JP2023554137A - Conjugated zearalenone to protect against mycotoxicosis - Google Patents
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Abstract
本発明は、ZEA誘導性マイコトキシン症から動物を保護するための、特に体重増加の減少、腎臓損傷、肝臓損傷及び生殖器の損傷から保護するための方法における、コンジュゲート化ゼアラレノン(ZEA)の使用に関する。The present invention relates to the use of conjugated zearalenone (ZEA) in a method for protecting animals from ZEA-induced mycotoxicosis, in particular from reduced weight gain, kidney damage, liver damage and reproductive organ damage. .
Description
本発明は概して、マイコトキシンによって誘導されるマイコトキシン症に対する保護に関する。特に、本発明は、最も一般的なエストロゲン性マイコトキシンの1つであるゼアラレノン(ZEA)によって誘発されるマイコトキシン症に対する保護に関する。 The present invention generally relates to protection against mycotoxicosis induced by mycotoxins. In particular, the present invention relates to protection against mycotoxicosis induced by zearalenone (ZEA), one of the most common estrogenic mycotoxins.
ZEAは、主にフザリウム(Fusarium)及びジベレラ(Gibberella)の種によって産生され、動物の生殖能力に影響を及ぼすことが証明されている。ZEAへの家畜の曝露は、その毒性及び動物飼料中の広範な分布のために、世界的な公衆衛生上の懸念である。インビトロ及びインビボ実験は、ZEAがマウス、ブタ、ウマ及びウシにおいてエストロゲン活性を有することを示している。ZEAの生殖毒性の正確な機構はまだ確立されていない。ZEAは、おそらく不適切な貯蔵の結果として、天然動物飼料の試料中に高レベルで典型的に検出されるが、有毒性フザリウム属(Fusarium)種が既に穀類に感染し、収穫時前にZEA蓄積をもたらすことが判明した。今日、フザリウム属(Fusarium)真菌は、世界的な穀物取引の増加に伴って国から国へと広がっている。 ZEA is primarily produced by Fusarium and Gibberella species and has been shown to affect fertility in animals. Exposure of livestock to ZEA is a worldwide public health concern due to its toxicity and wide distribution in animal feed. In vitro and in vivo experiments have shown that ZEA has estrogenic activity in mice, pigs, horses and cows. The exact mechanism of ZEA's reproductive toxicity has not yet been established. ZEA is typically detected at high levels in natural animal feed samples, probably as a result of improper storage, but if toxic Fusarium species have already infected the grain and ZEA is It was found that this led to an accumulation. Today, Fusarium fungi are spreading from country to country with the increasing global grain trade.
特に、養ブタ業はZEAの影響を強く受けている。ブタは、食餌ZEAの生殖作用に対して他の家畜よりも感受性が高く、この毒素に対する有効な解毒剤は現在存在しないと思われる。離乳未経産ブタに対するZEAの毒性作用は、外陰肥大及び卵巣萎縮に関連する。ZEAは、卵巣障害を誘発することによって雌ブタに生殖不能状態を引き起こし得る。卵母細胞は卵胞で死滅し、排卵は、発情周期中に徴候が示されるにもかかわらず起こらない。ZEAは、ステロイドホルモンの分泌を阻害し、排卵前段階中のエストロゲン応答を妨害し、哺乳動物の卵胞の成熟を抑制する。ZEAによって引き起こされる発情周期の変化は、その用量及び投与時間に依存する。若齢ブタでは、経口投与されたZEAは迅速に吸収され、代謝される。ZEAは、ブタにおいて主にα-ZEAに触媒される。ブタにおけるα-ZEAの機構は、エストロゲン受容体と競合しながら、標的組織中の細胞に対するその効果によって説明することができる。α-ZEA及びβ-ZEAを含むZEAは、ブタ卵巣の天然卵胞液中で検出されることが多い。ZEA汚染飼料を摂取した未経産ブタは、偽妊娠を発症する可能性がある。更に、ZEAは、分裂期紡錘体の奇形を誘導することによって、分裂期を通してブタ卵母細胞の進行を抑制し得る。また、ZEAで自然に汚染された小麦を未経産ブタに与えることは、インビトロで卵母細胞の初期のクロマチン状態及び成熟能を妨害し得る。 In particular, the pig farming industry has been strongly affected by ZEA. Pigs are more susceptible than other livestock to the reproductive effects of dietary ZEA, and there currently appears to be no effective antidote to this toxin. The toxic effects of ZEA on weaned gilts are associated with vulvar hypertrophy and ovarian atrophy. ZEA can cause sterility in sows by inducing ovarian damage. The oocyte dies in the follicle and ovulation does not occur despite signs during the estrous cycle. ZEA inhibits the secretion of steroid hormones, interferes with the estrogen response during the preovulatory phase, and suppresses the maturation of mammalian follicles. Changes in the estrous cycle caused by ZEA are dependent on its dose and time of administration. In young pigs, orally administered ZEA is rapidly absorbed and metabolized. ZEA is primarily catalyzed by α-ZEA in pigs. The mechanism of α-ZEA in pigs can be explained by its effect on cells in target tissues while competing with estrogen receptors. ZEA, including α-ZEA and β-ZEA, are often detected in the natural follicular fluid of pig ovaries. Nilifers that consume ZEA-contaminated feed can develop pseudopregnancies. Furthermore, ZEA can suppress progression of porcine oocytes through mitosis by inducing mitotic spindle malformations. Also, feeding gilts with wheat naturally contaminated with ZEA can interfere with the early chromatin state and maturation capacity of oocytes in vitro.
家禽はZEAに対してかなり耐性があるように思われるが、反芻動物では、ZENは雌牛の受胎率を低下させる可能性がある。また、飼料摂取量の減少及び乳収量の減少は、乳牛におけるZEAに起因している。 Poultry appears to be fairly resistant to ZEA, but in ruminants, ZEN can reduce conception rates in cows. Also, reduced feed intake and reduced milk yield have been attributed to ZEA in dairy cows.
ZEA誘導性マイコトキシン症の予防的処置は、現在、作物でのマイコトキシン産生を減少させるための良好な農業慣行並びにマイコトキシンレベルが一定の限界未満のままであることを確実にするための食品及び飼料商品の制御プログラムに制限されている。 Preventive treatment of ZEA-induced mycotoxicosis currently relies on good agricultural practices to reduce mycotoxin production in crops and food and feed products to ensure that mycotoxin levels remain below certain limits. control program.
真菌は、一般に、器官及び組織の寄生並びにアレルゲン性発現を含む、動物における広範囲の疾患を引き起こす。しかしながら、非食用キノコの摂取による中毒以外に、真菌は、マイコトキシン症と呼ばれる様々な毒性作用を担うマイコトキシン及び有機化学物質を産生し得る。この疾患は、マイコトキシン、食品又は動物飼料を汚染する糸状菌によって産生される薬理学的に活性な化合物への曝露によって引き起こされる。マイコトキシンは、真菌の生理学にとって重要ではない二次代謝産物であり、摂取、吸入又は皮膚接触時に脊椎動物に対して最小濃度で極めて毒性である。約400のマイコトキシンが現在認識されており、類似の生物学的及び構造的特性を有する化学的に関連する分子のファミリーに細分されている。このうち、動物の健康に対する脅威として、10数群が定期的に注目されている。公共の関心及び農業経済的意義が最も高いマイコトキシンの例としては、アフラトキシン(AF)、オクラトキシン(OT)、トリコテセン(T;デオキシニバレノール(DONと略す)を含む)、ゼアラレノン(ZEA)、発振せん性毒素及び麦角アルカロイドが挙げられる。マイコトキシンは、急性及び慢性疾患に関連しており、生物学的作用は、主にそれらの化学構造の多様性に応じて変化するが、生物学的、栄養学的及び環境的要因にも関連する。マイコトキシン症の病態生理学は、マイコトキシンと動物細胞における機能性分子及び細胞小器官との相互作用の結果であり、発癌性、遺伝毒性、タンパク質合成の阻害、免疫抑制、皮膚刺激及び他の代謝的撹乱をもたらし得る。感受性動物種では、マイコトキシンは複雑で重複する毒性作用を誘発し得る。マイコトキシン症は伝染性ではなく、免疫系の有意な刺激もない。薬物又は抗生物質による処置は、疾患の経過にほとんど又は全く影響を及ぼさない。今日まで、マイコトキシン症にうまく対抗するヒト又は動物ワクチンは利用できず、記載もされていない。Pestka J.J.et al.は、J Food Prot,Nov 1985,48(11),953-957において、「ブタのゼアラレノンマイコトキシン症を予防する方法としての能動免疫の試験に免疫プロトコルが適用可能であり得る」と仮定していることに留意されたい。しかしながら、医療用途を試験するためのデータは提供されていない。これは数年後に行われ、MacDougald O.A.et al.in J Anim Sci,Nov 1990,68(11),3713-3718によって報告された。彼らは、「ゼアラレノンに対する免疫化は、ブタのゼアラレノンマイコトキシン症を予防するための実行可能な方法ではないようである」と結論づけた。 Fungi commonly cause a wide range of diseases in animals, including organ and tissue parasitism and allergic manifestations. However, besides poisoning through ingestion of inedible mushrooms, fungi can produce mycotoxins and organic chemicals that are responsible for various toxic effects called mycotoxicosis. The disease is caused by exposure to mycotoxins, pharmacologically active compounds produced by filamentous fungi that contaminate food or animal feed. Mycotoxins are secondary metabolites that are not important to fungal physiology and are highly toxic to vertebrates at minimal concentrations upon ingestion, inhalation, or skin contact. Approximately 400 mycotoxins are currently recognized and have been subdivided into families of chemically related molecules with similar biological and structural properties. Of these, more than a dozen groups regularly receive attention as threats to animal health. Examples of mycotoxins of greatest public concern and agricultural economic significance include aflatoxin (AF), ochratoxin (OT), trichothecenes (T; including deoxynivalenol (DON)), zearalenone (ZEA), These include sex toxins and ergot alkaloids. Mycotoxins are associated with acute and chronic diseases, and their biological effects vary mainly depending on the diversity of their chemical structures, but are also related to biological, nutritional and environmental factors. . The pathophysiology of mycotoxicosis is the result of the interaction of mycotoxins with functional molecules and organelles in animal cells, resulting in carcinogenicity, genotoxicity, inhibition of protein synthesis, immunosuppression, skin irritation and other metabolic disturbances. can bring about In susceptible animal species, mycotoxins can induce complex and overlapping toxic effects. Mycotoxicosis is not contagious and there is no significant stimulation of the immune system. Treatment with drugs or antibiotics has little or no effect on the course of the disease. To date, no human or animal vaccines that successfully combat mycotoxicosis are available or described. Pestka J. J. et al. hypothesize in J Food Prot, Nov 1985, 48(11), 953-957 that "the immunization protocol may be applicable to testing active immunization as a method of preventing zearalenone mycotoxicosis in pigs." Please note that. However, no data are provided to test medical applications. This took place a few years later, with MacDougald O. A. et al. Reported in J Anim Sci, Nov 1990, 68(11), 3713-3718. They concluded that "immunization against zearalenone does not appear to be a viable method to prevent zearalenone mycotoxicosis in pigs."
したがって、成長中の研究体は、特定の真菌疾患の予防において、真菌症、すなわち毒素の代わりに真菌自体による感染症に対抗する際の強力なツールとしての、広範な真菌クラスに対する有効性を有するワクチン及び/又は免疫療法の開発に焦点を当てている。真菌症とは対照的に、マイコトキシン症は、毒素産生真菌の関与を必要とせず、生物起源ではあるが、非生物的危険と見なされる。この意味で、マイコトキシン症は自然手段による中毒の例と考えられており、保護戦略は本質的に曝露防止に焦点を当ててきた。ヒト及び動物への曝露は、主に植物ベースの食品におけるマイコトキシンの摂取から起こる。摂取されたマイコトキシンの代謝は、異なる器官又は組織における蓄積をもたらし得、したがって、マイコトキシンは、動物の肉、乳又は卵を介してヒトの食物連鎖に入ることができる(キャリーオーバ)。有毒性真菌は、ヒト及び動物の消費のためにいくつかの種類の作物を汚染するので、マイコトキシンは、あらゆる種類の原材料、商品及び飲料に存在し得る。国際連合食糧農業機関(FAO)は、世界の食品作物の25%がマイコトキシンによって著しく汚染されていると推定した。現時点において、マイコトキシン症予防のための最良の戦略には、作物でのマイコトキシン産生を減少させるための良好な農業慣行、並びに、マイコトキシンのレベルが所定の閾値を下回ることを確実にするための食品及び飼料商品の制御プログラムが含まれる。これらの戦略は、高いコスト及び可変の有効性を有するマイコトキシンのいくつかの群による商品の汚染の問題を制限し得る。支持療法(例えば、食事、水分補給)を除いて、マイコトキシン曝露に対する治療法はほとんどなく、マイコトキシンに対する解毒剤は一般に利用できないが、AFに曝露された個体では、クロロフィリン、緑茶ポリフェノール及びジチオールチオン(oltipraz)等の一部の保護剤でいくつかの有望な結果が得られている。 A growing body of research therefore has efficacy against a wide range of fungal classes as a powerful tool in combating mycoses, i.e. infections caused by the fungi themselves instead of toxins, in the prevention of specific fungal diseases. The focus is on vaccine and/or immunotherapy development. In contrast to mycoses, mycotoxicosis does not require the involvement of toxin-producing fungi and, although of biological origin, is considered an abiotic hazard. In this sense, mycotoxicosis is considered an example of poisoning by natural means, and protection strategies have essentially focused on exposure prevention. Exposure to humans and animals primarily occurs from ingestion of mycotoxins in plant-based foods. Metabolism of ingested mycotoxins can lead to accumulation in different organs or tissues, and thus mycotoxins can enter the human food chain via animal meat, milk or eggs (carryover). Mycotoxins can be present in all kinds of raw materials, goods and beverages, as toxic fungi contaminate several types of crops for human and animal consumption. The Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) has estimated that 25% of the world's food crops are heavily contaminated with mycotoxins. Currently, the best strategies for mycotoxicosis prevention include good agricultural practices to reduce mycotoxin production in crops, and food and food practices to ensure mycotoxin levels are below predetermined thresholds. Includes control programs for feed products. These strategies can limit the problem of contamination of commercial products with several groups of mycotoxins that have high cost and variable effectiveness. There are few treatments for mycotoxin exposure other than supportive care (e.g., diet, hydration), and antidotes to mycotoxins are generally not available, but in individuals exposed to AF, chlorophyllin, green tea polyphenols, and dithiolthione (oltipraz ) have shown some promising results with some protective agents.
当技術分野では、主にヒトにおけるマイコトキシン症の予防を対象とした、マイコトキシンの初期吸収又は生物活性化、免疫遮断による動物製品(乳等)におけるそれらの毒性及び/又は分泌を特異的に遮断し得る抗体の産生に基づく戦略を用いて、動物起源の重要な食品の汚染によるマイコトキシン症を予防するための、いくつかのマイコトキシンに対する特定のワクチン接種戦略が提案されている。 In the art, research has been developed to specifically block the initial absorption or bioactivation of mycotoxins, their toxicity and/or secretion in animal products (such as milk) by immune blockade, mainly aimed at the prevention of mycotoxicosis in humans. Specific vaccination strategies against several mycotoxins have been proposed to prevent mycotoxicosis due to contamination of important foods of animal origin using strategies based on the production of antibodies obtained.
しかしながら、マイコトキシン症に対する保護のためのワクチンの製造は非常に困難であり、主にマイコトキシン自体が小さな非免疫原性分子であるという事実、及び健康な対象における抗原としての使用を無リスクにしないマイコトキシンに関連する毒性に関する。マイコトキシンは、低分子量であり、通常は非タンパク質性の分子であり、通常は免疫原性ではないが(ハプテン)、タンパク質等の大きな担体分子に結合すると潜在的に免疫応答を誘発し得る。マイコトキシンをタンパク質又はポリペプチド担体にコンジュゲート化し、動物免疫化のための条件を最適化するための方法は、動物及びヒトの消費に向けた産物中のマイコトキシンをスクリーニングするためのイムノアッセイにおいて使用される異なる特異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製する目的で、広く研究されてきた。これらの研究で使用されたカップリングタンパク質には、とりわけ、ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、サイログロブリン(TG)及びポリリジンが含まれた。過去数十年の間に、産生された抗体が天然毒素を認識するように元の構造を十分に保持しながらタンパク質に結合することができるマイコトキシン誘導体を開発するための多くの努力がなされてきた。これらの方法により、多くのマイコトキシンに対する抗体が利用可能になり、タンパク質へのコンジュゲーションが抗体産生のための効果的なツールであり得ることが実証されている。したがって、レシピエントにとって安全でありながら保護に到達するためのヒト及び動物ワクチン接種のためのこの戦略の適用は、インビボで放出され得る分子の毒性特性のためにこれまで成功していない。例えば、T-2等の毒素のタンパク質担体へのコンジュゲーションは、その活性形態の遊離毒素の潜在的な放出を伴う不安定な複合体をもたらすことが示されている(Chanh et al,Monoclonal anti-idiotype induces protection against the cytotoxicity of the trichothecene mycotoxin T-2,in J Immunol.1990,144:4721-4728)。細菌毒素の病理学的影響に対する保護状態を与え得るトキソイドワクチンと同様に、マイコトキシンに対するワクチンの開発に対する合理的なアプローチは、抗原性を維持しながら毒性を欠くマイコトキシンの改変形態として定義されるコンジュゲート化された「マイコトキシン」に基づき得る(Giovati L et al,Anaflatoxin B1 as the paradigm of a new class of vaccines based on ”Mycotoxoids”,in Ann Vaccines Immunization 2(1):1010,2015)。マイコトキシンの非タンパク質性を考えると、マイコトキシンへの変換のためのアプローチは、化学的誘導体化に依拠すべきである。関連する親マイコトキシンの戦略的位置に特定の基を導入することにより、異なる物理化学的特徴を有する分子が形成され得るが、それでもなお、天然毒素に対して十分に交差反応する抗体を誘導することができる。したがって、マイコトキシンのワクチン接種の一般的な理論的根拠は、細胞標的と比較して天然のマイコトキシンに結合する能力が増強されたマイコトキシンに対する抗体を生成し、毒素を中和し、曝露の場合に疾患発症を予防することに基づくであろう。この戦略の適用可能性は、AF群に属するマイコトキシン(Giovati et al,2015)の場合に実証されているが、他のマイコトキシンのいずれについても実証されていない。更に、予防効果は、ワクチン接種動物自体のマイコトキシン症に対しては実証されておらず、牛乳又はそれから作られる製品を消費する人々をマイコトキシン症から保護するために、乳牛におけるそれらの牛乳へのキャリーオーバに対してのみ実証されている。 However, the production of vaccines for protection against mycotoxicosis is very difficult, mainly due to the fact that mycotoxins themselves are small, non-immunogenic molecules, and mycotoxins that do not make their use as antigens in healthy subjects risk-free. Regarding toxicity associated with. Mycotoxins are low molecular weight, usually non-proteinaceous molecules that are not usually immunogenic (haptens), but can potentially elicit an immune response when bound to large carrier molecules such as proteins. Methods for conjugating mycotoxins to protein or polypeptide carriers and optimizing conditions for animal immunization are used in immunoassays for screening mycotoxins in products intended for animal and human consumption. The aim of producing monoclonal or polyclonal antibodies with different specificities has been extensively investigated. Coupling proteins used in these studies included bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), thyroglobulin (TG) and polylysine, among others. During the past few decades, many efforts have been made to develop mycotoxin derivatives that can bind to proteins while retaining enough of their original structure so that the antibodies produced recognize natural toxins. . These methods have made antibodies against many mycotoxins available and have demonstrated that conjugation to proteins can be an effective tool for antibody production. Therefore, the application of this strategy for human and animal vaccination to reach protection while being safe for the recipient has not been successful so far due to the toxic properties of the molecules that can be released in vivo. For example, conjugation of a toxin such as T-2 to a protein carrier has been shown to result in an unstable complex with potential release of the free toxin in its active form (Chanh et al, Monoclonal Antibiotics). -idiotype induces protection against the cytotoxicity of the trichothecene mycotoxin T-2, in J Immunol. 1990, 144:4721-4728). Similar to toxoid vaccines that can confer a protective status against the pathological effects of bacterial toxins, a rational approach to the development of vaccines against mycotoxins is to use conjugates, defined as modified forms of mycotoxins that lack toxicity while retaining antigenicity. Anaflatoxin B1 as the paradigm of a new class of vaccines based on “Mycotoxins”, in Ann Vaccine es Immunization 2(1):1010, 2015). Given the non-protein nature of mycotoxins, approaches for conversion to mycotoxins should rely on chemical derivatization. By introducing specific groups at strategic positions of the relevant parent mycotoxin, molecules with different physicochemical characteristics can be formed, yet still induce antibodies that are sufficiently cross-reactive against the natural toxin. Can be done. Therefore, the general rationale for mycotoxin vaccination is to generate antibodies against mycotoxins that have an enhanced ability to bind to natural mycotoxins compared to cellular targets, neutralize the toxin, and cause disease in the event of exposure. It will be based on preventing the onset of the disease. The applicability of this strategy has been demonstrated in the case of mycotoxins belonging to the AF group (Giovati et al, 2015), but not for any other mycotoxins. Furthermore, a preventive effect has not been demonstrated against mycotoxicosis in the vaccinated animals themselves, and their carriage in milk in dairy cows is necessary to protect people who consume milk or products made from it from mycotoxicosis. Proven only for over.
本発明の目的は、動物飼料中の重要なマイコトキシンであるゼアラレノンによって誘導されるマイコトキシン症から動物を保護する方法を提供することである。 The aim of the present invention is to provide a method for protecting animals from mycotoxicosis induced by zearalenone, an important mycotoxin in animal feed.
本発明の目的を満たすために、コンジュゲート化ゼアラレノン(ZEA)は、ZEA誘導性マイコトキシン症から動物を保護する方法における使用に適していることが見出された。 To meet the objectives of the present invention, conjugated zearalenone (ZEA) has been found suitable for use in a method of protecting animals from ZEA-induced mycotoxicosis.
驚くべきことに、ゼアラレノンに対する免疫化がゼアラレノンマイコトキシン症を予防するための実行可能な方法ではないようであるという先行技術の教示(MacDougald)に対して、マイコトキシン症に対する能動的免疫化が健康な動物、特に健康なブタ、より具体的には健康な未経産ブタ及び雌ブタにおいて誘導され得ることが見出された。当技術分野における卵巣切除(すなわち、非健康)未経産ブタの使用のため(MacDougald)、コンジュゲート化ZEAの保護効果を見出すことができなかったことがあり得る。また、当技術分野で使用された用量は非常に高く(mg範囲)、これはコンジュゲート化マイコトキシンの潜在的な負の効果を説明し得る。1.0mg範囲未満の用量(例えば、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2又は更には0.1mg未満)では、ZEA抗原の悪影響はなく、したがってZEAをトキソイドに変換する必要がないことが分かった。典型的な有効量は、0.01μg~0.05μgのZEA及び0.05mg~0.2mgのコンジュゲートの低さであることが見出された。コンジュゲート化毒素は、処置した宿主動物にとって安全であるようであった。また、マイコトキシン等の小分子に対して誘導される免疫応答が、処置後のマイコトキシンの摂取後にマイコトキシン症から動物自体を保護するのに十分に強いことが分かることは驚くべきことであった。動物においてマイコトキシン自体に対する免疫応答を誘導することによる動物のそのような実際の保護は、いかなるマイコトキシンについても当該技術分野において示されていない。 Surprisingly, contrary to the teaching of the prior art that immunization against zearalenone does not appear to be a viable method to prevent zearalenone mycotoxicosis (MacDougald), active immunization against mycotoxicosis does not appear to be a viable method for preventing zearalenone mycotoxicosis in healthy animals. , particularly in healthy pigs, more particularly in healthy gilts and sows. Due to the use of ovariectomized (ie, non-healthy) gilts in the art (MacDougald), it is possible that a protective effect of conjugated ZEA could not be found. Also, the doses used in the art were very high (mg range), which may explain the potential negative effects of conjugated mycotoxins. At doses below the 1.0 mg range (e.g., below 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 or even 0.1 mg) It was found that there were no adverse effects of the ZEA antigen and therefore there was no need to convert ZEA to a toxoid. Typical effective amounts have been found to be as low as 0.01 μg to 0.05 μg ZEA and 0.05 mg to 0.2 mg conjugate. The conjugated toxin appeared to be safe for the treated host animals. It was also surprising to find that the immune response induced against small molecules such as mycotoxins was strong enough to protect the animals themselves from mycotoxicosis after ingestion of the mycotoxins after treatment. Such actual protection of animals by inducing an immune response against the mycotoxin itself in the animal has not been shown in the art for any mycotoxin.
定義
マイコトキシン症は、マイコトキシンへの曝露に起因する疾患である。臨床徴候、標的器官及び結果は、マイコトキシンの固有の毒性特徴並びに曝露の量及び長さ、並びに曝露された動物の健康状態に依存する。
Definition Mycotoxicosis is a disease resulting from exposure to mycotoxins. Clinical signs, target organs and outcomes depend on the specific toxicity characteristics of the mycotoxin as well as the amount and length of exposure and the health status of the exposed animal.
マイコトキシン症から保護することは、動物におけるマイコトキシンの1つ又は複数の負の生理学的影響、例えば、平均1日体重増加の減少、腎臓損傷、肝臓損傷及び生殖器に対する損傷を予防又は減少させることを意味する。 Protecting against mycotoxicosis means preventing or reducing one or more negative physiological effects of mycotoxins in animals, such as reduced average daily weight gain, kidney damage, liver damage and damage to the reproductive organs. do.
ゼアラレノン(ZEA)は、世界中に分布するフザリウム属種(F.グラミネアラム(F.graminearum)、F.セレアリス(F.cerealis)、F.クルモラム(F.culmorum)、F.エクセティ(F.equiseti)、F.クロックウェランス(F.crookwellense)、F.セミテクトム(F.semitectum)等)によって産生されるマイコトキシンである。ZEA又は6-(10-ヒドロキシ-6-オキソ-トランス-1-ウンデセン)β-レゾルシル酸ラクトンは、C18H22O5(CAS番号17924-92-4)の分子式を有し、ZEN、RAL又はF-2マイコトキシンとも呼ばれる。 Zearalenone (ZEA) is a compound of Fusarium species (F. graminearum, F. cerealis, F. culmorum, F. equiseti) distributed all over the world. , F. crookwellense, F. semitectum, etc.). ZEA or 6-(10-hydroxy-6-oxo-trans-1-undecene)β-resorcylic acid lactone has a molecular formula of C 18 H 22 O 5 (CAS number 17924-92-4) and has a molecular formula of ZEN, RAL Also called F-2 mycotoxin.
コンジュゲート化分子は、共有結合を介して免疫原性化合物が結合している分子である。典型的には、免疫原性化合物は、KLH、BSA又はOVA等の大きなタンパク質である。 A conjugated molecule is a molecule to which an immunogenic compound is attached via a covalent bond. Typically, immunogenic compounds are large proteins such as KLH, BSA or OVA.
アジュバントは、非特異的免疫刺激剤である。原則として、免疫学的事象のカスケードにおける特定のプロセスを支持又は増幅することができ、最終的により良好な免疫学的応答(すなわち、抗原、特にリンパ球によって媒介され、典型的には特異的抗体又は以前に感作されたリンパ球による抗原の認識を含むものに対する統合された身体的応答)をもたらすことができる各物質は、アジュバントとして定義することができる。アジュバントは、一般に、当該特定のプロセスが起こるために必要とされず、単に当該プロセスを支持又は増幅する。アジュバントは、一般に、それらが誘導する免疫学的事象に従って分類することができる。とりわけ、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン(又はその画分及び誘導体、例えばQuilA)、水酸化アルミニウム、リポソーム、コクリエート、ポリ乳酸/グリコール酸を含む第1のクラスは、APC(抗原提示細胞)による抗原の取込み、輸送及び提示を促進する。とりわけ、油エマルジョン(W/O、O/W、W/O/W又はO/W/Oのいずれか)、ゲル、ポリマーマイクロスフェア(Carbopol)、非イオン性ブロックコポリマー、及びおそらく水酸化アルミニウムも含む第2のクラスは、デポー効果を提供する。とりわけ、CpGリッチモチーフ、モノホスホリルリピドA、マイコバクテリア(ムラミルジペプチド)、酵母抽出物、コレラ毒素を含む第3のクラスは、シグナル0として定義される、保存された微生物構造、いわゆる病原体関連微生物パターン(PAMP)の認識に基づく。とりわけ、油エマルジョン界面活性剤、水酸化アルミニウム、低酸素を含む第4のクラスは、免疫系の危険と無害(自己及び非自己と同じである必要はない)との識別能力を刺激することに基づく。とりわけ、サイトカインを含む第5のクラスは、APC上の共刺激分子、シグナル2の上方制御に基づく。 Adjuvants are non-specific immune stimulants. In principle, specific processes in the cascade of immunological events can be supported or amplified, ultimately resulting in a better immunological response (i.e. mediated by antigens, especially lymphocytes, and typically specific antibodies). Each substance capable of producing an integrated bodily response (including recognition of an antigen by previously sensitized lymphocytes) can be defined as an adjuvant. Adjuvants are generally not required for the particular process to occur, but merely support or amplify the process. Adjuvants can generally be classified according to the immunological events they induce. The first class includes, inter alia, ISCOMs (immune stimulating complexes), saponins (or fractions and derivatives thereof, e.g. QuilA), aluminum hydroxide, liposomes, cochleates, polylactic/glycolic acids, APCs (antigen presenting cells), ) promotes antigen uptake, transport and presentation by Among others, oil emulsions (either W/O, O/W, W/O/W or O/W/O), gels, polymer microspheres (Carbopol), nonionic block copolymers, and possibly also aluminum hydroxide. The second class containing provides a depot effect. A third class, including CpG-rich motifs, monophosphoryl lipid A, mycobacteria (muramyl dipeptides), yeast extracts, cholera toxin, among others, is a conserved microbial structure, defined as signal 0, so-called pathogen-associated microorganisms. Based on pattern (PAMP) recognition. A fourth class, including oil emulsion surfactants, aluminum hydroxide, and hypoxia, among others, stimulates the immune system's ability to distinguish between danger and harmless (self and non-self need not be the same). Based on. A fifth class that includes cytokines, among others, is based on the upregulation of the co-stimulatory molecule, Signal 2, on APCs.
ワクチンは、本発明の意味において、動物への適用に適した構成であり、免疫学的有効量の1つ又は複数の抗原を含み(すなわち、典型的には薬学的に許容される担体(すなわち、生体適合性培地、すなわち、投与後に対象動物において有意な有害反応を誘発せず、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示することができる培地)、例えば水及び/又は任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体、又は凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用される固体担体と組み合わせられ(糖及び/又はタンパク質に基づく)、疾患誘導薬剤によるチャレンジの負の効果を少なくとも低減するのに十分な標的動物の免疫系を刺激することができる)、免疫刺激剤(アジュバント)が含まれていてもよく、動物への投与時に疾患又は障害を治療するための免疫応答を誘導する、すなわち疾患又は障害の予防、改善又は治癒を助ける。 A vaccine within the meaning of the present invention is a composition suitable for application to an animal and comprises an immunologically effective amount of one or more antigens (i.e., typically in a pharmaceutically acceptable carrier (i.e. , a biocompatible medium, i.e. a medium that does not induce significant adverse reactions in the subject animal after administration and is capable of presenting the antigen to the host animal's immune system after administration of the vaccine), such as water and/or any other medium. liquids containing biocompatible solvents or solid carriers commonly used to obtain lyophilized vaccines (based on sugars and/or proteins) to at least eliminate the negative effects of challenge with disease-inducing drugs. may contain an immunostimulant (adjuvant) that is capable of sufficiently stimulating the immune system of the target animal to reduce and induce an immune response to treat the disease or disorder upon administration to the animal. to help prevent, ameliorate or cure a disease or disorder.
本発明の更なる実施形態では、コンジュゲート化ZEAは動物に全身投与される。例えば、胃腸管(口腔又は肛門腔)又は眼の粘膜組織を介した局所投与(例えばニワトリを免疫する場合)は、様々な動物において免疫応答を誘導する有効な経路であることが知られているが、全身投与が、ZEA誘導性マイコトキシン症から動物を保護するのに十分な免疫応答をもたらすことが見出された。特に、筋肉内、経口及び/又は皮内投与時に効果的な免疫化が得られ得ることが見出された。 In a further embodiment of the invention, the conjugated ZEA is administered systemically to the animal. For example, topical administration via the gastrointestinal tract (oral or anal cavity) or mucosal tissues of the eye (e.g. when immunizing chickens) is known to be an effective route for inducing immune responses in a variety of animals. However, it has been found that systemic administration produces an immune response sufficient to protect animals from ZEA-induced mycotoxicosis. In particular, it has been found that effective immunization can be obtained upon intramuscular, oral and/or intradermal administration.
投与年齢は重要ではないが、動物が相当量のZEAで汚染された飼料を摂取し得る前に投与を行うことが好ましい。したがって、投与時の好ましい年齢は6週以下である。更に好ましいのは、4週齢以下、例えば1~3週齢である。 Although the age of administration is not critical, it is preferred that administration occurs before the animal has been able to ingest significant amounts of ZEA-contaminated feed. Therefore, the preferred age at the time of administration is 6 weeks or less. More preferably, the age is 4 weeks or less, for example 1 to 3 weeks old.
本発明の更に別の実施形態では、コンジュゲート化ZEAは動物に少なくとも2回投与される。多くの動物(特に、ブタ、ニワトリ、反芻動物)は一般に、免疫原性組成物の1回の注射のみによる免疫化に対して感受性であるが、ZEAに対する経済的に実行可能な保護のためには2回の注射が好ましいと考えられる。これは、実際には、天然に存在するZEAが免疫原性ではないという単純な理由で、動物の免疫系がZEAへの天然の曝露によって抗ZEA抗体を産生するように誘発されないからである。したがって、動物の免疫系は、コンジュゲート化ZEAの投与に完全に依存する。コンジュゲート化ZEAの2回のショット間の時間は、1週間~1~2年の間の任意の時間であり得る。若齢動物の場合、例えば1~3週齢でのプライム免疫化とそれに続く1~4週間後、典型的には1~3週間後、例えば2週間後のブースター投与の計画で十分であると考えられる。より高齢の動物は、動物のための他の商業的に適用される免疫化レジメンから知られているように、数ヶ月毎(例えば、最後の投与の4、5、6ヶ月後)、又は毎年若しくは半年毎のブースター投与を必要とする場合がある。 In yet another embodiment of the invention, the conjugated ZEA is administered to the animal at least twice. Although many animals (particularly pigs, chickens, and ruminants) are generally susceptible to immunization with only one injection of an immunogenic composition, for economically viable protection against ZEA Two injections may be preferred. This is because, in fact, the animal's immune system is not induced to produce anti-ZEA antibodies by natural exposure to ZEA, simply because naturally occurring ZEA is not immunogenic. Therefore, the animal's immune system is completely dependent on the administration of conjugated ZEA. The time between two shots of conjugated ZEA can be any time between one week and one to two years. For young animals, a regimen of prime immunization, e.g. at 1-3 weeks of age, followed by a booster dose 1-4 weeks later, typically 1-3 weeks later, e.g. 2 weeks, may be sufficient. Conceivable. Older animals may be administered every few months (e.g. 4, 5, 6 months after the last dose) or annually, as is known from other commercially applied immunization regimens for animals. Alternatively, booster doses every six months may be required.
更に別の実施形態では、コンジュゲート化ZEAは、コンジュゲート化ZEAに加えてアジュバントを含む組成物中で使用される。コンジュゲート自体が免疫応答を誘導して所定のレベルの保護を得ることができない場合、アジュバントを使用することができる。KLH又はBSA等の追加のアジュバントなしで免疫系を十分に刺激することができるコンジュゲート分子が知られているが、追加のアジュバントを使用することが有利であり得る。これにより、ブースター投与の必要性がなくなり得るか、又はその投与間隔が長くなり得る。全ては、特定の状況で必要とされる保護のレベルに依存する。コンジュゲート化ZEAを免疫原として使用した場合に、ZEAに対する良好な免疫応答を誘導することが可能であることが示されたアジュバントの種類は、水及び油のエマルジョン、例えば油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョンである。前者は一般に家禽に使用され、後者は一般にブタ及び反芻動物等のアジュバント誘発部位反応をより起こしやすい動物に使用される。 In yet another embodiment, the conjugated ZEA is used in a composition that includes an adjuvant in addition to the conjugated ZEA. If the conjugate itself is unable to induce an immune response to obtain the desired level of protection, an adjuvant can be used. Although conjugate molecules are known that are able to sufficiently stimulate the immune system without additional adjuvants such as KLH or BSA, it may be advantageous to use additional adjuvants. This may eliminate the need for booster doses or may lengthen the time between doses. It all depends on the level of protection required in the particular situation. Types of adjuvants that have been shown to be able to induce a good immune response against ZEA when conjugated ZEA is used as an immunogen include emulsions of water and oil, such as water-in-oil emulsions or It is an oil-in-water emulsion. The former is generally used in poultry, and the latter is generally used in animals more susceptible to adjuvant-induced site reactions, such as pigs and ruminants.
また別の実施形態では、コンジュゲート化ZEAは、10.000Daを超える分子質量を有するタンパク質にコンジュゲートされたZEAを含む。そのようなタンパク質、特にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及びオボアルブミン(OVA)は、動物、特に健康なブタにおいて適切な免疫応答を誘導することができることが分かっている。タンパク質の実用的な上限は、100MDaであり得る。 In yet another embodiment, the conjugated ZEA comprises ZEA conjugated to a protein having a molecular mass greater than 10.000 Da. It has been found that such proteins, particularly keyhole limpet hemocyanin (KLH) and ovalbumin (OVA), are able to induce appropriate immune responses in animals, especially healthy pigs. A practical upper limit for proteins may be 100 MDa.
マイコトキシン症に対する保護に関して、特に、本発明を使用すると、動物は、生殖不全(例えば、受精能の低下及び異常な発情周期)、外陰の腫脹、膣炎、乳産生の低下及び乳腺肥大、したがって、ZEAによって誘発されるマイコトキシン症のこれらの徴候の1つ又は複数から保護されると考えられることが見出された。 With regard to protection against mycotoxicosis, in particular, using the invention animals suffer from reproductive failure (e.g. reduced fertility and abnormal oestrus cycles), vulvar swelling, vaginitis, reduced milk production and mammary gland enlargement, thus: It has been found that there appears to be protection against one or more of these manifestations of mycotoxicosis induced by ZEA.
ここで、以下の実施例を用いて本発明を更に説明する。 The invention will now be further illustrated using the following examples.
[実施例]
第1の一連の実験(実施例1~4を参照のこと)において、マイコトキシンに対する活性な免疫応答が、コンジュゲート化マイコトキシンを使用して誘発され得るかどうか、及び、誘発され得るならば、ワクチン接種動物を、その摂取後にこのマイコトキシンによって誘発される障害から保護することができるかどうかを評価した。後者については、DONによるチャレンジのためのブタモデルを使用した。その後(実施例5)、ワクチンにおけるコンジュゲート化ZEAの使用がワクチン接種動物においてゼアラレノンに対する抗体を誘導できるかどうかを評価した。
[Example]
In a first series of experiments (see Examples 1-4), we investigated whether an active immune response against mycotoxins could be induced using conjugated mycotoxins and, if so, vaccines. It was evaluated whether inoculated animals could be protected from damage induced by this mycotoxin after its ingestion. For the latter, a pig model for challenge with DON was used. Thereafter (Example 5), it was evaluated whether the use of conjugated ZEA in a vaccine could induce antibodies against zearalenone in vaccinated animals.
[実施例1]
コンジュゲート化DONを用いた免疫チャレンジ実験
目的
この研究の目的は、DON摂取によるマイコトキシン症から動物を保護するためのコンジュゲート化デオキシニバレノールの有効性を評価することであった。これを調べるために、ブタを毒性DONでチャレンジする前にDON-KLHで2回免疫した。異なる免疫化経路を使用して、投与経路の影響を研究した。
[Example 1]
Immune Challenge Experiment with Conjugated DON Purpose The purpose of this study was to evaluate the effectiveness of conjugated deoxynivalenol to protect animals from mycotoxicosis due to DON ingestion. To test this, pigs were immunized twice with DON-KLH before being challenged with virulent DON. Different immunization routes were used to study the effect of route of administration.
研究デザイン
8匹の雌ブタに由来する40匹の1週齢ブタを5つの群に分けて試験に使用した。群1~3の24匹の子ブタを1週齢及び3週齢で2回免疫した。群1は、両年齢で筋肉内(IM)免疫化された。群2は、1週齢でIM注射を受け、3週齢で経口ブーストを受けた。群3は皮内(ID)で2回免疫した。5 1/2週齢の群1~3を、DONを液体中で経口投与して4週間チャレンジした。群4は免疫化しなかったが、群1~群3について記載したようにDONでのみチャレンジした。群5は対照とし、5.5週齢から4週間で対照液のみを投与した。
Study Design Forty one-week-old pigs from eight sows were used in the study, divided into five groups. Twenty-four piglets in groups 1-3 were immunized twice at 1 and 3 weeks of age. Group 1 was immunized intramuscularly (IM) at both ages. Group 2 received an IM injection at 1 week of age and an oral boost at 3 weeks of age. Group 3 was immunized intradermally (ID) twice. Groups 1-3 at 5 1/2 weeks of age were challenged with DON orally in liquid for 4 weeks. Group 4 was not immunized but was challenged only with DON as described for Groups 1-3. Group 5 served as a control, and only the control solution was administered 4 weeks after the age of 5.5 weeks.
液体製剤中のDON濃度は、5.4mg/kg飼料の量に相当した。これは、1日当たり2.5mgのDONの平均量に相当する。4週間のチャレンジ後、全ての動物を、肝臓、腎臓及び胃に特別な注意を払いつつ死後調査した。更に、血液試料採取は、群5を除いて、研究の0、34、41、49、55、64日目(安楽死後)に行われ、群5の血液試料は、0、34、49日目、及び安楽死直後にのみ採取された。 The DON concentration in the liquid formulation corresponded to an amount of 5.4 mg/kg feed. This corresponds to an average amount of 2.5 mg DON per day. After 4 weeks of challenge, all animals were examined post mortem with special attention to the liver, kidneys and stomach. Additionally, blood sample collection was performed on days 0, 34, 41, 49, 55, and 64 (post-euthanasia) of the study, except for group 5; blood samples for group 5 were collected on days 0, 34, and 49. , and were collected only immediately after euthanasia.
試験項目
3つの異なる免疫原性組成物、すなわちIM免疫化に使用した注射用水中油型エマルジョン(X-solve50、MSD AH、Boxmeer)中に50μg/mlのDON-KLHを含む試験項目1;経口免疫化のために使用された油中水型エマルジョン(GNE、MSDAH、Boxmeer)中に50μg/mlのDON-KLHを含む試験項目2及びID免疫化のための注射用水中油型エマルジョン(X-solve50)中に500μg/mlのDON-KLHを含む試験項目3を製剤化した。
Test item Test item 1 containing 50 μg/ml DON-KLH in an injectable oil-in-water emulsion (X-solve50, MSD AH, Boxmeer) used for IM immunization; oral immunization. Test item 2 containing 50 μg/ml DON-KLH in water-in-oil emulsion (GNE, MSDAH, Boxmeer) used for immunization and oil-in-water emulsion for injection (X-solve50) for ID immunization. Test item 3 containing 500 μg/ml DON-KLH was formulated.
チャレンジデオキシニバレノール(Fermentek,Israelから入手)を、100mg/mlの最終濃度で100%メタノールに希釈し、<-15℃で保存した。使用前に、DONを更に希釈し、投与のための処置において供給した。 Challenge deoxynivalenol (obtained from Fermentek, Israel) was diluted in 100% methanol at a final concentration of 100 mg/ml and stored at <-15°C. Prior to use, DON was further diluted and provided in the treatment for administration.
組み入れ基準
健康な動物のみを使用した。不健康な動物を除外するために、研究開始前に、全ての動物を、それらの一般的な身体的外観及び臨床的異常又は疾患の非存在について調べた。群ごとに、異なる雌ブタの子ブタを使用した。毎日の実施において、全ての動物は、DON汚染飼料の摂取によってDONに事前に曝露された場合であっても免疫化される。DON自体は免疫応答を引き起こさないので、DONに事前に曝露された動物とDONに関してナイーブな動物との間に原理的な違いはないと考えられる。
Inclusion criteria Only healthy animals were used. All animals were examined for their general physical appearance and the absence of clinical abnormalities or diseases before the start of the study to exclude unhealthy animals. Piglets from different sows were used for each group. In daily practice, all animals are immunized even if they have been previously exposed to DON by ingestion of DON-contaminated feed. Since DON itself does not elicit an immune response, there appears to be no fundamental difference between animals pre-exposed to DON and animals naive with respect to DON.
結果
いずれの動物も、DON-KLHによる免疫化に関連する悪影響を有していなかった。したがって、組成物は安全であるように見えた。
Results None of the animals had any adverse effects associated with immunization with DON-KLH. Therefore, the composition appeared to be safe.
全てのブタは、実験開始時にDONに対する力価について血清学的に陰性であったが、チャレンジ中に、筋肉内免疫群(群1)及び皮内免疫群(群3)は、天然のDON-BSAを被覆抗原として用いたELISAによって測定されるように、DONに対する抗体応答を発現した。表1は、試験中の4つの時点での平均IgG値をそれらのSD値と共に示す。筋肉内免疫化及び皮内免疫化の両方が、DONに対して有意な力価を誘導した。 All pigs were serologically negative for titers to DON at the beginning of the experiment, but during challenge, the intramuscularly immunized group (group 1) and the intradermally immunized group (group 3) were exposed to native DON- Antibody responses against DON were developed as measured by ELISA using BSA as the coating antigen. Table 1 shows the mean IgG values at the four time points during the study along with their SD values. Both intramuscular and intradermal immunizations induced significant titers against DON.
表1 IgG力価
表2 体重分析
表3 絨毛/陰窩比
表4 一般健康データ
DONレベルに対する免疫化の効果
目的
この研究の目的は、DON摂取の毒物動態学に対するDONコンジュゲートによる免疫化の効果を評価することであった。これを調べるために、ブタに毒性DONを与える前にDON-KLHで2回免疫した。
Table 4 General health data
Effect of Immunization on DON Levels Purpose The purpose of this study was to evaluate the effect of immunization with DON conjugates on the toxicokinetics of DON uptake. To test this, pigs were immunized twice with DON-KLH before being fed toxic DON.
研究デザイン
10匹の3週齢ブタを試験に使用し、それぞれ5匹のブタからなる2つの群に分けた。群1のブタをDON-KLH(試験項目1;実施例1)で3週齢及び6週齢で2回IM免疫化した。群2は対照としての役割を果たし、対照流体のみを受けた。11週齢で、動物にそれぞれ、(毎日の飼料摂取量に基づいて)1mg/kg飼料の汚染レベルに類似する0.05mg/kgの用量でボーラスによってDON(Fermentek,Israel)を投与した。DON投与前並びにDON投与の0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8及び12時間後にブタの血液試料をジャッキに採取した。
Study Design Ten 3 week old pigs were used in the study and divided into two groups of 5 pigs each. Group 1 pigs were IM immunized twice with DON-KLH (Test Item 1; Example 1) at 3 and 6 weeks of age. Group 2 served as a control and received control fluid only. At 11 weeks of age, each animal received DON (Fermentek, Israel) by bolus at a dose of 0.05 mg/kg, which is similar to the contamination level of 1 mg/kg feed (based on daily feed intake). Pig blood samples were collected in jacks before DON administration and at 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8 and 12 hours after DON administration.
組み入れ基準
健康な動物のみを使用した。
Inclusion criteria Only healthy animals were used.
血漿中のDONの分析
未結合DONの血漿分析は、Xevo(登録商標)TQ-SMS装置(Waters,Zellik,Belgium)に連結されたAcquity(登録商標)UPLCシステムで、検証済みLC-MS/MS法を使用して行った。この方法を用いたブタ血漿中のDONの定量下限は0.1ng/mlである。
Analysis of DON in Plasma Plasma analysis of unbound DON was performed using a validated LC-MS/MS on an Acquity® UPLC system coupled to a Xevo® TQ-SMS instrument (Waters, Zellik, Belgium). It was done using the method. The lower limit of quantification of DON in pig plasma using this method is 0.1 ng/ml.
毒物動態学的分析
DONの血漿濃度-時間プロファイルの毒物動態学的モデリングを非コンパートメント分析(Phoenix,Pharsight Corporation,USA)によって行った。以下のパラメータを計算した:時間0から無限までの曲線下面積(AUC0→∞)、最大血漿濃度(Cmax)、及び最大血漿濃度の時間(tmax)。
Toxicokinetic analysis Toxicokinetic modeling of the plasma concentration-time profile of DON was performed by non-compartmental analysis (Phoenix, Pharsight Corporation, USA). The following parameters were calculated: area under the curve from time 0 to infinity (AUC 0→∞ ), maximum plasma concentration (C max ), and time of maximum plasma concentration (t max ).
結果
毒物動態学の結果を下の表5に示す。分かるように、DON-KLHによる免疫化は、全ての毒物動態学パラメータを減少させる。毒性作用の活動を担うのが未結合DONであるため、DON-KLHによる免疫化は、動物の血液中の未結合DONの量を減少させることによってDONによって引き起こされる毒性作用を減少させると結論づけることができる。
Results The toxicokinetic results are shown in Table 5 below. As can be seen, immunization with DON-KLH reduces all toxicokinetic parameters. Since it is unbound DON that is responsible for the activity of toxic effects, we conclude that immunization with DON-KLH reduces the toxic effects caused by DON by reducing the amount of unbound DON in the blood of animals. Can be done.
表5 未結合DONの毒物動態学パラメータ
様々なDONコンジュゲートに対する血清学的応答
目的
この研究の目的は、異なるコンジュゲート化デオキシニバレノール生成物の有効性を評価することであった。
Table 5 Toxicological parameters of unbound DON
Serological Responses to Various DON Conjugates Purpose The purpose of this study was to evaluate the efficacy of different conjugated deoxynivalenol products.
研究デザイン
18匹の3週齢のブタを試験に使用し、それぞれ6匹のブタからなる3つの群に分けた。群1のブタを、(実施例1の試験項目1を使用して)DON-KLHで3週齢及び5週齢で2回筋肉内免疫化した。群2は、DON-OVAに対応して免疫した。群3を陰性対照とした。全ての動物を、3週齢、5週齢及び8週齢で抗DON IgG応答についてチェックした。
Study Design Eighteen 3 week old pigs were used in the study and divided into three groups of 6 pigs each. Group 1 pigs were immunized intramuscularly with DON-KLH twice at 3 and 5 weeks of age (using Test Item 1 of Example 1). Group 2 was immunized correspondingly with DON-OVA. Group 3 served as a negative control. All animals were checked for anti-DON IgG responses at 3, 5 and 8 weeks of age.
結果
血清学的結果を、log2抗体価の表において以下に示す。
Results Serological results are shown below in a table of log2 antibody titers.
表6 抗DON IgG応答
[実施例4]
ニワトリにおける血清学的応答
目的
この研究の目的は、ニワトリにおけるDON-KLHの血清学的応答を評価することであった。
[Example 4]
Serological Response in Chickens Purpose The purpose of this study was to evaluate the serological response of DON-KLH in chickens.
研究デザイン
この研究のために、30羽の4週齢のニワトリを使用し、それぞれ10羽のニワトリの3つの群に分けた。ニワトリをDON-KLHで筋肉内免疫した。群1を対照として使用し、PBSのみを投与した。群2はアジュバントなしでDON-KLHを受け、群3はGNEアジュバントに製剤化されたDON-KLHを受けた(MSD Animal Health,Boxmeerから入手可能)。0日目に、0.5mlワクチンを用いて右脚にプライム免疫処置を行った。14日目に、ニワトリを左脚に同等のブースター免疫化した。
Study Design For this study, 30 4-week-old chickens were used and divided into three groups of 10 chickens each. Chickens were immunized intramuscularly with DON-KLH. Group 1 was used as a control and received PBS only. Group 2 received DON-KLH without adjuvant and Group 3 received DON-KLH formulated in GNE adjuvant (available from MSD Animal Health, Boxmeer). On day 0, a prime immunization was performed in the right leg with 0.5 ml vaccine. On day 14, chickens were given an equivalent booster immunization in the left leg.
採血は、0日目及び14日目、並びに35、56、70及び84日目に行った。DONに対するIgYの測定のために血清を単離した。0日目及び14日目に、免疫化の直前に血液試料を単離した。 Blood sampling was performed on days 0 and 14, and on days 35, 56, 70 and 84. Serum was isolated for measurement of IgY against DON. Blood samples were isolated on days 0 and 14, immediately prior to immunization.
結果
血清学的結果をlog2抗体力価で表7に示す。PBSバックグラウンドはデータから差し引かれている。
Results Serological results are shown in Table 7 as log2 antibody titers. PBS background has been subtracted from the data.
表7 抗DON IgY応答
[実施例5]
ZEAコンジュゲートに対する血清学的応答
目的
この実験の目的は、ワクチン中のコンジュゲート化ZEAの使用がワクチン接種動物においてゼアラレノンに対する抗体を誘導できるかどうかを評価することであった。
[Example 5]
Serological Responses to ZEA Conjugates Purpose The purpose of this experiment was to evaluate whether the use of conjugated ZEA in vaccines can induce antibodies against zearalenone in vaccinated animals.
研究デザイン
このために、キーホールリンペットヘモシアニン(ZEA-KLH)にコンジュゲートしたゼアラレノンを含むワクチンを使用した。コンジュゲートを、筋肉内(IM)投与のために50μg/ml、又は皮内(ID)投与のために500μg/mlの最終濃度で水中油型エマルジョンアジュバント(XSolve50、MSD Animal Health,The Netherlands)と混合した。
Study Design For this, a vaccine containing zearalenone conjugated to keyhole limpet hemocyanin (ZEA-KLH) was used. The conjugate was administered with an oil-in-water emulsion adjuvant (XSolve50, MSD Animal Health, The Netherlands) at a final concentration of 50 μg/ml for intramuscular (IM) administration or 500 μg/ml for intradermal (ID) administration. Mixed.
この実験では、上記のDONワクチンも陽性対照として使用した。これの次に、他のコンジュゲート化マイコトキシンを含むワクチンを製剤化し、使用した。特に、キーホールリンペットヘモシアニン(FUM-KLH)にコンジュゲートされたフモニシン(FUM)及びKLH(T2-KLH)にコンジュゲートされたT-2マイコトキシン(T2-毒素)をワクチンに製剤化した。コンジュゲートを、それぞれFUM-KLH及びDON-KLHについては筋肉内(IM)投与のための50μg/ml又は皮内(ID)投与のための500μg/ml、及びT2-KLHについては115(IM)又は1150μg/ml(ID)の最終濃度で、本明細書中上で言及されるような水中油型エマルジョンアジュバント(XSolve)と混合した。 The DON vaccine described above was also used as a positive control in this experiment. Following this, vaccines containing other conjugated mycotoxins were formulated and used. In particular, fumonisin (FUM) conjugated to keyhole limpet hemocyanin (FUM-KLH) and T-2 mycotoxin (T2-toxin) conjugated to KLH (T2-KLH) were formulated into vaccines. The conjugate was administered at 50 μg/ml for intramuscular (IM) administration or 500 μg/ml for intradermal (ID) administration for FUM-KLH and DON-KLH, respectively, and 115 (IM) for T2-KLH. or mixed with an oil-in-water emulsion adjuvant (XSolve) as mentioned herein above at a final concentration of 1150 μg/ml (ID).
実験では、5匹の健康な未経産ブタの6つの群をワクチン接種に使用した。群1には0.2mlのFUM-KLHを皮内に2回投与し、群2には0.2mlのZEA-KLHを2回投与し、群3には2.0mlのX-Solve50のDON-KLH IMを2回ワクチン接種し、群4には2.0mlのFUM-KLH IMを2回投与し、群5には2.0mlのZEA-KLHを2回IM投与し、最後に群6には2.0mlのT2-KLH IMを2回ワクチン接種した。3匹の子ブタからなる対照群があり、この対照群はワクチン接種を受けなかった。全てのプライムは3週齢であり、ブースターは5週齢であった。動物を試験開始後14週間モニタリングした。 In the experiment, six groups of five healthy gilts were used for vaccination. Group 1 received 0.2 ml of FUM-KLH intradermally twice, Group 2 received 0.2 ml of ZEA-KLH twice, and Group 3 received 2.0 ml of X-Solve50 DON. - Vaccinated twice with KLH IM, group 4 received two doses of 2.0 ml FUM-KLH IM, group 5 received two doses of 2.0 ml ZEA-KLH IM, and finally group 6. were vaccinated twice with 2.0 ml of T2-KLH IM. There was a control group of 3 piglets, which received no vaccinations. All primes were 3 weeks old and boosters were 5 weeks old. Animals were monitored for 14 weeks after the start of the study.
結果
全てのブタは、実験開始時にFUM、ZEA、T2及びDONに対する力価について血清学的に陰性であり、全てのワクチン接種群は抗体力価を発現した。得られたlog2力価を以下の表8に示す。分かるように、各コンジュゲート化マイコトキシンに対して抗体を高レベルで上昇させることができた。これは、DON誘導性マイコトキシン症について上に示したように、ワクチンが対応するマイコトキシン症に対して有効に使用され得ることを裏付けている。
Results All pigs were serologically negative for titers against FUM, ZEA, T2 and DON at the start of the experiment and all vaccinated groups developed antibody titers. The log2 titers obtained are shown in Table 8 below. As can be seen, high levels of antibodies could be raised against each conjugated mycotoxin. This confirms that the vaccine can be effectively used against the corresponding mycotoxicosis, as shown above for DON-induced mycotoxicosis.
表8 IgG力価
ニワトリにおけるZEAコンジュゲートに対する血清学的応答
目的
この実験の目的は、ワクチン中のコンジュゲート化ZEAの使用がニワトリにおいてゼアラレノンに対する抗体を誘導できるかどうかを評価することであった。
Table 8 IgG titer
Serological Responses to ZEA Conjugates in Chickens Purpose The purpose of this experiment was to evaluate whether the use of conjugated ZEA in a vaccine could induce antibodies against zearalenone in chickens.
研究デザイン
このために、キーホールリンペットヘモシアニン(ZEA-KLH)にコンジュゲートしたゼアラレノンを含むワクチンを実施例5に沿って使用した。実施例5で使用したのと同じ鉱油を使用し、及び代替として非鉱油の同等のエマルジョン中で、両方とも最終濃度50μg/mlでコンジュゲートを油エマルジョンアジュバントと混合した。
Study Design For this, a vaccine containing zearalenone conjugated to keyhole limpet hemocyanin (ZEA-KLH) was used according to Example 5. The conjugate was mixed with an oil emulsion adjuvant, using the same mineral oil used in Example 5, and alternatively in an equivalent emulsion of non-mineral oil, both at a final concentration of 50 μg/ml.
15羽のニワトリの群を研究に使用した。5匹の動物の3つの群を使用した。群1は陰性対照として使用し、PBS溶液を投与し、群2には鉱油含有アジュバントに混合したZEA-KLHをワクチン接種し、群3には非鉱油含有アジュバントをワクチン接種した。ニワトリに、T=8及びT=22で0.5mlのワクチンを筋肉内ワクチン接種した(馴化のためにトリをT=0で試験に含めた)。 A group of 15 chickens was used in the study. Three groups of 5 animals were used. Group 1 was used as a negative control and was administered PBS solution, group 2 was vaccinated with ZEA-KLH mixed in a mineral oil-containing adjuvant, and group 3 was vaccinated with a non-mineral oil-containing adjuvant. Chickens were vaccinated intramuscularly with 0.5 ml of vaccine at T=8 and T=22 (birds were included in the study at T=0 for acclimatization).
結果
全てのニワトリは、実験開始時にZEAに対する力価について血清学的に陰性であり、全てのワクチン接種群は抗体力価を発現した。得られたlog2力価を以下の表9に示す。見て分かるように、両方の群において、コンジュゲート化ゼアラレノンに対して抗体を高レベルで上昇させることができた。これは、アジュバントの種類は、それ自体で十分な免疫応答を上昇させるために必須ではないという共通の理解を支持する。
Results All chickens were serologically negative for titers against ZEA at the start of the experiment and all vaccinated groups developed antibody titers. The log2 titers obtained are shown in Table 9 below. As can be seen, high levels of antibodies could be raised against the conjugated zearalenone in both groups. This supports the common understanding that the type of adjuvant is not essential in itself to raise a sufficient immune response.
表9 ニワトリにおけるZEAに対する抗体価
ブタにおけるZEAチャレンジに対する保護
目的
この実験の目的は、ワクチン中のコンジュゲート化ZEAの使用がブタのゼアラレノンチャレンジに対する保護を誘導し得るか否かを評価することであった。
Table 9 Antibody titers against ZEA in chickens
Protection against ZEA challenge in pigs Purpose The purpose of this experiment was to assess whether the use of conjugated ZEA in a vaccine could induce protection against zearalenone challenge in pigs.
研究デザイン
このために、実施例6に記載されるように、2つの異なるアジュバント中のキーホールリンペットヘモシアニン(ZEA-KLH)にコンジュゲートされたゼアラレノンを含む同じワクチンを使用し、一方は鉱油をベースとし、他方は非鉱油をベースとした。この試験では、24匹のブタの群を使用した。群1の8匹の子ブタにZEA-KLHをワクチン接種したが、第1の亜群の4匹の動物は鉱油含有アジュバントに基づくワクチンを受け、第2の亜群は代替ワクチンを受けた。両ワクチンを50μg/mlの濃度で2mlの量で筋肉内投与した。動物に7~12日齢でプライムワクチン接種し(T=0)、21~26日齢でブースターワクチン接種した(T=14)。群2はワクチン接種しなかったが、ゼアラレノンでチャレンジし、陽性対照とした。群3はワクチン接種せず、チャレンジもせず、陰性対照とした。(群1及び2)の16匹のチャレンジされた子ブタは、液体製剤中、1.15mg/日に相当する4週間にわたって毎日、ZEA1.15mg/kg飼料をおよそ5.5週齢で受けた。ブタは、最初の週に16mlの流体中0.46mgのZEA/日、第2週に32mlの流体中0.96mg/日、第3週に45mlの流体中1.39mg/日及び第4週に60mlの流体中1.79mgのZEA/日を受けた。抗体力価を経時的にモニタリングした。研究の最後に、肝臓及び腎臓を評価した。
Study Design For this, we used the same vaccine containing zearalenone conjugated to keyhole limpet hemocyanin (ZEA-KLH) in two different adjuvants, one with mineral oil, as described in Example 6. one based on non-mineral oil. A group of 24 pigs was used in this study. Eight piglets in group 1 were vaccinated with ZEA-KLH, while 4 animals in the first subgroup received a vaccine based on a mineral oil-containing adjuvant and the second subgroup received an alternative vaccine. Both vaccines were administered intramuscularly in a volume of 2 ml at a concentration of 50 μg/ml. Animals were prime vaccinated at 7-12 days of age (T=0) and booster vaccinated at 21-26 days of age (T=14). Group 2 was not vaccinated but challenged with zearalenone and served as a positive control. Group 3 was not vaccinated or challenged and served as a negative control. Sixteen challenged piglets (groups 1 and 2) received ZEA 1.15 mg/kg feed daily for 4 weeks, equivalent to 1.15 mg/day, in a liquid formulation at approximately 5.5 weeks of age. . Pigs received 0.46 mg of ZEA/day in 16 ml of fluid in the first week, 0.96 mg/day in 32 ml of fluid in the second week, 1.39 mg/day in 45 ml of fluid in the third week and received 1.79 mg of ZEA/day in 60 ml of fluid. Antibody titers were monitored over time. At the end of the study, the liver and kidneys were evaluated.
同様の研究では、(雄子ブタの)生殖器官の皮膚をモニタリングし、非チャレンジ対照と比較した。チャレンジ用量は、液体製剤中の0.78mg/日に相当する1.625mg/kg/日であった。ブタは、最初の週に16mlの流体中0.28mgのZEA/日、第2週に32mlの流体中0.58mg/日、第3週に45mlの流体中0.84mg/日及び第4週に60mlの流体中1.43mgのZEA/日を受けた。 In a similar study, reproductive tract skin (of male piglets) was monitored and compared to non-challenged controls. The challenge dose was 1.625 mg/kg/day, corresponding to 0.78 mg/day in the liquid formulation. Pigs received 0.28 mg ZEA/day in 16 ml fluid in the first week, 0.58 mg/day in 32 ml fluid in the second week, 0.84 mg/day in 45 ml fluid in the third week and 0.84 mg/day in 45 ml fluid in the fourth week. received 1.43 mg of ZEA/day in 60 ml of fluid.
結果
全ての子ブタは、実験開始時にZEAに対して力価について血清学的に陰性であった。チャレンジ中、ZEA-KLHのワクチン接種は、試験中の6つの時点でのIgG値を示す表10に示すように、ZEAに対する抗体応答を発現した。
Results All piglets were serologically negative for titer against ZEA at the beginning of the experiment. During challenge, the ZEA-KLH vaccination developed an antibody response against ZEA, as shown in Table 10, which shows IgG values at six time points during the study.
表10 ブタのZEAに対するIgG力価
表11は、チャレンジの開始体重からのチャレンジ中の体重増加%を有する群当たりの動物の割合を示し、更に、特定の器官に対する損傷を有する動物の割合を示す。これは全て、ZEA誘導性マイコトキシン症から動物を保護する方法において、コンジュゲート化ゼアラレノンを首尾よく使用できることを示している。 Table 11 shows the percentage of animals per group with % weight gain during challenge from challenge starting weight and also shows the percentage of animals with damage to specific organs. All this indicates that conjugated zearalenone can be successfully used in methods of protecting animals from ZEA-induced mycotoxicosis.
表11 子ブタの体重及び器官スコア
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