JP2009219445A - Method and primer set for detecting single nucleotide polymorphism on vkorc1 gene - Google Patents
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Description
本発明は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の１塩基多型を検出する方法およびプライマーセットに関する。 The present invention relates to a method for detecting a single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene and a primer set.
遺伝情報を担っているＤＮＡ配列は、個体毎に多くの部位が異なっていることが知られている。同じ生物種のＤＮＡ配列のうちの、異なる遺伝子・ＤＮＡ配列のことを遺伝子多型という。このような遺伝子多型として、１塩基の置換によって生じる１塩基多型、２〜数塩基からなる配列の繰り返し回数の違いであるマイクロサテライト、１から数十塩基が欠失や挿入されたものなどが知られている。 It is known that the DNA sequence carrying genetic information differs in many parts from individual to individual. Different DNA sequences of the same species are called gene polymorphisms. Examples of such gene polymorphisms include single nucleotide polymorphisms caused by substitution of one base, microsatellite that is a difference in the number of repetitions of sequences consisting of 2 to several bases, and deletions or insertions of 1 to several tens of bases It has been known.
遺伝子多型の中でも特に１塩基多型は、原因遺伝子のわかっている遺伝病について将来的な危険率を診断するための有用なツールとなる。また、薬剤応答性、および副作用の有無について非常に有用な情報を提供することもできる。このような１塩基多型を有する遺伝子として、多くの薬剤代謝に関与する酵素チトクロームＰ４５０(ＣＹＰ)のファミリーおよび抗結核薬イソニアジドの代謝に関与するＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２(ＮＡＴ−２)、並びに経口抗凝固剤ワーファリンの効果の強さに大きく影響するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子およびＶＫＯＲＣ１遺伝子などが挙げられる。従って、１塩基多型の検出をより正確に行うことが求められている。 Among gene polymorphisms, single nucleotide polymorphisms are particularly useful tools for diagnosing future risk factors for genetic diseases with known causative genes. It can also provide very useful information about drug responsiveness and the presence or absence of side effects. Genes having such single nucleotide polymorphisms include the family of enzymes cytochrome P450 (CYP) involved in many drug metabolisms and N-acetyltransferase 2 (NAT-2) involved in the metabolism of the antituberculosis drug isoniazid, and oral anti-tumor Examples include CYP2C9 gene and VKORC1 gene, which greatly affect the strength of the coagulant warfarin. Therefore, there is a demand for more accurate detection of single nucleotide polymorphisms.
１塩基多型の検出方法として、核酸の等温増幅法であるＳＭＡＰ（登録商標）法（非特許文献１、特許文献１）を利用する方法がある。ＳＭＡＰ（登録商標）法では、プライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも一つが、１塩基多型部位を認識するように設計されたプライマーセットを用いる。
As a method for detecting a single nucleotide polymorphism, there is a method using the SMAP (registered trademark) method (Non-patent
ＳＭＡＰ（登録商標）法では、次のようにして、１塩基多型を検出する。検体となる核酸試料中にプライマーの標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応においてプライマーが当該標的核酸配列に完全にアニーリングするため、酵素がプライマーと核酸試料の二本鎖を認識することができ増幅産物が得られる。逆に検体となる核酸試料中にプライマーの標的核酸配列とは異なる配列が含まれている場合には、核酸増幅反応においてプライマーが当該標的核酸配列にアニーリングしにくくなるため、酵素がプライマーと核酸試料の二本鎖を認識しにくくなり増幅産物が得られないか、あるいはその増幅速度が著しく低下する。このようにして生じる核酸増幅速度の差によって１塩基多型を検出することができる。 In the SMAP (registered trademark) method, a single nucleotide polymorphism is detected as follows. If the sample nucleic acid sample contains the target nucleic acid sequence of the primer, the primer completely anneals to the target nucleic acid sequence in the nucleic acid amplification reaction, so the enzyme recognizes the double strand of the primer and nucleic acid sample. Amplification product can be obtained. Conversely, if the nucleic acid sample to be used as a sample contains a sequence different from the target nucleic acid sequence of the primer, the primer is difficult to anneal to the target nucleic acid sequence in the nucleic acid amplification reaction. This makes it difficult to recognize the double strand, and an amplification product cannot be obtained, or the amplification rate is significantly reduced. A single nucleotide polymorphism can be detected by the difference in the nucleic acid amplification rate generated in this way.
ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目にみられる１塩基多型の周辺配列は、ＧＣが連続している配列になっている。遺伝子増幅反応において、このようなＧＣリッチな配列をプライマーの末端の反応開始点で認識する場合に、プライマーの配列とテンプレート核酸の配列が完全に一致していなくても、プライマーとテンプレート核酸が二本鎖を形成し、その部分を酵素が認識し、増幅反応が起きてしまうため反応の特異性が低下するという問題点が知られている（遺伝子工学実験ノート（下）」、２００７年、田村隆明編、p.14）。
この問題点のため、周辺配列にＧＣが連続している１塩基多型をプライマーの末端で認識する場合に、１塩基多型部位がミスマッチになっていてもプライマーがテンプレート核酸にアニーリングしてしまい、十分な増幅速度差が得られず、変異核酸の検出を正確に行うことは困難である。
The peripheral sequence of the single nucleotide polymorphism found at the 3673rd position on the VKORC1 gene sequence is a sequence in which GC is continuous. In a gene amplification reaction, when such a GC-rich sequence is recognized at the reaction start point at the end of the primer, the primer and the template nucleic acid are duplicated even if the primer sequence and the template nucleic acid sequence do not completely match. There is a known problem that the specificity of the reaction is reduced because the enzyme recognizes this part of the chain and the amplification reaction occurs (genetic engineering experiment note (bottom)), 2007, Tamura. Takaaki, p.14).
Because of this problem, when a single nucleotide polymorphism with a continuous GC in the peripheral sequence is recognized at the end of the primer, the primer anneals to the template nucleic acid even if the single nucleotide polymorphism site is mismatched. A sufficient difference in amplification rate cannot be obtained, and it is difficult to accurately detect mutant nucleic acids.
本発明の目的は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型を検出するための方法およびプライマーセットを提供することである。 An object of the present invention is to provide a method and a primer set for detecting the 3673rd single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene sequence.
上記課題を解決するため、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型をより正確に識別することが可能なプライマーセットを見出し、本発明に至った。
すなわち、上記課題は、以下の手段により解決することができる。
１．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
２．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする方法。
（１）以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。
３．前記プライマーセットが、さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前項１または２に記載の方法。
４．鎖置換能を有するポリメラーゼを使用する、前項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．融解温度調整剤の存在下で核酸増幅反応を行う、前項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．酵素安定化剤の存在下で核酸増幅反応を行う、前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである前項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．さらに以下の工程（４）を含むことを特徴とする前項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（４）工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程。
９．さらに以下の工程（５）を含むことを特徴とする前項８に記載の方法。
（５）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する工程。
１０．さらに以下の工程（６）〜（８）を含むことを特徴とする前項９に記載の方法。
（６）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
（７）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
（８）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。
１１．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
１２．ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出するためのプライマーセットであって、
以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
１３．さらに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前項１１または１２に記載のプライマーセット。
１４．前記一塩基多型が、前記配列番号１に示される塩基配列の第７５番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである前項１１〜１３のいずれかに記載のプライマーセット。
１５．前項１１〜１４のいずれかに記載のプライマーセットを含むＶＫＯＲＣ１遺伝子の一塩基多型検出用キット。
In order to solve the above problems, a primer set capable of more accurately discriminating the 3673rd single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene sequence was found, and the present invention was achieved.
That is, the above problem can be solved by the following means.
1. A method for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing included in the VKORC1 gene sequence, comprising the following steps (1) to (3): A method characterized by comprising.
(1) The following oligonucleotides (a1) and (b) are included, and a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be amplified under isothermal conditions, A step of preparing a primer set for detecting a single nucleotide polymorphism.
(A1) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
A base sequence existing on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 1 ′) having a fifth base (cytosine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(2) A step of subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction with the primer set under isothermal conditions.
(3) A step of detecting a nucleic acid amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction.
2. A method for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing included in the VKORC1 gene sequence, comprising the following steps (1) to (3): A method characterized by comprising.
(1) The following oligonucleotides (a2) and (b) are included, and a region containing the 50th to 80th nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 can be amplified under isothermal conditions, A step of preparing a primer set for detecting a single nucleotide polymorphism.
(A2) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 2 ′) having a fifth base (thymine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(2) A step of subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction with the primer set under isothermal conditions.
(3) A step of detecting a nucleic acid amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction.
3. 3. The method according to
4). 4. The method according to any one of
5. 5. The method according to any one of
6). 6. The method according to any one of
7). 7. The single nucleotide polymorphism according to any one of 1 to 6 above, wherein the 75th base guanine (G) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is mutated to adenine (A). the method of.
8). Furthermore, the method of any one of the preceding clauses 1-7 characterized by including the following processes (4).
(4) A step of detecting a nucleic acid amplification reaction rate from the amount of the nucleic acid amplification product detected in step (3).
9. 9. The method according to item 8 above, further comprising the following step (5).
(5) The nucleotide sequence (Y 1 ′) or nucleotide sequence (Y 2 ) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 ') And the nucleotide sequence of the nucleic acid sample, the difference in the speed of the nucleic acid amplification reaction that occurs when the nucleic acid sample is complementary and when it is not complementary, the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 Detecting a single nucleotide polymorphism.
10. 10. The method according to item 9 above, further comprising the following steps (6) to (8).
(6) The nucleotide sequence (Y 1 ′) or nucleotide sequence (Y 2 ) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of comparing the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) with the reference rate, using the nucleic acid amplification reaction rate when the base sequence of the nucleic acid sample is complementary to the reference rate.
(7) When the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) is lower than the reference rate, the (a1) or (a2) in the 75th base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or base sequence (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide is not complementary to the base sequence of the nucleic acid sample.
(8) When the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) is not lower than the reference rate, the (a1) or (a2) above in the 75th base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or base sequence (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide is complementary to the base sequence of the nucleic acid sample.
11. A primer set for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, contained in the VKORC1 gene sequence,
A primer set comprising the following oligonucleotides (a1) and (b), wherein a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be amplified under isothermal conditions.
(A1) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and 5 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 1 ′) having a fifth base from the end (cytosine) at any position of the second to fifth bases from the 5 ′ end.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
12 A primer set for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, contained in the VKORC1 gene sequence,
A primer set comprising the following oligonucleotides (a2) and (b) and capable of amplifying a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 under isothermal conditions.
(A2) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 2 ′) having a fifth base (thymine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
13. The primer set according to
14 The primer according to any one of the
15. A kit for detecting a single nucleotide polymorphism of the VKORC1 gene comprising the primer set according to any one of the
本発明に係るプライマーセットは、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の１塩基多型をプライマー配列の中央部付近で認識することができる。このことによって、酵素の認識能の効果だけでなく、１塩基のミスマッチの効果によって生じるプライマーのアニーリング効率差の効果も得られるので、より大きな増幅速度差を得ることができ、正確な変異の検出が行えるようになる。従って、本発明に係る方法によれば、従来不十分であったＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目の１塩基多型の同定を正確かつ速やかに行うことができ、ＶＫＯＲＣ１遺伝子の関与する薬剤応答性をより迅速に解析することができる。このことにより、個体差の著しい薬剤応答性を簡易かつ迅速に解析し、適切な治療方法を提供することができる。 The primer set according to the present invention can recognize the 3673rd single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene sequence near the center of the primer sequence. As a result, not only the effect of the recognition ability of the enzyme but also the effect of the difference in primer annealing efficiency caused by the mismatch effect of one base can be obtained, so that a larger amplification speed difference can be obtained, and accurate mutation detection Can be done. Therefore, according to the method of the present invention, the 3673rd single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene, which has been insufficient in the past, can be identified accurately and promptly, and the drug responsiveness involving the VKORC1 gene can be improved. Analysis can be performed more quickly. This makes it possible to simply and quickly analyze drug responsiveness with significant individual differences and provide an appropriate treatment method.
本発明において、ＶＫＯＲＣ１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ＿５８７０２０に示す塩基配列に表される。また、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列上の第３６７３番目の一塩基多型は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しているものである。
なお、配列番号１および配列番号１４は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３５９９番目〜第３７４７番目の塩基配列を示しており、ＶＫＯＲＣ１遺伝子上の第３６７３番目が、配列番号１および配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目に対応する。配列番号１の第７５番目の塩基はグアニンであり、配列番号１４の第７５番目の塩基はアデニンである。
In the present invention, VKORC1 gene is a GenBank Accession No. It is represented by the base sequence shown in AY — 587020. The 3673rd single nucleotide polymorphism on the VKORC1 gene sequence is a mutation of the 3673rd base guanine (G) on the VKORC1 gene to adenine (A).
SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14 show the 3599th to 3747th base sequences on the VKORC1 gene, and the 3673rd on the VKORC1 gene is the base shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 14. This corresponds to the 75th array. The 75th base of SEQ ID NO: 1 is guanine, and the 75th base of SEQ ID NO: 14 is adenine.
本発明の方法は、ＶＫＯＲＣ１遺伝子配列に含まれる、配列表の配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する方法であって、前記工程（１）〜（３）を含む。本発明の方法には、ＳＭＡＰＴＭ法（Nature Methods (2007), Vol.4, No.3, p.257-262および特許第３９４２６２７号公報参照）を用いることが好ましい。 The method of the present invention is a method for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, which is contained in the VKORC1 gene sequence, the step (1) Includes (3). In the method of the present invention, the SMAP TM method (Nature Methods (2007), Vol. 4, No. 3, p. 257-262 and Japanese Patent No. 3926627) is preferably used.
以下、各工程について説明する。
工程（１）：（ａ１）および（ｂ）、または、（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程
Hereinafter, each step will be described.
Step (1): The oligonucleotides of (a1) and (b) or (a2) and (b) are contained, and the 50th to 80th of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of preparing a primer set for detecting the single nucleotide polymorphism capable of amplifying a region containing a base sequence under isothermal conditions
以下、（ａ１）、（ａ２）、および（ｂ）のオリゴヌクレオチドについて説明する。
・（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチド
（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチドは、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅用プライマーとして用いるプライマーである。
まず、（ａ１）のオリゴヌクレオチドについて説明する。（ａ１）のオリゴヌクレオチドは、塩基配列（Ｘｃ'）と、塩基配列（Ｘｃ'）の５’側に存在する塩基配列（Ｙ１'）とを含む。
塩基配列（Ｘｃ'）は、図１（ａ）に示すように、鋳型となる配列番号６に示される塩基配列（配列番号１に相補的な塩基配列）の第１００番目から第１３５番目の領域である塩基配列（Ｘ）にハイブリダイズするものである。すなわち、塩基配列（Ｘｃ'）は、配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むものである。この配列番号２の塩基配列は、配列番号１の第１５番目から第５０番目と同じ配列である。
Hereinafter, the oligonucleotides (a1), (a2), and (b) will be described.
-Oligonucleotides (a1) and (a2) The oligonucleotides (a1) and (a2) are primers used as amplification primers in the SMAP TM method.
First, the oligonucleotide (a1) will be described. The oligonucleotide (a1) includes a base sequence (Xc ′) and a base sequence (Y 1 ′) present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′).
As shown in FIG. 1 (a), the base sequence (Xc ′) is a region from the 100th to the 135th region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (base sequence complementary to SEQ ID NO: 1) as a template. It hybridizes to the base sequence (X). That is, the base sequence (Xc ′) includes at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence of SEQ ID NO: 2 is the same sequence as the 15th to 50th sequences of SEQ ID NO: 1.
また、塩基配列（Ｙ１'）は、配列番号６に示される塩基配列において、前記塩基配列（Ｘ）よりも５’側に存在する、第７１番目から第８５番目の領域である塩基配列（Ｙ）の相補配列（Ｙｃ）にハイブリダイズするものである（図１（ｂ）のＹ’）。すなわち、塩基配列（Ｙ１'）は、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含むものである。この配列番号３の塩基配列は、配列番号６の第７１番目から第８５番目と同じ配列である。
そして、塩基配列（Ｙ１'）は、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有している。
塩基配列（Ｙ１’）と塩基配列（Ｙｃ）がハイブリダイズすると、塩基配列（Ｙｃ）に含まれる一塩基多型部位（グアニンまたはアデニン）は、塩基配列（Ｙ１’）の５’末端から２〜５塩基目のいずれかの塩基上に位置することになる。
In addition, the base sequence (Y 1 ′) is a base sequence (71st to 85th regions present on the 5 ′ side of the base sequence (X) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 ( It hybridizes to the complementary sequence (Yc) of Y) (Y ′ in FIG. 1B). That is, the base sequence (Y 1 ′) includes 8 to 12 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The base sequence of SEQ ID NO: 3 is the same sequence as the 71st to 85th positions of SEQ ID NO: 6.
The base sequence (Y 1 ′) has the fifth base (cytosine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 at any position from the 2 ′ to 5th base from the 5 ′ end. ing.
When the base sequence (Y 1 ′) and the base sequence (Yc) are hybridized, the single nucleotide polymorphism site (guanine or adenine) contained in the base sequence (Yc) is separated from the 5 ′ end of the base sequence (Y 1 ′). It will be located on any of the 2nd to 5th bases.
次に、（ａ２）のオリゴヌクレオチドについて説明する。（ａ２）のオリゴヌクレオチドは、塩基配列（Ｘｃ'）と、塩基配列（Ｘｃ'）の５’側に存在する塩基配列（Ｙ２'）とを含む。
塩基配列（Ｙ２'）は、配列番号６に示される塩基配列において、前記塩基配列（Ｘ）よりも５’側に存在する第７１番目から第８５番目の領域であり、第７５番目の塩基がＴ（チミン）である塩基配列（Ｙ）の相補配列（Ｙｃ）にハイブリダイズするものである（図１（ｂ）のＹ’）。すなわち、塩基配列（Ｙ２'）は、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含むものである。この配列番号１３の塩基配列は、配列番号３の第５番目がチミンである塩基配列である。
そして、塩基配列（Ｙ２'）は、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基チミンを有している。
塩基配列（Ｙ２’）と塩基配列（Ｙｃ）がハイブリダイズすると、塩基配列（Ｙｃ）に含まれる一塩基多型部位（グアニンまたはアデニン）が、塩基配列（Ｙ２’）の５’末端から２〜５塩基目のいずれかの塩基上に位置することになる。
Next, the oligonucleotide (a2) will be described. The oligonucleotide (a2) includes a base sequence (Xc ′) and a base sequence (Y 2 ′) present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′).
The base sequence (Y 2 ′) is the 71st to 85th region existing on the 5 ′ side of the base sequence (X) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the 75th base. Is hybridized to a complementary sequence (Yc) of the base sequence (Y) where T is thymine (Y ′ in FIG. 1B). That is, the base sequence (Y 2 ′) includes 8 to 12 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. The base sequence of SEQ ID NO: 13 is a base sequence in which the fifth of SEQ ID NO: 3 is thymine.
The base sequence (Y 2 ′) has the fifth base thymine from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 at any position from the 5 ′ end to the 2nd to 5th bases. .
When the base sequence (Y 2 ′) and the base sequence (Yc) are hybridized, the single nucleotide polymorphism site (guanine or adenine) contained in the base sequence (Yc) is transferred from the 5 ′ end of the base sequence (Y 2 ′). It will be located on any of the 2nd to 5th bases.
このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ｘｃ'）が標的核酸配列の配列（Ｘ）にハイブリダイズした状態となる。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（Ｙ１'）または（Ｙ２'）が、同核酸中に存在する配列（Ｙｃ）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。 When such a primer is annealed to the template nucleic acid, the sequence (Xc ′) in the primer is hybridized to the sequence (X) of the target nucleic acid sequence. When a primer extension reaction occurs in this state, a nucleic acid containing a complementary sequence of the target nucleic acid sequence is synthesized. Then, the sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′) present on the 5 ′ end side of the synthesized nucleic acid hybridizes to the sequence (Yc) present in the nucleic acid, and thereby the synthesized nucleic acid A stem-loop structure is formed at the 5 ′ end of
その結果、鋳型核酸上の配列（Ｘ）が一本鎖となり、この部分に先の（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される。 As a result, the sequence (X) on the template nucleic acid becomes a single strand, and another primer having the same sequence as the oligonucleotide (a1) or (a2) is hybridized to this portion. Thereafter, an extension reaction from the newly hybridized oligonucleotide (a1) or (a2) occurs by the strand displacement reaction, and at the same time, the previously synthesized nucleic acid is separated from the template nucleic acid.
（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドの鎖長は、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長とする。当該鎖長は、好ましくは２０〜６５ヌクレオチド、より好ましくは２０〜４５ヌクレオチドとする。また、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドを構成する配列（Ｘｃ'）と配列（Ｙ１'）、（Ｙ２'）の長さは、それぞれ、（Ｘｃ'）は好ましくは１５〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとし、（Ｙ１'）および（Ｙ２'）は好ましくは５〜２５ヌクレオチド、より好ましくは５〜１５ヌクレオチドとする。
また、必要に応じて、配列（Ｘｃ'）と配列（Ｙ１'）または（Ｙ２'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
The chain length of the oligonucleotide (a1) or (a2) is such that the base pairing with the target nucleic acid can be carried out while maintaining the necessary specificity under the given conditions. The chain length is preferably 20 to 65 nucleotides, more preferably 20 to 45 nucleotides. The lengths of the sequence (Xc ′) and the sequences (Y 1 ′) and (Y 2 ′) constituting the oligonucleotide (a1) or (a2) are preferably (Xc ′) of 15 to 40, respectively. Nucleotides, more preferably 15-30 nucleotides, (Y 1 ′) and (Y 2 ′) are preferably 5-25 nucleotides, more preferably 5-15 nucleotides.
If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Xc ′) and the sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′).
配列番号１：
5’-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3’
配列番号２：
5’-ACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGA-3’
配列番号３：
5’-CACCCGGCCAATGGT-3’
配列番号６：
5’-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCACCCGGCCAATGGTTGTTTTTCAGGTCTTCTCTTGCTTGACTTCCCAGAGGGATCCCTTACTGTTGCACCTACCCTTC-3’
配列番号１３：
5’-CACCTGGCCAATGGT-3’
配列番号１４：
5’-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3’
SEQ ID NO: 1:
5'-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3 '
SEQ ID NO: 2:
5'-ACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGA-3 '
SEQ ID NO: 3
5'-CACCCGGCCAATGGT-3 '
SEQ ID NO: 6
5'-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCACCCGGCCAATGGTTGTTTTTCAGGTCTTCTCTTGCTTGACTTCCCAGAGGGATCCCTTACTGTTGCACCTACCCTTC-3 '
SEQ ID NO: 13
5'-CACCTGGCCAATGGT-3 '
SEQ ID NO: 14:
5'-GAAGGGTAGGTGCAACAGTAAGGGATCCCTCTGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGCATTTTGGGAGGCCGAGGTGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT-3 '
・（ｂ）のオリゴヌクレオチド
（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の第８０番目から第１４９番目の塩基配列（Ｚ）の相補的な配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドである。すなわち、配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチドである。
（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅用プライマーとして用いるプライマーである。
-Oligonucleotide (b) The oligonucleotide (b) comprises at least 15 consecutive bases of the complementary sequence of the base sequence (Z) from the 80th to the 149th base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is an oligonucleotide containing. That is, an oligonucleotide containing at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
The oligonucleotide (b) is a primer used as an amplification primer in the SMAP TM method.
また、（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｚｃ'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）を前記配列（Ｚｃ'）の５’側に含んでなるものである。 The oligonucleotide (b) preferably comprises a base sequence (Zc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 at the 3 ′ end portion and hybridizes to each other. It comprises a folded sequence (W-Wc ′) containing two nucleic acid sequences to soybean on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (Zc ′).
（ｂ）のオリゴヌクレオチドを構成する配列（Ｚｃ'）の長さは、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜４０ヌクレオチドとする。また、前記折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドとする。 The length of the sequence (Zc ′) constituting the oligonucleotide (b) is preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 15 to 40 nucleotides. The length of the folded sequence (W-Wc ′) is preferably 2 to 1000 nucleotides, more preferably 2 to 100 nucleotides, still more preferably 4 to 60 nucleotides, and even more preferably 6 to 40 nucleotides.
前記折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐとする。
折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ｚｃ'）と折返し配列（Ｗ−Ｗｃ'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
配列番号４：
5’-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCG -3’
The number of nucleotides of base pairs formed by hybridization within the folded sequence (W-Wc ′) is preferably 2 to 500 bp, more preferably 2 to 50 bp, still more preferably 2 to 30 bp, and still more preferably 3 to 3 bp. 20 bp.
The nucleotide sequence of the folded sequence (W-Wc ′) may be any sequence and is not particularly limited, but is preferably a sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence. If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Zc ′) and the folded sequence (W-Wc ′).
SEQ ID NO: 4:
5'-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCG -3 '
前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットは、好ましくは、さらに（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含む。
（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、ＳＭＡＰＴＭ法において増幅促進用プライマーとして用いるプライマーである。
また、（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。ここで、「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
The primer set for detecting the single nucleotide polymorphism preferably further comprises the oligonucleotide (c).
The oligonucleotide (c) is an oligonucleotide containing at least 10 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and is a primer used as an amplification promoting primer in the SMAP TM method.
The oligonucleotide (c) hybridizes to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence, and does not compete with other primers for hybridization to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence. Here, “non-competing” means that the primer does not interfere with the provision of the complementary strand synthesis starting point by hybridizing to the target nucleic acid.
（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。 When the target nucleic acid is amplified by the oligonucleotides (a1) or (a2) and (b), as described above, the amplification product has the target nucleic acid sequence and its complementary sequence alternately. A folded sequence or a loop structure exists at the 3 'end of the amplified product, and extension reactions occur one after another from the complementary strand synthesis starting point provided thereby. The oligonucleotide (c) can be annealed to the target sequence present in the single-stranded part when such an amplification product is partially in a single-stranded state. As a result, a new complementary strand synthesis starting point is provided in the target nucleic acid sequence in the amplification product, and an extension reaction takes place therefrom, so that the nucleic acid amplification reaction is performed more rapidly.
ここで、本発明の方法において、増幅促進用プライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上のプライマーを同時に用いてもよい。これら増幅促進用プライマーは、典型的には（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。
（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含む増幅促進用プライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとする。
配列番号５：
5’-TGGTTGTTTTTCAGGTCTTCT-3’
Here, in the method of the present invention, the number of primers for promoting amplification is not necessarily limited to one, and two or more types of primers may be used simultaneously in order to improve the speed and specificity of the nucleic acid amplification reaction. Good. These amplification-promoting primers typically comprise a different sequence from the oligonucleotides (a1) or (a2) and (b), but hybridize to partially overlapping regions as long as they do not compete with these primers. It is good to do.
The chain length of the primer for promoting amplification containing the oligonucleotide (c) is preferably 2 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 7 to 30 nucleotides.
SEQ ID NO: 5:
5'-TGGTTGTTTTTCAGGTCTTCT-3 '
本発明のプライマーセットに含まれるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる自体公知の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法およびチオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。 Oligonucleotides contained in the primer set of the present invention can be synthesized by methods known per se that can be used for oligonucleotide synthesis, such as the phosphotriester method, H-phosphonate method, and thiophosphonate method. The primer can be easily obtained by, for example, synthesizing by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 of ABI (Applied Biosystem Inc.).
工程（２）：前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程
工程（２）は工程（１）で調製したプライマーセットを用いて等温下で核酸増幅反応を行う工程である。工程（２）の核酸増幅反応はＳＭＡＰＴＭ法により行うことが好ましい。
Step (2): Step of performing nucleic acid amplification reaction with isothermal primer The step (2) is a step of performing nucleic acid amplification reaction isothermally using the primer set prepared in step (1). The nucleic acid amplification reaction in step (2) is preferably performed by the SMAP TM method.
以下のア）〜オ）に、これら（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を説明する（図２ａおよびｂ）。
ア）まず、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる［図２ａ（ａ）］。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ｘ）に新たな（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｂ）］、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。
In the following a) to o), possible mechanisms of action for the nucleic acid amplification reaction by the oligonucleotides (a1) or (a2) and (b) are described (FIGS. 2a and b).
A) First, the oligonucleotide (a1) or (a2) hybridizes to the sense strand of the target nucleic acid, and an extension reaction of the primer occurs [FIG. 2a (a)]. Next, a stem-loop structure is formed on the extended strand (−), and thereby a new oligonucleotide (a1) or (a2) hybridizes to the sequence (X) on the target nucleic acid sense strand that has become a single strand. The soybean is soaked [FIG. 2a (b)], and the extension reaction of the primer occurs, and the previously synthesized extension chain (−) is eliminated.
イ）次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（Ｚ）に（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｃ）］、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される［図２ａ（ｄ）］。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され［図２ａ（ｅ）］、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する［図２ａ（ｆ）］。 A) Next, the oligonucleotide (b) hybridizes to the sequence (Z) on the released extended strand (−) [FIG. 2 a (c)], the extension reaction of the primer occurs, and the extended strand (+ ) Is synthesized [FIG. 2a (d)]. A stem-loop structure is formed at the 3 ′ end of the generated extended strand (+) and the 5 ′ end of the extended strand (−) [FIG. 2 a (e)], and the extended strand (+) which is the free 3 ′ end. At the same time as the elongation reaction occurs from the loop tip, the elongated chain (-) is detached [FIG. 2a (f)].
ウ）ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（Ｘ）および配列（Ｙｃ）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（Ｘ）および配列（Ｙｃ）に（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし［図２ａ（ｇ）］、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する［図２ａ（ｈ）および図２ｂ（ｉ）］。 C) By the extension reaction from the end of the loop, a hairpin-type double-stranded nucleic acid in which the extended strand (-) is bound to the 3 'side of the extended strand (+) via the sequence (X) and the sequence (Yc) is generated. Then, the oligonucleotide (a1) or (a2) hybridizes to the sequence (X) and the sequence (Yc) [FIG. 2a (g)], and an extended chain (−) is generated by the extension reaction [FIG. 2a]. (H) and FIG. 2b (i)].
エ）また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され［図２ａ（ｈ）］、そこからの伸長反応により［図２ｂ（ｉ）］、両端に折返し配列を有し、（ａ１）または（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する［図２ｂ（ｊ）］。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため［図２ｂ（ｋ）］、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる［図２ｂ（ｌ）および（ｍ）］。 D) Also, a free 3 ′ end is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end of the hairpin double-stranded nucleic acid [FIG. 2 a (h)], and an extension reaction therefrom [FIG. 2 b (i) ], A single strand having folded sequences at both ends and alternately comprising an extended strand (+) and an extended strand (−) via a sequence derived from the oligonucleotides (a1) or (a2) and (b) Nucleic acids are produced [FIG. 2b (j)]. In this single-stranded nucleic acid, since the free 3 ′ end (starting point of complementary strand synthesis) is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end [FIG. 2 b (k)], the same extension reaction is repeated, The chain length is doubled per extension reaction [FIGS. 2b (l) and (m)].
オ）また、イ）［図２ｂ（ｉ）］において脱離した（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため［図２ｂ（ｎ）］、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する［図２ｂ（ｏ）］。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。 E) Also, in the extension strand (-) from the oligonucleotide (a1) or (a2) released in [Fig. 2b (i)], the free 3 Since the 'end (starting point of complementary strand synthesis) is provided [FIG. 2b (n)], a stem-loop structure is formed at both ends by the extension reaction therefrom, and the extended strand (+ ) And extended strands (-) are alternately produced (FIG. 2b (o)). In this single-stranded nucleic acid as well, the complementary strand synthesis starting point is sequentially provided by the loop formation at the 3 'end, so that elongation reactions occur one after another.
上記のようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドおよび（ｂ）のオリゴヌクレオチドに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。 In the single-stranded nucleic acid that is automatically extended as described above, the sequence derived from the oligonucleotide (a1) or (a2) and the oligonucleotide (b) has an extended strand (+) and an extended strand (- ), The oligonucleotides can hybridize and cause an extension reaction, whereby the sense strand and the antisense strand of the target nucleic acid are significantly amplified.
核酸増幅反応に用いる核酸試料は、検体、例えばヒトから取得することができる。その場合には、該検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において自体公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。 The nucleic acid sample used for the nucleic acid amplification reaction can be obtained from a specimen, for example, a human. In that case, the nucleic acid can be extracted from a sample such as a desired tissue, organ and cell from the specimen by a method known per se in the art, and if necessary, the size of the nucleic acid fragment can be extracted after the extraction. In addition, conditions such as purification purity can be adjusted to an appropriate state. Thereafter, the test nucleic acid in the nucleic acid sample may be further amplified by performing an amplification reaction by a general polymerase chain reaction (PCR) or the like.
標的核酸配列を含む核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。 The nucleic acid sample containing the target nucleic acid sequence can be either DNA or RNA. DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. RNA includes all of RNA, mRNA, rRNA, siRNA, hnRNA and synthetic RNA.
核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動および密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。 Isolation of the nucleic acid sample can be performed by any method, and examples thereof include a method using dissolution treatment with a surfactant, sonication, shaking and stirring using glass beads, and a French press. In addition, when an endogenous nuclease is present, it is preferable to purify the isolated nucleic acid. Nucleic acid purification can be performed, for example, by phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis, density-dependent centrifugation, and the like.
より具体的には、前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸および全ＲＮＡまたはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。 More specifically, the nucleic acid sample includes a double-stranded nucleic acid such as genomic DNA or PCR fragment isolated by the above method and a single strand such as cDNA prepared by reverse transcription from total RNA or mRNA. Any of the nucleic acids can be used. In the case of the above double-stranded nucleic acid, it can be used more optimally by carrying out denaturing to make it a single strand.
前記逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。
The enzyme used in the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template. For example, avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Rous-related
標的核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージおよびプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。 The target nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. The double-stranded nucleic acid may be used as a nucleic acid sample as it is, or may be amplified with a vector such as a phage and a plasmid.
標的核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま核酸増幅反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、標的核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。 Even if the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, it can be used in the nucleic acid amplification reaction as it is. However, if necessary, denaturing them to make them single-stranded can efficiently anneal the primer to the target nucleic acid. It can be done well. Increasing the temperature to about 95 ° C is a preferred nucleic acid denaturation method. As another method, it is possible to denature by raising the pH, but in this case, it is necessary to lower the pH in order to hybridize the primer to the target nucleic acid.
本明細書において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸をも意味する。 As used herein, “target nucleic acid” or “target nucleic acid sequence” means not only the nucleic acid to be amplified or the sequence itself, but also a complementary sequence or a nucleic acid having the sequence.
また、本明細書において「二本鎖核酸」とは、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。 In the present specification, “double-stranded nucleic acid” means any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, and DNA / RNA.
核酸増幅反応に用いるポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性および耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。 The polymerase used in the nucleic acid amplification reaction only needs to have strand displacement activity (strand displacement ability), and any of normal temperature, intermediate temperature, and heat resistance can be suitably used. Further, this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutation. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Furthermore, it is preferable that the DNA polymerase has substantially no 5 '→ 3' exonuclease activity.
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。 Examples of the DNA polymerase include thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B. st”), Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B. ca”), and the like. Examples thereof include mutants lacking 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity of the derived DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli derived DNA polymerase I, and the like.
ＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、例えば、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｅｒ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。 Examples of the DNA polymerase further include, for example, Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, Deep Vent (Exo-) DNA polymerase, Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase , Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, and Terminator DNA polymerase.
また、上記核酸増幅反応において、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。 In addition, in the nucleic acid amplification reaction, by using a DNA polymerase having reverse transcription activity, for example, BcaBEST DNA polymerase and Bca (exo-) DNA polymerase, a reverse transcription reaction from total RNA or mRNA and cDNA were used as templates. It is possible to perform the DNA polymerase reaction with one kind of polymerase. Moreover, you may use combining DNA polymerase and above-mentioned reverse transcriptases, such as MMLV reverse transcriptase.
核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。 Other reagents used in the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, etc. Can be used. Furthermore, additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, and cation complexes may be used.
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、変化させることができる。したがって、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロールが挙げられる。融解温度調整剤は、一種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。 In the nucleic acid amplification reaction, a melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in order to increase the amplification efficiency of the nucleic acid. The melting temperature (Tm) of a nucleic acid is generally determined by the specific nucleotide sequence of the double stranded portion in the nucleic acid. It can be changed by adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution. Therefore, it becomes possible to adjust the intensity of double strand formation in the nucleic acid under a certain temperature. The melting temperature adjusting agent is not particularly limited, and examples thereof include dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide, or glycerol. A melting temperature adjusting agent may be used individually by 1 type, and may be used in combination of multiple types.
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミンおよび糖類などの、当該技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。 Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, an enzyme stabilizer can be added to the reaction solution. Thereby, since the enzyme in the reaction solution is stabilized, the amplification efficiency of the nucleic acid can be increased. The enzyme stabilizer used in the present invention may be any known in the art, such as glycerol, bovine serum albumin and saccharides, and is not particularly limited.
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの複数種の混合物とする。 Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, a reagent for enhancing the heat resistance of enzymes such as DNA polymerase and reverse transcriptase can be added to the reaction solution as an enzyme stabilizer. As a result, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid synthesis efficiency and amplification efficiency can be increased. Such a reagent may be any known in the art and is not particularly limited, but is preferably a saccharide, more preferably a mono- or oligosaccharide, more preferably trehalose, sorbitol or mannitol, or these A mixture of a plurality of types.
また、核酸増幅反応において、ミスマッチ結合タンパク質を反応溶液中に添加することにより、より正確に変異を検出することが可能となる。ミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩおよびレゾルバーゼなどが挙げられる。 In addition, in a nucleic acid amplification reaction, a mutation can be detected more accurately by adding a mismatch binding protein to the reaction solution. Examples of the mismatch binding protein include MutS, MutH, MutL, HexA, MSH1-6, Rep3, RNaseA, uracil-DNA glycosidase, T4 endonuclease VII, and resolvase.
本発明の方法における核酸増幅反応は、等温で実施する。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。また、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。 The nucleic acid amplification reaction in the method of the present invention is carried out isothermally. Here, “isothermal” refers to maintaining an approximately constant temperature condition such that the enzyme and the primer can substantially function. In addition, “substantially constant temperature condition” means that not only the set temperature is accurately maintained, but also a temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is allowed. To do.
前記一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、当該核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。 The nucleic acid amplification reaction under the constant temperature condition can be carried out by keeping the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained. In the nucleic acid amplification reaction, in order for the primer to anneal to the target nucleic acid, for example, the reaction temperature is preferably set to a temperature near or below the melting temperature (Tm) of the primer, The level of stringency is preferably set in consideration of the melting temperature (Tm) of the primer. Therefore, this temperature is preferably about 20 ° C to about 75 ° C, more preferably about 35 ° C to about 65 ° C.
上記の核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。 In the nucleic acid amplification reaction, the amplification reaction is repeated until the enzyme is deactivated or one of the reagents including the primer is used up.
工程（３）：核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程
工程（３）は、工程（２）の核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程である。当該核酸増幅産物の存在は、自体公知の核酸検出方法により検出が可能である。例えば、工程（２）において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。
Step (3): Step of detecting nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification reaction Step (3) is a step of detecting the nucleic acid amplification product obtained by nucleic acid amplification reaction of step (2). The presence of the nucleic acid amplification product can be detected by a nucleic acid detection method known per se. For example, by using a labeled nucleotide in step (2), it is possible to facilitate detection by incorporating the labeled nucleotide into the amplification product, and to enhance the detection signal using the label. Detection using a method, fluorescence energy transfer, or the like is also possible. Furthermore, by constructing an appropriate detection system, it is possible to automatically detect the target nucleic acid or to quantify the target nucleic acid.
また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に挙げられる。例えば、電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等が挙げられる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に挙げられる。電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。 Moreover, the naked eye detection method by a hybrid chromatography method is also mentioned suitably. For example, a method of detecting a reaction product of a specific size by electrophoresis, detection by hybridization with a probe, and the like can be mentioned. Furthermore, the detection method which combined magnetic beads etc. is also mentioned suitably. For detection by electrophoresis, a fluorescent substance such as ethidium bromide is usually used, but hybridization with a probe may be combined. In addition to labeling with a radioisotope, a probe with a non-radioactive label such as biotin or a fluorescent substance can be used.
本発明の方法は、さらに以下の工程（４）を含むことができる。
工程（４）：工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程
工程（４）は、工程（３）で検出した核酸増幅産物の量を定量し、核酸増幅反応速度を検出する工程である。核酸増幅反応速度は、例えば、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ・Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ・ロシュ社製）等により検出する。
The method of the present invention can further include the following step (4).
Step (4): A step of detecting the nucleic acid amplification reaction rate from the amount of nucleic acid amplification product detected in step (3) Step (4) quantifies the amount of nucleic acid amplification product detected in step (3) and amplifies the nucleic acid. This is a step of detecting the reaction rate. The nucleic acid amplification reaction rate is detected by, for example, a real-time fluorescence detection device (manufactured by Mx3000p / Stratagene and LightCycler / Roche).
本発明の方法では、プライマーの配列と標的塩基配列中の対応する配列とが相補的である場合と、相補的でない場合との間に生じる核酸増幅反応の速度差により１塩基多型を検出することができる。例えば、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、当該変異が核酸試料中に存在しない場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がグアニンである場合）は、当該変異が核酸試料中に存在する場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がアデニンである場合）と比較して、核酸増幅反応速度が低下することとなる。 In the method of the present invention, a single nucleotide polymorphism is detected based on the difference in the speed of the nucleic acid amplification reaction that occurs between when the primer sequence and the corresponding sequence in the target nucleotide sequence are complementary to each other. be able to. For example, when a primer set designed with a target nucleic acid sequence having a target mutation (mutation in which the 75th guanine of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is adenine) as a target nucleic acid sequence is used, the mutation is When it is not present in the nucleic acid sample (when the 75th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is guanine), when the mutation is present in the nucleic acid sample (75th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1). Compared with the case where the second is adenine), the nucleic acid amplification reaction rate is decreased.
また、例えば、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、当該変異が核酸試料中に存在する場合は（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目がアデニンである場合）、当該変異が核酸試料中に存在しない場合（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンである場合）と比較して、核酸増幅反応速度が低下することとなる。 Further, for example, when using a primer set designed as a target nucleic acid sequence nucleic acid sequence that does not have the target mutation (mutation in which the 75th guanine of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is adenine) When the mutation exists in the nucleic acid sample (when the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is adenine), when the mutation does not exist in the nucleic acid sample (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) In the case of the 75th guanine), the nucleic acid amplification reaction rate is reduced.
本発明の方法は、さらに以下の工程（５）を含むことができる。
工程（５）：配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示されるＶＫＯＲＣ１遺伝子の第７５番目の一塩基多型を検出する工程
The method of the present invention can further include the following step (5).
Step (5): At the 75th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, the base sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′) and the nucleotide sequence of the nucleic acid sample are complementary and non-complementary, the difference in the speed of the nucleic acid amplification reaction caused by the difference between the nucleotide sequence of the nucleic acid sample and the nucleotide sequence of the VKORC1 gene shown in SEQ ID NO: 1 or Process for detecting single nucleotide polymorphism
ここで、核酸増幅反応速度の速度差は、例えば、核酸増幅産物が得られるまでの時間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは１０分以上遅れる場合に、核酸増幅反応速度の速度差があり、核酸増幅反応速度が低下したとする。 Here, the speed difference of the nucleic acid amplification reaction rate is, for example, a difference in the speed of the nucleic acid amplification reaction rate when the time until the nucleic acid amplification product is obtained is preferably 30 minutes or more, more preferably 10 minutes or more. Assume that the nucleic acid amplification reaction rate has decreased.
具体的には、例えば、同一の検体からの核酸試料を鋳型とした場合に、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度と比較して、当該変異を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度が低下している場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在すると判定することができる。 Specifically, for example, when a nucleic acid sample from the same specimen is used as a template, it has a target mutation (mutation in which the 75th guanine of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is adenine). Compared to the speed of nucleic acid amplification reaction using a primer set designed with a nucleic acid sequence as a target nucleic acid sequence, the speed of nucleic acid amplification reaction using a primer set designed with a target nucleic acid sequence as a target nucleic acid sequence is reduced. If it is, it can be determined that the mutation is present in the nucleic acid sample from the specimen.
また、例えば、同一の検体からの核酸試料を鋳型とした場合に、目的とする変異（配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度と比較して、当該変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた核酸増幅反応の速度が低下している場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在しないと判定することができる。 Further, for example, when a nucleic acid sample from the same specimen is used as a template, the nucleic acid sequence does not have the target mutation (mutation in which the 75th guanine of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is adenine) Compared to the speed of nucleic acid amplification reaction using a primer set designed as a target nucleic acid sequence, the speed of nucleic acid amplification reaction using a primer set designed as a target nucleic acid sequence is reduced. In this case, it can be determined that the mutation does not exist in the nucleic acid sample from the specimen.
本発明の方法はさらに以下の工程（６）〜（８）を含むことができる。
工程（６）：配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
工程（７）：工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
工程（８）：工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。
The method of the present invention can further include the following steps (6) to (8).
Step (6): The nucleotide sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 ) And the nucleotide sequence of the nucleic acid sample are complementary, and the nucleic acid amplification reaction rate is a reference rate, and the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) is compared with the reference rate.
Step (7): When the nucleic acid amplification reaction rate detected in Step (4) is lower than the reference rate, at the 75th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, the (a1) or ( A step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide of a2) and the base sequence of the nucleic acid sample are not complementary.
Step (8): When the nucleic acid amplification reaction rate detected in Step (4) is not lower than the reference rate, at the 75th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14, the (a1) or ( a step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide of a2) is complementary to the base sequence of the nucleic acid sample.
ここで、基準速度以下とは、例えば、配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または（Ｙ２’）と核酸試料の塩基配列とが相補的である場合の核酸増幅反応速度と比較して、核酸増幅産物が得られるまでの時間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは１０分以上遅れる場合に、基準速度以下とする。 Here, the reference speed or lower is, for example, the base sequence (Y 1 ′) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14. Or, compared to the nucleic acid amplification reaction rate when (Y 2 ′) and the base sequence of the nucleic acid sample are complementary, the time until the nucleic acid amplification product is obtained is preferably 30 minutes or more, more preferably 10 If it is delayed more than a minute, it will be below the reference speed.
具体的には、例えば、目的とする変異（例えば、配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンになっている変異）を有しない核酸配列を標的核酸配列として設計したプライマーセットを用いた場合、あらかじめ塩基配列を同定した当該変異を有しない核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度を基準速度とする。そして、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較する［工程（６）］。 Specifically, for example, a nucleic acid sequence that does not have a target mutation (for example, a mutation in which the 75th guanine of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 is adenine) is a target nucleic acid sequence When the primer set designed as follows is used, the nucleic acid amplification reaction rate when the nucleic acid sample having no mutation and having the base sequence identified in advance as a template is used as a reference rate. Then, the nucleic acid amplification reaction rate when the nucleic acid sample from the specimen detected in step (4) is used as a template is compared with the reference rate [step (6)].
そして、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較した結果、当該核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在すると判定することができる［工程（７）］。 Then, when the nucleic acid amplification reaction rate when the nucleic acid sample from the specimen detected in step (4) is used as a template and the reference speed is lower than the reference speed, the nucleic acid sample from the specimen is Can be determined to have the mutation [step (7)].
また、工程（４）で検出した検体からの核酸試料を鋳型とした場合の核酸増幅反応速度と基準速度を比較した結果、当該核酸増幅反応速度が基準速度以下とならず、同程度の反応速度である場合、検体からの核酸試料には当該変異が存在しないと判定することができる［工程（８）］。 Moreover, as a result of comparing the nucleic acid amplification reaction rate when the nucleic acid sample from the specimen detected in step (4) was used as a template, the nucleic acid amplification reaction rate was not lower than the reference rate, and the reaction rate was comparable. If it is, it can be determined that the mutation does not exist in the nucleic acid sample from the specimen [step (8)].
本発明の方法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。該キットは、本発明のプライマーセットを含む。また、該キットは、好ましくは少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種の鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに、該キットは、融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤、緩衝液、ミスマッチ結合タンパク質などの試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。 In order to carry out the method of the present invention, necessary reagents can be combined into a kit. The kit includes the primer set of the present invention. The kit preferably contains at least one deoxynucleoside triphosphate and at least one strand-displacement DNA polymerase. Further, the kit may contain a melting temperature adjusting agent, the above-mentioned enzyme stabilizer, a buffer, reagents such as a mismatch binding protein, a reaction vessel, instructions and the like.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。また、以下、実施例において、ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）とは、配列番号１に示される塩基配列の第７５番目のグアニンがアデニンに変化した１塩基多型を示す。ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）は、配列番号１に示される塩基配列（第７５番目の塩基がグアニン）を含む塩基配列を示す。ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）は、配列番号１４に示される塩基配列（第７５番目の塩基がアデニン）を含む塩基配列を示す。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples. In the following examples, VKORC1 (75G → A) represents a single nucleotide polymorphism in which the 75th guanine of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is changed to adenine. VKORC1 (75G) represents a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the 75th base is guanine). VKORC1 (75A) represents a base sequence including the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 (the 75th base is adenine).
＜実施例１＞
ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出
（１）核酸試料液の調製
すでに遺伝子配列がＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）またはＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）であると同定されているヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ３０ｎｇを１μｌの精製水に溶解し、９８℃にて３分間加熱して１本鎖にした後、核酸試料液として用いた。
<Example 1>
Detection of single nucleotide polymorphism of VKORC1 (75G → A) (1) Preparation of nucleic acid sample solution 30 ng of genomic DNA extracted from human blood whose gene sequence has already been identified as VKORC1 (75G) or VKORC1 (75A) After dissolving in 1 μl of purified water and heating at 98 ° C. for 3 minutes to make a single strand, it was used as a nucleic acid sample solution.
（２）核酸増幅反応
上記（１）で調製した核酸試料液および表１に示す組み合わせの各プライマーセットを用いて、核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、６０℃にて４０分間反応させて増幅反応を実施した。また、酵素は、ＮＥＢ社のＢｓｔ．ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。
(2) Nucleic acid amplification reaction The nucleic acid amplification reaction was performed using the nucleic acid sample solution prepared in (1) above and each primer set of the combinations shown in Table 1. The nucleic acid amplification reaction was carried out at 60 ° C. for 40 minutes to carry out the amplification reaction. In addition, the enzyme is manufactured by NEB Bst. DNA polymerase was used.
（各プライマーの配列）
〔Ｐ１〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）検出用］
５’−ACCCGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号７）
〔Ｐ２〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）検出用］
５’−ACCTGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号８）
〔Ｐ３〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ）検出用］
５’−CGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号９）
〔Ｐ４〕［検出用プライマー：ＶＫＯＲＣ１（７５Ａ）検出用］
５’−TGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA−３’（配列番号１０）
〔Ｐ５〕
５’−GGTATATATATATACCCACCCACCTCGGCCTC−３’（配列番号１１）
〔Ｐ６〕
５’−GTTTTTCAGGTCTTCT−３’（配列番号１２）
(Each primer sequence)
[P1] [Detection primer: VKORC1 (75G) detection]
5′-ACCCGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
[P2] [Detection primer: VKORC1 (75A) detection]
5′-ACCTGGCCAATTCTGGGAAGTCAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
[P3] [Detection primer: VKORC1 (75G) detection]
5′-CGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
[P4] [Primer for detection: VKORC1 (75A) for detection]
5′-TGGCCAATGGTTCTGGGAAGTCAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
[P5]
5′-GGTATATATATATACCCACCCACCTCGGCCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
[P6]
5′-GTTTTTCAGGTCTTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
なお、〔Ｐ１〕は、配列番号３の第２番目から第１２番目の配列と、配列番号２の第１６番目から第３１番目の配列とからなるものである。〔Ｐ２〕は、配列番号１３の第２番目から第１２番目の配列と、配列番号２の第１６番目から第３１番目の配列とからなるものである。それぞれ（ａ１）、（ａ２）のオリゴヌクレオチドに相当する。
〔Ｐ１〕、〔Ｐ２〕は配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基を、配列の５’末端から４塩基目で認識するプライマーであり、〔Ｐ３〕、〔Ｐ４〕は配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の塩基を、配列の５’末端で認識するプライマーである。すなわち、〔Ｐ３〕は５’末端にシトシン、〔Ｐ４〕は５’末端にチミンを有する。
〔Ｐ５〕は、配列番号４の第２２番目から第３７番目の配列を含むプライマーであり、〔Ｐ６〕は、配列番号５の第６番目から第２１番目の配列を含むプライマーである。それぞれ（ｂ）、（ｃ）のオリゴヌクレオチドに相当する。
[P1] is composed of the 2nd to 12th sequences of SEQ ID NO: 3 and the 16th to 31st sequences of SEQ ID NO: 2. [P2] consists of the 2nd to 12th sequences of SEQ ID NO: 13 and the 16th to 31st sequences of SEQ ID NO: 2. These correspond to the oligonucleotides (a1) and (a2), respectively.
[P1] and [P2] are primers that recognize the 75th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 at the fourth base from the 5 ′ end of the sequence, and [P3], [P4 ] Is a primer that recognizes the 75th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 at the 5 'end of the sequence. That is, [P3] has cytosine at the 5 ′ end and [P4] has thymine at the 5 ′ end.
[P5] is a primer containing the 22nd to 37th sequences of SEQ ID NO: 4, and [P6] is a primer containing the 6th to 21st sequences of SEQ ID NO: 5. These correspond to the oligonucleotides (b) and (c), respectively.
（反応液の組成）
１０×Ｂｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(ＤＦ) ２．５μＬ
１００ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μＬ
１０％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０ ０．２５μＬ
１００％ ＤＭＳＯ １．２５μＬ
２５ｍＭ 各ｄＮＴＰ １．４μＬ
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（２０００倍） ０．５μＬ
１００μＭ〔Ｐ１〜４のいずれか〕 ０．８８μＬ
１００μＭ〔Ｐ５〕 ０．８８μＬ
１００μＭ〔Ｐ６〕 ０．４４μＬ
Ｂｓｔ.Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０μＬ
１）で得た核酸試料液(３０ｎｇ) １．０μＬ
精製水 １２．４μＬ
合計 ２５．０μＬ
(Composition of reaction solution)
10 x Bst Buffer (DF) 2.5μL
100 mM MgSO 4 1.5 μL
10% (v / v)
100% DMSO 1.25 μL
25 mM each dNTP 1.4 μL
SYBR GreenI (2000 times) 0.5μL
100 μM [any of P1 to P4] 0.88 μL
100 μM [P5] 0.88 μL
100 μM [P6] 0.44 μL
Bst. Polymerase 1.0 μL
Nucleic acid sample solution (30 ng) obtained in 1) 1.0 μL
Purified water 12.4 μL
Total 25.0μL
（３）ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出
前記（２）における核酸増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて検出した。その結果を図３および４に示す。
図３および４から分かるように、蛍光値の増幅より核酸増幅反応が起きていることが分かった。また、核酸試料の配列と検出用プライマーの配列が相補的でない場合［増幅サンプル２）、３）］は相補的である場合［増幅サンプル１）、４）］と比較して核酸増幅反応速度が低下していることが分かった。すなわち、より核酸増幅反応速度が早い検出用プライマーの種類から、検体からの核酸試料における塩基配列の第７５番目の１塩基多型が判別できることが分かった。
(3) Detection of single nucleotide polymorphism of VKORC1 (75G → A) The nucleic acid amplification reaction in (2) above was detected using a real-time fluorescence detector (Mx3000p, manufactured by Stratagene). The results are shown in FIGS.
As can be seen from FIGS. 3 and 4, it was found that the nucleic acid amplification reaction occurred from the amplification of the fluorescence value. Further, when the sequence of the nucleic acid sample and the sequence of the detection primer are not complementary [amplification sample 2), 3)], the nucleic acid amplification reaction rate is higher than when the amplification is complementary [amplification sample 1), 4)]. It turns out that it is decreasing. That is, it was found that the 75th single nucleotide polymorphism of the base sequence in the nucleic acid sample from the specimen can be discriminated from the kind of detection primer having a faster nucleic acid amplification reaction rate.
＜実施例２＞
ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出におけるプライマー配列上の１塩基多型認識部位の位置の効果
（１）核酸試料液の調製
実施例１と同じ核酸試料を用いた。
（２）核酸増幅反応
実施例１と同じ条件で、表２に示す組み合わせの各プライマーと検体を用いて核酸増幅反応を行った。
<Example 2>
Effect of position of single nucleotide polymorphism recognition site on primer sequence in detection of single nucleotide polymorphism of VKORC1 (75G → A) (1) Preparation of nucleic acid sample solution The same nucleic acid sample as in Example 1 was used.
(2) Nucleic Acid Amplification Reaction Under the same conditions as in Example 1, a nucleic acid amplification reaction was performed using each primer and sample in the combinations shown in Table 2.
３）ＶＫＯＲＣ１（７５Ｇ→Ａ）の１塩基多型の検出におけるプライマー配列上の１塩基多型認識部位の位置の効果
前記（２）における核酸増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて検出した。その結果を図３および５に示す。
ここでＭｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、図３および５において蛍光量が２５０に到達したときの時間（Ｃｔ値）を算出した。
3) Effect of position of single nucleotide polymorphism recognition site on primer sequence in detection of single nucleotide polymorphism of VKORC1 (75G → A) The nucleic acid amplification reaction in (2) above was performed using a real-time fluorescence detector (Mx3000p, manufactured by Stratagene) ). The results are shown in FIGS.
Here, using the Mx3000p analysis software, the time (Ct value) when the fluorescence amount reached 250 in FIGS. 3 and 5 was calculated.
表３から分かるとおり、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列上の第７５番目の塩基を配列の５’末端から４塩基目で認識するプライマーである〔Ｐ１〕、〔Ｐ２〕を使った場合の方が、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列上の第７５番目の塩基を配列の５’末端で認識するプライマーである〔Ｐ３〕、〔Ｐ４〕を使った場合と比べてより大きなＣｔ値差になっていることが分かる。
これらのことから、本発明の方法によれば、目的としている１塩基多型の周辺配列にＧＣが連続している配列であってもその１塩基多型の識別が行えることがわかった。
As can be seen from Table 3, primers [P1] and [P2] are used to recognize the 75th base on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 at the 4th base from the 5 ′ end of the sequence. Compared to the case of using [P3] and [P4], which are primers that recognize the 75th base on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 at the 5 ′ end of the sequence. It can be seen that the Ct value difference is larger.
From these results, it was found that according to the method of the present invention, the single nucleotide polymorphism can be identified even if the GC is continuous with the peripheral sequence of the target single nucleotide polymorphism.
Claims (15)
（１）以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。 A method for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing included in the VKORC1 gene sequence, comprising the following steps (1) to (3): A method characterized by comprising.
(1) The following oligonucleotides (a1) and (b) are included, and a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be amplified under isothermal conditions, A step of preparing a primer set for detecting a single nucleotide polymorphism.
(A1) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
A base sequence existing on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 1 ′) having a fifth base (cytosine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(2) A step of subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction with the primer set under isothermal conditions.
(3) A step of detecting a nucleic acid amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction.
（１）以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、前記一塩基多型を検出するためのプライマーセットを用意する工程。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。
（２）核酸試料に対して前記プライマーセットによる核酸増幅反応を等温下で行う工程。
（３）前記核酸増幅反応で得られた核酸増幅産物を検出する工程。 A method for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing included in the VKORC1 gene sequence, comprising the following steps (1) to (3): A method characterized by comprising.
(1) The following oligonucleotides (a2) and (b) are included, and a region containing the 50th to 80th nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 can be amplified under isothermal conditions, A step of preparing a primer set for detecting a single nucleotide polymorphism.
(A2) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 2 ′) having a fifth base (thymine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(2) A step of subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction with the primer set under isothermal conditions.
(3) A step of detecting a nucleic acid amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction.
（４）工程（３）で検出した核酸増幅産物の量から核酸増幅反応速度を検出する工程 The method according to any one of claims 1 to 7, further comprising the following step (4).
(4) A step of detecting the nucleic acid amplification reaction rate from the amount of the nucleic acid amplification product detected in step (3).
（５）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合と相補的でない場合とに生じる核酸増幅反応の速度差により、配列番号１または配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目の一塩基多型を検出する工程。 The method according to claim 8, further comprising the following step (5).
(5) The nucleotide sequence (Y 1 ′) or nucleotide sequence (Y 2 ) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 ') And the nucleotide sequence of the nucleic acid sample, the difference in the speed of the nucleic acid amplification reaction that occurs when the nucleic acid sample is complementary and when it is not complementary, the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 Detecting a single nucleotide polymorphism.
（６）前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的である場合の核酸増幅反応速度を基準速度とし、工程（４）で検出した核酸増幅反応速度と基準速度とを比較する工程。
（７）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下となる場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的でないと判定する工程。
（８）工程（４）で検出した核酸増幅反応速度が基準速度以下とならない場合、前記配列番号１または前記配列番号１４に示される塩基配列の第７５番目において、前記（ａ１）または（ａ２）のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基配列（Ｙ１’）または塩基配列（Ｙ２’）と、核酸試料の塩基配列とが、相補的であると判定する工程。 The method according to claim 9, further comprising the following steps (6) to (8).
(6) The nucleotide sequence (Y 1 ′) or nucleotide sequence (Y 2 ) contained in the oligonucleotide (a1) or (a2) at the 75th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of comparing the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) with the reference rate, using the nucleic acid amplification reaction rate when the base sequence of the nucleic acid sample is complementary to the reference rate.
(7) When the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) is lower than the reference rate, the (a1) or (a2) in the 75th base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or base sequence (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide is not complementary to the base sequence of the nucleic acid sample.
(8) When the nucleic acid amplification reaction rate detected in step (4) is not lower than the reference rate, the (a1) or (a2) above in the 75th base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 A step of determining that the base sequence (Y 1 ′) or base sequence (Y 2 ′) contained in the oligonucleotide is complementary to the base sequence of the nucleic acid sample.
以下の（ａ１）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ１）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、配列番号３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（シトシン）を、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に有する塩基配列（Ｙ１’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。 A primer set for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, contained in the VKORC1 gene sequence,
A primer set comprising the following oligonucleotides (a1) and (b), wherein a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be amplified under isothermal conditions.
(A1) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and 5 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 1 ′) having a fifth base from the end (cytosine) at any position of the second to fifth bases from the 5 ′ end.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
以下の（ａ２）および（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含み、前記配列番号１４に示される塩基配列の第５０番目〜第８０番目の塩基配列を含む領域を等温下で増幅しうる、プライマーセット。
（ａ２）配列番号２に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含む塩基配列（Ｘｃ’）と、
前記塩基配列（Ｘｃ’）の５’側に存在する塩基配列であって、配列番号１３に示される塩基配列のうち連続する８塩基から１２塩基を含み、５’末端から２〜５塩基目のいずれかの位置に、配列番号１３に示される塩基配列の５’末端から５番目の塩基（チミン）を有する塩基配列（Ｙ２’）と、を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１５塩基を含むオリゴヌクレオチド。 A primer set for detecting the 75th single nucleotide polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 14 in the sequence listing, contained in the VKORC1 gene sequence,
A primer set comprising the following oligonucleotides (a2) and (b) and capable of amplifying a region containing the 50th to 80th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 under isothermal conditions.
(A2) a base sequence (Xc ′) comprising at least 15 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
A base sequence present on the 5 ′ side of the base sequence (Xc ′), comprising 8 to 12 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the 2nd to 5th bases from the 5 ′ end An oligonucleotide comprising a base sequence (Y 2 ′) having a fifth base (thymine) from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 at any position.
(B) an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
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