JP2024018100A - 細胞培養基材及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】所望の厚さで均一に液膜を形成することができ、細胞を含み均一な形状のハイドロゲル粒子が得られる細胞培養基材の製造方法を提供する。【解決手段】基材の表面にハイドロゲルを介して細胞が固定された細胞培養基材の製造方法は、基材の表面に第１液の膜を形成する工程と、膜に第２液の液滴を吐出する工程と、を含み、ハイドロゲルは第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と高分子が含む水とを有し、第１液は第１固定剤を含む水溶液であり、第２液は第２固定剤と細胞とを含む懸濁液であり、基材において前記膜を形成する位置には凹部が形成され、膜は凹部の内部を充填し、液滴を吐出する工程において、膜を構成する第１液と液滴を構成する第２液との少なくとも一部が混合し、液滴の大きさに対応するハイドロゲルの粒子が形成され、粒子は細胞を内包して基材の表面に付着する。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞培養基材及びその製造方法に関する。
近年、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毒性乃至薬効評価ツールの需要が高まってきている。その理由の１つとして、動物実験の３Ｒｓ（「代替（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」、「削減（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び「改善（Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）」）の促進により、実験動物数の削減、さらに実験動物に替わる代替法が求められていること等が挙げられる。前記動物実験の３Ｒｓの促進以外の理由には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける毒性乃至薬効評価ツールは、動物実験にかかる経費の削減や試験時間の短縮等、多くの利点を有していることが挙げられる。
一方で、組織工学の進展に伴い、複数の細胞からなる組織を人工的に形成する技術の開発が行われている。中でも、バイオプリンターは、固定剤の種類によっては細胞を培養容器底面やゲル上に迅速に固定することができるため、三次元組織モデルの構築において注目されている。しかし、生体における細胞の機能や薬剤への反応の過程をｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に再現することは難しく、未だ方法は確立されていない。
そこでｉｎ ｖｉｔｒｏで組織モデルを構築する方法の１つとして、細胞を基材に接着することができる評価用基材の製造方法が特許文献１に開示されている。具体的には、特許文献１には、基材に、固定剤Ａを含有する溶液を付与する固定剤Ａ含有溶液付与工程と、前記固定剤Ａに対して混合が可能な固定剤Ｂ及び細胞を含有する懸濁液を付与する固定剤Ｂ及び細胞含有懸濁液付与工程と、を含み、前記固定剤Ａと、前記固定剤Ｂとのそれぞれ少なくとも一部が混合されてハイドロゲルの粒子を形成し、前記細胞が、前記ハイドロゲルを介して前記基材に固定され、前記懸濁液が、細胞が重ならないように配置されるように液滴として付与される、評価用基材の製造方法が開示されている。特許文献１に記載の方法により、細胞を含むハイドロゲル粒子のパターニングが可能であり、該方法がｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織モデル構築の重要な手段であることが既に知られている。
しかしながら、特許文献１に記載の方法において、固定剤Ａ含有溶液を所望の厚さで均一に塗布することが困難であるという課題を発明者らは見出している。特に、創薬研究で多用されるウェルプレート等の多穴のプレートを用いた場合において、水を主成分とするような低粘度で表面張力が高い固定剤Ａ含有溶液をウェル底面に塗布した際に、表面張力によりウェルの壁面に固定剤Ａ含有溶液が吸い寄せられることで、固定剤Ａ含有溶液を所望の厚さで均一に塗布することが困難である。これにより、ハイドロゲル粒子の形状が不均一となり、細胞がハイドロゲル粒子に内包されず漏れ出たり、ハイドロゲル粒子の形状が扁平な形となり、ハイドロゲル粒子が水分を十分に包含できず乾燥により細胞にダメージを与え、最悪の場合には細胞死を招く虞がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、所望の厚さで均一に液膜を形成することができ、細胞を含み、均一な形状のハイドロゲル粒子が得られる細胞培養基材の製造方法、及び前記製造方法により得られる細胞培養基材を提供する。
細胞培養基材の製造方法は、基材の表面にハイドロゲルを介して細胞が固定された細胞培養基材の製造方法であって、
前記基材の表面に、第１液の膜を形成する工程と、
前記膜に第２液の液滴を吐出する工程と、を含み、
前記ハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有し、
前記第１液は、前記第１固定剤を含む水溶液であり、
前記第２液は、前記第２固定剤と、前記細胞とを含む懸濁液であり、
前記基材において前記膜を形成する位置には凹部が形成され、前記膜は前記凹部の内部を充填し、
前記液滴を吐出する工程において、前記膜を構成する前記第１液と、前記液滴を構成する前記第２液との少なくとも一部が混合し、前記液滴の大きさに対応する前記ハイドロゲルの粒子が形成され、
前記粒子は、前記細胞を内包して前記基材の表面に付着する。
上記態様の細胞培養基材の製造方法によれば、所望の厚さで均一に液膜を形成することができ、細胞を含み、均一な形状のハイドロゲル粒子が得られる。上記態様の細胞培養基材は、前記製造方法により得られ、細胞を含み、均一な形状のハイドロゲル粒子を有する。
本発明の第１実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図１Ａに示すＩ－Ｉ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の第２実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図２Ａに示すＩＩ－ＩＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の第３実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図３Ａに示すＩＩＩ－ＩＩＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の第４実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図４Ａに示すＩＶ－ＩＶ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の第５実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図５Ａに示すＶ－Ｖ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の第６実施形態に係る細胞培養基材の平面図である。 図６Ａに示すＶＩ－ＶＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法で用いられるピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法で用いられる装置の一例を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法で用いられる装置の変形例を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法で用いられる装置の変形例を示す模式図である。 図８の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法のプロセスを示す概略図である。 従来の細胞培養基材の製造方法を９６ウェルプレートに適用した場合での第１液の膜の明視野像（上）及びウェルの断面図（下）である。 従来の細胞培養基材の製造方法のプロセスを示す概略図である。 実施例１及び比較例１で製造された細胞培養基材上のハイドロゲル粒子の顕微鏡像である。 実施例１で製造された細胞培養基材上のハイドロゲル粒子の製造直後（ｄａｙ０）及び７２時間後（ｄａｙ３）の顕微鏡像である。
以下、本発明の一実施形態に係る（以下、単に「本実施形態の」と称する場合がある）について、必要に応じて特定の実施形態及び図面を参照して説明する。かかる実施形態及び図面は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれる。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
≪細胞培養基材の製造方法≫
本実施形態の細胞培養基材の製造方法は、基材の表面にハイドロゲルを介して細胞が固定された細胞培養基材の製造方法であって、以下の工程を含む。
前記基材の表面に、第１液の膜を形成する工程（以下、「膜形成工程」と称する場合がある）；
前記膜に第２液の液滴を吐出する工程（以下、「液滴突出工程」と称する場合がある）。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記ハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有する。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記第１液は、前記第１固定剤を含む水溶液である。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記第２液は、前記第２固定剤と、前記細胞とを含む懸濁液である。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記基材において前記膜を形成する位置には凹部が形成され、前記膜は前記凹部の内部を充填する。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記液滴の直径は、前記凹部の深さで規定される前記膜の膜厚と同等以下であることが好ましい。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、液滴突出工程において、前記膜を構成する前記第１液と、前記液滴を構成する前記第２液との少なくとも一部が混合し、前記液滴の大きさに対応する前記ハイドロゲルの粒子が形成される。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法において、前記粒子は、前記細胞を内包して前記基材の表面に付着する。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法は、従来の細胞培養基材の製造方法では、表面張力によりウェル等の壁面に第１液が吸い寄せられることで、第１液を所望の厚さで均一に塗布することが困難であるという問題があるという知見に基づくものである。また、従来の細胞培養基材の製造方法では、上記理由により、第１液を所望の厚さで均一に塗布することが困難であることから、ハイドロゲル粒子の形状が不均一となり、細胞がハイドロゲル粒子に内包されず漏れ出たり、ハイドロゲル粒子の形状が扁平な形となり、ハイドロゲル粒子が水分を十分に包含できず乾燥により細胞にダメージを与えるという問題があるという知見に基づくものである。
上記問題を解決するために、本実施形態の細胞培養基材の製造方法では、基材の表面に凹部を形成し、第１液の膜厚が凹部の深さと同等になるように第１液を添加することで、所望の厚さで均一に第１液の膜を形成することができ、細胞を含み、均一な形状のハイドロゲル粒子が得られる。これにより、ハイドロゲル粒子内で効率的に細胞を増殖させることができる。
＜細胞培養基材＞
［第１実施形態］
図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の第１実施形態に係る細胞培養基材１００を示す図である。
図１Ａは、細胞培養基材１００の平面図である。図１Ｂは、図１Ａに示すＩ－Ｉ’線を通る面で切断した細胞培養基材１００の断面図である。
図１Ａ及び図１Ｂに示すように、細胞培養基材１００は、基材１と、基材１の表面に付着し細胞を内包するハイドロゲル粒子３と、を有する。基材１の表面には凹部２が形成されている。ハイドロゲル粒子３は、凹部の底面２ａに付着しており、ハイドロゲル粒子の高さＲは、凹部の深さＤＲよりも小さい。
後述する本実施形態の細胞培養基材の製造方法によれば、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ハイドロゲル粒子３、すなわち、細胞が所望の位置に配置された細胞培養基材１００を得ることができる。また、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ハイドロゲル粒子３が凹部の底面２ａに付着することにより、ハイドロゲルを介して、細胞を基材１に接着することができる。
（基材）
基材としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；ガラスプレート、スライドガラス、カバーガラス等の平板状；平膜状等が挙げられる。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔質構造、メッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造等が挙げられる。
基材の材質としては、例えば、有機材料、無機材料等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース等が挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックス等が挙げられる。
（凹部）
凹部２は基材１の表面に形成されている。
凹部２は、基材１にいくつ形成されていてもよいが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等が挙げられる。
凹部２の深さＤＲは、５０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。凹部２の深さＤＲが上記下限値以上であることで、より均一な半球又は略半球形状のハイドロゲル粒子を得ることができる。一方で、凹部２の深さＤＲが上記上限値以下であることで、第１液の膜に含まれる第１固定剤と、第２液の液滴に含まれる第２固定剤との反応によるハイドロゲルの形成速度（硬化速度）がより良好なものとなり、半硬化の状態でハイドロゲル粒子を凹部の底面２ａに到達させることができるため、形成されたハイドロゲル粒子を接着させることができる。
凹部を平面視した際の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、略円形、三角形、四角形等が挙げられる。
例えば、凹部２を平面視した際の形状が円形である場合、凹部２の内径は５ｍｍ以上１００ｍｍ以下であることが好ましく、６ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることがより好ましい。
細胞培養基材１００において、凹部の底面２ａは、インクジェット法で第２液を添加する場合において、第２液の液滴の着弾面、すなわち、ハイドロゲル粒子の接着面となる。
細胞培養基材１００において、凹部２は、基材１と同じ材料からなり、基材１における凹部２の形成には、目的に応じて選択される任意の加工方法を用いることができる。すなわち、例えば、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、フォトリソグラフィーによる加工、エッチング加工、エンボス加工等により形成することができる。また、例えば、射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等により、形成することができる。
これらの中でも、凹部２の形成方法は、レーザー加工が好ましい。凹部２の形成方法がレーザー加工であると、凹部２の形状を簡易に且つ微細に形成することができる。また、基材１に直接接触して加工しないことから、生体適合性を得やすい点で有利である。
細胞培養基材１００において、凹部の縁２ｂは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂが撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
凹部の縁２ｂにおいて、撥水性表面の水接触角は典型的には９０°以上、好ましくは１００°以上、より好ましくは１０５°以上である。水接触角が上記下限値以上であることで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。撥水性表面の水接触角は、好ましくは１５０°以下である。なお、本明細書において、水接触角とは、２３℃において測定される水接触角を指す。
撥水処理は、長鎖アルキル基を有するシランカップリング剤やフッ素系のシランカップリング剤等でコーティングすることにより実施できる。
撥水性材料としては、例えば、フッ素及び酸素を含有する材料、パーフルオロカーボン材料等が挙げられ、具体的には、テトラフルオロエチレンとパーフルオロ［２－（フルオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテル]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のイオン性フッ素高分子等が挙げられる。
（ハイドロゲル粒子）
ハイドロゲル粒子３は、細胞を内包している。
ハイドロゲル粒子３において、細胞は、ハイドロゲルで少なくも一部、好ましくは全体が被覆されており、ハイドロゲル以外に、後述する第１固定剤及び第２固定剤が共存していてもよい。ハイドロゲル粒子３において、ハイドロゲルが、細胞の少なくとも一部を被覆することにより、細胞の乾燥を防止することができる。
ハイドロゲル粒子３を構成するハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有する。第１固定剤、第２固定剤、及び形成される高分子については、後述する細胞培養基材の製造方法について詳細を説明する。
ハイドロゲル粒子３は、凹部の底面２ａにいくつ配置されていてもよいが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等が挙げられる。
ハイドロゲル粒子の形状は、半球又は略半球形状である。
ハイドロゲル粒子の高さＨＣは、上記凹部の深さＤＲより小さければよく、例えば、１０μｍ超５００μｍ未満であり、３０μｍ以上４００μｍ以下が好ましい。
ハイドロゲル粒子を平面視した際の直径は、５０μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましい。
（細胞）
ハイドロゲル粒子に内包される細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞等が挙げられる。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞等が挙げられる。
本実施形態の細胞培養基材は、第１実施形態に係る細胞培養基材の凹部２に加えて、後述する第２、４、及び６実施形態に係る細胞培養基材に示すような、ウェル４を更に備える。ウェル４を備えることで、ハイドロゲル粒子内の細胞をより長期間安定して培養することができる。また、本実施形態の細胞培養基材は、第１実施形態に係る細胞培養基材の凹部２が、第２～６実施形態に係る細胞培養基材に示すような、凸条部５を配置することで形成されていてもよい。
次いで、各実施形態に係る細胞培養基材について以下に詳細を説明する。
［第２実施形態］
図２Ａ及び図２Ｂは、本発明の第２実施形態に係る細胞培養基材２００を示す図である。図２Ａは、細胞培養基材２００の平面図である。図２Ｂは、図２Ａに示すＩＩ－ＩＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材２００の断面図である。図２Ａ及び図２Ｂに示す細胞培養基材２００では、ウェル４を更に備える点が、図１Ａ及び図１Ｂに示す細胞培養基材１００と異なる。細胞培養基材２００では、ウェル４を備えることで、収容できる溶液の容量を凹部２のみの場合よりも多くすることができ、乾燥の影響を受けにくい。そのため、ハイドロゲル粒子内の細胞をより長期間安定して培養することができる。
図２Ａに示す細胞培養基材２００において、基材がウェルプレートであり、ウェルプレートの１以上のウェル４の底部に凹部２が形成されている。
（ウェル）
ウェル４は、基材１にいくつ形成されていてもよいが、例えば、１、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等が挙げられる。
ウェル４を平面視した際の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、略円形、三角形、四角形等が挙げられる。
例えば、ウェル４を平面視した際の形状が円形である場合、ウェル４の内径は５ｍｍ以上３００ｍｍ以下であることが好ましく、６ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることがより好ましい。
ウェル４の深さＤＷは、凹部２の深さＤＲよりも大きければよく、例えば、１ｍｍ以上２０ｍｍ以下とすることができる。
複数のウェル４の基材１上の配置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、縦横に等間隔に整列するように配置されていてもよい。
複数のウェル４のうち、１以上のウェル４の底部に凹部が形成されていればよく、全てのウェル４の底部に凹部が形成されていることが好ましい。
ウェル４の容量は、細胞の種類やハイドロゲル粒子の大きさに応じて適宜設定することができるが、例えば、１００μＬ以上１０００μＬ以下とすることができる。ウェル４の容量が上記下限値以上であることで、収容できる溶液の容量を凹部２のみの場合よりも多くすることができ、乾燥の影響を受けにくい。また、液面の制御及び管理を容易に行なうことができ、安定的に細胞を培養することができる。
細胞培養基材２００において、凹部２及びウェル４は、基材１と同じ材料からなり、凹部２及びウェル４の形成は、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００に記載の凹部２の形成方法と同様の公知の加工方法により行うことができる。
細胞培養基材２００において、凹部の縁２ｂ、又は、図２Ａに示すように平面視した際に凹部２の外縁領域にあたるウェルの底面４ａは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂ及びウェルの底面４ａに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂ及びウェルの底面４ａを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂ又はウェルの底面４ａが撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
撥水性表面の水接触角、撥水処理方法、及び撥水性材料については、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００において説明したとおりである。
［第３実施形態］
図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の第３実施形態に係る細胞培養基材３００を示す図である。図３Ａは、細胞培養基材３００の平面図である。図３Ｂは、図３Ａに示すＩＩＩ－ＩＩＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材３００の断面図である。図３Ａ及び図３Ｂに示す細胞培養基材３００では、凹部２が基材１に環状に設けられた凸条部で囲まれた部位である点が、図１Ａ及び図１Ｂに示す細胞培養基材１００と異なる。
（凸条部）
凸条部５は基材１の表面に形成されている。
凸条部５としては、第１液の膜厚を均一に保つことができるものであれば、形状、材質に特に制限はない。
凸条部５は、基材１にいくつ形成されていてもよいが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等が挙げられる。
凸条部５の高さ、すなわち、凹部２の深さＤＲは、５０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。凹部２の深さＤＲが上記下限値以上であることで、より均一な半球又は略半球形状のハイドロゲル粒子を得ることができる。一方で、凹部２の深さＤＲが上記上限値以下であることで、第１液の膜に含まれる第１固定剤と、第２液の液滴に含まれる第２固定剤との反応によるハイドロゲルの形成速度（硬化速度）がより良好なものとなり、半硬化の状態でハイドロゲル粒子を凹部の底面２ａに到達させることができるため、形成されたハイドロゲル粒子を接着させることができる。
凸条部５を平面視した際の形状としては、環状であればよく、円環状、略円環状；三角形、四角形等の多角形の環状等が挙げられる。
例えば、凸条部５を平面視した際の形状が円環状である場合、凸条部５の幅は特に制限されず、例えば０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍなどであってよい。凸条部５の幅は、凸条部を設ける箇所や確保したい凹部２の大きさ等により適宜設定することができる。
また、凸条部５を平面視した際の形状が円環状である場合、凸条部５の内径、すなわち、凹部２の内径は５ｍｍ以上１００ｍｍ以下であることが好ましく、６ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることがより好ましい。
細胞培養基材３００において、凹部２及び凸条部５は、基材１と同じ材料からなり、凹部２及び凸条部５の形成は、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００に記載の凹部２の形成方法と同様の公知の加工方法により行うことができる。
細胞培養基材３００において、凹部の縁２ｂ又は凸条部５の上面５ａは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂ又は凸条部５が撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
撥水性表面の水接触角、撥水処理方法、及び撥水性材料については、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００において説明したとおりである。
［第４実施形態］
図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の第４実施形態に係る細胞培養基材４００を示す図である。図４Ａは、細胞培養基材４００の平面図である。図４Ｂは、図４Ａに示すＩＶ－ＩＶ’線を通る面で切断した細胞培養基材４００の断面図である。図４Ａ及び図４Ｂに示す細胞培養基材４００では、ウェル４を更に備える点が、図３Ａ及び図３Ｂに示す細胞培養基材３００と異なる。細胞培養基材４００では、ウェル４を備えることで、収容できる溶液の容量を凹部２のみの場合よりも多くすることができ、乾燥の影響を受けにくい。そのため、ハイドロゲル粒子内の細胞をより長期間安定して培養することができる。
細胞培養基材４００において、凹部２、ウェル４及び凸条部５は、基材１と同じ材料からなり、凹部２、ウェル４及び凸条部５の形成は、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００に記載の凹部２の形成方法と同様の公知の加工方法により行うことができる。
細胞培養基材４００において、凹部の縁２ｂ又は凸条部５の上面５ａは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂ又は凸条部５が撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
撥水性表面の水接触角、撥水処理方法、及び撥水性材料については、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００において説明したとおりである。
［第５実施形態］
図５Ａ及び図５Ｂは、本発明の第５実施形態に係る細胞培養基材５００を示す図である。図５Ａは、細胞培養基材５００の平面図である。図５Ｂは、図５Ａに示すＶ－Ｖ’線を通る面で切断した細胞培養基材５００の断面図である。図５Ａ及び図５Ｂに示す細胞培養基材５００では、凸条部５が基材１と別部材からなる点が、図３Ａ及び図３Ｂに示す細胞培養基材３００と異なる。細胞培養基材３００では、凸条部５は基材１に固定されていてもよく、基材から取り外し可能な部材からなってもよいが、基材から取り外し可能な部材からなることが好ましい。凸条部５が基材から取り外し可能な部材からなることで、例えば、基材がスライドガラスである場合には、ハイドロゲル粒子内の細胞の観察の妨げとならないように、観察前に該凸条部５を取り除くことができる。
（凸条部）
凸条部５が基材１と別部材からなる場合に、凸条部５の形状としては、上記第３実施形態において例示されたものと同様のものが挙げられる。
凸条部５の材質としては、シリコーンゴム、金属、ガラス、プラスチック、ゴム等が挙げられる。凸条部５は、撥水性材料で構成されていてもよい。撥水性材料としては、上記第１実施形態に係る細胞培養基材１００において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、凸条部５が取り外し可能な部材である場合には、加工が容易であり、且つ、細胞への毒性がほとんどみられないことから、シリコーンゴムを材料とする部材であることが好ましい。
細胞培養基材５００において、凸条部５は、上記材質からなるシートから、打ち抜き加工やレーザー加工等の公知の加工方法により所望の形状となるように加工して作製したものを基材１上に配置することで、形成することができる。
細胞培養基材５００において、凹部の縁２ｂ又は凸条部５の上面５ａは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂ又は凸条部５が撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
［第６実施形態］
図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の第６実施形態に係る細胞培養基材６００を示す図である。図６Ａは、細胞培養基材６００の平面図である。図６Ｂは、図６Ａに示すＶＩ－ＶＩ’線を通る面で切断した細胞培養基材６００の断面図である。図６Ａ及び図６Ｂに示す細胞培養基材６００では、ウェル４を更に備える点が、図５Ａ及び図５Ｂに示す細胞培養基材５００と異なる。細胞培養基材６００では、ウェル４を備えることで、収容できる溶液の容量を凹部２のみの場合よりも多くすることができ、乾燥の影響を受けにくい。そのため、ハイドロゲル粒子内の細胞をより長期間安定して培養することができる。
細胞培養基材６００において、凹部の縁２ｂ又は凸条部５の上面５ａは、撥水性を有してもよい。例えば、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａに撥水処理層を配置することで、撥水性を付与することができる。或いは、凹部の縁２ｂ及び凸条部５の上面５ａを撥水性材料で構成してもよい。凹部の縁２ｂ又は凸条部５が撥水性を有することで、後述する膜形成工程において添加される第１液が基材１の表面に塗れ広がらず、凹部２内に第１液の膜をより均一な厚みで形成することができる。
上記で説明した実施形態は、各々単独で実施してもよく、あるいはこれらの２種以上を組み合わせて実施してもよい。
本実施形態の細胞培養基材は、図１Ａ～図６Ｂに示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１Ａ～図６Ｂに示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図６Ａ及び図６Ｂに示す細胞培養基材６００において、凸条部５はウェル４の壁面に接するように配置されているが、図１２に示すように、凸条部５をウェル４の壁面から一定の距離を置いて配置してもよい。このような配置とすることで、凸条部５が取り外し可能な部材からなる場合に、凸条部５の着脱がより容易になる。
例えば、図１Ａ～図６Ｂに示す細胞培養基材において、凹部２乃至ウェル４の内部を培地で満たしてもよい。これにより、ハイドロゲル粒子の乾燥を予防し、細胞をより長期間安定して培養することができる。
例えば、図１Ａ及び図１Ｂ、図３Ａ及び図３Ｂ、並びに、図５Ａ及び図５Ｂに示す細胞培養基材において、細胞培養基材を、培地等を添加した別容器に浸漬することで、ハイドロゲルを介して固定された細胞を培養することも可能である。
本実施形態の細胞培養基材は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける被験物質の毒性乃至薬効の評価用基材として好ましく用いることができる。
次いで、本実施形態の細胞培養基材の製造方法の各工程について以下に詳細を説明する。
＜膜形成工程＞
膜形成工程では、基材の表面に、第１液の膜を形成する。基材において膜を形成する位置には凹部が形成されており、膜は凹部の内部を充填する。すなわち、膜形成工程において、第１の液の膜厚は凹部の深さで規定されており、第１の液の膜厚が凹部の深さと同等となるように第１液を添加する。
従来では、ウェル等の第１液を収容する溶室の壁面に第１液が引き寄せられて膜厚が安定しない。これに対して、本実施形態の細胞培養基材の製造方法では、第１の液の膜厚が凹部２の深さと同等となるように第１液を添加することで、第１の液の膜厚を均一なものとすることができ、後述する液滴吐出工程において均一な形状のハイドロゲル粒子を形成することができる。なお、ここでいう「第１の液の膜厚が凹部２の深さと同等」とは、第１の液の膜厚が凹部２の深さの８０％以上１００％以下であることを意味する。第１の液の膜厚は、凹部２の深さによって適宜調整できるが、具体的には、例えば、４０μｍ以上５００μｍ以下とすることができる。
膜形成工程において、第１液を凹部２の内部に添加する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペット等を用いたピペット分注法、マイクロマニピュレーター法、アスピレータ法、液滴吐出法（インクジェット法）、ゲル押し出し法、スクリーン印刷法等の転写法などが挙げられる。
［第１液］
第１液は、第１固定剤を含む水溶液である。
（第１固定剤）
第１固定剤としては、第２固定剤と混合されて架橋構造を形成するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。中でも、形成されるハイドロゲルの増粘性を向上するものであることが好ましい。第１固定剤として具体的には、例えば、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、フィブロイン等の生体由来ポリマー；フィブリノーゲン等の凝固因子；フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド等の接着因子；アルギン酸、ジェランガム等の多糖化合物金属塩；ポリ乳酸、ポリエチレングリコール等の合成ポリマー等が挙げられる。また、これらのポリマーに、チオール基等の官能基を修飾したものを用いることもできる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、チオールゼラチンが好ましい。
（その他の成分）
第１液は、必要に応じて、更にその他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤等が挙げられる。
第１液は、第１固定剤及び必要に応じてその他成分を所望の濃度となるように、水やリン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液に添加して、混合することで調製することができる。
＜液滴吐出工程＞
液滴吐出工程では、膜６に第２液の液滴９ａを吐出する。液滴吐出工程において、膜を構成する第１液と、液滴９ａを構成する第２液との少なくとも一部が混合し、液滴９ａの大きさに対応するハイドロゲルの粒子３が形成される。粒子３は、細胞を内包しており、基材１の表面に付着する。
液滴吐出工程において、液滴９ａの直径は、凹部の深さで規定される膜の膜厚と同等以下である。これにより、凹部の底面に到達するまでに、ハイドロゲルが適度な硬さまで硬化して、均一な形状のハイドロゲル粒子を得ることができる。
液滴９ａの直径として具体的には、２０μｍ超５００μｍ以下とすることができ、５０μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましい。
液滴吐出工程において、液滴９ａを吐出する方法としては、目的に応じて適宜選択することができ、液滴９ａを所望の位置に付与できる方法であればよく、例えば、インクジェット方式の吐出方法、マイクロマニピュレーター法、ゲル押し出し法、スクリーン印刷法等の転写法等が挙げられる。中でも、インクジェット方式の吐出方法であることが好ましい。なお、インクジェット方式の吐出方法（以下、「インクジェット法」と称する場合がある）とはノズルより液滴を連続的に滴下させる方法である。
インクジェット法としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でも、コンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェルプレートの各ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本実施形態では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
静電方式は、懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明の評価用基材の製造方法では、液滴を受けるための基材が対向して配置されており、基材構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物や基材の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から、圧力印加方式が好ましい。
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等が挙げられる。第２液の液滴吐出に使用可能な吐出ヘッドの構成例を図７に示す。図７は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
ピエゾ方式の吐出ヘッド２０では、液室部材２１の底面に弾性部材２２を介してＭＥＭＳチップ２３が配置されている。
ＭＥＭＳチップ２３には薄板部位となるメンブレン２６が配置されている。メンブレン２６の中央にはノズル２５が形成されている。メンブレン２６の外側表面に薄膜状の圧電素子２４が配置されている。ＭＥＭＳチップ２３に配置された圧電素子２４に、駆動波形発生供給源（図示せず）から配線２７を通して駆動波形が印加されることで、ＭＥＭＳチップ２３のメンブレン２６が振動し、液室内の第２液９がノズル２５から液滴９ａとして吐出される。
液室部材２１とノズル２５が形成されるメンブレン２６とによって形成される液室は、細胞１１を含む懸濁液である第２液９を保持する液体保持部である。液室は、下面側には貫通孔であるノズル２５が形成されている。液室は、例えば、金属、シリコン、セラミックス等から形成することができる。
メンブレン２６は、液室部材２１の下端部に固定された膜状部材である。メンブレン２６の略中心には貫通孔であるノズル２５が形成されており、液室に保持された第２液９はメンブレン２６の振動によりノズル２５から液滴として吐出される。メンブレン２６の振動の慣性により液滴を形成するため、高表面張力（高粘度）の第２液９でも吐出が可能である。メンブレン２６の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
メンブレン２６の材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン２６が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン２６の材質としては、例えば、金属材料やセラミックス材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
特に、細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミックス（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
このような材料の他の例としては、例えば、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどを挙げることができる。これら以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
ノズル２５は、メンブレン２６の略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル２５の径としては、特に限定はないが、細胞１１がノズル２５に詰まることを避けるため、細胞１１の大きさの２倍以上とすることが好ましい。細胞１１が、例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ以上５０μｍ以下程度であるため、使用する細胞に合わせて、ノズル２５の径は１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
一方で、ノズル２５の径は、２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、吐出ヘッド２０においては、ノズル２５の径は、典型的には１０μｍ以上２００μｍ以下の範囲となる。
圧電素子２４は、メンブレン２６の下面側に形成されている。圧電素子２４の形状は、メンブレン２６の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン２６の平面形状が円形である場合には、ノズル２５の周囲に平面形状が円環状（リング状）の圧電素子２４を形成することが好ましい。
圧電素子２４に駆動波形発生供給源から駆動波形を供給することにより、メンブレン２６を振動させることができる。メンブレン２６の振動により、細胞１１を含有する液滴を、ノズル２５から吐出させることができる。
圧電素子２４は、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動波形発生供給源から圧電素子２４の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン２６を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
駆動波形発生供給源は、メンブレン２６を振動させて液滴を形成する吐出波形と、液滴を形成しない範囲でメンブレン２６を振動させる撹拌波形とを圧電素子２４に選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン２６の振動状態（振動の程度）を制御することができる。
吐出ヘッド２０では、圧電素子２４がメンブレン２６の下面側に形成されているため、圧電素子２４によりメンブレン２６が振動すると、液室の下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
この時、細胞１１の動きは下から上への運動となり、液室内で対流が発生して第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９の撹拌が起きる。液室の下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した細胞１１が液室の内部に均一に分散する。
つまり、駆動波形発生供給源は、吐出波形を圧電素子２４に加え、メンブレン２６の振動状態を制御することにより、液室に保持された第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９をノズル２５から液滴として吐出させることができる。又、駆動波形発生供給源は、撹拌波形を圧電素子２４に加え、メンブレン２６の振動状態を制御することにより、液室に保持されたた第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル２５から液滴は吐出されない。
このように、液滴を形成していない間に第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９を撹拌することにより、細胞１１がメンブレン２６上に沈降、凝集することを防ぐと共に、細胞１１を、第２固定剤を含有する第２液９中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル２５の詰まりを抑えることが可能となる。その結果、第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９を、長時間連続して安定的に液滴として吐出することができる。
また、第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、吐出ヘッド２０においては、液室の上部が開放されているため、第２固定剤及び細胞１１を含有する第２液９中に混入した気泡を、液室の上部を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴を形成することが可能となる。
すなわち、ノズル２５の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン２６上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン２６上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン２６の振動によって上方に移動するが、液室の上部が開放されているため、混入した気泡を液室の上部から排出可能となる。そのため、液室に気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴を形成することができる。
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン２６を振動させ、積極的に気泡を液室の上方に移動させてもよい。
吐出ヘッドとしては、ピエゾ方式及び電磁バルブ方式のいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、細胞培養基材の製造のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
また、一般的な圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。このため、図７に示すピエゾ方式の吐出ヘッドを好ましく用いることができる。図７の吐出ヘッド２０では、図示していない駆動波形発生供給源から圧電素子２４に対して配線２７を通して駆動波形が印加されることにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン２６を紙面上下方向に変形させることができる。これにより上記問題を解決することができる。
コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向に電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名「セルソーターＳＨ８００」を用いることができる。
吐出ヘッドでは、電圧の強弱により、液滴の形成及び第２液の攪拌を行うことができる。液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
圧電素子に印加する電圧及び吐出ヘッドにおける液滴形成動作の詳細については、例えば、特許文献１に記載の内容が本実施形態の細胞培養基材の製造方法においても好ましく適用される。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法に用いられる装置について、図８～図１０を用いて説明する。
図８は、細胞培養基材の製造装置の一例を示す模式図である。図９及び図１０は、図８の細胞培養基材の製造装置の他の変形例を示す模式図である。
図８に示すように、細胞培養基材の製造装置１１０は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）２０と、ヘッド搬送手段３０と、制御手段４０と、を有する。また、細胞培養基材の製造装置１１０において、圧電素子の駆動波形供給源２８が配線２７を介して吐出ヘッド２０の圧電素子に接続している。
図８に示す細胞培養基材の製造装置１１０において、液滴の吐出と同期して制御手段４０に接続されたヘッド搬送手段３０により吐出ヘッド２０とウェルプレート１２の相対位置を変化させることで、ウェル４の底面への第２液の液滴を任意の位置に配置することができる。
吐出ヘッド２０とウェルプレート１２の相対位置を変化させる手段は、図８に示すように、吐出ヘッド２０にのみ搬送手段を配置してもよく、或いは、図９に示すように、ウェルプレート１２にのみ搬送手段を配置してもよく、或いは、図１０に示すように、吐出ヘッド２０及びウェルプレート１２両方の搬送手段を配置してもよい。
例えば、図１０に示す細胞培養基材の製造装置１３０において、紙面左右方向の動作はヘッド搬送手段３０で制御し、紙面前後方向の動作はプレート搬送手段５０で制御することもできる。
制御手段４０は、駆動波形供給源２８、ヘッド搬送手段３０、プレート搬送手段５０を制御する機能を有している。以下、図１１を参照し、制御手段４０の動作を含有する細胞培養基材の製造装置の動作について説明する。
図１１は、図８～図１０の制御手段４０のハードウェアブロックを例示する図である。
図１１に示すように、制御手段４０は、ＣＰＵ４１と、ＲＯＭ４２と、ＲＡＭ４３と、Ｉ／Ｆ４４と、バスライン４５とを有している。ＣＰＵ４１、ＲＯＭ４２、ＲＡＭ４３、及びＩ／Ｆ４４は、バスライン４５を介して相互に接続されている。
ＣＰＵ４１は、制御手段４０の各機能を制御する。
記憶手段であるＲＯＭ４２は、ＣＰＵ４１が制御手段４０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。
記憶手段であるＲＡＭ４３は、ＣＰＵ４１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ４３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。
Ｉ／Ｆ４４は、細胞培養基材の製造装置を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。細胞培養基材の製造装置は、Ｉ／Ｆ４４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
［第２液］
第２液は、第２固定剤と、細胞とを含む懸濁液である。細胞としては、上記第１実施形態に係る細胞培養基材で例示されたものと同様のものが挙げられる。
（第２固定剤）
第２固定剤としては、第１固定剤と混合されて架橋構造を形成するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。第２固定剤として具体的には、例えば、多糖類、多価金属塩、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド、キトサン、キチン、四官能性ポリエチレングリコール（Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ）等が挙げられる。また、これらに、マレイミジル基等の官能基を修飾したものを用いることもできる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、第１固定剤がチオールゼラチンである場合には、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジルであることが好ましい。
（その他の成分）
第２液は、必要に応じて、更にその他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤等が挙げられる。
第２液は、細胞、第２固定剤、及び、必要に応じてその他成分を所望の濃度となるように、水やリン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、或いは、培地に添加して、混合することで調製することができる。
［ハイドロゲル］
ハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有する。
１液性のゲルでは、ゲルの硬化に時間がかかるため、すぐに培地を充填するとハイドロゲル粒子が基材の底面に接着しておらず流されてしまう。これに対して、本実施形態の細胞培養基材の製造方法で形成されるハイドロゲルは、膜を構成する第１液と、液滴９ａを構成する第２液との少なくとも一部が反応してなる２液性のゲルである。そのため、１液性のゲルよりもゲルの硬化時間が短く、滴下した液滴が基材の底面に到着するまでにゲルを所望の硬さまで硬化させることができる。
例えば、第１固定剤がＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジルであり、第２固定剤がチオールゼラチンである場合には、マレイミジル基とチオール基の反応によりチオエーテル基が形成されており、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ構成単位と、ゼラチン構成単位とを有する高分子と、該高分子を含む水と、を有するハイドロゲルを用いることができる。
＜培地添加工程＞
本実施形態の細胞培養基材の製造方法は、上記膜形成工程及び上記液滴吐出工程に加えて、細胞がハイドロゲルを介して基材に固定された後に、ハイドロゲル粒子に培地を添加する工程（以下、「培地添加工程」と称する場合がある）を更に含んでもよい。
培地を添加する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペット等を用いたピペット分注法、マイクロマニピュレーター法、アスピレータ法、インクジェット法、スクリーン印刷法等の転写法等が挙げられる。
［培地］
培地としては、組織体の形成と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ、浸透圧等の外部環境を整える溶液であり、当該分野で公知のものを適宜選択することができる。常時培地液内に浸しておく必要のない場合においては適宜除去してもよい。
培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成により分類される培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、「粉培地」とも称することがある）等の形状により分類される培地等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。
動物細胞の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択す
ることができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄ－ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｅ－ＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｉ－ＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｖ／ｖ％以上５ｖ／ｖ％以下が好ましく、３ｖ／ｖ％以上４ｖ／ｖ％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、上記範囲内であると、細胞を好適に培養させることができる。
図１２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造方法のプロセスを示す概略図である。図１２を参照しながら、本実施形態の細胞培養基材の製造方法について説明する。
図１２の膜形成工程に示すように、第１液をマイクロピペット７によりウェル４の底面形成されている凹部２の内部に、第１液の膜厚が凹部２の深さと同等となるように、添加する。次に、図１２の液滴吐出工程に示すように、吐出ヘッド２３を用いて、インクジェット法により、第２液９を液滴９ａにして吐出し、凹部２の内部に形成された第１液の膜６に接触させる。第２液の液滴９ａを第１液の膜６に接触させることにより、第１固定剤及び第２固定剤が反応して、ハイドロゲルの粒子３が形成される。形成されたハイドロゲルを介して、細胞が基材に接着した細胞培養基材を作製することができる。次に、図１２の培地添加工程に示すように、ハイドロゲル粒子６の上に、培地１０をマイクロピペット７により滴下して、ハイドロゲル粒子の乾燥防止や評価の前準備を行うことができる。
本実施形態の細胞培養基材の製造方法で得られた細胞培養基材は、被験物質の毒性乃至薬効の評価に好適に用いられる。
本実施形態の細胞培養基材を被験物質の毒性乃至薬効の評価に用いる場合は、図１２の培地添加工程に示す培地１０に、毒性乃至薬効の評価を行う被験物質を事前に添加したものを用いることにより評価を行うことができる。
毒性の評価を行う被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、塩化亜鉛、１－ブタノール、安息香酸、エチルバニリン、４－ヒドロキシ安息香酸、スルファニル酸、酒石酸、サリチル酸メチル、サリチル酸、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、ベンジルアルコール、デキストラン、ジエチルフタレート、グリセロール、プロピルパラベン、Ｔｗｅｅｎ８０、ジメチルイソフタレート、フェノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、オクタン酸等が挙げられる。
薬効の評価を行う被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、オキサゾロン、ベンゾキノン、２，４－ジニトロコロベンジン、４－フェニレンジアミン、グルタルアルデヒド、ベンゾイルペルオキシド、４－メチルアミノフェノール硫酸塩、ホルムアルデヒド、シンナムアルデヒド、エチレンジアミン、アクリル酸２－ヒドロキシエチル、イソオイゲノール、硫酸ニッケル（ＩＩ）、ベンジリデンアセトン、２－ノニン酸メチル、サルチル酸ベンジル、ジエチレントリアミン、チオグリセロール、２－メルカプトベンゾチアゾール、フェニルアセトアルデヒド、ヘキシルシンナムアルデヒド、ジヒドロオイゲノール、ベンゾイソチアゾリオーネ、シトラール、レゾルシノール、安息香酸フェニル、オイゲノール、アビエチン酸、アミノ安息香酸エチル、ベンジルシンナメート、シンナミルアルコール、ヒドロキシシトロネラール、イミダゾリジニル尿素、ブチルグリシジルエーテル、エチレングリコールジメタクリラート、グリオキサール、４－ニトロベンジルブロミド等が挙げられる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
特許文献１等の従来の方法では、第１液をウェルやディッシュ等の細胞培養基材に滴下して、第１液の膜を形成する。このとき、図１３に示すように、９６ウェルプレートに第１液を滴下する場合に、表面張力によりウェルプレートの角及び側面にも第１液が引き寄せられるために、ウェル内に所望の厚さであって均一な第１液の薄膜を形成することは困難であった。また、この方法で形成されるウェルの中央近傍の薄膜は１０μｍ以下であるために、直径１００μｍ程度のハイドロゲル粒子を形成できない。
そこで、細胞培養基材に凹部を形成することで、凹部の深さが障壁となり、第１液がウェルプレートの角及び壁面に吸い寄せされず、所望の厚さであって、均一な第１液の薄膜を形成することが可能になると仮定した。本実施例では、凹部の形成方法の一例として、シリコーンゴムのリングをウェル内に配置することで、細胞培養基材上に凹部を形成することを検討した。
＜材料＞
［第１液の調製］
リン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；以下、「ＰＢＳ（－）」と称する場合がある）１ｍＬに、第１固定剤として、チオールゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、商品名「Ｔｈｉｏｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ」）５０ｍｇを添加して、５０ｍｇ／ｍＬのチオールゼラチン水溶液を調製して、第１液を得た。
［第２液の調製］
マウス胎児線維芽細胞株であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＪＣＲＢ０６１５、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手；以下、単に「３Ｔ３細胞」と称する場合がある）１×１０５個をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品名「ＤＭＥＭ（１×）」；以下、「Ｄ－ＭＥＭ」と称する場合がある）３０ｍＬに懸濁し、得られた細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに添加して、インキュベーター（パナソニック株式会社製、装置名「ＫＭ－ＣＣ１７ＲＵ２」、３７℃、５％ＣＯ２環境）内で、７２時間培養した。培養後、培養液を除去し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＤＰＢＳ」と称する場合がある）を２ｍＬ添加して洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、トリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品名「０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（１×）」）２ｍＬを加えて、上記インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で５分間、トリプシン処理して細胞を単離した。
予め、ＰＢＳ（－）１ｍＬに、第２固定剤として、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジル（油化産業株式会社製、商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ－１００ＭＡ」）１０ｍｇを添加して、１０ｍｇ／ｍＬのＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジル水溶液を調製した。
おいた。次いで、上記のとおり、単離した細胞を、１０ｍｇｍｇ／ｍＬのチオールゼラチン水溶液に、細胞数が１×１０７個／ｍＬの濃度になるように添加して、第２固定剤及び細胞を含有する第２液を得た。
＜細胞培養基材の製造＞
［実施例１］
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、商品名「９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート 平底 低蒸発タイプ、フタ付 ポリスチレン」）の各ウェル内に、シリコーンゴムリング（直径５ｍｍ、厚み１００μｍ）を配置し、ウェルの底部に凹部が形成された細胞培養基材を得た。シリコーンゴムリングは、シリコーンゴムシート（ケニス社製、３００ｍｍ×３００ｍｍ×１００μｍ）を、直径５ｍｍ、厚み１００μｍのリング状となるように打ち抜き加工を行い、作製した。
９６ウェルプレートの各ウェルの凹部内に、マイクロピペットを用いて、５０ｍｇ／ｍＬのチオールゼラチン水溶液２．５μＬを添加した（図１２の「膜形成工程」参照）。第１液の膜厚は約１００μｍであった。
次に、第２液をインクジェット法のバイオプリンター（自社開発品、装置名「細胞対応インクジェット装置」）を用いて、細胞を含むハイドロゲル粒子が重ならないように配置されるように、９６ウェルプレートのウェルの凹部内に直径１００μｍの液滴を吐出した（図１２の「液滴吐出工程」参照）。第１固定剤であるチオールゼラチンと第２固定剤であるＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジルとが混合されてハイドロゲルの粒子を形成し、数分の常温静置を経て細胞を含むハイドロゲル粒子を凹部の底面に固定した。ハイドロゲル粒子の高さは、約４０μｍであり、形状は均一であった。ハイドロゲル粒子が固定されたことを確認した後、溶液を除去して、代わりに、Ｄ－ＭＥＭ０．１ｍＬを添加して、細胞を培養した（図１２の「培地添加工程」参照）。
［比較例１］
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、商品名「９６ｗｅｌｌ細胞培養用プレート 平底 低蒸発タイプ、フタ付 ポリスチレン」）の各ウェルに、マイクロピペットを用いて、５０ｍｇ／ｍＬのチオールゼラチン水溶液１５μＬを添加した（図１４の「従来の膜形成工程」参照）。
次に、第２液をインクジェット法のバイオプリンター（自社開発品、装置名「細胞対応インクジェット装置」）を用いて、細胞を含むハイドロゲル粒子が重ならないように配置されるように、９６ウェルプレートのウェル上に直径１００μｍの液滴を吐出した（図１４の「従来の液滴吐出工程」参照）。第１固定剤であるチオールゼラチンと第２固定剤であるＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－マレイミジルとが混合されてハイドロゲルの粒子を形成し、数分の常温静置を経て細胞を含むハイドロゲル粒子を凹部の底面に固定した。ハイドロゲル粒子の高さは、約数～１０μｍとばらつきがあり、形状が不均一であった。ハイドロゲル粒子が固定されたことを確認した後、溶液を除去して、代わりに、Ｄ－ＭＥＭ０．１ｍＬを添加して、細胞を培養した（図１４の「従来の培地添加工程」参照）。
実施例１及び比較例１で得られた製造直後の細胞培養基材上のハイドロゲル粒子を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社製、装置名「ＣＫＸ５３」）を用いて観察した。結果を図１５に示す。
図１５に示すように、実施例１で得られた細胞培養基材では、平面視した際の直径が１００μｍ程度であって、細胞が内包されたハイドロゲル粒子が形成されていることが確かめられた。一方で、比較例１で得られた細胞培養基材では、ハイドロゲル粒子が扁平な形状となっており、細胞が乾燥しやすくダメージを受けやすい環境となっていることが明らかとなった。
また、実施例１で得られた細胞培養基材上のハイドロゲル粒子の製造直後（ｄａｙ０）及び７２時間後（ｄａｙ３）の顕微鏡像を図１６に示す。
図１６に示すように、ｄａｙ０からｄａｙ３までの期間において、ハイドロゲル粒子がウェル内の凹部の底面に固定されたままの状態で、ハイドロゲル粒子の中で３Ｔ３細胞が増殖を続けていることが確かめられた。
以上のことから、本実施形態の細胞培養基材の製造方法では、基材の表面に凹部を形成することで、所望の厚さで均一に液膜を形成することができ、細胞を含み均一な形状のハイドロゲル粒子が得られることが明らかとなった。
本発明は以下の態様を含む。
（１） 基材の表面にハイドロゲルを介して細胞が固定された細胞培養基材の製造方法であって、
前記基材の表面に、第１液の膜を形成する工程と、
前記膜に第２液の液滴を吐出する工程と、を含み、
前記ハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有し、
前記第１液は、前記第１固定剤を含む水溶液であり、
前記第２液は、前記第２固定剤と、前記細胞とを含む懸濁液であり、
前記基材において前記膜を形成する位置には凹部が形成され、前記膜は前記凹部の内部を充填し、
前記液滴を吐出する工程において、前記膜を構成する前記第１液と、前記液滴を構成する前記第２液との少なくとも一部が混合し、前記液滴の大きさに対応する前記ハイドロゲルの粒子が形成され、
前記粒子は、前記細胞を内包して前記基材の表面に付着する、細胞培養基材の製造方法。
（２） 前記液滴の直径は、前記凹部の深さで規定される前記膜の膜厚と同等以下である、（１）に記載の細胞培養基材の製造方法。
（３） 前記凹部は、前記基材に環状に設けられた凸条部で囲まれた部位である、（１）又は（２）に記載の細胞培養基材の製造方法。
（４） 前記凸条部は、前記基材から取り外し可能な部材からなる、（３）に記載の細胞培養基材の製造方法。
（５） 前記部材がシリコーンゴムを材料とする、（４）に記載の細胞培養基材の製造方法。
（６） 前記基材がウェルプレートであり、
前記ウェルプレートの１以上のウェルの底部に前記凹部が形成されている、（１）～（５）のいずれか一つに記載の細胞培養基材の製造方法。
（７） 前記液滴を吐出する工程において、インクジェット方式の吐出方法で前記第２液を吐出する、（１）～（６）のいずれか一つに記載の細胞培養基材の製造方法。
（８） 基材と、
前記基材の表面に付着し細胞を内包するハイドロゲル粒子と、を有し、
前記基材の表面には凹部が形成され、
前記ハイドロゲル粒子は、前記凹部の底面に付着し、
前記ハイドロゲル粒子の高さは、前記凹部の深さよりも小さい、細胞培養基材。
１：基材、２：凹部、２ａ：凹部の底面、２ｂ：凹部の縁、３：ハイドロゲル粒子、４：ウェル、５：凸条部、５ａ：凸条部の上面、６：第１液の膜、７：ピペット、８：吐出ヘッド、９：第２液、９ａ：第２液の液滴、１０：培地、１１：細胞、１２：ウェルプレート、２０：吐出ヘッド、２１：液室部材、２２：弾性部材、２３：ＭＥＭＳチップ、２４：圧電素子、２５：ノズル、２６：メンブレン、２７：配線、２８：圧電素子の駆動波形供給源、３０：ヘッド搬送手段、４０：制御手段、４１：ＣＰＵ、４２：ＲＯＭ、４３：ＲＡＭ、４４：Ｉ／Ｆ、４５：バスライン、５０：プレート搬送手段、１００，２００，３００，４００，５００，６００：細胞培養基材、１１０，１２０，１３０：細胞培養基材の製造装置、ＤＲ：凹部の深さ、ＤＷ：ウェルの深さ、ＨＣ：ハイドロゲル粒子の高さ
特許第６９７７３４７号公報

Claims (8)

  1. 基材の表面にハイドロゲルを介して細胞が固定された細胞培養基材の製造方法であって、
    前記基材の表面に、第１液の膜を形成する工程と、
    前記膜に第２液の液滴を吐出する工程と、を含み、
    前記ハイドロゲルは、第１固定剤と第２固定剤とが結合して形成される高分子と、前記高分子が含む水と、を有し、
    前記第１液は、前記第１固定剤を含む水溶液であり、
    前記第２液は、前記第２固定剤と、前記細胞とを含む懸濁液であり、
    前記基材において前記膜を形成する位置には凹部が形成され、前記膜は前記凹部の内部を充填し、
    前記液滴を吐出する工程において、前記膜を構成する前記第１液と、前記液滴を構成する前記第２液との少なくとも一部が混合し、前記液滴の大きさに対応する前記ハイドロゲルの粒子が形成され、
    前記粒子は、前記細胞を内包して前記基材の表面に付着する、細胞培養基材の製造方法。
  2. 前記液滴の直径は、前記凹部の深さで規定される前記膜の膜厚と同等以下である、請求項１に記載の細胞培養基材の製造方法。
  3. 前記凹部は、前記基材に環状に設けられた凸条部で囲まれた部位である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材の製造方法。
  4. 前記凸条部は、前記基材から取り外し可能な部材からなる、請求項３に記載の細胞培養基材の製造方法。
  5. 前記部材がシリコーンゴムを材料とする、請求項４に記載の細胞培養基材の製造方法。
  6. 前記基材がウェルプレートであり、
    前記ウェルプレートの１以上のウェルの底部に前記凹部が形成されている、請求項１又は２のいずれか一項に記載の細胞培養基材の製造方法。
  7. 前記液滴を吐出する工程において、インクジェット方式の吐出方法で前記第２液を吐出する、請求項１又は２に記載の細胞培養基材の製造方法。
  8. 基材と、
    前記基材の表面に付着し細胞を内包するハイドロゲル粒子と、を有し、
    前記基材の表面には凹部が形成され、
    前記ハイドロゲル粒子は、前記凹部の底面に付着し、
    前記ハイドロゲル粒子の高さは、前記凹部の深さよりも小さい、細胞培養基材。
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