JP2024016295A - Method for producing non-enveloped viruses using divalent cations - Google Patents
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Abstract
【課題】 非エンベロープウイルスを精製に供する前に実施される「ウイルス産生細胞の処理方法」についての改良は少なく、依然改善の余地が残されている。【解決手段】 本発明は、アデノ随伴ウイルスの製造方法であって、（ａ）アデノ随伴ウイルスを産生する能力を有する細胞と５ｍＭ以上の二価の陽イオンとを含む溶液を凍結融解する工程、及び（ｂ）（ａ）の溶液からアデノ随伴ウイルスを取得する工程、を含む、方法、を提供する。【選択図】 図１[Problem] There are few improvements in the "method for processing virus-producing cells" that is carried out before subjecting non-enveloped viruses to purification, and there is still room for improvement. SOLUTION: The present invention provides a method for producing adeno-associated virus, comprising: (a) freezing and thawing a solution containing cells capable of producing adeno-associated virus and divalent cations of 5 mM or more; and (b) obtaining an adeno-associated virus from the solution of (a). [Selection diagram] Figure 1
Description
本発明は、エンベロープを持たないウイルス（以下、非エンベロープウイルス）、好適には、アデノ随伴ウイルス（以下、ＡＡＶ）を製造するための方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a non-enveloped virus (hereinafter referred to as non-enveloped virus), preferably an adeno-associated virus (hereinafter referred to as AAV).
現在、遺伝子組換え分野や医療分野においては、ヒトを含む哺乳動物細胞に遺伝子を導入する方法として、電気穿孔や金属微粒子を用いる物理的方法、核酸、ポリカチオン、もしくはリポソームを用いる化学的方法等に加えて、生物学的方法としてウイルス由来の遺伝子導入用のベクター（以下、ウイルスベクター）を用いる方法がある。ウイルスベクターとは、天然由来のウイルスを改変し、所望の遺伝子等を標的細胞に移入することができるようにしたベクターのことで、近年技術開発が進んでいる。一般に、遺伝子組換え技術を用いて作製したウイルスベクターは、組換えウイルスベクターと呼ばれるが、そういった組換えウイルスベクターの由来となるウイルスとしては、レトロウイルスやレンチウイルス、センダイウイルス、及びヘルペスウイルス等のエンベロープを持つウイルス、並びにアデノウイルス、及びＡＡＶ等の非エンベロープウイルスがよく知られている。 Currently, in the genetic recombination and medical fields, methods for introducing genes into mammalian cells, including humans, include physical methods using electroporation and metal particles, and chemical methods using nucleic acids, polycations, or liposomes. In addition, there is a biological method that uses a virus-derived gene transfer vector (hereinafter referred to as a virus vector). Viral vectors are vectors that have been modified from naturally occurring viruses to be able to transfer desired genes, etc. into target cells, and technological development has been progressing in recent years. Generally, viral vectors produced using genetic recombination technology are called recombinant viral vectors, and the viruses from which such recombinant viral vectors are derived include retroviruses, lentiviruses, Sendai viruses, and herpesviruses. Enveloped viruses as well as non-enveloped viruses such as adenoviruses and AAV are well known.
特にＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞等の分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること等から、先天性遺伝子疾患の治療の他、癌や感染症の治療を目的とした遺伝子治療法に用いる遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が、近年注目されている。 In particular, AAV can infect cells of a wide variety of species, including humans, and can also infect non-dividing cells that have completed differentiation, such as blood cells, muscles, and nerve cells, and is not pathogenic to humans, so there is little concern about side effects. Because the virus particles are physicochemically stable, they have value as vectors for gene transfer used in gene therapy methods aimed at treating congenital genetic diseases as well as cancer and infectious diseases. It has been attracting attention in recent years.
組換えウイルスベクターの製造方法としては、一般的には、ウイルス粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものを分離して宿主として使用可能な細胞に導入することで、野生型ウイルスの産生、及び遺伝子組換えウイルスの感染先での自立複製を防ぐ方法が取られる。通常、前記ウイルス粒子形成に必須な要素を核酸構築物の形で細胞に導入し、ウイルスを産生する能力を有する細胞（以下、ウイルス産生細胞）が作製される。当該細胞を培養してウイルス粒子形成に必須なすべての要素が当該細胞内で発現されると、ウイルスベクターが生成される。 In general, the method for producing recombinant virus vectors involves separating those elements that require cis supply from those that can be supplied in trans among the elements essential for virus particle formation, and introducing them into cells that can be used as hosts. Therefore, methods are taken to prevent the production of wild-type virus and the autonomous replication of recombinant virus in the infected destination. Usually, the essential elements for virus particle formation are introduced into cells in the form of a nucleic acid construct to produce cells that have the ability to produce viruses (hereinafter referred to as virus-producing cells). When the cells are cultured and all elements essential for virus particle formation are expressed within the cells, a viral vector is produced.
ウイルス産生が達成されたウイルス産生細胞は、その後、回収、破砕され、得られたｒＡＡＶベクターを含む細胞破砕液を適宜フィルターろ過、超遠心、クロマトグラフィー、又は限外ろ過等の工程に供することによってｒＡＡＶベクターが精製され、最終製造物となる。 The virus-producing cells that have achieved virus production are then collected and disrupted, and the resulting cell disruption solution containing the rAAV vector is subjected to appropriate steps such as filter filtration, ultracentrifugation, chromatography, or ultrafiltration. The rAAV vector is purified into the final product.
現在、ｒＡＡＶベクターの利用が遺伝子治療の基礎研究、又は臨床応用の分野に広がるにつれ、より高力価、高純度のｒＡＡＶベクターを、大規模にかつ簡易に取得する方法が必要とされ、各種の改良方法が開示されている。しかし、当該開示された改良方法の多くは、細胞破砕液から非エンベロープウイルスを精製する工程についての工夫であり、非エンベロープウイルスを精製に供する前に実施される「ウイルス産生細胞の処理方法」についての改良は少ない。 Currently, as the use of rAAV vectors spreads to the basic research of gene therapy and the field of clinical application, there is a need for a method to easily obtain rAAV vectors with higher titer and higher purity on a large scale. An improved method is disclosed. However, most of the disclosed improved methods are improvements to the process of purifying non-enveloped viruses from cell lysate, and are not concerned with the "method for processing virus-producing cells" that is carried out before purifying non-enveloped viruses. There are few improvements.
ウイルス産生細胞の処理方法として、凍結融解、超音波処理、機械的破砕、乳鉢・乳棒での破砕、界面活性剤の添加、等が挙げられるが、一般的には、凍結融解が行われることが多い。すなわち、ウイルス産生細胞を含む溶液を凍結融解することにより、細胞を破砕した後、遠心やろ過を行うことにより、ウイルスベクターを含む粗抽出液を取得する。例えば、非特許文献１では、ＡＡＶ産生細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞またはＢＨＫ細胞のペレットにｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を添加し、凍結融解を３回実施した後に、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ処理をし、更に遠心によって溶解物を清澄化している。また、非特許文献２では、ＡＡＶ産生細胞であるＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａＳ３細胞のペレットをｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で懸濁し、凍結融解を３回実施している。 Methods for treating virus-producing cells include freezing and thawing, ultrasonication, mechanical crushing, crushing with a mortar and pestle, and addition of a surfactant, but in general, freezing and thawing is often used. many. That is, by freezing and thawing a solution containing virus-producing cells, the cells are disrupted, and then centrifugation and filtration are performed to obtain a crude extract containing virus vectors. For example, in Non-Patent Document 1, lysis buffer (50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.5) was added to pellets of Expi293F cells or BHK cells, which are AAV-producing cells, and after freeze-thawing three times, Benzonase treatment was performed. The lysate is then further clarified by centrifugation. In addition, in Non-Patent Document 2, pellets of HEK293 cells or HeLaS3 cells, which are AAV-producing cells, were suspended in lysis buffer (20mM Tris [pH 7.5], 150mM NaCl, 10mM MgCl 2 ), and freeze-thawed three times. are doing.
上述したように、非エンベロープウイルスを精製に供する前に実施される「ウイルス産生細胞の処理方法」についての改良は少なく、依然改善の余地が残されている。 As mentioned above, there are few improvements in the "method for processing virus-producing cells" that is carried out before non-enveloped viruses are purified, and there is still room for improvement.
本発明者らは、煩雑な操作なく効率よく非エンベロープウイルスを得ることができる「ウイルス産生細胞の処理方法」を提供することを目的に鋭意研究した結果、非エンベロープウイルスを産生する能力を有する細胞と二価の陽イオンとを含む溶液を凍結融解し、当該溶液から非エンベロープウイルスを取得することにより、煩雑な操作なく効率よく非エンベロープウイルスを取得できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive research aimed at providing a "method for processing virus-producing cells" that can efficiently obtain non-enveloped viruses without complicated operations, the present inventors found that cells capable of producing non-enveloped viruses The present inventors have discovered that non-enveloped viruses can be efficiently obtained without complicated operations by freezing and thawing a solution containing a divalent cation and a non-enveloped virus from the solution, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、
［１］アデノ随伴ウイルスの製造方法であって、
（ａ）アデノ随伴ウイルスを産生する能力を有する細胞と５ｍＭ以上の二価の陽イオンとを含む溶液を凍結融解する工程、及び
（ｂ）（ａ）の溶液からアデノ随伴ウイルスを取得する工程、
を含む、方法、
［２］二価の陽イオンが、マグネシウムイオンである［１］に記載の方法、
［３］溶液が、培地である［１］に記載の方法、
［４］培地が、ＤＭＥＭである［３］に記載の方法、
［５］（ｂ）の工程が、遠心により実施される［１］に記載の方法、
に関する。
That is, the present invention
[1] A method for producing adeno-associated virus, comprising:
(a) a step of freezing and thawing a solution containing cells capable of producing adeno-associated virus and a divalent cation of 5 mM or more; and (b) a step of obtaining adeno-associated virus from the solution of (a).
including a method;
[2] The method according to [1], wherein the divalent cation is a magnesium ion;
[3] The method according to [1], wherein the solution is a medium;
[4] The method according to [3], wherein the medium is DMEM,
[5] The method according to [1], wherein the step (b) is carried out by centrifugation;
Regarding.
本発明により、煩雑な操作なく効率的に非エンベロープウイルス液を得るための製造方法が提供される。更に、当該製造方法に使用される二価の陽イオンを含む溶液、及び当該製造方法を用いて製造した非エンベロープウイルスが提供される。本発明の二価の陽イオンを含む溶液を用いて得られたウイルス粗抽出液は、従来の非エンベロープウイルス精製方法にも適用可能である。 The present invention provides a manufacturing method for efficiently obtaining a non-enveloped virus solution without complicated operations. Furthermore, a solution containing a divalent cation used in the production method and a non-enveloped virus produced using the production method are provided. The crude virus extract obtained using the solution containing divalent cations of the present invention can also be applied to conventional non-enveloped virus purification methods.
以下に本発明について詳細に説明する。
＜定義＞
The present invention will be explained in detail below.
<Definition>
本明細書において「非エンベロープウイルス」という用語は、エンベロープウイルス以外のウイルスを指す。ここでエンベロープウイルスとは、ウイルス表面に脂質層もしくは脂質２重層を持つウイルスを指す。非エンベロープウイルスの代表的なものとしては、ＤＮＡをゲノムとするウイルスについては、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス等、ＲＮＡをゲノムとするウイルスについては、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス等が例示される。 As used herein, the term "non-enveloped virus" refers to viruses other than enveloped viruses. Here, the enveloped virus refers to a virus that has a lipid layer or a lipid bilayer on the virus surface. Typical non-enveloped viruses include viruses whose genome is DNA such as adenovirus, parvovirus, papovavirus, and human papillomavirus, and viruses whose genome is RNA such as rotavirus, coxsackievirus, enterovirus, and sapovirus. , norovirus, poliovirus, echovirus, hepatitis A virus, hepatitis E virus, rhinovirus, astrovirus, and the like.
本発明の製造方法が適用される非エンベロープウイルスに特に限定はなく、既に産生方法が知られた非エンベロープウイルスでも、天然から新たに取得された非エンベロープウイルス、又はそれらを由来とする遺伝子組換えウイルスベクターでもよい。本発明の製造方法で製造される非エンベロープウイルスには、好適にはアデノウイルス、又はパルボウイルス科のＡＡＶやボカウイルスが例示される。 There are no particular limitations on the non-enveloped viruses to which the production method of the present invention can be applied, including non-enveloped viruses for which production methods are already known, non-enveloped viruses newly obtained from nature, or genetically modified viruses derived therefrom. It may also be a viral vector. Preferred examples of the non-enveloped virus produced by the production method of the present invention include adenovirus, AAV of the Parvoviridae family, and Bocavirus.
本明細書においてＡＡＶとは、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する、ヒトを含む霊長目の動物やその他の脊椎動物に感染する小型のウイルスを示す。ＡＡＶはエンベロープを持たない正２０面体の外殻とその内部に１本の１本鎖ＤＮＡを有する。本明細書において、ＡＡＶは野生型ウイルス及びその派生物を含み、特に記載する場合を除き全ての血清型及びクレードを含む。 As used herein, AAV refers to a small virus that belongs to the family Parvoviridae and the genus Dependovirus and infects primates including humans and other vertebrates. AAV has an icosahedral outer shell without an envelope and a single single-stranded DNA inside it. As used herein, AAV includes wild-type viruses and derivatives thereof, and includes all serotypes and clades unless otherwise specified.
本発明の製造方法は、公知のいずれの血清型のＡＡＶにも適用可能であり、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶの製造に利用することができる。本発明の製造方法は、好適にはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６に適用され、さらに好適にはＡＡＶ２に適用される。なお、本明細書においてｒＡＡＶの血清型について述べる場合、キャプシド（ｃａｐｓｉｄ）の由来となる血清型を基準とする。すなわち、ｒＡＡＶ調製時に使用されるｃａｐ遺伝子の由来に応じてそのｒＡＡＶの血清型を決定するものとし、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノムの血清型の由来には依存しないものとする。例えば、キャプシドがＡＡＶ６由来で、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノム中のＩＴＲがＡＡＶ２由来の場合は、本明細書中では当該ｒＡＡＶは血清型６とする。さらに、前記の各血清型のＡＡＶのキャプシドの変異体を含むＡＡＶの製造にも、本発明の製造方法を適用することができる。 The production method of the present invention is applicable to any known serotype of AAV, for example, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, and AAV13. It can be used for the production of at least one type of AAV selected from the group consisting of. The manufacturing method of the present invention is preferably applied to AAV1, AAV2, AAV5, and AAV6, and more preferably to AAV2. In addition, when describing the serotype of rAAV in this specification, the serotype from which the capsid is derived is used as a reference. That is, the serotype of rAAV shall be determined according to the origin of the cap gene used during rAAV preparation, and shall not depend on the origin of the serotype of the AAV genome encapsulated in the rAAV particle. For example, if the capsid is derived from AAV6 and the ITR in the AAV genome encapsulated in the rAAV particle is derived from AAV2, the rAAV is referred to as serotype 6 herein. Furthermore, the production method of the present invention can also be applied to the production of AAV containing capsid variants of each of the above-mentioned serotypes of AAV.
本明細書においてウイルスを産生する能力を有する細胞（以下、ウイルス産生細胞）とは、ウイルス産生に必要な要素を発現し、ウイルス粒子を産生する細胞のことを指す。本発明の製造方法で用いられるウイルス産生細胞に特に限定はなく、環境中や、感染症の患者の臨床検体等から得られたウイルス産生細胞でもよく、人為的に作製したウイルス産生細胞でもよい。好適には、本発明には人為的に作製したウイルス産生細胞が使用され、例えば所望の非エンベロープウイルスの粒子形成に必須な要素を供給する核酸、及び非エンベロープウイルスの粒子に封入される核酸を任意の細胞に導入することにより作製したウイルス産生細胞や、細胞に人為的に非エンベロープウイルス、さらに必要に応じて当該ウイルスを産生させるために必要なヘルパーウイルスを感染させたウイルス産生細胞が使用される。 As used herein, a cell capable of producing a virus (hereinafter referred to as a virus-producing cell) refers to a cell that expresses elements necessary for virus production and produces virus particles. The virus-producing cells used in the production method of the present invention are not particularly limited, and may be virus-producing cells obtained from the environment or from clinical specimens of patients with infectious diseases, or may be artificially produced virus-producing cells. Preferably, artificially produced virus-producing cells are used in the present invention, e.g., to provide nucleic acids that provide essential elements for the formation of particles of a desired non-enveloped virus, and nucleic acids to be encapsulated in particles of a non-enveloped virus. Virus-producing cells produced by introducing the virus into arbitrary cells, or virus-producing cells that are artificially infected with a non-enveloped virus and, if necessary, a helper virus necessary to produce the virus, are used. Ru.
ウイルス産生細胞製造用の細胞としては、特に限定はなく、ヒト、サル、げっ歯類等の哺乳動物細胞を使用することができる。好適には人為的に樹立された細胞株、例えばトランスフェクション効率が高い２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）、２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ－ｈｉ細胞（国際公開第２００６／０３５８２９号パンフレット）、市販のウイルス産生用細胞株、ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が例示される。また、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）などの節足動物細胞（昆虫細胞）が例示される。例えば、前記２９３細胞等はアデノウイルスＥ１タンパク質を恒常的に発現するが、このような、ｒＡＡＶ産生に必要なタンパク質の１つ、又はいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞であってもよい。これらの種々の細胞に対して、公知の方法や市販のキットを用いて以下に挙げるウイルス形成に必要な要素を導入し、ウイルス産生細胞とすることができる。また、当該細胞の培養は、公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９５％ＲＨ、ＣＯ２濃度５～１０％（ｖ／ｖ）での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望のウイルス産生細胞の増殖やウイルスの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。また、培養期間は特に限定はなく、例えば１２～１５０時間、好適には４８～１２０時間である。 Cells for producing virus-producing cells are not particularly limited, and mammalian cells such as human, monkey, and rodent cells can be used. Preferably, artificially established cell lines, such as 293 cells (ATCC CRL-1573), 293T cells (ATCC CRL-3216), 293T/17 cells (ATCC CRL-11268), 293F cells, which have high transfection efficiency, Examples include 293FT cells (all manufactured by Life Technologies), G3T-hi cells (International Publication No. 2006/035829 pamphlet), commercially available cell lines for virus production, and AAV293 cells (Stratagene). Further, arthropod cells (insect cells) such as Sf9 cells (ATCC CRL-1711) are exemplified. For example, the 293 cells etc. constantly express the adenovirus E1 protein, but these cells have been modified to express one or several of the proteins necessary for rAAV production either transiently or constitutively. It may also be a cell. The following elements necessary for virus formation can be introduced into these various cells using known methods or commercially available kits to produce virus-producing cells. Further, the cells can be cultured under known culture conditions. For example, culture may be carried out at a temperature of 30 to 37° C., humidity of 95% RH, and a CO 2 concentration of 5 to 10% (v/v), but the present invention is not limited to such conditions. As long as the desired proliferation of virus-producing cells and production of viruses can be achieved, the reaction may be carried out at temperatures, humidity, and CO 2 concentrations outside the above ranges. Furthermore, the culture period is not particularly limited, and is, for example, 12 to 150 hours, preferably 48 to 120 hours.
ウイルス産生細胞として、ｒＡＡＶ産生細胞を例に挙げて説明すると、ｒＡＡＶ形成に必須な要素として、（Ａ）ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸、（Ｂ）ＡＡＶ由来の要素、例えばＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質、並びに（Ｃ）ヘルパー機能を発揮する要素、例えばアデノウイルス由来のＥ１ａタンパク質、Ｅ１ｂタンパク質、Ｅ２タンパク質、Ｅ４タンパク質及びＶＡＲＮＡ、が挙げられる。これらの要素を任意の細胞に導入することにより、ｒＡＡＶ産生細胞を作製することができる。 Taking rAAV-producing cells as an example of virus-producing cells, essential elements for rAAV formation include (A) nucleic acid encapsulated in rAAV particles, (B) AAV-derived elements such as Rep protein and Cap protein, and (C) elements that exert helper functions, such as adenovirus-derived E1a protein, E1b protein, E2 protein, E4 protein, and VARNA. By introducing these elements into any cell, rAAV-producing cells can be produced.
前記の「（Ａ）ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸」は、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列とｒＡＡＶ粒子に搭載することが望まれる核酸とで構成される。ｒＡＡＶ粒子に搭載することが望まれる核酸としては、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等を供給する核酸が例示される。加えて外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素の１以上がｒＡＡＶ粒子に封入される核酸に挿入されていてもよい。ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は核酸構築物として、プラスミドの形態で細胞に導入することができる。前記のプラスミドは、例えば、市販又は公知のプラスミドを用いて公知の方法により構築することができる。当該プラスミドの例として、ｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ及びｐＡＡＶ－ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒ（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。 The above-mentioned "(A) nucleic acid to be encapsulated in rAAV particles" is composed of an AAV-derived ITR sequence and a nucleic acid that is desired to be loaded into rAAV particles. Nucleic acids that are desired to be loaded onto rAAV particles include any foreign genes, such as polypeptides (enzymes, growth factors, cytokines, receptors, structural proteins, etc.), antisense RNAs, ribozymes, decoys, RNAs that cause RNA interference, etc. An example is a nucleic acid that provides In addition, one or more suitable promoters, enhancers, terminators, and other transcriptional regulatory elements may be inserted into the nucleic acid encapsulated in the rAAV particles to control the expression of the foreign gene. Nucleic acids encapsulated in rAAV particles can be introduced into cells as nucleic acid constructs in the form of plasmids. The above-mentioned plasmid can be constructed by a known method using, for example, a commercially available or known plasmid. Examples of such plasmids include pAAV-ZsGreen1 Vector and pAAV-CMV Vector (both manufactured by Takara Bio Inc.).
前記の「（Ｂ）ＡＡＶ由来の要素、例えばＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質」の形態には限定はなく、それぞれの要素をタンパク質として直接細胞に導入することもできるし、それぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することもできる。これらの核酸の細胞への導入は、例えば、市販又は公知のプラスミド又はウイルスベクターを用いて公知の方法により行うことができる。Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質を供給可能なプラスミドの例として、ｐＲＣ１ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＲＣ５－ Ｖｅｃｔｏｒ、及びｐＲＣ６ Ｖｅｃｔｏｒ（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。 There is no limit to the form of the above-mentioned "(B) AAV-derived elements, such as Rep protein and Cap protein", and each element can be directly introduced into cells as a protein, or Alternatively, multiple nucleic acid constructs can be loaded onto a plasmid or a viral vector and introduced into cells. These nucleic acids can be introduced into cells by, for example, known methods using commercially available or known plasmids or viral vectors. Examples of plasmids capable of supplying Rep protein and Cap protein include pRC1 Vector, pRC2-mi342 Vector, pRC5-Vector, and pRC6 Vector (all manufactured by Takara Bio Inc.).
前記の「（Ｃ）ヘルパー機能を発揮する要素」の形態には限定はなく、それぞれの要素を直接タンパク質として細胞に導入することもできるし、それぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することができる。これらの核酸の細胞への導入は、例えば、市販又は公知のプラスミド又はウイルスベクターを用いて公知の方法により行うことができる。当該プラスミドの例として、ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）が挙げられ。また、プラスミドやウイルスベクターの代わりに、アデノウイルスのようなヘルパー機能を発揮するウイルスを直接細胞に感染させることによっても、上述の目的を達成することができる。 There is no limitation on the form of the above-mentioned "(C) elements that exhibit helper functions"; each element can be directly introduced into cells as a protein, or one or more nucleic acid constructs capable of supplying each element can be used. It can be loaded onto a plasmid or viral vector and introduced into cells. These nucleic acids can be introduced into cells by, for example, known methods using commercially available or known plasmids or viral vectors. An example of the plasmid is pHelper Vector (manufactured by Takara Bio Inc.). Furthermore, the above objective can also be achieved by directly infecting cells with a virus that exhibits a helper function, such as an adenovirus, instead of using a plasmid or a viral vector.
核酸構築物の導入の方法としては、一過性の導入方法が例示される。
一過性に導入する方法には特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法、エレクトロポレーション法等が使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２０２０（以上、Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤ Ｒｅａｇｅｎｔ（以上、ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）等を用いてもよい。また、昆虫細胞をウイルス産生細胞とする場合はバキュロウイルスを用いた導入法を利用することもできる。
An example of the method for introducing the nucleic acid construct is a transient introduction method.
There are no particular limitations on the method of transient introduction, and known transient introduction methods such as the calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, polyethyleneimine (PEI) method, electroporation method, etc. can be used. . In addition, commercially available reagents such as TransIT (registered trademark) -293 Reagent, TransIT (registered trademark) -2020 (all manufactured by Mirus), Lipofectamine 2000 Reagent, Lipofectamine 2000CD Reagent (all manufactured by Life Technologies), FuGene (registered trademark) )Transfection Reagent (manufactured by Promega), etc. may be used. Furthermore, when insect cells are used as virus-producing cells, an introduction method using baculovirus can also be used.
以上、ｒＡＡＶ産生細胞を例に挙げて説明したが、他の非エンベロープウイルスの産生細胞も公知の方法で作製することができる。このようにして作製されたウイルス産生細胞を培養する。ウイルス産生細胞の培養は公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０～３７℃、湿度９５％ＲＨ、ＣＯ２濃度５～１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望のウイルス産生細胞の増殖、及び非エンベロープウイルスの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。また、培養期間は特に限定はなく、ｒＡＡＶ産生細胞の場合は例えば１２～１５０時間、好適には４８～１２０時間である。ウイルス産生細胞の培養に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を含んでいればよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ：Ｆ－１２等の基本合成培地（以上、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社などから販売）、また必要に応じてこれらの基本合成培地にウシ胎児血清、成長因子類、ペプチド類を添加したり、アミノ酸類を増量したりしたものが挙げられる。 Although the explanation has been given above using rAAV producing cells as an example, producing cells of other non-enveloped viruses can also be produced by known methods. The virus-producing cells thus produced are cultured. Virus-producing cells can be cultured under known culture conditions. For example, culture may be carried out at a temperature of 30 to 37° C., humidity of 95% RH, and CO 2 concentration of 5 to 10%, but the present invention is not limited to such conditions. As long as the desired proliferation of virus-producing cells and production of non-enveloped viruses can be achieved, the reaction may be carried out at temperatures, humidity, and CO 2 concentrations outside the above-mentioned ranges. Furthermore, the culture period is not particularly limited, and in the case of rAAV-producing cells, it is, for example, 12 to 150 hours, preferably 48 to 120 hours. The medium used for culturing virus-producing cells only needs to contain components necessary for culturing the cells, such as basic synthetic media such as DMEM, IMDM, and DMEM:F-12 (including those from Thermo Fisher, etc.). (sold from), as well as those in which fetal bovine serum, growth factors, peptides, or amino acids are added to these basic synthetic media as necessary.
＜非エンベロープウイルスの製造方法＞ <Method for producing non-enveloped virus>
上記のように培養されたウイルス産生細胞を、二価の陽イオンを含む溶液と接触させる。当該接触は、培養後に遠心分離やろ過によって培養液を除去して回収されたウイルス産生細胞のペレットを二価の陽イオンを含む溶液に懸濁する操作、もしくはウイルス産生細胞の培養液に「二価の陽イオンを供給可能な成分」を添加する操作、のいずれかにより実施される。なお、二価の陽イオンを含む溶液と接触させる時点でのウイルス産生細胞は、既にウイルス産生が達成された状態であり、二価の陽イオンを含む溶液と接触している間には、基本的にはウイルスの産生や細胞の増殖は見られないこともある。 The virus-producing cells cultured as described above are brought into contact with a solution containing divalent cations. The contact may be carried out by removing the culture medium by centrifugation or filtration after culturing and suspending the collected pellet of virus-producing cells in a solution containing divalent cations, or by adding ``divalent'' to the culture medium of virus-producing cells. It is carried out by any of the following operations: adding a component capable of supplying valent cations. It should be noted that the virus-producing cells at the time of contact with the solution containing divalent cations have already achieved virus production, and while they are in contact with the solution containing divalent cations, the basic In some cases, no virus production or cell proliferation is observed.
ウイルス産生細胞のペレットを二価の陽イオンを含む溶液に懸濁する操作を行う場合における「二価の陽イオンを含む溶液」は、ウイルス産生細胞の培養時の二価の陽イオン濃度より高い濃度の二価の陽イオンを含み、かつ、凍結融解した後に非エンベロープウイルスを含む粗抽出液を取得できる溶液であれば限定はない。 When suspending a pellet of virus-producing cells in a solution containing divalent cations, the concentration of divalent cations in the solution containing divalent cations is higher than the concentration of divalent cations during culture of virus-producing cells. There are no limitations as long as the solution contains divalent cations at a high concentration and can obtain a crude extract containing non-enveloped viruses after freezing and thawing.
二価の陽イオンを含む溶液は、「二価の陽イオンを供給可能な成分」及び「溶媒」を適宜混合することにより調製される。 A solution containing divalent cations is prepared by appropriately mixing "a component capable of supplying divalent cations" and a "solvent".
本発明に使用される「二価の陽イオン」には特に限定はなく、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、カドミウムイオン、ニッケル（ＩＩ）イオン、亜鉛イオン、銅（ＩＩ）イオン、水銀（ＩＩ）イオン、鉄（ＩＩ）イオン、コバルト（ＩＩ）イオン、スズ（ＩＩ）イオン、鉛（ＩＩ）イオン、及びマンガン（ＩＩ）イオンが例示される。特に限定されないが、本発明には、好適にはマグネシウムイオンが使用される。 The "divalent cations" used in the present invention are not particularly limited, and include, for example, magnesium ions, calcium ions, strontium ions, barium ions, cadmium ions, nickel (II) ions, zinc ions, copper (II). ion, mercury (II) ion, iron (II) ion, cobalt (II) ion, tin (II) ion, lead (II) ion, and manganese (II) ion. Although not particularly limited, magnesium ions are preferably used in the present invention.
本発明の「二価の陽イオンを供給可能な成分」には特に限定はなく、マグネシウムイオンを使用する場合、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、が例示される。特に限定されないが、本発明には、好適には塩化マグネシウムが使用される。 The "component capable of supplying divalent cations" of the present invention is not particularly limited, and when magnesium ions are used, magnesium chloride (MgCl 2 ) and magnesium sulfate (MgSO 4 ) are exemplified. Although not particularly limited, magnesium chloride is preferably used in the present invention.
本発明の「溶媒」には特に限定はなく、水、緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、及び培地、が例示され、適宜選択可能である。培地としてはウイルス産生細胞の培養に使用可能なものであれば限定はなく、脊椎動物（哺乳動物）細胞培養用の培地、好適にはＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ－１２及びＤＭＥＭ：Ｆ－１２等の基本合成培地が例示される。さらに、培地は血清を含む培地でもよく、血清を含まない無血清培地、さらに規定された化学組成を有する培地でもよい。特に限定されないが、本発明には、特に好適にはＤＭＥＭが使用される。 The "solvent" of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include water, buffer, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffered saline (TBS), and culture medium, and can be selected as appropriate. The medium is not limited as long as it can be used for culturing virus-producing cells, and medium for vertebrate (mammalian) cell culture, preferably DMEM, IMDM, RPMI1640, Ham's F-12, and DMEM: An example is a basic synthetic medium such as F-12. Furthermore, the medium may be a medium containing serum, a serum-free medium not containing serum, or a medium having a defined chemical composition. Although not particularly limited, DMEM is particularly preferably used in the present invention.
「二価の陽イオンを含む溶液」の中に含まれる、二価の陽イオンの濃度としては、特に限定はないが、例えば、５～２００ｍＭが例示される。溶媒が水の場合、二価の陽イオンの濃度は、特に限定はされないが、２０～８０ｍＭであり、好適には４０～８０ｍＭである。一方、溶媒がＤＭＥＭなどの培地の場合、二価の陽イオンの濃度は、特に限定はされないが、５～１００ｍＭであり、好適には５～８０ｍＭであり、さらに好適には１０～４０ｍＭであり、特に好適には１５～２０ｍＭである。なお、前記の二価の陽イオンの濃度は、溶媒に添加した二価の陽イオンの最終濃度である。 The concentration of divalent cations contained in the "solution containing divalent cations" is not particularly limited, but is exemplified, for example, from 5 to 200 mM. When the solvent is water, the concentration of divalent cations is not particularly limited, but is 20 to 80 mM, preferably 40 to 80 mM. On the other hand, when the solvent is a medium such as DMEM, the concentration of divalent cations is not particularly limited, but is 5 to 100 mM, preferably 5 to 80 mM, and more preferably 10 to 40 mM. , particularly preferably 15-20mM. Note that the above concentration of divalent cations is the final concentration of divalent cations added to the solvent.
なお、二価の陽イオンの濃度については、後述するヌクレアーゼ処理の工程の実施内容に応じて適宜設定することが可能である。すなわち、ヌクレアーゼにあわせて、適切な濃度に調製された二価の陽イオンを含む溶液を使用することが好ましい。本発明においては、好適には、高塩濃度耐性ヌクレアーゼを使用することができる。例えば、低温菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．由来のエンドヌクレアーゼ（Ｃｒｙｏｎａｓｅ Ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（タカラバイオ社製））のマグネシウムイオンの至適濃度は、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）などの他のヌクレアーゼの至適濃度と比較して、高い。すなわち、Ｃｒｙｏｎａｓｅ等の高塩濃度耐性ヌクレアーゼで処理する場合、比較的高濃度のマグネシウムイオンを含む溶液を用いて凍結融解を行った後、溶液を希釈することなく、そのまま当該高塩濃度耐性ヌクレアーゼで処理することができる。 Note that the concentration of divalent cations can be appropriately set depending on the content of the nuclease treatment step described below. That is, it is preferable to use a solution containing divalent cations prepared at an appropriate concentration in accordance with the nuclease. In the present invention, high salt concentration tolerant nucleases can preferably be used. For example, the psychrotrophic bacterium Shewanella sp. The optimal concentration of magnesium ions for the endonuclease (Cryonase Cold-active Nuclease (manufactured by Takara Bio Inc.)) derived from this method is higher than that of other nucleases such as DNase I, DNase II and Benzonase (registered trademark) . That is, when treating with a high salt concentration resistant nuclease such as Cryonase, after freezing and thawing using a solution containing a relatively high concentration of magnesium ions, the solution is directly treated with the high salt concentration tolerant nuclease without diluting the solution. can be processed.
二価の陽イオンを含む溶液は、その他の成分を含んでいてもよく、例えば、緩衝成分、ブドウ糖やショ糖などの糖類、及び一価または複数価の陽イオンまたは陰イオンを含んでいてもよい。なお、二価の陽イオンを含む溶液のｐＨには限定はなく、例えば、ｐＨ５．５～８．５、好ましくはｐＨ６．０～８．０、更に好ましくはｐＨ６．５～７．５が例示される。 Solutions containing divalent cations may also contain other components, such as buffer components, sugars such as glucose or sucrose, and monovalent or multivalent cations or anions. good. Note that the pH of the solution containing divalent cations is not limited, and for example, pH 5.5 to 8.5, preferably pH 6.0 to 8.0, and more preferably pH 6.5 to 7.5. be done.
一方、ウイルス産生細胞の培養液に「二価の陽イオンを供給可能な成分」を添加する操作を行う場合、成分の添加量としては、凍結融解した後に非エンベロープウイルスを含む粗抽出液を取得できる量であれば特に限定されず、ウイルス産生細胞の培養液における二価の陽イオン濃度が前記の「二価の陽イオンを含む溶液」における濃度となる量であればよい。 On the other hand, when performing an operation to add "components capable of supplying divalent cations" to the culture solution of virus-producing cells, the amount of components to be added is as follows: After freezing and thawing, obtain a crude extract containing non-enveloped viruses. The amount is not particularly limited as long as it can be used, and the amount may be such that the concentration of divalent cations in the culture solution of virus-producing cells becomes the concentration in the above-mentioned "solution containing divalent cations."
ウイルス産生細胞と、二価の陽イオンを含む溶液との接触において、細胞濃度および接触時間には特に限定は無い。 In contacting virus-producing cells with a solution containing divalent cations, there are no particular limitations on cell concentration and contact time.
上記のようにして得られた、ウイルス産生細胞と二価の陽イオンとを含む溶液を凍結融解する。 The solution containing virus-producing cells and divalent cations obtained as described above is frozen and thawed.
凍結は、液体窒素、ドライアイス、超低温フリーザー等を用いて実施される。凍結温度と凍結時間は特に限定はなく、温度としては例えば－２００～－２０℃、好適には－９０～－７０℃が例示される。凍結時間は、凍結温度、方法に応じて適宜設定すればよいが、例えば３分間～１時間の範囲で選択すればよい。エタノールドライアイスを使用する場合、５～１０分間の凍結操作が例示される。 Freezing is performed using liquid nitrogen, dry ice, an ultra-low temperature freezer, or the like. The freezing temperature and freezing time are not particularly limited, and examples of the temperature include -200 to -20°C, preferably -90 to -70°C. The freezing time may be appropriately set depending on the freezing temperature and method, and may be selected within the range of 3 minutes to 1 hour, for example. When using ethanol dry ice, a freezing operation for 5 to 10 minutes is exemplified.
融解は、インキュベーターやウォーターバス等を用いて実施される。融解温度と融解時間は特に限定はなく、温度としては例えば３０～４５℃、好適には３５～４０℃、時間としては例えば３分間～１時間、好適には５～１０分間が例示される。 Thawing is performed using an incubator, water bath, or the like. The melting temperature and melting time are not particularly limited, and the temperature is, for example, 30 to 45°C, preferably 35 to 40°C, and the time is, for example, 3 minutes to 1 hour, preferably 5 to 10 minutes.
凍結融解の回数に特に限定は無く、例えば、０回、１回、２回、３回、４回、５回以上が例示される。また、凍結融解を複数回実施する場合において、インターバルの長さには制限はなく、凍結融解が終了した後、または、凍結物を融解する途中に、－８０℃の超低温フリーザー等を用いて再凍結させることができる。本発明において、凍結融解は１回の実施で十分である。本発明の方法で凍結融解を１回行うことにより、二価の陽イオンを含まない溶解バッファーを用いて凍結融解を３回行うよりも、高効率で、非エンベロープウイルスを含む細胞破砕液および／または粗抽出液を取得できる。 There is no particular limitation on the number of times of freezing and thawing, and examples thereof include 0 times, 1 time, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times or more. In addition, when freezing and thawing is carried out multiple times, there is no limit to the length of the interval, and after freezing and thawing is completed or during the process of thawing the frozen material, it may be Can be frozen. In the present invention, one freeze-thaw operation is sufficient. One freeze-thaw process using the method of the present invention can produce cell lysates containing non-enveloped viruses with higher efficiency than three freeze-thaw cycles using a lysis buffer that does not contain divalent cations. Alternatively, a crude extract can be obtained.
上記の凍結融解操作により、ウイルス産生細胞は破砕され、非エンベロープウイルスは細胞外に放出される。なお、本発明の方法は、従来法として一般的な超音波破砕、酵素処理、浸透圧処理等の細胞破砕方法を更に含んでもよいし、含まなくてもよい。 By the above freezing and thawing operation, virus-producing cells are disrupted and non-enveloped viruses are released outside the cells. The method of the present invention may or may not further include conventional cell disruption methods such as ultrasonic disruption, enzyme treatment, and osmotic pressure treatment.
上記の工程を経て得られた、細胞破砕液は、非エンベロープウイルスの取得に供される。例えば、細胞破砕液を遠心分離やフィルターろ過などの物理的分離方法を実施して上清又はろ液を取得して、細胞やその残渣とは分離された粗抽出液を調製することにより、非エンベロープウイルスを取得することができる。好適には、非エンベロープウイルスの取得は、遠心分離により実施される。特に限定されないが、細胞破砕液を９０００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、その上清を回収して非エンベロープウイルスを含む粗抽出液を取得することができる。 The cell lysate obtained through the above steps is used to obtain non-enveloped viruses. For example, by performing a physical separation method such as centrifugation or filter filtration on a cell disruption solution to obtain a supernatant or filtrate, a crude extract separated from cells and their residues can be prepared. Enveloped viruses can be acquired. Preferably, obtaining non-enveloped viruses is performed by centrifugation. Although not particularly limited, a crude extract containing a non-enveloped virus can be obtained by centrifuging the cell disruption solution at 9,000×g, 4° C., for 10 minutes, and collecting the supernatant.
このようにして取得された非エンベロープウイルスを含む粗抽出液は、後述する任意の「非エンベロープウイルスの測定方法」を実施することにより、その試料における、「ウイルスベクターの量」、「キャプシドタンパク質の量」、「ウイルスベクター粒子とウイルスの空キャプシドとの比率」など、所望の値を測定することができる。 The crude extract containing the non-enveloped virus obtained in this way can be used to determine the amount of viral vector and capsid protein in the sample by performing any of the following methods for measuring non-enveloped viruses. Desired values such as "the amount", "the ratio of viral vector particles to viral empty capsids", etc. can be measured.
本発明の方法により、二価の陽イオンを含まない溶解バッファーを用いて凍結融解を行うよりも、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍以上の高効率で、非エンベロープウイルスを含む粗抽出液を取得できる。 The method of the present invention allows 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times more A crude extract containing non-enveloped viruses can be obtained with a high efficiency of 9 times, 9 times, or 10 times or more.
本発明の方法においては、引き続き前記粗抽出物をヌクレアーゼ処理し、さらに超遠心、クロマトグラフィー、限外ろ過、沈殿剤、その他公知の方法による精製に供し、濃縮もしくは精製した非エンベロープウイルスを最終製造物として取得することができる。精製には、市販の試薬やキットを使用することができる。ｒＡＡＶを精製する場合、特に限定されないが、例えば、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いることができる。 In the method of the present invention, the crude extract is subsequently treated with nuclease and further purified by ultracentrifugation, chromatography, ultrafiltration, precipitation, and other known methods to produce a concentrated or purified non-enveloped virus. It can be acquired as an object. Commercially available reagents and kits can be used for purification. When purifying rAAV, for example, AAVpro (registered trademark) Purification Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) can be used, although it is not particularly limited.
ＡＡＶｐｒｏ（登録商標） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いたＡＡＶベクターの精製をより具体的に説明すると、まずは、（１）ＡＡＶベクターを含む粗抽出物に、Ｃｒｙｏｎａｓｅ Ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅを１／１００量（終濃度２００Ｕ／ｍｌ）添加し、３７℃で１時間反応させる。この反応により、非エンベロープウイルスベクターの精製に不要な細胞ゲノムや遊離プラスミド等が切断される。Ｃｒｙｏｎａｓｅは低温菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．由来のエンドヌクレアーゼを組換え大腸菌で発現・精製したものであり、あらゆるＤＮＡおよびＲＮＡ基質（一本鎖、二本鎖、直鎖状、環状）を低温で切断可能である。次に、（２）上記溶液に、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｏｒ Ａを１／１０量添加し、ボルテックスで１０秒間混和後、３７℃で３０分間反応させ、再度ボルテックスで１０秒間混和する。さらに、（３）溶液に１／２０量のＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｏｒ Ｂを添加し、速やかにボルテックスで１０秒間混和し、５０００～９０００×ｇ、４℃で５分間遠心する。（４）上清をＭｉｌｌｅｘ－ＨＶ ０．４５μｍを用いてろ過する。（５）ろ過したＡＡＶベクター溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，１００ｋＤａに添加し、２０００×ｇ、１５℃で５分間遠心し、ＡＡＶベクター溶液が１．５ｍｌ以下になったことを確認する。（６）ろ液を除去後、５ｍｌ のＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをカップ内に添加し、ピペッティングで溶液を均一化し、２０００×ｇ、１５℃で５分間遠心する。ＡＡＶベクター溶液が１．５ｍｌ以下になったことを確認する。（７）上記６の操作を４回（計５回）繰り返し、最終的に任意の容量まで濃縮する。（８）ろ液を除去後、ボルテックスで３０秒間、もしくはピペッティングで十分に懸濁し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，１００ｋＤａカップ内のＡＡＶベクター溶液をチューブに移す。 To explain in more detail how to purify an AAV vector using the AAVpro (registered trademark) Purification Kit, first, (1) add 1/100 amount of Cryonase Cold-active Nuclease to the crude extract containing the AAV vector (final concentration 200 U). /ml) and react at 37°C for 1 hour. This reaction cleaves cell genomes, free plasmids, etc. that are unnecessary for purification of non-enveloped viral vectors. Cryonase is a psychrotrophic bacterium Shewanella sp. The derived endonuclease is expressed and purified in recombinant E. coli, and is capable of cleaving all DNA and RNA substrates (single-stranded, double-stranded, linear, circular) at low temperatures. Next, (2) 1/10 amount of Precipitator A is added to the above solution, mixed by vortexing for 10 seconds, reacted at 37° C. for 30 minutes, and mixed again by vortexing for 10 seconds. Furthermore, (3) add 1/20 amount of Precipitator B to the solution, mix immediately by vortexing for 10 seconds, and centrifuge at 5000-9000×g at 4° C. for 5 minutes. (4) Filter the supernatant using Millex-HV 0.45 μm. (5) Add the filtered AAV vector solution to Amicon Ultra-15,100kDa, centrifuge at 2000 x g and 15°C for 5 minutes, and confirm that the AAV vector solution is 1.5 ml or less. (6) After removing the filtrate, add 5 ml of Suspension Buffer into the cup, homogenize the solution by pipetting, and centrifuge at 2000 x g and 15°C for 5 minutes. Confirm that the AAV vector solution is 1.5 ml or less. (7) Repeat the above operation 6 four times (total 5 times) and finally concentrate to the desired volume. (8) After removing the filtrate, suspend thoroughly by vortexing for 30 seconds or by pipetting, and transfer the AAV vector solution in the Amicon Ultra-15,100 kDa cup to the tube.
本発明の方法により得られた非エンベロープウイルスは、適切な溶液中で、長期間保存することが可能である。例えば、ｒＡＡＶベクターは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に置換した場合、－８０℃の条件下で、例えば、１２時間以上、１日以上、３日以上、１週間以上、２週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、又は６か月以上保存することができる。 The non-enveloped virus obtained by the method of the present invention can be stored for a long period of time in an appropriate solution. For example, when the rAAV vector is replaced with phosphate buffered saline (pH 7.4), it can be used for at least 12 hours, for at least 1 day, for at least 3 days, for at least 1 week, or for 2 weeks at -80°C. In this case, it can be stored for 1 month or more, 2 months or more, 3 months or more, or 6 months or more.
＜非エンベロープウイルスの測定方法＞
非エンベロープウイルスの測定方法として、特に限定はないが、例えば、一定量の試料中の（ａ）非エンベロープウイルスベクターの量、例えばウイルスゲノムの量、または（ｂ）非エンベロープウイルスを構成するタンパク質の量、例えばキャプシドタンパク質の量を測定する方法が挙げられる。
<Method for measuring non-enveloped viruses>
There are no particular limitations on the method for measuring non-enveloped viruses, but for example, (a) the amount of non-enveloped virus vectors, such as the amount of viral genome, or (b) the amount of proteins constituting non-enveloped viruses, in a certain amount of sample. Examples include methods for measuring the amount, for example, the amount of capsid protein.
上記（ａ）の方法としては、試料中のウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲ法で測定する方法が例示される。特に限定はされないが、例えば、ＡＡＶ ｑＰＣＲ迅速タイタ―測定キット（タカラバイオ社製）を使用し、取扱説明書に記載された方法で、ＡＡＶゲノムの量を算出することができる。 An example of the method (a) above is a method of measuring the copy number of the virus genome in a sample using a PCR method. Although not particularly limited, the amount of AAV genome can be calculated, for example, using an AAV qPCR rapid titer measurement kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the method described in the instruction manual.
上記（ｂ）の方法としては、例えば当該タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析する方法あるいは免疫的手法（ＥＬＩＳＡ法など）で定量する方法等が例示される。 Examples of the method (b) above include a method in which the protein is analyzed by SDS-PAGE, a method in which the protein is quantified by an immunological method (ELISA method, etc.), and the like.
上記（ａ）及び（ｂ）を組み合わせることにより、試料中に含まれるウイルスベクター粒子とウイルスの空キャプシドとの比率について計算することができる。すなわち、ウイルスベクター粒子はキャプシドタンパク質及びウイルスゲノムの両方を含むのに対して、ウイルスの空キャプシドはキャプシドタンパク質を含むがウイルスゲノムを含まない。したがって、例えば、ある試料を測定した時に、一定量のキャプシドタンパク質あたりのウイルスゲノムの量が少ない場合、その試料は空キャプシドを多く含むことを示す。 By combining (a) and (b) above, it is possible to calculate the ratio of viral vector particles to viral empty capsids contained in a sample. That is, viral vector particles contain both capsid proteins and viral genomes, whereas empty viral capsids contain capsid proteins but no viral genomes. Therefore, for example, if a sample is measured and the amount of viral genome is low per a given amount of capsid protein, this indicates that the sample contains a large amount of empty capsids.
試料中に含まれるウイルスベクター粒子とウイルスの空キャプシドとの比率を求める方法としては、他にも、（ｃ）電子顕微鏡で観察する方法、が挙げられる。 Other methods for determining the ratio of viral vector particles and empty viral capsids contained in a sample include (c) observation using an electron microscope.
また、試料中に含まれるウイルスベクター粒子が機能的であるかどうか、すなわち標的細胞に感染する能力を有するかどうかを測定する方法として、（ｄ）実験的にウイルスベクター粒子の細胞への感染能力（感染力価）を測定する方法が挙げられる。より具体的には、例えばウイルスベクター粒子を含む試料の系列希釈液をＨｅＬａ細胞などの適当な標的細胞に感染させ、細胞の形状変化（細胞変性）を検出する方法、導入遺伝子の発現を検出する方法、または、細胞に導入されたウイルスゲノムのコピー数を測定する方法等が例示される。 In addition, as a method for measuring whether the viral vector particles contained in a sample are functional, that is, whether they have the ability to infect target cells, (d) experimentally determining the ability of viral vector particles to infect cells; (infectious titer). More specifically, for example, a method of infecting appropriate target cells such as HeLa cells with a serially diluted solution of a sample containing viral vector particles and detecting a change in cell shape (cytopathology) or detecting the expression of a transgene. Examples include methods for measuring the copy number of viral genomes introduced into cells.
＜その他の発明＞ <Other inventions>
本発明により、非エンベロープウイルスの製造方法の他、当該製造方法に使用される二価の陽イオンを含む溶液、及び当該製造方法で製造した非エンベロープウイルスも提供される。また、本発明の製造方法を用いて取得した非エンベロープウイルスを有効成分とする医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、遺伝子治療用のウイルスベクター製剤の製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られた粗抽出液より非エンベロープウイルスを公知の方法で更に濃縮、精製、加工して得られた非エンベロープウイルスを医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することもできる。 The present invention provides a method for producing a non-enveloped virus, as well as a solution containing divalent cations used in the production method, and a non-enveloped virus produced by the production method. Further, a pharmaceutical composition containing a non-enveloped virus obtained using the production method of the present invention as an active ingredient is also provided. The pharmaceutical composition can be appropriately prepared according to the manufacturing technology of viral vector preparations for gene therapy. For example, a non-enveloped virus obtained by further concentrating, purifying, and processing a non-enveloped virus using a known method from a crude extract obtained by the production method of the present invention can be used as a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition can also be used ex vivo on cells derived from a patient or administered directly to the patient.
さらに、本発明の一の態様として、非エンベロープウイルスを製造するためのキットが提供される。本発明のキットは二価の陽イオンを含む溶液を必須の構成要素として含むがさらに、非エンベロープウイルスの粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むベクター、非エンベロープウイルスの粒子に封入される核酸を含むベクター、ヌクレアーゼ、ろ過フィルター等を含んでもよい。 Furthermore, as one aspect of the present invention, a kit for producing non-enveloped viruses is provided. The kit of the present invention includes a solution containing divalent cations as an essential component, and further includes a vector containing a nucleic acid that provides the essential elements for non-enveloped virus particle formation, which is encapsulated in the non-enveloped virus particles. Vectors containing nucleic acids, nucleases, filtration filters, etc. may also be included.
さらに別態様として、二価の陽イオンを含む溶液、ウイルス精製用カラム、およびカラム精製操作に使用される各種の緩衝液、を含むキットであってもよい。 In yet another embodiment, the kit may include a solution containing divalent cations, a virus purification column, and various buffers used in column purification operations.
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。 The present invention will be explained in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples.
実施例１ ＭｇＣｌ２を含まない溶解バッファーを用いた凍結融解との比較
（１）ｒＡＡＶベクター作製用細胞の播種
細胞培養用１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ（イワキ社製）８枚それぞれに、１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を含むＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）１０ｍｌを入れ、そこに２９３Ｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
Example 1 Comparison with freezing and thawing using a lysis buffer that does not contain MgCl 2 (1) Seeding of cells for
（２）プラスミドトランスフェクション
実施例１－（１）で得られた細胞は１０ｍｌのＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）に培地交換を行った。その後、２９３Ｔ細胞に、３種のプラスミド（ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、およびｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製））をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法で、トランスフェクションした。トランスフェクション後、２９３Ｔ細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
(2) Plasmid transfection The cells obtained in Example 1-(1) were subjected to medium exchange with 10 ml of DMEM High-glucose (manufactured by Thermo Fisher). Thereafter, three types of plasmids (pRC2-mi342 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), pHelper Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), and pAAV-ZsGreen1 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.)) were introduced into 293T cells using the polyethyleneimine (PEI) method. I did the transfection. After transfection, 293T cells were cultured in a CO2 incubator at 37°C for 3 days.
（３）ｒＡＡＶベクター産生細胞の回収
実施例１－（２）で得られた１００ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに０．５ｍＭ ＥＤＴＡ １２５μｌ添加し、室温で１０分間保温することで細胞を剥離させた。その後、細胞懸濁液を回収し、１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を除去して細胞ペレットを得た。
(3) Recovery of rAAV vector-producing cells 125 μl of 0.5 mM EDTA was added to the 100 mm culture dish obtained in Example 1-(2), and the cells were detached by incubating at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cell suspension was collected and centrifuged at 1700×g, 4° C. for 10 minutes, and the supernatant was removed to obtain a cell pellet.
（４）抽出用溶液の作製
ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）にＭｇＣｌ２を２０ｍＭになるように添加し、「ＭｇＣｌ２培地」を調製した。
(4) Preparation of extraction solution MgCl 2 was added to DMEM (manufactured by Thermo Fisher) to a concentration of 20 mM to prepare "MgCl 2 medium".
（５）「ＭｇＣｌ２培地」によるｒＡＡＶベクターの粗抽出液の取得
凍結融解を１回行う場合
実施例１－（３）で得られた細胞ペレットを１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いてほぐし、実施例１－（４）で作製したＭｇＣｌ２培地もしくはＭｇＣｌ２を含まない溶解バッファーとしてＰＢＳを各々５００μｌ添加しボルテックスミキサーを用いて混合した。その後、エタノールドライアイス中で５～１０分間程度静置して細胞懸濁液を凍結させたのち、３７℃のウォーターバス５～１０分間程度融解操作を行った。融解後の細胞破砕液をボルテックスミキサーを用いて混合し、９０００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、その上清を回収してｒＡＡＶベクターの粗抽出液とした（各条件Ｎ＝２で行った）。
凍結融解を３回する場合
実施例１－（３）で得られた細胞ペレットを１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いてほぐし、実施例１－（４）で作製したＭｇＣｌ２培地もしくはＭｇＣｌ２を含まない溶解バッファーとしてＰＢＳを５００μｌ添加しボルテックスミキサーを用いて混合した。その後、エタノールドライアイス中で５～１０分間程度静置して細胞懸濁液を凍結させたのち、３７℃のウォーターバスで５～１０分間程度融解操作を行った。融解後の細胞破砕液をボルテックスミキサーを用いて混合した。この凍結融解サイクルを３回行った。そして、細胞破砕液を９０００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、その上清を回収してｒＡＡＶベクターの粗抽出液とした（各条件Ｎ＝２で行った）。
(5) Obtaining crude extract of rAAV vector using "MgCl 2 medium" When freeze-thawing is performed once The cell pellet obtained in Example 1-(3) is loosened using a vortex mixer for about 15 seconds, and then 500 μl of each of the MgCl 2 medium prepared in 1-(4) or PBS as a lysis buffer not containing MgCl 2 was added and mixed using a vortex mixer. Thereafter, the cell suspension was frozen by standing in ethanol dry ice for about 5 to 10 minutes, and then thawed in a water bath at 37° C. for about 5 to 10 minutes. The cell lysate after thawing was mixed using a vortex mixer, centrifuged at 9000 x g and 4°C for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a crude rAAV vector extract (each condition was N = 2). Ta).
When freeze-thawing three times: Loosen the cell pellet obtained in Example 1-(3) using a vortex mixer for about 15 seconds, and use the MgCl 2 medium prepared in Example 1-(4) or MgCl 2- free. 500 μl of PBS was added as a lysis buffer and mixed using a vortex mixer. Thereafter, the cell suspension was frozen by standing in ethanol dry ice for about 5 to 10 minutes, and then thawed in a water bath at 37° C. for about 5 to 10 minutes. The cell disruption solution after thawing was mixed using a vortex mixer. This freeze-thaw cycle was performed three times. Then, the cell disruption solution was centrifuged at 9000×g and 4° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a crude rAAV vector extract (each condition was N=2).
（６）粗抽出液のゲノム力価測定
実施例１－（５）で調製したｒＡＡＶベクターの粗抽出液のゲノム力価を測定した。ゲノム力価測定にはＡＡＶ ｑＰＣＲ迅速タイタ―測定キット（タカラバイオ社製）を使用した。説明書に従い、粗抽出液をＤＮａｓｅＩ処理し、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。
上記の反応液を３７℃、３０分間で保温した後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９５℃、１０分間の熱処理を行った。
このＤＮａｓｅＩ処理済みの溶液２０μｌに、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌを添加し、７０℃、１０分間保温した。保温後、この溶液をＥＡＳＹ ｄｉｌｕｔｉｏｎで１００倍希釈し、この希釈液５μｌをゲノム力価測定に使用した。キット付属のプライマー（ＡＡＶ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、ＡＡＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ）を用いて５０×プライマーミックスを調製した後、反応液は説明書に従い下記のように調製した（１反応当たり）。
リアルタイムＰＣＲとして、初期変性９５℃、２分間行った後、「９５℃、５秒間」、「６０℃、３０秒間」の２ステップサイクルを３５サイクル行った。その後、融解曲線分析を行った。標準品はキット付属のポジティブコントロールを使用した。得られた値及び粗抽出液量から、ベクターゲノム（ｖｇ）を求めた。結果を表１及び図１に示す。
(6) Measurement of genome titer of crude extract The genome titer of the crude extract of the rAAV vector prepared in Example 1-(5) was measured. AAV qPCR rapid titer measurement kit (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for genome titer measurement. According to the instructions, the crude extract was treated with DNaseI to remove free genomic DNA and plasmid DNA.
After incubating the above reaction solution at 37° C. for 30 minutes, heat treatment was performed at 95° C. for 10 minutes to inactivate DNase I.
20 μl of Lysis Buffer was added to 20 μl of this DNase I-treated solution and kept at 70° C. for 10 minutes. After incubation, this solution was diluted 100 times with EASY dilution, and 5 μl of this diluted solution was used for genome titer measurement. After preparing a 50x primer mix using the primers included in the kit (AAV Forward Titer Primer, AAV Reverse Titer Primer), a reaction solution was prepared as follows (per reaction) according to the instructions.
As real-time PCR, initial denaturation was performed at 95°C for 2 minutes, and then 35 cycles of a two-step cycle of "95°C, 5 seconds" and "60°C, 30 seconds" were performed. Melting curve analysis was then performed. The standard product used was the positive control included in the kit. Vector genome (vg) was determined from the obtained value and the amount of crude extract. The results are shown in Table 1 and Figure 1.
（７）
表１及び図１より、ＭｇＣｌ２培地によるｒＡＡＶベクターの抽出効率はＰＢＳと比較して１回の凍結融解でも効率よく抽出可能であることが示された。
(7)
From Table 1 and FIG. 1, it was shown that rAAV vector extraction efficiency using MgCl 2 medium can be extracted even with one freeze-thaw operation compared to PBS.
実施例２ ＭｇＣｌ２を添加したＨ２Ｏを使用した凍結融解によるＡＡＶ抽出効率の上昇効果ついて
（１）ｒＡＡＶベクター作製用細胞の播種
細胞培養用Ｔ２２５フラスコ（コーニング社製）１枚に、１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を含むＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）４０ｍｌを入れ、２９３Ｔ細胞を４×１０６ｃｅｌｌｓ播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
Example 2 About the effect of increasing AAV extraction efficiency by freezing and thawing using H 2 O containing MgCl 2 (1) Seeding of cells for rAAV vector production In one T225 flask for cell culture (manufactured by Corning), 10% 40 ml of DMEM High-glucose (manufactured by Thermo Fisher) containing FBS (manufactured by BioWest) was added, and 293T cells were seeded at 4×10 6 cells. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in a CO 2 incubator at 37°C.
（２）プラスミドトランスフェクション
実施例２－（１）で得られた細胞は４０ｍｌのＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）に培地交換を行った。その後、２９３Ｔ細胞に、３種のプラスミド（ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、およびｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製））をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法で、トランスフェクションした。トランスフェクション後、２９３Ｔ細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
(2) Plasmid transfection The cells obtained in Example 2-(1) were subjected to medium exchange with 40 ml of DMEM High-glucose (manufactured by Thermo Fisher). Thereafter, three types of plasmids (pRC2-mi342 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), pHelper Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), and pAAV-ZsGreen1 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.)) were introduced into 293T cells using the polyethyleneimine (PEI) method. I did the transfection. After transfection, 293T cells were cultured in a CO2 incubator at 37°C for 3 days.
（３）ｒＡＡＶべクター産生細胞の回収
実施例２－（２）で得られたＴ２２５フラスコに０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌを添加し、室温で１０分間保温することで細胞を剥離させた。その後、細胞懸濁液を２６等分しチューブに分注した（１．５ｍｌ／チューブ）。細胞懸濁液それぞれを１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を除去して細胞ペレットを得た。
(3) Collection of rAAV vector-producing cells 500 μl of 0.5 mM EDTA was added to the T225 flask obtained in Example 2-(2), and the cells were detached by incubating at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cell suspension was divided into 26 equal parts and dispensed into tubes (1.5 ml/tube). After centrifuging each cell suspension at 1700 xg and 4°C for 10 minutes, the supernatant was removed to obtain a cell pellet.
（４）抽出用溶液の作製
１Ｍ ＭｇＣｌ２又は１Ｍ ＮａＣｌに注射用水（大塚製薬社製）を添加して下記の塩濃度の「抽出用溶液」を作製した。
（５）各種「抽出用溶液」によるｒＡＡＶベクターの粗抽出液の取得
実施例２－（３）で得られた細胞ペレットを１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いてほぐし、実施例２－（４）で作製した各種の抽出用溶液１００μｌを添加し、１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いて混合した（各条件Ｎ＝２で行った）。その後、フリーザーを使用して－８０℃で５～１０分間程度静置して細胞懸濁液を凍結させたのち、３７℃のインキュベーターを使用して５～１０分間程度融解操作を行った。
融解後のサンプルをボルテックスミキサーを用いて混合し、９０００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、その上清を回収してｒＡＡＶベクターの粗抽出液とした。
(5) Obtaining crude extracts of rAAV vectors using various "extraction solutions" The cell pellet obtained in Example 2-(3) was loosened using a vortex mixer for about 15 seconds, and the cell pellet obtained in Example 2-(4) was 100 μl of each of the prepared extraction solutions was added and mixed for about 15 seconds using a vortex mixer (each condition was N=2). Thereafter, the cell suspension was frozen by standing at -80°C for about 5 to 10 minutes using a freezer, and then thawing was performed for about 5 to 10 minutes using a 37°C incubator.
The thawed sample was mixed using a vortex mixer, centrifuged at 9000 xg, 4°C for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a crude rAAV vector extract.
（６）「粗抽出液」のゲノム力価測定
実施例２－（５）で調製したｒＡＡＶベクターの粗抽出液のゲノム力価を測定した。ゲノム力価測定にはＡＡＶ ｑＰＣＲ迅速タイタ―測定キット（タカラバイオ社製）を使用した。説明書に従い、粗抽出液をＤＮａｓｅＩ処理し、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。
上記の反応液を３７℃、３０分間保温した後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９５℃、１０分間の熱処理を行った。
このＤＮａｓｅＩ処理済みの溶液２０μｌに、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌを添加し、７０℃、１０分間保温した。保温終了後、この溶液をＥＡＳＹ ｄｉｌｕｔｉｏｎで１００倍希釈し、この希釈液５μｌをゲノム力価測定に使用した。キット付属のプライマー（ＡＡＶ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、ＡＡＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ）を用いて５０×プライマーミックスを調製した後、反応液は説明書に従い下記のように調製した（１反応当たり）。
リアルタイムＰＣＲとして、初期変性９５℃、２分間行った後、「９５℃、５秒間」、「６０℃、３０秒間」の２ステップサイクルを３５サイクル行った。その後、融解曲線分析を行った。標準品はキット付属のポジティブコントロールを使用した。得られた値及び粗抽出液量から、ベクターゲノム（ｖｇ）を求めた。結果を表２及び図２に示す。
(6) Measurement of genome titer of "crude extract" The genome titer of the crude extract of the rAAV vector prepared in Example 2-(5) was measured. AAV qPCR rapid titer measurement kit (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for genome titer measurement. According to the instructions, the crude extract was treated with DNaseI to remove free genomic DNA and plasmid DNA.
After incubating the above reaction solution at 37° C. for 30 minutes, heat treatment was performed at 95° C. for 10 minutes to inactivate DNase I.
20 μl of Lysis Buffer was added to 20 μl of this DNase I-treated solution and kept at 70° C. for 10 minutes. After incubation, this solution was diluted 100 times with EASY dilution, and 5 μl of this diluted solution was used for genome titer measurement. After preparing a 50x primer mix using the primers included in the kit (AAV Forward Titer Primer, AAV Reverse Titer Primer), a reaction solution was prepared as follows (per reaction) according to the instructions.
As real-time PCR, initial denaturation was performed at 95°C for 2 minutes, and then 35 cycles of a two-step cycle of "95°C, 5 seconds" and "60°C, 30 seconds" were performed. Melting curve analysis was then performed. The standard product used was the positive control included in the kit. Vector genome (vg) was determined from the obtained value and the amount of crude extract. The results are shown in Table 2 and Figure 2.
（７）
表２及び図２より、ＭｇＣｌ２の塩濃度が４０ｍＭ，８０ｍＭの場合、他の条件と比較して高効率にｒＡＡＶベクターが抽出されることが示された。
(7)
From Table 2 and FIG. 2, it was shown that rAAV vectors were extracted with higher efficiency when the MgCl 2 salt concentration was 40 mM and 80 mM compared to other conditions.
実施例３ ＭｇＣｌ２を添加したＤＭＥＭを使用した凍結融解によるＡＡＶ抽出効率の上昇効果ついて
（１）ｒＡＡＶベクター作製用細胞の播種
細胞培養用Ｔ２２５フラスコ（コーニング社製）１枚に、１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を含むＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）４０ｍｌを入れ、２９３Ｔ細胞を４×１０６ｃｅｌｌｓ播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
Example 3 Regarding the effect of increasing AAV extraction efficiency by freezing and thawing using DMEM supplemented with MgCl 2 (1) Seeding of cells for rAAV vector production In one T225 flask for cell culture (manufactured by Corning), 10% FBS ( 40 ml of DMEM High-glucose (manufactured by Thermo Fisher) containing BioWest (manufactured by Thermo Fisher) was added, and 293T cells were seeded at 4×10 6 cells. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in a CO 2 incubator at 37°C.
（２）プラスミドトランスフェクション
実施例３－（１）で得られた細胞は４０ｍｌのＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）に培地交換を行った。その後、２９３Ｔ細胞に、３種のプラスミド（ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、ｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、およびｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製））をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法で、トランスフェクションした。トランスフェクション後、２９３Ｔ細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養した。
(2) Plasmid transfection The cells obtained in Example 3-(1) were subjected to medium exchange with 40 ml of DMEM High-glucose (manufactured by Thermo Fisher). Thereafter, three types of plasmids (pRC2-mi342 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), pHelper Vector (manufactured by Takara Bio Inc.), and pAAV-ZsGreen1 Vector (manufactured by Takara Bio Inc.)) were introduced into 293T cells using the polyethyleneimine (PEI) method. I did the transfection. After transfection, 293T cells were cultured in a CO2 incubator at 37°C for 3 days.
（３）ｒＡＡＶベクター産生細胞の回収
実施例３－（２）で得られたＴ２２５フラスコに０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌを添加し、室温で１０分間保温することで細胞を剥離させた。その後、細胞懸濁液を２６等分しチューブに分注した（１．５ｍｌ／チューブ）。細胞懸濁液それぞれを１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を除去して細胞ペレットを得た。
(3) Collection of rAAV vector-producing cells 500 μl of 0.5 mM EDTA was added to the T225 flask obtained in Example 3-(2), and the cells were detached by incubating at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the cell suspension was divided into 26 equal parts and dispensed into tubes (1.5 ml/tube). After centrifuging each cell suspension at 1700 xg and 4°C for 10 minutes, the supernatant was removed to obtain a cell pellet.
（４）抽出用溶液の作製
１Ｍ ＭｇＣｌ２又は１Ｍ ＮａＣｌにＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を添加して下記の塩濃度の「抽出用溶液」を作製した。
（５）各種「抽出用溶液」によるｒＡＡＶベクターの粗抽出液の取得
実施例３－（３）で得られた細胞ペレットを１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いてほぐし、実施例３－（４）で作製した各種の抽出用溶液１００μｌを添加し、１５秒間程度ボルテックスミキサーを用いて混合した（各条件Ｎ＝２で行った）。その後、フリーザーを使用して－８０℃で５～１０分間程度静置して細胞懸濁液を凍結させたのち、３７℃のインキュベーターを使用して５～１０分間程度融解操作を行った。
融解後のサンプルをボルテックスミキサーを用いて混合し、９０００×ｇ、４℃、１０分間遠心後、その上清を回収してｒＡＡＶベクターの粗抽出液とした。
(5) Obtaining crude extracts of rAAV vectors using various "extraction solutions" The cell pellet obtained in Example 3-(3) was loosened using a vortex mixer for about 15 seconds, and the cell pellet obtained in Example 3-(4) was 100 μl of each of the prepared extraction solutions was added and mixed for about 15 seconds using a vortex mixer (each condition was N=2). Thereafter, the cell suspension was frozen by standing at -80°C for about 5 to 10 minutes using a freezer, and then thawing was performed for about 5 to 10 minutes using a 37°C incubator.
The thawed sample was mixed using a vortex mixer, centrifuged at 9000 xg, 4°C for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a crude rAAV vector extract.
（６）「粗抽出液」のゲノム力価測定
実施例３－（５）で調製したｒＡＡＶベクターの粗抽出液のゲノム力価を測定した。ゲノム力価測定にはＡＡＶ ｑＰＣＲ迅速タイタ―測定キット（タカラバイオ社製）を使用した。説明書に従い、粗抽出液をＤＮａｓｅＩ処理し、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。
上記の反応液を３７℃、３０分間保温した後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９５℃、１０分間の熱処理を行った。
このＤＮａｓｅＩ処理済みの溶液２０μｌに、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２０μｌを添加し、７０℃、１０分間保温した。保温終了後、この溶液をＥＡＳＹ ｄｉｌｕｔｉｏｎで１００倍希釈し、この希釈液５μｌをゲノム力価測定に使用した。キット付属のプライマー（ＡＡＶ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、ＡＡＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｉｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ）を用いて５０×プライマーミックスを調製した後、反応液は説明書に従い下記のように調製した（１反応当たり）。
リアルタイムＰＣＲとして、初期変性９５℃、２分間行った後、「９５℃、５秒間」、「６０℃、３０秒間」の２ステップサイクルを３５サイクル行った。その後、融解曲線分析を行った。標準品はキット付属のポジティブコントロールを使用した。得られた値及び粗抽出液量から、ベクターゲノム（ｖｇ）を求めた。結果を表３及び図３に示す。
(6) Measurement of genome titer of "crude extract" The genome titer of the crude extract of the rAAV vector prepared in Example 3-(5) was measured. AAV qPCR rapid titer measurement kit (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for genome titer measurement. According to the instructions, the crude extract was treated with DNaseI to remove free genomic DNA and plasmid DNA.
After incubating the above reaction solution at 37° C. for 30 minutes, heat treatment was performed at 95° C. for 10 minutes to inactivate DNase I.
20 μl of Lysis Buffer was added to 20 μl of this DNase I-treated solution, and the mixture was kept at 70° C. for 10 minutes. After incubation, this solution was diluted 100 times with EASY dilution, and 5 μl of this diluted solution was used for genome titer measurement. After preparing a 50x primer mix using the primers included in the kit (AAV Forward Titer Primer, AAV Reverse Titer Primer), a reaction solution was prepared as follows (per reaction) according to the instructions.
As real-time PCR, initial denaturation was carried out at 95°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of a two-step cycle of "95°C, 5 seconds" and "60°C, 30 seconds". Melting curve analysis was then performed. The standard product used was the positive control included in the kit. Vector genome (vg) was determined from the obtained value and the amount of crude extract. The results are shown in Table 3 and Figure 3.
（７）
表３及び図３より、低イオン強度（１５～６０ｍＭ）条件において、ＭｇＣｌ２を添加した条件の方がＮａＣｌを添加した条件より高効率で抽出できることが示された。
(7)
Table 3 and FIG. 3 show that under low ionic strength (15 to 60 mM) conditions, the conditions in which MgCl 2 is added can extract with higher efficiency than the conditions in which NaCl is added.
本発明の非エンベロープウイルスの製造方法により、煩雑な操作なく効率的に非エンベロープウイルス液を得ることができる。本発明の方法により製造された非エンベロープウイルスや当該非エンベロープウイルスを有効成分とする組成物は、遺伝子治療の基礎研究又は臨床応用の分野における遺伝子導入方法として非常に有用である。 By the method for producing a non-enveloped virus of the present invention, a non-enveloped virus solution can be efficiently obtained without complicated operations. The non-enveloped virus produced by the method of the present invention and the composition containing the non-enveloped virus as an active ingredient are very useful as a gene introduction method in the field of basic research or clinical application of gene therapy.
Claims (5)
（ａ）アデノ随伴ウイルスを産生する能力を有する細胞と５ｍＭ以上の二価の陽イオンとを含む溶液を凍結融解する工程、及び
（ｂ）（ａ）の溶液からアデノ随伴ウイルスを取得する工程、
を含む、方法。 A method for producing adeno-associated virus, comprising:
(a) a step of freezing and thawing a solution containing cells capable of producing adeno-associated virus and a divalent cation of 5 mM or more; and (b) a step of obtaining adeno-associated virus from the solution of (a).
including methods.
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