JP2023552820A - 遺伝子編集のためのａａｖベクター - Google Patents

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Abstract

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターへの組み込みのために構成されたポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ｇＲＮＡ、及び標的核酸の改変に有用なＡＡＶベクターの補助的成分をコードする。このシステムはまた、細胞（例えば、遺伝子の標的核酸に変異を有する真核生物細胞）への導入に有用である。かかる変異を有する細胞を改変するためにかかるＡＡＶベクターを使用する方法も提供される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１２３，１１２号及び２０２１年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２３５，６３８号の優先権を主張し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
本配列表パラグラフ出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢによってＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月９日に作成され、名前が、ＳＣＲＢ－０２８＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが１３ＭＢである。
遺伝子編集は、多くの遺伝子疾患を治療又は予防するために非常に有望である。しかしながら、治療的利益を達成するためには、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集機構の所望の細胞への安全かつ標的化された送達が必要である。当該技術分野では、インビトロ及び／又はインビボでＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集機構を細胞に送達するための組成物及び方法が依然として必要とされている。
本開示は、標的核酸の改変のためにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを細胞に送達するためのＡＡＶベクターに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶ導入遺伝子（例えば、導入遺伝子プラスミド）の産生、並びに組換えアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）ベクターの産生に有用なポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）５’逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）配列、第２のＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、第１のガイドＲＮＡ（guide RNA、ｇＲＮＡ）、１つ以上のプロモーター、及び任意選択的にアクセサリエレメントをコードするポリヌクレオチドを提供し、全てが、単一のＡＡＶ粒子に組み込むことができる単一の発現カセットに包含されている。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、第２の３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び任意選択的に１つ以上のアクセサリエレメントをコードする配列を含む。更に他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、第２の３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、及び任意選択的に１つ以上のアクセサリエレメントをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列及びｇＲＮＡ配列は、合わせて、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質配列及びｇＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、合わせて、約３０４０～約３１００未満のヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超～少なくとも約１９００のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である。一実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、全ポリヌクレオチド配列長の少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は少なくとも３５％以上を構成する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのアクセサリエレメントは、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント、核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター又はリプレッサーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アクセサリエレメントは、当該アクセサリエレメントの非存在下でのＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現、結合、活性、又は性能を増強する。特定の実施形態では、増強された性能は、インビトロアッセイにおけるＣＲＩＳＰＲ成分の発現時の標的核酸の編集の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５００％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加である。
いくつかの実施形態では、本開示は、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質であるＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸは、配列番号１～３並びに配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９及び４０８２８～４０９１２の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、コードされるＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上のドメインに少なくとも１つの改変を含む配列番号１４５の配列を含み、１つ以上の改変は、表３０～表３３に示される改変からなる群から選択され、１つ以上の改変は、配列番号１４５のＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して改善された特徴をもたらす。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１及び第２のｇＲＮＡをコードし、コードされたｇＲＮＡは各々、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされた第１及び第２のｇＲＮＡは、配列番号２２３８と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、１つ以上の改変は、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらし、１つ以上の改変は、表２８に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含み、１つ以上の改変は、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす。別の実施形態では、コードされた第１及び第２のｇＲＮＡは、配列番号２２３９と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、１つ以上の改変は、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらし、１つ以上の改変は、表２８に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含み、１つ以上の改変は、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’及び３’ＩＴＲを含み、ＩＴＲは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２７の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む。
他の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つのポリヌクレオチドとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示は、組換えＡＡＶベクターを作製する方法であって、細胞集団を提供することと、本明細書に開示される実施形態のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターで細胞集団をトランスフェクトすることとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の成分配列が、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択され、ＣｐＧジヌクレオチドが実質的に欠失しており、成分配列がそれらの機能的特徴（例えば、発現を駆動する能力又は標的核酸の編集能を保持する能力）を保持するＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドが実質的に欠失しているＡＡＶベクターは、例えば投与された場合に、免疫原性特性の低下（例えば、炎症性サイトカイン又はＡＡＶの成分に対する抗体を誘発する能力の低下）を示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、哺乳動物細胞の集団における標的核酸を改変するための方法であって、複数の細胞を、本明細書に開示される実施形態のいずれかのｒＡＡＶの有効量と接触させることを含み、発現されたｇＲＮＡによって標的化される細胞の遺伝子の標的核酸が、発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質によって改変される、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象（例えば、ヒト）の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる対象における疾患を治療するための方法であって、治療有効用量の本明細書に開示される実施形態のいずれかのｒＡＡＶを投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択されるＡＡＶ成分の配列のＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部を欠失させることを含む、ｒＡＡＶの免疫原性を低下させる方法を提供する。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。
２０２０年１２月１０日に公開された国際公開第２０２０／２４７８８２号及び２０２１年１２月２日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０６１６７３の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
添付の特許請求の範囲に本開示の新規の特徴を詳細に示す。本開示の原理を利用する例示的な実施形態について示す以下の詳細な説明、並びに添付の図面を参照することによって、本開示の特徴及び利点がより良く理解されるであろう。
実施例１に記載されるＡＡＶ構築物の概略図を示す。
実施例１に記載されるように、ｍＮＰＣにヌクレオフェクトされたＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用する編集アッセイの結果を示し、３つの異なるベクター（構築物１、２、及び３）におけるＣａｓＸ及び標的化ガイドが、非標的化対照（non-targeting control、ＮＴ）と比較して高効率でオンターゲット（ｔｄＴｏｍａｔｏ）編集することを実証する。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例１に記載されるように、４つの異なる用量レベルでｍＮＰＣにヌクレオフェクトされたＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用する編集アッセイの結果を示す。ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとしてｍＮＰＣに送達されたＣａｓＸは、非標的化対照（ＮＴ）と比較して、用量依存的に高い効率でオンターゲット編集する。３つの異なるベクター（構築物１、２、及び３）において、ｔｄＴｏｍａｔｏを標的とする足場バリアント１７４及びスペーサーを有するＣａｓＸバリアント４９１を、ｍＮＰＣにヌクレオフェクトし、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって編集を評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例１に記載されるように、形質導入の５日後にＦＡＣＳによって評価された、３倍希釈物でｍＮＰＣに形質導入されたＡＡＶベクター構築物３を使用する編集アッセイの結果を示す。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。ＭＯＩ：感染多重度（multiplicity of infection）。
実施例２に記載されるように、ＣａｓＸバリアント４３８、ｇＲＮＡ足場１７４及びスペーサー１２．７でパッケージ化されたＡＡＶ粒子を示す走査透過顕微鏡写真である。ＡＡＶを１％酢酸ウラニルでネガティブ染色した。空の粒子は、カプシドの中心の濃い電子密度の円によって同定される。
実施例３に記載されるように、マウス冠状脳切片の免疫組織化学染色の結果を示す。マウスには、ＣａｓＸ ４９１、スペーサー１２．７を有するｇＲＮＡ足場１７４でパッケージ化された１×１０１１ＡＡＶのＩＣＶ注射を投与したが（上パネル）、これは、Ａｉ９マウスにおいてｔｄＴｏｍ遺伝子座を編集することができた（編集された細胞は白色に見える）。下のパネルは、ＡＡＶ ＩＣＶ注射として投与されたＣａｓＸ ４９１及び非標的化スペーサーを有する足場１７４が、ｔｄＴｏｍ遺伝子座において編集しなかったことを示す。注射の１ヶ月後に組織を免疫組織化学的分析のために処理した。
実施例４に記載されるように、ＣａｓＸプロモーターに変異を有する構築物のＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例４に記載されるように、ＣａｓＸプロモーターに変異を有する構築物のＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例４に記載されるように、ＣａｓＸプロモーター及び導入遺伝子サイズ（挿入表を参照されたい）における変異を有する構築物のＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例４に記載されるように、図９に示されるものと同じプロモーターを組み込んだＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。左側のグラフは、構築物の３倍希釈物を試験した結果であり、右側のグラフは、２×１０５ｖｇ／細胞のＭＯＩを使用する編集の結果である。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例４に記載されるように、以前に同定された上位４つのタンパク質プロモーターバリアント（ＡＡＶ．３、ＡＡＶ．４、ＡＡＶ．５及びＡＡＶ．６）を有するＡＡＶと比較して、導入遺伝子サイズを減少させるように設計されたタンパク質プロモーターバリアントを有するＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。破線は、ＡＡＶ．４の編集レベルを示し、ＡＡＶ構築物は、この実験において、バリアントにわたる比較のためのベースラインとして使用された。
この研究において試験された種々のプロモーターを有する全ての構築物についてのパーセント編集対導入遺伝子サイズのグラフである。破線で囲まれた構築物は、導入遺伝子サイズを最小化しながら、平均を超える編集を有すると同定された。破線は、ＡＡＶ．４の編集レベルを示し、ＡＡＶ構築物は、この実験において、バリアントにわたる比較のためのベースラインとして使用された。
実施例５に記載されるように、ｇＲＮＡプロモーター強度の変異を有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣの編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例５に記載されるように、ｇＲＮＡプロモーター強度の変異を有する３つの異なるＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣの編集アッセイの結果を示す。左側のグラフは、１×１０４～５×１０５ｖｇ／細胞の範囲の構築物の３倍希釈物を試験した結果であり、右側のグラフは、３×１０５ｖｇ／細胞のＭＯＩを使用する編集の結果である。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例５に記載されるように、送達された導入遺伝子におけるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのフットプリントを最小化するように設計されたＡＡＶ導入遺伝子プラスミドにおいて送達された場合の構築物における短縮型Ｕ６ ＲＮＡプロモーターの使用を評価するための実験におけるｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集パーセントを示す棒グラフである。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例５に記載されるように、送達された導入遺伝子におけるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのフットプリントを最小化するように設計されたＡＡＶベクターとして送達された場合の、基本構築物５３を構築物８５と比較する、ｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集パーセントを示す棒グラフである。
実施例５に記載されるように、ＡＡＶ導入遺伝子におけるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのフットプリントを最小化するように設計されたＡＡＶベクター中のｍＮＰＣに送達された場合の、操作されたＵ６ ＲＮＡプロモーターを有する構築物の効果を評価するための実験におけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集結果を示す棒グラフである。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例５に記載されるように、Ｘ軸上の操作されたＵ６ ＲＮＡプロモーターを有する試験された全てのＡＡＶバリアントの導入遺伝子サイズ対Ｙ軸上の編集されたｍＮＰＣのパーセントを示す散布図である。破線は、試験された最大プロモーターを有する構築物５３を示し、一方、点線は、試験された最小プロモーターを有する構築物８９を示す。
実施例５に記載されるように、ＡＡＶ導入遺伝子におけるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのフットプリントを最小化するように設計されたＡＡＶベクターにおいて送達される場合の、操作されたＰｏｌ ＩＩＩ ＲＮＡプロモーターを有する構築物の効果を評価するための実験における、ｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例５に記載されるように、示される構築物を使用する３．０Ｅ＋５ｖｇ／細胞のＭＯＩでのｍＮＰＣにおけるＡＡＶ媒介性編集レベルを示す棒グラフである。
実施例５に記載されるように、Ｘ軸上の試験された全てのバリアントの導入遺伝子サイズ対Ｙ軸上の編集されたｍＮＰＣのパーセントを示す散布図である。
実施例６に記載されるように、ポリ（Ａ）シグナルに変異を有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例６に記載されるように、トップポリ（Ａ）シグナルを有する２つのＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例７に記載されるように、タンパク質プロモーター転写単位に関して異なる配向でガイドＲＮＡ転写単位（Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ足場－スペーサースタック）を含有するＡＡＶプラスミド構築物の概略図である。先細点は、タンパク質又はガイドＲＮＡの転写単位の配向を示す。
実施例７に記載されるように、調節エレメントの配向に差異を有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例７に記載されるように、タンパク質プロモーター転写単位に対して異なる配向でガイドＲＮＡ転写単位（Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ足場－スペーサースタック）を含有するＡＡＶベクターを使用するＮＰＣの編集アッセイの結果を示す。左側のグラフは、１×１０４～２×１０６ｖｇ／細胞の範囲の構築物の３倍希釈物を試験した結果を示す。右側の棒グラフは、３．０Ｅ＋５ｖｇ／細胞のＭＯＩでのｍＮＰＣにおけるＡＡＶ媒介性編集パーセントを示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例８に記載されるような、転写後調節エレメントを有さない構築物と比較した、異なる転写後調節エレメントを有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミド構築物を使用するｍＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍ遺伝子座の編集アッセイの結果の棒グラフである。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例８に記載されるように、異なる転写後調節エレメント配列を含まない（構築物４、５、６）、又はそれらと組み合わせた（基本プラスミド４についての構築物３５～３７、基本プラスミド５についての構築物３８～３９、及び基本プラスミド６についての構築物４２～４３）、トッププロモーター制御下でＣａｓＸタンパク質４９１を発現する１５０ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミド（黒棒）を使用するヌクレオフェクション編集と比較した、３．０Ｅ＋５のウイルスＭＯＩでのｍＮＰＣのＡＡＶ媒介性編集レベル（灰色棒）を示す棒グラフである。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例８に記載されるように、異なる転写後調節エレメント配列を含まない（構築物５８，５９，５３）、又はそれと組み合わせた（それぞれ、Ｊｅｔプロモーターを含有する基本プラスミド５８についての構築物７２～７４、Ｊｅｔ＋ＵＳＰプロモーターを含有する基本プラスミド５９についての構築物７５～７７、及びＵｂＣプロモーターを含有する基本プラスミド５３についての構築物８０～８１）プロモーター下の構築物について、ウイルスＭＯＩ ３．０Ｅ＋５でのｍＮＰＣのＡＡＶ媒介編集レベルを示す棒グラフである。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データ（ｎ＝３）は、平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例８に記載されるように、評価された各構築物の導入遺伝子サイズ（ＩＴＲからＩＴＲまで、ｂｐ単位）を、３．０ｅ＋５ｖｇ／細胞のＭＯＩでのｍＮＰＣにおけるＡＡＶ媒介性編集レベルと比較する散布図である。丸で囲まれたデータ点は、選択された導入遺伝子サイズの編集レベルに関して上位の同定された構築物を表す。灰色の横線は、比較目的のためのベンチマークベクターＡＡＶ．５３の編集レベルを示す。縦の灰色の線は、４．９ｋｂの導入遺伝子サイズを上回るか又は下回るベクターの範囲を定める。
実施例８に記載されるように、その塩基（同じプロモーターを有するがＰＴＲＥを有さない導入遺伝子、灰色の破線によって示される）に対する、導入遺伝子プラスミドにおける示されたＰＴＲＥエレメントの包含からのＡＡＶ媒介性の倍率改善を示すバイオリンプロットである。
実施例８に記載されるように、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとしてｍＮＰＣに送達された異なるニューロンエンハンサーを有する構築物の編集結果を示す棒グラフである。灰色の線は、ＣＭＶエンハンサー＋コアプロモーターを有する参照プラスミド６４の編集レベルを示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例９に記載されるように、複数のｇＲＮＡを有する構築物についての代替的なｇＲＮＡ構成を有するＡＡＶ構築物の概略図を示す。上の概略図は構造１であり、下は構造２である。先細点は、タンパク質又はガイドＲＮＡの転写単位の配向を示す。
実施例９に記載されるように、複数のｇＲＮＡを有する構築物についての代替的なｇＲＮＡ構成を有するＡＡＶ構築物の概略図を示す。先細点は、タンパク質又はガイドＲＮＡの転写単位の配向を示す。
実施例９に記載されるように、ヌクレオフェクション及びＡＡＶ形質導入で試験されたガイドＲＮＡスタック（Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、足場、スペーサー）構造の概略図を示す。導入遺伝子は、スペーサー１２．７、１２．２及び非標的スペーサーＮＴを有する、異なる配向の二重スタックを有する。先細点は、タンパク質又はガイドＲＮＡの転写単位の配向を示す。
実施例９に記載されるように、プラスミドトランスフェクションを介してｍＮＰＣに送達されたガイドＲＮＡスタックを有する構築物についての編集アッセイの結果を示し、非標的化対照（ＮＴ）と比較して増強された効力を有するＲＮＡスタック編集を有する構築物を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例９に記載されるように、単一のｇＲＮＡを有する構築物３及び非標的化構築物と比較した、異なる構造の複数のｇＲＮＡ及び異なる組み合わせのスペーサーを有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミド構築物（図３５を参照されたい）を使用するｍＮＰＣの編集アッセイの結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例９に記載されるように、構築物３と比較した、異なる構造の複数のｇＲＮＡ及び異なる組み合わせのスペーサーを有するＡＡＶベクター構築物４５～４８（図３５を参照されたい）を使用するｍＮＰＣの編集アッセイの結果を示す。左パネルは、１×１０４～３×１０５ｖｇ／細胞の範囲の３倍ＭＯＩ希釈を使用する編集結果を示し、右パネルは、３×１０５ｖｇ／細胞のＭＯＩでの編集結果を示す。編集は、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
実施例１０に記載されるように、ｍＮＰＣにおける３’ＮＬＳ１、８及び９との様々な５’ＮＬＳの組み合わせ（表１５における２、７及び９）を有するＡＡＶ導入遺伝子プラスミド構築物を使用するｍＮＰＣにおける編集パーセントの棒グラフである。
実施例１０に記載されるように、ｍＮＰＣにおける３’ＮＬＳ１、８及び９との様々な５’ＮＬＳの組み合わせを有するＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣにおける編集パーセントの棒グラフである。
導入遺伝子におけるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのフットプリントを最小化するように設計されたベクターにおいて送達された場合の、様々なＮＬＳの組み合わせを有するＡＡＶベクターを使用するｍＮＰＣにおける編集パーセントの棒グラフである。
実施例１２に記載されるように、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間の例示的なＡＡＶ導入遺伝子の成分の構成を示す模式図である。
実施例１２に記載されるように、マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座を標的とするスペーサー１１．３０を有する、ＣＭＶ及びガイドバリアント１７４、２２９～２３７のＣａｓＸタンパク質４９１発現を発現する１０００個のＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトされたｍＮＰＣにおける編集アッセイの結果を示し、マウスＲＨＯエキソン１において用量依存的に改善された活性を実証する。三連のウェルをｇＤＮＡ抽出のために一緒にプールし、したがってｎ＝１として処理した。
実施例１２に記載されるように、２つのプラスミドヌクレオフェクション用量１０００及び５００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドにわたる、スペーサー１１．３０（１．０の値に設定）を有するガイド１７４に対する各操作された足場（２２９～２３７）についての編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。三連のウェルをｇＤＮＡ抽出のために一緒にプールし、したがってｎ＝１として処理した。
ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＰｏｌ ＩＩＩ ｈＵ６プロモーターの発現下で、外因性ＲＨＯ－ＧＦＰ遺伝子座（レポーターとしてＧＦＰを有する）においてＲＨＯを標的化するスペーサー１１．１を有する１７４と比較した、操作されたガイド２３５の編集結果を示し、実施例１２に記載されるように、変異ＲＨＯレポーター遺伝子におけるオフターゲット切断を伴わないＷＴ外来性ＲＨＯにおけるオンターゲット活性の増加を伴う、ヒトＲＨＯ遺伝子座における２３５バリアントによる改善された活性を示す。データ（ｎ＝３）は、平均±ＳＤとして提示される。
実施例１２に記載されるように、１０００ｎｇの各プラスミドをヌクレオフェクトした細胞におけるベンチマークｐ５９．４９１．１７４．１１．１レベル（値１．０に設定）に対して正規化されたｐ５９．４９１．２３５．１１．１を有するヒトＲＨＯ遺伝子座における１７４と比較した、操作されたガイド２３５の編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。データ（ｎ＝３）は、平均±ＳＤとして提示される。
３つの異なるＭＯＩレベルでスペーサー１１．３０を有するガイド足場１７４と比較した、ＣａｓＸ分子及び操作されたガイドバリアント２３５のＡＡＶ媒介性発現によるｍＮＰＣにおける編集レベルを示し、実施例１２に記載されるように、オフターゲット遺伝子座を有さない内因性マウスＲｈｏエキソン１遺伝子座における編集レベルの増加を確認する。
実施例１２に記載されるように、５．０ｅ＋５ ＭＯＩで感染させた細胞における、スペーサー１１．３０を有するガイド足場１７４と比較した、ＣａｓＸ分子及び操作されたガイドバリアント２３５のＡＡＶ媒介性発現によるｍＮＰＣにおける編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。データは、ｎ＝３の平均として提示される。
ＣａｓＸタンパク質４９１及び様々な長さのオンターゲットスペーサーを有するｓｇＲＮＡ足場１７４を発現する１０００及び５００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトされたｍＮＰＣにおけるヒトＲＨＯ遺伝子座での編集結果を示し、実施例１２に記載されるように、マウスＲＨＯ遺伝子座での改善されたオンターゲット編集を実証する。スペーサーバリアントは、それぞれ、１１．３０（２０ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）、１１．３８（１８ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）、及び１１．３９（１９ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）である。マウス及びヒトゲノムにわたっていかなる配列も認識しないように設計された対照スペーサー、非標的（ＮＴ）も陰性対照として試験して、ＣａｓＸタンパク質単独の発現から生じる非特異的標的化がないことを確実にした。三連のウェルをｇＤＮＡ抽出のために一緒にプールし、したがってｎ＝１として処理した。
実施例１２に記載されるように、示されたオフターゲットスペーサーを有するＣａｓＸタンパク質４９１及びｓｇＲＮＡ足場１７４を発現する１０００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドを用いてヌクレオフェクトされたｍＮＰＣにおけるヒトＲＨＯ遺伝子座での編集レベルを示す棒グラフである。
実施例１２に記載されるように、親ｓｇＲＮＡ－足場－スペーサー１７４．１１．３０のレベルに対して正規化された、スペーサーバリアント１１．３８及び１１．３９を有する各ｓｇＲＮＡ－足場１７４についてのヌクレオフェクトされたｍＮＰＣにおけるヒトＲＨＯ遺伝子座での編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。データは、３つの異なる生物学的複製物にわたる平均±ＳＤを示す。
実施例１３に記載されるように、ベンチマーク構築物と比較したｓｇＲＮＡ足場バリアント及び最適化スペーサーのＡＡＶ媒介性送達を比較するマウスモデルにおけるＲＨＯの編集結果を示すＷｈｉｓｋｅｒボックスグラフである。各ドットは１つの網膜を表す（ｎ＝８～１６）。一元配置分散分析統計検定を行った（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
実施例１３に記載されるように、ベンチマーク構築物と比較して、ｓｇＲＮＡ足場バリアント１７４及び２３５並びに最適化スペーサーのＡＡＶ媒介性送達を比較するマウスモデルにおけるＲＨＯの編集における相対倍率変化を示すＷｈｉｓｋｅｒボックスグラフである。値は、ベンチマークベクターＡＡＶ．ＲＨＯ．１７４．１１．３０（１の値に設定される）に対するものである。各ドットは１つの網膜を表す（ｎ＝８～１６）。
実施例１４に記載されるように、それぞれＣａｓＸタンパク質バリアント４９１、５１５、５２７、５２８、５３５、５３６又は５３７及びｓｇＲＮＡ足場２３５．１１．３７（オンターゲット）を発現する１０００及び５００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトしたｍＮＰＣにおけるマウスＲＨＯ遺伝子座でのＣＴＣ－ＰＡＭ編集レベル（インデル率）を示す棒グラフである。マウス及びヒトゲノムにわたっていかなる配列も認識しないように設計された対照スペーサー、非標的（no-target、ＮＴ）も陰性対照として試験して、ＣａｓＸタンパク質単独の発現から生じる非特異的標的化がないことを確実にした。三連のウェルをｇＤＮＡ抽出のために一緒にプールし、したがってｎ＝１として処理した。
実施例１４に記載されるように、それぞれＣａｓＸタンパク質バリアント４９１、５１５、５２７、５２８、５３５、５３６又は５３７及びｓｇＲＮＡ足場２３５．１１．３９（オフターゲット）を発現するＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトしたｍＮＰＣにおけるマウスＲＨＯ遺伝子座でのＣＴＣ－ＰＡＭ編集レベル（インデル率）を示す棒グラフである。
実施例１４に記載されるように、親ＣａｓＸタンパク質４９１のレベルに対して正規化された結果とともに、ガイド２３５及びスペーサー１１．３９を有するそれぞれの示されたＣａｓＸタンパク質バリアントについての編集レベルの倍数変化を表示する棒グラフを示す。
実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質バリアント４９１、５１５、５２７、５２８、５３５、５３６又は５３７及びスペーサー１１．４１又は１１．４３を有するガイドバリアント２３５を発現する１０００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトされたＡＲＰＥ－１９ ｍＮＰＣにおける編集レベルを示す棒グラフを示す。データ（ｎ＝３）は、平均±ＳＤとして提示される。
実施例１４に記載されるように、ベンチマークｐ５９．４９１．２３５．１１．４１レベル（１．０の値に設定）に対する、ＣａｓＸタンパク質バリアント５１５、５２７、５２８、５３５、５３６又は５３７及びスペーサー１１．４１又は１１．４３を有するガイドバリアント２３５を発現する１０００ｎｇのＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドでヌクレオフェクトされたＡＲＰＥ－１９ ｍＮＰＣにおける編集レベルの倍率変化を表示する棒グラフを示す。データ（ｎ＝３）は、平均±ＳＤとして提示される。
実施例１４に記載されるように、内因性マウスＲｈｏエキソン１遺伝子座でのｍＮＰＣにおけるＡＡＶ媒介性編集レベルの棒グラフを示す。実施例１４に記載されるように、３．０ｅ＋５及び１．０ｅ＋５ｖｇ／細胞ＭＯＩを使用して、示されたＣａｓＸタンパク質４９１、５１５、５２７、５２８、５３５、又は５３７及びｓｇＲＮＡ足場バリアント２３５．１１．３９を発現するＡＡＶベクターをｍＮＰＣに感染させた。データ（ｎ＝３）は、平均として提示される。
実施例１４に記載されるように、示されたＭＯＩを感染させた細胞における、スペーサー１１．３９を有するガイド１７４と比較した、ガイド足場２３５を有する示されたＣａｓＸバリアントについての編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。
参照ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座及び標的アミノ酸残基Ｐ２３（ＣＣＣ）配列（太字で強調）の図であり、実施例１５に記載されるように、スペーサー１１．３０標的配列及び予想されるＣａｓＸ媒介性切断を示す。ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ編集（置換／欠失）において定量化された最も一般的な予測編集は、参照ゲノムの下に表示されている）。
実施例１５に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスの網膜におけるｍＲＨＯ Ｐ２３遺伝子座のインビボＡＡＶ ＣａｓＸ媒介性編集の結果を示す（ｎ＝６～８、ＮＧＳによって検出された全インデルのパーセントにおける定量化）。
実施例１５に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ（ｎ＝６～８）マウスの網膜におけるｍＲＨＯ Ｐ２３遺伝子座のＡＡＶ ＣａｓＸ媒介性フレームシフト編集の割合（％）を示す（ｎ＝６～８、ＮＧＳによって検出された全インデルのパーセントにおける定量化）。
図５３Ａ－Ｆは、 ＡＡＶ－ＣａｓＸ処置マウス又は陰性対照からの網膜の代表的な蛍光イメージングを示し、実施例１５に記載されるように染色した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色し（上段、図５３Ａ～図５３Ｃ）、網膜層を可視化し、ＨＡタグ（下段、図５３Ｄ～図５３Ｆ）抗体で染色し、光受容体（ＯＮＬ）及び他の網膜層（ＩＮＬ、ＧＣＬ）におけるＣａｓＸ発現を検出した。凡例：ＯＮＬ＝外顆粒層、ＩＮＬ＝内顆粒層、ＧＣＬ＝神経節細胞層。
５．０ｅ＋９ｖｇ／眼のＸ．４９１．１７４．１１．３０ベクターを注射した野生型網膜において注射の３週間後にＮＧＳによって検出されたＣａｓＸ ４９１のＡＡＶ媒介性発現を使用する編集値の中央値、最小値、最高値を示すボックスプロットであり、実施例１６に記載されるように、４９１タンパク質は、桿体光受容体（Ｘ＝ＲＰ１～ＲＰ５）又は遍在性プロモーター（Ｘ＝ＣＭＶ）において選択的に発現するように設計されたプロモーターバリアントによって駆動される。灰色の線は、試験した他のウイルスベクターと比較するために、ＡＡＶ．ＲＰ１．４９１．１７４．１１．３０によって達成される編集レベルに配置されている。
実施例１６に記載されるように、総導入遺伝子サイズ（ｂｐ）と比較した、５．０ｅ＋９ｖｇ／眼のＡＡＶ．Ｘ．４９１．１７４．１１．３０ベクターを注射した野生型網膜においてＡＡＶベクターによって達成された編集のレベルを示すプロットである。灰色の線は、４．９ｋｂサイズ以下又は以上の導入遺伝子の境界を示す。
実施例１６に記載されるように、桿体光受容体におけるＣａｓＸ ４９１及びｓｇＲＮＡスペーサー１７４．４．７６のＡＡＶ媒介性発現が、組み込まれたＮｒｌ－ＧＦＰ遺伝子座において用量依存的に検出可能なレベルの編集レベルをもたらしたインビボ編集結果を示す）。棒グラフは、示された用量のＡＡＶ．ＲＰ１．４９１．１７４．４．７６ベクターを一方の眼に注射し、ビヒクル対照を反対側の眼に注射したヘテロ接合性Ｎｒｌ－ＧＦＰマウスにおいて、注射の４週間後及び１２週間後に組み込まれたＧＦＰ遺伝子座でＮＧＳによって検出された編集レベルを示す。
陽性対照（Ｃ１、非注射ホモ接合性Ｎｒ１－ＧＦＰ網膜）及び陰性対照（Ｎ、非注射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜）、ビヒクル群（Ｖ、ＡＡＶ製剤緩衝液注射網膜）並びに中用量１．９ｅ＋９（Ｍ）又は高用量１．０ｅ＋１０ｖｇ（Ｈアーム。ブロットは、実施例１６に記載されるように、ローディングコントロールとして使用されるＨＡタンパク質（ＣａｓＸタンパク質、上）、ＧＦＰタンパク質（中央）及びＧＡＰＤＨ（下パネル）についてのそれぞれのバンドを示す）によるＡＡＶ－ＣａｓＸ ４９１、ｓｇＲＮＡ １７４及びスペーサー４．７６処置網膜からの網膜溶解物のウェスタンブロットを示す。ＮＧＳによって検出された網膜における編集パーセントのレベルを、各試料についてブロットの下に示す。
実施例１６に記載されるように、図５６Ａのウェスタンブロットにおいて検出されたＧＦＰタンパク質のレベル（ビヒクル群レベルに対して正規化された、タンパク質の総量に対するＧＦＰバンドの濃度測定値の比）を表す散乱箱ひげ図である。一元配置分散統計分析を行った（＊＝ｐ＜０．５）。
実施例１６に記載されるように、１．０ｅ＋９及び１．０ｅ＋１０用量群の両方について、ＧＦＰタンパク質画分を、ＡＡＶ処置マウスのマウス網膜において達成された編集のレベルに相関させるプロットである。
実施例１６に記載されるように、２つの用量レベルのＡＡＶ構築物を注射されたマウスにおいて、注射の１２週間後と比較して４週間後に眼底イメージングによって検出されたＧＦＰ蛍光レベルの比（上網膜と下網膜の平均グレー値）を表す棒グラフである。
実施例１６に記載されるように、４週目（左パネル）又は１２週目（右パネル）にＡＡＶ構築物とともに１．０ｅ＋９ｖｇ（＃１３）又は１．０ｅ＋１０ｖｇ（＃３４）を注射したマウス由来の網膜におけるＧＦＰの蛍光眼底イメージングの代表的な画像を示す。
図５８Ａ－５８Ｌは、実施例１６に記載されるように、種々の免疫化学試薬で染色されたマウスの組織学的画像又は網膜を示し、ＡＡＶ用量依存的様式での光受容体細胞におけるＧＦＰの効率的なノックダウンを確認する。画像は、ビヒクル（図５８Ａ、図５８Ｂ、図５８Ｃ、図５８Ｄ）、１．０ｅ＋９ｖｇ用量のＡＡＶ－ＣａｓＸ（図５８Ｅ、図５８Ｆ、図５８Ｇ、及び図５８Ｈ）、及び１．０Ｅ＋１０ｖｇ用量のＡＡＶ－ＣａｓＸ（図５８Ｉ、図５８Ｊ、図５８Ｋ、及び図５８Ｌ）を注射した網膜断面の代表的な共焦点画像である。構造イメージングは、外節における桿体光受容体によるＧＦＰ発現を示す（図５８Ａ、図５８Ｅ、図５８Ｉの画像並びに図５８Ｃ、図５８Ｇ、及び図５８Ｋの画像、それぞれ２０倍及び４０倍拡大率）。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色し（図５８Ｂ、図５８Ｆ、及び図５８Ｊ）、細胞を抗ＨＡで染色して、ＨＡ（ＣａｓＸ導入遺伝子レベル、図５８Ｄ、図５８Ｈ、及び図５８Ｌ、４０倍拡大率）及び光受容体において発現されたＧＦＰのレベルを相関させた。Ｂ及びＦにおける白枠の輪郭は、図５８Ｃ及び図５８Ｇにおいて４０倍の倍率で分析された網膜領域を示す。凡例：ＲＰＥ＝網膜色素上皮、ＯＳ＝外節、ＯＮＬ＝外顆粒層、ＩＮＬ＝内顆粒層、ＧＣＬ＝神経節。
実施例３に記載されるように、ＡＡＶ ＩＶ注射として投与されたＣａｓＸ ４９１及びスペーサー１２．７を有する足場１７４が、Ａｉ９マウスにおいてインビボでｔｄＴｏｍ遺伝子座を編集することができたことを示す、マウス肝臓切片の免疫組織化学染色の結果を示す。画像は、ｎ＝３動物の代表である。
実施例３に記載されるように、ＡＡＶ ＩＶ注射として投与されたＣａｓＸ ４９１及びスペーサー１２．７を有する足場１７４が、Ａｉ９マウスにおいてインビボでｔｄＴｏｍ遺伝子座を編集することができたことを示す、マウス心臓切片の免疫組織化学染色の結果を示す。画像は、ｎ＝３動物の代表である。
実施例１７に記載されるように、ＭＯＩの一連の３倍希釈におけるヒトＮＰＣへのＡＡＶの形質導入の５日後のＢ２Ｍ遺伝子座での編集パーセントの定量化のグラフである。編集レベルを、インデル率としてＮＧＳによって、及びＢ２Ｍ遺伝子座における編集の成功によりＨＬＡタンパク質を発現しない細胞の集団としてフローサイトメトリーによって決定した。
実施例１７に記載されるように、それぞれＣａｓＸ４９１及びＡＡＶＳ１を標的とする特異的スペーサーを有するｇＲＮＡを含有する３つの示されたＡＡＶを使用して、ヒト誘導ニューロン（induced neurons、ｉＮ）におけるヒトＡＡＶＳ１遺伝子座でＮＧＳによって検出されたインデル率として測定された編集アッセイの結果を示す。
実施例１７に記載されるように、２Ｅ４又は６．６７Ｅ３のＭＯＩで様々なタンパク質プロモーターによって駆動されるＣａｓＸ４９１を発現するＡＡＶの形質導入１４日後のヒトｉＮにおけるＢ２Ｍ遺伝子座での編集パーセントを示す棒グラフである。
実施例１８に記載されるように、ｈＮＰＣにヌクレオフェクトされたＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを使用する編集アッセイの結果を示し、Ｕ１ａプロモーター（構築物ＩＤ１７８及び１７９）、Ｕ６プロモーター（構築物ＩＤ１８０及び１８１）、又はｂＧＨポリ（Ａ）（構築物ＩＤ１８２）内のＣｐＧ減少又は欠失が、元のＣｐＧ＋ＡＡＶベクター（構築物ＩＤ１７７）を用いて達成された編集と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子座におけるＣａｓＸ媒介性編集を有意に減少させなかったことを実証する。この実験で使用した対照は、非標的化（ＮＴ）スペーサー及び未処置（ＮＴｘ）であった。
実施例５に記載されるように、ＡＡＶベクター中のｍＮＰＣに送達された場合の、操作されたＰｏｌ ＩＩＩプロモーターハイブリッドバリアントを有するＡＡＶ構築物の効果を評価するための実験におけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座の編集結果を示す棒グラフである。編集は、ヌクレオフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。
実施例２０に記載されるように、足場ライブラリを設計するために使用されるガイドＲＮＡの領域及びドメインの模式図である。
実施例２０に記載されるように、示される不偏（二重及び単一変異）及び標的化変異（三重鎖、足場ステムバブル、シュードノット、並びに伸長ステム及びループに対する）の両方を有する足場ライブラリの相対的分布及び設計の円グラフである。
実施例２０に記載されるように、別の三重鎖形成塩基対を三重鎖に特異的に組み込むように設計された三重鎖変異誘発の概略図である。実線は三重鎖中のワトソン－クリック対を示す。第３鎖ヌクレオチドは、二重鎖のプリンとの非標準相互作用を表す点線として示されている。ライブラリにおいて、示された５つの位置の各々は、全ての可能な三重鎖モチーフで置換された（Ｇ：ＧＣ、Ｔ：ＡＴ、Ｇ：ＧＣ）＝２４３配列。ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＮＮＮＡＵＣＡＡＡＧの配列（配列番号４１８２９）。
実施例２０に記載されるように、各スクリーニングにおける参照ガイド足場１７４及び１７５の濃縮値の結果を伴う棒グラフである。
実施例２０に記載されるように、ガイド足場１７４及び１７５についての変異体ライブラリの２つの独立したスクリーニングの各々において測定された、各測定された単一ヌクレオチド置換、欠失、又は挿入についてのｌｏｇ２濃縮値を示す散布図である。
実施例２０に記載されるように、配列にわたる足場における特定の変異可能領域を示す、ガイド足場１７４及び１７５における単一変異体についてのヒートマップである。黄色の影は、参照足場と同様の濃縮を有する値を反映し、赤色の影は、参照足場と比較して、濃縮、したがって活性の増加を示し、青色の影は、野生型足場に対する活性の喪失を示し、白は、欠損データ（又は野生型配列をもたらす置換）を示す。
実施例２０に記載されるように、参照ガイド足場１７４及び１７５上の単一ヌクレオチド変異のｌｏｇ２濃縮を比較する散布図である。１７４と１７５との間で類似した位置への変異のみが示されている。結果は、全体として、ガイド足場１７４が１７５よりも変化に対して耐性があることを示唆している。
実施例２０に記載されるように、各新しいシュードノットが塩基対の同じ組成を有するが、ステム内で異なる順序であるようにシュードノット対がシャッフルされた足場のセットについての平均（及び９５％信頼区間）ｌｏｇ２濃縮値を示す棒グラフである。各棒グラフは、Ｇ：Ａ（又はＡ：Ｇ）ペアの位置を示したスキャフォールドのセットを示す（右図を参照されたい）。２９１個のシュードノットステムを試験し、棒グラフの上の数字は、各位置にＧ：Ａ（又はＡ：Ｇ）ペアを有するステムの数を示す。
下線によって分離された２つの鎖配列を有する、５’から３’に与えられた図５５及び図５６のシュードノット配列の概略図である。
実施例２０に記載されるように、シュードノットステム領域の予測二次構造安定性で除した、足場についての平均（及び９５％信頼区間）ｌｏｇ２濃縮値を示す棒グラフである。非常に安定なステム（例えば、ΔＧ＜－７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する足場は、平均して高い濃縮値を有したが、不安定化されたステム（ΔＧ≧－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する足場は、平均して低い濃縮値を有した。
実施例２０に記載されるような、足場１７５における７位及び２９位の全ての二重変異体のヒートマップである。シュードノット配列は、右側の５’から３’に与えられる。
実施例２１に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質５１５及び足場１７４によって標的化される場合の、異なるスペーサーに対するＣｃｄＢ選択の選択的ストリンジェンシーを決定するための生存アッセイのグラフである。
例示的な実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、かかる実施形態は、単なる例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本明細書で特許請求される本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。本開示の実施形態を実施する際に、本明細書に記載の実施形態に対する様々な代替形態を用いることができることを理解されたい。特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本実施形態の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。
定義
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多重鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多重鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」は、互換的に使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、温度及び溶液のイオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的な逆平行様式で、別の核酸に非共有結合する（すなわち、ワトソン－クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する）、「アニールする」又は「ハイブリダイズする」（すなわち、核酸が相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列の配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。それは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有し、それでもなお標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与することなく、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造又はヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など）。
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、並びにかかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、アクセサリエレメント配列を含み得、これには、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。コード配列は、転写又は転写及び翻訳の際に遺伝子産物をコードする。本開示のコード配列は、オープンリーディングフレームの断片を含んでもよく、全長を含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖並びにアンチコドンを含有する相補鎖の両方を含み得る。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して「に隣接する」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドにおいて互いに隣にある又は隣接する配列を指す。当業者は、２つの配列が互いに隣接していると考えることができ、それでも限定された量の介在配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチド又はアミノ酸を包含することを理解するであろう。
「アクセサリエレメント」という用語は、本明細書で「アクセサリ配列」という用語と互換的に使用され、とりわけポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）シグナル）、エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（posttranscriptional regulatory element、ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、更なるプロモーター、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復を刺激する因子（例えば、シス又はトランス）、転写のアクチベーター又はリプレッサー、自己切断配列、及び融合ドメイン、例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合した融合ドメインを含むことが意図される。適切なアクセサリエレメント又は複数のアクセサリエレメントの選択は、発現されるコードされた成分（例えば、タンパク質若しくはＲＮＡ）に依存するか、又は核酸が異なるポリメラーゼを必要とする複数の成分を含むか若しくは融合タンパク質として発現するように意図されていないかに依存することが理解される。
「プロモーター」という用語は、転写開始部位並びにポリメラーゼ結合及び転写を促進するための更なる配列を含有するＤＮＡ配列を指す。例示的な真核生物プロモーターとしては、ＴＡＴＡボックス及び／又はＢ認識エレメント（B recognition element、ＢＲＥ）などのエレメントが挙げられ、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／又は遺伝子（又は導入遺伝子）の転写及び発現を補助又は促進する。プロモーターは、合成的に産生され得るか、又は既知の若しくは天然に存在するプロモーター配列若しくは別のプロモーター配列に由来し得る。プロモーターは、転写される遺伝子に対して近位又は遠位であり得る。プロモーターはまた、特定の特性を付与するための２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターを含み得る。本開示のプロモーターは、組成が類似しているが、既知の又は本明細書に提供される他のプロモーター配列と同一ではないプロモーター配列のバリアントを含み得る。プロモーターは、プロモーター（例えば、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など）に作動可能に連結された関連するコード配列若しくは転写可能配列又は遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類され得る。プロモーターはまた、その強度によっても分類され得る。プロモーターの文脈で使用される場合、「強度」は、プロモーターによって制御される遺伝子の転写速度を指す。「強い」プロモーターは、転写速度が高いことを意味し、「弱い」プロモーターは、転写速度が比較的低いことを意味する。
本開示のプロモーターは、ポリメラーゼＩＩ（Pol II）プロモーターであり得る。ポリメラーゼＩＩは、全てのタンパク質コード遺伝子及び多くの非コード遺伝子を転写する。代表的なＰｏｌ ＩＩプロモーターは、転写開始部位を取り囲む約１００塩基対の配列であるコアプロモーターを含み、Ｐｏｌ ＩＩポリメラーゼ及び関連する一般的転写因子のための結合プラットフォームとして働く。プロモーターは、１つ以上のコアプロモーターエレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、ＢＲＥ、イニシエーター（Initiator、ＩＮＲ）、モチーフ１０エレメント（motif ten element、ＭＴＥ）、下流コアプロモーターエレメント（downstream core promoter element、ＤＰＥ）、下流コアエレメント（downstream core element、ＤＣＥ））を含み得るが、これらのエレメントを欠くコアプロモーターは、当該技術分野で既知である。
本開示のプロモーターは、ポリメラーゼＩＩＩ（Pol III）プロモーターであり得る。Ｐｏｌ ＩＩＩは、ＤＮＡを転写して、５Ｓ ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び他の小ＲＮＡなどの小リボソームＲＮＡを合成する。代表的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、転写を支持するために内部制御配列（遺伝子の転写された部分内の配列）を使用するが、ＴＡＴＡボックスなどの上流エレメントも時に使用される。全てのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、本開示の範囲内として想定される。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合した場合に、関連する遺伝子の発現を調節する、調節ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、又は遺伝子のコード配列の５’若しくは３’に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位（すなわち、プロモーターの数十若しくは数百塩基対（base pair、ｂｐ）内）にあってもよく、又は遺伝子の遠位（すなわち、プロモーターから数千ｂｐ、数十万ｂｐ、若しくは更に数百万ｂｐ離れている）に位置してもよい。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節されてもよく、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。
本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント（post-transcriptional regulatory element、ＰＲＥ）」（例えば、肝炎ＰＲＥ）とは、転写された場合、それに作動可能に連結された関連遺伝子の発現を増強又は促進する転写後活性を示し得る三次構造を生成するＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント（post-transcriptional regulatory element、ＰＴＲＥ）」（例えば、肝炎ＰＴＲＥ）とは、転写された場合、それに作動可能に連結された関連遺伝子の発現を増強又は促進する転写後活性を示し得る三次構造を生成するＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される場合、「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、クローニングステップ、制限ステップ、及び／又は連結ステップの様々な組み合わせの産物であり、その結果、天然のシステムで見出される内因性核酸から識別可能な構造的なコード配列又は非コード配列を有する構築物が得られることを意味する。一般に、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカー、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ、細胞又は無細胞転写及び翻訳システムに含まれる組換え転写単位から発現され得る合成核酸を提供する。かかる配列は、典型的には、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成において使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、ここで、かかる配列は、コード領域の操作又は発現を妨害せず、実際に、様々な機構によって所望の産物の産生を調節するように作用し得る（上記の「エンハンサー」及び「プロモーター」を参照されたい）。
「組換えポリヌクレオチド」又は「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離された配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。これは、通常、配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを、同じアミノ酸又は保存的アミノ酸をコードする縮重コドン（redundant codon）で置換するように行う。代替的には、所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結して、所望の機能の組み合わせを生成するように行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」という用語は、天然に存在しないポリペプチド又はタンパク質、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離されたアミノ配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は組換え体である。
本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の実体間に物理的接続を確立することを意味する。例えば、標的核酸をガイド核酸と接触させることは、標的核酸及びガイド核酸が、物理的接続を共有していることを意味する（例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができる）。
「解離定数」又は「Ｋｄ」は、互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性を意味する（すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどの程度強く結合するかである）。解離定数は、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を用いて計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、及び［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、及び複合体のモル濃度を表す。
本開示は、標的核酸配列を編集するために有用なシステム及び方法を提供する。本明細書で使用される場合、「編集」は、「改変」と互換的に使用され、切断、ニッキング、欠失、ノックイン、ノックアウトなどを含むが、これらに限定されない。
「切断」とは、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）の共有結合骨格の破壊を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。
「ノックアウト」という用語は、遺伝子又は遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊をもたらすヌクレオチド配列の欠失又は付加のいずれかによってノックアウトされ得る。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列で置換することによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子又はその遺伝子産物の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質活性若しくは機能が減弱され得るか、又はタンパク質レベルが低減若しくは排除され得る。
本明細書で使用される場合、「相同組換え修復」（homology-directed repair、ＨＤＲ）とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的ＤＮＡを修復又はノックアウトし、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。相同組換え修復は、ドナー鋳型が標的ＤＮＡ配列と異なり、ドナー鋳型の配列の一部又は全部が標的ＤＮＡに組み込まれる場合、挿入、欠失、又は変異による標的配列の配列の改変をもたらすことができる。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによる、ＤＮＡにおける二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（micro-homology mediated end joining、ＭＭＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断部位に隣接する欠失と常に関連する、変異原性ＤＳＢ修復機構を指す。ＭＭＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特定のパーセント「配列類似性」又は「配列同一性」を有し、これは、２つの配列を比較した場合（整列させた場合）、同じ相対位置にある同じ塩基又はアミノ酸の割合を意味する。配列類似性（パーセント類似性、パーセント同一性、又は相同性と称されることもある）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む、当該技術分野で既知の方法及びコンピュータプログラムを使用して整列させることができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間のパーセント相補性は、任意の便利な方法を使用して決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所整列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）が挙げられる（又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するデフォルト設定を使用して）。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質（異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない）を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、ウイルス様粒子、又はコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント（すなわち、「インサート」）を結合させて、細胞において結合されたセグメントの複製又は発現をもたらすことができる。
本明細書で使用される「天然に存在する」又は「未改変」又は「野生型」という用語は、核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物に適用される場合、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」とは、野生型若しくは参照アミノ酸配列と比較して、又は野生型若しくは参照ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞を表すことを意味する。単離された遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の混合集団中に存在してもよい。
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、真核細胞、原核細胞、又は多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株において）を意味し、真核細胞又は原核細胞は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエントとして使用され、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な変異に起因して、形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡの相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）は、異種核酸（例えば、発現ベクター）が導入された宿主細胞である。
「標的細胞マーカー」は、細胞表面受容体、サイトカイン受容体、抗原、腫瘍関連抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、又は抗体断片若しくは糖タンパク質向性因子のリガンドとして機能し得る標的組織若しくは細胞の表面に存在し得る結合部位を含むがこれらに限定されない、標的細胞によって発現される分子を指す。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質における、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、ＶＨＨ抗体などの単一ドメイン抗体、及び所望の抗原結合活性又は免疫学的活性を示す限り抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーを表す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益及び／又は予防的利益を含むがこれらに限定されない有益な結果若しくは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療される基礎となる障害又は疾患の根絶又は改善を意味する。治療的利益はまた、対象が依然として基礎障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、基礎疾患に関連する１つ以上の症状の根絶若しくは改善、あるいは１つ以上の臨床パラメータの改善により達成することができる。
「治療有効量」及び「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト又は実験動物）に単回用量又は反復用量で投与した場合、疾患状態又は病状の任意の症状、態様、測定されたパラメータ、又は特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を有することができる、単独での又は組成物の一部としての薬物又は生物製剤の量を指す。かかる効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、化合物（例えば、本開示の組成物）又は組成物（例えば、医薬組成物）の投与量を対象に与える方法を意味する。
「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、及び他のげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。
Ｉ．一般的な方法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらは、標準的な教科書であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）に見出すことができる（それらの開示は、参照により本明細書に援用される）。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれること、及びその範囲の上限と下限との間の各介在値が、文脈が別途明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１まで、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その複数の指示対象が含まれることに留意されたい。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解されるであろう。他の場合では、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴は、別個に又は任意の好適な部分的な組み合わせで提供されてもよい。本開示に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的な組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆるかかる部分的な組み合わせが本明細書に個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
ＩＩ．ＡＡＶベクター
第１の態様では、本開示は、遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現及び標的細胞及び／又は組織への送達のために最適化されたＡＡＶベクターに関する。
野生型ＡＡＶは、パルボウイルスファミリーに属する小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子から構成され、複製に重要なヘアピン形状に折り畳まれる１３０～１４５ヌクレオチドを有する逆位末端反復（ＩＴＲ）がいずれかの側に隣接する。ビリオンは、同じオープンリーディングフレームから、しかしディファレンシャルスプライシング（Ｖｐ１）及び代替翻訳開始部位（それぞれＶｐ２及びＶｐ３）から１：１：１０の比で産生される３つのカプシドタンパク質、Ｖｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３から構成される。ｃａｐ遺伝子は、アセンブリ活性化タンパク質（Assembly-Activating Protein、ＡＡＰ）と呼ばれる更なる非構造タンパク質を産生する。このタンパク質はＯＲＦ２から産生され、カプシド集合プロセスに必須である。カプシドは、約６０個の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子集合体を形成して、ＡＡＶゲノムを保護することができる非エンベロープＴ－１二十面体格子を形成する。
天然に複製欠損であり、ヒト体内のほぼ全ての細胞型を形質導入し得るので、ＡＡＶは、遺伝子治療又はワクチン送達における治療的使用のための好適なベクターを表す。典型的には、組換えＡＡＶベクターを産生する場合、２つのＩＴＲ間の配列は、１つ以上の目的の配列（例えば、導入遺伝子）で置換され、Ｒｅｐ及びＣａｐ配列は、トランスで提供され、ＩＴＲをベクター中に残る唯一のウイルスＤＮＡにする。得られる組換えＡＡＶベクターゲノム構築物は、目的の導入遺伝子配列をコードする発現カセットに隣接する２つのシス作用性１３０～１４５ヌクレオチドＩＴＲを含み、ベクターの総サイズが５～５．２ｋｂ未満であるように、導入遺伝子、１つ以上のプロモーター及びアクセサリエレメントを含み得る外来ＤＮＡのパッケージングのために少なくとも４．７ｋｂ以上を提供し、これは、ＡＡＶカプシド内のパッケージングと適合性である（構築物のサイズがこの閾値を超えると、ベクターのパッケージング効率が低下することが理解される）。導入遺伝子は、対象の細胞における遺伝子欠損を修正又は改善するために使用され得る。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集の文脈で、発現カセットのサイズ制限は、ヌクレアーゼのサイズが大きいことを考慮すると、ほとんどのＣＲＩＳＰＲ系にとって難題である。
本開示は、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドの産生のため、並びにＡＡＶウイルスベクターの産生のためのポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、第２のＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、１つ以上のプロモーター、及び任意選択的にアクセサリエレメントをコードする配列を含み、全てが、単一のＡＡＶウイルス粒子に組み込むことができる単一のポリヌクレオチドによってコードされる単一の発現カセットに包含される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、第２の３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び任意選択的に１つ以上のアクセサリエレメントをコードする配列を含む。
プロモーター及びアクセサリエレメントは、実施形態のＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞におけるその転写、翻訳及び／又は発現を可能にする様式で、導入遺伝子、例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び／又はｇＲＮＡに作動可能に連結され得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に接触しているアクセサリエレメント配列及び目的の遺伝子を制御する距離にあるアクセサリエレメント配列の両方を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のｇＲＮＡは、第１のプロモーターの制御下にあり、それに作動可能に連結されている。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、第１のプロモーターの制御下にあり、それに作動可能に連結されており、第１のｇＲＮＡは、第２のプロモーターの制御下にあり、それに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、転写開始、終結、プロモーター、エンハンサーエレメント、ＲＮＡプロセシングシグナル配列、エンハンサーエレメント、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、第２のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター又はリプレッサーを制御する配列を含むが、これらに限定されない、ＡＡＶベクターに含めるためのアクセサリエレメントを提供する。
「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復」又は「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野で認識される領域を意味し、これは、ＤＮＡの複製起点として及びウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域とともに、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除及び救出、並びに哺乳動物細胞ゲノムへの２つの隣接ＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組み込みを提供する。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。追加的に、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０が挙げられるが、これらに限定されない）、並びにこれらの血清型の改変カプシドのうちのいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する（すなわち、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切除及び救出を可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、レシピエント細胞のゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする）限り、必ずしも同一である必要はないか、又は同じＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要はない。宿主細胞への異種配列の組み込みのためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野において既知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１９５５５５（Ａ１）号及び米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２４（Ａ１）号を参照されたい）。特定の一実施形態では、ＩＴＲは、血清型ＡＡＶ１に由来する。別の特定の実施形態では、ＩＴＲは、配列ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号４０５５７）を有する５’ＩＴＲ及び配列ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号４０５７６）を有する３’ＩＴＲを含む、血清型ＡＡＶ２に由来する。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、まとめて、ＡＡＶゲノムを複製するために必要とされる。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、又はそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、まとめて、ウイルスゲノムをパッケージングするために必要とされるパッケージング機能を供給する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）の前臨床モデルにおいて脊髄全体の運動ニューロン及びグリアにポリヌクレオチドを効果的に送達することが実証されている血清型９又は血清型６のものである（Ｆｏｕｓｔ，ＫＤ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＡＡＶ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＲＨＯ ｓｌｏｗｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ＡＬＳ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２１（１２）：２１４８（２０１３））。いくつかの実施形態では、本方法は、実質内脳注射を介したニューロンの標的化のためのＡＡＶ９又はＡＡＶ６の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ベクターの静脈内投与のためのＡＡＶ９の使用を提供し、ＡＡＶ９は、血液脳関門を通過し、ベクターのニューロン及びグリア両方の指向性を介して神経系における遺伝子発現を駆動する能力を有する。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、網膜細胞にポリヌクレオチドを効果的に送達することが実証されている血清型８のものである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のアクセサリエレメントは、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、第３のプロモーター、第２のガイドＲＮＡ（標的核酸の異なる又は重複するセグメントを標的とする）、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター又はリプレッサーからなる群から選択される。場合によっては、ＰＴＲＥは、サイトメガロウイルス最初期イントロンＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（hepatitis B virus PRE、ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis virus PRE、ＷＰＲＥ）、及びヒト熱ショックタンパク質７０ｍＲＮＡ（human heat shock protein 70 mRNA、Ｈｓｐ７０）の５’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）からなる群から選択される。
上記において、１つ以上のアクセサリエレメントは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結されている。ＡＡＶ構築物のポリヌクレオチド中のアクセサリエレメントの包含は、ＡＡＶ構築物中の当該アクセサリエレメントの非存在下のＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現、結合、活性、又は性能を増強することができることが発見された。一実施形態では、１つ以上のアクセサリエレメントの包含は、ＡＡＶ構築物中の当該アクセサリエレメントの非存在下でのＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５００％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の、インビトロアッセイにおけるＣＲＩＳＰＲタンパク質による標的核酸の編集の増加をもたらす。
本開示のＡＡＶベクターの特徴において、より小さいサイズの特定のクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系の利用は、本明細書に記載されるように、導入遺伝子の残りの成分のために利用され得るＡＡＶベクターの作製において使用されるポリヌクレオチドにおける更なる配列空間の包含を可能にすることが発見されている。いくつかの実施形態では、クラス２ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ及びＣａｓＸからなる群から選択されるＶ型タンパク質、並びにそれぞれの系の関連ガイドＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸであり、ＣａｓＸは、表３に列挙される配列番号１～３及び配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、及び４０８２８～４０９１２からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸであり、ＣａｓＸは、表３に列挙される配列番号１～３及び配列番号４９～１６０及び４０２０８～４０３６９及び４０８２８～４０９１２の配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される足場配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７の配列からなる群から選択される配列を含む。前述の実施形態では、ｇＲＮＡは、改変される標的核酸に相補的な標的化配列を更に含み、標的化配列は、少なくとも１５～２０ヌクレオチドを有する。本開示のＡＡＶベクターへの組み込みのために企図されるＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡ成分の実施形態は、以下でより完全に記載される。
上述したように、ＡＡＶ構築物に含めることが企図されるより小さいサイズのクラス２、Ｖ型タンパク質及びｇＲＮＡは、単一のＡＡＶ粒子にパッケージ化することができる追加の又はより大きい成分の包含を可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質配列及びｇＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、約３１００、約３０９０、約３０８０、約３０７０、約３０６０、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質配列及びｇＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、合わせて、約３０４０～約３１００未満のヌクレオチド長である。したがって、ＡＡＶ粒子にパッケージ化することができる発現カセットの全長を考慮すると、いくつかの実施形態では、第１のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する。他の実施形態では、第１のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超～少なくとも約１９００のヌクレオチド長を有する。一実施形態では、第１のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する。別の実施形態では、第１のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超～少なくとも約１９００のヌクレオチド長を有する。一実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する。更にその他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する。他の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、少なくとも約１３００超～少なくとも約１９００のヌクレオチド長を有する。一実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する。別の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び２つ以上のアクセサリエレメントのポリヌクレオチド配列は、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、第１のプロモーター配列、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、第２のプロモーター配列、少なくとも第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び１つ以上のアクセサリエレメント配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は３５％以上が、第１及び第２のプロモーター並びに１つ以上のアクセサリエレメント配列を合わせた長さで含む、ポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、第１のプロモーター配列、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、第２のプロモーター配列、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、第３のプロモーター配列、第２のｇＲＮＡをコードする配列、及び１つ以上のアクセサリエレメント配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は３５％以上が、第１、第２、及び第３のプロモーター並びに１つ以上のアクセサリエレメント配列を合わせた長さで含む、ポリヌクレオチドを提供する。実施例において詳述されるように、ＡＡＶ導入遺伝子の発現カセットの全ポリヌクレオチドのより多くをプロモーター、第２のｇＲＮＡ、及び／又はアクセサリエレメントに充てる能力は、インビトロアッセイ又はインビボのいずれかで対象において、標的宿主細胞において発現されるとき、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡの発現及び／又は性能の増強をもたらすことが発見されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶポリヌクレオチド及び得られるＡＡＶベクターにおける代替的又はより長いプロモーター及び／若しくはアクセサリエレメント（例えば、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター又はリプレッサー）の使用は、代替的又はより長いプロモーター及び／若しくはアクセサリエレメントを有さない構築物と比較して、ＡＡＶがインビトロアッセイにおいて評価される場合、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５００％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の標的核酸の編集の増加をもたらす。一実施形態では、ポリヌクレオチドの第１のプロモーター配列は、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、又は少なくとも約８００ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、ポリヌクレオチドの第２のプロモーター配列は、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、又は少なくとも約８００ヌクレオチドを有する。プロモーターの実施形態は、以下でより詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２３及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２６に示されるものと、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のｇＲＮＡの標的化配列の選択においてのみ異なり、標的化配列は、標的核酸の配列とハイブリダイズすることができる１５～３０ヌクレオチドを有する配列である。前述の特定の実施形態では、標的化配列は、表２７に示される配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、図２４、図３３～図３５、又は図４２の構築物の構成を有する、ポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクターの作製における使用のためのポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、表８～表１０、表１２、１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクターの作製における使用のためのポリヌクレオチドであって、表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２６に示されるものと、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のｇＲＮＡの標的化配列の選択においてのみ異なり、標的化配列は、１５～３０ヌクレオチドを有する配列であり、改変される標的核酸の配列とハイブリダイズすることができる。前述の特定の実施形態では、標的化配列は、表２７に示される配列の群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクターの作製における使用のための本明細書に記載の実施形態のいずれかのポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、図２４、図３３～図３５、又は図４２の構築物の構成を有する、ポリヌクレオチドを提供する。
ＩＩＩ．ＡＡＶ系のガイド核酸
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の標的核酸のゲノム編集において有用性を有するＡＡＶ系において利用される、特異的に設計されたガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）に関する。本開示は、遺伝子編集ＡＡＶ系の成分として、標的核酸に相補的である（したがって、それとハイブリダイズすることができる）標的化配列を有する特異的に設計されたｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、複数のｇＲＮＡ（例えば、複数のｇＲＮＡ）が、標的核酸の改変のためにＡＡＶ系において送達されることが想定される。例えば、遺伝子内の２つの異なる部位又は重複する部位で結合及び切断するために、各々がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化する場合、標的核酸配列の異なる領域又は重複する領域に対する標的化配列を有する一対のｇＲＮＡを使用することができ、次いで、遺伝子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（homology-independent targeted integration、ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（single strand annealing、ＳＳＡ）、又は塩基除去修復（base excision repair、ＢＥＲ）によって編集される。
いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞における遺伝子のゲノム編集において有用性を有するシステムにおいて利用されるｇＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、システムのｇＲＮＡは、以下により詳細に記載される、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、リボ核タンパク質（ribonucleoprotein、ＲＮＰ）複合体と複合体を形成することができる。
ａ．参照ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡバリアント
いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡ（「参照ｇＲＮＡ」）の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の参照ｇＲＮＡは、参照ｇＲＮＡと比較して増強された又は異なる特性を有する１つ以上のバリアント（本明細書では「ｇＲＮＡバリアント」と称される）を生成するために、１つ以上の変異誘発方法（例えば、網羅的変異進化（Deep Mutational Evolution、ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（deep mutational scanning、ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピング（本明細書及び参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／２４７８８３（Ａ２）号に記載されている）を含み得る、本明細書に記載される変異誘発方法）に供され得る。ｇＲＮＡバリアントはまた、例えば、５’末端若しくは３’末端のいずれかに融合された又は内部に挿入された、１つ以上の外因性配列を含むバリアントも含む。参照ｇＲＮＡの活性又はそれが由来したバリアントは、それに対してｇＲＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用されてもよく、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能又は他の特徴の改善が測定される。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的な特異的に標的化された変異に供され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドは、リボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ガイドは、キメラであり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。
本開示のｇＲＮＡは、２つのセグメント、すなわち、標的化配列及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、以下でより詳細に記載される標的核酸（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖など）内の特定の配列（標的部位）に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（互換的に、ガイド配列、スペーサー、標的化配列、又は標的化領域と称される）を含む。ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸配列（コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む）及びアクセサリエレメントに結合することができる。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、ＲＮＰを形成する複合体として、ＣａｓＸタンパク質と相互作用（例えば、結合）する（以下でより詳細に記載される）。代替的には、タンパク質結合セグメントは、本明細書で「足場（scaffold）」と呼ばれ、これは、いくつかの領域から構成される（以下でより詳細に記載される）。
デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の場合、ターゲッター部分及びアクチベーター部分は各々、二重鎖形成セグメントを有し、ターゲッターの二重鎖形成セグメント及びアクチベーターの二重鎖形成セグメントは、互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖の二重鎖（ｇＲＮＡについてはｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する。ｇＲＮＡがｇＲＮＡである場合、「ターゲッター」又は「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、本明細書において、ＣａｓＸデュアルガイドＲＮＡの（したがって、「アクチベーター」及び「ターゲッター」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結されている場合、ＣａｓＸシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために使用される。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとアニーリングする５’領域、続いて、標的化配列のヌクレオチドを有する。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列と、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント（ｃｒＲＮＡリピートとも称され得る）と、を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーター）はまた、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成するヌクレオチドの二重鎖形成ストレッチも含む。したがって、ターゲッター及びアクチベーターは、対応する対としてハイブリダイズして、デュアルガイドＲＮＡ（本明細書において「二種分子ｇＲＮＡ」、「ｄｇＲＮＡ」、「二種分子ガイドＲＮＡ」、又は「２分子ガイドＲＮＡ」と呼ばれる）を形成する。ＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／又は切断は、ｇＲＮＡの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対形成の相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で起こり得る。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列（ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣなど）に相補的な配列に隣接する標的核酸に相補的な配列を有し、したがって、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列は標的核酸配列の配列とハイブリダイズするので、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、特定の標的核酸配列とハイブリダイズするように、使用者によってターゲッターが改変され得る。したがって、場合によっては、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列の相補体であり得る。他の場合では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子配列の相補体に由来する天然に存在する配列であり得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡのアクチベーター及びターゲッターは、（互いにハイブリダイズするのではなく）互いに共有結合しており、単一分子（本明細書において、「単一分子ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と称される）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、「アクチベーター」又は「ターゲッター」を含み、したがって、それぞれ「アクチベーターＲＮＡ」及び「ターゲッターＲＮＡ」であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、リボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラであり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡという用語は、天然に存在する分子、並びに配列バリアント（例えば、天然に存在しない改変されたヌクレオチド）を包含する。
まとめると、本開示の構築されたｇＲＮＡは、４つの別個の領域又はドメイン、すなわち、ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、伸長ステム、及び標的化配列（本開示の実施形態では標的核酸に特異的であり、ｇＲＮＡの３’末端に位置する）を含む。ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、及び伸長ステムは、合わせて、ｇＲＮＡの「足場」（ｇＲＮＡ足場）と称される。本開示のｇＲＮＡ足場は、ＲＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡを含み得る。
ｂ．ＲＮＡ三重鎖
本明細書に提供されるガイドＮＡ（参照ｓｇＲＮＡを含む）のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ三重鎖が存在し、ＲＮＡ三重鎖が、２つの介在ステムループ（足場ステムループ及び伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧ（配列番号４０７８６）で終わるＵＵＵ－ｎＸ（約４～１５）－ＵＵＵ（配列番号１９）ステムループの配列を含み、三重鎖を越えて二重鎖シュードノットへと伸長してもよいシュードノットを形成する。三重鎖のＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ（配列番号４０７８７）配列は、標的化配列と、足場ステムと、伸長ステムとの間のネクサスとして形成される。例示的なＣａｓＸ ｓｇＲＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次いで、足場ステムループがコードされ、次いで、テトラループによって連結された伸長ステムループがコードされ、次いで、ＡＡＡＧ（配列番号４０７８６）が三重鎖を閉じてから標的化配列になる。
ｃ．足場ステムループ
本開示のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、三重鎖領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＣａｓＸタンパク質（例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質）が結合するｇＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定なステムループである。場合によっては、足場ステムループは、多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムは、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡの機能に必要である。これは、おそらく、重要なステムループであるＣａｓ９のネクサスステムに類似しているが、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡの足場ステムは、いくつかの実施形態では、必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで見出される多くの他のステムループとは異なる。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｓｇＲＮＡにわたって保存されている。ｇＲＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号１４）を含む。
ｄ．伸長ステムループ
本開示のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、主にＣａｓＸタンパク質が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ融合体を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に可鍛性であり得る。いくつかの実施形態では、シングルガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ中のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間にＧＡＡＡ（配列番号４０７８８）テトラループリンカー又はＧＡＧＡＡＡ（配列番号４０７８９）リンカーを用いて作製される。場合によっては、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのターゲッター及びアクチベーターは、介在ヌクレオチドによって互いに連結され、リンカーは、３～２０ヌクレオチドの長さを有し得る。本開示のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体中のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きな３２ｂｐのループである。ｓｇＲＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号１５）を含む。
ｅ．標的化配列
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムループの後に、三重鎖の一部を形成する領域が続き、次いで、ｇＲＮＡの３’末端に標的化配列（又は「スペーサー」）が続く。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的化する。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＣＴＣのうちのいずれか１つが、標的配列に相補的な非標的鎖配列に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、ＲＮＰの成分として、真核細胞の標的核酸（例えば、真核生物の染色体、染色体配列など）における遺伝子の一部に相補的な（したがって、それにハイブリダイズすることができる）配列を有する。ｇＲＮＡの標的化配列は、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＲＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的化することができるように改変することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、標的配列の５’側にあり、標的化配列が、ｇＲＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣ、すなわち、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡの標的化配列が改変される遺伝子の標的核酸配列に相補的であるｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、変異を含む配列を本開示のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムで編集する目的で、野生型遺伝子配列と比較して１つ以上の変異を含む遺伝子の標的核酸配列に相補的である。そのような場合、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムによって行われる改変は、変異を修正若しくは補償することができるか、又は変異遺伝子産物の発現をノックダウン若しくはノックアウトすることができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子をノックダウン又はノックアウトするために、本開示のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムで変異を導入するために配列を編集する目的で、野生型遺伝子の標的核酸配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のエキソンに特異的であるように設計される。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロンに特異的であるように設計される。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロン－エキソン接合部に特異的であるように設計される。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の調節エレメントに特異的であるように設計される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の１つ以上の一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）を含む配列に相補的であるように設計される。コード配列内又は非コード配列内にあるＳＮＰは、両方とも本開示の範囲内である。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的であるように設計される。
いくつかの実施形態では、標的化配列は、遺伝子産物の発現を調節する調節エレメントに特異的である。かかる調節エレメントとしては、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（5’untranslated region、５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’untranslated region、３’ＵＴＲ）、保存されたエレメント、及びシス調節エレメントを含む領域が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含することが意図され、又は遺伝子エンハンサーエレメント若しくは保存されたエレメントの場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から数千ｂｐ、数十万ｂｐ、又は更には数百万ｂｐ離れていてもよい。上記において、標的は、遺伝子産物が細胞において発現されないか、又はより低いレベルで発現されるように、標的のコード遺伝子がノックアウト又はノックダウンされることが意図されるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶに組み込まれるｇＲＮＡの標的化配列は、１４～３５個の連続ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、１０～３０個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、２０個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続したヌクレオチドを有し、標的化配列は、標的核酸配列に対して０～５、０～４、０～３、又は０～２個のミスマッチを含むことができ、標的化配列を含むｇＲＮＡを含むＲＮＰが改変される標的核酸に対して相補的な結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶに組み込まれるｇＲＮＡの標的化配列は、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８０％、若しくは少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶに組み込まれるｇＲＮＡの標的化配列は、表２７に示されるように、配列番号４１０５６～４１７７６の配列からなる群から選択される配列からなる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、第１のｇＲＮＡを含み、第２（及び任意選択的に、第３、第４、第５、又はそれ以上）のｇＲＮＡを更に含み、第２のｇＲＮＡ又は追加のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、その結果、標的核酸において複数の点が標的化され、例えば、ＣａｓＸによって複数の切断が標的核酸に導入される。そのような場合、第２のｇＲＮＡ又は追加のｇＲＮＡは、ＣａｓＸタンパク質の追加のコピーと複合体化されることが理解されるであろう。ｇＲＮＡの標的化配列の選択によって、変異を囲む標的核酸配列の規定された領域を、ＣａｓＸ：ＲＮＡシステムを使用して改変又は編集することができる。改変又は編集には、例えば、変異反復が生じる場合、又は変異を含むエキソンの除去がそれにもかかわらず機能的遺伝子産物の発現をもたらす場合に、ドナー鋳型の挿入又は切断部位間のＤＮＡの切除を促進すること挙げられる。
ｆ．ｇＲＮＡ足場
標的化配列ドメインを除いて、ｇＲＮＡの残りの成分は、本明細書において足場と称される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、参照ｇＲＮＡとして以下に記載される天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、参照ｇＲＮＡのバリアントであり、変異、挿入、欠失、又はドメイン置換が導入されて、ｇＲＮＡに望ましい特性を付与する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離された又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離された又はそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２２）及びＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）を含み得る。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離された又はそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧの配列（配列番号２４）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離された又はそれに由来する配列と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離された又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離された又はそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２５）及び
ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２６）を含み得る。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離された又はそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、
ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２７）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離された又はそれに由来する配列と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離された又はそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離された又はそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号２８）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１１）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１２）及びＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１３）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離された又はそれに由来する配列と同一の配列を含む。
表１は、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒの配列、ｃｒ及び足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡバリアント配列を提供し、ｇＲＮＡが、表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＲＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を有する配列を含む足場を有する。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。
ｇ．ｇＲＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場と比較して１つ以上の改変を含むか、又は別のｇＲＮＡバリアントに由来するｇＲＮＡバリアントに関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除いて、ｇＲＮＡの機能に必要なｇＲＮＡの全ての部分を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又はスワップ若しくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡ足場の任意の領域において生じ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４又は配列番号５の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアント配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又はスワップ若しくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号２２３８又は配列番号２２３９の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの特徴を改善する参照ｇＲＮＡ足場の１つ以上の領域内に１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域としては、ＲＮＡ三重鎖、シュードノット、足場ステムループ、及び伸長ステムループが挙げられる。場合によっては、バリアント足場ステムは、バブルを更に含む。他の場合では、バリアント足場は、三重鎖ループ領域を更に含む。更に他の場合では、バリアント足場は、５’非構造化領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４に対して少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の配列を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、本開示は、配列番号５に対して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、並びに改変された伸長ステムループ（元の６ｎｔループ及びループに対して最も近位の（most-loop-proximal）１３塩基対（合計３２ヌクレオチド）が、Ｕｖｓｘヘアピン（４ｎｔループ及びループに対して最も近位の５塩基対、合計１４ヌクレオチド）に置換され、伸長ステムのループに対して遠位の（loop-distal）塩基が、Ａ９９欠失及びＧ６５Ｕ置換によって新しいＵｖｓｘヘアピンに隣接する完全に塩基対合したステムに変換された）を提供する。前述の実施形態では、ｇＲＮＡ足場１７４は、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２２３８）を含む。
１つ以上の改善された特徴を有するか、又はバリアントｇＲＮＡを本明細書に記載の参照ｇＲＮＡと比較した場合に１つ以上の新たな機能を追加する、全てのｇＲＮＡバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。そのようなｇＲＮＡバリアントの代表的な例は、その設計が実施例に記載されているガイド１７４（配列番号２２３８）、及びガイド２３５（配列番号３９９８７）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、以下から選択される改善された特徴を有する：安定性の増加、ｇＲＮＡの転写の増加、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加、ｇＲＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の編集の特異性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合のオフターゲット編集の減少、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の編集におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の増加、及びそれらの任意の組み合わせ。場合によっては、ｇＲＮＡバリアントの増加した特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上である。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍増加している。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍増加している。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントを１つ以上の変異誘発方法、例えば、以下で本明細書に記載される変異誘発方法に供することによって作製することができ、これには、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る。参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントの活性は、それに対してｇＲＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用されてもよく、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能の改善が測定される。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的に標的化された変異、置換、又はドメインスワップに供され得る。かかる方法によって産生される例示的なｇＲＮＡバリアントは、実施例に記載されており、ｇＲＮＡ足場の代表的な配列は、表２に提示されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ガイド核酸足場配列又はｇＲＮＡバリアント足場配列と比較して、１つ以上の改変を含み、１つ以上の改変は、以下から選択される：ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、ｇＲＮＡの領域の全部若しくは一部の置換、ｇＲＮＡの領域の全部若しくは一部の欠失、又は上記の任意の組み合わせ。場合によっては、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１５個の連続した又は連続していないヌクレオチドの置換である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの欠失である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの挿入である。他の場合では、改変は、足場ステムループ又は伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換である。場合によっては、本開示のｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡと比較して１つの領域に２つ以上の改変を含む。他の場合では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、２つ以上の領域に改変を含む。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントは、この段落に記載されている前述の改変の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡの例示的な改変は、表２の改変を含む。
いくつかの実施形態では、＋１ヌクレオチドがＧである場合、Ｕ６プロモーターからの転写がより効率的であり、開始部位に関してより一貫性があるので、インビボでの発現のために、参照ｇＲＮＡと比較して５’ＧがｇＲＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、２つの５’Ｇが付加され、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位のＧ及び＋２位のプリンを強く好むので、インビトロでの転写で生産効率を増加させるためにｇＲＮＡバリアント配列を生成する。場合によっては、５’Ｇ塩基が、表１の参照足場に付加される。場合によっては、５’Ｇ塩基が、表２のバリアント足場に付加される。
表２は、例示的なｇＲＮＡバリアント足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、表２に列挙される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、若しくは４１８１７のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２３８～２２８５、３９９８１～４００２６、及び４０９１３～４０９５８、若しくは４１８１７のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２８１～２２８５、３９９８１～４００２６、及び４０９１３～４０９５８、若しくは４１８１７のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、表２の配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４３、配列番号２２５６、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、配列番号２２８１、配列番号２２８５、配列番号３９９８４、配列番号３９９８７、又は配列番号４０００３の配列に対する１つ以上の追加の改変を含む。
本開示のｇＲＮＡバリアントのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号５の参照ガイド足場と比較して少なくとも１つの改変を含み、少なくとも１つの改変が、以下のうちの１つ以上から選択される：（ａ）三重鎖ループにおけるＣ１８Ｇ置換、（ｂ）ステムバブルにおけるＧ５５挿入、（ｃ）Ｕ１欠失、（ｄ）（ｉ）６ｎｔループ及びループに対して近位の１３塩基対がＵｖｓｘヘアピンによって置換されており、（ｉｉ）Ａ９９の欠失及びＧ６５Ｕの置換により、ループに対して遠位の塩基が完全に塩基対合している、伸長ステムループの改変。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を有する外因性ステムループを含む。本明細書で使用されるｌｎｃＲＮＡは、長さが約２００ｂｐよりも長い非コードＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合している（すなわち、二重鎖ＲＮＡの領域を形成するように相互作用する）。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合しており、外因性ステムループの５’末端と３’末端との間の１つ以上の領域は、塩基対合しておらず、ループを形成している。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ｇＲＮＡと比較して、ヌクレオチドの改変を有するｇＲＮＡバリアントを提供し、（ａ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、（ｂ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、（ｃ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、（ｄ）足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換、又は（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を有する。本明細書に記載の置換、挿入及び欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成することができる。例えば、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失、を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡバリアントは、以前に生成されたバリアントの配列に対する１つ以上の改変を含み、以前に生成されたバリアント自体が、改変される配列として機能する。場合によっては、１つ以上の改変が、足場のシュードノット領域に導入される。他の場合には、１つ以上の改変が、足場の三重鎖領域に導入される。他の場合には、１つ以上の改変が、足場バブルに導入される。他の場合では、１つ以上の改変が、足場の伸長ステム領域に導入される。更に他の場合では、改変の１つは、前述の領域の２つ以上に導入される。かかる改変は、前述の領域における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変を生成及び評価するための例示的な方法は、実施例２０に記載される。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４１、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、又は配列番号２２８５、配列番号３９９８４、配列番号３９９８７、又は配列番号４０００３の配列に対する１つ以上の改変を含む。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して機能的特徴の改善を示す。他の例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７５（配列番号２２３９）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７５と比較して機能的特徴の改善を示す。例えば、ｇＲＮＡバリアント１７５の三重ループに対する改変を有するバリアント、特にＣ１５又はＣ１７に対する変異は、１７５足場と比較して高い濃縮を示す。追加的に、Ｇ７とＡ２９との間のシュードノットステムにおける予測される対のいずれかのメンバーに対する変化は、両方とも、１７５足場と比較して高度に濃縮され、Ａ２９をＣ又はＴに変換して、標準的なワトソン－クリック対合（Ｇ７：Ｃ２９）を形成し、２つ目は、ＧＵゆらぎ対（Ｇ７：Ｕ２９）を形成し、これらは両方とも、Ｇ：Ａ対と比較してヘリックスの安定性を増加させることが予想され得る。加えて、ガイド足場１７５における５４位のＣの挿入は、富化された改変をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、表２８の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡバリアントを提供し、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して機能的特徴の改善を示す。いくつかの実施形態では、改善された機能的特徴は、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である。前述の実施形態では、表２８の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７４に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡ（連結された標的化配列を有し、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成している）は、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、表２９の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７５（配列番号２２３９）に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡバリアントを提供し、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７５と比較して機能的特徴の改善を示す。いくつかの実施形態では、改善された機能的特徴は、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である。前述の実施形態では、表２９の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７５に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡ（連結された標的化配列を有し、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成している）は、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の１つ以上の改変は、ヌクレオチド位置Ｕ１１、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ６５、Ｃ６６、Ｃ６８、Ａ６９、Ｕ７６、Ｇ７７、Ａ７９、及びＡ８７からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の改変は、Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、Ｕ６５Ｃ、Ｃ６６Ｇ、Ｃ６８Ｕ、６９位のＡＣＧＧＡの挿入、７６位のＵＣＣＧＵの挿入、Ｇ７７Ａ、７９位のＧＡの挿入、Ａ８７Ｇである。別の特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７５の改変は、ヌクレオチド位置Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｇ５４、Ｃ６５、Ａ８９、及びＡ９６からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の改変は、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位のＧの挿入、６５位のＣの挿入、Ａ８９Ｇ、及びＡ９６Ｇである。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２１５（配列番号２２７５）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２１５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２１（配列番号２２８１）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２１と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２５（配列番号２２８５）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２３５（配列番号３９９８７）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２５１（配列番号４０００３）に対する１つ以上の改変を含み、得られるｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２５１と比較して機能的特徴の改善を示す。
前述の実施形態では、改善された機能的特徴は、安定性の増加、ｇＲＮＡの転写の増加、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加、ｇＲＮＡのフォールディング速度の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的フォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合のオフターゲット編集の減少、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の改変においてＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列のより広いスペクトルを利用する能力の増加のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、それが由来したｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、それが由来したｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、それが由来したｇＲＮＡと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、それが由来したｇＲＮＡと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、外因性伸長ステムループを含み、参照ｇＲＮＡとのかかる差異は、以下の通りである。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）とほとんど又は全く同一性を有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、又は少なくとも２０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＲＮＡの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ステムループを置換する外因性ステムループ領域は、ＲＮＡステムループ又はヘアピンを含み、得られるｇＲＮＡは、安定性が増加しており、ループの選択に応じて、特定の細胞タンパク質又はＲＮＡと相互作用することができる。かかる外因性伸長ステムループは、例えば、熱安定性ＲＮＡ、例えば、ＭＳ２ヘアピン（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号３５））、Ｑβヘアピン（ＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号３６））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵ（配列番号３７））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３８））、ＰＰ７ヘアピン（ＡＧＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵ（配列番号３９））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号４０））、キッシングループ＿ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４１））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４２））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号４３））、Ｇ三重鎖Ｍ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号４４））、Ｇ四重鎖テロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号４５））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号４６））、又はシュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号４７））を含み得る。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（ステムＩＩＢ、配列番号４１８４３）、ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（ステムＩＩ；配列番号４１８４４）、ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（ステムＩＩ－Ｖ配列番号４１８４５）、ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（ＲＢＥ；配列番号４１８４６）、及びＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（全長ＲＲＥ；配列番号４１８４７）を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、末端融合パートナーを含む。ｇＲＮＡバリアントという用語は、末端融合又は内部挿入などの外因性配列を含むバリアントを包含する。例示的な末端融合は、自己切断リボザイム又はタンパク質結合モチーフへのｇＲＮＡの融合を含み得る。本明細書で使用される場合、「リボザイム」とは、タンパク質酵素に類似する１つ以上の触媒活性を有するＲＮＡ又はそのセグメントを指す。例示的なリボザイム触媒活性としては、例えば、ＲＮＡの切断及び／若しくはライゲーション、ＤＮＡの切断及び／若しくはライゲーション、又はペプチド結合形成が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、かかる融合は、足場のフォールディングを改善するか、又はＤＮＡ修復機構を動員するかのいずれかであり得る。例えば、ｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、δ型肝炎ウイルス（hepatitis delta virus、ＨＤＶ）アンチゲノムリボザイム、ＨＤＶゲノムリボザイム、ハチェットリボザイム（メタゲノムデータ由来）、ｅｎｖ２５ピストルリボザイム（Ａｌｉｉｓｔｉｐｅｓパテリニスからの代表）、ＨＨ１５最小ハンマーヘッドリボザイム、タバコリングスポットウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイム、ＷＴウイルスハンマーヘッドリボザイム（及び合理的バリアント）、又はＴｗｉｓｔｅｄ Ｓｉｓｔｅｒ １若しくはＲＢＭＸ動員モチーフに融合され得る。ハンマーヘッド型リボザイムは、ＲＮＡ分子内の特定の部位で可逆的切断及びライゲーション反応を触媒するＲＮＡモチーフである。ハンマーヘッド型リボザイムには、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型ハンマーヘッド型リボザイムが含まれる。ＨＤＶ、ピストル型、及びハチェットリボザイムは、自己切断活性を有する。１つ以上のリボザイムを含むｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ参照と比較して拡張されたｇＲＮＡ機能を可能にし得る。例えば、自己切断リボザイムを含むｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、転写され、ポリシストロン性転写物の一部として成熟ｇＲＮＡへとプロセシングされ得る。かかる融合は、ｇＲＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかで起こり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、５’末端と３’末端の両方に融合を含み、各融合は、独立して、本明細書に記載される通りである。
ｇＲＮＡバリアントの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡの３’末端に位置し、標的核酸とハイブリダイズすることができるスペーサー（又は標的化配列）領域を更に含み、スペーサーが、少なくとも１４～約３５ヌクレオチドを含み、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、標的核酸に相補的な少なくとも１０～２０ヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、２０ヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４ヌクレオチドを有する。
ｈ．ＣａｓＸタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、表３の配列（配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２）のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質を含む、クラス２、Ｖ型タンパク質と複合体化されたＲＮＰを形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、発現時、表３の配列（配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２）のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、発現時、配列（配列番号８５～１６０、４０２０８～４０３６９、及び４０８２８～４０９１２）のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較した場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質との複合体を形成する改善された能力を有し、それによって、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質と切断能力のあるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体の形成を改善することは、いくつかの実施形態では、機能的なＲＮＰが構築される効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント及びその標的化配列を含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超が、標的核酸の遺伝子編集に適格である。
ＣａｓＸタンパク質と複合体を形成するｇＲＮＡバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することによって、ｇＲＮＡバリアントとＣａｓＸタンパク質との全体的な結合安定性を増加させることができる。代替的に、又は追加的に、ステムループの大部分を除去することによって、ｇＲＮＡバリアントのフォールディング動態が変化し、例えば、ｇＲＮＡバリアントがそれ自体で「もつれ」得る程度を減少させることによって、機能的にフォールディングされたｇＲＮＡがより容易にかつ迅速に構造的に構築され得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＲＮＡのために利用される異なるスペーサーによって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、スペーサー、したがって、標的配列に合わせて調整することができる。実施例のアッセイを含む生化学的アッセイを使用して、ＲＮＰを形成するためのｇＲＮＡバリアントに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者は、追加の非標識「コールド競合（cold competitor）」ｇＲＮＡの濃度の増加に対する応答として、固定化ＣａｓＸタンパク質に結合している蛍光タグ付きｇＲＮＡの量の変化を測定することができる。代替的に、又は追加的に、異なる量の蛍光標識されたｇＲＮＡが固定化ＣａｓＸタンパク質上を流れる際に、蛍光シグナルがどのように変化するのかを監視又は観察することができる。代替的に、ＲＮＰを形成する能力は、規定された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価され得る。
ＩＶ．ＡＡＶ系のＣＲＩＳＰＲタンパク質
本開示は、真核細胞のゲノム編集において有用性を有し、かつ構築物の自己不活性化特徴の不可欠な成分であるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするＡＡＶ系を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムにおいて使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼである。クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーには相違点があるが、それらは、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。まず、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼは、単一のＲＮＡ誘導ＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを有するが、ＨＮＨドメインを有さず、非標的鎖上の標的領域の５’上流のＴ－リッチＰＡＭを認識し、これは、標的配列の３’側でＧ－リッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列に対して遠位にずれた二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、シスで結合する標的ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡによって活性化された場合、トランスでｓｓＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、本実施形態のＶ型ヌクレアーゼは、５’－ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによってのみ切断される付着末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｖ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、ＣａｓＰｈｉ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、ＣａｓＺ及びＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びトランスフェクトされた細胞における発現時に、ＲＮＰ複合体を形成することができ、真核細胞において標的核酸配列を改変するように、かつＡＡＶ構築物の導入遺伝子を含むポリヌクレオチドに組み込まれた自己不活性化セグメントを切断するように特異的に設計された１つ以上のｇＲＮＡ酸をコードするＡＡＶ系を提供する。
本明細書で使用される「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、全ての天然に存在するＣａｓＸタンパク質、天然に存在するＣａｓＸタンパク質と少なくとも５０％の同一性を共有するタンパク質、並びに天然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントを包含する（以下でより詳細に記載される）。
本開示のＣａｓＸタンパク質は、以下のドメインのうちの少なくとも１つを含む：非標的鎖結合（non-target strand binding、ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（target strand loading、ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン（ヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩサブドメインに更に分割される）、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ、ＯＢＤ－Ｉ及びＯＢＤ－ＩＩサブドメインに更に分割される）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ及びＩＩサブドメインに更に分割される）。ＲｕｖＣドメインは、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントにおいて改変又は欠失され得る（以下でより詳細に記載される）。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸配列内の配列にハイブリダイズする関連するｇＲＮＡによって標的化される特定の配列において標的核酸に結合する及び／又はそれを改変する（例えば、ニックを入れる、二本鎖切断を触媒する、メチル化する、脱メチル化するなど）ことができる。
ａ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書において「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）を提供し、これはその後、本開示のＣａｓＸバリアントを作製するために改変された。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離することができる。参照ＣａｓＸタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するタンパク質のＣａｓＸ（互換的に、Ｃａｓ１２ｅと称される）ファミリーに属するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と同一の配列を含む：
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と同一の配列を含む：
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパクは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と同一の配列を含む：
ｂ．クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアントタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のクラス２、Ｖ型、ＣａｓＸバリアント又は他のＣａｓＸバリアントに由来するバリアント（本明細書では互換的に「クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアント」、「ＣａｓＸバリアント」又は「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）を提供し、クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの改変（配列番号１～３の配列を含むが、これらに限定されない）、又は別のＣａｓＸバリアントと比較して少なくとも１つの改変を含む。ＣａｓＸタンパク質の特性の改善をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質又は別のＣａｓＸバリアントタンパク質のアミノ酸配列の変化は、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、若しくはスワップされたドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示のＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はそれが由来したバリアント、例えば、ＣａｓＸ４９１（配列番号１３８）又はＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）と比較して、１つ以上の改善された特徴を有する。ＣａｓＸバリアントの実施形態の例示的な改善された特徴としては、バリアントのフォールディングの改善、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集及び／又は結合においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集又は切断の減少、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、及び融合特性の改善が挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はＣａｓＸ４９１（配列番号１３８）若しくはＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の実施形態では、改善は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はＣａｓＸ４９１（配列番号１３８）若しくはＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡ１７４を有するＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５のＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特徴のうちの１つ以上は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡ１７４を有するＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５のＲＮＰと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡ、又はｇＲＮＡ１７４を有するＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５のＲＮＰと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸における変異である。他の実施形態では、改変は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部又は全部の挿入又は置換である。特定の実施形態では、配列番号１４４～１６０、４０２０８～４０３６９、４０８２８～４０９１２のＣａｓＸバリアントは、配列番号１のＮＴＳＢ及びヘリックス１Ｂドメインを有するが、他のドメインは、本明細書に記載される選択ドメインにおける個々の改変に加えて、配列番号２に由来する。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来したＣａｓＸバリアントの任意の１つ以上のドメインにおいて導入され、ＣａｓＸバリアントをもたらすことができ、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質の任意のドメインにおける１つ以上のドメインの一部若しくは全部の欠失、又は１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、若しくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインは、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む。理論又は機構に束縛されるものではないが、ＣａｓＸ中のＮＴＳＢドメインは、非標的核酸鎖への結合を可能にし、非標的鎖及び標的鎖の巻き戻しを助けることができる。ＮＴＳＢドメインは、ほどけた状態の非標的核酸鎖の巻き戻し、又は捕捉に関与すると推定される。例示的なＮＴＳＢドメインは、配列番号１のアミノ酸１００～１９０又は配列番号２のアミノ酸１０２～１９１を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のＮＴＳＢドメインは、４本鎖βシートを含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＬは、標的鎖ＤＮＡ骨格の切断可能なリン酸をＲｕｖＣ活性部位に配置する折り畳み状態で標的鎖を配置又は捕捉するように作用する。例示的なＴＳＬは、配列番号１のアミノ酸８２４～９３３又は配列番号２のアミノ酸８１１～９２０を含む。理論に束縛されるものではないが、場合によっては、ヘリックスＩドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif、ＰＡＭ）の結合に寄与し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のヘリックスＩドメインは、１つ以上のアルファヘリックスを含む。例示的なヘリックスＩ－Ｉドメイン及びＩ－ＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸５６～９９及び１９１～３３１、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸５８～１０１及び１９２～３３２を含む。ヘリックスＩＩドメインは、ガイドＲＮＡ足場ステムループ並びに結合ＤＮＡへの結合に関与する。例示的なヘリックスＩＩドメインは、配列番号１のアミノ酸３３２～５０８、又は配列番号２のアミノ酸３３３～５００を含む。ＯＢＤは、ガイドＲＮＡ足場のＲＮＡ三重鎖に大きく結合する。ＯＢＤはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への結合に関与し得る。例示的なＯＢＤ Ｉ及びＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸１～５５及び５０９～６５９、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸１～５７及び５０１～６４６を含む。ＲｕｖＣは、ＤＮＡの両方の鎖を切断することに関与するＤＥＤモチーフ活性部位を有する（１つずつ、非標的鎖が最初に１１～１４ヌクレオチド（nucleotide、ｎｔ）で標的配列に切断され、次に標的鎖が標的配列の２～４ヌクレオチド後に切断される可能性が最も高く、その結果、ずれた切断が生じる）。特にＣａｓＸにおいて、ＲｕｖＣドメインは、ＣａｓＸ機能に重要なガイドＲＮＡ足場ステムループの結合にも関与するという点で独特である。例示的なＲｕｖＣ Ｉ及びＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸６６０～８２３及び９３４～９８６、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸６４７～８１０及び９２１～９７８を含むが、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２に対してＩ６５８及びＡ７０８位における変異、又は以下に記載されるＣａｓＸ ５１５の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて、少なくとも２つのドメインの各々において、少なくとも３つのドメインの各々において、少なくとも４つのドメインの各々において、又は少なくとも５つのドメインの各々において、少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて２つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも２つの改変、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも３つの改変、又は参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも４つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して２つ以上の改変を含み、各改変は、独立して、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択されるドメインにおいて行われる。ＣａｓＸバリアントが参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２つ以上の改変を含むいくつかの実施形態では、改変は、２つ以上のドメインにおいて行われる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの改変は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質の１つのドメインの少なくとも一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＮＴＳＢドメイン、ＴＳＬドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、又はＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにある。
場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントは、１つ以上のドメインを包含し得る構造領域における改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアントとのｇＲＮＡ：標的核酸複合体が生じるチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの非連続アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ｇＲＮＡと結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの非連続アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの非連続アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的核酸のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの非連続アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアントの非連続表面露出アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアントのドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する非連続アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。本段落の前述の実施形態では、領域の改変は、領域の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換のうちの１つ以上を含むことができるか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸で置換されているか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基は、極性アミノ酸で置換されているか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基は、ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基と積み重なるか若しくは親和性を有するアミノ酸で置換されている。
他の実施形態では、本開示は、別のＣａｓＸバリアントと比較して少なくとも１つの改変を含むＣａｓＸバリアントを提供する。例えば、ＣａｓＸバリアント５１５及び５２７は、ＣａｓＸバリアント４９１のバリアントであり、ＣａｓＸバリアント６６８及び６７２は、ＣａｓＸ ５３５のバリアントである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、アミノ酸挿入、欠失、又は置換からなる群から選択される。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来したバリアントと比較した場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能又は特徴を改善する全てのバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。実施例に記載されるように、ＣａｓＸバリアントは、別のＣａｓＸバリアントを作製するために変異誘発され得る。特定の実施形態では、本開示は、実施例２１、表３０において、１つ以上のドメイン内の１つ以上の位置におけるアミノ酸置換、欠失、又は挿入をもたらす改変をコード配列に導入することによって作製されたＣａｓＸ ５１５（配列番号１４５）のバリアントを提供する。
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／３６５０６及び国際公開第２０２０／２４７８８３（Ａ２）号に記載されており、参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、例えば、実施例に記載のアッセイを用いて同定されたＣａｓＸバリアントにおける複数の所望の変異を選択することによって設計される。特定の実施形態では、変異誘発前の参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントタンパク質の活性は、それに対して１つ以上の得られたＣａｓＸバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それによって、新規のＣａｓＸバリアントの機能の改善が測定される。
本明細書に記載のＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３の参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント４９１（配列番号１３８）、若しくはＣａｓＸバリアント５１５（配列番号１４５）と比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来したバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来したバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３の参照ＣａｓＸ、又はそれが由来したバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来したバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来したバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＣａｓＸ ４９１、又はＣａｓＸ ５１５の配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個の改変を有する配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ ４９１、又は配列番号１３８と比較して１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ ５１５、又は配列番号１４５と比較して１つ以上の置換を含む。これらの改変は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。改変は、ＣａｓＸバリアントの１つのドメイン、又はいずれかのドメイン、又はドメインのいずれかの組み合わせにあり得る。本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸は、任意の他のアミノ酸と置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される）。置換は、非保存的置換であってもよい（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、又はその逆も同様である）。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質におけるプロリンを、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのうちのいずれかに置換して、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
本明細書に記載の実施形態の置換、挿入、及び欠失の任意の順列を組み合わせて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ ４９１若しくはＣａｓＸ ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ ４９１若しくはＣａｓＸ ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ ４９１若しくはＣａｓＸ ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ ４９１若しくはＣａｓＸ ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、４００～２０００アミノ酸、５００～１５００アミノ酸、７００～１２００アミノ酸、８００～１１００アミノ酸、又は９００～１０００アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列からなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号８５～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号８５～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２の配列を含むか、又はそれからなる。
ｃ．複数の供給源のタンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質（例えば、２つ以上の参照ＣａｓＸタンパク質又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列）由来のタンパク質ドメインを含むＡＡＶ系において使用するためのキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、異なる供給源（例えば、２つの天然に存在するタンパク質）から単離又は誘導された少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、これは、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤドメイン、及び配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。更なる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ及びＲｕｖＣドメイン、並びに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。したがって、特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ及びＲｕｖＣドメイン、並びに第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列に由来し、第１及び第２のＣａｓＸタンパク質は、同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分及び第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分を含む少なくとも１つのキメラドメインを含む。本明細書で使用される場合、「キメラドメイン」は、２つの天然に存在するタンパク質又は２つの参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメインの部分などの、異なる供給源から単離された又はそれに由来する少なくとも２つの部分を含有する単一ドメインを指す。少なくとも１つのキメラドメインは、本明細書に記載されるＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ又はＲｕｖＣドメインのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号２の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラドメインは、キメラＲｕｖＣドメインを含む。前述の例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４及び配列番号２のアミノ酸９２２～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４８～８１２及び配列番号１のアミノ酸９３５～９８６を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメイン及び第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメイン、並びにこの段落に記載される実施形態のアプローチを使用して異なるＣａｓＸタンパク質から単離された少なくとも２つの部分を含む少なくとも１つのキメラドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列からなる群から選択される配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。
ｄ．ｇＲＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対する改善された親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成についてより低いＫｄをもたらし得、これは、場合によっては、より安定なリボ核タンパク質複合体の形成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、ヒト細胞に送達された場合、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性、例えば、インビボ又はインビトロでの遺伝子編集を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のＥＧＦＰ破壊アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対して約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、対象へのインビボ送達を含む、哺乳動物細胞に送達された場合、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性（例えば、インビボ又はインビトロ遺伝子編集）を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。ＲＮＰを形成し、それらを安定な形態に保つ能力の増加は、アッセイ（例えば、本明細書の実施例に記載のインビトロ切断アッセイ）を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰは、ＲＮＰとして複合体化した場合、配列番号１～３の参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍高いｋ切断速度を達成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のアッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ヘリックスＩドメインにおけるアミノ酸変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ標的化配列との結合親和性を増加させることができ、ヘリックスＩＩドメインにおける変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ足場ステムループとの結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ三重鎖との結合親和性を増加させる。
ｇＲＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を測定する方法は、精製されたＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡを使用するインビトロの方法を含む。参照ＣａｓＸ及びバリアントタンパク質に対する結合親和性は、ｇＲＮＡ又はＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアでタグ付けされている場合、蛍光偏光によって測定することができる。代替的に、又は追加的に、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay、ＥＭＳＡ）、又は膜結合によって測定することができる。参照ｇＲＮＡ及びそのバリアントなどの特定のｇＲＮＡに対する、参照ＣａｓＸ及び本開示のバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量化するための更なる標準的な技術としては、等温熱量測定（isothermal calorimetry、ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）、並びに実施例の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ｅ．標的核酸に対する親和性
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸配列に対する参照ＣａｓＸタンパク質の親和性と比較して、標的核酸配列に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対して増加した親和性を有しない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対する親和性の改善は、標的核酸配列に対する親和性の改善、より広範囲のＰＡＭ配列に対する結合親和性の改善、標的核酸配列についてＤＮＡを検索する能力の改善、又はそれらの任意の組み合わせを含む。理論に束縛されるものではないが、ＣａｓＸなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＤＮＡ分子に沿った一次元拡散によってそれらの標的核酸配列を見出すことができると考えられる。このプロセスは、（１）リボ核タンパク質のＤＮＡ分子への結合、続く（２）標的核酸配列での停止、を含むと考えられ、これらのいずれかは、いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対するＣａｓＸタンパク質の改善された親和性によって影響され得、それによって、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する改善された結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、ｇＲＮＡにおける標的化配列とワトソン及びクリック塩基対を形成せず、標的鎖に相補的であるＤＮＡ標的核酸配列の鎖を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照タンパク質、又はＣａｓＸバリアント１１９（配列番号７２）及びＣａｓＸ４９１（配列番号１３８）と比較して、標的核酸の非標的鎖に対して約１．１～約１００倍増加した結合親和性を有する。
標的核酸分子に対するＣａｓＸタンパク質（参照又はバリアントなど）の親和性を測定する方法は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、膜結合、等温熱量測定（ＩＴＣ）、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光偏光、及びバイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry、ＢＬＩ）を含み得る。標的に対するＣａｓＸタンパク質の親和性を測定する更なる方法としては、経時的にＤＮＡ切断事象を測定するインビトロ生化学的アッセイが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパクは、触媒的に失活している（ｄＣａｓＸ）。いくつかの実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する触媒的に失活したＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰを提供する。例示的な触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の残基６７２、７６９及び／又は９３５に置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ及び／又はＤ９３５Ａの置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のアミノ酸６５９、７６５及び／又は９２２に置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ及び／又はＤ９２２Ａ置換を含む。更なる実施形態では、触媒的に失活した参照ＣａｓＸタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全部又は一部の欠失を含む。例示的なｄＣａｓＸ配列は、表７において配列番号４０８０８～４０８２７、４１００６～４１００９として提供される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＤＮＡに対する改善された親和性はまた、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒的に失活したバージョンの機能を改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒的に失活したバージョンは、ＲｕｖＣ中のＤＥＤモチーフ中に１つ又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したバリアントタンパク質は、塩基編集又はエピジェネティック改変のために使用され得る。ＤＮＡに対するより高い親和性により、いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的ＤＮＡをより速く見つけることができ、より長い期間にわたって標的ＤＮＡに結合したままであり得、より安定した様式で標的ＤＮＡに結合することができ、又はそれらの組み合わせであり得、それによって触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善する。
ｆ．標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、「特異性」（互換的に「標的特異性」と称される）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列に類似するが同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指す。例えば、より高い程度の特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の特異性、及び潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用のための許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
理論に束縛されることを望むものではないが、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリックスＩ及びＩＩドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸配列全体に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の減少をもたらし得る。
ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）の標的特異性を試験する方法は、ガイド及び配列決定による切断効果のインビトロ報告のための環状化（Circularization for In vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing）（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）、又は同様の方法を含み得る。簡潔に、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ技術では、ゲノムＤＮＡを剪断し、ステム・ループアダプターのライゲーションによって環状化し、ステム・ループ領域にニックを入れて、４ヌクレオチドのパリンドロームオーバーハングを露出させる。これに続いて、残りの直鎖ＤＮＡの分子内ライゲーション及び分解が行われる。続いて、ＣａｓＸ切断部位を含む環状ＤＮＡ分子をＣａｓＸで線状化し、アダプターアダプター（adapter adapters）を、露出した末端にライゲーションした後、ハイスループット配列決定を行って、オフターゲット部位についての情報を含むペアエンドリードを生成する。オフターゲット事象（したがって、ＣａｓＸタンパク質の特異性）を検出するために使用することができる更なるアッセイとしては、それらの選択されたオフターゲット部位で形成されたインデル（挿入及び欠失）を検出及び定量化するために使用されるアッセイ（例えば、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイ及び次世代シーケンシング（next generation sequencing、ＮＧＳ））が挙げられる。例示的なミスマッチ検出アッセイとしては、ヌクレアーゼアッセイが挙げられ、これは、ＣａｓＸ及びｓｇＲＮＡで処理した細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、１つの野生型鎖と１つのインデルを有する鎖とを含むヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成する。ミスマッチは、ミスマッチ検出ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩ）によって認識及び切断される。
ｇ．プロトスペーサー及びＰＡＭ配列
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補的なＤＮＡ配列及びその配列に相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ標的鎖及び非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、ｇＲＮＡの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのＣａｓＸの配向及び位置決めを助ける、プロトスペーサーに近位のヌクレオチド配列である。
ＰＡＭ配列は縮重していてもよく、特定のＲＮＰ構築物は、異なる切断効率を支持する異なる好ましい許容されるＰＡＭ配列を有していてもよい。慣例に従って、別段の記載がない限り、本開示は、ＰＡＭ及びプロトスペーサー配列の両方、並びに非標的鎖の配向に従ったそれらの方向性について言及する。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が切断の決定因子であるか、又は標的認識に機構的に関与することを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭに言及する場合、実際には、標的切断に必要な相補的なＧＡＡ配列であってもよく、又は両方の鎖からのヌクレオチドの何らかの組み合わせであってもよい。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’側に位置し、単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離する。したがって、正規のＰＡＭがＴＴＣである参照ＣａｓＸの場合、ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（式中、「Ｎ」は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、「（プロトスペーサー）」は、ガイドＲＮＡの標的化配列と同一性を有するＤＮＡ配列である）に従う配列を意味すると理解されるべきである。拡張されたＰＡＭ認識を有するＣａｓＸバリアントの場合、ＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭは、以下の式に従う配列を意味すると理解されるべきである：
５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、
５’－．．．ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、
５’－．．．ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、又は
５’－．．．ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’。代替的に、ＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’に従う配列を意味すると理解されるべきである。
追加的に、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣから選択されるＰＡＭ配列を含むＰＡＭ ＴＣモチーフを利用して（５’から３’の配向で）、ＲＮＰとしてｇＲＮＡと複合体化された場合、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡのＲＮＰ、又はそれが由来した別のＣａｓＸバリアント、例えばＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰと比較して、標的核酸を効率的に編集及び／又は結合する能力が増強されている。前述において、ＰＡＭ配列は、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、アッセイシステムにおけるｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して少なくとも１ヌクレオチド５’側に位置する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又はＣａｓＸ４９１などのそれが由来した別のＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰ）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＴＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又はＣａｓＸ４９１などのそれが由来した別のＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰ）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＡＴＣである。ＣａｓＸバリアントがＡＴＣ ＰＡＭによる編集の増強を示す上記の特定の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは５２８（配列番号１５７）である。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又はＣａｓＸ４９１などのそれが由来した別のＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰ）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＣＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又はそれが由来した別のＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰ）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＧＴＣである。前述の実施形態では、１つ以上のＰＡＭ配列に対する増大した編集効率及び／又は結合親和性は、ＰＡＭ配列についての配列番号１～３のうちのいずれか１つのＣａｓＸタンパク質及び表１の配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰの編集効率及び／又は結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも１０倍以上、少なくとも２０倍以上、少なくとも３０倍以上、少なくとも４０倍以上大きい。改善された編集を実証する例示的なアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸及び／又は標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、ヒストンテールのメチル化又はアセチル化）に結合する及び／又はそれを改変（例えば、切断、ニック形成、メチル化、脱メチル化など）することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、触媒的に失活した（ｄＣａｓＸ）であるが、標的核酸への結合能を保持する。
ｈ．標的ＲＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶシステムにおける使用のための参照ＣａｓＸタンパク質のバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した場合に、標的ＲＮＡに対する増加した特異性、及び標的ＲＮＡに関する増加した活性を有する。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した場合、標的ＲＮＡに対する結合親和性の増加、又は標的ＲＮＡの切断の増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、かつ／又は標的ＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質と比較して、標的ＲＮＡに対して少なくとも約２～約１０倍増加した結合親和性を有する。
ｉ．複数の供給源のタンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質（例えば、２つ以上の天然に存在するＣａｓＸタンパク質又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列）由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸバリアントタンパク質をコードするＡＡＶを提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、異なる供給源（例えば、２つの天然に存在するタンパク質）から単離又は誘導された少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、これは、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤドメイン、及び配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。更なる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ及びＲｕｖＣドメイン、並びに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。したがって、特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ及びＲｕｖＣドメイン、並びに第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列に由来し、第１のＣａｓＸタンパク質と第２のＣａｓＸタンパク質とは同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。前述の例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６０～８２３及び配列番号２のアミノ酸９２１～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４７～８１０及び配列番号１のアミノ酸９３４～９８６を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラドメインは、キメラヘリックスＩドメインを含み、キメラヘリックスＩドメインは、配列番号１のアミノ酸５６～９９及び配列番号２のアミノ酸１９２～３３２を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸバリアントは更に改変され、配列番号４０９５９、配列番号４０９６０、配列番号４０９６８、配列番号４０９７７、配列番号４０９６９、配列番号４０９７０、配列番号４０９７１、配列番号４０９７２、配列番号４０９７３、配列番号４０９６１、配列番号４０９７８、配列番号４０９６２、配列番号４０９７９、配列番号４０９６３、配列番号４０９８０、配列番号４０９６４、配列番号４０９８１、配列番号４０９６５、配列番号４０９８２、配列番号４０９６６、配列番号４０９８３、配列番号４０９６７、配列番号４０９７４、配列番号４０９７５、配列番号４０９７６、配列番号４０９８４、及び配列番号４０９８５の配列からなる群から選択されるＣａｓＸバリアントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の改変は、本明細書に記載の挿入、置換又は欠失を含む。
ヘリックスＩ、ＲｕｖＣ、及びＯＢＤなどの分割又は非連続ドメインの場合、非連続ドメインの一部を任意の他の供給源由来の対応する部分で置換することができる。例えば、配列番号２におけるヘリックスＩ－Ｉドメイン（ヘリックスＩ－ａと称されることもある）は、配列番号１由来の対応するヘリックスＩ－Ｉ配列などで置換され得る。表４に、参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメイン配列及びそれらの座標を示す。キメラＣａｓＸタンパク質の代表的な例としては、ＣａｓＸ ４７２－４８３、４８５－４９１及び５１５のバリアントが挙げられ、表３に、その配列を示す。
＊ＯＢＤ Ｉ及びＩＩ、ヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩ、並びにＲｕｖＣ Ｉ及びＩＩは、本明細書において、ＯＢＤ ａ及びｂ、ヘリックスＩａ及びｂ、並びにＲｕｖＣ ａ及びｂとも称される。
例示的なドメイン配列を以下の表５に提供する。
更なる例示的なヘリックスＩＩドメイン配列は、配列番号４１００４として提供され、更なる例示的なＲｕｖＣ ａドメイン配列は、配列番号４１００５として提供される。
他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０２８６、又は４０８２８～４０９１２の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくは両方のいずれかに、又はその近傍に、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号７２～１６０、４０２０８～４０２８６、又は４０８２８～４０９１２の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくは両方のいずれかに、又はその近傍に、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１４４～１６０、４０２０８～４０２８６、又は４０８２８～４０９１２の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくは両方のいずれかに、又はその近傍に、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。場合によっては、表のＣａｓＸバリアントのＮ末端メチオニンは、翻訳後改変の間に発現されたＣａｓＸバリアントから除去されることが理解されるであろう。当業者は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端付近のＮＬＳが、Ｎ末端又はＣ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０又は２０アミノ酸以内であり得ることを理解する。
ｊ．他のＣａｓＸバリアントに由来するＣａｓＸバリアント
バリアントタンパク質の生成の更なる反復において、バリアントタンパク質を利用して、本開示の更なるＣａｓＸバリアントを生成することができる。例えば、ＣａｓＸ１１９（配列番号７２）、ＣａｓＸ４９１（配列番号１３８）、及びＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）は、それらが由来した参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントと比較して改善又は追加の特性を有する本開示の追加のＣａｓＸバリアントを生成するように改変される例示的なバリアントタンパク質である。ＣａｓＸ １１９は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、及び７９３位のＰの欠失を含有する。ＣａｓＸ ４９１は、配列番号１由来のＮＴＳＢ及びヘリックス１Ｂスワップを含有する。ＣａｓＸ ５１５は、７９３位（配列番号２に対して）のＰの挿入によってＣａｓＸ４９１に由来し、実施例２１に記載されるＣａｓＸバリアントを作製するために使用された。例えば、ＣａｓＸ ６６８は、ＣａｓＸ５１５に対して、２６位にＲの挿入及びＧ２２３Ｓの置換を有する。ＣａｓＸ６７２は、ＣａｓＸ５１５に対してＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換を有する。ＣａｓＸ６７６は、ＣａｓＸ５１５に対して２６位にＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換並びにＲの挿入を有する。
他のＣａｓＸバリアントに由来するＣａｓＸバリアントを生成及び評価するために使用される例示的な方法は、実施例に記載されており、これは、ＣａｓＸバリアントの１つ以上のドメインにおける１つ以上の位置でのアミノ酸置換、欠失、又は挿入をもたらす改変をコード配列に導入することによって作製された。特に、実施例２１は、ＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）のバリアントを作製するために使用される方法を記載しており、これを次いでアッセイして、アミノ酸の挿入、欠失又は置換によって改変された場合にアッセイにおいて濃縮又は改善をもたらす配列中の位置を決定した。本開示の目的のために、ＣａｓＸ５１５のドメインの配列を表６に提供し、配列番号４０９９５の配列を有するＯＢＤ－Ｉドメイン、配列番号４１０００の配列を有するＯＢＤ－ＩＩドメイン、配列番号４０９８８の配列を有するＮＴＳＢドメイン、配列番号４０９９６の配列を有するヘリックスＩ－Ｉドメイン、配列番号４０９８９の配列を有するヘリックスＩ－ＩＩドメイン、配列番号４１００４の配列を有するヘリックスＩＩドメイン、配列番号４１００５の配列を有するＲｕｖＣ－Ｉドメイン、配列番号４１００３の配列を有するＲｕｖＣ－ＩＩドメイン、及び配列番号４１００２の配列を有するＴＳＬドメインを含む。本開示の方法によって、ＣａｓＸ５１５のドメイン中の個々の位置を改変し、アッセイし、得られる位置及びその後の濃縮又は改善をもたらす例示的な改変を、各ドメイン又はサブドメイン中のそれらの位置に対して提供する。場合によっては、かかる位置は、実施例の表３０～表３３に開示されている。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択されるＮＴＳＢドメイン配列（配列番号４０９８８）に対するＮＴＳＢドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変（すなわち、挿入、欠失、又は置換）を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ＮＴＳＢドメイン配列（配列番号４０９８８）に対するＮＴＳＢドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ｇ２、＾Ｉ４、＾Ｌ４、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、［Ｓ３０］、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される（ここで、「＾」は挿入を表し、「［］」はその位置における欠失を表す）。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９ Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択されるヘリックスＩ－ＩＩドメイン配列（配列番号４０９８９）に対するヘリックスＩ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ヘリックスＩ－ＩＩドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ｔ２４、＾Ｃ２５、Ｙ２９Ｆ、Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、［Ｇ３２］、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、＾Ｑ１３８、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択されるヘリックスＩＩドメイン配列（配列番号４１００４）に対するヘリックスＩＩドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特性をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ヘリックスＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ａ２、＾Ｈ２、［Ｌ２］＋［Ｖ３］、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、［Ｖ３］、＾Ｄ３、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、［Ｅ４］、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、＾Ｑ６、＾Ｇ７、＾Ｈ９、＾Ａ９、ＶＤ１０、＾Ｔ１０、［Ｖ１０］、＾Ｆ１０、＾Ｄ１１［Ｄ１１］Ｄ１１Ｓ［Ｗ１２］Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、＾Ｐ１２、＾Ｑ１３、＾Ｇ１２、＾Ｒ１３、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、＾Ｄ１３、Ｗ１３Ｌ、＾Ｐ１４、＾Ｄ１４、［Ｄ１４］＋［Ｍ１５］、［Ｍ１５］、＾Ｔ１６、＾Ｐ１７、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、＾Ｇ２５、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、＾Ｓ３７、［Ｌ３７］＋［Ａ３８］、Ｋ４１Ｌ、＾Ｒ４２、［Ｑ４３］＋［Ｅ４４］、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、＾Ｅ７９、＾Ｔ８１、＾Ｒ８１、＾Ｗ８１、＾Ｙ８１、＾Ｗ８２、＾Ｙ８２、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、＾Ｌ８５、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、＾Ｋ１０９、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、［Ｒ１１０］、Ｄ１１４Ｅ、＾Ｄ１１４、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、＾Ｃ１３３、＾Ｓ１３４、＾Ｇ１３４、＾Ｒ１３５、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、［Ｅ１３８］、Ｄ１４０Ｒ、＾Ｄ１４０、＾Ｐ１４１、＾Ｄ１４２、［Ｅ１４３］＋［Ｆ１４４］、＾Ｑ１４３、Ｆ１４４Ｋ、［Ｆ１４４］、［Ｆ１４４］＋［Ｃ１４５］、Ｃ１４５Ｒ、＾Ｇ１４５、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、＾Ｖ１４８、Ｅ１４８Ｄ、＾Ｈ１４９、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、及び＾Ｆ１６７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択されるＲｕｖＣ－Ｉドメイン配列（配列番号４１００５）に対するＲｕｖＣ－Ｉドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ－Ｉドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ｉ４、＾Ｓ５、＾Ｔ６、＾Ｎ６、＾Ｒ７、＾Ｋ７、＾Ｈ８、＾Ｓ８、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、＾Ｐ１３７、［Ｌ１４１］、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、＾Ｑ１４２、＾Ｒ１４３、＾Ｎ１４３、Ｅ１４４Ｎ、＾Ｐ１４６、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、＾Ｒ１５２、＾Ｈ１５３、Ｔ１５５Ｑ、＾Ｈ１５５、＾Ｒ１５５、＾Ｌ１５６、［Ｌ１５６］、＾Ｗ１５６、＾Ａ１５７、＾Ｆ１５７、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、［Ｙ１５９］、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、＾Ｉ１６１、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、＾Ｎ１６３、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択されるＯＢＤ－Ｉドメイン配列（配列番号４０９９５）に対するＯＢＤ－Ｉドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ｇ３、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、＾Ｇ４、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、＾Ｐ５、＾Ｇ５、Ｒ５Ｓ、＾Ｓ５、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、＾Ｇ６、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、＾Ｆ１６、＾Ｆ１８、＾Ｐ２７、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、＾Ｐ４８、Ｅ５２Ｐ、＾Ｐ５５、［Ｐ５５］＋［Ｑ５６］、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、＾Ｄ５６、＾Ｔ５６、及びＱ５６Ｐからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択されるＯＢＤ－ＩＩドメイン配列（配列番号４１０００）に対するＯＢＤ－ＩＩドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、［Ｓ２］Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、［Ｉ３］＋［Ｌ４］、［Ｌ４］、Ｋ１１Ｔ、＾Ｐ２４、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、＾Ｓ５３、＾Ｒ５８、［Ｋ６３］、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、＾Ａ９３、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、＾Ａ１２４、＾Ｒ１４１、＾Ｄ１４３、＾Ａ１４３、＾Ｗ１４４、及び＾Ａ１４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択されるＴＳＬドメイン配列（配列番号４１００２）に対するＴＳＬドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の改変を含むＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントであって、改変がＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴をもたらす、ＣａｓＸバリアントを提供する。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメイン中の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ｍ１、［Ｎ２］＾Ｖ２、Ｃ３Ｓ、＾Ｇ４、＾Ｗ４、Ｆ５Ｐ、＾Ｗ７、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、＾Ａ６７、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、［Ｓ８０］、［Ｇ８１］、＾Ｅ８２、＾Ｎ８２、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される。段落の同じ前述の改変のいずれかの組み合わせを、本開示のＣａｓＸバリアントに同様に導入することができ、改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントをもたらすことが理解されるであろう。例えば、一実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に対してＧ２２３Ｓの単一変異を
有するＣａｓＸバリアント５３５（配列番号４０２１１）を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に対して２６位にＲの挿入及びＧ２２３Ｓの置換を有するＣａｓＸバリアント６６８（配列番号４０３４４）を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に対してＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換を有するＣａｓＸ６７２（配列番号４０３４７）を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に対して２６位にＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換並びにＲの挿入を有するＣａｓＸ６７６（配列番号４０３５１）を提供する。ＣａｓＸ５１５に対して改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントは、表３のバリアントを含む。
ＣａｓＸバリアントタンパク質において、参照ＣａｓＸタンパク質における同じ特徴と比較して、又はそれらが由来したＣａｓＸバリアントと比較して改善され得る例示的な特徴としては、バリアントのフォールディングの改善、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集及び／又は結合においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集又は切断の減少、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、及び融合特性の改善が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、実施例に記載されるように、かかる改善された特徴としては、ＴＴＣ、ＡＴＣ、及びＣＴＣ ＰＡＭ配列を有する標的核酸における切断活性の改善、標的核酸配列の切断に対する特異性の増加、並びに標的核酸のオフターゲット切断の減少が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸバリアントは、本明細書に開示されるｇＲＮＡとＲＮＰ複合体を形成する能力を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＰは、２０ｐＭ以下の濃度で、少なくとも８０％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、２０ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、又は５ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。これらの改善された特性は、以下により詳細に記載される。
ｋ．触媒的に失活したＣａｓＸバリアント
いくつかの実施形態、例えば、標的核酸配列の切断が所望の結果ではない適用を包含する実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を変化、低下、又は消失させることを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、標的核酸に相補的な標的化配列を有するｇＲＮＡと複合体化された場合に標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。例示的な触媒的に失活したＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１と比較して、残基６７２、７６９及び／又は９３５に置換を含む。一実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、Ｄ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ及び／又はＤ９３５Ａの置換を含む。他の実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、アミノ酸６５９、７５６及び／又は９２２に置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、Ｄ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ及び／又はＤ９２２Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸバリアント５２７、６６８及び６７６タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を消失させるためにＤ６６０Ａ、Ｅ７５７Ａ及びＤ９２２Ａ改変を含む。更なる実施形態では、触媒的に失活したＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全部又は一部の欠失を含む。同じ前述の置換を本開示のＣａｓＸバリアントに同様に導入することができ、触媒的に失活したＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）バリアントをもたらすことが理解されるであろう。一実施形態では、ＲｕｖＣドメインの全部又は一部は、ＣａｓＸバリアントから欠失され、ｄＣａｓＸバリアントをもたらす。いくつかの実施形態では、触媒的に失活したｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、塩基編集又はエピジェネティック改変のために使用され得る。ＤＮＡに対するより高い親和性により、いくつかの実施形態では、触媒的に失活したｄＣａｓＸバリアントタンパクは、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができ、より長い期間標的核酸に結合したままであり得、より安定した様式で標的核酸に結合することができ、又はそれらの組み合わせであり得、それによって、その切断能力を保持するＣａｓＸバリアントと比較して、触媒的に失活したＣａｓＸバリアントタンパク質のこれらの機能を改善する。例示的なｄＣａｓＸバリアント配列は、表７に示される配列番号４０８０８～４０８２７及び４１００６～４１００９として開示される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、配列番号４０８０８～４０８２７、４１００６～４１００９の配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一であり、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質の機能特性を保持する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、配列番号４０８０８～４０８２７又は４１００６～４１００９の配列を含む。
ｌ．ＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸに融合した異種タンパク質を含むＣａｓＸタンパク質をコードするＡＡＶを提供する。場合によっては、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、目的の活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された表３に示される配列のいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ融合タンパク質は、目的の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２のうちのいずれか１つを含み、融合タンパク質をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸を改変する、又は核酸に会合するポリペプチドを改変する（例えば、ヒストン改変）タンパク質（又はそのドメイン）に融合される。
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（又はシステイン残基若しくは非天然アミノ酸などの異種アミノ酸）をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入して、ＣａｓＸ融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入し、続いて、以下に記載する異種ポリペプチドをコンジュゲートすることができる。いくつかの代替的な実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加され得る。他の実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、ＣａｓＸタンパク質の配列内に内部挿入され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型の配列特異的な標的核酸結合及び切断活性を保持する。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の５０％以上を有する（保持する）。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約１００％を保持する。
場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しないＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性を保持する（有する）。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の結合活性の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約１００％を保持する。
場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しない親ＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性及び／又は切断活性を保持する（有する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応するＣａｓＸ親タンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％）を有する（保持する）。ＣａｓＸタンパク質及び／又はＣａｓＸ融合タンパク質の切断活性及び／又は結合活性を測定する方法は、当業者に既知であり、任意の便利な方法を使用することができる。
様々な異種ポリペプチドが、本開示の参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質に含めるのに好適である。場合によっては、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる。例えば、場合によっては、融合パートナーは、転写を抑制するタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写リプレッサー、転写抑制タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡに会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して機能するタンパク質）である。場合によっては、融合パートナーは、転写を増加するタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写アクチベーター、転写アクチベータータンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡに会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して作用するタンパク質）である。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸配列を改変する酵素活性を有し、例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２のうちのいずれか１つと、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を有するポリペプチドと、を含む。
転写を増加させるための融合パートナーとして使用することができるタンパク質（又はその断片）の例としては、転写アクチベーター（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、及び（例えば、植物における活性の）ＥＤＬＬの活性化ドメイン及び／又はＴＡＬ活性化ドメイン）；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）；並びにＤＮＡデメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）が挙げられるが、これらに限定されない。
転写を減少させるための融合パートナーとして使用され得るタンパク質（又はその断片）の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ又はＳＫＤ））；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ERF repressor domain、ＥＲＤ）、（例えば、植物における抑制の）ＳＲＤＸ抑制ドメインなど；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなど）；ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）；ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）；及び末梢動員エレメント（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸配列（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、ヌクレアーゼ活性（例えば、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるもの）、メチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｈｈａｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などによって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるもの）、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性（例えば、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのＡＰＯＢＥＣタンパク質）によって提供されるもの）、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性（例えば、インテグラーゼ及び／又はリゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼ（例えば、ＧｉｎインベルターゼＧｉｎＨ１０６Ｙの高活性変異体））、ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）、Ｔｎ３リゾルバーゼなどによって提供されるもの）、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性（例えば、リコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎリコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるもの）、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、本開示のＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン）、転写を減少させるためのドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン（例えば、Ｋｏｘ１タンパク質由来））、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）、又は塩基エディター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼ）から選択されるポリペプチドに融合される。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）に関連するタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性（標的核酸に関連するタンパク質を改変する）の例としては、メチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（histone methyltransferase、ＨＭＴ）（例えば、斑入り３－９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ １など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるもの）、アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コア／断片、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）によって提供されるもの）、デアセチラーゼ活性（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）によって提供されるもの）、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣａｓＸバリアントの好適な融合パートナーの更なる例は、（ｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能な対象のＲＮＡ誘導型ポリペプチド又は条件的に活性なＲＮＡ誘導型ポリペプチドを生成するため）、及び（ｉｉ）葉緑体移行ペプチド、である。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２のいずれか１つと、
ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号４０７９０）；
ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号３９９８０）；
ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号３９９６８）；
ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３９９６９）；
ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３９９７０）；
ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号３９９７１）；
ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号３９９７２）；
ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号３９９７３）；
ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号３９９７４）；
ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号３９９７５）；及び
ＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号３９９７６）が含まれるが、これらに限定されない葉緑体移行ペプチドと、を含む。
場合によっては、ＡＡＶ系における使用のための本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、エンドソームエスケープペプチドを含んでもよい。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号３９９７７）を含み、各Ｘは、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号３９９７８）又はＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３９９７９）を含む。
ｓｓＲＮＡ標的核酸配列を標的化する場合、ＣａｓＸバリアントとともに使用するための融合パートナーの非限定的な例としては（限定されないが）、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、伸長、及び／又は終結因子；例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ（例えば、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase acting on RNA、ＡＤＡＲ））、ＡからＩ及び／又はＣからＵの編集酵素を含む）；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質などが挙げられる。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、又は場合によっては、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、又は４０８２８～４０９１２のいずれか１つのＣａｓＸバリアントは、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメインの融合パートナーを含む（本開示の目的のために、分子内及び／又は分子間二次構造を含む、例えば、二本鎖ＲＮＡ二重鎖、例えば、ヘアピン、ステムループなどが含まれる）。一過的又は不可逆的、直接的又は間接的にかかわらず、以下を含む群から選択されるエフェクタードメインが挙げられるが、これに限定されない：エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、並びにＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン）；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ－１又はエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ ＳＩ、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、及びＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、翻訳を調節することができる）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、及びＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジニル化に関与するタンパク及びタンパクドメイン（例えば、ＣＩ Ｄｌ及び末端ウリジル酸トランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核内保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外輸送に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、及びｈｎＲＮＰ Ａｌ）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ｓｅｒｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低下に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７及びＨＩＶ Ｔａｔ）。代替的に、エフェクタードメインは、以下を含む群から選択することができる：エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジニル化することができるタンパク及びタンパクドメイン；ＲＮＡ局在化活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを核内保持することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外輸送活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率を低下させることができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；並びに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン。別の好適な異種ポリペプチドは、ＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインであり、これは、国際公開第２０１２／０６８６２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
ＣａｓＸバリアントとの融合パートナーとして（全体又はその断片で）使用することができるいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的なＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインを有するモジュール構成を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、プレｍＲＮＡにおけるエキソンスプライシングエンハンサー（exonic splicing enhancer、ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（RNA recognition motif、ＲＲＭ）及びエキソン封入を促進するＣ末端ＲＳドメインを含む。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａｌは、そのＲＲＭドメインを介してエキソンスプライシングサイレンサー（exonic splicing silencer、ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを介してエキソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの選択的部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（splice site、ｓｓ）の選択的使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰ Ａｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠位部位の使用にシフトさせることができる。かかる因子の１つの適用は、内因性遺伝子（特に、疾患関連遺伝子）の選択的スプライシングを調節するＥＳＦを作製することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘプレｍＲＮＡは、反対の機能のタンパク質をコードする２つの選択的５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生する。長いスプライシングアイソフォームのＢｃｌ－ｘＬは、長寿命の有糸分裂後細胞において発現される強力なアポトーシス阻害剤であり、多くのがん細胞において上方制御され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームのＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高い代謝率を有する細胞（例えば、発生中のリンパ球）において高レベルで発現される。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエキソン領域又はエキソン伸長領域（すなわち、２つの選択的５’スプライス部位間）のいずれかに位置する複数のｃｉｓエレメントによって調節される。更なる例については、国際公開第２０１０／０７５３０３号を参照されたい（その全体が参照により本明細書に援用される）。
ＣａｓＸバリアントとともに使用するための更なる好適な融合パートナーとしては、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（又はその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例：ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、ＣａｓＸバリアントとともに使用するための異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持するための配列（例えば、核外輸送配列（nuclear export sequence、ＮＥＳ））、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど）を含む。いくつかの実施形態では、対象のＲＮＡガイドポリペプチド若しくは条件的活性型ＲＮＡガイドポリペプチド及び／又は対象のＣａｓＸ融合タンパク質は、タンパク質が核を標的化しないように、ＮＬＳを含まない（これは、例えば、標的核酸配列が細胞質ゾルに存在するＲＮＡである場合に有利であり得る）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグを提供することができる。すなわち、異種ポリペプチドが検出可能な標識である（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein、ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（red fluorescent protein、ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein、ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６×Ｈｉｓタグ；赤血球凝集素（hemagglutinin、ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。
場合によっては、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ／ｇＲＮＡを細胞の核に標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む（に融合される）。場合によっては、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上のＮＬＳに融合される。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及び／若しくはＣ末端に、又はその近傍（例えば、５０アミノ酸以内）に位置する。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端又はその近傍（例えば、５０アミノ酸以内）に位置する。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端又はその近傍（例えば、５０アミノ酸以内）に位置する。場合によっては、ＮＬＳはＮ末端に位置し、ＮＬＳはＣ末端に位置する。場合によっては、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方又はその近傍（例えば、５０アミノ酸以内）に位置する。場合によっては、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、１～１０個のＮＬＳ（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、又は２～５個のＮＬＳ）を含む（に融合される）。場合によっては、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２～５個のＮＬＳ（例えば、２～４個又は２～３個のＮＬＳ）を含む（に融合される）。ＣａｓＸバリアントとともに使用するのに好適なＮＬＳの非限定的な例としては、以下に由来する配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列が挙げられる：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９６）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９７）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２４８）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）；ヘルペスウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）；マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）；ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）；ボルナ病ウイルスＰタンパク質（ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）；Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）；ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）；ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）；ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）；インフルエンザＡタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）；ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）；核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）；ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）；インポーチンαに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）；ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク由来の配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）；並びに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９４）、及びＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９５）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号４０１８８）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号４０１８９）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号４０１９０）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号４０１９１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０１９４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４０１９５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０１９６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号４０１９７）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号４０１９８）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０１９９）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０２００）。本開示のＡＡＶ系における組み込みのための更なるＮＬＳは、表１５及び表１６に提供され、ＣａｓＸのＮ末端又はＣ末端に連結するためのＮＬＳを示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、リンカーペプチドによってＣａｓＸ又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号４０２０１）、（ＧＳ）ｎ（配列番号４０２０２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０８）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１０）、ＧＧＳＧ（配列番号２１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１６）、ＧＰＧＰ（配列番号２１７）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１８）、ＰＰＰＧ（配列番号４０２０７）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１９）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０２０３）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号４０２０４）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０２０５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号４０２０６）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、段落の前述の実施形態のいずれかのＮＬＳ及びリンカーペプチド、並びに表１５及び表１６のＮＬＳをコードするポリ核酸を含み、場合によっては、図２４、図３３～図３５又は図４２のいずれか１つに示されるような構築物の他の成分に関連して構成され得る。
一般に、ＮＬＳ（又は複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核におけるＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分強力なものである。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が可視化され得るように、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次いで、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス（例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイ）によって分析され得る。核における蓄積はまた、間接的に決定され得る。
場合によっては、ＡＡＶ系における使用のためのＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ細胞透過ペプチドとしても知られる）を含み、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又は小胞膜の横断を促進するタンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指す。別の分子（これは、小さな極性分子から大きな高分子及び／又はナノ粒子の範囲であり得る）に結合したＰＴＤは、分子が膜を横断すること、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、又はサイトゾルから細胞小器官内へ移行することを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合される。場合によっては、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓＸバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤを含む（にコンジュゲートされている、融合されている）。場合によっては、ＰＴＤは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＰＴＤの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１９９）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２００）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２０１）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２０２）；細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列（配列番号２０３）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアタンパク形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；短縮型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２０４）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２０５）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２０６）；並びにＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２０７）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（activatable CPP、ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に切断可能なリンカーを介して連結されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、正味電荷をほぼ０に減少させ、それによって、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性を局所的にアンマスクし、したがって、ＡＣＰＰを「活性化」して膜を通過させる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して内部に挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチド（異種アミノ酸配列）に連結されたＣａｓＸタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、Ｃ末端及び／又はＮ末端において、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して異種ポリペプチド（融合パートナー）に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、一般的に柔軟な性質のスペーサーペプチドによって連結され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、４アミノ酸～４０アミノ酸長、又は４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をカップリングすることによって生成される。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。連結ペプチドは、好ましいリンカーが一般的に柔軟なペプチドをもたらす配列を有するであろうことを考慮して、実質的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの生成において有用である。かかる配列の生成は、当業者にとって日常的である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であると考えられる。リンカーポリペプチドの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、グリシン－プロリンポリマー、プロリンポリマー及びプロリン－アラニンポリマーが挙げられる。リンカーの例には、（Ｇ）ｎ（配列番号４０２０１）、（ＧＳ）ｎ（配列番号４０２０２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０８）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１０）、ＧＧＳＧ（配列番号２１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１６）、ＧＰＧＰ（配列番号２１７）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１８）、ＰＰＰＧ（配列番号４０２０７）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１９）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０２０３）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号４０２０４）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０２０５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号４０２０６）（式中、ｎは１～５であり、ｎは１～５である）挙げられるが、これらに限定されないアミノ酸配列が含まれる。当業者であれば、上記の任意のエレメントにコンジュゲートされたペプチドの設計は、リンカーが、柔軟なリンカー、並びにあまり柔軟ではない構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、全て又は部分的に柔軟なリンカーを含むことができることを認識するであろう。
Ｖ．標的核酸の改変のためのＡＡＶ系及び方法
本明細書において提供されるＡＡＶは、治療剤、診断剤として、及び研究用を含む様々な用途に有用である。遺伝子編集のための本開示の方法を実施するために、プログラム可能なＡＡＶ系が本明細書に提供される。本明細書で提供されるＡＡＶ系のＣａｓＸ及びｇＲＮＡ成分のプログラム可能な性質は、標的核酸配列中の所定の関心対象の１つ以上の領域において所望の効果（ニッキング、切断など）を達成するための正確な標的化を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ系は、ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸配列に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる。場合によっては、ＡＡＶ系は、ドナー鋳型核酸を更に含む。
本開示のいくつかの実施形態では、標的核酸配列を改変する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、標的核酸配列を含む細胞を、本開示のＣａｓＸタンパク質をコードするＡＡＶ及び標的化配列を含む本開示のｇＲＮＡと接触させることを含み、ｇＲＮＡの標的化配列が、標的核酸の配列に相補的であり、それとハイブリダイズすることができる配列を有する。ＣａｓＸ及びｇＲＮＡによる標的核酸とのハイブリダイゼーションの際に、ＣａｓＸは、遺伝子の調節エレメント又は非コード領域を含有する配列を含み得る標的核酸内又はその付近に１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を導入し、これは、本明細書に記載されるように、標的核酸における永続的なインデル（欠失又は挿入）又は変異をもたらし、遺伝子産物の機能における対応する発現の調節又は変更を伴い、それによって編集された細胞を作製する。他の実施形態では、本方法は、標的核酸配列を含む細胞を、標的核酸の異なる又は重複する部分を標的とする複数のｇＲＮＡをコードするＡＡＶと接触させることを含み、ＣａｓＸタンパク質は、本明細書に記載されるように、標的核酸に複数の切断を導入して、標的核酸に永続的なインデル又は変異をもたらし、遺伝子産物の発現の対応する調節又は機能の変更を伴い、それによって編集された細胞を作製する。
一実施形態では、標的核酸の改変は、標的核酸を含む遺伝子の遺伝子産物の発現の減少をもたらし、発現は、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターのｇＲＮＡはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ｇＲＮＡ（single-molecule gRNA、ｓｇＲＮＡ）である。本方法の他の実施形態では、ｇＲＮＡは、二分子ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であり、アクチベーター及び標的化因子成分は、介在ヌクレオチドによって一緒に連結される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラｇＲＮＡ－ｇＤＮＡである。いくつかの実施形態では、本方法は、標的核酸配列を、標的核酸の異なる又は重複する領域を標的とする複数のｇＲＮＡをコードするＡＡＶと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７の配列のいずれか１つを含む。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターに組み込まれるＣａｓＸタンパク質は、配列番号１～３から選択される参照ＣａｓＸ、又は配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣａｓＸバリアントである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸欠失を含む。他の実施形態では、少なくとも１つの改変は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。本方法のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、及び４０８２８～４０９１２の配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアントをコードする。実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す。本方法のいくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の改善された特徴は、ＣａｓＸタンパク質のフォールディングの改善、ガイドＲＮＡに対する結合親和性の改善、標的核酸配列に対する結合親和性の改善、１つ以上のＰＡＭ配列に対する結合親和性の変化、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣを含む参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより広いスペクトルのカノニカルＰＡＭ配列に効果的に結合する能力、標的核酸配列の巻き戻しの改善、活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ガイドＲＮＡ複合体の安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ガイドＲＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、及び融合体特徴の改善からなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１０～約１０，０００倍改善されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の少なくとも約１．１～約１０００倍増加した結合親和性である。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも１．５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、又は少なくとも１０，０００倍改善されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のタンパク質と比較して、標的核酸配列に対して少なくとも約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質による標的核酸配列に対する増加した結合親和性は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列に対するものである。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列の改変は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の改変は、細胞内でインビトロで実施される。細胞内の標的核酸配列の改変のいくつかの実施形態では、細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される真核細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の改変は、対象においてインビボで実施される。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列を改変する方法は、標的核酸を、ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡ対をコードし、ドナー鋳型を更に含むＡＡＶベクターと接触させることを含む。ドナー鋳型は、遺伝子産物の全てが発現されるか、又は全く発現されないように、標的核酸に挿入され得る。系がタンパク質コード配列をノックダウン／ノックアウトするために使用されるのか、又はノックインするために使用されるのかに依存して、ドナー鋳型は、短い一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり得るか、又は長い一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり得る。ノックダウン／ノックアウトについては、ドナー鋳型配列は、それが置換するゲノム配列と同一である必要はなく、ゲノム配列に関して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位又は再編成を含有してもよい。ＣａｓＸ：ｇＲＮＡによって標的とされる標的核酸配列の切断部位（すなわち、切断部位に対して５’及び３’）に隣接して、相同性指向性修復を支持するのに十分な数の相同性を有するヌクレオチドを有するアーム（「相同アーム」）が存在する場合、かかるドナー鋳型の使用は、遺伝子産物が発現されないか、又はより低いレベルで発現されるように、フレームシフト又は他の変異をもたらし得る。いくつかの実施形態では、相同アームは、１０～１００ヌクレオチドを含む。上流及び下流ホモロジーアーム配列は、ＣａｓＸが標的核酸配列を切断する切断部位のいずれかの側に隣接する１～５０塩基内のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相同性を共有し、ＨＤＲによるドナー鋳型配列の挿入を促進する。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接アーム配列との間の相同組換え修復が標的領域における非相同又は異種配列の挿入をもたらし、標的遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらし、遺伝子産物の発現の低減又は排除をもたらすように、２つの相同アームに隣接する非相同又は異種配列を含む。かかるノックダウンの場合では、遺伝子産物の発現は、改変されていない標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。他の場合には、外因性ドナー鋳型は、組み込まれる補正配列を含んでもよく、上流相同アーム及び下流相同アームに隣接し、それぞれが細胞に導入される標的核酸配列に対する相同性を有する。かかるドナー鋳型の使用は、遺伝子編集後に、機能的タンパク質の発現又は生理学的に正常なレベルの機能的タンパク質の発現をもたらし得る。他の場合では、変異、異種配列、又は補正配列を含み得る外因性ドナー鋳型は、相同性非依存的標的化組み込み（ＨＩＴＩ）機構によるＣａｓＸ切断によって生成された末端の間に挿入される。ＨＩＴＩによって挿入される外因性配列は、任意の長さ、例えば、１～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、又は約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。相同性の欠如は、例えば、２０～５０％以下の配列同一性を有すること、及び／又は低い厳密性での特異的なハイブリダイゼーションを欠くことであり得る。他の場合では、相同性の欠如は、５、６、７、８、又は９ｂｐ以下の同一性を有するという基準を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型配列を含み、配列は、標的核酸配列と比較して、特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列の差異は、マーカー配列の除去のために後で活性化され得る、隣接する組換え配列（例えば、ＦＬＰ配列、ｌｏｘＰ配列など）を含み得る。本方法のいくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０～約７００ヌクレオチド、少なくとも約２０～約６００ヌクレオチド、少なくとも約４０～約４００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である。
場合によっては、本方法は、標的核酸配列をドナー鋳型と接触させることを含まず、標的核酸配列は、標的核酸配列内のヌクレオチドが細胞自体の修復経路に従って欠失又は挿入されるように改変される（例えば、細胞修復経路は、ＮＨＥＪであり得る）。
他の実施形態では、本方法は、ＣａｓＸ／ｇＲＮＡを細胞の核に標的化するための、本明細書に記載の実施形態のいずれか又は複数の１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓＸをコードするＡＡＶを提供する。ＮＬＳは、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、若しくはその両方に、又はその近傍に融合することができる。
本開示の導入遺伝子成分（例えば、ＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、プロモーター及びアクセサリ成分、並びに任意選択的にドナー鋳型配列）をコードする配列を含む組換えＡＡＶベクターの細胞へのインビトロ条件下での導入は、細胞の生存及びＣａｓＸ：ｇＲＮＡの産生を促進する任意の適切な培養培地中及び任意の適切な培養条件下で行うことができる。組換えＡＡＶベクターの標的細胞への導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで実施することができる。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。例えば、細胞を、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードする核酸を有し、任意選択的に、ベクターが細胞によって取り込まれるようにドナー鋳型配列を有するベクターと接触させてもよい。細胞をプラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法は、当該技術分野において周知である、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、形質導入及びリポフェクションを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、治療有効用量で対象に投与される。前述では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。ベクターは、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、又は腹腔内投与経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができ、投与方法は、注射、輸血、又は移植である。
ｇＲＮＡ及びＣａｓＸタンパク質をコードする核酸を標的宿主細胞に提供するために使用されるＡＡＶベクターは、目的の核酸の発現（すなわち、転写活性化）を駆動するための好適なプロモーター又は他のアクセサリエレメントを含むことができる。場合によっては、目的のコード核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。これは、遍在的に作用するプロモーター（例えば、ＣＭＶ－β－アクチンプロモーター）又は誘導性プロモーター（例えば、特定の細胞集団において活性であるか、又はテトラサイクリン若しくはカナマイシンのような薬物の存在に応答するプロモーター）を含み得る。転写活性化によって、転写が、ベクターを含む標的宿主細胞における基底レベルを超えて、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、より通常には少なくとも約１０００倍増加することが意図される。加えて、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓＸタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、ＣａｓＸタンパク質及び／又はｇＲＮＡを取り込んだ細胞を同定するために、標的細胞における選択可能マーカーをコードする核酸配列を含み得る。
ＶＩ．ＡＡＶベクター
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＣａｓＸタンパク質、ｇＲＮＡ、並びに調節エレメント及びアクセサリエレメントをコードするポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質、及びｂ）本明細書に記載される実施形態のいずれか１つのポリヌクレオチド、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。前述の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、本明細書に記載の実施形態のいずれかの第１のプロモーター配列、本明細書に記載の実施形態のいずれかの第２のプロモーター配列、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、本明細書に記載の実施形態のいずれかの少なくとも第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び本明細書に記載の実施形態のいずれかの１つ以上のアクセサリエレメント配列から選択される成分の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２７に示される配列の群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、表８～表１０、表１２、表１３、並びに表１７～表２２及び表２４～表２６に示されるものと、ポリヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のｇＲＮＡの標的化配列の選択においてのみ異なり、標的化配列は、標的核酸の配列とハイブリダイズすることができる１５～３０ヌクレオチドを有する配列である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの標的化配列は、表２７に示される配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される実施形態のいずれかのポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、図２４、図３３～図３５、又は図４２のいずれか１つの構築物の構成を有するポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲは、同じ血清型のＡＡＶに由来する。他の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲは、異なる血清型のＡＡＶに由来する。特定の実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、ＡＡＶ１に由来する。別の特定の実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１～３の参照ＣａｓＸをコードする配列を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、及び４０８２８～４０９１２のＣａｓＸタンパク質バリアントを含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントをコードする配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、及び４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞内の標的核酸に相補的であり、したがって、標的核酸とハイブリダイズし、ｇＲＮＡ足場配列の３’末端に連結される、１５～３０ヌクレオチドを有する標的化配列を含む。
他の実施形態では、本開示は、ドナー鋳型核酸を含むＡＡＶ系を提供し、ドナー鋳型が、標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、遺伝子編集のために意図され、標的遺伝子の全て又は少なくとも一部を含み、ドナー鋳型の挿入の際に、遺伝子がノックダウン、ノックアウトされるか、又は変異が修正される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸エキソンの少なくとも一部をコードする配列を含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸イントロンの少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸イントロン－エキソン接合部の少なくとも一部をコードする配列を有する。更に他の場合では、ＡＡＶ系のドナー鋳型配列は、標的核酸に対して１つ以上の変異を含む。前述の実施形態では、ドナー鋳型は、１０～７００ヌクレオチドのサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型である。
他の態様では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶベクターをコードするポリヌクレオチド配列を産生する方法、並びにＡＡＶを発現及び回収する方法に関する。概して、本方法は、発現カセットの成分に加え、本明細書に記載の実施形態のいずれかの隣接ＩＴＲをコードするポリヌクレオチド配列を産生することと、コード遺伝子を宿主細胞に適した発現ベクターに組み込むことと、を含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶベクターの産生のために、本方法は、コードポリヌクレオチド、並びにトランスで提供されるＲｅｐ配列及びＣａｐ配列を含む発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換することと、得られるＡＡＶが産生されることを引き起こすか又は可能にする条件下で宿主細胞を培養することとを含み、このＡＡＶは、本明細書に記載される方法又は当該技術分野において既知の標準的な精製方法によって回収される。Ｒｅｐ及びＣａｐは、プラスミドとしてパッケージング宿主細胞に提供され得る。代替的に、宿主細胞ゲノムは、安定に組み込まれたＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を含み得る。好適なパッケージング細胞株は、当業者に公知である。例えば、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ａａｖ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ａｎｄ－ｐａｃｋａｇｉｎｇを参照されたい。宿主細胞株によって産生されたＡＡＶを精製する方法は、当業者に公知であり、アフィニティークロマトグラフィー、勾配遠心分離、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。本開示のポリヌクレオチド及びＡＡＶベクターを作製するために、実施例の方法とともに、分子生物学における標準的な組換え技術が使用される。
本開示によれば、本明細書に記載の実施形態のいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ（又はそれらの相補体）をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞における発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略が本開示を実施するのに好適であり、その多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子又はその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略を使用して、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を生成する。
いくつかのアプローチでは、まず、ＡＡＶベクター及び導入遺伝子の成分をコードするＤＮＡ配列を含有する構築物が調製される。かかる構築物の調製のための例示的な方法は、実施例に記載されている。次いで、構築物を使用して、宿主パッケージング細胞（例えば、導入遺伝子を含むＡＡＶベクターの発現及び回収のための真核宿主細胞）を形質転換するのに好適な発現ベクターを生成する。真核宿主パッケージング細胞は、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、又は組換えＡＡＶの産生に好適な当該技術分野で既知の他の真核細胞から選択することができる。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子導入、脂質媒介性形質導入、及び高速微粒子銃を使用する核酸送達が挙げられる。発現ベクターの生成、宿主細胞の形質転換、並びに核酸及びＡＡＶベクターの発現及び回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。
ＡＡＶベクターをコードする遺伝子は、完全に合成的に、又は実施例でより詳細に記載される方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、及び重複伸長などの酵素プロセスと組み合わせた合成によって、１つ以上のステップで作製することができる。本明細書に開示される方法は、例えば、所望の配列の様々な成分（例えば、ＩＴＲ、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ、プロモーター及びアクセサリエレメント）をコードするポリヌクレオチドの配列をライゲーションして発現ベクターを構築するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製及びカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来コード配列であり、これが発現してＡＡＶ遺伝子産物を提供し、それは次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶ発現ベクターに欠けている必要なＡＡＶ機能を補完するために使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、ｒｅｐ及びｃａｐのコード領域をコードする主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方又は両方、又はその機能的ホモログを含む。アクセサリ機能は、当業者に既知の方法を使用して宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞で発現され得る。通常、アクセサリ機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、アクセサリ機能は、アクセサリ機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの成分をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。このタイプの最適化は、同じＣａｓＸタンパク質又は他のタンパク質成分をコードしながら、意図された宿主生物又は細胞のコドン選好性を模倣するために、コードヌクレオチド配列の変異を伴い得る。したがって、コドンを変化させることはできるが、コードされるタンパク質は変化しないままである。例えば、意図された宿主細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＸコードヌクレオチド配列を使用することができる。遺伝子設計は、ＡＡＶベクターの産生において利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して行うことができる。本開示の１つの方法において、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、次いで、上記のように構築される。次いで、本明細書に記載されるように、得られる遺伝子を組み立て、得られる遺伝子を使用して宿主細胞を形質転換し、その特性を評価するために、ＡＡＶベクター組成物を産生及び回収する。いくつかの実施形態では、以下により完全に記載されるように、ＡＡＶベクターの成分をコードするヌクレオチド配列は、それらの機能的特徴を保持しながら、成分の免疫原性を減少させるために、ＣｐＧジヌクレオチドを除去するように操作される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。他の場合では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードするヌクレオチドは連結され、単一の調節エレメントに作動可能に連結されている。例示的なアクセサリエレメントとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、単一の転写物から複数の遺伝子の翻訳を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又はＰ２Ａペプチド、下流の転写終結を促進するポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、及び翻訳終結配列が挙げられる。場合によっては、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、誘導性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。場合によっては、転写アクセサリエレメント（例えば、プロモーター）は、標的化細胞型又は標的化細胞集団において機能的である。例えば、場合によっては、転写アクセサリエレメントは、真核細胞、例えば、ＡＡＶベクターの産生のためのパッケージング宿主細胞において機能的であり得る。場合によっては、アクセサリエレメントは、転写を開始するためにプロモーターと協力して働く転写アクチベーターである。転写活性化によって、転写が、標的細胞における基礎レベルよりも１０倍、１００倍、より一般的には１０００倍増加することが意図される。
真核生物プロモーター（真核生物細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、ＥＦ－１α、ＥＦ－１αコアプロモーター、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期由来のプロモーター、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長鎖末端反復（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びにマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。真核生物プロモーターの更なる非限定的な例としては、ＣＭＶプロモーター全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＩＶ－Ｌｔｒプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現を付与するヒトシナプシンＩプロモーター、ニューロンにおける選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（Rous sarcoma virus enhancer/promoter、ＲＳＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＳＶ４０エンハンサー、ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子（肝臓特異的）由来のＴＢＧプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２核内低分子ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター及びグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターは、Ｕ６である（Ｋｕｎｋｅｌ，ＧＲ ｅｔ ａｌ．Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ ｉｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８３（２２）：８５７５（１９８６））。
本開示のＡＡＶ構築物における使用に好適なｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ポリユビキチンＣ（polyubiquitin C、ＵＢＣ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）、ニワトリβアクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位融合（ＣＡＧ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７）、ＰＧＫ、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）、ＧＵＳＢ、ＣＢＡハイブリッド（CBA hybrid、ＣＢｈ）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）、ベータ－アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（silencing-prone spleen focus forming virus、ＳＦＦＶ）、ＣＭＶｄ１プロモーター、短縮型ヒトＣＭＶ（truncated human CMV、ｔＣＭＶｄ２）、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、ＭＬＣ、ＭＣＫ、ＧＲＫ１タンパク質プロモーター、Ｒｈｏプロモーター、ＣＡＲタンパク質プロモーター、ｈＳｙｎプロモーター、Ｕ１Ａプロモーター、リボソームＲｐｌ及びＲｐｓプロモーター（ｈＲｐｌ３０及びｈＲｐｓ１８など）、ＣＭＶ５３プロモーター、最小ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ＳＦＣｐプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＭＬＰプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅｃＰ２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ＣＫ７プロモーター、及びＣＫ８ｅプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、表８に示される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。特定の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＥＦ－１αであり、プロモーターが、トランスフェクション効率、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子の転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及び長期培養におけるエピソームベクターのコピー数を増強する。別の特定の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＪｅＴであり、プロモーターが、トランスフェクション効率、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子の転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及び長期培養におけるエピソームベクターのコピー数を増強する。いくつかの実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、前述のプロモーターの短縮型である。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物中のｐｏｌ ＩＩプロモーターは、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約４０ヌクレオチド未満を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物中のｐｏｌ ＩＩプロモーターは、約４０～約５８５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、又は約１５０～約３００ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、段落の前述の実施形態のいずれかのｐｏｌ ＩＩプロモーター、及び表８のプロモーターをコードするポリ核酸を含み、場合によっては、図２４、図３３～図３５又は図４２のいずれか１つに示されるような構築物の他の成分に関連して構成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、連結されたイントロンを有するｐｏｌ ＩＩプロモーターを含み、イントロンは、長期培養におけるプロモーターのトランスフェクション有効性、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及びエピソームベクターのコピー数を増加させるプロモーターの能力を増強する。かかるプロモーター－イントロンの組み合わせの例示的な実施形態は、実施例に記載されている。
本開示のＡＡＶ構築物における使用に好適なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、ミニＵ６、７ＳＫ、及びＨ１バリアント、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６、Ｂｉ７ＳＫ、ＢｉＨ１（双方向性Ｕ６、７ＳＫ、及びＨ１プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ＳＫ、及びヒトＨ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ＡＡＶによってコードされるｇＲＮＡの転写を増強する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、表９に示される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、前述のプロモーターの短縮型である。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物中のｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物中のｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ構築物は、段落の前述の実施形態のいずれかのｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び表９のプロモーターをコードするポリ核酸を含み、場合によっては、図２４、図３３～図３５又は図４２のいずれか１つに示されるような構築物の他の成分に関連して構成され得る。
適切なプロモーターの選択は、発現の制御に関連するので（例えば、遺伝子又は他の標的核酸を改変するための）、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含み得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、ＣａｓＸタンパク質に融合され得るタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、赤血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、精製又は検出のために使用されるキメラＣａｓＸタンパク質を得ることができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、誘導性プロモーター、構成的に活性なプロモーター、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサー、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、又は時間的に制限されたプロモーターに作動可能に連結されているｇＲＮＡ及び／又はＣａｓＸタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
特定の実施形態では、好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがって、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物又は真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）、増強Ｕ６プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、７ＳＫプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子の２つのｇＲＮＡが、２つのコードされたｇＲＮＡ配列の間に配置された単一の双方向性プロモーター（例えば、双方向性Ｈ１プロモーター又は双方向性Ｕ６プロモーター）に作動可能に連結されており、プロモーターが両方のｇＲＮＡ配列の転写を開始することができるポリヌクレオチド配列を提供する。他の実施形態では、本開示は、逆方向（すなわち、３’から５’）に配向されたプロモーターを含むＡＡＶ構築物を提供する。例示的な逆方向及び双方向性プロモーターは、実施例及び表８に記載されており、図２４及び３４に概略的に示されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子の１つ以上の成分が、真核細胞において作動可能な誘導性プロモーターに作動可能に連結されている（その制御下にある）ポリヌクレオチド配列を提供する。誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、カナマイシン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、エストロゲン及び／又はエストロゲンアナログ、ＩＰＴＧなどが挙げられるが、これらに限定されない分子によって制御され得る。誘導性プロモーターの更なる例としては、化学的／生化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーター（例えば、アルコール調節プロモーター、カナマイシン調節プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター及び他のテトラサイクリン応答性プロモーター系（テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）及びテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む））、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイドレセプター、ヒトエストロゲンレセプター、ガエクジソンレセプターに基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺レセプタースーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、酵母、マウス及びヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンを結合及び隔離するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーター）、病原性調節プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン又はベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、並びに光調節プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、その結果、多細胞生物において、プロモーターは、特定の細胞のサブセットにおいて活性（すなわち、「オン」）である。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写アクセサリエレメント、制御配列などと呼ばれることもある。プロモーターが標的化宿主細胞（例えば真核細胞、原核細胞）において機能的である限り、任意の便利な空間的に制限されたプロモーターを使用することができる。
場合によっては、プロモーターは、可逆的プロモーターである。好適な可逆的プロモーター（可逆的誘導性プロモーターを含む）は、当該技術分野で既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの生物（例えば、真核生物及び原核生物）から単離及び誘導され得る。第２の生物（例えば、第１の原核生物及び第２の真核生物、第１の真核生物及び第２の原核生物など）における使用のための第１の生物に由来する可逆的プロモーターの改変は、当該技術分野で周知である。かかる可逆的プロモーター、及びかかる可逆的プロモーターに基づくが、更なる制御タンパク質もまた含む系としては、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質に応答するプロモーター（ＡｌｃＲなど）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、Ｔｅｔアクチベーター、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦなどを含むプロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイドレセプタープロモーター系、ヒトエストロゲンレセプタープロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系など）、病原性関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ダイズ熱ショックプロモーターなど）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の組換え発現ベクターはまた、本開示の成分（例えば、ＣａｓＸ又はｇＲＮＡ）の強力な発現を促進するエレメントを含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ））、イントロン配列、又は転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）（例えば、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ウッドチャック肝炎転写後アクセサリエレメント（ＷＰＲＥ））のうちの１つ以上を含むことができる。本開示のＡＡＶ構築物に好適なＰＴＲＥの非限定的な例としては、表１２の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列が挙げられる。本開示の発現ベクターに含めるのに好適な例示的なポリ（Ａ）配列としては、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短鎖）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）短鎖などが挙げられる。本開示のＡＡＶ構築物に好適なポリ（Ａ）シグナルの非限定的な例としては、表１０の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列が挙げられる。本開示のＡＡＶ構築物に好適なイントロンの非限定的な例としては、表１７の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列が挙げられる。当業者は、本明細書に記載の組換え発現ベクターに含まれる好適なエレメントを選択することができるであろう。
導入遺伝子成分をコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶ発現ベクターに個々にクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに第１のｇＲＮＡ及び任意選択的に第２のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。場合によっては、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列及び／又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は各々、選択された細胞型において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態では、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列及びｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、別々のベクターで提供される。
導入遺伝子成分をコードする核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。概して、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用する。かかる技術は、当該技術分野で周知であり、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。様々なベクターが公的に入手可能である。
組換え発現ベクターは、以下及び実施例においてより完全に記載されるように、様々な方法によって標的宿主細胞に送達され得る。かかる方法としては、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。パッケージング細胞は、典型的には、ウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞（及び当該技術分野で既知の他の細胞）が含まれる。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製及びカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来コード配列であり、これが発現してＡＡＶ遺伝子産物を提供し、それは次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ＡＡＶ発現ベクターから失われている必要なＡＡＶ機能を補完するためのＡＡＶヘルパー機能を含むプラスミドでトランスフェクトされる。したがって、ＡＡＶヘルパー機能プラスミドは、ｒｅｐ及びｃａｐコード領域をコードする主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方又は両方、又はその機能的ホモログ、並びにプロモーターに作動可能に連結されたＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子を含むアデノウイルスヘルパー遺伝子を含む。アクセサリ機能は、当業者に既知の方法を使用して宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞で発現され得る。通常、アクセサリ機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、アクセサリ機能は、アクセサリ機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳アクセサリエレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。
ＶＩＩ．用途
本明細書で提供されるＡＡＶ系は、治療、診断、及び研究を含む様々な用途において標的核酸配列を改変するための方法において有用である。
本明細書に記載される細胞において標的核酸配列を改変する方法において、本方法は、本明細書に記載されるＡＡＶ系の実施形態のいずれかを利用する。場合によっては、本方法は、変異遺伝子産物の発現をノックダウンする。
他の場合では、本方法は変異遺伝子産物の発現をノックアウトする。更に他の場合では、本方法は、遺伝子産物の機能的タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、本方法は、標的核酸配列を、ＣａｓＸタンパク質をコードするＡＡＶ及び標的化配列を含むガイド核酸と接触させることを含み、当該接触させることは、ＲＮＰのＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列の改変をもたらす。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡをコードするＡＡＶを細胞に導入することを含み、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の一部に相補的な配列を含み、接触させることは、ＲＮＰの標的核酸の改変をもたらす。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのコードされた足場は、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み、コードされたＣａｓＸタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３、又は表３に示される配列番号４９～１６０、４０２０８～４０３６９、及び４０８２８～４０９１２からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントである。
いくつかの実施形態では、改変された標的核酸は、一本鎖切断を含み、細胞の修復機構による変異、挿入、又は欠失をもたらす。他の実施形態では、改変された標的核酸は、二本鎖切断を含み、細胞の修復機構による変異、挿入、又は欠失をもたらす。例えば、ＡＡＶによってコードされるＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、遺伝子の開始点又はその近傍でインデル、例えばフレームシフト変異を細胞に導入することができる。他の実施形態では、細胞の改変標的核酸は、ドナー鋳型の挿入によって改変されており、標的核酸を含む遺伝子はノックダウン又はノックアウトされている。
他の実施形態では、本方法は、標的核酸配列を、１つ以上の変異又は重複を有する標的核酸の異なる又は重複する領域を標的とする複数（例えば、２つ以上）のｇＲＮＡをコードするＡＡＶと接触させることを含む。前述において、得られる改変は、標的核酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、複製、又は逆位であり得る。
ＶＩＩＩ．治療方法
本開示は、疾患を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本開示のＡＡＶ組成物を対象に投与することによって、対象の疾患を予防、治療及び／又は改善することができる。いくつかの実施形態では、対象に投与される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を更に含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象の細胞中の標的核酸を改変することを含み、改変することが、治療有効用量の本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶベクターを対象に投与することを含み、コードされたｇＲＮＡの標的化配列が、標的核酸とハイブリダイズする配列を有し、ＣａｓＸタンパク質による標的核酸の改変をもたらす、方法、を提供する。
他の実施形態では、疾患を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法は、治療有効用量の本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶベクターを対象に投与することを含み、コードされたｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸とハイブリダイズする配列を有し、ＡＡＶは、標的核酸を含む遺伝子をノックダウン又はノックアウトするために標的核酸配列に挿入されるか又はそれを置換する１つ以上の変異又は異種配列を含むドナー鋳型を更に含む。前述において、ドナー鋳型の挿入は、遺伝子及び得られる遺伝子産物の発現を破壊するのに役立つ。前述の方法のいくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ鋳型は、１０～１５，０００ヌクレオチドのサイズの範囲である。前述の方法の他の実施形態では、ドナー鋳型は、１００～１，０００ヌクレオチドのサイズの範囲である。場合によっては、ドナー鋳型は、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型である。
治療された対象の改変細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、治療された対象の真核細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、本方法は、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、眼球内又は腹膜内経路からなる群から選択される投与経路を介して、本明細書に記載の実施形態のＡＡＶベクターを対象に投与することを含み、投与方法は、注射、輸血、又は移植である。対象における疾患を治療する方法のいくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
疾患を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。眼のような器官系では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ、少なくとも約１×１０１６ｖｇの用量で投与される。
いくつかの治療戦略が、疾患を有する対象の治療方法における使用のための組成物を設計するために使用されている。いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を有する対象の治療方法であって、治療有効用量を使用する１つ以上の連続用量を含む治療レジメンに従って、本明細書に開示される実施形態のいずれかのＡＡＶベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。治療レジメンのいくつかの実施形態では、治療有効用量のＡＡＶベクターは、単回用量として投与される。治療レジメンの他の実施形態では、治療有効用量は、少なくとも２週間、又は少なくとも１ヶ月間、又は少なくとも２ヶ月間、又は少なくとも３ヶ月間、又は少なくとも４ヶ月間、又は少なくとも５ヶ月間、又は少なくとも６ヶ月間の期間にわたって、２回以上の用量として対象に投与される。治療レジメンのいくつかの実施形態では、有効用量は、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、眼球内、網膜下、硝子体内、又は腹膜内経路からなる群から選択される経路によって投与され、投与方法は、注射、輸血、又は移植である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異を有する遺伝子の発現をノックダウン又はノックアウトするために治療有効量のＡＡＶベクターを投与することは、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、基礎疾患の予防又は改善をもたらす。いくつかの実施形態では、治療有効量のＡＡＶベクターの投与は、疾患の少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。治療方法のいくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類、及びヒトから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とするヒトの治療のための医薬として使用するための、本明細書に記載されるＡＡＶ実施形態のいずれかの組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬品は、治療有効用量を使用して、１回以上の連続した用量を含む治療レジメンに従って、対象に投与される。
ＩＸ．免疫原性を低下させ、編集特性を保持するように操作されたＡＡＶ
哺乳動物宿主における免疫応答に寄与するＡＡＶ関連病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、ｉ）ｔｏｌｌ様受容体２（toll-like receptor 2、ＴＬＲ２）に結合するｒＡＡＶウイルスカプシド上に存在するリガンド、肝臓における非実質細胞上の細胞表面ＰＲＲ；並びにｉｉ）ＴＬＲ９に結合するウイルスＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell、ｐＤＣ）及びＢ細胞中のエンドソームＰＲＲを含む（Ｆａｕｓｔ，ＳＭ，ｅｔ ａｌ．ＣｐＧ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：２２９４（２０１３））。特に、ＡＡＶベクター中のＣｐＧジヌクレオチドモチーフ（ＣｐＧ ＰＡＭＰ）は、高度のメチル化を有する哺乳動物ＣｐＧモチーフと比較して、高度の低メチル化のために免疫刺激性である。したがって、ＡＡＶベクターゲノム中の非メチル化ＣｐＧの頻度を、ヒトＴＬＲ９を活性化する閾値未満のレベルに低下させることは、外因的に投与されたＡＡＶベースの生物製剤に対する免疫応答を低下させると予想される。同様に、ＡＡＶ構築物中のＣｐＧ ＰＡＭＰのメチル化は、ＡＡＶベースの生物製剤に対する免疫応答を低下させることが同様に予想される。
いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子の１つ以上の成分が、哺乳動物種由来の相同ヌクレオチド配列の置換によってＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化されているＡＡＶベクターであって、１つ以上の成分が、形質導入された細胞における発現時にそれらの機能特性、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現を駆動する能力、ｇＲＮＡの発現を駆動する能力、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの発現を増強する能力、並びに標的核酸配列を編集する増強された能力、を実質的に保持している、ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ導入遺伝子成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のためにコドン最適化されているＡＡＶベクターを提供し、得られるＡＡＶベクター導入遺伝子は、ＣｐＧジヌクレオチドを実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、本開示は、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、ポリ（Ａ）、及びアクセサリエレメントからなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ導入遺伝子成分配列が、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、及びポリ（Ａ）からなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ導入遺伝子成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドを欠いているＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子が約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された１つ以上のＡＡＶ成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる配列、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列の群から選択されるＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された導入遺伝子の１つ以上の成分を有するＡＡＶベクターであって、発現されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡが、同等の条件下でインビトロアッセイにおいてアッセイされた場合に、導入遺伝子がＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化されていないＡＡＶベクターと比較して、標的核酸についての編集能の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％を保持する、ＡＡＶベクターを提供する。特定の実施形態では、本開示は、編集能を保持するＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された１つ以上のＡＡＶ成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる配列、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列の群から選択されるＡＡＶベクターを提供する。
ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された導入遺伝子の１つ以上の成分を含むＡＡＶベクターの実施形態は、改善された特徴として、炎症反応のマーカーを検出するように設計されたインビボでの哺乳動物細胞アッセイ（対象に投与された場合）又はインビトロでの哺乳動物細胞アッセイのいずれかにおいて、免疫応答を誘導する能力が低い。いくつかの実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された導入遺伝子の１つ以上の成分を含む治療有効用量のＡＡＶベクターの対象への投与は、導入遺伝子がＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化されていない比較可能なＡＡＶベクターの免疫応答と比較して免疫応答の低下をもたらし、応答の低下は、抗体の産生若しくはＡＡＶ成分に対する遅延型過敏、又はＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などであるがこれらに限定されない炎症性サイトカイン及びマーカーの産生などの１つ以上のパラメータの測定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドを実質的に欠く導入遺伝子の１つ以上の成分を含むＡＡＶベクターは、かかるアッセイに適した当該技術分野で既知の細胞（例えば、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）を用いる細胞ベースのインビトロアッセイにおいてアッセイした場合に、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（tumor necrosis factor alpha、ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（interferon gamma、ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor、ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される１つ以上の炎症マーカーの産生の低下を誘発する。特定の実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のためにコドン最適化された導入遺伝子の１つ以上の成分を含むＡＡＶベクターは、インビトロアッセイにおいて、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のｈＮＰＣにおけるＴＬＲ９の活性化の低下を示す。
Ｘ．キット及び製造品
他の実施形態では、本開示の実施形態のいずれかのＡＡＶベクターと、好適な容器（例えば、チューブ、バイアル又はプレート）とを含むキットが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子改変用途のために適切な対照組成物、及び使用説明書を含む。
ＸＩ．列挙された実施形態
以下の一連の列挙された実施形態は、例示目的のために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
セットＩ：
セットＩの実施形態は、米国仮出願第６３／１２３，１１２号において提供される表、及び２０２０年１２月９日に米国仮出願第６３／１２３，１１２号とともに提出された配列表を参照する。
実施形態Ｉ－１．
ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、
ｂ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｃ．第１のプロモーター配列、
ｄ．ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、
ｅ．少なくとも第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び、任意選択的に、
ｆ．少なくとも１つのアクセサリエレメント配列、を含むポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質配列及び少なくとも第１のｇＲＮＡをコードする配列が、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する、実施形態Ｉ－１又はＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－４．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する、実施形態Ｉ－１又はＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－５．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する、実施形態Ｉ－１又はＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－６．第１のプロモーター配列及びＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態Ｉ－１～Ｉ－５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－７．ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び少なくとも第１のガイドＲＮＡをコードする配列が、第１のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態Ｉ－１～Ｉ－６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－８．少なくとも１つのアクセサリエレメントが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結されている、実施形態Ｉ－１～Ｉ－７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－９．第２のプロモーターを更に含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１０．第２のプロモーター配列及びｇＲＮＡをコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態Ｉ－９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１１．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－９又はＩ－１０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１２．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－９又はＩ－１０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１３．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－９又はＩ－１０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１４．２つ以上のアクセサリエレメントを含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１５．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－１４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１６．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－１４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１７．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態Ｉ－１４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１８．ポリヌクレオチドが、第２のプロモーターを含み、ポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は少なくとも３５％以上が、第１のプロモーターの配列及び第２のプロモーターの配列並びに少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列を合わせた長さで含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－１９．少なくとも１つのアクセサリエレメントが、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、第３のプロモーター、第２のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、転写のアクチベーター又はリプレッサー、及び自己切断配列からなる群から選択される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２０．アクセサリエレメントが、当該アクセサリエレメントの非存在下でのＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現、結合、活性、又は性能を増強する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２１．増強された性能が、インビトロアッセイにおける標的核酸の編集の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５００％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加である、実施形態Ｉ－２０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２３．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態Ｉ－２２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２４．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＣａｓＸである、実施形態Ｉ－２３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２５．ＣａｓＸが、表３に示される配列番号１～３及び４９～１６０からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態Ｉ－２４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２６．ＣａｓＸが、表３に示される配列番号１～３及び４９～１６０の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態Ｉ－２４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２７．第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２８．第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－２９．第１のｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～２０ヌクレオチドを有する、実施形態Ｉ－２８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３０．第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５の配列から選択される配列を含む、実施形態Ｉ－１９～Ｉ－２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３１．第２のｇＲＮＡが、実施形態Ｉ－２８の標的核酸とは異なる標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～２０ヌクレオチドを有する、実施形態Ｉ－３０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３２．表４、表５、表６、表７、表９、表１０、及び表１２の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３３．表４、表５、表６、表７、表９、表１０、及び表１２の配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３４．アクセサリエレメントが、サイトメガロウイルス最初期イントロンＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、及びヒト熱ショックタンパク質７０ ｍＲＮＡ（Ｈｓｐ７０）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３５．第１のプロモーター配列が、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、又は少なくとも約８００ヌクレオチドを有する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３６．第２のプロモーター配列が、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、又は少なくとも約８００ヌクレオチドを有する、実施形態Ｉ－９～Ｉ－３５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３７．ポリヌクレオチドが、図１５、図２１、又は図２２の構築物の構成を有する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３８．５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－３９．ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質、及びｂ）実施形態Ｉ－１～Ｉ－３８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
実施形態Ｉ－４０．ＡＡＶカプシドタンパク質が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態Ｉ－３９に記載のｒＡＡＶ。
実施形態Ｉ－４１．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、同じ血清型のＡＡＶに由来する、実施形態Ｉ－４０に記載のｒＡＡＶ。
実施形態Ｉ－４２．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶの異なる血清型に由来する、実施形態Ｉ－４０に記載のｒＡＡＶ。
実施形態Ｉ－４３．実施形態Ｉ－３９～Ｉ－４２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物。
実施形態Ｉ－４４．哺乳動物細胞の集団において標的核酸を改変するための方法であって、複数の細胞を、有効量の実施形態Ｉ－３９～Ｉ－４２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は実施形態Ｉ－４３に記載の医薬組成物と接触させることを含み、ｇＲＮＡによって標的化される細胞の標的核酸が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって改変される、方法。
実施形態Ｉ－４５．改変することが、細胞集団の標的核酸において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態Ｉ－４４に記載の方法。
実施形態Ｉ－４６．ｒＡＡＶベクターを作製する方法であって、
ｉ）細胞の集団を提供することと、
ｉｉ）実施形態Ｉ－１～Ｉ－３８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクターで細胞集団をトランスフェクトすることとを含む、方法。
実施形態Ｉ－４７．細胞の集団が、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現する、実施形態Ｉ－４６に記載の方法。
実施形態Ｉ－４８．ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上のベクターで細胞をトランスフェクトすることを更に含む、実施形態Ｉ－４６に記載の方法。
実施形態Ｉ－４９．ｒＡＡＶベクターを回収することを更に含む、実施形態Ｉ－４６～Ｉ－４８のいずれか１つに記載の方法。
セットＩＩ：
セットＩＩの実施形態は、米国仮出願第６３／２３５，６３８号において提供される表、及び２０２１年８月２０日に米国仮出願第６３／２３５，６３８号とともに提出された配列表を参照する。
実施形態ＩＩ－１．
ａ．第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、
ｂ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｃ．第１のプロモーター配列、
ｄ．ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、
ｅ．少なくとも第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び
ｆ．任意選択的に、少なくとも１つのアクセサリエレメント配列、を含む、ポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列及び少なくとも第１のｇＲＮＡをコードする配列が、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩ－１又はＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩ－１又はＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩ－１又はＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－６．第１のプロモーター配列及びＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－７．第１のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、実施形態ＩＩ－６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－８．プロモーターが、ポリユビキチンＣ（ＵＢＣ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ニワトリβアクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位融合（ＣＡＧ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７）、ＰＧＫ、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）、ＧＵＳＢ、ＣＢＡハイブリッド（ＣＢｈ）、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）、ベータ－アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、ＣＭＶｄ１プロモーター、短縮型ヒトＣＭＶ（ｔＣＭＶｄ２）、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、ＭＬＣ、ＭＣＫ、ＧＲＫ１タンパク質プロモーター、Ｒｈｏプロモーター、ＣＡＲタンパク質プロモーター、ｈＳｙｎプロモーター、Ｕ１Ａプロモーター、リボソームＲｐｌ及びＲｐｓプロモーター（例えば、ｈＲｐｌ３０及びｈＲｐｓ１８）、ＣＭＶ５３プロモーター、最小ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ＳＦＣｐプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＭＬＰプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅｃＰ２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ＣＫ７プロモーター、及びＣＫ８ｅプロモーターからなる群から選択される、実施形態ＩＩ－６又はＩＩ－７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－９．プロモーターが、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＣＡＧ、ＣＢ７、ＰＧＫ、ＪｅＴ、ＧＵＳＢ、ＣＢ、ＥＦ－１アルファ、ベータ－アクチン、ＲＳＶ、ＳＦＦＶ、ＣＭＶｄ１、ｔＣＭＶｄ２、最小ＣＭＶ、ニワトリβアクチン、ＨＳＶ ＴＫ、Ｍｉｎｉ－ＴＫ、最小ＩＬ－２、ＧＲＰ９４、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、ＭＬＣ、ＭＣＫ、ＧＲＫ１タンパク質Ｒｈｏ、ＣＡＲタンパク質、ｈＳｙｎ、Ｕ１Ａ ｒ、リブソームＲｐｌ、及びＲｐｓ（例えば、ｈＲｐｌ３０及びｈＲｐｓ１８）、ＣＭＶ５３、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ５３、ＳＦＣｐ、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５、ＭＬＰ、ＥＦＳ、ＭｅＰ４２６、ＭｅｃＰ２、ＭＨＣＫ７、（ＧＵＳＢ、ＣＫ７、又はＣＫ８ｅプロモーターの短縮型バリアントである、実施形態ＩＩ－８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１０．プロモーターが、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約４０ヌクレオチド未満を有する、実施形態ＩＩ－８又はＩＩ－９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１１．プロモーターが、約４０～約５８５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、又は約１５０～約３００ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－８又はＩＩ－９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１２．プロモーターが、表４に示される配列番号４０３７０～４０４００、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１３．少なくとも１つのアクセサリエレメントが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に作動可能に連結されている、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１４．第２のプロモーターを更に含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１５．第２のプロモーター配列及びｇＲＮＡをコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態ＩＩ－１４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１６．第２のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、実施形態ＩＩ－１４又はＩＩ－１５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１７．第２のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６（双方向性Ｕ６プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓＫ、及びヒトＨ１プロモーターからなる群から選択される、実施形態ＩＩ－１０～ＩＩ－１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１８．プロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１、ＢｉＵ６、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、又はヒトＨ１プロモーターの短縮型バリアントである、実施形態ＩＩ－１７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－１９．プロモーターが、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する、実施形態ＩＩ－１７又はＩＩ－１８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２０．プロモーターが、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－１７又はＩＩ－１８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２１．プロモーターが、表５に示される配列番号４０４０１～４０４００、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２２．第２のプロモーターが、ｇＲＮＡの転写を増強する、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２３．第１のプロモーターの配列及び第２のプロモーターの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２４．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２５．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２６．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２７．２つ以上のアクセサリエレメントを含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２８．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－２７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－２９．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－２７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３０．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩ－２７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３１．ポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は少なくとも３５％以上が、第１のプロモーターの配列及び第２のプロモーターの配列並びに少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列を合わせた長さで含む、実施形態ＩＩ－１４～ＩＩ－３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３２．アクセサリエレメントが、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、第３のプロモーター、第２のガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター又はリプレッサーからなる群から選択される、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３３．アクセサリエレメントが、当該アクセサリエレメントを欠く以外は同一のポリヌクレオチドと比較して、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の転写、転写終結、発現、結合、活性、又は性能を増強する、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－３２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３４．増強された性能が、インビトロアッセイにおけるＣＲＩＳＰＲタンパク質による標的核酸の編集の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加である、実施形態ＩＩ－３３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３５．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－３４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３６．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態ＩＩ－３５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３７．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＣａｓＸである、実施形態ＩＩ－３６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３８．コードされたＣａｓＸが、表３に示される配列番号１～３、４９～１６０、及び４０２０８～４０３６９、並びに表２１に示される配列番号４０８０８～４０８２７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩ－３７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－３９．コードされたＣａｓＸが、表３に示される配列番号１～３、４９～１６０及び４０２０８～４０３６９、並びに表２１に示される配列番号４０８０８～４０８２７の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩ－３７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４０．ポリヌクレオチドが、ＣａｓＸをコードする配列に連結された１つ以上のＮＬＳをコードする、実施形態ＩＩ－３５～ＩＩ－３９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４１．１つ以上のＮＬＳをコードする配列が、ＣａｓＸタンパク質をコードする配列の５’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩ－４０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４２．１つ以上のＮＬＳをコードする配列が、ＣａｓＸタンパク質をコードする配列の３’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩ－４０又はＩＩ－４１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４３．ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのＮＬＳをコードし、少なくとも２つのＮＬＳをコードする配列が、ＣａｓＸタンパク質をコードする配列の５’末端及び３’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩ－４１又はＩＩ－４２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４４．１つ以上のコード化されたＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９６）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２４８）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９５）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号４０４０８）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号４０８０９）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号４０８１０）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号４０８１１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０８１２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０８１３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０８１４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４０８１５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０８１６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号４０４５２）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０８１７）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０８１８）からなる配列の群から選択され、１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、ＣａｓＸバリアント又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、（Ｇ）ｎ（配列番号４０２０１）、（ＧＳ）ｎ（配列番号４０２０２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０８）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１０）、ＧＧＳＧ（配列番号２１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１６）、ＧＰＧＰ（配列番号２１７）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１８）、ＰＰＰＧ（配列番号４０２０７）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１９）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０２０３）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号４０２０４）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０２０５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号４０２０６）（式中、ｎは１～５である）からなる配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－４０～ＩＩ－４３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４５．１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１１及び表１２に示される配列番号４０４４３～４０５０１、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－４０～ＩＩ－４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４６．１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１１及び表１２に示される配列番号４０４４３～４０５０１からなる配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－４０～ＩＩ－４３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４７．第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１－２２８５、及び３９９８１～４００２６からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－４６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４８．第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５及び３９９８１～４００２６からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－４７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－４９．第１のｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－４８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５０．標的化配列が１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－４９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５１．第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１－２２８５、及び３９９８１～４００２６からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩ－３２～ＩＩ－５０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５２．第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５及び３９９８１～４００２６からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩ－３２～ＩＩ－５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５３．第２のｇＲＮＡが、実施形態ＩＩ－４９又はＩＩ－５０に記載の標的核酸とは異なる標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－５１又はＩＩ－５２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５４．標的化配列が１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩ－５３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５５．アクセサリエレメントが、サイトメガロウイルス最初期イントロンＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、及びヒト熱ショックタンパク質７０ ｍＲＮＡ（Ｈｓｐ７０）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）である、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５６．アクセサリエレメントが、表８に示される配列番号４０４３１～４０４４２、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択されるＰＴＲＥである、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５７．５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５８．５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ２に由来する、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－５９．表４、表５、表６、表８、表９、表１３～表１６及び表２０の配列からなる群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－６０．表４、表５、表６、表８、表９、表１３～表１６及び表２０の配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－６１．ポリヌクレオチドが、図２４、図３３～図３５、又は図４２のいずれか１つに示される構築物の構成を有する、実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩ－６２．ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質、及びｂ）実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
実施形態ＩＩ－６３．ＡＡＶカプシドタンパク質が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態ＩＩ－６２に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩ－６４．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、同じ血清型のＡＡＶに由来する、実施形態ＩＩ－６３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩ－６５．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶの異なる血清型に由来する、実施形態ＩＩ－６３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩ－６６．５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２に由来する、実施形態ＩＩ－６５に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩ－６７．実施形態ＩＩ－６２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
実施形態ＩＩ－６８．哺乳動物細胞の集団において標的核酸を改変するための方法であって、複数の細胞を、有効量の実施形態ＩＩ－６２～６６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ又は実施形態ＩＩ－６７に記載の医薬組成物と接触させることを含み、ｇＲＮＡによって標的化される細胞の標的核酸が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって改変される、方法。
実施形態ＩＩ－６９．改変することが、細胞集団の標的核酸において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態ＩＩ－６８に記載の方法。
実施形態ＩＩ－７０．ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態ＩＩ－６８又はＩＩ－６９に記載の方法。
実施形態ＩＩ－７１．ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態ＩＩ－６８又はＩＩ－６９に記載の方法。
実施形態ＩＩ－７２．ｒＡＡＶが、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、眼球内又は腹膜内経路から選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が注射、輸血、又は移植である、実施形態ＩＩ－６８～ＩＩ－７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩ－７３．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態ＩＩ－６８～ＩＩ－７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩ－７４．対象が、ヒトである、実施形態ＩＩ－６８～ＩＩ－７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩ－７５．ｒＡＡＶベクターを作製する方法であって、
ａ．パッケージング細胞の集団を提供することと、
ｂ．細胞集団を
ｉ）実施形態ＩＩ－１～ＩＩ－５７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
ｉｉ）ａａｐ（アセンブリ）遺伝子を含むベクター、並びに
ｉｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐゲノムを含むベクター、でトランスフェクトすることと、を含む、方法。
実施形態ＩＩ－７６．ｒＡＡＶベクターを回収することを更に含む、実施形態ＩＩ－７０に記載の方法。
セットＩＩＩ：
セットＩＩＩの実施形態は、本明細書において提供される表及び本明細書とともに提出される配列表を参照する。
実施形態ＩＩＩ－１．以下の成分配列：
ａ．第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、
ｂ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｃ．第１のプロモーター配列、
ｄ．ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、
ｅ．第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び
ｆ．任意選択的に、少なくとも１つのアクセサリエレメント配列、を含むポリヌクレオチドであって、
ポリヌクレオチドが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）への組み込みのために構成されている、ポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のｇＲＮＡをコードする配列が、合わせて、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩＩ－１又はＩＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩＩ－１又はＩＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５．第１のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する、実施形態ＩＩＩ－１又はＩＩＩ－２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６．第１のプロモーター配列及びＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７．第１のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、実施形態ＩＩＩ－６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８．第１のプロモーターが、ポリユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位融合（ＣＡＧ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７）、ＰＧＫプロモーター、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）プロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＣＢＡハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＣＭＶｄ１プロモーター、短縮型ヒトＣＭＶ（ｔＣＭＶｄ２）、最小ＣＭＶプロモーター、ｈｅｐＢプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、スーパーコアプロモーター３、アデノウイルス主要後期（ＡｄＭＬ）プロモーター、ＭＬＣプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＧＲＫ１タンパク質プロモーター、Ｒｈｏプロモーター、ＣＡＲタンパク質プロモーター、ｈＳｙｎプロモーター、Ｕ１ａプロモーター、リボソームタンパク質大サブユニット３０（Ｒｐｌ３０）プロモーター、リボソームタンパク質小サブユニット１８（Ｒｐｓ１８）プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、最小ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ＳＦＣｐプロモーター、Ｍｅｃｐ２プロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＭＬＰプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅｃＰ２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、及びＣＫ８ｅプロモーターからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－６又はＩＩＩ－７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９．第１のプロモーターが、ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＣＡＧ、ＣＢ７、ＰＧＫ、ＪｅＴ、ＧＵＳＢ、ＣＢ、ＥＦ－１アルファ、ベータ－アクチン、ＲＳＶ、ＳＦＦＶ、ＣＭＶｄ１、ｔＣＭＶｄ２、最小ＣＭＶ、ニワトリβアクチン、ＨＳＶ ＴＫ、Ｍｉｎｉ－ＴＫ、最小ＩＬ－２、ＧＲＰ９４、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、ＭＬＣ、ＭＣＫ、ＧＲＫ１タンパク質Ｒｈｏ、ＣＡＲタンパク質、ｈＳｙｎ、Ｕ１ａ、リボソームタンパク質大サブユニット３０（Ｒｐｌ３０）、リボソームタンパク質小サブユニット１８（Ｒｐｓ１８）、ＣＭＶ５３、最小ＳＶ４０、ＣＭＶ５３、ＳＦＣｐ、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５、ＭＬＰ、ＥＦＳ、ＭｅＰ４２６、ＭｅｃＰ２、ＭＨＣＫ７、ＣＫ７、又はＣＫ８ｅプロモーターの短縮型バリアントである、実施形態ＩＩＩ－８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０．第１のプロモーター配列が、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約４０ヌクレオチド未満を有する、実施形態ＩＩＩ－７又はＩＩＩ－８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１．第１のプロモーター配列が、約４０～約５８５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、又は約１５０～約３００ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－７又はＩＩＩ－８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２．第１のプロモーターが、表８に示される配列番号４０３７０～４０４００、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１３．第１のプロモーターが、表２４に示される配列番号４１０３０～４１０４４、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１４．少なくとも１つのアクセサリエレメントが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１５．第２のプロモーターを更に含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１６．第２のプロモーター配列及び第１のｇＲＮＡをコードする配列が、作動可能に連結されている、実施形態ＩＩＩ－１５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１７．第２のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、実施形態ＩＩＩ－１５又はＩＩＩ－１６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１８．第２のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６（双方向性Ｕ６プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓＫ、及びヒトＨ１プロモーターからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１９．第２のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１、ＢｉＵ６、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、又はヒトＨ１プロモーターの短縮型バリアントである、実施形態ＩＩＩ－１８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２０．第２のプロモーター配列が、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する、実施形態ＩＩＩ－１８又はＩＩＩ－１９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２１．第２のプロモーター配列が、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－１８又はＩＩＩ－１９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２２．第２のプロモーター配列が、表９に示される配列番号４０４０１～４０４２０及び４１０１０～４１０２９、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２３．第２のプロモーターが、第１のｇＲＮＡの転写を増強する、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２４．第１のプロモーターの配列及び第２のプロモーターの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２５．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２６．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態１５～ＩＩＩ－２５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２７．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２８．２つ以上のアクセサリエレメント配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－２９．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌ超のクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－２８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３０．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－２８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３１．第１のプロモーターの配列、第２のプロモーターの配列、及び２つ以上のアクセサリエレメントの配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、実施形態ＩＩＩ－２８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３２．ポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は少なくとも３５％以上が、第１のプロモーターの配列及び第２のプロモーターの配列並びに少なくとも１つのアクセサリエレメントの配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１５～ＩＩＩ－３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３３．アクセサリエレメントが、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター、及び転写のリプレッサーからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－３２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３４．アクセサリエレメントが、当該アクセサリエレメントを欠く以外は同一のポリヌクレオチドと比較して、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の転写、転写終結、発現、標的核酸の結合、標的核酸の編集、又は性能を増強する、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－３２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３５．増強された性能が、インビトロアッセイにおける発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のｇＲＮＡによる標的核酸の編集の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加である、実施形態ＩＩＩ－３４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３６．コードされたＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－３５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３７．コードされたＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、実施形態ＩＩＩ－３６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３８．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、
ａ．ＱＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱの配列（配列番号４１８１８）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＮＴＳＢドメイン、
ｂ．ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳＦの配列（配列番号４１８１９）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－ＩＩドメイン、
ｃ．ＰＬＶＥＲＱＡＮＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡＧＹＫＲＱＥＡＬＲＰＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫＧＫＫＦＡＲＹＱＬＧＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥの配列（配列番号４１８２０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩＩドメイン、及び
ｄ．ＳＳＮＩＫＰＭＮＬＩＧＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥＫＱＲＴＩＱＡＫＫＥＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣの配列（配列番号４１８２１）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－Ｉドメイン、を含む、実施形態ＩＩＩ－３７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－３９．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＱＥＩＫＲＩＮＫＩＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫＫＰＥＮＩＰＱの配列（配列番号４１８２２）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－Ｉドメインを含む、実施形態ＩＩＩ－３８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４０．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥＲＲＥＶＬＤの配列（配列番号４１８２３）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－ＩＩドメインを含む、実施形態ＩＩＩ－３８又はＩＩＩ－３９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４１．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＰＩＳＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶＡの配列（配列番号４１８２４）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－Ｉドメインを含む、実施形態ＩＩＩ－３８～ＩＩＩ－４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４２．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨの配列（配列番号４１８２５）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＴＳＬドメインを含む、実施形態ＩＩＩ－３８～ＩＩＩ－４１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４３．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬＫＥＶＷＫＰＡＶの配列（配列番号４１８２６）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－ＩＩドメインを含む、実施形態ＩＩＩ－３８～ＩＩＩ－４２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４４．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号１４５の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－３８～ＩＩＩ－４３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４５．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、１つ以上のドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態ＩＩＩ－３８～ＩＩＩ－４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４６．少なくとも１つの改変が、
ａ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
ｂ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
ｃ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態ＩＩＩ－４５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４７．Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択される配列番号４１８１８に対するＮＴＳＢドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５又はＩＩＩ－４６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４８．ＮＴＳＢドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変が、配列番号４１８１８に対して２位のＧの挿入、４位のＩの挿入、４位のＬの挿入、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、３０位のＳの欠失、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－４７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－４９．Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９ Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択される配列番号４１８１９に対するヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－４８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５０．ヘリックスＩ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変が、配列番号４１８１９に対して、２４位のＴの挿入、２５位のＣの挿入、Ｙ２９Ｆ、Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、３２位のＧの欠失、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、１３８位のＱの挿入、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－４９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５１．Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択される配列番号４１８２０に対するヘリックスＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－５０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５２．ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号４１８２０に対して、２位のＡの挿入、２位のＨの挿入、２位のＬの欠失及び３位のＶの欠失、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、３位のＶの欠失、３位のＤの挿入、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、４位のＥの欠失、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、６位のＱの挿入、７位のＧの挿入、９位のＨの挿入、９位のＡの挿入、ＶＤ１０、０位のＴ１の挿入、１０位のＶの欠失、１０位のＦの挿入、１１位のＤの挿入、１１位のＤの欠失、Ｄ１１Ｓ、１２位のＷの欠失、Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、１２位のＰの挿入、１３位のＱの挿入、１２位のＧの挿入、１３位のＲの挿入、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、１３位のＤの挿入、Ｗ１３Ｌ、１４位のＰの挿入、１４位のＤの挿入、１４位のＤの欠失及び１５位のＭの欠失、１５位のＭの欠失、１６位のＴの挿入、１７位のＰの挿入、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、２５位のＧの挿入、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、３７位のＳの挿入、３７位のＬの欠失及び３８位のＡの欠失、Ｋ４１Ｌ、４２位のＲの挿入、４３位のＱの欠失及び４４位のＥの欠失、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、７９位のＥの挿入、８１位のＴの挿入、８１位のＲの挿入、８１位のＷの挿入、８１位のＹの挿入、８２位のＷの挿入、８２位のＹの挿入、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、８５位のＬの挿入、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、１０９位のＫの挿入、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、１１０位のＲの欠失、Ｄ１１４Ｅ、１１４位のＤの挿入、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、１３３位のＣの挿入、１３４位のＳの挿入、１３４位のＧの挿入、１３５位のＲの挿入、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、１３８位のＥの欠失、Ｄ１４０Ｒ、１４０位のＤの挿入、１４１位のＰの挿入、１４２位のＤの挿入、１４３位のＥの欠失及び１４４位のＦの欠失、１４３位のＱの挿入、Ｆ１４４Ｋ、１４４位のＦの欠失、１４４位のＦの欠失及び１４５位のＣの欠失、Ｃ１４５Ｒ、１４５位のＧの挿入、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、１４８位のＶの挿入、Ｅ１４８Ｄ、１４９位のＨの挿入、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、並びに１６７位のＦの挿入からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－５１のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５３．Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される配列番号４１８２１に対するＲｕｖＣ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－５２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５４．ＲｕｖＣ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号４１８２１に対して、４位のＩの挿入、５位のＳの挿入、６位のＴの挿入、６位のＮの挿入、７位のＲの挿入、７位のＫの挿入、８位のＨの挿入、８位のＳの挿入、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、１３７位のＰの挿入、１４１位のＬの欠失、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、１４２位のＱの挿入、１４３位のＲの挿入、１４３位のＮの挿入、Ｅ１４４Ｎ、１４６位のＰの挿入、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、１５２位のＲの挿入、Ｈ１５３の挿入、Ｔ１５５Ｑ、１５５位のＨの挿入、１５５位のＲの挿入、１５６位のＬの挿入、１５６位のＬの欠失、１５６位のＷの挿入、１５７位のＡの挿入、１５７位のＦの挿入、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、１５９位のＹの欠失、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、１６１位のＩの挿入、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、１６３位のＮの挿入、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－５３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５５．Ｉ３、Ｋ４、Ｒ５、Ｉ６、Ｎ７、Ｋ８、Ｋ１５、Ｄ１６、Ｎ１８、Ｐ２７、Ｍ２８、Ｖ３３、Ｒ３４、Ｍ３６、Ｒ４１、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｅ５２、Ｐ５５、及びＱ５６からなる群から選択される配列番号４１８２２に対するＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－５４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５６．ＯＢＤ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号４１８２２に対して、３位のＧの挿入、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、４位のＧの挿入、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、５位のＰの挿入、５位のＧの挿入、Ｒ５Ｓ、５位のＳの挿入、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、６位のＧの挿入、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、１６位のＦの挿入、Ｆ１８の挿入、２７位のＰの挿入、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、４８位のＰの挿入、Ｅ５２Ｐ、５５位のＰの挿入、５５位のＰの欠失及び５６位のＱの欠失、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、５６位のＤの挿入、５６位のＴの挿入、並びにＱ５６Ｐからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－５５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５７．Ｓ２、Ｉ３、Ｌ４、Ｋ１１、Ｖ２４、Ｋ３７、Ｒ４２、Ａ５３、Ｔ５８、Ｋ６３、Ｍ７０、Ｉ８２、Ｑ９２、Ｇ９３、Ｋ１１０、Ｌ１２１、Ｒ１２４、Ｒ１４１、Ｅ１４３、Ｖ１４４、及びＬ１４５からなる群から選択される配列番号４１８２３に対するＯＢＤ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－５６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５８．ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号４１８２３に対して、２位のＳの欠失、Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、３位のＩの欠失及びＬ４の欠失、４位のＬの欠失、Ｋ１１Ｔ、２４位のＰの挿入、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、５３位のＳの挿入、５８位のＲの挿入、６３位のＫの欠失、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、９３位のＡの挿入、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、１２４位のＡの挿入、１４１位のＲの挿入、１４３位のＤの挿入、１４３位のＡの挿入、１４４位のＷの挿入、及び１４５位のＡの挿入からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－５７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－５９．Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択される配列番号４１８２５に対するＴＳＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６０．ＯＢＤ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号４１８２５に対して、１位のＭの挿入、２位のＮの欠失、２位のＶの挿入、Ｃ３Ｓ、４位のＧの挿入、４位のＷの挿入、Ｆ５Ｐ、７位のＷの挿入、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、６７位のＡの挿入、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、８０位のＳの欠失、８１位のＧの欠失、８２位のＥの挿入、８２位のＮの挿入、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－５９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６１．発現されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号２又は配列番号１４５と比較して改善された特徴を示し、改善された特徴が、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸の切断に対する編集特異性の改善、標的核酸のオフターゲット編集又は切断の減少、編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、及び融合特性の改善を含む、実施形態ＩＩＩ－４５～ＩＩＩ－６０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６２．改善された特徴が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、実施形態ＩＩＩ－６１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６３．改善された特徴が、配列番号１４５の配列の切断活性と比較して、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、実施形態ＩＩＩ－６２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６４．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列のスコアと比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態ＩＩＩ－６３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６５．改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、ＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、実施形態ＩＩＩ－６３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６６．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列のスコアと比較して、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態ＩＩＩ－６５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６７．改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、実施形態ＩＩＩ－６２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６８．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列のスコアと比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｌｏｇ２又はそれ以上大きい濃縮スコアである、実施形態ＩＩＩ－６７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－６９．改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、標的核酸配列の切断に対する特異性の増加を含む、実施形態ＩＩＩ－６１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７０．特異性の増加が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列と比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｌｏｇ２又はそれ以上大きい濃縮スコアである、実施形態ＩＩＩ－６９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７１．改善された特徴が、標的核酸配列のオフターゲット切断の減少を含む、実施形態ＩＩＩ－６１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７２．コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｊ（ＣａｓＰｈｉ）、及びＣａｓＸからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－３７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７３．コードされたＣａｓＸが、配列番号１～３、４９～１６０、及び４０２０８～４０３６９からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－７２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７４．コードされたＣａｓＸが、配列番号１～３、４９～１６０、４０２０８～４０３６９及び４０８２８～４０９１２の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩＩ－７２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７５．ポリヌクレオチドのＣａｓＸ配列が、表２１に示される配列番号４０５７７～４０５８８からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－７２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７６．ポリヌクレオチドのＣａｓＸ配列が、表２１に示される配列番号４０５７７～４０５８８からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩＩ－７２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７７．ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列に連結された１つ以上のＮＬＳをコードする、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７８．１つ以上のＮＬＳをコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩＩ－７７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－７９．１つ以上のＮＬＳをコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の３’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩＩ－７８又はＩＩＩ－７９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８０．ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのＮＬＳをコードし、少なくとも２つのＮＬＳをコードする配列が、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の５’末端及び３’末端又はその近傍に位置する、実施形態ＩＩＩ－７８又はＩＩＩ－７９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８１．１つ以上のコード化されたＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９６）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２４８）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４１８２７）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９５）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号４０１８８）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号４０１８９）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号４０１９０）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号４０１９１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０１９４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４０１９５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０１９６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号４０７１０）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号４０１９８）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４１８２８）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０２００）からなる配列の群から選択され、１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、ＣＲＩＳＰＲバリアント又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号４０２０１）、（ＧＳ）ｎ（配列番号４０２０２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０８）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１０）、ＧＧＳＧ（配列番号２１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１６）、ＧＰＧＰ（配列番号２１７）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１８）、ＰＰＰＧ（配列番号４０２０７）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１９）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０２０３）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号４０２０４）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０２０５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号４０２０６）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－７７～ＩＩＩ－８０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８２．１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１５及び表１６に示される配列番号４０４４３～４０５０１、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－７７～はＩＩＩ－８０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８３．１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１５及び表１６に示される配列番号４０４４３～４０５０１からなる配列の群から選択される、実施形態ＩＩＩ－７７～ＩＩＩ－８０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８４．コードされた第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－８３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８５．コードされた第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－８４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８６．コードされた第１のｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－８５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８７．標的化配列が１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－８６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８８．第２のｇＲＮＡと、第２のｇＲＮＡに作動可能に連結された第３のプロモーターとをコードする配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－８７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－８９．第３のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、実施形態ＩＩＩ－８８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９０．第３のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１（（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６（（双方向性Ｕ６プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、及びヒトＨ１プロモーターからなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－８８又はＩＩＩ－８９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９１．第３のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１、ＢｉＵ６、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、又はヒトＨ１プロモーターの短縮型バリアントである、実施形態ＩＩＩ－９０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９２．第３のプロモーターが、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９３．第３のプロモーターが、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９４．第３のプロモーターが、表９に示される配列番号４０４０１～４０４２０及び４１０１０～４１０２９、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９５．第３のプロモーターが、第２のｇＲＮＡの転写を増強する、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９６．コードされた第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９７．コードされた第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列を含む、実施形態ＩＩＩ－８８～ＩＩＩ－９５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９８．コードされた第２のｇＲＮＡが、実施形態ＩＩＩ－８６又は実施形態ＩＩＩ－８７に記載の標的核酸とは異なる標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－８９～ＩＩＩ－９７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－９９．標的化配列が１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態ＩＩＩ－９８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１００．標的化配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－８６～ＩＩＩ－９９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０１．標的化配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－８６～ＩＩＩ－９９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０２．コードされた第１及び第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、１つ以上の改変が、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす、実施形態ＩＩＩ－８６～ＩＩＩ－１０１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０３．１つ以上の改変が、表２８に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含む、実施形態ＩＩＩ－１０２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０４．改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、スキャフォールドステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、実施形態ＩＩＩ－１０２又はＩＩＩ－１０３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０５．発現されたｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、実施形態ＩＩＩ－１０２～ＩＩＩ－１０４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０６．コードされた第１及び第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３９と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、１つ以上の改変が、発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす、実施形態ＩＩＩ－８４～ＩＩＩ－１０１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０７．１つ以上の改変が、表２９に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含む、実施形態ＩＩＩ－１０６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０８．改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、スキャフォールドステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、実施形態ＩＩＩ－１０６又はＩＩＩ－１０７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１０９．発現されたｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、実施形態ＩＩＩ－１０６～ＩＩＩ－１０８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１０．配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ５４、Ｇ６４、Ａ８８、及びＡ９５からなる群から選択される位置に１つ以上の改変を含む、実施形態ＩＩＩ－１０６～ＩＩＩ－１０９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１１．配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位のＧの挿入、６４位のＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる群から選択される１つ以上の改変を含む、実施形態ＩＩＩ－１１０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１２．配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位のＧの挿入、６４位のＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる改変を含む、実施形態ＩＩＩ－１１１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１３．改善された特徴が、シュードノットステム安定性、三重鎖領域安定性、スキャフォールドバブル安定性、拡張ステム安定性、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１０６～ＩＩＩ－１１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１４．配列番号２２３９の配列と比較して、６４位のＣの挿入及びＡ８８Ｇ置換が、伸長ステムの非対称バルジエレメントを分離し、ｇＲＮＡ足場の伸長ステムの安定性を増強する、実施形態ＩＩＩ－１１２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１５．Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、及びＡ９５Ｇの置換が、ｇＲＮＡ足場の三重鎖領域の安定性を増加させる、実施形態ＩＩＩ－１１２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１６．Ａ２９Ｃの置換が、シュードノットステムの安定性を増加させる、実施形態ＩＩＩ－１１２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１７．アクセサリエレメントが、サイトメガロウイルス最初期イントロンＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、及びヒト熱ショックタンパク質７０ ｍＲＮＡ（Ｈｓｐ７０）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）である、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１８．アクセサリエレメントが、表１２に示される配列番号４０４３１～４０４４２、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択されるＰＴＲＥである、実施形態ＩＩＩ－１１７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１１９．５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２０．５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ２に由来する、実施形態ＩＩＩ－１１９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２１．表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７の配列からなる群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２２．表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７の配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２３．表２６の配列からなる群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２４．表２６の配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２５．表２６に示される１～１７４、１７７～１８６、及び１８８～１９８の構築物の群から選択される構築物の配列を含む、実施形態ＩＩＩ－１２４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２６．配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６の配列からなる群から選択される標的化配列を更に含み、標的化配列が、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端に連結されている、実施形態ＩＩＩ－１２３～ＩＩＩ－１２５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２７．５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、配列のＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されている、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２８．５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、及びポリ（Ａ）、並びにアクセサリエレメントからなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む、実施形態ＩＩＩ－１２７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１２９．５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、及びポリ（Ａ）、並びにアクセサリエレメントからなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドを欠いている、実施形態ＩＩＩ－１２７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１３０．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のためにコドン最適化された１つ以上のＡＡＶ成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１２７～ＩＩＩ－１２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１３１．ポリヌクレオチドが、図２４、図３３～図３５、又は図４２のいずれか１つに示される構築物の構成を有する、実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態ＩＩＩ－１３２．ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質、及びｂ）実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）。
実施形態ＩＩＩ－１３３．ＡＡＶカプシドタンパク質が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、実施形態ＩＩＩ－１３２に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３４．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、同じ血清型のＡＡＶに由来する、実施形態ＩＩＩ－１３３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３５．ＡＡＶカプシドタンパク質並びに５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶの異なる血清型に由来する、実施形態ＩＩＩ－１３３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３６．５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２に由来する、実施形態ＩＩＩ－１３５に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３７．ｒＡＡＶによる細胞の形質導入時に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡが発現されることができる、実施形態ＩＩＩ－１３２～ＩＩＩ－１３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３８．発現時に、ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる、実施形態ＩＩＩ－１３７に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１３９．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されたＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、発現時にそれらの機能特性を実質的に保持する、実施形態ＩＩＩ－１３７又はＩＩＩ－１３８に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４０．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されたＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、ｒＡＡＶと比較して、免疫応答を誘導するより低い能力を示し、ＡＡＶポリヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のために改変されていない、実施形態ＩＩＩ－１３７又はＩＩＩ－１３８に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４１．免疫応答を誘導するより低い能力が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される炎症反応の１つ以上のマーカーの産生を検出するように設計されたインビトロ哺乳動物細胞アッセイにおいて示される、実施形態ＩＩＩ－１４０に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４２．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されたＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含むｒＡＡＶが、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％少ない、１つ以上の炎症マーカーの産生の減少を誘発する、実施形態ＩＩＩ－１４１に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４３．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されたＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含むｒＡＡＶの用量の対象への投与が、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶの投与用量と比較して、免疫応答の低下を誘発する、実施形態ＩＩＩ－１４０に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４４．免疫応答の低下が、対象における抗ｒＡＡＶ抗体の産生の減少又はｒＡＡＶ成分に対する遅延型過敏症反応である、実施形態ＩＩＩ－１４３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４５．免疫応答の低下が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、対象の血液中の１つ以上の炎症マーカーの測定によって決定され、１つ以上のマーカーが、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減される、実施形態ＩＩＩ－１４３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４６．対象が、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及び非ヒト霊長類から選択される、実施形態ＩＩＩ－１４３～ＩＩＩ－１４５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４７．対象が、ヒトである、実施形態ＩＩＩ－１４３～ＩＩＩ－１４５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
実施形態ＩＩＩ－１４８．実施形態ＩＩＩ－１３２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
実施形態ＩＩＩ－１４９．哺乳動物細胞の集団において標的核酸を改変するための方法であって、複数の細胞を有効量の実施形態ＩＩＩ－１３２～ＩＩＩ－１４７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶと接触させることを含み、発現されたｇＲＮＡによって標的化される細胞の遺伝子の標的核酸が、発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質によって改変される、方法。
実施形態ＩＩＩ－１５０．細胞の遺伝子が、１つ以上の変異を含む、実施形態ＩＩＩ－１４９に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５１．改変することが、細胞集団の標的核酸において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態ＩＩＩ－１４９又はＩＩＩ－１５０に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５２．遺伝子が、ノックダウン又はノックアウトされている、実施形態ＩＩＩ－１４９～ＩＩＩ－１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５３．遺伝子が、機能的遺伝子産物が発現され得るように改変される、実施形態ＩＩＩ－１４９～ＩＩＩ－１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５４．対象の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる対象における疾患を治療するための方法であって、治療有効用量の実施形態ＩＩＩ－１３２～ＩＩＩ－１４５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶを対象に投与することを含む、方法。
実施形態ＩＩＩ－１５５．ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態ＩＩＩ－１４９に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５６．ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態ＩＩＩ－１５４に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５７．ｒＡＡＶが、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、眼球内又は腹膜内経路から選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が注射、輸血、又は移植である、実施形態ＩＩＩ－１５４～ＩＩＩ－１５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５８．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１４９～ＩＩＩ－１５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１５９．対象が、ヒトである、実施形態ＩＩＩ－１４９～ＩＩＩ－１５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６０．ｒＡＡＶベクターを作製する方法であって、
ａ．パッケージング細胞の集団を提供することと、
ｂ．細胞集団を
ｉ）実施形態ＩＩＩ－１～ＩＩＩ－１３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
ｉｉ）ａａｐ（アセンブリ）遺伝子を含むベクター、並びに
ｉｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐゲノムを含むベクター、でトランスフェクトすることと、を含む、方法。
実施形態ＩＩＩ－１６１．パッケージング細胞が、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１６０に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６２．方法が、ｒＡＡＶベクターを回収することを更に含む、実施形態ＩＩＩ－１６０又はＩＩＩ－１６１に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６３．ＡＡＶポリヌクレオチドの成分配列が、単一のｒＡＡＶ粒子に包含される、実施形態ＩＩＩ－１６０～ＩＩＩ－１６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６４．ｒＡＡＶの免疫原性を低下させる方法であって、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択されるＡＡＶ成分配列の配列のＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部を欠失させることを含む、方法。
実施形態ＩＩＩ－１６５．１つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む、実施形態ＩＩＩ－１６４に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６６．１つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドを欠いている、実施形態ＩＩＩ－１６５に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６７．１つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１６４～ＩＩＩ－１６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６８．ｒＡＡＶが、インビトロ哺乳動物細胞アッセイにおいて、ＣｐＧジヌクレオチドが欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、炎症反応の１つ以上のマーカーの産生を誘導するより低い能力を示し、１つ以上の炎症マーカーが、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、実施形態ＩＩＩ－１６４～ＩＩＩ－１６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１６９．ｒＡＡＶが、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％少ない、１つ以上の炎症マーカーの産生の減少を誘発する、実施形態ＩＩＩ－１６８に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７０．ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されたＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含むｒＡＡＶの用量の対象への投与が、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶの投与用量と比較して、免疫応答の低下を誘発する、実施形態ＩＩＩ－１６４～ＩＩＩ－１６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７１．免疫応答の低下が、対象における抗ｒＡＡＶ抗体の産生の低下又はｒＡＡＶ成分に対する遅延型過敏反応である、実施形態ＩＩＩ－１７０に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７２．免疫応答の低下が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、対象の血液中の１つ以上の炎症マーカーの測定によって決定され、１つ以上のマーカーが、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減される、実施形態ＩＩＩ－１７０に記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７３．対象が、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及び非ヒト霊長類から選択される、実施形態ＩＩＩ－１６４～ＩＩＩ－１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７４．対象が、ヒトである、実施形態ＩＩＩ－１６４～ＩＩＩ－１７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態ＩＩＩ－１７５．それを必要とするヒトの治療のための医薬品として使用するための、実施形態ＩＩＩ－１３２～ＩＩＩ－１４７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶの組成物。
本明細書は、多数の例示的な構成、方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、かかる説明は、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。以下の実施例は、例示の目的のために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１：小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、インビトロでＡＡＶエピソームから発現された場合にゲノムを編集することができる。
実験を行って、小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、インビトロでＡＡＶプラスミド又はＡＡＶベクターから発現された場合にゲノムを編集することができることを実証した。
材料及び方法：
ＡＡＶ導入遺伝子は、ＩＴＲ間で異なる部分に概念的に分解され、これは、治療カーゴ及び哺乳動物細胞における治療カーゴの発現に関連するアクセサリエレメントからなっていた。ＡＡＶベクター学は、部分リストを同定し、続いて哺乳動物細胞においてプラスミド及びＡＡＶ形態の両方でベクターを設計し、構築し、試験することからなった。その成分の概略的な１つの構成を図１に示す。
この第１の実施例では、３つのプラスミドを構築し（構築物１、構築物２、及び構築物３、成分配列については表２６を参照）、ＩＴＲ間のプラスミド配列における唯一の差異は、親和性タグ領域にあった。
クローニング及びＱＣ：
ＡＡＶベクターを、予め消化されたＡＡＶ骨格、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに隣接する５’及び３’ＤＮＡ配列からなる４パートＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを用いてクローニングした。５’配列はエンハンサー、タンパク質プロモーター及びＮ末端ＮＬＳを含み、３’配列はＣ末端ＮＬＳ、ＷＰＲＥ、ポリ（Ａ）シグナル、ＲＮＡプロモーター及びｔＤＴｏｍａｔｏ（ＤＮＡ配列：ＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号４０８００））を標的とするスペーサー１２．７を含有するガイドＲＮＡを含んでいた。５’及び３’部分を、Ｔｗｉｓｔから遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、Ｔ４リガーゼ及びＢｂｓＩを使用する循環的Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を介してＡＡＶベクターに組み立てた。
次いで、構築されたＡＡＶベクターを、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｂｌ３ｓ）に形質転換した。形質転換された細胞を３７℃の振盪インキュベーター中で１時間回収し、カナマイシンＬＢ－寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で１２～１６時間増殖させた。コロニーＰＣＲを実施して、完全な導入遺伝子を含有するクローンを決定した。正しいクローンをカナマイシンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に接種し、一晩増殖させた。次いでプラスミドを翌日にミディプレップし、配列を確認した。ミディプレップの品質を評価するために、構築物を、ＸｍａＩ（ＩＴＲのそれぞれにおいて切断する）及びＸｈｏＩ（ＡＡＶゲノムにおいて１回切断する）を用いた制限消化において処理した。次いで、消化物及び未切断構築物を１％アガロースゲル上で泳動し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ上で画像化した。プラスミドが＞９０％スーパーコイル化され、正しいサイズであり、ＩＴＲが無傷である場合、構築物をヌクレオフェクション及び／又は形質導入によって試験した。
プラスミドヌクレオフェクションの方法：
ＡＡＶゲノムを含有するプラスミドを、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、Ａｉ９－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ）から単離されたマウス不死化神経前駆細胞（ＮＰＣ）株にトランスフェクトした。簡潔には、Ａｉ９は、ＣＡＧプロモーター駆動ｔｄＴｏｍａｔｏマーカーの転写を防止するｌｏｘＰ隣接停止カセットを有するように設計されたＣｒｅレポーターツール株である。Ａｉ９マウス又はＡｉ９ ｍＮＰＣは、停止カセットを除去するためのＣｒｅ媒介性組換え後にｔｄＴｏｍａｔｏを発現する。配列検証されたプラスミドを２００ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ及び２５ｎｇ／μＬの濃度に希釈し、それぞれ５μＬ（１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇ）を２００，０００ ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣを含有するＰ３溶液に添加した。プログラムＥＨ－１００に従ってＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、合わせた溶液をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、溶液を、予め平衡化したｍＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１：１０００ ２－メルカプトエタノール、１Ｘ Ｂ－２７サプリメントを含み、ビタミンＡ１ＸＮ２を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２；増殖因子ｂＦＧＦ及びＥＧＦ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を補充）でクエンチした。次いで、この溶液を、ＰＬＦ（１Ｘポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、滅菌ｄｉＨ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ、１Ｘラミニン、及び１Ｘフィブロネクチン）でコーティングした９６ウェルプレートに３連で分注した（ウェル当たり約６７，０００細胞）。トランスフェクションの４８時間後、処理した細胞に、増殖因子を含有する新鮮なｍＮＰＣ培地を補充した。トランスフェクションの５日後、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣをリフトし、活性をＦＡＣＳによって評価した。
ＡＡＶ産物：
懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で増殖させた。スクリーニング目的のために、小規模培養物（２０～３０ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ中で培養し、１１０ｒｐｍで撹拌した）を、トランスフェクションの日に１．５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンを含まないｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離して、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を細胞破片を含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、次いで、０．４５μＭフィルターを使用して更に清澄化した。
ウイルスゲノム力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＣＭＶプロモーター領域（Ｆｗｄ ５’－ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡ－３’（配列番号４０８０１））、Ｒｅｖ ５’－ＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣ－３’（配列番号４０８０２））、プローブ５’－ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧ－３’（配列番号４０８０３））、又はＡＡＶ２－ＩＴＲ内に位置する６２ヌクレオチド断片（Ｆｗｄ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号４０８０４）、Ｒｅｖ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号４０８０５）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’）を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドの１０倍連続希釈（２ｅ＋９～２ｅ＋４ ＤＮＡコピー／ｍＬの各５μＬ）を参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５℃で５分間の初期変性ステップ、その後、９５℃で１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル行った。
ＡＡＶ形質導入：
１０，０００細胞／ウェルのｍＮＰＣを、ＡＡＶ形質導入の４８時間前に、９６ウェルプレート中のＰＬＦコーティングウェル上に播種した。全てのウイルス感染条件は、約１．０ｅ＋６～１．０ｅ＋４ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（multiplicity of infection、ＭＯＩ）の一連の３倍希釈で、実験ベクター間のｖｇ数を正規化して、３連で行った。ｂＦＧＦ／ＥＧＦ増殖因子（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した予め平衡化したｍＮＰＣ培地で希釈した最終体積５０μＬのＡＡＶベクターを各ウェルに適用した。トランスフェクションの４８時間後、完全な培地交換を、増殖因子を補充した新鮮な培地で行った。編集活性（ｔｄＴ＋細胞定量）を、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。
ＦＡＣＳによる活性評価方法：
トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣをｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥで１５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。再懸濁した細胞を丸底９６ウェルプレートに移し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、１×ＤＡＰＩを含有するｄＰＢＳで再懸濁し、プレートをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターオートサンプラーにロードした。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを、以下のゲーティングパラメータを使用して実行した：細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＳＳＣ－Ａ、単一細胞を選択するためのＦＳＣ－ＨｘＦＳＣ－Ａ、ＤＡＰＩ陰性生存細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＶＬ１－Ａ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＹＬ１－Ａ。
結果
図２のグラフは、ｔｄＴｏｍａｔｏ停止カセットを標的とするスペーサー１２．７を有するＣａｓＸバリアント４９１及びガイドバリアント１７４が、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、ｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することができたことを示す（ＦＡＣＳによってｔｄＴｏｍ＋である細胞のパーセンテージによって測定される）。試験したベクターの中で、構築物３（８０％ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞を有する）において送達されたＣａｓＸ ４９１．１７４は、他のものよりも性能が優れていた。図３は、試験した３つ全てのベクターが、用量依存的にｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座で編集を達成したことを示す。図４は、ＡＡＶベクター中の構築物３を用いた編集の結果を示し、これは用量依存的応答を実証し、高度の編集を達成した。
実験は、小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）及び標的化ガイドが、インビトロでＡＡＶ導入遺伝子プラスミド又はエピソームから発現された場合にゲノムを編集することができることを実証する。
実施例２：ＡＡＶベクター内への小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系のパッケージング
実験を行って、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡなどの小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の系がコードされ、単一のＡＡＶベクター内に効率的にパッケージ化され得ることを実証した。
材料及び方法：
この実験のために、実施例１に記載されるようなＡＡＶ産生、精製及び特徴付けのための方法を使用して、ＣａｓＸバリアント４３８、ｇＲＮＡ足場１７４及びスペーサー１２．７をパッケージングする導入遺伝子を有するＡＡＶベクターを生成した。特徴付けのために、ＡＡＶウイルスゲノムをｑＰＣＲによって力価測定し、走査透過電子顕微鏡（scanning transmission electron microscopy、ＳＴＥＭ）を使用して空－完全比を定量した。ＡＡＶを１％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、可視化した。空の粒子は、カプシドの中心の濃い電子密度の円の存在によって同定された。
結果
ＡＡＶ調製物についてのゲノムＤＮＡ力価（ｑＰＣＲによる）は、１ＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物から生成された６ｅ１２ｖｇ／ｍＬであると測定された。図５は、このＡＡＶ製剤中の粒子の推定９０％がウイルスゲノム（例えば、完全）を含有していたことを示す走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）顕微鏡写真からの画像である。実験の条件下で、結果は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡが単一のＡＡＶベクター粒子に効率的にパッケージ化され得、高い力価及び高いパッケージング効率をもたらすことを実証する。
実施例３：ＡＡＶエピソームから発現された小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質によるゲノムのインビボ編集
実験を行って、ＣａｓＸなどの小型クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＡＡＶエピソームからインビボで発現された場合にゲノムを編集することができることを実証した。
材料及び方法：
この実験のために、ＡＡＶベクターを、実施例１に記載されるようなＡＡＶ産生、精製及び特徴付けのための方法を使用して生成した。
インビボでのＡＡＶ投与及び組織処理：
Ａｉ９マウスからのＰ０－Ｐ１仔に、ＣａｓＸバリアント４９１及びスペーサー１２．７を有するガイドバリアント１７４をコードする導入遺伝子を有するＡＡＶを注射した。簡潔には、マウスを寒冷麻酔し、１～２μＬのＡＡＶベクター（約１ｅ１１ウイルスゲノム（ｖｇ））を脳室内（ＩＣＶ）空間に、３３ゲージ針（小型ハブＲＮ ＮＤＬカスタム長０．５インチ、ポイント４（４５度））を装着したハミルトンシリンジ（１０μＬ、モデル１７０１ ＲＮ ＳＹＲカタログ番号：７６５３－０１）を使用して片側注射した。注射後、仔を温かい加熱パッド上で回復させた後、ケージに戻した。ＩＣＶ注射の１ヶ月後、動物をケタミン／キシラジンの腹腔内注射で終末麻酔し、生理食塩水及び固定液（４％パラホルムアルデヒド）で経心的に灌流した。脳を解剖し、更に４％ＰＦＡで後固定した後、３０％スクロース溶液を浸潤させ、ＯＣＴ化合物に包埋した。ＯＣＴ包埋脳を、クリオスタットを用いて冠状に切片化した。次いで、切片をスライド上に載せ、細胞核を標識するためにＤＡＰＩで対比染色し、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡で画像化した。画像はＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して処理し、編集レベルは、ｔｄＴｏｍ＋細胞の数をＤＡＰＩ標識核のパーセンテージとして計数することによって定量化した。
末梢組織、特に肝臓及び心臓における編集を評価するためのその後の実験では、Ａｉ９マウスからのＰ０－Ｐ１仔を寒冷麻酔し、４０μＬ容量中の同じＡＡＶ構築物の約１ｅ１２ウイルスゲノム（ｖｇ）を静脈内注射した。注射後、仔を温かい加熱パッド上で回復させた後、ケージに戻した。投与の１ヶ月後、動物を終末麻酔し、心臓及び肝臓組織を剖検し、上記のように処理した。
結果：
図６は、ＡＡＶパッケージングＣａｓＸバリアント４９１及びスペーサー１２．７を有するガイド１７４のＩＣＶ注射に対する、ＡＡＶパッケージングＣａｓＸバリアント４９１及びスペーサー１２．７を有するガイド足場１７４のＩＣＶ注射（上）を投与したＡｉ９マウスから処理され、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールで染色された脳組織の比較免疫組織化学（immunohistochemistry、ＩＨＣ）画像を提供する。ｔｄＴｏｍチャネル内の細胞からのシグナルは、これらの細胞内のｔｄＴｏｍ遺伝子座が首尾よく編集されたことを示す。ｔｄＴｏｍ＋細胞（白色）は、脳の全領域にわたって均一に分布しており、コードされたＣａｓＸ、ガイド及びスペーサーをパッケージングするＩＣＶ投与されたＡＡＶが、非標的化対照（下パネル）と比較して、これらの細胞（上パネル）に到達し、編集することができることを示す。図６の画像は、各群について３匹のマウスから得られた画像の代表である。追加的に、図５９Ａ（肝臓）及び５９Ｂ（心臓）に提示される結果は、ＡＡＶが肝臓及び心臓内に分布し（白色の編集された細胞）、インビボで単一のＡＡＶエピソームから発現された場合にゲノムを編集することができたことを実証する。
結果は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）及び標的化ガイドをコードするＡＡＶが、局所的に（脳）又は全身的に送達された場合に組織内に分布し、単一のＡＡＶエピソームから発現された場合インビボにゲノムを編集することができることを実証する。
実施例４：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、ＡＡＶベクタータンパク質プロモーターの選択によって増強される
実験を行って、ＣａｓＸなどの小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質発現が、コードされたタンパク質のためのＡＡＶ構築物中の異なるプロモーターを利用することによって増強され得ることを実証した。ＡＡＶ導入遺伝子におけるカーゴ空間は、ＣａｓＸと組み合わせた短いプロモーターの使用により最大化することができる。追加的に、実験を行って、Ｃａｓ９などのより大きなＣＲＩＳＰＲタンパク質と組み合わされた場合、そうでなければ長すぎてＡＡＶベクターに効率的にパッケージ化されないプロモーターの使用によって発現を増強することができることを実証した。小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を増強するための長い細胞型特異的プロモーターの使用は、本明細書に記載されるＡＡＶ系に対する利点であり、他のＣＲＩＳＰＲタンパク質のサイズに起因して従来のＣＲＩＳＰＲ系では不可能である。
材料及び方法：
クローニング及びＱＣを実施例１に記載したように行った。プロモーターバリアントを、ＡＡＶ－ｃｉｓプラスミド中のＣａｓＸタンパク質の上流にクローニングした。ＣａｓＸ（表２１）及び１つ以上のｇＲＮＡ（表１８及び表１９）をコードする配列を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
プラスミドヌクレオフェクションの方法：
不死化神経前駆細胞を、実施例１に記載のようにヌクレオフェクトした。配列検証されたプラスミドを２００ｎｇ／ｕｌ、１００ｎｇ／ｕｌ、５０ｎｇ／μＬ及び２５ｎｇ／μＬの濃度に希釈し、それぞれ５μＬ（１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇ）を２００，０００ ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣを含有するＰ３溶液に添加した。
ＡＡＶウイルス産生及びＱＣ、並びにＦＡＣＳによるｍＮＰＴＣ－ｔｄＴ細胞におけるＡＡＶ形質導入及び編集レベル評価を、実施例１に記載されるように行った。
結果
図７の結果は、ＣａｓＸタンパク質４３８、足場バリアント１７４、及びｔｄＴｏｍａｔｏ停止カセットを標的とするスペーサー（配列ＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号４０８００）を有するスペーサー１２．７）を有するいくつかの異なるプロモーターが、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、１０００ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて標的ストップカセットを編集することを実証する。これらのプロモーターは、７００ヌクレオチドを超える長さから８１ヌクレオチドという短い長さまでの範囲であった（表８）。試験したプロモーターの中で、構築物７及び１４は、かなりの編集効力を示した。
図８の結果は、ＣａｓＸバリアント４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７と組み合わせたいくつかの短いプロモーターが、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合に、５００ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを実証する。５８４ヌクレオチドのプロモーターを有する構築物２を除いて、全ての構築物は、２５０ヌクレオチド長未満のプロモーターを有した。試験したタンパク質プロモーターの中で、構築物１５は、特にその短い長さ（８１ヌクレオチド）を考慮すると、かなりの編集効力を示した。
図９の結果は、ＣａｓＸバリアント４９１及びスペーサー１２．７を有する足場バリアント１７４を有する４つのリードプロモーターが、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、１２５ｎｇ及び６２．５ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを実証する。構築物４、５及び６は、４００ヌクレオチド以下のプロモーター長を有し、したがって、ＡＡＶカーゴ容量を最小限に抑えながら編集効力を最大にすることができる。
図１０の結果は、ＡＡＶにおける４つのプロモーターバリアントの使用も強力な編集をもたらすことを実証する。簡潔には、ＡＡＶ（ＡＡＶ．３、ＡＡＶ．４、ＡＡＶ．５及びＡＡＶ．６）を、それぞれ導入遺伝子構築物３～６を用いて生成した。各構築物は、標的遺伝子座において用量依存的編集を示した（図１０、左パネル）。２ｅ５のＭＯＩで、ＡＡＶ．４は、標的遺伝子座において３８％±３％の編集を示し、他の構築物よりも優れていた（図１０、右パネル）。
図１１に示す実験では、いくつかの新しいタンパク質プロモーターを、以前に同定された上位４つのタンパク質プロモーターバリアント（ＡＡＶ．３、ＡＡＶ．４、ＡＡＶ．５及びＡＡＶ．６）と比較した。簡潔には、対応する導入遺伝子構築物を用いてＡＡＶを生成し、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣに形質導入した。形質導入の５日後に３ｅ５のＭＯＩで、複数のプロモーターが編集の改善を示した（図１１）。特に、構築物５８及び５９は、導入遺伝子サイズを最小限に抑えながら、３０％を超える編集活性を有した（図１２）。構築物５８及び５９は、構築物３よりもそれぞれ４２０及び２５８ｂｐ小さいプロモーターを含有したが、標的遺伝子座の同様の又は改善された編集をもたらした。特に、構築物５９のプロモーターにおけるイントロンの包含は、イントロンを欠く構築物５８と比較して編集の増加をもたらし、これは、ＡＡＶ構築物プロモーターにおけるイントロンの包含が有益であることを示唆する。
結果は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）の発現が、そうでなければＡＡＶゲノムのサイズ制約のために従来のＣＲＩＳＰＲタンパク質では使用できないであろう長いプロモーターを利用することによって増強され得ることを実証する。更に、短いプロモーターを小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）と組み合わせることは、発現効率を損なうことなく、ＡＡＶ導入遺伝子カーゴ容量の有意な低減を可能にする。この空間の保存は、更なるアクセサリエレメント（例えば、エンハンサー及び調節エレメント）を導入遺伝子に含めることを可能にし、これは、編集能の増加を可能にする。
実施例５：小型ＣＲＩＳＰＲ系の効力は、ＡＡＶベクターＲＮＡプロモーターの選択によって増強される。
実験を行って、ＡＡＶベクターにおいて、編集のための標的ＤＮＡを認識するガイドＲＮＡの発現のために特定のプロモーターが選択される場合、小型ＣＲＩＳＰＲ系（ＣａｓＸなど）の編集効力が増強され得ることを実証した。異なる強度を有するＲＮＡプロモーターを使用することによって、ガイドＲＮＡ発現を調節することができ、これは編集効力に影響を及ぼす。ＣａｓＸ系に基づくＡＡＶプラットフォームは、２つのガイドＲＮＡの発現のための少なくとも２つの独立したプロモーターを含むのに十分なカーゴ空間をＡＡＶに提供する。異なる発現レベルを有するプロモーターを組み合わせることによって、複数のガイドＲＮＡの発現を単一のＡＡＶ導入遺伝子内で調整することができる。保持された編集効力を生じるＲＮＡプロモーターのより短いバージョンを操作することはまた、ＡＡＶ導入遺伝子における他のアクセサリエレメントの付加のための操作空間の増加を可能にする。
材料及び方法：
実施例１の方法を、構築物のクローニング及び品質管理、並びにプラスミドヌクレオフェクション及びＡＡＶ産生、形質導入、並びにＦＡＣＳ分析のために使用した。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの配列は、表９に提示されている。ＣａｓＸ（表２１）及び１つ以上のｇＲＮＡ（表１８及び表１９）をコードする配列を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
結果
図１３に示される結果は、タンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有する３つの異なるＲＮＡプロモーターが、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを実証する。構築物３及び３２は同様の活性を有し、４２％の効率で標的遺伝子座において編集する。構築物３３は、構築物３及び３２の活性の約５６％を示す。
図１４に示される結果は、タンパク質４９１、足場バリアント１７４、及びスペーサー１２．７を有する同じ３つの異なるプロモーターが、ＡＡＶとして送達された場合、ｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを実証する。ＡＡＶ．３、ＡＡＶ．３２、ＡＡＶ．３３を、それぞれ導入遺伝子構築物３、３２及び３３を用いて生成した。各ベクターは、標的遺伝子座において用量依存的編集を示した（図１４、左パネル）。３ｅ５のＭＯＩで、ＡＡＶ．３２及びＡＡＶ．３３は、ＡＡＶ．３の効力の５０～６０％を有した（図１４、右パネル）。
図１５の結果は、タンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有するＵ６プロモーターの４つの異なる切断のうちの１つを有する構築物が、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、それぞれ、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて差次的レベルで標的停止カセットを編集することができたことを実証する。構築物８５は、基本構築物５３の３３％の効力を有したが、構築物８６、８７及び８８は、非標的化対照とのいかなる編集も示さず、非標的化対照と同等であった。
図１６は、ＡＡＶとして送達された場合の、基本構築物５３と構築物８５との間のｍＮＰＣにおける編集を比較する実験の結果を示す。ＡＡＶ．８５は、図１５からの結果と一致して、３ｅ５のＭＯＩでのＡＡＶ．５３についての１５％と比較して７％で編集することができた。
図１７の結果は、構築物５３の基本Ｕ６と比較してプロモーターのサイズを最小化するように設計された操作されたＵ６プロモーターを有し、コードされたＣａｓＸタンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有する構築物が、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて差次的レベルで標的停止カセットを編集することができたことを実証する。構築物の１つのクラスター（８９、９０、９２、９３、９６、９７、９８、及び９９）は全て、構築物５３についての５５％と比較して、１５～２０％の範囲で編集した。他のＰｏｌ ＩＩバリアント（構築物９４、９５及び１００）は全て、約３２％編集でより高いレベルの編集を示したが、構築物１０１は４８％編集をもたらした。操作されたＵ６ ＲＮＡプロモーターを有する試験された全てのＡＡＶバリアントの導入遺伝子サイズをＸ軸上に、編集されたｍＮＰＣのパーセントをＹ軸上に示す図１８の散布図に示されるように、これらのプロモーターは全て、基本構築物５３中のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターよりも小さい。
図１９の結果は、タンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有する操作されたＵ６プロモーターを有する構築物が、ＡＡＶとして送達された場合に、用量依存的様式でｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することができたことを示す。構築物ＡＡＶ．９４、ＡＡＶ．９５、ＡＡＶ．１００、及びＡＡＶ．１０１を有するＡＡＶによる編集の可変速度が見られ、全ての編集は、図１５及び図１６からのＡＡＶ．８５と同じＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを有する基本構築物ＡＡＶ．５３とＡＡＶ．８９との間の速度であった。
図２０の結果は、ＣａｓＸタンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有する操作されたＵ６プロモーターを有する構築物が、ＡＡＶとして送達された場合に、ｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することができたことを示す。構築物ＡＡＶ．９４、ＡＡＶ．９５、ＡＡＶ．１００、及びＡＡＶ．１０１を有するＡＡＶによる編集の可変速度が見られ、全ての編集は、図１５及び図１６からのＡＡＶ．８５と同じＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを有する基本構築物ＡＡＶ．５３とＡＡＶ．８９との間の速度であった。図２１は、編集対導入遺伝子サイズの散布図として結果を示す。
図６４に示される結果は、ＣａｓＸタンパク質４９１、足場バリアント１７４、及びスペーサー１２．７をコードする配列を有する合理的に操作されたＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの構築物が、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇの用量でＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとしてマウスＮＰＣにヌクレオフェクトされた場合、様々な効率で標的ｔｄＴｏｍａｔｏ停止カセットを編集することができたことを実証する。構築物１５９～１７４を、基本Ｕ６（構築物ＩＤ１５７）又はＨ１（構築物ＩＤ１５８）プロモーターと比較してプロモーターのサイズを最小化するように設計し、構築物１６０～１７４を、７ＳＫ及び／又はＵ６プロモーターからのドメインスワップの変動を有するＨ１プロモーター（構築物１５９）のコア領域に基づく短いハイブリッドバリアントとして操作した。図６４は、基本Ｕ６及びＨ１プロモーターよりも実質的に短いこれらのプロモーターバリアントのほとんどが、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとして機能して、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座における十分なｇＲＮＡ転写及び編集を駆動することができたことを示す。具体的には、構築物１５９、１６１、１６２、１６５、及び１６７は、２５０ｎｇのより高い用量で少なくとも３０％の編集を達成することができた。これらのバリアントは、標的化編集のために適切なｇＲＮＡ発現を駆動しながら、ＡＡＶカーゴ容量の有意な低減を可能にする、ＡＡＶ構築物設計におけるプロモーター代替物として機能する。
実験の結果は、小型ＣＲＩＳＰＲ系（ＣａｓＸ及びガイドなど）の発現が、代替的ＲＮＡプロモーターを利用することによって選択的に調節され得ることを実証する。ほとんどの他のＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドＲＮＡを発現するための別個のプロモーターを含むのに十分な空間を有さないが、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系は、導入遺伝子における様々な長さのいくつかの可能なｇＲＮＡプロモーターを使用して、発現及び編集を示差的に制御することを可能にする。データはまた、機能的ガイドの転写を促進する能力を保持するＰｏｌ ＩＩＩプロモーターのより短いバージョンが操作され得ることを支持する。この品質は、更なる操作又は更なるプロモーター及び／若しくはアクセサリエレメントの包含のための導入遺伝子空間を節約するために、本明細書に記載されるＡＡＶ系の重要な特徴である。更に、本発明者らの系における他のエレメントを調節することは、様々な効力を有するものを含む複数のｇＲＮＡプロモーターの組み合わせを可能にする。
実施例６：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、ＡＡＶベクターにおけるポリ（Ａ）の選択によって増強される
実験を行って、様々なポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルを利用して、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）をＡＡＶゲノム中で発現させることができることを実証した。具体的には、より小さなＣＲＩＳＰＲ系は、より大きなポリ（Ａ）シグナルの包含を可能にする。加えて、実験を行って、構築物中のより短い合成ポリ（Ａ）シグナルの包含が、ＡＡＶ導入遺伝子カーゴ容量の更なる低減を可能にすることを実証した。
材料及び方法：
クローニング及びＱＣ：
ＡＡＶゲノム内のポリ（Ａ）シグナルを制限酵素部位によって分離して、モジュールクローニングを可能にした。部分を、Ｔｗｉｓｔからの遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、対応する制限酵素で消化し、洗浄し、次いで、同様に同じ酵素で消化したベクターにライゲーションした。
実施例１の方法を、構築物のクローニング及び品質管理、並びにプラスミドヌクレオフェクション及びＦＡＣＳ分析のために使用した。ポリ（Ａ）配列の配列は、表１０に提示されている。ＣａｓＸ（表２１）及び１つ以上のｇＲＮＡ（表１８及び表１９）をコードする配列を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
プラスミドヌクレオフェクション及びＦＡＣＳによる活性評価のための方法は、実施例１に記載されているように行った。
結果：
図２２に示される結果は、ＣａｓＸバリアント４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有するいくつかの代替ポリ（Ａ）シグナルを有する構築物が、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、２５０ｎｇ及び１２５ｎｇの用量でｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することができたことを実証する。構築物３は、この実験で試験した３つの構築物の中で最も高い効力を示し、標的遺伝子座を６０％の効率（２５０ｎｇ用量）で編集した。構築物３のポリ（Ａ）配列のサイズのそれぞれ５９％及び３９％であるポリ（Ａ）配列を有する構築物２８及び２９（表１１を参照されたい）は、それぞれ２１％及び２４％（２５０ｎｇ用量）で編集された。
図２３に示される結果は、タンパク質４９１、足場バリアント１７４及びスペーサー１２．７を有する２つの異なるポリ（Ａ）シグナルが、ＡＡＶベクターとして送達された場合、ｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することができたことを実証する。ＡＡＶ．３４及びＡＡＶ．３７を、それぞれ、導入遺伝子構築物３４（１８６ヌクレオチドのポリ（Ａ）及び４５６５ヌクレオチドの総導入遺伝子長を有する）及び３７（２０８ヌクレオチドのポリ（Ａ）及び４６１９ヌクレオチドの総導入遺伝子長を有する）を用いて生成した。各ベクターは、標的遺伝子座において用量依存的編集を示し、より短いポリ（Ａ）シグナルを含有するＡＡＶ．３４は、両方の用量についてＡＡＶ．３７の約７５％の編集効力を有した。
実験の条件下で、結果は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）の発現が、様々な長さのポリ（Ａ）シグナルによって調節され得ることを実証する。より長いポリ（Ａ）配列は、増強されたＣａｓＸ活性のためにＡＡＶ構築物において利用され得るが、より短いポリ（Ａ）配列は、ＡＡＶ導入遺伝子内に更なるアクセサリエレメントを含めるために利用可能なより多くの配列空間を作製するためにＡＡＶ構築物において利用され得る。
実施例７：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、ＡＡＶベクター中の調節エレメントの位置によって調節される
ｇＲＮＡプロモーター及びガイド足場複合体などの調節エレメントの配向（順方向又は逆方向）及び位置（ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の上流又は下流）は、ＡＡＶベクターにおける小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の根底にある発現及びＣＲＩＳＰＲ系の全体的な編集効率を調節することができる。これらの実験の目標は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイドＲＮＡの効力を増強するためのＡＡＶゲノム内の調節エレメントの最良の配向及び位置を評価することであった。
材料及び方法：
ＦＡＣＳによるｍＮＰＴＣ－ｔｄＴ細胞におけるＡＡＶベクター産生及びＱＣ、ヌクレオフェクション、ＡＡＶウイルス産生及び編集レベル評価を、実施例１に記載されるように行った。
結果：
構築物４４（図２４に示される構成、上から２番目）は、構築物３（図１５の上の構成）の逆配向でガイド足場１７４及びスペーサー１２．７の発現を駆動するＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含有する。図２５は、構築物４４が、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドのヌクレオフェクションによって送達された場合、用量依存的様式で構築物３と同様にｍＮＰＣ中の標的停止カセットを改変することを実証する。
図２６は、ＡＡＶベクターとして送達された構築物４４がｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを示し、この構築物の有用性を更に支持する。ＡＡＶ．３及びＡＡＶ．４４を、それぞれ導入遺伝子構築物３及び４４を用いて生成した。各ベクターは、標的遺伝子座において用量依存的編集を示した（図２６、左パネル、ベクターを３倍希釈物を使用してアッセイした）。図２６の右パネルは、３×１０５のＭＯＩでの編集結果を示し、ＡＡＶ．４４は、ベクターＡＡＶ．３の元の構成の６０％の編集効力を有した。
この実験は、ＡＡＶゲノム内の部分の配向が変動し得るが、それにもかかわらずＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイドＲＮＡの十分な発現をもたらすことを実証する。これは、コードされるタンパク質又はＲＮＡ成分に対する調節エレメントの特定の配向又は位置が、１つ又は複数のガイドを含有するＣａｓＸパッケージングＡＡＶ構築物における発現の制御された調節を可能にし得ることを示す。
実施例８：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、より大型のタンパク質では可能でない追加の調節エレメントをＡＡＶベクターに含めることによって増強される。
これらの実験の目的は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）を送達するＡＡＶベクターによって媒介される転写レベルが、大きな導入遺伝子（例えば、ｓｐＣａｓ９）プラスミドを発現するＡＡＶベクターに従来適合しない異なる調節エレメント（イントロン配列、エンハンサーなど）を含めることによって増強され得ることを実証することであった。
材料及び方法：
クローニング及びＱＣ：予め消化されたＡＡＶ骨格、小型ＣＲＩＳＰＲタンパクをコードするＤＮＡ、並びに隣接する５’及び３’ＤＮＡ配列からなる４パートＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを使用して、実施例１に記載のようにＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドを生成した。５’配列は、エンハンサー、タンパク質プロモーター及びＮ末端ＮＬＳを含み、３’配列は、Ｃ末端ＮＬＳ、ＷＰＲＥ、ポリ（Ａ）シグナル、ＲＮＡプロモーター及びスペーサー１２．７を含むガイドＲＮＡを含む。５’及び３’部分を、Ｔｗｉｓｔから遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、構築し、ＡＡＶベクターに構築された。クローニング及びプラスミドＱＣ、ヌクレオフェクション、並びにＦＡＣＳ法を、実施例１に記載されるように行った。
ＡＡＶ ｃｉｓプラスミド３に翻訳後調節エレメント（ＰＴＲＥ）１、２、３を含めることによる編集の増強を、ＣａｓＸの発現を駆動する異なるプロモーターの組み合わせにおいて試験した。第１のセットのプロモーターを試験した。導入遺伝子プラスミド４、３５、３６、３７、導入遺伝子プラスミド５、３８、３９、４０、及び導入遺伝子プラスミド６、４２、４３は、それぞれＣＭＶ、ＵｂＣ、ＥＦＳ、ＣＭＶ－ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓＸタンパク質発現を有する。試験した構築物の第２のセットは、タンパク配列とポリ（Ａ）配列との間にＰＴＲＥを含み、ＣａｓＸの発現を駆動するＵｂＣプロモーター（それぞれ導入遺伝子５８、７２、７３、７４、５９、７５、７６、７７及び導入遺伝子５３、８０及び８１）と比較してプロモーターＪｅｔ、ＪｅｔＵｓｐを用いて生成した。ＰＴＲＥの配列を表１２に列挙し、エンハンサー＋プロモーター配列を表１３に列挙する。ＣａｓＸ（表２１）及び１つ以上のｇＲＮＡ（表１８及び表１９）をコードする配列を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
結果：
導入遺伝子発現に対するＰＴＲＥの効果を、３つのエンハンサー配列（ＰＴＲＥ１、ＰＴＲＥ２、及びＰＴＲ３）をＡＡＶ－ｃｉｓプラスミド（構築物３）及びより短いタンパク質プロモーターを含む構築物プラスミド（構築物４、５、６、５３、５７及び５８は、それぞれ４００、２３４、３３５、４００、１６４及び３２６ｂｐのプロモーター配列を含む）にクローニングすることによって評価した。
ＡＡＶ－ｃｉｓプラスミド活性を、ｍＮＰＣ－ｔｄｔ細胞におけるヌクレオフェクションによって最初に確認した。各ベクターについて、ＰＴＲＥの添加は、様々なレベルで編集活性を増強した（図２７）。表１４は、プロモーター及びＰＴＲＥの長さを提供する。導入遺伝子カセットへのＰＴＲＥ２の付加は、最も高いＣａｓＸ編集活性の増強を示し、構築物４と比較して構築物３６について編集レベルが２倍増加し（５８．５％対２５％）、構築物５と比較して構築物３９について１．５倍増加し（３５．４％対２２．９％）、構築物６と比較して構築物４２について３倍増加した（３０．５％対１２％）。最も短いエンハンサー配列、ＰＴＲＥ３もまた、他のベクターと比較して、構築物３７及び４３の間で様々なレベルでタンパク質活性を増加させた。
編集レベルの改善もまた、構築物がＡＡＶにパッケージ化された場合に観察された。導入遺伝子にＰＴＲＥ２を含めると、同様にＡＡＶベクター全体にわたって編集が増加した。ＡＡＶ感染を有するｍＮＰＣにおいて観察されたオンターゲット編集における傾向は、一般に、ＡＡＶプラスミドヌクレオフェクションデータセットと相関した（図２８）。
この傾向は、これらのエンハンサー配列を含む別のセットのプロモーターを試験することによって確認された。試験した全てのＡＡＶベクターにわたって、ゲノム中にＰＴＲＥ１及びＰＴＲＥ２を含む構築物は、基本ベクターと比較して平均１．５倍の増加を生じた（図２９）。短いプロモーターとこれらの転写後配列との固有の組み合わせは、より短いプロモーターを有する編集レベルが増加したベクター（例えば、ＡＡＶ．７４）の同定をもたらし、これは、ＡＡＶの保有能力限界下にあるＡＡＶ製造の両方についての利点を表し、より多くの調節エレメント及びＣＲＩＳＰＲエレメント（例えば、ガイド）の包含を可能にする（図３０）。
結果はまた、導入遺伝子プラスミドへのＰＴＲＥ１の包含が、評価された全てのプロモーターにわたって編集レベルを改善し（図３１）、より少ない変動性であり、一方、ＰＴＲＥ２は、最も高い導入遺伝子改善をもたらしたが、試験されたプロモーターにわたってより多くの変動性であったことを実証する。
単一の構成的プロモーターの上流に組織特異的ニューロンエンハンサーを有するいくつかの構築物を試験した。このアッセイでは、７つのニューロンエンハンサー配列（構築物６５～７２）を、コアＣＭＶプロモーターを有する単一のＡＡＶ－ｃｉｓプラスミド（６４）にクローニングし、全てが、ベース構築物６４よりもヌクレオフェクションを介して改善された編集を実証した（図３２）。これらの構築物はまた、ＵｂＣプロモーターを含む構築物５３より性能が優れていたが、完全なＣＭＶプロモーター（ＣＭＶエンハンサー＋ＣＭＶコアプロモーター）を有する構築物３より性能が優れていなかった。
結果は、ＡＡＶ導入遺伝子構築物における小さなプロモーターの使用が、更なるアクセサリエレメントの包含を可能にすることを実証する。短いが強力なプロモーター配列の制御下でＣａｓＸを発現するＡＡＶ導入遺伝子に対する転写後調節エレメントなどのこれらの追加のアクセサリエレメントは、全ての成分が単一のＡＡＶベクターに組み込まれ得るようにカーゴサイズを低減しながら、ＣａｓＸ発現の増加及びオンターゲット編集を可能にする。
実施例９：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、ＡＡＶベクター中に追加の調節エレメントを含め、組み合わせることによって増強される
これらの実験の目的は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡ複合体媒介性編集が、２つ以上のガイドＲＮＡを含み得るオールインワン単一ＡＡＶベクターにおいて増強され得ることを実証することであった。更に、実験を行って、多くの調節エレメントの包含及び組み合わせが効力を増強し得ること、及びより多くの調節配列を有するより大きなＡＡＶゲノムがより大きな編集活性を生じることを示した。ＡＡＶ導入遺伝子中のＣａｓＸ系に含めることが可能なアクセサリ配列及び調節配列の長さは、Ｃａｓ９などのより大きなＣａｓタンパク質の長さによって制限される、伝統的に使用されているＣＲＩＳＰＲタンパク質で可能な長さを超えている。
材料及び方法：
プラスミドクローニング、ＱＣ、及びヌクレオフェクションを、実施例１に記載のように行った。
「ガイドＲＮＡスタック」（各スタックは、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｇＲＮＡ足場－スペーサー１７４．１２．７、１．７４．１２．２又は１７４．ＮＴから構成される）と呼ばれる複数のＲＮＡ転写単位ブロック（図３５）の配向を、ポリ（Ａ）の３’末端上にテールからテールの配向（プラスミドＩＤ ４５～４９）で、又は依然としてＣａｓＸタンパク質／プロモーターと同じ転写配向で、タンパク質の各側に１つずつ（プラスミドＩＤ＝５０～５２）、２つのガイドＲＮＡスタックをクローニングすることによって調査した。タンパク質プロモーター及びＰｏｌ ＩＩＩプロモーターについての五角形のボックスは、転写の配向を示す（先細点、５’から３’又は３’から５’の配向）。スペーサー配列は、１２．２（ＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡ配列番号４０８０７））、１２．７（ＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号４０８００））、及びＮＴ（ＧＧＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣ（配列番号４０５０５））である。ＡＡＶベクター産生及び力価測定を実施例１に記載されるように行った。ＡＡＶ形質導入及びＦＡＣ選別による編集評価を、実施例１に記載されるように行った。
結果：
図３３は、構築物の構造の概略図であり、ガイドＲＮＡ成分が様々な構築物（構造１及び構造２）においてどのように組み合わされたかを示す。図３４は、追加の構成を示す。図３６に示す編集アッセイの結果は、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとして構造１のｍＮＰＣに送達された構築物が、増強された効力で編集することを実証する。スペーサー及び非標的化スペーサーの異なる組み合わせは、各個々のガイドＲＮＡが活性であることを実証するが、１つの標的化スペーサー及び１つの非標的化スペーサーを有する構造（構築物４５及び４６）は、およそ１８％低い編集レベルをもたらした。標的化スペーサーの特定の組み合わせは、有効性の増加をもたらした。ＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ（配列番号４０８００）の配列を有するスペーサー１２．７は、ＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡ（配列番号４０８０７）の配列を有するスペーサー１２．２（構築物４８）と組み合わせて、ガイドＲＮＡ構造１において有意な効力で編集され、１２．７（構築物４７）の２つのセットは、構築物３の単一のガイド構築物よりも１０％大きな効力をもって編集された。１２５及び６２．５ｎｇの各ＣａｓＸ構築物をｍＮＰＣにヌクレオフェクトし、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって編集を評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
図３７の結果は、ＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとしてｍＮＰＣに送達されたガイドＲＮＡスタック構造２（図３３参照されたい）も標的核酸を編集することを示す。１２５及び６２．５ｎｇの各ＣａｓＸ構築物をｍＮＰＣにヌクレオフェクトし、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって編集を評価した。データは、ｎ＝３複製についての平均±ＳＥＭとして提示される。
図３８の結果は、ガイドＲＮＡ構造１においてＡＡＶとして送達された構築物３、４５、４６、４７、及び４８がｍＮＰＣにおいて標的停止カセットを編集することを示す。ＡＡＶ．３、ＡＡＶ．４５、ＡＡＶ．４６、ＡＡＶ．４７及びＡＡＶ．４８を、それぞれ導入遺伝子構築物３及び４５、４６、４７及び４８を用いて生成した。各ベクターは、標的遺伝子座において用量依存的編集を示した（図３８、左パネル）。３ｅ５のＭＯＩで、ＡＡＶ．４７は、元の配向ベクターＡＡＶ．３よりも＜５％低い効力を有した（図３８、右パネル）。
これらの実験は、１つのＡＡＶゲノムにおける完全なＣａｓタンパク質配列と組み合わせた複数のガイドＲＮＡの使用の実現可能性を実証し、これは、ＡＡＶカプシドのパッケージング制約に起因して、Ｃａｓ９などのより大きなＣＲＩＳＰＲタンパク質の使用では以前は達成不可能であった。更に、これらの実験はまた、オールインワンベクター中の複数のガイドＲＮＡもまた、標的核酸を編集する能力を保持することを示す。
実施例１０：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効力は、核局在化配列（ＮＬＳ）の選択によって増強される。
実験を行って、構築物において利用される核局在化配列（ＮＬＳ）の改変が、ＡＡＶ設定における編集結果を調節し得るかどうかを決定した。ＣａｓＸタンパク質による編集のためにＡＡＶを最適化するというより大きな状況において、この最初のスクリーニングは、どのＮＬＳが構築物の前進において使用されるべきかを決定するための最初の試みとして機能した。
材料及び方法。
クローニング及びＱＣ：ＡＡＶベクターを、予め消化されたＡＡＶ骨格、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに隣接する５’及び３’ＤＮＡ配列からなる４パートＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを用いてクローニングした。５’配列は、エンハンサー、タンパク質プロモーター及びＮ末端ＮＬＳを含み、３’配列は、Ｃ末端ＮＬＳ、ＷＰＲＥ、ポリ（Ａ）シグナル、ＲＮＡプロモーター及びスペーサー１２．７を含むガイドＲＮＡを含む。５’及び３’部分を、Ｔｗｉｓｔから遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、Ｔ４リガーゼ及びＢｂｓＩを使用する循環的Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を介してＡＡＶベクターに組み立てた。ＮＬＳ配列は、表１５及び表１６に提示されている。
ＡＡＶベクターのアセンブリ及びＱＣ並びにヌクレオフェクションのための方法を、実施例１に記載されるように実施した。ＣａｓＸ（表２１）及び１つ以上のｇＲＮＡ（表１８及び表１９）をコードする配列を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
＊太字の配列はＮＬＳであり、一方、太字でない配列はリンカーである。
ＦＡＣＳによるｍＮＰＴＣ－ｔｄＴ細胞におけるＡＡＶ形質導入及び編集レベル評価を、実施例１に記載されるように行った。
結果：
最初のプラスミドヌクレオフェクションは、いくつかのＮＬＳ順列が、対照（Ｎ及びＣ末端の両方に１ｘＳＶ４０ ＮＬＳ）と比較した場合に改善された編集を示すことを明らかにした。特に、Ｃｍｙｃ又はヌクレオプラスミンＮＬＳを含有するＮ末端バリアントは、ＳＶ４０ ＮＬＳの組み合わせよりも有意に優れていた（図３９）。Ｎ末端ＮＬＳ変異におけるこの傾向は、ＡＡＶ形質導入において再現され、Ｃｍｙｃ及びヌクレオプラスミンＮＬＳバリアントは、再び、ＳＶ４０ ＮＬＳバリアントよりも性能が優れていた（図４０）。最後に、Ｃｍｙｃ定数を保持する変異（図４１）を試験し、結果は、最良の構築物が両方のＮ及びＣ末端上にＣｍｙｃ ＮＬＳを含有することを実証する。
データは、ＮＬＳのアミノ酸配列を選択することが、ＡＡＶ設定における編集結果を増強し得ることを示唆する。具体的には、Ｎ末端Ｃｍｙｃ含有ＮＬＳバリアントは、Ｎ末端ＳＶ４０ ＮＬＳバリアントと比較して明らかな改善を示した。加えて、Ｃ末端Ｃｍｙｃ及びＮｕｃバリアントは、ＳＶ４０ ＮＬＳバリアントよりも編集を改善する。ＳＶ４０ ＮＬＳの反復は、両方のＮ及びＣ末端上の編集効率にとって有害であるようである。
実施例１１：小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質発現は、５’ＵＴＲへのイントロンの付加によって増強される。
この実験の目的は、小型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＣａｓＸなど）を送達するＡＡＶベクターによって媒介される転写レベルが、従来は大型導入遺伝子（例えば、ｓｐＣａｓ９）プラスミドを発現するＡＡＶベクターに適合しないウイルス、マウス、又はヒトゲノムから得られるイントロン配列などの異なる調節エレメントを含めることによって増強され得ることを実証することである。
方法：
ＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドを生成するために、予め消化されたＡＡＶ骨格、小型ＣＲＩＳＰＲタンパクをコードするＤＮＡ、並びに隣接する５’及び３’ＤＮＡ配列からなる４パートＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを使用する。５’配列は、ＵｂＣ、ＪｅＴ、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢＨ、ｈＳｙｎ、又は他のＰｏｌ２プロモーター、イントロン領域、及びＮ末端ＮＬＳを含むタンパク質プロモーターを含むが、３’配列は、Ｃ末端ＮＬＳ、ポリＡシグナル、ＲＮＡプロモーター、及びスペーサー１２．７を含むガイドＲＮＡを含む。５’及び３’部分をＰＣＲ増幅し、実施例１に記載したように組み立てる。クローニング及びプラスミドＱＣ、ＡＡＶウイルス産生、並びにＦＡＣＳによるｍＮＰＴＣ－ｔｄＴ細胞における編集レベル評価は、実施例１に記載されるように行われる。構築物に組み込まれるイントロン配列の非限定的な例を表１７に列挙する。
イントロン３６（導入遺伝子プラスミド５９）の包含による編集の増強を、イントロンを含有しない基本構築物である導入遺伝子プラスミド５８に対して試験する。残りのイントロンは、ＣａｓＸをコードする将来の構築物において使用することができ、ウイルス、マウス、及びヒト起源に由来する予測的イントロン配列である。
結果：
導入遺伝子発現に対するイントロンの効果は、５０個の異なるイントロンをＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドにクローニングし、次いでｔｄＴｏｍａｔｏアッセイにおいて編集についてアッセイすることによって評価される。
イントロンを含まない基本構築物と比較した場合、イントロン配列の付加は、一般に、ＡＡＶ導入遺伝子の全体的な編集効率を増加させる。
結果は、短いが強力なプロモーター配列の制御下でＣａｓＸを発現するＡＡＶ導入遺伝子へのイントロンの付加が、カーゴサイズを減少させながらＣａｓＸ発現及びオンターゲット編集の増加を可能にし、ＡＡＶ系を更に最適化することを支持すると予想される。
実施例１２：改善されたガイドバリアントは、インビトロで増強されたオンターゲット活性を示す
実験を行って、治療的に関連するマウス及びヒトＲｈｏエキソン１を含む異なるゲノム標的において増加した活性を有する操作されたガイドＲＮＡバリアントを同定した。以前のアッセイは、編集効率並びに特異性を有意に増加させる能力を保持する足場配列内の多くの異なる「ホットスポット」領域（例えば、ステムループ）を同定した。追加的に、オフターゲット又は非特異的編集を引き起こすことなく、複数の異なるＰＡＭ－スペーサーの組み合わせにわたって、ＡＡＶベクターにおける本発明者らのＣＲＩＳＰＲ系の全体的な活性を増加させる足場バリアントを同定するために、スクリーニングを行った。現在のベンチマークベクターと比較して増加した編集効率を達成することは、インビボ研究において使用されるウイルスベクター用量の減少を可能にし、ＡＡＶ媒介ＣａｓＸガイド系の安全性を改善する。
方法：
新たなｇＲＮＡ足場及びスペーサーバリアントを、プラスミド及びウイルスベクター検証のためにＡＡＶ導入遺伝子構築物に挿入した（表１８及び表１９のコード配列）。ＣａｓＸ４９１バリアントタンパク質を、この実験で評価した全ての構築物に使用したが、本開示は、表３のもの及び表２１のコード配列を含むＣａｓＸバリアントのいずれかを利用することを企図する。本発明者らは、ＩＴＲ間のＡＡＶ導入遺伝子を、哺乳動物細胞における発現に関連する本発明者らの治療用カーゴ及びアクセサリエレメント並びに本発明者らのヌクレアーゼ－ガイドＲＮＡ複合体（タンパク質ヌクレアーゼ、足場、スペーサー）からなる異なる部分に概念的に分解した。概略図及びその概念的部分を図４２に示す。様々な構築物に共通する残りの成分の核酸配列を表２６に示し、ガイドのコード配列を表１８及び表１９に示し、ＣａｓＸのコード配列を表２１に示すことにより、導入遺伝子の様々な順列を解明することができる。
クローニング：ＡＡＶゲノム中の各部分を制限酵素部位によって分離して、モジュールクローニングを可能にした。部分を、Ｔｗｉｓｔからの遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、対応する制限酵素で消化し、洗浄し、次いで、同様に同じ酵素で消化したベクターにライゲーションした。次いで、新たなＡＡＶ構築物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｔｕｒｂｏｓ又はＳｔｂｌ３ｓ）に形質転換した。形質転換された細胞を３７℃の振盪インキュベーター中で１時間回収し、次いでカナマイシンＬＢ－寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で１２～１６時間増殖させた。コロニーを、カナマイシンで処理した６ｍＬの２ｘｙｔ中に採取し、７～１４時間増殖させ、次いでミニプレップし、サンガー配列決定した。次いで、形質転換及びミニプレッププロトコルを繰り返し、スペーサークローニングされたベクターを再度配列検証した。検証された構築物をマキシプレップした。マキシプレップの品質を評価するために、構築物を、ＸｍａＩ（各ＩＴＲ中のいくつかの部位で切断する）及びＡＡＶゲノム中で１回切断するＸｈｏＩによる２つの別々の消化物中で処理した。次いで、これらの消化物及び切断されていない構築物を１％アガロースゲル上で泳動し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ上で画像化した。プラスミドが＞９０％スーパーコイル化され、正しいサイズであり、ＩＴＲが無傷である場合、構築物は、ヌクレオフェクションを介して試験されるように移動し、その後、ＡＡＶベクター産生のために使用された。
＊ＮＤ＝記載なし 配列表に提供される配列。
レポーター細胞株：Ａｉ９－ｔｄＴｏｍａｔｏから単離された神経前駆細胞株を、予め平衡化したｍＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１：１０００ ２－メルカプトエタノール、１Ｘ Ｂ－２７サプリメント、マイナスビタミンＡ、増殖因子ｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充した１Ｘ Ｎ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中の懸濁液中で培養した。試験前に、細胞をアキュターゼを用いて解離させ、穏やかに再懸濁し、ニューロスフェアの完全な分離についてモニタリングした。次いで、細胞を培地でクエンチし、スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。細胞を計数し、ヌクレオフェクションに直接使用するか、又は１０，０００個の細胞を、ＡＡＶ形質導入の２日前に、ＰＬＦ（１×ポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、滅菌ｄｉＨ２０中１０ｍｇ／ｍＬ、１×ラミニン、及び１×フィブロネクチン）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
ＨＥＫ２９３Ｔ二重レポーター細胞株を、ＧＦＰに連結されたヒトＲＨＯ遺伝子のエキソン１及びｍｓｃａｒｌｅｔに連結されたヒトＰ２３Ｈ．ＲＨＯ遺伝子のエキソン１を構成的に発現する２つの導入遺伝子カセットをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にノックインすることによって生成した。改変された細胞を、３～５日ごとの連続継代によって増殖させ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃１０－０１３－ＣＶ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、＃１５００－５００）、並びに１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｘ－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ；ＧＩＢＣＯ＃１５１４０－１２２）が補充された、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１５６３００８０）、及び２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃２１９８５０２３）を更に含み得る、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃１０－０１３－ＣＶ）からなる線維芽細胞（Fibroblast、ＦＢ）培地中で維持した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。１～２週間後、ＧＦＰ＋／ｍｓｃａｒｌｅｔ＋細胞をＦＢ培地にバルク選別した。レポーター株を３～５日ごとの連続継代によって増殖させ、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内のＦＢ培地中で維持した。レポータークローンを限界希釈法によって生成した。クローン株を、フローサイトメトリー、ゲノム配列決定、及び以前に検証されたＲＨＯ標的化ＣａｓＸ分子を使用するＲＨＯ遺伝子座の機能的改変を介して特徴付けた。最適なレポーター株は、ｉ）ＷＴＲＨＯ．ＧＦＰ及びｍｕｔＲＨＯ．ｍｓｃａｒｌｅｔの単一コピーが１セル当たり正しく組み込まれ、ｉｉ）未改変細胞と同等の倍加時間を維持し、ｉｉｉ）以下に記載の方法を用いてアッセイした場合、ＲＨＯ遺伝子の破壊時にＧＦＰ及びｍｓｃａｒｌｅｔ蛍光の減少をもたらすものとして同定された。
プラスミドヌクレオフェクション：ＣａｓＸ－足場－ガイド系の発現を駆動するＡＡＶ ｃｉｓ－プラスミドを、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用してｍＮＰＣにヌクレオフェクトした。ＡＲＰＥ－１９株については、Ｌｏｎｚａ ＳＦ溶液及びサプリメントを使用した。プラスミドを２００ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。構築物当たり５μＬのＤＮＡを、それぞれ２００，０００個のｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞を含有するＰ３又はＳＦ溶液に添加した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者のガイドラインに従って使用して、合わせた溶液をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、溶液を適切な培養培地でクエンチした。次いで、この溶液を９６ウェルプレートに３連で分注した（ウェル当たり約６７，０００細胞）。トランスフェクションの４８時間後、処理されたｍＮＰＣに成長因子を含有する新鮮なｍＮＰＣ培地を補充し、処理されたＡＲＰＥ－１９細胞に新鮮なＦＢ培地を補充した。トランスフェクションの５日後、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ及びＡＲＰＥ－１９細胞をリフトし、活性をＦＡＣＳによって評価した。
ＡＡＶベクター産生：懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で増殖させた。スクリーニング目的のために、小規模培養物（２０～３０ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ中で培養し、１１０ｒｐｍで撹拌した）を、トランスフェクションの日に１．５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンを含まないｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を４０００ｒｐｍで２０分間、４℃でスピンして、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を細胞破片を含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、０．４５μＭフィルターを使用して更に清澄化した。
ウイルスゲノム力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＣＭＶプロモーター領域（Ｆｗｄ ５’－ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡ－３’（配列番号４０８０１）、Ｒｅｖ ５’－ＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣ－３’（配列番号４０８０２））、プローブ５’－ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧ－３’（配列番号４０８０３））、又はＡＡＶ２－ＩＴＲ内に位置する６２ｂｐ断片（Ｆｗｄ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号４０８０４）、Ｒｅｖ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号４０８０５）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’（配列番号４０８０６）を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドの１０倍連続希釈（２ｅ＋９～２ｅ＋４ ＤＮＡコピー／ｍＬの各５μＬ）を参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５℃で５分間の初期変性ステップ、その後、９５℃で１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル行った。
ＡＡＶ形質導入：１０，０００細胞／ウェルのｍＮＰＣを、ＡＡＶ形質導入の４８時間前に、９６ウェルプレート中のＰＬＦコーティングウェル上に播種した。全てのウイルス感染条件は、約１．０ｅ＋６～１．０ｅ＋４ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）の一連の３倍希釈で、実験ベクター間のｖｇ数を正規化して、３連で行った。計算は、トランスフェクション時に１ウェル当たり２０，０００個の細胞の推定数に基づいた。ｂＦＧＦ／ＥＧＦ増殖因子（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した予め平衡化したｍＮＰＣ培地で希釈した最終体積５０μＬのＡＡＶベクターを各ウェルに適用した。トランスフェクションの４８時間後、完全な培地交換を、増殖因子を補充した新鮮な培地で行った。編集活性（ｔｄＴ＋細胞定量）を、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。
ＦＡＣＳによる編集活性の評価：トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞をｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）でそれぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。再懸濁した細胞を丸底９６ウェルプレートに移し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、１×ＤＡＰＩを含有するｄＰＢＳで再懸濁し、プレートをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターオートサンプラーにロードした。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを、以下のゲーティングパラメータを使用して実行した：細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＳＳＣ－Ａ、単一細胞を選択するためのＦＳＣ－ＨｘＦＳＣ－Ａ、ＤＡＰＩ陰性生存細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＶＬ １－Ａ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＹＬ １－Ａ。
ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座におけるインデルのＮＧＳ分析：トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣをｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）でそれぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。次いで、細胞をスピンダウンし、得られた細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した後、製造業者の説明書に従ってＺｙｍｏミニＤＮＡキットを使用してｇＤＮＡ抽出のために処理した。マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座で生じる編集レベルを評価するために、アンプリコンを、プライマーセット（Ｆｗｄ ５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧ－３’（配列番号４０５９５）、Ｒｅｖ ５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＣ－３’（配列番号４０５９６）、ビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）を用いて２００ｎｇのｇＤＮＡから増幅し、次いで再増幅して、ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を組み込んだ。具体的には、これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列並びに固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を導入するために５’末端に追加の配列を含有した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。
結果：
異なる編集実験を行って、複数の目的のゲノム遺伝子座を標的化する異なるスペーサーを有するｇＲＮＡ足場バリアント（ガイド１７４及び２２９～２３７）と対になったＣａｓＸ ４９１によって媒介されるオンターゲット切断を定量化した。構築物を、ＩＴＲ２配列に隣接するＡＡＶ骨格ｐ５９にクローニングし、ＣＭＶプロモーターの制御下でタンパク質Ｃａｓ４９１の発現を駆動し、ヒトＵ６プロモーターの制御下で足場スペーサーを駆動した。
ｍＮＰＣ－ＴｄＴレポーター細胞株を使用して、内因性マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座（スペーサー１１．３０、ＣＴＣ ＰＡＭ）での単一切断効率を評価した。ＡＲＰＥ－１９由来細胞株に組み込まれた二重レポーター系も使用して、外因的に発現されたヒトＷＴ Ｒｈｏ遺伝子座（スペーサー１１．１、ＣＴＣ ＰＡＭ）におけるオンターゲット編集を評価した。
スペーサー１１．３０を有する足場バリアントを、２つの異なる用量（１０００ｎｇ及び５００ｎｇ）でマウスＮＰＣ細胞株におけるヌクレオフェクションによって試験した。構築物を、現在のベンチマークｇＲＮＡ足場１７４活性と比較した。足場バリアント２３１、２３３、２３４、２３５を発現する構築物は、足場１７４．１１．３０を有するものよりも高いレベルで機能した（図４３Ａ及び図４３Ｂ）。足場２３５は、ｇＲＮＡ足場１７４と比較して、ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座において２倍増加した活性を示した。本発明者らは更に、足場２３５が、構築物ｐ５９．４９１．１７４．１１．１及びｐ５９．４９１．２３５．１１．１、並びに非標的スペーサー対照を用いて二重レポーターＡＲＰＥ－１９細胞株をヌクレオフェクションすることによって、オフターゲット切断を増加させることなく活性を一貫して改善することを検証した。スペーサー１１．１は、外因的に発現されたｈＲＨＯ－ＧＦＰ遺伝子を標的とした。足場２３５は、１７４と比較して３倍増加した活性を示した（それぞれＲｈｏ－ＧＦＰｃｅｌｌｓの９％対３％、図４４Ａ及び図４４Ｂ）。対立遺伝子特異性は、配列が野生型と１ｂｐ異なるｈＰ２３Ｈ－ＲＨＯ－Ｓｃａｒｌｅｔｔ－細胞集団の頻度を調べることによって評価した。
本発明者らはまた、これらの足場バリアントがＡＡＶに効率的にパッケージ化され、ウイルス的に送達された場合に強力なままであることを実証しようとした。スペーサー１１．３０を有するガイド足場２３５（オンターゲット、マウスＷＴ ＲＨＯ）を発現するＡＡＶベクターで形質導入されたｍＮＰＣは、３．０ｅ＋５ ＭＯＩでＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３０に感染させたものと比較して、オンターゲット遺伝子座における活性の増加（＞５倍増加、図４５Ａ及び図４５Ｂ）を示し、それぞれ、Ｐ２３Ｈ－ＲＨＯ ＳＮＰを標的とするＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３１及びＡＡＶ．４９１．２３５．１１．３１ベクターの両方で検出可能なオフターゲットインデルは有意になかった。
スペーサー長の影響を評価する：別のセットの実験を行って、スペーサー長バリアントがオンターゲット活性を改善し得るかどうかを試験した。スペーサー１１．３９、１１．３８及びスペーサー１１．３７（１９ｎｔ Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ）、１１．３６（１８ｎｔ Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ）は、それぞれ親スペーサー１１．３０（２０ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）及び１１．３１（２０ｎｔ Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ）から設計され、配列の３’末端に１又は２ｂｐの切断を有した。ｍｆＮＰＣ－ＴｄＴ細胞に、１０００ｎｇ及び５００ｎｇの構築物ｐ５９．４９１．１７４．１１．３０（２０ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）、ｐ５９．４９１．１７４．１１．３９（１９ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）、ｐ４９．４９１．１７４．１１．３８（１８ｎｔ ＷＴ ＲＨＯ）をヌクレオフェクトし、５日後に編集レベルを評価した。全ての短縮型スペーサーバージョンは、編集レベルを改善し（図４６Ａ及び図４６Ｃ）、ｐ５９．４９１．１１．３９構築物で最も高い改善が観察された（２０ｂｐスペーサー長構築物に対して１９ｂｐスペーサーで約２倍の改善が達成された）。マウスＰ２３Ｈ－ＲＨＯ遺伝子座を標的とする１１．３１スペーサーのトランケーションスペーサーバリアントでは、オフターゲット切断の増加は観察されなかった（図４６Ｂ）。
これらの結果は、構造的変異を有する足場バリアントが、マウス及びヒトＲＨＯエキソン１遺伝子座などの治療的に関連するゲノム標的を調査する二重レポーター系において増加した活性で操作され得ることを支持する。更に、新たに特徴付けられた足場は、活性において全体的に＞２倍の増加を示したが、１ｂｐミスマッチスペーサー領域によるオフターゲット切断は検出されなかった。これは、スペーサー１１．３１によって標的化される、変異対立遺伝子がＷＴ配列と１ヌクレオチド異なる、ａｄＲｐ Ｐ２３Ｈ Ｒｈｏなどの対立遺伝子特異的治療戦略に関連する。この研究は、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯレスキュー及び遺伝毒性研究並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおけるガイド足場２３５の使用を更に検証する。
実施例１３：改善された足場及びガイドバリアントは、インビボで増強されたオンターゲット活性を実証する
実験を行って、選択性及びオンターゲット活性を改善する構造変異を有する操作されたＣａｓＸ＆ｓｇＲＮＡガイド及びスペーサーバリアントが、ＷＴにおいて治療的に適切なレベルでＰ２３残基を標的とするスペーサーを用いて、マウス網膜における光受容体にインビボで送達された場合に編集の増加をもたらすことを実証した。ここで、本発明者らは、ＣａｓＸバリアント４９１、ガイドバリアント２３５及びスペーサー１１．３９を発現するベクターが、親ＣａｓＸ４９１、ガイドバリアント１７４及びスペーサー１１．３０と比較してインビボで編集レベルを改善するかどうかを評価した。
材料及び方法：
ＡＡＶプラスミド及びウイルスベクターの生成：ＲＨＯプロモーターの制御下のＣａｓＸバリアント４９１、並びにＵ６プロモーター下のスペーサー１１．３０及びスペーサー１１．３１（ＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ（配列番号４０５０３））を有するｓｇＲＮＡガイドバリアント１７４、又はＰ２３残基でマウスＲＨＯエキソン１を標的化するスペーサー１１．３９（ＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ（配列番号４０５３１））及び１１．３７（ＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号４０５３５））を有するｓｇＲＮＡガイドバリアント２３５を、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するｐ５９プラスミドにクローニングした。
クローニング：ＡＡＶゲノム中の各部分を制限酵素部位によって分離して、モジュールクローニングを可能にした。部分を、Ｔｗｉｓｔからの遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、対応する制限酵素で消化し、洗浄し、次いで、同様に同じ酵素で消化したベクターにライゲーションした。ＲＨＯプロモーター下のＣａｓ Ｘバリアント４９１並びにヒトＵ６プロモーターの制御下の足場バリアント１７４及び２３５を、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するＡＡＶ骨格にクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを用いて、スペーサー１１．３０、１１．３１及びバリアント１１．３９、１１．３７をそれぞれｐＡＡＶ．ＲＨＯ．４９１．１７４及びｐＡＡＶ．ＲＨＯ．４９１．２３５にクローニングした。次いで、新たなＡＡＶ構築物を、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｂｌ３ｓ）に形質転換した。検証された構築物をマキシプレップした。マキシプレップの品質を評価するために、構築物を、ＸｍａＩ（各ＩＴＲ中のいくつかの部位で切断する）及びＡＡＶゲノム中で１回切断するＸｈｏＩによる２つの別々の消化物中で処理した。プラスミドが＞９０％スーパーコイル化され、正しいサイズであり、ＩＴＲが無傷である場合、構築物を続いてＡＡＶベクター産生に使用した。
ＡＡＶベクター産生：懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地中で増殖させた。５００ｍＬ培養物（１Ｌ三角フラスコ、１１０ｒｐｍで撹拌）を、トランスフェクションの日に２ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンを含まないｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を４０００ｒｐｍで２０分間、４℃でスピンして、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を細胞破片を含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、０．４５μＭフィルターを使用して更に清澄化した。ＡＡＶ溶解物を、アフィニティークロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。溶出液を緩衝液交換し、ＰＢＳ＋２００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．００１％プルロニック中で濃縮した。
ウイルスゲノム力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＡＡＶ２－ＩＴＲに位置する６２ｂｐ断片（Ｆｗｄ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号４０８０４）、Ｒｅｖ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号４０８０５）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’（配列番号４０８０６）を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドを参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５℃で５分間の初期変性ステップ、その後、９５℃で１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル行った。
網膜下注射Ｃ５７ＢＬ６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、通常の１２時間の明／暗サイクルで維持した。３～４週齢のマウスに網膜下注射を行った。マウスをイソフルラン吸入で麻酔した。プロパラカイン（０．５％）を角膜に局所的に適用し、眼をトロピカミド（１％）及びフェニレフリン（２．５％）の液滴で散大させた。手術の間、眼をゲンティールゲルで潤滑に保った。手術用顕微鏡下で、超微細３０ １／２ゲージ使い捨て針を、強膜の赤道及び縁に隣接して通過させて、硝子体腔への小さな穴を作製した。平滑末端針を使用して、１～１．５μＬのウイルスを、ＲＰＥと網膜層との間の網膜下腔に直接注射した。実験群からの各マウスに、１．５．０ｅ＋９ウイルスゲノム（ｖｇ）／眼を注射した。
ＮＧＳ解析：注射の３週間後、動物を屠殺し、眼を新鮮なＰＢＳ中で摘出した。全網膜を眼杯から単離し、製造業者の指示に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｇＤＮＡ抽出のために処理した。アンプリコンを、２００ｎｇのｇＤＮＡからマウスＲＨＯエキソン１遺伝子座を標的とするプライマーセット（Ｆｗｄ ５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧ－３’（配列番号４０５９５）、Ｒｅｖ ５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＣ－３’（配列番号４０５９６））、ビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）を用いて増幅し、次いで再増幅して、ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を組み込んだ。具体的には、これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列並びに固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を導入するために５’末端に追加の配列を含有した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。
結果：
ベンチマークベクター、ＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３０（オンターゲット）は、全ての試料にわたって約８％の編集を達成した（図４７Ａ、ｎ＝８網膜）。スペーサー１１．３１（オフターゲット、Ｐ２３Ｈ－ＲＨＯ ＳＮＰを標的とする１１．３０からの１ｂｐミスマッチ）を有する同様のベクターは、バックグラウンドレベルの編集（約０．４％）を示した。足場バリアント２３５及びスペーサー１１．３９を発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３０親ベクターと比較して２倍を超える改善を達成し（図４７Ｂ）、平均１６％編集であり、いくつかの網膜において２５％もの高さであった。オンターゲット編集におけるこの増加は、ＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３１親ベクターと比較して、スペーサー１１．３７（Ｐ２３Ｈ－ＲＨＯ ＳＮＰを標的とする、スペーサー１１．３９と比較して１ｂｐミスマッチ）レベルによるオフターゲットの増加がないので、選択的なままであった。
これらの実験は、足場１７４を有する桿体光受容体選択的プロモーター、及びマウスＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座を標的とするスペーサーによって駆動されるＣａｓＸ ４９１発現が、マウス網膜においてＡＡＶを介して網膜下送達された場合に、Ｐ２３マウス遺伝子座において治療関連レベルの編集を達成することができるという概念実証を実証する。これらの結果はまた、以前にインビトロでスクリーニングされた操作されたｓｇＲＮＡガイド（２３５）及びスペーサーバリアント（１１．３９）から達成された編集レベルが、同様にインビボで翻訳され、対立遺伝子特異的選択性を保持することを支持する。この研究は、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯレスキュー及び遺伝毒性研究並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおけるガイド足場２３５の使用を更に検証する。
実施例１１及び１２の結果は、構造的変異を有する足場バリアントが、マウス及びヒトＲＨＯエキソン１遺伝子座などの治療的に関連するゲノム標的を調査する二重レポーター系において増加した活性で操作され得ることを支持する。更に、新たに特徴付けられた２３５足場は、活性において全体的に＞２倍の増加を示したが、１ｂｐミスマッチスペーサー領域によるオフターゲット切断は検出されなかった。これは、スペーサー１１．３１によって標的化される、変異対立遺伝子がＷＴ配列と１ヌクレオチド異なる、ａｄＲｐ Ｐ２３Ｈ Ｒｈｏなどの対立遺伝子特異的治療戦略に関連する。本研究は、マウスＰ２３Ｈ ＲＨＯレスキュー及び遺伝毒性研究、並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおけるガイド足場２３５の使用を更に検証するために行った。
実施例１４：改善されたＣａｓＸバリアントは、インビトロで増強されたオンターゲット活性を示す
ＣａｓＸプロトスペーサー隣接モチーフは、野生型配列を改変することなくＰ２３Ｈ変異の対立遺伝子特異的標的化を必要とする常染色体優性ＲＨＯなどの様々なゲノム編集治療用途に必要である、正確なゲノム標的化を可能にする。
実験を行って、高い忠実度を維持しながらＣＴＣ－ＰＡＭ媒介オンターゲット活性を増加させると予測される変異が導入され、オフターゲット事象が低減された、合理的に設計された操作されたＣａｓＸヌクレアーゼが、桿体光受容体細胞にインビボで送達された場合に内因性マウスＲＨＯ遺伝子座における編集レベルを改善するかどうかを調査した。
追加的に、実験を行って、マウスＰ２３Ｈ ＲＨＯレスキュー及び遺伝毒性研究、並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおけるガイド足場２３５の使用を更に検証した。
方法：
ＰＡＭ活性を調べる異なるアッセイにおいて同定されたＣａｓＸタンパク質バリアントを、ＣＴＣ ＰＡＭにおけるそれらの増加した活性について選択した。プラスミド及びウイルスベクターの検証のためにＣａｓＸタンパク質をＡＡＶ導入遺伝子構築物にクローニングした。本発明者らは、ＩＴＲ間のＡＡＶ導入遺伝子を、哺乳動物細胞における発現に関連する本発明者らの治療用カーゴ及びアクセサリエレメント並びに本発明者らのヌクレアーゼ－ガイドＲＮＡ複合体（タンパク質、足場、スペーサー）からなる異なる部分に概念的に分解した。
クローニング：ＡＡＶゲノム中の各部分を制限酵素部位によって分離して、モジュールクローニングを可能にした。部分を、Ｔｗｉｓｔからの遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、対応する制限酵素で消化し、洗浄し、次いで、同様に同じ酵素で消化したベクターにライゲーションした。次いで、新たなＡＡＶ構築物を、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｂｌ３ｓ）に形質転換した。検証された構築物をマキシプレップした。マキシプレップの品質を評価するために、構築物を、ＸｍａＩ（各ＩＴＲ中のいくつかの部位で切断する）及びＡＡＶゲノム中で１回切断するＸｈｏＩによる２つの別々の消化物中で処理した。次いで、これらの消化物及び切断されていない構築物を１％アガロースゲルで泳動した。プラスミドが＞９０％スーパーコイル化され、正しいサイズであり、ＩＴＲが無傷である場合、構築物は、ヌクレオフェクションを介して試験されるように移動し、その後、ＡＡＶベクター産生のために使用された。
レポーター細胞株：Ａｉ９－ｔｄＴｏｍａｔｏから単離された不死化神経前駆細胞株を、予め平衡化したｍＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１：１０００ ２－メルカプトエタノール、１Ｘ Ｂ－２７サプリメント、マイナスビタミンＡ、増殖因子ｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充した１Ｘ Ｎ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中の懸濁液中で培養した。試験前に、アキュターゼを用いて細胞を持ち上げ、穏やかに再懸濁し、ニューロスフェアの完全な分離についてモニタリングした。次いで、細胞を培地でクエンチし、スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。細胞を計数し、ヌクレオフェクションに直接使用するか、又は１０，０００個の細胞を、ＡＡＶ形質導入の２日前に、ＰＬＦ（１×ポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、滅菌ｄｉＨ２０中１０ｍｇ／ｍＬ、１×ラミニン、及び１×フィブロネクチン）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
ＨＥＫ２９３Ｔ二重レポーター細胞株を、ＧＦＰに連結されたヒトＲＨＯ遺伝子のエキソン１及びｍｓｃａｒｌｅｔに連結されたヒトＰ２３Ｈ．ＲＨＯ遺伝子のエキソン１を構成的に発現する２つの導入遺伝子カセットをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にノックインすることによって生成した。改変された細胞を、３～５日ごとの連続継代によって増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ，＃１５００－５００）、並びに１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｘ－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ；ＧＩＢＣＯ＃１５１４０－１２２）が補充され、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃１５６３００８０）、及び２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃２１９８５０２３）を更に含み得る、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃１０－０１３－ＣＶ）からなる線維芽細胞（ＦＢ）培地中で維持した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。１～２週間後、ＧＦＰ＋／ｍｓｃａｒｌｅｔ＋細胞をＦＢ培地にバルク選別した。レポーター株を３～５日ごとの連続継代によって増殖させ、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内のＦＢ培地中で維持した。レポータークローンを限界希釈法によって生成した。クローン株を、フローサイトメトリー、ゲノム配列決定、及び以前に検証されたＲＨＯ標的化ＣａｓＸ分子を使用するＲＨＯ遺伝子座の機能的改変を介して特徴付けた。最適なレポーター株は、ｉ）ＷＴ－ＲＨＯ．ＧＦＰ及びＰ２３Ｈ－ＲＨＯ．ｍｓｃａｒｌｅｔの単一コピーが１セル当たり正しく組み込まれ、ｉｉ）未改変細胞と同等の倍加時間を維持し、ｉｉｉ）以下に記載の方法を用いてアッセイした場合、ＲＨＯ遺伝子の破壊時にＧＦＰ及びｍｓｃａｒｌｅｔ蛍光の減少をもたらす、ものとして同定された。
プラスミドヌクレオフェクション：ＣａｓＸ－足場－ガイド系の発現を駆動するＡＡＶ ｃｉｓ－プラスミドを、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用してｍＮＰＣにヌクレオフェクトした。ＡＲＰＥ－１９株については、Ｌｏｎｚａ ＳＦ溶液及びサプリメントを使用した。プラスミドを２００ｎｇ／ｕｌ、１００ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。構築物当たり５μＬのＤＮＡを、それぞれ２００，０００個のｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞を含有するＰ３又はＳＦ溶液に添加した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者のガイドラインに従って使用して、合わせた溶液をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、溶液を適切な培養培地でクエンチした。次いで、この溶液を９６ウェルプレートに３連で分注した（ウェル当たり約６７，０００細胞）。トランスフェクションの４８時間後、処理した細胞に、増殖因子を含有する新鮮なｍＮＰＣ培地を補充した。トランスフェクションの５日後、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣをリフトし、活性をＦＡＣＳによって評価した。
ＡＡＶベクター産生：懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で増殖させた。スクリーニング目的のために、小規模培養物（２０～３０ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ中で培養し、１１０ｒｐｍで撹拌した）を、トランスフェクションの日に１．５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンを含まないｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を４０００ｒｐｍで２０分間、４℃でスピンして、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を細胞破片を含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、０．４５μＭフィルターを使用して更に清澄化した。
ウイルスゲノム力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＣＭＶプロモーター領域（Ｆｗｄ ５’－ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡ－３’（配列番号４０８０１））、Ｒｅｖ ５’－ＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣ－３’（配列番号４０８０２））、プローブ５’－ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧ－３’（配列番号４０８０３））、又はＡＡＶ２－ＩＴＲ内に位置する６２ヌクレオチド断片（Ｆｗｄ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号４０８０４）、Ｒｅｖ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号４０８０５）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’）を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドの１０倍連続希釈（２ｅ＋９～２ｅ＋４ ＤＮＡコピー／ｍＬの各５μＬ）を参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５’Ｃで５分間の初期変性ステップ、その後、９５’Ｃで１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル行った。
ＡＡＶ形質導入：１０，０００細胞／ウェルのｍＮＰＣを、ＡＡＶ形質導入の４８時間前に、９６ウェルプレート中のＰＬＦコーティングウェル上に播種した。全てのウイルス感染条件は、約１．０ｅ＋６～１．０ｅ＋４ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）の一連の３倍希釈で、実験ベクター間のｖｇ数を正規化して、３連で行った。計算は、トランスフェクション時に１ウェル当たり２０，０００個の細胞の推定数に基づいた。ｂＦＧＦ／ＥＧＦ増殖因子（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した予め平衡化したｍＮＰＣ培地で希釈した最終体積５０μＬのＡＡＶベクターを各ウェルに適用した。トランスフェクションの４８時間後、完全な培地交換を、増殖因子を補充した新鮮な培地で行った。編集活性（ｔｄＴ＋細胞定量）を、トランスフェクションの５日後にＦＡＣＳによって評価した。
ＦＡＣＳによる編集活性の評価：トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞をｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）でそれぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。再懸濁した細胞を丸底９６ウェルプレートに移し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、１×ＤＡＰＩを含有するｄＰＢＳで再懸濁し、プレートをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターオートサンプラーにロードした。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを、以下のゲーティングパラメータを使用して実行した：細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＳＳＣ－Ａ、単一細胞を選択するためのＦＳＣ－ＨｘＦＳＣ－Ａ、ＤＡＰＩ陰性生存細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＶＬ１－Ａ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を選択するためのＦＳＣ－ＡｘＹＬ１－Ａ。
ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座におけるインデルのＮＧＳ分析：トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣをｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）でそれぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。次いで、細胞をスピンダウンし、得られた細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した後、製造業者の説明書に従ってＺｙｍｏミニＤＮＡキットを使用してｇＤＮＡ抽出のために処理した。マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座で生じる編集レベルを評価するために、アンプリコンを、プライマーセット（Ｆｗｄ ５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧ－３’（配列番号４０５９５）、Ｒｅｖ ５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＣ－３’（配列番号４０５９６）、ビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）を用いて２００ｎｇのｇＤＮＡから増幅し、次いで再増幅して、ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を組み込んだ。具体的には、これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列並びに固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を導入するために５’末端に追加の配列を含有した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した
結果：
以前のアッセイにおける操作された変異は、ヌクレアーゼの全体的な活性、特異性の両方を増大させる能力、並びにＣＴＣ－ＰＡＭ部位を標的とするスペーサーによる増大した活性を有するＣａｓＸバリアントを同定した。ＣａｓＸ ４９１タンパク質に対するこれらの変異は、ＣａｓＸバリアントタンパク質５１５、５２７、５２８、５３５、５３６及び５３７を生じさせた（配列については表３を参照されたい）。
複数の編集スクリーニングを実施して、ｇＲＮＡ足場１７４又は２３５及び複数の目的のゲノム遺伝子座を標的化する異なるスペーサーと対になったこれらのＣａｓＸバリアントタンパク質によって媒介されるオンターゲット編集レベルを定量化した（ガイド及びスペーサーのコード配列は、表１８及び表１９に提示されている）。構築物を、ＩＴＲ２配列に隣接するＡＡＶ骨格ｐ５９にクローニングし、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣａｓＸの発現を駆動し、ヒトＵ６プロモーターの制御下で足場－スペーサーを駆動した。ｍＮＰＣ－ｔｄＴレポーター細胞株を使用して、内因性マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座（スペーサー１１．３９、ＣＴＣ ＰＡＭ、図４８Ａ）での単一切断効率を評価した。ＡＲＰＥ－１９由来細胞株に組み込まれた二重レポーター系も使用して、外因的に発現されたヒトＷＴ Ｒｈｏ遺伝子座（スペーサー１１．４１、ＣＴＣ ＰＡＭ）又はＰ２３Ｈ－ＲＨＯ遺伝子座（スペーサー１１．４３、ＣＴＣ ＰＡＭ、図４８Ｂ）におけるオンターゲット編集を評価した。
スペーサー１１．３９を有するＣａｓＸタンパク質バリアントを、２つの異なる用量（１０００ｎｇ及び５００ｎｇ）でマウスＮＰＣ細胞株におけるヌクレオフェクションによって試験した。構築物を親ＣａｓＸ ４９１活性と比較した。足場１７４及びスペーサー１１．３０を有するＣａｓＸ５３５及び５３７を発現するＡＡＶ構築物は、ＣａｓＸバリアントのいずれかのｍＲＨＯエキソン１遺伝子座において最大の編集活性を実証し（編集パーセントによる、図４８Ａ）、スペーサー１１．３７（変異Ｐ２３Ｈ－Ｒｈｏ対立遺伝子を標的とする、図４８Ｂ）を有するタンパク質バリアントのヌクレオフェクションによって示されるオフターゲット切断の増加なしに、ＣａｓＸ ４９１（図４８Ｃ、１に正規化）と比較して１．５倍増加した。
次いで、マウスＲＨＯ遺伝子座において観察された改善が、より臨床的に関連するヒトＲＨＯ遺伝子座において翻訳された変異改変体を用いているか否かを決定するために、実験を行った。二重レポーターＡＲＰＥ－１９細胞株に、ヒトＲＨＯを標的とする、スペーサー１１．４１又はスペーサー１１．４３を有するｓｇＲＮＡ足場２３５のいずれかと対になったＣａｓＸバリアントタンパク質を発現する構築物をヌクレオフェクトした。ＣａｓＸ５３５及び５３７はまた、外因性ＷＴ－ＲＨＯ－ＧＦＰ遺伝子座を標的化する場合、ＣａｓＸ４９１と比較して１．５倍を超える増大した編集活性を示した（それぞれ、Ｒｈｏ－ＧＦＰｃｅｌｌｓの２．４％編集と比較して約４．３％及び４．１％編集、図４９Ａ及び図４９Ｂ）。ＣａｓＸバリアント５１５、５２７及び５３６を発現する構築物は、ＣａｓＸ４９１と同様のレベルで編集された。興味深いことに、Ｐ２３Ｈ－ＲＨＯ－ｍｓｃａｒｌｅｔ遺伝子座を標的とするスペーサーを使用した場合、全てのバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ４９１と比較して改善された編集を示した。最も高い活性レベルは、ＣａｓＸ５２７（２倍増加）及びＣａｓＸ５３５（１．８倍増加）を発現する構築物によって達成された。
最後に、本発明者らは、これらのタンパク質バリアントがＡＡＶ中に効率的にパッケージ化され、ウイルス的に送達された場合に強力なままであることを実証しようとした。ＣａｓＸ５２７、５３５及び５３７並びにスペーサー１１．３９を有するガイド足場２３５（オンターゲット、マウスＷＴ ＲＨＯ）を発現するＡＡＶベクターで形質導入されたｍＮＰＣは、３．０ｅ＋５ ＭＯＩでの形質導入で、ＡＡＶ ＣａｓＸ４９１及びスペーサー１１．３９を有するガイド足場２３５と比較して、オンターゲット遺伝子座で増加した活性（＞２倍増加、図５０Ａ及び図５０Ｂ）を示した。活性の倍数改善が用量依存的様式で観察された。
これらの結果は、構造的変異を有するＣａｓＸバリアントを操作して、マウス及びヒトＲＨＯエキソン１遺伝子座などの治療的に関連するゲノム標的において二重レポーター系における編集活性の増加をもたらすことができることを支持する。更に、新たに特徴付けられたバリアントは、活性の全体的な１．５～２倍の増加を示したが、それらは対立遺伝子特異的標的化を保持し、１ｂｐミスマッチスペーサーで検出されるオフターゲット切断はなかった。これは、対立遺伝子特異的治療戦略（例えば、ａｄＲＰ Ｐ２３Ｈ Ｒｈｏでの編集）に関連し、ここで、変異対立遺伝子は、１ヌクレオチドだけＷＴ配列と異なる（スペーサー１１．３７によって標的化される）。この研究は更に、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯレスキュー及び遺伝毒性研究のために、並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおける足場２３５を有するＣａｓＸバリアント５２７、５３５、５３６の使用を検証する。
実施例１５：ＣａｓＸ及び標的化ガイドを有するＡＡＶ構築物は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてインビボでＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座を編集する
治療的に適切なレベルでＰ２３残基を標的とするスペーサーを用いて、マウス網膜における内因性ＲＨＯ遺伝子座をインビボで編集するＣａｓＸの能力を実証するために実験を実施して、Ｐ２３Ｈマウス疾患モデルにおける実験を正当化して知らせる概念実証データを生成した。ここで、本発明者らは、ＣａｓＸバリアント４９１及びガイドバリアント１７４、並びにマウスＲＨＯ遺伝子のＰ２３遺伝子座を標的とするスペーサーが、網膜下に注射された場合に網膜において有意な検出可能なものを生成することができるかどうかを評価し、２つの異なるウイルス用量（１．０ｅ＋９ｖｇ及び１．０ｅ＋１０ｖｇ）の有効性及び安全性を評価した。桿体光受容体の１０％のレスキューは、ＡｄＲＰの場合に視力を回復し得る。したがって、網膜の桿体光受容体におけるＲＨＯ遺伝子座の１０％を編集することは、変異型ロドプシンタンパク質のレベルを低下させ、桿体光受容体変性を予防することによって、疾患の状況において治療的利益を提供し得る。
材料及び方法：
ＡＡＶプラスミド及びウイルスベクターの生成
ＣＭＶプロモーターの制御下のＣａｓＸバリアント４９１及びＵ６プロモーター下のＲＮＡガイドバリアント１７４／スペーサー１１．３０（Ｐ２３残基でマウスＲＨＯエキソン１を標的とするＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ（配列番号４０５０２））を、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するｐＡＡＶプラスミドにクローニングした。ＡＡＶ．４９１．１７４．１１．３０ベクターを、三重トランスフェクション法を使用してＨＥＫ２９３細胞において産生した。
網膜下注射
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、通常の１２時間の明／暗サイクルで維持した。５～６週齢のマウスに網膜下注射を行った。マウスをイソフルラン吸入で麻酔した。プロパラカイン（０．５％）を角膜に局所的に適用し、眼をトロピカミド（１％）及びフェニレフリン（２．５％）の液滴で散大させた。手術の間、眼をゲンティールゲルで潤滑に保った。手術用顕微鏡下で、超微細３０ １／２ゲージ使い捨て針を、強膜の赤道及び縁に隣接して通過させて、硝子体腔への小さな穴を作製した。平滑末端針を使用して、１～１．５μＬのウイルスを、ＲＰＥと網膜層との間の網膜下腔に直接注射した。各実験群（ｎ＝５）の一方の眼に１ｅ＋９ｖｇ又は１ｅ＋１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／眼を注射し、反対側の眼にＡＡＶ製剤緩衝液を注射した。
ＮＧＳ分析
注射の３週間後、動物を屠殺し、眼を新鮮なＰＢＳ中で摘出した。全網膜を眼杯から単離し、製造業者の指示に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｇＤＮＡ抽出のために処理した。アンプリコンを、２００ｎｇのｇＤＮＡからプライマーセット（Ｆｗｄ ５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧ－３’（配列番号４０５９５）、Ｒｅｖ ５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＣ－３’（配列番号４０５９６））、エキソン１遺伝子座、ビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）を用いて増幅し、次いで再増幅して、ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を組み込んだ。具体的には、これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列並びに固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を導入するために５’末端に追加の配列を含有した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。
免疫組織学：
注射の３～４週間後にマウスを安楽死させた。摘出した眼を１０％ホルマリン中に４℃で一晩置いた。網膜を眼杯から切除し、ＰＢＳ中で完全にすすぎ、１５％～３０％スクロース勾配中に浸漬した。組織を最適切断温度（optimal cutting temperature、ＯＣＴ）で包埋し、ドライアイス上で凍結させた後、－８０’Ｃの保存に移した。２０μＭ切片を、クリオスタットを用いて切断した。抗体標識の前に、ブロッキング緩衝液（２％正常ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）中、室温で１時間以上、切片をブロッキングした。使用した抗体は、抗マウスＨＡ（ａｂｃａｍ、１：５００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ウサギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）であった。切片をＤＡＰＩで対比染色して核を標識し、スライド上に載せ、蛍光顕微鏡で画像化した。
結果：
本発明者らは、マウス網膜におけるＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座を編集するＣａｓＸの能力を評価した。５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜下腔に、治療上適切な２つの用量、１．０ｅ＋９及び１．０Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ－ＣａｓＸ．４９１．１７４．１１．３０を投与した。注射の３週間後、網膜を採取し、ＮＧＳ及びＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ分析パイプラインを介して編集レベルを定量化した。スペーサー１１．３０は、ＲＨＯの第１のエキソンの開始に位置するＷＴ Ｐ２３ゲノム遺伝子座（図５１）を標的とする。ＣａｓＸ－４９１．１７４．１１．３０の過剰発現は、偽注射された網膜と比較して処理した網膜中のｍＲＨＯエキソン１遺伝子座の有意な用量依存的編集をもたらした（図５２Ａ～図５２Ｂ）。左パネル（図５２Ａ）は、マウス参照ゲノムと比較した、ＡＡＶ－ＣａｓＸ又は偽注射された網膜におけるマウスＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座でＮＧＳによって検出された総インデルの定量化（％）を示す。右パネル（図５２Ｂ）は、ＲＨＯタンパク質におけるフレームシフト変異をもたらすと予測される編集の割合（％）を示す。データは、実験コホート当たり６～８匹の動物からの網膜全体からの編集結果のＮＧＳ読み出しの平均として提示される。最も高いＡＡＶ用量、１ｅ＋１０ｖｇ／眼は、インデル率を１．０ｅ＋９ｖｇ用量と比較して４倍増加させ、それぞれ４０．３±２２％対１２．３±５％のＲＨＯ編集が検出された。ＣａｓＸ．４９１によって生成されたインデルの大部分は欠失であり（左パネル）、高頻度のフレームシフト変異（それぞれ１．０ｅ＋９及び１．０ｅ＋１０ｖｇ／用量について６４．７％対７６．９％）、及び仮定的に高レベルのＲＨＯタンパク質ノックダウンに翻訳されると予測された。これらの結果は、Ｐ２３Ｈ＋／－マウスモデルにおける変異体Ｐ２３Ｈ遺伝子座のスペーサー駆動対立遺伝子特異的標的を用いて、ＣａｓＸが桿体光受容体の１０％を効率的に編集することができ、編集の大部分が変異体Ｐ２３Ｈ Ｒｈｏのノックダウンに翻訳され、光受容体変性を有意に遅延させることを示唆している。
注入された網膜断面に対して実施された免疫組織化学は、光受容体層におけるＣａｓＸ発現を確認したが、図５３Ａ～図５３Ｆに示されるように、内層へのウイルスの拡散も示した。処置群は、１．０ｅ＋９ｖｇのＡＡＶ－ＣａｓＸ（図５３Ｂ及び図５３Ｅ）、１．０ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ－ＣａｓＸ（図５３Ｃ及び図５３Ｆ）、又はＰＢＳ（図５３Ａ及び図５３Ｄ）であった。ＨＡタグ付きＣａｓＸのレベルは、１ｅ９ｖｇ（図５３Ｂ及び図５３Ｅ）及び１ｅ１０ｖｇ（図５３Ｃ及び図５３Ｆ）の両方を注射した網膜において、外顆粒層（outer nuclear layer、ＯＮＬ）並びに外節に位置する光受容体細胞体における抗ＨＡ抗体染色（図５３Ｅ及び図５３Ｆの下パネル）によって評価した。偽（図５３Ａ及び図５３Ｃ）注射を投与した対照網膜は、ＲＰＥ／強膜においてＨＡ染色（図５３Ｄ）についてのバックグラウンドレベルのシグナルのみを示し、ＯＮＬ／ＩＮＬ層において検出可能なレベルを有しなかった。追加的に、肉眼的組織学的分析は、網膜構造がＡＡＶパッケージングＣａｓＸ構築物の網膜下投与後に維持されたことを示した。
実験の条件下で、結果は、ＣａｓＸ４９１、足場１７４、及びマウスＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座を標的とするスペーサーが、マウス網膜においてＡＡＶを介して網膜下送達された場合に、Ｐ２３マウス遺伝子座において治療的に関連するレベルの編集を達成することができるという概念実証を実証する。
実施例１６：光受容体におけるＣａｓＸのＡＡＶ媒介性選択的発現は、ＮＧＳ及び構造分析によるインビボでの強いオンターゲット活性をもたらす。
野生型網膜のＰ２３残基を治療的に適切なレベルで標的としたスペーサーをもつ、ＣａｓＸの発現を選択的光受容体プロモーターで制限することにより、ＣａｓＸがマウスの光受容体を選択的に編集することができることを実証するために実験を行った。本発明者らは更に、桿体光受容体においてのみＧＦＰを発現するトランスジェニックレポーターモデルにおける編集レベルとプロテオミクスレベルとの間の強い相関を示す。ここで、本発明者らは、組み込まれたＧＦＰ遺伝子座を標的とするスペーサーを有するＣａｓＸバリアント４９１及びガイドバリアント１７４が、網膜下に注射された場合に網膜において有意な検出可能な編集レベルを生じさせるかどうかを評価し、２つの異なるウイルス用量（眼当たり１．０ｅ＋９及び１．０ｅ＋１０ｖｇ）の有効性を評価した。
方法：
ＡＡＶプラスミド及びウイルスベクターの生成：様々な光受容体特異的プロモーター（内因性ロドプシンＲＨＯプロモーターに基づくＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、及び内因性Ｇ共役網膜キナーゼＧＲＫ１プロモーターに基づくＲＰ４、ＲＰ５、表２２の配列）及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるＣａｓＸバリアント４９１、並びにＵ６プロモーター下のｓｇＲＮＡガイドバリアント１７４／スペーサー１１．３０（Ｐ２３残基でマウスＲＨＯエキソン１を標的化するＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ（配列番号４０５０２））を、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するｐＡＡＶプラスミドにクローニングした。各側にＥｃｏＲＩ制限部位を用いて増幅したＷＰＲＥ配列を、ＥｃｏＲＩ消化ｐ５９．ＲＰ４．４９１．１７４．１１．３０及びｐ５９．ＲＰ５．４９１．１７４．１１．３０プラスミドに挿入した。Ｎｒｌ－ＧＦＰモデルにおける効力研究のために、ＧＦＰを標的とするスペーサー４．７６（ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号１７））を、スペーサー領域に隣接するｂｂｓＩ制限部位を有するＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを使用して、ＡＡＶ－ｃｉｓプラスミドｐ５９．ＲＰ１．４９１．１７４にクローニングした。
＊ＮＤ＝記載なし、配列表に提供される配列。
ＡＡＶベクター産生：懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で増殖させた。５００ｍＬ培養物（１Ｌ三角フラスコ、１１０ｒｐｍで撹拌）を、トランスフェクションの日に２ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンを含まないｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を４０００ｒｐｍで２０分間、４℃でスピンして、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を細胞破片を含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、０．４５μＭフィルターを使用して更に清澄化した。ＡＡＶ溶解物を、アフィニティークロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。溶出液を緩衝液交換し、ＰＢＳ＋２００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．００１％プルロニック中で濃縮した。ウイルスゲノム力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＡＡＶ２－ＩＴＲに位置する６２ｂｐ断片（Ｆｗｄ ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号４０８０４）、Ｒｅｖ ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号４０８０５）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’（配列番号４０８０６）を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドを参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５’Ｃで５分間の初期変性ステップ、その後、９５’Ｃで１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル行った。
ＡＡＶベクターＡＡＶ．ＲＰ１．４９１．１７４．４．７６は、ＨＥＫ２３９Ｔにおける三重トランスフェクション法を使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにおいて産生された。
網膜下注射：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びヘテロ接合性Ｎｒｌ－ＧＦＰ／Ｃ５７ＢＬ／５Ｊマウス（Jackson Laboratories）を、通常の１２時間の明／暗サイクルで維持した。４～５週齢のマウスに網膜下注射を行った。マウスをイソフルラン吸入で麻酔した。プロパラカイン（０．５％）を角膜に局所的に適用し、眼をトロピカミド（１％）及びフェニレフリン（２．５％）の液滴で散大させた。手術の間、眼をゲンティールゲルで潤滑に保った。手術用顕微鏡下で、超微細３０ １／２ゲージ使い捨て針を、強膜の赤道及び縁に隣接して通過させて、硝子体腔への小さな穴を作製した。平滑末端針を使用して、１～１．５μＬのウイルスを、ＲＰＥと網膜層との間の網膜下腔に直接注射した。実験群からの各マウスの一方の眼に１．０ｅ＋９、５．０ｅ＋９又は１．０ｅ＋１０ゲノム（ｖｇ）／眼を注射し、反対側の眼にＡＡＶ製剤緩衝液を注射した。
ウェスタンブロット：タンパク質溶解物を生成するために、眼を新たに摘出し、氷冷ＰＢＳ中で解剖し、ドライアイス中で急速凍結し、網膜当たり個々の１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中のプロテアーゼ阻害剤（最終濃度５ｍｇ／ｍＬ）、ＤＴＴ及びＰＭＳＦ（それぞれ最終濃度１ｍＭ）を新たに補充したＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、ｄＨ ２０）中に再懸濁した。網膜組織を、ＲＮＡを含まない使い捨てペレット乳棒（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２－１４１－３６４）を使用して小片に更にホモジナイズし、氷上で３０分間インキュベートし、チューブを時々ひっくり返して穏やかに混合した。次いで、試料を４ｏＣで最高速度で２０分間遠心分離して、ゲノムＤＮＡをペレット化した。次いで、タンパク質抽出物及びｇＤＮＡ細胞ペレットを分離した。タンパク質抽出物については、上清を回収した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって決定し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで読み取った。１５μｇのマウス網膜の総タンパク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＧＸゲル）によって分離し、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏを使用してポリビニリデンジフルオリド膜に移した。膜を５％脱脂粉乳で室温で１時間ブロックし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、ブロットを、Ｔｗｅｅｎ－２０（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）を含むトリス緩衝生理食塩水で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ又は抗マウス二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、化学発光基質ＥＣＬを用いて膜を現像し、ＣｈｅｍｉｃＤｏｃ（Ｘ）上で画像化した。ブロット画像をＩｍａｇｅＬａｂで処理した。
ＮＧＳ分析：動物を屠殺し、眼を新鮮なＰＢＳ中で摘出した。全網膜を眼杯から単離し、ウェスタンブロットの項で前述したようにｇＤＮＡ抽出のために処理した。ゲノムｇＤＮＡペレットを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の説明書に従って処理した。対象のゲノム領域を標的とするプライマーセット（表２３）を用いて、２００ｎｇのｇＤＮＡからアンプリコンを増幅した。アンプリコンをビーズ精製し（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）、次いで、再度増幅して、ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を組み込んだ。具体的には、これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列並びに固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を導入するために５’末端に追加の配列を含有した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。
免疫組織学：摘出した眼を１０％ホルマリン中に４℃で一晩置いた。網膜を眼杯から切除し、ＰＢＳ中で完全にすすぎ、１５％～３０％スクロース勾配中に浸漬した。組織を最適切断温度（ＯＣＴ）で包埋し、ドライアイス上で凍結させた後、－８０’Ｃの保存に移した。２０μＭ切片を、クリオスタットを用いて切断した。抗体標識の前に、ブロッキング緩衝液（２％正常ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）中、室温で１時間以上、切片をブロッキングした。使用した抗体は、抗マウスＨＡ（ａｂｃａｍ、１：５００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ウサギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２０００）であった。スライドをＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）で対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ退色防止封入剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）でマウントした。続いて、ＬＳＭ－７１０倒立共焦点顕微鏡システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して共焦点蛍光イメージングを行った。
結果：
複数の人工網膜プロモーター及び遍在性プロモーターの制御下でＣａｓＸ ４９１を発現するＡＡＶベクターを網膜下に注射した３週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪのｍＲＨＯエキソン遺伝子座における編集レベルを定量して、スペーサー１１．３０を有する光受容体において強いレベルの編集を駆動するプロモーターを同定した。桿体特異的ＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４プロモーターは、非常に類似したレベルの編集（約２０％）を媒介した。ベクターＡＡＶ．ＲＰ５．４９１．１７４．１１．３０及びＡＡＶ ＲＰ５．４９１．ＷＰＲＥ．１７４．１１．３０は、より低い発現レベルをもたらした（それぞれ約１０及び８％、図５４Ａ）。本発明者らは、光受容体における高レベルの編集をインビボで達成すること、並びに導入遺伝子プラスミドをＡＡＶ内にパッケージングするためにサイズ（同様のレベルの活性を有する他の構築物よりも１００～４００ｂｐ短い、図５４Ｂ）が有意に小さくなるように作製することを目的として、最適化ベクターＡＡＶ．ＲＰ１．４９１．１７４．１１．３０を更なる機能及び分布研究のための最も強力なベクターとして同定した。この最適化された構築物を、桿体光受容体においてＧＦＰを発現するトランスジェニックモデル（桿体特異的又はタンパク質のノックダウンを検証するために当該分野において使用される好都合なモデル）において有効性研究を行うことによって更に検証した。有効性を研究するために、ＡＡＶ．ＲＰ１．４９１．１７４．４．７６ベクターを２つの異なる用量で注射した。注射の４週間後及び１２週間後に、本発明者らは、組み込まれたＧＦＰ遺伝子座における編集のレベルをＮＧＳによって定量化し、検出可能な編集レベルを観察した。１．０Ｅ＋９ｖｇ／眼用量群では、約８％の編集レベルが観察された。１．０ｅ＋１０ｖｇを注射した増加用量群では、１０％の編集レベルが４週間で検出可能であり、これは、注射の１２週間後の追跡時点で２倍増加した（図５５）。
編集レベルは、構造解析及びプロテオミクス分析によって確認した。注射後１２週目の網膜溶解物のウェスタンブロット分析は、編集のレベルとＧＦＰタンパク質の減少との間の強い相関を示し（図５６Ａ及び図５６Ｃ）、タンパク質ノックダウンは、網膜全体において５％という低い編集で検出された。ＧＦＰタンパク質レベルは、１．０ｅ＋１０ｖｇ／眼用量でＡＡＶ－ＣａｓＸ処置網膜においてビヒクル群よりも有意に低かった（図５６Ｂ）。
これらの結果はまた、ＧＦＰ蛍光のインビボ眼底イメージングによっても確認された。上網膜対下網膜の平均グレー値の比は、１２週目までに２０％及び５０％のＧＦＰ蛍光の減少を示した（図５７Ａ）。ビヒクル群と比較して、注射された網膜においてのみ網膜下注射を投与した四分円内で、経時的なＧＦＰ蛍光の完全な減少が見られた（図５７Ｂ）。
免疫化学染色により、桿体光受容体におけるＧＦＰタンパク質発現の減少が確認された（図５８Ａ～図５８Ｌ）。代表的な共焦点画像は、ＡＡＶ製剤緩衝液のみを注射した網膜における強いＧＦＰ発現を示す。全網膜はＧＦＰを発現しており、核染色と一致している（図５８Ａ～図５８Ｃ）。ＡＡＶ媒介性ＣａｓＸ導入遺伝子発現の読み出しとして、ＨＡ発現は検出可能でなかった（図５８Ｄ）。
１．０ｅ＋９及び１．０ｅ＋１０を注射した網膜は、用量依存的様式で、全網膜切片におけるＧＦＰ発現の強い減少を示し（図５８Ｅ～図５８Ｌ）、これは、ＨＡのみの桿体外節（outer segment、ＯＳ）及び外顆粒層（ＯＮＬ）の検出可能なレベルと相関し、桿体光受容体に対するプロモーターＲＰ１選択性を確認した。高用量処置は、注射された網膜の完全なノックダウンをもたらしたが（注射は上勾配に限定されるので、網膜全体におけるＧＦＰノックダウンの約５０％）、１．０ｅ＋９ｖｇ用量は、対照（図５８Ｃ）と比較して、局在化領域（図５８Ｇ及び図５８Ｋ）におけるＧＦＰ発現の約５０％を減少させた。
結果は、ＣａｓＸ４９１、足場１７４、及びマウスＰ２３ ＲＨＯ遺伝子座を標的とするスペーサーが、ＡＡＶ媒介網膜下送達を介して、治療細胞標的である桿体光受容体においてのみ発現された場合に、Ｐ２３マウス遺伝子座において治療関連レベルの編集を達成することができるという概念実証を実証する。更に、ベクターの特異性及び有効性は、光受容体においてＧＦＰを過剰発現するレポーターモデルに組み込まれたＧＦＰ遺伝子座を標的とする追跡研究を行うことによって実証され、その結果は、ウェスタンブロット、眼底イメージング及び組織学によって評価される編集レベルとタンパク質ノックダウンとの間の強い相関を示す。
実施例１７：ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、パッケージ化され、ＡＡＶを介して送達された場合、ヒト神経前駆細胞及び誘導ニューロンを効率的に編集することができることの実証
実験を行って、インビトロでのヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）及び誘導ニューロン（ｉＮ）の編集におけるＡＡＶ発現ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の効率を実証した。
材料及び方法：
ＡＡＶ構築物クローニング：
ＣａｓＸバリアント４９１及びガイド足場バリアント２３５をこれらの実験で使用した。
ｈＮＰＣにおけるＡＡＶ発現ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の編集能力を評価するために、ＣａｓＸ発現を駆動するＵｂＣプロモーター、並びに内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とする足場バリアント２３５及びスペーサー７．３７を有するｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ ＩＩＩプロモーター足場を含有するＡＡＶ構築物（ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ、配列番号３７９、構築物ＩＤ１８３に組み込まれた）を、標準的な分子クローニング技術を使用して生成した。クローニング及び配列検証された構築物をマキシプレップし、ＡＡＶ産生のためのトランスフェクションの前に品質評価に供した。
ヒトｉＮにおけるＡＡＶ発現ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の編集能力を評価する実験のために、ＡＡＶＳ１標的化スペーサー３１．１２（ＵＵＣＵＣＧＧＣＧＣＵＧＣＡＣＣＡＣＧＵ、配列番号４１８３０、構築物ＩＤ１８８に組み込まれる）、３１．６３
（ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＵＵＵＧＧ、配列番号４１８３１、構築物ＩＤ１８９に組み込まれる）、又は３１．８２（ＧＧＧＧＣＣＵＧＵＧＣＣＡＵＣＵＣＵＣＧ、配列番号４１８３２、構築物ＩＤ１９０）を有するＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡをコードするＡＡＶ構築物を、記載されるように同様に生成した。非標的スペーサー０．１（ＡＧＧＧＧＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣ、配列番号４１８３３）もこれらの実験で使用した。ヒトｉＮｓにおけるＢ２Ｍ遺伝子座を編集するためにｇＲＮＡスペーサー７．３７を有するＣａｓＸ４９１の発現を駆動する様々なタンパク質プロモーターを評価する実験のために、これらのタンパク質プロモーターバリアントを含有するＡＡＶ構築物を、記載されるように同様に生成した（タンパク質プロモーターバリアントの配列については表２４を参照されたい）。ＣａｓＸタンパク質をコードする配列（表２１）を除いて、ＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。
＊ＮＤ＝記載なし。
ＡＡＶ産物：
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地中で維持された懸濁適合ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの日に１．５Ｅ６細胞／ｍＬで２０～３０ｍＬの培地中に播種した。ＩＴＲ反復に隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンフリーｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中でＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を４０％ＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌと混合し、氷上でインキュベートしてＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含有する細胞ペレットを溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で３７℃にて３０分間処理した。ＰＥＧ処理上清を遠心分離して沈殿したＡＡＶをペレット化し、粗溶解物を遠心分離してウイルス含有上清から細胞破片を除去した後、０．４５μｍフィルターを使用した更なる清澄化のために収集したウイルスを合わせた。ＡＡＶ溶解物を、アフィニティークロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して精製し、溶出液を緩衝液交換し、ＰＢＳ＋２００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．００１％プルロニック中で濃縮した。
ウイルスゲノム（viral genome、ｖｇ）力価を決定するために、粗溶解物ウイルスからの１μＬをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴプライムタイムマスターミックス並びにＡＡＶ２－ＩＴＲに位置する６２ｂｐ断片を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成される２５μＬのｑＰＣＲ反応において使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドを参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ｖｇ／ｍＬ）を計算した。ｑＰＣＲプログラムを以下のように設定した：９５’Ｃで５分間の初期変性ステップ、その後、９５’Ｃで１分間の４０サイクルの変性、及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長。
インビトロでのｈＮＰＣの培養：
不死化ｈＮＰＣをｈＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ ＮＥＡＡ、ビタミンＡを含まない１Ｘ Ｂ－２７、１Ｘ Ｎ２補充増殖因子ｈＦＧＦ及びＥＧＦ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、並びに２－メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養した。試験前に、細胞をＴｒｙｐＬＥで持ち上げ、穏やかに再懸濁してニューロスフェアを解離させ、培地でクエンチし、スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。細胞を計数し、ＡＡＶ形質導入の２４時間前に、ＰＬＦ（ポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、ラミニン、及びフィブロネクチン）でコーティングした９６ウェルプレート上にウェル当たり約１０，０００細胞の密度で直接播種した。
ｈＮＰＣのＡＡＶ形質導入、それに続くＨＬＡ免疫染色及びフローサイトメトリー：
約７，０００細胞／ウェルのｈＮＰＣを、ＰＬＦコーティング９６ウェルプレート上に播種した。２４時間後、播種した細胞をＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを発現するＡＡＶで処理した。全てのウイルス感染条件は、１Ｅ４～１Ｅ６ｖｇ／細胞の範囲のＭＯＩの一連の３倍連続希釈で、実験ベクター間のウイルスゲノム数（ｖｇ）を正規化して、少なくとも２連で行った。形質導入の５日後、ＡＡＶ処理ｈＮＰＣをＴｒｙｐＬＥでリフトした。細胞解離後、染色緩衝液（ｄＰＢＳ中３％ウシ胎児血清）をクエンチのために使用した。解離した細胞を丸底９６ウェルプレートに移し、続いて遠心分離し、細胞ペレットを染色緩衝液で再懸濁した。更に遠心分離した後、細胞表面上に発現されたＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質を検出する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する染色緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁した。ＨＬＡ免疫染色の後、細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した。ＨＬＡ＋ｈＮＰＣを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して測定した。ＨＬＡタンパク質発現の減少又は欠如は、これらのｈＮＰＣにおけるＢ２Ｍ遺伝子座での編集の成功を示す。形質導入されたｈＮＰＣのサブセットもまた、次世代配列決定（ＮＧＳ）によるゲノムＤＮＡ抽出及び編集分析のためにリフトした。
ＮＧＳ処理及び分析：
回収した細胞からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、製造業者の説明書に従ってＺｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキットを使用して抽出した。標的アンプリコンは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子座などの標的遺伝子座に特異的なプライマーのセットを用いて、２００ｎｇの抽出されたｇＤＮＡから目的の領域を増幅することによって形成した。これらの遺伝子特異的プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及び１６ヌクレオチドの固有分子識別子を導入するために５’末端に追加の配列を含有する。増幅されたＤＮＡ産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製した。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを品質管理し、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ２．１、ｆｌａｓｈ２ ｖ２．２．００、及びＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｖ２．０．２９を使用して処理した。各配列を、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において、参照配列に対する挿入又は欠失（インデル）を含有することについて定量した。ＣａｓＸ活性は、各試料について、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換、及び／又は欠失を含有するリードの総パーセントとして定量化した。
人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）のリプログラミング：
患者由来の線維芽細胞をＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した。ｉＰＳＣは、エピソームリプログラミングによってこれらの株から生成され、ニューロン分化を加速するためにニューロゲニン２（Ｎｅｕｒｏｇ２）を異所的に発現するように遺伝子操作された。３つのｉＰＳＣクローンを下流実験のために選択した。
神経細胞培養：
全ての神経細胞培養は、Ｎ２Ｂ２７ベースの培地を用いて行った。ニューロン分化を誘導するために、ｉＰＳＣをニューロン播種培地（１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン、２００μＭのＬ－アスコルビン酸、１μＭのジブチリルｃＡＭＰナトリウム塩、１０μＭ ＣｕｌｔｕｒｅＯｎｅ、１００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦを含むＮ２Ｂ２７基本培地）に播種した。分化の３日後（ＤＩＶ３）、ｉＮを解離させ、等分し、長期保存のために凍結させた。ＤＩＶ３ ｉＮを解凍し、９６ウェルプレートに３０，０００細胞／ウェルで播種した。ｉＮを平板培地中で１週間培養し、その後、半培地交換を、供給培地（２００μＭのＬ－アスコルビン酸、１μＭのジブチリルｃＡＭＰナトリウム、２００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦを含むＮ２Ｂ２７基本培地）を用いて毎週１回行った。
インビトロでのｉＮのＡＡＶ形質導入：
形質導入の２４時間前に、ウェル当たり約３０，０００～５０，０００個のｉＮをマトリゲルコーティング９６ウェルプレート上に播種した。次いで、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを発現するＡＡＶを、ニューロンプレーティング培地中で希釈し、細胞に添加し、条件当たり６ウェルを複製として使用した。細胞を様々なＭＯＩ（図６１については１Ｅ４又は１Ｅ５ｖｇ／細胞、図６２については２Ｅ４又は６．６７Ｅ３）で形質導入した。形質導入の７日後、供給培地を使用してｉＮを補充した。形質導入の１４日後、溶解緩衝液を使用して細胞をリフトし、６ウェル複製物をプールし、ｇＤＮＡを採取し、ＮＧＳを使用するヒトＡＡＶＳ１又はＢ２Ｍ遺伝子座のいずれかでの編集分析のために調製した。
結果
図６０は、様々なＭＯＩでのＡＡＶによる形質導入の５日後のヒトＮＰＣにおける２つの異なる評価（ＮＧＳによって遺伝子型的に定量化されたインデル率として、及びフローサイトメトリーによって検出された表現型読み出しＢ２Ｍ細胞集団として）を介して測定されたＢ２Ｍ遺伝子座における編集パーセントの定量化を示す。ヒトＢ２Ｍ遺伝子座での効率的な編集が観察され、最高レベルの編集が約３Ｅ５のＭＯＩで達成された：約５０％のインデル率及びＢ２Ｍタンパク質ノックアウト表現型を示す細胞の約１３％。図６１はまた、ヒトｉＮにおけるＡＡＶＳ１遺伝子座での効率的な編集を示し、構築物ＩＤ１８９は、１Ｅ５のより高いＭＯＩで約９０％の編集を達成する。予想通り、非標的化スペーサーを有するＡＡＶＳ１遺伝子座では編集は観察されなかった。
図６２は、ＣａｓＸバリアント４９１の発現を駆動するために使用される様々なタンパク質プロモーターのうちのいくつかについて、Ｂ２Ｍ遺伝子座における強力な編集が達成されたことを示す。簡潔には、示された導入遺伝子構築物を用いてＡＡＶを生成し、２Ｅ４又は６．６７Ｅ３のいずれかのＭＯＩでヒトｉＮに形質導入した。ＡＡＶ構築物１７７及び１８３は、いずれかのＭＯＩで少なくとも８０％の効率で、最も高い編集活性を示したプロモーターを含んでいた。
これらの実験の結果は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子座又はヒトＡＡＶＳ１遺伝子座のいずれかを標的とするスペーサーを有するＣａｓＸバリアント４９１及びガイド足場２３５が、インビトロでパッケージ化され、ＡＡＶを介してヒトＮＰＣ又はｉＮに送達された場合に、オンターゲットで効率的に編集することができることを実証する。
実施例１８：ＣｐＧ欠失ＡＡＶは、有効なＣａｓＸ媒介性編集を実証し、インビトロでより少ないＴＬＲ ９媒介性免疫応答を誘導する
非メチル化ＣｐＧモチーフなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、微生物のクラス内で保存されている小分子モチーフである。それらは、真核生物においてｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及び他のパターン認識受容体によって認識され、しばしば非特異的免疫活性化を誘導する。遺伝子治療に関連して、ＰＡＭＰを含有する治療薬は、多くの場合、忍容性が良好ではなく、誘発される強い免疫応答を考慮すると、患者から急速に除去され、これは最終的に治療効率の低下につながる。ＣｐＧモチーフは、ジヌクレオチドＣＧを含む短い一本鎖ＤＮＡ配列である。これらのＣｐＧモチーフがメチル化されていない場合、それらはＰＡＭＰとして作用し、したがって免疫応答を強力に刺激する。
ＣａｓＸバリアント４９１、ガイド足場バリアント２３５、及び内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的とするスペーサー７．３７をコードするＡＡＶ構築物（構築物ＩＤ１８３）中のＣｐＧモチーフを欠失させるため、並びにＣｐＧ欠失ＡＡＶベクターがインビトロで効果的に編集することができることを実証するために、実験を行った。更に、インビトロでのＴＬＲ ９媒介性免疫応答の活性化に対するＣｐＧ欠失の効果を評価するために実験を行う。ＡＡＶゲノムの個々のエレメント及びそれらのそれぞれのＣｐＧ減少バージョンを、最初に、編集活性及び免疫原性のインビトロ評価に供して、強力な編集を生じるが、望ましくないＴＬＲ９活性化を減少させる最適なＣｐＧ欠失配列を同定し、その後、組み合わせて、更なる評価のためにＣｐＧの存在が劇的に減少したＡＡＶゲノムを生成する。
材料及び方法：
ＣｐＧ欠失ＡＡＶプラスミドの生成：
天然ＣｐＧモチーフを置換するためのヌクレオチド置換を、以下のエレメントについての関連種由来の相同ヌクレオチド配列に基づいてインシリコで設計した：マウスＵ１ａ ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）遺伝子プロモーター、ヒトＵｂＣ（ポリユビキチンＣ）遺伝子プロモーター、ｂＧＨｐＡ（ウシ成長ホルモンポリアデニル化）配列、及びヒトＵ６プロモーター。以前に記載されているように、ＣａｓＸ４９１のコーディング配列をＣｐＧ欠失のためにコドン最適化し、ＡＡＶ２ ＩＴＲをＣｐＧ欠失させた（Ｐａｎ Ｘ，Ｙｕｅ Ｙ，Ｂｏｆｔｓｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣｐＧ－ｆｒｅｅ ＩＴＲ ｆｏｒ ＡＡＶ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４３４－０２１－００２９６－０）。全ての得られた配列（表２５）を、既存の基本ＡＡＶプラスミド（構築物ＩＤ１８３）の対応するエレメントを個々に置換するためのクローニング及び等温アセンブリのための適切なオーバーハングを有する遺伝子断片として順序付けた。内在性遺伝子β－２－ミクログロブリン（ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｂ２Ｍ）を標的とする、スペーサー７．３７（ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ、配列番号３７９）を、本実施例で考察される関連実験に使用した。等温アセンブリ後、ＡＡＶ構築物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｂｌ３ｓ）に形質転換し、これをカナマイシンＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で１時間回復させた。単一コロニーをコロニーＰＣＲのために採取し、サンガー配列決定した。配列検証された構築物を、その後のヌクレオフェクション及びＡＡＶベクター産生のためにミディ調製した。ＣａｓＸをコードする配列（表２１）を除いて、ＣｐＧを欠失していないＡＡＶ構築物の更なる成分の配列を表２６に列挙する。ＣＲＩＳＰＲ成分の強力な発現及び編集活性の保持の実証に基づいて、表２６の残りの未改変成分を有するＡＡＶ構築物を改変してＣｐＧモチーフを欠失させ、実施例１７に記載の方法を用いて評価する。
ＡＡＶベクターの産生は、実施例１７において先に記載したように行った。
ウイルスゲノム力価を、実施例１７において先に記載したように決定した。
インビトロでのヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）の培養：
不死化ｈＮＰＣをｈＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｘ ＮＥＡＡ、ビタミンＡを含まない１Ｘ Ｂ－２７、１Ｘ Ｎ２補充増殖因子ｈＦＧＦ及びＥＧＦ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、並びに２－メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養した。試験前に、細胞をＴｒｙｐＬＥで持ち上げ、穏やかに再懸濁してニューロスフェアを解離させ、培地でクエンチし、スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。細胞を計数し、ヌクレオフェクションに直接使用するか、又はＡＡＶ形質導入の４８時間前に、ＰＬＦ（ポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、ラミニン、及びフィブロネクチン）でコーティングした９６ウェルプレート上にウェル当たり約１０，０００細胞の密度で播種する。
ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）へのプラスミドヌクレオフェクション：
ＡＡＶゲノムの個々のエレメントのＣｐＧ欠失を伴う又は伴わない、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードするＡＡＶプラスミドを、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、ｈＮＰＣにヌクレオフェクトした。プラスミドを２つの濃度：５０ｎｇ／μＬ及び２５ｎｇ／μＬに希釈した。５μＬのＤＮＡを、１８％Ｖ／Ｖ Ｐ３サプリメントを補充したＬｏｎｚａ Ｐ３溶液中の２０μＬの２００，０００ ｈＮＰＣと混合した。プログラムＥＨ－１００に従ってＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、合わせた溶液をヌクレオフェクトした。その後、ヌクレオフェクトした溶液を適切な培養培地でクエンチし、次いで、ＰＬＦでコーティングした９６ウェルプレートの３つのウェルに分けた。ヌクレオフェクションの７日後、ｈＮＰＣを、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーによるＢ２Ｍタンパク質発現分析のために採取した。続いて、実質的なＣｐＧ欠失を有する組み合わされたＡＡＶゲノムを作製するための個々のＣｐＧ欠失エレメントのスタッキングが行われ、インビトロでのＢ２Ｍ遺伝子座における編集評価について同様に試験される。
ＨＬＡ免疫染色及びフローサイトメトリーによる編集活性評価：
ヌクレオフェクションの７日後、ＡＡＶ処理ｈＮＰＣをＴｒｙｐＬＥでリフトした。細胞解離後、染色緩衝液（ｄＰＢＳ中３％ウシ胎児血清）をクエンチのために使用した。解離した細胞を丸底９６ウェルプレートに移し、続いて遠心分離し、細胞ペレットを染色緩衝液で再懸濁した。更に遠心分離した後、細胞表面上に発現されたＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質を検出する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有する染色緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁した。ＨＬＡ免疫染色の後、細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した。ＨＬＡ＋ｈＮＰＣを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して測定した。
インビトロでのｈＮＰＣのＡＡＶ形質導入：
約１０，０００細胞／ウェルのｈＮＰＣを、ＰＬＦでコーティングした９６ウェルプレートに播種する。４８時間後、播種した細胞を、ＡＡＶゲノムの個々のエレメントのＣｐＧ欠失を伴う又は伴わない、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを発現するＡＡＶで処理する。全てのウイルス感染条件は、少なくとも二連で行われる。形質導入の５～７日後、ｈＮＰＣは、記載されるように、ＨＬＡ免疫染色、続いてフローサイトメトリーによる編集活性評価のためにリフトされる。続いて、実質的なＣｐＧ欠失を有する組み合わされたＡＡＶゲノムを作製するための個々のＣｐＧ欠失エレメントのスタッキングが行われ、インビトロでのＢ２Ｍ遺伝子座における編集評価について同様に試験される。
ＣｐＧ含有（ＣｐＧ＋）又はＣｐＧ欠失（ＣｐＧ－）ＡＡＶによる形質導入後のインビトロ免疫原性評価のためのヒトＴＬＲ９レポーターＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９）の使用：
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＴＬＲ ９誘導性ＮＦ－κＢシグナル伝達の研究のために特別に設計されたＨＥＫ２９３細胞に由来する。これらのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９細胞は、ヒトＴＬＲ９遺伝子、並びにＮＦ－κＢ誘導性プロモーターの制御下にあるＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を過剰発現する。比色アッセイを使用して定量化することができる細胞培養培地上清中のＳＥＡＰレベルは、ＴＬＲ９活性化を報告する。
この実験のために、５，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９細胞を、１０％ＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ培地中の９６ウェルプレートの各ウェルに播種する。翌日、播種した細胞に、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを発現するＣｐＧ＋又はＣｐＧＡＡＶを形質導入した。全てのウイルス感染条件は、１Ｅ６ｖｇ／細胞の有効ＭＯＩで開始するＭＯＩの一連の３倍連続希釈において、実験ベクター間のウイルスゲノム（ｖｇ）の正規化された数を用いて、少なくとも二連で行われる。細胞培養培地上清中の分泌されたＳＥＡＰのレベルを、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出キットを使用して、形質導入後１、２、３、及び４日目に製造業者の説明書に従って評価する。
結果
図６３は、ＣｐＧ含有（ＣｐＧ＋）又はＣｐＧ欠失（ＣｐＧ－）ＡＡＶベクターでヌクレオフェクトされたｈＮＰＣにおけるＢ２Ｍ遺伝子座での編集活性を評価するアッセイの知見を示す。編集活性は、Ｂ２Ｍ遺伝子座で編集され、細胞表面上のＢ２Ｍ発現の低減／欠如（Ｂ２Ｍ－）をもたらすｈＮＰＣのパーセンテージとして測定した。図６３は、Ｕ１ａプロモーター（構築物ＩＤ１７８及び１７９）、Ｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーター（構築物ＩＤ１８０及び１８１）、又はｂＧＨポリ（Ａ）（構築物ＩＤ１８２）の配列内のＣｐＧモチーフの減少又は欠失が、元のＣｐＧ＋ＡＡＶ構築物（構築物ＩＤ１７７）を用いて達成された編集レベルと比較して、編集活性を実質的に減少させなかったことを示す。具体的には、ＣｐＧ－Ｕ１ａ、ＣｐＧ－Ｕ６、又はＣｐＧ－ｂＧＨは、基本ＣｐＧ＋ＡＡＶ構築物で達成された編集レベルの約８０％、約９４％、又は約８３％の編集をもたらした。しかしながら、ＵｂＣプロモーター配列（構築物ＩＤ１８４、１８５、及び１８６）内のＣｐＧモチーフを減少又は欠失させると、基本ＵｂＣ構築物（構築物ＩＤ１８３）で見られるレベルと比較して編集活性が実質的に減少し、ＡＡＶ編集活性に対するＣｐＧ欠失の状況依存的効果が強調され、強力な編集をもたらす個々のＣｐＧ欠失ＡＡＶエレメントをスクリーニングする重要性が強調された。これらの知見は、ＣｐＧ＋又はＣｐＧ－ＡＡＶでのｈＮＰＣ形質導入を含む実験において検証される。個々のＣｐＧ－エレメントはまた、積み重ねられて、最大のＣｐＧ欠失を有する組み合わされたＡＡＶゲノムを生成し、これは、インビトロでの編集活性について評価される。
ＴＬＲ９調節型免疫応答を評価するためのＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９細胞を使用する実験は、非改変ＣｐＧ＋ＡＡＶで処理した細胞からのレベルと比較して、ＣｐＧ－ＡＡＶで処理した細胞からの分泌ＳＥＡＰのレベルの低下を示すことが予想される。減少したＳＥＡＰレベルは、減少したＴＬＲ ９媒介性免疫活性化を示す。
実施例１９：炎症性サイトカイン産生及びＣａｓＸ媒介性編集に対する効果を評価するための、ＣｐＧ欠失ゲノムを伴う又は伴わないＡＡＶベクターのインビボ投与
実験は、インビボでＣｐＧ欠失ゲノムを有するか又は有さないＡＡＶベクターを投与する効果を評価するために行われる。簡潔には、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム（ＣｐＧ欠失あり又はなし）を発現するＡＡＶ粒子をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに投与する。これらの実験において、実質的なＣｐＧ欠失を有する組み合わされたＡＡＶゲノムが、評価のために使用される。ＡＡＶ投与後、様々な時点でマウスから採血して血液試料を採取する。ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの産生を、ＥＬＩＳＡを使用して測定する。
材料及び方法：
ＣｐＧ欠失ＡＡＶプラスミドの生成：
導入遺伝子特異的Ｔ細胞の生成を評価するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端上のＡＡＶ導入遺伝子プラスミドにクローニングする。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは、十分に特徴付けられたオボアルブミン由来ペプチドであり、このペプチドエピトープに特異的なＴ細胞を探索するために広く利用可能な試薬を有する。このペプチドをコードする核酸配列を、ＲＯＳＡ２６標的化スペーサーを有するＡＡＶ構築物中のＣａｓＸへのＮ末端融合としてクローニングする。
ＡＡＶベクターの産生は、実施例１７において先に記載されるように実施される。
ウイルスゲノム力価は、実施例１７において先に記載されるように決定される。
体液性免疫活性化を評価するための炎症性サイトカインの測定：
約１Ｅ１２ｖｇのＡＡＶをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈内注射する。血液を、ＡＡＶ注射後７日間、尾静脈又は伏在静脈から毎日採取する。採取した血清を、マウス血液試料（Ａｂｃａｍ）についての製造業者の推奨に従って市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインのレベルについて評価する。簡潔には、５０μＬの標準、対照緩衝液、及び試料を、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、又はＴＮＦ－αに対する特異的抗体で予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルにロードし、室温で２時間インキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）とともに室温で２時間インキュベートし、続いて更に洗浄する。ウェルをＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質で処理し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした後、Ｈ２ＳＯ４でクエンチする。５７０ｎｍで波長補正したＴＥＣＡＮ分光光度計を使用して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
導入遺伝子特異的Ｔ細胞集団の評価：
ＡＡＶの静脈内注射の１０日後、血液をマウスから収集し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用してＴ細胞を単離する。単離されたＴ細胞を以下とともにインキュベートする：ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＢＶ４２１オボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬ ＭＨＣテトラマー（Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｓｈｏｐ）。ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＭＨＣテトラマーに特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して定量化する。ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、及びＢＶ４２１は、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び４０５ｎｍのレーザーによって励起され、シグナルは、それぞれバンドパスフィルター４４０／５０、５３０／３０、及び７８０／６０で定量化される。
ＣａｓＸ特異的抗体の定量化：
組換え産生及び精製されたＣａｓＸバリアント４９１（産生及び精製する方法は、国際公開第２０２０／２４７８８２（Ａ１）号に記載されており、その全体が参照により援用される）を、ｐＨ＞９の炭酸／重炭酸緩衝液を使用して、受動吸着によってポリスチレン９６ウェルプレートのウェルに直接付着させる。次いで、血清試料を、製造業者（Bethyl Laboratories）の推奨に従って市販のＨＲＰコンジュゲート二次抗体キットを用いる標準的なＥＬＩＳＡ技術を使用して、ＣａｓＸ４９１特異的抗体の存在について評価する。５７０ｎｍで波長補正したＴＥＣＡＮ分光光度計を使用して、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
ＲＯＳＡ２６遺伝子座でのＡＡＶ媒介ゲノム編集の定量化：
ＣｐＧ－ＡＡＶがインビボでＣｐＧ＋ＡＡＶと比較して増強されたＣａｓＸ編集活性を示すことを実証するために、ＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓＸタンパク質４９１を含有する約１Ｅ１２ ＡＡＶ粒子を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ新生児の顔面静脈を介して静脈内投与する。続いて、Ｓｃｒｉｂｅの施設動物使用プロトコルに従って動物を世話する。注射の４週間後、マウスを安楽死させ、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ／ＲＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、ｇＤＮＡ抽出のために肝臓及び／又は筋肉組織を採取する。標的アンプリコンは、目的のマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とするプライマーのセットを用いて２００ｎｇの抽出ｇＤＮＡから増幅され、実施例１７において先に記載したように処理される。
結果：
血清炎症性サイトカインレベルを測定するインビボ実験は、ＣｐＧ－ＡＡＶが、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの産生を有意に弱め、それによって免疫原性及び毒性を低下させることを示すと予想される。加えて、ＣｐＧ－ＡＡＶは、より少ないＴＬＲ９活性化を引き起こし、ＣａｓＸに融合したＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対するＴ細胞の増殖の減少をもたらす可能性が高い。したがって、ＣｐＧ－ＡＡＶを用いた注射は、ＣｐＧエレメントを含有するＡＡＶ構築物からのレベルと比較して、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの減少をもたらすと予想される。
ＣｐＧ－ＡＡＶは、より少ない体液性免疫活性化及び非特異的炎症、並びにより少ないＴ細胞媒介性免疫を引き起こす可能性が高いので、ＣａｓＸ反応性抗体の力価も低下することが予想される（すなわち、ＣａｓＸ抗体を定量化するより低いＥＬＩＳＡシグナルが予想される）。
最後に、ＣｐＧ－ＡＡＶの編集能力は、ゲノムＤＮＡ抽出のために筋肉及び／又は肝臓組織を採取することによって評価し、ＮＧＳに供して、ＲＯＳＡ２６遺伝子座における編集レベルを決定する。ＲＯＳＡ２６遺伝子座における増強されたＣａｓＸ編集活性は、インビボでより少ない体液性免疫応答を誘発するそれらの予想される可能性を考慮すると、ＣｐＧ－ＡＡＶで予想される。
＊表は、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、及び連結ペプチドをコードする配列を除く成分配列を列挙する。ＮＤ＝記載なし、配列表に提供される配列。
実施例２０：ガイドＲＮＡガイド足場プラットフォーム進化
実験を行って、二本鎖ＤＮＡ（double-stranded DNA、ｄｓＤＮＡ）切断について改善された活性を示すガイドＲＮＡガイド足場バリアントを同定した。これを達成するために、足場バリアントの大規模ライブラリを設計し、ヒト細胞におけるレポーター遺伝子の機能的ノックアウトについてプール様式で試験した。改善されたノックアウトをもたらす足場バリアントは、プール内の機能エレメントを配列決定し、その後コンピュータ分析することによって決定した。
材料及び方法
ライブラリ設計
ＲＮＡ二次構造安定性の評価
ＲＮＡｆｏｌｄ（ｖ２．４．１４）（Ｌｏｒｅｎｚ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６：２６（２０１１））用いてＲＮＡ配列の二次構造の安定性を予測した（Ｊａｒｍｏｓｋａｉｔｅ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．「Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｕｍｉｌｉｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．７４（５）：９６６（２０１９））。ΔΔＧ＿ＢＣ値を評価するために、非拘束アンサンブルのアンサンブル自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、次いで、拘束アンサンブルのアンサンブル自由エネルギー（ΔＧ）を計算した。ΔΔＧ＿ＢＣは、制約されたΔＧ値と制約されていないΔＧ値との差である。シュードノットステム、足場ステム、及び伸長ステムの塩基対合を反映し、三重鎖の塩基が対合しないことを必要とする拘束ストリングを使用した。
シュードノットステム二次構造安定性の計算
シュードノット構造安定性を、ガイド足場１７５からの三重ループ配列を使用して、３～３３位にわたるステムループ全体について計算した。更に、シュードノット塩基の対合及び三重鎖ループ中の塩基の非対合を強制する拘束ストリングを生成した。したがって、安定性の変化は、シュードノットステムの配列の違いのみによる可能性がある。例えば、シュードノット配列ＡＡＡＡＣＧ＿ＣＧＴＴＴＴは、三重ループ配列ＣＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡ（配列番号４１８３４）を挿入することによってステムループ配列に変えられ、その結果、最終配列はＡＡＡＡＣＧＣＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＣＧＴＴＴＴ（配列番号４１８３５）となり、制約ストリングは、「（（（（（（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ））））））））」（配列番号４１８３６、式中、ｘ＝ｎ）であった。
分子生物学
ライブラリ構築の分子生物学
ガイドＲＮＡ足場バリアントの設計されたライブラリを合成し、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、次いで、ライブラリに特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、ライブラリの５’末端及び３’末端で更なる配列を増幅して、制限酵素ＳａｐＩの配列認識部位を導入する。ＰＣＲは、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行い、製造業者の指示に従って行った。典型的なＰＣＲ条件は、５０μＬの反応中、１０ｎｇの鋳型ライブラリＤＮＡ、１×Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３００ｎＭ ｄＮＴＰ、３００ｎＭの各プライマー、０．２５μＬのＱ５ ＤＮＡポリメラーゼであった。サーマルサイクラーでは、典型的なプログラムは以下の通りである。９５℃で５分間のサイクル、次いで、９８℃で１５秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル、７２℃で２分間の最終伸長。増幅されたＤＮＡ産物をＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製した。次いで、このＰＣＲアンプリコン及びプラスミドｐＫＢ４を、制限酵素ＳａｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、両方を、製造業者の指示に従って、アガロースゲル電気泳動、続いてゲル抽出（Ｚｙｍｏ）によって独立してゲル精製した。次いで、全て製造業者の指示に従って、ライブラリを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してライゲーションし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）で精製し、ＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１Ｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ Ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した。形質転換されたライブラリをＳＯＣ培地中で１時間回収し、次いで５ｍＬの２ｘｙｔ培地中で振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。次いで、プラスミドＤＮＡを培養物からミニプレップした（ＱＩＡＧＥＮ）。次いで、プラスミドＤＮＡを、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化によって更にクローニングし、続いて、相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハング及びＧＦＰを標的化するための所望のスペーサー配列を有するアニールされたオリゴヌクレオチドとライゲーションした。オリゴヌクレオチドは５’リン酸化改変を有しており、９５℃で１分間加熱した後、２５℃の最終温度に達するまで１分当たり２度温度を下げることによってアニーリングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ反応としてライゲーションを行った。ここで、典型的な反応条件は、総体積４０μＬの水中の、１μｇの予め消化されたプラスミドライブラリ、１μＭのアニーリングされたオリゴヌクレオチド、２μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、２μＬ Ｅｓｐ３Ｉ、及び１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液からなった。反応を、３７℃で３分間及び１６℃で５分間の間で２５回循環させた。上記のように、ライブラリを精製し、形質転換し、一晩増殖させ、ミニプレップした。次いで、得られるプラスミドのライブラリをレンチウイルスの産生に使用した。
ライブラリスクリーニング
ＬＶ産物
レンチウイルス粒子は、２４時間前に播種したＬｅｎｔｉＸ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を７０～９０％の集密度でトランスフェクトすることによって生成した。プールしたライブラリを含有するプラスミドを、パッケージング及びＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドをポリエチレンイミンとともに含有する第二世代レンチウイルス系に、無血清培地中で導入した。粒子産生のために、トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの３６～４８時間後にウイルスを回収する。ウイルス上清を、０．４５μｍのＰＥＳ膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、標的細胞に添加する前に細胞培養培地中で希釈した。
濾過の７２時間後、レンチウイルス上清のアリコートをＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって力価測定した。ウイルスゲノムＲＮＡを、フェノール－クロロホルム抽出（ＴＲＩｚｏｌ）、続いてアルコール沈殿を使用して単離した。抽出の質及び量を、ナノドロップ読み取りによって評価した。次いで、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶリバーストランスクリプターゼによるｃＤＮＡ産生の直前に、任意の残留プラスミドＤＮＡをＤＮアーゼＩで消化した。ウイルスｃＤＮＡを１：１０００の連続希釈に供し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６によるｑＰＣＲの前に、ＷＰＲＥベースのプライマー及びＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと組み合わせた。全ての試料希釈物を二連で添加し、平均した後、既知のプラスミドベースの標準曲線に対して力価を計算する。水は常に陰性対照として測定する。
ＬＶスクリーニング（形質導入、維持、ゲーティング、選別、ｇＤＮＡ単離）
標的レポーター細胞を形質導入の２４～４８時間前に継代して、細胞分裂が起こることを確実にする。形質導入の時点で、細胞をトリプシン処理し、計数し、適切な密度に希釈した。細胞を、二重レンチウイルス組み込みを最小限にするために、低ＭＯＩ（０．１～５、ウイルスゲノムによる）で、無処理のライブラリ又は対照含有ニートレンチウイルス上清で再懸濁した。レンチウイルス－細胞混合物を４０～６０％の集密度で播種した後、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。形質導入４８時間後に、１～３μｇ／ｍＬのピューロマイシンによる４～６日間のトランスフェクションが上手くいった細胞を選択し、その後、ＨＥＫ培地又はＦｂ培地中で回収した。
選択後、細胞を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。次いで、細胞をＣｏｒｎｉｎｇストレーナーキャップＦＡＣＳチューブ（Ｐｒｏｄ．３５２２３５）で濾過し、Ｓｏｎｙ ＭＡ９００でソートした。標準的な方法による単一の生細胞のゲーティングに加えて、蛍光レポーターのノックダウンについて細胞を選別した。実験から選別した細胞を溶解し、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓを使用してゲノムを抽出した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のための処理
ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡをコードするガイドＲＮＡに特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。典型的なＰＣＲ条件は、５０μＬの反応中、２μｇのｇＤＮＡ、１×Ｋａｐａ Ｈｉｆｉ緩衝液、３００ｎＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各プライマー、０．７５μＬのＫａｐａ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼである。サーマルサイクラーで、９５℃で５分間サイクル、次いで、９８℃で１５秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で１分間を１５サイクル、７２℃で２分間の最終伸長。増幅されたＤＮＡ産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製する。第２のＰＣＲステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重化を可能にするために、インデックスアダプターを用いて行った。２０μＬの前のステップからの精製産物を、５０μＬの反応中で、１×Ｋａｐａ ＧＣ緩衝液、３００ｎＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．７５μＬのＫａｐａ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼと合わせた。サーマルサイクラーで、９５℃で５分間サイクル、次いで、９８℃で１５秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を５～１６サイクル、７２℃で２分間の最終伸長。増幅されたＤＮＡ産物をＡｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製する。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（ｖ３、１５０サイクルのシングルエンド配列決定）で配列決定した。
ＮＧＳ分析（試料処理及びデータ分析）
リードを、ｃｕｔａｄａｐｔ（バージョン２．１）を用いてアダプター配列についてトリミングし、ガイド配列（足場配列及びスペーサー配列を含む）を各リードについて抽出した（また、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ ２．１連結アダプターを用いて、上流アンプリコン配列と下流アンプリコン配列との間の配列を抽出した）。固有のガイドＲＮＡ配列をカウントし、次いで、各足場配列を、設計された配列のリスト並びにガイド足場１７４（配列番号２２３８）及び１７５（配列番号２２３９）の配列と比較して、それぞれの同一性を決定した。
各ユニークガイドＲＮＡ配列についてのリードカウントを、平均正規化を使用して配列決定深度について正規化した。濃縮は、各ＧＦＰ試料における正規化リードカウントを、関連するナイーブ試料における正規化リードカウントで割ることによって、各配列について計算した。両方の選択（Ｒ２及びＲ４）について、ＧＦＰ集団及びナイーブ集団を、３つの別々の日にＮＧＳについて処理し、各足場についての濃縮値を３連で形成した。足場当たりの全体的な濃縮スコアを、三連にわたってナイーブ及びＧＦＰ試料についてのリードカウントを合計した後に計算した。
異なる選択からの２つの濃縮スコアを、個々のｌｏｇ２濃縮スコアの加重平均によって組み合わせ、ナイーブ集団内のそれらの相対提示によって加重した。
ｌｏｇ２濃縮スコアの誤差を推定し、三連の試料にわたる平均濃縮スコアの９５％信頼区間を計算した。これらの誤差は、２つの別個の選択に対する濃縮値を組み合わせるときに伝搬される。
結果及び考察
ライブラリ設計、順序付け、及びクローニング
ガイドＲＮＡバリアントのライブラリは、偏りのない様式及びＲＮＡ足場内の重要なモジュールに焦点を当てた標的化様式の両方でＲＮＡ足場に対する変異を試験するように設計された。
ライブラリの不偏部分では、ガイド足場１７４（配列番号２２３８）及び１７５（配列番号２２３９）（約２８００個の個々の配列）の各残基に対して、全ての一塩基置換、挿入及び欠失を設計した。二重変異体は、相互作用している可能性がある領域に特異的に焦点を合わせるように設計された。ＣｒｙｏＥＭ構造（ＰＤＢｉｄ：６ＮＹ２）において、２つの残基が標準又は非標準塩基対形成相互作用に関与するか、又は２つの残基がＲＮＡｆｏｌｄ（ｖ２．４．１４）によって予測される最低エネルギー構造において対合すると予測された場合、ガイド足場１７４及び１７４における対応する残基を変異させた（両方の残基の全ての可能な置換、挿入、及び欠失を含む）。これらの「相互作用」残基に隣接する残基も変異させ、しかしながら、これらについては、２つの残基の各々の置換のみが含まれた。最終ライブラリにおいて、約２７Ｋ配列を、ガイド足場１７４又は１７５に対して２つの変異を伴って設計した。
ＲＮＡ足場の重要な領域の特異的変異誘発に充てられたライブラリの部分において、シュードノット領域、三重鎖領域、足場バブル、及び伸長ステムに対して改変を設計した（領域同定については図６５を参照されたい）。ライブラリのこれらの標的化されたセクションの各々において、全ドメインを仮説駆動様式で変異誘発した（図６６）。例として、三重鎖領域について、三重鎖を含む塩基トリプレットの各々を、異なる三重鎖形成モチーフに変異誘発した（図６７を参照されたい）。このタイプの変異誘発は、バブルを取り囲む塩基の全ての可能な置換が変異誘発された（すなわち、ガイド配列１７４又は１７５に対して最大５つの変異を有する）足場ステムバブルにおいて用いられたものとは異なる。これに対して、シュードノットステムを含む５塩基対は、別のワトソン－クリック対合配列で完全に置換された（最大１０個の異なる塩基が変異誘発された）。
ライブラリの最終標的化セクションは、タンパク質の結合に適した二次構造を形成する可能性がより高い配列について最適化することを意味した。要するに、配列の二次構造安定性は、２つの条件下で予測された：１）任意の制約の非存在下、２）シュードノットステム、足場ステム、及び伸長ステムなどの重要な二次構造要素が形成されるように制約される（材料及び方法を参照されたい）。本発明者らの仮説は、これらの２つの条件間の安定性の差（本明細書では、ΔΔＧ＿ＢＣと呼ぶ）が、タンパク質結合に対してより影響を受けやすい配列について最小であり、したがって、本発明者らは、この差が最小である配列を探索すべきであるというものであった）。
設計されたライブラリをＴｗｉｓｔ（約４０Ｋの異なる配列）から注文し、プロテインＳＴＸ１１９も発現するレンチウイルスプラスミド骨格にクローニングするためのｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ部位を含むように合成した（材料及び方法を参照されたい）。ＧＦＰ遺伝子を標的とするスペーサー配列をライブラリベクターにクローニングし、ＧＦＰ遺伝子を標的とするために各ＲＮＡ足場バリアントから単一ガイドＲＮＡを効果的に作製した。設計されたライブラリバリアントの提示を、次世代配列決定を用いて評価した（材料及び方法を参照されたい）。
ライブラリスクリーニング及び評価
ガイドＲＮＡバリアント及び単一ＣａｓＸタンパク質（バージョン１１９）を含有するプラスミドライブラリをレンチウイルス粒子に作製した（材料及び方法を参照されたい）。ｑＰＣＲアッセイ（材料及び方法を参照されたい）を使用して、ウイルスゲノムのコピー数に基づいて、粒子を力価測定した。ＧＦＰを安定に発現する細胞株に、レンチウイルス粒子ライブラリを低い感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入して、各細胞が多くとも１つのライブラリメンバーを組み込むことを強制した。細胞プールは、ゲノム組み込みを有する細胞のみを保持するように選択した。最後に、細胞集団をＧＦＰ発現について選別し、ＧＦＰ陰性細胞の集団を得た。これらのＧＦＰ陰性細胞は、ＣａｓＸ ＲＮＰをＧＦＰタンパク質に効果的に標的化するライブラリメンバーを含み、インデル及びその後の機能喪失を引き起こした。
ソートされていない細胞集団（「ナイーブ」）及びＧＦＰ陰性集団からのゲノムＤＮＡを処理して、各細胞におけるガイドＲＮＡライブラリメンバーの配列を単離した。ナイーブ集団及びＧＦＰ陰性集団におけるガイドＲＮＡの提示を決定するために、次世代配列決定を行った。濃縮スコアは、ＧＦＰ集団におけるライブラリメンバーの提示をナイーブ集団におけるその提示で除算することによって、各ライブラリメンバーについて計算した：高い濃縮スコアは、開始プールよりも活性なＧＦＰ陰性集団においてはるかに頻度が高いライブラリメンバーを示し、したがって、ＧＦＰ遺伝子内でインデルを効果的に生成することができる活性バリアントである（濃縮値＞１、ｌｏｇ２濃縮＞０）。低い濃縮スコアは、ナイーブと比較して活性ＧＦＰ集団において欠失しており、したがってインデルの形成において無効であるライブラリメンバーを示す（濃縮値＜１、ｌｏｇ２濃縮＜０）。比較のための最終統計として、相対濃縮値を、（ＧＦＰ陰性対ナイーブ集団における）ライブラリメンバーの濃縮を（ＧＦＰ陰性対ナイーブ集団における）参照足場配列の濃縮で割ったものとして計算した。（対数空間では、これらの値は単に減算される）参照足場配列の濃縮値を図６８に示す）。
レンチウイルス粒子の独立した産生、細胞の形質導入、ナイーブ集団及びＧＦＰ陰性集団を得るための選択及び選別、並びに各ライブラリメンバーの濃縮値を知るための配列決定を用いて、スクリーニングを複数回行った。これらのスクリーニングはＲ２及びＲ４と呼ばれ、ガイド足場１７４及び１７５上の単一ヌクレオチドバリアントについて得られた濃縮値を主に再現する（図６９）。スクリーニングは、機能的ＧＦＰ集団において濃縮された変異の多くの可能な組み合わせを同定することができ、したがって、機能的ＲＮＰをもたらし得る。対照的に、非標的スペーサーを含有するガイドは濃縮されず、濃縮が選択的カットオフであることが確認された（データは示さず）。濃縮されたガイド足場１７４及び１７５上の変異のフルセットを、それぞれ表２８及び表２９に示す。これらのリストは、標的化された機能的ＲＮＰを依然として達成することができる配列多様性を明らかにする。
単一ヌクレオチド変異は、足場の変異可能領域を示す。
ガイド足場１７４及び１７５と比較して類似又は改善された活性をもたらす足場変異を決定するために、単一ヌクレオチド置換、挿入、又は欠失の濃縮値をプロットした（図７０）。概して、ガイド足場１７４上の単一ヌクレオチド変化は、ガイド足場１７５よりも耐容性が高く、おそらく、この文脈におけるガイド足場１７４のより高い活性、したがって、活性を弱める変異に対するより高い耐容性を反映していた（図６８及び図７１）。有利であった１７５上の単一ヌクレオチド変異はまた、大多数の場合においてガイド足場１７４の文脈で有利であり（図７１）、したがって、ガイド足場１７５上の変異についての値は、変異効果のよりストリンジェントな読み出しであると解釈された。以下の段落に記載されるように、この分析によって重要な変異性領域が明らかになった。
最も注目すべき特徴は、伸長ステムであり、これは、足場１７４又は１７５の参照配列と同様の濃縮値を示し、足場が、過去に見られたものと同様に、この領域における変化を許容することができ、伸長ステムがタンパク質とほとんど接触しないことが見られるＣａｓＸ ＲＮＰの構造分析によって予測されることを示唆している。
三重ループは、特にガイド足場１７５（例えば、特にＣ１５又はＣ１７への変異）において作製された場合に、参照足場と比較して高い濃縮を示した別の領域であった。とりわけ、１７５におけるＣ１７位は、足場１７４において既にＧに変異しており、これは、足場１７５に対するこの位置での２つの高度に濃縮された変異のうちの１つである。
Ｇ７とＡ２９との間のシュードノットステムにおける予測された対のいずれかのメンバーに対する変化は、特にガイド足場１７５において、参照と比較して両方とも高度に濃縮された。この対はガイド足場１７４及び１７５の両方において非正準Ｇ：Ａ対である。これらの位置で最も強く濃縮された変異は、ガイド足場１７５にあり、Ａ２９をＣ又はＴに変換し、第１の変異は標準的なワトソン－クリック対（Ｇ７：Ｃ２９）を形成し、第２の変異はＧＵゆらぎ対（Ｇ７：Ｕ２９）を形成し、これらは両方とも、Ｇ：Ａ対と比較してヘリックスの安定性を増加させることが予想され得る。Ｇ７のＴへの変換も高度に濃縮され、これはこの位置でカノニカル対（Ｕ７：Ａ２９）を形成する。明らかに、これらの位置は、より安定に対合されるのに好都合である。一般に、５’末端は変異性であり、脱濃縮をもたらす変化はほとんどなかった。
最後に、ガイド足場１７５における５４位でのＣの挿入は高度に濃縮されたが、ガイド足場１７４における類似の位置でのＡ又は挿入されたＧのいずれかの欠失は両方とも、参照と同様の濃縮値を有した。総合すると、ガイド足場は、この足場ステムバブル中に２つのヌクレオチドを有することを好む場合があるが、それは強い優先性ではない場合がある。これらの結果を以下のセクションで更に検討する。
シュードノットステムの安定性は足場活性に不可欠である。
足場活性に対するシュードノットステムの効果を更に調査するために、シュードノットステムを以下の方法で改変した：（１）ステム内の塩基対をシャッフルして、それぞれの新しいシュードノットが塩基対の同じ組成を有するが、ステム内の順序が異なるようにし、（２）塩基対をランダムなＷＣ対合配列で完全に置換した。２９１（２９１）個のシュードノットステムを試験した。配列の第１のセットの分析は、Ｇ－Ａ対が、他の可能性のある位置（２～６位、野生型配列では５位、図７２）と比較してシュードノットステムの第１の位置にあることに対する強い優先性を示し、一方、結果はシュードノットステム中の２～６位の各々にＧＡ対を有することが一般的に好ましくなく、平均濃縮度が低いことを示す。１位にＧ－Ａ塩基を有することは、ヘリックスの残りがスタッキング（ワトソン－クリック対のみ）から形成することを可能にすることによって、シュードノットステムを安定させるようである。この結果は、足場が完全に対合したシュードノットステムを好むことを更に支持する。
相当数のシュードノット配列が正のｌｏｇ２濃縮を有し、この配列を代替塩基対で置換することが一般的に許容されることを示唆した（図７３のシュードノット構造）。シュードノットステムにおけるより安定なヘリックスがより活性な足場をもたらすという仮説を更に試験するために、各シュードノットステムの二次構造安定性を計算した（材料及び方法）。シュードノット安定性と濃縮、したがって活性との間に強い関係が観察され（図７４：より活性な足場は安定なシュードノットステムを有する）、安定なシュードノットステム（＜－７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するガイド足場は高い濃縮を有し、不安定化されたシュードノットステム（≧－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するガイド足場は非常に低い濃縮を有した。
二重変異は、ガイド足場の変異可能領域を示し、
各参照ガイド足場に対する二重変異を調べて、足場内の変異可能領域、及び足場活性を改善するための潜在的な変異を更に同定した。非標準Ｇを形成すると予測される７位及び２９位の単一対のみに焦点を当てる。シュードノットステムにおける対は、変異誘発を支持する（上の節を参照されたい）－本発明者らは、この位置の対について６４個の二重変異全てをプロットする（図７５）。正準対は、これらの２つの位置で好まれる（例えば、７位のＣ及び２９位のＧの置換は、Ｇ：Ｃ対を作製し、濃縮され、７位のＣの置換及び２９位のＧの挿入は、同様にＧ：Ｃ対を作製し、７位のＡ及び２９位のＵの置換は、Ａ：Ｕ対を作製する）。挿入の対は濃縮されなかったが、これはおそらく、Ｇ：Ａ対がヘリックス内で１つ上の位置にシフトしており、完全に除去されていないことを考えると、カノニカルの対を挿入してもヘリックスを安定するのに十分ではないためである。驚くべきことに、いくつかの濃縮された二重変異は正規のペアを形成しなかった、例えば、７位のＵ及び２９位のＣの置換（これは非正規のＵ：Ｃ対を形成する）、７位のＵ及び２９位のＵの置換（Ｕ：Ｕ対を形成する）、及び他のいくつかの置換である（図７５）。プリン：プリン対は、他の非カノニカル対よりもヘリックスに対して実質的により破壊的であることが可能である。実際、７位のＡ及び２９位のＧの置換は、この位置で濃縮されていないＡ：Ｇ対を再び形成する。
ガイド足場１７５の重要な構造要素の各々内の二重置換の濃縮値を、各位置が３つまでの置換を有し得るヒートマップから決定した。足場ステムが変異に対して最も耐性が低いことが決定され、この領域において強く拘束された配列が示唆された。
結果は、編集アッセイにおいて利用される場合、機能的遺伝子ノックアウトを依然としてもたらす実質的な変化がガイド足場に対してなされ得ることを実証する。特に、結果は、足場内のシュードノットステムの二次構造安定性の増加を含む、ガイド足場における改変を通して活性を改善するために利用され得る重要な位置を実証する。
＊変異配列は’であり、’で区切られ、配列ごとに複数の変異は「，」で区切られる
＊変異配列は’であり、’で区切られ、配列ごとに複数の変異は「，」で区切られる
実施例２１：ＣｃｄＢ選択アッセイは、ＴＴＣ、ＡＴＣ、及びＣＴＣ ＰＡＭ配列において改善されたｄｓＤＮＡ切断又は改善されたスペーサー特異性を有するＣａｓＸタンパク質バリアントを同定する
実験を行って、生化学的にコンピテントであり、ＴＴＣ又はＡＴＣ又はＣＴＣのいずれかのＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列での二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断についてＣａｓＸ５１５と比較して改善された活性又は改善されたスペーサー特異性を示すＣａｓＸ５１５（配列番号１４５）に由来するバリアントのセットを同定した。これを達成するために、まず、ＣａｓＸ５１５及びガイド足場１７４を使用するＣｃｄＢ選択実験において、バックグラウンドレベルを上回る生存を有するスペーサーのセットを同定した。第二に、これらのスペーサーを用いてＣｃｄＢ選択を実施して、標準的な「野生型」ＰＡＭ配列ＴＴＣにおけるｄｓＤＮＡ切断に対して生化学的にコンピテントであるＣａｓＸ５１５に由来するバリアントのセットを決定した。第三に、ＣｃｄＢ選択実験を実施して、ＡＴＣ型又はＣＴＣ型のいずれかのＰＡＭ配列において改善されたｄｓＤＮＡ切断を可能にするＣａｓＸ５１５のバリアントのセットを決定した。第四に、プラスミド対抗選択実験を実施して、スペーサー特異性の改善をもたらすＣａｓＸ５１５由来のバリアントのセットを決定した。
材料及び方法：
ＣｃｄＢ選択実験のために、示されたＣａｓＸタンパク質（又はライブラリ）及びｓｇＲＮＡを発現する３００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐ７３）を、ＣｃｄＢ毒性タンパク質を発現するプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＷ２５１１３にエレクトロポレーションした。形質転換後、培養物をグルコースリッチ培地中で振盪しながら３７℃で２０分間回復させた。その後、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、培養物を更に４０分間更にインキュベートした。次いで、回収した培養物を、プラスミドに選択的な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｌ９３１５）上で力価測定した。細胞を、グルコース（ＣｃｄＢ毒素が発現されない）又はアラビノース（ＣｃｄＢ毒素が発現される）のいずれかを含有するプレート上で力価測定し、相対生存率を計算し、図７６に示すようにプロットした。次に、培養物をエレクトロポレーションし、上記のように回収し、回収物の画分を力価測定のために保存した。回収された培養物の残りを回収期間後に分割し、グルコース又はアラビノースのいずれかを含有する培地中で増殖させて、プールされたライブラリの試料を、それぞれ選択なしで、又は強い選択で収集した。これらの培養物を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の指示に従って使用して、生存プラスミドプールを抽出した。全プロセスを合計３ラウンドの選択について繰り返した。
最終的なプラスミドプールを単離し、固有分子識別子（ＵＭＩ）に特異的なプライマーを用いてｐ７３プラスミドのＰＣＲ増幅を行った。これらのＵＭＩ配列は、各特異的ＵＭＩがＣａｓＸ５１５タンパク質のただ１つの変異と関連するように設計された。増幅には典型的なＰＣＲ条件が使用された。ＣａｓＸ５１５のバリアントプールは、Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＭＥ）と呼ばれるアプローチにおいて、多くの可能なアミノ酸置換、並びに可能な挿入、及び単一のアミノ酸置換を含有する。増幅されたＤＮＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットを用いて、３０μＬの水で溶出して精製した。次いで、アンプリコンを第２のＰＣＲによる配列決定のために調製して、製造業者の指示に従ってＭｉＳｅｑ機器又はＮｅｘｔＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のいずれかで次世代配列決定（ＮＧＳ）に適合するアダプター配列を付加した。調製した試料のＮＧＳを実施した。戻された生データファイルを以下のように処理した：（１）配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）リード１及びリード２からの配列を単一挿入配列にマージし、（３）各配列を、ＣａｓＸ５１５についての参照配列に対する変異に関連するＵＭＩを含有することについて定量した。ＣａｓＸ ５１５に対する個々の変異の発生率を計数した。選択後の変異カウントを選択前の変異カウントで割り、１０の偽カウントを使用して「濃縮スコア」を生成した。このスコアの対数塩基２（ｌｏｇ２）を計算し、ヒートマップとしてプロットし、ここで、単一のスペーサーについての生物学的複製物についての濃縮スコアを、挿入、欠失、又は置換についての各アミノ酸位置で決定した（図示せず）。ライブラリを、３連で実施した２つのＴＴＣ ＰＡＭスペーサー（スペーサー２３．２ ＡＧＡＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴ、配列番号４１８３７、及び２３．１３ ＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡ、配列番号４１８３８）及び２連で実施した１つのＴＴＣ ＰＡＭスペーサー（スペーサー２３．１１ ＴＣＣＣＣＧＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧ、配列番号４１８３９）によるＣｃｄＢ選択に通し、３連の測定の平均を、ＣａｓＸ５１５の測定されたバリアントについてのヒートマップとしてｌｏｇ２濃縮スケール上にプロットした。ＣａｓＸ５１５と比較して完全な切断能力を保持したＣａｓＸ５１５のバリアントは、約０のｌｏｇ２濃縮値を示し、切断機能の喪失を有するバリアントは、０未満のｌｏｇ２値を示したが、この選択を使用して改善された切断を有するバリアントは、ＣａｓＸ５１５の値と比較して０を超えるｌｏｇ２値をもたらした。追加のヒートマップ（図示せず）を作製する実験は、以下の単一スペーサー（１１．２ ＡＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＣＡＣＣ、配列番号４１８４０、２３．２７ ＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＧＡ、配列番号４１８４０、及び２３．１９ ＣＣＧＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡ、配列番号４１８４２）を使用して実施した。
プラスミド対抗選択実験のために、ＴＴＣ ＰＡＭスペーサーを用いたＣｃｄＢ選択から得られた最終プラスミドプールに対して追加ラウンドの細菌選択を行った。対抗選択の全体的なスキームは、プラスミドの２つの集団を同時に含むＥ．ｃｏｌｉ細胞のみの複製を可能にすることである。第１のプラスミド（ｐ７３）は、ＣａｓＸタンパク質（ＡＴｃによる誘導性発現下）及びｓｇＲＮＡ（構成的に発現される）、並びに抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコール）を発現する。このプラスミドはまた、ＣｃｄＢのような標準的な順方向選択アッセイのために使用され得、そしてスペーサー配列は、実験者によって所望されるように完全に自由に変化し得ることに留意されたい。第２のプラスミド（ｐ７４）は、抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン）を発現するためにのみ働くが、ｐ７３にコードされるスペーサーに適合する標的部位を含む（又は含まない）ように改変されている。更に、これらの標的部位は、スペーサーのＲＮＡと標的部位のＤＮＡとの間の非標準ワトソン－クリック塩基対形成からなる、スペーサー配列に対する「ミスマッチ」を組み込むように設計することができる。ｐ７３から発現されるＲＮＰがｐ７４中の標的部位を切断することができる場合、細胞はクロラムフェニコールに対してのみ耐性のままである。対照的に、ＲＮＰが標的部位を切断できない場合、細胞はクロラムフェニコール及びカナマイシンの両方に対して耐性のままである。最後に、上記の二重プラスミド複製系は２つの方法で達成することができる。連続法では、いずれかのプラスミドを最初に細胞に送達することができ、その後、株をエレクトロコンピテントにし、第２のプラスミドを送達する（両方ともエレクトロポレーションによって）。以前の研究は、プラスミド送達のいずれかの順序が、首尾よい対抗選択のために十分であることを示し、そして両方のスキームが実施された。「スクリーニング５」と名付けられた実験において、ｐ７３は、ｐ７４を保有するコンピテント細胞中にエレクトロポレーションされ、一方、スクリーニング６においては、逆が真である。培養物をエレクトロポレーションし、回収し、力価測定し、上記のような選択条件下で１回増殖させ、プラスミド回収後に増幅、ＮＧＳ、及び濃縮計算も上記のように行った。
最後に、追加のＣｃｄＢ選択を同様の様式で行ったが、ガイド足場２３５並びに代替プロモーターＷＧＡＮ４５、Ｒａｎ２、及びＲａｎ４を用い、全てスペーサー２３．２を有する毒性ＣｃｄＢプラスミドを標的とした。これらのプロモーターは、上記のＣｃｄＢ選択と比較してガイドＲＮＡをより弱く発現することが予想され、したがって、細菌細胞中のＣａｓＸ ＲＮＰの総濃度を減少させることが予想される。この生理学的効果は、選択的アッセイにおける細菌細胞の全生存を減少させるはずであり、したがって、濃縮スコアのダイナミックレンジを増加させ、ＴＴＣ ＰＡＭスペーサー２３．２におけるＲＮＰヌクレアーゼ活性とより正確に相関する。各プロモーターについて、３ラウンドの選択を上記のように３連で行い、実験の各ラウンドは上記のような濃縮データをもたらした。以下、これらの実験をスクリーン７と呼ぶ。
結果：
ライブラリスクリーニングヒートマップの結果は、ガイド足場１７４と複合体化されたＣａｓＸ５１５が、ＴＴＣ ＰＡＭ配列に関連するＤＮＡ配列を標的化するスペーサー（以下に列挙される）を使用して標的化される場合、ＣｃｄＢ発現プラスミドを切断することが可能であることを実証した。対照的に、代替的なＰＡＭ配列を利用するスペーサーは、はるかに可変性の生存を示した。ＡＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）は、数パーセントから０．１％未満の範囲の生存に及んだが、ＣＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）は、５０％超から１％未満の範囲の生存を可能にした。最後に、ＧＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）のみが、０．１％以下の生存を可能にした。これらのベンチマークデータは、この選択パイプラインの実験設計を支持し、ＣｃｄＢ細菌アッセイの強力な選択力を実証する。具体的には、二本鎖ＤＮＡを切断することができないＣａｓＸタンパク質は、少なくとも４桁の規模で脱濃縮されるが、切断に対して生化学的にコンピテントなＣａｓＸタンパク質は、アッセイに耐える。
ヒートマップを使用して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列でのｄｓＤＮＡ切断について生化学的にコンピテントであるＣａｓＸ５１５のバリアントのセット、並びにＣＴＣ（スペーサー１１．２及び２３．２７）及びＡＴＣ（スペーサー（２３．１９））のＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列でのｄｓＤＮＡ切断について改善を示すバリアントを同定した。
これらの３つのデータセットは、個々に又は組み合わせて、バリアント間の根本的な生化学的差異を表し、ヒトゲノム編集のための改善されたＣａｓＸ治療剤の将来の操作のための目的の領域を同定する。この証拠として、タンパク質全体にわたる各位置での停止コドンの存在など、内部対照をナイーブライブラリの一部として均一に含めた。これらの終止コドンは、選択のラウンドを通して失われることが一貫して観察され、部分的に短縮されたＣａｓＸ５１５がｄｓＤＮＡ切断を可能にしないはずであるという予想と一致した。同様に、ヒートマップデータに反映された活性の喪失を有するバリアントは、選択中に欠失していることが観察され、したがって、このアッセイにおける二本鎖ＤＮＡ切断に対する適合性の重度の喪失を有する。しかしながら、１以上の濃縮値（及び０以上の対応するｌｏｇ２濃縮値）を有するバリアントは、少なくとも、生化学的切断に関して中立である。重要なことに、バリアントのこの特定のサブセットにおいて同定された変異のうちの１つ以上が、治療分子について望ましい特性を示す場合、これらの変異は、生化学的機能と適合性であることが示される構造－機能関係を確立する。より具体的には、これらの変異は、ＣａｓＸタンパク質転写、翻訳、フォールディング、安定性、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）形成、ＰＡＭ認識、二本鎖ＤＮＡ巻き戻し、非標的鎖切断、及び標的鎖切断などの特性に影響を及ぼし得る。
ＣＴＣ及びＡＴＣ ＰＡＭ配列に関連する配列での切断に適格なバリアントについて、これらのデータセットにおける濃縮されたバリアント（濃縮＞１、およそ０の値についてのｌｏｇ２濃縮に等しい）は、ＣＴＣ又はＡＴＣ ＰＡＭ標的部位の切断を特異的に改善する変異を表す。これらの基準を満たす変異は、２つの一般的な方法で更に下位分類することができる。すなわち、変異は、ＰＡＭの認識を改善することによって切断速度を改善する（１型）か、又は変異は、ＰＡＭ配列にかかわらず分子の全体的な切断速度を改善する（２型）。
第１の型の例として、２２３位での置換変異は、試験した全ての試料において数百倍濃縮されていることが見出された。この位置は、野生型参照ＣａｓＸタンパク質ＣａｓＸ１及び２の両方においてグリシンをコードし、これは、ＣａｓＸ１の公開されたＣｒｙｏＥＭ構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＮＹ２）におけるＤＮＡ非標的鎖の－４ヌクレオチド位置から６．３４オングストロームであると測定される。したがって、２２３位におけるこれらの置換変異は、新規ＰＡＭの改変ヌクレオチドに物理的に近位であり、ＤＮＡと直接相互作用する可能性が高い。この結論を更に支持するものとして、濃縮された置換の多くは、置換されたアミノ酸（グリシン）と比較して更なる水素結合を形成することができるアミノ酸をコードしていた。これらの知見は、特にＰＡＭ ＤＮＡ配列に物理的に近接している場合（１０オングストローム以内）、ＤＮＡ鎖の一方又は両方と相互作用する変異を導入することによって、ＣａｓＸタンパク質において新規ＰＡＭ配列の認識の改善を達成することができることを実証する。ＡＴＣ及びＣＴＣスペーサーについてのヒートマップの更なる特徴は、非カノニカルＰＡＭ配列の認識の増加を可能にする変異を表したが、それらの作用機序はまだ調査されていない。
第２のタイプの変異の例として、ヒートマップの結果を使用して、ＣａｓＸ５１５と比較して全体的な切断速度を改善するが、必ずしもＤＮＡのＰＡＭ配列を特異的に認識しない変異を同定した。例えば、２７位でのアルギニンの挿入からなるＣａｓＸ５１５のバリアントは、スペーサー１１．２（ＣＴＣ ＰＡＭ）及びスペーサー２３．１９（ＡＴＣ ＰＡＭ）による選択において１より大きい濃縮値を有することが測定された。このバリアントは、ＣＴＣ ＰＡＭスペーサー上での比較可能な選択によって以前に同定されており、ここで、この変異は桁違いに濃縮された（データは示さず）。このアミノ酸変異の位置は、上記構造モデルにおける－１位のＤＮＡ標的鎖に物理的に近位（９．２９オングストローム）である。これらの洞察は、二本鎖ＤＮＡを有するＣａｓＸ ＲＮＰによって形成される成熟Ｒループが、アルギニンの側鎖によって、おそらく、正に荷電した側鎖とＤＮＡ標的鎖の負に荷電した骨格とのイオン相互作用によって安定化される機構を示唆する。かかる相互作用は、ＰＡＭ特異性を変化させることなく、全体的な切断動態に有益である。これらのデータは、いくつかの濃縮された変異が、それらに物理的に近位（１０オングストローム以内）である場合、ＤＮＡ鎖のいずれか又は両方と物理的に相互作用することによって、ＣａｓＸ５１５の全体的な切断活性を改善するバリアントを表すという結論を支持する。
このデータは、ヒートマップから同定されたＣＴＣ又はＡＴＣ ＰＡＭ配列に関連する配列における切断を改善するために測定された変異の多くが、上記で特定された２つの型の変異のいずれかとして分類され得るという結論を支持する。１型の変異について、ＣＴＣ ＰＡＭで試験したスペーサーのうちの少なくとも１つにおいて大きな濃縮スコアを有する２２３位への変異からなるバリアントを、関連する最大濃縮スコアとともに表３０に列挙する。２型の変異については、数千の濃縮されたバリアントの中から系統的に変異のより小さなリストを選択した。ＣａｓＸ５１５と比較して全体的な切断活性を改善する可能性が高い変異を同定するために、以下のアプローチを取った。第一に、ＣＴＣ又はＡＴＭ ＰＡＭスペーサーにわたって最も一貫して濃縮された変異をフィルタリングした。各スペーサーについての各変異の濃縮スコアについて、下限（lower bound、ＬＢ）を定義した。ＬＢは、３つの生物学的にわたる組み合わせたｌｏｇ２濃縮スコアから、３つの個々についてのｌｏｇ２濃縮スコアの標準偏差を引いたものとして定義された。第二に、３つの独立した実験データセット（１つのＡＴＣ ＰＡＭ選択及び２つのＣＴＣ ＰＡＭ選択）のうち少なくとも２つについてＬＢ＞１であるこれらの変異のサブセットを取った。第三に、変異のこのサブセットは、３つのＴＴＣ ＰＡＭ選択のいずれかにおいて負のｌｏｇ２濃縮が測定されたものを除外することによって更に減少した。最後に、少なくとも１つの実験における構造的特徴及び強い濃縮スコアの組み合わせに基づいて、個々の変異を手動で選択した。これらの基準を満たす得られる２７４個の変異を、得られるヒートマップに表される２つのＣＴＣ又は１つのＡＴＣ ＰＡＭ実験から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア、並びに変異が位置するドメインとともに、表３１に列挙する。
クラスＩ変異とは対照的に、ＣａｓＸタンパク質のヌクレアーゼ活性のスペーサー特異性を改善するクラスＩＩと呼ばれるスペーサー配列によって決定されるように、ゲノムＤＮＡにおけるオンターゲット部位とオフターゲット部位とを識別するＣａｓＸ ＲＮＰの能力を改善する別のカテゴリーの変異が存在する。クラスＩＩ変異を特異的に同定するために、２つの更なる実験を実施した。これらの実験は、プラスミド対抗選択からなり、ＣａｓＸ５１５と比較して、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と意図される標的ＤＮＡとの間の単一ミスマッチに対する、生成されたバリアントの感受性を表す濃縮スコアをもたらした。得られる濃縮スコアを、実験データにわたって観察された全ての変異についてランク付けし、以下の分析を実施して、所望のオンターゲット部位におけるヌクレアーゼ活性を実質的に低下させることなくＣａｓＸタンパク質のスペーサー特異性を改善する可能性が高い変異のサブセットを同定した。最初に、スクリーニング５からの変異を、スペーサー２３．２を使用して、３つの技術的複製物にわたるそれらの平均濃縮スコアによってランク付けした。標的部位（ＰＤＢ ＩＤ：６ＮＹ２）に結合したＣａｓＸ ＲＮＰの公開されたモデルから推測されるように、ヌクレオチドミスマッチに物理的に近位であった変異を除去して、スペーサーにわたって普遍的ではなく、スペーサー２３．２のみで特異性に改善を与える可能性があるクラスＩＩ変異を廃棄した。最後に、これらのクラスＩＩ変異は、３つのＴＴＣ ＰＡＭ ＣｃｄＢ選択からのそれらの平均ｌｏｇ２濃縮が０未満であった場合に、オンターゲットＴＴＣ ＰＡＭ部位でのそれらの切断活性が変異によって負の影響を受けた場合廃棄された。これらの基準を満たす得られる変異を、スクリーニング５から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに、表３２に列挙する。追加的に、クラスＩＩ変異は、スクリーニング６の対抗選択実験から同定された。これらの変異は、それらの平均濃縮スコアによって同様にランク付けされたが、異なるフィルタリングステップが適用された。特に、以下のカテゴリーの各々から変異を同定した：スペーサー２３．２、スペーサー２３．１１、又はスペーサー２３．１３のいずれかからの最高の平均濃縮スコアを有するもの；スペーサー２３．２及びスペーサー２３．１１からの最高の合計平均濃縮スコアを有するもの；スペーサー２３．１１及びスペーサー２３．１３からの最高の合計平均濃縮スコアを有するもの；又は、スクリーニング５におけるスペーサー２３．２及びスクリーニング６におけるスペーサー２３．２からの最高の組み合わせ平均濃縮スコアを有するもの。これらの得られた変異を、スクリーニング６から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに、表３２に列挙する。
クラスＩ又はクラスＩＩ変異に加えて、ＴＴＣ ＰＡＭ配列でのｄｓＤＮＡ編集活性を改善することが直接観察されている別のカテゴリーの変異が存在する。クラスＩＩＩ変異と呼ばれるこれらの変異は、スクリーニング７においてスペーサー２３．２を使用してＣｃｄＢプラスミドを標的化する場合にＣａｓＸ５１５の濃縮スコアを上回る濃縮スコアを示すことによって、ヌクレアーゼ活性の改善を実証した。コンピュータによるフィルタリングステップを用いて、特に興味深いこれらの濃縮された変異のサブセットを同定した。具体的には、試験した３つのプロモーターの各々について０を超える３つの複製物にわたる平均濃縮値を有する変異を同定した。最後に、アミノ酸配列にわたる濃縮スコアの特徴を使用して、濃縮された位置での更なる変異を同定した。対象となる特徴の例としては、以下のものが挙げられる：トポロジー変化を促進するための、タンパク質ドメインの接合部における挿入又は欠失；ポリペプチド骨格をねじるためのプロリンに対するアミノ酸の置換；タンパク質と、ガイドＲＮＡ又は標的ＤＮＡのいずれかの鎖の負に荷電した核酸骨格との間にイオン結合を付加するための、正に荷電したアミノ酸へのアミノ酸の置換；連続した欠失の両方が高度に濃縮されているアミノ酸の欠失；多くの高度に濃縮された置換を含む位置への置換；タンパク質の最Ｎ末端における高度に濃縮されたアミノ酸に対するアミノ酸の置換。これらの得られた変異を、スクリーニング６から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに、表３３に列挙する。

Claims (175)

  1. 以下の成分配列：
    ａ．第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、
    ｂ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
    ｃ．第１のプロモーター配列、
    ｄ．ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列、
    ｅ．第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列、及び
    ｆ．任意選択的に、少なくとも１つのアクセサリエレメント配列、を含むポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）への組み込みのために構成されている、ポリヌクレオチド。
  2. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記第１のｇＲＮＡをコードする前記配列が、合わせて、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記第１のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記第１のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長を有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記第１のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長を有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記第１のプロモーター配列及び前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列が、作動可能に連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記第１のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記第１のプロモーターが、ポリユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター及びウサギベータ－グロビンスプライスアクセプター部位融合（ＣＡＧ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ７）、ＰＧＫプロモーター、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）プロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＣＢＡハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）プロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＣＭＶｄ１プロモーター、短縮型ヒトＣＭＶ（ｔＣＭＶｄ２）、最小ＣＭＶプロモーター、ｈｅｐＢプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、スーパーコアプロモーター３、アデノウイルス主要後期（ＡｄＭＬ）プロモーター、ＭＬＣプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＧＲＫ１タンパク質プロモーター、Ｒｈｏプロモーター、ＣＡＲタンパク質プロモーター、ｈＳｙｎプロモーター、Ｕ１ａプロモーター、リボソームタンパク質大サブユニット３０（Ｒｐｌ３０）プロモーター、リボソームタンパク質小サブユニット１８（Ｒｐｓ１８）プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、最小ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ＳＦＣｐプロモーター、Ｍｅｃｐ２プロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＭＬＰプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅｃＰ２プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ＣＫ７プロモーター、及びＣＫ８ｅプロモーターからなる群から選択される、請求項６又は請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記第１のプロモーターが、前記ＵＢＣ、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＣＡＧ、ＣＢ７、ＰＧＫ、ＪｅＴ、ＧＵＳＢ、ＣＢ、ＥＦ－１アルファ、ベータ－アクチン、ＲＳＶ、ＳＦＦＶ、ＣＭＶｄ１、ｔＣＭＶｄ２、最小ＣＭＶ、ニワトリβアクチン、ＨＳＶ ＴＫ、Ｍｉｎｉ－ＴＫ、最小ＩＬ－２、ＧＲＰ９４、スーパーコアプロモーター１、スーパーコアプロモーター２、ＭＬＣ、ＭＣＫ、ＧＲＫ１タンパク質Ｒｈｏ、ＣＡＲタンパク質、ｈＳｙｎ、Ｕ１ａ、リボソームタンパク質大サブユニット３０（Ｒｐｌ３０）、リボソームタンパク質小サブユニット１８（Ｒｐｓ１８）、ＣＭＶ５３、最小ＳＶ４０、ＣＭＶ５３、ＳＦＣｐ、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５、ＭＬＰ、ＥＦＳ、ＭｅＰ４２６、ＭｅｃＰ２、ＭＨＣＫ７、ＣＫ７、又はＣＫ８ｅプロモーターの短縮型バリアントである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記第１のプロモーター配列が、約４００ヌクレオチド未満、約３５０ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１５０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約４０ヌクレオチド未満を有する、請求項７又は請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記第１のプロモーター配列が、約４０～約５８５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、又は約１５０～約３００ヌクレオチドを有する、請求項７又は請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記第１のプロモーターが、表８に示される配列番号４０３７０～４０４００、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記第１のプロモーターが、表２４に示される配列番号４１０３０～４１０４４、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記少なくとも１つのアクセサリエレメントが、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列に作動可能に連結されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 第２のプロモーターを更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記第２のプロモーター配列及び前記第１のｇＲＮＡをコードする前記配列が、作動可能に連結されている、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記第２のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項１５又は請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記第２のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６（双方向性Ｕ６プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓＫ、及びヒトＨ１プロモーターからなる群から選択される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記第２のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１、ＢｉＵ６、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、又はヒトＨ１プロモーターの短縮型バリアントである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記第２のプロモーター配列が、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する、請求項１８又は請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記第２のプロモーター配列が、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する、請求項１８又は請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記第２のプロモーター配列が、表９に示される配列番号４０４０１～４０４２０及び４１０１０～４１０２９、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記第２のプロモーターが、前記第１のｇＲＮＡの転写を増強する、請求項１５～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記第１のプロモーターの前記配列及び前記第２のプロモーターの前記配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、請求項１５～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長である、請求項１５～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、請求項１５～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、請求項１５～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  28. ２つ以上のアクセサリエレメント配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記２つ以上のアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、少なくとも約１３００超、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記２つ以上のアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３１４超のヌクレオチド長である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記第１のプロモーターの前記配列、前記第２のプロモーターの前記配列及び前記２つ以上のアクセサリエレメントの前記配列が、合わせて、１３８１超のヌクレオチド長である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、又は少なくとも３５％以上が、前記第１のプロモーターの前記配列及び前記第２のプロモーターの前記配列並びに前記少なくとも１つのアクセサリエレメントの前記配列を含む、請求項１５～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記アクセサリエレメントが、ポリ（Ａ）シグナル、遺伝子エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復の刺激因子、及び転写のアクチベーター、及び転写のリプレッサーからなる群から選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記アクセサリエレメントが、前記アクセサリエレメントを欠く以外は同一のポリヌクレオチドと比較して、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質の転写、転写終結、発現、標的核酸の結合、標的核酸の編集、又は性能を増強する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記増強された性能が、インビトロアッセイにおける前記発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記第１のｇＲＮＡによる標的核酸の編集の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加である、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記コードされたＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記コードされたＣＲＩＳＰＲタンパク質が、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、
    ａ．ＱＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱの配列（配列番号４１８１８）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＮＴＳＢドメイン、
    ｂ．ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳＦの配列（配列番号４１８１９）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－ＩＩドメイン、
    ｃ．ＰＬＶＥＲＱＡＮＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡＧＹＫＲＱＥＡＬＲＰＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫＧＫＫＦＡＲＹＱＬＧＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥの配列（配列番号４１８２０）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩＩドメイン、及び
    ｄ．ＳＳＮＩＫＰＭＮＬＩＧＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥＫＱＲＴＩＱＡＫＫＥＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣの配列（配列番号４１８２１）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－Ｉドメインを含む、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＱＥＩＫＲＩＮＫＩＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫＫＰＥＮＩＰＱの配列（配列番号４１８２２）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－Ｉドメインを含む、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥＲＲＥＶＬＤの配列（配列番号４１８２３）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－ＩＩドメインを含む、請求項３８又は請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＰＩＳＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶＡの配列（配列番号４１８２４）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－Ｉドメインを含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨの配列（配列番号４１８２５）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＴＳＬドメインを含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬＫＥＶＷＫＰＡＶの配列（配列番号４１８２６）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－ＩＩドメインを含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号１４５の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  45. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、１つ以上のドメインに少なくとも１つの改変を含む、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記少なくとも１つの改変が、
    ａ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
    ｂ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
    ｃ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、又は
    ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
  47. Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択される配列番号４１８１８に対する前記ＮＴＳＢドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５又は請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記ＮＴＳＢドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８１８に対して２位のＧの挿入、４位のＩの挿入、４位のＬの挿入、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、３０位のＳの欠失、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  49. Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９ Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択される配列番号４１８１９に対する前記ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記ヘリックスＩ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８１９に対して、２４位のＴの挿入、２５位のＣの挿入、Ｙ２９Ｆ、Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、３２位のＧの欠失、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、１３８位のＱの挿入、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
  51. Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択される配列番号４１８２０に対する前記ヘリックスＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～５０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記ヘリックスＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８２０に対して、２位のＡの挿入、２位のＨの挿入、２位のＬの欠失及び３位のＶの欠失、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、３位のＶの欠失、３位のＤの挿入、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、４位のＥの欠失、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、６位のＱの挿入、７位のＧの挿入、９位のＨの挿入、９位のＡの挿入、ＶＤ１０、０位のＴ１の挿入、１０位のＶの欠失、１０位のＦの挿入、１１位のＤの挿入、１１位のＤの欠失、Ｄ１１Ｓ、１２位のＷの欠失、Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、１２位のＰの挿入、１３位のＱの挿入、１２位のＧの挿入、１３位のＲの挿入、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、１３位のＤの挿入、Ｗ１３Ｌ、１４位のＰの挿入、１４位のＤの挿入、１４位のＤの欠失及び１５位のＭの欠失、１５位のＭの欠失、１６位のＴの挿入、１７位のＰの挿入、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、２５位のＧの挿入、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、３７位のＳの挿入、３７位のＬの欠失及び３８位のＡの欠失、Ｋ４１Ｌ、４２位のＲの挿入、４３位のＱの欠失及び４４位のＥの欠失、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、７９位のＥの挿入、８１位のＴの挿入、８１位のＲの挿入、８１位のＷの挿入、８１位のＹの挿入、８２位のＷの挿入、８２位のＹの挿入、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、８５位のＬの挿入、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、１０９位のＫの挿入、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、１１０位のＲの欠失、Ｄ１１４Ｅ、１１４位のＤの挿入、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、１３３位のＣの挿入、１３４位のＳの挿入、１３４位のＧの挿入、１３５位のＲの挿入、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、１３８位のＥの欠失、Ｄ１４０Ｒ、１４０位のＤの挿入、１４１位のＰの挿入、１４２位のＤの挿入、１４３位のＥの欠失及び１４４位のＦの欠失、１４３位のＱの挿入、Ｆ１４４Ｋ、１４４位のＦの欠失、１４４位のＦの欠失及び１４５位のＣの欠失、Ｃ１４５Ｒ、１４５位のＧの挿入、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、１４８位のＶの挿入、Ｅ１４８Ｄ、１４９位のＨの挿入、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、並びに１６７位のＦの挿入からなる群から選択される、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
  53. Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される配列番号４１８２１に対する前記ＲｕｖＣ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～５２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記ＲｕｖＣ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８２１に対して、４位のＩの挿入、５位のＳの挿入、６位のＴの挿入、６位のＮの挿入、７位のＲの挿入、７位のＫの挿入、８位のＨの挿入、８位のＳの挿入、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、１３７位のＰの挿入、１４１位のＬの欠失、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、１４２位のＱの挿入、１４３位のＲの挿入、１４３位のＮの挿入、Ｅ１４４Ｎ、１４６位のＰの挿入、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、１５２位のＲの挿入、Ｈ１５３の挿入、Ｔ１５５Ｑ、１５５位のＨの挿入、１５５位のＲの挿入、１５６位のＬの挿入、１５６位のＬの欠失、１５６位のＷの挿入、１５７位のＡの挿入、１５７位のＦの挿入、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、１５９位のＹの欠失、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、１６１位のＩの挿入、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、１６３位のＮの挿入、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. Ｉ３、Ｋ４、Ｒ５、Ｉ６、Ｎ７、Ｋ８、Ｋ１５、Ｄ１６、Ｎ１８、Ｐ２７、Ｍ２８、Ｖ３３、Ｒ３４、Ｍ３６、Ｒ４１、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｅ５２、Ｐ５５、及びＱ５６からなる群から選択される配列番号４１８２２に対する前記ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～５４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  56. 前記ＯＢＤ－Ｉドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８２２に対して、３位のＧの挿入、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、４位のＧの挿入、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、５位のＰの挿入、５位のＧの挿入、Ｒ５Ｓ、５位のＳの挿入、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、６位のＧの挿入、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、１６位のＦの挿入、Ｆ１８の挿入、２７位のＰの挿入、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、４８位のＰの挿入、Ｅ５２Ｐ、５５位のＰの挿入、５５位のＰの欠失及び５６位のＱの欠失、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、５６位のＤの挿入、５６位のＴの挿入、並びにＱ５６Ｐからなる群から選択される、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
  57. Ｓ２、Ｉ３、Ｌ４、Ｋ１１、Ｖ２４、Ｋ３７、Ｒ４２、Ａ５３、Ｔ５８、Ｋ６３、Ｍ７０、Ｉ８２、Ｑ９２、Ｇ９３、Ｋ１１０、Ｌ１２１、Ｒ１２４、Ｒ１４１、Ｅ１４３、Ｖ１４４、及びＬ１４５からなる群から選択される配列番号４１８２３に対する前記ＯＢＤ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～５６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  58. 前記ＯＢＤ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８２３に対して、２位のＳの欠失、Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、３位のＩの欠失及びＬ４の欠失、４位のＬの欠失、Ｋ１１Ｔ、２４位のＰの挿入、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、５３位のＳの挿入、５８位のＲの挿入、６３位のＫの欠失、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、９３位のＡの挿入、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、１２４位のＡの挿入、１４１位のＲの挿入、１４３位のＤの挿入、１４３位のＡの挿入、１４４位のＷの挿入、及び１４５位のＡの挿入からなる群から選択される、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択される配列番号４１８２５に対する前記ＴＳＬドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置に改変を含む、請求項４５～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  60. 前記ＯＢＤ－ＩＩドメイン内の１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号４１８２５に対して、１位のＭの挿入、２位のＮの欠失、２位のＶの挿入、Ｃ３Ｓ、４位のＧの挿入、４位のＷの挿入、Ｆ５Ｐ、７位のＷの挿入、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、６７位のＡの挿入、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、８０位のＳの欠失、８１位のＧの欠失、８２位のＥの挿入、８２位のＮの挿入、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
  61. 前記発現されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号２又は配列番号１４５と比較して改善された特徴を示し、前記改善された特徴が、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、前記標的核酸に対する結合親和性の増加、前記標的核酸の前記編集においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、前記標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、前記標的核酸の切断に対する編集特異性の改善、前記標的核酸のオフターゲット編集又は切断の減少、編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、前記ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、及び融合特性の改善を含む、請求項４５～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  62. 前記改善された特徴が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
  63. 前記改善された特徴が、配列番号１４５の配列の切断活性と比較して、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
  64. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列のスコアと比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、請求項６３に記載のポリヌクレオチド。
  65. 前記改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、ＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、請求項６３に記載のポリヌクレオチド。
  66. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列のスコアと比較して、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
  67. 前記改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列における切断活性の増加を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
  68. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列と比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｌｏｇ２又はそれ以上大きい濃縮スコアである、請求項６７に記載のポリヌクレオチド。
  69. 前記改善された特徴が、配列番号１４５の配列と比較して、前記標的核酸配列の切断に対する特異性の増加を含む、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
  70. 前記特異性の増加が、インビトロアッセイにおいて、配列番号１４５の配列と比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、又は少なくとも約６ｌｏｇ２又はそれ以上大きい濃縮スコアである、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
  71. 前記改善された特徴が、前記標的核酸配列のオフターゲット切断の減少を含む、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
  72. 前記コードされたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｊ（ＣａｓＰｈｉ）、及びＣａｓＸからなる群から選択される、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
  73. 前記コードされたＣａｓＸが、配列番号１～３、４９～１６０、及び４０２０８～４０３６９からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
  74. 前記コードされたＣａｓＸが、配列番号１～３、４９～１６０、４０２０８～４０３６９及び４０８２８～４０９１２からなる群から選択される配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
  75. 前記ポリヌクレオチドの前記ＣａｓＸ配列が、表２１に示される配列番号４０５７７～４０５８８からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
  76. 前記ポリヌクレオチドの前記ＣａｓＸ配列が、表２１に示される配列番号４０５７７～４０５８８からなる群から選択される配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
  77. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列に連結された１つ以上のＮＬＳをコードする、請求項１～７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  78. 前記１つ以上のＮＬＳをコードする前記配列が、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列の５’末端又はその近傍に位置する、請求項７７に記載のポリヌクレオチド。
  79. 前記１つ以上のＮＬＳをコードする前記配列が、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列の３’末端又はその近傍に位置する、請求項７７に記載のポリヌクレオチド。
  80. 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのＮＬＳをコードし、前記少なくとも２つのＮＬＳをコードする前記配列が、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列の５’及び３’末端又はその近傍に位置する、請求項７８又は請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
  81. 前記１つ以上のコード化されたＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９６）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１９７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２４８）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４１８２７）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９５）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号４０１８８）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号４０１８９）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号４０１９０）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号４０１９１）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４０１９３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０１９４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４０１９５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０１９６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号４０７１０）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号４０１９８）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４１８２８）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４０２００）からなる配列の群から選択され、前記１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、ＣＲＩＳＰＲバリアント又は隣接するＮＬＳに連結され、前記リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号４０２０１）、（ＧＳ）ｎ（配列番号４０２０２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０８）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２０９）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１０）、ＧＧＳＧ（配列番号２１１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１６）、ＧＰＧＰ（配列番号２１７）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１８）、ＰＰＰＧ（配列番号４０２０７）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１９）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０２０３）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号４０２０４）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４０２０５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号４０２０６）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  82. 前記１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１５及び表１６に示される配列番号４０４４３～４０５０１、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  83. 前記１つ以上のコードされたＮＬＳが、表１５及び表１６に示される配列番号４０４４３～４０５０１からなる配列の群から選択される、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  84. 前記コードされた第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１～８３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  85. 前記コードされた第１のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列を含む、請求項１～８４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  86. 前記コードされた第１のｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、前記標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、請求項８５に記載のポリヌクレオチド。
  87. 前記標的化配列が、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、請求項８６に記載のポリヌクレオチド。
  88. 第２のｇＲＮＡと、前記第２のｇＲＮＡに作動可能に連結された第３のプロモーターとをコードする配列を含む、請求項１～８７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  89. 前記第３のプロモーターが、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである、請求項８８に記載のポリヌクレオチド。
  90. 前記第３のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６（（双方向性Ｕ６プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、及びヒトＨ１プロモーターからなる群から選択される、請求項８８又は請求項８９に記載のポリヌクレオチド。
  91. 前記第３のプロモーターが、Ｕ６、ミニＵ６１、ミニＵ６２、ミニＵ６３、ＢｉＨ１、ＢｉＵ６、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ｓｋ、又はヒトＨ１プロモーターの短縮型バリアントである、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
  92. 前記第３のプロモーターが、約２５０ヌクレオチド未満、約２２０ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１６０ヌクレオチド未満、約１４０ヌクレオチド未満、約１３０ヌクレオチド未満、約１２０ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約８０ヌクレオチド未満、又は約７０ヌクレオチド未満を有する、請求項８８～９１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  93. 前記第３のプロモーターが、約７０～約２４５ヌクレオチド、約１００～約２２０ヌクレオチド、又は約１２０～約１６０ヌクレオチドを有する、請求項８８～９１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  94. 前記第３のプロモーターが、表９に示される配列番号４０４０１～４０４２０及び４１０１０～４１０２９、又はそれらと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項８８～９３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  95. 前記第３のプロモーターが、前記第２のｇＲＮＡの転写を増強する、請求項８８～９４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  96. 前記コードされた第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、並びに、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項８８～９５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  97. 前記コードされた第２のｇＲＮＡが、表２に示される配列番号２１０１～２２８５、３９９８１～４００２６、４０９１３～４０９５８、及び４１８１７からなる群から選択される配列を含む、請求項８８～９５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  98. 前記コードされた第２のｇＲＮＡが、請求項８６又は請求項８７に記載の標的核酸とは異なる標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、前記標的化配列が、少なくとも１５～３０ヌクレオチドを有する、請求項８９～９７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  99. 前記標的化配列が、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、請求項９８に記載のポリヌクレオチド。
  100. 前記標的化配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、請求項８６～９９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  101. 前記標的化配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６からなる群から選択される、請求項８６～９９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  102. 前記コードされた第１及び第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、前記１つ以上の改変が、前記発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす、請求項８６～１０１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  103. 前記１つ以上の改変が、表２８に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含む、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
  104. 前記改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、スキャフォールドステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、請求項１０２又は請求項１０３に記載のポリヌクレオチド。
  105. 前記発現されたｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８の前記ｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  106. 前記コードされた第１及び第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３９と比較して１つ以上の改変を有する足場配列を含み、前記１つ以上の改変が、前記発現された第１及び第２のｇＲＮＡにおける改善された特徴をもたらす、請求項８４～１０１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  107. 前記１つ以上の改変が、表２９に示される１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失を含む、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド。
  108. 前記改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、スキャフォールドステム安定性の増加、ステム安定性の延長、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、請求項１０６又は請求項１０７に記載のポリヌクレオチド。
  109. 前記発現されたｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９の前記ｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  110. 配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ５４、Ｇ６４、Ａ８８、及びＡ９５からなる群から選択される位置に１つ以上の改変を含む、請求項１０６～１０９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  111. 配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位のＧの挿入、６４位のＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる群から選択される１つ以上の改変を含む、請求項１１０に記載のポリヌクレオチド。
  112. 配列番号２２３９の配列と比較して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位のＧの挿入、６４位のＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる改変を含む、請求項１１１に記載のポリヌクレオチド。
  113. 前記改善された特徴が、シュードノットステム安定性、三重鎖領域安定性、スキャフォールドバブル安定性、伸長ステム安定性、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性からなる群から選択される、請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  114. 配列番号２２３９の配列と比較して、前記６４位のＣの挿入及び前記Ａ８８Ｇ置換が、前記伸長ステムの非対称バルジエレメントを分離し、前記ｇＲＮＡ足場の前記伸長ステムの安定性を増強する、請求項１１２に記載のポリヌクレオチド。
  115. 前記Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、及びＡ９５Ｇの置換が、前記ｇＲＮＡ足場の前記三重鎖領域の前記安定性を増加させる、請求項１１２に記載のポリヌクレオチド。
  116. 前記Ａ２９Ｃの置換が、前記シュードノットステムの前記安定性を増加させる、請求項１１２に記載のポリヌクレオチド。
  117. 前記アクセサリエレメントが、サイトメガロウイルス最初期イントロンＡ、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、及びヒト熱ショックタンパク質７０ ｍＲＮＡ（Ｈｓｐ７０）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からなる群から選択される転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）である、請求項１～１１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  118. 前記アクセサリエレメントが、表１２に示される配列番号４０４３１～４０４４２、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％の同一性を有する配列からなる群から選択されるＰＴＲＥである、請求項１１７に記載のポリヌクレオチド。
  119. 前記５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、請求項１～１１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  120. 前記５’及び３’ＩＴＲが、血清型ＡＡＶ２に由来する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
  121. 表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７の配列からなる群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  122. 表８～表１０、表１２、表１３、表１７～表２２及び表２４～表２７の配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、請求項１～１２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  123. 表２６の配列からなる群から選択される１つ以上の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  124. 表２６の配列からなる群から選択される１つ以上の配列を含む、請求項１～１２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  125. 表２６に示される１～１７４、１７７～１８６、及び１８８～１９８の構築物の群から選択される構築物の配列を含む、請求項１２４に記載のポリヌクレオチド。
  126. 前記配列が、表２７に示される配列番号４１０５６～４１７７６の配列の群から選択される標的化配列を更に含み、前記標的化配列が、前記ｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列の３’末端に連結されている、請求項１２３～１２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  127. ５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、前記配列のＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変されている、請求項１～１２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  128. ５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、及びポリ（Ａ）、並びにアクセサリエレメントからなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１２７に記載のポリヌクレオチド。
  129. ５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、及びポリ（Ａ）、並びにアクセサリエレメントからなる群から選択される１つ以上のＡＡＶ成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドを欠いている、請求項１２７に記載のポリヌクレオチド。
  130. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のためにコドン最適化された前記１つ以上のＡＡＶ成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる群から選択される、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  131. 前記ポリヌクレオチドが、図２４、図３３～図３５、又は図４２のいずれか１つに示される構築物の構成を有する、請求項１～１３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  132. ａ．ＡＡＶカプシドタンパク質、及び
    ｂ．請求項１～１３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）。
  133. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０に由来する、請求項１３２に記載のｒＡＡＶ。
  134. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質並びに前記５’及び３’ＩＴＲが、同じ血清型のＡＡＶに由来する、請求項１３３に記載のｒＡＡＶ。
  135. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質並びに前記５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶの異なる血清型に由来する、請求項１３３に記載のｒＡＡＶ。
  136. 前記５’及び３’ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２に由来する、請求項１３５に記載のｒＡＡＶ。
  137. 前記ｒＡＡＶによる細胞の形質導入時に、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡが発現され得る、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  138. 発現時に、前記ｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる、請求項１３７に記載のｒＡＡＶ。
  139. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変された前記ＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、発現時にそれらの機能特性を実質的に保持する、請求項１３７又は請求項１３８に記載のｒＡＡＶ。
  140. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変された前記ＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、ｒＡＡＶと比較して、免疫応答を誘導するより低い能力を示し、前記ＡＡＶポリヌクレオチドが、前記ＣｐＧジヌクレオチドの欠失のために改変されていない、請求項１３７又は請求項１３８に記載のｒＡＡＶ。
  141. 免疫応答を誘導する前記より低い能力が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される炎症反応の１つ以上のマーカーの産生を検出するように設計されたインビトロ哺乳動物細胞アッセイにおいて示される、請求項１４０に記載のｒＡＡＶ。
  142. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変された前記ＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含む前記ｒＡＡＶが、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％少ない、１つ以上の炎症マーカーの産生の減少を誘発する、請求項１４１に記載のｒＡＡＶ。
  143. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変された前記ＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含む前記ｒＡＡＶの用量の対象への投与が、ＣｐＧ欠失されていない比較可能なｒＡＡＶの投与用量と比較して、免疫応答の低下を誘発する、請求項１４０に記載のｒＡＡＶ。
  144. 前記免疫応答の低下が、前記対象における抗ｒＡＡＶ抗体の産生の減少又はｒＡＡＶ成分に対する遅延型過敏症反応である、請求項１４３に記載のｒＡＡＶ。
  145. 前記免疫応答の低下が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、前記対象の血液中の１つ以上の炎症マーカーの測定によって決定され、前記１つ以上のマーカーが、ＣｐＧ欠失されていない前記比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減される、請求項１４３に記載のｒＡＡＶ。
  146. 前記対象が、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及び非ヒト霊長類から選択される、請求項１４３～１４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  147. 前記対象が、ヒトである、請求項１４３～１４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  148. 請求項１３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物。
  149. 哺乳動物細胞の集団において標的核酸を改変するための方法であって、複数の前記細胞を有効量の請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと接触させることを含み、前記発現されたｇＲＮＡによって標的化される前記細胞の遺伝子の前記標的核酸が、前記発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質によって改変される、方法。
  150. 前記細胞の前記遺伝子が、１つ以上の変異を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記改変することが、前記細胞集団の前記標的核酸において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、請求項１４９又は請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記遺伝子が、ノックダウン又はノックアウトされる、請求項１４９～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記遺伝子が、機能的遺伝子産物が発現され得るように改変される、請求項１４９～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  154. 対象の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる前記対象における疾患を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１３２～１４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、方法。
  155. 前記ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ）、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１４９に記載の方法。
  156. 前記ｒＡＡＶが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、請求項１５４に記載の方法。
  157. 前記ｒＡＡＶが、皮下、皮内、神経内、結節内、髄内、筋内、腰椎内、髄腔内、くも膜下、心室内、嚢内、静脈内、リンパ管内、眼球内又は腹膜内経路から選択される投与経路によって前記対象に投与され、前記投与方法が注射、輸血、又は移植である、請求項１５４～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１４９～１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記対象が、ヒトである、請求項１４９～１５７のいずれか一項に記載の方法。
  160. ｒＡＡＶベクターを作製する方法であって、
    ａ．パッケージング細胞の集団を提供することと、
    ｂ．前記細胞集団を、
    ｉ）請求項１～１３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
    ｉｉ）ａａｐ（アセンブリ）遺伝子を含むベクター、並びに
    ｉｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐゲノムを含むベクター、でトランスフェクトすることと、を含む、方法。
  161. 前記パッケージング細胞が、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記方法が、前記ｒＡＡＶベクターを回収することを更に含む、請求項１６０又は請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記ＡＡＶポリヌクレオチドの前記成分配列が、単一のｒＡＡＶ粒子に包含される、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. ｒＡＡＶの免疫原性を低下させる方法であって、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのコード配列、ｇＲＮＡのコード配列、アクセサリエレメント、及びポリ（Ａ）からなる群から選択されるＡＡＶ成分配列の配列のＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部を欠失させることを含む、方法。
  165. 前記１つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１６４に記載の方法。
  166. １つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、ＣｐＧジヌクレオチドを欠いている、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記１つ以上のＡＡＶポリヌクレオチド成分配列が、表２５に示される配列番号４１０４５～４１０５５からなる群から選択される、請求項１６４～１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記ｒＡＡＶが、インビトロ哺乳動物細胞アッセイにおいて、前記ＣｐＧジヌクレオチドが欠失されていない比較可能なｒＡＡＶと比較して、炎症反応の１つ以上のマーカーの産生を誘導するより低い能力を示し、前記１つ以上の炎症マーカーが、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項１６４～１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記ｒＡＡＶが、ＣｐＧ欠失されていない前記比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％少ない、前記１つ以上の炎症マーカーの産生の減少を誘発する、請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記ＣｐＧジヌクレオチドの全部又は一部の欠失のために改変された前記ＡＡＶポリヌクレオチド成分配列を含む前記ｒＡＡＶの用量の対象への投与が、ＣｐＧ欠失されていない前記比較可能なｒＡＡＶの投与用量と比較して、免疫応答の低下を誘発する、請求項１６４～１６７のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記免疫応答の低下が、前記対象における抗ｒＡＡＶ抗体の産生の減少又はｒＡＡＶ成分に対する遅延型過敏症反応である、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記免疫応答の低下が、ＴＬＲ９、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）からなる群から選択される、前記対象の血液中の１つ以上の炎症マーカーの測定によって決定され、前記１つ以上のマーカーが、ＣｐＧ欠失されていない前記比較可能なｒＡＡＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減される、請求項１７０に記載の方法。
  173. 前記対象が、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及び非ヒト霊長類から選択される、請求項１６４～１７２のいずれか一項に記載の方法。
  174. 前記対象が、ヒトである、請求項１６４～１７２のいずれか一項に記載の方法。
  175. それを必要とするヒトの前記治療のための医薬品として使用するための、請求項１３２～１４７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの組成物。
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