JP2024503725A - 小分子調節遺伝子発現システム - Google Patents

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Abstract

二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であって、ＤＮＡ結合ドメインが、応答要素に特異的に結合する、融合タンパク質を提供する。

Description

関連出願
２０２１年１月１５日出願の米国仮特許出願第６３／１３７，８０３号、２０２１年１月２８日出願の米同第６３／１４３，０２６号、２０２１年１月２９日出願の同第６３／１４３，７３５号、及び２０２１年３月２３日出願の同第６３／１６４，８６６号。先行出願の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２２年１月１７日に作成されたＡＳＣＩＩファイルは、０１６－ＴＮＰ０２２ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと命名され、約５３，０００キロバイトのサイズである。
開示の分野
本開示は、小分子制御遺伝子発現システム、並びに小分子、遺伝子療法、タンパク質設計、及び細胞シグナル伝達の分野に関する。発現システムは、小分子によって媒介される融合タンパク質の二量体化を介して調節要素を局在化させ、それによって目的の遺伝子の発現を媒介する。
背景
翻訳後制御システムは、小分子を外因性の入力として使用する特定の時期での調節を容易にするように設計されている。そのようなシステムは、様々なインビトロ、エクスビボ、及びインビボ用途に有用である。化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）は、小分子を使用して目的の遺伝子の発現の翻訳後制御をもたらすことができる１つの機序である。これらのシステムは、小分子を利用してタンパク質の二量体化を誘導し、それによって転写に必要な構成成分を局在化させる。そのようなシステムを設計する場合、目的の遺伝子のバックグラウンド発現を低減することが望ましい。本開示は、バックグラウンド発現が低減した改変された翻訳後制御システムを提供する。本開示はまた、とりわけ、パッケージング、形質導入、プロモーター設計、及びベクター設計の改善を含む、様々な他の改善を提供する。
概要
本開示は、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であって、ＤＮＡ結合ドメインが、応答要素に特異的に結合する、融合タンパク質を提供する。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むものを含め、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガラクトース活性化転写因子４（Ｇａｌ４）配列、ジンクフィンガー１（ＺＦ１）配列、ジンクフィンガー２（ＺＦ２）配列、ジンクフィンガー３（ＺＦ３）配列、ジンクフィンガーＨＩＶ２（ＺＦＨＩＶ２）配列、ジンクフィンガーホメオドメイン１（ＺＦＨＤ１）配列、触媒不活性型Ｃａｓ１２ａ（ｄＣａｓ１２ａ）配列、触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）配列、触媒不活性型ＣａｓＰｈｉ（ｄＣａｓＰｈｉ）配列、及びＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（ＴＡＬＥ）配列のうちの１つ以上に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇａｌ４（配列番号５６）、ＺＦ１（配列番号５７）、ＺＦ２（配列番号５８）、ＺＦ３（配列番号５９）、ＺＦＨＩＶ２（配列番号６０）、及びＺＦＨＤ１（配列番号１６５）のうちの１つ以上の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むものを含め、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ１２ａ配列（配列番号１６６）に由来する配列を含み、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６６と比較して、以下の位置：１７６、１９２、３８２、５４８、６０４、６０７、７８０、７８３、９０８、９５１、９５５、９５８、９９３、１２２６、１２３８、及び１２６３のうちの１つ以上における置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６６と比較して、以下の置換：Ｒ１７６Ａ、Ｒ１９２Ａ、Ｗ３８２Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ７８０Ａ、Ｇ７８３Ｐ、Ｄ９０８Ｐ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ９５５Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｅ９９３Ｐ、Ｒ１２２６Ａ、Ｄ１２３８Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むものを含め、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）に由来する配列を含み、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６７と比較して、以下の位置：１０、１５、６６、７０、７４、７８、１６５、４７５～４７７、７６２、８４０、８５４、８６３、９８２、９８３、９８６、１１２５～１１２７、１１３２、及び１３３３～１３３５のうちの１つ以上における置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６７と比較して、以下の置換：Ｄ１０Ａ、Ｓ１５Ａ、Ｒ６６Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ１６５Ａ、４７５～４７７のＰＷＮ－ＡＡＡ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ｄ９８６Ａ、１１２５～１１２７のＤＷＤ－ＡＡＡ、Ｇ１１３２Ｃ、Ｒ１３３３Ａ、Ｒ１３３５Ａ、及び１３３３～１３３５のＲＫＲ－ＡＫＡのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６７と比較して、以下の置換：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）に由来する配列を含み、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６７と比較して、以下の欠失：９７～１５０、１７５～３０７、３１２～４０９、及び１０９９～１３６８のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離される又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）は、別の種から単離される又はそれに由来し、置換又は欠失が、Ｃａｓ９配列中の相同な位置で生じる。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むものを含め、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣａｓＰｈｉ配列（配列番号１６８）に由来する配列を含み、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６８と比較して、以下の位置：３３、１２６、１２７、１３０、３６７、３７１、３７３、３９４、及び６０６のうちの１つ以上における置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６８と比較して、以下の置換：Ｋ３３Ａ、Ｖ１２６Ａ、Ｑ１２７Ａ、Ｎ１３０Ａ、Ｖ１２６Ａ／Ｑ１２７Ａ／Ｎ１３０Ａ、Ｋ３６７Ａ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７３Ａ、Ｋ３６７Ａ／Ｋ３７１Ａ／Ｋ３７３Ａ、Ｄ３９４Ａ、及びＥ６０６Ｑのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣａｓＰｈｉ配列（配列番号１６８）に由来する配列を含み、ＤＮＡ結合ドメイン配列は、配列番号１６８と比較して、以下の欠失：１～４５のうちの１つ以上を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むものを含め、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ配列（配列番号１６９）に由来する配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、細胞が、応答要素を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、内因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも１回の反復を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、細胞核が、応答要素を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、内因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも１回の反復を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、染色体が、応答要素を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、内因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも１回の反復を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、応答要素は、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）、及び１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、（ａ）ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇａｌ４ＤＢＤ（配列番号５６）を含み、かつ応答要素は、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）を含む、又は（ｂ）ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦ１（配列番号５７）を含み、かつ応答要素は、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）を含む、又は（ｃ）ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦ２（配列番号５８）を含み、かつ応答要素は、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）を含む、又は（ｄ）ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦ３（配列番号５９）を含み、かつ応答要素は、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、及び１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）のうちの１つ以上を含む、又は（ｅ）ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＨＩＶ２（配列番号６０）を含み、かつ応答要素は、１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、及び二量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、アミノ酸配列、及びポリマーのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ａ）ＧＧＧＧＳの配列を含むか、又は（ｂ）２～２０アミノ酸の長さを含むか、又は（ｃ）グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、オリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化ドメインは、配列番号１、２、３、４、又は５の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＮＳ３ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３ａポリペプチドは、配列番号６、７、８、９、６６、１３３、又は１３４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３ａポリペプチドは、配列番号６５、６８～７３、又は１５３の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＤＮＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＣＲポリペプチドは、配列番号１１～４６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＣＲポリペプチドは、配列番号５５の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＧＮＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＮＣＲポリペプチドは、配列番号４７～５０の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、分解ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、分解ドメインは、配列番号１５６又は１６０の配列を含む。
本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、切断可能なペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、Ｐ２Ａ配列又はＴ２Ａ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ａ配列は、配列番号７４の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ配列は、配列番号７５の配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号１３５又は１３６の配列を含む。本開示全体を通して使用される場合、「分離要素」及び「切断可能ペプチド」という用語は、互換的に使用され得る。
本開示は、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
本開示は、二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を提供し、調節ドメインは、１つ以上の標的配列の転写活性又はエピジェネティック活性を調節することができる。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、調節ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、転写を活性化する。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、転写を不活性化する。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、転写を阻止する。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、１つ以上の標的配列を含むクロマチンを再構成する。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）配列、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）配列、ｐ６５配列、最小ｐ６５（ｐ６５ｍｉｎｉ）配列、ｐ６５ｍｉｎｉ－ヒートショック因子タンパク質１（ＨＳＦ１）（ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１）配列、ＶＰ１６配列、ＶＰ６４配列、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ配列、ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）配列、及び最小ＶＰＲ（ＶＰＲｍｉｎｉ）配列のうちの１つ以上に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、調節ドメインは、ＫＲＡＢ配列（配列番号１５５）、ＭｅＣＰ２配列（配列番号１７０又は１７１）、ｐ６５配列（配列番号１７２～１７５）、ｐ６５ｍｉｎｉ配列（配列番号６１）、ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１配列（配列番号６２）、ＶＰ１６配列（配列番号１７６）、ＶＰ６４配列（配列番号１７７）、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ配列（配列番号６３）、及びＶＰＲｍｉｎｉ配列（配列番号６４）のうちの１つ以上の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、二量体化ドメイン、リンカー、及び調節ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、アミノ酸配列、及びポリマーのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ａ）ＧＧＧＧＳの配列を含むか、又は（ｂ）２～２０アミノ酸の長さを含むか、又は（ｃ）グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、オリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化ドメインは、配列番号１、２、３、４、又は５の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＮＳ３ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３ａポリペプチドは、配列番号６、７、８、９、６６、１３３、又は１３４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＳ３ａポリペプチドは、配列番号６７の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＤＮＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＣＲポリペプチドは、配列番号１１～４６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＣＲポリペプチドは、配列番号５１～５４又は１６２の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、ＧＮＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＮＣＲポリペプチドは、配列番号４７～５０の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、分解ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、分解ドメインは、配列番号１６０の配列を含む。
二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、１つ以上の標的配列は、表Ａに提供されるタンパク質又はその任意のアイソフォームをコードする配列から単離された又は前記配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的配列は、表Ａに提供されるタンパク質をコードする配列から単離された若しくは前記配列に由来する配列、又は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列、又は少なくともそれらの間の任意の割合の同一性を有する配列を含む。
本開示は、二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
本開示は、（ａ）二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む、本開示の第１の融合タンパク質であって、ＤＮＡ結合ドメインが応答要素に特異的に結合する、第１の融合タンパク質と、（ｂ）二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む、本開示の第２の融合タンパク質であって、調節ドメインが１つ以上の標的配列の転写活性又はエピジェネティック活性を調節することができる、第２の融合タンパク質とを含む、組成物を提供する。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、小分子を更に含み、小分子の存在下で、第１の融合タンパク質の二量体化ドメインと第２の融合タンパク質の二量体化ドメインとが、複合体を形成することができる。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、標的組成物を更に含み、標的組成物は、プロモーターと１つ以上の標的配列とを含む核酸配列を含み、プロモーターは、１つ以上の標的配列の発現を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、標的組成物は、第１の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合することができる応答要素を更に含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、２つ以上の応答要素を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む。いくつかの実施形態では、応答要素は、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）、及び１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質のいずれかは、本開示のＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質のいずれかは、本開示のＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質のいずれかは、本開示のＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、（ａ）第１の融合タンパク質は、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ第２の融合タンパク質は、ＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、又は（ｂ）第２の融合タンパク質は、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ第１の融合タンパク質は、ＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、小分子は、ダノプレビルを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、小分子は、ダノプレビルを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、（ａ）第１の融合タンパク質は、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ第２の融合タンパク質は、ＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、又は（ｂ）第２の融合タンパク質は、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ第１の融合タンパク質は、ＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、小分子は、グラゾプレビルを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、小分子は、グラゾプレビルを含む。
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、１つ以上の標的配列は、表Ａの遺伝子をコードする配列から単離された又は前記配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的配列は、表Ａに提供されるタンパク質をコードする配列から単離された又は前記配列に由来する配列、又は少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列、又は少なくともそれらの間の任意の割合の同一性を有する配列を含む。
本開示の核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号１６３の配列を含む。
本開示の核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び翻訳後調節要素（ＰＲＥ）のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター（配列番号７７）、ヒトβグロビンプロモーター（ｈｕＢＧ）（配列番号７８）、ｍｉｎＩＬ２プロモーター（配列番号７９）、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーター（配列番号８０）、及びＴＲＥ３Ｇプロモーター（配列番号８１）から単離された又はそれらに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ＭＮＤプロモーター（配列番号８２）、ｈＰＧＫプロモーター（配列番号８３）、ＣＭＶプロモーター（配列番号１３７）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１３８）、ＳＦＦＶプロモーター（配列番号１３９）、ＥＦ１αプロモーター（配列番号１４０）、ＵＢＣプロモーター（配列番号１４１）、及びＣＤ４３プロモーター（配列番号１４２）から単離された又はそれらに由来する配列を含む。
本開示は、本開示の核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の核酸配列を含み、任意選択的に、核酸配列は、二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む本開示の融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の核酸配列を含み、任意選択的に、核酸配列は、二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む本開示の融合タンパク質をコードし、調節ドメインは、１つ以上の標的配列の転写活性又はエピジェネティック活性を調節することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む本開示の融合タンパク質をコードする本開示の核酸配列と、（ｂ）二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインをコードする本開示の核酸配列とを含み、調節ドメインは、１つ以上の標的配列の転写活性又はエピジェネティック活性を調節することができる。
本開示のベクターのいくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞中で核酸の発現を引き起こすことができる発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プラスミドを含む。
本開示のベクターのいくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞に核酸を導入することができる送達ベクターを含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、リポソーム、ミセル、ポリマーソーム、及びナノ粒子のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスゲノムから単離された又はウイルスゲノムに由来する１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損である。
本開示は、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、又は本開示のベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄前駆細胞、又はリンパ球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄前駆細胞は、マスト細胞、骨髄芽球、赤血球、又は血小板である。いくつかの実施形態では、リンパ球前駆細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、又はＴリンパ球（Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞又はメモリーＢ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞（Ｔ細胞）、ＭＡＩＴ Ｔ細胞、メモリーＣＤ４ Ｔ細胞、メモリーＣＤ８ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞、又は調節性Ｔ細胞（Ｔ－ｒｅｇ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボ又はインビトロにある。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボにある。
本開示は、本開示の細胞、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、又は本開示のベクターを含む組成物を提供する。
本開示は、本開示の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のベクター、本開示の細胞、本開示の組成物、又は本開示の医薬組成物の使用を提供する。
疾患又は障害の治療のための、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のベクター、本開示の細胞、本開示の組成物、又は本開示の医薬組成物の使用。
本開示の使用のいくつかの実施形態では、疾患又は障害は、自己免疫性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、免疫不全疾患又は障害、虚血性疾患又は障害、血液疾患又は障害、骨疾患又は障害、神経疾患又は障害、心疾患又は障害、血管疾患又は障害、代謝疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、消化器系疾患又は障害、ミトコンドリア疾患又は障害、筋肉疾患又は障害、肝臓疾患又は障害、腎臓疾患又は障害、聴覚疾患又は障害、眼疾患又は障害、及び増殖性疾患又は障害のうちの１つ以上を含む。
本開示の使用のいくつかの実施形態では、疾患又は障害は、がんを含む。本開示の使用のいくつかの実施形態では、がんは、成人における急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎がん、肛門がん、基底及び扁平上皮細胞皮膚がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、成人における脳及び脊髄腫瘍、小児における脳及び脊髄腫瘍、乳がん、男性における乳がん、青年期のがん、小児のがん、若年成人のがん、原発不明がん、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼がん（眼内黒色腫）、胆嚢がん、消化管神経内分泌（カルチノイド）腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び下咽頭がん、白血病、小児の白血病、肝臓がん、肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、黒色腫皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔（口）及び口腔咽頭（喉）がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、原発性マクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍のうちの１つを含む。本開示の使用のいくつかの実施形態では、疾患又は障害は、がんであり、１つ以上の標的遺伝子は、表４に提供される遺伝子のうちの１つ以上を含む。
本開示の使用のいくつかの実施形態では、疾患又は障害は、感染症を含む、又は感染性疾患に起因する疾患若しくは障害を含む。
本開示の使用のいくつかの実施形態では、疾患又は障害は、遺伝子疾患又は障害を含む。
いくつかの実施形態では、有効量の融合タンパク質、核酸、ベクター若しくは細胞、組成物、又は医薬組成物を対象に投与することは、疾患又は障害の兆候又は症状の重症度の低下をもたらし、それによって疾患又は障害を治療する。
いくつかの実施形態では、有効量の融合タンパク質、核酸、ベクター若しくは細胞、組成物、又は医薬組成物を対象に投与することは、疾患又は障害の兆候又は症状の発症又は再発の遅延又は阻害をもたらし、それによって疾患又は障害を予防する。
疾患又は障害は、例えば、自己免疫性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、免疫不全疾患又は障害、虚血性疾患又は障害、血液疾患又は障害、骨疾患又は障害、神経疾患又は障害、心疾患又は障害、血管疾患又は障害、代謝疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、消化器系疾患又は障害、ミトコンドリア疾患又は障害、筋肉疾患又は障害、肝臓疾患又は障害、腎臓疾患又は障害、聴覚疾患又は障害、眼疾患又は障害、及び増殖性疾患又は障害のうちの１つ以上を含み得る。
疾患又は障害は、例えば、がんを含み得る。
疾患又は障害は、例えば、感染症を含み得る、又は感染性疾患に起因する疾患若しくは障害を含み得る。
疾患又は障害は、例えば、遺伝子疾患又は障害を含み得る。
本開示は、（ａ）（ｉ）１つ以上の目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列、又は（ｉｉ）１つ以上の目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列を含む、第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）１つ以上の目的の遺伝子のプロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインに連結された第１の二量体化ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）第２の二量体化ポリペプチドに連結された転写又はエピジェネティック調節ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、第２のポリヌクレオチドとを含む、ポリヌクレオチドセットを提供し、第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの相互作用が小分子の存在によって媒介されるように選択される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、１つ以上の目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、１つ以上の目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプロモーター配列をコードするポリヌクレオチド構成成分に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの構成的プロモーター配列をコードするポリヌクレオチド構成成分に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、第１又は第２の二量体化ポリペプチドは、ＮＳ３ａを含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２の二量体化ポリペプチドは、ＤＮＣＲ２及びＧＮＣＲ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１又は第２の二量体化ポリペプチドは、ＮＳ３ａを含み、第１又は第２の二量体化ポリペプチドの他方は、ＤＮＣＲ２及びＧＮＣＲ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１又は第２の二量体化ポリペプチドは、ＤＮＣＲ２＿１～ＤＮＣＲ２＿３４、ＤＮＣＲ２－３ｒｅｐ、ＧＮＣＲ１－３ｒｅｐ、Ｇ３３、及びＧ３８からなる群から選択される。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、細胞中での目的の１つ以上の遺伝子の発現は、細胞への小分子の投与に対してタイトレーション可能である。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボにおけるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボにおけるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、小分子は、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの結合を媒介する。いくつかの実施形態では、小分子は、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの結合を破壊する。いくつかの実施形態では、小分子は、ダノプレビル及びグラゾプレビル、並びにそれらの類似体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の小分子は、第１の小分子を競合排除することによって、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの結合を破壊する。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、ベクターは、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、第１のベクターは、第１のポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、構成的プロモーターを欠く。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、形質導入マーカーを欠く。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びトランスポゾンベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、相同組換え修復ベクターを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、染色体は、第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドを含む。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の融合を防止するポリヌクレオチド配列を含む分離要素によって分離される。いくつかの実施形態では、分離要素は、リボソームスキッピング配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、分離要素は、少なくとも２つのリボソームスキッピング配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、分離要素は、Ｐ２ａ及び／又はＴ２ａを含むポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、分離要素は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む：Ｐ２ａ、Ｔ２ａ、Ｔ２ａ－ＲＦＰ－Ｐ２ａ、Ｐ２ａ－Ｔ２ａ、Ｔ２ａ－Ｐ２ａ、及びＩＲＥＳ。いくつかの実施形態では、分離要素は、第２の構成的プロモーターを含むポリヌクレオチド配列を含む。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、構成的プロモーター配列は、以下からなる群から選択される：ＭＮＤ、ｈＰＧＫ、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＳＦＦＶ、ＥＦ１α、ＵＢＣ、及びＣＤ４３。いくつかの実施形態では、構成的プロモーター配列は、ｈＰＧＫプロモーターを含む。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、転写活性化ドメインは、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ｐ６５、ｐ６５ｍｉｎｉ、ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ、ＶＰＲ、及びＶＰＲｍｉｎｉからなる群から選択される。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｄＣａｓ１２ａ、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓＰｈｉ、Ｇａｌ４、ＴＡＬＥ、ＺＦ１、ＺＦ２、ＺＦ３、ＺＦＨＤ１、及びＺＦＨＩＶ２からなる群から選択される。
本開示のポリヌクレオチドセットのいくつかの実施形態では、誘導性ポリヌクレオチド構成成分は、転写因子特異的応答要素を含む転写因子特異的認識配列を含む。いくつかの実施形態では、転写因子応答要素は、５ｘＧａｌ４、ＺＦ１、ＺＦ２、ＺＦ３ｖ１、ＺＦ３ｖ２、ＺＦＨＩＶ２について６ｘＲＥ、ＺＦ３ｖ３及びＺＦＨＩＶ２について１２ｘＲＥ、並びに前述のいずれかの反復又は組み合わせからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、転写因子応答要素は、反復される。いくつかの実施形態では、転写因子応答要素は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上反復される。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボにおけるヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボにおけるヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多分化能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、間葉系間質細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、間葉細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞療法のために選択される自己細胞であるか、又は細胞療法のために選択される自己細胞の子孫である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞療法のために選択される同種細胞であるか、又は細胞療法のために選択される同種細胞の子孫である。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットのポリペプチドセットを使用して、幹細胞を改変することを含む、幹細胞分化をもたらす方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、がん細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、がんと診断されたヒト対象由来の非がん細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、自己反応性Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、心臓細胞、肺細胞、筋細胞、上皮細胞、膵臓細胞、皮膚細胞、ＣＮＳ細胞、ニューロン、ミオサイト、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、及びグリア細胞からなる群から選択される。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを含む、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、又はＩＬＣ細胞である。
本開示は、産生細胞株を提供し、その細胞株の細胞は、本開示のポリヌクレオチドセットを含む。
本開示は、目的の遺伝子から目的のポリペプチド産物を産生する方法を提供し、この方法は、本開示のポリヌクレオチドセットを使用して細胞株を改変して、産生細胞株をもたらすことと、産生細胞株を培養して、目的の生成物を産生することとを含む。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチド産物は、治療用タンパク質又はペプチドを含む。
本開示は、産生細胞株を提供し、その細胞株の細胞は、ウイルスカプシドにパッケージングされる本開示のポリヌクレオチドセットを産生する。本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを含むウイルスカプシドを提供する。本開示は、本開示のウイルスカプシドを産生する細胞を提供する。本開示のいくつかの実施形態では、ウイルスカプシドは、アデノウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、エプスタインバーウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスのカプシドから選択される。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを含む組成物を提供する。
本開示は、ＣＡＲ療法を必要とする対象を治療する際に使用するための本開示の組成物を提供する。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを含むキットを提供する。
本開示は、操作された細胞を作製する方法を提供し、この方法は、本開示のポリヌクレオチドセットのポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞中で発現される。いくつかの実施形態では、方法は、その必要がある対象において細胞を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、小分子を対象に投与することを更に含む。
本開示は、その必要がある対象においてＴ細胞媒介性免疫応答を制御する方法を提供し、この方法は、本開示の有効量の細胞を対象に投与することを含む。
本開示は、対象における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、本開示の有効量の細胞を対象に投与することを含む。
本開示は、その必要がある対象において抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、この方法は、本開示の有効量の細胞を対象に投与することを含む。
本開示は、その必要がある対象においてがんを治療する方法を提供し、この方法は、本開示の有効量の細胞を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種である。いくつかの実施形態では、方法は、小分子を対象に投与することを更に含む。
本開示は、遺伝子療法方法を提供し、第１のポリヌクレオチドは、目的の１つ以上の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列を含み、目的の１つ以上の遺伝子は、治療用ポリペプチドを含み、この方法は、その必要がある対象に本開示の治療有効量のポリヌクレオチドセットを投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、小分子を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、小分子の投与量を調整して、対象における治療用ポリペプチドの産生を調整することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象における治療用ポリペプチドの産生を監視することと、小分子の用量を調整して、対象における治療用ポリペプチドの産生を所望のレベルに調整することとを更に含む。いくつかの実施形態では、対象は、がん、嚢胞性線維症、心疾患、糖尿病、血友病、及びＡＩＤＳからなる群から選択される状態を有する。
本開示は、その必要がある対象においてがんを治療するための薬剤の製造のための本開示のポリヌクレオチドセットの使用を提供する。
作動中の本開示の例示的な小分子調節遺伝子発現システムを示す概略図である。 単一ベクター上に誘導性ポリヌクレオチド構成成分及び構成的ポリヌクレオチド構成成分をコードするための一方向順方向、一方向逆方向、及び二方向ヘッドトゥトウの構成の例を示す一連の概略図である。 目的の遺伝子の発現のための誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターと、分割転写因子の発現のための構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む第２のベクターとを含む、例示的な小分子調節遺伝子発現システムを示す概略図である。 一方向順方向、一方向逆方向、及び二方向ヘッドトゥヘッドの配向の、レンチウイルス骨格における例示的なオールインワンベクターを示す一連の概略図である。 図５Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中での異なる体積の１０倍濃縮レンチウイルスを使用した、図４の３つのベクター配向の形質導入結果を示すプロットである。図５Ｂは、図４の一方向順方向又は二方向ベクターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞における、ダノプレビルのタイトレーションを示すプロットである。 別々のレンチウイルスベクター上に構成的転写因子構成成分及び誘導性プロモーター構成成分を有する、例示的な２ベクターシステムを示す概略図である。 図７Ａは、ダノプレビルの濃度上昇に応答した、形質導入陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＧＦＰ強度を示すプロットである。図７Ｂは、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＧＦＰ強度の中央値を示すプロットである。 ５００ｎＭのダノプレビルに曝露された、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞、又は転写因子ベクターＴＦＶ１と誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ２～ＩＰＶ６）のうちの１つとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞から発現されたＥＧＦＰを示す、ヒストグラムプロットのパネルである。 転写因子ベクターＴＦＶ１と誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ２～ＩＰＶ６）のうちの１つとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞中の、５００ｎＭのダノプレビルに応答した誘導ＧＦＰ発現について、最大ＥＧＦＰ平均蛍光強度データ（ｇＭＦＩ）及び誘導倍率をそれぞれ示す、一対のプロットである。 最も弱い最小プロモーターＹＢ＿ＴＡＴＡ（すなわち、ＩＰＶ３）における、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベルを示す、一対のプロットである。 最も強い最小プロモーターであるｍｉｎＣＭＶ（ＩＰＶ２）、ｈｕＢＧ（ＩＰＶ５）、ＴＲＥ３Ｇ（ＩＰＶ６）についての、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベル、及びｈｕＢＧについてのＥＧＦＰレベルをそれぞれ示す、一対のプロットである。 形質導入マーカーＢＦＰの発現を引き起こす構成的プロモーターＭＮＤ、及びＥＧＦＰの発現を引き起こす最小誘導性プロモーターｈｕＢＧを示す、例示的な誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ５）を示す概略図である。 ＴＦＶ１と、ＩＰＶ５又はＩＰＶ７（それぞれＭＮＤ及びｈＰＣＫプロモーターを利用する）のいずれかとによって同時形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞中の正規化されたＧＦＰ発現レベルを示す一対のプロットである。 ＴＦＶ１を同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞中のｈＰＧＫベクター（すなわち、ＩＰＶ７）における、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベルを示す一対のプロットである。 それぞれＩＰＶ１と、ＴＦＶ１、ＴＦＶ２、又はＴＦＶ３のいずれかとを同時形質導入され、ダノプレビル又はＤＭＳＯに曝露された細胞中のＧＦＰレベルを示す、一連のヒストグラムプロットである。 ５００ｎＭのダノプレビルを用いた処理に応答した、４つのジンクフィンガー（ＺＦ）ＤＢＤ－ＮＳ３ａ融合タンパク質及び４つのＤＮＣＲ２－ＴＡＤ融合タンパク質についての、ＧＦＰ発現（ｇＭＦＩ）を示すプロットである。 図１２Ａは、誘導性プロモーター上のＤＮＣＲ２－ＶＰＲｍｉｎｉによって誘導されたＧＦＰ発現（ｇＭＦＩ）が、ＺＦＨＩＶ２について６ＸＲＥ又は１２ＸＲＥを含むことを示すプロットである。図１２Ｂは、誘導性プロモーター上のＤＮＣＲ２－ＶＰＲｍｉｎｉによって誘導されたＧＦＰ発現（ｇＭＦＩ）が、ＺＦ３について６ＸＲＥ又は１２ＸＲＥを含むことを示すプロットである。 図１３Ａは、ＤＮＣＲ２／ダノプレビル／ＮＳ３ａの結晶構造、並びにＤ－１、Ｄ－９、及びＤ－２０設計のモデルを示す概略図である。図１３Ｂは、酵母上に提示される４つのＤＮＣＲ２バリアントへのＮＳ３ａ／ダノプレビル結合のタイトレーションについての、ＮＳ３ａ結合強度（ＰＥ）の中央値を示すプロットである。 図１４Ａは、ＧＮＣＲ１（Ｇ－３ｒｅｐ短縮が示されている）、Ｇ－３３、及びＧ－３８の例示的なモデルを示す一連の概略図である。図１４Ｂは、ＧＮＣＲ１に結合するＮＳ３ａ／グラゾプレビルのタイトレーション（左）、並びに酵母上に提示されるＧ－３ｒｅｐ、Ｇ－３３、及びＧ－３８上のＮＳ３ａ／グラゾプレビルのタイトレーション（右）を示す、一対のプロットである。 構成的転写因子及び誘導性プロモーターレンチウイルスベクターから形質導入マーカーを除去した、例示的な改変２ベクターシステムを示す概略図である。 ＩＰＶ１６と、ＴＦＶ１又はＴＦＶ２１のいずれかとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３細胞中のＧＦＰレベルを示す、ヒストグラムプロットのパネルである。 通常のＩＰＶ１６ベクター及びＴＦＶ１ベクターを形質導入された、又はＥＧＦＰ生成量を低減するように設計された要素を発現するベクターを形質導入されたＨＥＫ２９３細胞中のＥＧＦＰ発現を示す、ヒストグラムプロットのパネルである。 通常のＩＰＶ１６／ＴＦＶ１の組み合わせからの、及びＡＮＲ－ＳＰＯＰを発現する転写因子ベクターＴＦＶ２３を伴うＩＰＶ１６からの、ＥＧＦＰバックグラウンドレベルの比較、及びタイトレーション可能なＥＧＦＰ発現を示す、プロットのパネルである。
詳細な説明
核酸
本開示のいくつかの実施形態では、「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」という用語、及びそれらの文法的変化形は、互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン若しくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、若しくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、あるいは一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスのいずれかの、ホスホロチオエート及びチオエステルなどのそれらの任意のホスホエステル類似体を指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。
本開示のいくつかの実施形態では、「核酸」、及び具体的にはＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、分子の一次構造及び二次構造のみを指し、それを任意の特定の三次形態に限定しない。本開示のいくつかの実施形態では、「核酸」は、特に、直鎖又は環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際に、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って、５’から３’の方向に左から右に配列を記述する通常の慣習に従って配列が提供される。別段の指示がない限り、全ての核酸配列及びヌクレオチド配列は、５’から３’の配向に左から右に記述される。
ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される、その一般的に知られている１文字記号によって言及される。それに応じて、「Ａ」はアデニンを表し、「Ｃ」はシトシンを表し、「Ｇ」はグアニンを表し、「Ｔ」はチミンを表し、「Ｕ」はウラシルを表す。
本開示のいくつかの実施形態では、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含む、任意の長さ又はタイプのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。これはまた、例えば、アルキル化及び／又はキャッピングによって改変されたポリヌクレオチド、並びに非改変形態のポリヌクレオチドを含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」は、スプライスであるか非スプライスであるかに関わらず、ｍＲＮＡを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）及びポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ－又はＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、並びにヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）、及びポリモルホリノポリマー、並びにポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するという条件で、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を含む。本開示のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターに挿入されたＤＮＡ配列、又はＤＮＡ配列を含むベクターを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡであるか、又はｍＲＮＡは、合成ヌクレオチドを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然核酸、非自然発生的核酸、又は改変核酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数の非天然核酸、非自然発生的核酸、又は改変核酸を含む。いくつかの実施形態では、ある特定のクラスの全ての核酸は、非天然核酸、非自然発生的核酸、又は改変核酸である（例えば、ポリヌクレオチド中の全てのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えられ得る）。
本開示のいくつかの実施形態では、「発現」は、プロモーターによって引き起こされる特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
本開示のいくつかの実施形態では、発現ベクターは、細胞中でのポリペプチド発現のために設計されたプラスミド、ウイルス、又は他の核酸を指す。ベクター又は構築物は、宿主細胞中に遺伝子を導入するために使用され、それによってベクターは、細胞中のポリメラーゼと相互作用して、ベクター／構築物においてコードされるタンパク質を発現する。発現ベクターは、細胞中で染色体外に存在し得るか、又は染色体内に組み込まれ得る。発現ベクターは、ベクターを原核細胞、真核生物、又は好ましくは両方における複製及び組み込みに適したもの（例えば、シャトルベクター）にする追加の配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチドは、発現ベクターの構成成分として提供され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「クローニングベクター」は、ポリヌクレオチドのコピーを産生するために設計されたプラスミド、ウイルス、又は他の核酸を指す。クローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳終結配列、並びにポリアデニル化シグナルを含有し得る。そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二本鎖ＤＮＡ合成の起源、及び３’ＬＴＲ、又はそれらの一部分を含む。本開示のポリヌクレオチドは、クローニングベクターの構成成分として提供され得、これは、本開示のポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「プロモーター」は、遺伝子の転写がどこで開始され、転写がどの方向に継続するかを示すヌクレオチド配列を指す。
本開示のいくつかの実施形態では、「コード」又は同様のものは、ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ）が、ヌクレオチドの定義された配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型としての役割を果たす能力を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の生成物をコードするものと称され得る。
別段の指定がない限り、アミノ酸配列を「コードする」ヌクレオチド配列、例えば、本開示の以下に定義されるキメラポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドは、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。
ポリペプチド
アミノ酸は、その一般的に知られている３文字記号、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって言及される。アミノ酸残基は、以下のように略される（略語は、括弧内に示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの配向に左から右に記述される。
本開示のいくつかの実施形態では、「ポリペプチド」は、アミノ酸サブユニットの配列を指し得る。いくつかの実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であり得る。「ポリペプチド」は、任意の長さ、サイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように互換的に使用される。
本開示のポリペプチドは、天然又は合成的に作製されたアミノ酸、又は改変されたアミノ酸、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、又は標識構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作若しくは改変を含み得る。定義内には、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然発生的アミノ酸（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンなどの合成アミノ酸を含む）の人工化学類似体であるポリペプチド、並びに当該技術分野で既知の他の改変物も含まれる。ポリペプチドはまた、前述の遺伝子産物、相同体、オルソログ、パラログ、断片、及び他の等価物、バリアント、及び類似体も含む。ポリペプチドは、単一ポリペプチドを含み得るか、又は二量体、三量体、若しくは四量体などの多分子複合体であり得る。本開示のポリペプチドは、一本鎖ポリペプチド又は多重鎖ポリペプチドを含み得る。最も一般的に、ジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチド中に見られる。
本開示のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸＋グリシン、Ｄ－アミノ酸＋グリシン（インビボでＬ－アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性である）、又はＤ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の組み合わせ＋グリシンを含み得る。記載されるポリペプチドは、化学的に合成され得るか、又は組換えにより発現され得る。
本開示のポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、ポリペプチド内部、又はそれらの組み合わせに追加の残基を含み得る。これらの追加の残基は、参照ポリペプチドに対する本開示のポリペプチドの同一性パーセントを決定する際に含まれない。そのような残基は、タグを含むがこれに限定されない、使用目的に適した任意の残基であり得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「タグ」は、一般的な検出可能な部分（例えば、蛍光タンパク質、抗体エピトープタグなど）、治療剤、精製タグ（Ｈｉｓタグなど）、リンカー、精製目的に適したリガンド、ポリペプチドの局在化を引き起こすリガンド、及びポリペプチドに機能性を追加するペプチドドメインなどを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、「キメラポリペプチド」は、第２の供給源に由来する第２のアミノ酸配列に共有結合又は非共有結合した、第１の供給源に由来する第１のアミノ酸配列で構成された任意のポリペプチドを指し得、第１の供給源及び第２の供給源は、同一ではない。いくつかの実施形態では、同一ではない第１の供給源及び第２の供給源は、２つの異なる生物学的実体、又は同じ生物学的実体からの２つの異なるタンパク質、又は生物学的実体及び非生物学的実体を含み得る。キメラタンパク質は、例えば、少なくとも２つの異なる生物学的供給源に由来するタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、２つの異なる種に由来する類似したタンパク質からの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、同じ種に由来する異なるタンパク質からの配列を含み得る。生物学的供給源は、任意の非合成的に産生された核酸又はアミノ酸配列（例えば、上記のいずれかゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、プラスミドベクター若しくはウイルスベクター、天然ビリオン、又は上記のいずれかの変異体若しくは類似体）を含み得る。合成源は、生物系（例えば、アミノ酸配列の固相合成）によってではなく、化学的に産生されたタンパク質又は核酸配列を含み得る。キメラタンパク質はまた、少なくとも２つの異なる合成源に由来するタンパク質、又は少なくとも１つの生物学的供給源及び少なくとも１つの合成源に由来するタンパク質を含み得る。キメラタンパク質はまた、任意の供給源に由来する、核酸に共有結合若しくは非共有結合した、第１の供給源に由来する第１のアミノ酸配列、又は任意の供給源に由来する小有機分子若しくは小無機分子も含み得る。キメラタンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間、又は第１のアミノ酸配列と核酸との間、又は第１のアミノ酸配列と小有機若しくは小無機分子との間にリンカー分子を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドの「断片」、又は「短縮ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの配列（自然発生的配列であり得る）よりも短いポリペプチドのアミノ酸配列を指し得る。参照ポリペプチドと比較して、断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端の欠失を含み得る。参照ポリペプチドと比較して、断片は、欠失が連続的であるかどうかに関わらず、配列の任意の部分の欠失を含み得る。自然発生的配列に対して内部アミノ酸が欠失したポリペプチドも、断片とみなされる。本開示の様々なポリペプチド構成成分は、参照タンパク質の断片又は短縮型として提供され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「機能的断片」は、ポリペプチドの機能を保持するポリペプチド断片を指し得る。いくつかの実施形態では、生物活性ペプチド（例えば、酵素）の機能的断片は、機能的断片が酵素の触媒ドメインを含むため、生物学的作用を触媒する能力を保持する。本開示のポリペプチドは、機能的断片又は短縮型として提供され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「アミノ酸置換」は、親配列又は参照配列中に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指し得る。いくつかの実施形態では、親配列又は参照配列は、野生型配列を含む。アミノ酸は、例えば、化学ペプチド合成を介して、又は当該技術分野で既知の組換え方法を介して置換され得る。例えば、アミノ酸残基を代替のアミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。本開示のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を受け得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられる場合、置換は、保存的であるとみなされる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる化学的に類似した鎖で保存的に置き換えられ得る。本開示の様々なポリペプチド構成成分は、保存的アミノ酸置換を受け得る。
本開示のいくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換としては、（ｉ）正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、若しくはＬｙｓ）が、負電荷残基（例えば、Ｇｌｕ若しくはＡｓｐ）に取って代わる、若しくは負電荷残基によって置換されるもの、ｉｉ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、若しくはＶａｌ）に取って代わる、若しくは疎水性残基によって置換されるもの、（ｉｉｉ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基に取って代わる、若しくは任意の他の残基によって置換されるもの、又は（ｉｖ）大きい疎水性若しくは芳香族の側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、若しくはＴｒｐ）が、より小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ若しくはＳｅｒ）、若しくは側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）に取って代わる、若しくはより小さい側鎖を有するもの若しくは側鎖を有しないものによって置換されるものが挙げられる。本開示の様々なポリペプチド構成成分は、非保存的アミノ酸置換を受け得る。前述の非保存的置換のうちの１つがタンパク質の機能的特性を変化させることができる可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置にも相関する。したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性にほとんど又は全く影響を与えない可能性がある。本開示の様々なポリペプチド構成成分は、変化した構成成分の機能性を著しく変化させない非保存的アミノ酸置換を受け得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「膜貫通要素」又は「膜貫通ドメイン」は、細胞外要素と細胞内要素との間のポリペプチド要素を指し得る。膜貫通要素の一部分は、細胞膜内に存在する。本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通要素を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、「細胞内要素」又は「細胞内ドメイン」は、真核細胞の細胞質膜の細胞質側に存在し、真核細胞にシグナルを伝達するポリペプチド要素を指し得る。本開示のＣＡＲは、細胞内要素を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、「細胞内シグナル伝達要素」又は「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、真核細胞に特殊機能を実施するように指示するエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内要素の一部分を指し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「細胞外要素」又は「細胞外要素」は、真核細胞の細胞質膜の外側に存在するポリペプチド要素を指し得る。ＣＡＲ発現細胞中では、細胞外要素は、ＣＡＲの抗原結合要素を含む。
配列分析
本開示のいくつかの実施形態では、「保存された」は、比較される２つ以上の配列の同じ位置で変化することなく生じる、ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基を指し得る。比較的保存されたヌクレオチド又はアミノ酸とは、配列中の他の場所に現れるヌクレオチド又はアミノ酸よりも、より関連した配列の間で保存されたものである。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約３０％同一、少なくとも約３５％同一、少なくとも約４０％同一、少なくとも約４５％同一、少なくとも約５０％同一、少なくとも約５５％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、互いに少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの全長に適用され得るか、又はその一部分、領域、若しくは特徴に適用され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、完全に保存され得るか、又は「同一」であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、互いに少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。
本開示のいくつかの実施形態では、「同一性」は、ポリマー分子間の、例えば、ポリペプチド分子又はポリヌクレオチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。例えば、タンパク質Ａがタンパク質Ｂと同一であるなど、任意の追加の修飾語のない「同一」は、配列が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。２つの配列を、例えば「７０％同一」として記載することは、それらを、例えば「７０％の配列同一性」を有するものとして記載することと同等である。
第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸によって占有される場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要がある各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
ある特定の実施形態では、第２のアミノ酸（又は核酸）配列に対する第１のアミノ酸（又は核酸）配列の同一性パーセント（％ＩＤ）は、％ＩＤ＝１００（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアライメント（目視検査又は特定の配列アライメントプログラムによってアライメントされるような）における同一の一致としてスコアリングされたアミノ酸（又は核酸塩基）残基の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高い。
２つのポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的で２つの配列をアライメントすることによって実施され得る。例えば、ギャップは、最適なアライメントのために第１及び第２のポリペプチド配列のうちの一方又は両方に導入され得、非同一配列は、比較目的で無視され得る。ある特定の実施形態では、比較目的でアライメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。
配列同一性パーセントの計算のための配列アライメントの生成は、一次配列データによってのみ駆動されるバイナリ配列間比較に限定されない。配列アライメントが、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、又は系統学的データなどの異種の供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも理解されるであろう。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能な、あるいは例えば、ウェブサイトｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アライメントが、自動又は手動でキュレートされ得ることも理解されるであろう。
好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から、かつタンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアライメントのために利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂ１２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムスイートの一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒであり、ＥＢＩからも入手可能である。配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、又はＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当該技術分野で既知の方法を使用して実施され得る。ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列とアラインする単一のポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の異なる領域は各々、それら自体の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、小数第２位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１～８０．１４の値は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５～８０．１９の値は、８０．２に切り上げられる。また、長さ値は常に整数になることにも留意されたい。
本開示のいくつかの実施形態では、「連結された」は、Ｃ末端又はＮ末端の第２の部分への第１の部分の融合を指し得るだけではなく、第１の部分（又は第２の部分）全体の、第２の部分（又は第１の部分のそれぞれ）の任意の２つの点、例えば、アミノ酸への挿入も含む。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ペプチド結合又はリンカーによって第２の部分に連結される。第１の部分は、ホスホジエステル結合又はリンカーによって第２の部分に連結され得る。リンカーは、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオチド鎖、又は任意の化学部分であり得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「非自然発生的」とは、自然界には存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、非自然発生的配列は、その配列が自然発生的配列に対して変化しているため、自然界には存在しない。いくつかの実施形態では、非自然発生的配列は、それが、自然界では一緒に生じない２つの既知の自然発生的配列（例えば、キメラポリペプチド）の組み合わせであるため、自然界には存在しない。いくつかの実施形態では、非自然発生的ポリペプチドは、キメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、配列が自然界では見ることができない部分（例えば、断片）、すなわち、新規配列を含有するため、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然発生的ではない。本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかは、例えば、天然配列に対して変化している配列を有する非自然発生的配列として提供され得るか、又は自然界には存在しない様式で他のポリヌクレオチドに連結されたポリヌクレオチドとして提供され得る。本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかは、例えば、天然配列に対して変化している配列を有する非自然発生的配列として提供され得るか、又は自然界には存在しない様式で他のポリペプチドに連結されたポリペプチドとして提供され得る。
抗体
本開示のいくつかの実施形態では、「抗体」は、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し得る。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の目的の遺伝子は、例えば、抗体断片を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、可動性ペプチドリンカーによって連結されている重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む抗体断片を指し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「抗原結合分子」は、抗原決定基に特異的に結合する分子を指し得る。本開示の目的の遺伝子は、例えば、抗原結合分子を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「抗原」は、免疫応答を誘発する分子を指し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、抗原認識部分及び細胞活性化要素を含む融合タンパク質を指す。本開示のポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコード又は産生する目的の遺伝子を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「ＣＡＲ Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ Ｔリンパ球」は、ＣＡＲポリペプチドを発現又は産生することができるＴ細胞を指す。例えば、ＣＡＲを発現することができる細胞は、細胞中でのＣＡＲの発現のための核酸配列を含有するＴ細胞である。本開示の細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞であり得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「共刺激要素」又は「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ポリペプチド」は、共刺激ポリペプチドの細胞内部分を指す。共刺激シグナルは、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、機能、持続性、及び抗腫瘍活性を増強し得る。ＣＤ２８又は４－１ＢＢなどの１つ以上のＴ細胞共刺激分子からの細胞内シグナル伝達ドメインを組み込むことによって、本開示のＣＡＲ中に共刺激シグナルが提供され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、共刺激ポリペプチドは、以下のタンパク質ファミリーのうちの１つ以上に属するタンパク質から単離された又は前記タンパク質に由来する配列を含む：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ナチュラルキラー細胞受容体。本開示のそのような共刺激ポリペプチドの例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及びＭｙＤ８８が挙げられるが、これらに限定されない。
治療用途
本開示のいくつかの実施形態では、「治療的に有効な」という用語は、レシピエントに有益な効果を付与すること、例えば、対象における少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和、又は減少を提供することを指し得る。本開示の治療効果は、何らかの利益が対象に提供される限り、完全又は治癒的である必要はない。例えば、本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞を本開示の小分子とともに組み込む治療レジメンは、レジメンが全体として治療的に有効であるように構造化され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「治療有効量」という用語は、レシピエントに治療的に有効な利益を付与するのに十分な量の本開示の核酸、ベクター、ポリペプチド、組成物、医薬組成物、又は細胞の用量又は量を指す。例えば、本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞は、治療有効量で投与され得る。本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞を投与された対象は、その後、治療有効量、すなわち、ポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞を以前に投与されたレシピエントに有益な効果を付与するのに十分な量の本開示の小分子を投与され得る。
任意の特定の対象についての本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞の具体的な用量レベルは、様々な要因、例えば、治療される障害；治療される障害の病期又は重症度；ポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞の有効性；小分子の有効性；ポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、細胞、又は小分子の投与経路；ポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、細胞、又は小分子のクリアランス速度；治療期間；細胞療法又は遺伝子療法と組み合わせて、又は同時に使用される薬剤；対象の年齢、体重、性別、食事、及び全身の健康；並びに医学及び科学においてよく知られている要因に依存し得る。
細胞療法
本開示のいくつかの実施形態では、「幹細胞」という用語は、様々なタイプの細胞に分化し、無限に増殖して、より多くの同じ幹細胞を産生することができる、未分化細胞又は部分的に分化した細胞を指し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）という用語は、未分化状態を無限に維持することができ、身体の全ての細胞ではないとしても、大部分の細胞に分化することができる細胞を指し得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ又はｉＰＳＣ）という用語は、体細胞から直接生成され得る多能性幹細胞を指し得る。これには、成人に由来する皮膚細胞又は血液細胞などの特殊化細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、「多分化能性」という用語は、２つ以上の細胞型に発達することができるが、多能性細胞よりも限定される細胞を指し得る。例えば、成人幹細胞及び臍帯血幹細胞は、多分化能性とみなされ得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「造血細胞」という用語は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から生じる細胞を指し得る。本開示の造血細胞としては、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、巨核球、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、マクロファージ、血小板、単球、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、及び形質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、「Ｔリンパ球」又は「Ｔ細胞」という用語は、通常は胸腺において発生する造血細胞を指し得る。Ｔリンパ球又はＴ細胞としては、天然キラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及び粘膜不変Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、「間葉」という用語は、タンパク質及び流体のメッシュ、すなわち、細胞外マトリックスに埋め込まれた疎性細胞を含む動物組織のタイプを指し得る。間葉は、骨、軟骨、リンパ系、及び循環系を含む、身体の結合組織の大部分を直接生じさせる。
本開示のいくつかの実施形態では、「間葉細胞」という用語は、間葉組織に由来する細胞を指し得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、間葉細胞であり得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「間葉系間質細胞」（ＭＳＣ）という用語は、インビトロで多分化能性の分化能力を有する、骨髄、脂肪、及び他の組織源から単離された紡錘状のプラスチック付着性細胞を指し得る。例えば、間葉系間質細胞は、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ））、ミオサイト（筋細胞）、及び脂肪細胞（骨髄脂肪組織を生じさせる脂肪細胞）に分化することができる。間葉系間質細胞という用語は、科学文献において「間葉系幹細胞」という用語に取って代わることが示唆されている。いくつかの場合では、本開示の細胞は、間葉系間質細胞であり得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「自己細胞」は、それが療法として投与され得る同じ個体から得られた細胞である（細胞は、対象に対して自己である）。本開示の自己細胞としては、造血細胞、及び造血幹細胞などの幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、同種細胞は、療法としての細胞の意図されたレシピエントではない個体から得られた細胞である（細胞は、対象に対して同種である）。本開示の同種細胞は、本開示の方法の対象に関して免疫学的に適合するドナーから選択され得る。本開示の同種細胞は、意図的ではない免疫原性を伴わずに任意の対象への投与に適した、「普遍的な」同種細胞を産生するように改変され得る。本開示の同種細胞としては、造血細胞、及び造血幹細胞などの幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態では、「トランスフェクトする」又は「形質転換する」又は「形質導入する」という用語は、外因性核酸が宿主細胞中に移されるか又は導入されるプロセスを指し得る。いくつかの実施形態では、「トランスフェクト」又は「形質転換」、又は「形質導入」された細胞は、外因性核酸をトランスフェクトされた、それによって形質転換された、又はそれを形質導入された細胞又はその細胞の子孫である。
本開示のいくつかの実施形態では、「細胞療法」という用語は、治療目的でのレシピエントへの細胞の提供又は送達を指し得る。
小分子の用語
本開示のいくつかの実施形態では、「類似体」という用語は、化合物又は化合物のクラスのメンバーの化学的に修飾された形態を意味し、これは、その化合物又はクラスの結合特性を維持する。いくつかの実施形態では、ダノプレビルの類似体は、ＤＮＣＲ２及びＮＳ３ａに結合する能力を保持する化学的に修飾された形態のダノプレビルを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、「プロドラッグ」という用語は、そのようなプロドラッグが患者に投与された場合に、インビボで本開示の小分子を放出する共有結合した担体を指す。本開示のプロドラッグは、修飾が日常的な操作又はインビボのいずれかで親化合物へと切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製され得る。インビボでの転換は、例えば、カルボン酸エステル、リン酸エステル、若しくは硫酸エステルの化学的若しくは酵素的加水分解、又は感受性官能基の還元若しくは酸化などの何らかの代謝プロセスの結果としてであり得る。本開示の範囲内のプロドラッグは、ヒドロキシ基、アミノ基、又はスルフヒドリル基が、本開示のプロドラッグが哺乳動物対象に投与された場合にそれぞれ切断されて遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基、又は遊離スルフヒドリル基を形成する任意の基に結合されている化合物を含む。代謝切断によって急速に転換され得る官能基は、インビボで、本開示の化合物のカルボキシル基と反応性である基のクラスを形成する。それらには、アルカノイル（アセチル、プロピオニル、ブチリルなど）、非置換及び置換アロイル（ベンゾイル及び置換ベンゾイルなど）、アルコキシカルボニル（エトキシカルボニルなど）、トリアルキシリル（トリメチル－及びトリエチシリル）、ジカルボン酸で形成されるモノエステル（スクシニルなど）などの基が含まれるが、これらに限定されない。本開示の小分子は、プロドラッグとして投与され得る。本開示の小分子は、プロドラッグとして対象に投与され得る。本開示のそのようなプロドラッグの治療有効量が投与され得る。プロドラッグは、本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、若しくは細胞の投与と同時に、又は本開示のポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、若しくは細胞の投与の後に投与され得る。
組成物
本開示のいくつかの実施形態では、「薬学的に許容される」は、妥当な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症のない、ヒト及び動物の組織と接触しての使用に適した、正しい医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。例えば、本開示の小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞は、薬学的に許容される担体を含む他の薬学的に許容される構成成分と一緒に、組成物の一部として投与され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の小分子の誘導体を指し、ここで、指定された化合物は、その酸又は塩基塩に変換される。そのような薬学的に許容される塩としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩又は四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸（ｅｔｈａｎｅ ｄｉｓｌｆｏｎｉｃ）、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が挙げられる。例えば、本開示の小分子は、薬学的に許容される塩として提供され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「制御放出」という用語は、長期間にわたって（すなわち、１時間超の期間にわたって）１つ以上の活性医薬品を放出することができる剤形の一部又は全てを指す。制御放出（ＣＲ）の特徴は、徐放（ＳＲ）、持続放出（ＰＲ）、又は長期放出（ＥＲ）とも称され得る。本明細書で考察される溶解プロファイルに関連して使用される場合、「制御放出」という用語は、１時間超の期間にわたって活性薬剤を送達する本開示に従った剤形の部分を指す。例えば、本開示の小分子は、制御放出組成物中において投与され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「即時放出」という用語は、胃液との接触の実質的に直後に活性薬剤を放出し、約１時間以内に実質的に完全な溶解をもたらす剤形の一部又は全てを指す。即時放出（ＩＲ）の特徴は、瞬間放出（ＩＲ）とも称され得る。本明細書で考察される溶解プロファイルに関連して使用される場合、「即時放出」という用語は、１時間未満の期間にわたって活性薬剤を送達する本開示に従った剤形の部分を指す。本開示の小分子は、即時放出組成物中において投与され得る。
本開示のいくつかの実施形態では、「賦形剤」という用語は、体内で活性ではない薬理学的に不活性な成分を指す。例えば、Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｂ．Ｃ．，Ｍｏｓｓ，Ｇ．Ｐ．，＆ａｍｐ；Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｄ．Ｊ．（２０２０）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｌｏｎｄｏｎ： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本開示の小分子は、投与方法及び剤形の性質に応じて、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクル、例えば、防腐剤、充填剤、ポリマー、崩壊剤、流動促進剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、潤滑剤、酸性化剤、及び分散剤と混合され得る。経口剤形を製剤化するために使用され得る薬学的に許容される担体及び賦形剤を含む、そのような成分。薬学的に許容される担体としては、水、エタノール、ポリオール、植物油、脂肪、ゲル形成ポリマー及び非ゲル形成ポリマーを含むワックスポリマー、並びにそれらの好適な混合物が挙げられる。賦形剤の例としては、デンプン、アルファ化デンプン、Ａｖｉｃｅｌ、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、及びレイクブレンドが挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、アルギニン酸、及びある特定の複合ケイ酸塩が挙げられる。潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、並びに高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。例えば、本開示の小分子、ポリヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、又は細胞は、薬学的に許容される賦形剤を含む組成物中において提供及び投与され得る。
定義
本開示のいくつかの実施形態では、「対象」という用語は、ヒトを含むがこれに限定されない、任意の哺乳動物を指す。
文脈上別段の明確な指示がない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語は、それらの複数形を含む。
「及び」という用語は、別段の明示的な記載がない限り、「又は」と互換的に使用される。
「及び／又は」という用語は、２つの指定された特徴又は構成要素の各々の、他方を伴うか又は伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、「及び／又は」は、「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を含む。同様に、「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するよう意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）、並びにＣ（単独）。
本開示のいくつかの実施形態では、「約」という用語は、「およそ」又は「実質的に」という用語と互換的に使用される。「約」が数値範囲と使用される場合、これは、記載される数値の上及び下の境界を拡張することによって、その範囲を修正する。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、例えば、１０％上又は下（より高い又はより低い）変動によって、数値を、記載された値よりも上及び下に修正し得る。
数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。値の範囲が記載される場合、その範囲の列挙された上限と下限との間に介在する各整数値及びその各端数も、そのような値の間の各部分範囲のように、具体的に開示される。任意の範囲の上限及び下限は独立して、その範囲に含まれ得るか又は除外され得、いずれかの限界が含まれるか、いずれの限界も含まれないか、又は両方の限界が含まれる各範囲も、本開示内に包含される。したがって、範囲は、列挙された終点を含む、範囲内の値の全ての省略表現であることが理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群から選択される任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むことが理解される。
値が明示的に記載される場合、記載された値とほぼ同じ数量又は量である値も、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各部分的組み合わせも具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素又は要素の群が個々に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示の任意の要素が複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単独で又は他の代替物との任意の組み合わせで除外されるその開示の例も本明細書に開示され、開示の２つ以上の要素がそのような除外を有し得、そのような除外を有する要素の全ての組み合わせが本明細書に開示される。
文脈上明確に他の意味に解釈すべき場合を除き、説明及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」、「含むこと」という用語などは、排他的又は網羅的な意味ではなく包括的な意味で、すなわち、「が挙げられるが、これらに限定されない」の意味で解釈されるべきである。
単数形又は複数形の用語はまた、それぞれ複数及び単数を含む。したがって、例えば、本明細書が目的の遺伝子を記載する場合、本開示は、目的の単一遺伝子又は目的の複数の遺伝子を有するポリヌクレオチドを含む。
「上記」及び「下記」、並びに類似の意味の用語は、本出願の任意の特定の部分ではなく、本出願を全体として指す。
「セット」は、１つ以上の要素又は物体のセットを含む。
単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）によって認められた形態で示される。
参照のために、かつ様々なセクションを見つけるのを助けるために、見出しが本明細書に含まれる。これらの見出しは、見出しに関して記載される概念の範囲を制限することを意図していない。そのような概念は、本明細書全体にわたって適用できる。
本開示は、明確性及び理解の目的で、例示及び実施例によってある程度詳細に記載されるが、ある特定の変更及び修正が実施され得ることは、当業者に明らかになるであろう。「本開示」などへの言及は、本開示を単一の実施形態又は態様に限定するものとしてではなく、本開示の幅広い実施形態又は態様のいずれかへの言及として意図されている。本開示全体を通して使用される場合、「態様」及び「実施形態」という用語は、交換可能である。本開示の「ある特定の」、「いくつかの」、又は「他の」態様又は実施形態との関連で考察される特徴は、本開示の任意の実施形態に見られ得るが、これらの場合、特徴は、これらの強調された実施形態において好ましい特徴とみなされ得る。
説明及び実施例は、本開示の範囲を、本明細書に記載される実施形態及び実施例に限定するものとして解釈されるべきではなく、むしろ本開示の真の範囲及び精神内に入る全ての修正物及び代替物を包含するものとして解釈されるべきである。
小分子調節遺伝子発現システム
本開示は、小分子調節遺伝子発現システムを提供する。システムは概して、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットを含む。第１及び第２のポリヌクレオチドは、単一ポリヌクレオチドとして、又は２つ以上のポリヌクレオチドのセットとして提供され得る。第１のポリヌクレオチドは概して、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含む。例えば、第１のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列又は誘導性プロモーター配列を含み得る。第２のポリヌクレオチドは、小分子の存在下で二量体化複合体を形成するポリペプチド二量体化システムの構成成分をコードする。二量体化複合体は、調節要素と相互作用して、目的の遺伝子の発現を調節するポリペプチド構成成分を局在化させるために使用され得る。
第２のポリヌクレオチドは、各二量体化ポリペプチドを、他のポリペプチド構成成分と共に融合タンパク質としてコードする。例えば、各二量体化ポリペプチドは、調節要素に連結された二量体化ポリペプチドを含み得る。一実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、以下をコードする：
（ｉ）目的の遺伝子のプロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインに連結された第１の二量体化ポリペプチドを含み得る、第１の融合タンパク質、及び
（ｉｉ）第２の二量体化ポリペプチドに連結された転写又はエピジェネティック調節ドメインを含み得る、第２の融合タンパク質。
第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの相互作用が小分子の存在によって媒介されるように選択され得る。例えば、第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、小分子と共に、二量体化複合体を形成するように集合することができる。
上述のように、第１のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列を含み得る。例えば、第１のポリヌクレオチドは、以下を含み得る：
（ｉ）転写因子特異的応答要素を含む転写因子特異的認識配列、
（ｉｉ）１つ以上の応答要素に連結された最小プロモーター配列、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の任意選択的な調節配列。
応答要素、最小プロモーター、及び任意選択的な調節配列は、目的の遺伝子の発現のためにベクター骨格内に構成され得る。
第２のポリヌクレオチドは、例えば、以下を含み得る：
（ｉ）構成的プロモーター配列、
（ｉｉ）第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｖ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の融合を防止する分離要素、並びに
（ｖ）１つ以上の任意選択的な調節配列。
構成的プロモーター配列、第１及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、分離要素、及び任意選択的な調節配列は、第１及び第２の融合タンパク質の発現のためのベクター骨格内に構成され得る。
図１は、作動中の本開示の小分子調節遺伝子発現システムの一例の概略図を示す。この図面は、応答要素ＲＥに結合し、第１のポリヌクレオチドからの誘導性プロモーター（ｍｉｎ）からの目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現を引き起こすシステム（第１及び第２の融合タンパク質）の発現された構成成分を示す。３つの応答要素（ＲＥ）及び最小プロモーター（ｍｉｎ）は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）に連結されて示される。第１の融合タンパク質は、３つのＲＥを認識しかつそれらに結合するＤＮＡ結合ドメインに融合されたＮＳ３ａタンパク質を含む。第２の融合タンパク質は、転写活性化ドメインに融合されたリーダータンパク質（ＤＮＣＲ２）を含む。小分子薬物ダノプレビルの存在下で、ＤＮＣＲ２リーダータンパク質は、ＮＳ３ａ／ダノプレビル複合体を認識し、かつそれに結合し、それによって目的の遺伝子の転写のための最小プロモーター（ｍｉｎ）に転写活性化ドメインを共局在化させる。この例では、リーダータンパク質であるＤＮＣＲ２は、異なるＮＳ３ａ阻害剤の小分子薬物に応答する代替のリーダー（例えば、グラゾプレビル／ＮＳ３複合体リーダー（ＧＮＣＲ）タンパク質）でモジュール式に置き換えられ得る。
化学誘導二量体
本開示は、小分子調節ポリペプチド二量体を使用して、調節要素を共局在化させ、それによって目的の遺伝子の発現を調節する。例えば、二量体は、ＤＮＡ結合ドメイン、及び目的の遺伝子に連結された誘導性プロモーターのための転写調節ドメインを共局在化させ得る。二量体は、二量体化ポリペプチドが小分子と共に集合して、二量体化複合体を形成するときに形成される。
二量体を使用して、分割転写因子を共局在化させ得る。例えば、分割転写因子は、以下を含み得る：
（ｉ）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に連結された第１の二量体化ポリペプチドを含む、第１の融合タンパク質、及び
（ｉｉ）転写又はエピジェネティック調節ドメインに連結された第２の二量体化ポリペプチドを含む、第２の融合タンパク質。
第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの相互作用が小分子の存在によって媒介されるように選択され得る。いくつかの場合では、小分子は、二量体の集合を媒介し得る。他の場合では、小分子は、二量体の分解を媒介し得る。更に他の場合では、第１の小分子が二量体の集合を媒介し得る一方で、第２の小分子は、第１の小分子を移動させ、それによって二量体の分解を媒介し得る。
一例として、小分子調節ポリペプチド二量体は、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼＮＳ３ａ／４ａタンパク質（以下、ＮＳ３ａと称される）又はその改変物を第１の二量体化ポリペプチドとして、及び「リーダー」タンパク質を第２の二量体化ポリペプチドとして含み得る。リーダータンパク質は、例えば、ＮＳ３ａタンパク質の特定の薬物結合状態を認識するように選択され得る。ＮＳ３ａタンパク質及びＮＳ３ａリーダータンパク質は、２０２０年６月１１日に公開された、「Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」と題するＢａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際特許公開第２０２０／１１７７７８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＮＳ３ａは、複数の薬物投入物を組み込み、異なる操作されたリーダータンパク質を二量体化パートナーとして使用して、薬物投入物を多様な生成物に変換することができる。ダノプレビル／ＮＳ３ａ複合体リーダー、グラゾプレビル／ＮＳ３ａ複合体リーダー、及びＡＮＲ／ＮＳ３ａ複合体リーダーからのＮＳ３ａタンパク質及び多面的応答の生成は、Ｆｏｉｇｈｔ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）３７：１２０９－１２１６、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ－Ｂｒｙａｎｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１９）１４１：３３５２－３３５５、及びＫｕｇｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）２８７：３９２２４－３９２３２に記載されており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一例では、二量体を形成する分割転写因子は、以下を含む：
（ｉ）ＮＳ３ａポリペプチド及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、第１の融合タンパク質、及び
（ｉｉ）リーダーポリペプチド及び転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む、第２の融合タンパク質。
ＮＳ３ａとリーダー結合パートナーとの間の相互作用は、小分子薬物の存在によって制御され得る。リーダーは、特定のＮＳ３ａ／薬物複合体を認識し、かつそれに結合するように選択され得る。
いくつかの実施形態では、二量体のために選択されるリーダーは、小分子薬物ダノプレビルの存在下でＮＳ３ａを認識し、かつそれに結合し、それによって薬物誘導性転写システムを提供するように設計された、ダノプレビル／ＮＳ３複合体リーダー（ＤＮＣＲ）ポリペプチド（又はその最小化／改変バリアント）である。一例では、ＤＮＣＲポリペプチドは、ＤＮＣＲ２である。Ｆｏｉｇｈｔ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）３７：１２０９－１２１６を参照されたい。
いくつかの実施形態では、二量体のために選択されるリーダーは、小分子薬物グラゾプレビルの存在下でＮＳ３ａを認識し、かつそれに結合し、それによって薬物誘導性転写システムを提供するように設計された、グラゾプレビル／ＮＳ３複合体リーダー（ＧＮＣＲ）ポリペプチド（又はその最小化／改変バリアント）である。一例では、ＧＮＣＲタンパク質は、ＧＮＣＲ１である。Ｆｏｉｇｈｔ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）３７：１２０９－１２１６を参照されたい。
いくつかの実施形態では、二量体のために選択されるリーダーは、ａｐｏＮＳ３ａ複合体リーダー（ＡＮＲ）ペプチド（又はその最小化／改変バリアント）である。ＡＮＲは、ＮＳ３ａと基礎複合体を形成し、これは、ＮＳ３ａを標的とする薬物によって破壊され、それによって薬物破壊可能な転写システムを提供する。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ－Ｂｒｙａｎｔ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１９）１４１：３３５２－３３５５、Ｋｕｇｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）２８７：３９２２４－３９２３２、及びＦｏｉｇｈｔ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）３７：１２０９－１２１６を参照されたい。
転写因子特異的認識配列
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、転写因子特異的認識配列を含む誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む。
いくつかの実施形態では、転写因子特異的認識配列は、Ｇａｌ４応答要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、転写因子特異的認識配列は、ジンクフィンガー（ＺＦ）応答要素（例えば、ＺＦ１、ＺＦ２、ＺＦ３、及び／若しくはＺＦＨＩＶ２応答要素）、又はそれらの任意の改変物を含み得る。
いくつかの実施形態では、転写因子特異的認識配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上反復される応答要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、転写因子応答要素は、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）、及び１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）、並びにそれらの反復又は組み合わせからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含み得る。
最小プロモーター配列
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子に作動可能に連結された最小プロモーター配列を含む誘導性ポリヌクレオチド構成成分をコードする。最小プロモーターは、例えば、最小コアプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、最小プロモーター配列は、以下からなる群から選択され得る：ＹＢ＿ＴＡＴＡ（配列番号７７）、ヒトβグロビン（ｈｕＢＧ）（配列番号７８）、ｍｉｎＩＬ２（配列番号７９）、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）（配列番号８０）、及びＴＲＥ３Ｇ（配列番号８１）。
調節ドメイン及び要素
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、転写後調節要素などの任意選択的な調節要素を含む誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む。例えば、転写後調節要素は、目的の遺伝子の発現を増加させるために含まれ得る。例としては、ｂＧＨｐＡ（配列番号９１）、ＳＶ４０ｐＡ（配列番号９２）、及びｓｙｎｐＡ（配列番号９３）が挙げられる。
構成的ポリヌクレオチド構成成分
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、
（ｉ）第１の二量体化ポリペプチド及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む第１の融合タンパク質をコードする、第１のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の二量体化ポリペプチド及び転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む第２の融合タンパク質をコードする、第２のポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の融合を防止するポリヌクレオチド配列を含む、分離要素、
（ｉｖ）第１及び第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された、構成的プロモーター配列、並びに
（ｖ）１つ以上の任意選択的な調節配列
を含み得る構成的ポリヌクレオチド構成成分を含み、第１及び第２のポリヌクレオチド、分離要素、構成的プロモーター配列、及び任意選択的な調節要素は、分割転写因子の発現のために構成されている。
二量体化ポリペプチド
様々な実施形態では、第１又は第２のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ（又はその改変物）を含む二量体化ポリペプチドをコードし得、第１又は第２のポリヌクレオチドの他方は、ＤＮＣＲ２（又はその改変物）及びＧＮＣＲ１（又はその改変物）からなる群から選択される二量体化ポリペプチドをコードし得る。
いくつかの実施形態では、第１又は第２のポリヌクレオチドは、以下を含むＮＳ３ａポリペプチドを含み得る二量体化ポリペプチドをコードする：ＮＳ３ａｏｐｔ Ｓ１３９Ａ（配列番号６６）、ＮＳ３ａ１ｂ（配列番号１３３）、ＮＳ３ａＨ１（配列番号１３４）。ＮＳ３ａポリペプチドは、本明細書に列挙されるように、触媒活性型又は触媒不活性型のいずれかであるように設計され得る。
いくつかの実施形態では、第１又は第２のポリヌクレオチドは、二量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号６）、六量体－ＮＳ３ａ（配列番号７）、五量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号８）、又は三量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号９）を含むホモオリゴマーＮＳ３ａ融合ポリペプチドを含み得る、二量体化ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、第１又は第２のポリヌクレオチドは、以下を含むＤＮＣＲ２ポリペプチドを含み得る二量体化ポリペプチドをコードする：ＤＮＣＲ２（配列番号１１）、ＤＮＣＲ２＿１（配列番号１２）、ＤＮＣＲ２＿２（配列番号１３）、ＤＮＣＲ２＿３（配列番号１４）、ＤＮＣＲ２＿４（配列番号１５）、ＤＮＣＲ２＿５（配列番号１６）、ＤＮＣＲ２＿６（配列番号１７）、ＤＮＣＲ２＿７（配列番号１８）、ＤＮＣＲ２＿８（配列番号１９）、ＤＮＣＲ２＿９（配列番号２０）、ＤＮＣＲ２＿１０（配列番号２１）、ＤＮＣＲ２＿１１（配列番号２２）、ＤＮＣＲ２＿１２（配列番号２３）、ＤＮＣＲ２＿１３（配列番号２４）、ＤＮＣＲ２＿１４（配列番号２５）、ＤＮＣＲ２＿１５（配列番号２６）、ＤＮＣＲ２＿１６（配列番号２７）、ＤＮＣＲ２＿１７（配列番号２８）、ＤＮＣＲ２＿１８（配列番号２９）、ＤＮＣＲ２＿１９（配列番号３０）、ＤＮＣＲ２＿２０（配列番号３１）、ＤＮＣＲ２＿２１（配列番号３２）、ＤＮＣＲ２＿２２（配列番号３３）、ＤＮＣＲ２＿２３（配列番号３４）、ＤＮＣＲ２＿２４（配列番号３５）、ＤＮＣＲ２＿２５（配列番号３６）、ＤＮＣＲ２＿２６（配列番号３７）、ＤＮＣＲ２＿２７（配列番号３８）、ＤＮＣＲ２＿２８（配列番号３９）、ＤＮＣＲ２＿２９（配列番号４０）、ＤＮＣＲ２＿３０（配列番号４１）、ＤＮＣＲ２＿３１（配列番号４２）、ＤＮＣＲ２＿３２（配列番号４３）、ＤＮＣＲ２＿３３（配列番号４４）、ＤＮＣＲ２＿３４（配列番号４５）、又はＤＮＣＲ２－３ｒｅｐ（配列番号４６）。
いくつかの実施形態では、第１又は第２のポリヌクレオチドは、以下を含むＧＮＣＲ１ポリペプチドを含み得る二量体化ポリペプチドをコードする：ＧＮＣＲ１（配列番号４７）、ＧＮＣＲ１－３ｒｅｐ（配列番号４８）、Ｇ３３（配列番号４９）、又はＧ３８（配列番号５０）。
二量体化ペプチド＋ＤＮＡ結合ドメイン
様々な実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、以下を含み得る融合タンパク質をコードする：
（ｉ）ＮＳ３ａｏｐｔ Ｓ１３９Ａ（配列番号６６）、ＮＳ３ａ１ｂ（配列番号ｘｘｘ）、ＮＳ３ａＨ１（配列番号ｘｘｘ）、二量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号６）、六量体－ＮＳ３ａ（配列番号７）、五量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号８）、三量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号９）、ＤＮＣＲ２（配列番号１１）、ＤＮＣＲ２＿１（配列番号１２）、ＤＮＣＲ２＿２（配列番号１３）、ＤＮＣＲ２＿３（配列番号１４）、ＤＮＣＲ２＿４（配列番号１５）、ＤＮＣＲ２＿５（配列番号１６）、ＤＮＣＲ２＿６（配列番号１７）、ＤＮＣＲ２＿７（配列番号１８）、ＤＮＣＲ２＿８（配列番号１９）、ＤＮＣＲ２＿９（配列番号２０）、ＤＮＣＲ２＿１０（配列番号２１）、ＤＮＣＲ２＿１１（配列番号２２）、ＤＮＣＲ２＿１２（配列番号２３）、ＤＮＣＲ２＿１３（配列番号２４）、ＤＮＣＲ２＿１４（配列番号２５）、ＤＮＣＲ２＿１５（配列番号２６）、ＤＮＣＲ２＿１６（配列番号２７）、ＤＮＣＲ２＿１７（配列番号２８）、ＤＮＣＲ２＿１８（配列番号２９）、ＤＮＣＲ２＿１９（配列番号３０）、ＤＮＣＲ２＿２０（配列番号３１）、ＤＮＣＲ２＿２１（配列番号３２）、ＤＮＣＲ２＿２２（配列番号３３）、ＤＮＣＲ２＿２３（配列番号３４）、ＤＮＣＲ２＿２４（配列番号３５）、ＤＮＣＲ２＿２５（配列番号３６）、ＤＮＣＲ２＿２６（配列番号３７）、ＤＮＣＲ２＿２７（配列番号３８）、ＤＮＣＲ２＿２８（配列番号３９）、ＤＮＣＲ２＿２９（配列番号４０）、ＤＮＣＲ２＿３０（配列番号４１）、ＤＮＣＲ２＿３１（配列番号４２）、ＤＮＣＲ２＿３２（配列番号４３）、ＤＮＣＲ２＿３３（配列番号４４）、ＤＮＣＲ２＿３４（配列番号４５）、ＤＮＣＲ２－３ｒｅｐ（配列番号４６）、ＧＮＣＲ１（配列番号４７）、ＧＮＣＲ１－３ｒｅｐ（配列番号４８）、Ｇ３３（配列番号４９）、又はＧ３８（配列番号５０）を含む、第１の二量体化ポリペプチド、及び
（ｉｉ）Ｇａｌ４ＤＢＤ（配列番号５６）、ＺＦ１（配列番号５７）、ＺＦ２（配列番号５８）、ＺＦ３（配列番号５９）、又はＺＦＨＩＶ２（配列番号６０）を含む、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＮＳ３ａ二量体化ポリペプチドを含む、Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ融合タンパク質（配列番号６５）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦ１ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ＮＳ３ａ－ＺＦ１融合タンパク質（配列番号６８）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦ２ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ＮＳ３ａ－ＺＦ２融合タンパク質（配列番号６９）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦ３ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ＮＳ３ａ－ＺＦ３融合タンパク質（配列番号７０）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦＨＩＶ２ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ＮＳ３ａ－ＺＦＨＩＶ２融合タンパク質（配列番号７１）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦ３ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ホモ二量体化ＮＳ３ａ－ＬＺ－ＺＦ３融合タンパク質（配列番号７２）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＺＦＨＩＶ２ ＤＮＡ結合ドメインを含む、ホモ二量体化ＮＳ３ａ－ＬＺ－ＺＦＨＩＶ２融合タンパク質（配列番号７３）をコードする。
ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＣＲ２二量体化ポリペプチドを含む、Ｇａｌ４－ＤＮＣＲ２融合タンパク質（配列番号５５）をコードする。
二量体化ポリペプチド＋転写活性化ドメイン
様々な実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、以下を含み得る融合タンパク質をコードする：
（ｉ）ＮＳ３ａｏｐｔ Ｓ１３９Ａ（配列番号６６）、ＮＳ３ａ１ｂ（配列番号ｘｘｘ）、ＮＳ３ａＨ１（配列番号ｘｘｘ）、二量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号６）、六量体－ＮＳ３ａ（配列番号７）、五量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号８）、三量体－ＮＳ３ａＨ１（配列番号９）、ＤＮＣＲ２（配列番号１１）、ＤＮＣＲ２＿１（配列番号１２）、ＤＮＣＲ２＿２（配列番号１３）、ＤＮＣＲ２＿３（配列番号１４）、ＤＮＣＲ２＿４（配列番号１５）、ＤＮＣＲ２＿５（配列番号１６）、ＤＮＣＲ２＿６（配列番号１７）、ＤＮＣＲ２＿７（配列番号１８）、ＤＮＣＲ２＿８（配列番号１９）、ＤＮＣＲ２＿９（配列番号２０）、ＤＮＣＲ２＿１０（配列番号２１）、ＤＮＣＲ２＿１１（配列番号２２）、ＤＮＣＲ２＿１２（配列番号２３）、ＤＮＣＲ２＿１３（配列番号２４）、ＤＮＣＲ２＿１４（配列番号２５）、ＤＮＣＲ２＿１５（配列番号２６）、ＤＮＣＲ２＿１６（配列番号２７）、ＤＮＣＲ２＿１７（配列番号２８）、ＤＮＣＲ２＿１８（配列番号２９）、ＤＮＣＲ２＿１９（配列番号３０）、ＤＮＣＲ２＿２０（配列番号３１）、ＤＮＣＲ２＿２１（配列番号３２）、ＤＮＣＲ２＿２２（配列番号３３）、ＤＮＣＲ２＿２３（配列番号３４）、ＤＮＣＲ２＿２４（配列番号３５）、ＤＮＣＲ２＿２５（配列番号３６）、ＤＮＣＲ２＿２６（配列番号３７）、ＤＮＣＲ２＿２７（配列番号３８）、ＤＮＣＲ２＿２８（配列番号３９）、ＤＮＣＲ２＿２９（配列番号４０）、ＤＮＣＲ２＿３０（配列番号４１）、ＤＮＣＲ２＿３１（配列番号４２）、ＤＮＣＲ２＿３２（配列番号４３）、ＤＮＣＲ２＿３３（配列番号４４）、ＤＮＣＲ２＿３４（配列番号４５）、ＤＮＣＲ２－３ｒｅｐ（配列番号４６）、ＧＮＣＲ１（配列番号４７）、ＧＮＣＲ１－３ｒｅｐ（配列番号４８）、Ｇ３３（配列番号４９）、又はＧ３８（配列番号５０）を含む、第２の二量体化ポリペプチド、及び
（ｉｉ）ｐ６５ｍｉｎｉ（配列番号６１）、ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１（配列番号６２）、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ（配列番号６３）、又はＶＰＲｍｉｎｉ（配列番号６４）を含む、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）。
ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＮＳ３ａ二量体化ポリペプチド及びＶＰＲｍｉｎｉ転写活性化ドメインを含む、ＮＳ３ａ－ＶＰＲｍｉｎｉ融合タンパク質（配列番号６７）をコードする。
ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＣＲ２二量体化ポリペプチド及びｐ６５ｍｉｎｉ転写活性化ドメインを含む、ＤＮＣＲ２－ｐ６５ｍｉｎｉ融合タンパク質（配列番号５１）をコードする。
ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＣＲ２二量体化ポリペプチド及びｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、ＤＮＣＲ２－ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１融合タンパク質（配列番号５２）をコードする。
ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＣＲ２二量体化ポリペプチド及びＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ転写活性化ドメインを含む、ＤＮＣＲ２－ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ融合タンパク質（配列番号５３）をコードする。
ある特定の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＣＲ２二量体化ポリペプチド及びＶＰＲｍｉｎｉ転写活性化ドメインを含む、ＤＮＣＲ２－ＶＰＲｍｉｎｉ融合タンパク質（配列番号５４）をコードする。
分離要素
様々な実施形態では、融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドは、融合タンパク質を分離する分離要素をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、分離要素は、以下からなる群から選択されるリボソームスキッピング配列を含み得る：Ｐ２ａ（配列番号７４）及びＴ２ａ（配列番号７５）。
いくつかの実施形態では、分離要素は、Ｔ２ａ－ＲＦＰ－Ｐ２ａ（配列番号７６）、Ｐ２ａ－Ｔ２ａ（配列番号１３５）、及びＴ２ａ－Ｐ２ａ（配列番号１３６）からなる群から選択される少なくとも２つのリボソームスキッピング配列を含むポリヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、分離要素は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、分離要素は、第２の構成的プロモーター配列を含み得る。
構成的プロモーター配列
様々な実施形態では、構成的ポリヌクレオチド構成成分は、以下からなる群から選択される構成的プロモーター配列を含み得る：ＭＮＤ（配列番号８２）、ｈＰＧＫ（配列番号８３）、ＣＭＶ（配列番号１３７）、ＣＡＧ（配列番号１３８）、ＳＦＦＶ（配列番号１３９）、ＥＦ１α（配列番号１４０）、ＵＢＣ（配列番号１４１）、及びＣＤ４３（配列番号１４２）。
調節配列
いくつかの実施形態では、構成的ポリヌクレオチド構成成分は、以下からなる群から選択される１つ以上の任意選択的な調節配列を含み得る：ｂＧＨｐＡ（配列番号９１）、ＳＶ４０ｐＡ（配列番号９２）、及びｓｙｎｐＡ（配列番号９３）。
標的配列（目的の遺伝子（ＧＯＩ））
本開示のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子をコードする。目的の遺伝子は、有益な治療効果をもたらすポリペプチドをコードし得る。目的の遺伝子は、例えば、抗体、抗体の部分構成成分、酵素、ウイルスパッケージングポリペプチド、及び他のポリペプチドをコードし得る。目的の遺伝子は、治療用ポリペプチドであり得る。治療用ポリペプチドを発現する目的の遺伝子は、対象に治療効果、すなわち、遺伝子療法をもたらすためにインビボで発現され得る。治療用ポリペプチドを発現する目的の遺伝子は、インビトロで発現され、対象への後続の投与のために精製され得る。目的の遺伝子は、単一ポリペプチド又は複数のポリペプチドをコードし得る。
キメラ抗原受容体
目的の遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。ＣＡＲは、細胞外抗原結合／認識要素、受容体を細胞膜に固定する膜貫通要素、及び少なくとも１つの細胞内要素を含む、融合タンパク質であり得る。これらのＣＡＲ要素は、当該技術分野で既知であり、例えば、２０１４年８月２８日に公開された、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」と題する米国特許出願第２０１４／０２４２７０１号に記載され、これは、その全体が参照により組み込まれる。ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合要素、膜貫通要素、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含むポリヌクレオチドから発現される、組換えポリペプチドであり得る。
刺激分子は、例えば、Ｔ細胞受容体複合体に関連したゼータ鎖であり得る。
細胞質シグナル伝達要素は、例えば、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達要素を含み得る。
共刺激分子は、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／又はＣＤ２８から選択され得る。
ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であり得る。
ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、並びに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質を含み得る。
ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、並びに１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達要素及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であり得る。
ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、並びに１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達要素及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質を含み得る。
ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択的なリーダー配列を含み得る。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素のＮ末端にリーダー配列を更に含み得、リーダー配列は、ＣＡＲの細胞処理及び細胞膜への局在化中に抗原認識要素（例えば、ｓｃＦｖ）から任意選択的に切断される。
治療用途
目的の遺伝子は、以下の状態のうちの１つ以上を治療するために有用なポリペプチドなどの治療用ポリペプチドをコードし得る：
●自己免疫系障害、例えば以下：
〇アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ）
〇ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）
〇強直性脊椎炎
〇自己免疫性疾患（インターロイキン－１受容体アンタゴニスト）
〇慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）
〇ＤＡＤＡ２血管炎
〇１型糖尿病（インスリン、ＰＧＣ－ａｌ、ＧＬＰ－１、ミオスタチンプロペプチド、グルコーストランスポーター４）
〇全身型重症筋無力症（ＧＭＧ）
〇橋本甲状腺炎（実験的自己免疫性甲状腺炎（ＥＡＴ））
〇炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
〇肢虚血（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＧＣ－ｌａ、ＥＣ－ＳＯＤ、ＨＩＦ）
〇全身性エリテマトーデス
〇粘膜優位型尋常性天疱瘡
〇多発性硬化症（β－インターフェロン）
〇関節リウマチ
〇重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）
〇Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＸＳＣＩＤ）
●血液細胞障害、例えば以下：
〇貧血（エリスロポエチン）
〇慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）
〇家族性高コレステロール血症
〇ファンコニ貧血
〇グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）
〇Ｈｂ Ｓ／β－サラセミア（Ｈｂ Ｓ／Ｔｈ）
〇血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）
〇血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）
〇ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）
〇１型高リポ蛋白血症
〇ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）
〇オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症
〇鎌状赤血球貧血（Ｈｂ ＳＳ）５，０００人に１人超
〇鎌状赤血球症（Ｈｂ Ｓ／Ｃ）
〇サラセミア（β－グロビン）
〇バリアントヘモグロビン異常症（Ｈｂ Ｅを含む）
〇及び他の血液障害
●骨障害及び骨折、例えば骨異形成症
〇歯槽骨萎縮
〇先天性及び後天性顎顔面欠損
〇股関節骨折
〇顎顔面骨再生
〇抜歯、骨形成
●脳障害、例えば以下：
〇骨異形成症（骨障害にも存在）
〇統合失調症
●心血管障害、例えば以下：
〇急性心筋梗塞
〇末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の貧血
〇狭心症（クラス２～４）
〇慢性心不全
〇貧血を患う慢性腎疾患患者
〇冠動脈バイパス移植術
〇冠動脈疾患
〇重症先天性心臓欠陥（パルスオキシメトリーを使用してスクリーニング）
〇重症下肢虚血（下肢）
〇皮膚病変を伴う重症下肢虚血
〇びまん性冠動脈疾患
〇勃起不全
〇心疾患
〇左室駆出分画率の低下を伴う、心不全、進行性心不全
〇心臓移植（の生存の改善）（スーパーオキシドジスムターゼ）
〇不完全な血行再建
〇間欠性跛行
〇内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓの送達による）
〇虚血性心疾患
〇クオピオ血管形成術
〇心筋血管新生
〇心筋虚血
〇有痛性糖尿病性末梢神経障害
〇末梢動脈疾患
〇末梢血管疾患
〇肺高血圧症
〇難治性狭心症
〇難治性冠動脈疾患
〇再狭窄
〇二次性レイノー現象
〇重症狭心症
〇重症末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）
〇重症末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）フォンテーヌステージ３
〇安定（重症）狭心症
〇安定労作性狭心症
〇狭窄予防
〇全身性強皮症
〇不安定狭心症
〇血液透析患者における血管アクセス移植片の生存
〇静脈性下肢潰瘍
●がん、例えば以下：
〇がん（エンドスタチン、アンギオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン、ＲＮＡｉを含むがこれに限定されない阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）、ＶＥＧＦに対する阻害性ＲＮＡを含むアンチセンスＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ、多剤耐性遺伝子産物、又はがん免疫原）。
〇ＥＢＶ＋ホジキン病
〇ａｌｌｏ－ＢＭＴ後のＥＢＶ＋リンパ腫
〇濾胞性非ホジキンリンパ腫
〇移植片対宿主病
〇白血病
〇リンパ系悪性腫瘍
〇悪性黒色腫
〇神経芽細胞腫
〇非小細胞肺がん
〇口腔粘膜炎（がん療法に関連）
〇網膜芽細胞腫
〇肉腫
〇乳がんの治療に関連する二次性リンパ浮腫
●皮膚障害、例えば以下：
〇マウス乾癬様皮膚病変
〇乾癬
●消化器障害、例えば以下：
〇クローン病
〇潰瘍性大腸炎
●耳障害、例えば以下：
〇内耳障害
〇高度難聴
●感染性疾患、例えば以下：
〇アデノウイルス感染症
〇ＣＯＶＩＤ－１９
〇サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症
〇エプスタインバーウイルス
〇Ｂ型、Ｃ型肝炎
〇ＨＩＶ－ＡＩＤＳ
〇インフルエンザ
〇マラリア
〇パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）
〇熱帯熱マラリア原虫感染症
〇呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症
〇破傷風
〇結核
●アミノ酸代謝の先天異常、例えば以下：
〇アルギニン血症
〇アルギニノコハク酸尿症（ＡＳＡ）
〇良性高フェニルアラニン血症
〇シトルリン血症（ＣＩＴ）
〇シトルリン血症ＩＩ型
〇ビオプテリン補因子の生合成障害
〇ビオプテリン補因子の再生障害
〇ホモシスチン尿症（ＨＣＹ）
〇高メチオニン血症
〇メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）
〇フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）
〇チロシン血症Ｉ（ＴＹＲ Ｉ）
〇チロシン血症ＩＩ
〇チロシン血症ＩＩＩ
●有機酸代謝の先天異常、例えば以下：
〇２－メチル３－ヒドロキシブチル酸尿症
〇２－メチルブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症
〇３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症（３ＭＣＣ）
〇３－メチルグルタコニル－ＣｏＡヒドラターゼ欠損症
〇アデノシルコバラミン合成異常
〇β－ケトチオラーゼ欠損症（ＢＫＴ）
〇β－メチルクロトニルカルボキシラーゼ欠損症
〇グルタミン酸血症Ｉ型（ＧＡ Ｉ）
〇グルタミン酸血症ＩＩ型
〇ＨＨＨ症候群（高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症症候群）
〇ヒドロキシメチルグルタリルリアーゼ欠損症（ＨＭＧ）
〇イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症
〇イソ吉草酸血症（ＩＶＡ）
〇マロン酸血症
〇メチルマロン酸血症（Ｃｂｌ Ｃ、Ｄ）
〇メチルマロン酸尿症、ｃｂｌＡ及びｃｂｌＢ型（ＭＭＡ、Ｃｂｌ Ａ、Ｂ）
〇メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ欠損症（ＭＵＴ）
〇複合ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症（ＭＣＤ）
〇プロピオン酸血症（ＰＲＯＰ）
●脂肪酸代謝の先天異常、例えば以下：
〇カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症１型
〇カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症２型
〇カルニチン取り込み障害（ＣＵＤ）
〇カルニチン／アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症（トランスロカーゼ）
〇ジエノイル－ＣｏＡレダクターゼ欠損症
〇グルタミン酸血症ＩＩ型
〇長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＡＤ）
〇長鎖ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤ）
〇中鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）
〇中鎖ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ欠損症
〇中鎖／短鎖Ｌ－３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症
〇多発性アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＡＤＤ）
〇短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＣＡＤ）
〇短鎖ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＳＣＨＡＤ）
〇三頭酵素欠損症（ＴＦＰ）
〇超長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ＶＬＣＡＤ）
〇Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー
●炎症性疾患、例えば以下：
〇変形性膝関節疾患
〇単純ヘルペスウイルス
〇炎症性関節炎
〇膝骨関節炎（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ ＆ Ｌａｗｒｅｎｃｅグレード２～３）
〇直腸の重症炎症性疾患
●腎臓障害、例えば腎不全（エリスロポエチン）
〇慢性腎機能不全
〇血液透析動静脈瘻成熟
〇腎臓移植
●肝臓障害、例えば肝炎（ａ－インターフェロン）
●肺障害、例えば以下：
〇α－１抗トリプシン
〇慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
〇肺移植
●代謝障害、例えば以下：
〇高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）
〇リソソーム蓄積症（ゴーシェ病）
〇フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）
〇ポンペ病
〇ムコ多糖症１型
●混合型多系統疾患、例えば以下：
〇ビオチニダーゼ欠損症（ＢＩＯＴ）
〇古典的ガラクトース血症（ＧＡＬＴ）
〇先天性副腎過形成（ＣＡＨ）
〇先天性甲状腺機能低下症（ＣＨ）
〇嚢胞性線維症（ＣＦ）（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）
〇ガラクトキナーゼ欠損症
〇ガラクトースエピメラーゼ欠損症
〇ＰＯＥＭＳ症候群
●ミトコンドリア病態、例えば以下：
〇エチルマロン酸脳症
〇レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）
●筋肉障害、例えば以下：
〇デュシェンヌ型及びベッカー型を含む筋ジストロフィー（例えば、ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、マイクロ－ジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、ミオスタチン又はミオスタチンプロペプチドに対するサルコグリカン（例えば、ａ、β、γ）阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡ）、ラミニン－α２、フクチン関連タンパク質、優性陰性ミオスタチン、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、Ｉｋａｐｐａ Ｂ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ－ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するジストロフィン遺伝子内のスプライス接合部に対する阻害性ＲＮＡ［例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡ］［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照されたい］、エクソンスキッピングを誘導するための、Ｕ７ ｓｎＲＮＡに対する阻害性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡ）［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照されたい］、及びミオスタチン又はミオスタチンプロペプチドに対する抗体又は抗体断片）
〇筋肉消耗（インスリン様成長因子Ｉ、ミオスタチンプロペプチド、抗アポトーシス因子、フォリスタチン）
〇排尿筋過活動
〇過活動膀胱症候群
●神経系障害、例えばＳＣＡ１、ＳＣＡ２、及びＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症
●神経変性障害、例えば以下：
〇ハンチントン病（反復を除去するための、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はマイクロＲＮＡなどのＲＮＡｉを含むがこれらに限定されない、阻害性ＲＮＡ）
〇パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）
●神経状態及び病態、例えば以下：
〇アルツハイマー病（ＧＤＦ、ネプリライシン）
〇筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
〇芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）欠損症
〇大脳型副腎白質ジストロフィー（ＣＡＬＤ）
〇シャルコー・マリー・トゥース神経障害１Ａ型
〇慢性外傷性脳損傷（ＴＢＩ）
〇肘部管症候群
〇異染性白質ジストロフィー及び副腎白質ジストロフィーの発症
〇糖尿病足
〇糖尿病性無感覚性足潰瘍
〇てんかん（ガラニン、神経栄養因子）
〇難治性疼痛
〇ムコ多糖症（Ｍｕｃｏｌｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）３Ａ（サンフィリポＡ型症候群）
〇視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）
〇末梢神経障害
〇脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）
〇外傷性脳損傷（ＴＢＩ）
●眼障害及び疾患、例えば以下：
〇色覚異常
〇加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
〇ＡＭＤ（滲出性）
〇失明（網膜色素変性）（ｒｐ）
〇脈絡膜血症
〇ＣＮＧＡ３連鎖性色覚異常
〇先天性色覚異常
〇糖尿病黄斑浮腫
〇緑内障
〇レーベル先天性黒内障（ＬＣＡ）
〇レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）
〇黄斑変性
〇黄斑部毛細血管拡張症２型
〇近視
〇新生血管ＡＭＤ
〇網膜疾患
〇網膜ジストロフィー
〇網膜分離症
〇スターガルト病
〇表在性角膜混濁／角膜瘢痕
〇アッシャー症候群（１Ｂ）
〇Ｘ連鎖性ｒｐ（ｘｌｒｐ）
〇Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＲｅｔＮｅｔウェブサイトに列挙されている全ての網膜疾患
●リウマチ状態、例えば以下：
〇関節炎（ＩＲＡＰ及びＴＮＦａ可溶性受容体などの抗炎症因子）
〇他の関節障害（インスリン様成長因子）
〇関節リウマチ
〇変性性関節炎
〇骨関節炎
●他の障害及び治療、例えば以下：
〇同種幹細胞移植
〇屈筋腱損傷
〇ピーナッツアレルギー
〇創傷治癒
ベクター及びベクター構成
本開示のポリヌクレオチドは、ベクターの一部として提供され得る。好適なベクターの例としては、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターが挙げられる。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を含み得る。本開示のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞型に依存する。形質転換される細胞型に従って好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、遺伝子編集技術の実施に有用なポリペプチドなどの遺伝子編集ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのような遺伝子編集技術の例としては、ＲＮＡ／ＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート））、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、又はウイルス組み込みが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）ベクターの一部として提供され得る。相同組換え修復機序を使用して、ポリヌクレオチドセットを染色体に組み込み得る。ポリヌクレオチドセットを染色体に組み込むために使用され得る機序の例としては、トランスポサーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＺＦヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及び当該技術分野で既知の他の相同組換えターゲティングベクターなどの配列特異的ヌクレアーゼが挙げられる。
ベクター構成成分としては概して、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を挙げられるが、これらに限定されない。真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、シグナル配列、又は目的の成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドをコードし得る。選択されるシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダーが使用され得る。真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、真核又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、及び時には３’非翻訳領域から一般的に入手可能である。１つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するか、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠損を補完するか、又は（ｃ）複合培地から入手可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
本開示のポリヌクレオチドは、いくつかの場合では、単一ベクターの一部として提供され得る。本開示のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター及び第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターの、少なくとも２つのベクターのセットの一部として提供され得る。いくつかの場合では、システムの誘導性部分及び構成的部分は、別々のベクター、すなわち、誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクター及び構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む第２のベクター上で提供される。
本開示のポリヌクレオチドとの使用に適したベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びトランスポゾンベクターが挙げられる。本開示のポリヌクレオチドは、相同組換え修復ベクターの一部として提供され得る。
本開示は、１つ以上のベクターの一部として、以下：
（ｉ）目的の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、第１のポリヌクレオチド、並びに
（ｉｉ）目的の遺伝子のプロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインに連結された第１の二量体化ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び第２の二量体化ポリペプチドに連結された転写又はエピジェネティック調節ドメインを含む第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、第２のポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドセットを提供し、第１の及び第２の二量体化ポリペプチドの相互作用は、小分子の存在によって媒介される。
本開示は、１つ以上のベクターの一部として、以下：
（ｉ）目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列をコードする、誘導性ポリヌクレオチド構成成分、並びに
（ｉｉ）分割転写因子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの構成的プロモーター配列をコードする、構成的ポリヌクレオチド構成成分
を含むポリヌクレオチドセットを提供し、分割転写因子は、（ａ）ＮＳ３ａポリペプチド及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む第１の融合タンパク質、及び（ｂ）リーダーポリペプチド及び転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＳ３ａポリペプチドとリーダーポリペプチドとの間の相互作用は、小分子の存在によって制御される。
本開示は、１つ以上のベクターの一部として、以下：
（ｉ）目的の遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター配列をコードする、誘導性ポリヌクレオチド構成成分、並びに
（ｉｉ）分割転写因子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの構成的プロモーター配列をコードする、構成的ポリヌクレオチド構成成分
を含むポリヌクレオチドセットを提供し、分割転写因子は、（ａ）ＮＳ３ａポリペプチド及び転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む第１の融合タンパク質、及び（ｂ）リーダーポリペプチド及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む第２の融合タンパク質を含み、ＮＳ３ａポリペプチドとリーダーポリペプチドとの間の相互作用は、小分子の存在によって制御される。
様々な実施形態では、誘導性ポリヌクレオチド構成成分は、以下：
（ｉ）転写因子特異的応答要素を含む転写因子特異的認識配列、
（ｉｉ）目的の遺伝子に作動可能に連結された最小プロモーター配列、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の任意選択的な調節配列
を含むポリヌクレオチドを含み得、応答要素、最小プロモーター、及び任意選択的な調節配列は、目的の遺伝子の発現のために構成されている。
単一ベクター構成
図２は、単一ベクター上に誘導性ポリヌクレオチド構成成分及び構成的ポリヌクレオチド構成成分をコードするための一方向順方向構成２００、一方向逆方向構成２１０、及び二方向ヘッドトゥトウ構成２１５の例の概略図を示す。各ベクター構成２００、２１０、及び２１５は、分割転写因子を発現するように構成された構成的ポリヌクレオチド構成成分、及び目的の遺伝子の発現を調節するためにその転写因子によって結合される誘導性ポリヌクレオチド構成成分からなる、小分子調節遺伝子発現システムの例である。コードされた分割転写因子は、２つのポリペプチド鎖：（１）第１の二量体化ポリペプチド、ＮＳ３ａに融合されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び（２）「リーダー」と指定された、第２の二量体化ポリペプチドに融合された転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含み得る。一例では、リーダーポリペプチドは、ＤＮＣＲ２ポリペプチドである。第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、第１及び第２の二量体化ポリペプチドの相互作用が小分子の存在によって媒介されるように選択される。分離要素は、２つのポリペプチド鎖の融合が、分割転写因子をコードする配列間に位置付けられることを防止するポリヌクレオチド配列を含む。構成的プロモーター構成成分はまた、ポリＡ配列などの任意選択的な調節配列を含み得る。誘導性プロモーター構成成分は、ＤＢＤによって認識及び結合される１つ以上の５’応答要素反復（ＲＥ）を有する最小プロモーターからなる。誘導性プロモーター構成成分はまた、ポリＡ配列などの任意選択的な調節配列を含み得る。
２ベクター構成
いくつかの実施形態では、誘導性ポリヌクレオチド構成成分及び構成的ポリヌクレオチド構成成分を含むポリヌクレオチドセットは、２つのベクター上で組み込まれ、（ｉ）第１のベクターは、誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含み得、かつ（ｉｉ）第２のベクターは、構成的ポリヌクレオチド構成成分を含み得る。誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含むベクターは、「誘導性プロモーターベクター」（ＩＰＶ）と称され得る。構成的ポリヌクレオチド構成成分を含むベクターは、「転写因子ベクター」（ＴＦＶ）と称され得る。
いくつかの実施形態では、誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターは、構成的プロモーター及び／又は形質導入マーカーを欠く。
いくつかの実施形態では、誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターは、構成的プロモーター及び／又は形質導入マーカーを更に含む。
図３は、目的の遺伝子の発現のための誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターと、分割転写因子の発現のための構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む第２のベクターとを含む、例示的な小分子調節遺伝子発現システムの例の概略図を示す。第１のベクター骨格上で、誘導性ポリペプチド構成成分は、１つ以上の応答要素（例えば、５つの応答要素）及び目的の誘導性遺伝子に連結された最小プロモーター配列を含む。誘導性ポリヌクレオチド構成成分はまた、システムの性能を改善するために、コード領域に対して５’又は３’に配置されたポリＡ配列などの調節配列、インシュレーター、又はＷＰＲＥなどの転写後調節要素を含み得る。
更に図３を参照すると、第２のベクター骨格上で、構成的ポリヌクレオチド構成成分は、分離要素（Ｐ２ａなど）を含むか、又は第２の構成的プロモーターを使用して、分割転写因子の別個のポリペプチド鎖を産生することができ、これは、ＤＮＡ結合ドメイン、転写調節ドメイン、ＮＳ３ａ、及びリーダータンパク質（ＤＮＣＲ２、ＡＮＲ、ＧＮＣＲ１、又はその最小化／改変バリアント）の異なる融合バリアントから構成され得る。ポリＡ、インシュレーター、又はＷＰＲＥなどの任意選択的な調節配列は、コード領域に対して５’又は３’に配置されて、システムの性能を改善することができる（表１を参照されたい）。
本開示は、目的の遺伝子の発現を調節するために、分割転写因子をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分及びその転写因子によって結合される誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む、ポリヌクレオチドセットを含む組成物を提供する。
本開示のポリヌクレオチドセットは、ベクターの一部として提供され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドセットの誘導性ポリヌクレオチド構成成分及び構成的ポリヌクレオチド構成成分は、単一ベクターの一部として提供され得る。
本開示は、目的の遺伝子に連結された誘導性ポリヌクレオチド構成成分、及び目的の遺伝子の発現を調節するための分割転写因子をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む、単一ベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、目的のポリペプチド産物を産生するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、療法を必要とする対象を治療するために使用され得る。本開示は、（ｉ）目的の遺伝子に連結された誘導性ポリヌクレオチド構成成分、及び目的の遺伝子の発現を調節するための分割転写因子をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む、単一ベクターと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤とを含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、構成的ポリヌクレオチド構成成分及び誘導性ポリヌクレオチド構成成分は、少なくとも２つのベクターのセットの一部として提供され得、例えば、第１のベクターは、誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含み、第２のベクターは、構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターと、（ｉｉ）目的の遺伝子の発現を調節するための分割転写因子をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む第２のベクターとを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、目的のポリペプチド産物を産生するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、療法を必要とする対象を治療するために使用され得る。本開示は、（ｉ）誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む第１のベクターと、（ｉｉ）目的の遺伝子の発現を調節するための分割転写をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分を含む第２のベクターと、（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤とを含む、組成物を提供する。
宿主細胞
本開示の発現ベクターは、宿主細胞中で発現され得る。宿主細胞は、例えば、細菌細胞などの原核細胞、又は酵母細胞、植物細胞、若しくは哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。本開示での使用に適した哺乳動物細胞の例としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、及びヤギ細胞が挙げられる。いくつかの場合では、細胞は、合成細胞である。
宿主細胞は、例えば、心臓細胞、肺細胞、筋細胞、上皮細胞、膵臓細胞、皮膚細胞、ＣＮＳ細胞、ニューロン、ミオサイト、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、及びグリア細胞からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エクスビボにおけるヒト細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、インビボにおけるヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多能性幹細胞又は造血幹細胞などの幹細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多分化能性細胞、間葉細胞、又は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、幹細胞であり、本開示のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞などの多能性細胞から生成される細胞産物の分化を制御するために使用される。薬物誘導性遺伝子発現システムは、例えば、分化を引き起こす転写因子のタイミング／投与量を制御するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多能性ではなく、本開示のポリヌクレオチドは、多能性を誘導するための細胞の再プログラミングを制御するために使用される。薬物誘導性遺伝子発現システムは、例えば、再プログラミングを引き起こす転写因子のタイミング／投与量を制御するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、生物の一部である。本明細書の他の箇所に記載される治療実施形態に加えて、細胞は、モデル生物の一部であり得る。薬物誘導性遺伝子発現システムは、例えば、疾患特徴又は生物学的増強などの科学的研究のための特徴を生成する発現を制御するために使用され得る。好適なモデル生物の例としては、酵母、ミバエ、線虫、カエル、マウス、及び魚（例えば、ゼブラフィッシュ）が挙げられる。目的の遺伝子は、例えば、機能不全のポリペプチド、又は生物の遺伝子と相互作用する、若しくはそれを調節するか、又は代謝プロセスに干渉するポリペプチドであり得る。本開示の小分子は、発現を調節又はタイトレーションするために、したがって研究される特徴の変動をもたらすために投与され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、がんと診断されたヒト対象からのがん細胞及び／又は非がん細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、自己反応性Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージからなる群から選択される免疫細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、産生細胞株であり、この細胞株の細胞は、目的の産物を産生するように構成されたポリヌクレオチドセットを含む。
宿主細胞は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチド又はベクターで形質転換され、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、又は目的の遺伝子を増幅するために製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物の細胞又は細胞株である。非限定的な例としては、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／Ｉ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は細胞株、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（例えば、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－６１（商標）及びＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７５９－７６５を参照されたい）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（例えば、Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６－４２２０を参照されたい）、ＦＳ４細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＴ－１０８０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１２１（商標））、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）、ヒト胎児由来腎臓細胞株（懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ヒト肝細胞がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＭＲＣ ５細胞、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、並びに操作されたＴ細胞及び操作されたナチュラルキラー細胞が挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドセットは、宿主細胞中に提供され得る。細胞は、本開示のポリヌクレオチドセットを組み込むために一過性又は安定的に操作され得る。本開示は、目的の遺伝子の発現を調節するために、分割転写因子をコードする構成的ポリヌクレオチド構成成分及びその転写因子によって結合される誘導性ポリヌクレオチド構成成分を含む、ポリヌクレオチドセットを含む細胞を提供する。
本開示は、ポリヌクレオチドセットを発現するように改変された細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、目的のポリペプチド産物を産生するために使用され得る。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出液から回収され得るか、又は培養培地から回収され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、療法を必要とする対象を治療するために使用され得る。本開示は、（ｉ）ポリヌクレオチドセットを発現するように改変された細胞と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤とを含む、医薬組成物を提供する。
細胞は、治療的利益を提供する目的の遺伝子を発現する本開示のポリヌクレオチドを含み得る。目的の遺伝子の発現は、腫瘍細胞を攻撃する能力を細胞に付与し得る。目的の遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体であり得る。目的の遺伝子は、膜貫通領域に連結されたヒンジに連結された一本鎖抗体断片を発現し得る。膜貫通領域は、細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。膜貫通領域は、共刺激ドメインに連結され得る。
組成物の細胞は、例えば、Ｔ細胞であり得る。組成物の細胞は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞、例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞の集団における疲弊及び／又は機能不全を低減、改善、又は阻害するための手段を含む細胞組成物を提供する。いくつかの実施形態では、手段は、ポリヌクレオチドセット中の目的の遺伝子としてＣＡＲを発現することを含む。
小分子の作製方法
本開示の小分子は、既知の技術を使用して合成され得る。ダノプレビル（（２Ｒ，６Ｓ，１２Ｚ，１３ａＳ，１４ａＲ，１６ａＳ）－１４ａ－［（シクロプロピルスルホニル）カルバモイル］－６－（｛［（２－メチル－２－プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）－５，１６－ジオキソ－１，２，３，５，６，７，８，９，１０，１１，１３ａ，１４，１４ａ，１５，１６，１６ａ－ヘキサデカヒドロシクロプロパ［ｅ］ピロロ［１，２－ａ］［１，４］ジアザシクロペンタデシン－２－イル４フルオロ－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イソインドール－２－カルボキシレート）は、既知の技術を使用して合成され得る。例えば、Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｅｒｉｃｋ Ｍｏｒａｎ，Ｈｉｓａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ，ａｎｄ Ｎ．Ｋ．Ｙｅｅ．“Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．” Ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ ９，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２．Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．１９．６，Ｄａｎｏｐｒｅｖｉｒを参照されたく、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、本開示のポリヌクレオチド、例えば、本開示のＤＮＡベクター及びその部分構成成分、並びに本開示のパッケージングベクター及びプラスミドを産生する方法を提供する。標準的な分子生物学技術を使用して、本開示のポリヌクレオチドを集合させ得る。ポリヌクレオチドは、化学的に合成され得る。
パッケージングされたウイルスカプシドの作製方法
本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含有するウイルスカプシドを作製する方法を含む。概して、本開示のウイルスカプシドは、本開示のパッケージングポリヌクレオチドを細胞に供給することによって産生され得る。パッケージングポリヌクレオチドは、プラスミドとしてパッケージング細胞に供給され得る。パッケージング細胞は、本開示のポリヌクレオチドを含有するウイルスカプシドを産生するように培養され得る。好ましくは、パッケージングされたウイルスカプシドは、複製能力がない。
様々な市販のキットは、本開示のパッケージングされたウイルスカプシドの産生に適している。例としては、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから入手可能）、ＬＶ－Ｍａｘ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）が挙げられる。
パッケージング細胞によって産生されるウイルスカプシドは、ポリペプチドの産生における使用のための細胞への送達、細胞ベースの療法における使用のための細胞への送達、又は遺伝子療法の方法のための対象への送達などの終了段階の方法における使用のために精製され得る。精製は、宿主細胞又は培養培地からの汚染物を排除するための処理を含み得る。精製工程は、プラスミドの物理的及び／又は化学的特徴に基づく工程を含み得る。化学的特徴としては、例えば、親水性－疎水性が挙げられ得る。物理的特徴としては、例えば、サイズが挙げられ得る。粒径に基づく精製戦略の例としては、密度勾配超遠心分離、限外濾過、沈殿、二相抽出システム、及びサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。いくつかの場合では、沈殿が、遠心分離と一緒に、例えば、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、又はリン酸カルシウムを使用して用いられ得る。いくつかの場合では、ＰＥＧ、デキストラン、又はポリビニルアルコールを有する水性二相分離システムが使用され得る。いくつかの場合では、膜ベースの接線流濾過技術が使用され、例としては、限外濾過、透析濾過、及び精密濾過が挙げられる。他の実施形態では、クロマトグラフィー手段が、ウイルスカプシドを精製するために使用され得る。更に他の実施形態では、免疫親和性方法が、関連するカプシドに対する特異性を有するモノクローナル抗体を使用して、カプシドを捕捉するために使用され得る。Ｍｏｒｅｎｗｅｉｓｅｒ，Ｒ．，“Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，Ｓ１０３－Ｓ１１０（２００５）を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
好適なウイルスカプシドの例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルス、エプスタインバーウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞の作製方法
本開示は、目的の遺伝子を発現するために改変細胞を作製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、目的のポリペプチド産物の分離のためのポリヌクレオチドセットを発現する改変細胞を作製する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、単一ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドセットからの目的のポリペプチド産物の発現及び単離のための細胞を生成又は調製する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、２つ（又はそれ以上）のベクターに組み込まれたポリヌクレオチドセットからの目的のポリペプチド産物の発現及び単離のための細胞を生成又は調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞療法を必要とする対象の治療における使用のためのポリヌクレオチドセットを発現する治療用細胞を作製する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、単一ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドセットから目的の遺伝子を発現する治療用細胞を生成又は調製する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、２つ（又はそれ以上）のベクターに組み込まれたポリヌクレオチドセットから目的の遺伝子を発現する治療用細胞を生成又は調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、宿主細胞中の染色体外ポリヌクレオチドとして維持される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、宿主細胞中のベクター（例えば、発現ベクター）中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド又はその部分構成成分は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。
本開示のいくつかの実施形態の発現ベクターを細胞に導入して、本開示の細胞を産生するために、様々な方法が使用され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１４）を参照されたい。
目的の遺伝子に核酸改変を導入する方法は、当該技術分野で周知である。例としては、標的相同組換え（例えば、「ヒット・エンド・ラン」、「二重置換」）、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐリコンビナーゼ）、ＰＢトランスポサーゼ（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏ１２、又はＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ）、操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集（例えば、メガヌクレアーゼーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、並びに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラットフォームを使用したゲノム編集が挙げられる。目的の遺伝子に核酸改変を導入するための薬剤は、公的に入手可能な供給源を使用して設計され得るか、又はＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、Ａｄｄｇｅｎｅ、及びＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に得られ得る。本開示のベクターは、これらの方法を利用して、本開示のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに組み込み得る。本開示のベクターは、本開示のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに組み込むためのこれらの方法の実施に必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込むのに適した様々なアプローチが当該技術分野で既知であり、ランダム組み込み又は部位特異的組み込み（例えば、「ランディングパッド」アプローチ）を含む。例えば、Ｚｈａｏ，Ｍ．ｅｌ ａｌ．（２０１８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：６１０５－６１１７、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：８５７２、及びＧａｉｄｕｋｏｖ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６：４０７２－４０８６を参照されたい。本開示のベクターは、これらの方法を利用して、本開示のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに組み込み得る。本開示のベクターは、本開示のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに組み込むためのこれらの方法の実施に必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
本開示の宿主細胞の培養に適した市販の培地の例としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰ ＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。
培養培地は、必要に応じて、ホルモン及び／若しくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース、又は等価エネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、当業者に明らかとなる。
ポリペプチド及び細胞代謝物の作製方法
本開示は、ポリペプチドを製造する方法を提供する。方法は、本開示の小分子で処理された本開示の細胞を利用し得る。
本開示は、ポリヌクレオチドセットを含むベクターを産生し、ベクターを細胞内に送達し（例えば、インビボ、インビボ、又はエクスビボ）、ポリヌクレオチドセットを発現させて細胞機能を提供及び／又は制御する方法を提供する。発現は、本開示の小分子によって調節され得る。
一実施形態では、方法は、（ａ）目的のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドセットを使用して細胞を改変して、産生細胞株をもたらす工程と、（ｂ）ポリペプチド産物の発現を促す条件下で産生細胞株を培養する工程と、（ｃ）本開示の小分子を細胞株に送達することによって、ポリペプチド産物の産生を調節する工程と、（ｄ）任意選択的に、発現されたポリペプチドを回収する工程とを含む。
一実施形態では、方法は、（ａ）目的のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドセットを使用して細胞を改変して、産生細胞株をもたらす工程と、（ｂ）ポリペプチド産物の発現を促す条件下で産生細胞株を培養する工程と、（ｃ）目的のポリペプチドを測定する工程と、（ｄ）本開示の小分子を細胞株に送達することによって、ポリペプチド産物の産生を調節する工程と、（ｄ）任意選択的に、発現されたポリペプチドを回収する工程とを含む。
発現されたポリペプチドは、例えば、無細胞抽出液から回収され得るか、又は培養培地から回収され得る。
一例では、目的のポリペプチド産物は、治療用タンパク質又はペプチドである。
目的のポリペプチド産物は、細胞内で産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、細胞は、溶解され得る。微粒子状破片は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去され得る。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現システムからの上清は、例えば、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、Ａｍｉ ｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、任意選択的に濃縮され得る。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害する前述の工程のいずれかに含まれ得、抗生物質が、外来汚染物の成長を防止するために含まれ得る。
ポリペプチドは、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、免疫親和性カラム又はイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、並びにゲル濾過を使用して精製され得る。
目的のポリペプチド産物は、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均質である調製物を得るように精製され得る。目的のポリペプチド産物は、薬学的用途のために十分に均質である調製物を得るように精製され得る。
本開示の実施形態は、本開示のポリヌクレオチドで形質転換された細胞を利用して、細胞代謝物を作製し得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドで形質転換された細胞は、基質を生成物、例えば、エタノール、アセトン、及びブタノールなどのアルコール生成物に転換するために使用され得る。代謝物としては、例えば、解糖、脂肪酸合成、ＴＣＡサイクル、リン酸化経路、及びペントースリン酸経路などの代謝経路の生成物が挙げられる。
細胞療法
本開示は、細胞療法を必要とする対象を治療する方法を提供する。方法は、（ａ）目的のポリペプチド産物をコードする治療用細胞を含む有効量の医薬組成物を対象に投与する工程と、（ｂ）治療有効量の小分子を対象に投与する工程とを含む。
一実施形態では、本開示は、その必要がある対象において、がん、例えば、腫瘍を治療するための方法を提供する。本明細書に開示される医薬組成物を使用して治療され得るがんの例としては、黒色腫、リンパ腫、肉腫、及び結腸、腎臓、胃、膀胱、脳（例えば、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫）、前立腺、膀胱、直腸、食道、膵臓、肝臓、肺、乳房、子宮、子宮頸部、卵巣、血液（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫）のがんが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本開示は、その必要がある対象においてＴ細胞媒介性免疫応答を制御する方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、対象における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供する。
遺伝子療法
本開示は、本開示のポリヌクレオチドセットを対象に送達する方法を提供する。本開示のポリヌクレオチドセットは、対象の細胞内に送達され得る。方法は、薬学的有効量のポリヌクレオチドセットを対象に投与することを含み得る。投与は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含むウイルス粒子の投与を介し得る。投与は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物の投与を介し得る。
方法は、（ａ）目的のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドセットを含む有効量の医薬組成物を対象に投与する工程と、（ｂ）治療有効量の小分子を対象に投与する工程と、（ｃ）対象における治療用ポリペプチドの産生を監視する工程と、（ｄ）任意選択的に、小分子の投与量を調整して、対象に対するポリペプチド産物の産生を所望のレベルに調整する工程とを含む。
対象は、哺乳動物対象であり得る。対象は、ヒト対象であり得る。
遺伝子療法のために選択され得る条件の例としては、がん、嚢胞性線維症、心疾患、糖尿病、血友病、及びＡＩＤＳが挙げられるが、これらに限定されない。
キット
本開示は、本開示のポリヌクレオチドと細胞へのポリヌクレオチドの送達のための調製物とを含む、キット又は製造品を提供する。ポリヌクレオチドは、ベクターの一部として提供され得る。いくつかの実施形態では、キット又は製造品は、目的のポリペプチドを産生するために、ポリヌクレオチドのセットを使用して、細胞を形質転換し、目的の遺伝子を発現するための説明書を更に含む。
いくつかの場合では、キットはまた、本開示の小分子も含み得る。
表
（表Ａ）標的配列
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（表１）完全ベクター挿入例
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（表２）ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを試験するためのＩＰＶベクター及びＴＦＶベクター
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（表３）２ベクターシステムを最適化するためのＩＰＶベクター及びＴＦＶベクター
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（表４）
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方法
遺伝子発現の標的化調節のための発現ベクターを、Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入及びフローサイトメトリー分析を使用して評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）から取得し、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。レンチウイルス形質導入について、製造会社が推奨する濃度（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴを加えた完全培地中で、レンチウイルスとＪｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。形質導入の１８時間後、レンチウイルス及びＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴを、３体積の新鮮な培地の添加によって希釈した。
正常なドナーからの、予め選択され、凍結保存された初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、Ｂｌｏｏｄｗｏｒｋｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）から取得した。ヒトＴ細胞を、免疫細胞血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｒ＆Ｄシステム）、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－７（Ｒ＆Ｄシステム）、及び２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄシステム）を補充したＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。
レンチウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ懸濁株中で標準プロトコルを使用して産生した。ウイルス上清を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用して製造業者のプロトコルに従って１０倍に濃縮した。
レンチウイルス形質導入について、Ｔ細胞を１：１００の希釈のＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で３０時間刺激した。次いで、ウイルスを１８～２４時間、Ｔ細胞に添加した。次いで、刺激及びウイルス感染を、ＴｒａｎｓＡｃｔを用いない７体積の新鮮な培地の添加によって終了させ、細胞を更に３～７日間培養した後に分析した。
フローサイトメトリーをＺｅ５サイトメーター（Ｂｉｏｒａｄ）上で実施した。細胞を、ダノプレビル又は等体積のＤＭＳＯを用いて２４時間にわたって誘導した後に分析した。蛍光タンパク質の発現を決定するために、１×１０５～２×１０５の総細胞を、Ｕ底９６ウェル培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２回洗浄し、次いで、１：１０００の希釈においてｅＦｌｕｏｒ－７８０固定可能生存色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。染色後、細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液で２回洗浄し、直ちに分析した。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ １０（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。分析中、該当する場合、ＢＦＰ又はＲＦＰ形質導入マーカーに基づいて、細胞を形質導入陽性細胞でゲーティングし、生／形質導入＋／ＧＦＰ＋細胞についてＧＦＰ ｇＭＦＩを決定した。
誘導性及び構成的ポリヌクレオチド
初期分割転写因子は、構成的プロモーター（ＭＮＤ）の制御下で発現された、ＮＳ３ａに融合されたＧａｌ４ ＤＢＤ及びＶＰＲｍｉｎｉ ＴＡＤに融合されたＤＮＣＲ２を含んだ。これらの転写単位（構成的プロモーター及び誘導性プロモーター）の両方を、レンチウイルス骨格のオールインワンベクターに、３つの異なる配向：一方向順方向、一方向逆方向、及び二方向ヘッドトゥヘッドで集合させた。図４は、一方向順方向（配列番号９６）、一方向逆方向（配列番号９５）、及び二方向ヘッドトゥヘッド（配列番号９７）の配向におけるレンチウイルス骨格中のオールインワンベクターの一例の概略図４００を示す。この実施例では、発現された誘導性遺伝子は、ＥＧＦＰであり、これは、増強ＧＦＰタンパク質（ＥＧＦＰ又はＧＦＰ）をコードする。発現された分割転写因子は、５ｘＧａｌ４－ＲＥ反復に結合して、最小ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）からの発現ＧＦＰを誘導する。
図５Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中での異なる体積の１０倍濃縮レンチウイルスを使用した、図４の３つのベクター配向の形質導入結果を示すプロット５００である。データは、ウイルスが首尾よく形質導入され、ダノプレビル処置後にＧＦＰを発現したＪｕｒｋａｔ細胞の割合がより高いことによってわかるように、一方向順方向ベクターが、より高力価のレンチウイルスを提供することにおいて明確な利点を有したことを示す。二方向ベクター構成が、中程度の力価のレンチウイルスをもたらした一方で、一方向逆方向ベクターは、低力価のウイルスをもたらした。
図５Ｂは、図４の一方向順方向又は二方向ベクターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞における、ダノプレビルのタイトレーションを示すプロット５１０である。データは、一方向順方向及び二方向のベクターにおけるダノプレビルのタイトレーションが、誘導されたＧＦＰ発現の類似の用量応答をもたらしたことを示し、二方向ベクターは、おそらく構成的プロモーター及び誘導性プロモーターの近接に起因する可能性がある、ダノプレビルの非存在下でのより高いバックグラウンドレベルのＧＦＰを示す。
誘導性及び構成的転写単位（すなわち、誘導性ポリヌクレオチド及び構成的ポリヌクレオチドの構成成分）は、２つのレンチウイルスベクターにわたって分割されて、ベクターのサイズがより小さいことに起因して、プロモーター間のクロストークを低減し、ウイルス収率を改善することができる。図６は、別々のレンチウイルスベクター上に構成的転写因子構成成分及び誘導性プロモーター構成成分を有する、２ベクターシステムの一例の概略図６００を示す。この実施例では、転写因子ベクター（ＴＦＶ１、配列番号１１３）はまた、形質導入マーカーとして構成的に発現された赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードし、誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ１、配列番号９８）はまた、形質導入マーカーとして構成的に発現された青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）もコードする。誘導性プロモーターベクターで発現された誘導性遺伝子は、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ又はＧＦＰ）である。
２ベクターシステムを評価するために、２つのレンチウイルスを別々に産生し、Ｊｕｒｋａｔ細胞又は初代ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞に同時形質導入した。ＴＦＶ１から発現された分割転写因子は、ＩＰＶ１上の５ｘＧａｌ４－ＲＥ反復に結合して、最小ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）からのＧＦＰ発現を誘導する。
図７Ａは、ダノプレビルの濃度上昇に応答した、形質導入陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＧＦＰ強度を示すプロット７００及びヒストグラム７１０である。形質導入マーカーＲＦＰに基づいて、細胞を形質導入陽性細胞でゲーティングし、生／形質導入＋／ＧＦＰ＋細胞についてＥＧＦＰ ｇＭＦＩを決定した。データは、Ｊｕｒｋａｔ細胞中、形質導入陽性細胞でゲーティングされた場合、ダノプレビル濃度が増加するにつれて、ＧＦＰピークの中央値が徐々にシフトすることを示す。これは、このシステムが、遺伝子産物の細胞内濃度（ここではＧＦＰ）が、誘導剤薬物の濃度によって細胞毎に調節されることを可能にすることを意味する、「タイトレーション能力」を示す。この観察は、細胞毎にバイナリ応答を示す他の小分子システム（例えば、ｔｅｔ誘導性）とは対照的である（Ｌｏｅｗ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｍｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１０）１０，８１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
図７Ｂは、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＧＦＰ強度の中央値を示すプロット７１５である。形質導入マーカーＢＦＰに基づいて、細胞を形質導入陽性細胞でゲーティングし、生／形質導入＋／ＧＦＰ＋細胞についてＥＧＦＰ ｇＭＦＩを決定した。このデータは、初代ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞中のＧＦＰの高い誘導を示す。
バックグラウンドＧＦＰ発現を、ダノプレビルの非存在下で観察した。使用した誘導性プロモーターが構成的漏出発現を有すると仮定して、我々は、誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ）中の最小プロモーターのパネルを試験することによって、このバックグラウンドを低減しようと努めた。試験した最小プロモーターのパネルは、以下を含んだ：ｍｉｎＣＭＶ（すなわち、ＩＰＶ２、配列番号９９）、ＹＢ＿ＴＡＴＡ（すなわち、ＩＰＶ３、配列番号１００）、最小ＩＬ２プロモーター（ｍｉｎＩＬ２）（すなわち、ＩＰＶ４、配列番号１０１）、最小ヒトβグロビンプロモーター（ｈｕＢＧ）（すなわち、ＩＰＶ５、配列番号１０２）、及びテトラサイクリン誘導性システムＴＲＥ３Ｇからのプロモーター領域（すなわち、ＩＰＶ６、配列番号１０３）（Ｅｄｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１６）５：３９５－４０４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、転写因子ベクターＴＦＶ１（配列番号１１３）と、誘導性プロモーターベクターＩＰＶ２～ＩＰＶ６のうちの１つとを同時形質導入した。
図８Ａは、５００ｎＭのダノプレビルに曝露された、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞、又は転写因子ベクターＴＦＶ１と誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ２～ＩＰＶ６）のうちの１つとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞から発現されたＥＧＦＰを示す、ヒストグラムプロット８００のパネルである。非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞及び同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のＤＭＳＯへの曝露を、ビヒクル対照として使用した。データは、試験した全ての最小プロモーターが、ダノプレビルに応答してＥＧＦＰの発現を誘導したことを示す。ＤＭＳＯに曝露された細胞中のＥＧＦＰのレベルは、非形質導入細胞と比較して、誘導性プロモーターベクターによるバックグラウンドＧＦＰの増加を示す。
図８Ｂは、転写因子ベクターＴＦＶ１と誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ２～ＩＰＶ６）のうちの１つとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞中の、５００ｎＭのダノプレビルに応答した誘導ＧＦＰ発現について、最大ＥＧＦＰ平均蛍光強度データ（ｇＭＦＩ）及び誘導倍率をそれぞれ示す、プロット８１０及びプロット８１５である。プロット８１５について、誘導倍率を、ＤＭＳＯに曝露された細胞（すなわち、ダノプレビル／ＤＭＳＯ条件）と比較した、ダノプレビルに曝露された細胞についてのＥＧＦＰ ｇＭＦＩとして計算した。
図８Ｃは、最も弱い最小プロモーターＹＢ＿ＴＡＴＡ（すなわち、ＩＰＶ３、配列番号１００）における、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベルを示す、プロット８２０及びヒストグラムプロット８２５である。
図８Ｄは、最も強い最小プロモーターであるｍｉｎＣＭＶ（ＩＰＶ２、配列番号９９）、ｈｕＢＧ（ＩＰＶ５、配列番号１０２）、ＴＲＥ３Ｇ（ＩＰＶ６、配列番号１０３）についての、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベル、及びｈｕＢＧについてのＥＧＦＰレベルをそれぞれ示す、プロット８３０及びヒストグラムプロット８３５である。
ここで図８Ａから図８Ｄを参照すると、データは、最小プロモーターＹＢ＿ＴＡＴＡ及びｍｉｎＩＬ２が、それらの最大誘導レベルで最も弱いことを示し、ｍｉｎＩＬ２は、不完全な活性化を示す（すなわち、一方の集団は、薬物誘導性発現を有し、他方は、構成的漏出発現を有する）。合成プロモーターであるＹＢ＿ＴＡＴＡは、最低のバックグラウンドＧＦＰレベル及び良好なタイトレーション能力を有するという利点を有したが、最低の最大誘導レベルを有した。３つの最強プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ、ＴＲＥ３Ｇ、ｈｕＢＧ）のうち、ｈｕＢＧは、最低のバックグラウンドレベルを有し、最高のＧＦＰの誘導倍率をもたらした。
我々は更に、ＹＢ＿ＴＡＴＡ及びｈｕＢＧ最小プロモーターで観察された残りのバックグラウンドＧＦＰレベルが、誘導性プロモーターベクター上の形質導入マーカーとしてのＢＦＰの発現を引き起こすために使用した、構成的ＭＮＤプロモーターのエンハンサーとのクロストークに起因した可能性があると仮定した。図９Ａは、形質導入マーカーＢＦＰの発現を引き起こす構成的プロモーターＭＮＤ、及びＥＧＦＰの発現を引き起こす最小誘導性プロモーターｈｕＢＧを示す、誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ５、配列番号１０２）の一例の概略図９００を示す。
観察されたバックグラウンドＧＦＰレベルが、ＭＮＤプロモーターとのクロストークに起因する可能性を調査するために、構成的ＭＮＤプロモーターを構成的ｈＰＧＫプロモーターで置き換えた。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、ＴＦＶ１（配列番号１１３）と、それぞれＭＮＤプロモーター及びｈＰＣＫプロモーターを利用するＩＰＶ５（配列番号１０２）又はＩＰＶ７（配列番号１０４）のいずれかとを同時形質導入した。ＤＭＳＯに曝露された、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞及び同時形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞を対照として使用した。
図９Ｂは、ＴＦＶ１と、ＩＰＶ５又はＩＰＶ７（それぞれＭＮＤ及びｈＰＣＫプロモーターを利用する）のいずれかとによって同時形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞中の正規化されたＧＦＰ発現レベルを示すヒストグラムプロット９１０及びヒストグラムプロット９１５である。ＤＭＳＯ状態と非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞との比較は、構成的ｈＰＣＫプロモーターが、誘導性プロモーターとのより少ないクロストーク及びより低いバックグラウンドＧＦＰレベルをもたらすことを示す。
図９Ｃは、ＴＦＶ１を同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞中のｈＰＧＫベクター（すなわち、ＩＰＶ７）における、ダノプレビルのタイトレーションに応答したＥＧＦＰ発現レベルを示すプロット９２０及びヒストグラムプロット９２５である。
ここで図９Ｂ及び図９Ｃを参照すると、データは、ＭＮＤプロモーターをｈＰＧＫプロモーターで置き換えることにより、バックグラウンドＧＦＰ発現が減少したことを示す。得られたＩＰＶ７ベクターは、転写因子ベクターＴＦＶ１を同時形質導入された場合、ＧＦＰ発現の広いダイナミックレンジを示した。我々は、レポーターベクターから構成的プロモーター及び形質導入マーカーを除去すると、漏出性が更に低減されると予想する。
転写因子構成成分
最小プロモーター及び構成的プロモーターの変化に加えて、小分子誘導性遺伝子発現システムの転写因子構成成分を最適化した。転写因子は、２つのポリペプチド鎖からなる分割転写因子であるため、第１の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び第２の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、リボソームスキッピング配列（例えば、Ｐ２ａ又はＴ２ａ）、ＩＲＥＳなどの分離要素によって分離されなければならないか、又は２つの別々の構成的プロモーターから発現されなければならない。簡潔に述べると、初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞に、誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１（ｓｙｎＰＡ－ｔａｇＢＦＰ－ＭＮＤ－ｂＧＨｐＡ－ｓｆＧＦＰ－ｍｉｎＣＭＶ－５ｘＧａｌ４ＲＥ、配列番号９８）と、以下を含む転写因子ベクターのいずれかとを同時形質導入した：
（ｉ）Ｇａｌ４ＤＢＤ－ＮＳ３ａポリヌクレオチド及びＤＮＣＲ２－ＴＡＤポリヌクレオチドを分離する、２つの２ａ配列（ＴＦＶ１：ＮＤ－Ｇａｌ４ＤＢＤ－ＮＳ３ａ－Ｔ２ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２ａ－ＤＮＣＲ２－ＶＰＲ、配列番号１１３）、
（ｉｉ）ａＧａｌ４ＤＢＤ－ＮＳ３ａポリヌクレオチド及びＤＮＣＲ２－ＴＡＤポリヌクレオチドを分離する、単一の２ａ配列（ＴＦＶ２：ＭＮＤ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｔ２ａ－Ｇａｌ４ＤＢＤ－ＮＳ３ａ－Ｐ２ａ－ＤＮＣＲ２－ＶＰＲ、配列番号１１４）、又は
（ｉｉｉ）ＮＳ３ａ－ＴＡＤポリヌクレオチド及びＧａｌ４ＤＢＤ－ＤＮＣＲ２ポリヌクレオチドを分離する、２つの２ａ配列（ＴＦＶ３：ＭＮＤ－ＮＳ３ａ－ＶＰＲ－Ｔ２ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２ａ－Ｇａｌ４ＤＢＤ－ＤＮＣＲ２、配列番号１１５）。
この実施例では、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、ＶＰＲｍｉｎｉ（「ＶＰＲ」）である。同時形質導入された細胞を５００ｎＭのダノプレビル又はＤＭＳ０（対照）に曝露し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。
図１０はそれぞれ、ＩＰＶ１と、ＴＦＶ１、ＴＦＶ２、又はＴＦＶ３のいずれかとを同時形質導入され、ダノプレビル又はＤＭＳＯに曝露された細胞中のＧＦＰレベルを示す、ヒストグラムプロット１０００、１０１０、及び１０１５である。データは、転写因子構成成分間の単一の２ａ要素（ＴＦＶ２）が、融合ＮＳ３ａ－ＤＢＤ－ＤＮＣＲ２－ＴＡＤタンパク質のある程度の産生をもたらす不完全な翻訳スキッピングからである可能性が高い、２つの２ａ要素（ＴＦＶ１）よりも高いバックグラウンドＧＦＰ発現をもたらしたことを示す。更に、転写因子の融合パートナーは交換され得、ＤＮＣＲ２はＧａｌ４に融合され、ＮＳ３ａはＶＰＲｍｉｎｉに融合された（ＴＦＶ３）。ＴＦＶ３は、転写因子構成成分を分離する２つの２ａ配列を有し、ダノプレビル処置後に、ＴＦＶ１と類似したバックグラウンドＧＦＰレベル及びＧＦＰの誘導の成功をもたらした。
遺伝子発現システムを他のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）に一般化するために、４つのジンクフィンガー（ＺＦ）及び４つのＴＡＤのパネルを試験した。試験した４つのＺＦ（ＺＦＨＩＶ２、ＺＦ１、ＺＦ２、及びＺＦ３）については、以前に記載されている（Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：５１８０－５１８７、Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０２０）１１、及びＫｈａｌｉｌ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１２）１５０：６４７－６５８（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。４つのＺＦの各々をＮＳ３ａに融合した。試験したＮＳ３ａ融合タンパク質は、ＮＳ３ａ－ＺＦＨＩＶ２（配列番号７１）、ＮＳ３ａ－ＺＦ１（配列番号６８）、ＮＳ３ａ－ＺＦ２（配列番号６９）、及びＮＳ３ａ－ＺＦ３（配列番号７０）であった。誘導性プロモーターベクターについて、ＺＦ応答要素であるＨＩＶ２ＲＥ（配列番号１４３）、ＺＦ１ＲＥ（６ｘＺＦ１ＲＥ、配列番号８５）、ＺＦ２ＲＥ（６ｘＺＦ２ＲＥ、配列番号８６）、ＺＦ３ｖ１ＲＥ（６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ、配列番号８７）、及びＺＦ３ｖ３ＲＥ（配列番号８８）の６回反復を、ＹＢ＿ＴＡＴＡ最小プロモーター（配列番号７７）の前でコードした。２つの異なる６ｘＲＥコードがＺＦ３に使用され、ＲＥ配列に隣接するヌクレオチドが変化したことに留意されたい：ＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）及びＺＦ３ｖ３ＲＥ（配列番号８８）。異なるジンクフィンガータンパク質融合を、５ｘＧａｌ４ＲＥ及びＹＢ＿ＴＡＴＡ最小プロモーターベクターＩＰＶ８（配列番号１０５）を用いて、ＮＳ３ａ－Ｇａｌ４ ＤＢＤ融合タンパク質（Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ、配列番号６５）と比較した。簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ細胞に、誘導性プロモーターベクター（ＩＰＶ）と、その同族転写因子ベクター（ＴＦＶ）とを同時形質導入した。細胞を、５００ｎＭのダノプレビル又は等体積のＤＭＳＯで２４時間誘導した後、フローサイトメトリーによって分析した。使用したベクターを表２に示す。
図１１は、５００ｎＭのダノプレビルを用いた処理に応答した、４つのジンクフィンガー（ＺＦ）ＤＢＤ－ＮＳ３ａ融合タンパク質及び４つのＤＮＣＲ２－ＴＡＤ融合タンパク質についての、ＧＦＰ発現（ｇＭＦＩ）を示すプロット１１００である。全てのＩＰＶ（ＩＰＶ８～ＩＰＶ１３）が、最小プロモーターとしてＹＢ＿ＴＡＴＡを利用し、それらの同族ＴＦＶ（ＴＦＶ４～ＴＦＶ１８）と共に使用される。レポーター単独は、誘導性プロモーターベクターのみを形質導入されたＪｕｒｋａｔｓからのＧＦＰレベルを示す。比較のために、ＶＰＲｍｉｎｉを有するＧａｌ４を示す。このデータは、ＺＦＨＩＶ２及びＺＦ３（ＺＦ３ｖ３ＲＥを有する）が、最も高い誘導されたＧＦＰレベルをもたらしたことを示す。ＺＦ２はまた、高いＧＦＰレベルももたらしたが、そのレポーター配列は、高いバックグラウンドＧＦＰレベルをもたらした（「レポーター単独」条件）。ＶＰＲｍｉｎｉが、最も強い転写活性化ドメインである一方で、ＶＰ６４－ＲＴＡ及びｐ６５－ＨＳＦ１（全ヒト構成成分から構成されたＴＡＤ）は両方とも、中程度の誘導レベルを示した。ｐ６５単独は、非常に弱かった。比較すると、ＶＰＲｍｉｎｉを有するＧａｌ４システムは、ＺＦ３及びＺＦＨＩＶ２よりも弱い最大誘導をもたらし、これらのヒト由来ジンクフィンガー配列が、酵母由来Ｇａｌ４ ＤＢＤと同程度又はより良好な遺伝子誘導をもたらすことを示す。
更に、ＧＦＰ発現の誘導を増加させるために、２つの異なる戦略を使用した。第１の戦略では、ＺＦＨＩＶ２又はＺＦ３について、ＲＥ反復の数を６ｘ（ＩＰＶ９、ＩＰＶ１３）から１２ｘ（ＩＰＶ１４、ＩＰＶ１５）に増加させた。誘導を増加させる第２の戦略は、ロイシンジッパーホモ二量体配列（ＬＺ）（ＴＦＶ１９、ＴＦＶ２０）を用いてＮＳ３ａ－ＺＦ構築物を二量体化することである。
図１２Ａ及び１２Ｂは、誘導性プロモーター上のＤＮＣＲ２－ＶＰＲｍｉｎｉによって誘導されたＧＦＰ発現（ｇＭＦＩ）が、ＺＦＨＩＶ２若しくはＺＦ３について６ＸＲＥ又は１２ＸＲＥを含むことを示すプロット１２００及びプロット１２１０である。この実施例では、ジンクフィンガーは、ＮＳ３ａに直接融合されたか、又はＮＳ３ａドメインとＺＦドメイン（ＴＦＶ１９、ＴＦＶ２０）との間のホモ二量体ロイシンジッパー（ＬＺ）と融合された。データは、ＺＦ３からの誘導の増加を示すが、ＺＦＨＩＶ２からの誘導の低下を示す。データは、ＺＦＨＩＶ２についてより高い最大誘導を示すが、ＺＦ３についてはより低い誘導を示し、使用されているＤＢＤに対するこの戦略のある程度の依存を示す。
遺伝子カーゴ容量が限定されているウイルスベクターにおける誘導性遺伝子発現システムのコードを改善するために、我々は、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェアパッケージを使用して、我々の小分子によって誘導された二量体のサイズを縮小する新しい設計を作り出した（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２０１１）４８７：５４５－７４（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。具体的には、我々は、ＤＮＣＲ２及びＧＮＣＲ１（配列ＤＮＣＲ２＿１～ＤＮＣＲ２＿３４（配列番号１２～４５）及びＧ－３ｒｅｐ（配列番号４８）、Ｇ３３（配列番号４９）、並びにＧ３８（配列番号５０））におけるヘリックスの数及び長さを縮小する設計を作り出し、続いて、以前に記載された設計方法（Ｂｒｕｎｅｔｔｅ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２８（７５８３）：５８０－４、及びＢｒｕｎｅｔｔｅ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０２０）１１７（１６）８８７０－８８７５（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））を使用して、これらの短縮を包囲する領域のアミノ酸配列を再設計した。
幅広い短縮度及び配列多様性を有するこれらの設計のパネルを、ＮＳ３ａ／ダノプレビルに結合するそれらの能力について試験した。最小化ＤＮＣＲ２及びＧＮＣＲ１設計を、ＥＢＹ １００サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の表面上に発現させ、フローサイトメトリーによって分析した。簡潔に述べると、Ａｖｉ－Ｈｉｓ６タグ付きＮＳ３ａを、ＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のビオチンリガーゼＢｉｒＡと共発現させ、ビオチン化ＮＳ３ａを、標準的なＨｉｓタグ精製手順に従って溶解細胞から精製した。ＤＮＣＲ２及びＧＮＣＲ１設計を、発現検出用のｃ－ｍｙｃタグを有する標準的な酵母提示ベクターｐＥＴＣＯＮ中のＡｇａ２ｐへの融合を介して、ＥＢＹ１００ Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の表面上に発現させた。ＮＳ３ａ複合体を、過剰なダノプレビル又はグラゾプレビル（ＡｐｅｘＢｉｏ）を含むＰＢＳ＋０．５％ｗ／ｖのＢＳＡ中で形成させた。ＮＳ３ａ／薬物複合体を、設計を発現する酵母と室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。酵母細胞を、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ８６６）及び抗ｍｙｃ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃２２３３Ｓ）と共に１０分間インキュベートし、洗浄した後、ＢｉｏＲａｄ ＺＥ５フローサイトメーターで分析した。
図１３Ａは、ＤＮＣＲ２／ダノプレビル／ＮＳ３ａの結晶構造、並びにＤ－１（ＤＮＣＲ２＿１、配列番号１２）、Ｄ－９（ＤＮＣＲ２＿９、配列番号２０）、及びＤ－２０（ＤＮＣＲ２＿２０、配列番号３１）設計のモデルを示す概略図である。図１３Ｂは、酵母上に提示される４つのＤＮＣＲ２バリアントへのＮＳ３ａ／ダノプレビル結合のタイトレーションについての、ＮＳ３ａ結合強度（ＰＥ）の中央値を示すプロット１３１０である。酵母の表面に設計を提示し、ＮＳ３ａ／ダノプレビルを酵母においてタイトレーションし、フローサイトメトリーによって観察した。多数のＤＮＣＲ２最小化設計は、元のＤＮＣＲ２（配列番号１１）よりもかなり小さく、ＮＳ３ａ／ダノプレビルへの結合を維持した。Ｄ－１及びＤ－９が、ＤＮＣＲ２と同等の結合を示した一方で、Ｄ－２０（５７アミノ酸での設計の成功が最小）は、より弱い結合を示した。
図１４Ａは、ＧＮＣＲ１（Ｇ－３ｒｅｐ短縮が示されている）、Ｇ－３３、及びＧ－３８のモデルを示す概略図１４００である。図１４Ｂは、それぞれ、ＧＮＣＲ１に結合するＮＳ３ａ／グラゾプレビルのタイトレーション、並びに酵母上に提示されるＧ－３ｒｅｐ、Ｇ－３３、及びＧ－３８上のＮＳ３ａ／グラゾプレビルのプロット１４１０及びプロット１４１５のタイトレーションである。ＧＮＣＲ１について、元のＧＮＣＲ１（配列番号４７）と比較して結合が低減したにも関わらず、ＮＳ３ａへの中程度の結合を保持した３つの設計（すなわち、Ｇ－３ｒｅｐ、Ｇ３３、及びＧ３８）が特定された。
２ベクターシステムの最適化
２ベクターシステムを更に最適化するために、我々は、（ｉ）転写因子及び誘導性プロモーターベクター構築物のサイズを縮小することと、（ｉｉ）誘導性プロモーター構築物からのバックグラウンド発現（すなわち、「漏出性」）を低減することに努めた。
転写因子及び誘導性プロモーターベクターのサイズを縮小するために、形質導入マーカー（すなわち、ＲＦＰ及びＢＦＰ）を両方のベクターから除去した。図６を参照して上述したように、元の転写因子ベクターＴＦＶ１は、転写因子構成成分を分離するＴ２ａ－ＲＦＰ－Ｐ２ａ配列を含み、誘導性プロモーターベクターは、構成的プロモーター－ＢＦＰ配列を含んだ。２ベクターシステムを最適化するためのＩＰＶベクター及びＴＦＶベクターを表３に示す。
図１５は、構成的転写因子及び誘導性プロモーターレンチウイルスベクターから形質導入マーカーを除去した、改変２ベクターシステムの一例の概略図を示す。この実施例では、転写因子ベクターＴＦＶ２１は、ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４ＤＢＤ－ＮＳ３ａ）及び転写活性化ドメイン（ＤＮＣＲ２－ＶＰＲｍｉｎｉ）構成成分を分離する、それら（Ｔ２ａ～Ｐ２ａ）間にＲＦＰ配列がない２つの連続的な２ａリボソームスキッピング要素を含む。誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１６、誘導性プロモーター（ｈｕＢＧ）、及びＥＧＦＰを順方向に、構成的プロモーター及びＢＦＰ形質導入マーカーをコードする配列を除去した。ＩＰＶ１６における構成的プロモーター－ＢＦＰ配列の除去は、ベクターのサイズを縮小し、構成的プロモーターと誘導性プロモーターとの間のクロストークの可能性を除去したが、我々は、これが、バックグラウンドＥＧＦＰ漏出性に影響を与える可能性があったことを示している（図９を参照されたい）。
改変発現ベクターＴＦＶ２１及びＩＰＶ１６を、Ｔ細胞（すなわち、Ｊｕｒｋａｔ及びＨＥＫ２９３Ｔの細胞株）のレンチウイルス形質導入、並びにフローサイトメトリー分析を使用して評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）から取得し、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。レンチウイルス形質導入について、製造会社が推奨する濃度（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴを加えた完全培地中で、レンチウイルスとＪｕｒｋａｔ細胞をインキュベートした。形質導入の１８時間後、レンチウイルス及びＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴを、３体積の新鮮な培地の添加によって希釈した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）（カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）から取得し、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＤＭＥＭ、高グルコース培地中で維持した。レンチウイルス形質導入について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入の２４時間前に約３０％のコンフルエントで播種し、次いで、完全培地中でレンチウイルスとインキュベートした。形質導入の２４～４８時間後に、細胞をより大きい体積のウェルに継代した。フローサイトメトリーを、本質的に上述したように実施した。
図１６は、ＩＰＶ１６と、ＴＦＶ１又はＴＦＶ２１のいずれかとを同時形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３細胞中のＧＦＰレベルを示す、ヒストグラムプロットのパネルである。形質導入された細胞を、５００ｎＭのダノプレビル又は２０ｎＭのダノプレビルで処理し、同体積のＤＭＳで処理した形質導入された細胞及び非形質導入の野生型ＨＥＫ２９３細胞と比較した。ヒストグラムは、生きている単一細胞を示す。データは、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＨＥＫ２９３細胞中、ＩＰＶ１６は、ＴＲＶ１又はＴＦＶ２１とともに形質導入された場合に、野生型細胞と比較して、非常に低いレベルのＧＦＰ漏出性を示したことを示す。この結果は、誘導性プロモーターベクター上の構成的プロモーターの除去が、漏出性の重要な原因を除去することを実証した。ＴＦＶ１及びＴＦＶ２１は、非常に類似したバックグラウンドＧＦＰ及び誘導されたＧＦＰレベルを示し、連続的なＴ２ａ－Ｐ２ａ要素が、形質導入マーカーを含有する分離要素に対する実行可能な代替物であることを示す。
システムにおける何らかの残存漏出性を低減するために、我々は、Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ ＤＮＡ結合ドメインの分解、又はＧａｌ４－ＫＲＡＢ（配列番号１５９）を用いた基本転写のエピジェネティック阻止のいずれかによって、ダノプレビルの非存在下でのＥＧＦＰ発現を低減するように設計された戦略のパネルを試験した。Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ結合ドメインを分解するために、我々は、Ｅ３リガーゼＳＰＯＰ（配列番号１５６）を、Ｇａｌ４－ＮＳ３ａとの相互作用を介して誘導性プロモーターに局在化させるための２つのアプローチを試みた。１つのアプローチでは、我々は、二等分した構成的タンパク質ヘテロ二量体結合対（ＤＨＤ３７－２Ｂ及びＤＨＤ３７－２Ｂ）を、Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ（Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ－ＤＨＤ３７－２Ｂ、配列番号１６１）及びＳＰＯＰ（ＤＨＤ３７－２Ａ－ＳＰＯＰ、配列番号１６０）に融合して、ダノプレビル処置に関わらず、プロモーターにおいて常にＥ３リガーゼ活性があるであろうシステムを生成した。別のアプローチでは、我々は、ＳＰＯＰをａｐｏ－ＮＳ３ａリーダーＡＮＲ（ＡＮＲ－ＳＰＯＰ、配列番号１５７）に融合することによって、ＳＰＯＰが、ダノプレビルの非存在下で誘導性プロモーターにのみ局在化するシステムを生成した。ＮＳ３ａへのＡＮＲ結合は、ＮＳ３ａ小分子阻害剤のいずれかによって解離され得る。我々は、ＨＥＫ２９３細胞中の通常のＩＰＶ１６／ＴＦＶ１の組み合わせに対するこれらのアプローチおよび各ベクター対についての非形質導入の野生型ＨＥＫ２９３細胞の自己蛍光のレベルから、バックグラウンド（ＤＭＳＯ対照）及びダノプレビル誘導性（１００ｎＭのダノプレビル）ＥＧＦＰ発現レベルを比較した。
図１７は、通常のＩＰＶ１６ベクター及びＴＦＶ１ベクターを形質導入された、又はＥＧＦＰ生成量を低減するように設計された要素を発現するベクターを形質導入されたＨＥＫ２９３細胞中のＥＧＦＰ発現を示す、ヒストグラムプロットのパネルである。プロット１７００は、通常の誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１６と転写因子ベクターＴＦＶ１とを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７１０は、誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１９から発現されるＤＨＤ－ＳＰＯＰと、転写因子ベクターＴＦＶ２４から発現されるＧａｌ４－ＮＳ３ａ－ＤＨＤとを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７１５は、誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１７から発現されるＧａｌ４－ＫＲＡＢと、転写因子ベクターＴＦＶ１とを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７２０は、誘導性転写ベクターＩＰＶ１６と、転写因子ベクターＴＦＶ２２から発現されるＧａｌ４－ＫＲＡＢとを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７２５は、誘導性プロモーターベクターＩＰＶ１８と、転写因子ベクターＴＦＶ１から発現されるＡＮＲ－ＳＰＯＰとを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７３０は、誘導性転写ベクターＩＰＶ１６と、転写因子ベクターＴＦＶ２３から発現されるＡＮＲ－ＳＰＯＰとを同時形質導入された細胞中のＧＦＰ発現を示す。プロット１７００、１７１０、１７１５、及び１７２５を、単一の生きているＴＦＶ形質導入陽性事象上でゲーティングした。プロット１７２０及び１７３０を、生きている単一細胞上でゲーティングした。
図１７のプロット１７００は、ＨＥＫ２９３細胞中の通常のＩＰＶ１６／ＴＦＶ１の組み合わせにおけるバックグラウンド（ＤＭＳＯ対照）及びダノプレビル誘導性ＥＧＦＰ発現レベルを示し、これは、ＩＰＶ１６のより高い形質導入レベルにおいて少量のＥＧＦＰ漏出発現を示し得る。
ここで図１７のプロット１７１５及び１７２０を参照すると、誘導性発現ベクター（プロット１７１５）から誘導的に、又は転写因子ベクター（１７２０）から構成的に発現されたＧａｌ４－ＫＲＡＢは、ＥＧＦＰ漏出発現及びダノプレビル誘導性ＥＧＦＰ発現の両方を阻止し、このエピジェネティック戦略が強すぎることを示す。
ここで図１７のプロット１７１０を参照すると、我々は、二等分した構成的タンパク質ヘテロ二量体結合対（ＤＨＤ３７－２Ｂ及びＤＨＤ３７－２Ｂ）を、Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ（Ｇａｌ４－ＮＳ３ａ－ＤＨＤ３７－２Ｂ）及びＳＰＯＰ（ＤＨＤ３７－２Ａ－ＳＰＯＰ）に融合して、ダノプレビル処置に関わらず、プロモーターにおいて常にＥ３リガーゼ活性があるであろうシステムを生成した。プロット１７１０は、ＥＧＦＰ漏出発現の低減に有効であるが、このＤＨＤ－ＳＰＯＰ戦略がまた、ダノプレビル誘導性ＥＧＦＰ発現を強力に低減したことを示す。
ここで図１７のプロット１７２５及び１７３０を参照すると、我々は、ＳＰＯＰをａｐｏ－ＮＳ３ａリーダーＡＮＲ（ＡＮＲ－ＳＰＯＰ）に融合することによって、ＳＰＯＰが、ダノプレビルの非存在下で誘導性プロモーターにのみ局在化するシステムを生成した。ＡＮＲ－ＳＰＯＰが誘導的（プロット１７２５）又は構成的（プロット１７３０）に発現された場合、これは、ＥＧＦＰの任意のバックグラウンド漏出発現を効果的に除去した。誘導性ＡＮＲ－ＳＰＯＰ発現はまた、より高いＡＮＲ－ＳＰＯＰ発現レベルに起因する可能性が高い、最大ダノプレビル誘導性ＥＧＦＰ発現を低減した。対照的に、転写因子ベクターから発現されたＡＮＲ－ＳＰＯＰ（プロット１７３０）は、高いダノプレビル誘導性発現を維持しながら、ダノプレビルの非存在下で、バックグラウンドＥＧＦＰ発現を効果的に低減した。ダノプレビル処置を用いたプロット１７３０における陰性集団の蛍光レベルのわずかなシフトは、ＡＮＲ－ＳＰＯＰの抑制効果が、誘導性プロモーターと基本的に会合する転写機構に作用することを反映し得る。ＤＨＤシステム又はＡＮＲに融合された他のＥ３リガーゼは、バックグラウンド発現の低減に類似した効果を有すると予想された。
構成的ＡＮＲ－ＳＰＯＰ発現あり（ＩＰＶ１６／ＴＦＶ２３）及びなし（ＩＰＶ１６／ＴＦＶ１）で、システムの性能をより厳密に比較するために、ダノプレビルのタイトレーションに対するＥＧＦＰ発現の用量応答を検査した。図１８は、通常のＩＰＶ１６／ＴＦＶ１の組み合わせからの、及びＡＮＲ－ＳＰＯＰを発現する転写因子ベクターＴＦＶ２３を伴うＩＰＶ１６からの、ＥＧＦＰバックグラウンドレベルの比較、及びタイトレーション可能なＥＧＦＰ発現を示す、プロットのパネルである。プロット１８００は、ＤＭＳＯで処理した、ＩＰＶ１６／ＴＦＶ１の組み合わせ（ＡＮＲ－ＳＰＯＰなし）又はＩＰＶ１６／ＴＦＶ２３の組み合わせ（ＡＮＲ－ＳＰＯＰあり）を形質導入されたＨＥＫ２９３細胞と比較した、野生型（ｗｔ）ＨＥＫ２９３細胞についてのバックグラウンドＥＧＦＰレベルを示す。プロット１８１０は、２つの構築物の組み合わせにおけるダノプレビルのタイトレーションについてプロットされたＥＧＦＰの幾何平均蛍光強度（ｇＭＲＩ）を示す。プロット１８１５及び１８２０は、プロット１８１０にプロットされたデータについてのＥＧＦＰ発現のヒストグラムを示す。
ここで図１８のプロット１８００を参照すると、ＡＮＲ－ＳＰＯＰを有するシステムが、野生型ＨＥＫ２９３細胞と区別できないバックグラウンドＥＧＦＰ発現レベルを有し、ＡＮＲ－ＳＰＯＰを有しないシステムよりも約３倍低いことが確認された。
ここでプロット１８１０、１８１５、及び１８２０を参照すると、２つのシステムにおけるダノプレビルのタイトレーションは、同等のダノプレビルＥＣ５０レベル及び最大発現レベルを実証した。

Claims (159)

  1. 二量体化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、応答要素に特異的に結合する、融合タンパク質。
  2. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガラクトース活性化転写因子４（Ｇａｌ４）配列、ジンクフィンガー１（ＺＦ１）配列、ジンクフィンガー２（ＺＦ２）配列、ジンクフィンガー３（ＺＦ３）配列、ジンクフィンガーＨＩＶ２（ＺＦＨＩＶ２）配列、ジンクフィンガーホメオドメイン１（ＺＦＨＤ１）配列、触媒不活性型Ｃａｓ１２ａ（ｄＣａｓ１２ａ）配列、触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）配列、触媒不活性型ＣａｓＰｈｉ（ｄＣａｓＰｈｉ）配列、及びＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（ＴＡＬＥ）配列のうちの１つ以上に由来する配列を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｇａｌ４（配列番号５６）、ＺＦ１（配列番号５７）、ＺＦ２（配列番号５８）、ＺＦ３（配列番号５９）、ＺＦＨＩＶ２（配列番号６０）、及びＺＦＨＤ１（配列番号１６５）のうちの１つ以上の配列を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  5. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ１２ａ配列（配列番号１６６）に由来する配列を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６６と比較して、以下の位置：１７６、１９２、３８２、５４８、６０４、６０７、７８０、７８３、９０８、９５１、９５５、９５８、９９３、１２２６、１２３８、及び１２６３のうちの１つ以上における置換を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  6. 前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６６と比較して、以下の置換：Ｒ１７６Ａ、Ｒ１９２Ａ、Ｗ３８２Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ７８０Ａ、Ｇ７８３Ｐ、Ｄ９０８Ｐ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ９５５Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｅ９９３Ｐ、Ｒ１２２６Ａ、Ｄ１２３８Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）に由来する配列を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６７と比較して、以下の位置：１０、１５、６６、７０、７４、７８、１６５、４７５～４７７、７６２、８４０、８５４、８６３、９８２、９８３、９８６、１１２５～１１２７、１１３２、及び１３３３～１３３５のうちの１つ以上における置換を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６７と比較して、以下の置換：Ｄ１０Ａ、Ｓ１５Ａ、Ｒ６６Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ１６５Ａ、４７５～４７７のＰＷＮ－ＡＡＡ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ｄ９８６Ａ、１１２５～１１２７のＤＷＤ－ＡＡＡ、Ｇ１１３２Ｃ、Ｒ１３３３Ａ、Ｒ１３３５Ａ、及び１３３３～１３３５のＲＫＲ－ＡＫＡのうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６７と比較して、以下の置換：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９配列（配列番号１６７）に由来する配列を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６７と比較して、以下の欠失：９７～１５０、１７５～３０７、３１２～４０９、及び１０９９～１３６８のうちの１つ以上を含む、請求項１～２又は７～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＣａｓＰｈｉ配列（配列番号１６８）に由来する配列を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６８と比較して、以下の位置：３３、１２６、１２７、１３０、３６７、３７１、３７３、３９４、及び６０６のうちの１つ以上における置換を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  12. 前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６８と比較して、以下の置換：Ｋ３３Ａ、Ｖ１２６Ａ、Ｑ１２７Ａ、Ｎ１３０Ａ、Ｖ１２６Ａ／Ｑ１２７Ａ／Ｎ１３０Ａ、Ｋ３６７Ａ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７３Ａ、Ｋ３６７Ａ／Ｋ３７１Ａ／Ｋ３７３Ａ、Ｄ３９４Ａ、及びＥ６０６Ｑのうちの１つ以上を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＣａｓＰｈｉ配列（配列番号１６８）に由来する配列を含み、前記ＤＮＡ結合ドメイン配列が、配列番号１６８と比較して、以下の欠失：１～４５のうちの１つ以上を含む、請求項１～２又は１１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ配列（配列番号１６９）に由来する配列を含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  15. 前記応答要素を細胞が含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記応答要素を細胞核が含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記応答要素を染色体が含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記応答要素が、内因性配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記応答要素が、外因性配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 前記応答要素が、前記応答要素の配列の少なくとも１回の反復を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. 前記応答要素が、前記応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  22. 前記応答要素が、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）、及び１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む、請求項１～２又は１５～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  23. （ａ）前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｇａｌ４ＤＢＤ（配列番号５６）を含み、かつ前記応答要素が、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）を含む、又は
    （ｂ）前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦ１（配列番号５７）を含み、かつ前記応答要素が、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）を含む、又は
    （ｃ）前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦ２（配列番号５８）を含み、かつ前記応答要素が、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）を含む、又は
    （ｄ）前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦ３（配列番号５９）を含み、かつ前記応答要素が、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、及び１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）のうちの１つ以上を含む、又は
    （ｅ）前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＺＦＨＩＶ２（配列番号６０）を含み、かつ前記応答要素が、１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）を含む、
    請求項１～２又は１５～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  24. アミノ末端からカルボキシ末端へと、前記ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、及び前記二量体化ドメインを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. 前記リンカーが、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、アミノ酸配列、及びポリマーのうちの１つ以上を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
  26. 前記リンカーが、
    ＧＧＧＧＳの配列を含むか、又は
    ２～２０アミノ酸の長さを含むか、又は
    グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）を含む配列を含む、
    請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。
  27. 前記リンカーが、オリゴマー化ドメインを含む、請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。
  28. 前記オリゴマー化ドメインが、配列番号１、２、３、４、又は５の配列を含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
  29. 前記二量体化ドメインが、ＮＳ３ａポリペプチドを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  30. 前記ＮＳ３ａポリペプチドが、配列番号６、７、８、９、６６、１３３、又は１３４の配列を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
  31. 前記ＮＳ３ａポリペプチドが、配列番号６５、６８～７３、又は１５３の配列を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
  32. 前記二量体化ドメインが、ＤＮＣＲポリペプチドを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  33. 前記ＤＮＣＲポリペプチドが、配列番号１１～４６の配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
  34. 前記ＤＮＣＲポリペプチドが、配列番号５５の配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
  35. 前記二量体化ドメインが、ＧＮＣＲポリペプチドを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  36. 前記ＧＮＣＲポリペプチドが、配列番号４７～５０の配列を含む、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  37. 分解ドメインを更に含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  38. 前記分解ドメインが、配列番号１５６又は１６０の配列を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  39. 切断可能なペプチドを更に含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  40. 前記切断可能なペプチドが、Ｐ２Ａ配列又はＴ２Ａ配列を含む、請求項３７に記載の融合タンパク質。
  41. 前記Ｐ２Ａ配列が、配列番号７４の配列を含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
  42. 前記Ｔ２Ａ配列が、配列番号７５の配列を含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
  43. 前記切断可能なペプチドが、配列番号１３５又は１３６の配列を含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  44. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  45. 内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を更に含む、請求項４２に記載の核酸。
  46. 前記ＩＲＥＳが、配列番号１６３の配列を含む、請求項４３に記載の核酸。
  47. プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び翻訳後調節要素（ＰＲＥ）のうちの１つ以上を更に含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の核酸。
  48. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含む、請求項４５に記載の核酸。
  49. 前記誘導性プロモーターが、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター（配列番号７７）、ヒトβグロビンプロモーター（ｈｕＢＧ）（配列番号７８）、ｍｉｎＩＬ２プロモーター（配列番号７９）、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーター（配列番号８０）、及びＴＲＥ３Ｇプロモーター（配列番号８１）から単離された又はそれらに由来する配列を含む、請求項４６に記載の核酸。
  50. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項４５に記載の核酸。
  51. 前記構成的プロモーターが、ＭＮＤプロモーター（配列番号８２）、ｈＰＧＫプロモーター（配列番号８３）、ＣＭＶプロモーター（配列番号１３７）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１３８）、ＳＦＦＶプロモーター（配列番号１３９）、ＥＦ１αプロモーター（配列番号１４０）、ＵＢＣプロモーター（配列番号１４１）、及びＣＤ４３プロモーター（配列番号１４２）から単離された又はそれらに由来する配列を含む、請求項４８に記載の核酸。
  52. 請求項４２～４９のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  53. 哺乳動物細胞中で前記核酸の発現を引き起こすことができる発現ベクターを含む、請求項５０に記載のベクター。
  54. 前記発現ベクターが、プラスミドを含む、請求項５１に記載のベクター。
  55. 前記核酸を哺乳動物細胞に導入することができる送達ベクターを含む、請求項５０に記載のベクター。
  56. 前記送達ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、リポソーム、ミセル、ポリマーソーム、及びナノ粒子のうちの１つ以上を含む、請求項５０に記載のベクター。
  57. 前記ウイルスベクターが、ウイルスゲノムから単離された又はウイルスゲノムに由来する１つ以上の配列を含む、請求項５１に記載のベクター。
  58. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項５０～５５のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  59. 哺乳動物細胞である、請求項５６に記載の細胞。
  60. ヒト細胞である、請求項５６に記載の細胞。
  61. 体細胞である、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の細胞。
  62. 幹細胞である、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の細胞。
  63. ヒト胚性幹細胞ではない、請求項６０に記載の細胞。
  64. エクスビボ又はインビトロにある、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の細胞。
  65. インビボにある、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の細胞。
  66. 請求項５６～６３のいずれか一項に記載の細胞、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項５０～５５のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
  67. 請求項６４に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  68. 二量体化ドメインに作動可能に連結された調節ドメインを含む融合タンパク質であって、前記調節ドメインが、１つ以上の標的配列の転写活性又はエピジェネティック活性を調節することができる、融合タンパク質。
  69. 前記調節ドメインが、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む、請求項６６に記載の融合タンパク質。
  70. 前記調節ドメインが、転写を活性化する、請求項６６又は６７に記載の融合タンパク質。
  71. 前記調節ドメインが、転写を不活性化する、請求項６６又は６７に記載の融合タンパク質。
  72. 前記調節ドメインが、転写を阻止する、請求項６９に記載の融合タンパク質。
  73. 前記調節ドメインが、前記１つ以上の標的配列を含むクロマチンを再構成する、請求項６６又は６７に記載の融合タンパク質。
  74. 前記調節ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）配列、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）配列、ｐ６５配列、最小ｐ６５（ｐ６５ｍｉｎｉ）配列、ｐ６５ｍｉｎｉ－ヒートショック因子タンパク質１（ＨＳＦ１）（ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１）配列、ＶＰ１６配列、ＶＰ６４配列、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ配列、ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）配列、及び最小ＶＰＲ（ＶＰＲｍｉｎｉ）配列のうちの１つ以上に由来する配列を含む、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  75. 前記調節ドメインが、ＫＲＡＢ配列（配列番号１５５）、ＭｅＣＰ２配列（配列番号１７０又は１７１）、ｐ６５配列（配列番号１７２～１７５）、ｐ６５ｍｉｎｉ配列（配列番号６１）、ｐ６５ｍｉｎｉ－ＨＳＦ１配列（配列番号６２）、ＶＰ１６配列（配列番号１７６）、ＶＰ６４配列（配列番号１７７）、ＶＰ６４－ＲＴＡｍｉｎｉ配列（配列番号６３）、及びＶＰＲｍｉｎｉ配列（配列番号６４）のうちの１つ以上の配列を含む、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  76. アミノ末端からカルボキシ末端へと、前記二量体化ドメイン、リンカー、及び前記調節ドメインを含む、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  77. 前記リンカーが、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、アミノ酸配列、及びポリマーのうちの１つ以上を含む、請求項７４に記載の融合タンパク質。
  78. 前記リンカーが、
    ＧＧＧＧＳの配列を含むか、又は
    ２～２０アミノ酸の長さを含むか、又は
    グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）を含む配列を含む、
    請求項７４又は７５に記載の融合タンパク質。
  79. 前記リンカーが、オリゴマー化ドメインを含む、請求項７５又は７６に記載の融合タンパク質。
  80. 前記オリゴマー化ドメインが、配列番号１、２、３、４、又は５の配列を含む、請求項７７に記載の融合タンパク質。
  81. 前記二量体化ドメインが、ＮＳ３ａポリペプチドを含む、請求項６６～７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  82. 前記ＮＳ３ａポリペプチドが、配列番号６、７、８、９、６６、１３３、又は１３４の配列を含む、請求項７９に記載の融合タンパク質。
  83. 前記ＮＳ３ａポリペプチドが、配列番号６７の配列を含む、請求項７９に記載の融合タンパク質。
  84. 前記二量体化ドメインが、ＤＮＣＲポリペプチドを含む、請求項６６～７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  85. 前記ＤＮＣＲポリペプチドが、配列番号１１～４６の配列を含む、請求項８２に記載の融合タンパク質。
  86. 前記ＤＮＣＲポリペプチドが、配列番号５１～５４又は１６２の配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
  87. 前記二量体化ドメインが、ＧＮＣＲポリペプチドを含む、請求項６６～７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  88. 前記ＧＮＣＲポリペプチドが、配列番号４７～５０の配列を含む、請求項８５に記載の融合タンパク質。
  89. 分解ドメインを更に含む、請求項６６～８６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  90. 前記分解ドメインが、配列番号１６０の配列を含む、請求項８７に記載の融合タンパク質。
  91. 切断可能なペプチドを更に含む、請求項６６～８８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  92. 前記切断可能なペプチドが、Ｐ２Ａ配列又はＴ２Ａ配列を含む、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  93. 前記Ｐ２Ａ配列が、配列番号７４を含む、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  94. 前記Ｔ２Ａ配列が、配列番号７５を含む、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  95. 前記切断可能なペプチドが、配列番号１３５又は１３６の配列を含む、請求項８９～９２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  96. 前記１つ以上の標的配列が、表Ａの遺伝子をコードする配列から単離された又は表Ａの遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む、請求項６６～９３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  97. 前記１つ以上の標的配列が、表４の遺伝子をコードする配列から単離された又は表４の遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む、請求項６６～９３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  98. 請求項６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
  99. 内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を更に含む、請求項９６に記載の核酸。
  100. 前記ＩＲＥＳが、配列番号１６３の配列を含む、請求項９７に記載の核酸。
  101. プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び翻訳後調節要素（ＰＲＥ）のうちの１つ以上を更に含む、請求項６６～９８のいずれか一項に記載の核酸。
  102. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含む、請求項９９に記載の核酸。
  103. 前記誘導性プロモーターが、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター（配列番号７７）、ヒトβグロビンプロモーター（ｈｕＢＧ）（配列番号７８）、ｍｉｎＩＬ２プロモーター（配列番号７９）、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーター（配列番号８０）、及びＴＲＥ３Ｇプロモーター（配列番号８１）から単離された又はそれらに由来する配列を含む、請求項１００に記載の核酸。
  104. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項９９に記載の核酸。
  105. 前記構成的プロモーターが、ＭＮＤプロモーター（配列番号８２）、ｈＰＧＫプロモーター（配列番号８３）、ＣＭＶプロモーター（配列番号１３７）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１３８）、ＳＦＦＶプロモーター（配列番号１３９）、ＥＦ１αプロモーター（配列番号１４０）、ＵＢＣプロモーター（配列番号１４１）、及びＣＤ４３プロモーター（配列番号１４２）から単離された又はそれらに由来する配列を含む、請求項１０２に記載の核酸。
  106. 請求項９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  107. 請求項４２～４９のいずれか一項に記載の核酸を更に含む、請求項１０４に記載のベクター。
  108. 哺乳動物細胞中で前記核酸の発現を引き起こすことができる発現ベクターを含む、請求項１０４又は１０５に記載のベクター。
  109. 前記発現ベクターが、プラスミドを含む、請求項１０６に記載のベクター。
  110. 前記核酸を哺乳動物細胞に導入することができる送達ベクターを含む、請求項１０４又は１０５に記載のベクター。
  111. 前記送達ベクターが、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、リポソーム、ミセル、ポリマーソーム、及びナノ粒子のうちの１つ以上を含む、請求項１０４又は１０５に記載のベクター。
  112. 前記ウイルスベクターが、ウイルスゲノムから単離された又はウイルスゲノムに由来する１つ以上の配列を含む、請求項１０９に記載のベクター。
  113. 請求項６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  114. 哺乳動物細胞である、請求項１１１に記載の細胞。
  115. ヒト細胞である、請求項１１１に記載の細胞。
  116. 体細胞である、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の細胞。
  117. 幹細胞である、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の細胞。
  118. ヒト胚性幹細胞ではない、請求項１１５に記載の細胞。
  119. エクスビボ又はインビトロにある、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の細胞。
  120. インビボにある、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の細胞。
  121. 請求項１１１～１１８のいずれか一項に記載の細胞、請求項６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
  122. 請求項１１９に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  123. （ａ）請求項１～４１のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質と、
    （ｂ）請求項６６～９５のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質と
    を含む、組成物。
  124. 小分子を更に含み、
    前記小分子の存在下で、前記第１の融合タンパク質の二量体化ドメインと前記第２の融合タンパク質の二量体化ドメインとが、複合体を形成することができる、
    請求項１２１に記載の組成物。
  125. 標的組成物を更に含み、
    前記標的組成物が、プロモーターと１つ以上の標的配列とを含む核酸配列を含み、前記プロモーターが、前記１つ以上の標的配列の発現を引き起こすことができる、
    請求項１２１又は１２２に記載の組成物。
  126. 前記標的組成物が、前記第１の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに結合することができる応答要素を更に含む核酸配列を含む、請求項１２３に記載の組成物。
  127. 前記応答要素が、２つ以上の応答要素を含む、請求項１２４に記載の組成物。
  128. 前記応答要素が、前記応答要素の配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の反復を含む、請求項１２４に記載の組成物。
  129. 前記応答要素が、５ｘＧａｌ４ＲＥ（配列番号８４）、６ｘＺＦ１ＲＥ（配列番号８５）、６ｘＺＦ２ＲＥ（配列番号８６）、６ｘＺＦ３ｖ１ＲＥ（配列番号８７）、６ｘＺＦ３ｖＲＥ（配列番号８８）、１２ｘＺＦ３ｖｅＲＥ（配列番号８９）、及び１２ｘＺＦＨＩＶ２ＲＥ（配列番号９０）のうちの１つ以上を含む、請求項１２４～１２６のいずれか一項に記載の組成物。
  130. 前記第１の融合タンパク質又は前記第２の融合タンパク質のいずれかが、ＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、請求項１２１～１２７のいずれか一項に記載の組成物。
  131. （ａ）前記第１の融合タンパク質が、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ前記第２の融合タンパク質が、ＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、又は
    （ｂ）前記第２の融合タンパク質が、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ前記第１の融合タンパク質が、ＤＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、
    請求項１２１～１２８のいずれか一項に記載の組成物
  132. 前記小分子が、ダノプレビルを含む、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の組成物。
  133. 前記第１の融合タンパク質又は前記第２の融合タンパク質のいずれかが、ＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、請求項１２１～１２９又は１３０のいずれか一項に記載の組成物。
  134. （ｃ）前記第１の融合タンパク質が、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ前記第２の融合タンパク質が、ＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、又は
    （ｄ）前記第２の融合タンパク質が、ＮＳ３ａ配列を含む二量体化ドメインを含み、かつ前記第１の融合タンパク質が、ＧＮＣＲ配列を含む二量体化ドメインを含む、
    請求項１２１～１２９又は１３０～１３１のいずれか一項に記載の組成物。
  135. 前記小分子が、グラゾプレビルを含む、請求項１２２～１２９又は１３０～１３２のいずれか一項に記載の組成物。
  136. 前記１つ以上の標的配列が、表Ａの遺伝子をコードする配列から単離された又は表Ａの遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む、請求項１２３～１３３のいずれか一項に記載の組成物。
  137. 前記１つ以上の標的配列が、表４の遺伝子をコードする配列から単離された又は表４の遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む、請求項１２３～１３３のいずれか一項に記載の組成物。
  138. 請求項１２１～１３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
  139. 哺乳動物細胞である、請求項１３６に記載の細胞。
  140. ヒト細胞である、請求項１３６に記載の細胞。
  141. 体細胞である、請求項１３６～１３８のいずれか一項に記載の細胞。
  142. 幹細胞である、請求項１３６～１３８のいずれか一項に記載の細胞。
  143. ヒト胚性幹細胞ではない、請求項１４に記載の細胞。
  144. エクスビボ又はインビトロにある、請求項１３６～１４１のいずれか一項に記載の細胞。
  145. インビボにある、請求項１３６～１４１のいずれか一項に記載の細胞。
  146. 請求項１３６～１４３のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。
  147. 請求項１２１～１３５又は１４４のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  148. 疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１～４１若しくは６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９若しくは９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、請求項５０～５５若しくは１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクター、請求項５６～６２、１１１～１１８、若しくは１３６～１４３のいずれか一項に記載の細胞、請求項６４、１１９、１２１～１３５、若しくは１４４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１４５に記載の医薬組成物の使用。
  149. 疾患又は障害の治療のための、請求項１～４１若しくは６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９若しくは９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、請求項５０～５５若しくは１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクター、請求項５６～６２、１１１～１１８、若しくは１３６～１４３のいずれか一項に記載の細胞、請求項６４、１１９、１２１～１３５、若しくは１４４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１４５に記載の医薬組成物の使用。
  150. 前記疾患又は障害が、自己免疫性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、免疫不全疾患又は障害、虚血性疾患又は障害、血液疾患又は障害、骨疾患又は障害、神経疾患又は障害、心疾患又は障害、血管疾患又は障害、代謝疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、消化器系疾患又は障害、ミトコンドリア疾患又は障害、筋肉疾患又は障害、肝臓疾患又は障害、腎臓疾患又は障害、聴覚疾患又は障害、眼疾患又は障害、及び増殖性疾患又は障害のうちの１つ以上を含む、請求項１４７又は１４８に記載の使用。
  151. 前記疾患又は障害が、がんを含む、請求項１４７又は１４８に記載の使用。
  152. 前記疾患又は障害が、感染症を含む、又は感染性疾患に起因する疾患若しくは障害を含む、請求項１４７～１４９のいずれか一項に記載の使用。
  153. 前記疾患又は障害が、遺伝子疾患又は障害を含む、請求項１４７～１４９のいずれか一項に記載の使用。
  154. 有効量の請求項１～４１若しくは６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９若しくは９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、請求項５０～５５若しくは１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクター、請求項５６～６２、１１１～１１８、若しくは１３６～１４３のいずれか一項に記載の細胞、請求項６４、１１９、１２１～１３５、若しくは１４４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１４５に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法であって、前記疾患又は障害の兆候又は症状の重症度が低下し、それによって前記疾患又は障害を治療する、方法。
  155. 有効量の請求項１～４１若しくは６６～９５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４２～４９若しくは９６～１０３のいずれか一項に記載の核酸、請求項５０～５５若しくは１０４～１１０のいずれか一項に記載のベクター、請求項５６～６２、１１１～１１８、若しくは１３６～１４３のいずれか一項に記載の細胞、請求項６４、１１９、１２１～１３５、若しくは１４４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１４５に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患又は障害を予防する方法であって、前記疾患又は障害の兆候又は症状の発症又は再発が遅延又は阻害され、それによって前記疾患又は障害を予防する、方法。
  156. 前記疾患又は障害が、自己免疫性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、免疫不全疾患又は障害、虚血性疾患又は障害、血液疾患又は障害、骨疾患又は障害、神経疾患又は障害、心疾患又は障害、血管疾患又は障害、代謝疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、消化器系疾患又は障害、ミトコンドリア疾患又は障害、筋肉疾患又は障害、肝臓疾患又は障害、腎臓疾患又は障害、聴覚疾患又は障害、眼疾患又は障害、及び増殖性疾患又は障害のうちの１つ以上を含む、請求項１５２又は１５３に記載の方法。
  157. 前記疾患又は障害が、がんを含む、請求項１５２又は１５３に記載の方法。
  158. 前記疾患又は障害が、感染症を含む、又は感染性疾患に起因する疾患若しくは障害を含む、請求項１５２～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記疾患又は障害が、遺伝子疾患又は障害を含む、請求項１５２～１５５のいずれか一項に記載の方法。
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CN115639357B (zh) * 2022-11-03 2023-05-09 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
FR2874384B1 (fr) 2004-08-17 2010-07-30 Genethon Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
JP6053688B2 (ja) 2011-10-07 2016-12-27 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
EP3365442B8 (en) * 2015-10-23 2022-06-08 Fred Hutchinson Cancer Center Methods to create chemically-induced dimerizing protein systems for regulation of cellular events
JP7379160B2 (ja) * 2017-04-21 2023-11-14 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１を使用する誘導性で調整可能な多重ヒト遺伝子制御
EP3891749A2 (en) 2018-12-04 2021-10-13 University of Washington Reagents and methods for controlling protein function and interaction
JP2022532236A (ja) * 2019-05-16 2022-07-13 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 調節された合成遺伝子発現システム

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