｈ１によるＨＣ誘導による系譜追跡の実験手順を例示する模式図。 小分子およびｓｉＲＮＡカクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）がロバストな有毛細胞再生を誘導したことを示すデータを示す図である。図５Ｋ：Ｔａｍｏ／ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ／ａｄ－Ａｔｏｈ１処置成体（Ｐ３０）Ｓｏｘ２ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴマウス蝸牛試料は、ＭＹＯ７Ａ／Ｓｏｘ２－ｔｄＴで標識された。図５Ｌ：（図５Ｋ）からの拡大図。矢印は、ＭＹＯ７Ａ／Ｓｏｘ２－ｔｄＴ二重陽性細胞を示す。矢頭は、ＭＹＯ７Ａ＋／Ｓｏｘ２－ｔｄＴ細胞を示し、再生された有毛細胞が支持細胞の分化転換由来であったことを実証している。 種々のＨＤＡＣ阻害剤が、ＭｙｃモジュレーターｓｉＲＮＡとの組合せでＡｄ－Ａｔｏｈ１感染後にｉｎ ｖｉｔｒｏで成体蝸牛中の有毛細胞を効率的に再生するために使用され得ることを示すデータを示す図である。Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。 図７Ａ、図７Ｂ：ＭｙｃモジュレーターＦｂｘｗ７に対するｓｉＲＮＡが、単独またはＭｙｃモジュレーターＦｉｒおよびＭｘｉ１に対するｓｉＲＮＡおよびＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡとの組合せで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成体野生型蝸牛において有毛細胞再生を異なる効率で促進することを示すデータを示す図である。 図７Ｃ：ＭｙｃモジュレーターＦｂｘｗ７に対するｓｉＲＮＡが、単独またはＭｙｃモジュレーターＦｉｒおよびＭｘｉ１に対するｓｉＲＮＡおよびＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡとの組合せで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成体野生型蝸牛において有毛細胞再生を異なる効率で促進することを示すデータを示す図である。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度のＨＣ減少モデルからのデータを示す図である。図８Ａ：ｉｎ ｖｉｖｏでカナマイシン／フロセミドによって処置されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの実験手順を例示する模式図。図８Ｂ：ＭＹＯ７Ａ／ＳＯＸ２を用いて染色したＫａｎａ／Ｆｕｒｏ処置成体野生型マウス蝸牛試料。スケールバー：１０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度のＨＣ減少モデルからのデータを示す図である。図８Ｃ：新たに切断した、およびＫａｎａ／Ｆｕｒｏ処置耳の間での有毛細胞および支持細胞の定量および比較（ＨＣ／ＳＣ）。データは、カナマイシン／フロセミド処置後に、大部分の外有毛細胞は、蝸牛回転（cochlea turn）全体にわたって死滅されていたが、一方支持細胞は維持されていたことを示した。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５。ソースデータはソースデータファイルとして提供される。スケールバー：１０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度ＨＣ減少モデルにおける新たなＨＣのロバストな再生を示すデータを示す図である。図９Ａ：ｉｎ ｖｉｖｏでのカナマイシン／フロセミド、小分子の組合せ（またはビヒクル）およびａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙによるＨＣ誘導によって処置されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの実験手順を例示する模式図。図９Ｂ：ＥＳＰＮ／ｍＣｈｅｒｒｙを用いて標識したＫａｎａ／Ｆｕｒｏ／ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ（またはビヒクル）／ａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙ処置成体野生型マウス蝸牛試料。カクテル（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）処置を行わない対照群では、わずかに残った外有毛細胞が見られた。対照的に、カクテル処置後は、ロバストな有毛細胞再生が蝸牛回転にわたって見られた。Ｄ：Ｄｏｘ；Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５～６。ソースデータはソースデータファイルとして提供される。スケールバー：１０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度ＨＣ減少モデルにおける新たなＨＣのロバストな再生を示すデータを示す図である。図９Ｃ：定量および比較は、外有毛細胞（ＯＨＣ）領域では、蝸牛回転にわたって、ビヒクル処置耳と比較してカクテル処置内耳での有毛細胞の数の有意な増加を示した。内有毛細胞（ＩＨＣ）領域では、ａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙ感染の欠如およびＩＨＣの生存のためＩＨＣ数は変化しない。Ｄ：Ｄｏｘ；Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５～６。ソースデータはソースデータファイルとして提供される。スケールバー：１０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの新たなＨＣを低倍率で示すデータを示す図である。図１０Ａ：ｉｎ ｖｉｖｏでのカナマイシン／フロセミド、小分子の組合せ（またはビヒクル）、およびａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙによるＨＣ誘導によって処置されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの実験手順を例示する模式図。図１０Ｂ：ＥＳＰＮ／ｍＣｈｅｒｒｙを用いて標識したＫａｎａ／Ｆｕｒｏ／ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ（またはビヒクル）／ａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙ処置成体野生型マウス蝸牛の頂部（apex）から頂部－中央部（apex-mid）の試料。Ｄ：Ｄｏｘ；Ｌ：ＬｉＣｌ；Ｆ：ＦＳＫ；ｓｉＦ：ｓｉＦＩＲ；ｓｉＭ：ｓｉＭｘｉ１。スケールバー：２０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度ＨＣ減少モデルにおける支持細胞分化転換による新たなＨＣのロバストな再生を示すデータを示す図である。図１１Ａ：ｉｎ ｖｉｖｏでのカナマイシン／フロセミド、小分子の組合せ（またはビヒクル）およびａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙによるＨＣ誘導によって処置されたＣ５７ＢＬ／６ｊマウスの実験手順を例示する模式図。図１１Ｂ：ＥＳＰＮ／ＳＯＸ２／ｍＣｈｅｒｒｙを用いて染色されたＫａｎａ／Ｆｕｒｏ／ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ／ａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙ処置成体野生型マウス蝸牛試料（矢頭）。ＥＳＰ－ＳＯＸ２の二重標識は、有毛細胞（ＭＹＯ７Ａ）が支持細胞（ＳＯＸ２）の分化転換由来であることの指標である。図１１Ｃ：定量および比較は、新たに切断した耳と比較して、カクテル処置後の有毛細胞への支持細胞の分化転換の結果として非分化転換ＳＣ（ＥＳＰＮ－／ＳＯＸ２＋）の減少を示した。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５。スケールバー：２０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでの重度ＨＣ減少モデルにおける支持細胞分化転換による新たなＨＣのロバストな再生を示すデータを示す図である。図１１Ｃ：定量および比較は、新たに切断した耳と比較して、カクテル処置後の有毛細胞への支持細胞の分化転換の結果として非分化転換ＳＣ（ＥＳＰＮ－／ＳＯＸ２＋）の減少を示した。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側対応のないスチューデントのｔ検定。エラーバー、平均±ＳＥＭ；各群においてＮ＝５。スケールバー：２０μｍ。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の記載に記されている。本発明の他の特性および有利点は、続く図面およびいくつかの実施形態の詳細な記載から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかである。

詳細な記載
有毛細胞の減少は、ヒトでの永久難聴の主な原因である。哺乳動物における不可逆的な蝸牛の有毛細胞損傷および減少を克服するための戦略は、聴力回復に非常に重要である。成熟した哺乳動物の蝸牛では、ｃ－ＭｙｃおよびＮｏｔｃｈ１の同時活性化が支持細胞を再プログラムし、有毛細胞再生を促進する。細胞周期、細胞成長および幹細胞におけるＭｙｃの重要な役割を考慮すると、臨床に関連するアプローチによるＭｙｃの調節は、内耳における有毛細胞の再生において優先事項である。本発明者らは、Ｍｙｃが有毛細胞再生において非常に重要であることを示した。しかし、小分子を使用してＭｙｃを活性化することは困難であり、ＭＹＣタンパク質は不安定で産生することは困難である。したがって、本発明者らは、有毛細胞再生のための十分なレベルにＭｙｃを活性化するための方法の同定に注目した。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて効率的に有毛細胞を再生するためにＭｙｃと共に作用するものを同定するために、ＨＤＡＣ阻害剤および内耳発達経路を含む複数の標的について追加的にスクリーニングした。

本明細書に記載のとおり、小分子と阻害性核酸との組合せが成体野生型マウスにおいて有毛細胞を再生するために使用された。再生された有毛細胞の元の支持細胞は、系譜追跡によって確認された。再生された有毛細胞は外有毛細胞についてのＳＬＣ２６Ａ５（プレスチン）および内有毛細胞についてのＳＬＣ１７Ａ８（ＶＧＬＵＴ３）を含む複数の成熟有毛細胞マーカーを用いて標識された。新たな有毛細胞は、成体らせん神経節ニューロンと接続を形成し、形質導入複合体の存在の指標、ＦＭ１－４３色素を取り込む。加えて、ｉｎ ｖｉｖｏでの重度の有毛細胞減少のマウスモデルにおける効率的な有毛細胞再生が実証された。要約すると、本明細書に記載の実験結果は、野生型成熟哺乳動物の蝸牛において有毛細胞を再生するために小分子および阻害性核酸を使用するコンビナトリアルアプローチを同定し、臨床に関連するアプローチを用いた聴力回復のための基礎を築いた。

聴覚機能を回復させるためのＨＣ再生についての戦略は、活発に探求されている。多方面の証拠は、哺乳動物でのＨＣ再生が可能であることを示唆している。自発性のＨＣ再生は、トリおよび魚などの下等脊椎動物では生じる。胚性および新生仔のマウス蝸牛も、ＨＣ発達のために不可欠な特定の遺伝子の発現を増強することによってＨＣを再生する能力を保持する。新生仔げっ歯類での有毛細胞再生は、さまざまなシグナル経路を変更することによって達成された。ソニックヘッジホッグシグナル伝達を活性化することは、蝸牛感覚上皮での細胞周期再進入およびＨＣ再生の両方をもたらした。ＥＲＢＢ２経路は、新生仔マウスにおける支持細胞増殖の促進およびＭＹＯ７Ａ＋細胞生成の増加にも関与した^１２。しかし、新たなＨＣを生成するこの能力は、出生２週間後に、ＨＣ再生シグナル経路の発現を変更した後でさえ急速に減少し^９、上記の処置のいずれも成体マウスにおいて蝸牛のＨＣを再生するために十分でなかった。

ＭｙｃおよびＮＩＣＤ（Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン）の一過的な同時活性化によって、成体マウス蝸牛が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でのＡｔｏｈ１過剰発現後に多数の新たなＨＣの生成を伴って、比較的若い段階に良好に再プログラムされ、前駆細胞の能力を取り戻し得ることが以前示された^１６。しかしながら、この「達成」は、ヒト患者における臨床試験に適用できないトランスジェニック動物においてのみ生じる。したがって、ヒト蝸牛でのＨＣ再生は、とりわけ困難なままである。

本明細書に記載の小分子と阻害性核酸との種々の組合せをスクリーニングすることによって、Ｍｙｃを調節でき、Ｓｏｘ２＋支持細胞（ＳＣ）を含む高分化型の蝸牛上皮細胞を、成体において前駆細胞の能力を取り戻し、新たなＨＣをロバストに再生するように再プログラムできる薬剤の固有の組合せが同定された。さらに、さまざまなＨＣ減少マウスモデルの新たに再生されたＨＣを比較することによって、成体蝸牛におけるさまざまな再プログラムアプローチが、新たなＨＣのさまざまな成熟レベルをもたらすことが明らかになった。したがって、本明細書で提供される実験データは、蝸牛のＨＣのロバストな再生が、臨床に関連するアプローチを使用して成体マウスにおいて達成され得ることを実証する。

したがって、本開示は、一部の態様において、薬剤の固有の組合せを使用して、成体野生型蝸牛および卵形嚢において有毛細胞を再生するための方法を提供する。

Ｉ．成体哺乳動物の蝸牛において有毛細胞（ＨＣ）を再生するための薬剤
成体哺乳動物の蝸牛における有毛細胞を再生するための方法であって、（１）成体哺乳動物の蝸牛が比較的若い段階に良好に再プログラムされ、それにより前駆細胞の能力を取り戻し得る、再プログラムステップ；および（２）再プログラムされた成体前駆細胞におけるＨＣ運命決定因子（Ａｔｏｈ１）の活性化がＨＣ再生をもたらす分化転換ステップを含む、方法を本明細書で提供する。

本明細書に記載の再プログラムステップでは、哺乳動物の蝸牛は、ＨＤＡＣ阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸を含む薬剤の固有の組合せを使用して、低分化状態に再プログラムされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法における使用のための薬剤の固有の組合せは、Ｗｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストも含む。

本明細書において使用される場合、「薬剤」は、有毛細胞再生のために哺乳動物の蝸牛を再プログラムできる、および／または哺乳動物の蝸牛中の有毛細胞を再生することができる任意の分子（例えば、小分子、核酸）を指す。記載される方法における使用のための薬剤として、ＨＤＡＣ阻害剤、Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする阻害性核酸、Ｗｎｔアゴニスト、ｃＡＭＰアゴニストおよびＡｔｏｈ１活性化因子が挙げられる。

（ａ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤
本明細書に記載の方法は、成体哺乳動物の蝸牛を低分化前駆細胞状態に再プログラムするためのＨＤＡＣ阻害剤の使用を含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣクラスＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤、および／またはｐａｎ－ＨＤＡＣ阻害剤である。一部の実施形態では、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤は、ＳＩＲＴ１阻害剤および／またはＳＩＲＴ２阻害剤である。

本明細書において使用される場合、「ＨＤＡＣ阻害剤」は、１つまたは複数のＨＤＡＣに結合および阻害し、それによりＨＤＡＣの酵素活性に影響を与える化合物を指す。ＨＤＡＣは、ヒストンのＮ末端でリジン残基のε－アミノ基からのアセチル基の除去を触媒する酵素のファミリーのいずれか１つを指す。文脈により他に示されない限り、用語「ヒストン」は、任意の種由来の、ＨＩ、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５が挙げられる任意のヒストンタンパク質を指して意味する。ヒトＨＤＡＣタンパク質は、４つのクラスに分類される：クラスＩはＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ８を含む；クラスＩＩはＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７およびＨＤＡＣ９を含む；クラスＩＩＩはＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６およびＳＩＲＴ７を含む；ならびにクラスＩＶはＨＤＡＣ１１を含む。ＨＤＡＣ阻害剤は、ｐａｎ－ＨＤＡＣ阻害剤であってよい、または１つまたは複数のＨＤＡＣに対する選択性を示す場合がある。

一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、脂肪酸化合物、ピロキサミド、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、ロミデプシン、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＩ－９９４（Ｎ－アセチルジナリン、タセジナリンとも）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５；以前はＭＳ－２７５）、ＥＶＰ－０３３４、ＳＲＴ５０１、ＣＵＤＣ－１０１、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＰＣＩ２４７８１、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、またはこれらの組合せである。ＨＤＡＣ阻害剤の例として、これだけに限らないが、表１に列挙する化合物が挙げられる。

（ｂ）Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１およびＦｂｘｗ７を標的にする阻害性核酸
本開示の態様は、Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７、またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸を使用して成体哺乳動物の蝸牛を低分化前駆細胞状態に再プログラムするための方法を提供する。

ヒトＦｉｒ、ヒトＭｘｉ１およびヒトＦｂｘｗ７の配列は、当技術分野において公知である。例えば、ヒトＦｉｒの配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてＮＭ＿０７８４８０．３として利用可能である（配列番号１）。例えば、ヒトＭｘｉ１の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてＮＭ＿００５９６２．５として利用可能である（配列番号２）。例えば、ヒトＦｂｘｗ７の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてＮＭ＿０３３６３２．３として利用可能である（配列番号３）。下の表２を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「阻害性核酸」は、哺乳動物細胞に投与された場合に、標的遺伝子の発現の減少を生じる核酸またはその模倣物を指す。典型的には、阻害性核酸は、標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調節する標的核酸分子の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％またはこれを超えて低減される。

阻害性核酸の例として、これだけに限らないが、低分子干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。阻害性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸およびこれらの組合せ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）を含み得る。特定の配列を標的にする阻害性核酸を作製および送達するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ramachandran and Ignacimuthu, Appl Biochem Biotechnol. 2013; 169(6):1774-89；Li et al., J Control Release 2013; 172(2):589-600；Lochmatter and Mullis, Horm Res Paediatr. 2011; 75(1):63-9；Higuchi et al., BioDrugs. 2010; 24(3):195-205；およびMing et al., Expert Opin Drug Deliv. 2011; 8(4):435-49を参照されたい。

本明細書に記載の方法は、単一の阻害性核酸または複数の阻害性核酸の使用を包含する。例えば、ＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする場合、本明細書に記載の方法および組成物は、ＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする単一の阻害性核酸の使用、またはＦｉｒを標的にする阻害性核酸およびＭｘｉ１を標的にする阻害性核酸の使用を含み得る。

一部の実施形態では、阻害性核酸は、Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１またはＦｂｘｗ７の内の１つを標的にする（例えば、阻害性核酸はＦｉｒを標的にする、阻害性核酸はＭｘｉ１を標的にする、または阻害性核酸はＦｂｘｗ７を標的にする）。一部の実施形態では、阻害性核酸は、Ｆｉｒ、Ｍｘｉ１およびＦｂｘｗ７の内の２つを標的にする（例えば、阻害性核酸はＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする、阻害性核酸はＦｉｒおよびＦｂｘｗ７を標的にする、または阻害性核酸はＭｘｉ１およびＦｂｘｗ７を標的にする）。一部の実施形態では、阻害性核酸はＦｉｒ、Ｍｘｉ１およびＦｂｘｗ７のそれぞれを標的にする。

（ｃ）ＷｎｔアゴニストおよびｃＡＭＰアゴニスト
本明細書に記載の方法は、一部の実施形態では、成体哺乳動物の蝸牛を低分化前駆細胞状態に再プログラムするためのＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストの使用を含む。

本明細書において使用される場合、用語「Ｗｎｔアゴニスト」は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を活性化する、またはＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の阻害剤、例えば、ＧＳＫ－３β活性のアンタゴニストもしくは阻害剤の活性および／もしくは発現を阻害する任意の薬剤を指す。

Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質、またはＦｒｉｚｚｌｅｄおよびリポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）共受容体タンパク質（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化因子、ＬＲＰ５／６活性化因子）に、哺乳動物細胞の核においてβ－カテニンの濃度の増加を促進する様式で直接結合する他の化合物を含む。代替的に、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔタンパク質に結合し、内在性Ｗｎｔ共受容体との相互作用から隔離する、１つもしくは複数の分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）（例えば、ｓＦＲＰ阻害剤）またはＷｎｔ阻害性タンパク質（ＷＩＦ）（例えば、ＷＩＦ阻害剤）を阻害することによって機能し得る。Ｗｎｔアゴニストの例として、これだけに限らないが、グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）阻害剤、Ｗｎｔ活性化因子、ディシェベルド（Disheveled）（Ｄｖｌ）活性化因子、アキシン阻害剤、ディッコフ（Dickkopf）（Ｄｋｋ）阻害剤およびグルーチョ（Groucho）阻害剤も挙げられる。ＧＳＫ－３βは、プロテアソームによる下流分解のためにβ－カテニンを調製するようにアキシン、ＡＰＣ（大腸腺腫症（Adenomatous polyposis coli））およびβ－カテニンと複合体を形成するキナーゼである。ディシェベルド（Ｄｖｌ）は、活性化Ｎｏｔｃｈ受容体から下流エフェクターにシグナルを中継する細胞内タンパク質である。Ｄｖｌは、受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄによってリクルートされ、β－カテニンの構成的破壊（descruction）を妨げる。Ｄｋｋは、ＬＲＰ５／６共受容体タンパク質を単離するように作用し、それによりＷｎｔシグナル伝達を阻害する分泌タンパク質である。グルーチョは、遺伝子発現を抑制するように核中でＴＬＥと複合体を形成するタンパク質である。β－カテニンが核に進入すると、それはグルーチョ／ＴＬＥ複合体を破壊し、遺伝子発現を活性化する。Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する小分子化合物であってよい。例えば、本明細書で参照される目的および主題についてその関連する開示が参照により組み込まれる国際公開第２０１８１７２９９７号パンフレットを参照されたい。Ｗｎｔアゴニストの例として、これだけに限らないが、表３に列挙する化合物が挙げられる。

本明細書において使用される場合、「ｃＡＭＰアゴニスト」は、薬剤が非存在であるバックグラウンド生理的細胞内レベルと比較して、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させる薬剤を指す。ｃＡＭＰアゴニストの例として、これだけに限らないが、フォルスコリン、ロリプラム、ＮＫＨ４７７、ＰＡＣＡＰ１－２７、ＰＡＣＡＰ１－３８およびイソプロテレノールが挙げられる。

（ｄ）Ａｔｏｈ１活性化因子
成体野生型蝸牛を低分化状態に再プログラムした後に、Ａｔｏｈ１活性は、成体哺乳動物の蝸牛においてＨＣを再生するように増加され得る。したがって、本明細書に記載の方法は、一部の実施形態では、低分化状態に再プログラムされた（例えば、内耳前駆細胞遺伝子を再発現するように再プログラムされた）成体野生型蝸牛において蝸牛の有毛細胞を再生するためにＡｔｏｈ１活性を増加させる薬剤の使用を含む。

本明細書において使用される場合、用語「Ａｔｏｈ１」は、哺乳動物の内耳において有毛細胞の形成に関与する転写因子の塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ＢＨＬＨ）ファミリーに属するタンパク質を指す。

Ａｔｏｈ１活性を増加させるための任意の方法は、本明細書に記載の方法において使用され得る。Ａｔｏｈ１活性を増加させる方法（Ａｔｏｈ１アゴニストの使用を含む）は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第８，１８８，１３１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３０５６７４号明細書；米国特許出願公開第２００９０２３２７８０号明細書；Kwan et al. (2009) INT'L SYMPOSIUM ON OLFACTION AND TASTE: ANN. N.Y. ACAD. SCI. 1170:28-33；Daudet et al. (2009) Dev. Bio. 326:86-100；Takebayashi et al. (2007) Dev. Bio. 307:165-178；およびAhmed et al. (2012) Dev. Cell 22(2):377-390を参照されたい）。

本明細書に記載の方法において使用され得るＡｔｏｈ１活性を増加させるための方法の非限定的例は、本明細書にその全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０２０／０３３８１６０号明細書に提供されている。

Ａｔｏｈ１活性を増加させるための薬剤は、Ａｔｏｈ１、Ａｔｏｈ１タンパク質またはＡｔｏｈ１アゴニストをコードする核酸であり得る。例示的なＡｔｏｈ１ポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて参照されるＮＰ＿００５１６３．１が挙げられる。標的細胞において発現され得る例示的なＡｔｏｈ１核酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースにおいて参照されるＮＭ＿００５１７２．１が挙げられる。

米国特許第８，１８８，１３１号明細書に記載された他の例示的なＡｔｏｈ１活性化因子として、４－（４－クロロフェニル）－１－（５Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］インドール－４－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－アミン；６－クロロ－１－（２－クロロベンジルオキシ）－２－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；６－クロロ－１－（２－クロロベンジルオキシ）－２－（４－メトキシフェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；６－クロロ－２－（４－メトキシフェニル）－１－（４－メチルベンジルオキシ）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；６－クロロ－１－（３，５－ジメチルベンジルオキシ）－２－（４－メトキシフェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；６－クロロ－１－（４－メトキシベンジルオキシ）－２－（４－メトキシフェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；１－（４－メチルベンジルオキシ）－６－ニトロ－２－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；４－（１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）フェノール；２，５－ジクロロ－Ｎ－（（１－メチル－Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）メチル）アニリン；４－（２－（１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）エチル）アニリン；２－（（２－メトキシフェノキシ）メチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；２－（（４－フルオロフェノキシ）メチル）－１－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；２－（フェニルチオメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；３－（６－メチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－２Ｈ－クロメン－２－イミン；Ｎ－（２－（１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）フェニル）イソブチルアミド；２－（ｏ－トリルオキシメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；２－（４－メトキシフェニル）－１－フェネチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール；Ｎ－（６－ブロモベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）チオフェン－２－カルボキサミド；Ｎ－（ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド；２－（４－フルオロベンジルチオ）ベンゾ［ｄ］チアゾール；５－クロロ－Ｎ－メチルベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン；Ｎ－（６－アセトアミドベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）フラン－２－カルボキサミド；Ｎ－（６－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－３－メトキシベンズアミド；２－（ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２－イルチオ）－Ｎ－（２－クロロフェニル）アセトアミド；５－クロロ－２－フェニルベンゾ［ｄ］オキサゾール；５－メチル－２－ｍ－トリルベンゾ［ｄ］オキサゾール；２－（４－イソブトキシフェニル）－３－（ナフタレン－２－イル）－２，３－ジヒドロキナゾリン－４（１Ｈ）－オン；Ｎ－（２－（２－（４－フルオロフェニル）－２－オキソエチルチオ）－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）ベンズアミド；２－（４－クロロフェニル）－４－（４－メトキシフェニル）－１，４－ジヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２－ａ］ピリミジン；２－（３－ピリジル）－４－（４－ブロモフェニル）－１，４－ジヒドロベンゾ［４，５］イミダゾ［１，２－ａ］ピリミジン；Ｎ－ｓｅｃ－ブチル－１，７，７－トリメチル－９－オキソ－８，９－ジヒドロ－７Ｈ－フロ［３，２－ｆ］クロメン－２－カルボキサミド；Ｎ－（３－カルバモイル－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－シクロペンタ［ｂ］チオフェン－２－イル）ベンゾフラン－２－カルボキサミド；３－クロロ－Ｎ－（５－クロロピリジン－２－イル）ベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボキサミド；３－クロロ－Ｎ－（（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボキサミド；Ｎ－（３－（５－クロロ－３－メチルベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）アセトアミド；２－（ナフタレン－２－イル）－１Ｈ－インドール；２－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－インドール；Ｎ－（２－クロロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－２－オキソアセトアミド；２－ｍ－トリルキノリン；２－（４－（２－メトキシフェニル）ピペラジン－１－イル）キノロン；２－（１Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール－１－イル）－Ｎ－（２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－２－イル）アセトアミド；１－フェネチル－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール；７－（４－フルオロベンジルオキシ）－２Ｈ－クロメン－２－オン；Ｎ－（２，４－ジクロロフェニル）－８－メトキシ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド；Ｎ－（３－クロロフェニル）－８－メチル－３，４－ジヒドロキノリン－１（２Ｈ）－カルボチオアミド；７－メトキシ－５－メチル－２－フェニル－４Ｈ－クロメン－４－オン；２－（３，４－ジメチルフェニル）キノキサリン；４－ブロモ－Ｎ－（５－クロロピリジン－２－イル）ベンズアミド；３－アミノ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［ｅ］チエノ［２，３－ｂ］ピリジン－２－カルボキサミド；（Ｚ）－３－メチル－Ｎ’－（ニコチノイルオキシ）ベンズイミドアミド；Ｎ，Ｎ－ジエチル－６－メトキシチエノ［２，３－ｂ］キノリン－２－カルボキサミド；６－（４－メトキシフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－１，５－ナフチリジン；５－ブロモ－Ｎ－（２－（フェニルチオ）エチル）ニコチンアミド；Ｎ－（６－メチルピリジン－２－イル）－２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－カルボキサミド；２－（４－メチルベンジルチオ）オキサゾロ［４，５－ｂ］ピリジン；Ｎ－（２－メトキシエチル）－５－ｐ－トリルピリミジン－２－アミン；４－（５－（ベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）ピリミジン－２－イル）モルホリノ；４－（５－（４－フルオロフェニル）ピリミジン－２－イル）モルホリノ；Ｎ－（４－ブロモ－３－メチルフェニル）キナゾリン－４－アミン；Ｎ－（４－メトキシフェニル）キナゾリン－４－アミン；Ｎ－（３－メトキシフェニル）－９Ｈ－プリン－６－アミン；Ｎ，Ｎ－ジエチル－１－ｍ－トリル－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン；（５－（４－ブロモフェニル）フラン－２－イル）（モルホリノ）メタノン；（Ｚ）－４－ブロモ－Ｎ’－（フラン－２－カルボニルオキシ）ベンズイミドアミド；Ｎ－（４－ヨードフェニル）フラン－２－カルボキサミド；５－（５－（２，４－ジフルオロフェニル）フラン－２－イル）－１－（メチルスルホニル）－１Ｈ－ピラゾール；１－（３－アミノ－５－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオフェン－２－イル）エタノン；Ｎ－（３－シアノ（cayano）－４，５，６，７－テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）－２－フルオロベンズアミド；Ｎ－（５－クロロピリジン－２－イル）チオフェン－２－カルボキサミド；Ｎ－（２－（４－フルオロフェノキシ）エチル）チオフェン－２－カルボキサミド；２，５－ジメチル－Ｎ－フェニル－１－（チオフェン－２－イルメチル）－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミド；Ｎ－（３－シアノチオフェン－２－イル）－４－イソプロポキシベンズアミド；２－（４－メトキシフェノキシ）－Ｎ－（チアゾール－２－イル）アセトアミド；４－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（３－メチルピリジン－２－イル）チアゾール－２－アミン；４－（ビフェニル－４－イル）チアゾール－２－アミン；４－（４－（４－メトキシフェニル）チアゾール－２－イル）－３－メチルイソキサゾール－５－アミン；Ｎ－（２－メトキシフェニル）－４－フェニルチアゾール－２－アミン；１－（４－アミノ－２－（ｍ－トリルアミノ）チアゾール－５－イル）－２－メチルプロパン－１－オン；４－（４－クロロフェニル）－１－（５Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］インドール－４－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－アミン；２－（４－クロロフェニル）－６－エチル－５－メチルピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－７（４Ｈ）－オン；５－メトキシ－２－（５－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノール；（３－（４－ブロモフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）メタノール；Ｎ－（２，５－ジクロロフェニル）－１－エチル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボキサミド；４－クロロ－１－メチル－Ｎ－（２－オキソ－２－フェニルエチル）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボキサミド；Ｎ－（３－（５－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフラン－３－イル）－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）ベンズアミド；Ｎ－（５－メチルイソキサゾール－３－イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボキサミド；（５－（４－ブロモフェニル）イソキサゾール－３－イル）（モルホリノ）メタノン；Ｎ－（４－ブロモフェニル）－５－イソプロピルイソキサゾール－３－カルボキサミド；５－（（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）メチル）－３－（ピリジン－４－イル）－１，２，４－オキサジアゾール；５－（２－メトキシフェニル）－３－ｐ－トリル－１，２，４－オキサジアゾール；５－（フェノキシメチル）－３－（ピリジン－３－イル）－１，２，４－オキサジアゾール；５－（２－クロロ－４－メチルフェニル）－３－（ピリジン－３－イル）－１，２，４－オキサジアゾール；３－（２－クロロフェニル）－５－ｐ－トリル－１，２，４－オキサジアゾール；５－（ピペリジン－１－イルメチル）－３－ｐ－トイル－１，２，４－オキサジアゾール；５－（４－ブロモフェニル）－３－（ピリジン－３－イル）－１，２，４－オキサジアゾール；５－（２－ブロモフェニル）－３－（４－ブロモフェニル）－１，２，４－オキサジアゾール；５－（２－ブロモ－５－メトキシフェニル）－３－（チオフェニル－２－イル）－１，２，４－オキサジアゾール；３－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（ピペリジン－１－イル）プロピル）－１，２，４－オキサジアゾール－５－アミン；２－（２－クロロベンゾイル）－Ｎ－（４－フルオロフェニル）ヒドラジンカルボチオアミド；２－（メチルアミノ）－Ｎ－フェネチルベンズアミド；４－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－（（テトラヒドロフラン－２－イル）メチル）ベンズアミド；２－フェニル－５－ｏ－トリル－１，３，４－オキサジアゾール；４－（３－（４－クロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－５－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン；７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－１，１０ｂ－ジヒドロスピロ［ベンゾ［ｅ］ピラゾロ［１，５－ｃ］［１，３］オキサジン－５，１’－シクロヘキサン］；６－オキソ－２－（４－（３－（トリフルオロメチル）フェノキシ）フェニル）－１，４，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボニトリル；６－（４－メトキシフェニル）イミダゾ［２，１－ｂ］チアゾール；２－（２－ブロモフェノキシ）－Ｎ－（４Ｈ－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アセトアミド；１－（インドリン－１－イル）－２－フェノキシエタノン；２－（４－クロロフェニル）－６，７，８，９－テトラヒドロベンゾ［ｅ］イミダゾ［１，２－ｂ］［１，２，４］トリアジン；および薬学的に許容されるこれらの塩が挙げられる。

（ｅ）医薬組成物
本明細書に記載の蝸牛の有毛細胞を再生するためのいずれの化合物も、蝸牛の前駆細胞の集団を産生する方法および難聴を処置する方法における使用のための医薬組成物を形成するために、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合され得る。

本明細書に記載の１つまたは複数の化合物を含む医薬組成物は、目的の投与方法に応じて製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、局所または全身投与、例えば、耳への滴下剤（例えば、耳への滴下）もしくは注射、吹送（insufflation）（耳へなど）、静脈内、局所または経口投与による投与のために製剤化され得る。本明細書に記載の１つまたは複数の化合物は、対象への直接投与のための医薬組成物として製剤化され得る。

投与のための医薬組成物の性質は、投与の様式に依存し、当業者によって容易に決定され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、滅菌または滅菌可能である。本発明において注目される治療用組成物は、担体または賦形剤を含んでよく、その多くは当業者に公知である。使用され得る賦形剤として、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤および炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アルコルビン酸、リン脂質、ポリペプチド（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、水ならびにグリセロールが挙げられる。核酸、ポリペプチド、小分子および本発明において注目される他の調節性化合物は、投与の任意の標準的経路によって投与され得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、皮下または経口であり得る。

医薬組成物は、投与の対応する経路に応じて種々の方法で製剤化され得る。例えば、液体溶液剤は、耳への滴下剤による投与のために、注射のために、または経口摂取のために作製され得る；ゲル剤または散剤は、経口摂取または局所適用のために作製され得る。そのような製剤を作製するための方法は、周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^ndEd., Allen, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2012に見出すことができる。

１つまたは複数の化合物は、例えば、医薬組成物として、注射によって直接および／もしくは局所に、または外科的留置を通じて、例えば、内耳に投与され得る。医薬組成物の量は、有効量として、または治療有効量として記載され得る。一定期間にわたる適用が妥当であるまたは望ましい場合、本発明の組成物は、徐放性製剤中にまたは埋め込み型のデバイス（例えば、ポンプ）中に置かれてもよい。

代替的にまたは付加的に、医薬組成物は、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による全身非経口投与のために製剤化され得る。そのような製剤は、保存剤が添加されて、単位投与形態で、例えば、アンプル中または複数用量容器中に存在してよい。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤などの形態を取ってよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤用剤（formulatory agent）を含有してよい。代替的に活性成分は、使用前の好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質不含有水を用いた構成のために粉末形態であってもよい。

既に記載された製剤に加えて、組成物は、デポ調製物として製剤化されてもよい。そのような長時間作用型製剤は、埋め込み術（例えば、皮下に）によって投与され得る。したがって、例えば、組成物は、好適なポリマー性または疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳液として）またはイオン交換レジン、または、例えば、やや難溶性の塩のようなやや難溶性の誘導体を含んで製剤化され得る。

全身経口投与のために製剤化される医薬組成物は、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒロドキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を含んで従来の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法によってコーティングされてよい。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態を取ってよく、またはそれらは、使用前に水もしくは他の好適なビヒクルを用いる構成のための乾燥産生物として存在してもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素付加食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物は、必要に応じて緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有してもよい。経口投与のための調製物は、活性化合物の放出制御をもたらすように適切に製剤化されてよい。

一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のいずれかの方法により製剤化した１つまたは複数の化合物を含み得る。

ＩＩ．有毛細胞再生のために哺乳動物の蝸牛を再プログラムする方法
本開示の態様は、成体哺乳動物の蝸牛を再プログラムするための方法であって、哺乳動物の蝸牛を、ＨＤＡＣ阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸に、蝸牛の前駆細胞の集団を産生するための条件下で、その産生に十分な時間、接触させることを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、哺乳動物の蝸牛をＷｎｔアゴニスト（例えば、ＬｉＣｌ）および／またはｃＡＭＰアゴニスト（例えば、フォルスコリン）に接触させることをさらに含む。

本明細書において使用される場合、用語「再プログラムすること」は、蝸牛細胞の分化状態を変化させるまたは戻す工程を指す。例えば、分化した蝸牛細胞を含む成体哺乳動物の蝸牛は、分化した蝸牛細胞が蝸牛の前駆細胞に変換されるように再プログラムされ得る。再プログラムは、蝸牛細胞の分化状態の完全なまたは部分的な復帰を包含する。一部の実施形態では、再プログラムは、哺乳動物の蝸牛または哺乳動物の蝸牛細胞がＡｔｏｈ１活性化因子と接触された場合に、有毛細胞をさらに再生しやすいようにする。

本明細書において使用される場合、用語「前駆細胞」は、特定の細胞型、例えば、有毛細胞に成熟（分化）する潜在力を有する未成熟または未分化細胞を指す。本明細書において使用される場合、「蝸牛の前駆細胞」は、蝸牛の有毛細胞を形成する分化潜在力を有する前駆細胞を指す。前駆細胞は、分化によって生じ得る細胞よりも原始的である細胞の表現型を有する。例えば、蝸牛の前駆細胞は、Ｓｉｘ１、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｈｅｓ５または組合せ、などの前駆細胞マーカーを発現できる。

本明細書に記載の再プログラム法を実施するために、成体哺乳動物の蝸牛は、ＨＤＡＣ阻害剤および１つまたは複数の阻害性核酸などの薬剤の組合せに接触される。本明細書において使用される場合、用語「接触させること」は、有毛細胞再生のための薬剤の組合せ（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤ならびにＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸、ならびに任意選択でＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニスト）への哺乳動物の蝸牛の、哺乳動物の蝸牛において蝸牛の前駆細胞の集団を産生するための条件下で、その産生に十分な時間での曝露を指す。哺乳動物の蝸牛は、有毛細胞再生のための薬剤の組合せにｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、培養物中）でまたはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、対象において）で接触されてよい。

本明細書に記載の方法は、哺乳動物の蝸牛を本明細書に記載の薬剤の組合せに、蝸牛細胞を低分化前駆細胞状態に再プログラムするために好適な時間、接触させることを包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、哺乳動物の蝸牛を本明細書に記載の薬剤の組合せに、１～１５日間、例えば、２～１５日間、３～１５日間、４～１５日間、５～１５日間、６～１５日間、７～１５日間、８～１５日間、９～１５日間、１０～１５日間、１１～１５日間、１２～１５日間、１３～１５日間、１４～１５日間、１～１４日間、１～１３日間、１～１２日間、１～１１日間、１～１０日間、１～９日間、１～８日間、１～７日間、１～６日間、１～５日間、１～４日間、１～３日間または１～２日間接触させることを含む。

蝸牛の前駆細胞の存在は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、例えば、哺乳動物の蝸牛においてＳｉｘ１、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｈｅｓ５、またはこれらの組合せなどの１つまたは複数の前駆細胞遺伝子の発現を検出することによって決定され得る。

ＩＩＩ．処置方法
ＨＤＡＣ阻害剤ならびにＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸、ならびに任意選択でＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストを使用する、哺乳動物対象（例えば、ヒトまたは非ヒト獣医学対象）において難聴を処置する方法を本明細書で提供する。一部の実施形態では、対象は、新生児期の後（例えば、小児、青年または成年、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３歳を超える年齢）の対象である。対象は、本明細書に記載の薬剤の組合せを用いる処置を受け得る。

本明細書に記載の方法は、難聴、および騒音性永久聴覚消失、薬物誘発性難聴、加齢性難聴、前庭機能障害などの蝸牛の有毛細胞減少の結果として生じる任意の障害を処置することを包含する。

一部の実施形態では、難聴は、蝸牛の損傷または機能不全、例えば、有毛細胞の減少を生じる感覚上皮の減少または損傷から生じ得る感音性難聴である。

一部の実施形態では、難聴は、どのような理由からである場合もあり、またはどのような種類の事象の結果である場合もある。例えば、遺伝的または先天性欠損のため；例えば、ヒト対象は出生時から聾である場合があり、遺伝的または先天性欠損のために聴力が徐々に失われた結果として聾または聴力が低下している場合がある。別の例では、難聴は、耳の構造への物理的外傷、または急な大音響、または大音響への長期的曝露などの外傷性の事象の結果である場合がある。例えば、コンサート会場、空港の滑走路および建築エリアへの長期間の曝露は、内耳損傷および続く難聴を生じる場合がある。

一部の実施形態では、難聴は、化学物質誘発中毒性難聴による場合があり、ここで耳毒（ototoxin）は、抗悪性腫瘍剤、サリチレート（salicylates）、キニーネおよびアミノグリコシド抗生物質を含む治療薬、食品または医薬品中の混入物、ならびに環境または産業の汚染物質を含む。一部の実施形態では、難聴は加齢から生じる場合がある。

一部の実施形態では、方法は対象を選択することを含む。治療のために好適な対象は、内耳有毛細胞の減少を有するかもしくはそのリスクにある者、または感音性難聴を有するまたはそのリスクにあるものを含む。難聴を経験しているまたはそれを発症するリスクがある任意の対象は、本明細書に記載の処置方法のための候補である。一部の例では、対象は、騒音性永久聴覚消失、薬物誘発性難聴、加齢性難聴、突発性感音性難聴、ウイルス感染による難聴、耳鳴症、前庭機能障害、またはこれらの組合せを有する。難聴を有するまたはそれを発症するリスクがあるヒト対象は、平均的なヒトよりも聞くことが不十分、または難聴を経験する前のヒトよりも聞くことが不十分である場合がある。例えば聴力は、少なくとも５、１０、３０、５０％またはそれを超えて損なわれる場合がある。

一部の実施形態では、方法は、耳毒性のある傷害、例えば、有毛細胞の減少を生じるまたは生じる可能性がある物理的（騒音、外傷）または化学的（耳毒）傷害への曝露の１、２、３、４、５、６もしくは７日または１、２、３、４、５もしくは６週間以内に本明細書に記載の薬剤の組合せを対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、本発明において注目される薬剤および方法を使用する処置のために好適な対象は、両側性および片側性前庭機能障害を含む前庭機能障害を有する対象を含んでよく；方法は、治療有効量の本明細書に記載の薬剤を例えば、全身投与または内リンパ嚢（ＥＳ）を介する投与によって、投与することを含む。前庭機能障害は、めまい、不均衡、回転性めまい、悪心およびファジービジョン（fuzzy vision）を含む症状によって特徴付けられる内耳機能障害であり、聴覚の問題、疲労および認知機能の変化を伴う場合がある。本明細書に記載の方法によって処置され得る前庭機能障害は、前庭性有毛細胞の減少を生じる、遺伝的もしくは先天性欠損；感染、ウイルスもしくは細菌感染など；または傷害、外傷性もしくは非外傷性傷害など、の結果である場合がある。一部の実施形態では、平衡障害またはメニエール疾患（特発性内リンパ水腫）は、本明細書に記載の方法によって処置され得る。前庭機能障害は、最も一般的には、障害の個々の症状（例えば、めまい、悪心およびファジービジョン）を測定することによって検査される。

代替的にまたは付加的に、本発明において注目される薬剤および方法は、難聴、聴覚消失または他の有毛細胞の減少に関連する聴覚性障害の予防、低減または進行を遅らせるためなど予防的に使用され得る。例えば、１つまたは複数の薬剤を含有する組成物は、聴覚毒性治療、すなわち、有毛細胞毒性のリスクおよびそれにより聴力障害を生じるリスクを有する治療と共に（例えば、その前、後または同時に）投与され得る。聴覚毒性薬物として、抗生物質、ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、ビオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、バンコマイシンおよびストレプトマイシン；化学療法薬、シスプラチンなど；非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）、トリサリチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナク、ジフルニサル、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート（meclofenamate）、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サルサレート（salsalate）、スリンダクおよびトルメチンなど；利尿薬；サリチレート（salicylates）、アスピリンなど；ならびにある特定のマラリア処置、キニーネおよびクロロキンなど、が挙げられる。例えば、化学療法を受けている対象は、本明細書に記載の薬剤および方法を使用して処置され得る。例えば化学療法剤シスプラチンは、難聴を生じることが公知である。したがって、１つまたは複数の薬剤を含有する組成物は、シスプラチン副作用を予防するまたはその重症度を減らすためにシスプラチン治療と共に（例えば、その前、後または同時に）投与され得る。そのような組成物は、第２の治療剤の前、後および／または同時に投与され得る。２つの薬剤は、同じ経路によって、または異なる経路によって投与されてよい。

一般に、本明細書に記載の薬剤および方法は、内耳（例えば、蝸牛および／または卵形嚢）において、有毛細胞成長を生じさせるためならびに／または有毛細胞の数を増加させるために使用され得る。例えば、内耳（例えば、蝸牛および／または卵形嚢）中の有毛細胞の数は、処置前の有毛細胞の数と比較して約２、３、４、６、８または１０倍またはそれを超えて増加され得る。この新たな有毛細胞成長は、対象の聞く能力を効果的に回復させ得る、または少なくとも部分的な改善を確立し得る。例えば、薬剤の投与は、難聴を約５、１０、１５、２０、４０、６０、８０、１００％またはこれを超えて改善できる。

一部の場合では、組成物は、対象、例えば、処置の必要があると同定された対象に、全身投与経路を使用して投与され得る。全身投与経路として、これだけに限らないが、投与の非経口経路、例えば、静脈内注射、筋肉内注射および腹腔内注射；投与の経腸的経路、例えば、経口経路、トローチ剤、圧縮錠剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、滴下剤（例えば、耳滴下剤）、シロップ剤、懸濁剤および乳剤による投与；経皮的投与経路；ならびに吸入（例えば、点鼻薬）が挙げられる。

一部の場合では、組成物は、対象に、例えば、処置が必要であると同定された対象に、全身または局所投与経路を使用して投与され得る。そのような局所投与の経路は、１つまたは複数の薬剤を対象の耳、および／または対象の内耳に、例えば、注射によって、および／またはポンプを使用して投与することを含む。

一部の場合では、組成物は、耳（例えば、耳介投与）に、蝸牛の管腔（例えば、中央階、Ｓｃ前庭（vestibulae）およびＳｃ鼓室）などに注射され得る。例えば、組成物は、鼓室内注射（例えば、中耳への）、内耳内送達（例えば、あぶみ骨底）、ならびに／または外耳、中耳および／もしくは内耳への注射によって投与され得る。そのような方法は、例えば、ヒトの耳へのステロイドおよび抗生物質の投与のために当技術分野において日常的に使用される。注射は、例えば、耳の蝸牛窓を通じて、または蝸牛嚢（cochlea capsule）を通じてであり得る。投与の別の例示的様式では、組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで、カテーテルまたはポンプを介して投与されてもよい。カテーテルまたはポンプは、例えば、蝸牛の管腔へまたは耳の蝸牛窓に医薬組成物を方向付ける。１つまたは複数の化合物を耳に、例えば、ヒトの耳に投与するために好適な例示的な薬物送達装置および方法は、ＭｃＫｅｎｎａら、（米国特許出願公開第２００６／００３０８３７号明細書）およびＪａｃｏｂｓｅｎら、（米国特許第７，２０６，６３９号明細書）によって記載されている。一部の実施形態では、外科的手技の際にカテーテルまたはポンプは、例えば、対象の耳（例えば、外耳、中耳および／または内耳）に置かれてよい。一部の実施形態では、カテーテルまたはポンプは、例えば、外科的手技の必要のない対象の耳（例えば、外耳、中耳および／または内耳）に置かれてよい。

一部の場合では、本開示は、本明細書で開示される薬剤および方法を使用して産生される細胞を対象に投与することによって対象を処置することを含む。一般に、そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内耳の成熟細胞型（例えば、有毛細胞）へのまたはそれに向けた細胞の完全なまたは部分的な分化を促進するために使用され得る。次いで、そのような方法から生じる細胞は、そのような処置を必要とする対象に移植または埋め込まれ得る。好適な細胞型を同定するおよび選択するための方法、選択された細胞の完全なまたは部分的な分化を促進するための方法、完全にまたは部分的に分化した細胞型を同定するための方法、ならびに完全にまたは部分的に分化した細胞を埋め込むための方法を含む、これらの方法を実行するために必要な細胞培養方法は、本明細書に記載される。これらの方法における使用のために好適な標的細胞は、上に記載されている。

対象への細胞の投与は、単独または本明細書に開示される薬剤との組合せであるかどうかに関わらず、未分化の、部分的に分化した、および完全に分化した細胞の混合物を含んで、未分化の、部分的に分化した、および完全に分化した細胞の投与を含み得る。本明細書に開示されるとおり、完全分化に満たない細胞は、対象への投与後に完全に分化した細胞に向けて分化し続ける場合がある。

必要に応じて処置後に、対象は、聴力または内耳障害に関連する他の症状における改善について検査されてよい。聴力を測定するための方法は、周知であり、純音聴力検査、気導および骨伝導検査を含む。これらの検査は、対象が聞くことができる音圧（強度）および高さ（周波数）の限界を測定する。ヒトでの聴力検査は、聴性行動反応（７か月までの乳児用）、視覚強化配向性聴力検査（visual reinforcement orientation audiometry）（７か月から３歳までの小児用）；３歳を超える小児のための遊戯聴力検査；ならびにさらに年上の小児および成人のための標準的な聴力検査、例えば、ささやき声（whispered speech）、純音聴力検査；音叉検査；脳幹聴性誘発電位（ＢＡＥＲ）検査または聴覚性脳幹誘発電位（ＡＢＥＰ）検査を含む。耳音響発光検査は、蝸牛の有毛細胞の機能を検査するために使用でき、蝸電図検査は、蝸牛のおよび脳への神経経路の第１の部分の機能についての情報を提供する。一部の実施形態では、処置は、変更を含んで、もしくは含まずに継続され得る、または停止され得る。

記載される本発明がさらに完全に理解されるように、以下の実施例を記載する。本出願に記載される実施例は、本明細書で提供する方法および組成物を例示するために提供され、いかなる方法においてもその範囲を限定するとして解釈されない。

材料および方法
以下の材料および方法を本明細書に記載する実施例において使用した。

マウスモデル
Ｒｏｓａ－ｒｔＴＡ（ｒｔＴＡ）、Ｓｏｘ２ＣｒｅトランスジェニックマウスおよびＡｉ１４ ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ＃００６９６５；０１７５９３；００７９１４）から購入した；ｔｅｔ－ｏｎ－ＭｙｃマウスはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＤｒ．Ｍ．Ｂｉｓｈｏｐからであった；ｔｅｔ－ｏｎ－ＮＩＣＤマウスはＨａｒｖａｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎからであった。トランスジェニックｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ｏｎ－Ｍｙｃ／ｔｅｔ－ｏｎ－ＮＩＣＤマウスについて、バックグラウンドは混合Ｃ５７／１２９ＳｖＪ／ＣＤ１で、性別はおよそ同数であった；Ａｔｏｈ１－ｎＧＦＰマウスはＤｒ．Ｊａｎｅ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）からであった；野生型マウスはＪａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＣ５７ＢＬ／６であった。すべての実験は、倫理規制に従って実施し、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ ＥａｒおよびＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成体蝸牛の培養およびウイルス感染
蝸牛が骨から分離された新生仔蝸牛の培養方法とは異なり、成体マウスの蝸牛全体（４～６週齢）を骨が付着した状態で切断した。最初にブラ（bulla）を頭蓋から除き、ＨＢＳＳ中に置く前に７５％エタノール中に３分間浸漬した。前庭性領域も除いた。解剖顕微鏡下で、中耳、血管およびデブリをブラから除いた。頂回転（apical turn）を覆う骨を除き、蝸牛窓および卵円窓膜を蝸牛液との培地交換を可能にするように開けた。蝸牛の両端で靱帯部分およびライスナー膜も感覚上皮領域への培地の接近を促進するために除去した。蝸牛は、Ｎ２およびＢ２７（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１４～１８日間維持した。Ａｄ－Ａｔｏｈ１／ａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙアデノウイルスはＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入し、６×１０^１０ｐｆｕ／ｍｌの力価であった。

ＨＣ再生のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再プログラム
ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－Ｍｙｃ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤマウスモデルでは、蝸牛はＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、最終濃度２μｇ／ｍｌ）を用いて処置した；Ｓｏｘ２／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－Ｍｙｃ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤマウスモデルでは、蝸牛はＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、最終濃度２μｇ／ｍｌ）および４－ヒドロキシタモキシフェン（Ｔｍ、Ｓｉｇｍａ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて処置した；ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＭｙｃおよびｒｔＴＡ／ｔｅｔ－Ｍｙｃ／Ａｔｏｈ１－ＧＦＰマウスモデルでは、蝸牛はＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、最終濃度２μｇ／ｍｌ）およびＶＰＡ（２ｍＭ）を用いて処置した；Ｓｏｘ２／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－Ｍｙｃマウスモデルでは、蝸牛は４－ヒドロキシタモキシフェン（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ、２μｇ／ｍｌ）およびＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ、２ｍＭ）を用いて処置した；ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤマウスモデルでは、蝸牛はＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、最終濃度２μｇ／ｍｌ）、ＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ、８ｍＭ）、ＦＳＫ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０μＭ）、ｓｉＦＩＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０．０２μＭ）およびｓｉＭｘｉ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、０．０２μＭ）を用いて処置した；Ｓｏｘ２／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤマウスモデルでは、蝸牛は４－ヒドロキシタモキシフェン（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ、最終濃度２μｇ／ｍｌ）、ＬｉＣｌ（８ｍＭ）、フォルスコリン（ＦＳＫ）（２０μＭ）、ｓｉＦＩＲ（Ｐｕｆ６０、遺伝子ＩＤ：６７９５９）（０．０２μＭ）およびｓｉＭｘｉ１（遺伝子ＩＤ：１７８５９）（０．０２μＭ）を用いて処置した；Ａｔｏｈ１－ＧＦＰマウスモデルでは、蝸牛はＶＰＡ（２ｍＭ）、ＬｉＣｌ（８ｍＭ）、ＦＳＫ（２０μＭ）、ｓｉＦＩＲ（０．０２μＭ）およびｓｉＭｘｉ１（０．０２μＭ）を用いて４日間処置し、一晩のａｄ－Ａｔｏｈ１（６×１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ）感染が続いた。ｓｉＲＮＡを製造者の説明書に従って送達した（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ；８９１２９－９２０）。培養した成体マウス蝸牛では、それらをＨＤＡＣ阻害剤、ベリノスタット（１μＭ、Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（８２．５ｎＭ、Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）（２μＭ；Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ）およびＭｙｃ ｓｉＲＮＡ Ｆｂｘｗ７（０．０２μＭ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて処置した。対照は、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯを含む滅菌水）に加えてａｄ－Ａｔｏｈ１を用いて処置した同じ遺伝子型の培養された成体蝸牛であった。培養物は、新鮮培地中にさらに１０～１４日間置いた。蝸牛を採取し、免疫組織化学的検査の前に脱灰させた。

卵形嚢全体を４週齢マウスから切断し、浮遊させて培養した。耳石を２５Ｇ針およびシリンジから押し出したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の穏流を使用して除去した。卵形嚢を１０００μＬの培地中で、未処置２４ウエル平底プレートで培養した。すべての培養物は、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気で維持した。

培養培地は、Ｂ２７およびＮ２を補充したダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなった。硫酸ネオマイシン保存液（０．９％ＮａＣｌ中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから）を培養培地中、４ｍＭに希釈した。Ｓｉｇｍａからのバルプロ酸（ＶＰＡ）を２ｍＭで含め、Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚからのｓｉＲＮＡを０．０２μＭで含めた。

系譜追跡
４から６週齢Ｓｏｘ２－ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴマウス、Ｓｏｘ２－ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＭＹＣ ｑｕａｄマウス、Ｓｏｘ２－ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤ ｑｕａｄマウスおよびＳｏｘ２－ＣｒｅＥＲ／ｔｄＴ／ｒｔＴＡ／ｔｅｔ－ＭＹＣ／ｔｅｔ－ＮＩＣＤ ｑｕｉｎｔマウス由来の蝸牛組織を培養のために切断した。系譜追跡研究のためにＣｒｅを活性化するように４－ヒドロキシタモキシフェン（２０ｎｇ／ｍＬ）を０日目に培養物に加えた。Ａｄ－Ａｔｏｈ１－Ｖ５ウイルスを１６から２４時間、６ｘ１０^１０ｐｆｕ／ｍｌの濃度で培地に加えた。

ｉｎ ｖｉｖｏでの化学物質およびｓｉＲＮＡの経鼓室注射
使用したすべての成体マウスは、４から６週齢であった。カナマイシン（０．８ｍｇ／ｇ；Ｓｉｇｍａ）の皮下注射の３０分後に続くフロセミド（０．３ｍｇ／ｇ；Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ）の腹腔内注射の７日後に経鼓室注射を実施した。マウスをキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。経鼓室注射をＶＰＡ（５ｍｇ／ｍｌ）、ＬｉＣｌ（４０ｍＭ）、ＦＳＫ（５０μｇ／ｍｌ）、ｓｉＦＩＲ（０．６μｇ／１０μｌ）およびｓｉＭｘｉ１（０．６μｇ／１０μｌ）またはビヒクル（０．５％ＤＭＳＯを含むｄｄＨ_２Ｏ）の化学物質の組合せ５μｌを用いて実施した。化学物質またはビヒクルをマウスに鼓膜（ＴＭ）を通じて一方の耳に注射した。マイクロ鉗子を、皮膚を引くために使用し、ＴＭに隣接した内側上方のヒダ（fold）を見えるようにした。３３Ｇ針と共にハミルトンシリンジを経鼓室で薬物を注射するために使用した。

ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス注射
すべての外科的手技は、清潔な専用の場所で行った。装置は、７０％エタノールを用いて徹底的に清掃し、外科的手術の前に高圧滅菌した。マウスは、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。ウイルス注射のために、ブラを開くことによって蝸牛開窓術（cochleostomy）を麻酔したマウスに実施し、５×１０^１２ｐｆｕ／ｍｌの力価を有するアデノウイルスを中央階の中央回転（middle turn）に圧力制御モーター付き微量注入器によって３ｎｌ／秒の速度で注射した。合計１μｌのアデノウイルスを各蝸牛に注射した。

[実施例１]
有毛細胞再生のためのｓｉＲＮＡと化学化合物との新規組合せ
小分子とｓｉＲＮＡとの種々の組合せを、培養された成体マウス蝸牛における有毛細胞の再プログラムおよび再生についてスクリーニングした。スクリーニングに含まれた小分子およびｓｉＲＮＡは、Ｎｏｔｃｈ、Ｍｙｃ、ｍＴＯＲ、Ｗｎｔ、Ｔｇｆｂ、ＦＧＦ、レチノイン酸、ＢＭＰ４およびＡｌｋ５経路を含む種々の経路を標的にした。メチル基転移酵素阻害剤およびＨＤＡＣ阻害剤も培養された成体マウス蝸牛において有毛細胞を再プログラムおよび再生する能力についてスクリーニングした。検査した種々の組合せの内、バルプロ酸（ＶＰＡ）と２つのｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＩＲ（ｓｉＦ）およびｓｉＭｘｉ１（ｓｉＭ））との組合せは、蝸牛の再プログラムを増強した。図１Ａ～１Ｃに示すとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成体野生型マウス蝸牛において、ＶＰＡおよびｓｉＦ／Ｍの組合せを用いた再プログラムに続くａｄ－Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙの添加後に、新規ＭＹＯ７Ａ＋／Ａｔｏｈ１－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＨＣを検出した。他の組合せは、有毛細胞再生を達成できなかった（図２Ａ～２Ｃ）。

次に、本発明者らは、新規「ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテル」を用いた処置が卵形嚢においてＨＣを再生できるかどうかを試験した。ネオマイシンを用いた５日間の処置後、切断した卵形嚢は、未処置切断卵形嚢と比較して卵形嚢ＨＣの総数が減少していた（図３Ａ～３Ｂ）。ネオマイシンを用いた処置後、培養した成体卵形嚢をＶＰＡ／ｓｉＦ／ｓｉＭカクテルを用いて１４日間処置した。処置した卵形嚢は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処置群と比較して有毛細胞（ＭＹＯ７Ａ＋／Ａｔｏｈ１－ＧＦＰ＋）の数の増加を示した（図３Ｃ～３Ｄ）。卵形嚢では、有毛細胞はＡｔｏｈ１を含まない「ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテル」単独によっても再生され得ることに注目されたい。

合わせて本発明者らは、Ａｔｏｈ１を含むまたは含まないＨＣ再生のために、新規「ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテル」の処置が成体マウス蝸牛および卵形嚢を再プログラムするために十分であることを実証した。

[実施例２]
野生型マウスにおける有毛細胞の再生
ＷｎｔおよびｃＡＭＰ経路が、成体蝸牛を再プログラムするために十分であるかどうかを調査するために、本発明者らは、先の化学物質ＶＰＡ、ｓｉＦＩＲおよびｓｉＭｘｉ１（ＶｓｉＦｓｉＭ）をＷｎｔアゴニスト（ＬｉＣｌ、Ｌ）およびｃＡＭＰアゴニストフォルスコリン（ＦＳＫ、Ｆ）と組み合わせて５種の化学物質（ＶＬＦｓｉＦｓｉＭ）を含む「カクテル」を作製した。カクテルを用いた処置は、成体野生型マウス蝸牛がＳｉｘ１、Ｅｙａ１およびＧａｔａ３を含む内耳前駆細胞遺伝子を再発現するようにさせたが、ＮａｎｏｇおよびＦｕｔ４などの胚性幹細胞遺伝子は再発現させなかった（図４Ａ～４Ｂ）。

ＨＣ再生潜在力の源をさらに追跡するために、本発明者らは、Ａｔｏｈ１エンハンサーがＡｔｏｈ１系列での核ＧＦＰレポーターの発現を駆動する成体Ａｔｏｈ１－ＧＦＰマウス蝸牛を再プログラムするためにＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテルを加えた（図５Ａ）。ａｄ．Ａｔｏｈ１誘導に続いて、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成体蝸牛中において再生された多数のＡｔｏｈ１－ＧＦＰ＋／ＭＹＯ７Ａ＋ＨＣを見出した（図５Ｂ～５Ｇ）。対照的に、カクテル処置を行わない対照蝸牛では、実質的にＡｔｏｈ１－ＧＦＰ＋／ＭＹＯ７Ａ＋ＨＣは再生されなかった（図５Ｂ～５Ｇ）。本発明者らは、新たなＨＣが機能性形質導入チャネルを保有するかどうかを研究するためにＦＭ１－４３取り込み実験を実施した。この蛍光色素は、機能性形質導入チャネルを通過し、それらの電荷によってＨＣに捕捉される。注目すべきことに、ＦＭ１－４３＋／Ａｔｏｈ１－ＧＦＰ＋／ＭＹＯ７Ａ＋三重陽性ＨＣがカクテル処置群において生成され、ＨＣによる色素の取り込みを示している（図５Ｈ）。興味深いことに、本発明者らは、カクテル処置群でのＡｔｏｈ１－ＧＦＰ＋／ＭＹＯ７Ａ＋球状構造を見出し（図５Ｉ）、前駆細胞／幹細胞シグナルがカクテルを用いた再プログラムによって活性化された可能性を示している。本発明者らは、タモキシフェン（ＴＡＭ）処置がｔｄＴを有する支持細胞を持続的に標識しているＳｏｘ２ＣｒｅＥＲ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）マウスを使用して系譜（linage）追跡研究を実施した。カクテル処置およびａｄ－Ａｔｏｈ１感染後、新たに再生した有毛細胞（ＭＹＯ７Ａ＋）はｔｄＴ陽性であると見出され、それらがＳＯＸ２＋支持細胞の分化転換由来であったことを実証している（図５Ｊ～５Ｌ）。

次に、本発明者らは、ＶＰＡ以外のＨＤＡＣ阻害剤を有毛細胞再生のために成体野生型蝸牛を再プログラムするように使用できるかどうかを試験した。上に記載した実験を、ＶＰＡの代わりにＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡ（８２．５ｎＭ）、ＳＡＨＡ（２μＭ）またはベリノスタット（１μＭ）をカクテル中に使用して実施した。興味深いことに、それぞれのＨＤＡＣ阻害剤は、Ａｄ－Ａｔｏｈ１感染後に成体野生型蝸牛において有毛細胞の再プログラムおよび効率的な再生を誘導するために十分であった（図６）。

ＭｙｃモジュレーターＦｂｘｗ７を標的にするｓｉＲＮＡを、有毛細胞再生を促進するために使用できるかどうかを調査するために、Ｆｂｘｗ７を標的にするｓｉＲＮＡ（ｓｉＦｂｘｗ７）を単独で、またはＶＰＡとの組合せで用いて成体野生型マウス蝸牛を処置した。実験は、ｓｉＦｂｘｗ７をｓｉＦおよびｓｉＭとの組合せで使用しても実施した（図７Ａ）。培養された成体ＷＴ蝸牛では、ＶＰＡ処置およびＡｄ－Ａｔｏｈ１感染は、ＨＣをもたらさなかった（ＭＹＯ７Ａ）（図７Ｂ）。Ｆｂｘｗ７ ｓｉＲＮＡ処置単独およびＡｄ－Ａｔｏｈ１感染は、有毛細胞を再生しなかった（ＭＹＯ７Ａ＋）（図７Ｂ）。対照的に、ＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡおよびｓｉＦｂｘｗ７を単独またはｓｉＦおよびｓｉＭとの組合せで用いた処置に続くＡｄ－Ａｔｏｈ１感染は、培養された成体ＷＴ蝸牛においてＨＣ（ＭＹＯ７Ａ＋）再生を誘導した（図７Ｂ）。定量は、さまざまな検査条件下での再生の結果として有毛細胞の増加を示した（図７Ｃ）。

合わせて、本発明者らは、新規「ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテル」を用いた処置が、Ａｔｏｈ１を用いたＨＣ再生のために成体マウス蝸牛を再プログラムするために十分であることを実証した。本発明者らは、種々のＨＤＡＣ阻害剤（ＶＰＡ、ＴＳＡ、ＳＡＨＡまたはベリノスタット）が、ＨＣを再生するためにＭｙｃモジュレーターＦｉｒ、Ｍｉｘ１またはＦｂｘｗ７を標的にするｓｉＲＮＡとの組合せで使用できることも実証した。

[実施例３]
重度のＨＣ減少マウスモデルでのＨＣのロバストな再生
将来の臨床応用のために本発明者らのＨＣ再生プロトコールをさらに調査するために、本発明者らは、重度のＨＣ減少マウスモデルにおいて本発明者らのプロトコールを試験した。本発明者らは、カナマイシンおよびフロセミドの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の７日後にＯＨＣの９５％以上が消失したことを観察した。際だったことに、ほとんどすべてのＯＨＣが頂部－中央部および中央部回転では一掃されている一方で、ほとんどすべてのＳＯＸ２＋ＳＣは保存されており、これをｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣ－ＨＣ分化転換を検出するために好適なモデルにしている（図８Ａ～８Ｃ）。ＯＨＣの重度の減少後、本発明者らは、ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテルを注射することによって損傷した蝸牛を処置し、次に、蝸牛の中央回転での蝸牛開窓術を介するＡｄ．Ａｔｏｈ１ｍＣｈｅｒｒｙ感染によってＨＣを再生した。１４～２１日間後、複数のＡｔｏｈ１ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を蝸牛の頂部から中央部回転の全体のＳＥ領域で検出し、その大部分はＯＨＣ領域中であった。ＯＨＣ領域では、ビヒクル処置未再プログラム蝸牛と比較して、カクテル再プログラム蝸牛全体では有意に多いＥＳＰＮ＋細胞が観察された（図９Ａ～９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｂ）。注目すべきことに、多数の新たに再生されたＨＣはＳＯＸ２＋／ＥＳＰＮ＋ＨＣであり、それらの新たに再生された状態を反映している（図１１Ａ～１１Ｂ）。それと一致して、非分化転換ＥＳＰＮ－／ＳＯＸ２＋ＳＣの総数が再プログラム蝸牛において有意に低下していたことから、ＳＣからＨＣへの分化転換が示される（図１１Ｃ）。ＯＨＣ領域でのＨＣのロバストな再生は、ビデオによって観察した（データ未記載）。

合わせて、本発明者らは、Ａｔｏｈ１との組合せで新規「ＶＬＦｓｉＦｓｉＭカクテル」を用いた処置が、ｉｎ ｖｉｖｏで重度のＨＣ減少マウスモデルにおいて成体マウス蝸牛を再プログラムし、ＨＣを再生するために十分であることを実証した。

他の実施形態
本発明は、その詳細な記載と共に記載されているが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって明示される本発明の範囲を例示することを意図し、限定を意図しないことは理解される。他の態様、有利点および改変は以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (22)

1. 有毛細胞再生のために成体哺乳動物の内耳を再プログラムするための方法であって：
   成体哺乳動物の内耳を、有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸に、前記成体哺乳動物の内耳において前駆細胞の集団を産生するための条件下で、その産生に十分な時間、接触させること
   を含む、方法。
2. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、脂肪酸化合物、ピロキサミド、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、ロミデプシン、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＩ－９９４（Ｎ－アセチルジナリン、タセジナリンとも）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５；以前はＭＳ－２７５）、ＥＶＰ－０３３４、ＳＲＴ５０１、ＣＵＤＣ－１０１、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＰＣＩ２４７８１、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）またはベリノスタット（ＰＸＤ１０１）である、請求項２に記載の方法。
4. 前記１つまたは複数の阻害性核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記１つまたは複数の阻害性核酸が、ＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする阻害性核酸を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記哺乳動物の蝸牛をＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストに接触させることをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記Ｗｎｔ活性化因子が塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である、および／または前記ｃＡＭＰ活性化因子がフォルスコリンである、請求項６に記載の方法。
8. 前記集団の前記前駆細胞が、Ｓｉｘ１、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｈｅｓ５またはこれらの組合せを発現する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記接触が、対象の前記内耳において生じる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 対象において難聴または前庭機能障害を処置するための方法であって：
    それを必要とする対象の内耳に有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、およびＦｉｒ、Ｍｘｉ１、Ｆｂｘｗ７またはこれらの組合せを標的にする１つまたは複数の阻害性核酸を投与すること；ならびに
    前記対象の前記内耳に有効量のＡｔｏｈ１活性化因子を投与すること
    を含む、方法。
11. 前記ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、脂肪酸化合物、ピロキサミド、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸、ロミデプシン、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＩ－９９４（Ｎ－アセチルジナリン、タセジナリンとも）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５；以前はＭＳ－２７５）、ＥＶＰ－０３３４、ＳＲＴ５０１、ＣＵＤＣ－１０１、ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＰＣＩ２４７８１、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）またはベリノスタット（ＰＸＤ１０１）である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記１つまたは複数の阻害性核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記１つまたは複数の阻害性核酸がＦｉｒおよびＭｘｉ１を標的にする、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記Ａｔｏｈ１活性化因子が、Ａｔｏｈ１をコードする核酸である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. Ａｔｏｈ１をコードする前記核酸が、ベクター中に含まれる、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記対象にＷｎｔアゴニストおよび／またはｃＡＭＰアゴニストを投与することをさらに含む、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記Ｗｎｔ活性化因子が塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である、および／または前記ｃＡＭＰ活性化因子がフォルスコリンである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記対象が、騒音性永久聴覚消失、薬物誘発性難聴、加齢性難聴、突発性感音性難聴、ウイルス感染による難聴、耳鳴症、前庭機能障害、またはこれらの組合せを有するヒト患者である、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記対象がヒトである、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の方法。