JP2024504319A - カンナビノイドの調製のためのアシル活性化酵素 - Google Patents

カンナビノイドの調製のためのアシル活性化酵素 Download PDF

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Abstract

カンナビノイドファミリーの臨床的に重要なプレニル化ポリケチドの生合成のための酵素及び組換え宿主細胞が提供される。容易に入手可能な出発物質を使用して、異種酵素（例えば、細菌のＣｏＡ－トランスフェラーゼ及びＣｏＡ－リガーゼ）を使用して、組換え酵母細胞などの宿主細胞におけるカンナビノイド生合成に導く。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２０日に出願された、米国仮特許出願第６３／１３９，６８９号の優先権を主張し、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ品種は、多くの用途のために世界中で広く栽培され、利用されてきた。茎、枝、及び葉は、繊維及び繊維ベースの製品、食品としての芽及び種子、安価な油のための種子、芳香、レクリエーション、儀式、及び薬用目的の花、ならびに栄養及び追加的に薬及び医薬品用途の花及び根に使用される。実際、ヒトにおける多くの対照臨床試験及び事例報告的または非盲検試験は、多くのヒトの医学的状態における植物抽出物、及び精製されたＣ．ｓａｔｉｖａ植物化合物の両方で、有益な効果を実証することが文書化されている。ヒト研究から説明されるカンナビノイドファミリーの化合物の有益な活性は、神経学的なものから気分／行動障害、ならびに胃腸障害、ならびに睡眠、食欲及び疲労の問題に及ぶ。他の用途または潜在的な用途としては、様々な微生物感染症及びウイルス感染症の治療、ならびに多くのがんの治療が挙げられる。したがって、この急増するヒト治療適応症のリストの直接的な結果として、現在、持続可能な最新の生物製剤調製方法を使用した、医薬品グレードのカンナビノイドを生産するための満たされていない必要性が存在する。
現在、カンナビノイドは、主に世界中の農業活動における大面積のアサまたはヘンプ植物の栽培によって単離されており、合成化学プロセスを含む低レベルであるが臨床的に重要なレベルの生産方法がある。前者の技術は高価であり、耕作可能及び土地や水などの大量の天然資源を利用し、常に、所望の活性原薬を汚染する追加の活性カンナビノイドを含有する最終医薬品につながる。これは、所望の純粋な化合物の活性の不一致をもたらし、臨床試験の状況及び市販されている製品の両方で偽の活性を引き起こす可能性がある。さらに、有毒金属及び殺虫剤による天然植物由来のカンナビノイド製剤の汚染は、現在解決が必要な問題である。また、多くのカンナビノイドの複雑な立体化学のため、化学合成は困難で高価で低収率のプロセスである。さらに、多くのカンナビノイドの合成化学生産は、Ｃ．ｓａｔｉｖａ植物から抽出された分子よりも薬理学的に活性の低い分子を産生することが報告されている。
カンナビノイド生成物を産生するように操作された改変組換え宿主細胞が、本明細書において提供される。細胞は、脂肪族カルボン酸をアシルＣｏＡチオエステルに変換する、ＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む。宿主細胞はまた、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、及び／またはカンナビノイドシンターゼをコードする、さらなる外因性ポリヌクレオチドを含有してもよい。
カンナビノイド生成物の製造方法も、本明細書に提供される。方法は、
外因性ポリヌクレオチドによってコードされたＣｏＡ－トランスフェラーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが産生される条件下で、脂肪族カルボン酸をアシルＣｏＡチオエステルに変換するＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、を含む改変組換え宿主細胞を培養することと、
アシルＣｏＡチオエステルを、カンナビノイド生成物に変換することと、を含む。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、
アシルＣｏＡチオエステル及びマロニルＣｏＡからポリケチドを産生するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、
２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、及び／または
プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチド、を含み、
改変組換え宿主細胞を培養することは、第２、第３、及び／または第４の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる生成物を発現すること、
アシルＣｏＡチオエステルを２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールに変換すること、及び／または
２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールに変換すること、を含む。
ＣＢＧＡ及びＣＢＧＶＡの調製のための生合成スキームを示す。
本発明は、外因性ＣｏＡ－トランスフェラーゼ（例えば、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓなどの細菌由来）及びＣｏＡ－リガーゼを、様々な天然に存在するカンナビノイド及び非天然カンナビノイド類似体を産生するために、組換え酵母細胞または他の宿主細胞に用いることができるという発見に部分的に基づいている。
Ｉ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術分野の全ての用語、表記法、及び他の科学用語は、本出願が関連する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかのケースでは、一般的に理解される意味を有する用語が、明確にするために及び／または容易に参照するために本明細書に定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、必ずしも、当技術分野で一般的に理解されるものとの実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「カンナビノイド」、「カンナビノイド化合物」、及び「カンナビノイド生成物」という用語は、ポリケチド部分、例えば、オリべトール酸（ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）または別の２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、及びテルペン由来部分、例えば、ゲラニル基を含有する分子を指すために同義に使用される。ゲラニル基は、ゲラニルピロリン酸として知られるゲラニオールの二リン酸に由来し、これは、オリベトール酸型化合物と反応して、酸性カンナビノイドカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）及びＣＢＧＡ類似体を形成することができる。ＣＢＧＡは、酵素的に（例えば、インビボまたはインビトロでの酵素処理による脱カルボキシル化によって）及び化学的に（例えば、加熱によって）の両方で、さらなる生体活性カンナビノイドに変換することができる。
カンナビノイドという用語には、酸性カンナビノイド及び中性カンナビノイドが含まれる。「酸性カンナビノイド」という用語は、カルボン酸部分を有するカンナビノイドを指す。カルボン酸部分は、プロトン化形態（すなわち、－ＣＯＯＨとして）または脱プロトン化形態（すなわち、カルボキシレート－ＣＯＯ－として）で存在し得る。酸性カンナビノイドの例としては、カンナビゲロール酸、カンナビジオール酸、カンナビクロメン酸、及びΔ９－テトラヒドロカンナビノール酸が挙げられるが、これらに限定されない。「中性カンナビノイド」という用語は、カルボン酸部分を含有しない（すなわち、－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＯ－部分を含有しない）カンナビノイドを指す。中性カンナビノイドの例としては、カンナビゲロール、カンナビジオール、カンナビクロメン、及びΔ９－テトラヒドロカンナビノールが挙げられるが、これらに限定されない。
「２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸」という用語は、構造：
（式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ２０アルキル基であり、これは、いくつかの実施形態では、ハロゲン化、ヒドロキシル化、重水素化、及び／またはトリチウム化することができる）を有する化合物を指す。２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の例としては、限定するものではないが、オリベトール酸（すなわち、２－ペンチル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、ＣＡＳ登録番号４９１－７２－５）及びジバリニン酸（すなわち、２－プロピル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、ＣＡＳ登録番号４７０７－５０－０）が挙げられる。オリベトール酸類似体としては、他の２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、及び５－ハロメチルレゾルシノール、５－ハロエチルレゾルシノール、５－ハロプロピルレゾルシノール、５－ハロヘキシルレゾルシノール、５－ハロヘプチルレゾルシノール、５－ハロオクチルレゾルシノール、及び５－ハロノニルレゾルシノールを含むがこれらに限定されない、置換レゾルシノールが挙げられる。
「プレニル部分」という用語は、少なくとも１つのメチルブテニル基（例えば、２－メチルブタ－２－エン－１－イル基）を含有する置換基を指す。多くの場合、プレニル部分は、イソペンテニルピロリン酸及び／またはイソペンテニル二リン酸から生化学的に合成され、テルペン天然産物及び他の化合物が生じる。プレニル部分の例としては、プレニル、ゲラニル、ミルセニル、オシメニル、ファルネシル、及びゲラニルゲラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ゲラニオール」という用語は、（２Ｅ）－３，７－ジメチル－２，６－オクタジエン－１－オール（ＣＡＳ登録番号１０６－２４－１）を指す。「ゲラニル化」という用語は、２－アルキル－４，６－ヒドロキシ安息香酸などの分子に対する３，７－ジメチル－２，６－オクタジエン－１－イルラジカルの共有結合を指す。ゲラニル化は、本明細書に記載されるように、化学的にまたは酵素的に行うことができる。
「２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸」という用語は、構造：
（式中、ＲはＣ１～Ｃ２０アルキル基である）を有する化合物を含む。２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の例としては、限定するものではないが、オリベトール酸（すなわち、２－ペンチル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、ＣＡＳ登録番号４９１－７２－５）及びジバリニン酸（すなわち、２－プロピル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、ＣＡＳ登録番号４７０７－５０－０）が挙げられる。オリベトール酸類似体としては、他の２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、及び５－メチルレソルシノール、５－エチルレソルシノール、５－プロピルレソルシノール、５－ヘキシルレソルシノール、５－ヘプチルレソルシノール、５－オクチルレソルシノール、及び５－ノニルレソルシノール等の置換レゾルシノールが挙げられる。
「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、直鎖または分岐の飽和脂肪族ラジカルを指す。アルキルは、Ｃ１～２、Ｃ１～３、Ｃ１～４、Ｃ１～５、Ｃ１～６、Ｃ１～７、Ｃ１～８、Ｃ１～９、Ｃ１～１０、Ｃ２～３、Ｃ２～４、Ｃ２～５、Ｃ２～６、Ｃ３～４、Ｃ３～５、Ｃ３～６、Ｃ４～５、Ｃ４～６、及びＣ５～６などの任意の数の炭素を含むことができる。例えば、Ｃ１～６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルはまた、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどの、最大２０個の炭素原子を有するアルキル基を指すことができるが、これらに限定されない。
「アルケニル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する、本明細書に定義されるアルキル基を指す。アルケニル基の例としては、ビニル（すなわち、エテニル）、クロチル（すなわち、ブタ－２－エン－１－イル）、ペンタ－１，３－ジエン－１－イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル部分は、例えば、アリール置換基（４－ヒドロキシスチリルの場合、フェニルまたはヒドロキシフェニルなど）でさらに置換され得る。
「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を指す。
「ハロアルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、水素原子の一部または全てがハロゲン原子で置換されているアルキル基を指す。アルキル基については、ハロアルキル基は、Ｃ１～６などの任意の好適な数の炭素原子を有することができる。例えば、ハロアルキルとしては、トリフルオロメチル、フルオロメチルなどが挙げられる。場合によっては、「パーフルオロ」という用語は、全ての水素がフッ素に置き換えられている化合物またはラジカルを定義するために使用することができる。例えば、パーフルオロメチルは、１，１，１－トリフルオロメチルを指す。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、水素原子の一部または全てがヒドロキシル基（すなわち、－ＯＨ基）で置換されているアルキル基を指す。アルキル及びハロアルキル基に関して、ヒドロキシアルキル基は、Ｃ１～６などの任意の好適な数の炭素原子を有することができる。
「重水素化」という用語は、１つ以上の水素原子の代わりに１つ以上の重水素原子（すなわち、２Ｈ原子）を有する置換基（例えば、アルキル基）を指す。
「トリチウム化された」という用語は、１つ以上の水素原子の代わりに１つ以上のトリチウム原子（すなわち、３Ｈ原子）を有する置換基（例えば、アルキル基）を指す。
「有機溶媒」は、周囲温度及び圧力で液体であり、実質的に水を含まない炭素含有物質を指す。有機溶媒の例としては、トルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及び石油エーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
「酸」という用語は、酸の共役塩基を形成するためにプロトン（すなわち、水素カチオン）を供与することができる物質を指す。酸の例としては、限定するものではないが、鉱酸（例えば、塩酸、硫酸など）、カルボン酸（例えば、酢酸、ギ酸など）、及びスルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸など）が挙げられる。
本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数の群を除外することを意味しないと理解される。
２つ以上のポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、同一、または比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大の一致のために比較及びアライメントされた場合、指定された領域にわたって同一であるアミノ酸残基の指定されたパーセンテージ（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の同一性を有する、２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、とりわけ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用するものを含む、様々な方法で実施され得る。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される、ＢＬＡＳＴ ２．０である。したがって、ＢＬＡＳＴ２．０は、パーセント配列同一性を決定するために記載されるデフォルトパラメータとともに使用され得る。
本明細書で使用される場合、「保存的」置換は、側基鎖の電荷、疎水性、及び／またはサイズが維持されるようなアミノ酸の置換を指す。互いに置換され得るアミノ酸の例示的なセットとしては、（ｉ）正荷電アミノ酸である、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ、（ｉｉ）負荷電アミノ酸である、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸である、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ、（ｉｖ）窒素環アミノ酸である、Ｈｉｓ及びＴｒｐ、（ｖ）脂肪族アミノ酸である、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ；（ｖｉ）わずかに極性のアミノ酸である、Ｍｅｔ及びＣｙｓ；（ｖｉｉ）小側鎖アミノ酸である、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏ、（ｖｉｉｉ）小ヒドロキシルアミノ酸である、Ｓｅｒ及びＴｈｒ、ならびに硫黄含有アミノ酸である、Ｃｙｓ及びＭｅｔが挙げられる。この段落でのアミノ酸の電荷への言及は、ｐＨ７．０での電荷を指す。
特定の場合において、略語が使用される。例えば、「ＣＢＧＡ」という用語は、カンナビゲロール酸を指す。同様に、「ＯＡ」は、オリベトール酸を指し、「ＣＢＧ」は、カンナビゲロールを指し、「ＣＢＤＡ」はカンナビジオール酸を指し、「ＣＢＤ」はカンナビジオールを指し、「ＴＨＣ」は、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（Δ９－ＴＨＣ）を指し、「Δ８－ＴＨＣ」は、Δ８－テトラヒドロカンナビノールを指し、「ＴＨＣＡ」は、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸（Δ９－ＴＨＣＡ）を指し、「Δ８－ＴＨＣＡ」は、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸を指し、「ＣＢＣＡ」は、カンナビクロメン酸を指し、「ＣＢＣ」は、カンナビクロメンを指し、「ＣＢＮ」はカンナビノールを指し、「ＣＢＮＤ」は、カンナビノジオールを指し、「ＣＢＮＡ」は、カンナビノール酸を指し、「ＣＢＶ」はカンナビバリンを指し、「ＣＢＶＡ」は、カンナビバリン酸を指し、「ＴＨＣＶ」は、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン（Δ９－ＴＨＣＶ）を指し、「Δ８－ＴＨＣＶ」は、「Δ８－テトラヒドロカンナビバリンを指し、「ＴＨＣＶＡ」は、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン酸（Δ９－ＴＨＣＶ）を指し、「Δ８－ＴＨＣＶＡ」は、Δ８－テトラヒドロカンナビバリン酸を指し、「ＣＢＧＶ」は、カンナビゲロバリンを指し、「ＣＢＧＶＡ」は、カンナビゲロバリン酸を指し、「ＣＢＣＶ」は、カンナビクロメバリンを指し、「ＣＢＣＶＡ」は、カンナビクロメバリン酸を指し、「ＣＢＤＶ」は、カンナビジバリンを指し、「ＣＢＤＶＡ」は、カンナビジバリニン酸を指し、「ＭＰＦ」は、複数の前駆体供給を指し、「ＰＫＳ」は、ポリケチドシンターゼを指し、「ＧＯＴ」は、ゲラニルピロリン酸オリベトール酸（ｏｌｉｖｅｔｏｌａｔｅ）ゲラニルトランスフェラーゼを指し、「ＹＡＣ」は、酵母人工染色体を指し、「ＩＲＥＳ」または「内部リボソームエントリー部位」とは、キャップ構造とは独立に、リボソーム結合及びｍＲＮＡ翻訳を直接促進する特殊な配列を意味し、「ＨＰＬＣ」とは、高速液体クロマトグラフィーを指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ（ａｒｏｕｎｄ）」という用語は、その特定の値を修正するために使用される場合、数値の周りの近接範囲を示す。「Ｘ」が値である場合、例えば、「約Ｘ」または「およそＸ」は、０．９Ｘ～１．１Ｘの値、例えば、０．９５Ｘ～１．０５Ｘの値、または０．９８Ｘ～１．０２Ｘの値、または０．９９Ｘ～１．０１Ｘの値を示すであろう。「約Ｘ」または「およそＸ」への任意の言及は、具体的には、少なくとも値Ｘ、０．９Ｘ、０．９１Ｘ、０．９２Ｘ、０．９３Ｘ、０．９４Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、１．０５Ｘ、１．０６Ｘ、１．０７Ｘ、１．０８Ｘ、１．０９Ｘ、及び１．１Ｘ、ならびにこの範囲内の値を示す。
本明細書で使用される特定の方法論は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｒｏｕｇｈ Ｊｕｌｙ １７，２０１８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記述される。適宜、化学的に利用可能なキット及び試薬の使用を含む手順は、他に断りのない限り、一般に、製造者が定義したプロトコル及び／またはパラメータにしたがって実施される。本方法、発現系、及びそれによる使用を記載する前に、本発明が、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、生物種または属、構築物、及び試薬に限定されず、当然変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することが意図されないことも理解されたい。
ＩＩ．カンナビノイド発現系
目的のカンナビノイド化合物及びカンナビノイド化合物中間体は、ＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼを用いる、本明細書に記載の発現系を使用して産生される。かかる化合物としては、ＣＢＧ、ＣＢＤＡ、ＣＢＤ、ＴＨＣ、Δ８－ＴＨＣ、ＴＨＣＡ、Δ８－ＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＡ、ＣＢＮ、ＣＢＤＮ、ＣＢＮＡ、ＣＢＶ、ＣＢＶＡ、ＴＨＣＶ、ＴＨＣＶＡ、Δ８－ＴＨＣＡ、ＣＢＧＶ、ＣＢＧＶＡ、ＣＢＣＶ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶ及びＣＢＤＶＡ、ならびにカンナビクロマノン、カンナビクマロノン、カンナビシクラン、１０－オキソ－Δ６ａ（１０ａ）テトラヒドロヒドロカンナビノール（ＯＴＨＣ）、カンナビグレンドール、及びΔ７－イソテトラヒドロカンナビノール、を含む化合物、ならびにそのような化合物の類似体、例えば、ハロゲン化化合物または重水素化化合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、目的のカンナビノイド化合物を産生する代謝経路の各工程は、本明細書に記載の改変組換え細胞で生じる。他の実施形態では、代謝経路の少なくとも１つの工程は、本明細書に記載される改変組換え細胞において生じ、代謝経路の少なくとも１つのステップは、細胞外、例えば、酵母培地において、または共培養された改変組換え細胞内において生じる。代謝経路の各工程で産生される化合物は、「中間体」または「中間化合物」または「化合物中間体」と呼ばれてもよい。
いくつかの実施形態では、外因性ＣｏＡ－トランスフェラーゼまたは外因性ＣｏＡ－リガーゼを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣｏＡトランスフェラーゼは、酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼまたはプロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、外因性ポリケチドシンターゼ、外因性２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ、外因性プレニルトランスフェラーゼ、及び／または外因性カンナビノイドシンターゼを発現するようにさらに改変される。
Ａ．ＣｏＡ－トランスフェラーゼ
本法で使用するためのＣｏＡ－トランスフェラーゼを発現する生物の例は、酵素委員会番号（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）ＥＣ２．８．３．８（酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）及びＥＣ２．８．３．１（プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）の下の包括的酵素情報システム（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＲＥＮＤＡ）に見出すことができる。これらの生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ種及び株（例えば、Ａ．ｃａｃｃａｅ、Ａ．ｃａｃｃａｅ ＤＳＭ １４６６２）、Ａｎａｅｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ種及び株（例えば、Ａ．ｈａｌｌｉｉ、Ａ．ｈａｌｌｉｉ Ｍ７２／１）、Ａｎａｅｒｏｔｉｇｎｕｍ種及び株（例えば、Ａ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種及び株（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ種及び株（例えば、Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ １６／４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種及び株（例えば、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ種及び株（例えば、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｌ２－５０）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ種（例えば、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種及び株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種及び株（例えば、Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅ ＤＳＭ １７６２９）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種及び株（例えば、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｌ２－６、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｍ２１／２）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ種及び株（例えば、Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種及び株（例えば、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、ならびにＲｏｓｅｂｕｒｉａ種及び株（例えば、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ Ｌ１－８２、Ｒ．ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒ．ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ Ａ２－１９４ならびにＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｓｐ．Ａ２－１８１）。特定のＣｏＡ－トランスフェラーゼの非限定的な例を表１に列挙する。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、例えば、配列番号１に示されるような、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、例えば、配列番号２及び配列番号３に示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、例えば、配列番号４に示されるような、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号１または４に示される配列と、少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号２及び３に示される配列に対して、少なくとも６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号１または４に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号２及び３に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号１または４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、配列番号２及び３のアミノ酸配列を含む。
Ｂ．ＣｏＡ－リガーゼ
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＡＡ２中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、及びＥ．ｃｏｌｉ ＦＡＤＫアシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、例えば、配列番号５に示されるような、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、例えば、配列番号６に示されるような、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、例えば、配列番号７に示されるような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＡＡ２中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、例えば、配列番号８に示されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＡＤＫアシル－ＣｏＡ－リガーゼポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、配列番号５、６，７，または８に示される配列に対して、少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、配列番号５、６、７、または８に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、配列番号５、６、７、または８のアミノ酸配列を含む。
Ｃ．ポリケチドシンターゼ
いくつかの実施形態では、ＰＫＳは、Ｉ型ＰＫＳ、ＩＩ型ＰＫＳ、またはＩＩＩ型ＰＫＳである。ＰＫＳの例としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／２０９１４３号及びＷＯ２０２０／１０２４３０に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉ型ＰＫＳ
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリケチドシンターゼ活性を有する、Ｉ型ＰＫＳまたはＩ型ＰＫＳの非天然変異体をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＫＳは、ＰＫＳを部分的に還元する反復型である。部分的に還元するＰＫＳは、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを有し得るが、さらなる還元プロセスのためのデヒドラーゼまたはエノイルレダクターゼドメインを欠いている点で非還元及び高還元するＰＫＳとは区別される、高度に保存されたドメインアーキテクチャを共有する。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＫＳポリペプチドは、ヘキサノイル－ＣｏＡを開始ユニットとして用いるように選択される。
優先的に利用され得るＩ型ＰＫＳとしては、ミカコシジン生合成経路をコードするＰＫＳなどの開始ユニットのヘキサノイル－ＣｏＡによって自然に開始されるＰＫＳ、またはオルセリン酸シンターゼ（ＯＳＡＳ）などの反復型Ｉ型ＰＫＳ、または長鎖脂肪酸開始ユニットを受け入れてオリベトール酸及びジバリニン酸ならびにそれらの類似体を産生するように変異された６－メチルサリチル酸シンターゼ（６－ＭＳＡＳ）が挙げられる。
例示的な実施形態では、外因性Ｉ型ＰＫＳは、抗生物質のミカコシジンを産生し、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍから得られる、反復型部分還元ＰＫＳである（Ｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：７６４－７７１，２０１３、Ｋａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：１１４１４－１１４１７，２０１５）。
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍのＭｉｃＣ ＰＫＳは、ローディングモジュールに続いて３つのエクステンダーモジュールを含む。本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＩ型ＰＫＳは、アデニル化（Ａ１）ドメイン、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン、ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、ＫＲドメイン、及びモジュールのＣ末端にあるＡＣＰドメインを含む、ＭｉｃＣの充填モジュール及びエクステンダーモジュール１を含む。いくつかの実施形態では、ＰＫＳは、例えば、配列番号９に示されるようなＭｉｃＣポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲドメインは、ＫＲドメインの活性部位での変異、例えば、Ｌｙｓ及びＳｅｒ残基とともに触媒トライアドの一部である、１９９１位でのＴｙｒの変異によって不活性化される（例えば、Ｃａｆｆｒｅｙ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ４：６５４－６５７，２００３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、フェニルアラニンを導入して、１９９１位のＴｙｒを置換する。他の実施形態では、脂肪族アミノ酸残基、例えば、アラニンは、Ｔｙｒの１９９１位で置換される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号９に示される配列と、少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するアミノ酸を含むＩ型ＰＫＳをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９に示される配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＩ型ＰＫＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＫＳは、配列番号９の天然に存在しない変異体であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体は、ＫＲドメインを不活性化するＫＲドメイン内の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＰＫＳは、配列番号９を参照して決定されるように、１９９１位のチロシンが、ＫＲドメインを不活性化する置換、例えば、アラニン置換を含む、配列番号９に記載のポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）を発現するようにさらに操作される。特定の実施形態では、ＰＰＴａｓｅ遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のＭｉｃＡ、またはそのオルソログ、例えば、別のＲａｌｓｔｏｎｉａ種由来のＭｉｃＡである。いくつかの実施形態では、ＰＰＴａｓｅは、配列番号１０に示される配列と、少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０に示される配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＰＰＴａｓｅをコードする。いくつかの実施形態では、ＰＰＴａｓｅは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。代替的な実施形態では、ＰＰＴａｓｅは、真菌または細菌のＰＰＴａｓｅ、例えば、ＮｐｇＡまたはｓｆｐである。
いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＫＳは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（ｏｒｓＡ）またはＦｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（ＰＫＳ１４）に由来する変異型オルセリン酸シンターゼである。例えば、ＯＳＡＳ ＯｒｓａまたはＰＫＳ１４のＳＡＴドメインは、ＰｋｓＡまたはＢｅｎＱのＳＡＴドメインで置き換えることができる。
ＩＩ型ＰＫＳ
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＩ型ＰＫＳ、またはポリケチドシンターゼ活性を有するＩＩ型ＰＫＳの非天然型変異体、をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＰＫＳは、ヘキサノイルＣｏＡを開始ユニットとして使用することができるＰＫＳをコードする。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＰＫＳは、ベナスタチンを天然に産生するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．もしくはそのオルソログ由来のＢｅｎＡポリペプチドまたは多量体ＢｅｎＡ－ＢｅｎＢ－ＢｅｎＣ ＰＫＳ酵素を含む。本明細書で使用される場合、「ＢｅｎＡ ＰＫＳ」は、ベナスタチン遺伝子クラスターのＢｅｎＡ遺伝子によってコードされるＢｅｎＡを含むＰＫＳを指す。いくつかの実施形態では、「ＢｅｎＡ ＰＫＳ」は、ＢｅｎＢ及びＢｅｎＣを追加的に含む。
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１１に示される配列に対して、少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むＩＩ型ＰＫＳをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＩＩ型ＰＫＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＰＫＳは、配列番号１１の、天然に存在しない変異体であるポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ＰＫＳ開始ユニットとしてヘキサノエートを提供及び選択する役割を果たすＦａｂＨ様ケトアシルシンターゼ（ＫＡＳＩＩＩ）であるＢｅｎＱを発現するようにさらに操作される。特定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．またはそのオルソログ由来のＢｅｎＱをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＱポリペプチドは、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＢｅｎＱポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＱポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多量体ＢｅｎＡ－ＢｅｎＢ－ＢｅｎＣ ＰＫＳ酵素を発現するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．またはそのオルソログ由来の、ＢｅｎＢをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＢポリペプチドは、配列番号１３に示される配列に対して、少なくとも６０％以上（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、の同一性）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＢｅｎＢポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＢポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、遺伝子改変宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．またはそのオルソログ由来の、ＢｅｎＣをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＣポリペプチドは、配列番号１４に示される配列に対して、少なくとも６０％以上（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するＢｅｎＣポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＢｅｎＣポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
ＩＩＩ型ＰＫＳ
いくつかの実施形態では、使用されるＰＫＳは、ＩＩＩ型クラスのＰＫＳ、例えば、天然の芳香族オリベトール酸シンターゼ／シクラーゼ系、または関連するＩＩＩ型オルセリン酸シンターゼ、またはこれらの酵素の改変型に由来する。オリベトール酸シンターゼ（Ｔａｕｒａ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８３：２０６１－２０６６，２００９）（３，５，７，－トリオキソドデカノイルＣｏＡシンターゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｂ１Ｑ２Ｂ６）は、以下に示すように、３分子のマロニルＣｏＡとアシルＣｏＡとの縮合を触媒し、３，５，７－トリオキシアルカノイルＣｏＡテトラケチドを形成する、ＩＩＩ型ＰＫＳである。
ここで、「ＣｏＡ」はコエンザイムＡであり、「Ｒ」はアルキル基である。例えば、ヘキサン酸がカンナビノイド産生のための出発供給物として使用される場合、上述のＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼによって形成されるヘキサノイル－ＣｏＡは、３分子のマロニル－ＣｏＡと縮合して、３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡを形成する（すなわち、「Ｒ」は、ｎ－ペンチル基である）。ＩＩＩ型ＰＫＳは、アシル－ＣｏＡ基質（Ｉ型ＰＫＳ及びＩＩ型ＰＫＳの場合の、アシル担体タンパク質結合基質とは対照的に）に直接作用するホモ二量体酵素である。ＩＩＩ型ＰＫＳは、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，６４（４）：２８５－２９５，２０１２）によって、よく特性評価されている。
いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型ＰＫＳは、配列番号１５に記載の配列に対して、約６０％以上（例えば、約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）の同一性を有するオリベトール酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型ＰＫＳは、配列番号１５に示される配列に対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するオリベトール酸シンターゼポリペプチド配列を含む。
Ｄ．２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ
宿主細胞は、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ（例えば、オリベトール酸シクラーゼ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するようにさらに改変されてもよい。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のＤＡＢＢ型ポリケチドシクラーゼに類似する二量体α＋βバレル（ＤＡＢＢ）タンパク質ドメインである。オリベトール酸シクラーゼは、例えば、Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９（３１）：１２８１１－１２８１６；２０１２）に記載されている。「２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ」という用語は、シクラーゼ活性を有する変異体、例えば、切断または改変ポリペプチド、及び天然に存在する相同体またはオルソログを含む。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、Ｃ．ｓａｔｉｖａ（ＥＣ番号４．４．１．２６）由来のオリベトール酸シクラーゼである。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、ジバリニン酸を産生する（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２８３：１０８８－１１０６，２０１６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡｔＨＳ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＬＵＶ２、上記Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．も参照されたい）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ ＳＰ１（Ｐ０Ａ８８１）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ａｔ５ｇ２２５８０（Ｑ９ＦＫ８１）、Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ ＴｃｍＩシクラーゼ（Ｐ３９８９０）、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＡｃｔＶＡ－Ｏｒｆ６（Ｑ５３９０８）、Ｐ．ｒｅｉｎｅｋｅｉ ＭＬＭＩ（Ｃ５ＭＲ７６）、Ｓ．ｎｏｇａｌａｔｅｒ ＳｎｏａＢ（Ｏ５４２５９）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｖ０７９３（Ｏ８６３３２）、またはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ３５６６（Ｑ９ＨＹ５１）由来のオリベトール酸シクラーゼ相同体である。いくつかの実施形態では、シクラーゼは、ベナスタチン遺伝子クラスター、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．種Ａ２９９１２００由来のＢｅｎＨタンパク質のＮ末端ドメインである。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～１８個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～１２個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～９個の炭素原子を含む。
いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、オリベトール酸シクラーゼ、ＡｔＨＳ１ポリペプチド、またはＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインである。
いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、１７，または１８に示される配列に対して、６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１６、１７、または１８に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼは、配列番号１９に示される配列対する、６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するポリヌクレオチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９に示される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０に示される配列に対して、６０％以上の同一性（例えば、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２０に示される配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。
Ｅ．プレニルトランスフェラーゼ
いくつかの実施形態では、改変組換え宿主細胞は、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールの産生のためのプレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む。
プレニルトランスフェラーゼの例としては、ＷＯ２０１８／２０９１４３及び米国仮特許出願第６２／９６３，４４８号に記載されているものが含まれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼは、Ｆｅｌｌｅｒｍｅｉｅｒ＆Ｚｅｎｋ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２７：２８３－２８５；１９９８）によって記述されているように、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ；ＥＣ２．５．１．１０２）であり得る。Ｋｕｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１６（１７）：８１１７－８１２６；２００８）に記載されているような、ＮｐｈＢを含むストレプトマイセスプレニルトランスフェラーゼも用いることができる。いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼは、ｆｎｑ２６、すなわち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ由来のフラビオリンリナリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子改変された宿主細胞は、以下に記載されるような改変された宿主細胞であり得る。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞は、ゲラニルピロリン酸のオリベトール酸への結合を触媒するためのＧＯＴを発現するように改変される。いくつかの実施形態では、ＧＯＴのアミノ酸配列は、配列番号２１である。いくつかの実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの複数のコピーが、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。例えば、５～２０コピー（例えば、５～１５コピーまたは５～１０コピー）が、様々な位置で酵母細胞のゲノムに組み込まれ得る。非必須遺伝子をコードするものを含む様々な遺伝子座は、プレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの組み込みに好適である。１つ以上のコピーは、各遺伝子座において統合され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの２つのコピーは、１、２、または３個の遺伝子座に方向的に配置され、ポリヌクレオチドの１つのコピーは、１個の２個または３個の他の遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子座ＹＥＬ０６０Ｃ、ＹＨＲ０９０Ｃ、ＹＥＲ０２４Ｗ、ＹＩＬ１１４Ｃ、及びＹＨＲ１６２Ｗのうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの５～１０（例えば、９）コピーは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子座ＹＥＬ０６０Ｃ、ＹＨＲ０９０Ｃ、ＹＥＲ０２４Ｗ、ＹＩＬ１１４Ｃ、及びＹＨＲ１６２Ｗに組み込まれる。
ゲラニオールなどの外因性プレニル種は、培養中及びプレニル化化合物の産生中に宿主細胞に供給することができる。あるいは、宿主細胞は、高レベルのプレニル前駆体、例えば、プレノール、イソプレノール、ゲラニオールなどを含有する培地中で培養することができる。複数の前駆体供給（ＭＰＦ）を含む手順では、５－炭素プレノール及びイソプレノールは、カップリング前に、モノリン酸レベル（すなわち、ジメチルアリル一リン酸及びイソペンテニル一リン酸）に、次いで、二リン酸レベル（すなわち、ジメチルアリルピロリン酸及びイソペンテニルピロリン酸）に酵素的に変換されて、１０－炭素ゲラニルピロリン酸を形成することができる。
したがって、本明細書に詳述されるように、開始芳香族ポリケチド前駆体の生合成に関連するいくつかの実施形態では、単純な開始ユニットを形成する酵素が発現され、外因性に供給される脂肪族カルボン酸、アシルチオエステル、典型的にはアセチル、プロピオニル、ブタノイル、ヘキサノイル、マロニルまたはメチルマロニルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）チオエステルを生成するために使用される。次いで、これらをマロニルＣｏＡと繰り返し縮合して、カンナビノイド生合成の次の工程、すなわちプレニル化のための芳香族ポリケチド構築ブロックを形成する。
いくつかの実施形態では、改変組換え宿主細胞も提供され、その宿主細胞は、プレノール及びイソプレノールキナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、外因性プレノール及びイソプレノールの存在下で成長したときにジメチルアリルピロリン酸及びイソペンテニルピロリン酸を産生するキナーゼ活性をコードする外因性ポリヌクレオチド、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはゲラニルピロリン酸のオリベトール酸またはオリべトール酸類似体（例えば、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸）への結合を触媒するプレニルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、カンナビノイド化合物を形成する。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～１８個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～１２個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸の２－アルキル基は、１～９個の炭素原子を含む。
５炭素プレノール（プレノール及びイソプレノール）は、酵素ＧＰＰシンターゼにより、１０炭素ゲラニル－二リン酸を得るために、それらのカップリング前に、いくつかの酵素によって一リン酸レベルに、次いでさらなる発現酵素によって二リン酸レベルに変換されてもよい。いくつかの実施形態では、最初のキナーゼイベントは、酵素ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼによって行われる。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びトウモロコシ種を含む、コード遺伝子が由来するいくつかの生物において記載されている。
二リン酸レベルへのさらなるリン酸化は、酵素イソプレニル二リン酸シンターゼまたはリン酸イソペンテキナーゼを使用することによって達成される（米国特許第６，２３５，５１４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、この酵素、またはより活性な変異体をコードする化学合成遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏ－ｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａまたはＭａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａアミノ酸配列、またはキナーゼ活性を有する他の相同配列を使用することによって誘導される。
１０炭素ゲラニル二リン酸はまた、ゲラニオールを一リン酸レベルにリン酸化するキナーゼ、続いてゲラニル二リン酸を生じる第２のキナーゼによって生成され得る。いくつかの実施形態では、第１のキナーゼイベントは、酵素ファルネソールキナーゼによって実行される（ＦＯＬＫ）（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｂｈａｎｄａｒｉ ａｎｄ Ｃｒｏｗｅｌｌ，２０１１；Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１１ Ｊｕｎ；６６（６）：１０７８－８８）。このキナーゼ酵素は、植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ、Ｎｏｃｃａｅａ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓなど）及び真菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ａｔｒｏｒｏｓｅｕｓなど）を含む、５－炭素プレノールをリン酸化する生物からの既知のアミノ酸配列または変異体に由来する。
ゲラニルリン酸の変異体であるゲラニル二リン酸レベルへのさらなるリン酸化は、ＩＰＫにおける変異酵素イソペンテニル一リン酸キナーゼ（ＩＰＫ）（Ｖａｌ７３，Ｖａｌ１３０，Ｉｌｅ１４０）を使用することによって達成され、ゲラニルリン酸キナーゼ活性の向上をもたらすことが報告されている（Ｍａｂａｎｇｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。このキナーゼ酵素は、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍを含むが、これらに限定されない、細菌または古細菌種に由来する既知のアミノ酸配列または変異体に由来する。
いくつかの実施形態では、ゲラニル二リン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼのＤＮＡ構築物は、酵母に好ましいコドンを有する野生型または変異酵素をコードする。他では、緩和された基質特異性を有する細菌、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ構築物が使用される（Ｋｕｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、以下の３つの外因性ポリヌクレオチドから選択される１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドを含む：プレノール及びイソプレノールキナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、外因性プレノール及びイソプレノールの存在下で成長したときにジメチルアリルピロリン酸及びイソペンテニルピロリン酸を産生するキナーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド；ならびにゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、プレノール及びイソプレノールの双方の高い水溶性は、これらの５炭素化合物を二リン酸レベルにリン酸化することができる異種キナーゼ酵素を発現する組換え宿主細胞とともに活用され、それによって、荷電二リン酸部分に起因して、それらを宿主細胞内に閉じ込める。
いくつかの実施形態では、得られた二リン酸塩は、次いで、内因性または異種的に発現されたゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＰＰシンターゼ）のいずれかの作用によって縮合されて、ゲラニル二リン酸塩（ゲラニルピロリン酸塩とも呼ばれる）を形成する。これは、次いで、野生型または好ましくはより活性な改変芳香族プレニルトランスフェラーゼ酵素の作用によって２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸と縮合して、カンナビゲロール酸またはカンナビゲロール酸類似体を形成するために利用可能である。
他の実施形態では、ゲラニオール自体は、異種発現キナーゼ酵素の作用によって変換され、ゲラニルピロリン酸を形成し、次いで、野生型プレニルトランスフェラーゼまたは変異型プレニルトランスフェラーゼ酵素の作用によって、オリベトール酸またはオリベトール酸類似体（例えば、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸）と結合されて、カンナビゲロール酸またはカンナビゲロール酸類似体を形成する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞をさらに改変して、以下にさらに記載するような、ＣＢＤＡシンターゼ（ＥＣ１．２１．３．８）、ＴＨＣＡシンターゼ、またはＣＢＣＡシンターゼを発現させる。
いくつかの実施形態では、プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの発現は、ＡＤＨ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＴＰＩプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、またはＦＢＡ１プロモーターによって駆動される。
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドの少なくとも２つは、同じ自律複製発現ベクターに存在し、マルチシストロニックｍＲＮＡとして発現する。
Ｆ．カンナビノイドシンターゼ
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞をさらに改変して、カンナビゲロール酸などのカンナビノイド生成物をさらなるカンナビノイドに変換する。いくつかのそのような実施形態では、発現系は、同じベクター上または別個のベクター上にあるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、変換活性の発現系は、Ｃ．ｓａｔｉｖａ酵素ＣＢＣＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、またはＣＢＤＡシンターゼのうちの１つをコードする。いくつかの実施形態では、シンターゼは、ホップ由来の相同体、例えば、ホップ由来のＣＢＤＡシンターゼ相同体である。いくつかの実施形態では、発現系は、配列番号２３、２４、または２５に示される配列に対して、少なくとも７０％の同一性または少なくとも７５％の同一性、または少なくとも約８０％以上の同一性（例えば、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するホップＣＢＤＡ相同体をコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３、２４、または２５に示される配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。
ＣＢＣＡＳは、それ自身のシグナルペプチドを欠く融合タンパク質として発現され得るか、またはそれ自身のシグナルペプチドまたはそのアミノ末端での異種シグナルペプチドまたは疎水性ドメインで発現され得る。
他の実施形態では、ＨＤＥＬまたはＫＤＥＬ内質網様体保持配列は、発現されたＧＯＴ、ＣＢＣＡＳまたはＧＯＴ／ＣＢＣＡＳ変異酵素に融合される。いくつかの実施形態では、発現された酵素がカンナビノイド酸の産生に好ましい特性を有するように、発現された酵素に標的変異またはランダム変異を導入するように、ＧＯＴ及びＣＢＣＡＳ構築物を改変してもよい。
いくつかの実施形態では、ＣＢＣＡＳシグナルペプチドは、アサ植物によって使用される内因性シグナルペプチドであるか、もしくは酵母アルファ因子プレもしくはプレ－プロ配列、酵母プロテイナーゼＡプレ－プロ配列、もしくは、例えば、成熟ＧＯＴ３酵素のアミノ酸８０の周りから始まる疎水性領域（複数可）などのアサＧＯＴ（本明細書では「ＣｓＰＴ４」とも呼ばれる）酵素に由来する配列など、酵母または異種標的配列によって置き換えられてもよい。他の好ましいシグナルペプチドとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｄｉ１シグナル配列またはベルベリンブリッジ関連のｅａｓＥシグナル配列が挙げられる。ＣＢＣＡＳ遺伝子構築物は、タンパク質中のＮ結合グリコシル化部位を除去するように配列を変更することによって改変され得る。グリコシル化部位改変の全ての順列及び組み合わせを、増加した活性または最適な活性について調べることができる。他の実施形態では、ｈＳＯＤなどの融合タンパク質は、発現される構築物に組み込まれてもよい。ＣＢＣＡ、ＴＨＣＡまたはＣＢＤＡシンターゼ遺伝子構築物は、同様に改変され得る。
例示的なＣＢＣＡＳポリペプチド配列は、配列番号２６～３２に提供される。いくつかの実施形態では、ＣＢＣＡＳをコードするポリヌクレオチドは、シグナル配列またはＥＲ保持配列を除外する配列番号２６～３２のいずれか１つのＣＢＣＡＳポリペプチドの領域に対して、少なくとも７０％の同一性、または少なくとも７５％の同一性、または少なくとも約８０％以上の同一性（例えば、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６～３２のいずれか１つに示される配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有する。
宿主細胞の操作
ポリヌクレオチドは、任意の方法論を使用して宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の２つ以上の酵素（例えば、ＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼ、Ｉ型ポリケチドシンターゼ、ＩＩ型ポリケチドシンターゼ、またはＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ、及び２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼのうちの２つ）をコードする外因性ポリヌクレオチドは、同じ発現構築物、例えば、自律複製発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、２つ以上の酵素は、発現が同じプロモーターによって駆動されるマルチシストロニックＲＮＡの成分として発現される。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＰＫＳ、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼ、またはプレニルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドは、同じプロモーターによって駆動される発現構築物に含有され得る。いくつかの実施形態では、発現ベクター、例えば、自律複製ベクターは、発現が同じプロモーターによって駆動されてジシストロニックｍＲＮＡを生成するように、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されたカンナビノイドを生成するための２つの外因性ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ－２プロモーターである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、同じ発現構築物、例えば、自律複製発現ベクターに存在し、別個のプロモーターに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、２つ以上の発現構築物、例えば、自律複製発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、自律複製発現ベクターは、酵母人工染色体である。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、宿主ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、レトロトランスポゾン組み込みによって、複数の外因性ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入される。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞などの糸状真菌宿主細胞である。宿主細胞として用いることができる酵母の属としては、限定するものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＰｈａｆｆｉａの細胞が挙げられる。好適な酵母種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞として用いることができる糸状真菌属としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌種の例示的な種としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅが含まれる．
いくつかの実施形態では、改変組換え宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される細胞である。
いくつかの実施形態では、酵母株は、改変された産業用エタノール産生株であり、及び／または「スーパーアルコール活性乾燥酵母」株である（Ａｎｇｅｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｙｉｃｈａｎｇ，Ｈｕｂｅｉ ４４３００３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）。そのような株は、ｃｉｒ０にキュアする（ｃｕｒｉｎｇ）ことによって改変され、ゲノムに組み込まれた選択マーカー（例えば、ＵＲＡ３及びＬＥＵ２）を有する。使用することができる追加の酵母株としては、ＩｎｖＳｃ１（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５２／ＭＡＴα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはプロテアーゼ欠失株ＢＪ２１６８（ＡＴＣＣ ２０８２７７ ＭＡＴａ ｐｒｃ１－４０７ ｐｒｂ１－１１２２ ｐｅｐ４－３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３－５２ ｇａｌ２）が挙げられる。
上記の実施形態では、遺伝子は、Ｃ．ｓａｔｉｖａ、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａまたは他の生物由来の野生型または変異酵素をコードする、酵母コドン最適化を用いた化学合成遺伝子によってコードされてもよい。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の酵母における遺伝子の転写を駆動するために使用されるプロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ－２（ＡＤＨ２）プロモーターなどの、成長培地におけるグルコース濃度によって調節されるＤＮＡエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。ＧＡＬ１、ＭＥＴ２５、及びＣＵＰ１遺伝子の発現を駆動するものなど、他の調節されたプロモーターまたは誘導性プロモーターは、条件付き発現が必要な場合に使用される。ＧＡＬ１及びＣＵＰ１は、それぞれ、ガラクトース及び銅によって誘導されるが、ＭＥＴ２５は、メチオニンの非存在によって誘導される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、グルコース調節プロモーターに作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの発現は、アルコールデヒドロゲナーゼ－２プロモーターによって駆動される。
他のプロモーターは、構成的な様式で強く転写を駆動する。そのようなプロモーターとしては、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、エノラーゼ（ＥＮＯ２）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ－１（ＡＤＨ１）などの、高発現酵母解糖酵素の制御エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他の強力な構成的プロモーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転写伸長因子ＥＦ－１アルファ遺伝子（ＴＥＦ１及びＴＥＦ２）由来のもの（Ｐａｒｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ．２０１０，（１１）：９５５－６４、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１５，（１４）：９１－１０２）、及び高親和性グルコーストランスポーター（ＨＸＴ７）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅジオーキックシフトに続く低グルコースの状態下でよく機能するシャペロニン（ＳＳＡ１）プロモーター（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１５，（１４）：９１－１０２）である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、前駆体プールなどを増加させることによって、カンナビノイド産生を増加させることができる。マロン酸供給を伴うマロニルＣｏＡシンターゼなどの酵素のための異種の天然または化学的に合成された遺伝子（Ｍｕｔｋａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２００６）、及びアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１及び２は、ＰＫＳ生合成のために重要なマロニルＣｏＡを上方制御する。同様に、アセチルＣｏＡシンターゼ１及び２、ならびにメバロン酸経路における他の遺伝子産物、例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のＮｐｈＴ７遺伝子産物（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたは他の真核生物種由来の変異型ファルネシル－ピロリン酸シンターゼ（ＥＲＧ２０；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）も、当業者に周知の方法を使用して、高レベル発現プラスミドベクターに、またはゲノム統合を通じて導入されてもよい。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ－９技術、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはレトロトランスポゾンの使用を含み得る。代替的に、宿主生物に天然である場合、かかる遺伝子は、当業者に既知の遺伝子エレメント組み込み方法によって上方制御され得る。
いくつかの実施形態では、同様の操作を用いて、天然産物、例えば、カンナビノイド産生のための炭素源の利用の低減につながるその炭素源を利用するエタノールの産生を低減し得る。そのような遺伝子は、欠失によってゲノムから完全に「ノックアウト」されてもよく、またはプロモーターの強度の低下などによって活性が低下してもよい。かかる遺伝子としては、酵素ＡＤＨ１及び／またはＡＤＨ６の遺伝子が挙げられる。他の遺伝子「ノックアウト」としては、エルゴステロール経路に関与する遺伝子、例えば、ＥＲＧ９、及び酵母の２つの最も顕著な芳香族脱カルボキシラーゼ遺伝子である、ＰＡＤ１及びＦＤＣ１が挙げられる。
いくつかの実施形態では、メバロン酸経路の組み込み遺伝子または改変遺伝子を過剰発現する酵母株を利用して、カンナビノイドの産生のためにゲラニル二リン酸を生合成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸経路の１つ以上の酵素を過剰発現するように操作される。かかる酵素としては、例えば、Ｅｒｇ１０、Ｅｒｇ１３、ＨＭＧＲ、Ｅｒｇ１２、Ｅｒｇ８、Ｍｖｄ１、Ｉｄｉ１、及びＥｒｇ２０が挙げられる。例えば、参照により組み込まれる、米国特許第６，６８９，５９３号を参照されたい。いくつかの実施形態では、カンナビノイド産生のための酵母株は、特に明記しない限り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅベースの配列を使用して、以下の組み込みを有する。
ＨＯ遺伝子座において：ｐＴＥＦ１－ＩＤＩ１、ｐＡＤＨ２－ｔＨＭＧＲ、ｐＡＤＨ２－ＥＲＧ１３、ｐＴＥＦ２－ＥＲＧ２０（Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）、ＹＦＬ０４１Ｗ遺伝子座において：ｐＭＬＳ１－ＥＲＧ２０（Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）、ｐＩＣＬ１－ＥＲＧ１３、ｐＡＤＨ２（Ｓ．ｐａｒａ）－ｔＨＭＧＲ、ｐＦＢＡ１－ＭａｔＢ（Ｓ．ｃｏ）、ＲＥＩ１遺伝子座において：ｐＭＬＳ１－ＥＲＧ１２、ｐＦＢＡ１－ＭＶＤ１、ｐＡＤＨ２－ｍｖａＥ（Ｅ．ｆａ）、ｐＩＣＬ１－ｍｖａＳ（Ｅ．ｆａ）、ｐＴＥＦ１－ＥＲＧ８、ＰＲＢ１遺伝子座において：ｐＵＲＡ３－ＵＲＡ３、ｐＴＥＦ１－ＡＤＲ１、ｐＦＢＡ１－ＰＤＣ（Ｚ．ｍｏ）、ＹＥＲ１８０Ｃ遺伝子座において：ｐＴＤＨ３－ＦＡＤシンターゼ（Ｓ．ｃｅ）、ｐＴＥＦ１－Ｈａｃ１（Ｐｉｃｈｉａ ＣＡＹ６７７５８．１）、ｐＦＢＡ１－カルネキシン（Ｐｉｃｈｉａ ＣＡＹ６８９３８．１）、ＰＥＰ４遺伝子座において：ｐＡＤＨ２－Ｅｒｇ９、ｐＳＳＡ１－ＧＰＰＳ（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ）。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、最終生成物であるカンナビノイドの産生を補助することを目的としたアクセサリー酵素の遺伝子を含むように改変される。そのような酵素の１つであるカタラーゼは、カンナビジオール酸シンターゼ（Ｔａｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（Ｓｉｒｉｋａｎｔａｒａｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）及びカンナビクロメン酸シンターゼ（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）などの、ＣＢＧＡ及び類似体の酸化環化に関与する特定の酵素によって産生される過酸化水素を中和することができる。
いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、例えば、カンナビノイド生合成のための前駆体プールを最適化するために、上方制御または下方制御された内因性または異種遺伝子を含む。さらなる異種遺伝子産物を発現させて、細胞内に「アクセサリー」機能を付与してもよい。例えば、過剰発現されるカタラーゼは、酸化環化工程で形成された過酸化水素を、ＣＢＤＡ、Δ９－ＴＨＣＡ及びＣＢＣＡなどの重要な酸性カンナビノイドに中和するために発現されてもよい。「アクセサリー」遺伝子及びそれらの発現産物は、当該技術分野で周知の技術を介して酵母ゲノムへの組み込みを通じて提供されてもよく、プラスミド（酵母発現ベクターとしても知られる）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）または酵母トランスポゾンから発現されてもよい。
組換え宿主細胞は、操作された代謝経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を用いて、ゲノム組み込みまたはエピソームプラスミド（発現ベクター、または単にベクターとも呼ばれる）のいずれかで、宿主細胞を形質転換することによって作製され得る。「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、及び「遺伝子構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖の、任意選択により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指すために同義に使用される。ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡの１つ以上のセグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを変化させることなく、宿主細胞の典型的なコドン使用を反映するようにコドン最適化される。ある実施形態では、「コドン最適化」または「コドン最適化された」という用語は、核酸によってコードされるポリペプチドの配列を改変せずに、核酸配列のコドン含有量を修正して、特定の宿主細胞での発現を増強することを指す。ある特定の実施形態では、この用語は、ポリペプチドの発現レベルを制御する手段（例えば、発現レベルの増加または減少のいずれか）として、核酸配列のコドン含有量を変更することを包含することを意味する。したがって、操作された代謝経路に関与する酵素をコードする核酸配列が記載される。いくつかの実施形態では、代謝的に操作された細胞は、以下に記載の工程を実施するために必要な酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドを発現し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、米国特許第７，５６１，９７２号に記載の方法に従って、酵母での発現のために合成され、コドン最適化される。
例えば、特定の細胞は、本明細書に記載のカンナビノイド化合物、またはカンナビノイド化合物中間体を産生するのに必要なポリペプチド（複数可）をそれぞれコードする、１、２、３、４、５、または５個を超える核酸配列を含み得る。あるいは、単一の核酸分子は、１つ、または２つ以上のポリペプチドをコードすることができる。例えば、単一の核酸分子は、２つ、３つ、４つ、または５つもの異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。核酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ配列の増幅、ＤＮＡライブラリ、新規合成、ゲノムセグメントの切除などの様々な供給源から得ることができる。次いで、そのような供給源から得られた配列を、標準的な分子生物学及び／または組換えＤＮＡ技術を使用して改変して、所望の改変を有する核酸配列を作製してもよい。核酸配列の改変のための例示的な方法は、例えば、制限酵素を使用して、任意選択により、ライゲーション、相同組換え、部位特異的組換え、またはそれらの様々な組み合わせを使用した、配列の部位特異的変異導入、ＰＣＲ変異導入、欠失、挿入、置換、部分のスワップを含む。他の実施形態では、核酸配列は、合成核酸配列であり得る。合成ポリヌクレオチド配列は、米国特許第７，３２３，３２０号、ならびに米国特許出願第２００６／０１６０１３８号及び同第２００７／０２６９８７０号に記載されている、様々な方法を使用して産生される。酵母細胞の形質転換方法は、当該技術分野で周知である。
ＩＩＩ．カンナビノイド産生のための方法
カンナビノイド生成物の製造方法も、本明細書に提供される。方法は、
外因性ポリヌクレオチドによってコードされたＣｏＡ－トランスフェラーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが産生される条件下で、脂肪族カルボン酸をアシルＣｏＡチオエステルに変換するＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、を含む改変組換え宿主細胞を培養することと、
アシルＣｏＡチオエステルをカンナビノイド生成物に変換することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－リガーゼは、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、脂肪族カルボン酸は、Ｃ２～５カルボン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸など）またはＣ６～２０カルボン酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸など）である。いくつかの実施形態では、脂肪族カルボン酸は、炭素－炭素二重結合、ヒドロキシ基、ハロゲン、重水素、トリチウム、またはそれらの組み合わせを含む。脂肪族カルボン酸は、例えば、式Ｉ：
に記載の化合物であってもよく、式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２０ヒドロキシアルキル、重水素化Ｃ１～Ｃ２０アルキル、トリチウム化Ｃ１～Ｃ２０アルキル、及びＣ２～Ｃ２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ１０ヒドロキシアルキル、重水素化Ｃ１～Ｃ１０アルキル、トリチウム化Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カルボン酸は、４－フルオロブタン酸、５－フルオロペンタン酸、及び６－フルオロヘキサン酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、改変組換え宿主細胞は、
アシルＣｏＡチオエステル及びマロニルＣｏＡからポリケチドを生成するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び／または
２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、
改変組換え宿主細胞を培養することが、第２及び第３の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる生成物を発現させ、アシルＣｏＡチオエステルを２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールに変換することを含み、
アシルＣｏＡチオエステルをカンナビノイド生成物に変換することが、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールをカンナビノイド生成物に変換することを含む。
上述のＣｏＡ－トランスフェラーゼ、ＣｏＡ－リガーゼ、ＰＫＳ、及び２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼのいずれも、いくつかの好適な組み合わせで使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼであり、脂肪族カルボン酸は、酪酸であり、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸は、ジバリニン酸である。
いくつかの実施形態では、方法は、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸、または式ＩＩ：
の５－アルキルベンゼン－１，３－ジオール（５－ｏｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅ－ １，３－ｄｉｏｌ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｏｒｍｕｌａ ＩＩ）（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ２０ヒドロキシアルキル、重水素化Ｃ１～Ｃ２０アルキル、トリチウム化Ｃ１～Ｃ２０アルキル、及びＣ２～Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、ＣＯＯＲ２ａ及びＨからなる群から選択され、
Ｒ２ａは、Ｈ及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３は、プレニル部分及びＨからなる群から選択される）の製造を含む。
発酵条件
本明細書に提供される方法によるカンナビノイド産生は、一般に、上記の発現系を含有するように操作された宿主細胞（例えば、酵母または糸状菌）の培養を含む。いくつかの実施形態では、酵母の成長のための炭素源は、グルコース、デキストロース、キシロースなどの糖、または、例えば、セルロース源に由来する糖などの他の持続可能な原料糖である。他の実施形態では、使用される炭素源は、メタノール、グリセロール、エタノールまたはアセテートであり得る。いくつかの実施形態では、原料組成物は、ＨＰＬＣなどの分析技術を使用して測定されるように、最適な酵母成長及び最終的なカンナビノイド産生レベルを提供するために実験によって精製される。そのような実施形態では、方法は、グルコース／エタノールまたはグルコース／アセテートの混合物の利用を含み、グルコースと２－炭素源（エタノールまたはアセテート）のモル比は、５０／５０、６０／４０、８０／２０、または９０／１０の範囲である。供給は、グルコース調節プロモーターを誘導し、産生株におけるアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡ前駆体の産生を最大化するように最適化され得る。
発酵方法は、炭素利用経路または発現制御の様式の違いのために、特定の酵母株に適合させることができる。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母発酵は、単一のグルコース供給、複合窒素源（例えば、カゼイン加水分解物）、及び複数のビタミン補給を必要とし得る。これは、最適な成長及び発現のために、グリセロール、メタノール、及び微量ミネラル供給を必要とし得るが、単純なアンモニウム（窒素）塩のみを必要とするメチル栄養酵母であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓとは対照的である。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．（１９９０）９：９５ １０４，米国特許第５，３２４，６３９号、及びＦｉｅｓｃｈｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８７）２９：１１１３ １１２１を参照されたい。培地は、酵母抽出物、ペプトンなどの成分を含有してもよい。微生物は、バッチ、フィードバッチ、及び連続的流を含むが、これらに限定されない、従来の発酵モードで培養することができる。
いくつかの実施形態では、発酵槽へのグルコース添加速度は、グルコース添加速度が酵母によるグルコース消費速度にほぼ等しくなるように制御され、そのような条件下では、グルコースまたはエタノールの量は有意に蓄積されない。そのような例におけるグルコースの添加速度は、特定の酵母株、発酵温度、及び発酵装置の物理的寸法を含むがこれらに限定されない要因に依存し得る。
ＭＰＦ手順のために、バッチモードでは、前駆体のオリベトール酸（または別の２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸などのオリベトール酸類似体）、オリベトール（または別の５－アルキルベンゼン－１，３－ジオールなどのオリベトール類似体）、プレノール、イソプレノールまたはゲラニオールは、０．１～５０グラム／Ｌ（例えば、１～１０ｇ／Ｌ）の濃度で存在し得る。供給バッチモードでは、前駆体は、２～２０時間にわたってゆっくりと発酵に供給されてもよく、各必要な前駆体の１～１００グラム／Ｌ（例えば、１～１０グラム／Ｌ、または１０～１００グラム／Ｌ）の最終的な添加が生じる。
同様に、ヘキサン酸、ブタン酸、ペンタン酸などのカルボン酸出発物質は、０．１～５０グラム／Ｌ（例えば、１～１０ｇ／Ｌ）の濃度で存在してもよい。供給バッチモードでは、カルボン酸は、カルボン酸の１～１００グラム／Ｌ（例えば、１～１０グラム／Ｌ、または１０～１００グラム／Ｌ）の最終的な添加が生じるように、２～２０時間にわたってゆっくりと発酵に供給されてもよい。
発現時間、温度、及びｐＨなどの培養条件は、標的カンナビノイド中間体（例えば、オリベトール酸）及び／または標的カンナビノイド生成物（例えば、ＣＢＧＡ、ＣＢＧ）を高収率で得るように制御することができる。宿主細胞は、一般に、ヘキサン酸、プレノール、イソプレノールなどの出発物質の存在下で、使用される特定の宿主細胞に応じて、約２０℃～約４０℃の範囲の温度で、数時間～１日以上（例えば、２４時間、３０時間、３６時間、または４８時間）の範囲の期間培養される。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、２５～３２℃で２４～４０時間（例えば、３０時間）培養してもよい。培地のｐＨは、酸、塩基、及び／または緩衝剤の添加によって、特定のレベルで維持することができる。ある特定の実施形態では、６以上のｐＨで酵母を培養することで、オリベトールなどの望ましくない副産物の産生を減少させることができる。いくつかの実施形態では、酵母培養物のｐＨは、約６～約８の範囲である。いくつかの実施形態では、酵母培養物のｐＨは、約６．５である。いくつかの実施形態では、酵母培養物のｐＨは、約７である。いくつかの実施形態では、酵母培養物のｐＨは、約８である。
いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞は、一般に、上記のような好適な前駆体含有培地中でインビボで培養したときに、少なくとも約０．１ｇ／Ｌ、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約０．７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｇ／Ｌのレベルでの、目的のカンナビノイド生成物または中間体を生成するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞は、好適な培地でインビボで培養したときに、目的のカンナビノイド生成物または中間体を少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、または少なくとも約８０ｇ／Ｌのレベルで産生するように遺伝子改変される。
カンナビノイド産生は、細胞増殖及び／またはインキュベーションを可能にする任意の容器で行われ得る。例えば、反応混合物は、バイオリアクター、細胞培養フラスコ、またはプレート、マルチウェルプレート（例えば、９６、３８４、１０５６ウェルマイクロタイタープレートなど）、培養フラスコ、発酵槽、または細胞増殖もしくはインキュベーションのための他の容器であってもよい。生物学的に産生される、目的の生成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して、発酵培地または細胞抽出物から単離され得る。例えば、固形物または細胞断片は、遠心分離または濾過によって除去され得る。対象となる生成物は、例えば、蒸留、液体－液体抽出、膜蒸発、吸着、または他の方法によって単離され得る。
カンナビノイド出発物質及び中間体のカンナビノイド生成物への変換
いくつかの実施形態では、方法は、酵母細胞においてカンナビノイド前駆体を発現させることと、酵母細胞を単離することと、単離された酵母細胞においてカンナビノイド前駆体をカンナビノイド生成物に変換することと、を含む。いくつかの実施形態では、カンナビノイド前駆体は、オリベトール、オリベトール酸、ジバリノール、またはジバリニン酸である。カンナビノイド前駆体をカンナビノイド生成物に変換することは、本明細書に記載の手順（例えば、化学的もしくは酵素的プレニル化、熱もしくは脱カルボキシル化など）を使用して実施することができ、または変換経路を、特定のカンナビノイド前駆体または特定のカンナビノイド生成物の本性に従って変更することができる。酵母細胞を単離することは、任意選択により、遠心分離、濾過、または他の手段によって培地から酵母細胞を収集すること、酵母細胞を洗浄して培地または他の成分を除去すること、細胞から液体（例えば、培地）の少なくとも一部分を除去すること、及び／または細胞を乾燥すること（例えば、凍結乾燥または他の手段によって）を含むことができる。単離された酵母細胞は、カンナビノイド生成物を形成するための反応条件に直接供することができる。例えば、酵母細胞は、溶媒及び他の試薬と直接組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールをカンナビノイド生成物に変換することは、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することを含む。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド前駆体をカンナビノイド生成物に変換することは、インビボで行われ得る。いくつかの実施形態では、例えば、改変組換え宿主細胞は、プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含み、改変組換え宿主細胞を培養することは、第４の外因性ポリヌクレオチドによってコードされたプレニルトランスフェラーゼを発現させ、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールをインビボで産生することを含む。
代替的に、変換ステップをインビトロで行ってもよい。いくつかの実施形態では、例えば、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを製造することは、
１）２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオール、及び２）ゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールを、含む反応混合物を形成することと、
反応混合物を、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを形成するのに十分な条件下で維持することと、を含む
いくつかの実施形態では、化学的プレニル化は、（ｉ）２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸（例えば、ジバリニン酸）または５－アルキルベンゼン－１，３－ジオール（例えば、ジバリノール）、（ｉｉ）ゲラニオール、活性化ゲラニオール（例えば、臭化ゲラニル、塩化ゲラニル、トシル酸ゲラニル、メシル酸ゲラニルなど）、またはシトラール、及び（ｉｉｉ）酸性カンナビノイド（例えば、カンナビゲロバリン酸、ＣＢＧＶＡ）または中性カンナビノイド（例えば、カンナビゲロバリン（、ＣＢＧＶ）を生成するのに十分な条件下で有機溶媒、を含む反応混合物を形成することを含んでもよい。この方法は、ジバリニン酸類似体を対応する酸性カンナビノイドに変換するか、またはジバリノール類似体を対応する中性カンナビノイドに変換するために使用することができる。化学的プレニル化は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６６９６５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述される条件を使用して実施できる。カンナビノイド前駆体は、酵母混合物（例えば、培養物から採取された乾燥酵母細胞、または湿潤酵母細胞ペレット）中に存在し得る。いくつかのそのような実施形態では、反応混合物は、宿主細胞（例えば、乾燥酵母細胞）を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、アミン（例えば、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、及び１，２－ジアミンなどのジアミン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、シトラール及びＮ，Ｎ－ジメチルエチレンジアミンを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＢＧＶＡなどの酸性カンナビノイドは、カンナビノイド生成物である。いくつかの実施形態では、この方法は、酸性カンナビノイド、例えば、ＣＢＧＶＡを、カンナビノイド生成物として中性カンナビノイドまたは別の酸性カンナビノイドに変換することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＶＡなどの中間化合物の別のカンナビノイドへの変換は、加熱、自動酸化、またはＵＶ光処理などの物理的または化学的プロセスを介して行われる。例えば、方法は、操作された酵母細胞内で、または熱の作用、またはインビボまたはインビトロでカンナビノイド酸に接触する野生型または変異デカルボキシラーゼ酵素の作用によって、それらの完全または部分的精製の後のいずれかで、酸性カンナビノイドの脱カルボキシル化を含むことができる。酸性カンナビノイドの脱カルボキシル化は、対応する中性カンナビノイドを提供し、例えば、ＣＢＧＡの脱カルボキシル化は、ＣＢＧを提供する。
いくつかの実施形態では、酸性カンナビノイド、例えば、ＣＢＧＶＡは、デカルボキシラーゼ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｏｒｓＢデカルボキシラーゼを使用して、脱炭酸化されて、中性カンナビノイド化合物、例えば、ＣＢＧＶＮを形成し得る。あるいは、酸性カンナビノイドは、酸性カンナビノイドを、数分から数時間の範囲の期間、高温（例えば、約４０℃、５０℃、または１００℃）で維持することによって脱カルボキシル化することができる。
いくつかの実施形態では、表２に記載のカンナビノイド生成物は、以下に記載するように、化学工程及び／またはカンナビノイドシンターゼ触媒工程を使用して調製することができる。カンナビノイド生成物の例としては、ＷＯ２０２０／０９２８２３に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
カンナビノイド生成物には、ＣＢＧ、ＣＢＤＡ、ＣＢＤ、ＴＨＣ、Δ８－ＴＨＣ、ＴＨＣＡ、Δ８－ＴＨＣＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＣ、ＣＢＮ、ＣＢＮＤ、ＣＢＮＡ、ＣＢＶ、ＣＢＶＡ、ＴＨＣＶ、ＴＨＣＶＡ、Δ８－ＴＨＣＡ、ＣＢＧＶ、ＣＢＧＶＡ、ＣＢＣＶ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶ、ＣＢＤＶＡ、ＣＢＴＮ、及びそれらの類似体が含まれるが、これらに限定されない。さらなる例としては、カンナビクロマノン、カンナビクマロノン、１０－オキソ－Δ６ａ（１０ａ）－テトラヒドロヒドロカンナビノール（ＯＴＨＣ）、カンナビグレンドール、及びΔ７－イソテトラヒドロカンナビノールが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ．実施例
実施例１．組換え酵母におけるジバリニン酸及びジバリノールの産生。
Ｃ．ｓａｔｉｖａオリベトール酸ＰＫＳ系（Ｃ．ｓａｔｉｖａテトラケチドシンターゼ（ＴＫＳ）及び操作されたＣ．ｓａｔｉｖａシクラーゼ）を発現し、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ ブタノイル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼを使用してブタノイル－ＣｏＡを産生するためにＤＮＡ構築物で形質転換された酵母細胞の一晩培養物を、３ｍＬのＬｅｕ－、Ｕｒａ－最小培地中で増殖させた。次いで、３００μＬの一晩培養物を、３ｍＬのＹＰＤ培養チューブ（２％Ｄ、１０ｍＭのリボフラビン、及び５０μＭのパントテン酸）に播種した。細胞を、３０℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。朝と夕方に、２ｍＭのブタン酸ボーラスを１Ｍのエタノール溶液から供給し、培養物を一晩増殖させた。翌朝及び夕方、エタノール中で希釈した０．３Ｍのブタン酸ストックから２ｍＭのブタン酸を供給し、培養物を一晩増殖させた。２ｍＭのブタン酸供給（エタノール中の０．３Ｍストック）を３日間繰り返した。培養物を抽出し、７２時間の時点でＨＰＬＣによってジバリニン酸及びジバリノール産生を測定した。ジバリニン酸の収率は６２８ｍｇ／Ｌ、ジバリノールの収率は９３ｍｇ／Ｌであった。この実験を２リットルのグルコース供給発酵槽で繰り返すと、ジバリニン酸の収率は約１．４ｇ／Ｌに増加した。
実施例２．組換え酵母におけるオリベトール酸類似体及びオリベトール類似体の産生。
Ｃ．ｓａｔｉｖａオリベトール酸ＰＫＳ系を発現する酵母細胞を、様々なＣｏＡ－トランスフェラーゼまたはＣｏＡ－リガーゼのＤＮＡ構築物で形質転換し、ブタン酸に加えて様々な脂肪酸基質を供給して、実施例１に記載したように培養した。表３に示されるように、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼは、様々なオリベトール酸類似体及びオリベトール類似体の産生において特に有用であることが見出された。特に、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼを発現する培養物からのオリベトール酸及びジバリニン酸の収率は、それぞれ、Ｃ．ｓａｔｉｖａ ＡＡＥ３を発現する培養物からの収率よりも、それぞれ３倍及び１２倍高かった。
実施例３．カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の製造
ＧＯＴ３（アミノ酸８０～３９８）をコードするプラスミドで形質転換した酵母細胞を、３ｍＬのＬｅｕ最小培地中で一晩培養した。次いで、５ｍＬのＹＰＤフラスコ（２％Ｄ、１０ｍＭのリボフラビン、５０μＭのパントテン酸、１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）に、５００μＬの一晩培養物を播種した。細胞を、３０℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。朝及び夕方に、実施例１に記載されるように調製され、ＥｔＯＨに溶解した、０．５ｍＭの粗ジバリニン酸抽出物を添加した（合計１ｍＭのジバリニン酸）。細胞をさらに４８～７２時間増殖させ、ＨＰＬＣによってＣＢＧＶＡ産生を測定した。１４８ｍｇ／ＬのＣＢＧＶＡを得た。
実施例４．Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼを発現する、操作されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ヘキサン酸からのＣＢＧＡ及び酪酸からのＣＢＧＶＡの産生。
酵母株Ｙ５５１（ＵＲＡ＋、ＬＥＵ－）は、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）の過剰産生のために上述したようにメバロン酸経路酵素を発現し、酵母ゲノムに組み込まれたゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）（カンナビゲロール酸シンターゼ、ＣＢＧＡＳとも呼ばれる）の複数のコピーを含有するように操作された。ｈＳＯＤ ＧＯＴ ＤＮＡカセットは、非必須遺伝子をコードすると予測される遺伝子座で、酵母ゲノムに組み込まれた。最初のＵＲＡマーク付きカセットは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＤＨ２プロモーターによって駆動される単一のｈＳＯＤ－ＧＯＴ遺伝子を含み、ＹＥＬ０６０Ｃ遺伝子座で株Ｙ４０７に組み込まれ、５－フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を含有する寒天での対抗選択によるＵＲＡメーカー除去後に株Ｙ５２３を得た。ＹＨＲ０９０Ｃ遺伝子座に組み込まれた第２のＵＲＡマーク付きカセット（Ａ１４６）は、２つの双方向に配列されたｈＳＯＤ－ＧＯＴ遺伝子を含み、それぞれが別個のプロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＥＦ１及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＢＡ１プロモーター）によって駆動され、ＵＲＡ対抗選択後に株Ｙ５３１を得た。ＹＥＲ０２４Ｗ遺伝子座に組み込まれた第３のＵＲＡマーク付きカセット（Ａ１４７）は、２つの双方向に配列されたｈＳＯＤ－ＧＯＴ遺伝子を含み、それぞれが別個のプロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＥＦ２及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＤＨ３プロモーター）によって駆動され、ＵＲＡ対抗選択後に株Ｙ５４０を得た。第４のＵＲＡマーク付きカセット（Ａ１５０）は、Ａ１４７と同じｈＳＯＤ－ＧＯＴ及びプロモーター構成を含有したが、ＹＩＬ１１４Ｃ遺伝子座に組み込まれ、ＵＲＡ対抗選択後に株Ｙ５４７を得た。最後に、第５のＵＲＡマーク付きカセット（Ａ１５１）は、Ａ１４６と同じｈＳＯＤ－ＧＯＴ及びプロモーター構成を含有したが、ＹＨＲ１６２Ｗ遺伝子座に組み込まれて、ｈＳＯＤ－ＧＯＴの合計９個の組み込まれたコピーを含有しているＵＲＡ原栄養株である、Ｙ５５１を得た。
プラスミドｐＪＫ１５４Ｌを、ロイシンなし及びウラシルなしの最小培地寒天上で選択してＹ５５１に形質転換した。プラスミドｐＪＫ１５４Ｌは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＤＨ２プロモーター（ｈＳＯＤ－ＴＫＳ）から発現されるＣ．ｓａｔｉｖａオリベトールシンターゼ遺伝子（ヒトスーパーオキシドジスムターゼ［ｈＳＯＤ］融合パートナー配列を有する）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＥＦ１プロモーターから発現されるＣ．ｓａｔｉｖａオリベトール酸シクラーゼ（シクラーゼ、酸を保持したテトラケチドの環化のための）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＢＡ１プロモーターから発現されるＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：アセテートＣｏＡ－トランスフェラーゼ（ブタ－ＣｏＡ Ｔ）、を含む（図１を参照）。一次形質転換体を、新鮮な寒天プレートに「採取及びパッチ」された。ウラシルまたはロイシンを含まない最小液体培地（１５ｍＬ培養チューブ中３ｍＬ）に、新しいパッチからの細胞を播種した。培養物を振盪器／インキュベーターで３０℃で一晩増殖させた。富栄養培地（ＹＰ、２％デキストロース、１５ｍＬ培養チューブ中に３ｍＬ）に３００μＬの一晩培養物を播種し、３０℃の振盪器／インキュベーター中で一晩増殖させた。
一晩のインキュベーション後（及び培養物のＯＤが約８～１０に達したとき）、ヘキサン酸（１ｍＭの最終濃度）を第１の培養物に添加し、酪酸（２ｍＭの最終濃度）を第２の培養物に添加した。振盪を伴う３０℃での培養のインキュベーションを継続した。２４時間後、最終濃度の酸がヘキサン酸で２ｍＭ、または酪酸で４ｍＭとなるように、ヘキサン酸または酪酸の第２のアリコートを培養物に添加した。第２の酸アリコートを添加してから２４時間後（第１の添加から４８時間後）、各培養物のアリコート（５００μＬ）を、ポリケチド及びカンナビノイドの産生について分析した。ヘキサン酸及び酪酸供給培養物からの５００μＬの全細胞ブロスのアリコートに、５００μＬのイソプロパノールを添加した。細胞培養ブロス：イソプロパノール混合物を３０秒間ボルテックスし、細胞破片を遠心分離によって除去した。上清（２０μＬ）をＨＰＬＣによって分析して、生成されたポリケチド及びカンナビノイドの量を決定した。ヘキサン酸または酪酸のいずれかを供給した菌株からの抽出物の含有量を、表４に要約する。
ヘキサン酸で培養した株では、主な生成物はＣＢＧＡであった。この株におけるジバリニン酸の産生は、酵母株が内因性産生または培地に存在する前駆体のいずれかから、いくつかのブチリルＣｏＡを産生するという事実に起因すると考えられている。酪酸で培養した株については、相当量のジバリニン酸とともにＣＢＧＶＡを生成した。
Ｖ．例示的な実施形態
本開示の主題に従って提供される例示的な実施形態は、限定されないが、特許請求の範囲及び以下の実施形態を含む。
１．脂肪族カルボン酸をアシルＣｏＡチオエステルに変換するＣｏＡ－トランスフェラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞であって、前記改変組換え宿主細胞が、カンナビノイド生成物を産生するように操作される、前記改変組換え宿主細胞。
２．前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼが、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、実施形態１に記載の改変組換え宿主細胞。
３．ＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞であって、
前記ＣｏＡ－リガーゼが、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択され、
前記改変組換え宿主細胞が、カンナビノイド生成物を産生するように操作される、前記改変組換え宿主細胞。
４．前記改変組換え宿主細胞が、
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の改変組換え宿主細胞。
５．前記ＰＫＳがＩ型ＰＫＳ、ＩＩ型ＰＫＳ、またはＩＩＩ型ＰＫＳである、実施形態４に記載の改変組換え宿主細胞。
６．前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼが、オリベトール酸シクラーゼ、ＡｔＨＳ１ポリペプチド、またはＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインである、実施形態４または５に記載の改変組換え宿主細胞。
７．前記改変組換え宿主細胞が、プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態４～６のいずれか１つに記載の改変組換え宿主細胞。
８．前記プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼである、実施形態７に記載の改変組換え宿主細胞。
９．前記第４のポリヌクレオチドの複数のコピーが、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態７または実施形態８に記載の改変組換え宿主細胞。
１０．１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの発現が、ＡＤＨ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＴＰＩプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、またはＦＢＡ１プロモーターによって駆動される、実施形態１～９のいずれか１つの改変組換え宿主細胞。
１１．前記外因性ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、同じ自律複製発現ベクターに存在し、マルチシストロニックｍＲＮＡとして発現する、実施形態１～１０のいずれか１つの改変組換え宿主細胞。
１２．前記宿主細胞が、１つ以上のメバロン酸経路酵素を過剰発現するように遺伝子改変される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の改変組換え宿主細胞。
１３．前記メバロン酸経路酵素が、ｅｒｇ１０、ｅｒｇ１３、ｔｈｍｇｒ、ｅｒｇ１２、ｅｒｇ８、ｍｖｄ１、ｉｄｉ１、ｅｒｇ２０ Ｆ９６ＷＮ１２７Ｗ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＥ、及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＳからなる群から選択される、実施形態１２に記載の改変組換え宿主細胞。
１４．前記改変組換え宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される細胞である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の改変組換え宿主細胞。
１５．カンナビノイド生成物を製造する方法であって、
外因性ポリヌクレオチドによってコードされたＣｏＡ－トランスフェラーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが生成される条件下で、脂肪族カルボン酸を前記アシルＣｏＡチオエステルに変換する、前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む、改変組換え宿主細胞を培養することと、
前記アシルＣｏＡチオエステルを、前記カンナビノイド生成物に変換することと、を含む、前記方法。
１６．前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼが、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、実施形態１５に記載の方法。
１７．カンナビノイド生成物を製造する方法であって、
外因性ポリヌクレオチドによってコードされるＣｏＡ－リガーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが産生される条件下で、脂肪族カルボン酸を前記アシルＣｏＡチオエステルに変換する、前記ＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞を培養することと、
前記アシルＣｏＡチオエステルを、前記カンナビノイド生成物に変換することと、を含み、
前記ＣｏＡ－リガーゼが、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択される、前記方法。
１８．前記脂肪族カルボン酸が、Ｃ２～５カルボン酸である、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記脂肪族カルボン酸が、Ｃ６～２０カルボン酸である、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記改変組換え宿主細胞が、前記脂肪族カルボン酸が、炭素－炭素二重結合、ヒドロキシ基、ハロゲン、重水素、トリチウム、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．改変組換え宿主細胞が、
前記アシルＣｏＡチオエステル及びマロニルＣｏＡからポリケチドを産生する、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、
改変組換え宿主細胞を培養することが、第２及び第３の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる生成物を発現させ、前記アシルＣｏＡチオエステルを２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールに変換することを含み、
アシルＣｏＡチオエステルを前記カンナビノイド生成物に変換することが、前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを前記カンナビノイド生成物に変換することを含む、実施形態１５～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸が、ジバリニン酸である、実施形態２１に記載の方法。
２３．前記ＰＫＳが、Ｉ型ＰＫＳ、ＩＩ型ＰＫＳ、またはＩＩＩ型ＰＫＳである、実施形態２１または実施形態２２に記載の方法。
２４．前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼが、オリベトール酸シクラーゼ、ＡｔＨＳ１ポリペプチド、またはＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインである、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを前記カンナビノイド生成物に変換することが、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することを含む、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記改変組換え宿主細胞が、プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含み、前記改変組換え宿主細胞を培養することが、前記第４の外因性ポリヌクレオチドによってコードされた前記プレニルトランスフェラーゼを発現させ、前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することを含む、実施形態２５に記載の方法。
２７．前記プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼである、実施形態２６に記載の方法。
２８．前記第４のポリヌクレオチドの複数のコピーが、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態２６または実施形態２７に記載の方法。
２９．前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することが、
１）２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールと、２）ゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールと、を含む反応混合物を形成することと、
前記反応混合物を、前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを形成するのに十分な条件下で維持することと、を含む、実施形態２５に記載の方法。
３０．前記反応混合物が、ジアミンをさらに含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記外因性ポリヌクレオチドのうちの１つ以上の発現が、ＡＤＨ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＴＰＩプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、またはＦＢＡ１プロモーターによって駆動される、実施形態１５～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記外因性ポリヌクレオチドの少なくとも２つが、同じ自律複製発現ベクターに存在し、マルチシストロニックｍＲＮＡとして発現される、実施形態１５～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記宿主細胞が、１つ以上のメバロン酸経路酵素を過剰発現するように遺伝子改変される、実施形態１５～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記メバロン酸経路酵素が、ｅｒｇ１０、ｅｒｇ１３、ｔｈｍｇｒ、ｅｒｇ１２、ｅｒｇ８、ｍｖｄ１、ｉｄｉ１、ｅｒｇ２０ Ｆ９６ＷＮ１２７Ｗ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＥ、及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＳからなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記改変組換え宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される細胞である、実施形態１５～３４のいずれか１つに記載の方法。
本明細書に例示的に説明される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または限定がない場合に、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各例では、「含む」、「から本質的になる）」、及び「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えられ得る。したがって、例えば、いくつかの実施形態は、いくつかの構成要素を「含む」宿主細胞を包含してもよく、他の実施形態は、同じ構成要素を「本質的に含む」宿主細胞を包含してもよく、さらに他の実施形態は、同じ構成要素「からなる」宿主細胞を包含してもよい。使用されてきた用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明され、またはその一部の特徴の任意の等価物を除外することを意図するものではないが、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択による特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正及び変形は、当業者によって利用され得、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。加えて、本明細書に提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個々に組み込まれるのと同じ程度に、参照によりその全体が組み込まれる。
例示的なシーケンス
配列番号１ Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ
ＭＤＦＲＥＥＹＫＱＫＬＶＳＡＤＥＡＶＫＬＩＫＳＧＤＷＶＤＹＧＷＣＴＮＴＶＤＡＬＤＱＡＬＡＫＲＴＤＥＬＴＤＶＫＬＲＧＧＩＬＭＫＰＬＡＶＦＡＲＥＤＡＧＥＨＦＣＷＮＳＷＨＭＳＧＩＥＲＫＭＩＮＲＧＶＡＹＹＣＰＩＲＹＳＥＬＰＲＹＹＲＥＬＤＣＰＤＤＶＡＭＦＱＶＡＰＭＤＡＨＧＹＦＮＦＧＰＳＡＳＨＬＧＡＭＣＥＲＡＫＨＩＩＶＥＶＮＥＮＭＰＲＣＬＧＧＴＥＣＧＩＨＩＳＤＶＴＹＩＶＥＧＳＮＰＰＩＧＥＬＧＡＧＧＰＡＴＤＶＤＫＡＶＡＫＬＩＶＤＥＩＰＮＧＡＣＬＱＬＧＩＧＧＭＰＮＡＶＧＳＬＩＡＥＳＤＬＫＤＬＧＶＨＴＥＭＹＶＤＡＦＶＤＩＡＫＡＧＫＩＮＧＳＫＫＮＩＤＲＹＲＱＴＹＡＦＧＡＧＴＫＫＭＹＤＹＬＤＤＮＰＥＬＭＳＡＰＶＤＹＴＮＤＩＲＳＩＳＡＬＤＮＦＩＳＩＮＮＡＶＤＩＤＬＹＧＱＶＮＡＥＳＡＧＩＫＱＩＳＧＡＧＧＱＬＤＦＶＬＧＡＹＬＳＫＧＧＫＳＦＩＣＬＳＳＴＦＫＴＫＤＧＱＶＱＳＲＩＲＰＴＬＡＮＧＳＩＶＴＤＡＲＰＮＴＨＹＶＶＴＥＹＧＫＶＮＬＫＧＬＳＴＷＱＲＡＥＡＬＩＳＩＡＨＰＤＦＲＤＤＬＩＫＥＡＥＱＭＨＩＷＲＲＳＮＲ
配列番号２ Ｅ．ｃｏｌｉアセチルＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡ－トランスフェラーゼＡｔｏＡ
ＭＤＡＫＱＲＩＡＲＲＶＡＱＥＬＲＤＧＤＩＶＮＬＧＩＧＬＰＴＭＶＡＮＹＬＰＥＧＩＨＩＴＬＱＳＥＮＧＦＬＧＬＧＰＶＴＴＡＨＰＤＬＶＮＡＧＧＱＰＣＧＶＬＰＧＡＡＭＦＤＳＡＭＳＦＡＬＩＲＧＧＨＩＤＡＣＶＬＧＧＬＱＶＤＥＥＡＮＬＡＮＷＶＶＰＧＫＭＶＰＧＭＧＧＡＭＤＬＶＴＧＳＲＫＶＩＩＡＭＥＨＣＡＫＤＧＳＡＫＩＬＲＲＣＴＭＰＬＴＡＱＨＡＶＨＭＬＶＴＥＬＡＶＦＲＦＩＤＧＫＭＷＬＴＥＩＡＤＧＣＤＬＡＴＶＲＡＫＴＥＡＲＦＥＶＡＡＤＬＮＴＱＲＧＤＬ
配列番号３ Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼＡｔｏＤ
ＭＫＴＫＬＭＴＬＱＤＡＴＧＦＦＲＤＧＭＴＩＭＶＧＧＦＭＧＩＧＴＰＳＲＬＶＥＡＬＬＥＳＧＶＲＤＬＴＬＩＡＮＤＴＡＦＶＤＴＧＩＧＰＬＩＶＮＧＲＶＲＫＶＩＡＳＨＩＧＴＮＰＥＴＧＲＲＭＩＳＧＥＭＤＶＶＬＶＰＱＧＴＬＩＥＱＩＲＣＧＧＡＧＬＧＧＦＬＴＰＴＧＶＧＴＶＶＥＥＧＫＱＴＬＴＬＤＧＫＴＷＬＬＥＲＰＬＲＡＤＬＡＬＩＲＡＨＲＣＤＴＬＧＮＬＴＹＱＬＳＡＲＮＦＮＰＬＩＡＬ
配列番号４ Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ
ＭＫＶＩＴＡＲＥＡＡＡＬＶＱＤＧＷＴＶＡＳＡＧＦＶＧＡＧＨＡＥＡＶＴＥＡＬＥＱＲＦＬＱＳＧＬＰＲＤＬＴＬＶＹＳＡＧＱＧＤＲＧＡＲＧＶＮＨＦＧＮＡＧＭＴＡＳＩＶＧＧＨＷＲＳＡＴＲＬＡＴＬＡＭＡＥＱＣＥＧＹＮＬＰＱＧＶＬＴＨＬＹＲＡＩＡＧＧＫＰＧＶＭＴＫＩＧＬＨＴＦＶＤＰＲＴＡＱＤＡＲＹＨＧＧＡＶＮＥＲＡＲＱＡＩＡＥＧＫＡＣＷＶＤＡＶＤＦＲＧＤＥＹＬＦＹＰＳＦＰＩＨＣＡＬＩＲＣＴＡＡＤＡＲＧＮＬＳＴＨＲＥＡＦＨＨＥＬＬＡＭＡＱＡＡＨＮＳＧＧＩＶＩＡＱＶＥＳＬＶＤＨＨＥＩＬＱＡＩＨＶＰＧＩＬＶＤＹＶＶＶＣＤＮＰＡＮＨＱＭＴＦＡＥＳＹＮＰＡＹＶＴＰＷＱＧＥＡＡＶＡＥＡＥＡＡＰＶＡＡＧＰＬＤＡＲＴＩＶＱＲＲＡＶＭＥＬＡＲＲＡＰＲＶＶＮＬＧＶＧＭＰＡＡＶＧＭＬＡＨＱＡＧＬＤＧＦＴＬＴＶＥＡＧＰＩＧＧＴＰＡＤＧＬＳＦＧＡＳＡＹＰＥＡＶＶＤＱＰＡＱＦＤＦＹＥＧＧＧＩＤＬＡＩＬＧＬＡＥＬＤＧＨＧＮＶＮＶＳＫＦＧＥＧＥＧＡＳＩＡＧＶＧＧＦＩＮＩＴＱＳＡＲＡＶＶＦＭＧＴＬＴＡＧＧＬＥＶＲＡＧＤＧＧＬＱＩＶＲＥＧＲＶＫＫＩＶＰＥＶＳＨＬＳＦＮＧＰＹＶＡＳＬＧＩＰＶＬＹＩＴＥＲＡＶＦＥＭＲＡＧＡＤＧＥＡＲＬＴＬＶＥＩＡＰＧＶＤＬＱＲＤＶＬＤＱＣＳＴＰＩＡＶＡＱＤＬＲＥＭＤＡＲＬＦＱＡＧＰＬＨＬ
配列番号５ Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ
ＭＳＤＴＴＴＡＦＴＶＰＡＶＡＫＡＶＡＡＡＩＰＤＲＥＬＩＩＱＧＤＲＲＹＳＹＲＱＶＩＥＲＳＮＲＬＡＡＹＬＨＳＱＧＬＧＣＨＴＥＲＥＡＬＡＧＨＥＶＧＱＤＬＬＧＬＹＡＹＮＧＮＥＦＶＥＡＬＬＧＡＦＡＡＲＶＡＰＦＮＶＮＦＲＹＶＫＳＥＬＨＹＬＬＡＤＳＥＡＴＡＬＩＹＨＡＡＦＡＰＲＶＡＥＩＬＰＤＬＰＲＬＲＶＬＩＱＩＡＤＥＳＧＮＥＬＬＤＧＡＶＤＹＥＤＡＬＡＳＶＳＡＥＰＰＰＶＲＨＣＰＤＤＬＹＶＬＹＴＧＧＴＴＧＭＰＫＧＶＬＷＲＱＨＤＩＦＭＴＳＦＧＧＲＮＬＭＴＧＥＰＳＳＳＩＤＥＩＶＱＲＡＡＳＧＰＧＴＫＬＭＩＬＰＰＬＩＨＧＡＡＱＷＳＶＭＴＡＩＴＴＧＱＴＶＶＦＰＴＶＶＤＨＬＤＡＥＤＶＶＲＴＩＥＲＥＫＶＭＶＶＴＶＶＧＤＡＭＡＲＰＬＶＡＡＩＥＫＧＩＡＤＶＳＳＬＡＶＶＡＮＧＧＡＬＬＴＰＦＶＫＱＲＬＩＥＶＬＰＮＡＶＶＶＤＧＶＧＳＳＥＴＧＡＱＭＨＨＭＳＴＰＧＡＶＡＴＧＴＦＮＡＧＰＤＴＦＶＡＡＥＤＬＳＡＩＬＰＰＧＨＥＧＭＧＷＬＡＱＲＧＹＶＰＬＧＹＫＧＤＡＡＫＴＡＫＴＦＰＶＩＤＧＶＲＹＡＶＰＧＤＲＡＲＨＨＡＤＧＨＩＥＬＬＧＲＤＳＶＣＩＮＳＧＧＥＫＩＦＶＥＥＶＥＴＡＩＡＳＨＰＡＶＡＤＶＶＶＡＧＲＰＳＥＲＷＧＱＥＶＶＡＶＶＡＬＳＤＧＡＡＶＤＡＧＥＬＩＡＨＡＳＮＳＬＡＲＹＫＬＰＫＡＩＶＦＲＰＶＩＥＲＳＰＳＧＫＡＤＹＲＷＡＲＥＱＡＶＤＧ
配列番号６ Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシルＣｏＡ－リガーゼ
ＭＥＫＳＧＹＧＲＤＧＩＹＲＳＬＲＰＴＬＶＬＰＫＤＰＮＴＳＬＶＳＦＬＦＲＮＳＳＳＹＰＳＫＬＡＩＡＤＳＤＴＧＤＳＬＴＦＳＱＬＫＳＡＶＡＲＬＡＨＧＦＨＲＬＧＩＲＫＮＤＶＶＬＩＦＡＰＮＳＹＱＦＰＬＣＦＬＡＶＴＡＩＧＧＶＦＴＴＡＮＰＬＹＴＶＮＥＶＳＫＱＩＫＤＳＮＰＫＩＩＩＳＶＮＱＬＦＤＫＩＫＧＦＤＬＰＶＶＬＬＧＳＫＤＴＶＥＩＰＰＧＳＮＳＫＩＬＳＦＤＮＶＭＥＬＳＥＰＶＳＥＹＰＦＶＥＩＫＱＳＤＴＡＡＬＬＹＳＳＧＴＴＧＴＳＫＧＶＥＬＴＨＧＮＦＩＡＡＳＬＭＶＴＭＤＱＤＬＭＧＥＹＨＧＶＦＬＣＦＬＰＭＦＨＶＦＧＬＡＶＩＴＹＳＱＬＱＲＧＮＡＬＶＳＭＡＲＦＥＬＥＬＶＬＫＮＩＥＫＦＲＶＴＨＬＷＶＶＰＰＶＦＬＡＬＳＫＱＳＩＶＫＫＦＤＬＳＳＬＫＹＩＧＳＧＡＡＰＬＧＫＤＬＭＥＥＣＧＲＮＩＰＮＶＬＬＭＱＧＹＧＭＴＥＴＣＧＩＶＳＶＥＤＰＲＬＧＫＲＮＳＧＳＡＧＭＬＡＰＧＶＥＡＱＩＶＳＶＥＴＧＫＳＱＰＰＮＱＱＧＥＩＷＶＲＧＰＮＭＭＫＧＹＬＮＮＰＱＡＴＫＥＴＩＤＫＫＳＷＶＨＴＧＤＬＧＹＦＮＥＤＧＮＬＹＶＶＤＲＩＫＥＬＩＫＹＫＧＦＱＶＡＰＡＥＬＥＧＬＬＶＳＨＰＤＩＬＤＡＶＶＩＰＦＰＤＥＥＡＧＥＶＰＩＡＦＶＶＲＳＰＮＳＳＩＴＥＱＤＩＱＫＦＩＡＫＱＶＡＰＹＫＲＬＲＲＶＳＦＩＳＬＶＰＫＳＡＡＧＫＩＬＲＲＥＬＶＱＱＶＲＳＫＭ
配列番号７ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＡＡ２中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ
ＭＡＡＰＤＹＡＬＴＤＬＩＥＳＤＰＲＦＥＳＬＫＴＲＬＡＧＹＴＫＧＳＤＥＹＩＥＥＬＹＳＱＬＰＬＴＳＹＰＲＹＫＴＦＬＫＫＱＡＶＡＩＳＮＰＤＮＥＡＧＦＳＳＩＹＲＳＳＬＳＳＥＮＬＶＳＣＶＤＫＮＬＲＴＡＹＤＨＦＭＦＳＡＲＲＷＰＱＲＤＣＬＧＳＲＰＩＤＫＡＴＧＴＷＥＥＴＦＲＦＥＳＹＳＴＶＳＫＲＣＨＮＩＧＳＧＩＬＳＬＶＮＴＫＲＫＲＰＬＥＡＮＤＦＶＶＡＩＬＳＨＮＮＰＥＷＩＬＴＤＬＡＣＱＡＹＳＬＴＮＴＡＬＹＥＴＬＧＰＮＴＳＥＹＩＬＮＬＴＥＡＰＩＬＩＦＡＫＳＮＭＹＨＶＬＫＭＶＰＤＭＫＦＶＮＴＬＶＣＭＤＥＬＴＨＤＥＬＲＭＬＮＥＳＬＬＰＶＫＣＮＳＬＮＥＫＩＴＦＦＳＬＥＱＶＥＱＶＧＣＦＮＫＩＰＡＩＰＰＴＰＤＳＬＹＴＩＳＦＴＳＧＴＴＧＬＰＫＧＶＥＭＳＨＲＮＩＡＳＧＩＡＦＡＦＳＴＦＲＩＰＰＤＫＲＮＱＱＬＹＤＭＣＦＬＰＬＡＨＩＦＥＲＭＶＩＡＹＤＬＡＩＧＦＧＩＧＦＬＨＫＰＤＰＴＶＬＶＥＤＬＫＩＬＫＰＹＡＶＡＬＶＰＲＩＬＴＲＦＥＡＧＩＫＮＡＬＤＫＳＴＶＱＲＮＶＡＮＴＩＬＤＳＫＳＡＲＦＴＡＲＧＧＰＤＫＳＩＭＮＦＬＶＹＨＲＶＬＩＤＫＩＲＤＳＬＧＬＳＮＮＳＦＩＩＴＧＳＡＰＩＳＫＤＴＬＬＦＬＲＳＡＬＤＩＧＩＲＱＧＹＧＬＴＥＴＦＡＧＶＣＬＳＥＰＦＥＫＤＶＧＳＣＧＡＩＧＩＳＡＥＣＲＬＫＳＶＰＥＭＧＹＨＡＤＫＤＬＫＧＥＬＱＩＲＧＰＱＶＦＥＲＹＦＫＮＰＮＥＴＳＫＡＶＤＱＤＧＷＦＳＴＧＤＶＡＦＩＤＧＫＧＲＩＳＶＩＤＲＶＫＮＦＦＫＬＡＨＧＥＹＩＡＰＥＫＩＥＮＩＹＬＳＳＣＰＹＩＴＱＩＦＶＦＧＤＰＬＫＴＦＬＶＧＩＶＧＶＤＶＤＡＡＱＰＩＬＡＡＫＨＰＥＶＫＴＷＴＫＥＶＬＶＥＮＬＮＲＮＫＫＬＲＫＥＦＬＮＫＩＮＫＣＴＤＧＬＱＧＦＥＫＬＨＮＩＫＶＧＬＥＰＬＴＬＥＤＤＶＶＴＰＴＦＫＩＫＲＡＫＡＳＫＦＦＫＤＴＬＤＱＬＹＡＥＧＳＬＶＫＴＥＫＬ
配列番号８ Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＡＤＫアシル－ＣｏＡ－リガーゼ
ＭＨＰＴＧＰＨＬＧＰＤＶＬＦＲＥＳＮＭＫＶＴＬＴＦＮＥＱＲＲＡＡＹＲＱＱＧＬＷＧＤＡＳＬＡＤＹＷＱＱＴＡＲＡＭＰＤＫＩＡＶＶＤＮＨＧＡＳＹＴＹＳＡＬＤＨＡＡＳＣＬＡＮＷＭＬＡＫＧＩＥＳＧＤＲＩＡＦＱＬＰＧＷＣＥＦＴＶＩＹＬＡＣＬＫＩＧＡＶＳＶＰＬＬＰＳＷＲＥＡＥＬＶＷＶＬＮＫＣＱＡＫＭＦＦＡＰＴＬＦＫＱＴＲＰＶＤＬＩＬＰＬＱＮＱＬＰＱＬＱＱＩＶＧＶＤＫＬＡＰＡＴＳＳＬＳＬＳＱＩＩＡＤＮＴＳＬＴＴＡＩＴＴＨＧＤＥＬＡＡＶＬＦＴＳＧＴＥＧＬＰＫＧＶＭＬＴＨＮＮＩＬＡＳＥＲＡＹＣＡＲＬＮＬＴＷＱＤＶＦＭＭＰＡＰＬＧＨＡＴＧＦＬＨＧＶＴＡＰＦＬＩＧＡＲＳＶＬＬＤＩＦＴＰＤＡＣＬＡＬＬＥＱＱＲＣＴＣＭＬＧＡＴＰＦＶＹＤＬＬＮＶＬＥＫＱＰＡＤＬＳＡＬＲＦＦＬＣＧＧＴＴＩＰＫＫＶＡＲＥＣＱＱＲＧＩＫＬＬＳＶＹＧＳＴＥＳＳＰＨＡＶＶＮＬＤＤＰＬＳＲＦＭＨＴＤＧＹＡＡＡＧＶＥＩＫＶＶＤＤＡＲＫＴＬＰＰＧＣＥＧＥＥＡＳＲＧＰＮＶＦＭＧＹＦＤＥＰＥＬＴＡＲＡＬＤＥＥＧＷＹＹＳＧＤＬＣＲＭＤＥＡＧＹＩＫＩＴＧＲＫＫＤＩＩＶＲＧＧＥＮＩＳＳＲＥＶＥＤＩＬＬＱＨＰＫＩＨＤＡＣＶＶＡＭＳＤＥＲＬＧＥＲＳＣＡＹＶＶＬＫＡＰＨＨＳＬＳＬＥＥＶＶＡＦＦＳＲＫＲＶＡＫＹＫＹＰＥＨＩＶＶＩＥＫＬＰＲＴＴＳＧＫＩＱＫＦＬＬＲＫＤＩＭＲＲＬＴＱＤＶＣＥＥＩＥ
配列番号９ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＭｉｃＣ．いくつかの実施形態では、ＭｉｃＣアミノ酸配列は、Ｙ１９９１Ａアミノ酸置換を含む（Ｙ１９９１は、配列番号９に下線が引かれている）。
配列番号１０：切断型Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＭｉｃＡ
ＭＭＴＩＴＴＤＲＴＰＰＡＡＧＡＡＬＤＲＮＲＳＡＹＡＧＬＡＤＶＬＥＲＡＧＬＡＥＨＡＬＹＬＮＷＧＹＲＰＶＤＧＱＰＤＷＡＡＲＥＬＰＰＧＥＬＧＲＭＱＡＲＬＶＬＥＶＬＧＤＴＰＬＤＧＲＲＶＬＤＶＧＣＧＲＧＧＡＬＡＬＭＧＲＬＨＡＰＡＡＬＡＧＡＤＩＳＡＡＮＩＡＹＣＲＫＲＨＴＨＰＲＬＲＦＱＩＡＤＡＣＲＬＰＹＰＤＳＳＭＤＶＶＦＮＬＥＳＳＧＡＹＰＤＩＧＡＦＦＨＨＶＨＲＩＬＲＶＧＧＲＦＣＬＡＤＶＦＤＡＤＳＶＡＷＶＲＡＡＬＥＱＡＧＦＴＬＥＲＥＲＳＩＰＡＱＶＲＡＡＲＥＲＡＳＰＧＩＷＲＲＬＤＴＡＬＴＡＬＤＡＰＧＬＲＲＥＬＥＲＹＬＡＡＰＳＳＧＬＦＱＡＬＥＤＧＲＶＤＹＲＬＦＨＷＲＫＴＣＰＡＡＧＲＩＤＡＤＶＩＡＲＬＡＴＲＳＡＲＬＤＡＡＬＱＤＲＡＰＳＡＡＡＰＱＳＰＡＰＧＰＡＮＡＳＡＳＡＷＦＰＦＴＡＰＤＡＱＡＧＦＮＶＦＡＬＰＹＡＧＧＧＡＳＶＹＲＡＷＴＬＰＲＲＰＧＡＡＰＷＱＬＣＰＶＱＬＰＧＲＥＳＲＦＧＥＰＬＩＤＤＭＡＴＬＡＤＲＬＡＤＡＩＧＰＹＡＨＲＰＷＡＬＬＧＣＳＬＧＣＫＩＡＦＥＶＡＲＲＦＡＲＱＧＲＰＰＡＬＬＦＬＭＡＣＰＡＰＧＬＰＬＧＲＲＩＳＴＲＡＥＡＤＦＡＲＥＶＣＨＬＧＧＴＰＰＥＶＬＡＤＡＥＭＭＲＴＬＭＰＩＬＲＮＤＳＡＬＡＥＨＹＶＡＡＥＤＡＴＶＮＶＰＩＶＭＶＡＡＧＤＤＨＬＶＴＶＥＥＡＲＲＷＱＲＨＡＧＡＧＦＤＷＲＬＶＤＧＧＨＦＦＬＲＱＲＲＲＥＬＴＤＷＬＬＤＡＬＲＲＧＥＲＴＬＰＶＱＴＴＴＴＤＶＰＤＶＰＣＳＴＰＥＱＰＲＤＰＳＲＭＰＡＰＧＡＳＡＮＬＶＬＡＰＧＥＩＬＶＶＴＡＰＲＳＬＡＡＲＬＴＰＡＶＬＳＤＤＥＱＲＱＬＡＲＦＡＦＤＡＤＲＥＲＹＬＡＡＨＷＡＫＲＲＶＬＧＡＬＬＡＡＡＰＲＳＬＲＦＧＡＱＡＧＧＫＰＹＬＩＧＥＡＬＨＦＳＬＳＨＳＧＤＲＶＡＶＡＶＣＲＨＡＰＶＧＶＤＩＥＱＡＲＧＩＡＣＨＡＳＡＡＲＩＭＨＰＬＤＲＩＡＰＱＣＥＴＰＥＤＲＦＬＡＡＷＳＬＫＥＡＶＡＫＣＴＧＡＧＬＡＬＰＦＤＳＬＲＬＡＦＡＧＮＧＲＹＧＣＬＬＧＴＨＡＡＷＥＡＨＨＱＨＥＤＧＶＨＬＡＶＡＳＡＴＰＷＡＡＬＲＩＬＰＬＤＡＡＬＡＥＧ
配列番号１１ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ａ２９９１２００ ＢｅｎＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＢｅｎＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸２－２９からのシグナルペプチド配列なし）
ＭＡＧＲＴＡＴＲＲＩＴＬＦＤＰＥＲＦＲＣＲＩＡＡＥＣＤＦＤＡＡＡＬＧＬＴＰＱＥＩＲＲＭＤＲＡＶＱＭＡＶＡＡＴＧＥＡＬＡＤＡＧＶＧＥＧＤＬＤＰＡＲＴＧＶＴＩＧＮＡＶＧＳＴＭＭＭＥＥＥＹＶＶＩＳＤＧＧＲＫＷＬＣＤＥＥＹＧＶＲＨＬＹＧＡＶＩＰＳＴＡＧＶＥＶＡＲＲＶＧＡＥＧＰＴＡＶＶＳＴＧＣＴＳＧＬＤＡＶＧＨＡＡＱＬＩＥＥＧＳＡＤＶＶＩＧＧＡＴＤＡＰＩＳＰＩＴＶＡＣＦＤＳＬＫＡＴＳＴＲＮＤＤＡＥＨＡＣＲＰＦＤＲＤＲＤＧＬＶＬＧＥＧＳＡＶＦＶＭＥＡＲＥＲＡＶＲＲＧＡＫＩＹＣＥＶＡＧＹＡＧＲＡＮＡＹＨＭＴＧＬＫＰＤＧＲＥＬＡＥＡＩＤＲＡＭＡＱＡＧＩＳＡＥＤＩＤＹＶＮＡＨＧＳＧＴＲＱＮＤＲＨＥＴＡＡＦＫＲＳＬＲＤＨＡＲＲＶＰＶＳＳＩＫＳＭＶＧＨＳＬＧＡＩＧＡＩＥＶＡＡＳＡＬＡＩＥＨＧＶＶＰＰＴＡＮＬＴＴＰＤＰＥＣＤＬＤＹＶＰＲＥＡＲＥＨＰＴＤＶＶＬＳＶＧＳＧＦＧＧＦＱＳＡＶＶＬＩＳＰＲＳＲＲ
配列番号１２ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ａ２９９１２００ ＢｅｎＱ
ＭＳＱＬＳＬＳＱＡＡＰＡＧＧＳＲＩＲＧＶＧＡＹＲＰＡＲＶＶＴＮＥＥＩＡＰＲＩＧＶＡＰＥＷＩＡＲＲＳＧＩＨＴＲＲＦＡＧＰＤＥＰＬＡＭＭＡＡＴＡＳＥＫＡＬＡＡＡＧＬＳＡＤＥＶＤＣＶＬＶＡＴＩＳＨＬＬＱＭＰＡＬＡＶＤＶＡＨＲＬＧＡＡＰＴＡＡＦＤＬＳＡＡＣＡＧＦＣＨＧＶＡＩＡＤＳＭＶＲＳＧＴＡＨＮＶＬＬＶＧＡＤＲＭＴＤＶＶＤＡＤＤＰＡＴＡＦＬＦＡＤＧＡＧＡＶＶＩＧＰＳＥＴＰＧＩＧＰＶＡＷＧＳＤＧＥＲＭＤＡＩＴＭＴＧＨＷＴＰＳＬＲＴＮＰＥＬＰＷＰＹＬＣＭＴＧＷＫＶＦＲＷＡＴＥＴＭＧＱＡＡＲＤＡＩＥＲＡＧＶＴＳＥＥＬＳＡＦＩＰＨＱＡＮＧＬＩＴＤＡＬＡＫＤＩＧＬＴＡＤＴＡＩＡＲＤＩＴＤＳＧＮＴＳＧＡＳＩＰＭＡＭＥＲＬＬＡＳＧＱＡＲＳＧＥＡＡＬＬＩＧＦＧＳＧＬＶＨＡＧＱＶＶＬＬＰ
配列番号１３ ＢｅｎＢ
ＭＴＶＩＴＧＬＧＶＶＡＰＴＧＶＧＬＤＤＹＷＡＴＴＬＡＧＫＳＧＩＤＲＩＲＲＦＤＰＳＧＹＴＡＱＬＡＧＱＶＤＤＦＥＡＴＤＨＶＰＳＫＬＬＡＱＴＤＲＭＴＨＦＡＦＡＧＡＮＭＡＬＡＤＡＨＶＤＬＡＤＦＰＥＹＥＲＡＶＶＴＡＮＳＳＧＧＶＥＹＧＱＨＥＬＱＫＭＷＳＧＧＰＭＲＶＳＡＹＭＳＶＡＷＦＹＡＡＴＴＧＱＬＳＩＨＨＧＬＲＧＰＣＧＬＩＡＴＥＱＡＧＧＬＤＡＬＧＨＡＲＲＬＬＲＲＧＡＲＩＡＶＴＧＧＴＤＡＰＬＳＰＡＳＭＶＡＱＬＡＴＧＬＬＳＳＮＰＤＰＴＡＡＹＬＰＦＤＤＲＡＡＧＹＶＰＧＥＧＧＡＩＭＩＭＥＰＡＥＨＡＬＲＲＧＡＥＲＩＹＧＥＩＡＧＹＡＡＴＦＤＰＡＰＧＴＧＲＧＰＴＬＧＲＡＩＲＮＡＬＤＤＡＲＩＡＰＳＥＶＤＬＶＦＡＤＧＳＧＴＰＡＭＤＲＡＥＡＥＡＬＴＥＶＦＧＰＲＧＶＰＶＴＶＰＫＡＡＴＧＲＭＹＳＧＧＧＡＬＤＶＡＴＡＬＬＡＭＲＤＧＶＡＰＰＴＰＨＶＴＥＬＡＳＤＣＰＬＤＬＶＲＴＥＰＲＥＬＰＩＲＨＡＬＶＣＡＲＧＶＧＧＦＮＡＡＬＶＬＲＲＧＤＬＴＴＰＥＨ
配列番号１４ ＢｅｎＣ
ＭＳＴＬＳＶＥＫＬＬＥＩＭＲＡＴＱＧＥＳＡＤＴＳＧＬＴＥＤＶＬＤＫＰＦＴＤＬＮＶＤＳＬＡＶＬＥＶＶＴＱＩＱＤＥＦＫＬＲＩＰＤＳＡＭＥＧＭＥＴＰＲＱＶＬＤＹＶＮＥＲＬＥＥＡＡ
配列番号１５ Ｃ．ｓａｔｉｖａオリベトール酸シンターゼ
ＭＮＨＬＲＡＥＧＰＡＳＶＬＡＩＧＴＡＮＰＥＮＩＬＬＱＤＥＦＰＤＹＹＦＲＶＴＫＳＥＨＭＴＱＬＫＥＫＦＲＫＩＣＤＫＳＭＩＲＫＲＮＣＦＬＮＥＥＨＬＫＱＮＰＲＬＶＥＨＥＭＱＴＬＤＡＲＱＤＭＬＶＶＥＶＰＫＬＧＫＤＡＣＡＫＡＩＫＥＷＧＱＰＫＳＫＩＴＨＬＩＦＴＳＡＳＴＴＤＭＰＧＡＤＹＨＣＡＫＬＬＧＬＳＰＳＶＫＲＶＭＭＹＱＬＧＣＹＧＧＧＴＶＬＲＩＡＫＤＩＡＥＮＮＫＧＡＲＶＬＡＶＣＣＤＩＭＡＣＬＦＲＧＰＳＥＳＤＬＥＬＬＶＧＱＡＩＦＧＤＧＡＡＡＶＩＶＧＡＥＰＤＥＳＶＧＥＲＰＩＦＥＬＶＳＴＧＱＴＩＬＰＮＳＥＧＴＩＧＧＨＩＲＥＡＧＬＩＦＤＬＨＫＤＶＰＭＬＩＳＮＮＩＥＫＣＬＩＥＡＦＴＰＩＧＩＳＤＷＮＳＩＦＷＩＴＨＰＧＧＫＡＩＬＤＫＶＥＥＫＬＨＬＫＳＤＫＦＶＤＳＲＨＶＬＳＥＨＧＮＭＳＳＳＴＶＬＦＶＭＤＥＬＲＫＲＳＬＥＥＧＫＳＴＴＧＤＧＦＥＷＧＶＬＦＧＦＧＰＧＬＴＶＥＲＶＶＶＲＳＶＰＩＫＹ
配列番号１６ Ｃ．ｓａｔｉｖａオリベトール酸シクラーゼ
ＭＡＶＫＨＬＩＶＬＫＦＫＤＥＩＴＥＡＱＫＥＥＦＦＫＴＹＶＮＬＶＮＩＩＰＡＭＫＤＶＹＷＧＫＤＶＴＱＫＮＫＥＥＧＹＴＨＩＶＥＶＴＦＥＳＶＥＴＩＱＤＹＩＩＨＰＡＨＶＧＦＧＤＶＹＲＳＦＷＥＫＬＬＩＦＤＹＴＰＲＫ
配列番号１７ 配列番号１６と比較して、Ｎ末端メチオニン及びＣ末端リジンを欠くオリベトール酸シクラーゼポリペプチド配列
ＡＶＫＨＬＩＶＬＫＦＫＤＥＩＴＥＡＱＫＥＥＦＦＫＴＹＶＮＬＶＮＩＩＰＡＭＫＤＶＹＷＧＫＤＶＴＱＫＮＫＥＥＧＹＴＨＩＶＥＶＴＦＥＳＶＥＴＩＱＤＹＩＩＨＰＡＨＶＧＦＧＤＶＹＲＳＦＷＥＫＬＬＩＦＤＹＴＰＲ
配列番号１８ 配列番号１６と比較して、Ｎ末端メチオニン及びＣ末端に５つのアミノ酸配列ＹＴＰＲＫを欠くシクラーゼ、９５ａａの切断型バージョン
ＡＶＫＨＬＩＶＬＫＦＫＤＥＩＴＥＡＱＫＥＥＦＦＫＴＹＶＮＬＶＮＩＩＰＡＭＫＤＶＹＷＧＫＤＶＴＱＫＮＫＥＥＧＹＴＨＩＶＥＶＴＦＥＳＶＥＴＩＱＤＹＩＩＨＰＡＨＶＧＦＧＤＶＹＲＳＦＷＥＫＬＬＩＦＤ
配列番号１９ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡｔＨＳ１シクラーゼ
ＭＥＥＡＫＧＰＶＫＨＶＬＬＡＳＦＫＤＧＶＳＰＥＫＩＥＥＬＩＫＧＹＡＮＬＶＮＬＩＥＰＭＫＡＦＨＷＧＫＤＶＳＩＥＮＬＨＱＧＹＴＨＩＦＥＳＴＦＥＳＫＥＡＶＡＥＹＩＡＨＰＡＨＶＥＦＡＴＩＦＬＧＳＬＤＫＶＬＶＩＤＹＫＰＴＳＶＳＬ
配列番号２０ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来のＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインＡ２９９１２００
ＡＧＲＴＤＮＳＶＶＩＤＡＰＶＱＬＶＷＤＭＴＮＤＶＳＱＷＡＶＬＦＥＥＹＡＥＳＥＶＬＡＶＤＧＤＴＶＲＦＲＬＴＴＱＰＤＥＤＧＫＱＷＳＷＶＳＥＲＴＲＤＬＥＮＲＴＶＴＡＲＲＬＤＮＧＬＦＥＹＭＮＩＲＷＥＹＴＥＧＰＤＧＶＲＭＲＷＩＱＥＦＳＭＫＰＳＡＰＶＤＤＳＧＡＥＤＨＬＮＲＱＴＶＫＥＭＡＲＩＫＫＬＩＥＥＡ
配列番号２１ Ｃ．ｓａｔｉｖａ ＧＯＴ 切断配列（成熟タンパク質の８０～３９８）
ＭＳＤＱＩＥＧＳＰＨＨＥＳＤＮＳＩＡＴＫＩＬＮＦＧＨＴＣＷＫＬＱＲＰＹＶＶＫＧＭＩＳＩＡＣＧＬＦＧＲＥＬＦＮＮＲＨＬＦＳＷＧＬＭＷＫＡＦＦＡＬＶＰＩＬＳＦＮＦＦＡＡＩＭＮＱＩＹＤＶＤＩＤＲＩＮＫＰＤＬＰＬＶＳＧＥＭＳＩＥＴＡＷＩＬＳＩＩＶＡＬＴＧＬＩＶＴＩＫＬＫＳＡＰＬＦＶＦＩＹＩＦＧＩＦＡＧＦＡＹＳＶＰＰＩＲＷＫＱＹＰＦＴＮＦＬＩＴＩＳＳＨＶＧＬＡＦＴＳＹＳＡＴＴＳＡＬＧＬＰＦＶＷＲＰＡＦＳＦＩＩＡＦＭＴＶＭＧＭＴＩＡＦＡＫＤＩＳＤＩＥＧＤＡＫＹＧＶＳＴＶＡＴＫＬＧＡＲＮＭＴＦＶＶＳＧＶＬＬＬＮＹＬＶＳＩＳＩＧＩＩＷＰＱＶＦＫＳＮＩＭＩＬＳＨＡＩＬＡＦＣＬＩＦＱＴＲＥＬＡＬＡＮＹＡＳＡＰＳＲＱＦＦＥＦＩＷＬＬＹＹＡＥＹＦＶＹＶＦＩ
配列番号２２ ｈＳＯＤ－ＧＯＴ３（ｈＳＯＤ配列には下線が引かれている）
配列番号２３ ホップＣＢＤＡＳ相同ヌクレオチド配列ＨＬ．Ｔｅａ．ｖ１．０．Ｇ０１９５５１からのタンパク質配列翻訳
ＭＮＦＲＦＳＳＰＳＬＰＫＰＳＶＩＩＴＰＦＨＶＳＱＩＫＡＴＬＭＣＳＫＫＨＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＳＤＧＬＳＹＩＳＤＶＰＹＶＶＩＤＬＲＮＬＳＫＶＫＶＤＶＨＤＫＴＡＷＶＱＡＧＡＴＩＧＥＶＹＹＮＩＡＫＫＳＰＩＬＧＦＰＡＧＩＣＹＴＶＧＶＧＧＨＦＳＧＧＧＹＧＩＬＭＲＫＹＧＬＧＧＤＮＶＩＤＶＲＩＬＬＡＮＧＫＩＶＤＲＫＳＭＧＧＤＬＦＷＡＬＲＧＧＧＡＶＳＦＧＩＶＬＡＷＫＩＮＬＶＤＩＰＳＴＩＴＩＡＮＶＱＭＤＹＥＱＤＳＴＫＲＬＶＨＱＷＱＴＩＡＤＫＦＤＫＤＬＬＬＦＶＲＬＱＴＧＮＳＴＴＰＧＩＴＫＰＳＬＱＡＳＦＡＶＶＦＬＧＧＴＤＫＬＩＰＬＶＫＫＳＦＰＤＬＧＬＡＲＫＤＣＶＥＭＳＷＩＱＳＩＬＬＦＮＧＦＰＴＮＳＳＬＤＶＬＬＮＲＴＱＳＶＭＦＳＦＫＡＫＡＤＹＶＫＥＰＩＰＤＤＶＶＤＫＬＡＫＳＬＹＱＥＤＬＧＴＡＶＬＱＬＦＰＹＧＧＲＭＧＥＩＰＥＳＥＴＰＦＰＨＲＳＧＮＬＹＥＬＴＹＬＡＲＷＶＥＫＧＮＡＳＥＴＥＮＨＬＫＷＴＲＳＳＹＳＹＭＡＰＹＶＳＫＮＰＲＥＡＹＬＮＹＲＤＬＤＩＧＲＮＮＹＮＧＳＴＴＹＡＱＡＳＩＷＧＳＫＹＹＫＤＮＦＫＲＬＶＹＶＫＴＭＶＤＰＳＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＡＹＳＬ
配列番号２４ ホップにおけるヌクレオチド配列ＨＬ．Ｔｅａ．ｖ１．０．Ｇ０１９６３６．１ ＣＢＤＡＳ相同体からのタンパク質配列翻訳
ＭＫＬＲＤＳＳＩＦＰＳＶＩＶＦＭＩＩＩＳＬＳＳＴＴＫＡＹＡＴＬＨＤＹＱＹＴＫＴＮＦＩＱＣＬＳＨＨＳＳＳＮＳＳＨＮＮＤＩＴＫＶＶＹＳＴＴＮＳＳＹＦＳＶＬＮＦＴＩＩＮＰＲＦＳＳＰＳＴＰＫＰＬＦＩＩＴＰＬＨＥＳＨＶＱＡＡＶＶＣＳＲＫＨＧＶＱＩＲＩＲＳＧＧＨＤＹＥＧＬＳＹＶＳＤＶＰＦＶＶＩＤＬＩＮＨＲＳＩＴＩＤＶＥＫＲＴＡＷＶＱＡＧＡＴＬＧＥＬＹＹＥＩＮＶＫＳＫＴＬＡＦＰＡＧＡＣＰＴＩＧＶＧＧＨＩＳＧＧＧＹＧＳＩＦＲＫＹＧＬＡＡＤＮＶＩＤＡＱＩＶＤＶＥＧＲＶＬＤＲＥＴＭＧＥＤＬＦＷＡＩＲＧＧＧＧＡＳＦＧＶＩＬＡＷＫＶＲＬＶＰＶＰＥＴＶＴＶＦＡＩＮＲＮＬＥＨＮＶＴＫＬＶＨＲＷＱＹＩＡＤＫＬＨＫＤＬＬＬＡＶＲＦＱＴＶＫＶＮＳＴＱＥＧＳＹＫＫＥＬＱＡＴＦＩＳＶＦＬＧＲＶＤＧＬＬＤＬＭＧＫＲＦＰＥＬＧＬＡＲＥＤＣＴＥＭＳＷＩＥＳＡＬＦＶＡＧＬＰＲＥＱＳＰＥＩＬＬＤＲＴＰＱＳＲＬＳＦＫＡＫＳＤＹＶＫＥＰＩＰＥＫＧＬＥＧＩＷＥＲＬＹＥＥＥＩＧＲＧＶＶＩＭＳＰＹＧＧＫＭＳＥＩＳＥＳＥＬＰＦＧＨＲＡＧＮＬＹＫＩＱＹＬＩＹＷＥＥＥＧＮＡＴＶＭＥＫＨＩＳＷＩＲＲＬＹＹＹＭＴＱＦＶＳＫＮＰＲＳＡＹＩＮＹＲＤＬＤＩＧＴＮＳＮＮＧＴＡＳＹＡＱＡＳＩＷＧＶＫＹＦＧＨＮＮＦＮＲＬＶＨＶＫＴＩＶＤＰＴＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＲＩＥＹＳＳ
配列番号２５ ホップにおけるヌクレオチド配列ＨＬ．Ｔｅａ．ｖ１．０．Ｇ０３７７９３．１ ＣＢＤＡＳ相同体からのタンパク質配列翻訳
ＭＫＨＳＶＦＳＹＷＦＬＣＫＩＶＮＩＳＬＬＳＦＳＩＲＳＴＲＡＤＰＨＡＤＦＬＱＣＦＳＱＹＩＳＮＳＴＴＩＡＫＬＩＹＴＰＮＤＰＬＹＩＳＩＬＮＳＴＩＱＮＮＲＦＳＳＰＳＴＰＫＰＬＩＩＩＴＰＬＮＳＦＨＶＱＡＳＩＬＣＳＲＫＹＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＦＥＧＶＳＹＶＳＥＶＰＦＶＩＶＤＭＲＮＬＲＳＩＴＩＤＶＤＮＫＴＡＷＶＤＶＧＡＴＬＧＥＬＹＹＲＩＡＥＫＮＥＮＬＳＦＰＡＧＹＣＨＴＶＧＶＧＧＨＦＳＧＧＧＹＧＡＬＭＲＫＹＧＬＡＡＤＮＶＩＤＡＨＬＶＮＶＤＧＥＶＬＤＲＱＳＭＧＥＤＬＦＷＡＩＲＧＧＧＧＡＳＦＧＩＩＬＡＷＫＩＲＬＶＰＶＰＳＫＶＴＩＶＳＩＮＫＮＬＥＩＮＥＴＶＫＬＹＮＫＷＱＮＩＡＨＫＦＤＫＤＬＬＩＦＶＲＦＴＴＭＮＳＴＤＧＱＧＫＮＫＴＡＩＬＴＳＦＹＳＩＦＦＧＧＭＤＧＬＬＡＬＭＥＫＳＦＰＥＬＤＶＫＲＫＤＣＦＥＡＳＷＩＥＭＩＦＹＦＮＧＦＳＳＧＤＫＬＥＶＬＬＧＲＴＮＥＥＫＧＦＦＫＡＫＬＤＹＶＲＫＰＩＰＥＴＶＩＶＫＬＬＥＫＬＹＮＥＤＶＧＬＧＬＩＱＭＹＰＹＧＧＫＭＤＥＩＰＥＳＡＩＰＦＰＨＲＶＧＦＩＹＫＩＬＹＬＳＱＷＥＫＥＥＥＧＥＲＨＬＮＷＶＲＳＶＹＮＹＭＴＰＦＶＳＫＳＰＲＡＳＹＬＮＹＲＤＦＤＬＧＴＮＮＫＮＧＰＴＳＹＧＱＡＳＩＷＧＫＫＹＦＤＫＮＦＫＲＬＶＨＶＫＴＫＶＤＰＴＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＳＶＲＧＬ
配列番号２６ プレプロアルファ－ＣＢＣＡＳタンパク質配列（プレプロ配列は下線が引かれている。成熟ポリペプチド配列の開始を太字で示す）
配列番号２７ プレプロアルファ－ＣＢＣＡＳ－ＨＤＥＬ（プレプロ配列及びＨＤＥＬ配列には下線が引かれている。）
配列番号２８ Ｐｄｉ１－ＣＢＣＡＳ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｐｄｉ１シグナル配列に下線が引かれている）
配列番号２９ ＥａｓＥ－ＣＢＣＡＳ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ由来のベルベリン架橋関連ｅａｓＥシグナル配列に下線が引かれている。）
配列番号３０ プレプロアルファ－ＣＢＣＡＳ（配列番号３２のアミノ酸８７～５４５。プレプロシーケンスには下線が引かれている。）
配列番号３１ ＣＢＣＡＳ（メチオニン開始コドンを有する、配列番号３２のアミノ酸８７～５４５）
ＭＰＳＮＶＳＨＩＱＡＳＩＬＣＳＫＫＶＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＡＥＧＬＳＹＩＳＱＶＰＦＡＩＶＤＬＲＮＭＨＴＶＫＶＤＩＨＳＱＴＡＷＶＥＡＧＡＴＬＧＥＶＹＹＷＩＮＥＭＮＥＮＦＳＦＰＧＧＹＣＰＴＶＧＶＧＧＨＦＳＧＧＧＹＧＡＬＭＲＮＹＧＬＡＡＤＮＩＩＤＡＨＬＶＮＶＤＧＫＶＬＤＲＫＳＭＧＥＤＬＦＷＡＩＲＧＧＧＧＥＮＦＧＩＩＡＡＷＫＩＫＬＶＶＶＰＳＫＡＴＩＦＳＶＫＫＮＭＥＩＨＧＬＶＫＬＦＮＫＷＱＮＩＡＹＫＹＤＫＤＬＭＬＴＴＨＦＲＴＲＮＩＴＤＮＨＧＫＮＫＴＴＶＨＧＹＦＳＳＩＦＬＧＧＶＤＳＬＶＤＬＭＮＫＳＦＰＥＬＧＩＫＫＴＤＣＫＥＬＳＷＩＤＴＴＩＦＹＳＧＶＶＮＹＮＴＡＮＦＫＫＥＩＬＬＤＲＳＡＧＫＫＴＡＦＳＩＫＬＤＹＶＫＫＬＩＰＥＴＡＭＶＫＩＬＥＫＬＹＥＥＥＶＧＶＧＭＹＶＬＹＰＹＧＧＩＭＤＥＩＳＥＳＡＩＰＦＰＨＲＡＧＩＭＹＥＬＷＹＴＡＴＷＥＫＱＥＤＮＥＫＨＩＮＷＶＲＳＶＹＮＦＴＴＰＹＶＳＱＮＰＲＬＡＹＬＮＹＲＤＬＤＬＧＫＴＮＰＥＳＰＮＮＹＴＱＡＲＩＷＧＥＫＹＦＧＫＮＦＮＲＬＶＫＶＫＴＫＡＤＰＮＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＰＰＲＨＨ＊
配列番号３２ 完全長ＣＢＣＡＳシンターゼ
ＭＮＣＳＴＦＳＦＷＦＶＣＫＩＩＦＦＦＬＳＦＮＩＱＩＳＩＡＮＰＱＥＮＦＬＫＣＦＳＥＹＩＰＮＮＰＡＮＰＫＦＩＹＴＱＨＤＱＬＹＭＳＶＬＮＳＴＩＱＮＬＲＦＴＳＤＴＴＰＫＰＬＶＩＶＴＰＳＮＶＳＨＩＱＡＳＩＬＣＳＫＫＶＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＡＥＧＬＳＹＩＳＱＶＰＦＡＩＶＤＬＲＮＭＨＴＶＫＶＤＩＨＳＱＴＡＷＶＥＡＧＡＴＬＧＥＶＹＹＷＩＮＥＭＮＥＮＦＳＦＰＧＧＹＣＰＴＶＧＶＧＧＨＦＳＧＧＧＹＧＡＬＭＲＮＹＧＬＡＡＤＮＩＩＤＡＨＬＶＮＶＤＧＫＶＬＤＲＫＳＭＧＥＤＬＦＷＡＩＲＧＧＧＧＥＮＦＧＩＩＡＡＷＫＩＫＬＶＶＶＰＳＫＡＴＩＦＳＶＫＫＮＭＥＩＨＧＬＶＫＬＦＮＫＷＱＮＩＡＹＫＹＤＫＤＬＭＬＴＴＨＦＲＴＲＮＩＴＤＮＨＧＫＮＫＴＴＶＨＧＹＦＳＳＩＦＬＧＧＶＤＳＬＶＤＬＭＮＫＳＦＰＥＬＧＩＫＫＴＤＣＫＥＬＳＷＩＤＴＴＩＦＹＳＧＶＶＮＹＮＴＡＮＦＫＫＥＩＬＬＤＲＳＡＧＫＫＴＡＦＳＩＫＬＤＹＶＫＫＬＩＰＥＴＡＭＶＫＩＬＥＫＬＹＥＥＥＶＧＶＧＭＹＶＬＹＰＹＧＧＩＭＤＥＩＳＥＳＡＩＰＦＰＨＲＡＧＩＭＹＥＬＷＹＴＡＴＷＥＫＱＥＤＮＥＫＨＩＮＷＶＲＳＶＹＮＦＴＴＰＹＶＳＱＮＰＲＬＡＹＬＮＹＲＤＬＤＬＧＫＴＮＰＥＳＰＮＮＹＴＱＡＲＩＷＧＥＫＹＦＧＫＮＦＮＲＬＶＫＶＫＴＫＡＤＰＮＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＰＰＲＨＨ
配列番号３３ ｈＳＯＤ－ＴＫＳ（ｈＳＯＤ配列に下線が引かれている）

Claims (35)

  1. 脂肪族カルボン酸をアシルＣｏＡチオエステルに変換するＣｏＡ－トランスフェラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞であって、前記改変組換え宿主細胞が、カンナビノイド生成物を産生するように操作される、前記改変組換え宿主細胞。
  2. 前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼが、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチルＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の改変組換え宿主細胞。
  3. ＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞であって、
    前記ＣｏＡ－リガーゼが、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ、及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択され、
    前記改変組換え宿主細胞が、カンナビノイド生成物を産生するように操作される、前記改変組換え宿主細胞。
  4. 前記改変組換え宿主細胞が、
    ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
    ２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２に記載の改変組換え宿主細胞。
  5. 前記ＰＫＳが、Ｉ型ＰＫＳ、ＩＩ型ＰＫＳ、またはＩＩＩ型ＰＫＳである、請求項４に記載の改変組換え宿主細胞。
  6. 前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼが、オリベトール酸（ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ）シクラーゼ、ＡｔＨＳ１ポリペプチド、またはＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインである、請求項４に記載の改変組換え宿主細胞。
  7. 前記改変組換え宿主細胞が、プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の改変組換え宿主細胞。
  8. 前記プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸（ｏｌｉｖｅｔｏｌａｔｅ）ゲラニルトランスフェラーゼである、請求項７に記載の改変組換え宿主細胞。
  9. 前記第４のポリヌクレオチドの複数のコピーが、前記宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項７に記載の改変組換え宿主細胞。
  10. 前記外因性ポリヌクレオチドのうちの１つ以上の発現が、ＡＤＨ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＴＰＩプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、またはＦＢＡ１プロモーターによって駆動される、請求項１に記載の改変組換え宿主細胞。
  11. 前記外因性ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、同じ自律複製発現ベクターに存在し、マルチシストロニックｍＲＮＡとして発現する、請求項１に記載の改変組換え宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞が、１つ以上のメバロン酸経路酵素を過剰発現するように遺伝子改変される、請求項１に記載の改変組換え宿主細胞。
  13. 前記メバロン酸経路酵素が、ｅｒｇ１０、ｅｒｇ１３、ｔｈｍｇｒ、ｅｒｇ１２、ｅｒｇ８、ｍｖｄ１、ｉｄｉ１、ｅｒｇ２０ Ｆ９６ＷＮ１２７Ｗ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＥ、及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＳからなる群から選択される、請求項１２に記載の改変組換え宿主細胞。
  14. 前記改変組換え宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される細胞である、請求項１に記載の改変組換え宿主細胞。
  15. カンナビノイド生成物を製造する方法であって、
    外因性ポリヌクレオチドによってコードされたＣｏＡ－トランスフェラーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが生成される条件下で、脂肪族カルボン酸を前記アシルＣｏＡチオエステルに変換する、前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む、改変組換え宿主細胞を培養することと、
    前記アシルＣｏＡチオエステルを、前記カンナビノイド生成物に変換することと、を含む、前記方法。
  16. 前記ＣｏＡ－トランスフェラーゼが、Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓブチリル－ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアセチル－ＣｏＡ：アセトアセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼ、及びＣ．ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６プロピオン酸ＣｏＡ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. カンナビノイド生成物を製造する方法であって、
    外因性ポリヌクレオチドによってコードされたＣｏＡ－リガーゼが発現され、アシルＣｏＡチオエステルが産生される条件下で、脂肪族カルボン酸を前記アシルＣｏＡチオエステルに変換する、前記ＣｏＡ－リガーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含む改変組換え宿主細胞を培養することと、
    前記アシルＣｏＡチオエステルを、前記カンナビノイド生成物に変換することと、を含み、
    前記ＣｏＡ－リガーゼが、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｍｉｇ中鎖アシル－ＣｏＡ－リガーゼ及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴ４ｇ０５１６０クマル酸アシル－ＣｏＡ－リガーゼからなる群から選択される、前記方法。
  18. 前記脂肪族カルボン酸が、Ｃ２～５カルボン酸である、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記脂肪族カルボン酸が、Ｃ６～２０カルボン酸である、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記脂肪族カルボン酸が、炭素－炭素二重結合、ヒドロキシ基、ハロゲン、重水素、トリチウム、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記改変組換え宿主細胞が、
    前記アシルＣｏＡチオエステル及びマロニルＣｏＡからポリケチドを産生する、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
    ２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、
    前記改変組換え宿主細胞を培養することが、前記第２及び第３の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる生成物を発現させ、前記アシルＣｏＡチオエステルを２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールに変換することを含み、
    前記アシルＣｏＡチオエステルを前記カンナビノイド生成物に変換することが、前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを前記カンナビノイド生成物に変換することを含む、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸が、ジバリニン酸である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＰＫＳが、Ｉ型ＰＫＳ、ＩＩ型ＰＫＳ、またはＩＩＩ型ＰＫＳである、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸シクラーゼが、オリベトール酸シクラーゼ、ＡｔＨＳ１ポリペプチド、またはＢｅｎＨポリペプチドのＮ末端ドメインである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを前記カンナビノイド生成物に変換することが、プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸またはプレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することを含む、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記改変組換え宿主細胞が、プレニルトランスフェラーゼをコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含み、前記改変組換え宿主細胞を培養することが、前記第４の外因性ポリヌクレオチドによってコードされた前記プレニルトランスフェラーゼを発現させ、前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記プレニルトランスフェラーゼが、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第４のポリヌクレオチドの複数のコピーが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを生成することが、
    １）前記２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールと、２）ゲラニオール、活性化ゲラニオール、またはシトラールと、を含む反応混合物を形成することと、
    前記反応混合物を、前記プレニル化２－アルキル－４，６－ジヒドロキシ安息香酸または前記プレニル化５－アルキル－ベンゼン－１，３－ジオールを形成するのに十分な条件下で維持することと、を含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記反応混合物が、ジアミンをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記外因性ポリヌクレオチドのうちの１つ以上の発現が、ＡＤＨ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＹＫプロモーター、ＴＰＩプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、またはＦＢＡ１プロモーターによって駆動される、請求項１５に記載の方法。
  32. 前記外因性ポリヌクレオチドの少なくとも２つが、同じ自律複製発現ベクターに存在し、マルチシストロニックｍＲＮＡとして発現される、請求項１５に記載の方法。
  33. 前記宿主細胞が、１つ以上のメバロン酸経路酵素を過剰発現するように遺伝子改変される、請求項１５に記載の方法。
  34. 前記メバロン酸経路酵素が、ｅｒｇ１０、ｅｒｇ１３、ｔｈｍｇｒ、ｅｒｇ１２、ｅｒｇ８、ｍｖｄ１、ｉｄｉ１、ｅｒｇ２０ Ｆ９６ＷＮ１２７Ｗ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＥ、及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｍｖａＳからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記改変組換え宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群から選択される細胞である、請求項１５に記載の方法。
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