JP2024070748A - Non-genomic antiviral oligonucleotides - Google Patents
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Abstract
【課題】複数種のRNAウイルスの感染細胞に働き抗ウイルス効果を示し、また、耐性ウイルスが出現しにくい抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬理学的組成物を提供する。【解決手段】ＲＮＡゲノムを持つウイルスのゲノムＲＮＡとヌクレオキャプシドタンパク質の結合を阻害するゲノム配列に存在しないオリゴヌクレオチドであって、ウイルス粒子及び／あるいはウイルス感染細胞においてウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬学的組成物を用いる。【選択図】なし[Problem] To provide an antiviral oligonucleotide and a pharmacological composition thereof that act on cells infected with multiple types of RNA viruses, exhibiting an antiviral effect and preventing the emergence of resistant viruses. [Solution] An antiviral oligonucleotide and a pharmaceutical composition thereof are used, which are oligonucleotides that are not present in the genome sequence of a virus having an RNA genome and inhibit the binding of the genomic RNA and nucleocapsid protein of the virus, and which suppress the proliferation of the virus in virus particles and/or virus-infected cells. [Selected Figure] None
Description
本発明は、ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に作用しウイルスの増殖を阻害する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド、並びにヒト及び動物のウイルスにより起きるウイルス感染、および病因がウイルスに基づくその他の疾患における治療剤としての該抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとその使用に関する。 The present invention relates to antiviral oligonucleotides that act on viruses and/or virus-infected cells to inhibit viral proliferation, and to the use of said antiviral oligonucleotides as therapeutic agents for viral infections caused by human and animal viruses and other diseases whose etiology is viral.
以下の議論は、単に読者の理解を助けるために提供されるのであって、議論された情報又は引用された文献のいかなるものも本発明の先行技術を構成することを容認するものではない。 The following discussion is provided solely to aid the reader's understanding and is not an admission that any of the information discussed or documents cited constitute prior art to the present invention.
有史以来世界の人々を苦しめてきた痘瘡の根絶が１９７７年に宣言され、「ウイルス感染症は克服できるもの」と認識された時期があった。しかし、エボラウイルス病、新型インフルエンザ、新型コロナウイルス感染症など新たな感染症が次々見いだされ人類を苦しめている。ヒトに病気を起こす新たな感染症の多くは自然界の動物より派生する人獣共通感染症である。 The eradication of smallpox, which had afflicted people around the world since recorded history, was declared in 1977, and there was a time when it was thought that viral infectious diseases could be overcome. However, new infectious diseases such as Ebola virus disease, new strains of influenza, and COVID-19 continue to be discovered one after another, causing suffering to humanity. Many of the new infectious diseases that cause illness in humans are zoonoses that originated from animals in the natural world.
インフルエンザＡ型ウイルスは、８本の分節に分かれたゲノムをもち、ヒト、ブタ、トリに感染する。複数の異なった型のインフルエンザＡウイルスがブタの気道上皮細胞に同時感染したときに、分節ゲノムの組み換えを起こす。さらに変異を繰り返す過程で、ヒトに感染しさらにヒトからヒトへの感染が成立した場合に、人類がこれまで経験したことがない（免疫を持たない）新型インフルエンザウイルスの発生とその感染拡大につながると考えられている。 Influenza A viruses have a genome divided into eight segments and infect humans, pigs, and chickens. When multiple different types of influenza A viruses simultaneously infect the respiratory epithelial cells of a pig, the segmented genomes recombine. If, through the process of repeated mutations, the virus infects humans and then spreads from person to person, it is believed that this will lead to the emergence of a new type of influenza virus that humans have never experienced before (to which humans have no immunity) and the spread of this infection.
コロナウイルスは多くの動物に固有のウイルスが存在する。ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）としてはＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ‐ＯＣ４３、ＨＣｏＶ‐ＮＬ６３、ＨＣｏＶ‐ＨＫＵ１が存在し通常の風邪の１０～１５％（流行期３５％）の原因となる。これら風邪のコロナウイルスに加えて、重症肺炎を起こす重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を起こすＳＡＲＳコロナウイルス（２００２年）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の原因となるＭＥＲＳコロナウイルス（２０１２年）、新型コロナウイルス(ＳＡＲＳコロナウイルス２型、２０１９年)が発生した。ＳＡＲＳのり患者は８０９６人で９．７％の致死率と高いが1年足らずで収束した。一方ＭＥＲＳは２２５００名以上のり患者で致死率は３５％と高く感染は継続している。新型コロナウイルス感染症は発生後４年が経過し約６億３千万人以上がり患し６６０万人が犠牲になっており、この新感染症が医療の混乱をはじめ感染対策による社会経済活動の停滞と混乱の原因となっている。これらのコロナウイルスのほとんどは、もともとはコウモリが持つコロナウイルスに由来し、ヒトに感染するようになったと考えられている（非特許文献１）。
Coronaviruses exist in many animals and are endemic to many animals. Human coronaviruses (HCoVs) include HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, and HCoV-HKU1, which are responsible for 10-15% of common colds (35% during epidemics). In addition to these cold coronaviruses, SARS coronavirus (2002), which causes severe acute respiratory syndrome (SARS), which causes severe pneumonia, MERS coronavirus (2012), which causes Middle East Respiratory Syndrome (MERS), and the new coronavirus (
これらの状況から考えて、今後も新型インフルエンザや新型コロナウイルス感染症などの新感染症の発生を防ぐのは難しく、発生時に対応するための有効な予防法および治療法の開発が求められる。 Given these circumstances, it will be difficult to prevent the outbreak of new infectious diseases such as novel influenza and COVID-19 in the future, and there is a need to develop effective prevention and treatment methods to respond when an outbreak occurs.
これまでに人類が唯一根絶に成功した感染症は痘瘡である。痘瘡は痘瘡ウイルスの接触、飛沫感染により起こる。感染者を早期に発見して隔離治療をするとともに、広くワクチン接種（種痘）を施したことによる。自然界で痘瘡ウイルスにり患する動物はヒトのみで、痘瘡にり患すると症状が現れること、痘瘡ワクチン接種による感染防御の有効性は高いことが理由で１９８０年に根絶することに成功した。 The only infectious disease that humanity has succeeded in eradicating so far is smallpox. Smallpox is caused by contact and droplet infection of the smallpox virus. This was made possible by early detection of infected individuals, isolation and treatment, as well as widespread vaccination (smallpox vaccination). Humans are the only animals that can contract the smallpox virus in the wild, and because symptoms appear when infected with smallpox and because the smallpox vaccination is highly effective in preventing infection, it was successfully eradicated in 1980.
一方で新型インフルエンザや新型コロナウイルス感染症は、自然界のヒト以外の動物よりその派生する人獣共通感染症ためにその発生を防ぐことは難しい。また、これらの感染症は感染しても症状が出ない場合や発症前の数日の期間（潜伏期）の人の移動が感染拡大の要因となっている。 On the other hand, it is difficult to prevent the outbreak of new strains of influenza and COVID-19, as these are zoonotic diseases that originate from animals other than humans in the natural world. In addition, the spread of these infections is due to the movement of people when they are infected but do not show symptoms, or during the incubation period of several days before symptoms appear.
新型コロナウイルス感染症の発生で実用化されたｍＲＮＡワクチンは感染予防効果、重症化を防ぐ効果を示してその有効性が認められている（非特許文献２）。しかし、新型コロナウイルスに対する感染予防効果を示す免疫は数カ月で減弱する。さらにウイルスのゲノムの変異が積み重なり、抗原性を担うＳタンパク質の抗原性が変化し人の免疫から逃れた変異株が発生し、それによる度重なる流行を繰り返した（非特許文献３）。そのため、感染症の流行の抑制には有効なワクチンと共に抗ウイルス薬の実用化が好ましい。 The mRNA vaccine, which was put into practical use following the outbreak of COVID-19, has been shown to be effective in preventing infection and preventing the disease from becoming severe, and its effectiveness has been recognized (Non-Patent Document 2). However, the immunity that prevents infection against the new coronavirus weakens within a few months. Furthermore, as mutations in the virus genome accumulate, the antigenicity of the S protein, which is responsible for antigenicity, changes, resulting in the development of mutant strains that escape human immunity, which have caused repeated epidemics (Non-Patent Document 3). For this reason, it is preferable to put into practical use antiviral drugs along with effective vaccines in order to suppress the spread of infectious diseases.
新型インフルエンザではないインフルエンザ、いわゆる季節性インフルエンザは毎年流行を繰り返し、世界で毎年３～５約万人がり患し２９～６５万人が呼吸器死すると見積もられている感染症である（非特許文献４）。地球上のどこかで流行し、変異を繰り返すことで抗原性を変えながら流行地を変えていく。したがって年ごとに流行する可能性のある抗原型を予測して、それに合わせたワクチンを用意するという計画的な施策がなされている。また、ワクチンの有効性も数か月で減弱することからその予防には毎年の接種が求められる。 Influenza that is not a new type of influenza, i.e. so-called seasonal influenza, is an infectious disease that repeats epidemics every year, and is estimated to affect approximately 30,000 to 50,000 people worldwide each year, with 290,000 to 650,000 respiratory deaths (Non-Patent Document 4). It spreads somewhere on the planet, and by repeatedly mutating, it changes its antigenicity and moves to different epidemic locations. Therefore, planned measures are taken to predict the antigenic types that are likely to spread each year and prepare vaccines that match them. In addition, the effectiveness of the vaccine weakens after a few months, so annual vaccination is required to prevent it.
インフルエンザ、新型インフルエンザおよび新型コロナウイルス感染症の重症化を防ぐためには、ワクチン接種による予防に加えて、感染時にウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス薬が有効である。 In order to prevent influenza, new influenza, and COVID-19 from becoming severe, in addition to prevention through vaccination, antiviral drugs that suppress the proliferation of the virus during infection are effective.
抗ウイルス薬はウイルスタンパク質の構造に特異的に作用してその活性を阻害する。これまでに、ウイルスの増殖に機能する数種類のタンパク質をターゲットに、それぞれ特異的な数種類の抗ウイルス薬が開発されているが、これらウイルスタンパク質はウイルスごとに異なった立体構造を持つことから、対象となるウイルスタンパク質ごとに開発することが望ましい。 Antiviral drugs act specifically on the structure of viral proteins to inhibit their activity. To date, several specific antiviral drugs have been developed targeting several proteins that function in viral proliferation, but because these viral proteins have different three-dimensional structures for each virus, it is desirable to develop drugs for each target viral protein.
ウイルスタンパク質に特異的に作用する化合物は、ウイルスの変異によるウイルスタンパク質の構造変化でその有効性が低下することがある（非特許文献５）。ウイルスの感染拡大に伴って、そのウイルスに有効な特定の抗ウイルス薬が多用されると、ウイルスゲノムの変異によりその抗ウイルス薬の結合部位が変化して耐性化することがある。 The effectiveness of compounds that act specifically on viral proteins can be reduced by structural changes in the viral proteins caused by viral mutations (Non-Patent Document 5). If a specific antiviral drug that is effective against that virus is used frequently as the infection spreads, mutations in the viral genome can change the binding site of the antiviral drug, resulting in resistance.
これまでに、耐性ウイルスが広がりその使用ができなくなった抗インフルエンザ薬が知られている。インフルエンザＡ型ウイルスが細胞に侵入しウイルス粒子からゲノムＲＮＡを細胞内に放出する「脱殻」の段階を阻害するアマンタジンが使用されたが、アマンタジン耐性化ウイルスの拡大により使用ができなくなっている。また、ウイルスの出芽に機能するノイラミニダーゼを阻害するタミフルに対する耐性ウイルスも出現し拡大した（非特許文献６）。さらにｍＲＮＡ合成の段階を阻害する新規抗インフルエンザ薬のゾフルーザの耐性ウイルスの出現も指摘されている（非特許文献７）。 To date, there are known anti-influenza drugs that have become unusable due to the spread of resistant viruses. Amantadine was used to inhibit the "uncoating" stage, in which influenza A viruses invade cells and release genomic RNA from the virus particles into the cells, but it has become unusable due to the spread of amantadine-resistant viruses. In addition, viruses resistant to Tamiflu, which inhibits neuraminidase, which functions in viral budding, have also appeared and spread (Non-Patent Document 6). Furthermore, the emergence of viruses resistant to Xofluza, a new anti-influenza drug that inhibits the mRNA synthesis stage, has also been noted (Non-Patent Document 7).
抗インフルエンザ薬でヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）に結合してその機能を阻害するＮｕｃｌｅｏｚｉｎが開発された（非特許文献８）。これはゲノムＲＮＡとＮＰが結合して形成されるｖＲＮＰの形成阻害やｖＲＮＰ細胞内輸送を阻害しウイルスの増殖を阻害する。一方、ＮＰのＹ２８９Ｈ変異はＮｕｃｌｅｏｚｉｎに抵抗性を示す（非特許文献９）。 Nucleozin has been developed as an anti-influenza drug that binds to the nucleocapsid protein (NP) and inhibits its function (Non-Patent Document 8). This inhibits the formation of vRNP, which is formed when genomic RNA binds to NP, and inhibits the intracellular transport of vRNP, thereby inhibiting viral proliferation. On the other hand, the Y289H mutation in NP is resistant to Nucleozin (Non-Patent Document 9).
以上のように、ウイルスは感染拡大に伴い感染宿主の免疫や使用された抗ウイルス薬から逃れる変異を繰り返し流行するため、当該抗ウイルス薬に抵抗性を獲得したウイルスが感染拡大する傾向がある。また、新たな感染症に備えるため広いウイルス種およびウイルスの変異に抵抗性がある抗ウイルス薬を創出することが好ましい。 As described above, as the infection spreads, viruses repeatedly mutate to escape the immunity of the infected host or the antiviral drugs used, and so viruses that have acquired resistance to the antiviral drugs tend to spread. In addition, it is preferable to create antiviral drugs that are resistant to a wide range of virus species and viral mutations in order to prepare for new infectious diseases.
核酸医薬としてアンチセンス核酸（ＡＳＯ）はターゲットＲＮＡに相補的なおよそ２１ヌクレオチド長の配列である。このＡＳＯが細胞内で相補的なｍＲＮＡとハイブリダイズして細胞内の酵素によりそのｍＲＮＡの分解を促し遺伝子発現を抑制する。 As a nucleic acid drug, antisense nucleic acid (ASO) is a sequence of approximately 21 nucleotides in length that is complementary to the target RNA. This ASO hybridizes with complementary mRNA within the cell, promoting the degradation of that mRNA by intracellular enzymes and suppressing gene expression.
ＡＳＯ医薬としてＲＳウイルス感染症の治療を目的に開発されたＡＬＮ－ＲＳＶ０１はＲＳウイルス感染を抑制し（非特許文献１０、１１）、経鼻投与による臨床試験も良好な結果が得られている（非特許文献１２）。ＡＳＯの効果は配列特異性があるためウイルスごとに配列を選択することが望ましい。さらに、ウイルスが変異しにくい配列を選択するなど、ウイルスの変異によるＡＳＯの効果の減弱を防ぐことが望まれる。
ALN-RSV01, developed as an ASO drug for the treatment of respiratory syncytial virus infection, inhibits respiratory syncytial virus infection (Non-Patent
特許第５５１４１７９号においては、配列番号２３（ＲＥＰ ２０５５）は ＡおよびＣが２０回繰り返した４０塩基長でありそのすべての連結がホスホロチオエート化したヌクレオチドポリマーが抗ウイルスオリゴヌクレオチドとしてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の増殖を抑制することが示された。ＲＥＰ２１３９はＲＥＰ ２１５５に５′メチルシトシン及び２′Ｏ－メチルリボースの修飾を加えたヌクレオチドポリマーであるが、これはＨＢＶ感染細胞内のウイルス複製（ＨＢＶ ＤＮＡ、ＲＮＡの合成）及びＨＢＶの細胞からの放出は阻害しないが、ＨＢｓ抗原の放出を阻害することが明らかとなった。特許第５７９６０２４号では少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化された２０及び１２０ヌクレオチド長の抗ウイルス性ヌクレオチドポリマーが、インフルエンザウイルスおよびコロナウイルスを含む各種ウイルスに対して抗ウイルス性を示す。前述したＨＢＶの結果から、これらのヌクレオチドポリマーは細胞外でウイルスの放出を阻害する効果があると予想される。 In Japanese Patent No. 5,514,179, it was shown that SEQ ID NO:23 (REP 2055) is a 40-base long nucleotide polymer with 20 repeats of A and C, all of which are phosphorothioated, and acts as an antiviral oligonucleotide to inhibit the proliferation of hepatitis B virus (HBV). REP2139 is a nucleotide polymer in which REP 2155 is modified with 5' methylcytosine and 2' O-methylribose, and it has been revealed that this does not inhibit viral replication (synthesis of HBV DNA and RNA) in HBV-infected cells or release of HBV from the cells, but inhibits the release of HBs antigen. In Japanese Patent No. 5,796,024, at least one fully phosphorothioated antiviral nucleotide polymer of 20 and 120 nucleotides shows antiviral activity against various viruses, including influenza virus and coronavirus. Based on the above-mentioned results for HBV, it is expected that these nucleotide polymers will have the effect of inhibiting the release of viruses outside cells.
抗ウイルス効果を高めるため細胞内に導入され、明確な機構でウイルスの複製を阻害し、しかもウイルスの変異に抵抗性である薬剤が望ましい。 To enhance their antiviral effects, drugs that can be introduced into cells and inhibit viral replication through a defined mechanism while being resistant to viral mutations are desirable.
特許第２８１８０３１号（１９９９, 米国特許第５，９５２，４９０号）においては、Ｇカルテット形成を起こすコンセンサス配列を持つ８～２７塩基長のオリゴヌクレオチド配列がヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及びインフルエンザウイルスに抗ウイルス活性を示すことが示された。この配列はグアニン塩基のみで形成されたものでなく、３塩基あるいは４塩基の連続したグアニン塩基を多くの場合はグアニン塩基以外の１塩基以上のスペーサーを持つ構造を基本とし、請求項の配列番号 ８、１０および３４が連続した５つのグアニンを持つが６つ以上連続した配列は含まれていない。
In Japanese Patent No. 2818031 (1999, US Patent No. 5,952,490), it was shown that an 8-27 base long oligonucleotide sequence having a consensus sequence that causes G-quartet formation exhibits antiviral activity against human immunodeficiency virus, herpes simplex virus, cytomegalovirus, and influenza virus. This sequence is not formed only of guanine bases, but is based on a structure in which three or four consecutive guanine bases are often followed by one or more spacer bases other than guanine bases, and the claimed
Ｇカルテット構造は４つのグアニン塩基（Ｇ）の中心に向いた酸素分子が1価の陽イオンを中心に水素結合により平面構造を形成したものである。核酸塩基配列上に４つのＧＧＧが、ループと呼ばれる１～７塩基長をはさみ存在するときに、それぞれのＧ塩基により形成される３つのＧカルテット構造によりＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと呼ばれる４重鎖構造を形成する（非特許文献１３）。この構造はＤＮＡにもＲＮＡにも存在し、ＤＮＡにはテロメアやプロモーター領域に存在し特異的結合タンパク質との相互作用がそれらの機能制御に寄与している。また、ｍＲＮＡの非翻訳領域やｍｉＲＮＡなどの種々の低分子ＲＮＡに存在し結合タンパク質の影響によりその機能に影響を与える（非特許文献１４）。Ｇ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘのコンセンサス配列は５′‐Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７Ｇ３－５Ｎ１－７－３‘ （ＮはＡ，Ｃ，Ｇ，ＴあるいはＵ）で構成される（非特許文献１５、１６）。
The G-quartet structure is a planar structure formed by hydrogen bonding of oxygen molecules facing the center of four guanine bases (G) with a monovalent cation at the center. When four GGGs are present on a nucleic acid base sequence, sandwiching a 1-7 base length called a loop, three G-quartet structures formed by each G base form a quadruple-stranded structure called a G-quadruplex (Non-Patent Document 13). This structure exists in both DNA and RNA, and exists in the telomere and promoter regions of DNA, where interaction with specific binding proteins contributes to the control of their functions. It also exists in the untranslated regions of mRNA and various low molecular weight RNAs such as miRNA, and affects their functions through the influence of binding proteins (Non-Patent Document 14). The consensus sequence of the G-quadruplex is 5'-G 3-5 N 1-7 G 3-5 N 1-7 G 3-5 N 1-7 G 3-5 N 1-7 -3' (N is A, C, G, T, or U) (
アプタマーＡＳ１４１１はグアニンヌクレオチドに富む２６塩基のデオキシオリゴヌクレオチドはＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成し、がん細胞特異的に細胞内のｎｕｃｌｅｏｌｉｎに結合し急性骨髄性白血病の増殖を抑制する（非特許文献１７）。 Aptamer AS1411 is a 26-base deoxyoligonucleotide rich in guanine nucleotides that forms a G-quadruplex and binds specifically to intracellular nucleolin in cancer cells, suppressing the proliferation of acute myeloid leukemia (Non-Patent Document 17).
一方、試験管内でＧ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成するグアニンヌクレオチドリッチなデオキシオリゴヌクレオチドを細胞外から処理した場合の細胞増殖抑制作用は、Ｇ‐ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの形成に相関がなく、デオキシグアノシン１リン酸やグアニンなどのデオキシオリゴヌクレオチドの分解産物に起因することが示唆されておおり（非特許文献１８）、その作用点や作用機序が不明瞭である可能性がある。 On the other hand, it has been suggested that the cell proliferation inhibitory effect of extracellular application of guanine nucleotide-rich deoxyoligonucleotides that form G-quadruplexes in vitro is not correlated with the formation of G-quadruplexes and is due to decomposition products of deoxyoligonucleotides such as deoxyguanosine monophosphate and guanine (Non-Patent Document 18), and the site and mechanism of action may be unclear.
解決しようとする課題は、従前の抗ウイルス薬より広い範囲のウイルス種に抗ウイルス効果を示し、また耐性ウイルスが出現しにくい様態を示す抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよびその薬学的組成物を提供する点である。 The problem to be solved is to provide an antiviral oligonucleotide and a pharmaceutical composition thereof that exhibit antiviral effects against a wider range of virus species than conventional antiviral drugs and that are less susceptible to the emergence of resistant viruses.
本発明は、ウイルスゲノムＲＮＡ中に存在しない配列を含むＲＮＡオリゴマーが、ウイルスのゲノムＲＮＡとその結合タンパク質である（ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎタンパク質）との相互作用を阻害しウイルス複製を抑制することを主要な特徴とする。以下にその内容を示す。 The main feature of the present invention is that an RNA oligomer containing a sequence not present in the viral genomic RNA inhibits the interaction between the viral genomic RNA and its binding protein (nucleocapsid protein (N protein)) and suppresses viral replication. The details are as follows:
一般的にＮタンパク質とＲＮＡの結合は、ウイルス特異的タンパク質合成、ゲノムＲＮＡ複製に寄与し、さらに最終的にはＲＮＡ配列に依存せずにゲノムＲＮＡ全体がＮタンパク質-ＲＮＡ（ｖｉｒａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｖＲＮＰ）のポリマーを形成しウイルス粒子の核を形成する。ｖＲＮＰポリマーが適切に形成されることは、効率の良いウイルス粒子の形成や他の細胞への感染（感染力）の維持に機能する。 In general, the binding of N protein to RNA contributes to virus-specific protein synthesis and genomic RNA replication, and ultimately, the entire genomic RNA forms an N protein-RNA (viral ribonucleoprotein, vRNP) polymer, regardless of the RNA sequence, to form the nucleus of the virus particle. Proper formation of vRNP polymers functions to efficiently form virus particles and maintain infection (infectivity) to other cells.
ウイルスの複製酵素は、ＲＮＡウイルスゲノムがそのコピーを作る複製過程で誤って塩基を取り込む。ウイルス進化の過程でウイルスの複製に不利な配列が形成された場合には、その配列を持つウイルスの増殖が阻害され、結果的に淘汰されると考えられる。逆に、コードされるタンパク質の機能に不利な影響を及ぼさない変異はゲノムＲＮＡ中に蓄積すると考えられる。ｖＲＮＰポリマー形成を想定した場合、Ｎタンパク質への結合が極端に強いＲＮＡ配列や、ｖＲＮＰの構造に影響を与えるＲＮＡ配列が存在する場合は、正常なゲノムＲＮＡのＮ蛋白質への結合を阻害するなど複製に不利な影響を与え、このような配列はゲノムＲＮＡ上から変異により排除されると洞察して鋭意研究の結果、本発明に至った。 Viral replication enzymes incorporate erroneous bases during the replication process when the RNA virus genome makes copies of itself. If a sequence unfavorable to viral replication is formed during the process of viral evolution, it is believed that the proliferation of viruses that have that sequence will be inhibited, and as a result, they will be selected out. Conversely, mutations that do not adversely affect the function of the encoded protein are thought to accumulate in the genomic RNA. Assuming the formation of vRNP polymers, if there is an RNA sequence that binds extremely strongly to the N protein or an RNA sequence that affects the structure of vRNP, it will have an adverse effect on replication, such as inhibiting the binding of normal genomic RNA to the N protein, and such sequences will be eliminated from the genomic RNA through mutation. This insight led to the present invention as a result of extensive research.
すなわち、本発明は以下の１）～６）に関するものである。
１）動物ウイルスのゲノムＲＮＡ中に少なくとも６塩基連続して存在しない配列を含む６～１９ヌクレオチド長であって、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド。
２）動物ウイルスのＮタンパク質とＲＮＡの結合を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンリボヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長あるいはグアニンヌクレオチドが１２個連続したオリゴヌクレオチド。
３）ウイルス及び／又はウイルス感染細胞に接触させた場合にウイルスの増殖を抑制する活性を有する抗ウイルス用オリゴヌクレオチドであって、グアニンヌクレオチドが少なくとも６つ連続した配列を含む６～１９ヌクレオチド長のオリゴリボヌクレオチド。
４）上記１）～３）のオリゴヌクレオチドの塩基以外および塩基部分に公知の技術を用いて修飾して安定性及び／又は抗ウイルス効果を高めたオリゴヌクレオチド。
５）上記１）～４）のオリゴヌクレオチドであってコロナウイルス感染およびインフルエンザウイルス感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
６）上記１）～５）のオリゴヌクレオチドであってＲＮＡをゲノムとして持つウイルスの感染を防ぐオリゴヌクレオチド。
７）上記１）～６）のオリゴヌクレオチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
８）上記１）～６）を他の抗ウイルス剤と組み合わせた抗ウイルス用薬学的組成物。
That is, the present invention relates to the following 1) to 6).
1) An antiviral oligonucleotide having a length of 6 to 19 nucleotides and containing a sequence of at least 6 consecutive bases that is not present in the genomic RNA of an animal virus, and having an activity of inhibiting the binding of the nucleocapsid (N) protein to RNA.
2) An antiviral oligonucleotide having activity of inhibiting the binding of the N protein and RNA of an animal virus, which is an oligonucleotide having a length of 6 to 19 nucleotides and containing a sequence of at least 6 consecutive guanine ribonucleotides or 12 consecutive guanine nucleotides.
3) An antiviral oligonucleotide having activity of suppressing viral proliferation when contacted with a virus and/or a virus-infected cell, which is an oligoribonucleotide having a length of 6 to 19 nucleotides and containing a sequence of at least 6 consecutive guanine nucleotides.
4) Oligonucleotides having improved stability and/or antiviral effect, obtained by modifying the non-base or base moiety of the oligonucleotides 1) to 3) above using known techniques.
5) An oligonucleotide according to any one of 1) to 4) above, which prevents coronavirus infection and influenza virus infection.
6) An oligonucleotide selected from the above 1) to 5) which prevents infection by a virus having RNA as its genome.
7) An antiviral pharmaceutical composition comprising the oligonucleotides 1) to 6) above.
8) An antiviral pharmaceutical composition comprising any one of 1) to 6) above in combination with another antiviral agent.
本発明により、ＲＮＡゲノムを持つ複数のウイルスに対する抗ウイルス効果を示すオリゴヌクレオチドおよび、これを含む抗ウイルス用薬学的組成物が提供される。また、好適には遺伝子変異による抗ウイルス効果の低下を起こしにくい抗ウイルス用オリゴヌクレオチドおよび、抗ウイルス用薬学的組成物として有用である。 The present invention provides an oligonucleotide that exhibits an antiviral effect against multiple viruses with an RNA genome, and an antiviral pharmaceutical composition containing the same. In addition, the oligonucleotide and antiviral pharmaceutical composition are preferably useful as antiviral oligonucleotides and antiviral pharmaceutical compositions that are less susceptible to a decrease in antiviral effect due to genetic mutation.
以下に本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 The following describes a preferred embodiment of the present invention. However, the present invention is not limited to the following embodiment.
本発明において使用するプローブＲＮＡは、特に限定はされないがウイルスゲノム配列の一部あるいはランダムな配列をもつＲＮＡが挙げられる。また、Ｎタンパク質はウイルスから調整したタンパク質、あるいはＮタンパク質全体およびＲＮＡが結合することが知られているＮタンパク質の一部、あるいは精製時に使用するＨＩＳタグ等のペプチド配列をＮタンパク質の全長あるいはＮタンパク質の一部と融合した融合タンパク質を遺伝子組換え技術により大腸菌などに発現させ精製したものなど（Ｎタンパク質等）が挙げられる。 The probe RNA used in the present invention is not particularly limited, but may be a part of the viral genome sequence or an RNA with a random sequence. In addition, the N protein may be a protein prepared from the virus, or the entire N protein or a part of the N protein to which RNA is known to bind, or a fusion protein in which a peptide sequence such as a HIS tag used during purification is fused with the full length or part of the N protein, which is expressed in Escherichia coli or the like by recombinant gene technology and purified (N protein, etc.).
ＲＮＡウイルスのゲノム配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪなどの公的データベースに公開されているものが使用できる。データベースより得たゲノム配列から６塩基程度の連続した配列でゲノム配列中に存在しない配列を選択することができる。単なる例示として挙げると、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の配列のその配列の中にグアノシンが６つ連続したＧ６およびＩｎ－１の配列が存在しない（図１）。 The genome sequence of an RNA virus can be one that is published in a public database such as GenBank or DDBJ. From the genome sequences obtained from the database, a sequence of about six consecutive bases that does not exist in the genome sequence can be selected. As a mere example, the sequence of the novel coronavirus (SARS-CoV-2) does not contain the sequences G6 and In-1, which contain six consecutive guanosines (Figure 1).
Ｎタンパク質とプローブＲＮＡの結合を阻害するオリゴヌクレオチドの選択は、一つの好適例として電気泳動移動度シフト法が挙げられる。例えば、プローブとしては、α‐３２Ｐ‐ＣＴＰを含ませたリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ，ＧＴＣ、低濃度ＣＴＰ）溶液中でＴ７‐ＲＮＡポリメラーゼ等を利用したインビトロＲＮＡ合成系を用いて３２Ｐ―ＲＮＡプローブを作製することができる。精製したＮタンパク質等をこのプローブに接触させアガロースゲルあるいはアクリルアミドゲル電気泳動により分離後し、オートラジオグラフィーで３２Ｐ―プローブＲＮＡのバンドの移動度を検出する。Ｎタンパク質等が結合することで移動度が遅延したバンドを定量することでＮタンパク質等とプローブＲＮＡの結合レベルを検出することができる。即ち、例えば候補オリゴヌクレオチドを接触させＮタンパク質により出現したバンドのレベルを定量することで、候補オリゴヌクレオチドのＮタンパク質―ＲＮＡ結合の阻害効果を定量的に見積もることができる。 One suitable example of the selection of oligonucleotides that inhibit the binding of N protein to probe RNA is the electrophoretic mobility shift method. For example, a 32 P-RNA probe can be prepared using an in vitro RNA synthesis system utilizing T7-RNA polymerase in a ribonucleotide (ATP, UTP, GTC, low-concentration CTP) solution containing α- 32 P -CTP. Purified N protein, etc. is contacted with this probe, separated by agarose gel or acrylamide gel electrophoresis, and the mobility of the 32 P-probe RNA band is detected by autoradiography. The binding level of N protein, etc. and probe RNA can be detected by quantifying the band whose mobility is delayed by the binding of N protein, etc. That is, for example, by contacting a candidate oligonucleotide and quantifying the level of the band that appears due to N protein, the inhibitory effect of the candidate oligonucleotide on N protein-RNA binding can be quantitatively estimated.
Ｎタンパク質等とＲＮＡの結合を阻害する化合物の選択は、他の好適例として、液―液相分離（ＬＬＰＳ, Ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ)による液滴形成を指標とすることができる。単なる例示として挙げるが、蛍光物質で標識したプローブＲＮＡとＮタンパク質あるいはＮタンパク質の一部分は、シラン化ポリエチレングリコールでコートしたガラス表面でＬＬＰＳを起こし数μmの小さな液滴を形成する。形成した液滴を、蛍光顕微鏡により蛍光像と微分干渉光学系で液滴の形態を観察すると、プローブＲＮＡとＮタンパク質等との可逆的な結合とＬＬＰＳを検出することができる。 As another suitable example, the selection of a compound that inhibits the binding of N protein, etc., to RNA can be performed using droplet formation due to liquid-liquid phase separation (LLPS) as an indicator. As a mere example, probe RNA labeled with a fluorescent substance and N protein or a portion of N protein undergo LLPS on a glass surface coated with silanized polyethylene glycol to form small droplets of a few μm in size. When the droplets that are formed are observed using a fluorescent microscope to view the fluorescent image and a differential interference optical system, the reversible binding of the probe RNA to N protein, etc., and the LLPS can be detected.
一つの好適例として挙げると、候補オリゴヌクレオシドがＮタンパク質等に接したときに相状態が変化するとＮタンパク質等の間の相互作用が強調されるなどの影響をうける例が挙げられる。例えば候補オリゴヌクレオチドの存在によりＬＬＰＳが進行した場合に１μｍ程度の液滴が数μmの大きさに成長したり相転移を起こし液滴が崩壊したりすることがある。また、他方ＬＬＰＳ内の蛍光プローブＲＮＡと候補オリゴヌクレオチドが置き換わりＬＬＰＳ液滴中の蛍光強度の減少する場合などが挙げられる。１本のゲノムＲＮＡとＮタンパク質等が会合してウイルス粒子を形成することから考えると、これらの変化の何れの場合もウイルスｖＲＮＡ形成は阻害されたあるいは負の影響を受けたと考えることができる。 As one suitable example, when a candidate oligonucleoside comes into contact with an N protein or the like, the phase state changes, and the interaction between the N protein or the like is accentuated, resulting in other effects. For example, when LLPS progresses due to the presence of a candidate oligonucleotide, droplets of about 1 μm may grow to a size of several μm, or a phase transition may occur, causing the droplets to collapse. Another example is when the fluorescent probe RNA in the LLPS is replaced by the candidate oligonucleotide, resulting in a decrease in the fluorescence intensity in the LLPS droplet. Considering that a single genomic RNA and an N protein or the like associate to form virus particles, in any of these cases of change, it can be considered that viral vRNA formation is inhibited or negatively affected.
以上のように、ゲノムＲＮＡとＮタンパク質等の相互作用の変化を、好適例として電気泳動移動度シフト法およびＬＬＰＳの変化を見出した候補オリゴヌクレオチドは、Ｎタンパク質とプローブＲＮＡとの結合を効率よく阻害する目的で、例えば塩基長を６塩基以上１９塩基以下の長さの間で変更してもよい。 As described above, the candidate oligonucleotides that have been found to change the interaction between genomic RNA and N protein, etc., using electrophoretic mobility shift method and LLPS as preferred examples, may have a base length that is altered, for example, between 6 and 19 bases in length, in order to efficiently inhibit the binding between N protein and probe RNA.
選択された候補オリゴヌクレオチドの安定性、及び/あるいは細胞内への侵入効率を上げるために、その抗ウイルス用オリゴヌクレオチドの構成する塩基部分、リボース部分、ホスホジエステル結合のいずれか、あるいはそれぞれを組み合わせて、該候補オリゴヌクレオチドの一部あるいは全てを修飾してもよい。 To increase the stability and/or intracellular penetration efficiency of the selected candidate oligonucleotide, the base portion, ribose portion, or phosphodiester bond constituting the antiviral oligonucleotide may be modified in part or in whole by a combination of these.
候補オリゴヌクレオチドの修飾としては、リボース部分の一部又は全部を２′位をデオキ化、２′－Ｏメチル化修飾、２′－Ｏ（２－メトキシエチル）化修飾、２′フルオロ化修飾、架橋型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、および/またはＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に変更することができる。リン酸ジエステル結合一部又は全部をホスホロチオエート化してもよい。 As for modifications of the candidate oligonucleotide, some or all of the ribose moiety may be modified by deoxygenating the 2' position, 2'-O methylation, 2'-O (2-methoxyethyl) modification, 2' fluorination modification, bridged artificial nucleic acid, and/or locked nucleic acid. Some or all of the phosphodiester bonds may be phosphorothioated.
ホスホジエステル結合の修飾法としては、候補オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の一部または全てのリン酸をホスホロチオエート化修飾してもよい。 As a method for modifying phosphodiester bonds, some or all of the phosphates in the phosphodiester bonds of the candidate oligonucleotide may be modified with phosphorothioates.
選択された候補オリゴヌクレオチドが低分子の場合には細胞内に侵入することが知られている。また、効率よく細胞内に導入するために、好適例として脂質類似膜やＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）のキャリアを用いて導入する方法、また、細胞透過性ペプチド等を候補オリゴヌクレオチドに共有結合する方法などが挙げられる。 It is known that the selected candidate oligonucleotide will enter cells if it is a low molecular weight. In addition, suitable examples of methods for efficiently introducing the oligonucleotide into cells include a method using a lipid-like membrane or a carrier such as polyethylenenimine (PEI), and a method in which a cell-penetrating peptide or the like is covalently bonded to the candidate oligonucleotide.
選択された候補オリゴヌクレオチドあるいは、以上のように修飾した抗ウイルス用オリゴヌクレオチドの効果を確認する。例えば、感染症の原因となるＲＮＡウイルスの感染細胞培養系がある場合には、感染細胞の培養液に抗ウイルス用オリゴヌクレオチドを添加し、ウイルスの増殖の抑制効率を観察する方法を用いる。ウイルスの増殖抑制効果は、例えばウイルス複製に伴い誘導されるウイルスタンパク質の定量、あるいは細胞内ウイルスＲＮＡや細胞外に放出されたウイルスＲＮＡあるいはウイルスの感染力価を定量する方法を用いる。ウイルスＲＮＡの定量は、例えば塩基配列を元に設計した２つの特異的なプライマーＤＮＡと検出用蛍光標識オリゴＤＮＡを用いて、逆転写反応後の定量ＰＣＲ（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）により該ウイルス特異的なｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡを定量する方法を用いる。ウイルスタンパク質の存在量は、例えば特異抗体を用いたウエスタンブロッティングや蛍光抗体法などが挙げられる。また、ウイルスの細胞変性効果や蛍光抗体法を用いて候補オリゴヌクレオチドによる感染力価を低下する効果を求める方法も挙げられる。 The effect of the selected candidate oligonucleotide or the antiviral oligonucleotide modified as described above is confirmed. For example, in the case of a cell culture system infected with an RNA virus that causes an infectious disease, an antiviral oligonucleotide is added to the culture medium of the infected cells, and the efficiency of suppressing the proliferation of the virus is observed. The effect of suppressing the proliferation of the virus is measured, for example, by quantifying the viral protein induced with the viral replication, or by quantifying the intracellular viral RNA, the extracellular viral RNA, or the infectious titer of the virus. The viral RNA is measured, for example, by using two specific primer DNAs designed based on the base sequence and a fluorescently labeled oligo DNA for detection, and quantifying the viral specific mRNA and genomic RNA by quantitative PCR (RT-qPCR) after reverse transcription reaction. The amount of viral protein present can be measured, for example, by Western blotting using a specific antibody or a fluorescent antibody method. In addition, the cytopathic effect of the virus or the effect of reducing the infectious titer by the candidate oligonucleotide can be measured using the fluorescent antibody method.
候補オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果は、実験動物を用いることができる。好適例として、マウスなどの実験動物の新生仔の鼻腔、気道、肺内にＲＮＡウイルスを接種しながら候補オリゴヌクレオチドを投与し、その動物体内におけるウイルスの増殖レベルを定量ＰＣＲ法や組織切片の蛍光抗体法により検出する方法、動物の病態の変化を観察することにより候補オリゴヌクレオチドの効果を見積もる方法が挙げられる。 The antiviral effect of a candidate oligonucleotide can be evaluated using experimental animals. Suitable examples include a method in which a candidate oligonucleotide is administered while an RNA virus is inoculated into the nasal cavity, airways, or lungs of a newborn experimental animal such as a mouse, and the level of virus proliferation in the animal's body is detected by quantitative PCR or fluorescent antibody testing of tissue sections, and a method in which the effect of the candidate oligonucleotide is estimated by observing changes in the animal's pathological condition.
抗ウイルス効果がある候補オリゴヌクレオチドを抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとする。 Candidate oligonucleotides that have antiviral effects are called antiviral oligonucleotides.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の配列のその配列の中に存在しない配列頻度を図１に示す。グアノシンが６つ連続したＧ６およびＩｎ－１の配列が存在しない（図１）。 Figure 1 shows the frequency of sequences that are not present in the sequence of the novel coronavirus (SARS-CoV-2). The sequences G6 and In-1, which are six consecutive guanosines, are not present (Figure 1).
Ｎタンパク質のＮ末端のＲＮＡ結合ドメイン（ＮＴＤ）と３２Ｐ‐ＲＮＡプローブの混合液に候補オリゴリボヌクレオチドを添加して、ＲＮＡ‐ＮＰ結合阻害効果を見積もることができる。本発明はこの方法を用いて、数種の異なった配列の６塩基長のオリゴリボヌクレオシドの中からＩｎ－１の阻害効果は極端に低いが、Ｇ６に最も効果が最も高いことを示す（図２－１、図２－２、図３）。 By adding candidate oligoribonucleotides to a mixture of the N-terminal RNA-binding domain (NTD) of the N protein and a 32 P-RNA probe, the inhibitory effect of RNA-NP binding can be estimated. Using this method, the present invention shows that, among several different 6-base-long oligoribonucleosides, In-1 has an extremely low inhibitory effect, while G6 has the highest inhibitory effect (Figures 2-1, 2-2, and 3).
本発明者らは、この方法でＩｎ－１はＮタンパク質のＣ末端側に結合してＬＬＰＳが進行させ～数μmの液滴とさらに相転移を誘導すること、Ｇ６はＮＴＤおよびそれ以外の領域に結合して液滴の成長と相転移を誘導することを見出した。さらに、グアノシンが連続した１２塩基長のオリゴリボヌクレオチド（Ｇ１２）が高いＮタンパク質-ＲＮＡの結合阻害活性を持つことを発見した（図４、図５）。Ｇ１２の効果は、形成されたＬＬＰＳ液滴中のプローブＲＮＡを追い出す効果（図６）、プローブＲＮＡによる安定な液滴形成そのものを阻害し相転移を促進する両方の効果がある（図７）。 The inventors found that, using this method, In-1 binds to the C-terminus of the N protein, promoting LLPS and inducing droplets of up to several μm in size and further phase transition, while G6 binds to the NTD and other regions to induce droplet growth and phase transition. Furthermore, they discovered that a 12-base-long oligoribonucleotide with consecutive guanosines (G12) has high N protein-RNA binding inhibitory activity (Figures 4 and 5). G12 has the effect of expelling the probe RNA from the LLPS droplets that have been formed (Figure 6), and of inhibiting the formation of stable droplets by the probe RNA itself and promoting the phase transition (Figure 7).
βコロナウイルス間でＮタンパク質の立体構造を比較した研究が多数あるが、Ｎタンパク質の共通の立体構造が見出されている。また、発明者らが見出したＧ６やＩｎ－１の配列も他のコロナウイルスゲノム中には極端に少ないことから、Ｇ１２の効果はコロナウイルス感染細胞に同様な影響を与える可能性を検討した。 There have been many studies comparing the three-dimensional structures of N proteins among β-coronaviruses, and a common three-dimensional structure of N proteins has been found. In addition, since the G6 and In-1 sequences found by the inventors are also extremely rare in other coronavirus genomes, the inventors investigated the possibility that G12 has a similar effect on coronavirus-infected cells.
選択されたオリゴヌクレオチドのＧ１２は、核酸を包む脂質膜等がない状態でウイルス感染細胞培養液に添加することで効果を示すことを見出した。すなわち、Ｇ１２の効果をヒトコロナウイルスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同様にβコロナウイルス科にＯＣ４３を用いて検証した。ＯＣ４３感染ヒト細胞の培養液中にＧ１２加えて培養すると、感染細胞のＲＮＡの合成（図８）およびＯＣ４３のタンパク質が阻害されるた（図９）。さらに、ヒトがん細胞Ａ５４９を用いてＯＣ４３のＮタンパク質の細胞内分布を、蛍光抗体法を用いて検出した結果、Ｇ１２は感染細胞において点状に分布するＮタンパク質を拡散させる効果があることを示すことができる（図１０）。これの結果より、Ｇ１２はＯＣ４３のＲＮＡの複製、ｍＲＮＡの転写、複製された新生ＲＮＡとＮタンパク質との会合に影響を与えるものと推察された。 We found that the selected oligonucleotide G12 was effective when added to a virus-infected cell culture medium in the absence of a lipid membrane or the like that envelops nucleic acid. That is, the effect of G12 was verified using OC43, a human coronavirus of the β-coronavirus family, as well as SARS-CoV-2. When G12 was added to the culture medium of OC43-infected human cells and cultured, RNA synthesis in the infected cells (Figure 8) and OC43 protein were inhibited (Figure 9). Furthermore, the intracellular distribution of OC43 N protein was detected using the fluorescent antibody method using human cancer cells A549, and it was shown that G12 has the effect of diffusing the N protein, which is distributed in a punctate manner in infected cells (Figure 10). From these results, it was inferred that G12 affects OC43 RNA replication, mRNA transcription, and the association of the replicated nascent RNA with the N protein.
培養液中のＧ１２は最終濃度で２０μＭ程度に増加しても細胞の増殖は８０％以上で細胞に毒性はないことがわかる（図１１）。 Even when the final concentration of G12 in the culture medium was increased to about 20 μM, cell proliferation was over 80% and there was no toxicity to the cells (Figure 11).
オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されたＧ１２オリゴヌクレオチドも液―液相分離（図１２―Ａ）およびＯＣ４３のＮタンパク質の合成を効率よく阻害する（図１２―Ｂ）。 G12 oligonucleotide, in which all phosphodiester bonds of the oligonucleotide are phosphorothioated, also efficiently inhibits liquid-liquid phase separation (Figure 12-A) and synthesis of OC43 N protein (Figure 12-B).
候補オリゴヌクレオチドは、Ｇ１２の抗ウイルス効果は、コロナウイルス以外でｖＲＮＰ構造を持ちエンベロープにくるまれたウイルスの感染細胞にも有効であると洞察して、インフルエンザＡ型ウイルス感染ＭＤＣＫ細胞の培養液に添加し、その増殖を検討した。インフルエンザウイルスの細胞由来のＨＡタンパク質の合成を効率よく阻害することを発見した（図１３）。また、細胞内ＲＮＡレベルの増加もＧ１２存在下で阻害される（図１４―Ａ）。さらに細胞外ＲＮＡ（培養液ＲＮＡ）を同時に定量した結果、細胞内部のＲＮＡが増加してもＧ１２は細胞外への放出も阻害していることを見出した（図１４－ＢおよびＣ）。 Based on the insight that the antiviral effect of G12 would also be effective against cells infected with viruses other than coronaviruses that have a vRNP structure and are enveloped, the candidate oligonucleotide was added to the culture medium of MDCK cells infected with influenza A virus and their proliferation was examined. It was discovered that G12 efficiently inhibited the synthesis of HA protein derived from influenza virus cells (Figure 13). Furthermore, the increase in intracellular RNA levels was also inhibited in the presence of G12 (Figure 14-A). Furthermore, by simultaneously quantifying extracellular RNA (culture medium RNA), it was found that G12 also inhibited the release of RNA outside the cells, even if the RNA inside the cells increased (Figures 14-B and C).
これらの結果から、Ｇ１２はコロナウイルスおよびインフルエンザウイルスのＲＮＡ合成に加えて、ウイルス粒子の産生のステップで阻害することを見出した。これらの知見より、Ｎタンパク質とゲノムＲＮＡが結合してｖＲＮＰ構造を形成するＲＮＡウイルスに共通した阻害効果を示す抗ウイルス用オリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。 From these results, it was found that G12 inhibits not only the RNA synthesis of coronaviruses and influenza viruses, but also the step of virus particle production. Based on these findings, an antiviral oligonucleotide was found that exhibits a common inhibitory effect on RNA viruses in which the N protein binds to the genomic RNA to form a vRNP structure, and the present invention was completed.
オリゴヌクレオチドの好適な修飾により核酸分解酵素の抵抗性を上げる効果がある。さらに、低分子のオリゴヌクレオチドは細胞内に侵入するため、抗ウイルス用オリゴヌクレオチドとして生体に適応できる。複数のウイルスに効果があることから好適には新感染症にも適応が可能な抗ウイルス薬が創出される。 Suitable modification of oligonucleotides has the effect of increasing resistance to nucleases. Furthermore, since low molecular weight oligonucleotides penetrate cells, they can be applied to the body as antiviral oligonucleotides. As they are effective against multiple viruses, antiviral drugs can be created that can be preferably applied to new infectious diseases.
１ 「候補オリゴヌクレオチド」とは、ウイルスゲノム中に存在しない塩基配列、あるいは／およびＮタンパク質とプローブＲＮＡの結合を阻害するオリゴヌクレオチド。
２ 「抗ウイルス用オリゴヌクレオチド」とは、Ｎタンパク質とプローブＲＮＡの結合に影響を与えウイルスの増殖を低下させるオリゴヌクレオチド。
1. "Candidate oligonucleotide" refers to a base sequence that does not exist in the viral genome and/or an oligonucleotide that inhibits the binding of the N protein to the probe RNA.
2. "Antiviral oligonucleotide" refers to an oligonucleotide that affects the binding between the N protein and the probe RNA, thereby reducing viral proliferation.
Claims (21)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022181458A JP2024070748A (en) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | Non-genomic antiviral oligonucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022181458A JP2024070748A (en) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | Non-genomic antiviral oligonucleotides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024070748A true JP2024070748A (en) | 2024-05-23 |
Family
ID=91128638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022181458A Pending JP2024070748A (en) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | Non-genomic antiviral oligonucleotides |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024070748A (en) |
-
2022
- 2022-11-11 JP JP2022181458A patent/JP2024070748A/en active Pending
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