JP2024011913A - Topical anti-aging agents, and topical compositions comprising active ingredient thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バニラの地上部(葉、茎)から単離された化合物(以下、本明細書では、「バニラ由来化合物」又は「本発明化合物」とも称する)の新たな用途に関する。より詳細には、皮膚のアンチエイジングに有用なバニラ由来化合物を含む外用アンチエイジング剤、及び外用組成物に関する。 The present invention relates to a new use of a compound isolated from the aerial parts (leaves, stems) of vanilla (hereinafter also referred to as "vanilla-derived compound" or "compound of the present invention" in this specification). More specifically, the present invention relates to an external anti-aging agent and an external composition containing a vanilla-derived compound useful for skin anti-aging.
皮膚は、外側から表皮、真皮、皮下組織の順に層で形成されている。表皮の内側にある真皮は平均して2 mm の厚さがあり、主にコラーゲンとエラスチンによって構成される。コラーゲンとエラスチンは線維芽細胞によって生成され、肌の柔軟性と弾力性を保持する重要な役割を果たしている。エラスチン分解酵素であるエラスターゼは、加齢や紫外線、活性酸素、ストレスによる刺激によって誘導されることが知られ、エラスターゼによってエラスチンが分解されると、コラーゲンとエラスチンの架橋構造が脆くなり、肌の弾力が失われ、シワの原因となる。エラスターゼ活性を阻害することで、肌の弾力を回復または維持する効果が期待出来る。 The skin is made up of layers in order from the outside: epidermis, dermis, and subcutaneous tissue. The dermis, which lies inside the epidermis, is 2 mm thick on average and is composed primarily of collagen and elastin. Collagen and elastin are produced by fibroblasts and play an important role in maintaining skin's flexibility and elasticity. Elastase, an elastin-degrading enzyme, is known to be induced by stimulation due to aging, ultraviolet rays, active oxygen, and stress.When elastin is degraded by elastase, the crosslinked structure of collagen and elastin becomes brittle, resulting in decreased skin elasticity. is lost, causing wrinkles. By inhibiting elastase activity, it can be expected to have the effect of restoring or maintaining skin elasticity.
また、皮膚真皮の線維芽細胞は、コラーゲン、及びヒアルロン酸といった肌を構成する上で重要な成分を産生する。コラーゲンは、動物の皮膚などの結合組織を形成する構造タンパク質である。コラーゲンは皮膚の強度を保ち、シワのない若々しい肌を保つために重要である。ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主成分となっており、様々な細胞間相互作用に関与している。ヒアルロン酸は皮膚の水分を保つために必須の要素であり、皮膚はヒアルロン酸を産生し蓄積することで、体内の水分の喪失を防ぐと共に、物理的刺激を防御していると考えられている。このため、線維芽細胞のコラーゲン産生およびヒアルロン酸産生を促進することができれば、瑞々しく、ハリのある皮膚を維持することができると考えられる。 Furthermore, fibroblasts in the skin dermis produce important components of the skin, such as collagen and hyaluronic acid. Collagen is a structural protein that forms connective tissues such as animal skin. Collagen is important for maintaining skin strength and keeping it wrinkle-free and youthful. Hyaluronic acid is a main component of the extracellular matrix and is involved in various cell-cell interactions. Hyaluronic acid is an essential element for maintaining moisture in the skin, and it is thought that by producing and accumulating hyaluronic acid, the skin prevents the loss of water in the body and protects against physical stimuli. . Therefore, it is thought that if collagen production and hyaluronic acid production in fibroblasts can be promoted, fresh and firm skin can be maintained.
従来、バニラ属植物を含むラン科植物の植物抽出物には、活性酸素消去作用及び過酸化脂質生成抑制作用があり、抗酸化剤として有用であること、また保湿作用があり、肌荒れや乾燥肌の改善に有用であることが知られている(特許文献1)。またバニラ抽出物には、PDGF成長因子に対して合成刺激活性があること、皮膚性の加齢の予防又は治療に有用であることが知られている(特許文献2)。しかし、特許文献1には、抗酸化作用及び保湿性の評価に使用されている植物抽出物がバニラ属植物のどの部位の抽出物であるかについての記載及び示唆はなく、不明である。特許文献2も同様である。また特許文献2には、「バニラ抽出物」との記載しかなく、使用した抽出溶媒も不明である。さらに、特許文献1及び2には、植物抽出物中のどの成分が抗酸化作用及び保湿作用、または加齢の予防・治療効果を発揮する有効成分であるかについての説明もない。
Conventionally, plant extracts of Orchidaceae plants, including plants of the genus Vanilla, have active oxygen scavenging effects and lipid peroxide production suppressing effects, are useful as antioxidants, and have moisturizing effects, which can help relieve rough and dry skin. It is known that it is useful for improving (Patent Document 1). It is also known that vanilla extract has a synthetic stimulating activity against PDGF growth factor and is useful for preventing or treating skin aging (Patent Document 2). However, in Patent Document 1, there is no description or suggestion as to which part of the Vanilla plant the plant extract used to evaluate the antioxidant effect and moisturizing property is extracted from, and it is unclear. The same applies to
また、バニラ属植物は、その果実(莢果、青莢、種子鞘、バニラビーズンズ等とも称される)の抽出物に多くの香気成分(バニリン、バニリン酸、4-ヒドロキシベンズアルデヒド、4-ヒドロキイ安息香酸等)が含まれており、それらの香りが複雑に絡みあうことで甘い独特な芳香(バニラ香料)を有する。
当該バニラ果実の抽出物は、香料のほか、化粧料の保湿成分や活性成分として有用であることが知られている(特許文献3、非特許文献1)。具体的には、特許文献3には、バニラ・プラニフォリアPFA(バニラ・プラニフォリアの果実をシャネル社独自の分離抽出プロセス[ポリフラクショニング:PFA]に供して調製したバニラ果実油)、及びバニラ・プラニフォリア インテンスウォーター(バニラ果実水)等が、化粧料の活性成分として使用できることが記載されている。また非特許文献1には、シャネル社の美容液(オイルクリーム)には、前述するバニラ・プラニフォリアPFA(バニラ果実油)及びバニラ・プラニフォリア インテンスウォーター(バニラ果実水)が保湿成分として配合されていることが記載されている。
また、特許文献4には、バニラ・プラニフォリアの果実の脂溶性画分(油相に溶解し、水相には溶解しない画分)が、老化、老化に関連する生理学的機序、又は該生理学的機序に関連する表皮及び/又は真皮レベルの異常が原因の症状に対して効果を示すこと、具体的には老化を原因とする皮膚劣化に対して予防改善効果を発揮することが記載されている。
このように、バニラ属植物は、その果実抽出が多用されているのが現状である。
In addition, the extract of the fruit of Vanilla plants (also called pods, green pods, seed pods, vanilla beans, etc.) contains many aromatic components (vanillin, vanillic acid, 4-hydroxybenzaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid, etc.). The complex intertwining of these scents creates a unique sweet aroma (vanilla flavor).
The vanilla fruit extract is known to be useful as a moisturizing ingredient or active ingredient in cosmetics as well as a fragrance (
Furthermore, Patent Document 4 discloses that the fat-soluble fraction (fraction that dissolves in the oil phase but does not dissolve in the aqueous phase) of the fruit of Vanilla planifolia is used to treat aging, the physiological mechanism related to aging, or the physiological mechanism related to aging. It has been described that it is effective against symptoms caused by abnormalities at the epidermal and/or dermal level related to physical mechanisms, and specifically, that it has a preventive and improving effect on skin deterioration caused by aging. ing.
As described above, the fruit extract of plants belonging to the genus Vanilla is currently widely used.
本発明は、皮膚のアンチエイジングに有用なバニラ由来化合物を提供するとともに、当該バニラ由来化合物を含む外用アンチエイジング剤、及び外用組成物を提供することを目的とする。なお、本発明が対象とする外用アンチエイジング剤には、エラスターゼ阻害剤、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進剤、及び皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進剤が含まれる。 An object of the present invention is to provide a vanilla-derived compound useful for skin anti-aging, as well as an external anti-aging agent and an external composition containing the vanilla-derived compound. The external anti-aging agents targeted by the present invention include elastase inhibitors, collagen production promoters in skin fibroblasts, and hyaluronic acid production promoters in skin fibroblasts.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を重ねていたところ、日本国の久留米産のラン科バニラ属植物(Vanilla pompona)の果実部以外の地上部(葉、茎)の含水アルコール抽出物から単離された化合物に、皮膚のアンチエイジングに有用な、エラスターゼ阻害作用、並びに皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進作用、及びヒアルロン酸産生促進作用があることを見出した。またこれらの化合物は、高濃度でもヒト皮膚線維芽細胞の生存率に影響しないことから、皮膚への安全性が高いことが示唆された。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive studies and found that the above-ground parts (leaves, stems) other than the fruit part of Vanilla pompona from Kurume, Japan, contain water. It has been found that a compound isolated from an alcoholic extract has an elastase inhibiting effect, an effect of promoting collagen production in skin fibroblasts, and an effect of promoting hyaluronic acid production, which are useful for skin anti-aging. Furthermore, these compounds did not affect the survival rate of human skin fibroblasts even at high concentrations, suggesting that they are highly safe for the skin.
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を包含するものである。 The present invention was completed based on this knowledge, and includes the following embodiments.
(I)外用アンチエイジング剤
(I-1)一般式(1)で示される化合物を含有する、外用アンチエイジング剤:
(I-2)前記外用アンチエイジング剤が、エラスターゼ阻害剤、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進剤、及び皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進剤よりなる群から選択される少なくとも1種である、(I-1)に記載する外用アンチエイジング剤。
(I-3)前記外用アンチエイジング剤が、一般式(1)で示される化合物を含む、バニラ属植物(Vanilla pompona)の葉及び/又は茎の抽出物を含有するものである、(I-1)又は(I-2)に記載する外用アンチエイジング剤。
(I) External anti-aging agent (I-1) External anti-aging agent containing a compound represented by general formula (1):
(I-2) the external anti-aging agent is at least one selected from the group consisting of elastase inhibitors, collagen production promoters in skin fibroblasts, and hyaluronic acid production promoters in skin fibroblasts; The external anti-aging agent described in (I-1).
(I-3) The external anti-aging agent contains an extract of the leaves and/or stems of a plant of the genus Vanilla (Vanilla pompona), which contains the compound represented by the general formula (1). The external anti-aging agent described in 1) or (I-2).
(II)外用組成物
(II-1)一般式(1)で示される化合物を含有する、外用組成物:
(II-2)化粧品、外用医薬部外品または外用医薬品である、(II-1)に記載する外用組成物。
(II-3)前記外用組成物が、一般式(1)で示される化合物を含む、バニラ属植物(Vanilla pompona)の葉及び/又は茎の抽出物を含有するものである、(II-1)又は(II-2)に記載する外用組成物。
(II-4)前記バニラ属植物(Vanilla pompona)が、日本国福岡県久留米市を産地とするものである、(II-3)記載の外用組成物。
(II) External composition (II-1) External composition containing a compound represented by general formula (1):
(II-2) The composition for external use according to (II-1), which is a cosmetic, a quasi-drug for external use, or a pharmaceutical for external use.
(II-3) The external composition contains an extract of leaves and/or stems of a plant belonging to the genus Vanilla (Vanilla pompona), which contains the compound represented by the general formula (1), (II-1) ) or the external composition described in (II-2).
(II-4) The external composition according to (II-3), wherein the vanilla plant (Vanilla pompona) is produced in Kurume City, Fukuoka Prefecture, Japan.
本発明によれば、皮膚のアンチエイジングに有用な、エラスターゼ阻害作用、並びに皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進作用、及びヒアルロン酸産生促進作用を有するバニラ由来化合物、及びそれを含むバニラの地上部(但し、果実を除く)の抽出物(以下、これを「バニラ抽出物」と略称する場合がある)を提供することができる。 According to the present invention, a vanilla-derived compound having an elastase-inhibiting effect, a collagen production-promoting effect in skin fibroblasts, and a hyaluronic acid production-promoting effect, which are useful for skin anti-aging, and an aerial part of vanilla containing the same ( However, it is possible to provide an extract (hereinafter, this may be abbreviated as "vanilla extract") of (excluding fruits).
本発明が提供するバニラ由来化合物は、エステラーゼ阻害剤の有効成分として有用であり、当該バニラ由来化合物又はそれを含むバニラ抽出物を含有する外用組成物によれば、そのエステラーゼ阻害作用により、肌弾力性維持、肌弾力性低下抑制、又は肌弾力性回復効果を期待することができる。 The vanilla-derived compound provided by the present invention is useful as an active ingredient of an esterase inhibitor, and according to a topical composition containing the vanilla-derived compound or a vanilla extract containing it, skin elasticity increases due to its esterase inhibitory effect. It can be expected to maintain skin elasticity, suppress a decrease in skin elasticity, or restore skin elasticity.
また本発明が提供するバニラ由来化合物は、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進剤の有効成分として有用であり、当該バニラ由来化合物又はそれを含む又はバニラ抽出物を含有する外用組成物によれば、そのコラーゲン産生促進作用により、シワを防止し、張りのある肌への改善効果を期待することができる。 Further, the vanilla-derived compound provided by the present invention is useful as an active ingredient of a collagen production promoter in skin fibroblasts, and according to the vanilla-derived compound or an external composition containing the same or containing vanilla extract, Due to its collagen production promoting effect, it can be expected to prevent wrinkles and improve firmness of the skin.
さらに本発明が提供するバニラ由来化合物は、皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進剤の有効成分として有用であり、当該バニラ由来化合物又はそれを含むバニラ抽出物を含有する外用組成物によれば、そのヒアルロン酸産生促進作用により、肌の水分を保持し(保湿)、瑞々しい肌への改善効果を期待することができる。 Furthermore, the vanilla-derived compound provided by the present invention is useful as an active ingredient of a hyaluronic acid production promoter in skin fibroblasts, and according to an external composition containing the vanilla-derived compound or a vanilla extract containing the same, Due to its hyaluronic acid production promoting effect, it retains moisture in the skin (moisturizing) and can be expected to improve the appearance of fresh skin.
加えて、本発明のバニラ由来化合物は、高濃度でもヒト皮膚線維芽細胞の生存性に影響を与えないことから、外用組成物への配合成分として使用可能である。 In addition, the vanilla-derived compound of the present invention does not affect the viability of human skin fibroblasts even at high concentrations, and therefore can be used as a component in external compositions.
(I)バニラ由来化合物
本発明が対象とするバニラ由来化合物は、下記一般式(1)に示すように、2つのグルコース残基がそれぞれベンジル基を介して、2-イソプロピルリンゴ酸(R1が水素原子である場合)、若しくはイソプロピル酒石酸(R1が水酸基である場合)に結合してなる構造を有する。
前記式(1)中、R1が水素原子である化合物を本明細書では化合物1と称する。化合物1には、bis [4-(β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl malateが含まれる。
また、前記式(1)中、R1が水酸基である化合物を本明細書では化合物2と称する。化合物2には、bis [4-(β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl tartrateが含まれる。当該化合物は、バニラグルコシドAとしても知られている。
In the above formula (1), a compound in which R 1 is a hydrogen atom is referred to herein as compound 1. Compound 1 includes bis [4-(β-DO-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl malate.
Further, in the above formula (1), a compound in which R 1 is a hydroxyl group is referred to as
これらの化合物は、ラン科バニラ属植物のうち、日本国福岡県久留米産のバニラ(Vanilla pompona)の地上部のうち、葉及び茎に含まれており、その含水アルコールの抽出物から単離することができる。単離方法の詳細は、後述する実験例1に記載する。 These compounds are contained in the leaves and stems of the aerial parts of Vanilla pompona from Kurume, Fukuoka Prefecture, Japan, which is a member of the Vanilla family, and is isolated from its hydroalcoholic extract. be able to. Details of the isolation method are described in Experimental Example 1 described below.
化合物1及び2(本明細書では、両者を区別することなく「本バニラ由来化合物」と称する)は、後述する実験例2に示すように、ヒト皮膚線維芽細胞由来のエラスターゼ活性を阻害する作用を有する。このため、肌の弾力性維持、肌の弾力性低下抑制、及び/又は肌の弾力性回復に寄与することが期待される。また、本バニラ由来化合物は、後述する実験例2に示すように、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生及びヒアルロン酸産生を促進する作用を有する。このため、肌に張りと瑞々しさを与え、シワ防止に寄与することが期待される。 Compounds 1 and 2 (herein referred to as "this vanilla-derived compound" without distinguishing between the two) have the effect of inhibiting elastase activity derived from human skin fibroblasts, as shown in Experimental Example 2 described below. has. Therefore, it is expected to contribute to maintaining skin elasticity, suppressing a decrease in skin elasticity, and/or restoring skin elasticity. In addition, the present vanilla-derived compound has the effect of promoting collagen production and hyaluronic acid production in human skin fibroblasts, as shown in Experimental Example 2 described below. Therefore, it is expected to give firmness and freshness to the skin and help prevent wrinkles.
(II)外用アンチエイジング剤
本発明の外用アンチエイジング剤は、前述する化合物1及び2の少なくとも1つ(本バニラ由来化合物)を有効成分として含有することを特徴とする。 本発明の外用アンチエイジング剤は、有効成分である本バニラ由来化合物の作用に基づいて、エラスターゼ阻害作用、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進作用、及び皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用の中から選択される少なくとも1つの作用を有し、それにより、加齢によって生じる皮膚の弾力性の低下及び/又は瑞々しさの低下を抑制するように作用する。
(II) Anti-aging agent for external use The anti-aging agent for external use of the present invention is characterized by containing at least one of the aforementioned compounds 1 and 2 (this vanilla-derived compound) as an active ingredient. The external anti-aging agent of the present invention has an effect of inhibiting elastase, promoting collagen production in skin fibroblasts, and promoting hyaluronic acid production in skin fibroblasts based on the effects of the vanilla-derived compound as an active ingredient. It has at least one effect selected from the following, and thereby acts to suppress a decrease in skin elasticity and/or a decrease in freshness caused by aging.
本発明でいう「外用アンチエイジング剤」という用語には、エラスターゼ阻害剤、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進剤、及び皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進剤が含まれる。つまり、本発明の外用アンチエイジング剤は、本バニラ由来化合物が有するエラスターゼ阻害作用に基づいてエラスターゼ阻害剤として使用することができる。また、本発明の外用アンチエイジング剤は、本バニラ由来化合物が有する皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用に基づいて、それぞれコラーゲン産生促進剤及びヒアルロン酸産生促進剤として使用することができる。 The term "external anti-aging agent" as used in the present invention includes elastase inhibitors, collagen production promoters in skin fibroblasts, and hyaluronic acid production promoters in skin fibroblasts. That is, the external anti-aging agent of the present invention can be used as an elastase inhibitor based on the elastase inhibitory effect of the vanilla-derived compound. Further, the external anti-aging agent of the present invention is used as a collagen production promoter and a hyaluronic acid production promoter, respectively, based on the collagen production promoting effect and hyaluronic acid production promoting effect in skin fibroblasts of the vanilla-derived compound. be able to.
本発明の外用アンチエイジング剤は、後述する外用組成物、好ましくは肌弾力性や保水性を保持し、シワを防止することで、加齢に伴う皮膚の老化を抑制または改善する作用を有するアンチエイジング用の外用組成物を調製するための原料(有効成分含有原料)として用いることができる。 The external anti-aging agent of the present invention is a topical composition described below, preferably an anti-aging agent that has the effect of suppressing or improving skin aging associated with age by maintaining skin elasticity and water retention and preventing wrinkles. It can be used as a raw material (active ingredient-containing raw material) for preparing an external composition for aging.
本発明の外用アンチエイジング剤は、本バニラ由来化合物を精製された状態で含むものであってもよい。しかし、本バニラ由来化合物は、前述するように、久留米産バニラ(Vanilla pompona)の地上部である葉及び茎に含まれている成分であるため、前述する作用が損なわれないことを限度として、その葉及び/又は茎の抽出物またはその粗精製物を含むものであってもよい。但し、植物抽出物またはその粗精製物は、本バニラ由来化合物を含み、前述する作用を有するとともに、安全性の点から外用に適したものであればよく、原料と使用する植物は必ずしもバニラ(Vanilla pompona)である必要はない。
本発明の外用アンチエイジング剤は、好ましくは精製された本バニラ由来化合物を含むか、または本バニラ由来化合物を植物抽出物から分画し濃縮した状態で含む本バニラ由来化合物含有画分を含有するものである。
The external anti-aging agent of the present invention may contain the vanilla-derived compound in a purified state. However, as mentioned above, this vanilla-derived compound is a component contained in the above-ground parts of the leaves and stems of Kurume-produced vanilla (Vanilla pompona), so as long as the above-mentioned effects are not impaired, It may contain extracts of its leaves and/or stems or crudely purified products thereof. However, the plant extract or its crude product may contain the present vanilla-derived compound, have the above-mentioned effects, and be suitable for external use from a safety point of view, and the plant used as the raw material may not necessarily be vanilla ( Vanilla pompona).
The external anti-aging agent of the present invention preferably contains a purified vanilla-derived compound, or a fraction containing the vanilla-derived compound fractionated from a plant extract and containing the vanilla-derived compound in a concentrated state. It is something.
外用アンチエイジング剤中に含まれる本バニラ由来化合物の量は、エラスターゼ阻害剤、コラーゲン産生促進剤、及びヒアルロン酸産生促進剤の各用途に応じて、外用組成物に添加配合した場合に、これらの各作用を発揮する割合であればよく、1~100質量%の範囲から適宜設定することができる。 The amount of this vanilla-derived compound contained in the external anti-aging agent is determined depending on the use of the elastase inhibitor, collagen production promoter, and hyaluronic acid production promoter, and the amount of these compounds when added to the external composition. It is sufficient that the proportion exhibits each effect, and can be set as appropriate from the range of 1 to 100% by mass.
(III)外用組成物
本発明の外用組成物は、前述する化合物1及び2の少なくとも1つ(本バニラ由来化合物)を有効成分として含有することを特徴とする。本バニラ由来化合物を含む原料として、前述する外用アンチエイジング剤(エラスターゼ阻害剤、コラーゲン産生促進剤、又はヒアルロン酸産生促進剤)を用いることもできる。
本発明の外用組成物は、本バニラ由来化合物が有するアンチエイジング作用(エラスターゼ阻害作用、コラーゲン産生促進作用、又はヒアルロン酸産生促進作用)に基づいて、肌弾力性や保水性を保持し、シワを防止することで、皮膚老化を抑制または改善する作用を有するアンチエイジング用の外用組成物として調製することができる。
(III) External composition The external composition of the present invention is characterized by containing at least one of the aforementioned compounds 1 and 2 (this vanilla-derived compound) as an active ingredient. As the raw material containing the present vanilla-derived compound, the external anti-aging agent described above (elastase inhibitor, collagen production promoter, or hyaluronic acid production promoter) can also be used.
The external composition of the present invention maintains skin elasticity and water retention and reduces wrinkles based on the anti-aging effects (elastase inhibitory effect, collagen production promoting effect, or hyaluronic acid production promoting effect) of this vanilla-derived compound. By preventing skin aging, it is possible to prepare an anti-aging external composition that has the effect of suppressing or improving skin aging.
本発明の外用組成物中に含まれる本バニラ由来化合物の割合は、外用組成物をヒト皮膚線維芽細胞に適用することで、当該細胞におけるエラスターゼ活性を抑制する作用を発揮するか、または、当該細胞でのコラーゲン産生及び/又はヒアルロン酸産生が促進され、コラーゲン量及び/又はヒアルロン酸量を増加させる作用が発揮される割合であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。通常0.00001~80重量%の範囲から適宜選択することができる。好ましくは0.0001~30重量%、より好ましくは0.001~20重量%である。皮膚線維芽細胞におけるエラスターゼ阻害活性、コラーゲン産生量、ヒアルロン酸産生量の測定及び評価方法は、後述する実験例2及び3に記載の通りであり、この記載に従って実施することができる。好ましくは、本バニラ由来化合物が有する前記作用に基づいて、加齢による肌劣化症状(皮膚老化症状)が抑制または/および改善できる量である。 The proportion of the vanilla-derived compound contained in the topical composition of the present invention is such that when the topical composition is applied to human skin fibroblasts, it exerts an effect of suppressing elastase activity in the cells, or There is no particular limitation as long as the rate is such that collagen production and/or hyaluronic acid production in cells is promoted and an effect of increasing the amount of collagen and/or hyaluronic acid is exerted. Usually, it can be appropriately selected from the range of 0.00001 to 80% by weight. The amount is preferably 0.0001 to 30% by weight, more preferably 0.001 to 20% by weight. The methods for measuring and evaluating elastase inhibitory activity, collagen production, and hyaluronic acid production in skin fibroblasts are as described in Experimental Examples 2 and 3 described below, and can be carried out according to these descriptions. Preferably, the amount is such that skin deterioration symptoms due to aging (skin aging symptoms) can be suppressed and/or improved based on the above-mentioned effects of the present vanilla-derived compound.
本発明の外用組成物には、外用の医薬品、医薬部外品または化粧品が含まれる。好ましくは化粧料である。 The external composition of the present invention includes external medicines, quasi-drugs, or cosmetics. Cosmetics are preferred.
本発明の外用組成物は、種類や用途に応じて、固形剤、半固形剤(クリーム剤を含む)、液剤、及び乳液剤等の各種剤形の組成物に調製することが可能である。 The external composition of the present invention can be prepared in various dosage forms, such as solid preparations, semi-solid preparations (including cream preparations), liquid preparations, and emulsion preparations, depending on the type and use.
外用の医薬品または医薬部外品としての形態としては、例えば、硬膏剤、軟膏剤、クリーム剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、乳液剤、液剤、エアゾール剤を挙げることができる。 Examples of the form of pharmaceuticals or quasi-drugs for external use include plasters, ointments, creams, poultices, liniments, lotions, emulsions, liquids, and aerosols.
化粧品としての形態は特に限定されるものではないが、例えばスキンケア化粧品として化粧水、美容液、パック、マッサージクリーム、乳液、モイスチャークリーム、リップクリーム等;メーキャップ化粧品としてファンデーション、白粉、口紅、ほほ紅、アイシャドウ等とすることができる。上記化粧品には、一般に化粧品に用いられている各種化粧品成分を適宜配合することができる。好ましくは、制限されないものの、上記の理由から乳液やクリーム等の乳化物の形態を有する組成物である。 The form of cosmetics is not particularly limited, but for example, skin care cosmetics include lotion, serum, pack, massage cream, milky lotion, moisture cream, lip balm, etc.; makeup cosmetics include foundation, white powder, lipstick, cheek rouge, etc. It can be used as an eye shadow or the like. The above-mentioned cosmetics may appropriately contain various cosmetic ingredients commonly used in cosmetics. Preferably, the composition is in the form of an emulsion such as a milky lotion or a cream for the above reasons, although it is not limited thereto.
本発明の外用組成物には、所望の効果を損なわない範囲で、通常の外用組成物に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、アミノ酸類、ビタミン類、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、抗炎症剤、肌荒れ改善剤、ニキビ用薬剤、アルカリ類、キレート剤の成分を配合することもできる。また、皮膚吸収促進剤(皮膚浸透促進剤)を配合することもできる。皮膚吸収促進剤(皮膚浸透促進剤)としては、本発明化合物の経皮浸透性を高め、皮膚線維芽細胞への吸収を促進する作用を有するものを使用することができる。かかるものとして、例えば、各種の界面活性剤(アニオン性、カチオン性、ノニオン性界面活性剤)、脂肪酸・脂肪酸エステル(オレイン酸、ミリスチン酸イソプロピル、中鎖脂肪酸トリグリセライド等)、生分解性促進剤(アルキルエステル、アミノカプロン酸)、その他、アミノ酸、テルペン類、ピロリドン類、尿素、リン脂質、各種の溶媒(ポリオール、低級アルコール、高級アルコール、ジメチルスルホキシド等)を制限なく例示することができる。 The external composition of the present invention contains oils and fats, waxes, hydrocarbons, fatty acids, alcohols, esters, and amino acids, which are ingredients used in ordinary external compositions, to the extent that the desired effects are not impaired. , vitamins, surfactants, pH adjusters, preservatives, fragrances, moisturizers, powders, ultraviolet absorbers, thickeners, pigments, antioxidants, whitening agents, anti-inflammatory agents, rough skin improvers, for acne Components such as drugs, alkalis, and chelating agents can also be blended. Further, a skin absorption enhancer (skin penetration enhancer) can also be blended. As the skin absorption enhancer (skin penetration enhancer), those having the effect of increasing transdermal permeability of the compound of the present invention and promoting absorption into skin fibroblasts can be used. Examples of such substances include various surfactants (anionic, cationic, and nonionic surfactants), fatty acids and fatty acid esters (oleic acid, isopropyl myristate, medium-chain fatty acid triglyceride, etc.), biodegradability promoters ( Examples include, without limitation, amino acids, terpenes, pyrrolidones, urea, phospholipids, and various solvents (polyols, lower alcohols, higher alcohols, dimethyl sulfoxide, etc.).
以上、本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。 As mentioned above, in this specification, the terms "comprising" and "containing" include the meanings of "consisting of" and "consisting essentially of."
以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、室温(25±5℃)、及び大気圧条件下で実施した。なお、特に言及しない限り、以下に記載する「%」は「質量%」、「部」は「質量部」を意味する。 Hereinafter, the present invention will be explained using experimental examples in order to help understand the structure and effects of the present invention. However, the present invention is not limited in any way by these experimental examples. The following experiments were conducted at room temperature (25±5° C.) and atmospheric pressure conditions unless otherwise noted. In addition, unless otherwise mentioned, "%" described below means "mass %" and "part" means "mass part."
実験例1 本発明化合物の単離と同定
(1)本発明化合物の単離
日本国福岡県久留米市産のバニラ(Vanilla pompona)の葉を、凍結乾燥(-50℃、40 pa)した後、ミルミキサーにて粉砕した。粉砕したサンプルに90%メタノール水溶液を加え、ソックスレー抽出を行った。ロータリーエバポレーターにて抽出後の溶媒を留去し、メタノール抽出物を得た。
Experimental Example 1 Isolation and Identification of the Compound of the Present Invention (1) Isolation of the Compound of the Present Invention After freeze-drying (-50°C, 40 pa) leaves of Vanilla pompona from Kurume City, Fukuoka Prefecture, Japan, It was ground with a mill mixer. A 90% methanol aqueous solution was added to the crushed sample, and Soxhlet extraction was performed. The solvent after extraction was distilled off using a rotary evaporator to obtain a methanol extract.
メタノール抽出物の分画には、順相シリカゲルまたは逆相C18フラッシュカラムクロマトグラフィーを備えた超高速フラッシュ自動精製システム(Biotage[登録商標] selekt:バイオタージ・ジャパン株式会社製)を使用した。化合物の精製は、分取クロマトグラフィーシステム(MPLC)Pure C-850 Flash prep[登録商標](BUCHI社製)を用い、UVおよびELSD検出器で行った。分析用TLCは、プレコートシリカゲル60 GF254(20×20 cm、膜厚0.2 mm) またはアルミニウムシート上のプレコートRP-C18 F254プレート(5×7.5 cm、膜厚0.2 mm)で実施した。分析用TLCプレートを適切な溶媒で展開し、254 nmと366 nmの紫外吸光下で検出されるスポットを観察した。さらに、バニリン/硫酸試薬をスプレーして可視化した後、110℃に予熱したオーブンで5分間温め、硫酸発色で検出されるスポットを観察した。
For fractionation of the methanol extract, an ultrafast flash automatic purification system (Biotage® selekt: manufactured by Biotage Japan Co., Ltd.) equipped with normal-phase silica gel or reverse-phase C18 flash column chromatography was used. The compound was purified using a preparative chromatography system (MPLC) Pure C-850 Flash prep [registered trademark] (manufactured by BUCHI) using UV and ELSD detectors. Analytical TLC was performed on
得られた画分について、ロータリーエバポレーターにて溶媒を留去し、各分画物の収量を測定した。その結果、最も収量が多かった画分について、再度、MPLCを用いて異なる溶媒条件により粗分画を行い、85画分(A1-15、B1-15、C1-9、C10-15、D1-15、E1-15、F1-10)を得た。
順相TLCにおいてUV(254nm)スポットが確認された画分C10-15について、再度、逆相条件でのMPLCにより分画を行った。溶離液には水とメタノールを用いてグラジエント条件にて含有成分を溶出させた。MPLC 検出器として、UV 検出器(検出波長:220、254、280、365 nm)及びELSD 検出器を用いた。
The solvent was distilled off from the obtained fractions using a rotary evaporator, and the yield of each fraction was measured. As a result, the fraction with the highest yield was crudely fractionated again using MPLC under different solvent conditions, and 85 fractions (A1-15, B1-15, C1-9, C10-15, D1- 15, E1-15, F1-10).
Fraction C10-15, in which a UV (254 nm) spot was confirmed by normal phase TLC, was fractionated again by MPLC under reversed phase conditions. The components were eluted under gradient conditions using water and methanol as the eluent. A UV detector (detection wavelength: 220, 254, 280, 365 nm) and an ELSD detector were used as MPLC detectors.
画分C10-15のMPLCクロマトグラムを図1に示す。
図1の枠上に示す間隔で59つの画分を分取し、各画分を逆相TLCに供して、その プロファイル(UV波長:254nm)を確認した。その結果、MPLCクロマトグラム(図1)で検出された大きなピークのうち、1番目のピークに含まれる画分5-9、及び3番目のピークに含まれる画分20-23について検出されたUVスポットは、いずれも単一であり、これらの画分には各々単一の成分が含まれていることが確認された。
The MPLC chromatogram of fraction C10-15 is shown in Figure 1.
Fifty-nine fractions were collected at the intervals shown on the frame in Figure 1, and each fraction was subjected to reversed-phase TLC to confirm its profile (UV wavelength: 254 nm). As a result, among the large peaks detected in the MPLC chromatogram (Figure 1), the UV detected for fractions 5-9 included in the first peak and fractions 20-23 included in the third peak. It was confirmed that all spots were single, and each of these fractions contained a single component.
(2)単離成分の同定
前記で単離された成分(画分5-9、画分20-23)について、その旋光をJasco P-2200 偏光計(日本分光株式会社製)で測定した。また、1次元NMRスペクトルを、Bruker DRX 600 NMR spectrometer(Bruker社製)で取得した(内部標準:テトラメチルシラン)。さらに高分解能MS データをLC-MS-IT-TOFを用いて取得した。
次いで、1次元NMRデータ、質量分析結果、及び先行文献で報告されているNMRスペクトルと比較することにより同定を行った。
その結果、後述するように、画分20-23の成分は、下記式(a)に示す構造を有するbis [4-(β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropylmalate(化合物1)であると同定した。また、画分5-9の成分は、下記式(b)に示す構造を有するbis [4-(β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl tartrate(化合物2)であると同定した。
(2) Identification of isolated components The optical rotations of the components isolated above (fraction 5-9, fraction 20-23) were measured using a Jasco P-2200 polarimeter (manufactured by JASCO Corporation). In addition, a one-dimensional NMR spectrum was obtained using a Bruker DRX 600 NMR spectrometer (manufactured by Bruker) (internal standard: tetramethylsilane). Furthermore, high-resolution MS data were acquired using LC-MS-IT-TOF.
Identification was then performed by comparing the one-dimensional NMR data, mass spectrometry results, and NMR spectra reported in prior literature.
As a result, as described below, the component of fractions 20-23 was bis[4-(β-DO-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropylmalate (compound 1) having the structure shown in formula (a) below. It was identified that there is. Furthermore, the component of fractions 5-9 was identified as bis [4-(β-DO-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl tartrate (compound 2) having the structure shown in formula (b) below.
化合物1および2の1Hおよび13C NMR データ(DMSO-d6、δ in ppm)を表1に示す。
1 H and 13 C NMR data (DMSO-d6, δ in ppm) of
(a)化合物1の同定
化合物1は非晶質の白色粉末として得られ、旋光度は[α]20D -42.3 (c 0.48、 メタノール溶媒)であった。高分解能MS分析では、分子式C33H44O17に対応するm/z: 711.2509に脱プロトン化分子イオンピーク[M-H]-が観察された。
1H 及び13C- NMR データにより、δH 2.61(J=15.6) 及び2.85(J=15.6) に2つのメチレンダブレット、δc173.9及び170.0に2つのエステルカルボニル、δc 41.8及び77.3に2つの炭素が観測された。さらに、0.73 (6.9) と0.82 (6.9) に2つのメチルダブレット、δH1.83にメチンが観測された。これまでのデータから2-イソプルピル-リンゴ酸部位の存在が示唆されている(非特許文献2)。1H-NMRでは、2組のAA'BB' シグナルがδH 7.27、2H (J=8.8) 7.28、2H (J=8.8), 7.01、4H (J=8.7) で重なり、4つのメチレンプロトンがδH 4.94 (J=12.4) で示された。94(J=12.4)、4.95 (J=12.4)、4.9(J=12.0)、5.05, H, d, (J=12.0) であり、2つの1,4-二置換ベンジルユニットの存在が示唆された。また、δH4.85 (J=7.2) 及び4.86 ppm (J=7.6) に2つのアノマー原子を示した。δc 100.28、100.30、73.2、76.6、69.7、77.0及び60.7のシグナルは、糖部分としてグルコースが示唆された(非特許文献2)。
これらのデータ及び先行文献(非特許文献3)に基づき、化合物1 は、前述するようにbis [4-(β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropylmalateと同定された。
(a) Identification of Compound 1 Compound 1 was obtained as an amorphous white powder, and the optical rotation was [α]20D -42.3 (c 0.48, methanol solvent). In high-resolution MS analysis, a deprotonated molecular ion peak [MH] - was observed at m/z: 711.2509, which corresponds to the molecular formula C 33 H 44 O 17 .
1 H and 13 C- NMR data show two methylene doublets at δ H 2.61 (J=15.6) and 2.85 (J=15.6), two ester carbonyls at δ c 173.9 and 170.0, and two at δ c 41.8 and 77.3. Carbon was observed. Furthermore, two methyl doublets at 0.73 (6.9) and 0.82 (6.9) and methine at δ H 1.83 were observed. Previous data suggest the existence of a 2-isopropyl-malic acid moiety (Non-Patent Document 2). In 1 H-NMR, two sets of AA'BB' signals overlap at δ H 7.27, 2H (J=8.8) 7.28, 2H (J=8.8), 7.01, 4H (J=8.7), and four methylene protons It was shown as δ H 4.94 (J=12.4). 94 (J=12.4), 4.95 (J=12.4), 4.9 (J=12.0), 5.05, H, d, (J=12.0), suggesting the presence of two 1,4-disubstituted benzyl units. Ta. Also, two anomeric atoms were shown at δ H 4.85 (J=7.2) and 4.86 ppm (J=7.6). The signals of δ c 100.28, 100.30, 73.2, 76.6, 69.7, 77.0 and 60.7 suggested glucose as the sugar moiety (Non-Patent Document 2).
Based on these data and the prior literature (Non-Patent Document 3), Compound 1 was identified as bis[4-(β-DO-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropylmalate, as described above.
(b)化合物2の同定
化合物 2は、非晶質の白色粉末として得られ、旋光度は [α]20D -33.8 (c 0.48, メタノ ール溶媒 )であった。高分解能MS分析では、分子式C33H44O18に対応するm/z: 727.2458に脱プロトン化分子イオンピーク[M-H]- が観察された。
1H および13C- NMR データは、δH 2.61 (J=15.6) 及び2.85 (J=15.6) の2つのメチレンダブレットが、δH 4.47, H, d (J=7.7) の酸素含有メチンに置換されている以外は化合物1のNMRスペクトルと同様であった。このことから、化合物2は、前述するようにbis 4-[β-D-O-glucopyranosyloxy)-benzyl]-2-isopropyl tartrateと同定された。当該化合物2は、一般名バニラグルコシドAとしても知られている(非特許文献4及び5) 。
(b) Identification of
1 H and 13 C- NMR data indicate that two methylene doublets at δ H 2.61 (J=15.6) and 2.85 (J=15.6) are substituted by an oxygen-containing methine at δ H 4.47, H, d (J=7.7). The NMR spectrum was similar to that of Compound 1, except that From this,
実験例2 本バニラ由来化合物のエラスターゼ阻害活性の評価
本実験では、本バニラ由来化合物(化合物1、及び2)のエステラーゼ阻害活性を測定することで、本バニラ由来化合物が有する肌弾力保持作用(肌弾力低下抑制作用を含む)を評価した。本バニラ由来化合物のエステラーゼ阻害活性は、ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-Ad)由来エラスターゼを用い、本バニラ由来化合物の存在下、N-Succinyl- Ala-Ala-Ala-p-nitroanilideを基質として生成したニトロアニリン量を測定してエステラーゼ活性(測定値)を測定し、その測定値を、別途、本バニラ由来化合物に代えて、コントロールとしてジメチルスルホキシド(DMSO)、及びポジティブコントロールとしてホスホラミドン(既知のエラスターゼ阻害剤)を用いてそれぞれ測定したエステラーゼ活性(コントロール値、ポジティブコントロール値)と比較することで評価した。
Experimental Example 2 Evaluation of the elastase inhibitory activity of the vanilla-derived compounds In this experiment, the esterase inhibitory activity of the vanilla-derived compounds (compounds 1 and 2) was measured to determine the skin elasticity-maintaining effect (skin elasticity) of the vanilla-derived compounds (compounds 1 and 2). (including the effect of suppressing elasticity decline) was evaluated. The esterase inhibitory activity of this vanilla-derived compound was determined using human skin fibroblast (NHDF-Ad)-derived elastase in the presence of this vanilla-derived compound and using N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide as a substrate. The amount of nitroaniline was measured to determine esterase activity (measured value), and the measured value was separately calculated using dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control and phosphoramidone (a known elastase enzyme) as a positive control in place of this vanilla-derived compound. The evaluation was made by comparing with the esterase activity (control value, positive control value) measured using the respective inhibitors.
(1)実験方法
(1-1)細胞溶解液の準備
ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-Ad)は、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(高グルコース)(含1 %ペニシリン-ストレプトマイシンおよび10 %ウシ胎児血清(FBS))を用いて、コンフルエントになるまでφ10 cmディッシュにてCO2インキュベーター(37℃, 5% CO2)内で培養した。
前培養した細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、細胞溶解液(0.2 M Tris-HCl (pH8.0) containing 1 mM PMSF and .5% Triton X-100)にて1.0×106 cells/mlに再懸濁した。その後、超音波処理を行い、遠心(13,000 rpm、4℃、15分間)した後、上清(cell lysate)を回収した。
(1) Experimental method (1-1) Preparation of cell lysate Human dermal fibroblasts (NHDF-Ad) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (high glucose) (containing 1% penicillin-streptomycin and 10% bovine fetus). The cells were cultured in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) in a φ10 cm dish until confluent using serum (FBS).
The pre-cultured cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) and diluted to 1.0×10 cells with cell lysis solution (0.2 M Tris-HCl (pH8.0) containing 1 mM PMSF and .5% Triton Resuspend at 6 cells/ml. Thereafter, the supernatant (cell lysate) was collected after ultrasonication and centrifugation (13,000 rpm, 4°C, 15 minutes).
(1-2)エラスターゼ活性の測定
前記で回収した上清12.5 μlに、0.2 Mトリス塩酸緩衝液(pH 8.0)35.5 μl、及び各被験物質(化合物1、化合物2、ホスホラミドン、DMSO)を下記に示す濃度になるようにそれぞれ2 μl混合し、37℃で15分間インキュベートした(被験試料:被験試料1、被験試料2、ポジコン試料、コントロール試料)。
(1-2) Measurement of elastase activity To 12.5 μl of the supernatant collected above, add 35.5 μl of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and each test substance (compound 1,
[各被験物質の終濃度]
化合物1:4、40、200、400、800μM(各々3、28、142、285、570μg/mLに該当)
化合物2:4、40、200、400、800μM(各々3、29、145、291、582μg/mLに該当)
ホスホラミドン(既知のエステラーゼ阻害剤):10、25、50、100μM
[Final concentration of each test substance]
Compound 1: 4, 40, 200, 400, 800μM (corresponding to 3, 28, 142, 285, 570μg/mL, respectively)
Compound 2: 4, 40, 200, 400, 800 μM (corresponding to 3, 29, 145, 291, 582 μg/mL, respectively)
Phosphoramidon (known esterase inhibitor): 10, 25, 50, 100 μM
その後、各被験試料に、5 mM 基質(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)を50 μl添加し、37℃、24時間インキュベートした。次いで、得られた各被験試料の405 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、各被験試料のエラスターゼ活性を算出した。 Thereafter, 50 μl of 5 mM substrate (N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide) was added to each test sample and incubated at 37° C. for 24 hours. Next, the absorbance at 405 nm of each test sample obtained was measured using a microplate reader, and the elastase activity of each test sample was calculated.
(2)実験結果
図2に、ポジコン試料(ホスホラミドン)、被験試料1(化合物1)、及び被験試料2(化合物2)のエラスターゼ活性を示す(平均値±SD, n=3, *p<0.05, **p<0.01) 。図2に示すエラスターゼ活性(%)は、コントロール試料のエラスターゼ活性(コントロール値)を100%とした場合の相対比である。
図2に示すように、化合物1及び2の添加により、コントロールと比較して有意にエラスターゼ活性の減少(エラスターゼ阻害活性)が認められた。化合物1及び2はいずれも濃度依存的にエラスターゼ阻害活性を示した。エラスターゼ阻害のIC50は、ホスホラミドンで0.04 ng/mL (64.4 nM)、化合物1で296.09μg/mL (415.7μM)、化合物2で426.10μg/mL (585.1μM)であった。
(2) Experimental results Figure 2 shows the elastase activities of the positive con sample (phosphoramidone), test sample 1 (compound 1), and test sample 2 (compound 2) (mean ± SD, n=3, *p<0.05 , **p<0.01). The elastase activity (%) shown in FIG. 2 is a relative ratio when the elastase activity (control value) of the control sample is taken as 100%.
As shown in FIG. 2, addition of
以上の結果より、バニラ(Vanilla pompona)由来単離化合物である化合物1及び2には、エラスターゼ阻害活性があり、肌の弾力回復または維持に寄与し、また抗シワ効果を持つことが示唆された。
The above results suggest that
実験例3 本バニラ由来化合物のコラーゲン及びヒアルロン酸産生促進作用の評価、並びに安全性評価
本実験では、ヒト線維芽細胞に本バニラ由来化合物(化合物1、及び2)を添加し、ヒト線維芽細胞におけるコラーゲンおよびヒアルロン酸の産生量の変化を測定することで、本バニラ由来化合物が有するコラーゲンおよびヒアルロン酸の産生促進作用、それに基づく抗シワ作用、及び肌の水分保持作用を評価した。
また、本バニラ由来化合物存在下で培養した後のヒト線維芽細胞の生存率を測定することで、本バニラ由来化合物の安全性を評価した
Experimental Example 3 Evaluation of collagen and hyaluronic acid production promoting effect of the present vanilla-derived compound, and safety evaluation In this experiment, the present vanilla-derived compounds (compounds 1 and 2) were added to human fibroblasts, and human fibroblast cells were By measuring changes in the production amounts of collagen and hyaluronic acid, the vanilla-derived compound was evaluated for its collagen and hyaluronic acid production promoting effect, its anti-wrinkle effect, and skin moisture retention effect.
In addition, the safety of this vanilla-derived compound was evaluated by measuring the survival rate of human fibroblasts after culturing in the presence of this vanilla-derived compound.
(1)実験方法
(1-1)細胞の調製
成人ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-Ad)をモデル細胞として用いた。NHDF-Ad細胞は、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(高グルコース)(含1 %ペニシリン-ストレプトマイシンおよび10 %ウシ胎児血清(FBS))を用いて、コンフルエントになるまでφ10 cmディッシュにて前培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、培地に再懸濁後、96穴プレートに0.5×104 cells/wellの濃度で播種しCO2インキュベーター(37℃, 5% CO2)でオーバーナイト培養した。
(1) Experimental method (1-1) Preparation of cells Adult human dermal fibroblasts (NHDF-Ad) were used as model cells. NHDF-Ad cells were precultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (high glucose) containing 1% penicillin-streptomycin and 10% fetal bovine serum (FBS) in a φ10 cm dish until confluent. . Thereafter, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), resuspended in culture medium, and then seeded in a 96-well plate at a concentration of 0.5×10 4 cells/well in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ). Cultured overnight.
(1-2)被験物質の添加
前記オーバーナイト培養後、各被験物質を下記の濃度で含む無血清培地(含1 %ペニシリン-ストレプトマイシン)に交換し、CO2インキュベーターにて72時間培養した。
(1-2) Addition of test substance After the overnight culture, the medium was replaced with a serum-free medium (containing 1% penicillin-streptomycin) containing each test substance at the following concentrations, and cultured in a CO 2 incubator for 72 hours.
[各被験物質の終濃度]
化合物1:50μM(35.6μg/mLに該当)
化合物2:50μM(36.4μg/mLに該当)
コントロール:DMSO
[Final concentration of each test substance]
Compound 1: 50μM (corresponds to 35.6μg/mL)
Compound 2: 50μM (corresponds to 36.4μg/mL)
Control: DMSO
(1-3)ヒアルロン酸産生促進評価試験およびコラーゲン産生促進評価試験
各被験物質添加72時間後の培養上清を回収し、培養上清中のコラーゲン量及びヒアルロン酸量をそれぞれ下記に記載する市販のELISAキットにて測定した。
コラーゲン量:Human Collagen Type I ELISA aasay, ACEL
ヒアルロン酸量:QnE Hyaluronic acid Quantitative ELISA assay, Biotech Trading Partner
(1-3) Hyaluronic acid production promotion evaluation test and collagen production promotion evaluation test 72 hours after addition of each test substance, the culture supernatant was collected, and the amount of collagen and hyaluronic acid in the culture supernatant was determined as shown below. Measured using ELISA kit.
Collagen amount: Human Collagen Type I ELISA aasay, ACEL
Hyaluronic acid amount: QnE Hyaluronic acid Quantitative ELISA assay, Biotech Trading Partner
(1-4)安全性評価(細胞生存率の測定)
各被験物質添加72時間後の培地中の細胞生存率を、Cell Counting kit-8(同仁化学)を用いて測定した。
培養上清を除去した96ウェルプレートへDMEM(高グルコース、含1 %ペニシリン-ストレプトマイシン)を100 μL加えた。次いで、各ウェルにCCK-8液3 μL添加し、CO2インキュベーターにて1時間静置培養した。細胞上清を90 μlずつ96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーで450 nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
(1-4) Safety evaluation (measurement of cell viability)
Cell viability in the medium 72 hours after addition of each test substance was measured using Cell Counting kit-8 (Dojindo Chemical).
100 μL of DMEM (high glucose, containing 1% penicillin-streptomycin) was added to the 96-well plate from which the culture supernatant had been removed. Next, 3 μL of CCK-8 solution was added to each well, and the cells were incubated for 1 hour in a CO 2 incubator. 90 μl of each cell supernatant was transferred to a 96-well plate, and absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader to calculate cell viability.
(2)実験結果
(2-1)ヒアルロン酸産生促進およびコラーゲン産生促進評価
図3(A)及び(B)に、被験物質として本バニラ由来化合物(化合物1、化合物2)を添加した培養上清中のコラーゲン量(コラーゲン産生量)及びヒアルロン酸量(ヒアルロン酸産生量)をそれぞれ示す(平均値±SD, n=3, *p<0.1, **p<0.05)。図3(A)及び(B)で示すコラーゲン産生量及びヒアルロン酸産生量は、本バニラ由来化合物に代えてDMSOを添加した培養上清中のコラーゲン量及びヒアルロン酸量(コントロール値)を100%とした場合の相対比である。
図3(A)及び(B)に示すように、本バニラ由来化合物はいずれも50 μMでコラーゲンおよびヒアルロン酸産生促進作用を示した。
(2) Experimental results (2-1) Hyaluronic acid production promotion and collagen production promotion evaluation Figures 3 (A) and (B) show the culture supernatant to which the present vanilla-derived compounds (Compound 1, Compound 2) were added as test substances. The amount of collagen (amount of collagen production) and the amount of hyaluronic acid (amount of hyaluronic acid production) in the cells are shown (mean value ± SD, n=3, *p<0.1, **p<0.05). The collagen production amount and hyaluronic acid production amount shown in Figure 3 (A) and (B) are 100% of the collagen and hyaluronic acid amount (control value) in the culture supernatant to which DMSO was added instead of this vanilla-derived compound. This is the relative ratio when .
As shown in FIGS. 3(A) and (B), both of the vanilla-derived compounds exhibited collagen and hyaluronic acid production promoting effects at 50 μM.
(2-2)安全性評価(細胞生存率)
図4に、本バニラ由来化合物(化合物1,化合物2)添加による成人ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-Ad細胞)の生存率(%)を示す(n=3、平均値±SD)。
図4に示すように、本バニラ由来化合物をNHDF-Ad細胞を添加した場合、高濃度でも細胞生存率に影響がなく、本バニラ由来化合物の安全性が確認された。
(2-2) Safety evaluation (cell survival rate)
FIG. 4 shows the survival rate (%) of adult human skin fibroblasts (NHDF-Ad cells) due to the addition of the present vanilla-derived compounds (Compound 1, Compound 2) (n=3, mean value ± SD).
As shown in FIG. 4, when the present vanilla-derived compound was added to NHDF-Ad cells, there was no effect on cell survival rate even at high concentrations, confirming the safety of the present vanilla-derived compound.
以上の結果より、バニラ(Vanilla pompona)由来単離化合物である化合物1及び2は、細胞毒性のない安全性の高い物質であるとともに、コラーゲンおよびヒアルロン酸産生促進効果があり、肌の抗シワ効果、及び水分保持効果(保湿効果)を持つことが示唆された。 From the above results, compounds 1 and 2, which are isolated compounds derived from vanilla (Vanilla pompona), are highly safe substances with no cytotoxicity, and have the effect of promoting collagen and hyaluronic acid production, and have anti-wrinkle effects on the skin. It was suggested that it has a water retention effect (moisturizing effect).
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