JP2024087513A - Method and kit for detecting target sequence - Google Patents
Method and kit for detecting target sequence Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024087513A JP2024087513A JP2022202366A JP2022202366A JP2024087513A JP 2024087513 A JP2024087513 A JP 2024087513A JP 2022202366 A JP2022202366 A JP 2022202366A JP 2022202366 A JP2022202366 A JP 2022202366A JP 2024087513 A JP2024087513 A JP 2024087513A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- target sequence
- probe
- strand
- melting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 233
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 126
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 126
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 121
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 62
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 54
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 49
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 claims description 18
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 9
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims description 6
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 claims description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 241001502334 Mycobacterium avium complex bacterium Species 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 208000022155 mycobacterium avium complex disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- -1 DNA and RNA Chemical class 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010309 melting process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005097 23S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000484121 Human parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
【課題】突然変異などの標的配列を的確にかつ迅速に検出する技術を提供する。
【解決手段】標的配列の検出方法は、標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、がハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する。この部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度は、標的配列特異的である。
【選択図】図１
The present invention provides a technology for accurately and quickly detecting a target sequence such as a mutation.
The method for detecting a target sequence involves obtaining the melting temperature of a partial double-stranded DNA formed by hybridizing a single-stranded DNA containing the target sequence with a probe that specifically hybridizes to a portion containing the target sequence. The melting temperature of this partial double-stranded DNA is target sequence-specific.
[Selected Figure] Figure 1
Description
本明細書は、標的配列を融解温度等により検出する方法及びそのためのキットに関する。 This specification relates to a method for detecting a target sequence by melting temperature or the like, and a kit for the same.
従来、一塩基多型（ＳＮＰｓ）などの変異を検出するには、例えば、変異を含む部分をＰＣＲにより選択的に増幅して、その増幅物に特異的にハイブリダイズする検出用のプローブを用いることが行われている。 Conventionally, to detect mutations such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), for example, the portion containing the mutation is selectively amplified by PCR, and a detection probe that specifically hybridizes to the amplified product is used.
例えば、近年、肺ＭＡＣ症の患者数が増大している。ＭＡＣ（Mycobacterium avium complex）は、Mycobacterium aviumとMycobacterium intracellulare との近縁な２菌種の総称である。肺ＭＡＣ症は、ＭＡＣを原因菌とする肺炎などの肺感染症である。肺ＭＡＣ症の治療の原則は、キードラッグであるマクロライド系抗菌薬のクラリスロマイシンを含む多剤併用療法である。 For example, the number of patients with pulmonary MAC disease has been increasing in recent years. MAC (Mycobacterium avium complex) is a collective term for two closely related bacterial species, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. Pulmonary MAC disease is a pulmonary infection, such as pneumonia, caused by MAC bacteria. The principle of treatment for pulmonary MAC disease is combination therapy with multiple drugs, including the key drug, clarithromycin, a macrolide antibiotic.
肺ＭＡＣ症治療における最も懸念すべき問題の一つとして、クラリスロマイシンに対する感受性が低下した耐性菌による治療効果の低下が挙げられる。肺ＭＡＣ症の治療においては、こうした菌の耐性化に応じて薬剤を適時に変更していく必要がある。そのため、肺ＭＡＣ症治療の開始時のみならず、定期的にクラリスロマイシンの感受性試験を実施する必要がある。現在、クラリスロマイシンの薬剤感受性試験は、ガイドラインに基づいた培養法が採用されている。 One of the most worrying issues in the treatment of pulmonary MAC infection is the reduced efficacy of treatment due to resistant bacteria with reduced susceptibility to clarithromycin. In the treatment of pulmonary MAC infection, it is necessary to change drugs in a timely manner according to the resistance of such bacteria. Therefore, susceptibility testing to clarithromycin must be performed not only at the start of treatment for pulmonary MAC infection, but also periodically. Currently, a culture method based on guidelines is used for drug susceptibility testing of clarithromycin.
ＭＡＣのクラリスロマイシン耐性化は、23SリボソームRNA（23S rRNA）のドメインＶの点突然変異（2058～2059番目）によって誘導されることが知られている。クラリスロマイシン感受性である野生型ＭＡＣは、23S rRNAの2058～2059番目の塩基配列がAA型である一方で、６種類の突然変異（TA、GA、AG、CA、AC、AT）を有したクラリスロマイシン耐性のＭＡＣが存在することが報告されている（例えば、非特許文献１）。 It is known that MAC resistance to clarithromycin is induced by a point mutation (2058-2059) in domain V of 23S ribosomal RNA (23S rRNA). Wild-type MAC that is sensitive to clarithromycin has an AA type in the base sequence of 2058-2059 of 23S rRNA, while it has been reported that there exist clarithromycin-resistant MAC with six types of mutations (TA, GA, AG, CA, AC, AT) (e.g., Non-Patent Document 1).
しかしながら、こうした変異を検出するクラリスロマイシン感受性試験は、結果を得るまでに２週間以上の時間を要し、クラリスロマイシン耐性菌の出現に十分に適応できていない。このほか、種々の微生物やウイルスなどにおける突然変異やＳＮＰｓなどを、適時にかつ的確に検出したい要請があるが、現状、こうした要請に十分対応できてはいない。本明細書は、標的配列を的確かつ迅速に検出する技術を提供することを目的とする。 However, clarithromycin susceptibility tests that detect such mutations take more than two weeks to obtain results, and are not adequately adapted to the emergence of clarithromycin-resistant bacteria. In addition, there is a demand for timely and accurate detection of mutations and SNPs in various microorganisms and viruses, but at present, these demands cannot be adequately met. This specification aims to provide a technology for accurate and rapid detection of target sequences.
本発明者らは、ＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡ二本鎖の温度上昇に伴う融解曲線の解析を利用することに着目した。さらに、ＤＮＡ二本鎖の融解曲線のみでは標的配列の相違を識別し難いことが多いことから、本発明者らは、標的配列の相違を、融解温度ないし融解曲線においてできるだけ大きな相違として検出する可能性を検討するに至った。 The inventors focused on the use of melting curve analysis of the double-stranded DNA, which is a PCR amplified product, as the temperature increases. Furthermore, since it is often difficult to distinguish differences in target sequences using only the melting curve of the double-stranded DNA, the inventors have come to consider the possibility of detecting differences in target sequences as the largest possible difference in melting temperature or melting curve.
検討の結果、本発明者らは、標的配列を含むＤＮＡ一本鎖とこの標的配列を含む一部分に対して特異的にハイブリダイズするプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖が、標的配列特異的であり、他の類似した配列と明確に区別できることを見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。 As a result of their investigation, the inventors have found that a partial DNA double strand consisting of a single strand of DNA containing a target sequence and a probe that specifically hybridizes to a portion containing this target sequence is target sequence-specific and can be clearly distinguished from other similar sequences. Based on these findings, the present specification provides the following means.
［１］標的配列の検出方法であって、
前記標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、前記ＤＮＡ一本鎖の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、を準備する準備工程と、
前記ＤＮＡ一本鎖と、前記プローブとがハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程と、
を備える、方法。
［２］前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、［１］に記載の方法。
［３］前記プローブは標識されていない、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を、３’末端が核酸増幅反応により伸長されない前記プローブの存在下で前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ＤＮＡ一本鎖は、塩基長が８０塩基以上２３０塩基以下である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記プローブの塩基長は、２０塩基以上７０塩基以下である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記標的配列は、２種以上の特徴をそれぞれ含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列にそれぞれ特異的な２種以上のプローブを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記標的配列は、微生物又はウイルスの薬剤感受性に関わる、２種以上の変異を含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列に特異的な２種以上のプローブを含む、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記微生物は、Mycobacterium avium及びMycobacterium intracellulareであり、前記標的配列は、これらの微生物におけるクラリスロマイシン感受性に関する少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの標的配列である、［８］に記載の方法。
［１０］前記プローブは、前記クラリスロマイシン感受性に関する点突然変異を含んで３０塩基以上５０塩基以下であり、前記プライマーセットは、前記点突然変異を含んで８０塩基以上１５０塩基以下の塩基長の前記ＤＮＡ二本鎖を増幅可能に構成されている、［９］に記載の方法。
［１１］標的配列を融解によって検出するためのキットであって、
前記標的配列を含むＤＮＡ二本鎖を増幅するための一対のプライマーセットと、
前記ＤＮＡ二本鎖の一方のＤＮＡ一本鎖中の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズする、プローブと、
を備える、キット。
［１２］前記一対のプライマーセットは、前記ＤＮＡ二本鎖のうち前記一方のＤＮＡ一本鎖を優勢に増幅する非対照核酸増幅反応のためのセットである、［１１］に記載のキット。
[1] A method for detecting a target sequence, comprising the steps of:
A preparation step of preparing a single strand of DNA containing the target sequence and a probe that specifically hybridizes to a portion of the single strand of DNA containing the target sequence;
a melting step of obtaining a melting temperature of a partial double-stranded DNA formed by hybridizing the single-stranded DNA with the probe;
A method comprising:
[2] The method according to [1], wherein the preparation step includes obtaining the single-stranded DNA by a nucleic acid amplification reaction that preferentially amplifies the single-stranded DNA.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the probe is unlabeled.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the preparation step includes obtaining the single-stranded DNA by a nucleic acid amplification reaction that preferentially amplifies the single-stranded DNA in the presence of the probe, the 3' end of which is not extended by the nucleic acid amplification reaction.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the single strand of DNA has a base length of 80 to 230 bases.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the base length of the probe is 20 to 70 bases.
[7] The target sequence includes two or more target sequences, each of which includes two or more features;
The method according to any one of [1] to [6], wherein the probe comprises two or more types of probes specific to the two or more types of target sequences, respectively.
[8] The target sequence includes two or more target sequences containing two or more mutations involved in drug susceptibility of a microorganism or virus,
The method according to any one of [1] to [7], wherein the probe comprises two or more probes specific to the two or more target sequences.
[9] The method according to [8], wherein the microorganisms are Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare, and the target sequence is at least one target sequence containing at least one mutation related to clarithromycin susceptibility in these microorganisms.
[10] The method described in [9], wherein the probe is 30 to 50 bases long, including the point mutation related to the clarithromycin sensitivity, and the primer set is configured to be capable of amplifying the DNA double-stranded strand having a base length of 80 to 150 bases, including the point mutation.
[11] A kit for detecting a target sequence by melting, comprising:
A pair of primer sets for amplifying a double-stranded DNA containing the target sequence;
a probe that specifically hybridizes to a portion including the target sequence in one DNA single strand of the DNA double strand;
A kit comprising:
[12] The kit according to [11], wherein the pair of primer sets is a set for a non-control nucleic acid amplification reaction that preferentially amplifies one of the DNA single strands of the DNA double strands.
本明細書に開示される標的配列の検出方法（以下、単に、本方法ともいう。）及びそのためのキットの各種実施形態について、以下に説明する。 Various embodiments of the method for detecting a target sequence disclosed in this specification (hereinafter also simply referred to as the present method) and a kit therefor are described below.
なお、本方法が検出する標的配列とは、特に限定するものではなく、例えば、生物（ウイルスを含む。以下、同じ。）における特定の遺伝子に関連する配列、その生物個体を特徴付ける、遺伝子に関連する変異及びその他の配列、その生物における疾患や病原体や変異株を特徴付ける配列、当該配列上の変異、その他の特徴が挙げられる。より具体的には、一塩基多型（ＳＮＰ）などの一塩基変異（置換変異等）、塩基の欠失、塩基の挿入変異等が挙げられる。標的配列とは、対比されるべき対照の塩基配列と相違する塩基配列のみを意味する。したがって、例えば、標的配列が一つの一塩基置換のみからなるとき、標的配列は一塩基でありうるし、また例えば、標的配列が、隣接して二つ以上の一塩基置換を含むとき、標的配列は一塩基置換で両端が規定される一続きの塩基配列（２ｍｅｒ～３０ｍｅｒ程度）でありうる。標的配列としては、また、生物に起源しない人工的な配列が挙げられる。 The target sequence detected by this method is not particularly limited, and examples thereof include sequences related to a specific gene in an organism (including viruses; the same applies below), gene-related mutations and other sequences that characterize the organism, sequences that characterize a disease, pathogen, or mutant strain in the organism, mutations in the sequence, and other characteristics. More specifically, examples include single-base mutations (substitution mutations, etc.) such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), base deletions, and base insertion mutations. The target sequence refers to only a base sequence that differs from the base sequence of the control to be compared. Therefore, for example, when the target sequence consists of only one single base substitution, the target sequence can be a single base, and when the target sequence contains two or more adjacent single base substitutions, the target sequence can be a continuous base sequence (approximately 2mer to 30mer) whose both ends are defined by single base substitutions. The target sequence can also be an artificial sequence that does not originate from an organism.
また、本明細書において、標的配列を含む核酸を標的核酸という。ここで、核酸とは、生物が保持するＤＮＡ及びＲＮＡである天然核酸のほか、人工的に合成された核酸であってもよい。核酸は、少なくともその一部に本明細書に開示されるプライマーと水素結合を形成する塩基を備えている。ＤＮＡとしては、特に限定されないで、生物が保持しうる天然由来のＤＮＡのほか、生物に対して人工的に導入されたＤＮＡであってもよい。例えば、ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡのほかプラスミドなどのベクター上におけるＤＮＡが含まれる。また、ＲＮＡとしては、特に限定されないで、生物が保持しうる天然由来のＲＮＡのほか、外部から生物に導入されたＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどのｎｃＲＮＡ、リボザイム及び二本鎖ＲＮＡ等が含まれる。 In this specification, a nucleic acid containing a target sequence is referred to as a target nucleic acid. Here, the nucleic acid may be natural nucleic acid, such as DNA and RNA, that an organism possesses, or may be artificially synthesized nucleic acid. The nucleic acid has at least a portion thereof a base that forms a hydrogen bond with the primer disclosed in this specification. The DNA is not particularly limited, and may be naturally occurring DNA that an organism can possess, or may be DNA that has been artificially introduced into an organism. For example, the DNA includes genomic DNA as well as DNA on a vector such as a plasmid. The RNA is not particularly limited, and may be naturally occurring RNA that an organism can possess, or may be RNA that has been introduced into an organism from the outside. The RNA includes, for example, mRNA, tRNA, rRNA, ncRNA such as siRNA and miRNA, ribozyme, and double-stranded RNA.
本明細書において、標的核酸を含む可能性のある試料が、本方法に供される被験試料である。被験試料とは、特に限定されない。被験試料は、検出対象とする標的配列が含有される可能性のある試料であればよい。例えば、天然ないし生体から採取したままの試料のほか、こうした試料を粗精製ないし精製した試料、こうした試料につき、試料中のＤＮＡないしＲＮＡを抽出した試料及びこうした試料中のＤＮＡ又はＲＮＡを、公知の核酸増幅方法等によりその含有量を増大させたり逆転写させたりした試料であってもよい。 In this specification, a sample that may contain a target nucleic acid is a test sample to be subjected to this method. There is no particular limitation on the test sample. The test sample may be any sample that may contain the target sequence to be detected. For example, in addition to a sample as collected from nature or a living organism, the test sample may be a crudely purified or purified sample of such a sample, a sample in which DNA or RNA has been extracted from such a sample, or a sample in which the DNA or RNA in such a sample has been increased in content or reverse transcribed by a known nucleic acid amplification method or the like.
また、被験試料は、例えば、ヒト、家畜などの各種動物から人為的に採取され又は自然に分離された、血液、尿、唾液などの各種の生体由来の液性試料、細胞試料及び組織試料並びにこれらについて核酸の抽出・増幅・逆転写等された加工試料が含まれる。また、被験試料には、植物又はウイルスを含むその他の生物から人為的に採取された又は自然に分離された種々の部分又は形態の各種試料が含まれる。また、被験試料には、標的核酸を含む可能性のある食品や飲料、加工品、物品などが含まれる。 Test samples also include various liquid samples derived from living organisms, such as blood, urine, and saliva, which are artificially collected or naturally isolated from various animals, such as humans and livestock, as well as cell and tissue samples, and processed samples in which nucleic acids have been extracted, amplified, reverse transcribed, etc. Test samples also include various parts or forms of samples that are artificially collected or naturally isolated from plants or other organisms, including viruses. Test samples also include foods, beverages, processed products, goods, etc. that may contain the target nucleic acid.
また、被験試料中の核酸の起源としては、例えば、感染症などの疾患の病原体や、遺伝子変異の判定が必要な感染症などの疾患の病原体が挙げられる。かかる病原体としては、例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、アデノウィルス、ヒトパルボウイルス、B型およびC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど等が挙げられる。また、ＭＡＣ、マイコプラズマ、腸管出血性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ属菌、カンピロバクター ジェジュニ及びコリ、及び腸炎ビブリオ菌等が挙げられる。 In addition, sources of nucleic acids in test samples include, for example, pathogens of diseases such as infectious diseases, and pathogens of diseases such as infectious diseases for which genetic mutations need to be determined. Examples of such pathogens include influenza virus, coronavirus, adenovirus, human parvovirus, hepatitis B and C viruses, human immunodeficiency virus, and the like. Other examples include MAC, mycoplasma, enterohemorrhagic Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Campylobacter jejuni and coli, and Vibrio parahaemolyticus, and the like.
本方法及びキットは、ＤＮＡやＲＮＡなどの生物の備えるゲノム上の変異や多型などの特徴を検出し、同定できることから、ヒトを含む動物の体質、薬剤の有効性、疾患への罹患しやすさなどの検査方法、ヒトを含む動物の疾患や症状の診断の補助方法、微生物やウイルス等の病原生物の同定方法、微生物やウイルス等の薬剤耐性など薬剤感受性の検査方法、遺伝子の同定方法等に用いることができる。 Since this method and kit can detect and identify characteristics such as mutations and polymorphisms in the genome of living organisms, such as DNA and RNA, they can be used in testing methods for the constitution of animals, including humans, the effectiveness of drugs, susceptibility to disease, etc., as well as in assisting in the diagnosis of diseases and symptoms in animals, including humans, as well as in identifying pathogenic organisms such as microorganisms and viruses, as well as testing drug susceptibility, such as drug resistance, in microorganisms and viruses, and as a method for identifying genes.
（標的配列の検出方法）
本方法は、標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、ＤＮＡ一本鎖の標的配列を含む一部分と特異的にハイブリダイズするプローブと、を準備する工程と、前記ＤＮＡ一本鎖と前記プローブとがハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程と、を備えている。
(Method of detecting a target sequence)
This method includes a step of preparing a single strand of DNA containing a target sequence and a probe that specifically hybridizes to a portion of the single strand of DNA containing the target sequence, and a melting step of obtaining the melting temperature of a partial double strand of DNA in which the single strand of DNA and the probe are hybridized.
本方法の概要を、本方法の一例を例示する図１を参照して説明する。本方法の準備工程は、例えば、ＤＮＡ一本鎖を含むＤＮＡ二本鎖の核酸増幅工程として実施することができる。図１（ａ）に示すように、ＤＮＡ断片に対して一対のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により標的配列を含むＤＮＡ二本鎖１０を増幅するとき、プライマーセットのプライマー比を調整することにより、ＤＮＡ一本鎖１０ｂを鋳型として一方のＤＮＡ一本鎖１０ａのみを優勢的に増幅することができる。この核酸増幅反応において、このＤＮＡ一本鎖１０ａの標的配列に特異的にハイブリダイズするプローブ２０を添加する。こうすることで、図１（ｂ）に示すように、一対のプライマーセットにより得られるＤＮＡ二本鎖１０から優勢的にＤＮＡ一本鎖１０ａが増幅され、このＤＮＡ一本鎖１０ａの標的配列に特異的にプローブ２０が結合した真正部分ＤＮＡ二本鎖３０を得ることができる。 The outline of this method will be described with reference to FIG. 1, which illustrates an example of this method. The preparation step of this method can be carried out, for example, as a nucleic acid amplification step of a DNA double strand including a DNA single strand. As shown in FIG. 1(a), when a DNA double strand 10 including a target sequence is amplified by a nucleic acid amplification reaction using a pair of primer sets for a DNA fragment, only one of the DNA single strands 10a can be predominantly amplified using the DNA single strand 10b as a template by adjusting the primer ratio of the primer set. In this nucleic acid amplification reaction, a probe 20 that specifically hybridizes to the target sequence of this DNA single strand 10a is added. In this way, as shown in FIG. 1(b), the DNA single strand 10a is predominantly amplified from the DNA double strand 10 obtained by the pair of primer sets, and a genuine partial DNA double strand 30 in which the probe 20 specifically binds to the target sequence of this DNA single strand 10a can be obtained.
一方、図１（ｃ）に示すように、標的配列を含まないＤＮＡ断片を鋳型にしたときであっても、プライマーセットによって、標的配列を含まない不真正ＤＮＡ一本鎖３２が増幅されうる。その結果、不真正ＤＮＡ二本鎖３４や、このようなＤＮＡ一本鎖３２に対してプローブ２０がミスハイブリダイズして、不真正部分ＤＮＡ二本鎖３６が形成される場合もある。 On the other hand, as shown in FIG. 1(c), even when a DNA fragment not containing the target sequence is used as a template, a false DNA single strand 32 not containing the target sequence can be amplified by the primer set. As a result, a false DNA double strand 34 or a false partial DNA double strand 36 may be formed by mishybridizing the probe 20 to such a DNA single strand 32.
しかしながら、図２及び図３に示すように、この適切なハイブリダイズに基づく真正部分ＤＮＡ二本鎖３０の融解温度又はその融解曲線は、真正ＤＮＡ二本鎖１０とも、また、標的配列でない他の配列とプローブとのミスハイブリダイズに基づく不真正ＤＮＡ二本鎖３４及び不真正部分ＤＮＡ二本鎖３６のそれらとは明確に区別される。 However, as shown in Figures 2 and 3, the melting temperature or melting curve of the authentic partial DNA duplex 30 based on this proper hybridization is clearly distinguished from that of the authentic DNA duplex 10 and from that of the illegitimate DNA duplex 34 and the illegitimate partial DNA duplex 36 based on mishybridization of the probe with other sequences that are not the target sequence.
すなわち、図２に示すように、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０の融解曲線及び融解温度は、その二本鎖構造の相違から、真正ＤＮＡ二本鎖１０の融解温度とは大きく相違する。 That is, as shown in FIG. 2, the melting curve and melting temperature of the authentic partial DNA double-strand 30 are significantly different from the melting temperature of the authentic DNA double-strand 10 due to the difference in the double-strand structure.
また、図３に示すように、プライマーセットによって増幅されるＤＮＡ二本鎖１０やその他の不真正ＤＮＡ二本鎖３４は熱的特性が近似しているため、これらを相互に区別できない場合があるが、これらと真正部分ＤＮＡ二本鎖３０の熱的特性は大きく相違する。したがって、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０は熱的特性により不真正ＤＮＡ二本鎖３４のそれとは明確に区別される。さらに、図４に示すように、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０は、プローブ２０がミスハイブリダイズしている標的配列の相違が大きく影響する不真正部分ＤＮＡ二本鎖３６よりも熱的安定性が高い。この結果、概して、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０の融解温度は、不真正部分ＤＮＡ二本鎖３６のそれを大きく上回ることが多くなる。このため、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０は、不真正部分ＤＮＡ二本鎖３６とも明確に区別される。 As shown in FIG. 3, the DNA duplex 10 amplified by the primer set and other illegitimate DNA duplexes 34 have similar thermal properties, so they may not be distinguishable from each other, but the thermal properties of these and the authentic partial DNA duplex 30 are significantly different. Therefore, the authentic partial DNA duplex 30 is clearly distinguished from the illegitimate DNA duplex 34 by its thermal properties. Furthermore, as shown in FIG. 4, the authentic partial DNA duplex 30 has higher thermal stability than the illegitimate partial DNA duplex 36, which is greatly influenced by the difference in the target sequence to which the probe 20 is mishybridized. As a result, the melting temperature of the authentic partial DNA duplex 30 is often much higher than that of the illegitimate partial DNA duplex 36. Therefore, the authentic partial DNA duplex 30 is also clearly distinguished from the illegitimate partial DNA duplex 36.
以上のことから、真正部分ＤＮＡ二本鎖３０は、こうした他のＤＮＡ二本鎖１０等や不真正ＤＮＡ二本鎖３４とは確実に区別されることになる。 From the above, the genuine partial DNA duplex 30 can be reliably distinguished from other DNA duplexes 10 and the illegitimate DNA duplex 34.
＜ＤＮＡ一本鎖とプローブとを準備する準備工程＞
（ＤＮＡ一本鎖）
ＤＮＡ一本鎖は、特に限定するものではないが、核酸増幅反応によりＤＮＡ二本鎖として取得することができる。また、ＤＮＡ二本鎖のうち一方のＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する非対称核酸増幅反応によって過剰のＤＮＡ一本鎖としても取得することができる。非対称増幅反応の増幅産物は、ＤＮＡ二本鎖とともにＤＮＡ一本鎖を過剰に含むことができる。なお、ＤＮＡ二本鎖として取得する場合には、ＤＮＡに対して制限酵素で切断することにより種々の末端態様を有するＤＮＡ二本鎖を得ることもできる。
<Preparation step of preparing single stranded DNA and probe>
(single stranded DNA)
Although not particularly limited, the single-stranded DNA can be obtained as a double-stranded DNA by a nucleic acid amplification reaction. It can also be obtained as an excess of single-stranded DNA by an asymmetric nucleic acid amplification reaction that preferentially amplifies one of the single-stranded DNA strands of the double-stranded DNA. The amplification product of the asymmetric amplification reaction can contain an excess of single-stranded DNA along with the double-stranded DNA. When the double-stranded DNA is obtained, the double-stranded DNA can be cut with a restriction enzyme to obtain a double-stranded DNA having various terminal configurations.
ＤＮＡ一本鎖の長さは、特に限定するものではないが、例えば、ＤＮＡ一本鎖と後述するプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度が標的配列特異的になるような長さに設定されうる。特に言及しない限り、ＤＮＡ一本鎖の長さというとき、ＤＮＡ二本鎖として取得する場合の長さも包含している。ＤＮＡ一本鎖の長さは、例えば、８０塩基以上２３０塩基以下などとすることができる。ＤＮＡ一本鎖の長さは、また例えば、９０塩基以上であり、また例えば、１００塩基以上である。また、ＤＮＡ一本鎖の長さは、２２０塩基以下であり、また例えば、２００塩基以下であり、また例えば、１８０塩基以下であり、また例えば、１６０塩基以下であり、また例えば、１５０塩基以下であり、また例えば、１４０塩基以下であり、また例えば、１３０塩基以下であり、また例えば、１２０塩基以下である。 The length of the single strand of DNA is not particularly limited, but may be set to a length such that the melting temperature of a partial double strand of DNA formed by the single strand of DNA and a probe described later is specific to the target sequence. Unless otherwise specified, the length of the single strand of DNA includes the length obtained as a double strand of DNA. The length of the single strand of DNA may be, for example, 80 bases or more and 230 bases or less. The length of the single strand of DNA may also be, for example, 90 bases or more, or for example, 100 bases or more. The length of the single strand of DNA may also be, for example, 220 bases or less, or for example, 200 bases or less, or for example, 180 bases or less, or for example, 160 bases or less, or for example, 150 bases or less, or for example, 140 bases or less, or for example, 130 bases or less, or for example, 120 bases or less.
ＤＮＡ一本鎖における標的配列の位置は特に限定するものではないが、例えば、ＤＮＡ二本鎖の長さを１０分割した場合の３‘末端側から４０％以上６０％以下の範囲に含まれる。 The position of the target sequence in the single strand of DNA is not particularly limited, but for example, is within a range of 40% to 60% from the 3' end when the length of the double strand of DNA is divided by 10.
ＤＮＡ一本鎖は、標的配列を含む標的核酸であるＤＮＡ断片に対して、プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより、ＤＮＡ二本鎖の一方として取得することができる。核酸増幅反応には、公知のＰＣＲ装置やキットを用いることができる。 A single strand of DNA can be obtained as one of two strands of DNA by performing a nucleic acid amplification reaction using a primer set on a DNA fragment, which is a target nucleic acid containing a target sequence. A known PCR device or kit can be used for the nucleic acid amplification reaction.
プライマーセットとしては、標的配列を含むＤＮＡ二本鎖を増幅可能に形成される。プライマーセットの構成する各プライマーは、例えば、自身内部には標的配列を含まずに、プライマーから伸長された部分に標的配列を含めるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーセットの各プライマーの長さは、特に限定するものではないが、例えば、１０塩基以上３０塩基以下であり、また例えば、１４塩基以上２８塩基以下であり、また例えば、１６塩基以上２８塩基以下であり、また例えば、１８塩基以上２４塩基以下である。 The primer set is formed so as to be capable of amplifying a double-stranded DNA containing a target sequence. Each primer constituting the primer set is, for example, an oligodeoxyribonucleotide designed to contain the target sequence in the portion extended from the primer without containing the target sequence within itself. The length of each primer in the primer set is not particularly limited, but is, for example, 10 to 30 bases, for example, 14 to 28 bases, for example, 16 to 28 bases, and for example, 18 to 24 bases.
なお、ＤＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）は、特に限定するものではないが、例えば、８０℃以上、また例えば、８５℃以上、また例えば、９０℃以上、また例えば９５℃以上となるように設計することができる。 The melting temperature (Tm) of the DNA double strand is not particularly limited, but can be designed to be, for example, 80°C or higher, for example, 85°C or higher, for example, 90°C or higher, or for example, 95°C or higher.
意図するＤＮＡ一本鎖を優勢的に取得するには、非対称核酸増幅反応を用いる。この場合、プライマーセットのうち、一方のＤＮＡ一本鎖を伸長するプライマーを他方のＤＮＡ一本鎖を伸長する他方のプライマーに対して、例えば、４倍以上、また例えば、６倍以上、また例えば、８倍以上、また例えば、１０倍以上、また例えば、２０倍以上、また例えば、４０倍以上、また例えば、６０倍以上、また例えば、８０倍以上、また例えば、１００倍以上など、適宜増大させて用いるようにすることができる。 To obtain the intended single stranded DNA predominantly, an asymmetric nucleic acid amplification reaction is used. In this case, the primer that extends one DNA single strand of the primer set can be used at an appropriate increased concentration, for example, 4 times or more, for example, 6 times or more, for example, 8 times or more, for example, 10 times or more, for example, 20 times or more, for example, 40 times or more, for example, 60 times or more, for example, 80 times or more, for example, 100 times or more, relative to the other primer that extends the other DNA single strand.
なお、ＤＮＡ一本鎖を一対のプライマーセットにより核酸増幅反応により取得するものとしたが、ＤＮＡ一本鎖として６０塩基以上１５０塩基以下などの所定の塩基長を決定した上で、このＤＮＡ一本鎖を取得するのに先だって、例えば、１３０塩基以上３００塩基以下、また例えば、１４０塩基以上３００塩基以下程度の標的核酸であるＤＮＡ二本鎖を取得する別のプライマーセットによる予備的核酸増幅反応を行うようにすることもできる。 Although a single strand of DNA is obtained by a nucleic acid amplification reaction using a pair of primer sets, it is also possible to determine a predetermined base length, such as 60 to 150 bases, for the single strand of DNA, and then, prior to obtaining this single strand of DNA, perform a preliminary nucleic acid amplification reaction using another primer set to obtain a double strand of DNA, which is the target nucleic acid, for example, 130 to 300 bases, or for example, 140 to 300 bases.
また、標的配列がＲＮＡである場合には、逆転写（REVERESE TRANSCRIPTION、ＲＴ）ＰＣＲによりＤＮＡ二本鎖として鋳型核酸を取得することが好適である。なお、ＲＴ－ＰＣＲは、逆転写反応と通常のＰＣＲと２段階で行うＴＷＯ ＳＴＥＰ ＲＴ－ＰＣＲでもよいし、これらを一段階で行うＯＮＥ ＳＴＥＰ ＲＴ－ＰＣＲであってもよい。核酸増幅反応により試料中の核酸を増幅する場合には、生体試料中の核酸は、ＲＮＡ一本鎖であっても最終的に二本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡ一本鎖となる。 In addition, when the target sequence is RNA, it is preferable to obtain the template nucleic acid as a double-stranded DNA by reverse transcription (RT) PCR. Note that RT-PCR may be a two-step RT-PCR that is performed in two steps, a reverse transcription reaction and a normal PCR, or a one-step RT-PCR that performs both in a single step. When amplifying nucleic acid in a sample by a nucleic acid amplification reaction, the nucleic acid in a biological sample will ultimately become a double-stranded DNA or a single-stranded DNA, even if it is a single-stranded RNA.
（プローブ）
準備工程においては、ＤＮＡ一本鎖中の標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブを準備する。プローブは、ＤＮＡ一本鎖とプローブとが特異的にハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖が標的配列に特異的な融解温度となるように設計されている。なお、種々のＤＮＡ二本鎖の融解温度は、実験的に又は理論的に取得可能である。
(probe)
In the preparation step, a probe is prepared that specifically hybridizes to a portion of a single strand of DNA that contains a target sequence. The probe is designed so that a partial double strand of DNA formed by specifically hybridizing the single strand of DNA and the probe has a melting temperature specific to the target sequence. The melting temperatures of various double strands of DNA can be obtained experimentally or theoretically.
プローブは、ＤＮＡ一本鎖の標的配列に相補的な配列を有して、さらに、ＤＮＡ一本鎖の標的配列を含む一部分、すなわち、所定範囲の連続した配列に相補的な配列を有したオリゴデオキシリボヌクレオチドである。こうした、標的配列特異的プローブを準備することで、融解工程において、ＤＮＡ一本鎖とプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得できる。オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチドで形成されていてもよいが、必要に応じて人工的な要素（塩基、糖鎖、骨格等）を備えていてもよい。 The probe is an oligodeoxyribonucleotide that has a sequence complementary to the target sequence of a single strand of DNA and further has a sequence complementary to a portion of the single strand of DNA that includes the target sequence, i.e., a contiguous sequence in a predetermined range. By preparing such a target sequence-specific probe, the melting temperature of the partial DNA double strand consisting of the single strand of DNA and the probe can be obtained in the melting process. The oligonucleotide may be formed of natural nucleotides, but may also have artificial elements (bases, sugar chains, backbones, etc.) as necessary.
プローブは、例えば、５’末端に標識を備えていてもよいが、標識を備えていなくてもよい。標識を備えないことでコストを低減できるメリットがある。プローブの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって伸長されないでプローブとして機能するように、３’－水酸基が修飾されている。こうした３’末端の修飾としては、リン鎖基を導入することのほか、水酸基の水素原子に替えて、炭素数が１～５程度の低級アルキル基やレン基、低級アセチル基等の官能基ほか、クエンチャーなどを導入してもよい。 The probe may, for example, have a label at the 5' end, but may not have a label. Not having a label has the advantage of reducing costs. The 3' end of the probe is modified at the 3'-hydroxyl group so that it functions as a probe without being extended by an extension reaction with DNA polymerase. Such modifications to the 3' end may include the introduction of a phosphorus chain group, or a functional group such as a lower alkyl group, ylene group, or lower acetyl group having about 1 to 5 carbon atoms, or a quencher, instead of the hydrogen atom of the hydroxyl group.
プローブは、核酸増幅反応において既に添加されている場合、プライマーの伸長反応に伴い、このプローブと同方向のプライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ作用により分解される場合がある。例えば、非対称核酸増幅反応によりＤＮＡ一本鎖を増幅する場合には、プローブ量を、意図するＤＮＡ一本鎖を増幅する一方のプライマーと同量程度、又は、プローブと他方のプライマーとの総量が、一方のプライマーと同量程度とすることで、核酸増幅反応後においても、有効量のプローブを維持することができる。 If the probe has already been added in the nucleic acid amplification reaction, it may be degraded by the 5'→3' exonuclease action of DNA polymerase that extends the primer in the same direction as the probe during the primer extension reaction. For example, when amplifying a single strand of DNA by an asymmetric nucleic acid amplification reaction, an effective amount of probe can be maintained even after the nucleic acid amplification reaction by making the amount of probe approximately the same as that of one of the primers that amplifies the intended single strand of DNA, or by making the total amount of the probe and the other primer approximately the same as that of one of the primers.
プローブは、例えば、部分ＤＮＡ二本鎖につき標的配列特異的な融解温度が得られるようにする。特に限定するものではないが、ＤＮＡ一本鎖と相補的なＤＮＡ一本鎖とのＤＮＡ二本鎖の融解温度と比べて、例えば、３℃以上、また例えば、４℃以上、また例えば、５℃以上、また例えば、６℃以上程度、低くなるように設定することができる。また、プローブは、特に限定するものではないが、部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度が、例えば、８５℃以下、また例えば、８４℃以下、また例えば、８２℃以下、また例えば、８０℃以下また例えば、７８℃以下、また例えば、７６℃以下程度となるように設定することができる。 The probe is designed to obtain a melting temperature specific to the target sequence for the partial DNA double strand. Although not particularly limited, the melting temperature can be set to be, for example, 3°C or more, for example, 4°C or more, for example, 5°C or more, or for example, 6°C or more lower than the melting temperature of the DNA double strand of the DNA single strand and the complementary DNA single strand. Furthermore, although not particularly limited, the probe can be designed to obtain a melting temperature of the partial DNA double strand of, for example, 85°C or less, for example, 84°C or less, for example, 82°C or less, for example, 80°C or less, for example, 78°C or less, or for example, 76°C or less.
プローブの長さとしては、例えば、２０塩基以上７０塩基以下であり、また例えば、３０塩基以上５０塩基以下である。また、プローブの長さは、例えば、部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度が標的配列特異的となり、かつ、ＤＮＡ二本鎖の融解温度を十分に異なるようにする観点から、ＤＮＡ一本鎖の２０％以上５０％以下、また例えば、２０％以上４０％以下などとすることができる。 The length of the probe is, for example, 20 to 70 bases, or, for example, 30 to 50 bases. The length of the probe can be, for example, 20% to 50% of the length of a single-stranded DNA, or, for example, 20% to 40%, from the viewpoint of making the melting temperature of the partial double-stranded DNA specific to the target sequence and making the melting temperatures of the double-stranded DNA sufficiently different.
ＤＮＡ一本鎖とプローブとの混合物を得るには、ＤＮＡ二本鎖を含む核酸増幅産物また例えばＤＮＡ二本鎖とＤＮＡ一本鎖とを含む核酸増幅産物に対して、プローブを添加して混合してもよいし、こうした核酸増幅の際に、プローブの存在下で核酸増幅反応を行ってもよい。意図するＤＮＡ一本鎖を効率的に得られる点において、プローブとプライマーセットの存在下で核酸増幅反応を行うことが好適な場合がある。後述する結合色素も、プライマーセットとプローブとともに、核酸増幅反応に供することが、意図するＤＮＡ一本鎖を効率的に得る点において好ましい場合がある。 To obtain a mixture of single-stranded DNA and a probe, a probe may be added to a nucleic acid amplification product containing double-stranded DNA or a nucleic acid amplification product containing, for example, double-stranded DNA and single-stranded DNA, and mixed, or a nucleic acid amplification reaction may be performed in the presence of a probe during such nucleic acid amplification. In terms of efficiently obtaining the intended single-stranded DNA, it may be preferable to perform a nucleic acid amplification reaction in the presence of a probe and a primer set. In terms of efficiently obtaining the intended single-stranded DNA, it may be preferable to subject the binding dye described below to the nucleic acid amplification reaction together with the primer set and probe.
核酸増幅反応により一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして、あるいは、ＤＮＡ二本鎖に加えて過剰の一本鎖ＤＮＡとして取得することができるが、プローブを併存させた場合には、ＤＮＡ一本鎖と、プローブとは、部分ＤＮＡ二本鎖を形成した形態を採ることもできる。 By using a nucleic acid amplification reaction, single-stranded DNA can be obtained as double-stranded DNA, or as double-stranded DNA plus excess single-stranded DNA. When a probe is used in combination, the single-stranded DNA and the probe can form a partial double-stranded DNA.
本方法では、こうして得られるＤＮＡ一本鎖及びプローブを融解工程に供するが、融解工程においては融解温度ないし融解曲線を取得するために必要な結合色素が必要となることがある。例えば、融解曲線を結合色素に基づく蛍光等が減少程度を利用して取得する場合などに必要となる。準備工程における核酸増幅反応の際に、結合色素をプライマーとともに存在させるようにしてもよい。結合色素としては、例えば、ＤＮＡ二本鎖の塩基対間に挿入される化合物であって、励起光の照射により蛍光を発する化合物が挙げられる。このように用いられる結合色素は、例えば、融解解析ほか、リアルタイムＰＣＲにおいても周知である。特に限定するものではないが、例えば、LightCycler480 ResoLight Dye(登録商標)、SYBRGreen（登録商標）、EvaGreen（登録商標）及びSYTO9（登録商標）などが挙げられる。 In this method, the thus obtained single stranded DNA and probe are subjected to a melting step, and in the melting step, a binding dye may be required to obtain the melting temperature or melting curve. For example, this is necessary when the melting curve is obtained by utilizing the degree of decrease in fluorescence based on the binding dye. The binding dye may be present together with the primer during the nucleic acid amplification reaction in the preparation step. An example of the binding dye is a compound that is inserted between the base pairs of the double stranded DNA and emits fluorescence when irradiated with excitation light. The binding dye used in this way is well known, for example, in melting analysis as well as in real-time PCR. Examples of the binding dye include, but are not limited to, LightCycler480 ResoLight Dye (registered trademark), SYBRGreen (registered trademark), EvaGreen (registered trademark), and SYTO9 (registered trademark).
準備工程において実施される核酸増幅反応の操作及び条件等は、当業者に周知であるほか、当業者であれば、商業的に入手可能なＰＣＲキットや装置のプロトコールに従って適切に実施することができる。 The operations and conditions of the nucleic acid amplification reaction carried out in the preparation process are well known to those skilled in the art, and can be appropriately carried out by those skilled in the art according to the protocols of commercially available PCR kits and devices.
＜ＤＮＡ一本鎖及びプローブが特異的にハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程＞
本工程では、先の工程で取得したＤＮＡ一本鎖及びプローブがハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する。既述のとおり、ＤＮＡ一本鎖の標的配列に特異的にプローブがハイブリダイズした真性の部分ＤＮＡ二本鎖は、標的配列特異的な融解温度を有している。非特異的な部分ＤＮＡ二本鎖にあっては、ミスマッチ部分の影響が大きく影響するため、より融解温度が低下する。さらに、核酸増幅反応によっては、ＤＮＡ一本鎖と相補的なもう一方のＤＮＡ一本鎖とがハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖が形成されるが、このＤＮＡ二本鎖は、熱的により安定しているため、高い融解温度を呈する。以上のことから、真性部分ＤＮＡ二本鎖は、標的配列特異的な融解温度を呈する。
<Melting step for obtaining melting temperatures of a DNA single strand and a partial DNA double strand in which the probe is specifically hybridized>
In this step, the melting temperatures of the DNA single strand obtained in the previous step and the partial DNA double strand hybridized with the probe are obtained. As described above, the true partial DNA double strand in which the probe is hybridized specifically to the target sequence of the DNA single strand has a melting temperature specific to the target sequence. In the case of a non-specific partial DNA double strand, the influence of the mismatch portion is large, so the melting temperature is further reduced. Furthermore, in a nucleic acid amplification reaction, a DNA double strand is formed in which the DNA single strand is hybridized with another complementary DNA single strand, and this DNA double strand is more thermally stable and therefore has a high melting temperature. From the above, the true partial DNA double strand exhibits a melting temperature specific to the target sequence.
融解温度を取得するには、部分ＤＮＡ二本鎖の紫外線吸収に基づいて行ってもよいし、ＤＮＡ結合色素を用いた融解曲線解析によって行ってもよい。 The melting temperature can be obtained based on the UV absorption of a partial DNA duplex or by melting curve analysis using a DNA-binding dye.
ここで、融解曲線又は融解曲線解析とは、ＤＮＡ二本鎖を融解させるのに必要な温度範囲の温度勾配を付与して、ＤＮＡ二本鎖の融解に伴うシグナル強度の変化から、ＤＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を測定したり、融解曲線の形状やピーク（シグナル強度の変曲点）などの変化からＳＮＰ、ヘテロ接合体とホモ接合体、メチル化パターンなどを解析できる技術である。かかる技術は、本明細書に開示される技術分野に属する当業者には周知である。 Here, melting curve or melting curve analysis refers to a technique that applies a temperature gradient in the temperature range required to melt a DNA double strand, and measures the melting temperature (Tm) of the DNA double strand from the change in signal intensity that accompanies melting of the DNA double strand, or analyzes SNPs, heterozygotes and homozygotes, methylation patterns, etc. from changes in the shape of the melting curve and peaks (inflection points of signal intensity). Such techniques are well known to those skilled in the art in the technical fields disclosed in this specification.
融解曲線解析は、任意の（温度）分解能で行うことができる。例えば、約０．１℃／秒～約１℃／秒の範囲内の速度で連続的に増加させることができる。また例えば、約０．０１℃／秒～約０．１℃／秒の範囲内の速度で、また例えば、約１℃／秒～約３℃／秒の範囲内の速度であってもよい。融解曲線解析は、例えば、７５℃以上９５℃以下、７０℃以上９０℃以下、また例えば７２℃以上８２℃以下、また例えば７０℃以上８０℃以下などの範囲で、概ね、例えば、５℃以上２０℃以下、また例えば、１０℃以上１５℃以下の範囲で温度を増加させることで取得することができる。融解分析は、チャンバー内で行うこともできるし、連続なフローの一部として、例えば、マイクロデバイス等におけるチャネル内において行うこともできる。 Melting curve analysis can be performed at any (temperature) resolution. For example, the temperature can be continuously increased at a rate in the range of about 0.1°C/s to about 1°C/s. Also, for example, at a rate in the range of about 0.01°C/s to about 0.1°C/s, for example, at a rate in the range of about 1°C/s to about 3°C/s. Melting curve analysis can be obtained by increasing the temperature in the range of about, for example, 5°C to 20°C, or for example, 10°C to 15°C, such as, for example, 75°C to 95°C, 70°C to 90°C, or for example, 72°C to 82°C, or for example, 70°C to 80°C. Melting analysis can be performed in a chamber or as part of a continuous flow, for example, in a channel in a microdevice.
融解曲線を取得するためのデータは、例えば、核酸の温度を選択された期間上昇させた際に検出される特性を測定することによって生成される。一般的なＤＮＡ二本鎖インターカレーターである結合色素は、ＤＮＡ二本鎖に挿入時において、励起光の照射により蛍光を呈示し、ＤＮＡ二本鎖の変性に伴ってシグナル強度が低下する。したがって、本方法においては、温度変化を伴う一定時間における、ＤＮＡ二本鎖の変性（融解）の指標となるシグナルの低下を測定する。融解解析によって取得されたデータから、当該分野において周知である技術によって、融解曲線を取得することができる。例えば、シグナル強度を取得する際の時間分解能としては、１秒間に例えば、１０～３０回、また例えば、１００～３００回、１０００～３０００回程度とすることができる。一般にこうした程度の時間分解能でのシグナル強度の検出による融解曲線は、高解像度融解曲線と称されている。高解像度融解曲線を得るためには、例えば、１塩基毎に結合する結合色素（例えば、SYTO9系などの蛍光色素）を好ましく用いることができる。なお、本明細書において、融解曲線は、昇温初期のシグナル強度で規格化した融解曲線の形態のほか、温度変化とシグナル強度の変化量とに基づく変化融解ピークの形態などのいわゆる温度変化曲線の形態として呈示されるものが、ディスプレイなどの媒体において呈示されるのに好適な形態であるが、本明細書における融解曲線はこれに限定するものではなく融解曲線解析で取得した温度変化とシグナル変化の時系列データの集合を意味する。 The data for obtaining the melting curve is generated, for example, by measuring the characteristics detected when the temperature of the nucleic acid is increased for a selected period of time. A binding dye, which is a general DNA double-strand intercalator, exhibits fluorescence when irradiated with excitation light when inserted into a DNA double strand, and the signal intensity decreases as the DNA double strand is denatured. Therefore, in this method, a decrease in signal that is an indicator of the denaturation (melting) of the DNA double strand over a certain period of time accompanied by a temperature change is measured. A melting curve can be obtained from the data obtained by melting analysis using techniques well known in the art. For example, the time resolution for obtaining the signal intensity can be, for example, 10 to 30 times, or, for example, 100 to 300 times, or 1000 to 3000 times per second. A melting curve obtained by detecting the signal intensity with such a time resolution is generally called a high-resolution melting curve. To obtain a high-resolution melting curve, for example, a binding dye that binds to every base (e.g., a fluorescent dye such as SYTO9) can be preferably used. In this specification, the melting curve is suitable for presentation on a medium such as a display in the form of a melting curve normalized by the signal intensity at the beginning of the temperature rise, or in the form of a so-called temperature change curve, such as a change melting peak based on the temperature change and the amount of change in signal intensity. However, the melting curve in this specification is not limited to this, and refers to a collection of time series data of temperature change and signal change obtained by melting curve analysis.
融解曲線解析は、当業者であれば、例えば、商業的に入手可能な当該解析が可能な装置を用いて、製造者等によるプロトコールに従い適宜実施することができる。典型的には、先の工程で取得した結合色素が結合した増幅産物を、増幅産物を取得したチューブやウエル内において、融解曲線解析における温度範囲よりも低い温度に予熱しておき、その後、予定された温度制御を行い、励起光を照射して、蛍光を測定する。 A person skilled in the art can appropriately perform melting curve analysis, for example, using a commercially available device capable of performing the analysis, following the manufacturer's protocol. Typically, the amplification product to which the binding dye is bound, obtained in the previous step, is preheated to a temperature lower than the temperature range in the melting curve analysis in the tube or well in which the amplification product was obtained, and then the temperature is controlled as planned, excitation light is irradiated, and fluorescence is measured.
なお、融解曲線を取得する場合、結合色素は、準備工程における核酸増幅反応時に反応液に添加されてもよいし、準備工程で取得したＤＮＡ一本鎖とプローブとに対して、融解工程に先立ってあるいはその融解のための予熱時に添加されてもよい。 When obtaining a melting curve, the binding dye may be added to the reaction solution during the nucleic acid amplification reaction in the preparation step, or may be added to the single-stranded DNA and probe obtained in the preparation step prior to the melting step or during preheating for melting.
被験試料から得られた部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度から、標的配列を検出できたかどうかを判定するには、標的核酸から取得されることが予定されている部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度（基準融解温度）を予め取得しておき、この融解温度と、被験試料から取得された融解温度とを対比する。あるいは、予め取得した、予定された部分ＤＮＡ二本鎖の融解曲線（基準融解曲線）と、被験試料から取得した融解曲線を対比する。 To determine whether a target sequence has been detected from the melting temperature of a partial DNA double-strand obtained from a test sample, the melting temperature (reference melting temperature) of the partial DNA double-strand expected to be obtained from the target nucleic acid is obtained in advance, and this melting temperature is compared with the melting temperature obtained from the test sample. Alternatively, the melting curve (reference melting curve) of the expected partial DNA double-strand obtained in advance is compared with the melting curve obtained from the test sample.
標的配列の検出、すなわち、融解温度又は融解曲線の一致及び不一致は、少なくとも一つの制御部を備えるコンピュータなどによって実施されてもよい。この場合、被験試料の融解温度又は融解曲線ほか、基準融解温度又は基準融解曲線は、いずれも、メモリ等に格納され、制御部による標的配列の検出プロセスで対比され、標的配列の存否が判定される。 The detection of the target sequence, i.e., the coincidence and non-coincidence of the melting temperature or melting curve, may be performed by a computer or the like equipped with at least one control unit. In this case, the melting temperature or melting curve of the test sample as well as the reference melting temperature or reference melting curve are all stored in a memory or the like and compared in the target sequence detection process by the control unit to determine the presence or absence of the target sequence.
なお、標的配列の検出のためには、部分ＤＮＡ一本鎖の融解温度のほか、準備工程で同時に得られるうるＤＮＡ二本鎖の融解温度ないし融解曲線を併せて用いることができる。特に、ＤＮＡ二本鎖の融解温度ないし融解曲線は、概ね部分ＤＮＡ二本鎖と同時に得られるため、迅速性を損なうことなく精度を向上させることができる。 To detect the target sequence, in addition to the melting temperature of the partial single-stranded DNA, the melting temperature or melting curve of the double-stranded DNA that can be obtained simultaneously in the preparation process can also be used. In particular, the melting temperature or melting curve of the double-stranded DNA can be obtained generally simultaneously with the partial double-stranded DNA, so that accuracy can be improved without compromising speed.
核酸増幅反応を伴う準備工程と、融解曲線解析を伴う融解工程とを、公知のリアルタイムＰＣＲ装置等を用いて行うことで効率的である。これらの工程を一挙に連続的に実施することで、迅速に標的配列を検出することができる。 It is efficient to use a known real-time PCR device or the like to perform the preparation process involving a nucleic acid amplification reaction and the melting process involving melting curve analysis. By performing these processes continuously all at once, the target sequence can be detected quickly.
以上の説明においては、概ね一種の標的配列を含む場合について説明したが、標的配列が、同一領域に複数種の標的配列を含みうる場合においても、同時的に実施できる。すなわち、共通するプライマーセットを準備するとともに、各標的配列に特異的なプローブをそれぞれ準備し、可能性ある標的配列に応じて準備したプローブセットの各プロ－ブの存在下で、それぞれ核酸増幅反応を、例えば同時的に行うようにし、これらの増幅産物から得られる部分ＤＮＡ二本鎖につき融解工程を実施する。こうすることで、各標的配列の存否を、一挙に検出することができる。 In the above explanation, we have described cases where one type of target sequence is generally included, but simultaneous implementation is also possible when the target sequence may include multiple types of target sequences in the same region. That is, a common primer set is prepared, and probes specific to each target sequence are prepared, and nucleic acid amplification reactions are carried out, for example simultaneously, in the presence of each probe of the probe set prepared according to the possible target sequence, and a melting step is carried out on the partial DNA double-strands obtained from these amplification products. In this way, the presence or absence of each target sequence can be detected all at once.
以上説明したように、本方法は、標的配列の検出を、的確にかつ迅速に行うことができる。本方法は、微生物及びウイルス感染症などにおけるサーベイランス、ヒトなどの動物の疾患に対して用いる薬剤が、ヒト等に有効であるかどうかのＳＮＰｓなどの検出、微生物又はウイルスの薬剤感受性など、複数の標的配列を検出するのに有効である。 As explained above, this method allows for accurate and rapid detection of target sequences. This method is effective for detecting multiple target sequences, such as for surveillance of microbial and viral infections, detection of SNPs that indicate whether drugs used to treat diseases in animals, such as humans, are effective in humans, and drug sensitivity of microorganisms or viruses.
また、本方法は、微生物として、Mycobacterium avium及びMycobacterium intracellulare（ＭＡＣ）であり、標的配列は、これらの微生物におけるクラリスロマイシン感受性に関する少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの標的配列である場合に有効である。例えば、従来、培養試験による薬剤感受性試験は２Ｗ程度要していたが、本方法によれば、核酸増幅反応と融解曲線解析を、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置で一挙に行うことで、２～３時間程度で検出可能である。なお、ＭＡＣにおいて、プローブは、クラリスロマイシン感受性に関する点突然変異を含んで３０塩基以上５０塩基以下であり、プライマーセットは、点突然変異を含んで８０塩基以上１５０塩基以下の塩基長のＤＮＡ一本鎖を増幅可能に構成されていることが好ましい場合がある。 This method is also effective when the microorganisms are Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare (MAC) and the target sequence is at least one target sequence containing at least one mutation related to clarithromycin susceptibility in these microorganisms. For example, a drug susceptibility test using a culture test conventionally required about 2 weeks, but according to this method, detection is possible in about 2 to 3 hours by simultaneously performing a nucleic acid amplification reaction and a melting curve analysis using, for example, a real-time PCR device. In addition, in MAC, it may be preferable that the probe is 30 to 50 bases long, including a point mutation related to clarithromycin susceptibility, and the primer set is configured to be capable of amplifying a single-stranded DNA having a base length of 80 to 150 bases long, including a point mutation.
（標的配列を融解によって検出するためのキット）
本明細書に開示される、標的配列を融解によって検出するためのキット（以下、単に、本キットともいう。）は、標的配列を含むＤＮＡ二本鎖を増幅するための一対のプライマーセットと、ＤＮＡ二本鎖の一方のＤＮＡ一本鎖中の標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、を備えることができる。本キットによれば、ＤＮＡ一本鎖とプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖を取得することができる。この部分ＤＮＡ二本鎖は、標的配列特異的な融解温度を有することから、標的配列を的確にかつ迅速に検出できる。
(Kit for detecting a target sequence by melting)
The kit for detecting a target sequence by melting (hereinafter, also simply referred to as the present kit) disclosed in this specification can include a pair of primer sets for amplifying a DNA double strand containing a target sequence, and a probe that specifically hybridizes to a portion containing the target sequence in one DNA single strand of the DNA double strand. With this kit, a partial DNA double strand consisting of the DNA single strand and the probe can be obtained. Since this partial DNA double strand has a melting temperature specific to the target sequence, the target sequence can be accurately and quickly detected.
本キットにおいては、プライマーセットは、ＤＮＡ二本鎖のうち一方のＤＮＡ一本鎖を優勢に増幅する非対称核酸増幅反応用として構成されている。すなわち、一方のＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅できるような濃度にプライマーセットが準備されている。また、本キットは、融解工程に用いる結合色素を備えていてもよい。また、本キットは、核酸増幅反応に用いる公知の要素（バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ等）の１種又は２種以上を備えていてもよい。その他、本キットにおけるＤＮＡ一本鎖、プライマー、プローブ及び結合色素等については、既に説明した本方法におけるこれらの要素の各種態様を適宜適用することができる。 In this kit, the primer set is configured for an asymmetric nucleic acid amplification reaction that predominantly amplifies one single strand of the double stranded DNA. That is, the primer set is prepared at a concentration that allows predominant amplification of one single strand of DNA. This kit may also include a binding dye for use in the melting step. This kit may also include one or more of the known elements (buffer, dNTPs, DNA polymerase, etc.) used in nucleic acid amplification reactions. In addition, the single stranded DNA, primers, probes, binding dyes, etc. in this kit can be appropriately applied to the various aspects of these elements in this method that have already been described.
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、以下の実施例に限定されるものではない。 The disclosure of this specification will be specifically explained below with reference to examples. However, the following examples are provided for the purpose of explaining the disclosure of this specification, and the present invention is not limited to the following examples.
（プライマーセット及びプローブの配列設計）
野生型ＭＡＣの23S rRNAドメインVの塩基配列は、NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）から得ることができる（Mycobacterium avium: GenBank accession number NC008595; Mycobacterium intracellulare: GenBank accession number CP003322）。図５には、クラリスロマイシン耐性化に関与する2058～2059番目を含む23S rRNAドメインV配列の一部を示している。かかる領域に関し、Mycobacterium aviumとMycobacterium intracellulareは、同一の塩基配列であるため、同じプライマーとプローブを使用することとした。
(Primer set and probe sequence design)
The nucleotide sequence of the 23S rRNA domain V of wild-type MAC can be obtained from NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Mycobacterium avium: GenBank accession number NC008595; Mycobacterium intracellulare: GenBank accession number CP003322). Figure 5 shows a part of the 23S rRNA domain V sequence including the 2058-2059 residues involved in clarithromycin resistance. Since Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare have the same nucleotide sequence for this region, the same primers and probes were used.
融解曲線取得用のプライマーの設計は、一般的なＰＣＲプライマーの設計サイト（Ｐｒｉｍｅｒ ３など）やソフトフェアを使用して設計した。ただし、ＰＣＲ増幅産物のサイズが小さすぎると、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ二本鎖とプローブ由来の部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ値）の区別が困難になるため、８０ｂｐ以上となるように留意した。プローブについては、３’末端をリン酸化などで修飾することで、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こらないようにし、Ｔｍ値は５５℃からＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡ二本鎖のＴｍ値よりも低い温度となるようにした。野生型と変異型の融解曲線が識別可能であるかは、ユタ大学が公開しているuMELT（www.dna-utah.org）により確認することができる。uMELTによる解析結果が野生型と変異型の融解曲線が重なるような識別が困難な場合は、プライマーやプローブの配列を変更した。これらの検討の結果、以下のとおりのプライマーとプローブを決定した。これらのプライマーとプローブは、図５において、それぞれ融解曲線用プライマー及びプローブとして示す。 Primers for obtaining melting curves were designed using general PCR primer design sites (such as Primer 3) or software. However, if the size of the PCR amplified product is too small, it becomes difficult to distinguish the melting temperature (Tm value) of the DNA double strand of the PCR product from the partial DNA double strand derived from the probe, so care was taken to make it 80 bp or more. The 3' end of the probe was modified by phosphorylation or the like to prevent the extension reaction by DNA polymerase from occurring, and the Tm value was set to a temperature lower than the Tm value of the DNA double strand of the PCR amplified product from 55°C. Whether the melting curves of the wild type and mutant types can be distinguished can be confirmed by uMELT (www.dna-utah.org) published by the University of Utah. If it was difficult to distinguish the melting curves of the wild type and mutant types by overlapping the analysis results using uMELT, the sequences of the primers and probes were changed. As a result of these considerations, the following primers and probes were determined. These primers and probes are shown in Figure 5 as melting curve primers and probes, respectively.
以下の表１において、プローブは以下の配列中のＮＮに７種の塩基配列（ＡＡ、ＴＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＡ、ＡＣ、ＡＴ）のいずれかをもつことを意味している。3’[Pho]は３’末端をリン酸化修飾したことを示す。 In Table 1 below, the probe has one of seven base sequences (AA, TA, GA, AG, CA, AC, AT) at NN in the following sequence. 3'[Pho] indicates that the 3' end has been phosphorylated.
（部分ＤＮＡ一本鎖の取得及び融解曲線の取得）
ＭＡＣの７種の点突然変異を含む２４０ｂｐのＤＮＡ断片のそれぞれに対して、上記プライマーを共通して用いるとともに、上記７種の変異のプローブも共通して用いて、核酸増幅反応を行った。すなわち、以下の組成の反応液を調製し、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行い、融解曲線を取得した。なお、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）分析装置としてLightCycler 96 System（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用し、付属のGene Scanning Software（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて融解曲線の解析を行った。解析結果を、図６～９に示す。
(Obtaining partial single stranded DNA and obtaining melting curve)
For each of the 240 bp DNA fragments containing seven kinds of point mutations in MAC, the above primers were used in common, and the probes for the above seven kinds of mutations were also used in common to carry out nucleic acid amplification reactions. That is, a reaction solution having the following composition was prepared, and real-time PCR was carried out under the following conditions to obtain a melting curve. In addition, a LightCycler 96 System (Roche Diagnostics) was used as a high-resolution melting curve (HRM) analyzer, and melting curve analysis was carried out using the attached Gene Scanning Software (Roche Diagnostics). The analysis results are shown in Figures 6 to 9.
（反応液の組成）
検体 １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー（２０ｍＭ Ｍｇ＋含有） １μＬ
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ） ０．４μＬ
（反応液中Ｍｇ＋濃度最終濃度３．０ｍＭ）
ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ） ０．８μＬ
プローブ（１０μＭ） ０．３６μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ） ０．０４μＬ
リバースプライマー（１０μＭ） ０．４０μＬ
ＰＣＲ酵素（LA Taq HS、Takara社） ０．０５μＬ
LightCycler480 Resolight Dye（ロシュ社） ０．５μＬ
水 適量
合計 １０μＬ
(Composition of reaction solution)
Sample 1 μL
10x PCR buffer (containing 20mM Mg + ) 1μL
MgCl2 (25 mM) 0.4 μL
(Final concentration of Mg + in the reaction solution: 3.0 mM)
dNTPs (2.5 mM) 0.8 μL
Probe (10 μM) 0.36 μL
Forward primer (10 μM) 0.04 μL
Reverse primer (10 μM) 0.40 μL
PCR enzyme (LA Taq HS, Takara) 0.05 μL
LightCycler480 Resolight Dye (Roche) 0.5 μL
Water (as needed)
Total 10 μL
（リアルタイム－融解解析条件）
熱変性：９５℃，５ｍｉｎ．
ＰＣＲ（４５ｃｙｃｌｅ）：９５℃，１０ｓ．６０℃，１０ｓ．７２℃，２０ｓ．
熱変性：９５℃，６０ｓ．
冷却：４０℃，６０ｓ．
予熱：６５℃，１ｓ．
ＨＲＭ：６５℃to ９５℃in 1℃/s increments with 25 acquisitions
冷却
(Real-time melting analysis conditions)
Heat denaturation: 95°C, 5 min.
PCR (45 cycles): 95° C., 10 s. 60°C, 10s. 72°C, 20s.
Heat denaturation: 95°C, 60s.
Cooling: 40°C, 60s.
Preheat: 65°C, 1s.
HRM: 65℃ to 95℃ in 1℃/s increments with 25 acquisitions
cooling
図６には、７種の変異をそれぞれ有するＤＮＡ断片に対してＡＡ特異的プローブを用いて非対称ＰＣＲにより増幅して得られた、部分ＤＮＡ二本鎖とＤＮＡ二本鎖とを含む７種の増幅産物についての６５℃～９５℃の融解曲線を示す。図６に示すように、全ての融解曲線は、８５℃以上の高温域と８２℃以下の低温域とにそれぞれピークを有していた。 Figure 6 shows melting curves at 65°C to 95°C for seven types of amplification products, including partial DNA double strands and DNA double strands, obtained by amplifying DNA fragments each having one of the seven types of mutations by asymmetric PCR using an AA-specific probe. As shown in Figure 6, all melting curves had peaks in the high-temperature range above 85°C and the low-temperature range below 82°C.
図７のＡに示すように、ＤＮＡ二本鎖の融解温度を示す８５℃以上の高温域においては、７種の融解曲線の各ピークは、相互に近接しており、個々の判別を行うことは困難であった。一方、図７のＢに示すように、８２℃以下の低温域では、標的配列としてＡＡを含有するＤＮＡ断片由来のＤＮＡ一本鎖とプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖の融解曲線のみが他の６種のＤＮＡ断片由来の部分ＤＮＡ二本鎖よりも高温域よりであって最も高い融解温度のピークを呈していた。すなわち、ＡＡ変異体を、明らかに他の変異と区別することができた。 As shown in Figure 7A, in the high-temperature range above 85°C, which indicates the melting temperature of a DNA double strand, the peaks of the seven melting curves were close to each other, making it difficult to distinguish between them individually. On the other hand, as shown in Figure 7B, in the low-temperature range below 82°C, only the melting curve of the partial DNA double strand made of the probe and a DNA single strand derived from a DNA fragment containing AA as the target sequence exhibited a peak at the highest melting temperature, which was in a higher temperature range than the partial DNA double strands derived from the other six DNA fragments. In other words, the AA mutant could be clearly distinguished from the other mutations.
また、他の６種の変異を有する各ＤＮＡ断片（ＴＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＡ、ＡＣ及びＡＴ）のそれぞれに対して、変異特異的な１種のプローブと残余のプローブをそれぞれ用いて得られた増幅産物についての融解曲線を図８及び図９に示す。図８のＡ～Ｃ及び図９のＡ～Ｃの各図は、特異的プローブ毎に７種のＤＮＡ断片から取得した７種の融解曲線のうち、部分二本鎖ＤＮＡに由来する融解曲線を示す。 Figures 8 and 9 show melting curves for the amplification products obtained using one mutation-specific probe and the remaining probes for each of the other six DNA fragments (TA, GA, AG, CA, AC, and AT) with the other six mutations. Figures A to C in Figures 8 and A to C in Figures 9 show melting curves derived from partially double-stranded DNA among the seven melting curves obtained from the seven DNA fragments for each specific probe.
図８に示すように、ＴＡ特異的プローブ、ＧＡ特異的プローブ及びＡＧ特異的プローブをそれぞれ用いるとき、これらのプローブに特異的なＤＮＡ断片に由来する部分二本鎖由来の融解曲線が、最も熱的に安定しており、特異的でない他のＤＮＡ断片よりも明らかに高温側に融解温度のピークを有することがわかった。 As shown in Figure 8, when using a TA-specific probe, a GA-specific probe, and an AG-specific probe, respectively, it was found that the melting curves derived from the partial double strands derived from DNA fragments specific to these probes were the most thermally stable, and had melting temperature peaks that were clearly higher than those of the other non-specific DNA fragments.
また、図９においても、同様に、ＴＡ特異的プローブ、ＧＡ特異的プローブ及びＡＧ特異的プローブをそれぞれ用いるとき、これらのプローブに特異的なＤＮＡ断片に由来する部分二本鎖由来の融解曲線が、最も熱的に安定しており、特異的でない他のＤＮＡ断片よりも明らかに高温側であって最も高い融解温度のピークを有することがわかった。 Similarly, in Figure 9, when a TA-specific probe, a GA-specific probe, and an AG-specific probe were used, the melting curves derived from the partial double strands derived from DNA fragments specific to these probes were found to be the most thermally stable, and had a peak at the highest melting temperature that was clearly higher than other non-specific DNA fragments.
以上のことから、標的配列を有するＤＮＡ一本鎖と、この標的配列に特異的なプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖は、その融解曲線解析において、点変異などによって類似する他の標的配列を有するＤＮＡ断片の存在下であっても、特異的な融解温度を呈することがわかった。これにより、例えば、非対称増幅反応などを利用して、標的配列を含む部分ＤＮＡ二本鎖を得ることで、高い特異性で的確にかつ迅速に標的配列を検出できることがわかった。 From the above, it was found that a partial DNA double-strand consisting of a single-stranded DNA having a target sequence and a probe specific to this target sequence exhibits a specific melting temperature in melting curve analysis, even in the presence of a DNA fragment having a similar target sequence due to point mutations or the like. This shows that the target sequence can be accurately and quickly detected with high specificity by obtaining a partial DNA double-strand containing the target sequence, for example, using an asymmetric amplification reaction or the like.
（予備的ＰＣＲによるＤＮＡ断片（標的核酸）の取得）
肺ＭＡＣ症患者の検体中に含まれる細菌数は患者によって異なるため、細菌数が少ない検体については、実施例１で示したプライマーセットでは識別が困難な検体も存在する可能性がある。そこで、被験試料に含まれる微生物由来のＤＮＡ断片を予め増幅しておくことが好適な場合がある。かかるＤＮＡ断片を取得するためのプライマーセットを以下の表に示すとともに、ＰＣＲ条件を示す。かかるプライマーセットを、図５において、融解曲線用プライマーの外側にＤＮＡ断片調製用プライマーとして示す。
(Obtaining DNA fragments (target nucleic acids) by preliminary PCR)
Since the number of bacteria contained in samples from patients with pulmonary MAC disease varies from patient to patient, there may be samples with a small number of bacteria that are difficult to distinguish using the primer set shown in Example 1. Therefore, it may be preferable to amplify DNA fragments derived from microorganisms contained in the test sample in advance. The primer sets for obtaining such DNA fragments are shown in the following table, along with the PCR conditions. In FIG. 5, such primer sets are shown as primers for preparing DNA fragments outside the primers for melting curve.
＜反応液の組成＞
検体 １μＬ
２×ＰＣＲバッファー ５μＬ
ｄＮＴＰｓ（２．０ｍＭ） ２μＬ
フォワードプライマー（１０μＭ） ０．３μＬ
リバースプライマー（１０μＭ） ０．３μＬ
ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ Ｆｘ ｎｅｏ，東洋紡）０．２μＬ
水 適量
合計 １０μＬ
<Composition of reaction solution>
Sample 1 μL
2x PCR buffer 5μL
dNTPs (2.0 mM) 2 μL
Forward primer (10 μM) 0.3 μL
Reverse primer (10 μM) 0.3 μL
PCR enzyme (KOD Fx neo, Toyobo) 0.2 μL
Water (as needed)
Total 10 μL
＜反応条件＞
熱変性：９４℃，４ｍｉｎ．
ＰＣＲ（３０ｃｙｃｌｅ）：９８℃，１０ｓ．６０℃，３０ｓ．６８℃，３０ｓ．
冷却
<Reaction conditions>
Heat denaturation: 94°C, 4 min.
PCR (30 cycles): 98° C., 10 s. 60°C, 30s. 68°C, 30s.
cooling
患者から取得した検体から抽出したＤＮＡ試料につき、上記プライマーセットを用いて上記条件で核酸増幅反応を行ったところ、意図したＤＮＡ断片を増幅できたことがわかった。 When a nucleic acid amplification reaction was carried out on DNA samples extracted from specimens obtained from patients using the above primer set under the above conditions, it was found that the intended DNA fragment was amplified.
以上、本技術の実施形態について詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例をさまざまに変形、変更したものが含まれる。本明細書または図面に説明した技術要素は、単独あるいは各種の組み合わせによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時の請求項に記載の組み合わせに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数の目的を同時に達成するものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。 Although the embodiments of the present technology have been described in detail above, these are merely examples and do not limit the scope of the claims. The technology described in the claims includes various modifications and variations of the specific examples exemplified above. The technical elements described in this specification or drawings demonstrate technical usefulness either alone or in various combinations, and are not limited to the combinations described in the claims at the time of filing. Furthermore, the technology exemplified in this specification or drawings achieves multiple objectives simultaneously, and achieving one of these objectives is itself technically useful.
配列番号１～５：合成ＤＮＡ SEQ ID NO: 1-5: Synthetic DNA
Claims (12)
前記標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、前記ＤＮＡ一本鎖の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、を準備する準備工程と、
前記ＤＮＡ一本鎖と、前記プローブとが特異的にハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程と、
を備える、方法。 A method for detecting a target sequence, comprising the steps of:
A preparation step of preparing a single strand of DNA containing the target sequence and a probe that specifically hybridizes to a portion of the single strand of DNA containing the target sequence;
a melting step of obtaining a melting temperature of a partial DNA double-strand in which the single-stranded DNA and the probe are specifically hybridized;
A method comprising:
前記プローブは、前記２種以上の標的配列にそれぞれ特異的な２種以上のプローブを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。 The target sequence includes two or more target sequences, each of which includes two or more features;
The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the probe comprises two or more probes specific to the two or more target sequences, respectively.
前記プローブは、前記２種以上の標的配列に特異的な２種以上のプローブを含む、請求項７に記載の方法。 The target sequence includes two or more target sequences containing two or more mutations involved in drug susceptibility of a microorganism or virus,
The method of claim 7 , wherein the probes comprise two or more probes specific for the two or more target sequences.
前記標的配列を含むＤＮＡ二本鎖を増幅するための一対のプライマーセットと、
前記ＤＮＡ二本鎖の一方のＤＮＡ一本鎖中の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズする、プローブと、
を備える、キット。 A kit for detecting a target sequence by melting, comprising:
A pair of primer sets for amplifying a double-stranded DNA containing the target sequence;
a probe that specifically hybridizes to a portion including the target sequence in one DNA single strand of the DNA double strand;
A kit comprising:
The kit according to claim 11 , wherein the pair of primer sets is a set for a non-control nucleic acid amplification reaction that predominantly amplifies one of the DNA single strands of the DNA double strands.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024087513A true JP2024087513A (en) | 2024-07-01 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2017203349B2 (en) | Compositions of toehold primer duplexes and methods of use | |
| CA3033250C (en) | Methods for performing multiplexed real-time pcr | |
| EP1749106B1 (en) | Detection of amplicon contamination during pcr exhibiting two different annealing temperatures | |
| US20100273159A1 (en) | Nested Multiplex Amplification Method for Identification of Multiple Biological Entities | |
| KR20140091944A (en) | Melting Curve Analysis Using Self Internal Control and PNA Probe Comprising Reporter and Quenching, Method and Kit for Analyzing Target DNA Detection Using Melting Curve Analysis | |
| JP4249186B2 (en) | Nucleic acid amplification method | |
| KR20130099092A (en) | Method for inhibiting nucleic acid amplification using light and highly sensitive method for selective nucleic acid amplification | |
| JP2011083286A (en) | Method for quick detection of nucleic acid | |
| JP6007652B2 (en) | Primers and probes for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and methods for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus using them | |
| JP2024087513A (en) | Method and kit for detecting target sequence | |
| US20180245140A1 (en) | Kit and method for detecting single nucleotide polymorphism | |
| JP4990771B2 (en) | Method for monitoring microbial genomic DNA | |
| US20180340214A1 (en) | Quantitative multiplex polymerase chain reaction in two reactions | |
| JP5530185B2 (en) | Nucleic acid detection method and nucleic acid detection kit | |
| JP5635496B2 (en) | EGFR gene polymorphism detection probe and use thereof | |
| JP2008245641A (en) | Method for detecting nucleic acid | |
| JP2008161164A (en) | Method for detecting gene with primer containing artificial mismatched nucleic acid | |
| CN117866951A (en) | Multiplex PCR reaction system | |
| CN117701689A (en) | Multiplex PCR reaction system | |
| JP5504676B2 (en) | Genotype identification method | |
| KR20230066614A (en) | Combinations, methods and kits for nucleic acid detection | |
| CN116606947A (en) | Primer probe for detecting pseudomonas aeruginosa and detection kit thereof | |
| CN117286265A (en) | Primer probe composition, kit and method for detecting drug resistance of helicobacter pylori to amoxicillin | |
| JP2009219445A (en) | Method and primer set for detecting single nucleotide polymorphism on vkorc1 gene | |
| JP2005278443A (en) | Oligonucleotide and method for detecting neisseria gonorrhoeae |