JP2024501754A - ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症に対するワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

少なくとも２つの抗原決定基を含む免疫原性組成物が提供され、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来し、免疫原性組成物は、少なくとも２つの抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物を含み、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来し、免疫原性組成物は、少なくとも１つの抗原決定基と、少なくとも１つの異なる抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物と、を含み、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する。ワクチン、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療又は予防又は免疫化する方法、及び免疫原性組成物を含むキットも提供される。【選択図】図9

Description

本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質を含む免疫原性組成物、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌に対して有効な新しいワクチンに関し、本発明はまた、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療又は予防する方法、及びストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫する方法を含む。ＤＮＡ／ＲＮＡベースのワクチン接種に含めるためのストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質をコードする核酸が、本発明の範囲内に更に含まれる。

ストレプトコッカス・ニューモニエは、通常、無菌部位に侵入して肺炎、血流感染及び髄膜炎を引き起こし、また、中耳炎等の非侵襲性疾患を引き起こすこともある鼻咽頭共生細菌である。肺炎球菌の集団構造及び進化遺伝学は十分に定義されているが、侵襲性疾患を引き起こす肺炎球菌が、侵襲性疾患を引き起こさない肺炎球菌と遺伝的に異なるかどうかは明らかではない。Ｋｕｌｏｈｏｍａ ｅｔ ａｌ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；２０１５，８３，１０，４１６５－４８９６）は、血流感染及び髄膜炎から採取されたＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１４０の分離株の全ゲノム配列を報告し、これらの分離株は１，４２７の遺伝子のコアを共有し、これらの疾患症状発現とコアゲノム又はアクセサリー遺伝子含有量に差はないことを見出した。したがって、遺伝子の存在／非存在のみでは肺炎球菌の侵襲的挙動は説明されないが、代わりにヌクレオチド多型又はＵｎｉｔｉｇ等の遺伝的変異が寄与因子であり得る。

先行技術から、１００を超える肺炎球菌血清型が存在し、それらの各々が生化学的に異なる莢膜多糖類（ＣＰＳ）を産生し、侵襲性疾患を引き起こす傾向が異なることが知られている。血清型１は、世界的にアフリカにおける症例の１１．７％を占める侵襲性肺疾患（ＩＰＤ）の最も一般的な原因の１つであり、他の血清型とは対照的に、血清型１は、西アフリカにおける閉鎖コミュニティにおけるアウトブレイク及び致死的な髄膜炎のアウトブレイクに関連している。ＩＰＤにおける血清型１の高い負荷は、この血清型に対する効果的なワクチンの必要性を強調する。Ｃｏｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ；（Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１７，３５（６），９７２－９８０）は、４つの大陸にわたって、２６の異なる国からの４４５の血清型１肺炎球菌の中で７つのタンパク質ワクチン候補（ＣｂｐＡ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ、ＰｓｐＡ、ＳＰ０１４８、ＳＰ１９１２、ＳＰ２１０８）の有病率を示した。ＣｂｐＡ（７６％）、ＰｓｐＡ（６８％）、ＰｈｔＤ（２８％）、ＰｃｐＡ（１１％）は、研究集団において普遍的にコードされておらず、血清型１に対して完全な適用範囲を提供しないであろう。例えば、ＰｃｐＡはヨーロッパ系の症例では広く存在したが（８２％）、アフリカ系の症例ではほとんど存在しなかった（２％）。彼らは、ＣｂｐＡ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ及びＰｓｐＡを組み込んだ多価ワクチンが世界人口の８６％に対する適用範囲を提供すると予測できることを提案し、ストレプトコッカス・ニューモニエＴＩＧＲ４由来のＳＰ０１４８、ＳＰ１９１２及び／又はＳＰ２１０８の単一変異体を更に組み込んだタンパク質ワクチンの更なる調査を提唱した。

肺炎球菌ワクチンは、２歳未満の乳児、６５歳以上の成人及び小児等の高リスク個体、並びに心臓及び腎臓の状態等の特定の長期の健康状態を有する免疫無防備状態の個体における重篤で潜在的に致死的な肺炎球菌感染症から保護する。現在、英国では二種類の肺炎球菌ワクチンが一般的に使用されており、年齢に応じて、乳児及び６５歳以上の者に差次的に投与される。Ｐｒｅｖｅｎａｒ１３（登録商標）（ＰＣＶ－１３としても知られている）は、１３の血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ細菌に対する保護を提供し、２歳未満の小児にワクチン接種するために使用される肺炎球菌ポリサッカライドコンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）を含み、一方、２３の血清型に対して保護する肺炎球菌ポリサッカライドワクチンＰＰＶ－２３（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘとしても知られている）は、６５歳以上の人々に投与される。このワクチンの問題は、少量では特に有効ではないことである。実際、両方のワクチンは、肺炎球菌疾患の予防に５０～７０％しか有効でないと考えられている。更に、ＰＣＶの主な制限は、ワクチン製剤に含まれる血清型に対する保護抗体のみを誘発することである。その結果、米国におけるＰＣＶ７導入後に観察されるように、非ワクチン血清型は、ＩＰＤ及びＰＣＶ導入後のキャリッジにおいて頻度が増加し得る（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３７８；１９６８－１９７３）。

有効な肺炎球菌ワクチンのための前提条件は、肺炎球菌集団における標的抗原の保存された発現及び最小限の変動、並びに堅牢なヒト免疫応答を誘導する能力である。

更なる要望は、全ての年齢、特に新生児及び乳児にわたって有効な肺炎球菌ワクチンを提供することである。

堅牢なヒト免疫応答を誘導するという強く示唆された能力を有する有効な肺炎球菌ワクチンが本明細書で実証される。このワクチン接種は、全ての年齢、特に新生児、乳児、高齢者及び免疫無防備状態の個体にわたって有効であろう。

Ｓ．ニューモニエの１００種以上の異なる株は、小児及び成人における罹患率及び死亡率の主要な、世界的な原因である。Ｐｒｅｖｅｎａｒ－１３（小児）及びＰｎｅｕｍｏｖａｘ－２３（成人）等の市販の肺炎球菌ワクチンが広く使用されているが、それらは株特異的炭水化物抗原を使用しているため、製造コストが高くなり（世界で最も高価なワクチン、Ｃｏｖｉｄパンデミック前）、その適用範囲が劇的に制限される。本発明は、既存の肺炎球菌ワクチンとは全く異なる方法で開発された：株ごとに異なる細菌の外側の糖分子を標的とする代わりに、したがって保護範囲を制限するために、本発明は、肺炎球菌の１００株全てに存在する高度に保存されたタンパク質を標的とすることを意図して開発された。本発明者らの研究は、本発明の免疫学的組成物が、ファイザーのＰＣＶ－１３ワクチンによってカバーされる肺炎球菌株並びにカバーされない株に対して同等又はより良好な防御免疫応答を誘導することができることを示した。広い適用範囲と低い製造コストとの組合わせは、本発明の免疫学的組成物を、肺炎球菌に対する全ての既存の及び開発段階のワクチンから区別する。

Ｋｕｌｏｈｏｍａ ｅｔ ａｌ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；２０１５，８３，１０，４１６５－４８９６） Ｃｏｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ；（Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１７，３５（６），９７２－９８０） Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３７８；１９６８－１９７３

本発明の第１の態様によれば、少なくとも２つの抗原決定基を含む免疫原性組成物が提供され、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する。

本発明の第２の態様によれば、少なくとも２つの抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物を含む免疫原性組成物が提供され、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する。

本発明の第３の態様によれば、少なくとも１つの抗原決定基と、少なくとも１つの異なる抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物と、を含む免疫原性組成物が提供され、抗原決定基は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する。

本発明はまた、本発明の第１、第２又は第３の態様による免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。

本発明は更に、個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療、予防、診断又はスクリーニングする方法を提示し、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療、予防、診断又はスクリーニングするために十分な量の本発明の第１、第２若しくは第３の態様の免疫学的組成物又は本発明のワクチンをそれを必要とする個体において投与することを含む。

本発明は更に、有効量の本発明の第１、第２若しくは第３の態様の免疫学的組成物又は本発明のワクチンを、それを必要とする個体に投与することを含む、個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌開始感染症に対する免疫化方法を提供する。

本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢのいずれか２つに由来する抗原決定基の組合わせによる免疫化が、良好な免疫原性応答を提供するという知見に基づいている。抗原決定基は、直接使用されてもよく、又は抗原決定基をコードする遺伝子構築物の形態で投与されてもよく、抗原決定基と異なる抗原決定基をコードする遺伝子構築物との混合物も使用されてもよい。したがって、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも２つの抗原決定基、又は少なくとも２つの抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物、又は少なくとも１つの抗原決定基及び少なくとも１つの異なる抗原決定基をコードする少なくとも１つの遺伝子構築物を含み得る。

本発明の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢのそれぞれに由来する抗原決定基の提供に基づいており、これらは、抗原決定基と１つ又は複数の抗原決定基をコードする遺伝子構築物との任意の組合わせ（例えば、３つの抗原決定基、２つの抗原決定基及び第３の抗原決定基をコードする１つの遺伝子構築物、１つの抗原決定基及び第２及び第３の抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物、又は３つ全ての抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物が存在し得る）で提供され得る。

２つ以上の抗原決定基が遺伝子構築物によってコードされる本発明の実施形態では、各異なる抗原決定基は異なる遺伝子構築物によってコードされてもよく、又は２つ以上の異なる抗原決定基は単一の遺伝子構築物によってコードされてもよい。例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢのそれぞれに由来する抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物を含む本発明の免疫原性組成物では、抗原決定基はそれぞれ別個の遺伝子構築物によってコードされ得るか、又は２つの抗原決定基は１つの遺伝子構築物によってコードされ、他方は第２の遺伝子構築物によってコードされ得るか、又は３つ全ての抗原決定基は単一の遺伝子構築物によってコードされ得る。

本発明での使用に適した遺伝子構築物は、レシピエントに投与された場合に抗原決定基を発現するのに適した任意の核酸ベースの構造を含む。適切な遺伝子構築物には、ＤＮＡ構築物（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＤＮＡワクチン）、ＲＮＡ構築物（例えば、ＲＮＡワクチン又はメッセンジャーＲＮＡ）、細菌ベースの構築物及びウイルスベースの構築物（不活化又は弱毒化ウイルス構築物等）が含まれる。

ＤＮＡワクチンは、病原体由来の特定のタンパク質（抗原）をコードするＤＮＡを含有する。ＤＮＡは体内に注入され、細胞によって取り込まれ、細胞の通常の代謝プロセスは、取り込まれたプラスミド中の遺伝暗号に基づいてタンパク質を合成する。

ＲＮＡワクチン又はｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）ワクチンは、天然化学物質の人工コピーを使用して免疫応答を生成するワクチンの一種である。ワクチンは、合成ＲＮＡの分子をヒト細胞にトランスフェクトし、適応免疫応答を刺激し、典型的にはｍＲＮＡ分子は薬物送達ビヒクル、通常はＰＥＧ化脂質ナノ粒子で被覆される。

本発明はまた、例えば限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシナウイルス又はリポソームに基づく送達系、例えばエマルジョン、微粒子、免疫刺激複合体ＩＳＣＯＭ及びリポソーム等の弱毒生ウイルス等の送達系を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを使用する可能性を含む。

本発明の免疫原性組成物は、ヒト医薬におけるヒト使用のためのものであり得る。好ましくは、組成物は対象に投与するためのものである。好ましくは、対象はヒトである。一実施形態では、対象は、６５歳を超える高齢成人等の成人；１歳未満の乳児；１～２歳の幼児；２～５歳の幼児；又は任意の年齢の免疫無防備状態の個体である。

本発明の一実施形態では、存在する場合、ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基は、３０～５０ｋＤａ、理想的には約４０ｋＤａであり、存在する場合、ＰａｖＡ由来の抗原決定基は、５５～７０ｋＤａであり、理想的には約６３ｋＤａであり、存在する場合、ＺｍｐＢに由来する抗原決定基は、１２５～１５５ｋＤａ、理想的には約１４８ｋＤａである。これらの配列は、隣接領域に免疫エピトープを含むと考えられるタンパク質の表面露出断片を包含する。

ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基、又はＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基をコードする遺伝子構築物を含む本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、抗原決定基は、配列番号１のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなる。

ＰａｖＡに由来する抗原決定基、又はＰａｖＡに由来する抗原決定基をコードする遺伝子構築物を含む本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、抗原決定基は、配列番号２のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなる。

ＺｍｐＢに由来する抗原決定基、又はＺｍｐＢに由来する抗原決定基をコードする遺伝子構築物を含む本発明の免疫原性組成物の一実施形態では、抗原決定基は、配列番号３のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなる。

好ましくは、本発明の免疫原性組成物は免疫賦活剤を更に含み、より好ましくは免疫賦活剤は以下に記載されるアジュバントである。

好ましくは、組成物は、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ（ＰｃｐＡ）、分泌４５－ＫＤａタンパク質Ｕｓｐ４５－加水分解酵素（ＰｃｓＢ）、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ（ＳｔｋＰ）、ペプチドパーミアーゼ酵素、マンガンＡＢＣトランスポーター（ＰｓａＡ）、ニューモリシンＤ（ＰｌｙＤ）、ニューモリシントキソイド（ｄＰｌｙ）、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）及びＤ（ＣｂｐＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｄ（ＰｈｔＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｅ（ＰｈｔＥ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ａ（ＰｈｔＡ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｂ（ＰｈｔＢ）；肺炎球菌鉄取り込みタンパク質Ａ（ＰｉｕＡ）、タンパク質細胞壁分離（ＰｃｓＢ）、肺炎球菌セリン－トレオニンキナーゼ（ＳｔｋＰ）及び類似体、プラスミン及びフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＰｆｂＢ）、ＳＰ０１４８、ＳＰ１９１２及びＳＰ２１０８、ＳＰ０７８５、ＳＰ１５００、ＳＰ２２１６を含む群から選択される、カプセル化又はコンジュゲート化され得るストレプトコッカス・ニューモニエ細菌由来の１つ又は複数の抗原決定基の更なるセットを含み得る。

本発明の更なる態様によれば、例えばその内容物を外部環境から保護する適切な容器に密封されたキットの形態の本明細書に記載の免疫原性組成物が提供される。そのようなキットは、使用説明書を含み得る。

好ましくは、免疫原性組成物は、組成物の量を示すアンプル又はサシェ等の密封容器に気密に包装される。一実施形態では、組成物は、液体、懸濁液、錠剤又はスプレーとして供給される。別の実施形態では、組成物は、気密に密閉された容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、組成物は、例えば水又は生理食塩水で再構成されて、対象への投与に適切な濃度を得ることができる。

本発明のワクチンを、例えば皮下若しくは筋肉内注射、針及び注射器、又は無針投与装置によって全身投与する場合、例えば限定されないが、吸入又は鼻腔内送達を使用することができる。ワクチン製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアルに封入することができる。

本発明の免疫原性組成物及びワクチンは、一般に、単一の組成物、すなわち必要な成分の全てを含む単一の組成物として提供されるが、本発明は、複数の組成物、例えば、１つ又は複数の抗原決定基及び／又は１つ又は複数の抗原決定基をコードする遺伝子構築物を含む第１の組成物、並びに特定の抗原決定基のうちの異なる１つ及び／又は特定の抗原決定基のうちの異なる１つをコードする遺伝子構築物を含む第２の組成物、あるいは１つ又は複数の特定の抗原決定基及び／又は特定の抗原決定基の１つ又は複数の抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物を含む第１の組成物、並びに抗原決定基の更なる１つ及び／又は抗原決定基の更なる１つをコードする遺伝子構築物を含むか又は含まない、１つ又は複数のアジュバントを含む第２の組成物として提供される組成物及びワクチンにも関することが理解されるであろう。この場合、複数の組成物は、同時に又は連続的に投与され得る。したがって、本発明は、更に、個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療若しくは予防する方法、又は個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫化する方法であって、十分量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択されるタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原決定基を投与することと、同時に又は続いて、十分量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢの異なる１つから選択されるタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原決定基を投与することと、を含む方法を提供する。

本発明は更に、個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症の治療若しくは予防に使用するための、及び／又は個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫するための、及び／又は個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を診断若しくはスクリーニングするための、本発明による免疫学的組成物又は本発明によるワクチンを提供する。

本発明は更に、本発明による免疫原性組成物又は本発明によるワクチンを含むキットと、免疫原性組成物又はワクチンを個体に投与する手段と、を提供する。本発明のキットには、担体及び凍結乾燥組成物又はワクチンを再懸濁する手段の１つ又は複数から選択される追加の成分が含まれていてもよい。

本発明の一態様による好ましい特徴は、本発明のあらゆる態様に準用されることが理解されよう。

本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下で更に説明される。

肺炎球菌ＡＴＰ結合カセットトランスポーターパーミアーゼ（ＡＢＣ－Ｔ）タンパク質配列の切断断片である配列番号１を示す図である。遺伝子ＩＤ：１３６９５５５２、遺伝子記号：ＨＭＰＲＥＦ１０３８＿０２２３９、タンパク質ＷＰ＿０００８３４６９０．１。 肺炎球菌付着及び病原性因子Ａ（ＰａｖＡ）タンパク質配列である配列番号２を示す図である。 肺炎球菌亜鉛メタロプロテアーゼＢ（ＺｍｐＢ）タンパク質配列の切断断片である配列番号３を示す図である。 小児から採取したヒト血清の免疫結合活性を示す図である。ｎ＝１３、地域獲得患者（ＣＡＰ）：ｎ＝５、高齢患者：ｎ＝３、健康なボランティア：ｎ＝５、及びＨＩＶを有する成人：ｎ＝５。ナイーブ野生型マウスから採取したマウス血清を陰性対照（対照血清）として使用して、結合の非存在を示した。プレートを、ＰａｖＡ単独、ＡＢＣＴ単独、ＺｍｐＢ単独、又は組み合わせた３つ全てのタンパク質（ＰＡＺ）のいずれかで被覆した。 中枢神経系の浸潤における３つの肺炎球菌抗原ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢの役割の検証を示す図である。髄膜炎マウスモデルの脳組織で採取した生存数を、感染後の様々な時点（日数）で決定した。 単独で、又はミョウバン若しくはＣｐＧ－キトサンと組み合わせてのいずれかで、ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢに由来する３つの抗原決定基の組合わせで免疫したマウスにおける臨床スコアを示す図である。図６Ａが新生児であり、図６Ｂが成体である。略語：Ａｇ：ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢ抗原の混合物；ＰＣＶ－１３：肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ－１３／Ｐｒｅｖｅｎａｒ－１３）。 抗体用量応答免疫化研究の結果を示す図である。 ワクチン製剤によるワクチン接種時の細胞媒介性免疫応答の結果を示す図である。 抗体媒介性免疫が、ワクチン製剤によるワクチン接種の結果が、従来のミョウバンアジュバント単独と比較して疾患保護を強化することを示す図である。 細胞媒介性免疫が、ワクチン製剤によるワクチン接種の結果が、従来のミョウバンアジュバント単独と比較して疾患保護を強化することを示す図である。 成体及び新生児マウスにおける肺炎球菌敗血症及び肺炎のモデルにおける、市販のＰｒｅｖｅｎａｒ－１３（登録商標）（ＰＣＶ－１３）に対するワクチン及びアジュバント製剤の有効性を示す図である。カプラン・マイヤー生存曲線が、成体（図８Ａ）マウス及び新生児（図８Ｂ）マウスにおける肺炎球菌によるチャレンジ時に示される。新生児マウスの肺組織及び血液における細菌生菌数を、それぞれ図８Ｃ及び図８Ｄに示す。略語：Ａｇ：抗原（ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢに由来する３つの抗原決定基の組合わせ）；ＰｒＰＶ：本明細書に記載の本発明の組成物。 本発明のワクチン製剤が、生存率（図９Ａ）及び臨床疼痛スコア（図９Ｂ）として、ＰＣＶ－１３と比較して、非ＰＣＶ１３応答性血清型（すなわち血清型８、１１Ａ及び３３Ｆ）に対してより良好な免疫保護効率を提供することを示す図である。 本発明のワクチン製剤がエクスビボヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を活性化／刺激することを示す図である。 本発明のワクチン製剤がヒトＰＢＭＣ中の形質Ｂ細胞を活性化することを示す図である。 受動移入実験からの結果を示す図である。本発明のワクチン製剤で免疫化されたマウスからの血清は、マウス生存時間（図１２Ａ）並びに血液及び肺におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）（図１２Ｂ）によって実証されるように、ナイーブマウスに受動免疫を付与する。 ヒトＰＢＭＣの受動移入実験からの結果を示す図である。本発明のワクチン製剤で刺激したヒトＰＢＭＣ培養物からの濃縮上清は、マウス生存時間（図１３Ａ）、並びに血液及び肺におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）（図１３Ｂ）によって実証されるように、ナイーブマウスに受動免疫を付与する。 マウスからのオプソニン化貪食作用死滅アッセイの結果を示す図である。本発明のワクチン製剤（ＰｒＰｖ）による免疫化は、肺炎球菌のインビトロオプソニン化を促進し、Ｐｒｅｖｅｎａｒ－１３（ＰＣＶ－１３）を打ち負かす。 本発明の混合タンパク質製剤によるワクチン接種が、ＣｐＧキトサンをアジュバントとして添加した単一タンパク質製剤と比較して増強された免疫原性を提示することを示し、図１５Ａは、抗原特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａに対する抗体用量応答を示し、図１５Ｂは、ワクチン接種時の細胞媒介性免疫応答を示す。 本発明の混合タンパク質製剤によるワクチン接種が、ＣｐＧキトサンをアジュバントとして添加した単一タンパク質と比較して疾患保護を強化することを示し、図１６Ａは、成体マウスの生存曲線を示し、図１６Ｂは、血液及び肺におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。 タンパク質の組合わせ（ＡＢＣ－Ｔ＋ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ）及び（ＡＢＣ－Ｔ＋ＺｍｐＢ）が１００％の保護を提供し（群当たりｎ＝５匹のマウス）、並びにタンパク質の組合わせ（ＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ）及び（ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ）が６０％の保護を提供する一方で、ビヒクル溶液のみを受けたマウスの８０％が投与の４６時間以内に感染に屈したことを示す図である。（１７Ａ）。血液（１７Ｂ）及び肺組織（１７Ｃ）で測定された生存数（ＣＦＵ）も示されている。全ての製剤はまた、ＣｐＧ－キトサンを含んでいた。 それぞれパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥに示される、免疫後０、１、３、９及び１５日間にわたる抗原のみ（緑色）、ＣｐＧ－キトサンのみ（青色）及びＣｐＧ－キトサンと混合した抗原（赤色）の免疫後のストレプトコッカス・ニューモニエによる経鼻コロニー形成（第１のプライム及び第２のブースター）の結果を示す図である。略語：ＣＦＵ：コロニー形成単位；ＮＰ：鼻咽頭；ｐｉ：感染後。 本発明の混合タンパク質製剤で免疫し、続いてＳ．ニューモニエを定着させたマウスにおいて得られたエクスビボ免疫細胞増殖（腸間膜リンパ節から採取したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞）からの結果を示す図である。染色パネルを示す：ＣＤ４－ＦＩＴＣ；ＣＤ３－ＡＰＣ；Ｋｉ６７－ＰＥｃｙ７。 ビヒクル、ＣｐＧ－ｃキトサン単独、又は本発明の組成物（ＰｒＰＶ）、すなわちＡＢＣ－Ｔ＋ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ＋ＣｐＧ－キトサンで免疫したマウスの肺組織におけるＩＬ－１７Ａ陽性メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）の誘導を示す図である。代表的なフローサイトメトリープロットを図２０Ａに示し、群比較を図２０Ｂに示す。略語：ＭＦＩ、平均蛍光強度。 ＣｐＧ－キトサンとは異なるβ－グルカン系アジュバントを含む本発明のワクチン抗原製剤でマウスを免疫する保護有効性を示す図である。 図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致する肺炎球菌ＡＴＰ結合カセットトランスポーターパーミアーゼ（ＡＢＣ－Ｔ）の切断断片のｍＲＮＡ配列である配列番号４を示す図である。 図２に示されるアミノ酸配列（配列番号２）と一致する肺炎球菌付着及び病原性因子Ａ（ＰａｖＡ）のｍＲＮＡ配列である配列番号５を示す図である。 図３に示されるアミノ配列（配列番号３）と一致する肺炎球菌亜鉛メタロプロテアーゼＢ（ＺｍｐＢ）の切断断片のｍＲＮＡ配列である配列番号３を示す図である。

「免疫原性組成物」という用語は、ヒト又は他の動物の体内で免疫応答を誘発する能力を有する任意の組成物を指し、これは、例えば、抗体の産生、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答、あるいは将来、疾患又は感染症からの保護を付与するワクチンの体内への導入に対する任意の他のそのような応答を含み得る。

本明細書における「ワクチン」への言及は、上記に定義されるように、人又は動物の体内に入れられ、免疫応答を引き起こすのに適した生物学的製剤を指す。

本明細書で使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語は、状態又は症状を治療する、状態又は疾患の確立を予防する、あるいは状態又は疾患又は他の望ましくない症状の進行を予防、妨害、遅延、改善又は逆転させる任意の及び全ての使用を指す。

本明細書で使用される「ワクチンタンパク質抗原」という用語は、タンパク質含有細胞断片、精製タンパク質、合成ペプチドであるかどうか、又はその性質がアミノ酸のみからなるか、又はワクチンが保護することを意図する感染性生物に由来する炭水化物若しくは脂質等の他の生物学的分子と組み合わせたアミノ酸からなるかどうかにかかわらず、抗原を指す。ワクチンタンパク質抗原を含める目的は、ワクチンタンパク質が由来する生物によって引き起こされる感染症に対して特異的かつ防御的な免疫を誘導することである。

本明細書における「抗原決定基」への言及は、抗体、Ｂ細胞又はＴ細胞が向けられ得るタンパク質抗原の一部を指し、これは「エピトープ」と同義である。

本明細書における特定のタンパク質「に由来する」抗原決定基への言及は、特定のタンパク質の全部若しくは一部に対応するか、又はタンパク質の全部若しくは一部の類似体であり、タンパク質の抗原効果と同様の抗原効果を有するペプチドを指す。例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基は、ＡＢＣ－Ｔタンパク質によって示される少なくとも１つの抗原効果を示す限り、ＡＢＣ－Ｔタンパク質の全配列を含むか若しくはそれからなってもよく、又はタンパク質の任意の断片を含むか若しくはそれからなってもよい。あるいは、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基は、それがＡＢＣ－Ｔタンパク質によって示される少なくとも１つの抗原効果を示す限り、ＡＢＣ－Ｔタンパク質の全配列の類似体、又はタンパク質の類似体の断片を含み得るか、又はそれらからなり得る。ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＰａｖＡ及びＺｍｐＢに由来する抗原決定基についても同様である。ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢに由来する適切な抗原決定基の例は、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくはその断片の免疫学的に有効な類似体を含むか、又はそれらからなる。本発明の特定の実施形態では、ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基は３０～５０ｋＤａであり、及び／又はＰａｖＡに由来する抗原決定基は５５～７０ｋＤａであり、及び／又はＺｍｐＢに由来する抗原決定基は１２５～１５５ｋＤａである。

図１、２及び３／配列番号１、２及び３に示されるタンパク質は、天然配列の一部ではないが、抗原の免疫学的特性に影響を及ぼさない限り、タンパク質の組換え産生及び／又は精製を助けるために含まれる追加のアミノ酸を含み得る。適切な更なるアミノ酸の例としては、（ＨＨＨＨＨＨ）等のポリヒスチジンタグが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、図１に示すＡＢＣ－Ｔの切断断片及び／又は図２に示すＰａｖＡの配列及び／又は図３に示すＺｍｐＢの切断断片は、末端ポリヒスチジンタグＨＨＨＨＨＨを含み得る。同一性／相同性パーセントに注目するか又は計算する場合、ポリ－ヒスチジンタグは計算の一部ではない場合がある。

本明細書における特定のタンパク質の「類似体」への言及は、タンパク質によって示される少なくとも１つの抗原効果を示すために、タンパク質に対して十分な同一性／相同性（この用語は、本明細書において互換的に使用される）を有するタンパク質を指す。

２つのアミノ酸配列の同一性／相同性パーセントを決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的で整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸又は核酸「アイデンティティ」はアミノ酸又は核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

一実施形態では、本発明で使用されるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢの類似体である抗原決定基は、配列番号１、２若しくは３のアミノ酸配列又はその断片と十分に同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有する。「十分に同一」又は「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１及び第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメイン又は共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸配列と十分又は最小数の同一又は等価な（例えば、同様の側鎖を有する）アミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を指すために使用される。例えば、少なくとも約６０％又は６５％の同一性、適切には７５％の同一性、より適切には８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書では十分に同一又は実質的に同一であると定義される。

本明細書で使用される場合、タンパク質の「免疫学的に有効な類似体又は部分」は、免疫学的応答を誘発する相互作用に関与するタンパク質の断片を含む。典型的には、タンパク質の免疫学的に有効な類似体又は部分は、タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフを含み、例えば、免疫学的に有効な類似体又は部分は、１つ又は複数の免疫原性部分を保持し得る。ポリペプチドは、以下の特性のうちの１つ、２つ、好ましくはそれ以上を有する場合、本明細書で定義されるＳ．ニューモニエ免疫学的有効性を有する：（１）Ｓ．ニューモニエ感染の過程で発現された場合、細胞へのＳ．ニューモニエの付着を促進又は媒介することができる；（２）Ｓ．ニューモニエタンパク質に特徴的な酵素活性、構造又は調節機能を有する；（３）あるいはそれをコードする遺伝子は、Ｓ．ニューモニエ遺伝子における致死突然変異を救済することができる；（４）細菌の免疫回避特性に寄与する。ポリペプチドは、上記の特性の１つを有するポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト、又はスーパーアゴニストである場合、免疫学的有効性を有する。

免疫学的に有効な「断片」又は「類似体」は、本発明のＳ．ニューモニエポリペプチドに特徴的なインビボ又はインビトロ活性を有するものであり、特にタンパク質は配列番号１～３の配列を有するか、又は他の天然に存在するＳ．ニューモニエポリペプチド、例えば本明細書に記載の生物学的活性の１つ又は複数の配列を有する。インビボで存在するフラグメント、例えば、転写後プロセシングから生じるフラグメント、又は選択的にスプライシングされたＲＮＡの翻訳から生じるフラグメントが特に好ましい。フラグメントには、天然細胞又は内因性細胞において発現されるフラグメント、並びに発現系において、例えばＣＨＯ細胞において作製されるフラグメントが含まれる。Ｓ．ニューモニエポリペプチド等のペプチドは多くの場合、ある範囲の生理学的特性を示し、そのような特性は分子の異なる部分に起因し得るので、有用なＳ．ニューモニエフラグメント又はＳ．ニューモニエ類似体は、Ｓ．ニューモニエ活性についての任意の生物学的アッセイにおいて生物学的活性を示すものである。

本明細書における「抗原決定基をコードする遺伝子構築物」への言及は、ＤＮＡ構築物（例えば、ＤＮＡプラスミド）、ＲＮＡ構築物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）、細菌ベースの構築物及びウイルスベースの構築物（不活化又は生弱毒化ウイルス構築物等）を含む、レシピエントに投与された場合に抗原決定基を発現するのに適した任意の核酸構造を指す。遺伝子構築物は、天然タンパク質の完全な配列に対応する抗原決定基をコードしてもよく、又は天然配列の免疫学的に有効な断片若しくは免疫学的に有効な類似体又はその断片をコードしてもよい。

配列番号１の配列に対応するＡＢＣ－Ｔの断片を含むタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む本発明の実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号４に対応する核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその類似体を含み得る（すなわち、図２２に示されるＲＮＡ配列であるが、等価なＤＮＡ配列も本発明の実施形態である）。

配列番号２の配列に対応するタンパク質ＰａｖＡを含むタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む本発明の実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号５に対応する核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその類似体を含み得る（すなわち、図２３に示されるＲＮＡ配列であるが、等価なＤＮＡ配列も本発明の実施形態である）。

配列番号３の配列に対応するＺｍｐＢの断片を含むタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む本発明の実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号６に対応する核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその類似体を含み得る（すなわち、図２４に示されるＲＮＡ配列であるが、等価なＤＮＡ配列も本発明の実施形態である）。

本明細書における「免疫刺激」への言及は、その成分のいずれかの活性化を誘導するか又は活性を増加させることによって免疫系を刺激する免疫賦活剤及び免疫賦活剤を指す。

本明細書における「アジュバント」への言及は、他の薬剤、この例では本発明のワクチン組成物の効果を改変する薬理学的又は免疫学的薬剤を含むことを意図している。本発明で使用されるアジュバントは、ワクチン組成物の免疫応答の大きさ及び／又は耐久性を高める又は増強するように作用し、これはまた、防御免疫及び長期持続免疫を誘導するのに必要な抗原の量の減少をもたらし得る。

ワクチン組成物に使用されるタンパク質、タンパク質断片及び遺伝子構築物は、免疫賦活性又は免疫賦活性物質／アジュバントとコンジュゲート又は混合されることが多い。アジュバントのワクチン製剤への組み込みは、ワクチン抗原に対する特異的免疫応答を増強、加速及び延長することを目的とする。アジュバントの利点には、より弱い抗原の免疫原性の増強、免疫化の成功に必要な抗原量の減少、十分なレベルの防御免疫を達成するためのブースター免疫化の頻度の減少が含まれる。選択的に、アジュバントを使用して、例えば免疫グロブリンクラス及び細胞傷害性又はヘルパーＴリンパ球応答の誘導に関して所望の免疫応答を最適化することもできる。

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）等のサイトゾルパターン認識受容体（ＰＲＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）等の核酸感知受容体、又はｍＴＯＲ及びＧＣＮ２等の栄養センサーに対する刺激効果を有する物質から選択される１つ又は複数の物質；以下の経路：ＭｙＤ８８／ＴＬＲ－シグナル伝達経路、ｃＧＡＳ－インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路、ＮＦ－κＢ経路、核酸等の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出をもたらす任意のストレス、細胞死及び組織損傷経路（壊死／ネクロトーシス、アポトーシス、オートファジー等）、自然免疫系を活性化する、尿酸、ＡＴＰ及びタンパク質、自然免疫系を長期間にわたって警報状態、すなわち記憶様状態で維持する免疫細胞動員又はエピジェネティック変化をもたらす任意のシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つに作用する物質；ＣＤ４＋Ｔｈ２（インターロイキン－４）、Ｔｈ１（インターフェロン－ガンマ）－又はＴｈ１７（ＩＬ１７Ａ）媒介性免疫への細胞分化によってもたらされるインフラマソーム活性化を誘導する特性を有する物質；免疫増強剤；ＩＬ－１β、ＣＬＲ及びＴＮＦ－αシグナル伝達経路に作用する多糖系物質）；送達系及び粘膜アジュバントから選択される１つ又は複数の物質を含み得る。

追加的又は代替的に、本発明の免疫原性組成物は、カプセル等の細菌タンパク質及び／又は多糖物質並びにその類似体、毒素／トキソイド及びその類似体、ＴＬＲリガンド及びその類似体、アゴニスト、例えばＰａｍ３ＣＳＫ４、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、ＭＰＬＡ（ＬＰＳ誘導体）、ＣｐＧ（非メチル化シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド「Ｃ」と、それに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド「Ｇ」と、を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子であり、「ｐ」は連続するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指すが、一部のＯＤＮは代わりに修飾ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有する）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＣｐＧモチーフ、キトサン又はβ－グルカン、フラジェリン、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）又はＰＬＧＡ－ポリ－Ｌ－リジン／ポリ－ガンマ－グルタミン酸（ＰＬＧＡ－ＰＬＬ／ガンマＰＧＡ）等のマイクロ粒子及びナノ粒子、又はモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴマンノース、ポリ（Ｉ：Ｃ）、外膜小胞（ＯＶＭ）等の細胞外小胞（ＥＶ）等の任意の他の免疫賦活剤と共製剤化された脂質ベースの骨格で作製されたマイクロ粒子及びナノ粒子；油中水型、水中油型及び熱可逆性水中油型エマルジョン、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ－７２０及びその類似体、ミョウバン又はアルミニウム塩アジュバント、リポソーム、ビロソーム、アーケオソーム、外膜小胞、ニオソーム、サポニン及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ポリマー粒子、炎症促進性サイトカインを含むサイトカイン、例えばＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７Ａ／Ｆ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＭＰＩ、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細菌成分、例えばＬＰＳの解毒変異体、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ親油性及び疎水性）、ＱＳ２１、ＰＬＧＡ、ＣＴ、リポソームベースのカチオン性アジュバント製剤、例えば、ＣＡＦ０１－０９（Ｓｐａｎ８０、ポリオキシエチレンセチル－ステアリルエーテル、マンニトール、スクアレンから構成される）及びコレステロール、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はα－Ｇａｌセラミドから構成される類似体、ＮＯＤ様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム、ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有タンパク質４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム、メラノーマ２に存在しない（ＡＩＭ２）インフラマソーム、ｄｓＲＮＡ：ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣ：ＬＣ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＬＰＳ、フラジェリン、イミダゾキノリン：イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（８４８）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、サポニン（ＱＳ－２１）、多糖カプセル及びその類似体、毒素／トキソイド及びその類似体、非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧ）及びその類似体、サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、正常なＴ細胞が発現及び分泌される）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α、共刺激分子又は接着分子、例えばＣＤ８０、リンパ球機能関連抗原－３及びポリアルギニンテール、キトサンによって提示されるものと同様の特性を有する多糖系物質、例えばＣｐＧ－デルタイヌリン、コクリエート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微粒子、例えばビロソーム、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧ（ポリ［ラクチド－ｃｏグリコリド］）、コレラ毒素（ＣＴ）誘導体、及び熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴＫ３及びＬＴＲ７２）から選択される１つ又は複数の物質を含み得る。

特定の実施形態では、本発明の免疫学的組成物は、ＴＬＲアゴニスト、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導することができる薬剤（特にＴｈ１及び／又はＴｈ１７分化プロファイルを有する）、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ＭｙＤ８８／ＴＬＲシグナル伝達経路に作用する薬剤、インターフェロン遺伝子のｃＧＡＳ刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路に作用する薬剤、及び粒子状多糖物質から選択される１つ又は複数の物質を含み得る。本発明の免疫学的組成物の特に好ましい実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲアゴニストと、ＭｙＤ８８／ＴＬＲシグナル伝達経路又はインターフェロン遺伝子のｃＧＡＳ刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路に作用することができる薬剤との組合わせ、例えば、ＣｐＧとキトサン及び／又はβ－グルカンとの組合わせを含む。

ワクチンの凍結乾燥は当技術分野で周知である。典型的には、液体ワクチンは、糖類、例えばスクロース又はラクトース（１０～２００ｍｇ／ｍｌの初期濃度で存在する）等の血餅阻害剤の存在下で凍結乾燥される。凍結乾燥は、通常、いくつかの工程を要し、例えば、サイクルは－６９℃で開始し、３時間かけて温度を－２４℃に徐々に調整し、次いでその温度を１８時間維持し、次いで－１６℃、次いで１℃に徐々に調整し、次いでこの温度を６時間維持し、次いで３時間かけて＋３４℃に調整し、最後に９時間維持する。

製剤の凍結乾燥は、より安定な製剤をもたらす（例えば、多糖抗原の分解が防止される）。このプロセスはまた、驚くべきことに、肺炎球菌多糖類に対するより高い抗体価を担う。これは、ＰＳ６Ｂコンジュゲート及び３ＤＭＰＬアジュバント（好ましくはアルミニウム系アジュバントなし）並びにＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐｌ２５、Ｓｐｉ０１、Ｓｐｌ２８、Ｓｐｌ３０及びＳｐｉ３３からなる群から選択される肺炎球菌タンパク質について特に見出された。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは凍結乾燥され得る。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＳ．ニューモニエポリペプチド又はＳ．ニューモニエポリペプチドバリアントをコードする核酸を含むベクター；ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞；並びに例えば細胞培養培地中で細胞を培養すること、及び例えば細胞又は細胞培養培地からＳ．ニューモニエポリペプチド又はＳ．ニューモニエポリペプチドバリアントを単離することを含む、組換えＳ．ニューモニエポリペプチド又はＳ．ニューモニエポリペプチド変異体を産生する方法を包含する。

宿主動物において抗体を産生するための方法も提供される。本発明の方法は、少なくとも１つのＳ．ニューモニエ由来の免疫原性成分で動物を免疫することを含み、免疫原性成分は、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン又はその配列保存的若しくは機能保存的変異体、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のいずれかが一部を形成する完全なタンパク質コード配列を含む任意のＯＲＦ内に含まれるポリペプチド、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のいずれかの中に含まれるポリペプチド配列、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のいずれかが一部を形成するポリペプチドを含む。宿主動物には、哺乳動物及び鳥類を含むがこれらに限定されない任意の温血動物が含まれる。そのような抗体は、Ｓ．ニューモニエ特異的抗原の存在量及び分布を評価するためのイムノアッセイのための試薬として有用である。

より効率的なペプチドワクチンの設計を達成するために研究されてきた送達系には、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、外膜小胞（ＯＭＶ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ポリマー、及び非分解性ナノスフェア等のナノスケールサイズ（＜１０００ｎｍ）の物質が含まれ、ワクチン抗原を安定化し、アジュバントとして作用することができるワクチン抗原の潜在的な送達ビヒクルとして注目されている。更に、それらは、免疫細胞を特異的に標的とする複数のタンパク質抗原性フラグメントを含有するワクチンを設計する能力を提供し、抗原提示細胞によるより効果的な取り込みをもたらす。

代替送達システムは、生分解性物質、例えばデンプン、アルギネート及びセルロース等の天然ポリマー化合物、ポリβ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）等の生合成物質、並びにポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリウレタン、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）及びポリメチルメタクリレート樹脂（ＰＭＭＡ）等のコポリマーを含み得、それらの生体適合性、生分解性及びしばしば低い毒性のためにワクチン研究において多くの注目を集めており、これらは抗原を分解から保護し、抗原安定性を高め、徐放を提供し得、増強された全体的な免疫原性をもたらす。これらはまた、本発明の新規肺炎球菌ワクチンのための有望なアジュバント／送達システムである。

更なる送達系としては、例えば限定されないが、プロバイオティクス、例えば乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）種；改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）及びポックスウイルス及びアデノウイルスを含む他の様々なウイルス等のウイルスベクターシステム並びに；ファージＴ４等のバクテリオファージが挙げられる。

本発明のワクチンは、他の既存のワクチン／コンジュゲートワクチンと共に使用され得ることが理解されよう。本発明のワクチンは、現在利用可能な製剤を改善するための担体タンパク質として使用され得、例えば、限定されないが、Ｐｒｅｖｅｎａｒは担体タンパク質ＣＲＭ１９７を含有する。したがって、ＣＲＭ１９７は、本発明のタンパク質／ポリペプチドの１つ若しくは複数又は全てによって置換され得る。

本明細書に記載の組成物は、単独で、又は他の治療と組み合わせて、同時又は連続的のいずれかで投与され得る。投与は、毎日、週２回、週１回又は月１回の間隔で繰り返され得る。個々の対象の治療スケジュールは、投与経路及び治療される状態の重症度等の要因に依存し得る。

本発明はまた、様々な病原体に対する防御を提供する混合ワクチンを包含する。現在、多くの小児ワクチンが、子供が受けなければならない注射の回数を減らすための混合ワクチンとして投与されている。したがって、他の病原体由来の抗原を含有する小児ワクチンは、本発明のワクチンと共に製剤化され得る。例えば、本発明のワクチンは、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、百日咳成分［典型的には、ペルタクチン（ＰＲＮ）及び／又はアグリトモームが含まれていてもよい解毒された糸状ヘムグルチニン（ＦＨＡ）、１＋２］を含有する周知の「三価」混合ワクチン、例えばＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮ抗原を含有する市販のＩＮＦＡＮＲＩＸＤＴＰａ（商標）ワクチン（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅａｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共に、又はＴｒｉｔａｎｒｉｘ（商標）としてＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｓ．Ａによって市販されているワクチン等の百日咳成分全細胞と共に製剤化され得る（又は単独であるが同時に投与される）。混合ワクチンはまた、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ポリオウイルス抗原（例えば、不活化三価ポリオウイルス－ＩＰＶ）、モラクセラ・カタラーリス外膜タンパク質、非典型インフルエンザ菌タンパク質、外膜髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ等の追加の抗原を含有し得る。

組成物は、１つ又は複数の用量で投与され得、その後、数日、数週間又は数年後に投与される１つ又は複数の更なる「ブースター」用量が続き得る。例えば、組成物を小児に投与する場合、最初の用量は１歳～１２歳で与えられ、ブースター用量は１６歳で与えられ得る。１３～１５歳で初回用量を受ける青年の場合、１６～１８歳でブースター用量が与えられ得る。幼児期に肺炎球菌ワクチンを受けていない可能性がある個体については、本発明の免疫原性組成物又はワクチンのプライム用量及び／又はブースター用量を、季節性インフルエンザ／インフルエンザワクチン等の季節性ワクチンと共に投与又は同時投与することができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンはまた、１年又は２年の間隔で１回又は２回の用量のＰＰＳＶ－２３（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ）を受けたことがある６５歳を超える成人においてプライム又はブースターとして投与され得る。注射剤は、同じ用量の活性成分を含有してもよく、又は異なる用量を含有してもよい。好ましくは、用量は注射によって投与されるが、無針投与も本発明の範囲内である。

免疫原性組成物又はワクチンは、小児、青年又は成人に投与され得る。「小児」には、一般に２歳までの乳児が含まれる。いくつかの国では、乳児には一般に２回の用量が投与され、第３の「ブースター」用量が生後２年目に投与されるが、他の国では２回の用量のみが投与され得、他の国では４回の用量が使用され得る。

任意の特定の患者に対する具体的な用量レベル及び投与頻度は様々であり得、治療を受けている個体の年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式を含む様々な因子に依存する。典型的には、適切な投与量は医師によって決定され得る。組成物は、０．００００１μｇ／Ｋｇ体重～体重～５ｍｇ／Ｋｇ体重、好ましくは０．０００１μｇ／Ｋｇ～５ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは０．００１ｇ／Ｋｇ～１ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは０．０１ｇ／Ｋｇ～５００ｇ／Ｋｇ、好ましくは０．０２μｇ／Ｋｇ～３００ｇ／Ｋｇ体重の用量として投与され得る。

現在、莢膜多糖類を両方とも標的とする認可済み肺炎球菌ワクチンには、（ａ）２３価肺炎球菌多糖類ベースのワクチン（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘという商品名で販売されているＰＰＶ－２３）並びに；（ｂ）７価、１０価及び１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（商品名Ｐｒｅｖｅｎａｒで販売されているＰＣＶ－７、－１０、－１３）の二種類がある。しかしながら、ＰＰＶ－２３は、２歳未満の小児では免疫原性が低く、免疫記憶応答も集団免疫も生じない。肺炎球菌多糖の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、多糖ベースのワクチンをＴ細胞非依存性からＴ細胞依存性抗原に変換し、それらの免疫原性を増強した。コンジュゲートワクチンは、効率的な免疫記憶を誘発し、関連する集団免疫を誘導した。

本発明のワクチンと併せて使用することができる他の適切なＳ．ニューモニエワクチンとしては、オートライシン（ｌｙｔＡ）遺伝子が欠失され、ニューモリシン（ｐｌｙ）遺伝子がｐｄＴに置換されたＳ．ニューモニエの非カプセル化株の不活性化細胞調製物である全細胞Ｓ．ニューモニエワクチンが挙げられる。更に、他の適切な候補は、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ（ＰｃｐＡ）、分泌４５－ＫＤａタンパク質Ｕｓｐ４５－加水分解酵素（ＰｃｓＢ）、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ（ＳｔｋＰ）、ペプチドパーミアーゼ酵素、マンガンＡＢＣトランスポーター（ＰｓａＡ）、ニューモリシンＤ（ＰｌｙＤ）、ニューモリシントキソイド（ｄＰｌｙ）、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）及びＤ（ＣｂｐＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｄ（ＰｈｔＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｅ（ＰｈｔＥ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ａ（ＰｈｔＡ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｂ（ＰｈｔＢ）；肺炎球菌鉄取り込みプロテインＡ（ＰｉｕＡ）、タンパク質細胞壁分離（ＰｃｓＢ）、肺炎球菌セリン－トレオニンキナーゼ（ＳｔｋＰ）及び類似体、プラスミン及びフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＰｆｂＢ）、ＳＰ０１４８、ＳＰ１９１２及びＳＰ２１０８、ＳＰ０７８５、ＳＰ１５００、ＳＰ２２１６を含む群から選択される１つ又は複数を含む。

本発明のワクチン組成物は、経口（例えば、錠剤又はカプセル）、経鼻（例えば、スプレー）、吸入、局所（例えば、クリーム又はローション）及び注射等の任意の従来の経路によって投与され得る。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、又は皮内であり得る。本発明のワクチン組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で又は更なる用量と共に所望の応答を生じるワクチン組成物の量である。肺炎球菌疾患を予防する場合、所望の応答は、感染性因子によって攻撃されたときに防御を提供することである。

本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤若しくは希釈剤、又は当業者に周知の他の物質を用いて製剤化され得る。適切な薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、例えば（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ［２０００］）に記載されている。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存する。

組成物は、意図された投与様式に適した形態で製剤化され得る。例えば、適切な担体、賦形剤又は希釈剤（又はそれらの組み合わせ）と一緒にされていてもよい、粉末、スプレー、錠剤、溶液又は懸濁液としてである。親投与のために、組成物は滅菌水溶液の形態であってもよく、他の物質、例えば塩又は緩衝液が含有されていてもよい。当業者は、例えば、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液注射液、乳酸加リンゲル液注射液を使用して適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニン等の酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の緩衝剤を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が含まれてもよい。

「治療有効量」は、対象に利益を示すのに十分な量の組成物を意味し、それには、限定されないが、対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ細菌に対する免疫応答を誘導／増加させること、並びに／あるいは対象において疾患の重症度又は持続期間を減少させることが含まれる。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されているものの性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば投与量等の決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、治療される疾患の症状の重症度及び／又は進行に依存し得る。

免疫応答は、これらが特定の組成物の投与前後に測定された免疫応答指標の検出可能な差である場合、誘導又は増加される。免疫応答指標には、それだけに限らないが、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、殺菌アッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈降、オウッテルロニー免疫拡散；例えば、スポット、ウエスタンブロット又は抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞傷害性アッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔ、エクスビボ末梢血単球性細胞及びリンパ球刺激アッセイ、マウス腹膜炎及びチャレンジモデル等のアッセイによって検出される抗体価又は特異性が含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン製剤又は組成物の治療有効量は、抗原特異的抗体（例えば、抗ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌）を生成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象に血清保護を提供するのに、すなわち、感染症を予防／防御するのに十分な抗原特異的抗体を生成するのに十分である。いくつかの実施形態では、血清保護は、ワクチン接種対象の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は少なくとも９５％に付与される。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの有効量は、少なくとも５０％の確率で対象を血清転換するのに十分である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は少なくとも９５％の確率で対象を血清転換するのに十分である。対象が血清転換されたかどうかは、対象から血清又は末梢血試料を得ること、及び抗ストレプトコッカス・ニューモニエ抗体又はＳ．ニューモニエ誘発リンパ球応答を検出するためのアッセイを行うこと等、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。いくつかの実施形態では、対象からの血清試料が閾値又は所定のベースラインを超える量の抗ストレプトコッカス・ニューモニエ抗体又はリンパ球媒介性応答を含む場合、対象は血清転換される。

インビトロ調査
細菌分離株
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型－２、ｌａｂ適合株Ｄ３９（ＮＣＴＣ７４６６）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から入手した。本研究で使用した他の全ての肺炎球菌株、例えば高毒性肺炎球菌血清型１は、Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ Ｒｏｙａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＲＬＢＵＨＴ）又はＭａｌａｗｉ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｂｌａｎｔｙｒｅ，Ｍａｌａｗｉに保管されている分離株のバイオバンクから得られた臨床分離株であった。肺炎球菌の同定はオプトチン感受性試験によって確認され、血清型は、肺炎球菌カプセル特異的抗血清との標準的なＱｕｅｌｌｕｎｇ反応を使用して決定された（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。全ての分離株をＰｒｏｔｅｃｔ（商標）クライオビーズ（Ｐｒｏ－Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．）上で－８０℃で実験室に保存し、嫌気性条件下３７℃で１８時間インキュベートした５％ウマ血液寒天プレート上で継代培養した。多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）も全ての分離株に対して行った。

細菌生存数をカウントするための組織試料
血液及び肺中の細菌の生菌数を、肺炎球菌感染後に示された間隔で決定した。ＩＫＡ Ｔ１０ホモジナイザーを用いて組織試料を粉砕した。肺細胞懸濁液及び血液試料中の生菌数を、滅菌ＰＢＳ中で段階希釈し、５％（ｖ／ｖ）の脱線維化ウマ血液（Ｏｘｏｉｄ）及び１０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ｓｉｇｍａ）を含有する血液寒天上に播種することによって決定した。乾燥したら、プレートを５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートし、翌日に細菌コロニー数をカウントした。

ストレプトコッカス・ニューモニエの突然変異誘発。

コンピテントＳ．ニューモニエ細胞の作製及びその後の形質転換を、完全形質転換培地（Ｃ＋Ｙ培地、ｐＨ＝６．８）法（Ｌａｃｋｓ ａｎｄ Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ，１９６０）を用いて行った。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を（カナマイシン耐性を付与する）ａｐｈＡ３カセットで置き換え、その後、カナマイシンを補充した血液寒天ベース培地上でカナマイシン耐性組換え体を選択することによって、単一欠失変異体を構築した。この組換えをサンガーシーケンシングによって検証した。

組換えタンパク質の産生及びＣｐＧ－キトサンへの吸着。

各ワクチン候補エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）最適化合成遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。これらは、図１に示される配列に対応するＡＢＣ－Ｔの切断断片（配列番号１）、図２に示される配列に対応するＰａｖＡの完全な配列（配列番号２）、及び図３に示される配列に対応するＺｍｐＢの切断断片（配列番号３）を含んでいた。

各抗原について、６ｘＨｉｓタグ付きＣ末端組換え肺炎球菌タンパク質を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養したＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングした。ＡＢＣ－Ｔは、大きな多重膜貫通タンパク質である：Ｍｅｔ４３５からＧｌｙ７９０までの配列（配列番号１、約４０ｋＤａ）を増幅し、Ｔ７プロモーターＣ－ｔｅｒｍ６ｘＨｉｓタグ組換え実体としてサブクローニングした。ＰａｖＡは、Ｔ７プロモーターＣ－ｔｅｒｍ６ｘＨｉｓタグ組換えタンパク質としてその全長、すなわちＭｅｔ１からＳｅｒ５５１（配列番号２、約６３ｋＤａ）で発現された。ＺｍｐＢの最大細胞外ドメイン、すなわち、Ｍｅｔ１４０～Ａｌａ１８７６（配列番号３、約１４８ｋＤａ）を増幅し、Ｔ７プロモーターＣ－ｔｅｒｍ６ｘＨｉｓタグ切断タンパク質としてサブクローニングした。全ての６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質をＩＭＡＣニッケル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムから回収し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）高容量エンドトキシン除去スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｅｒ）に４回通し、残留エンドトキシンレベルが０．０５単位／ｍｌ未満であることを確認した。次いで、発現したタンパク質を、単一タンパク質又は複合タンパク質製剤（すなわち、タンパク質のペア又は３つ全てのタンパク質を含む製剤）、すなわちワクチン製剤当たり１～１０μｇの抗原として、キトサン（ＣＳ）ポリマー（商品名Ｐｒｏｔｏｓａｎ、Ｎｏｖｏｍａｔｒｉｘ）と組み合わせた。１００μｇ／ｍｌの肺炎球菌抗原（単一又は組み合わせ製剤として、ワクチン製剤当たり１～１０ｕｇの抗原）を含有する滅菌リン酸緩衝生理食塩水水溶液を撹拌すると、肺炎球菌抗原吸着ＣＳナノ粒子が形成された。次いで、ＣＳナノ粒子を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．によって供給されるＣｐＧ（非メチル化シトシン－ホスホロチオエート－グアニンオリゴドオキシヌクレオチド又はＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（群２）と混合した。

任意のアジュバントの非存在下での配列番号１、２及び３に対応する３つの抗原の混合物は、本発明の免疫学的組成物であり、本明細書では「抗原」と呼ばれる。

ＣｐＧと組み合わせてキトサン微粒子に吸収された配列番号１、２及び３に対応する３つの抗原のうちの２つの混合物を含む上記組成物は、本発明の免疫学的組成物であり、それらのそれぞれの抗原決定基、すなわち「ＡＢＣ－Ｔ＋ＺｍｐＢ」、「ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ」及び「ＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ」を参照することによって本明細書で言及される。

ＣｐＧと組み合わせてキトサン微粒子に吸収された配列番号１、２及び３に対応する３つの抗原の混合物を含む上記組成物は、本発明の好ましい免疫学的組成物であり、本明細書では「ＰｒＰＶ」（タンパク質ベースの肺炎球菌ワクチン）と呼ばれる。

ＡＢＣ－Ｔは、大きな複数の膜貫通ドメインであり、Ｅ．コリにおいて高度に不溶性／毒性であることが分かった。最大外部ドメインは、ＴＭＨＭＭサーバ分析に基づく設計に従って表現された。ＰａｖＡ、全長タンパク質を発現させた。ＺｍｐＢは、ＮＣＢＩドメイン相同性検索によって同定されたように、非常に大きな複数の機能的ドメインであると決定された。どの最大部分が最良の発現をもたらすかを見るために、タンパク質のフラグメントの試験的発現を行った。

オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＫ）。

このアッセイの目的は、公開された標準化ＣＤＣ法（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：４１５：１９９７）から適合された方法を使用して、ストレプトコッカス・ニューモニエに対する試験血清試料のオプソニン化能力を再現可能に測定することである。このアッセイは、侵入しているストレプトコッカス・ニューモニエを排除し、続いて食作用を行い、次いで微生物を死滅させるためのインビボでの主要な機構であるインビトロ条件を模倣する。「食作用」は、細胞が物質を吸収し、それを細胞質の液胞（ファゴソーム）に封入するプロセスである。肺炎球菌は、健康な哺乳動物食細胞によって貪食されると死滅する。「オプソニン化」は、抗体及び補体等のオプソニンを抗原上に沈着させることによって食作用を促進するプロセスである。

多くのオプソニン食作用アッセイが文献に記載されている。標準化されたＣＤＣ法は、多くの研究室で試験されている（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＣＡＡＣ，Ｓｅｐｔ．１６－２０，２０００，Ｔｏｒｏｎｔｏ）。次いで、この試験をＳＢで改変し、一般に入手可能な試薬及び対照を使用し、この種の試験に一般的に使用される単位である生存肺炎球菌の５０％の死滅を促進する血清力価（希釈）として結果を表す他の検査室の比較の基礎を提供した。更に、この修正された試験は、他の４つの実験室（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＩＣＡＡＣ，Ｓｅｐｔ．１６－２０，２０００，Ｔｏｒｏｎｔｏ）と十分に対応する結果を生成できることが示されている。

生存肺炎球菌をオプソニン化し、死滅を媒介するワクチン接種マウス抗血清の能力を試験するためにＯＰＫを実施した。他の箇所に記載されている参照オプソニン食作用アッセイ（Ｂａｎｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１２ ＪＩＤ）を、わずかな修正を加えて使用した。ワクチン接種マウス対非ワクチン接種マウスから得られた熱不活性化血清、分化ＨＬ－６０細胞又は新たに単離されたヒト好中球、肺炎球菌、及び乳児ウサギ補体からなる反応混合物を調製した。補体及び／又は抗体、エフェクター細胞又は肺炎球菌を除く全ての成分を欠く対照反応物を並行して流し、振盪しながら３７℃でインキュベートした。インキュベーションの前後に一定分量を取り出し、滅菌ＰＢＳで段階希釈し、ＣＦＵ計数のために血液寒天プレートに試料を播種した。合計５ｘ１０^４個のＤＭＦ分化ＨＬ－６０細胞を、５ｘ１０^２個のオプソニン化Ｓ．ニューモニエ及び補体と共に３７℃／５％ＣＯ_２で４５分間インキュベートした。生コロニー数は、３７℃の嫌気性条件下で約１８時間のインキュベーション期間後に行った。１：１６の最終希釈でのＩＶＩＧをオプソニン化のための病原体特異的抗体の供給源として使用した。非オプソニン化肺炎球菌及び熱不活性化補体を含有するウェルを対照として使用した。

エクスビボ調査
ＰＢＭＣ単離及びエクスビボ刺激アッセイ
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって全血からＰＢＭＣを単離した。簡単に記載すると、全血をヘパリンチューブに採取し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中の等容量のＤＰＢＳで希釈した。３０ｍｌ容量の希釈血液をＦｉｃｏｌｌの上に重層し、室温で３０分間４００ｇで遠心分離した。単核細胞（ＭＮＣ）は、血漿とＦｉｃｏｌｌとの間の界面に規定の細胞層を形成する。最上層（血漿）を慎重に除去し、次いで、ＭＮＣ層を新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに回収した。ＭＮＣをＤＰＢＳで補充することによって洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び２００ｍＭＬ－グルタミンを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁した。ＰＢＭＣを使用して細胞内サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａ）アッセイを実施して、３つの肺炎球菌抗原に対するそれらの抗原特異的及びＴ細胞応答を調べた。簡潔には、ＰＢＭＣ（１ｘ１０^６／ウェル）を、ＣｐＧ－キトサンに吸着した肺炎球菌抗原の存在下で、ＲＰ１０（１０％ＦＢＳ、１ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ補充剤、５５μＭの２－メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ－１６４０）中で７２時間（３７℃、５％ＣＯ２）新たに培養した。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を最後の１４時間含めた。次いで、ＰＢＭＣを固定し、透過処理し、細胞表面マーカー特異的抗体（抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ８ ＡＰＣ；全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）並びに抗ＩＦＮ－ＰＥ及びＩＬ－１７Ａ－ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で標識して、細胞内サイトカインを検出した。増殖応答を、Ｋｉ６７標識を使用して評価した。

インビボマウス調査
マウス鼻咽頭キャリッジモデル。

Ｓ．ニューモニエを血液寒天上に画線接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩増殖させた。Ｓ．ニューモニエを、各コロニーの周りのα溶血ゾーン及びオプトチンディスクの周りの阻害ゾーンの存在によって同定した。コロニーのスイープを脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスに接種し、３７℃で一晩静的に増殖させた。翌日、７５０μｌの一晩増殖させたものを、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＢＨＩ中に継代培養し、対数期中期増殖（ＯＤ５００ ０．８）まで４～６時間静的に増殖させ、この時点で、ブロスを５００μｌの一定分量に分割し、使用するまでＦＣＳを含むＢＨＩブロス中－８０℃で１ヶ月以内保存した。マウスを酸素中２．５％イソフルオランで麻酔し、滅菌ＰＢＳ中の合計１０^６ＣＦＵ／１０ｕｌの細菌懸濁液を、マイクロピペットを使用して鼻腔内投与した。所定の時点で、動物をＣＯ_２チャンバ内で安楽死させ、様々な組織を解剖した。

鼻咽頭から脳への髄膜炎モデル
マウスをＯ２及びイソフルオランの混合物で麻酔し、マウス当たり１０^８ＣＦＵ／１０ｕｌで鼻腔内感染させた。疾患の臨床徴候についてマウスを定期的にスコア化し、頸椎脱臼による感染後の所定の時間に選別し、生菌数を決定するために組織を無菌的に除去した。血液試料を心臓穿刺によって採取した。

肺炎及び敗血症モデルにおけるマウス負荷試験
肺炎球菌分離株を５％血液寒天プレート上に画線接種した。単一コロニーをＢＨＩ中で一晩増殖させ、次いで－８０℃で保存するためにＢＨＩ＋２０％血清中で継代培養した。接種材料を様々な密度で滅菌ＰＢＳビヒクル溶液中のマウスに投与した：肺炎モデルでは、マウスを麻酔し、１０^６ＣＦＵ／５０μｌ／マウスで鼻腔内感染させ、敗血症モデルでは、マウスは１０^６ＣＦＵ／１００μｌ／マウスの静脈内投与を受けた。全ての実験を７２時間の監視期間にわたって行った。

免疫プロトコル。

本発明の三価タンパク質ベースのワクチン＋ＣｐＧキトサン製剤（ＰｒＰＶ）の免疫原性を、鼻腔内免疫化後のＣ５７ＢＬ／６マウス（１週齢の乳児対６週齢の成体）において評価した。体積１０μｌの溶液を、ｎ＝１０匹の乳児マウス／群の群に７、１４及び２１日目に筋肉内投与した。成体マウスを６週目（プライム）、８週目（ブースト１）及び１０週目（ブースト２）に同じ方法で免疫した。対照群には、ＰＢＳ又は遊離抗原溶液、すなわちアジュバントを含まない抗原溶液のいずれかを投与した。予備実験では、最適なワクチン投与量（１～１０μｇ／動物の範囲）を、３次ワクチン接種後２週間で抗体応答を測定することによって決定した。陰性／プラセボ対照群に加えて、ワクチン製剤も、現在認可されているワクチンＰＣＶ－１３（商品名Ｐｒｅｖｅｎａｒ１３（登録商標））に対して評価した。

受動的移行研究。

ビヒクル又はＣｐＧ－キトサンに吸着されたＡＢＣ－Ｔ＋ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢを含有するワクチンＰｒＰＶ製剤のいずれかで免疫した成体マウスを心臓穿刺によって選別し、血清（１００～１５０μｌ／マウス）を静脈内投与によってナイーブ動物に移した。移入の４時間後、動物にＳ．ニューモニエを鼻腔内（ニューモニエモデル）又は静脈内（敗血症モデル）でチャレンジした。マウス生存及び組織生存数を記録した。

免疫応答の測定。

抗肺炎球菌適応免疫を特徴付けるために、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、抗原特異的血清抗体応答（総ＩｇＧ、抗原特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を決定した。細胞媒介性免疫を、肺炎球菌抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を測定することによっても決定した：単一細胞懸濁物を腸間膜リンパ節から調製し、肺炎球菌抗原（ＡＢＣ－Ｔ＋ＰａｖＡ＋ＺｐｍＢ）の存在下又は非存在下でエクスビボで再刺激した。サイトカイン応答を、Ｔｈ１／Ｔｈ２及びＴｈ１７パネルのための細胞内染色キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４及びＩＬ－１７に特に焦点を合わせて決定した。

比較ゲノム解析
臨床的髄膜炎を伴わない血流感染（菌血症；ｎ＝７０）に対する髄膜炎を有するマラウイ人の成人及び子供に由来する１４０の肺炎球菌分離株（ｎ＝７０）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。マッピングされた遺伝子をクラスター化し、３つのカテゴリー：全ての分離株によって共有されるオルソロガス遺伝子（コア遺伝子）、２つ以上の分離株間で共有されるオルソロガス遺伝子（アクセサリー遺伝子）、及び１つの分離株に固有の遺伝子に分けた。合計３，１６４個のオルソロガス遺伝子クラスターが発見された：４５％（１，４２８個のコア遺伝子）が試験分離株の全てに存在し、１，６１２（５１％）が２つ以上の分離株に存在し、残りの１２４個の遺伝子（４％）はクラスター内にグループ化されなかった。予想外にも、１４０の分離株のコアゲノム又はアクセサリー遺伝子含有量の間に差は見られなかった。遺伝子の増加／減少事象（未公開）の進化履歴を比較するために、確率的混合（ＧＬＯＯＭＥ）に基づいて構築されたアプローチを採用した。ここで、髄膜炎特異的遺伝子の小さなサブセット、すなわち肺炎球菌付着病原性因子Ａ（ＰａｖＡ、遺伝子ＩＤ：１２８８９１０１）が同定された。ＡＴＰ結合カセット／トランスポータパーミアーゼ（ＡＢＣ－Ｔ、遺伝子ＩＤ：１３６９５５５２）；及び亜鉛メタロプロテアーゼＢ（ＺｍｐＢ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７６８０８３４）等が挙げられる。これらの遺伝子は、ヒトタンパク質とのそれらの低い配列相同性、それらの記録された機能、及びそれらの表面発現パターンに基づいて関心対象となった。その後、ゲノム分析を２５，００００を超える肺炎球菌分離株で構成されるデータセットに拡張した。年齢を越えて世界的な適用範囲を提供するワクチン製剤を設計するという目標に沿って、６大陸（アジア、アフリカ、北米、南米、欧州、オーストラリア）及び３６の異なる国にまたがる、先進国と発展途上国の両方に由来する４４の異なる肺炎球菌血清型を含む一組の分離株を評価した。

肺炎球菌病原性におけるそれらの重要な役割のために、３つの肺炎球菌タンパク質はまた、配列において最も可変であり得ることが予想された。例えば、これは、２１個の異なる対立遺伝子変異体がこれまでに同定されているニューモリシンの場合に実証されている。したがって、遺伝子配列可変性（対立遺伝子変異体）の程度を各同定された候補遺伝子について決定し、それらの遺伝的関係を評価し、全体レベルでの有病率、血清型特異的関連を決定し、最も一般的な変異体形態を選択した。

統計分析
複数の群の比較のために、データが正規分布している場合、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較事後検定によってエンドポイントの統計的有意性を評価した。データが正規分布していない場合、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてＤｕｎｎの多重比較事後検定によってエンドポイントの統計的有意性を評価した。２つの群の比較のために、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用した。データを平均±ＳＥＭとして棒グラフで示す。ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して、肺炎球菌チャレンジ生存曲線を分析した。ｐ値が０．０５未満の結果を有意とみなした（＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。統計分析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行った。

本明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語及びそれらの変形は、「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加剤、構成要素、整数又は工程を排除することを意図しない（及び排除しない）。本明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要とされない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈がそうでないことを要求しない限り、複数並びに単数を企図するものとして理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態又は実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学部分又は基は、それと非互換性でない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約、及び図面を含む）に開示された特徴の全て、及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合わせを除いて、任意の組合わせで組み合わせることができる。本発明は、任意の前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約、及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、若しくは任意の新規な組合わせ、又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の任意の新規なもの、若しくは任意の新規な組合わせに及ぶ。

読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時に又は本明細書の前に提出され、本明細書と共に公衆の閲覧に供される全ての論文及び文書に向けられ、そのような全ての論文及び文書の内容は参照により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

［実施例１］
ＺｍｐＢ、ＡｂｃＴ及びＰａｖＡに対する特異的ＩｇＧ抗体のレベルを、ｎ＝１２人の小児（２歳～７歳）、ｎ＝１２人の健康な成人（１８歳～４５歳）、ｎ＝１２人の肺炎球菌性院内肺炎（ＣＡＰ）を呈する成人患者、ｎ＝１２人のＨＩＶを有する成人、及びｎ＝１２人の６５歳～７５歳の高齢患者から得られた血清中の酵素免疫測定法によって決定した。高結合性マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を炭酸－重炭酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭ、ｐＨ９．２）中５ｕｇ／ｍｌの総タンパク質（単一のＡｂｃＴ、ＰａｖＡ、ＺｍｐＢとして、又はＡｂｃＴ＋ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢの組合わせのいずれか）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中１％ｗ／ｖＢＳＡを用いてブロッキングを行った。血清をＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡｗ／ｖ中に１：２０～１：４０，９６０で段階希釈した。使用した二次抗体は、アルカリホスファターゼコンジュゲート化モノクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ａ２０６４－１ＭＬ）であった。全ての測定について≧０・０４（対照血清の２標準偏差）のＯＤを陽性とみなした。検出不能な抗ＺｍｐＢ又は抗ＡｂｃＴ／ＰａｖＡを有する試料には、検出限界の半分に相当する値を割り当てた。タンパク質特異的ＩｇＧの結果は、ＯＤ値（４０５ｎｍでのＯＤ単位）に基づいて半定量的に与えられる。これらは、血清陰性対照ウェルのＯＤ読み取り値を差し引いた後の３連試料の平均ＯＤ読み取り値から計算した。

図４は、健康な成人ボランティア又は肺炎球菌侵襲性疾患にかかりやすい個体、すなわち小児、高齢者及びＨＩＶを有する患者から採取されたヒト血清抗体の結合活性を示す。結果は、本明細書に記載の３つのタンパク質、すなわちＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢが、ヒト抗体によって認識される抗体結合領域（又はＢ細胞エピトープ）を含み、したがってそれらを強力なワクチン候補として使用することを支持することを示唆している。

［実施例２］
図５は、髄膜炎マウスモデルにおける普遍的に発現される保存された肺炎球菌抗原の検証からの結果を示す。１０μｌの滅菌生理食塩水中のＳ．ニューモニエを鼻に適用するか、又は大槽に注射した。１００μＬの脳組織ホモジネートを９６ウェルプレート上のウェルに移し、滅菌ＰＢＳ中で１０倍連続希釈を行った。６０μＬの一定分量を、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する血液寒天プレートにスポットした。組織ホモジネートからの細菌負荷（ＣＦＵ）を、感染後０、１、３、７、１０及び１４日目の前臨床髄膜炎モデルにおける感染動物から列挙した。これらの結果は、ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢタンパク質の発現がヌルである場合、ストレプトコッカス・ニューモニエの病原性、すなわち宿主組織に拡散及び侵入する能力が有意に弱まることを示す。これらの所見は、ワクチン候補としてのこれらのタンパク質の使用を強く支持する。

［実施例３］
マウスを、本発明の配列番号１、２及び３に対応する３つの抗原決定基の混合物で、単独（Ａｇ）で、又はプライムブーストレジメンを使用してミョウバン（ミョウバン＋Ａｇ）若しくはＣｐＧ－キトサン（ＣｐＧ－キトサン＋Ａｇ）／ＰｒＰＶと組み合わせて免疫化し、５．１０^５ＣＦＵ／マウスで５０μｌ鼻腔内チャレンジした。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図６Ａ）成体及び（図６Ｂ）新生児における疾患の徴候の発症についてマウスをモニタリングし、臨床疼痛スコアを記録した（ｎ＝１０／群）。

本発明の配列番号１、２及び３に対応する３つの抗原決定基（Ａｇ）の様々な量の混合物を用いて、それぞれ一定量のＣｐＧ－キトサンと組み合わせて、抗体用量応答－免疫化試験を行った。抗血清中の抗原特異的抗体（Ｓｐｅ－ＩｇＧ１、Ｓｐｅ－ＩｇＧ２ａ）レベルを、抗原０．１、１．０及び１０μｇ／マウスでＣｐＧ－キトサンに吸着した組換えタンパク質抗原（Ａｇ）のプライム＋ブースター用量でワクチン接種したマウス（ｎ＝１０）から測定した。ＰＢＳ／ビヒクル接種動物からの抗血清を対照として含めた。結果を平均±ＳＥＭとして示した（図７Ａ）。細胞媒介性免疫応答を、ＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ＋ＺｍｐＢ（５００μｇ／ｍＬ）で７２時間のエクスビボ再刺激時に免疫化後３５日目に採取した腸間膜リンパ節を使用して決定した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行って、ＩＬ－１７及びＩＦＮ－γサイトカイン産生を測定した。（図７Ｂ）。

マウスにＰＢＳ（ビヒクル）、アジュバント単独（ミョウバン又はＣｐＧ－キトサン）、又はアジュバント＋抗原（ミョウバン＋１．０μｇのＡｇ；ＣｐＧ－キトサン＋１．０μｇのＡｇ）をワクチン接種した。ワクチン接種後３５日目に、マウスに５ｘ１０^５ＣＦＵの高毒性肺炎球菌血清型１臨床分離株を鼻腔内チャレンジし、疾患症状の発症時に選別した。免疫化後３５日目に採取した腸間膜リンパ節におけるワクチン抗原特異的応答を、７２時間のＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ＋ＺｍｐＢ（５００μｇ／ｍＬ）によるエクスビボ再刺激によって決定した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行って、ＩＬ－１７（Ｔｈ１）及びＩＬ－４（Ｔｈ２）サイトカイン産生を測定した。平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ及びＤｕｎｎの事後検定（対ビヒクル（図７Ｃ及び７Ｄ））。ＰｒＰＶ製剤によるワクチン接種は、従来のミョウバンアジュバントと比較して疾患保護を強化する。

［実施例４］
ＰｒＰＶの保護有効性を、成体（図８Ａ）及び新生児（図８Ｂ）マウスにおける肺炎球菌敗血症及び肺炎のモデルにおいてＰＣＶ－１３に対して比較した。マウスを、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（「ミョウバン＋Ａｇ」）と組み合わせた組換えＺｍｐＢ、ＡＢＣ－Ｔ及びＰａｖＡで免疫化し、Ｓ．ニューモニエ５ｘ１０^５ＣＦＵ（ｉ．ｎ．）でチャレンジした。チャレンジ後７日間、動物の生存をモニタリングした。生存マウスの数を全体のパーセンテージとしてプロットする（ｎ＝１０マウス／群）。図８Ｃは、チャレンジ後３日目の個々の新生児マウスの肺における細菌密度を示す。血液を心臓穿刺によって採取し、ＣＦＵ生菌数について血液寒天プレート上にスポットした（図８Ｄ）。全ての実験について、ナイーブマウス及びアジュバントのみ免疫化したマウスを陰性対照とした。

更なる実験では、ＣｐＧ－キトサン（ＰｒＰＶ）と組み合わせた配列番号１、２及び３に対応する組換えＺｍｐＢ、ＡＢＣ－Ｔ及びＰａｖＡでマウスを免疫化し、続いてＳ．ニューモニエ１ｘ１０^６ ＣＦＵをｉ．ｎ．でチャレンジした。動物の生存をチャレンジ後５日までモニタリングした。生存マウスの数を全体のパーセンテージとしてプロットした（ｎ＝１０マウス／群）。非ワクチン肺炎球菌血清型、例えば、イングランド及びウェールズで新興血清型として報告されている８、１１Ａ及び３３Ｆを試験して、ワクチン製剤の保護範囲の幅を評価した。ＰＣＶ－１３を比較対象として使用した（ｎ＝１０マウス／群）。マウス生存率（図９Ａ）及び臨床疼痛スコアをモニタリングした（図９Ｂ）。これらの結果は、本発明のＰｒＰＶ製剤が、市販のワクチンＰＣＶ－１３（Ｐｒｅｖｅｎａｒ－１３）と比較して、非ワクチン血清型に対してより良好な免疫保護効果を提供することを示す。

［実施例５］
単離したヒトＰＢＭＣをＰＣＶ－１３（１：５０）及びＰｒＰＶでそれぞれ７２時間刺激し、Ｔ細胞応答を細胞内染色によって調べた。図１０は、（Ａ）ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞をゲーティングアウトして、上部にパーセンテージを示した長方形のゲート内のＫｉ６７^＋増殖Ｔ細胞を表すことを示す。ＩＦＮγ^＋ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞（Ｂ）及びＩＬ－１７Ａ^＋ＣＤ４^＋Ｔｈ１７細胞（Ｃ）の割合をドットプロットの右上の象限に示した。２人の個々のドナーからのデータを棒グラフに要約した。ＭＣ：培地対照。結果は、ＰｒＰＶがヒトＰＢＭＣにおいてＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を活性化することを示している。同様の実験では、単離されたヒトＰＢＭＣをＰＣＶ－１３（１：５０）、キトサン＿ＣｐＧ及びＰｒＰＶでそれぞれ７日間刺激し、続いて血漿Ｂ細胞活性化を検出した。メモリーＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＣＤ２７^＋ＩｇＤ^－）内の形質Ｂ細胞（ＣＤ２７^ｈｉｇｈＣＤ３８^ｈｉｇｈとしてゲートされた）の割合を下の等高線図に示す（図１１）。データは、２人の個々のドナーの代表である。これらの結果は、ＰｒＰＶがヒトＰＢＭＣ中の形質Ｂ細胞を活性化することを示す。

［実施例６］
ビヒクル又はＰｒＰＶ製剤（ＣｐＧ－キトサンに吸着された配列番号１、２及び３に対応するＡＢＣ－Ｔ／ＰａｖＡ／ＺｍｐＢを含む）のいずれかで免疫した成体マウス（ｎ＝１０／群）を心臓穿刺によって選別し、血清（１００～１５０μｌ／マウス）を静脈内投与によってナイーブ動物に移した。移入の４時間後、疾患を引き起こす用量のＳ．ニューモニエを動物に静脈内チャレンジした（敗血症モデル）。マウス生存時間（図１２Ａ）及び血液及び肺におけるＣＦＵ生存数（図１２Ｂ）を記録した。これらの結果は、ＰｒＰＶ免疫マウス由来の血清がナイーブマウスにおいて受動免疫を付与することを示す。

健康なボランティア由来のヒトＰＢＭＣを、密度勾配分離を使用してＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓによって全血から単離し、ＰｒＰＶ組成物の存在下で７～８時間培養した。上清を回収し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器（１０Ｋ ＭＷＣＯ）を用いて濃縮し、成体ナイーブマウスに静脈内投与した。移入の４時間後、動物（ｎ＝５／群）にＳ．ニューモニエを鼻腔内（ニューモニエモデル）又は静脈内（敗血症モデル）のいずれかでチャレンジした。マウス生存時間（図１３Ａ）及び血液及び肺におけるＣＦＵ生存数（図１３Ｂ）を記録した。これらの結果は、ＰｒＰＶ刺激ヒトＰＢＭＣ培養物からの濃縮上清がナイーブマウスにおいて受動免疫を付与することを示す。

［実施例７］
ビヒクル又はＰｒＰＶ製剤のいずれかで免疫した成体マウス（ｎ＝１０／群）を心臓穿刺によって選別し、機能的オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＫアッセイ）で使用するために血清（１００～１５０μｌ／マウス、希釈１：１６）を採取した。生存肺炎球菌をオプソニン化し、死滅を媒介するワクチン接種マウス抗血清の能力を試験するためにＯＰＫを実施した。参照オプソニン食作用アッセイを使用し、それによりワクチン接種マウス対非ワクチン接種マウスから得られた熱不活性化血清、分化ＨＬ－６０細胞又は新たに単離されたヒト好中球、肺炎球菌、及び乳児ウサギ補体からなる反応混合物を調製した。補体及び／又は抗体、エフェクター細胞又は肺炎球菌を除く全ての成分を欠く対照反応物を並行して流し、振盪しながら３７℃でインキュベートした。結果は、ＰｒＰＶ免疫マウス由来の血清が肺炎球菌のインビトロオプソニン化を促進し、ライセンスされたＰＣＶ－１３ワクチンを打ち負かすことを示す（図１４）。

［実施例８］
ＰｒＰＶ組成物に対するＣｐＧ－キトサンと組み合わせた単一タンパク質の抗体用量応答を研究した。１．０μｇ／マウスのプライム＋ブースター用量の単一タンパク質又はＰｒＰＶ組成物（「ＣｐＧキトサン＋Ｍｉｘ」と標識）をワクチン接種したマウス（ｎ＝１０）から測定した抗血清中の抗原特異的抗体（Ｓｐｅ－ＩｇＧ１、Ｓｐｅ－ＩｇＧ２ａ）レベルを測定した。結果を平均±ＳＥＭとして示した（図１５Ａ）。単一タンパク質製剤対混合タンパク質製剤によるワクチン接種時の細胞媒介性免疫応答も研究した。免疫化後３５日目に採取した腸間膜リンパ節におけるワクチン抗原特異的応答を、７２時間のＰａｖＡ、ＡＢＣ－Ｔ、又はＺｍｐＢ（５００μｇ／ｍＬ）によるエクスビボ再刺激によって決定した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行って、ＩＬ－１７Ａ（Ｔｈ１７）及びＩＦＮ－γ（Ｔｈ１）サイトカイン産生を測定した。（図１５Ｂ）。これらの結果は、混合タンパク質製剤によるワクチン接種が、単一タンパク質アジュバント化ＣｐＧ製剤と比較して増強された免疫原性を提示することを示す。

成体マウス（ｎ＝１０／群）に、ＰＢＳ（ビヒクル）、単一抗原＋ＣｐＧ－キトサン又はＰｒＰＶでワクチン接種した。ワクチン接種後３５日目に、マウスに５ｘ１０^５ＣＦＵの高毒性肺炎球菌血清型１臨床分離株を鼻腔内チャレンジし、疾患症状の発症時に選別した。図１６Ａは生存曲線を示す。血液及び肺中の細菌の生菌数を、鼻腔内感染後に予め選択した間隔で決定した（図１６Ｂ）。ＩＫＡ Ｔ１０ホモジナイザーを用いて組織試料をホモジナイズした。肺細胞懸濁液及び血液試料中の生菌数を、滅菌ＰＢＳ中で段階希釈し、５％（ｖ／ｖ）の脱線維化ウマ血液（Ｏｘｏｉｄ）及び１０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ｓｉｇｍａ）を含有する血液寒天上に播種することによって決定した。乾燥したら、プレートを５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートし、翌日、細菌コロニー数を評価した。これらの結果は、本発明の混合タンパク質製剤によるワクチン接種が、単一タンパク質アジュバント添加製剤と比較して増強された疾患保護を提供することを示す。

成体マウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（ビヒクル）又はアジュバント＋抗原（対になったタンパク質製剤中のＣｐＧ－キトサン＋１．０μｇ Ａｇ）をワクチン接種した。対になったタンパク質製剤は、配列番号１、２及び３（ＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ又はＡＢＣ－Ｔ＋ＺｐｍＢ又はＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ）に対応するタンパク質であった。ワクチン接種後３５日目に、マウスに５ｘ１０^５ＣＦＵの高毒性肺炎球菌血清型１臨床分離株を鼻腔内チャレンジし、疾患症状の発症時に選別した。図１７Ａは生存曲線を示す。血液（図１７Ｂ）及び肺（図１７Ｃ）中の生菌数を、鼻腔内感染後に予め選択した間隔で決定した。ＩＫＡ Ｔ１０ホモジナイザーを用いて組織試料をホモジナイズした。肺細胞懸濁液及び血液試料中の生菌数を、滅菌ＰＢＳ中で段階希釈し、５％（ｖ／ｖ）の脱線維化ウマ血液（Ｏｘｏｉｄ）及び１０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ｓｉｇｍａ）を含有する血液寒天上に播種することによって決定した。乾燥したら、プレートを５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートし、翌日、細菌コロニー数を評価した。これらの結果は、対になったタンパク質製剤によるワクチン接種が、ＰａｖＡ＋ＺｍｐＢ、ＰａｖＡ＋ＡＢＣ－Ｔ、ＡＢＣ－Ｔ＋ＺｍｐＢの順序で保護効果を誘導することを示している。

［実施例９］
肺炎球菌のコロニー形成及びシェディングに対する本発明の免疫学的組成物（ＰｒＰＶ）の効果を、筋肉内免疫化後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて評価した。１０μｌの体積の溶液を、出生後７、１４及び２１日目に、ｎ＝１０匹の乳児マウス／群に筋肉内投与した。対照群には、アジュバント単独又は遊離抗原溶液、すなわちアジュバントを含まない抗原溶液のいずれかを投与した。２回目のブースターの２週間後、接種材料を１０^５肺炎球菌ＣＦＵ／１０μｌ／マウスの滅菌ＰＢＳビヒクル溶液中でマウスに鼻腔内投与した。細菌密度（組織ホモジナイズ及びノーズタップによる）を１５日間のモニタリング期間にわたって決定した（図１８）。ヒト鼻咽頭からの肺炎球菌の排除は、有害であり得る結果をもたらし得る。したがって、合理的なアプローチは、肺炎球菌が鼻咽頭に留まることを可能にするが、感染をもたらす身体部位への播種を防止するワクチンを開発することである。本発明のＰｒＰＶ組成物は肺炎球菌疾患に対する防御効果を提供するが、マウス鼻咽頭内の肺炎球菌生態には影響しない。

［実施例１０］
マウスにおけるＰｒＰＶによって誘導された免疫学的応答をフローサイトメトリーによって評価した。１０μｌの体積のＰｒＰＶ溶液を、出生後７、１４及び２１日目に、ｎ＝１０匹の乳児マウス／群に筋肉内投与した。更なる群のマウスに、アジュバント単独（「ＣｐＧ－キトサン」）又はビヒクル対照溶液のいずれかを投与した。２回目のブースターの２週間後、マウスを５０μｌ／マウス中２．１０^５ＣＦＵ肺炎球菌血清型１でプライミングした。肺炎球菌感染の３日後に腸間膜リンパ節で測定された免疫細胞増殖を図１９に示す。結果は、本発明の組成物（ＰｒＰＶ）が、ＰｒＰＶ免疫化マウスのリンパ系構造体において増殖応答（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｋｉ－６７陽性細胞の割合によって測定される）を誘導するのに強力であることを示す。

［実施例１１］
成体マウス（ｎ＝５／群）に、ＰＢＳ（ビヒクル）、ＣｐＧ－キトサンアジュバント単独（「ＣｐＧ－キトサン」）、又はＰｒＰＶ（すなわち、ＣｐＧ－キトサン＋１．０μｇ配列番号１、１．０μｇ配列番号２＋１．０μｇ配列番号３／マウス）をワクチン接種した。ワクチン接種後３５日目に、マウスに５ｘ１０^５ ＣＦＵの高毒性肺炎球菌血清型１臨床分離株を鼻腔内チャレンジし、２４時間後に選別した。実験エンドポイントで採取した肺単一細胞懸濁液中のワクチン抗原特異的応答を、２４時間のＰａｖＡ、ＡＢＣ－Ｔ又はＺｍｐＢ（５００μｇ／ｍＬ）によるエクスビボ再刺激によって決定した。簡単に説明すると、マウスの肺を解剖し、ハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）を含む小型チューブに移した。残存する気管組織を慎重に除去し、肺組織をペトリ皿を用いて小片に切断した。３００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ及び７５ｕｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉを含有する消化溶液を肺片（２ｍｌ／マウス）に添加し、３７℃で４０分間～１時間インキュベートした。消化した組織をセルストレーナに通し、遠心分離し、ペレットを５ｍｌの１ｘＲＢＣ溶解緩衝液に再懸濁し（４分間のインキュベーション）、細胞を計数し、４ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で播種した。誘導された単一細胞懸濁液を、それらのそれぞれのフルオロフォアにコンジュゲートした抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ４４又は抗ＩＬ－１７Ａ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図２０Ａは、各群の代表的なドットプロット、すなわち、ナイーブ、抗原、ＣｐＧ－キトサン（アジュバント単独）及びＰｒＰＶを示し、右上の象限は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋ＩＬ１７Ａ陽性細胞の割合を示す。図２０Ｂは、ＰｒＰＶ免疫マウスにおけるＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋ＩＬ１７Ａ陽性細胞のパーセンテージが他の全ての群よりも有意に高いことを示す（＊＊＜ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＰｒＰＶによるワクチン接種が、ビヒクル又はアジュバントのみの群と比較して有意に高いＩＬ－１７Ａ媒介防御免疫をもたらすことを示唆している。

［実施例１２］
本発明の抗原の保護有効性を、β－グルカン（β１，３／１，６－Ｄ－グルカン、ＩＲＩ１５０１、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離される）と共製剤化したときに試験した。成体マウスに、ＰＢＳ（ビヒクル）、アジュバント単独（ＣｐＧを補足した又は補足しないベータグルカンベースの製剤）、又はアジュバント＋配列番号３及び２に対応するＺｍｐＢ抗原とＰａｖＡ抗原との混合物（ベータグルカンベースのアジュバント＋ＣｐＧを補足した又は補足しない１．０μｇ Ａｇ）をワクチン接種した。ワクチン接種後３５日目に、マウスに５ｘ１０^５ＣＦＵの高毒性肺炎球菌血清型１臨床分離株を鼻腔内チャレンジし、疾患症状の発症時に選別した。生存曲線（図２１Ａ）及び生存数（ＣＦＵ）を、血液（図２１Ｂ）及び肺組織（図２１Ｃ）において決定した。４０％の保護有効性が、（抗原単独）又は（抗原＋ＣｐＧ＋β－グルカン）のいずれかを投与されたマウスにおいて得られたことから、β－グルカンベースのアジュバント添加製剤が本発明の抗原によって付与される保護有効性を妨げず、更なる最適化、例えば投与量、免疫化スケジュール、及び／又は他の免疫賦活性化合物による再製剤化の際に強力な肺炎球菌ワクチンに開発され得ることが示唆される。

Claims (21)

1. 少なくとも２つの抗原決定基を含む免疫原性組成物であって、前記抗原決定基が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する、免疫原性組成物。
2. 少なくとも２つの抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物を含む免疫原性組成物であって、前記抗原決定基が、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する、免疫原性組成物。
3. 少なくとも１つの抗原決定基と、少なくとも１つの異なる抗原決定基をコードする１つ又は複数の遺伝子構築物と、を含む免疫原性組成物であって、前記抗原決定基が、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択される少なくとも２つのタンパク質に由来する、免疫原性組成物。
4. 前記抗原決定基が、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のタンパク質ＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢの３つ全てに由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
5. 前記ＡＢＣ－Ｔに由来する抗原決定基が、配列番号１のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなり、並びに／あるいは
   前記ＰａｖＡに由来する抗原決定基が、配列番号２のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなり、並びに／あるいは
   前記ＺｍｐＢに由来する抗原決定基が、配列番号３のタンパク質配列、又はその免疫学的に有効な断片、又はその配列若しくは断片の免疫学的に有効な類似体を含むか又はそれからなる、
   請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
6. 免疫賦活剤を更に含み、好ましくは前記免疫賦活剤がアジュバントである、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
7. 前記アジュバントが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）等のサイトゾルパターン認識受容体（ＰＲＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）等の核酸感知受容体、又はｍＴＯＲ及びＧＣＮ２等の栄養センサーに対する刺激効果を有する物質；以下の経路：ＭｙＤ８８／ＴＬＲ－シグナル伝達経路、ｃＧＡＳ－インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路、ＮＦ－κＢ経路、核酸、尿酸、ＡＴＰ及び自然免疫系を活性化するタンパク質等の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出をもたらす任意のストレス、細胞死及び組織損傷経路（壊死／ネクロトーシス、アポトーシス、オートファジー等）、自然免疫系を長期間にわたって警報状態、すなわち記憶様状態で維持する免疫細胞動員又はエピジェネティック変化をもたらす任意のシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つに作用する物質；ＣＤ４＋Ｔｈ２（インターロイキン－４）、Ｔｈ１（インターフェロン－ガンマ）－又はＴｈ１７（ＩＬ１７Ａ）媒介性免疫への細胞分化によってもたらされるインフラマソーム活性化を誘導する特性を有する物質；免疫増強剤；ＩＬ－１β、ＣＬＲ及びＴＮＦ－αシグナル伝達経路に作用する多糖系物質）；送達系及び粘膜アジュバントから選択される１つ又は複数の物質を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
8. 前記アジュバントが、カプセル等の細菌タンパク質及び／又は多糖物質並びにその類似体、毒素／トキソイド及びその類似体、ＴＬＲリガンド及びその類似体、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、ＭＰＬＡ（ＬＰＳ誘導体）、ＣｐＧ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＣｐＧモチーフ等のアゴニスト；キトサン又はβ－グルカン、フラジェリン、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）又はＰＬＧＡ－ポリ－ｌ－リジン／ポリ－ガンマ－グルタミン酸（ＰＬＧＡ－ＰＬＬ／ガンマＰＧＡ）等のマイクロ粒子及びナノ粒子、又はモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴマンノース、ポリ（Ｉ：Ｃ）、外膜小胞（ＯＶＭ）等の細胞外小胞（ＥＶ）等の任意の他の免疫賦活剤と共製剤化された脂質ベースの骨格で作製されたマイクロ粒子及びナノ粒子；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－７２０及びその類似体等の油中水型、水中油型及び熱可逆性水中油型エマルジョンを含む、油ベースの封入又はエマルジョンベースのシステム、ミョウバン又はアルミニウム塩アジュバント、リポソーム、ビロソーム、アーケオソーム、外膜小胞、ニオソーム、サポニン及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ポリマー粒子、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７Ａ／Ｆ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＭＰＩ等の炎症促進性サイトカインを含むサイトカイン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）等のＬＰＳの解毒変異体等の細菌成分、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ親油性及び疎水性）、ＱＳ２１、ＰＬＧＡ、ＣＴ、リポソームベースのカチオン性アジュバント製剤、例えば、ＣＡＦ０１－０９（Ｓｐａｎ８０、ポリオキシエチレンセチル－ステアリルエーテル、マンニトール、スクアレンから構成される）並びにコレステロールから構成される類似体、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はα－Ｇａｌセラミド、ＮＯＤ様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム、ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有タンパク質４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム、Ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ２（ＡＩＭ２）インフラマソーム、ｄｓＲＮＡ：ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣ：ＬＣ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＬＰＳ、フラジェリン、イミダゾキノリン：イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（８４８）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、サポニン（ＱＳ－２１）、多糖カプセル及びその類似体を含む細菌分子又は誘導体、毒素／トキソイド及びその類似体、非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧ）及びその類似体、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）等のサイトカイン、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、正常なＴ細胞が発現及び分泌される）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α等のケモカイン、ＣＤ８０等の共刺激分子又は接着分子、リンパ球機能関連抗原－３及びポリアルギニンテール、キトサンによって提示されるものと同様の特性を有する多糖系物質、例えばＣｐＧ－デルタイヌリン、コクリエート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、微粒子、例えばビロソーム、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧ（ポリ［ラクチド－ｃｏグリコリド］）、コレラ毒素（ＣＴ）誘導体、及び熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴＫ３及びＬＴＲ７２）から選択される１つ又は複数の物質を含む、請求項６又は７に記載の免疫原性組成物。
9. 前記アジュバントが、ＴＬＲアゴニスト、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導することができる（特にＴｈ１及び／又はＴｈ１７分化プロファイルを有する）薬剤、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ＭｙＤ８８／ＴＬＲシグナル伝達経路に作用する薬剤、ｃＧＡＳ－インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路に作用する薬剤、及び粒子状多糖物質から選択される１つ又は複数の物質を含み、好ましくは、前記アジュバントが、ＴＬＲアゴニストと、ＭｙＤ８８／ＴＬＲシグナル伝達経路又はｃＧＡＳ－インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路に作用することができる薬剤との組合わせ、例えば、ＣｐＧとキトサン及び／又はベータグルカンとの組合わせを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ（ＰｃｐＡ）、分泌４５－ＫＤａタンパク質Ｕｓｐ４５－加水分解酵素（ＰｃｓＢ）、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ（ＳｔｋＰ）、ペプチドパーミアーゼ酵素、マンガンＡＢＣトランスポーター（ＰｓａＡ）、ニューモリシンＤ（ＰｌｙＤ）、ニューモリシントキソイド（ｄＰｌｙ）、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）及びＤ（ＣｂｐＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｄ（ＰｈｔＤ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｅ（ＰｈｔＥ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ａ（ＰｈｔＡ）、ヒスチジントリアドタンパク質Ｂ（ＰｈｔＢ）；肺炎球菌セリン－トレオニン取り込みタンパク質Ａ（ＰｉｕＡ）、タンパク質細胞壁分離（ＰｃｓＢ）、肺炎球菌セリン－トレオニンキナーゼ（ＳｔｋＰ）及び類似体、プラスミン及びフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＰｆｂＢ）、ＳＰ０１４８、ＳＰ１９１２及びＳＰ２１０８、ＳＰ０７８５、ＳＰ１５００及びＳＰ２２１６を含む群から選択される、カプセル化又はコンジュゲート化されたストレプトコッカス・ニューモニエ細菌由来の１つ又は複数の更なる抗原決定基を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
11. 液体、懸濁液、錠剤若しくはスプレーであるか、又は凍結乾燥されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
12. ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、外膜小胞（ＯＭＶ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ポリマー性、非分解性、生分解性物質、天然ポリマー化合物、デンプン、アルギネート、セルロース、生合成物質、ポリβ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、コポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリウレタン、ポリ（乳酸－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリメチルメタクリレート樹脂（ＰＭＭＡ）、プロバイオティクス、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）種；ウイルスベクターシステム；改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ポックスウイルス、アデノウイルス及びバクテリオファージを含む群によって送達される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. 請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
14. 請求項６～１２のいずれか一項に記載の特徴のうちの１つ又は複数を含む、請求項１３に記載のワクチン。
15. 個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療又は予防する方法であって、前記ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療又は予防するために、それを必要とする個体において、十分な量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫学的組成物又は請求項１３及び１４に記載のワクチンを投与することを含む方法。
16. 個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫する方法であって、それを必要とする個体に、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫学的組成物又は請求項１３及び１４に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
17. 前記免疫学的組成物又はワクチンが、経口、経鼻、吸入又は注射によって投与される、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記投与が、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、皮内、鼻腔内及び吸入を含む群から選択される経路による、請求項１７に記載の方法。
19. 個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症の治療又は予防において使用するための、並びに／あるいは個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫するための、並びに／あるいは個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を診断又はスクリーニングするための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫学的組成物あるいは請求項１３又は請求項１４に記載のワクチン。
20. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項１３若しくは請求項１４に記載のワクチンと、前記免疫原性組成物又はワクチンを個体に投与する手段と、を含むキット。
21. 個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症を治療若しくは予防する方法、又は個体におけるストレプトコッカス・ニューモニエ細菌感染症に対して免疫化する方法であって、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢから選択されるタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原決定基の十分な量を投与することと、同時に又は続いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ細菌のＡＢＣ－Ｔ、ＰａｖＡ及びＺｍｐＢの異なる１つから選択されるタンパク質に由来する少なくとも１つの抗原決定基の十分な量を投与することと、を含む方法。

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