JP2023552015A - 遺伝子変異を検出するためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
開示された技術は、より有益な試験結果を得るためにサンプルを再分析するための自動流体処理システム及び自動シーケンシング方法に関する。一実施形態では、標的変異を特定するためにサンプル核酸を処理する方法は、サンプル特異性を決定するために第１のシーケンシング反応を実行することを含む。方法は、第１のシーケンシング反応からの標的変異についての第１のリードカバレッジが閾値を超えるか又は閾値未満であるかどうかを判定するための統計的尺度を決定することを更に含む。判定した第１のリードカバレッジが閾値を超えない場合、方法は、第２のシーケンシング反応を実行するのに十分な量のサンプル核酸が利用可能であるかどうかを判定して、閾値を超えてリードカバレッジを増加させることを更に含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２日に出願された米国特許仮出願第６３／１２０６３６号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月２日に出願された米国特許仮出願第６３／１２０６３６号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により組み込まれる。
開示された技術は、遺伝子変異の非侵襲的評価のための自動化された方法及びシステムに関する。一態様では、システムは、推定遺伝子変異を有するサンプルが十分な信頼性で決定されたかどうかを判定し、そうでない場合、サンプルは再処理され得る。
関連技術の説明
生物（例えば、動物、植物及び微生物）の遺伝子情報及び遺伝子情報を複製する他の形態（例えば、ウイルス）は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＲＮＡ）にコードされる。遺伝子情報は、化学的な又は仮説上の核酸の一次構造を表す一連のヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドである。各遺伝子は特定のタンパク質をコードし、転写及び翻訳を介した発現後に、生細胞内の特定の生化学的機能を満たす。
生物（例えば、動物、植物及び微生物）の遺伝子情報及び遺伝子情報を複製する他の形態（例えば、ウイルス）は、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＤＮＡ）又はリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＲＮＡ）にコードされる。遺伝子情報は、化学的な又は仮説上の核酸の一次構造を表す一連のヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドである。各遺伝子は特定のタンパク質をコードし、転写及び翻訳を介した発現後に、生細胞内の特定の生化学的機能を満たす。
ヒトの医学的研究における重要な試みの１つは、有害な健康結果をもたらす遺伝的異常を発見することである。多くの場合、特定の遺伝子及び／又は重要な診断マーカーが、異常なコピー数で存在するゲノムの部分において特定されている。例えば、出生前診断では、染色体全体の余分な又は欠落したコピーは、頻繁に発生する遺伝子病変である。癌において、染色体又は染色体セグメント全体のコピーの欠失又は増殖、及びゲノムの特定領域のより高レベルの増幅が、一般的に発生する。
多くの医学的状態は、１つ以上の遺伝子変異によって引き起こされる。特定の遺伝子変異は、例えば、血友病、サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＤＭＤ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、アルツハイマー病、及び嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＣＦ）（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｎ．Ｃｏｏｐｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｋｒａｗｃｚａｋ，ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３）を含む医学的状態を引き起こす。そのような遺伝性疾患は、特定の遺伝子のＤＮＡにおける単一ヌクレオチドの付加、置換、又は欠失から生じ得る。特定の先天性欠損は、例えば、トリソミー２１（ダウン症候群）、トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（エドワーズ症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）、及び特定の性染色体異数性（例えば、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）など）などの、異数性とも呼ばれる染色体異常によって引き起こされる。いくつかの遺伝子変異は、例えば、糖尿病、動脈硬化症、肥満、様々な自己免疫疾患及び癌（例えば、結腸直腸、乳房、卵巣、肺）などの多くの疾患のいずれかについて、個人をかかりやすくさせる、又は引き起こす場合がある。
本明細書に開示されるシステム、デバイス、キット、及び方法は各々、いくつかの態様を有し、そのうちの単独のいずれかが、単独でそれらの望ましい属性に関与するものではない。特許請求の範囲を限定することなく、ここで、いくつかの顕著な特徴を簡単に説明する。より少ない、追加の、及び／又は異なる構成要素、ステップ、特徴、物体、利益、及び利点を有する実施形態を含む、多数の他の実施形態も企図される。構成要素、態様、及びステップはまた、異なって配置及び順序付けられてもよい。この考察を考慮した後、特に「発明を実施するための形態」と題されたセクションを読み取った後、本明細書に開示されるデバイス及び方法の特徴が他の既知のデバイス及び方法よりも利点を提供する方法を理解するであろう。
一態様では、開示された技術は、標的変異を特定するためにサンプル核酸を処理する方法を提供する。方法は、サンプル特異性標的変異の有無を判定するために第１のシーケンシング反応を実行することを含む。方法は、サンプル特異性に基づいて、標的変異に関連する第１の統計的尺度を決定することを更に含む。方法は、第１の統計的尺度を参照することによって、第１のシーケンシング反応からの標的変異についての第１のリードカバレッジが閾値を超えるか、又は閾値未満であるかを判定することを更に含む。決定された第１のリードカバレッジが閾値を超えない場合、方法は、第２のシーケンシング反応を実行するのに十分な量のサンプル核酸が利用可能であるかどうかを判定して、閾値を超えてリードカバレッジを増加させることを更に含む。十分な量のサンプル核酸が利用可能である場合、方法は、第２の有効リードカバレッジを得るために必要なサンプル量を計算し、サンプル核酸を再シーケンシングして、閾値を超える第２のリードカバレッジを得ることを更に含む。別の態様では、開示された技術は、標的変異を特定するためにサンプル核酸を処理するシステムを提供する。システムは、サンプル核酸をシーケンシングするように構成されたシーケンサを含む。システムは、本明細書に開示される方法のうちのいずれかを実行するためにシーケンサを制御するように構成されたプロセッサを更に含む。システムは、プロセッサと動作可能に接続されたメモリを更に含む。
本明細書で開示するシステムの任意の特徴を、任意の所望の様式及び／又は構成で組み合わせることができることを理解されたい。更に、本明細書で開示する方法の任意の特徴を、任意の所望の様式で組み合わせることができることを理解されたい。更に、方法及び／若しくはシステムの特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができ、かつ／又は本明細書に開示される実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。
以下でより詳細に考察される前述の概念及び追加の概念の全ての組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられ、本明細書に記載される便益及び利点を実現するために使用されてもよいことを理解されたい。
本明細書の実施例はヒトに関し、言語は主にヒトに関するものを対象としているが、本明細書に記載された概念は、任意の植物又は動物からのゲノムに適用可能である。本開示のこれらの並びにその他の目的及び特徴は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかとなる、又は以下に記載される本開示の実施によって学習されてもよい。
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。
試験サンプルを自動流体処理、ヌクレオチドシーケンシング、及び再分析するためのシステムの一実施形態を示すブロック図である。
図１に示すシステムに対応する様々な動作を実行するためのオプションを示すチャートである。
図１に示すシステムの一部として使用可能な例示的なコンピュータシステムを示すブロック図である。
標的変異を特定するためにサンプルを処理する例示的な方法を示すフローチャートである。
図４に示す方法に適合する更なる方法ステップを示すフローチャートである。
ディジョージ症候群の有効リードカバレッジ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅａｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ、ＥＲＣ）の異なるレベルでの胎児分画の関数としての対数尤度比（ｌｏｇ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ、ＬＬＲ）のシミュレーション結果を示す線グラフである。
胎児分画の関数として所望のＬＬＲを達成するための最小ＥＲＣを示す線グラフである。
正常なサンプル及び第１のシーケンシング反応後のディジョージ症候群を有するサンプルについて胎児分画の関数としてのＬＬＲのシミュレーション結果を示すチャートである。
図７の同じシミュレーション結果の上で、再シーケンシング後にＬＬＲカットオフがどのように適用されるかの図を示すチャートである。
全ての特許、特許出願、及び他の刊行物は、これらの文献に開示され、本明細書で言及される全ての配列を含めて、各公開物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。引用された全ての文献は、関連部分において、本明細書の引用の文脈によって示される目的のために、参照により全文が本明細書に組み込まれる。しかしながら、いずれの文献の引用も、それが本開示に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。
例えば、非侵襲性出生前診断（ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ、ＮＩＰＴ）、核型分析、微小欠失のコーリング、セルフリー核酸断片を含む試験サンプルの処理、コピー数多型を決定するためのセルフリーＤＮＡ断片サイズの使用、品質管理のための検出限界の使用、並びに遺伝性疾患、癌、神経系疾患、及び自己免疫疾患に関連する遺伝子異常のリストなどの遺伝的変異の非侵襲的評価を実行することに関する詳細は、米国特許第１０，０９５，８３１号、同第１０，６４３，７３８号、米国特許出願公開第２０１７／０３５１８１１号、同第２０１６／０２２４７２４号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３５７８７号に記載されおり、その開示は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
概要
液体生検は、対象となる分析物と他の分析物との混合物である生体サンプルを分析することを含む。例えば、非侵襲的出生前診断では、母体血漿サンプルは、セルフリー胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡの両方を含有し得る。癌診断では、患者の血液サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ及び正常なＤＮＡの両方を含有し得る。混合物であるサンプルは、例えば、胎児が特定の医学的状態を有するかどうかを決定するための次世代シーケンシング技術を使用する場合の診断の感度及び特異性に影響を及ぼす。しかしながら、感度及び特異性は、サンプルを再分析するために反射分析を行うことによって改善することができ、シーケンシング深度は、特定のマーカー又は一塩基多型（ＳＮＰ）のコーリングの正確な予測を行うのに十分ではない場合がある。
液体生検は、対象となる分析物と他の分析物との混合物である生体サンプルを分析することを含む。例えば、非侵襲的出生前診断では、母体血漿サンプルは、セルフリー胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡの両方を含有し得る。癌診断では、患者の血液サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ及び正常なＤＮＡの両方を含有し得る。混合物であるサンプルは、例えば、胎児が特定の医学的状態を有するかどうかを決定するための次世代シーケンシング技術を使用する場合の診断の感度及び特異性に影響を及ぼす。しかしながら、感度及び特異性は、サンプルを再分析するために反射分析を行うことによって改善することができ、シーケンシング深度は、特定のマーカー又は一塩基多型（ＳＮＰ）のコーリングの正確な予測を行うのに十分ではない場合がある。
本発明の一実施形態は、より有益な試験結果を得るためにサンプルを自動的に再分析するためのシステム又は方法である。例えば、システムは、第１のシーケンシングラウンドを実行して、特定の遺伝子マーカーの有無を判定し、次いで、サンプルの所望の有効リードカバレッジ（ＥＲＣ）に達したかどうかを計算することができる。所望のＥＲＣに到達していない場合、システムは、十分な量の生体サンプルが残っているかどうかを判定して、サンプルの閾値ＥＲＣに到達するために追加のシーケンシング反応を行う。十分な量のサンプルが残っている場合、システムは、どの程度のサンプルが必要かを決定し、計算されたサンプル量に対応する値を出力ファイルに出力する。一実施形態では、その出力ファイルをシステムによって読み取って、自動流体処理システムに指示して、所望の量の残りのサンプルを取り出し、閾値ＥＲＣに達するまで次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の別のラウンドのためのフローセル混合物に入れることができる。したがって、開示された技術は、サンプルの残りの再分析がサンプル内の遺伝情報のリードカバレッジを改善することができるかどうかを予測することに関連し、したがって、サンプルに対してシーケンシングの第２のラウンドが行われた場合に、試験結果にどの程度有益であり得るかを潜在的に改善する。
セルフリー核酸からの遺伝子変異の検出
１つ以上の遺伝子変異又は遺伝分散を特定することにより、特定の医学的状態の診断、又はそのなりやすい体質を判定できるようになり得る。遺伝分散を特定することは、医学的決定を容易にすること、及び／又は有用な医療処置を用いることをもたらし得る。比較的短時間でゲノム全体のシーケンシングを可能にする技術の出現、及び循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の発見は、侵襲的なサンプリング方法に関連するリスクなしに、１つの染色体に由来する遺伝物質を、別の染色体由来の遺伝物質と比較する機会を提供しており、これが、対象遺伝子配列の様々な種類のコピー数多型を診断するためのツールを提供する。非侵襲的出生前診断では、母体血漿サンプルは、セルフリー胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡの両方を含有し得る。癌診断では、患者の血液サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ及び正常なＤＮＡの両方を含有し得る。
１つ以上の遺伝子変異又は遺伝分散を特定することにより、特定の医学的状態の診断、又はそのなりやすい体質を判定できるようになり得る。遺伝分散を特定することは、医学的決定を容易にすること、及び／又は有用な医療処置を用いることをもたらし得る。比較的短時間でゲノム全体のシーケンシングを可能にする技術の出現、及び循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の発見は、侵襲的なサンプリング方法に関連するリスクなしに、１つの染色体に由来する遺伝物質を、別の染色体由来の遺伝物質と比較する機会を提供しており、これが、対象遺伝子配列の様々な種類のコピー数多型を診断するためのツールを提供する。非侵襲的出生前診断では、母体血漿サンプルは、セルフリー胎児ＤＮＡ及び母体ＤＮＡの両方を含有し得る。癌診断では、患者の血液サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ及び正常なＤＮＡの両方を含有し得る。
母体血漿中の胎児ＤＮＡの存在は、非侵襲的出生前診断に刺激的な可能性を切り開いた。最近、出生前診断目的のために循環胎児ＤＮＡを分析するための超並列シーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＭＰＳ）の使用に対してのかなりの関心がある。例えば、胎児トリソミー２１、１３、１８、及び選択された性染色体異数性は、母体血漿ＤＮＡ上でＭＰＳを使用して検出され、臨床サービスに急速に導入されている。染色体全体に関わるコピー数多型に起因する異常に加えて、亜染色体の欠失又は重複を検出するための母体血漿のＭＰＳベースの分析などの他の異常は、有用であり得る。いくつかの実施形態では、開示された技術は、次世代シーケンシング技術を使用して、胎児がある医学的状態を有するかどうか（例えば、胎児がディジョージ症候群又はダウン症候群を示す遺伝子シグネチャを有するかどうか）を判定する。
特定の実施形態では、１つ以上の遺伝子変異又は遺伝分散の特定は、セルフリーＤＮＡの分析を伴う。セルフリーＤＮＡ（Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）は、細胞死に由来するＤＮＡ断片で構成され、末梢血中で循環する。高濃度のｃｆＤＮＡは、癌、外傷、火傷、心筋梗塞、脳卒中、敗血症、感染、及び他の病気などの特定の臨床的状態を示し得る。更に、セルフリー胎児ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ、ｃｆｆＤＮＡ）は、母体血流中で検出され、様々な非侵襲性出生前診断に使用され得る。
いくつかの実施形態では、コピー数多型（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＣＮＶ）として知られる特定の遺伝子又はＤＮＡ部分のコピー数に関する情報は、構造異常の認識を可能にした細胞遺伝学的分解能（ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）によって提供され得る。いくつかの実施形態では、核型の分析のための細胞を得るための、遺伝的スクリーニング及び生物学的量測定のための方法は、侵襲的処置、例えば、羊水穿刺、臍帯穿刺、又は絨毛生検（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｕｓ ｓａｍｐｌｉｎｇ、ＣＶＳ）を含む。細胞培養、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＦＩＳＨ）、定量蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑｆ－ＰＣＲ）、及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙ－ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、アレイ－ＣＧＨ）が、コピー数多型の分析のための分子細胞遺伝法として開発されてきた。
胎児ｃｆＤＮＡ断片の平均長は、妊婦の血漿中の母体ｃｆＤＮＡ断片よりも短いことが証明されている。母体ｃｆＤＮＡと胎児ｃｆＤＮＡとの間のこの差異が、ＣＮＶ及び／又は胎児分画を判定するために、本明細書の実施態様において利用され得る。本明細書に開示される実施形態は、上記の必要性の一部を満たす。いくつかの実施形態は、ペアエンドＤＮＡシーケンシングと連結されたＰＣＲフリーライブラリ調製で実施され得る。いくつかの実施形態は、様々な疾患の非侵襲性の出生前診断（単数及び複数）にとって高い分析感度及び特異性を提供する。言い換えれば、母体血漿中の胎児ＤＮＡ断片の長さ分布が母体ＤＮＡ断片の長さ分布とは異なるという事実を考慮に入れることによって、感度及び特異性を改善することができる。同様に、患者の血液中の腫瘍ＤＮＡ断片の長さ分布は、正常なＤＮＡ断片の長さ分布とは異なる。遺伝子シグネチャで検出されたＤＮＡ断片は、その長さに基づいて胎児ＤＮＡ又は母体ＤＮＡとして特定することができ、したがって、胎児が医学的状態を有するかどうかを診断する際の感度及び特異性を改善する。
遺伝子変異を検出するための自動化された再シーケンシング
図１は、試験サンプルを自動流体処理、シーケンシング、及び再分析するためのシステムの一実施形態を示す。サンプル採取場所０１は、妊婦又は推定癌患者などの患者から試験サンプルを取得するために使用される。次に、サンプルは、本明細書に記載されるように試験用サンプルを処理及びシーケンシングすることができる、処理及びシーケンシング位置０３に提供される。位置０３は、サンプルを処理するための特定のシステム、並びに処理されたサンプルをシーケンシングするための装置を含み得る。例えば、位置０３は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって作製されたものなどの、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）シーケンシングシステムを含み得る。本明細書の他の箇所に記載されるような処理及びシーケンシングの結果は、典型的には電子形式で提供され、インターネットなどの内部又は外部ネットワーク０５に提供されるヌクレオチドリードの集合である。
図１は、試験サンプルを自動流体処理、シーケンシング、及び再分析するためのシステムの一実施形態を示す。サンプル採取場所０１は、妊婦又は推定癌患者などの患者から試験サンプルを取得するために使用される。次に、サンプルは、本明細書に記載されるように試験用サンプルを処理及びシーケンシングすることができる、処理及びシーケンシング位置０３に提供される。位置０３は、サンプルを処理するための特定のシステム、並びに処理されたサンプルをシーケンシングするための装置を含み得る。例えば、位置０３は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって作製されたものなどの、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）シーケンシングシステムを含み得る。本明細書の他の箇所に記載されるような処理及びシーケンシングの結果は、典型的には電子形式で提供され、インターネットなどの内部又は外部ネットワーク０５に提供されるヌクレオチドリードの集合である。
配列データはまた、分析及びコール生成が実行される遠隔位置０７に提供され得る。この位置は、１つ以上の強力な計算デバイスを含んでもよい。場所０７における計算リソースがそれらの分析を完了し、受信した配列情報からのコールを生成した後、遺伝子コール（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃａｌｌ）はネットワーク０５に再中継される。いくつかの実施形態では、位置０７でコールが生成されるだけでなく、関連する診断も生成され得る。次に、コール及び／又は診断は、図１に示されるように、ネットワークを横切って送信され、サンプル採取位置０１に戻る。説明されるように、これは、コール又は診断を生成することに関連する種々の動作が、どのように種々の位置の間で分割され得るかにおける、多くの変形形態のうちの１つである。１つの共通のバリアントは、単一の位置で、サンプル採取並びに処理及びシーケンシングを提供することを含む。別の変形形態は、分析及びコールの生成と同じ場所で処理並びにシーケンシングを提供することを含む。
図２は、図１に記載されたシステムに対応する様々な動作を、別個の位置Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤで実行するための選択肢を詳述する概略図である。図２に描かれる詳細な意味において、次の動作：サンプル採取、サンプル処理、シーケンシング、リード位置合わせ、コーリング、診断、並びに報告及び／又は計画策定の各々は、別個の位置で実行される。当然のことながら、これらの動作の各々は、同じ物理的な位置又は実験室でも実行され得ることが理解されるべきである。
これらの動作のいくつかをまとめる一実施形態では、サンプル処理及びシーケンシングが１つの場所で実行され、別の場所でリード位置合わせ、コーリング、及び診断が実行される。参照符号Ａで特定される図２の部分を参照されたい。図２において参照符号Ｂで特定される別の実施態様では、サンプル採取、サンプル処理、及びシーケンシングは全て同じ場所で実行される。この実施態様では、リード位置合わせ及びコーリングが第２の場所で実行される。最後に、診断、並びに報告及び／又は計画策定が第３の場所で実行される。図２の参照符号Ｃで示される実施態様では、サンプル採取が第１の場所で実行され、サンプル処理、シーケンシング、リード位置合わせ、コーリング、及び診断が全て第２の場所で一緒に実行され、報告及び／又は計画策定が第３の場所で実行される。最後に、図２で参照符号Ｄで示される実施態様では、サンプル採取が第１の場所で実行され、サンプル処理、シーケンシング、リード位置合わせ、及びコーリングが全て第２の場所で実行され、診断、並びに報告及び／又は計画策定が第３の場所で実行される。
図１に示すシステムは、任意の好適なコンピュータシステム又はサブシステムを利用することができる。そのようなコンピュータシステム９００の例を図３に示す。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム９００は、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、各々が内部構成要素を有するサブシステムである複数のコンピュータ装置を含むことができる。
図３に示されるコンピュータシステム９００のサブシステムは、システムバス９７５を介して相互接続されている。ディスプレイアダプタ９８２に結合されたプリンタ９７４、キーボード９７８、記憶デバイス（複数可）９７９、モニタ９７６などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ９７１に結合する周辺機器及び入出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、シリアルポート９７７などの当該技術分野で知られている任意の数の手段によってコンピュータシステムに接続することができる。例えば、シリアルポート９７７又は外部インターフェース９８１（例えば、イーサネット（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉなど）を使用して、コンピュータシステム９００をインターネットなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス、又はスキャナに接続することができる。システムバス９７５を介した相互接続は、中央プロセッサ９７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ９７２又は記憶デバイス（複数可）９７９（例えば、ハードドライブ又は光ディスクなどの固定ディスク）からの命令の実行、並びにサブシステム間の情報の交換を制御することを可能にする。システムメモリ９７２及び／又は記憶デバイス（複数可）９７９は、コンピュータ可読媒体を具現化することができる。本明細書で言及されるデータのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力され得、ユーザに出力され得る。
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース９８１によって又は内部インターフェースによって一緒に接続される、複数の同じ構成要素又はサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワークを介して通信することができる。そのような場合、１つのコンピュータをクライアントと見なすことができ、別のコンピュータをサーバと見なすことができ、各々は同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、又は構成要素を含むことができる。
図１に示すシステムは、図４に示すように、サンプルを処理して標的変異を識別する方法４００を実施し得る。図４に示すように、方法４００は、スタートブロック４０１から始まり、次いでブロック４０５に移行して、サンプルのマイクロリットルあたりの胎児分画及びリードカバレッジなどのサンプル特異性を決定するために第１のシーケンシング反応を実行する。いくつかの実施形態では、サンプル特異性を決定するために第１のシーケンシング反応を実行することは、第１のシーケンシング反応から配列リードを得て、配列リードを参照配列に位置合わせし、位置合わせ結果を得ることを含み得る。いくつかの実施形態では、参照配列は、代表的なゲノム又はトランスクリプトームの一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のシーケンシング反応及び第２のシーケンシング反応は、次世代シーケンシングプロセスを利用する。いくつかの実施形態では、サンプル核酸は、未処理サンプルからのライブラリ調製プロセスによって生成され、ライブラリ調製プロセスは、次世代シーケンシングプロセスに対応している。いくつかの実施形態では、サンプル核酸は、宿主からの宿主核酸、及びゲストからのゲスト核酸を含み、宿主及びゲストは、同じ種、例えば、ヒトに由来する。いくつかの実施形態では、宿主核酸及びゲスト核酸は、宿主を循環するセルフリー核酸に由来する。例えば、宿主は母親であり、ゲストは胎児であり、胎児の標的変異は胎児の表現型又は胎児死亡の原因に対応する。そのような場合、標的変異は、胎児の異数性症候群、微小欠失症候群、又は微小重複症候群に対応し得る。別の例では、宿主は患者であり、ゲストは腫瘍であり、腫瘍の標的変異は、治療に対する癌の種類、ステージ、又は感受性に対応する。
ブロック４０５においてサンプル特異性を決定するために第１のシーケンシング反応を実行した後、方法４００は次に、ブロック４１５に移行して、サンプル特異性に基づいて、標的変異に関連する第１の統計的尺度を計算し、第１の統計的尺度を参照することによって、第１のシーケンシング反応からの標的変異についての第１のリードカバレッジが閾値を超えるか又は閾値未満であるかを判定する。いくつかの実施形態では、第１の統計的尺度は、対数尤度比であり、対数尤度比を決定することは、第１のシーケンシング反応の結果に基づいて真陽性率を決定することであって、真陽性率が、ゲスト核酸中の標的変異を検出する頻度である、ことと、第１のシーケンシング反応の結果に基づいて偽陽性率を決定することであって、偽陽性率が、宿主核酸の標的変異を検出する頻度である、ことと、真陽性率を偽陽性率で割って、尤度比を得ることと、対数尤度比を得るために尤度比を対数変換することと、を含む。いくつかの実施形態では、真陽性率を決定すること、及び偽陽性率を決定することは、標的変異で検出された核酸が、宿主核酸であるかゲスト核酸であるかを、核酸の長さを核酸長の統計モデルと比較することによって推定することを伴い、統計モデルは、サンプル核酸が由来する方法と同様に導出された生体サンプルから経験的に決定される。
判定した第１のリードカバレッジがブロック４１５において閾値を超えない場合、方法４００は次に、ブロック４２５に移行し（図５に詳述される更なる方法ステップを通して）、第２のシーケンシング反応を実行するのに十分な量のサンプル核酸が利用可能であるかどうかを判定して、閾値を超えてリードカバレッジを増加させる。いくつかの実施形態では、十分な量のサンプル核酸が第２のシーケンシング反応を実行するために利用可能であるかどうかを判定することは、ＲＣ２／Ｖ２＝ＲＣ１／Ｖ１によって第２のリードカバレッジＲＣ２を推定することを含み、式中、ＲＣ１は、決定された第１のリードカバレッジであり、Ｖ１は、第１のシーケンシング反応で使用されるサンプル核酸の体積であり、Ｖ２は、サンプル核酸の残余の体積である。推定したＲＣ２が閾値を超える場合、第２のシーケンシング反応を実行するのに十分な量のサンプル核酸が利用可能であると判定する。
決定ブロック４２６で十分な量のサンプル核酸が利用可能である場合、方法４００は次に、ブロック４３５に移行して、第２の有効リードカバレッジを得るために必要な量を計算し、サンプル核酸を再シーケンシングして、閾値を超える第２のリードカバレッジを得る。いくつかの実施形態では、サンプルを再シーケンシングすることは、第１のシーケンシング反応後にサンプル核酸の残余で第２のシーケンシング反応を実行することを含む。あるいは、決定ブロック４２６において、ブロック４２５での定量後に十分な量のサンプル核酸が利用可能ではない場合、方法４００は次に、ブロック４４５に移行し、サンプル核酸を再シーケンシングすることが、標的変異に関して無益であることを報告する。
いくつかの実施形態では、図４の方法は、図５に示される更なる方法ステップのいくつかを含む。例えば、第１のシーケンシング反応からの標的変異についての第１のリードカバレッジが閾値を超えるか閾値未満であるかを判定するための第１の統計的尺度を決定する図４のブロック４１５は、図５のブロック５０５、５２５、及び５３５を含み得る。図５に示される方法４１５は、ブロック５０５で開始して、第１のシーケンシング反応の結果に基づいて第１の統計的尺度を決定する。決定した第１の統計的尺度が決定ブロック５０６でカットオフを超える場合、方法４１５はブロック５１５に移行し、標的変異の陽性所見を報告し、次いで方法４１５はエンドブロック５４６に移行する。あるいは、決定した第１の統計的尺度が決定ブロック５０６でカットオフを超えない場合、方法４１５は、ブロック５２５に移行して、第１のシーケンシング反応の結果に基づいて第１のリードカバレッジを決定し、次いで、ブロック５３５に移行して、決定した第１のリードカバレッジを閾値と比較する。任意選択的に、決定ブロック５３６で、決定した第１のリードカバレッジが閾値を超える場合、方法４１５は、ブロック５４５に移行して、標的変異の陰性所見を報告してもよく、次いで方法４１５は、エンドブロック５４６に移行する。あるいは、決定ブロック５３６において、決定した第１のリードカバレッジが閾値を超えない場合、方法４１５は、図４のブロック４２５に移行して戻ることができる。
いくつかの実施形態では、サンプル核酸の再シーケンシング後に、方法４００は、更なる配列リードを得ることに移行し得る。次いで、方法４００は、更なる配列リードを参照配列に位置合わせし、更なる位置合わせ結果を得ることに移行することができ、参照配列は、代表的なゲノム又はトランスクリプトームの一部を含む。次いで、方法４００は、更なる位置合わせ結果に基づいて標的変異を有するように第２の統計的尺度を決定することに移行し得る。決定された第２の統計的尺度がカットオフを超えない場合、方法４００は、次いで、標的変異の陰性所見を報告することに移行し得る。そうでなければ、方法４００は、次いで、標的変異の陽性所見の報告に移行し得る。
ＬＬＲカットオフは、第１のシーケンシング反応後の胎児分画の関数としてＬＬＲのシミュレーション結果を示す図７に示されている。図７に示されるサンプルは、ＬＬＲスコアが図７に示されるＬＬＲカットオフに関して低下する場所に応じて、陽性、陰性とコールされ得るか、又は反射分析のためにフラグ付けされ得る（例えば、ＥＲＣ＜必要ＥＲＣの場合）。ＬＬＲスコアに反射分析のためにフラグ付けすることができるが、ＥＲＣ＞必要ＥＲＣであるサンプルについては、それらのＬＬＲスコアは陰性と呼ばれることになり、反射分析のためにフラグ付けされない。ＬＬＲスコアが反射分析のためにフラグ付けされるサンプルについては、その残留体積を前提とした再シーケンシング反応で標的ＥＲＣを満たすことができないと判定された場合、反射されない。
図８は、図７の同じシミュレーション結果の上部で、図７に示される第１のシーケンシング反応に閾値がどのように適用されるかと比較した、再シーケンシング後にＬＬＲカットオフがどのように適用されるかの図を示す。図８に示すように、サンプルのＬＬＲスコアが上側ＬＬＲカットオフを超える必要ＥＲＣを達成したが、ＬＬＲスコアは依然として上側ＬＬＲカットオフを超えなかった場合、サンプルのＬＬＲスコアは陰性と呼ばれることになる。最終ＬＬＲスコアは、再シーケンシングからの個々のスコア、又は第１のシーケンシング反応及び再シーケンシング反応の両方からのＬＬＲスコアの合計（すなわち、「相加」ＬＬＲスコア）のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、方法４００のＬＬＲカットオフは、サンプル中のゲスト核酸も宿主核酸も標的変異を含まないと仮定して、ゲスト核酸の存在量のレベルが異なるサンプルに対応する複数の配列表現を計算的に生成することと、シーケンシングが異なるリードカバレッジで実行されると仮定して、複数の配列表現から位置合わせ結果をシミュレートすることと、シミュレートされた位置合わせ結果に基づいて、存在量の各レベル及び各リードカバレッジで標的変異を有するようにゲストの第１の統計的尺度を決定することと、かかる配列表現のプリセットされた割合以上は達成することができない第１の統計的尺度の値に、カットオフを設定することと、によって設定される。
いくつかの実施形態では、方法４００の閾値は、図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、サンプル核酸中のゲスト核酸が標的変異を含有することが既知であるか、又は含有すると仮定されていること、及びサンプル核酸中の宿主核酸が標的変異を含有しないことが既知であるか、又は含有しないと仮定されていることを考慮して、決定した第１の統計的尺度がカットオフを超えることを可能にする最小リードカバレッジとして設定される。いくつかの実施形態では、閾値は、標的変異の複雑さ、及びサンプル核酸中のゲスト核酸の存在量の関数である。いくつかの実施形態では、関数は、サンプル中のゲスト核酸が標的変異を含有する一方でサンプル中の宿主核酸が標的変異を含有しないと仮定して、ゲスト核酸の存在量のレベルが異なるサンプルに対応する複数の配列表現を計算的に生成することと、シーケンシングが異なるリードカバレッジで実行されると仮定して、複数の配列表現から位置合わせ結果をシミュレートすることと、シミュレートされた位置合わせ結果に基づいて、存在量の各レベル及び各リードカバレッジで標的変異を有するようにゲストの第１の統計的尺度を決定することと、標的変異について、存在量の各レベルでの閾値を、決定した第１の統計的尺度がカットオフを超えることを可能にする最小リードカバレッジに設定することと、によって得られる。いくつかの実施形態では、サンプル核酸中のゲスト核酸の存在量は、第１のシーケンシング反応の結果に基づいて、サンプル核酸中の核酸の長さ分布を得ることと、得た長さ分布を核酸長の統計モデルと比較することによって存在量を推測することと、によって推定され、統計モデルは、サンプル核酸が由来する方法と同様に導出された生体サンプルから経験的に決定される。
シーケンシングデータ分析及び診断方法
シーケンシングデータ及びそれから得られる診断の分析は、種々のコンピュータ実行アルゴリズム及びプログラムを使用して実行され得る。したがって、特定の実施形態は、１つ以上のコンピュータシステム又はその他の処理システム内に記憶された又はそれらを介して転送されたデータを含む、プロセスを採用する。本明細書に開示された実施形態はまた、これらの動作を実行するための装置に関する。本装置は、必要な目的のために特別に構築されてもよい、又はコンピュータに記憶されたコンピュータプログラム及び／若しくはデータ構造によって選択的に起動又は再構成される汎用コンピュータ（又はコンピュータのグループ）であってもよい。いくつかの実施形態では、プロセッサのグループは、列挙された分析動作の一部又は全てを協働して（例えば、ネットワーク又はクラウド算定を介して）、及び／又は並列に実行する。本明細書に記載された方法を実行するためのプロセッサ又はプロセッサのグループは、プログラム可能なデバイス（例えば、ＣＰＬＤ及びＦＰＧＡ）などのマイクロコントローラ及びマイクロプロセッサ、並びにゲートアレイＡＳＩＣ又は汎用マイクロプロセッサなどのプログラム不可能なデバイスを含む種々の種類のものであってもよい。
シーケンシングデータ及びそれから得られる診断の分析は、種々のコンピュータ実行アルゴリズム及びプログラムを使用して実行され得る。したがって、特定の実施形態は、１つ以上のコンピュータシステム又はその他の処理システム内に記憶された又はそれらを介して転送されたデータを含む、プロセスを採用する。本明細書に開示された実施形態はまた、これらの動作を実行するための装置に関する。本装置は、必要な目的のために特別に構築されてもよい、又はコンピュータに記憶されたコンピュータプログラム及び／若しくはデータ構造によって選択的に起動又は再構成される汎用コンピュータ（又はコンピュータのグループ）であってもよい。いくつかの実施形態では、プロセッサのグループは、列挙された分析動作の一部又は全てを協働して（例えば、ネットワーク又はクラウド算定を介して）、及び／又は並列に実行する。本明細書に記載された方法を実行するためのプロセッサ又はプロセッサのグループは、プログラム可能なデバイス（例えば、ＣＰＬＤ及びＦＰＧＡ）などのマイクロコントローラ及びマイクロプロセッサ、並びにゲートアレイＡＳＩＣ又は汎用マイクロプロセッサなどのプログラム不可能なデバイスを含む種々の種類のものであってもよい。
更に、特定の実施形態は、様々なコンピュータ実行動作を実行するためのプログラム命令及び／又はデータ（データ構造を含む）を含む有形及び／又は非一時的コンピュータ可読媒体又はコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータ可読媒体の例としては、半導体メモリデバイス、ディスクドライブなどの磁気媒体、磁気テープ、光学媒体（ＣＤ、光磁気媒体など）、並びに読み取り専用メモリデバイス（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの、プログラム命令を記憶及び実行するように特別に構成されたハードウエアデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータ可読媒体は、エンドユーザによって直接制御されてもよい、又は、媒体は、エンドユーザによって間接的に制御されてもよい。直接制御された媒体の例としては、ユーザ施設及び／又はその他の構成要素と共有されていない媒体に位置する媒体が挙げられる。間接的に制御された媒体の例としては、外部ネットワークを介して、及び／又は、「クラウド」などの共有リソースを提供するサービスを介して、ユーザに間接的にアクセス可能な媒体が挙げられる。プログラム命令の例としては、コンパイラによって生成されるものなどの機械コード、及びインタプリタを使用してコンピュータによって実行され得るものよりも高レベルのコードを含むファイルの両方が挙げられる。
様々な実施形態では、開示された方法及び装置に用いられるデータ又は情報は、電子フォーマットで提供される。このようなデータ又は情報は、核酸サンプルに由来するリード及びタグ、参照配列の特定の領域と位置合わせされる（例えば、染色体又は染色体セグメントに位置合わせされる）上記タグのカウント又は密度、参照配列（単独又は主に多型を提供する参照配列を含む）、染色体及びセグメント量、異数性コールなどのコール、正規化染色体及びセグメント値、染色体又はセグメントと対応する正規化染色体又はセグメントの対、カウンセリング推奨、診断などを含むことができる。本発明で使用する場合、電子形式で提供されるデータ又はその他の情報は、機械上での記憶及び機械間の送信のために利用可能である。従来、電子形式のデータはデジタル的に提供され、種々のデータ構造、リスト、データベースなどのビット及び／又はバイトとして記憶されてもよい。データは、電子的、光学的などに具現化されてもよい。
一実施形態は、試験サンプルにおける異数性、例えば、胎児異数性又は癌の有無を示す出力を生成するためのコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータ製品は、染色体異常を判定するための上記の方法のうちのいずれか１つ以上を実行するための命令を含んでもよい。上述したように、コンピュータ製品は、プロセッサが染色体量、場合によっては、胎児異数性の有無を判定できるように、コンピュータ実行可能又はコンパイル可能な論理（例えば、命令）を記録した非一時的及び／又は有形のコンピュータ可読媒体を含んでもよい。一実施例では、コンピュータ製品は、プロセッサに胎児異数性を診断させるためのコンピュータ実行可能又はコンパイル可能な論理（例えば、命令）を記録するコンピュータ可読媒体を含み、この論理は、母体生物学的サンプルからの核酸分子の少なくとも一部からシーケンシングデータを受信するための受信手順であって、当該シーケンシングデータが、計算された染色体及び／又はセグメント量を含む、受信手順と、受信されたデータから胎児異数性を分析するためのコンピュータ支援論理と、当該胎児異数性の有無又は種類を示す出力を生成するための出力手順と、を含む。
考慮中のサンプルからの配列情報は、染色体参照配列にマッピングされて、任意の１つ以上の対象染色体のそれぞれについての配列タグの数を特定し、任意の１つ以上の対象染色体のそれぞれについて、正規化セグメント配列についての配列タグの数を特定することができる。様々な実施形態では、参照配列は、例えば、リレーショナル又はオブジェクトデータベースなどのデータベースに記憶される。
ヒトが助けを借りることなく、本明細書に開示された方法の計算動作を実行することは実用的ではない、あるいは、ほとんどの場合、更に不可能である、と理解すべきである。例えば、サンプルから読み取られた単一の３０ｂｐをヒト染色体のうちのいずれか１つにマッピングすることは、計算装置の支援無しに多大な努力を要する場合がある。当然のことながら、信頼度の高い異数性コールは、一般に、１つ以上の染色体へ数千（例えば、少なくとも約１０，０００）又は更には数百万のリードをマッピングすることを必要とするため、問題は複雑である。
本明細書に開示される方法は、試験サンプル中の対象遺伝子配列のコピー数を評価するためのシステムを使用して実施することができる。本システムは、（ａ）サンプルから核酸配列情報を提供する試験サンプルから核酸を受容するためのシーケンサと、（ｂ）プロセッサと、（ｃ）当該プロセッサ上で実行するための命令を記憶して、任意のＣＮＶ、例えば、染色体又は部分的な異数性を特定するための方法を実行する１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体と、を備える。
いくつかの実施形態では、本方法は、任意のＣＮＶ、例えば、染色体又は部分的異数性を特定する方法を実行するためのコンピュータ可読命令を記憶したコンピュータ可読媒体によって指示される。したがって、一実施形態は、コンピュータ実行可能命令を記憶した１つ以上のコンピュータ可読非一時的記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供し、コンピュータ実行可能命令は、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、胎児及び母体セルフリー核酸を含む試験サンプル中の対象配列のコピー数を評価する方法をコンピュータシステムに実施させる。本方法は、（ａ）試験サンプル中のセルフリー核酸断片をシーケンシングすることによって得られる配列リードを受け取ることと、（ｂ）セルフリー核酸断片の配列リードを、対象配列を含む参照ゲノムに位置合わせすることによって試験配列タグを提供することであって、参照ゲノムが複数のビンに分割される、ことと、（ｃ）試験サンプル中に存在するセルフリー核酸断片のサイズを判定することと、（ｄ）タグが得られるセルフリー核酸断片のサイズに基づいて、試験配列タグを重み付けすることと、（ｅ）（ｄ）の重み付けしたタグに基づいてビンのカバレッジを計算することと、（ｆ）計算したカバレッジから対象配列におけるコピー数多型を特定することと、を含む。いくつかの実施態様では、試験配列タグに重み付けすることは、試験サンプル中の１つのゲノムのサイズ又はサイズ範囲特性のセルフリー核酸断片から得られた試験配列タグに向けてカバレッジにバイアスをかけることを含む。いくつかの実施態様では、試験配列タグに重み付けすることは、サイズ又はサイズ範囲のセルフリー核酸断片から得られたタグに１の値を割り当てることと、他のタグに０の値を割り当てることと、を含む。いくつかの実施態様では、本方法は、対象配列を含む参照ゲノムのビンにおいて、閾値よりも短い又は長い断片サイズを有する試験サンプル中のセルフリー核酸断片の量を含む断片サイズパラメータの値を判定することを更に含む。ここで、対象配列におけるコピー数多型を特定することは、断片サイズパラメータの値だけでなく、（ｅ）で計算されたカバレッジを使用することを含む。いくつかの実施態様では、システムは、上述の様々な方法及びプロセスを使用して、試験サンプル中のコピー数を評価するように構成される。
いくつかの実施形態では、命令は、母体試験サンプルを提供するヒト被験者の患者の医療記録における染色体の量及び胎児染色体の有無などの方法に関連する情報を自動的に記録することを更に含んでもよい。患者の医療記録は、例えば、実験室、医師のオフィス、病院、健康管理施設、保険会社、又は個人医療記録ウェブサイトによって管理され得る。更に、プロセッサが実行する分析の結果に基づいて、本方法は、母体試験サンプルが採取されたヒト被験者の治療を指示、開始、及び／又は変更することを更に含んでもよい。これは、対象から採取した追加のサンプルに対して、１つ以上の追加の試験又は分析を実行することを含んでもよい。
開示された方法はまた、任意のＣＮＶ、例えば、染色体又は部分的異数性を特定するための方法を実行するように適合又は構成されたコンピュータ処理システムを使用して実行することもできる。一実施形態は、本明細書に記載された方法を実行するように適合又は構成されたコンピュータ処理システムを提供する。一実施形態では、本装置は、本明細書の他の箇所に記載される配列情報の種類を取得するために、サンプル中の核酸分子の少なくとも一部をシーケンシングするように適合又は構成されたシーケンシング装置を含む。装置はまた、サンプルを処理するための構成要素を含んでもよい。このような構成要素は、本明細書のその他の箇所に記載されている。
配列又はその他のデータは、コンピュータに入力することができる、又は直接的若しくは間接的にのどちらかで、コンピュータ可読媒体上に記憶されてもよい。一実施形態では、コンピュータシステムは、サンプルから核酸配列を読み取る及び／又は分析するシーケンシングデバイスに直接連結される。このようなツールからの配列又はその他の情報は、コンピュータシステム内のインターフェースを介して提供される。あるいは、システムによって処理された配列は、データベース又はその他のリポジトリなどの配列記憶ソースから提供される。処理装置が利用可能になると、メモリデバイス又は大容量記憶デバイスは、核酸の配列を少なくとも一時的に緩衝又は保存する。加えて、メモリデバイスは、種々の染色体又はゲノムなどのタグ数を記憶してもよい。メモリはまた、配列又はマップされたデータの提示を分析するための種々のルーチン及び／又はプログラムを記憶してもよい。このようなプログラム／ルーチンは、統計分析を実行するためのプログラムなどを含んでもよい。
一実施例では、使用者は、シーケンシング装置にサンプルを提供する。データは、コンピュータに接続されたシーケンシング装置によって収集及び／又は分析される。コンピュータ上のソフトウエアは、データ収集及び／又は分析を可能にする。データは、記憶され、（モニタ又はその他の同様のデバイスを介して）表示され、及び／又は別の場所に送信され得る。コンピュータは、遠隔ユーザ（例えば、医師、科学者、又は分析医）によって利用されるハンドヘルドデバイスにデータを送信するために使用されるインターネットに接続されてもよい。データは、送信前に記憶及び／又は分析され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、未加工データが収集され、データを分析及び／又は記憶する遠隔ユーザ又は装置に送信される。送信は、インターネットを介して行うことができるが、衛星又は他の接続を介しても行うことができる。あるいは、データは、コンピュータ可読媒体に記憶することができ、媒体は、エンドユーザに（例えば、メールを介して）配信することができる。遠隔ユーザは、建物、都市、州、国、又は大陸を含むがこれらに限定されない、同じ又は異なる地理的位置にあることができる。
いくつかの実施形態では、方法はまた、複数のポリヌクレオチド配列（例えば、リード、タグ、及び／又は参照染色体配列）に関するデータを収集することと、データをコンピュータ又はその他の計算システムに送信することと、を含む。例えば、コンピュータは、試験室機器、例えば、サンプル採取装置、ヌクレオチド増幅装置、ヌクレオチドシーケンシング装置、又はハイブリダイゼーション装置に接続することができる。次に、コンピュータは、試験室デバイスによって集められた適用可能なデータを収集することができる。データは、任意の工程で、例えば、実時間での収集中、送信前、送信中又は送信に関連して、又は送信後に、コンピュータ上に記憶され得る。データは、コンピュータから抽出することができるコンピュータ可読媒体上に記憶することができる。収集又は記憶されたデータは、コンピュータから遠隔位置に、例えば、ローカルネットワーク又はインターネットなどの広域ネットワークを介して送信することができる。遠隔位置では、以下に記載されるように、送信されたデータに対して種々の動作を実行することができる。
本明細書に開示されるシステム、装置、及び方法において記憶、送信、分析、及び／又は操作され得る電子的にフォーマットされたデータの種類の中でも、以下のものである。
・試験用サンプル中の核酸をシーケンシングすることによって得られたリード
・リードを、参照ゲノム又はその他の参照配列（単数又は複数）に位置合わせすることによって得られるタグ
・参照ゲノム又は配列
・配列タグ密度－参照ゲノム又は他の参照配列の２つ以上の領域（典型的には染色体又は染色体セグメント）のそれぞれについてのカウント又はタグ数
・特定の対象染色体又は染色体セグメントについての正規化染色体又は染色体セグメントの識別
・対象染色体又はセグメント及び対応する正規化染色体又はセグメントから得られた染色体又は染色体セグメント（又は他の領域）の量
・影響あり、影響なし、又はコールなしのいずれかとして染色体量をコールするための閾値
・染色体量の実際のコール
・診断（コールに関連する臨床的状態）
・コール及び／又は診断から誘導される更なる試験のための推奨
・コール及び／又は診断から誘導される治療及び／又は監視計画
・試験用サンプル中の核酸をシーケンシングすることによって得られたリード
・リードを、参照ゲノム又はその他の参照配列（単数又は複数）に位置合わせすることによって得られるタグ
・参照ゲノム又は配列
・配列タグ密度－参照ゲノム又は他の参照配列の２つ以上の領域（典型的には染色体又は染色体セグメント）のそれぞれについてのカウント又はタグ数
・特定の対象染色体又は染色体セグメントについての正規化染色体又は染色体セグメントの識別
・対象染色体又はセグメント及び対応する正規化染色体又はセグメントから得られた染色体又は染色体セグメント（又は他の領域）の量
・影響あり、影響なし、又はコールなしのいずれかとして染色体量をコールするための閾値
・染色体量の実際のコール
・診断（コールに関連する臨床的状態）
・コール及び／又は診断から誘導される更なる試験のための推奨
・コール及び／又は診断から誘導される治療及び／又は監視計画
これらの種々の種類のデータは、別個の装置を使用して、１つ以上の場所で取得、記憶、送信、分析、及び／又は操作されてもよい。処理オプションは、広域スペクトルに及ぶ。スペクトルの一方の端部において、この情報の全て又は多くは、試験用サンプルが処理される場所、例えば医師の診察室又はその他の臨床設定で保管及び使用される。その他の極端な場合、サンプルは１つの場所で取得され、異なる場所で処理され、所望によりシーケンシングされ、リードは位置合わせされ、１つ以上の異なる場所でコールが行われ、更に別の場所（サンプルが得られた場所であり得る）で診断、推奨、及び／又は計画が準備される。
様々な実施形態では、リードはシーケンシング装置で生成され、次いで、遠隔場所に送信されて、そこで処理されて異数性コールを生成する。この遠隔場所では、一例として、リードが、参照配列に位置合わせされてタグを生成し、このタグがカウントされ、対象染色体又はセグメントに割り当てられる。また、遠隔場所では、カウントは、関連する正規化染色体又はセグメントを使用して量に変換される。更に、遠隔場所では、この量を使用して、異数性コールを生成する。
個々の場所で採用され得る処理動作は、以下の通りである。
・サンプル採取
・シーケンシングの予備的サンプル処理
・シーケンシング
・配列データを分析し、異数性コールを導出する
・診断
・診断及び／又はコールを患者又は医療提供者へ報告する
・更なる処理、試験、及び／又は監視のための計画を策定する
・計画を実行する
・カウンセリング
・サンプル採取
・シーケンシングの予備的サンプル処理
・シーケンシング
・配列データを分析し、異数性コールを導出する
・診断
・診断及び／又はコールを患者又は医療提供者へ報告する
・更なる処理、試験、及び／又は監視のための計画を策定する
・計画を実行する
・カウンセリング
これらの動作のうちの任意の１つ以上は、本明細書のその他の箇所に記載されるように自動化されてもよい。典型的には、配列データをシーケンシング及び分析し、異数性を導出することは、計算で実行される。その他の動作は、手動で又は自動的に実行されてもよい。
サンプル採取が実行され得る場所の例としては、健康施術者のオフィス、診療所、患者の家（サンプル採取ツール又はキットが提供される場合）、及び移動医療車両が挙げられる。シーケンシング前のサンプル処理が実行され得る場所の例としては、健康施術者のオフィス、診療所、患者の家（サンプル処理装置又はキットが提供される）、移動医療車両、及び異数性分析提供者の施設が挙げられる。シーケンシングが実行され得る場所の例としては、健康施術者のオフィス、診療所、医療専門家のオフィス、診療所、患者の家（サンプルシーケンシング装置及び／又はキットが提供される）、移動医療車両、及び異数性分析提供者の施設が挙げられる。シーケンシングが実行される場所には、電子フォーマットで配列データ（典型的には、リード）を送信するための専用ネットワーク接続が提供され得る。このような接続は有線又は無線であってもよく、処理部位への送信前にデータを処理及び／又は集約することができる部位にデータを送信するように構成されてもよい。データアグリゲータは、健康管理機関（ＨＭＯ）などの健康機関によって管理され得る。
分析及び／又は導出操作は、前述の場所のうちのいずれかで、あるいは、核酸配列データを解析及び／又は分析するためのサービス専用の更なる遠隔サイトで実行されてもよい。このような場所としては、例えば、汎用サーバファームなどのクラスタ、異数性分析サービス事業の施設などが挙げられる。いくつかの実施形態では、分析を実行するために採用される計算装置は、リース又はレンタルされる。計算リソースは、通称クラウドとして知られる処理リソースなどの、インターネットアクセス可能なプロセッサの集合の一部であってもよい。場合によっては、計算は、互いに関連するか又は関連しないプロセッサの並列又は大並列群によって実行される。処理は、クラウドコンピューティング、グリッドコンピューティングなどの分散処理を使用して達成され得る。このような実施形態では、計算リソースのクラスタ又はグリッドは、本明細書に記載される分析及び／又は導出を実行するために一緒に動作する複数のプロセッサ又はコンピュータから構成される超仮想コンピュータを集合的に形成する。これらの技術並びにより伝統的なスーパーコンピュータを用いて、本明細書に記載されるような配列データを処理することができる。それぞれは、プロセッサ又はコンピュータ上に依存する並列計算の形態である。グリッドコンピューティングの場合、これらのプロセッサ（多くの場合、コンピュータ全体）は、イーサネット（登録商標）などの従来のネットワークプロトコルによって、ネットワーク（プライベート、パブリック、又はインターネット）を介して接続される。対照的に、スーパーコンピュータは、ローカル高速コンピュータバスによって接続された多くのプロセッサを有する。
特定の実施形態では、診断（例えば、胎児がダウン症候群を有するか、又は患者が特定の種類の癌を有する）は、分析動作と同じ場所で生成される。他の実施形態では、別々の場所で実行される。いくつかの例では、診断の報告は、サンプル採取場所で行われるが、そうである必要はない。診断の生成又は報告することができ、かつ／又は計画を開発する場所の例としては、医療施術者のオフィス、診療所、コンピュータによってアクセス可能なインターネットサイト、及びネットワークへの有線又は無線接続を有する携帯電話、タブレット、スマートフォンなどの携帯デバイスが挙げられる。カウンセリングが実行される場所の例としては、医療施術者のオフィス、診療所、コンピュータ、携帯デバイスによってアクセス可能なインターネットサイトが挙げられる。
いくつかの実施形態では、サンプル採取、サンプル処理、及びシーケンシング動作は、第１の場所で実行され、分析及び導出動作は、第２の場所で実行される。しかしながら、場合によっては、サンプル採取は１つの場所（例えば、医療施術者のオフィス又は診療所）で行われ、サンプル処理及びシーケンシングは、分析及び導出が行われる場所と任意選択的に同じ場所である異なる場所で実施される。
様々な実施形態では、上記の一連の動作は、サンプル採取、サンプル処理、及び／又はシーケンシングを開始するユーザ又はエンティティによって始動され得る。１つ以上のこれらの動作が実行を開始した後、自然に続いて他の動作が行われてもよい。例えば、シーケンシング動作により、リードを自動的に収集し、処理装置に送信することができ、その後、この処理装置は、多くの場合自動的に、おそらくは更なるユーザ介入なしに、配列分析及び異数性導出動作を実行する。いくつかの実施態様では、次いで、この処理動作の結果が、おそらく診断として再フォーマットされて、情報を処理し、医療専門家及び／又は患者に報告するシステム構成要素又はエンティティに自動的に送達される。上述するように、このような情報は、おそらくはカウンセリング情報と共に、治療、試験、及び／又はモニタリング計画を生成するように自動的に処理することもできる。したがって、早期に段階操作を開始することで、医療専門家、患者、又は他の関係者に対して、身体的状態に作用するのに有用な診断、計画、売り手、及び／又は他の情報を提供するエンドツーエンドシーケンスを開始することができる。これは、システム全体の一部が物理的に分離され、場合によっては、サンプル及び配列装置などの場所から遠隔に位置する場合であっても達成される。
一実施形態は、胎児及び母体の核酸を含む試験サンプル中の異数性の有無を判定する際に使用するためのシステムを提供し、このシステムは、核酸サンプルを受け取り、サンプルからの胎児及び母体の核酸配列情報を提供するシーケンサと、試験サンプルの胎児分画値を判定するように構成された１つ以上のプロセッサであって、（ａ）試験サンプル中の胎児由来セルフリー核酸断片の相対量を示す試験サンプルの胎児分画を判定し、（ｂ）コンピュータシステムによって、試験サンプル中のセルフリー核酸断片をシーケンシングすることによって得られる配列リードを受け取り、（ｃ）コンピュータシステムによって、セルフリー核酸断片の配列リードを、対象配列を含む参照ゲノムに位置合わせすることによって配列タグを提供し、（ｄ）コンピュータシステムによって、参照ゲノムの少なくとも一部に対する配列タグのカバレッジを判定し、（ｅ）（ｄ）で判定した配列タグ及び（ａ）で判定した胎児分画において判定した配列タグのカバレッジに基づいて、試験サンプルが除外領域内にあると判定し、除外領域が、少なくとも胎児分画検出限界（ＬＯＤ）曲線によって画定され、胎児分画ＬＯＤ曲線が、カバレッジ値と共に変動し、様々なカバレッジを与えて検出基準を達成するために必要とされる最小胎児分画値を示す、ように構成された１つ以上のプロセッサと、を含む。
本明細書で提供されるシステムのいずれかの、いくつかの実施形態では、シーケンサは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実行するように構成されている。いくつかの実施形態では、シーケンサは、可逆的染料ターミネータを伴う合成による配列を使用して、大規模な並列シーケンシングを実行するように構成されている。その他の実施形態では、シーケンサは、ライゲーションによるシーケンシングを実行するように構成されている。更にその他の実施形態では、シーケンサは、単一分子シーケンシングを実行するように構成されている。
本明細書で提供されるシステムのいずれかのいくつかの実施形態では、１つ以上のプロセッサが、上述の様々な方法を実行するようにプログラムされる。
本開示の別の態様は、プログラムコードを記憶する非一時的機械可読媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されるとき、コンピュータシステムに、（ａ）試験サンプルの胎児分画値を判定させ、試験サンプルの胎児分画が、試験サンプル中の胎児由来セルフリー核酸断片の相対量を示し、（ｂ）コンピュータシステムによって、試験サンプル中のセルフリー核酸断片をシーケンシングすることによって得られる配列リードを受け取り、（ｃ）コンピュータシステムによって、セルフリー核酸断片の配列リードを、対象配列を含む参照ゲノムに位置合わせすることによって配列タグを提供し、（ｄ）コンピュータシステムによって、参照ゲノムの少なくとも一部に対する配列タグのカバレッジを判定し、（ｅ）（ｄ）で判定した配列タグ及び（ａ）で判定した胎児分画において判定した配列タグのカバレッジに基づいて、試験サンプルが除外領域内にあると判定し、除外領域が、少なくとも胎児分画検出限界（ＬＯＤ）曲線によって画定され、胎児分画ＬＯＤ曲線が、カバレッジ値と共に変動し、様々なカバレッジを与えて検出基準を達成するために必要とされる最小胎児分画値を示すようにさせる、コンピュータプログラム製品に関する。
本明細書で提供されるシステムのいくつかの実施形態では、コンピュータプログラム製品は、上記の様々な方法を実行するために、１つ以上のプロセッサによって実行されるプログラムコードを記憶する非一時的機械可読媒体を含む。
コンピュータシステム
いくつかの実施形態では、システム及び方法は、特定の配列データ分析機能及び配列データストレージをクラウドコンピューティング環境又はクラウドベースのネットワークにシフト又は分配するためのアプローチを伴い得る。シーケンシングデータ、ゲノムデータ、又は他のタイプの生物学的データとのユーザ相互作用は、データとの様々な相互作用へのアクセスを記憶及び制御する中央ハブを介して媒介され得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境はまた、プロトコル、分析方法、ライブラリ、配列データ、並びにシーケンシング、分析、及び報告のための分散処理の共有を提供し得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境は、ユーザによる配列データの修正又は注釈を容易にする。いくつかの実施形態では、システム及び方法は、コンピュータブラウザ、オンデマンド、又はオンラインに実装され得る。
いくつかの実施形態では、システム及び方法は、特定の配列データ分析機能及び配列データストレージをクラウドコンピューティング環境又はクラウドベースのネットワークにシフト又は分配するためのアプローチを伴い得る。シーケンシングデータ、ゲノムデータ、又は他のタイプの生物学的データとのユーザ相互作用は、データとの様々な相互作用へのアクセスを記憶及び制御する中央ハブを介して媒介され得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境はまた、プロトコル、分析方法、ライブラリ、配列データ、並びにシーケンシング、分析、及び報告のための分散処理の共有を提供し得る。いくつかの実施形態では、クラウドコンピューティング環境は、ユーザによる配列データの修正又は注釈を容易にする。いくつかの実施形態では、システム及び方法は、コンピュータブラウザ、オンデマンド、又はオンラインに実装され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を実行するように書かれたソフトウェアは、メモリ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、メモリスティック、フラッシュドライブ、ハードドライブ、ＳＳＤハードドライブ、サーバ、メインフレームストレージシステムなどのいくつかの形態のコンピュータ可読媒体に記憶される。
いくつかの実施形態では、方法は、様々な好適なプログラミング言語、例えば、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、及びＪａｖａ（登録商標）などのコンパイルされた言語のいずれかで書かれ得る。他のプログラミング言語は、Ｐｅｒｌ、ＭａｔＬａｂ（登録商標）、ＳＡＳ、ＳＰＳＳ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｕｂｙ、Ｐａｓｃａｌ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｒ、及びＰＨＰなどのスクリプト言語であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｒ、Ｊａｖａ（登録商標）、又はＰｙｔｈｏｎで書かれている。いくつかの実施形態では、方法は、データ入力及びデータ表示モジュールを有する独立したアプリケーションであり得る。あるいは、方法は、コンピュータソフトウェア製品であり得、分散オブジェクトが、本明細書に記載の計算方法を含むアプリケーションを含むクラスを含み得る。更に、コンピュータソフトウェア製品は、コンポーネントソフトウェア製品の一部であってもよく、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．））、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｃｒａｃｋｅｒ Ｂｉｏ（Ｃｈｕｌｕｎｇ、Ｈｓｉｎｃｈｕ、Ｔａｉｗａｎ）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、ＧＥ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｉｓｋａｙｕｎａ、Ｎ．Ｙ．）、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏ－Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、ＮＡＢｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒ．Ｉ．）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）によって提供されるシーケンシングシステムと関連するコンピュータ実施ソフトウェア製品、及び核酸サンプルから配列を決定するための他のシーケンシングソフトウェア関連製品が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、方法は、シーケンシング機器に見られるような既存のデータ分析ソフトウェアに組み込まれ得る。そのようなソフトウェアの例は、ＣＡＳＡＶＡソフトウェアプログラム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、プログラム容量の例として、その全体が本明細書に組み込まれる、ＣＡＳＡＶＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅを参照されたい）である。本明細書に記載されるコンピュータ実施方法を含むソフトウェアは、コンピュータシステム上に直接導入されるか、又はコンピュータ可読媒体上に間接的に保持され、必要に応じてコンピュータシステム上にロードされる。更に、この方法は、サードパーティサービスプロバイダによって提供されるものなど、データが生成されている場所に対して別の場所に維持されているサーバなどで見出されるソフトウェアのような、データが生成されている場所に対してリモートであるコンピュータ上に配置され得る。
アッセイ器具、デスクトップコンピュータ、ノートＰＣ、又はサーバは、システム及び方法の実装のための命令を含む、アクセス可能なメモリと動作上の通信を行うプロセッサを含み得る。いくつかの実施形態では、デスクトップコンピュータ又はノートＰＣは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体又はデバイス及び／又は出力デバイスと動作上の通信を行う。アッセイ器具、デスクトップコンピュータ、及びノートＰＣは、Ａｐｐｌｅベースのコンピュータシステム又はＰＣベースのコンピュータシステムによって利用されるものなどの、多くの異なるコンピュータベースの動作言語の下で動作することができる。アッセイ器具、デスクトップ、及び／又はノートＰＣ及び／又はサーバシステムは、実験的定義及び／若しくは条件を作成又は修正し、データ結果を閲覧し、実験進捗を監視するためのコンピュータインターフェースを更に提供することができる。いくつかの実施形態では、出力デバイスは、コンピュータモニタ又はコンピュータ画面、プリンタ、携帯情報端末（すなわち、ＰＤＡ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標）、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標））などの携帯デバイス、タブレットコンピュータ（例えば、ｉＰＡＤ（登録商標））、ハードドライブ、サーバ、メモリスティック、フラッシュドライブなどのグラフィックユーザインターフェースであり得る。
コンピュータ可読記憶デバイス又は媒体は、サーバ、メインフレーム、スーパーコンピュータ、磁気テープシステムなどの任意のデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ器具に近接する場所にオンサイトで、例えば、アッセイ器具に隣接するか、又は極めて近接して設置され得る。例えば、記憶デバイスは、アッセイ器具に関連して同じ部屋、同じ建物、隣接する建物内、建物内の同じフロア上、建物内の異なるフロア上などに、設置され得る。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ器具に対してオフサイト又は遠位に設置され得る。例えば、記憶デバイスは、アッセイ器具と比較して、都市の異なる部分、異なる都市、異なる州、異なる国などに設置され得る。記憶デバイスがアッセイ器具の遠位に設置される実施形態では、アッセイ器具とデスクトップ、ノートＰＣ、又はサーバのうちの１つ以上との間の通信は、典型的には、アクセスポイントを介した無線又はネットワークケーブルのいずれかによるインターネット接続を介している。いくつかの実施形態では、記憶デバイスは、アッセイ器具と直接関連付けられた個人又はエンティティによって維持及び管理され得るが、他の実施形態では、記憶デバイスは、典型的には、アッセイ器具と関連付けられた個人又はエンティティに対して遠位の場所で、第三者によって維持及び管理され得る。本明細書に記載の実施形態では、出力デバイスは、データを視覚化するための任意のデバイスであり得る。
アッセイ器具、デスクトップ、ノートＰＣ、及び／又はサーバシステムは、本明細書に記載の計算方法を実行及び実装するためのコンピュータコードを組み込んだコンピュータ実装ソフトウェアプログラム、計算方法の実装で使用するためのデータなどを記憶しかつ／又は取り出すために使用され得る。アッセイ器具、デスクトップ、ノートＰＣ、及び／又はサーバのうちの１つ以上は、本明細書に記載の計算方法を実行及び実装するためのコンピュータコードを組み込んだソフトウェアプログラム、計算方法の実装で使用するためのデータなどを記憶しかつ／又は取り出すための１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体を含み得る。コンピュータ可読記憶媒体には、ハードドライブ、ＳＳＤハードドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ－ＲＯＭドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、フラッシュメモリスティック又はカードなどのうちの１つ以上が含まれ得るが、これらに限定されない。更に、インターネットを含むネットワークは、コンピュータ可読記憶媒体であり得る。いくつかの実施形態では、コンピュータ可読記憶媒体は、例えば、遠位の場所にあるローカルデスクトップ又はノートＰＣのコンピュータからアッセイ器具へというよりむしろ、インターネット又はサービスプロバイダによって提供される企業ネットワークを介したコンピュータネットワークによってアクセス可能な計算リソースストレージを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような計算方法を実行及び実装するためのコンピュータコードを組み込んだコンピュータ実装ソフトウェアプログラム、計算方法の実装に使用するためのデータなどを記憶及び／又は取り出すためのコンピュータ可読記憶媒体は、インターネット接続又はネットワーク接続を介してアッセイ器具、デスクトップ、ノートＰＣ、及び／又はサーバシステムと動作可能に通信するサービスプロバイダによって動作及び維持される。
いくつかの実施形態では、計算環境を提供するためのハードウェアプラットフォームは、プロセッサ時間及びランダムアクセスメモリ（すなわち、ＲＡＭ）などのメモリレイアウトがシステムの考慮事項であるプロセッサ（すなわち、ＣＰＵ）を含む。例えば、より小さいコンピュータシステムは、安価で、高速プロセッサ並びに大きなメモリ及び記憶機能を提供する。いくつかの実施形態では、グラフィックス処理ユニット（ｇｒａｐｈｉｃｓ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｕｎｉｔｓ、ＧＰＵ）を使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような計算方法を実行するためのハードウェアプラットフォームは、１つ以上のプロセッサを有する１つ以上のコンピュータシステムを含む。いくつかの実施形態では、より小さいコンピュータが一緒にクラスター化されて、スーパーコンピュータネットワークをもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような計算方法は、協調的に様々なオペレーティングシステムを実行することができる相互接続又は接続内コンピュータシステム（すなわち、グリッド技術）の集合体で実行される。例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能なＣＯＮＤＯＲフレームワーク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍａｄｉｓｏｎ）及びシステムは、多量のデータを扱う目的のための複数のスタンドアロンコンピュータシステムの協調の例示である。これらのシステムは、シリアル又は並列構成のクラスタ上で大きな配列分析ジョブをサブミット、監視、及び管理するためのＰｅｒｌインターフェースを提供することができる。
シーケンシング法
いくつかの実施形態では、調製されたサンプル（例えば、シーケンシングライブラリ）は、標的変異を特定するための手順の一部としてシーケンシングされる。多数のシーケンシング技術のうちのいずれかを利用することができる。
いくつかの実施形態では、調製されたサンプル（例えば、シーケンシングライブラリ）は、標的変異を特定するための手順の一部としてシーケンシングされる。多数のシーケンシング技術のうちのいずれかを利用することができる。
後述するように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）製のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、４５４Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）製の合成によるシーケンシングプラットフォーム、並びにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）製のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームなどのいくつかのシーケンシング技術が市販されている。Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を使用して実行される単一分子シーケンシングに加えて、その他の単一分子シーケンシング技術としては、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴ（商標）技術、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（商標）技術、及び、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたナノ細孔シーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
自動サンガー法は「第１世代」技術と見なされるが、自動サンガーシーケンシングを含むサンガーシーケンシングもまた、本明細書に記載された方法で採用することができる。更なる好適なシーケンシング法としては、核酸撮像技術、例えば、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）又は透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なシーケンシング技術を、以下にて更に詳細に記載する。
１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの合成によるシーケンシング及び可逆的ターミネータベースのシーケンシング化学作用（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ６：５３－５９［２００９］に記載）を用いて、試験サンプル中の核酸、例えば、母体サンプル中のｃｆＤＮＡ、癌に関してスクリーニングされる被験者中のｃｆＤＮＡ又は細胞ＤＮＡについての配列情報を取得することを含む。テンプレートＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、例えば、細胞ＤＮＡ又はｃｆＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、分離された細胞からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、数百個の塩基対の長さへと断片化する。その他の実施形態では、ｃｆＤＮＡはテンプレートとして使用されるが、断片化は、ｃｆＤＮＡが短い断片として存在するために必要ではない。例えば、胎児のｃｆＤＮＡは、長さにして約１７０個の塩基対（ｂｐ）の断片として血流中で循環し（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：１２７９－１２８６［２０１０］）、シーケンシング前にＤＮＡの断片化を必要としない。Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシング技術は、断片化されたゲノムＤＮＡの、オリゴヌクレオチドアンカーが結合される平面的な光学的に透明な表面への取り付けに依存する。テンプレートＤＮＡを末端修復して、５’リン酸化されたブラント末端を生成し、クレノウ断片のポリメラーゼ活性を使用して、単一のＡ塩基を、ブラントリン酸化ＤＮＡ断片の３’末端に加える。この添加は、ライゲーション効率を高めるために、それらの３’末端に単一のＴ塩基のオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドアダプタにライゲーションするためのＤＮＡ断片を調整する。アダプタオリゴヌクレオチドは、フローセルのアンカーオリゴと相補的である（リピート伸長の分析においてアンカーリード／アンカー型リードと混同されない）。制限希釈条件下で、アダプタ修飾一単鎖テンプレートＤＮＡがフローセルに添加されて、アンカーオリゴへのハイブリダイゼーションによって固定される。付着したＤＮＡ断片を伸長させ、ブリッジを増幅して、数億個のクラスタを有する超高密度シーケンシングフローセルを作製し、それぞれが同じテンプレートの約１，０００個のコピーを含有する。一実施形態では、ランダムに断片化されたゲノムＤＮＡは、クラスタ増幅を受ける前にＰＣＲを使用して増幅される。あるいは、増幅フリー（例えば、ＰＣＲフリー）ゲノムライブラリ調製が使用され、ランダムに断片化されたゲノムＤＮＡは、クラスタ増幅のみを用いて濃縮される（Ｋｏｚａｒｅｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：２９１－２９５［２００９］）。テンプレートは、除去可能な蛍光色素を有する可逆的ターミネータを用いる、合成技術による強い４色のＤＮＡシーケンシング技術（ｒｏｂｕｓｔ ｆｏｕｒ－ｃｏｌｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、シーケンシングする。高感度蛍光検出は、レーザ励起及び内部全反射光学素子を使用して達成される。約数十～数百個の塩基対の短い配列リードは、参照ゲノムに対して位置合わせされ、参照ゲノムに対する短い配列リードの固有のマッピングは、特別に開発されたデータ分析パイプラインソフトウエアを使用して特定される。第１のリードが完了した後、テンプレートをその場で再生して、断片の反対側末端から第２のリードを可能にすることができる。したがって、ＤＮＡ断片のシングルエンドシーケンシング又はペアエンドシーケンシングのいずれかを使用することができる。
本開示の様々な実施形態はペアエンドシーケンシングを可能にする合成によるシーケンシングを使用してもよい。いくつかの実施形態では、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる合成プラットフォームによるシーケンシングは、クラスタ化した断片を含む。クラスタ化は、各断片分子が等温増幅されるプロセスである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された例として、断片は、断片の２つの末端に取り付けられた２つの異なるアダプタを有し、アダプタは、断片がフローセルレーンの表面上の２つの異なるオリゴと混成することを可能にする。断片は、断片の２つの末端に２つのインデックス配列を更に含む、又はそれに接続されるが、このインデックス配列は、マルチプレックスシーケンシングにおいて異なるサンプルを特定するための標識を提供する。いくつかのシーケンシングプラットフォームでは、シーケンシングされる断片は、インサートとも呼ばれる。
いくつかの実施形態では、Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットフォーム内でクラスタ化するためのフローセルは、レーンを有するスライドガラスである。各レーンは、２種類のオリゴの菌叢でコーティングされたガラスチャネルである。ハイブリダイゼーションは、表面上の２種類のオリゴのうちの１つ目によって可能になる。このオリゴは、断片の一端にある第１のアダプタに対して相補的である。ポリメラーゼは、ハイブリダイズされた断片の相補鎖を形成する。二本鎖分子は変性し、元のテンプレート鎖を洗い流される。残りの鎖は、多くのその他の残りの鎖と並行して、ブリッジ適用によってクローン的に増幅される。
ブリッジ増幅では、鎖が上方に折り畳まれ、鎖の第２の端部上の第２のアダプタ領域は、フローセル表面上の第２の種類のオリゴとハイブリダイズする。ポリメラーゼは相補鎖を生成し、二本鎖架橋分子を形成する。この二本鎖分子は変性し、２つの異なるオリゴを介してフローセルにつながれた２つの一本鎖分子をもたらす。次に、本プロセスを、数百万個のクラスタにわたって繰り返し、それを同時に発生させ、全ての断片のクローン増幅をもたらす。ブリッジ増幅後、逆鎖が切断され、洗い流されて、前方鎖のみを残す。３’末端は、望ましくないプライミングを防止するためにブロックされる。
クラスタ化後、シーケンシングは、第１のシーケンシングプライマーを伸長して第１のリードを生成することによって開始する。各サイクルでは、蛍光標識されたヌクレオチドは、成長している鎖に添加するために競合する。テンプレートの配列に基づいて１つのみが組み込まれる。各ヌクレオチドの添加後、クラスタは光源によって励起され、特徴的な蛍光信号が放出される。サイクル数は、リードの長さを決定する。発光波長及び信号強度は、塩基コールを決定する。所与のクラスタについては、全ての同一の鎖が同時に読み取られる。数億個のクラスタを、大規模な並列様式で配列する。第１のリードの完了時に、読み取られた製品を洗い流す。
２つのインデックスプライマーを含むプロトコルの次の工程において、インデックス１プライマーを導入し、テンプレート上のインデックス１領域に混成する。インデックス領域は、マルチプレックスシーケンシングプロセスにおいて、サンプルを脱マルチプレックスするのに有用な断片の特定を提供する。インデックス１のリードは、第１のリードと同様に生成される。インデックス１のリードが完了した後、読み取られた製品を洗い流し、鎖の３’末端を脱保護する。次に、テンプレート鎖は、フローセル上の第２のオリゴの上に折り重なり、第２のオリゴに結合する。インデックス２の配列は、インデックス１と同じ方法で読み取られる。次に、工程の完了時にインデックス２のリード製品を洗い流す。
２つのインデックスを読み取ると、リード２はまず、ポリマーを使用して第２のフローセルオリゴを伸長させて、二本鎖ブリッジを形成する。この二本鎖ＤＮＡは変性し、３’末端が遮断される。元の順方向鎖を切断して洗い流し、逆鎖を残す。リード２は、リード２のシーケンシングプライマーの導入から始まる。リード１と同様に、所望の長さが達成されるまで、シーケンシング工程が繰り返される。リード２の製品を洗い流す。この全プロセスは、全ての断片を表す、数百万個のリードを生成する。プールサンプルライブラリからの配列は、サンプル調製中に導入された固有の指数に基づいて分離される。各サンプルについて、類似の伸長の塩基コールのリードが局所的にクラスタ化される。順方向及び逆方向のリードを対にして連続配列を作成する。これらの連続配列は、バリアント特定のために参照ゲノムに位置合わせされる。
上記の合成例によるシーケンシングは、開示された方法の多くの実施形態で使用される、ペアエンドリードを含む。対になった末端配列は、断片の２つの末端からの２つのリードを含む。一対のリードが参照配列にマッピングされると、２つのリード間の塩基対距離を判定することができ、次いで、その距離を使用して、リードを取得した断片の長を判定することができる。いくつかの例では、２つのビンをまたぐ断片では、ペアエンドリードの一方が１つのビンに位置合わせされ、他方が隣接するビンに位置合わせされる。ビンが長くなる、又はリードが短くなるほど、このことはより稀になる。様々な方法を使用して、これらの断片のビン－メンバシップを考慮することができる。例えば、それらは、ビンの断片サイズ頻度を判定する際に省略することができる、それらは、隣接するビンの両方についてカウントすることができる、それらは、２つのビンのうち、より多くの塩基対を包含するビンに割り当てることができる、又は、それらは、各ビン内の塩基対の部分に関連する重みを伴って両方のビンに割り当てることができる。
ペアエンドリードは、異なる長さのインサート（すなわち、シーケンシングされる異なる断片サイズ）を使用してもよい。本開示におけるデフォルトの意味として、ペアエンドリードは、種々のインサート長さから得られたリードを意味するために使用される。場合によっては、短インサートペアエンドリードと長インサートペアエンドリードからを区別するために、後者は嵌合ペアリードとも称される。メイトペアリードを含むいくつかの実施形態では、最初に２つのビオチン結合アダプタが、比較的長いインサート（例えば、いくつかのｋｂ）の２つの末端に取り付けられる。次に、ビオチン結合アダプタは、インサートの２つの末端をリンクして循環分子を形成する。次に、ビオチン結合アダプタを包含する細断片は、循環分子を更に断片化することによって得ることができる。次に、反対の順序で元の断片の２つの末端を含む細断片を、上記の短いインサートのペアエンドシーケンシングと同じ手順によってシーケンシングすることができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットフォームを用いたメイトペアシーケンシングの更なる詳細は、以下のＵＲＬでオンライン出版物に示されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅ＿ｎｅｘｔｅｒａ＿ｍａｔｅｐａｉｒ＿ｄａｔａ＿ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｐｄｆペアエンドシーケンシングに関する更なる情報は、ペアエンドシーケンシング方法及び装置上の材料について、米国特許第７６０１４９９号及び米国特許出願公開第２０１２／０，０５３，０６３号に見出すことができ、これらは参照により組み込まれる。
ＤＮＡ断片のシーケンシング後、所定の長さ（例えば、１００ｂｐ）の配列リードは、既知の参照ゲノムにマッピ又は配列される。位置づけられた又は位置合わせされたリード及び参照配列上のそれらの対応する位置は、タグとも呼ばれる。一実施形態では、参照ゲノム配列は、ワールドワイドウェブ上のｇｅｎｏｍｅ ｄｏｔ ｕｃｓｃ ｄｏｔ ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｏｒｇ＝Ｈｕｍａｎ＆ｄｂ＝ｈｇ１８＆ｈｇｓｉｄ＝１６６２６０１０５で利用可能なＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８配列である。あるいは、参照ゲノム配列は、ワールドワイドウェブ上のｇｅｎｏｍｅ ｄｏｔ ｕｃｓｃ ｄｏｔ ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙで利用可能なＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９である。公開配列情報のその他の供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ，ｄｂＥＳＴ，ｄｂＳＴＳ，ＥＭＢＬ（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、及びＤＤＢＪ（日本のＤＮＡデータベース）が挙げられる。配列を位置合わせするための多数のコンピュータアルゴリズムが利用可能であり、これには、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、Ｂｌｉｔｚ（ＭＰｓｒｃｈ）（Ｓｔｕｒｒｏｃｋ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９３）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）、ＢＯＷＴＩＥ（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：Ｒ２５．１～Ｒ２５．１０［２００９］）、又はＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）などを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、血漿ｃｆＤＮＡ分子のクローン拡張コピーの一端が、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（ＥＬＡＮＤ）ソフトウェアを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ用のバイオインフォマティクスアライメント分析によって、シーケンシングされ処理される。
配列リードを取得するために、他のシーケンシング方法及びシステムを使用してもよい。
シーケンサ
いくつかの実施形態では、シーケンサは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標），Ｉｎｃ．（ＮｏｖａＳｅｑ ６０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０、ＮｅｘｔＳｅｑ １０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００、ＨｉＳｅｑ １０００、ＨｉＳｅｑ ２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｃａｎ、ｉＳｃａｎ、ＢｅａｄＥｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＯＬＩＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＦＬＸ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）、又はＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）によって提供される。
いくつかの実施形態では、シーケンサは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標），Ｉｎｃ．（ＮｏｖａＳｅｑ ６０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０、ＮｅｘｔＳｅｑ １０００、ＮｅｘｔＳｅｑ ２０００、ＨｉＳｅｑ １０００、ＨｉＳｅｑ ２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｃａｎ、ｉＳｃａｎ、ＢｅａｄＥｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＯＬＩＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＦＬＸ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）、又はＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）によって提供される。
シーケンサは、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、同第２００６／０１８８９０１号、同第２００６／０２４０４３９号、同第２００６／０２８１１０９号、同第２００５／０１００９００号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第２００５／０６５８１４号、同第２００６／０６４１９９号、及び同第２００７／０１０２５１号に記載されているｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を組み込んだものなどの任意のシーケンシング技術に従って実装され得、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、ライゲーション技術によるシーケンシングは、米国特許第６，９６９，４８８号、同第６，１７２，２１８号、及び同第６，３０６，５９７号に記載されているようなシーケンサにおいて使用されてもよく、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ライゲーション技術によるシーケンシングは、ＤＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドを組み込み、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを識別する。いくつかの実施形態は、ナノ細孔シーケンシングを利用することができ、それによって、標的の核酸鎖又はヌクレオチドは、標的の核酸からエキソヌクレアーゼによって除去され、ナノ細孔を通過する。標的の核酸又はヌクレオチドがナノ細孔を通過するとき、それぞれの塩基種は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって特定され得る（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ＆ Ｍｅｌｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、及びＣｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）などに記載されている）。更なる他の実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、同第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、同第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、又は同第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載のシーケンシング方法及びシステムを使用することができ、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）の相互作用を介して、又はこれらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、及びＫｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載されているようなゼロモード導波路を用いて検出することができる。他の好適な代替手法としては、例えば、蛍光インサイチューシーケンシング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＦＩＳＳＥＱ）、及び超並列シグネチャシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＭＰＳＳ）が挙げられる。特定の実施形態では、シーケンサのうちの１つは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）からのＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、又はＨｉＳｃａｎＳＱであり得る。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、サンプルスライドとしてシーケンサにロードされ得、撮像されて配列データを生成し得る。例えば、生体サンプルと相互作用する試薬は、撮像モジュールによって生成された励起ビームに応答して特定の波長で蛍光発光し（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ）、それによって撮像のための放射線を戻す。例えば、蛍光成分は、成分の相補的分子にハイブリダイズするか、又はポリメラーゼを使用して生体サンプル中のオリゴヌクレオチドに組み込まれた蛍光タグ付きヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光タグ付き核酸によって生成され得る。サンプルの染料が励起される波長、及びそれらが蛍光を発する波長は、特定の色素の吸収及び発光スペクトルに依存し得る。そのような戻された放射線は、撮像モジュールの指向光学系を通って伝播し得る。撮像モジュール検出光学系は、任意の好適な技術に基づいてもよく、例えば、デバイス内の場所に影響を与える光子に基づいて画素化画像データを生成する荷電結合デバイス（ｃｈａｒｇｅｄ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ、ＣＣＤ）センサであってもよい。あるいは、撮像モジュール検出光学系は、時間遅延積分（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ、ＴＤＩ）動作のために構成された検出器アレイ、相補金属酸化物半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、ＣＭＯＳ）検出器、アバランシェフォトダイオード（ａｖａｌａｎｃｈｅ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ、ＡＰＤ）検出器、Ｇｅｉｇｅｒ－モード光子カウンタ、又は任意の他の適切な検出器に基づき得る。ＴＤＩモードの検出は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３２９，８６０号に記載されているように、ライン走査と連動することができる。
生体サンプル
ＣＮＶ、例えば、染色体異数体、部分的な異数体などのＣＮＶを判定するために使用されるサンプルは、１つ以上の対象配列のコピー数多型が判定される任意の細胞、組織、又は器官から採取されたサンプルを含むことができる。望ましくは、サンプルは、「セルフリー」（例えば、ｃｆＤＮＡ）である細胞及び／又は核酸中に存在する核酸を含有する。
ＣＮＶ、例えば、染色体異数体、部分的な異数体などのＣＮＶを判定するために使用されるサンプルは、１つ以上の対象配列のコピー数多型が判定される任意の細胞、組織、又は器官から採取されたサンプルを含むことができる。望ましくは、サンプルは、「セルフリー」（例えば、ｃｆＤＮＡ）である細胞及び／又は核酸中に存在する核酸を含有する。
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸、例えば、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を得ることが有利である。セルフリーＤＮＡを含むセルフリー核酸は、血漿、血清、及び尿を含むがそれらに限定されない生物学的サンプルから、技術分野において既知の様々な方法によって取得することができる（例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０５：１６２６６－１６２７１［２００８］；Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ２５：６０４－６０７［２００５］；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１０３３－１０３５［１９９６］；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５０：４８５－４８７［１９９７］；Ｂｏｔｅｚａｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４６：１０７８－１０８４、２０００；及びＳｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．６：１０１－１０７［２００４］を参照されたい）。サンプル中の細胞からセルフリーＤＮＡを分離するために、分画、遠心分離（例えば、密度勾配遠心分離）、ＤＮＡ特異的沈殿、又はハイスループット細胞選別及び／又は他の分離方法を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用することができる。ｃｆＤＮＡの手動分離及び自動分離のための市販のキットが入手可能である（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ，ＤＥｌ）。ｃｆＤＮＡを含む生物学的サンプルは、染色体異数体及び／又は様々な多型を検出することができるシーケンシングアッセイによって、トリソミー２１などの染色体異常の有無を判定するためにアッセイにおいて使用されてきた。
様々な実施形態では、サンプル中に存在するｃｆＤＮＡは、使用前に（例えば、シーケンシングライブラリの調製前に）特異的に又は非特異的に濃縮され得る。サンプルＤＮＡの非特異的濃縮とは、ｃｆＤＮＡシーケンシングライブラリを調製する前にサンプルＤＮＡのレベルを増加させるために使用することができる、サンプルのゲノムＤＮＡ断片のゲノム増幅全体を意味する。非特異的濃縮は、２つ以上のゲノムを含むサンプル中に存在する２つのゲノムのうちの１つの選択的濃縮であり得る。例えば、非特異的濃縮は、母体用サンプル中の胎児ゲノムを選択し、サンプル中の母体ＤＮＡに対する胎児の相対的割合を増加させる既知の方法によって得ることができる。あるいは、非特異的濃縮は、サンプル中に存在する両方のゲノムの非選択的増幅であり得る。例えば、非特異的増幅は、胎児及び母体ゲノム由来のＤＮＡの混合物を含むサンプル中の胎児及び母体ＤＮＡの増幅であり得る。全ゲノム増幅法は、当該技術分野において既知である。変性オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ法（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ（ＤＯＰ））、プライマー伸長ＰＣＲ技術（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＰＥＰ））、及び多置換増幅法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ））は、全ゲノム増幅法の例である。いくつかの実施形態では、様々なゲノムからのｃｆＤＮＡの混合物を含むサンプルは、混合物中に存在するゲノムのｃｆＤＮＡについて非濃縮である。他の実施形態では、様々なゲノムからのｃｆＤＮＡの混合物を含むサンプルは、サンプル中に存在するゲノムのいずれか１つについて非特異的に濃縮される。
本明細書に記載される方法が適用される核酸（複数可）を含むサンプルは、例えば、上述のように、生物学的サンプル（「試験サンプル」）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＮＶについてスクリーニングされる核酸が、数多くの周知の方法のいずれかによって精製又は単離される。
したがって、特定の実施形態では、サンプルは、精製又は単離されたポリヌクレオチドを含むか又はそれからなる、あるいは、サンプルは、組織サンプル、生物学的流体サンプル、細胞サンプルなどのサンプルを含むことができる。好適な生体液サンプルとしては、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、洗浄（ｌａｖａｇｅ）、骨髄懸濁液、膣流、子宮頸部液、大腿骨頚部液、脳液、腹水、乳、気道、腸道及び泌尿生殖器道の分泌物、羊水、乳、及び白血球瀉血サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳液、唾液、又は糞便などの、非侵襲的処置によって容易に得ることができるサンプルである。特定の実施形態では、サンプルは、末梢血サンプル、又は末梢血サンプルの血漿及び／若しくは漿液分画である。その他の実施形態では、生体サンプルは、スワブ若しくはスミア、生検標本、又は細胞培養物である。別の実施形態では、サンプルは、２つ以上の生物学的サンプルの混合物であり、例えば、生物学的サンプルは、生体流体サンプル、組織サンプル、及び細胞培養サンプルのうちの２つ以上を含むことができる。本発明で使用する場合、用語「血液」、「血漿」、及び「血清」は、その分画又はその処理された部分を明示的に包含する。同様に、サンプルが生検、綿棒、スミアなどから採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒、スミアなどから得られる処理された分画又は部分を明示的に包含する。
特定の実施形態では、サンプルは、異なる個体からのサンプル、同じ個体又は異なる個体の異なる発育段階からのサンプル、異なる疾患のある個体からのサンプル（例えば、癌を有する個体又は遺伝障害を有する疑いがある個体）、正常な個体、個体において異なる疾患ステージで取得されたサンプル、疾患に対して異なる治療を受けた個体から取得されたサンプル、異なる環境因子に供された個体からのサンプル、病状に素因を有する個体からのサンプル、感染症剤（例えば、ＨＩＶ）への曝露を有するサンプルなどを含むが、それらに限定されないソースから取得することができる。
１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、サンプルは、妊娠した女性、例えば、妊婦から得られる、母体サンプルである。この場合、胎児における潜在的な染色体異常の早期診断を提供するために、本明細書に記載された方法を使用して、サンプルを分析することができる。母体サンプルは、組織サンプル、生体液サンプル、又は細胞サンプルであり得る。生体液としては、非限定的な例として、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、痰、耳液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、洗浄（ｌａｖａｇｅ）、骨髄懸濁液、膣流、子宮頸部液、大腿骨頚部液、脳液、腹水、乳、気道、腸道及び泌尿生殖器道の分泌物、及び白血球瀉血サンプルが挙げられる。
別の例示的であるが非限定的な実施形態では、母体サンプルは、２つ以上の生物学的サンプルの混合物であり、例えば、生物学的サンプルは、生体流体サンプル、組織サンプル、及び細胞培養サンプルのうちの２つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、非侵襲的処置によって容易に得ることができるサンプル、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、喀痰、尿、乳、痰、耳流、唾液、又は糞便などである。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、末梢血サンプル、及び／又はその血漿及び血清分画である。他の実施形態では、生物学的サンプルは、スワブ又は塗抹標本、生検標本、又は細胞培養物のサンプルである。上述したように、用語「血液」、「血漿」、及び「血清」は、その分画又はその加工された部分を明示的に包含する。同様に、サンプルが生検、綿棒、スミアなどから採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒、スミアなどから得られる処理された分画又は部分を明示的に包含する。
特定の実施形態では、サンプルはまた、インビトロ培養された組織、細胞、又はその他のポリヌクレオチド含有供給源から得ることもできる。培養されたサンプルは、異なる培地及び条件（例えば、ｐＨ、圧力、又は温度）で維持した培養物（例えば、組織又は細胞）、異なる期間で維持した培養物（例えば、組織又は細胞）、異なる要素若しくは試薬（例えば、薬物候補、又は修飾物質）で処理した培養物（例えば、組織又は細胞）、又は異なる種類の組織及び／若しくは細胞の培養物を含むがこれらに限定されない供給源から、採取することができる。
シーケンシングのためのサンプル処理
生物学的供給源から核酸を分離する方法は、供給源の性質に応じて異なり得る。当業者であれば、本明細書に記載される方法に必要なソースから核酸を容易に単離することができる。場合によっては、核酸サンプル中の核酸分子を断片化することが有利であり得る。断片化はランダムであってもよい、又は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して達成されるように、特異的であり得る。ランダムな断片化のための方法は、例えば、限定されたＤＮＡｓｅ消化、アルカリ処理、及び物理的剪断が挙げられ得る。一実施形態では、サンプル核酸は、断片化されていないｃｆＤＮＡから取得される。
生物学的供給源から核酸を分離する方法は、供給源の性質に応じて異なり得る。当業者であれば、本明細書に記載される方法に必要なソースから核酸を容易に単離することができる。場合によっては、核酸サンプル中の核酸分子を断片化することが有利であり得る。断片化はランダムであってもよい、又は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して達成されるように、特異的であり得る。ランダムな断片化のための方法は、例えば、限定されたＤＮＡｓｅ消化、アルカリ処理、及び物理的剪断が挙げられ得る。一実施形態では、サンプル核酸は、断片化されていないｃｆＤＮＡから取得される。
一実施形態では、本明細書に記載された方法は、次世代シーケンシング技術（ＮＧＳ）を利用することができ、それにより、複数のサンプルをゲノム分子として個々にシーケンシングすること（すなわち、シングルプレックスシーケンシング）、又は、単一のシーケンシングランでインデックス化されたゲノム分子を含むプールサンプルとして個々にシーケンシングすること（例えば、マルチプレックスシーケンシング）を可能にする。これらの方法は、最大で数百万個のＤＮＡ配列のリードを生成することができる。様々な
実施形態では、ゲノム核酸配列、及び／又はインデックス化されたゲノム核酸の配列は、例えば、本明細書に記載された次世代シーケンシング技術（ＮＧＳ）を使用して決定することができる。様々な実施形態では、ＮＧＳを使用して取得された大量の配列データの分析は、本明細書に記載されるような１つ以上のプロセッサを使用して実行することができる。
実施形態では、ゲノム核酸配列、及び／又はインデックス化されたゲノム核酸の配列は、例えば、本明細書に記載された次世代シーケンシング技術（ＮＧＳ）を使用して決定することができる。様々な実施形態では、ＮＧＳを使用して取得された大量の配列データの分析は、本明細書に記載されるような１つ以上のプロセッサを使用して実行することができる。
様々な実施形態では、このようなシーケンシング技術の使用は、シーケンシングライブラリの調製を伴わない。
しかしながら、特定の実施形態では、本明細書で企図されるシーケンシング法は、シーケンシングライブラリの調製を含む。１つの例示的なアプローチでは、シーケンシングライブラリの調製は、シーケンシングされる準備が整ったアダプタ修飾ＤＮＡ断片（例えば、ポリヌクレオチド）のランダムな集合の生成を含む。ポリヌクレオチドのシーケンシングライブラリは、例えば、逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡテンプレートから生成された相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡであるＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの、ＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかの等価物、類似物を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡから調製することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅生成物などのｄｓＤＮＡなど）において発生し得る、又は特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖形態（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡなど）で発生し得て、ｄｓＤＮＡ形態に変換されている。例示として、特定の実施形態では、シーケンシングライブラリの調製に使用するのに好適な二本鎖ｃＤＮＡに、一本鎖ｍＲＮＡ分子をコピーすることができる。一次ポリヌクレオチド分子の正確な配列は、一般に、ライブラリ調製の方法に対して重要ではなく、既知であっても未知であってもよい。一実施形態では、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ分子である。より具体的には、特定の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、生物の遺伝子相補体全体又は実質的に生物の遺伝子相補体全体を表し、ゲノムＤＮＡ分子である（例えば、細胞ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）など）が、典型的にはイントロン配列及びエクソン配列（コード配列）、並びにプロモータ及びエンハンサ配列などの非コード調節配列を含む。特定の実施形態では、一次ポリヌクレオチド分子は、ヒトゲノムＤＮＡ分子、例えば、妊娠被験者の末梢血中に存在するｃｆＤＮＡ分子を含む。
いくつかのＮＧＳシーケンシングプラットフォームのシーケンシングライブラリの調製は、断片サイズの特定の範囲を含むポリヌクレオチドの使用によって促進される。このようなライブラリの調製は、典型的には、所望のサイズ範囲でポリヌクレオチドを得るための、大型のポリヌクレオチド（例えば、細胞ゲノムＤＮＡ）の断片化を伴う。
断片化は、当業者に既知の多数の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、断片化は、噴霧化、超音波処理、及びハイドロシェアを含むがこれらに限定されない機械的手段によって、達成することができる。しかしながら、機械的断片化は、典型的には、Ｃ－Ｏ、Ｐ－Ｏ、及びＣ－Ｃ結合でＤＮＡ骨格を切断し、破壊されたＣ－Ｏ、Ｐ－Ｏ、及び／Ｃ－Ｃ結合を有するブラント末端並びに３’－及び５’－オーバーハング末端の不均一な混合物をもたらす（例えば、Ａｌｎｅｍｒｉ ａｎｄ Ｌｉｗａｃｋ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６５：１７３２３－１７３３３［１９９０］、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｂｏｙｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１：３２７－２４０［１９６５］を参照）、以降の酵素反応、例えば、シーケンシングのためにＤＮＡを調製するのに必要とされるシーケンシングアダプタのライゲーションに必須の５’リン酸塩を欠くため、修復する必要があり得る。
対照的に、ｃｆＤＮＡは、典型的には、約３００個の塩基対未満の断片として存在し、その結果、断片化は、ｃｆＤＮＡサンプルを使用してシーケンシングライブラリを生成するために、典型的には必要ではない。
典型的には、ポリヌクレオチドが強制的に断片化される（例えば、インビトロで断片化される）か、又は自然に断片として存在するかどうかは、５’－リン酸及び３’－ヒドロキシルを有するブラント末端ＤＮＡに変換される。標準的なプロトコル、例えば、本明細書のその他の箇所に記載されているようなＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用してシーケンシングするためのプロトコルは、末端修復されたサンプルＤＮＡに対して、ｄＡ－テーリングの前に、末端修復された生成物を精製して、ライブラリ調製のアダプタ－ライゲーティング工程の前に、ｄＡ－テーリング生成物を精製するようにユーザに指示する。
本明細書に記載された配列ライブラリの調製方法の様々な実施形態は、ＮＧＳによりシーケンシングされ得る修飾ＤＮＡ生成物を得るために、標準的なプロトコルによって典型的に命じられている工程のうちの１つ以上を実行する必要性を排除する。略される方法（ＡＢＢ法）、１工程法、及び２工程法は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、特許出願第１３／５５５，０３７号（２０１２年７月２０日出願）に見出すことができるシーケンシングライブラリの調製方法の例である。
様々な実施形態では、サンプルの完全性の検証及びサンプル追跡は、サンプルゲノム核酸、例えば、ｃｆＤＮＡと、例えば処理前にサンプルに導入されている付随のマーカー核酸との混合物をシーケンシングすることによって達成することができる。
マーカー核酸は、試験サンプル（例えば、生物学的源サンプル）と組み合わされ、生物学的源サンプルを分画する工程、例えば、全血サンプルからほぼセルフリーの血漿分画を得る工程、分画された血漿など又は組織サンプルなどの未分画生物学的サンプルから核酸を生成する工程などのうちの１つ以上を含むプロセスに提供されてもよい。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、シーケンシングライブラリを調製することを含む。ソースサンプルと組み合わされたマーカー分子の配列の配列又は配列の組み合わせは、ソースサンプルに固有であるように選択される。いくつかの実施形態では、サンプル中の固有のマーカー分子は全て同じ配列を有する。他の実施形態では、サンプル中の特異なマーカー分子は、複数の配列、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又はそれ以上の異なる配列の組み合わせである。
一実施形態では、サンプルの完全性は、同一の配列を有する複数のマーカー核酸分子を使用して検証することができる。あるいは、サンプルの同一性は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、又はそれ以上の異なる配列を有する複数のマーカー核酸分子を用いて検証することができる。複数の生物学的サンプル、すなわち、２つ以上の生物学的サンプルの完全性の検証は、２つ以上のサンプルのそれぞれを、マークされている複数の試験サンプルのそれぞれに固有の配列を有するマーカー核酸で標識する必要がある。例えば、第１のサンプルは、配列Ａを有するマーカー核酸で標識することができ、第２のサンプルは、配列Ｂを有するマーカー核酸で標識することができる。あるいは、第１のサンプルは、全て配列Ａを有するマーカー核酸分子で標識することができ、第２のサンプルは、配列Ｂ及びＣの混合物で標識することができ、配列Ａ、Ｂ、及びＣは、異なる配列を有するマーカー分子である。
マーカー核酸（複数可）は、ライブラリ調製（ライブラリが調製される場合）及びシーケンシングの前の、サンプル調整の任意の段階で添加することができる。一実施形態では、マーカー分子は、未処理ソースサンプルと組み合わせることができる。例えば、マーカー核酸は、血液サンプルを採取するために使用される回収チューブ内に提供され得る。あるいは、マーカー核酸は、血液採取後に血液サンプルに添加され得る。一実施形態では、マーカー核酸は、生物学的流体サンプルを回収するために使用される容器に添加され、例えば、マーカー核酸は、血液サンプルを採取するために使用される血液採取チューブに添加される。別の実施形態では、マーカー核酸は、生物学的流体サンプルの分画に添加される。例えば、マーカー核酸は、血液サンプル、例えば、母体血漿サンプルの血漿及び／又は血清分画に添加される。更に別の実施形態では、マーカー分子は、精製サンプル、例えば、生物学的サンプルから精製された核酸のサンプルに添加される。例えば、マーカー核酸は、精製された母体及び胎児ｃｆＤＮＡのサンプルに添加される。同様に、マーカー核酸は、検体を処理する前に生検標本に添加することができる。いくつかの実施形態では、マーカー核酸は、マーカー分子を生物学的サンプルの細胞に送達するキャリアと組み合わせることができる。細胞送達キャリアとしては、ｐＨ感受性及びカチオン性リポソームが挙げられる。
様々な実施形態において、マーカー分子は、生物学的ソースサンプルのゲノムに存在しない配列である、抗ゲノム配列を有する。例示的な実施形態では、ヒト生物学的ソースサンプルの完全性を確認するために使用されるマーカー分子は、ヒトゲノムに存在しない配列を有する。別の実施形態では、マーカー分子は、ソースサンプル及び任意の１つ以上の他の既知のゲノムに存在しない配列を有する。例えば、ヒト生物学的源サンプルの完全性を確認するために使用されるマーカー分子は、ヒトゲノム及びマウスゲノムに存在しない配列を有する。この選択肢により、２つ以上のゲノムを含む試験サンプルの完全性を検証することができる。例えば、細菌などの病原体の影響を受けている被験者から得られたヒトセルフリーＤＮＡサンプルの完全性は、ヒトゲノム及び影響を及ぼす細菌のゲノムの両方に存在しない配列を有するマーカー分子を使用して検証することができる。例えば、細菌、ウイルス、酵母、真菌、原生動物などの多数の病原体のゲノム配列は、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓで公的に入手可能である。別の実施形態では、マーカー分子は、任意の既知のゲノムに存在しない配列を有する核酸である。マーカー分子の配列は、アルゴリズムによりランダムに生成され得る。
様々な実施形態において、マーカー分子は、天然に生じるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、ロック核酸、グリコール核酸、及びトレオース核酸などの人工核酸類似体（核酸模倣体）であり得、人工核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を有さない分子又はＤＮＡ模倣体の骨格への変化によって、天然に生じるＤＮＡ又はＲＮＡとは区別される。デオキシリボ核酸は、天然に生じるゲノム由来であってもよく、又は酵素の使用によって、若しくは固相化学合成によって実験室で生成することができる。化学的方法を使用して、天然には見出されないＤＮＡ模倣体を生成することもできる。ホスホジエステル結合が置換されているが、デオキシリボースが保持されているＤＮＡの誘導体は、チオホルムアセタール又はカルボキサミド結合により形成された骨格を有し、良好な構造ＤＮＡ模倣体であることが立証されているＤＮＡ模倣体を含むが、これらに限定されない。他のＤＮＡ模倣体としては、モルホリノ誘導体及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられ、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン系疑似ペプチド骨格を含む（Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２４：１６７－１８３［１９９５］）。ＰＮＡは、ＤＮＡ（又はリボ核酸［ＲＮＡ］）の非常に良好な構造模倣体であり、ＰＮＡオリゴマーは、ワトソンクリック相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ（又はＰＮＡ）オリゴマーを有する非常に安定的な二本鎖構造を形成することができ、また、ヘリックス侵入によって二本鎖ＤＮＡ中の標的に結合することもできる（Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６：２３３－２４８［２００４］）。マーカー分子として使用することができるＤＮＡ類似体の別の良好な構造模倣体／類似体は、非架橋オキシゲンのうちの１つが硫黄で置換されるホスホロチオエートＤＮＡである。この変更により、５’～３’及び３’～５’ＤＮＡ ＰＯＬ １エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１及びＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼ及びヘビ毒ホスホジエステラーゼなどのエンド及びエキソヌクレアーゼ２の作用が低減される。
マーカー分子の長は、同じ核酸の長と区別できても区別できなくてもよい、すなわち、マーカー分子の長は、サンプルゲノム分子の長と同様であってもよい、又はサンプルゲノム分子の長よりも大きくても小さくてもよい。マーカー分子の長は、マーカー分子を構成するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体塩基の数によって測定される。サンプルゲノム分子の長とは異なる長を有するマーカー分子は、技術分野において既知の分離法を使用して、ソース核酸と区別することができる。例えば、マーカー及びサンプル核酸分子の長の差は、電気泳動分離、例えば、キャピラリー電気泳動によって判定することができる。サイズの区別は、マーカー及びサンプル核酸の質を定量化及び評価するのに有利であり得る。好ましくは、マーカー核酸は、ゲノム核酸よりも短く、サンプルのゲノムにマッピングされるのを除外するのに十分な長さである。例えば、ヒトゲノムに一意にマッピングするには、３０塩基ヒト配列が必要とされる。したがって、特定の実施形態では、ヒトサンプルのシーケンシングに使用されるマーカー分子の長は、少なくとも３０ｂｐであるべきである。
マーカー分子の長の選択は、主に、ソースサンプルの完全性を検証するために使用されるシーケンシング技術によって判定される。シーケンシングされるサンプルゲノム核酸の長も考慮することができる。例えば、いくつかのシーケンシング技術は、ポリヌクレオチドのクローン増幅を用い、これは、クローン的に増幅されるゲノムポリヌクレオチドが最小の長さであることを必要とし得る。例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧＡＩＩ配列分析器を使用するシーケンシング法は、最小長１１０ｂｐを有するポリヌクレオチドの架橋ＰＣＲ（クラスタ増幅としても知られる）によるインビトロでのクローン増幅を含み、これにアダプタが結合されて、少なくとも２００ｂｐの核酸及び６００ｂｐ未満の核酸を提供することができる。いくつかの実施形態では、アダプタ結合マーカー分子の長は、約２００ｂｐ～約６００ｂｐ、約２５０ｂｐ～５５０ｂｐ、約３００ｂｐ～５００ｂｐ、又は約３５０～４５０である。他の実施形態では、アダプタ結合マーカー分子の長は、約２００ｂｐである。例えば、母体サンプル中に存在する胎児ｃｆＤＮＡをシーケンシングするとき、マーカー分子の長は、胎児ｃｆＤＮＡ分子の長と同様に選択することができる。したがって、一実施形態では、母体サンプル中のｃｆＤＮＡの超並列シーケンシングを含むアッセイにおいて使用されて、胎児染色体異数体の有無を判定するマーカー分子の長は、約１５０ｂｐ、約１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、約１８０ｂｐ、約１９０ｂｐ、又は約２００ｂｐであり得る。好ましくは、マーカー分子は、約１７０ｐｐである。例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシング法、ポロニ－シーケンシング、及び４５４シーケンシングなどの他のシーケンシングアプローチは、エマルジョンＰＣＲを使用してシーケンシングのためにＤＮＡ分子をクローナ増幅し、各技術は、増幅される分子の最小長及び最大長を指定する。クローン増幅核酸としてシーケンシングされるマーカー分子の長は、最大約６００ｂｐであり得る。いくつかの実施形態では、シーケンシングされるマーカー分子の長は、６００ｂｐ超であり得る。
分子のクローン増幅を採用しない単一分子シーケンシング技術は、非常に広い範囲のテンプレート長にわたって核酸をシーケンシングすることが可能であり、ほとんどの状況では、シーケンシングされる分子が任意の特定の長であることを必要としない。しかしながら、単位質量当たりの配列の収率は、３’末端ヒドロキシル基の数に依存するため、シーケンシングのための比較的短いテンプレートを有することは、長いテンプレートを有するよりも効率的である。１０００ｎｔより長い核酸から出発する場合、核酸を１００～２００ｎｔの平均長に剪断することで、より多くの配列情報を同じ質量の核酸から生成することができる。したがって、マーカー分子の長は、数十塩基～数千塩基の範囲であり得る。単一分子シーケンシングに使用されるマーカー分子の長は、最大約２５ｂｐ、最大約５０ｂｐ、最大約７５ｂｐ、最大約１００ｂｐ、最大約２００ｂｐ、最大約３００ｂｐ、最大約４００ｂｐ、最大約５００ｂｐ、最大約６００ｂｐ、最大約７００ｂｐ、最大約８００ｂｐ、最大約９００ｂｐ、最大約１０００ｂｐ、又はそれ以上であり得る。
マーカー分子のために選択される長はまた、シーケンシングされるゲノム核酸の長によって判定される。例えば、ｃｆＤＮＡは、細胞ゲノムＤＮＡのゲノム断片としてヒト血流中で循環する。妊婦の血漿中に見出される胎児ｃｆＤＮＡ分子は、一般的に母体ｃｆＤＮＡ分子よりも短い（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５０：８８９２［２００４］）。循環する胎児ＤＮＡのサイズ割合は、循環する胎児ＤＮＡ断片の平均長が３００ｂｐ未満であることが確認され、一方、母体ＤＮＡは、約０．５～１Ｋｂであると推定された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，５０：１００２－１０１１［２００４］）。これらの所見は、ＮＧＳを使用して、胎児ｃｆＤＮＡが滅多に３４０ｂｐを超えないと判定したＦａｎ ｅｔ ａｌ．の所見と一致する（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：１２７９－１２８６［２０１０］）。標準的なシリカベースの方法で尿から単離されたＤＮＡは、剥がれた細胞に由来する高分子量ＤＮＡと、腎臓通過性ＤＮＡ（Ｔｒ－ＤＮＡ）の低分子量（１５０～２５０塩基対）との２分画からなる（Ｂｏｔｅｚａｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４６：１０７８－１０８４、２０００；及びＳｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．６：１０１－１０７、２００４）。体液からセルフリー核酸と腎臓通過性核酸を単離するための新たに開発された技術の適用により、１５０塩基対よりもはるかに短いＤＮＡ及びＲＮＡ断片の尿中での存在が明らかになった（米国特許出願公開第２００８０１３９８０１号）。ｃｆＤＮＡがシーケンシングされるゲノム核酸である実施形態では、選択されるマーカー分子は、最大約ｃｆＤＮＡの長とすることができる。例えば、単一核酸分子又はクローン増幅核酸としてシーケンシングされる母体ｃｆＤＮＡサンプルで使用されるマーカー分子の長は、約１００ｂｐ～６００とすることができる。他の実施形態では、サンプルゲノム核酸は、より大きな分子の断片である。例えば、シーケンシングされるサンプルゲノム核酸は、断片化細胞ＤＮＡである。実施形態では、断片化細胞ＤＮＡがシーケンシングされると、マーカー分子の長は、最大でＤＮＡ断片の長とすることができる。いくつかの実施形態では、マーカー分子の長さは、少なくとも適切な参照ゲノムに一意的に読み取られる配列をマッピングするのに必要な最小の長さである。他の実施形態では、マーカー分子の長は、マーカー分子をサンプル参照ゲノムにマッピングすることを除外するのに必要な最小長である。
更に、マーカー分子を使用して、核酸シーケンシングによって分析されていないサンプルを検証することができ、シーケンシング以外のバイオ技術、例えばリアルタイムＰＣＲにより検証することができる。
様々な実施形態では、例えば、上述したように、サンプルに導入されるマーカー配列は、シーケンシング及びその後の処理及び分析の精度及び有効性を検証するための陽性対照として機能することができる。
したがって、サンプル中のＤＮＡをシーケンシングするためのプロセス内陽性対照（ＩＰＣ）を提供するための組成物及び方法が提供される。特定の実施形態では、ゲノムの混合物を含むサンプル中のｃｆＤＮＡをシーケンシングするための陽性対照が提供される。ＩＰＣは、異なるサンプルセット、例えば、異なるシーケンシングラン上の異なる時点でシーケンシングされるサンプルから得られた配列情報のベースラインシフトを関連付けるために使用することができる。したがって、例えば、ＩＰＣは、母体試験サンプルについて得られた配列情報を、異なる時点でシーケンシングされた適格サンプルのセットから得られた配列情報に関連付けることができる。
同様に、セグメント分析の場合、ＩＰＣは、特定のセグメント（複数可）についての被験者から得られた配列情報を、異なる時間にシーケンシングされた（類似配列の）適格サンプルのセットから得られた配列に関連付けることができる。特定の実施形態では、ＩＰＣは、特定の癌関連遺伝子座について被験者から得られた配列情報を、適格サンプルのセットから得られた配列情報（例えば、既知の増幅／欠失など）に関連付けることができる。
更に、ＩＰＣは、シーケンシングプロセスを通してサンプルを追跡するためのマーカーとして使用することができる。ＩＰＣはまた、適切な解釈を提供し、かつデータの信頼度及び正確性を確保するために、対象染色体の１つ以上の新しい染色体、例えば、トリソミー２１、トリソミー１３、トリソミー１８の定量的陽性配列量値、例えばＮＣＶを提供することができる。特定の実施形態では、ＩＰＣは、男性及び女性ゲノム由来の核酸を含むように作製されて、母体サンプル中のＸ及びＹ染色体の量を提供して、胎児が男性であるか否かを判定することができる。
プロセス内対照の種類及び数は、必要とされる試験の種類又は性質に依存する。例えば、ゲノムの混合物を含むサンプルからＤＮＡをシーケンシングすることを必要とする試験については、染色体異数体が存在するか否かを判定するために、プロセス内対照は、試験されているのと同じ染色体異数性を含むことが分かっているサンプルから得られるＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＰＣは、対象染色体の異数性を含むことが分かっているサンプルからのＤＮＡを含む。例えば、母体用のサンプル中の胎児トリソミー、例えば、トリソミー２１の有無を判定するための試験用ＩＰＣは、トリソミー２１を有する個体から得られたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩＰＣは、異なる異数性を有する２つ以上の個体から得られたＤＮＡの混合物を含む。例えば、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、及びモノソミーＸの有無を判定する試験のために、ＩＰＣは、試験されるトリソミーのうちの１つを有する胎児を各々身ごもっている妊婦から得られたＤＮＡサンプルの組み合わせを含む。完全染色体異数性に加えて、ＩＰＣは、部分的異数性の有無を判定する試験用の陽性対照を提供するように作成することができる。
単一の異数性を検出するための対照として機能するＩＰＣは、１人が異数体ゲノムの提供者である２人の被験者から得られた細胞ゲノムＤＮＡの混合物を使用して作成することができる。例えば、胎児トリソミー、例えば、トリソミー２１を判定する試験用対照として作成されるＩＰＣは、トリソーム染色体を有する男性又は女性被験者からのゲノムＤＮＡと、トリソーム染色体を有していないことが分かっている女性被験者のゲノムＤＮＡとを組み合わせることによって作成することができる。ゲノムＤＮＡは、両方の被験者の細胞から抽出され、剪断されて、約１００～４００ｂｐ、約１５０～３５０ｂｐ、又は約２００～３００ｂｐの断片を提供して、母体サンプル中の循環ｃｆＤＮＡ断片をシミュレートすることができる。異数性、例えば、トリソミー２１を有する被験者からの断片化ＤＮＡの割合を選択して、母体サンプルに見出される循環胎児ｃｆＤＮＡの割合をシミュレートし、異数性を有する被験者からのＤＮＡを約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％を含む断片化ＤＮＡの混合物を含有するＩＰＣを提供する。ＩＰＣは、それぞれが異なる異数性を有する様々な被験者からのＤＮＡを含むことができる。例えば、ＩＰＣは、影響なし女性ＤＮＡを約８０％含むことができ、残りの２０％は、トリソミー染色体２１、トリソミー染色体１３、及びトリソミー染色体１８をそれぞれ保有する３つの異なる被験者からのＤＮＡとすることができる。断片化ＤＮＡの混合物を、シーケンシング用に調製する。断片化ＤＮＡの混合物の処理は、シーケンシングライブラリの調製を含むことができ、任意の超並列方法をシングルプレックス又はマルチプレックス式に用いてシーケンシングすることができる。ゲノムＩＰＣのストック溶液は、複数の診断試験において保管及び使用することができる。
あるいは、ＩＰＣは、既知の染色体異数性を有する胎児を身ごもっていることが分かっている母親から得られたｃｆＤＮＡを使用して作成することができる。例えば、ｃｆＤＮＡは、トリソミー２１を有する胎児を身ごもっている妊婦から取得することができる。ｃｆＤＮＡが母体サンプルから抽出され、細菌ベクターにクローニングされ、細菌中で増殖されて、進行中のＩＰＣ源を提供する。ＤＮＡは、制限酵素を使用して細菌ベクターから抽出することができる。あるいは、クローン化ｃｆＤＮＡは、例えばＰＣＲによって増幅され得る。ＩＰＣＤＮＡは、染色体異数性の有無について分析される試験サンプルから、ｃｆＤＮＡと同じランでシーケンシングするために処理することができる。
ＩＰＣの作成は、トリソミンに関して上述されているが、ＩＰＣは、例えば、様々なセグメント増幅及び／又は欠失を含む他の部分的異数性を反映するように作成され得ることが理解されるであろう。したがって、例えば、様々な癌が特定の増幅に関連することが知られている場合（例えば、２０Ｑ１３に関連する乳癌）、これらの既知の増幅を組み込むことができるＩＰＣを作成することができる。
ゲスト核酸の存在量の決定
サンプル中の核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）を決定することができる。核酸中のゲスト核酸又は少数の核酸の存在量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）は、いくつかの実施形態において決定される。特定の実施形態では、サンプル中の少数の核酸種の量は、「少数種分画（ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「少数種分画」は、妊娠中の女性又は他の対象から得られたサンプル（例えば、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル）中の循環セルフリー核酸中の少数核酸種の分画を指す。
サンプル中の核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）を決定することができる。核酸中のゲスト核酸又は少数の核酸の存在量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）は、いくつかの実施形態において決定される。特定の実施形態では、サンプル中の少数の核酸種の量は、「少数種分画（ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「少数種分画」は、妊娠中の女性又は他の対象から得られたサンプル（例えば、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル）中の循環セルフリー核酸中の少数核酸種の分画を指す。
核酸中の癌細胞核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）は、いくつかの実施形態で決定される。特定の実施形態では、サンプル中の癌細胞核酸の量は、「癌細胞核酸の分画」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「癌細胞核酸の分画」は、対象から得られたサンプル（例えば、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル）中の循環セルフリー核酸中の癌細胞核酸の分画を指す。胎児分画を決定するための本明細書に記載されるか、又は当該技術分野で既知の特定の方法は、癌細胞核酸の分画及び／又は少数種分画を決定するために使用され得る。
核酸中の胎児核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）は、いくつかの実施形態で決定される。特定の実施形態では、サンプル中の胎児核酸の量は、「胎児分画」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、「胎児分画」は、妊娠中の女性から得られたサンプル（例えば、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル）中の循環セルフリー核酸中の胎児核酸の分画を指す。
特定の実施形態では、胎児核酸の量は、男児胎児に特異的なマーカー（例えば、Ｙ染色体ＳＴＲマーカー（例えば、ＤＹＳ １９、ＤＹＳ ３８５、ＤＹＳ ３９２マーカー）、ＲｈＤ陰性女性のＲｈＤマーカー）、多型配列の対立遺伝子比に従って、又は胎児核酸に特異的かつ母体核酸に特異的でない１つ以上のマーカー（例えば、母親と胎児との間の差動エピジェネティックバイオマーカー（例えば、メチル化；以下で更に詳細に説明する）、若しくは母体血漿中の胎児ＲＮＡマーカー（例えば、Ｌｏ，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３（３）：２９３－２９６を参照））に従って決定される。
胎児核酸含有量（例えば、胎児分画）の定量は、時として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載されているように、胎児定量化アッセイ（ｆｅｔａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ ａｓｓａｙ、ＦＱＡ）を使用して行われる。このタイプのアッセイは、サンプル中の核酸のメチル化状態に基づいて、母体サンプル中の胎児核酸の検出及び定量化を可能にする。特定の実施形態では、母体サンプルからの胎児核酸の量は、存在する核酸の総量に対して決定され得、それによってサンプル中の胎児核酸の割合を提供する。特定の実施形態では、胎児核酸のコピー数は、母体サンプル中で決定され得る。特定の実施形態では、胎児核酸の量は、配列特異的（又は部分特異的（ｐｏｒｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ））の様式で、時として、正確な染色体投与量分析を可能にするのに十分な感度で、決定され得る（例えば、胎児異数性、微小重複、又は微小欠失の有無を検出するため）。
胎児定量化アッセイ（ＦＱＡ）は、本明細書に記載の方法のいずれかと併せて実行することができる。そのようなアッセイは、当該技術分野で既知の任意の方法によって、かつ／又は米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載されているように、例えば、異なるメチル化状態に基づいて母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとを区別することができる方法、及び胎児ＤＮＡの定量化（すなわち、量を決定する）などによって行うことができる。メチル化状態に基づいて核酸を区別するための方法としては、メチル化感受性キャプチャ、例えば、ＭＢＤ２のメチル結合ドメインが抗体のＦｃ断片に融合されるＭＢＤ２－Ｆｃ断片（ＭＢＤ－ＦＣ）（Ｇｅｂｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（１２）：６１１８－２８）；メチル化特異的抗体；バイサルファイト変換法、例えば、ＭＳＰ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ、メチル化感受性ＰＣＲ）、ＣＯＢＲＡ、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）又はＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）技術、及びメチル化感受性制限酵素の使用（例えば、１つ以上のメチル化感受性制限酵素を使用した母体サンプル中の母体ＤＮＡの消化、それによって胎児ＤＮＡを濃縮する）が挙げられるがこれらに限定されない。メチル感受性酵素（Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ）はまた、メチル化状態に基づいて核酸を区別するために使用され得、これは、例えば、後者が非メチル化である場合、それらのＤＮＡ認識配列で優先的又は実質的に切断又は消化することができる。したがって、メチル化ＤＮＡサンプルよりも非メチル化ＤＮＡサンプルはより小さな断片に切断され、過剰メチル化ＤＮＡサンプルは切断されない。明示的に述べられている場合を除いて、メチル化状態に基づいて核酸を区別するための任意の方法を、本明細書の技術の組成物及び方法と共に使用することができる。胎児ＤＮＡの量は、例えば、増幅反応中に既知の濃度で１つ以上の競合物を導入することによって決定することができる。胎児ＤＮＡの量を決定することはまた、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、プライマー伸長、シーケンシング、及び／又はカウントすることによって行うことができる。特定の例では、核酸の量は、米国特許出願公開第２００７／００６５８２３号に記載されているように、ＢＥＡＭｉｎｇ技術を使用して決定することができる。特定の実施形態では、限定効率を決定することができ、効率レートを使用して、胎児ＤＮＡの量を更に決定する。
特定の実施形態では、胎児定量化アッセイ（ＦＱＡ）を使用して、母体サンプル中の胎児ＤＮＡの濃度を、例えば、以下の方法によって決定することができる：ａ）母体サンプル中に存在するＤＮＡの総量を決定する；ｂ）１つ以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体サンプル中の母体ＤＮＡを選択的に消化し、それによって胎児ＤＮＡを濃縮する；ｃ）ステップｂ）からの胎児ＤＮＡの量を決定する；ｄ）ステップｃ）からの胎児ＤＮＡの量をステップａ）からのＤＮＡの総量と比較し、それによって、母体サンプル中の胎児ＤＮＡの濃度を決定する。特定の実施形態では、母体サンプル中の胎児核酸の絶対コピー数は、例えば、質量分析及び／又は絶対コピー数測定のための競合ＰＣＲアプローチを使用するシステムを使用して決定され得る。例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：３０５９－３０６４、及び米国特許出願公開第２００４／００８１９９３号を参照されたい。
特定の実施形態では、胎児分画は、多型配列（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））の対立遺伝子比に基づいて、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０２２４０８７号に記載されている方法などを使用して、決定することができる。そのような方法では、ヌクレオチド配列リードは、母体サンプルについて得られ、胎児分画は、参照ゲノム中の有益な多型部位（例えば、ＳＮＰ）で第１の対立遺伝子にマッピングされるヌクレオチド配列リードの総数と、第２の対立遺伝子にマッピングされるヌクレオチド配列リードの総数とを比較することによって決定される。特定の実施形態では、胎児対立遺伝子は、例えば、サンプル中の胎児及び母体核酸の混合物に対する母体核酸による大きな寄与と比較した場合に、混合物に対する胎児対立遺伝子の相対的に小さな寄与によって特定される。したがって、母体サンプル中の胎児核酸の相対存在量は、多型部位の２つの対立遺伝子の各々について参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングされた固有の配列リードの総数のパラメータとして決定することができる。
胎児分画は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第２０１４／０５５７７４号に記載されているような母体染色体異常に由来する情報を組み込む方法を使用して決定することができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。胎児分画は、いくつかの実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２０１３－０２８８２４４号に記載されているような性染色体由来の情報を組み込む方法を使用して決定することができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
胎児分画は、いくつかの実施形態において、フラグメント長情報（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１７７０８６号に記載されているようなフラグメント長比（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｒａｔｉｏ、ＦＬＲ）分析、胎児比統計量（ｆｅｔａｌ ｒａｔｉｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ、ＦＲＳ）分析）を組み込む方法を使用して決定することができる。セルフリー胎児核酸断片は、一般に、母細胞由来の核酸断片よりも短い（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：８８－９２；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２：６１ｒａ９１を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、胎児分画は、特定の長さ閾値より下の断片をカウントし、そのカウントを、例えば、特定の長さ閾値を超える断片からのカウント、及び／又はサンプル中の総核酸量と比較することによって決定することができる。特定の長さの核酸断片をカウントするための方法は、国際公開第２０１３／１７７０８６号に更に詳細に記載されている。
胎児分画は、いくつかの実施形態では、（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／２０５４０１号に記載されているように）部分特異的胎児分画推定値に従って決定することができる。理論に制限されるものではないが、胎児ＣＣＦ断片（例えば、特定の長さの断片、又は長さの範囲）からのリードの量は、多くの場合、（例えば、同じサンプル内、例えば、同じシーケンシングラン内の）部分に対して変動する度数でマッピングされる。また、理論に制限されるものではないが、特定の部分は、複数のサンプル間で比較される場合、胎児ＣＣＦ断片（例えば、特定の長さの断片、又は長さの範囲）からのリードの同様の表現を有する傾向があり、表現は、部分特異的胎児分画（例えば、胎児に由来するＣＣＦ断片の相対量、百分率、又は比）と相関する。
いくつかの実施形態では、部分特異的胎児分画推定値は、部分特異的パラメータ及び胎児分画に対するそれらの関係式に部分的に基づいて決定される。部分特異的パラメータは、部分の特定のサイズ（例えば、サイズ範囲）のＣＣＦ断片長からのリードの量又は割合を反映する（例えば、相関する）任意の好適なパラメータであり得る。部分特異的パラメータは、複数のサンプルについて決定された部分特異的パラメータの平均（ａｖｅｒａｇｅ）、平均値（ｍｅａｎ）、又は中央値であり得る。任意の好適な部分特異的パラメータを使用することができる。部分特異的パラメータの非限定的な例としては、ＦＬＲ（例えば、ＦＲＳ）、選択された断片長未満の長さを有するリードの量、ゲノム被覆率（すなわち、被覆率）、マッピング性、カウント（例えば、部分にマッピングされた配列リードのカウント、例えば、正規化カウント、ＰＥＲＵＮ正規化カウント、ＣｈＡＩ正規化カウント）、ＤＮａｓｅＩ感受性、メチル化状態、アセチル化、ヒストン分布、グアニン－シトシン（ＧＣ）含有量、クロマチン構造など、又はそれらの組み合わせが挙げられる。部分特異的パラメータは、部分特異的な方法でＦＬＲ及び／又はＦＲＳと相関する任意の好適なパラメータであり得る。いくつかの実施形態では、いくつか又は全ての部分特異的パラメータは、部分に関するＦＬＲの直接的又は間接的な表現である。いくつかの実施形態では、部分特異的パラメータは、グアニン－シトシン（ＧＣ）含有量ではない。
いくつかの実施形態では、部分特異的パラメータは、部分にマッピングされたリードが選択された断片長未満の長さを有するＣＣＦ断片からのリードの量を表すか、そのリードの量に関連するか、又はそのリードの量に比例する任意の好適な値である。特定の実施形態では、部分特異的パラメータは、部分にマッピングする比較的短いＣＣＦ断片（例えば、約２００塩基対以下）にから得られるリードの量の表現である。選択された断片長未満の長さを有するＣＣＦ断片は、多くの場合、比較的短いＣＣＦ断片であり、時として、選択された断片長は、約２００塩基対以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、又は５０塩基長であるＣＣＦ断片）である。ＣＣＦ断片又はＣＣＦ断片に由来するリードの長さは、任意の好適な方法（例えば、シーケンシング法、ハイブリダイゼーションアプローチ）によって決定され得る（例えば、推定又は推測され得る）。いくつかの実施形態では、ＣＣＦ断片の長さは、ペアエンドシーケンシング法から得られたリードによって決定される（例えば、推定又は推測される）。特定の実施形態では、ＣＣＦ断片テンプレートの長さは、ＣＣＦ断片（例えば、シングルエンドリード）に由来するリードの長さから直接決定される。
部分特異的パラメータは、１つ以上の重み付け係数によって重み付け又は調整され得る。いくつかの実施形態では、重み付け又は調整された部分特異的パラメータは、サンプル（例えば、試験サンプル）についての部分特異的胎児分画推定値を提供することができる。いくつかの実施形態では、重み付け又は調整は一般に、部分のカウント（例えば、部分にマッピングされたリード）又は別の部分特異的パラメータを部分特異的胎児分画推定値に変換し、そのような変換は、時として、転換と見なされる。
いくつかの実施形態では、重み付け係数は、胎児分画（例えば、複数のサンプルから決定された胎児分画）と複数のサンプル（例えば、トレーニングセット）の部分特異的パラメータとの間の関係式を部分的に説明及び／又は定義する係数又は定数である。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、複数の胎児分画の定量及び複数の部分特異的パラメータについての関係式に従って決定される。関係式は、１つ以上の重み付け係数によって定義され得、１つ以上の重み付け係数は、関係式から決定され得る。いくつかの実施形態では、重み付け係数（例えば、１つ以上の重み付け係数）は、（ｉ）複数のサンプルの各々について決定された胎児核酸の分画、及び（ｉｉ）複数のサンプルの部分特異的パラメータに従って、部分に適合させた関係式から決定される。
重み付け係数は、好適な関係式（例えば、好適な数学関係式、代数関係式、適合させた関係式、回帰、回帰分析、回帰モデル）から導出される任意の好適な係数、推定係数又は定数であり得る。重み付け係数は、好適な関係式に従って決定することができるか、好適な関係式から導出することができるか、又は好適な関係式から推定することができる。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、適合させた関係式から推定された係数である。複数のサンプルについて関係式を適合させることは、時として、モデルをトレーニングすると呼ばれる。関係を適合させる任意の好適なモデル及び／又は方法（例えば、トレーニングセットを目的としてモデルをトレーニングする）を使用することができる。使用することができる好適なモデルの非限定的な例としては、回帰モデル、線形回帰モデル、単純回帰モデル、通常の最小二乗回帰モデル、多重回帰モデル、一般の多重回帰モデル、多項式回帰モデル、一般的な線形モデル、一般化した線形モデル、不連続選択回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、多項ロジットモデル、混合ロジットモデル、プロビットモデル、多項プロビットモデル、順序ロジットモデル、順序プロビットモデル、ポアソンモデル、多変量応答回帰モデル、多層モデル、固定効果モデル、変量効果モデル、混合モデル、非線形回帰モデル、ノンパラメトリックモデル、セミパラメトリックモデル、ロバストモデル、クォンタイルモデル、アイソトニックモデル、主成分モデル、最小角度モデル、局所モデル、セグメント化モデル、及び変数誤差モデルが挙げられる。いくつかの実施形態では、適合させた関係式は、回帰モデルではない。いくつかの実施形態では、適合させた関係式は、決定木モデル、サポートベクターマシンモデル、及びニューラルネットワークモデルから選択される。モデルのトレーニング結果（例えば、回帰モデル、関係式）は、多くの場合、数学的に説明され得る関係式であり、関係式は１つ以上の係数（例えば、重み付け係数）を含む。より複雑な多変量モデルは、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の重み付け係数を決定することができる。いくつかの実施形態では、モデルは、複数のサンプルから得られた胎児分画及び２つ以上の部分特異的パラメータ（例えば、係数）に従ってトレーニングされる（例えば、マトリックスによって、例えば、複数のサンプルに適合された適合させた関係）。
［０１４２］
重み付け係数は、好適な方法によって好適な関係式（例えば、好適な数学関係式、代数関係式、適合させた関係式、回帰、回帰分析、回帰モデル）から導出することができる。いくつかの実施形態では、適合させた関係式は推定によって適合され、この推定の非限定的な例としては、最小二乗、通常の最小二乗、線形、部分、トータル、一般化、加重、非線形、反復再加重、リッジ回帰、最小絶対偏差、ベイジアン、ベイジアン多変量、縮小ランク、ＬＡＳＳＯ、加重ランク選択基準（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｒａｎｋ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ、ＷＲＳＣ）、ランク選択基準（Ｒａｎｋ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ、ＲＳＣ）、エラスティックネット推定量（例えば、エラスティックネット回帰）及びこれらの組み合わせが挙げられる。
重み付け係数は、ゲノムの任意の好適な部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。重み付け係数は、任意の好適な染色体の任意の好適な部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、ゲノム中のいくつか又は全ての部分に対して決定されるか、又は関連付けられる。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、ゲノム中のいくつか又は全ての染色体の部分に対して決定されるか、又は関連付けられる。重み付け係数は、時として、選択された染色体の部分に対して決定されるか、又は関連付けられる。重み付け係数は、１つ以上の常染色体の部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。重み付け係数は、常染色体又はそのサブセット中の部分を含む複数の部分中の部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、性染色体（例えば、ＣｈｒＸ及び／又はＣｈｒＹ）の部分に対して決定されるか、又は関連付けられる。重み付け係数は、１つ以上の常染色体及び１つ以上の性染色体の部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。特定の実施形態では、重み付け係数は、全ての常染色体並びに染色体Ｘ及びＹ中の複数の部分中の部分に対して決定されるか、又は関連付けられる。重み付け係数は、Ｘ及び／又はＹ染色体中の部分を含まない複数の部分中の部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。特定の実施形態では、重み付け係数は、染色体の部分に対して決定されるか、又は関連付けられ、その染色体は異数性（例えば、全染色体異数性）を含む。特定の実施形態では、重み付け係数は、染色体の部分に対して決定されるか、又はその部分に対してのみ関連付けられ、その染色体は異数性（例えば、正倍数体染色体）ではない。重み付け係数は、染色体１３、１８、及び／又は２１中の部分を含まない複数の部分中の部分に対して決定され得るか、又は関連付けられ得る。
いくつかの実施形態では、重み付け係数は、１つ以上のサンプル（例えば、サンプルのトレーニングセット）に従って部分に対して決定される。重み付け係数は、多くの場合、部分に特異的である。いくつかの実施形態では、１つ以上の重み付け係数は、独立して部分に割り当てられる。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、複数のサンプルについての胎児分画の定量（例えば、サンプル特異的胎児分画の定量）のための関係式及び複数のサンプルに従って決定された部分特異的パラメータに従って決定される。重み付け係数は、多くの場合、複数のサンプル、例えば、約２０～約１００，０００以上、約１００～約１００，０００以上、約５００～約１００，０００以上、約１０００～約１００，０００以上、又は約１０，０００～約１００，０００以上のサンプルから決定される。重み付け係数は、正倍数体（例えば、正倍数体胎児を含む対象からのサンプル、例えば、異数性染色体が存在しないサンプル）であるサンプルから決定することができる。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、異数性染色体（例えば、正倍数体胎児を含む対象からのサンプル）を含むサンプルから得られる。いくつかの実施形態では、重み付け係数は、正倍数体胎児を有する対象から、及びトリソミー胎児を有する対象からの複数のサンプルから決定される。重み付け係数は、サンプルが男児胎児及び／又は女児胎児を有する対象に由来する複数のサンプルに由来し得る。
胎児分画は、多くの場合、重み付け係数が導出されるトレーニングセットの１つ以上のサンプルについて決定される。重み付け係数が決定される胎児分画は、時として、サンプル特異的胎児分画の定量である。重み付け係数が決定される胎児分画は、本明細書に記載の任意の好適な方法、又は当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、胎児核酸含有量（例えば、胎児分画）の決定は、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において既知の好適な胎児定量化アッセイ（ＦＱＡ）を使用して実行され、その非限定的な例としては、胎児分画の、男児胎児に特異的なマーカーによる定量、多型配列の対立遺伝子比に基づく定量、胎児核酸に特異的かつ母体核酸に特異的でない１つ以上のマーカーに従う定量、メチル化ベースのＤＮＡ識別（例えば、Ａ．Ｎｙｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６（１０）：１６２７－１６３５）の使用による定量、質量分析方法及び／又は競合ＰＣＲアプローチを使用するシステムによる定量、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載の方法による定量など、又はそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、胎児分画は、Ｙ染色体のレベル（例えば、１つ以上のゲノムセクションレベル、プロファイルのレベル）に従って決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、Ｙ染色体の好適なアッセイに従って（例えば、胎児特異的遺伝子座（例えば、男性の妊娠の染色体Ｙ上のＳＲＹ遺伝子座など）の量を母親及び胎児の両方に共通する任意の常染色体上の遺伝子座の量と定量リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｌｏ Ｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６２：７６８－７７５）を使用して比較することによって）決定される。
（例えば、試験サンプルの）部分特異的パラメータは、１つ以上の重み付け係数（例えば、トレーニングセットから導出された重み付け係数）によって重み付け又は調整することができる。例えば、重み付け係数は、複数サンプルのトレーニングセットについての部分特異的パラメータと胎児分画の定量との関係式に従って、部分に対して導出することができる。次いで、試験サンプルの部分特異的パラメータを、トレーニングセットから導出された重み付け係数に従って調整及び／又は重み付けすることができる。いくつかの実施形態では、重み付け係数が導出される部分特異的パラメータは、調整又は重み付けされる（試験サンプルの）部分特異的パラメータと同じである（例えば、両方のパラメータがＦＬＲである）。特定の実施形態では、重み付け係数が導出される部分特異的パラメータは、調整又は重み付けされる（例えば、試験サンプルの）部分特異的パラメータとは異なる。例えば、重み付け係数は、サンプルのトレーニングセットについてのカバレッジ（すなわち、部分特異的パラメータ）と胎児分画との関係式から決定され得、試験サンプルの一部分のＦＬＲ（すなわち、別の部分特異的パラメータ）は、カバレッジから導出された重み付け係数に従って調整され得る。理論によって限定されるものではないが、（例えば、試験サンプルについての）部分特異的パラメータは時として、各部分特異的パラメータと共通の部分特異的ＦＬＲとの間の関係及び／又は相関に起因して、（例えば、トレーニングセットの）異なる部分特異的パラメータから導出された重み付け係数によって、調整及び／又は重み付けされ得る。
部分特異的胎児分画推定値は、その部分について決定された重み付け係数によって部分特異的パラメータを重み付けすることによって、サンプル（例えば、試験サンプル）について決定することができる。重み付けは、任意の好適な数学的操作を適用することによって、重み付け係数に従って部分特異的パラメータを調整、変換、及び／又は転換することを含むことができ、その非限定的な例としては、乗算、除算、加算、減算、積分、記号計算、代数的計算、アルゴリズム、三角関数若しくは幾何学関数、転換（例えば、フーリエ変換）など、又はそれらの組み合わせが挙げられる。重み付けは、重み付け係数、好適な数学的モデルに従って部分特異的パラメータを調整、変換、及び／又は転換することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、胎児分画は、１つ以上の部分特異的胎児分画推定値に従ってサンプルについて決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、１つ以上の部分についての部分特異的パラメータを重み付け又は調整することによって、サンプル（例えば、試験サンプル）について決定される（例えば、推定される）。特定の実施形態では、試験サンプルの胎児核酸の分画は、調整されたカウント又はカウントの調整されたサブセットに基づいて推定される。特定の実施形態では、試験サンプルの胎児核酸の分画は、調整されたＦＬＲ、調整されたＦＲＳ、調整されたカバレッジ、及び／又は部分についての調整されたマッピング性に基づいて推定される。いくつかの実施形態では、約１～約５００，０００、約１００～約３００，０００、約５００～約２００，０００、約１０００～約２００，０００、約１５００～約２００，０００、又は約１５００～約５０，０００の部分特異的パラメータが重み付け又は調整される。
（例えば、試験サンプルについての）胎児分画は、任意の好適な方法によって（例えば、同じ試験サンプルについて）複数の部分特異的胎児分画推定値に従って決定することができる。いくつかの実施形態では、妊娠中の女性からの試験サンプル中の胎児核酸の分画の推定の精度を向上させるための方法は、１つ以上の部分特異的胎児分画推定値を決定することを含み、サンプルの胎児分画の推定値は、その１つ以上の部分特異的胎児分画推定値に従って決定される。いくつかの実施形態では、サンプル（例えば、試験サンプル）の胎児核酸の分画を推定又は決定することは、１つ以上の部分特異的胎児分画推定値を合計することを含む。合計することは、複数の部分特異的胎児分画推定値に従って平均、平均値、中央値、ＡＵＣ、又は積分値を決定することを含み得る。
いくつかの実施形態では、妊娠中の女性からの試験サンプル中の胎児核酸の分画の推定の精度を向上させるための方法は、参照ゲノムの部分にマッピングされた配列リードのカウントを取得することを含み、この配列リードは、妊娠中の女性からの試験サンプルからの循環セルフリー核酸のリードであり、得られたカウントの少なくとも１つのサブセットは、ゲノムのある領域から得られ、その領域は、その領域からの総カウントと比較した胎児核酸から得られたカウントが、ゲノムの別の領域の総カウントと比較した胎児核酸のカウントよりも大きいことに寄与する。いくつかの実施形態では、胎児核酸の分画の推定値は、部分のサブセットに従って決定され、部分のサブセットは、別の部分の胎児核酸のカウントよりも大きな数の胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って選択される。いくつかの実施形態では、部分のサブセットは、別の部分の、非胎児核酸と比較して、胎児核酸のカウントよりも、非胎児核酸と比較して、より大きな数の胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って選択される。部分の全て又はサブセットにマッピングされたカウントは、重み付けされ得、それによって重み付けされたカウントを提供する。重み付けされたカウントは、胎児核酸の分画を推定するために利用することができ、カウントは、別の部分の胎児核酸のカウントよりも大きな数の胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って重み付けすることができる。いくつかの実施形態では、カウントは、別の部分の、非胎児核酸と比較して、胎児核酸のカウントよりも、非胎児核酸と比較して、より大きな数の胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って重み付けされる。
胎児分画は、サンプル（例えば、試験サンプル）について、そのサンプルの複数の部分特異的胎児分画推定値に従って決定することができ、部分特異的推定値は、ゲノムの任意の好適な領域又はセグメントの部分から得られる。部分特異的胎児分画推定値は、好適な染色体（例えば、１つ以上の選択された染色体、１つ以上の常染色体、性別染色体（例えば、ＣｈｒＸ及び／又はＣｈｒＹ）、異数性染色体、正倍数体染色体など、又はそれらの組み合わせ）の１つ以上の部分について決定することができる。
いくつかの実施形態では、胎児分画を決定することは、（ａ）参照ゲノムの部分にマッピングされた配列リードのカウントを得ることであって、この配列リードは、妊娠中の女性からの試験サンプルからの循環セルフリー核酸のリードである、ことと、（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分にマッピングされた配列リードのカウント、又は（ｉｉ）各部分と独立して関連付けられた重み付け係数に従って、胎児核酸の部分特異的な分画に対する、他の部分特異的パラメータを重み付けし、それによって、重み付け係数に従って部分特異的胎児分画推定値を提供することであって、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数のサンプルの各々についての胎児核酸の分画と、（ｉｉ）複数のサンプルについての、各部分にマッピングされた配列リードのカウント又は他の部分特異的パラメータとの間の各部分について適合させた関係式から決定されている、ことと、（ｃ）部分特異的胎児分画推定値に基づいて試験サンプルの胎児核酸の分画を推定することと、を含む。
細胞外核酸中の胎児核酸の量は、本明細書で提供される方法と併せて定量化及び使用され得る。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の技術の方法は、胎児核酸の量を決定する追加のステップを含む。胎児核酸の量は、サンプル核酸を調製するための処理の前又は後に、対象からの核酸サンプル中で決定することができる。特定の実施形態では、胎児核酸の量は、サンプル核酸が処理され、調製された後にサンプル中で決定され、その量は更なる評価に利用される。いくつかの実施形態では、結果は、サンプル核酸中の胎児核酸の分画をファクタリングすることを含む（例えば、カウントを調整し、サンプルを除去し、コールを行う又はコールを行わない）。
決定ステップは、本明細書に記載の方法における任意のあるときより前、最中、そのときに、又は本明細書に記載の特定の（例えば、異数性検出、微小重複若しくは微小欠失検出、胎児性別判定）方法の後に実行することができる。例えば、所与の感度又は特異性で胎児の性別又は異数性、微小重複又は微小欠失判定方法を得るために、胎児核酸定量化法を、胎児の性別又は異数性、微小重複又は微小欠失判定の前、最中又は後に実施して、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％又はそれ以上の胎児核酸を有するサンプルを特定することができる。いくつかの実施形態では、特定の閾値量の胎児核酸（例えば、約１５％以上の胎児核酸、約４％以上の胎児核酸）を有すると決定されたサンプルは、例えば、胎児の性別若しくは異数性、微小重複若しくは微小欠失判定、又は異数性若しくは遺伝的変異の有無について更に分析される。特定の実施形態では、例えば、胎児性別、又は異数性、微小重複若しくは微小欠失の有無の判定は、特定の閾値量の胎児核酸（例えば、約１５％以上の胎児核酸、約４％以上の胎児核酸）を有するサンプルについてのみ選択される（例えば、選択され、患者に連絡される）。
いくつかの実施形態では、胎児分画の決定又は胎児核酸の量を決定することは、染色体の異数性、微小重複、又は微小欠失の有無を特定するために必要とされない又は必須ではない。いくつかの実施形態では、染色体異数性、微小重複、又は微小欠失の有無を特定することは、胎児対母体ＤＮＡの配列識別（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を必要としない。特定の実施形態では、これは、特定の染色体における母体配列及び胎児配列の両方の合計寄与が、その染色体部分又はそのセグメントを分析するためである。いくつかの実施形態では、染色体異数性、微小重複、又は微小欠失の有無を特定することは、胎児ＤＮＡを母体ＤＮＡから区別する事前の配列情報に依存しない。
いくつかの実施形態では、癌細胞核酸の分画は、癌細胞及び／又は非癌細胞のコピー数多型（例えば、異数性、微小重複、微小欠失）を表すものとして分類されるレベルに従って決定される。例えば、癌細胞核酸の分画を決定することは、癌細胞核酸の分画の決定に利用される癌細胞及び／又は非癌細胞のコピー数多型の予想レベルを評価することを含み得る。いくつかの実施形態では、癌細胞核酸の分画は、同じタイプのコピー数多型について決定された予想レベル範囲に従って、コピー数多型を表すものとして分類されるレベル（例えば、第１のレベル）について決定される。多くの場合、癌細胞核酸の分画は、予想レベル範囲内にあり、それによって癌細胞及び／又は非癌細胞のコピー数多型として分類される観察されたレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、癌細胞核酸の分画は、癌細胞及び／又は非癌細胞のコピー数多型として分類される観察されたレベル（例えば、第１のレベル）が、同じ癌細胞及び／又は非癌細胞のコピー数多型について決定された予想レベルとは異なるときに決定される。レベルに従って胎児分画を決定するための以下に記載される方法を、癌細胞核酸の分画を決定するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、胎児分画は、母体及び／又は胎児のコピー数多型（例えば、異数性、微小重複、微小欠失）を表すものとして分類されるレベルに従って決定される。例えば、胎児分画を決定することは、多くの場合、胎児分画の決定に利用される母体及び／又は胎児のコピー数多型の予想レベルを評価することを含む。いくつかの実施形態では、胎児分画は、同じタイプのコピー数多型について決定された予想レベル範囲に従って、コピー数多型を表すものとして分類されるレベル（例えば、第１のレベル）について決定される。多くの場合、胎児分画は、予想レベル範囲内にあり、それによって母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類される観察されたレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類される観察されたレベル（例えば、第１のレベル）が、同じ母体及び／又は胎児のコピー数多型について決定された予想レベルとは異なるときに決定される。
いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、第２のレベルとは有意に異なり、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、プロファイル内の第２のレベルと有意に異なる観察されたかつ／又は実験的に得られたレベルであり、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは平均、平均値、又は合計レベルであり、胎児分画は第１のレベルに従って決定される。特定の実施形態では、第１のレベル及び第２のレベルは、観察されたかつ／又は実験的に得られたレベルであり、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。場合によっては、第１のレベルは、部分の第１のセットについての正規化されたカウントを含み、第２のレベルは、部分の第２のセットについての正規化されたカウントを含み、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルの部分の第１のセットは、コピー数多型を含み（例えば、第１のレベルは、コピー数多型を表す）、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルの部分の第１のセットは、ホモ接合性又はヘテロ接合性の母体のコピー数多型を含み、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、プロファイルは、部分の第１のセットについての第１のレベル及び部分の第２のセットについての第２のレベルを含み、部分の第２のセットは、実質的にコピー数多型（例えば、母体のコピー数多型、胎児のコピー数多型、又は母体のコピー数多型及び胎児のコピー数多型）を含まず、胎児分画は、第１のレベルに従って決定される。
いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、第２のレベルとは有意に異なり、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型について分類され、胎児分画は、第１のレベル及び／又はコピー数多型の予想レベルに従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、コピー数多型の予想レベルに従ってコピー数多型について分類され、胎児分画は、第１のレベルと予想レベルとの間の差に従って決定される。特定の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、胎児分画は、コピー数多型の第１のレベルと予想レベルとの間の差の２倍として決定される。いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、第１のレベルは、予想レベルから差し引かれ、それによって差を提供し、胎児分画は、差の２倍と決定される。いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、予想レベルは、第１のレベルから差し引かれ、それによって差を提供し、胎児分画は、差の２倍と決定される。
多くの場合、胎児分画はパーセントとして提供される。例えば、胎児分画を１００で割り、それによってパーセント値を提供することができる。例えば、母体ホモ接合重複を表し、かつ１５５のレベルを有する第１のレベル、及び１５０のレベルを有する母体ホモ接合重複の予想レベルの場合では、胎児分画を１０％として決定することができる（例えば、（胎児分画＝２×（１５５－１５０））。
いくつかの実施形態では、胎児分画は、コピー数多型として分類されるプロファイル内の２つ以上のレベルから決定される。例えば、時として、プロファイル内の２つ以上のレベル（例えば、２つ以上の第１のレベル）は、参照レベル（例えば、第２のレベル、実質的にコピー数多型を含まないレベル）と有意に異なるものとして識別され、２つ以上のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型を表すものとして分類され、胎児分画は、２つ以上のレベルの各々から決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、プロファイル内の約３以上、約４以上、約５以上、約６以上、約７以上、約８以上、又は約９以上の胎児分画の定量から決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、プロファイル内の約１０以上、約２０以上、約３０以上、約４０以上、約５０以上、約６０以上、約７０以上、約８０以上、又は約９０以上の胎児分画の定量から決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、プロファイル内の約１００以上、約２００以上、約３００以上、約４００以上、約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、又は約１０００以上の胎児分画の定量から決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、プロファイル内の約１０～約１０００、約２０～約９００、約３０～約７００、約４０～約６００、約５０～約５００、約５０～約４００、約５０～約３００、約５０～約２００、又は約５０～約１００の胎児分画の定量から決定される。
いくつかの実施形態では、胎児分画は、プロファイル内の複数の胎児分画の定量の平均又は平均値として決定される。特定の実施形態では、複数の胎児分画の定量から決定された胎児分画は、複数の胎児分画の定量の平均値（例えば、平均、平均値、標準平均、中央値など）である。多くの場合、複数の胎児分画の定量から決定された胎児分画は、当技術分野で既知の又は本明細書に記載される好適な方法によって決定される平均値である。いくつかの実施形態では、胎児分画の定量の平均値は、加重平均である。いくつかの実施形態では、胎児分画の定量の平均値は、重み付けされていない平均である。複数の胎児分画の定量から生成された平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量（すなわち、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量値）は、時として、不確定値（例えば、分散、標準偏差、ＭＡＤなど）に関連している。複数の決定から平均値、中央値、又は平均の胎児分画値を決定する前に、いくつかの実施形態では、１つ以上の偏差決定が除去される（本明細書でより詳細に説明される）。
プロファイル内のいくつかの胎児分画の定量は、時として胎児分画の全体的な定量（例えば、平均値又は平均の胎児分画の定量）に含まれない。いくつかの実施形態では、胎児分画の定量は、プロファイルにおいて第１のレベル（例えば、第２のレベルと有意に異なる第１のレベル）から得られ、第１のレベルは、遺伝的変異を示さない。例えば、プロファイル内のいくつかの第１のレベル（例えば、スパイク又はディップ）は、異常又は未知の原因から生成される。そのような値は、多くの場合、真のコピー数多型から得られた他の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量を生成する。いくつかの実施形態では、プロファイルにおける他の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量を特定し、胎児分画の定量から除去する。例えば、異常スパイク及びディップから得られたいくつかの胎児分画の定量は、それらをプロファイル内の他の胎児分画の定量と比較することによって特定され、胎児分画の全体的な定量から除外される。
いくつかの実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる独立した胎児分画の定量は、特定され、認識され、及び／又は観察可能な差である。特定の実施形態では、「有意に異なる」という用語は、統計的に異なる、及び／又は統計的に有意な差を意味することができる。「独立した」胎児分画の定量は、コピー数多型として分類された特定のレベルから決定された胎児分画（例えば、いくつかの実施形態では、単一の定量）であり得る。任意の好適な閾値又は範囲を使用して、胎児分画の定量が平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なると判定することができる。特定の実施形態では、胎児分画の定量は、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なり、その定量は、平均又は平均値からのパーセント偏差として表すことができる。特定の実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、約１０パーセント以上異なる。いくつかの実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、約１５パーセント以上異なる。いくつかの実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、約１５％～約１００％以上異なる。
特定の実施形態では、胎児分画の定量は、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量に関連する多様な不確定値に従う、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量とは有意に異なる。多くの場合、不確定値及び定数ｎ（例えば、信頼区間）は、範囲（例えば、不確定カットオフ）を定義する。例えば、時として、不確定値は、胎児分画の定量（例えば、＋／－５）の標準偏差であり、定数ｎ（例えば、信頼区間）で乗算され、それによって、範囲又は不確実性カットオフ（例えば、５ｎ～－５ｎ、時として５シグマと呼ばれる）を定義する。いくつかの実施形態では、独立した胎児分画の定量は、不確実性カットオフによって定義される範囲外にあり、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なると考えられる。例えば、１０の平均値及び３の不確実性カットオフについては、１３を超えるか、又は７未満の独立した胎児分画は、有意に異なる。いくつかの実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、不確定値（例えば、ｎ×シグマ）のｎ倍より大きく異なり、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上である。いくつかの実施形態では、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、不確定値（例えば、ｎ×シグマ）ｎ倍より大きく異なり、ｎは、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は４．０以上である。
いくつかの実施形態では、レベルは、胎児及び／又は母体の微小倍数性（ｍｉｃｒｏｐｌｏｉｄｙ）（例えば、微小欠失、微小重複）を表す。いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、第２のレベルとは有意に異なり、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、第１のレベル及び／又は第２のレベルは、胎児微小倍数性及び／又は母体微小倍数性を表す。特定の実施形態では、第１のレベルは、胎児微小倍数性を表す。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、母体微小倍数性を表す。多くの場合、第１のレベルは、胎児微小倍数性及び母体微小倍数性を表す。いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、第２のレベルとは有意に異なり、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、第１のレベルは、胎児及び／又は母体の微小倍数性を表し、胎児分画は、胎児及び／又は母体の微小倍数性に従って決定される。場合によっては、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、第１のレベルは、胎児の微小倍数性を表し、胎児分画は、胎児の微小倍数性に従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類される。第１のレベルは、母体微小倍数性を表し、胎児分画は、母体微小倍数性に従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、第１のレベルは、母体及び胎児の微小倍数性を表し、胎児分画は、母体及び胎児の微小倍数性に従って決定される。
いくつかの実施形態では、胎児分画の定量は、胎児及び／又は母体の微小倍数性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察されたレベル）は、第２のレベルとは有意に異なり、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、胎児及び／又は母体の微小倍数性は、第１のレベル及び／又は第２のレベルに従って決定され、胎児分画が決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、胎児微小倍数性は、第１のレベル及び／又は第２のレベルに従って決定され、胎児分画は、胎児微小倍数性に従って決定される。特定の実施形態では、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、母体の微小倍数性は、第１のレベル及び／又は第２のレベルに従って決定され、胎児分画は、母体微小倍数性に従って決定される。いくつかの実施形態では、第１のレベルは、母体及び／又は胎児のコピー数多型として分類され、母体及び胎児の微小倍数性は、第１のレベル及び／又は第２のレベルに従って決定され、胎児分画は、母体及び胎児の微小倍数性に従って決定される。
胎児分画は、多くの場合、母親の微小倍数性が、所与のレベル又はコピー数多型として分類されるレベルに対する胎児の微小倍数性とは異なる（例えば、同じでない）場合に、決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、母親が重複についてホモ接合性（例えば、２の微小倍数性）であり、胎児が同じ重複についてヘテロ接合性（例えば、１．５の微小倍数性）であるときに決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、母親が重複についてヘテロ接合性（例えば、１．５の微小倍数性）であり、胎児が同じ重複についてホモ接合性（例えば、２の微小倍数性）であるか又はその重複が胎児に存在しない（例えば、１の微小倍数性）場合に決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、母親が欠失についてホモ接合性（例えば、０の微小倍数性）であり、胎児が同じ欠失についてヘテロ接合性（例えば、０．５の微小倍数性）である場合に決定される。いくつかの実施形態では、胎児分画は、母親が欠失についてヘテロ接合性（例えば、０．５の微小倍数性）であり、胎児が同じ欠失についてホモ接合性（例えば、０の微小倍数性）であるか、その欠失が胎児に存在しない（例えば、１の微小倍数性）場合に決定される。
特定の実施形態では、胎児分画は、母親の微小倍数性が、コピー数多型として特定された所与のレベルについての胎児の微小倍体と同じである（例えば、同じであると特定される）場合に決定することができない。例えば、いくつかの実施形態では、母親及び胎児の両方がコピー数多型の同じ数のコピーを持つ所与のレベルでは、胎児分画は決定されない。例えば、胎児分画は、母親及び胎児の両方が同じ欠失についてホモ接合性であるか、又は同じ重複についてホモ接合性である場合、コピー数多型として分類されるレベルについて決定することができない。特定の実施形態では、胎児分画は、母親及び胎児の両方が同じ欠失についてヘテロ接合性であるか、又は同じ重複についてヘテロ接合性である場合、コピー数多型として分類されるレベルについて決定することができない。複数の胎児分画の定量がサンプルに対して行われる実施形態では、平均値、中央値、又は平均の値から大幅に逸脱する定量は、母体倍数性が胎児倍数性に等しいコピー数多型から生じる場合があり、そのような定量は考察から除去され得る。
いくつかの実施形態では、母体コピー数多型及び胎児のコピー数多型の微小倍数性は未知である。いくつかの実施形態では、コピー数多型について胎児及び／又は母体の微小倍数性の定量がない場合、胎児分画が生成され、平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と比較される。平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なるコピー数多型についての胎児分画の定量は、時として、母親及び胎児の微小倍数性がコピー数多型について同じであるためである。平均値、中央値、又は平均の胎児分画の定量と有意に異なる胎児分画の定量は、その差異の供給源又は原因に関係なく、全体的な胎児分画の定量から多くの場合除外される。いくつかの実施形態では、母親及び／又は胎児の微小倍数性は、当該技術分野で既知の方法によって（例えば、標的シーケンシング法によって）決定及び／又は検証される。
定義
本明細書で使用するとき、数値に関して用語「約」は、±１０％を指す。
本明細書で使用するとき、数値に関して用語「約」は、±１０％を指す。
用語「からなる」は、「包含し、限定される」ことを意味する。
用語「から本質的になる」は、組成物、方法、又は構造が、追加成分、工程、及び／又は部分が特許請求される組成物、方法、又は構造の基本的及び新規の特性を実質的に変更しない場合にのみ、追加成分、工程、及び／又は部分を含み得ることを意味する。
別途記載のない限り、本明細書に開示される方法及びシステムの実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びＤＮＡシーケンシング、及び組み換えＤＮＡ分野において使用される従来の技術及び装置を含み、これらは現状技術に属する。このような技術及び装置は当業者に既知であり、多数のテキスト及び参照研究（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），［２００１］を参照されたい）、及びＡｕｓｕｂｅｌらの「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」［１９８７］）に記載されている。
数値範囲は、その範囲を定義する数字を含む。本明細書全体を通して与えられる全ての最大数値制限は、そのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に記載されているかのように、より低いあらゆる数値限定を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられる全ての最小数値限定は、そのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に記載されているかのように、より高いあらゆる数値限定を含む。本明細書全体を通して与えられるあらゆる数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内に入るより狭いあらゆる数値範囲を含む。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に含まれる用語を含む種々の科学的辞書は、当該技術分野において、利用可能である。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本明細書に開示された実施形態の実施又は試験に使用することができることが見出されているが、いくつかの方法及び材料が記載されている。
以下に定義される用語は、全体として明細書を参照することによってより完全に記載される。本開示は、当業者によって使用される文脈に応じて変更され得るので、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。本発明で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含む。
特に指示がない限り、核酸は、５’～３’の配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列はそれぞれ、アミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれる。
本明細書で使用される場合、「尤度比」は、診断試験の実行の値を評価するために使用される。尤度比は、試験結果が、ある状態（疾患状態など）が存在する確率を有効に変化させるかするかどうかを判定するために、試験の感度及び特異性を使用する。陽性尤度比は、Ｐｒ（Ｔ＋｜Ｄ＋）／Ｐｒ（Ｔ＋｜Ｄ－）に相当するＬＲ＋＝（感度）／（１－特異性）、又は疾患試験の陽性を有する人の確率を、疾患試験の陽性を有しない人の確率で割ったものとして計算される。ここで、Ｔ＋又はＴ－は、それぞれ、試験の結果が陽性又は陰性であることを示す。同様に、Ｄ＋又はＤ－は、それぞれ、疾患が存在するか、又は存在しないことを示す。したがって、「真陽性」は、試験陽性（Ｔ＋）、かつ疾患を有する（Ｄ＋）もの、「偽陽性」は、試験陽性（Ｔ＋）、かつ疾患を有しない（Ｄ－）ものである。特定の試験に対するＬＲ＋の値が大きいほど、陽性の試験結果が真の陽性である可能性が高い。一方、ＬＲ＋＜１は、非罹患個体が、罹患個体よりも陽性の試験結果を受ける可能性が高いことを意味する。
検出限界（ＬＯＤ）は、所定の信頼度で検出することができる最小レベルの信号（例えば、検体、胎児分画、状態を示すスコアなど）である。本出願では、ＬＯＤは、所定の信頼度を有する、標的変異（例えば、ＣＮＶ、微小欠失、微小重複、又はＳＮＰ）を検出するために必要とされる最小レベルの胎児分画又は腫瘍分画（又は他の検体）である。
用語「断片サイズパラメータ」は、断片又は核酸断片、例えば体液から得られるｃｆＤＮＡ断片の集合のサイズ又は長さに関連するパラメータを指す。本明細書で使用するとき、１）パラメータが、断片サイズ又はサイズ範囲に関して有利に重み付けされる、例えば、サイズ又はサイズ範囲の断片に関連付けられるときに他のサイズ又は範囲の場合よりも重く重み付けされるカウントであるとき、又は、２）パラメータが、例えば、断片サイズ又はサイズ範囲に関して有利に重み付けされる値から得られる、例えば、サイズ又はサイズ範囲の断片に関連付けられるときに他のサイズ又は範囲の場合よりも重く重み付けされるカウントから得られる比率であるとき、パラメータｉは「断片サイズ又はサイズ範囲に向けてバイアスがかかっている」。断片サイズ又はサイズ範囲は、ゲノムが、別のゲノム又は同じゲノムの別の部分からの核酸断片に対して、濃縮された又はより高濃度のサイズ又はサイズ範囲を有する核酸断片を生成する場合、ゲノム又はその一部の特徴であり得る。
用語「重み付け」は、「重み」と見なされる１つ以上の値又は関数を使用してパラメータ又は変数などの量を修正することを指す。特定の実施形態では、パラメータ又は変数は、重みで乗算される。他の実施形態では、パラメータ又は変数は、指数関数的に変更される。いくつかの実施形態では、関数は、線形関数であってもよく、又は非線形関数であってもよい。適用可能な非線形関数の例としては、これらに限定されるものではないが、ヘビサイドステップ関数、ボックスカー関数、ステアケース関数、又はシグモイド関数が挙げられる。元のパラメータ又は変数を重み付けすることで、重み付き変数の値を体系的に増加又は減少させることができる。様々な実施形態では、重み付けは、正、負、又は負の値をもたらし得る。
「遺伝的変異」又は「遺伝子変異」は、特定の個体に存在する特定の遺伝子型を指し、多くの場合、遺伝的変異は、個体の統計的に有意なサブ集団に存在する。遺伝的分散（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｃｅ）の有無は、本明細書に記載の方法又は装置を使用して判定することができる。特定の実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の有無は、本明細書に記載の方法及び装置によって提供される結果に従って判定される。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、染色体異常（例えば、異数性）、部分的な染色体異常又はモザイク現象であり、それらの各々は、本明細書でより詳細に説明される。遺伝的変異の非限定的な例としては、１つ以上の欠失（例えば、微小欠失）、重複（例えば、微小重複）、挿入、変異、多型（例えば、一塩基多型）、融合、反復（例えば、短いタンデム反復）、異なるメチル化部位、異なるメチル化パターンなど、及びそれらの組み合わせが挙げられる。挿入、反復、欠失、重複、変異又は多型は、任意の長さのものであり得、いくつかの実施形態では、長さにおいて約１塩基又は塩基対（ｂｐ）～約２５０メガ塩基対（Ｍｂ）であり得る。いくつかの実施形態では、挿入、反復、欠失、重複、変異、又は多型は、長さにおいて約１塩基又は塩基対（ｂｐ）～約１，０００キロベース（ｋｂ）（例えば、長さにおいて約１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、又は１０００ｋｂ）である。
遺伝的変異は、時として欠失である。特定の実施形態では、欠失は、染色体又はＤＮＡの配列の一部が欠落している変異（例えば、遺伝的異常）である。欠失は、多くの場合、遺伝物質の喪失である。任意の数のヌクレオチドが欠失される場合がある。欠失は、１つ以上の染色体全体、染色体のセグメント、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、それらのセグメント、又はそれらの組み合わせの欠失を含み得る。欠失は、微小欠失を含み得る。欠失は、単一塩基の欠失を含み得る。
遺伝的変異は、時として遺伝的重複である。特定の実施形態では、重複は、染色体又はＤＮＡの配列の一部がコピーされ、ゲノムに挿入されて戻される変異（例えば、遺伝的異常）である。特定の実施形態では、遺伝的重複（すなわち、重複）は、ＤＮＡの領域の任意の重複である。いくつかの実施形態では、重複は、ゲノム又は染色体内で、多くの場合タンデムで、繰り返される核酸配列である。いくつかの実施形態では、重複は、１つ以上の染色体全体、染色体のセグメント、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、それらのセグメント、又はそれらの組み合わせのコピーを含み得る。重複は、微小重複を含み得る。重複は、時として、重複した核酸の１つ以上のコピーを含む。重複は、１回以上繰り返される（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回繰り返される）遺伝的領域として特徴付けられる。重複は、場合によっては、小さな領域（数千の塩基対）から染色体全体までの範囲であり得る。重複は、相同組換えにおけるエラーの結果として、又はレトロトランスポゾン事象のために頻繁に生じる。重複は、特定のタイプの増殖性疾患に関連している。重複は、ゲノムマイクロアレイ又は比較遺伝子ハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＣＧＨ）を使用して特徴付けることができる。
遺伝的変異は、時として挿入である。挿入は、時として、１つ以上のヌクレオチド塩基対の核酸配列への付加である。挿入は、時として、微小挿入である。特定の実施形態では、挿入は、染色体のセグメントのゲノム、染色体、又はそれらのセグメントへの付加を含む。特定の実施形態では、挿入は、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、それらのセグメント、又はそれらの組み合わせの、ゲノム又はそれらのセグメントへの付加を含む。特定の実施形態では、挿入は、未知の起源の核酸の、ゲノム、染色体、又はそれらのセグメントへの付加（すなわち、挿入）を含む。特定の実施形態では、挿入は、単一の塩基の付加（すなわち、挿入）を含む。
本明細書における用語「コピー数多型（ＣＮＶ）」は、基準サンプル中に存在する核酸配列のコピー数と比較して、試験サンプル中に存在する核酸配列のコピー数が多様であることを指す。特定の実施形態では、核酸配列は、１ｋｂ以上である。場合によっては、核酸配列は、染色体全体又はその有意な部分である。「コピー数多型」は、試験サンプル中の対象核酸配列と対象核酸配列の予想レベルとを比較することにより、コピー数差が見出される核酸配列を指す。例えば、試験サンプル中の対象核酸配列のレベルが、適格サンプル中に存在するものと比較される。コピー数多型（ｖａｒｉａｎｔ）／多型（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、微小欠失を含む欠失、微小挿入を含む挿入、複製、増殖、及び転位を含む。ＣＮＶは、染色体異数性及び部分的異数性を包含する。
本明細書における用語「異数性」は、染色体全体又は染色体の一部の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡を指す。
本明細書における用語「染色体異数性」及び「完全染色体異数性」は、染色体全体の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡を指し、生殖細胞異数性及びモザイク異数性を含む。
本明細書において、用語「部分異数性」及び「部分染色体異数性」は、染色体、例えば、部分モノソミー及び部分トリソミーの一部の喪失又は獲得によって引き起こされる遺伝物質の不均衡を指し、転位、欠失、及び挿入から生じる不均衡を包含する。
用語「複数」とは、２つ以上の要素を意味する。例えば、この用語は、本明細書に開示される方法を使用して、試験サンプル及び適格サンプルにおけるコピー数多型の有意な差異を特定するのに十分な多数の核酸分子又は配列タグを参照して使用される。いくつかの実施形態では、各試験サンプルについて、約２０～４０ｂｐの少なくとも約３×１０６の配列タグが得られる。いくつかの実施形態では、各試験サンプルは、少なくとも約５×１０６、８×１０６、１０×１０６、１５×１０６、２０×１０６、３０×１０６、４０×１０６、又は５０×１０６の配列タグのデータを提供し、各配列タグは、約２０～４０ｂｐを含む。
用語「ペアエンドリード」は、核酸断片の各末端から１つのリードを取得する、ペアエンドシーケンシングからのリードを指す。ペアエンドシーケンシングは、ポリヌクレオチドの鎖を、インサートと呼ばれる短い配列に断片化することを含んでもよい。断片化は、セルフリーＤＮＡ分子などの比較的短いポリヌクレオチドの場合は任意選択的又は不要である。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」は同じ意味で用いられ、１つのヌクレオチドのペントースの３’位置が、ホスホジエステル基によって次のペントースの５’位置に結合されるヌクレオチドの共有結合様の配列（すなわち、ＲＮＡに関してはリボヌクレオチド、またＤＮＡに関してはデオキシリボヌクレオチド）を意味する。ヌクレオチドは、ｃｆＤＮＡ分子などのＲＮＡ及びＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない、任意の形態の核酸の配列を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
本明細書における用語「試験サンプル」は、典型的には、コピー数多型に関してスクリーニングされる少なくとも１つの核酸配列を含有する生物液、細胞、組織、器官、又は生物に由来するサンプルを指す。特定の実施形態では、サンプルは少なくとも１つの核酸配列を含み、そのコピー数は、変化したものと疑われる。このようなサンプルとしては、痰／口腔流体、羊水、血液、血液分画、又は細針生検サンプル（例えば、外科生検、細針生検など）、尿、腹膜流体、胸膜流体などが挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、多くの場合、ヒト被験者（例えば、患者）から採取されるが、分析物は、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物からのサンプル内のコピー数多型（ＣＮＶ）に対して使用することができる。サンプルは、生物学的源から得られるように、又はサンプルの特性を修正する前処理後に、直接使用することができる。例えば、このような前処理は、血漿を血液から調製すること、粘性流体を希釈することなどを含んでもよい。前処理の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、遠心分離、凍結、凍結乾燥、濃縮、増幅、核酸断片化、干渉成分の不活性化、試薬の添加、溶解などを含んでもよいが、これらに限定されない。このような前処理方法がサンプルに対して採用される場合、このような前処理方法は、典型的には、時々、未処理の試験用サンプル（例えば、すなわち任意のこのような前処理方法（複数可）に供されないサンプル）に比例する濃度で、対象とする核酸（複数可）が試験用サンプル中に残存するようなものである。このような「処理された（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）」サンプルは、本明細書に記載された方法に関して、依然として生物学的「試験用」サンプルであると考えられる。
本明細書における用語「トレーニングセット」は、影響ありサンプル及び／又は影響なしサンプルを含むことができ、試験サンプルを分析するためのモデルを開発するために使用されるトレーニングサンプルのセットを指す。いくつかの実施形態では、トレーニングセットは、影響なしサンプルを含む。これらの実施形態では、ＣＮＶを判定するための閾値は、対象コピー数多型について影響なしサンプルのトレーニングセットを使用して確定される。トレーニングセット内の影響なしサンプルは、適格サンプルとして使用されて、正規化染色体などの正規化配列を特定することができ、影響なしサンプルの染色体量を使用して、対象配列、例えば、染色体のそれぞれについて閾値を設定する。いくつかの実施形態では、トレーニングセットは、影響ありサンプルを含む。トレーニングセット内の影響ありサンプルを使用して、影響あり試験サンプルが影響なしサンプルと容易に区別できることを確認することができる。
トレーニングセットはまた、対象集団における統計サンプルであり、この統計サンプルは、生物学的サンプルと混同すべきではない。統計サンプルは多くの場合、複数の個体を含み、個体のデータは、母集団に一般化可能な１つ又はそれ以上の定量値を判定するために使用される。統計サンプルは、対象母集団における個体のサブセットである。個体は、人、動物、組織、細胞、他の生物学的サンプル（すなわち、統計サンプルは複数の生物学的サンプルを含んでもよい）、及び統計分析のためのデータ点を提供する他の個々のエンティティであってもよい。
通常、トレーニングセットは、検証セットと併せて使用される。用語「検証セット」は、統計サンプル中の個体のセットを指すために使用され、個体のデータは、トレーニングセットを使用して判定された対象の定量値を検証又は評価するために使用される。いくつかの実施形態では、例えば、トレーニングセットが、参照配列のマスクを計算するためのデータを提供する一方、検証セットは、マスクの妥当性又は有効性を評価するためのデータを提供する。
本明細書において、用語「対象配列」又は「対象核酸配列」は、健康な個体と疾病のある個体との間の配列表現の差に関連付けられる核酸配列を指す。対象配列は、疾患又は遺伝的状態において、誤って発現された、すなわち過剰又は過小に発現された染色体上の配列であり得る。対象配列は、染色体の一部、すなわち、染色体セグメントであってもよく、染色体全体であってもよい。例えば、対象配列は、異数性状態において過剰に発現された染色体、又は癌において過小に発現された腫瘍抑制因子をコードする遺伝子であってもよい。対象配列としては、集団全体又は被験者の細胞のサブ集団において過剰又は過小に発現された配列が挙げられる。「対象適格配列」は、適格サンプル中の対象配列である。「対象試験配列」は、試験サンプル中の対象配列である。
本明細書における用語「正規化配列」は、正規化配列に関連付けられた対象配列にマッピングされる配列タグの数を正規化するために使用される配列を指す。いくつかの実施形態では、正規化配列は、ロバストな染色体を含む。「ロバストな染色体」は、異数性である可能性が低いものである。ヒト染色体に関与する場合では、ロバストな染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、１３番染色体、１８番染色体、及び２１番染色体以外の任意の染色体である。いくつかの実施形態では、正規化配列は、それが正規化パラメータとして使用される対象配列の変動性に近似するサンプル及びシーケンシングランの中で、正規化配列にマッピングされる配列タグの数の変動性を示す。正規化配列は、影響ありサンプルと１つ又はそれ以上の影響なしサンプルとを区別することができる。いくつかの実施態様では、正規化配列は、他の染色体などの他の潜在的な正規化配列と比較されるとき、影響ありサンプルと１つ又はそれ以上の影響なしサンプルとを、最良又は効果的に区別する。いくつかの実施形態では、正規化配列の多様性は、サンプル及びシーケンシングラン全体にわたって対象配列に関する染色体量の多様性として計算される。いくつかの実施形態では、正規化配列は、影響なしサンプルのセットにおいて特定される。
「正規化染色体」、「正規化基準染色体」、又は「正規化染色体配列」は、「正規化配列」の例である。「正規化染色体配列」は、単一の染色体又は染色体群から構成され得る。いくつかの実施形態では、正規化配列は、２つ以上のロバストな染色体を含む。特定の実施形態では、ロバストな染色体は、Ｘ、Ｙ、１３番、１８番、及び２１番染色体以外の全ての常染色体である。「正規化セグメント」は、「正規化配列」の別の例である。「正規化セグメント配列」は、染色体の単一セグメントから構成されてもよく、又は同じ又は異なる染色体の２つ又はそれ以上のセグメントから構成されてもよい。特定の実施形態では、正規化配列は、プロセス関連、染色体間（ラン内）、及びシーケンシング間（ラン間）変動などの変動性について正規化することが意図される。
本明細書における用語「差異性」は、１つ又はそれ以上の影響なし、すなわち、正常サンプルと、１つ以上の影響ありサンプル、すなわち、異数性サンプルとの区別を可能にする正規化染色体の特徴を指す。最大の「差異性」を示す正規化染色体は、１セットの適格サンプル中の対象染色体に関する染色体量と、１つ又はそれ以上の影響ありサンプル中の対応する染色体における同じ対象染色体に関する染色体量との分布間の最大の統計的差異を提供する染色体又は染色体群である。
本明細書における用語「変動性」は、１つ又はそれ以上の影響なし、すなわち、正常サンプルと、１つ以上の影響ありサンプル、すなわち、異数性サンプルとの区別を可能にする正規化染色体の別の特徴を指す。正規化染色体の変動性は、適格サンプルのセット内で測定され、正規化パラメータとして機能する対象染色体にマッピングされる配列タグの数の変動に近似する配列タグの数の変動性を指す。
用語「カバレッジ」は、定義された配列にマッピングされた配列タグの存在度を指す。カバレッジは、配列タグ密度（又は配列タグのカウント）、配列タグ密度比、正規化カバレッジ量、調節されたカバレッジ値などによって定量的に示すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「シーケンシング深度」は、一般に遺伝子座が、その遺伝子座に位置合わせされた配列リードによってカバーされる回数を指す。遺伝子座は、ヌクレオチド程度に小さいか、又は染色体アーム程度に大きいか、又はゲノム全体程度に大きくてもよい。シーケンシング深度は、５０ｘ、１００ｘなどとして表すことができ、「ｘ」は、遺伝子座が配列リードでカバーされる回数を指す。シーケンシング深度はまた、複数の遺伝子座又は全ゲノムに適用することができ、この場合、ｘは、遺伝子座又はハプロイドゲノム、又は全ゲノムがそれぞれシーケンシングされる平均回数を指すことができる。平均深度が引用されるとき、データセットに含まれる異なる遺伝子座の実際の深さは、値の範囲にわたって広がる。ウルトラディープシーケンシングは、シーケンシング深度において少なくとも１００ｘを指すことができる。
染色体の「有効リードカバレッジ」は、リードによってカバーされた塩基の実際の量として定義される。リードによるヌクレオチドの予想されるカバレッジを指すシーケンシング深度は、リードが染色体間で均一に合成されるという仮定に基づいて計算される。実際には、ゲノム全体のリードカバレッジは均一ではない。例えば、１０ｘの被覆率は、ヌクレオチドが平均で１０回カバーされているが、ゲノムの特定の部分において、ヌクレオチドははるかに多く又ははるかに少なくカバーされていることを意味する。カバレッジに影響を与える１つの要因は、リードアライナーがゲノムにリードを位置合わせする能力である。ゲノムの一部が複雑である場合、例えば、多くの繰り返しを有する場合、アライナーは、リードをその領域に位置合わせするのに困難を有し、結果としてカバレッジが低くなる可能性がある。
用語「カバレッジ量」は、生カバレッジの改変を指し、多くの場合、ビンなどのゲノムの領域内の配列タグの相対量（カウントと称されることもある）を表す場合が多い。カバレッジ量は、ゲノムの領域について生カバレッジ又はカウントを正規化、調整、及び／又は補正することによって得ることができる。例えば、ある領域の正規化カバレッジ量は、該領域にマッピングされた配列タグカウントを、ゲノム全体にマッピングされた総配列タグ数で除算することによって得ることができる。正規化カバレッジは、異なるシーケンシングの深度を有し得る様々なサンプルにわたるビンのカバレッジの比較を可能にする。正規化カバレッジは配列量と異なり、後者は典型的には、ゲノム全体のサブセットにマッピングされたタグカウントで除算することによって得られる。サブセットは、１つ以上の正規化セグメント又は染色体である。正規化されているか否かにかかわらず、カバレッジ量は、ゲノム上の領域間の全体的なプロファイル変動、Ｇ－Ｃ分画変動、ロバストな染色体における外れ値などについて補正されてもよい。
本明細書において、用語「次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）」とは、クローン的に増幅された分子及び単一核酸分子の大規模な並列シーケンシングを可能にするシーケンシング法を意味する。ＮＧＳの非限定的な例としては、リバーシブルダイターミネータシーケンシング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）を用いた合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、及びライゲーションによるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）が挙げられる。
本明細書における用語「パラメータ」は、システムの特性を特徴付ける数値を指す。しばしば、パラメータは、定量データセット及び／又は定量データセット間の数値関係を数値的に特徴付ける。例えば、染色体に位置づけられる配列タグの数と、タグがマッピングされる染色体の長さとの比（又は比の関数）は、パラメータである。いくつかの場合において、本明細書で使用される用語「パラメータ」は、その値又は他の特性がコピー数多型などの関連条件に影響を及ぼす物理的特徴を表す。いくつかの場合において、パラメータという用語は、数学的関係又はモデルの出力に影響を及ぼす変数を参照して使用され、変数は、独立変数（すなわち、モデルへの入力）又は１つ以上の独立変数に基づく中間変数であってもよい。モデルの範囲に応じて、１つのモデルの出力は、別のモデルの入力になることによって他のモデルへのパラメータとなり得る。
用語「ビン」は、配列のセグメント又はゲノムのセグメントを指す。いくつかの実施形態では、ビンは、ゲノム又は染色体内で互いに隣接している。各ビンは、参照ゲノム中のヌクレオチド配列を定義することができる。ビンのサイズは、特定の用途及び配列タグ密度によって必要とされる分析に応じて、１ｋｂ、１００ｋｂ、１Ｍｂなどであってもよい。参照配列内の位置に加えて、ビンは、サンプルカバレッジ及びＧ－Ｃ分画などの配列構造特性などの他の特性を有してもよい。
本明細書における用語「正規化値」は、対象の配列（例えば、染色体又は染色体セグメント）について特定された配列タグの数を、正規化配列（例えば、正規化染色体又は正規化染色体セグメント）について特定された配列タグの数に関連付ける数値を指す。例えば、「正規化値」は、本明細書の他の箇所に記載されるような染色体量とする、又はＮＣＶとする、又は本明細書の他の箇所に記載されるようにＮＳＶとすることができる。
用語「リード」は、核酸サンプルの一部から得られる配列を指す。典型的には、必ずしもそうではないが、リードは、サンプルにおける連続的な塩基対の短い配列を表す。リードは、サンプル部分の塩基対配列（Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ）によって記号的に表されてもよい。リードが参照配列と整合する、又はその他の基準を満たすかを決定するために、メモリデバイスに記憶され、適切に処理されてもよい。リードは、シーケンシング装置から直接、又は試料に関する記憶された配列情報から間接的に得られてもよい。場合によっては、例えば、染色体又はゲノム領域又は遺伝子に位置合わせされ、特異的に割り当てられ得る、より大きな配列又は領域を識別するために使用することができる十分な長さ（例えば、少なくとも約２５ｂｐ）のＤＮＡ配列である。
用語「ゲノムリード」とは、個体のゲノム全体における任意のセグメントのリードに関して使用される。
本明細書で使用される場合、「配列リード」（又はシーケンシングリード）は、一般に、核酸分子の任意の部分又は全てからシーケンシングされたヌクレオチドのストリングを指す。例えば、配列リードは、核酸断片、核酸断片の一方又は両方の末端におけるヌクレオチドの短いストリング、又は生体サンプル中に存在する核酸断片全体のシーケンシングからシーケンシングされたヌクレオチドの短いストリング（例えば、２０～１５０）であり得る。配列リードは、様々な方法で、例えば、シーケンシング技術を使用して、又はプローブを、例えばハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブにおいて使用して、又は増幅技術（単一のプライマー若しくは等温増幅を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は線形増幅など）を使用して得ることができる。
用語「部位」とは、参照ゲノム上の固有の位置（すなわち、染色体ＩＤ、染色体位置及び配向）を指す。いくつかの実施形態では、部位は、残基、配列タグ、又は配列上のセグメントの位置であってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「位置合わせされた」、「位置合わせ」、又は「位置合わせする」は、リード又はタグを参照配列と比較することによって、参照配列がリード配列を含むか否かを判定するプロセスを指す。参照配列がリードを含む場合、リードは参照配列に位置づけられてもよい、又は特定の別の実施形態では、参照配列内の特定の位置にマッピングされてもよい。いくつかの場合において、位置合わせは、リードが特定の参照配列のメンバーであるか否か（すなわち、リードが参照配列中に存在するか又は存在していないか）かを単に伝える。例えば、ヒト染色体１３についての参照配列に対するリードの位置合わせは、染色体１３の参照配列中にリードが存在するかどうかを伝える。本情報を提供するツールは、セットメンバーシップテスタ（ｓｅｔ ｍｅｍｂｅｒｓｈｉｐ ｔｅｓｔｅｒ）と呼ばれる場合がある。いくつかの場合においては、位置合わせは、リード又はタグが参照シーケンス内にマッピングする場所を更に示す。例えば、参照配列がヒトゲノム配列全体である場合、位置合わせは、染色体１３上にリードが存在することを示してもよく、更に、リードが染色体１３の特定の鎖及び／又は部位にあることを更に示してもよい。
位置合わせされたリード又はタグは、参照ゲノムから既知の配列までの核酸分子の順序に関して一致として特定される１つ以上の配列である。位置合わせは手動で行うことができるが、本明細書に開示された方法を実施するために合理的な時間周期でリードを位置合わせさせることが不可能であるため、典型的にはコンピュータアルゴリズムによって実施される。配列を位置合わせさせるアルゴリズムの一例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓパイプラインの一部として分散されたヌクレオチドデータ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムの効率的な局所位置合わせである。あるいは、ブルームフィルタ（Ｂｌｏｏｍ ｆｉｌｔｅｒ）又は同様のセットメンバーシップテスタを用いて、リードを参照ゲノムに位置合わせさせることができる。参照により本明細書に全文が組み込まれる、２０１１年１０月２７日に出願された米国特許出願第６１／５５２，３７４号を参照されたい。位置合わせの際の配列リードのマッチングは、１００％配列一致又は１００％未満（非完璧一致）であり得る。
本明細書で使用される用語「マッピング」は、位置合わせによって、配列リードをより大きな配列、例えば、参照ゲノムに明確に）に割り当てることを指す。
本発明で使用する場合、用語「参照ゲノム」又は「参照配列」とは、対象からの特定された配列を参照するために使用され得る任意の生物又はウイルスの部分的又は完全ないずれかの特定の既知のゲノム配列を指す。例えば、ヒト被験者に使用される参照ゲノム、並びに多くのその他の生物が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で見出される。「ゲノム」とは、核酸配列で発現される、生物又はウイルスの完全な遺伝子情報を意味する。
各種実施形態では、参照配列は、それに位置合わせされたリードよりも著しく大きくてもよい。例えば、それは、少なくとも約１００倍大きい、又は少なくとも約１０００倍大きい、又は少なくとも約１０，０００倍大きい、又は少なくとも約１０５倍大きい、又は少なくとも約１０６倍大きい、又は少なくとも約１０７倍大きい場合がある。
一実施例では、参照配列は、完全長ヒトゲノムのものである。このような配列は、ゲノム参照配列と呼ばれることもある。別の例では、参照配列は、１３番染色体などの特定のヒト染色体に限定される。いくつかの実施形態では、参照Ｙ染色体は、ヒトゲノムバージョンｈｇ１９からのＹ染色体配列である。このような配列は、染色体参照配列と呼ばれることもある。参照配列の他の例としては、その他の種のゲノム、並びに任意の種の染色体、部分染色体領域（ストランドなど）などが挙げられる。
様々な実施形態では、参照配列は、複数の個体に由来する共通塩基配列又はその他の組み合わせである。しかしながら、特定の用途では、参照配列は、特定の個体から採取されてもよい。
本明細書において、用語「臨床関連配列」とは、既知である、又は遺伝的若しくは病状に関連する又は暗示されることが疑われる核酸配列を意味する。臨床関連配列の不在又は存在を決定することは、診断を判定すること、又は医学的状態の診断を確認すること、又は疾患の発症の予後を提供するのに有用であり得る。
用語「誘導される」とは、核酸又は核酸の混合物の文脈で使用される場合に、本明細書では、核酸が生じる源から核酸（複数可）が得られる手段を意味する。例えば、一実施形態では、２つの異なるゲノムに由来する核酸の混合物は、核酸、例えば、ｃｆＤＮＡが、壊死又はアポトーシスなどの自然発生プロセスを通じて細胞によって自然に放出されたことを意味する。別の実施形態では、２つの異なるゲノムに由来する核酸の混合物は、核酸が被験体からの２つの異なる種類の細胞から抽出されたことを意味する。
用語「基づいて」とは、特定の定量的値を得るという文脈において使用される場合、特定の定量的値を出力として計算するための入力として別の量を使用することを意味する。
本明細書において用語「患者サンプル」とは、患者から得られた生体サンプル、すなわち、医療用注意、ケア、又は治療の受け手を意味する。患者サンプルは、本明細書に記載されたサンプルのうちのいずれかであり得る。特定の実施形態では、患者サンプルは、非侵襲的処置、例えば、末梢血サンプル又は糞便サンプルによって得られる。本明細書に記載された方法は、ヒトに限定される必要はない。したがって、患者サンプルが非ヒト哺乳動物（例えば、ネコ、ブタ、ウマ、ウシなど）からのサンプルであり得る種々の獣医学的用途が想到される。
本明細書における用語「混合サンプル」は、異なるゲノム由来の核酸の混合物を含有するサンプルを指す。
本明細書における用語「母体サンプル」は、妊婦被験者、例えば、女性から得られる生物学的サンプルを指す。
本明細書において、用語「生物学的流体」とは、生物学的供給源から採取される液体を意味し、例えば、血液、血清、血漿、痰、洗浄液、脳脊髄液、尿、精液、汗、涙、唾液などを含む。本発明で使用する場合、用語「血液」、「血漿」、及び「血清」は、その分画又はその処理された部分を明示的に包含する。同様に、サンプルが生検、綿棒、スミアなどから採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒、スミアなどから得られる処理された分画又は部分を明示的に包含する。
本明細書における用語「母体核酸」及び「胎児核酸」は、妊娠中の女性の被験者の核酸、及び妊娠中の女性が身ごもっている胎児の核酸を指す。本明細書における「腫瘍核酸」という用語は、患者の１つ以上の腫瘍に由来する核酸を指す。
本発明で使用する場合、用語「対応する」とは、時として、異なる対象のゲノム中に存在する核酸配列、例えば、遺伝子又は染色体を指し、必ずしも全てのゲノムに同一の配列を有さないが、対象とする配列（例えば、遺伝子又は染色体）の遺伝情報ではなく同一性を提供する役割を果たす。
本明細書で使用するとき、用語「胎児分画」は、胎児核酸及び母体核酸を含むサンプル中に存在する胎児核酸の分画を指す。胎児分画は、母親の血液中のｃｆＤＮＡを特徴付けるために使用されることが多い。本明細書で使用するとき、用語「腫瘍分画」は、患者の腫瘍核酸及び正常な核酸の混合物を含むサンプル中に存在する腫瘍核酸の分画を指す。
本発明で使用する場合、用語「染色体」とは、ＤＮＡ及びタンパク質成分（特にヒストン）を含むクロマチンストランドに由来する、生きている細胞の本発明の有効性を有する遺伝子キャリアを意味する。従来の国際的に認識されている個々のヒトゲノム染色体番号付けシステムが本明細書で使用される。
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド長」は、参照ゲノムの配列又は領域中のヌクレオチドの絶対数を指す。用語「染色体長」とは、例えば、ヒト染色体のＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８アセンブリに提供される塩基対にある染色体の既知の長さを指す。インターネット（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ＧＣＦ＿０００００１４０５．１２／）を参照されたい。
本明細書における用語「被験者」は、ヒト被験者だけでなく、哺乳類、脊椎動物、脊椎動物、真菌、酵母、細菌、及びウイルスなどの非ヒト被験体を指す。本明細書の実施例はヒトに関し、言語は主にヒトに関するが、本明細書に開示された概念は、任意の植物又は動物からのゲノムに適用可能であり、獣医学、動物科学、研究所、及びこのような分野において有用である。
本明細書における用語「状態」は、全ての疾患及び障害を含む広範な用語として「医学的状態」を指すが、人の健康や医療補助からの恩恵に影響を及ぼし得る、又は医療処置に影響を及ぼし得る、傷害や妊娠などの正常な健康状況も含むことができる。
本明細書では、染色体異数性に関連して使用されるとき、用語「完全」は、染色体全体の獲得又は損失を指す。
本明細書では、染色体異数性に関連して使用されるとき、用語「部分」は、染色体の一部、すなわちセグメントの獲得又は損失を指す。
本明細書における用語「モザイク」は、単一の受精卵から成長した１つの個体における、異なる核型を有する２つの細胞集団の存在を示すことを指す。モザイク現象は、成人細胞のサブセットのみに伝播される成長中の突然変異から生じ得る。
本明細書における用語「非モザイク」は、１つの核型の細胞から構成される生物、例えば、ヒト胎児を指す。
本明細書で使用するとき、用語「感度」は、対象状態が存在するときに試験結果が陽性となる確率を指す。感度は、真陽性の数を真陽性と偽陰性との合計で除算することによって計算することができる。
本明細書で使用するとき、用語「特異性」は、対象状態が存在しない場合に試験結果が陰性である確率を指す。特異性は、真陰性の数を真陰性と偽陽性との合計で除算することによって計算することができる。
本明細書における用語「濃縮」は、母体サンプルの一部に含まれる多型標的核酸を増幅し、増幅された産物と、その部分が除去された母体サンプルの残部とを組み合わせるプロセスを指す。例えば、母体用サンプルの残部は元母体サンプルであり得る。
本明細書における用語「元母体サンプル」は、多型標的核酸を増幅するために一部が除去されるソースとして機能する、妊婦の被験者、例えば、女性から得られる非濃縮生物学的サンプルを指す。「元サンプル」は、妊娠した被験者から得られた任意のサンプル、及びその処理された分画、例えば、母体血漿サンプルから抽出された精製ｃｆＤＮＡサンプルであってもよい。
本発明で使用する場合、用語「プライマー」とは、伸長生成物の合成に誘導性の条件（例えば、条件は、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤、及び好適な温度並びにｐＨを含む）下に置かれた場合に合成の開始点として作用することができる、単離されたオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは最大増幅効率のために一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーはまず、拡張産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するように処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で拡張産物の合成をプライミングするのに十分な長を有していなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、方法の使用、及びプライマー設計に使用されるパラメータを含む多くの因子に依存する。
追記事項
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
「一例」、「別の例」、「ある例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。
本明細書に提供される範囲は、そのような値又は部分範囲が明示的に列挙されているかのように、示される範囲及びその示される範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解されたい。例えば、約２ｎｍ～約２０ｎｍの範囲は、約２ｎｍ～約２０ｎｍの明示的に列挙された限度だけでなく、約３．５ｎｍ、約８ｎｍ、約１８．２ｎｍなどの個々の値、及び約５ｎｍ～約１０ｎｍなどの部分範囲も含むと解釈されるべきである。更に、値を説明するために「約」及び／又は「実質的に」が利用される場合、それらは、記載された値からのわずかなばらつき（最大±１０％）を包含することを意味する。
いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。
特定の例が説明されてきたが、これらの実施例は、単なる例として提示されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。実際、本明細書に記載の新規の方法及びシステムは、様々な他の形態で具体化され得る。更に、本明細書に記載のシステム及び方法の様々な省略、置換、及び変更は、本開示の趣旨から逸脱することなく行われ得る。添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物は、本開示の範囲及び趣旨に含まれるように、そのような形態又は修正を網羅することが意図される。
本発明の記載された方法及び組成物の様々な修飾及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するための記載されたモードの様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
特定の態様、又は実施例と併せて記載された特徴、材料、特性、又は基は、このセクションに記載される任意の他の態様若しくは実施例（ａｓｐｅｃｔｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）、又はそれと矛盾しない限り、本明細書の他の場所に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴の全て、及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスのステップの全てが、そのような特徴及び／又はステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である場合の組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされ得る。保護は、任意の前述の例の詳細に限定されない。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴のうちの、任意の新規のもの若しくは任意の新規の組み合わせに対して、又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスのステップのうちの、任意の新規のもの若しくは任意の新規の組み合わせに対して、保護が及ぶものとする。
更に、別個の実施態様の文脈において本開示に記載されている特定の特徴はまた、単一の実施態様において組み合わせて実施され得る。逆に、単一の実施態様の文脈で説明される様々な特徴はまた、複数の実施態様で別々に、又は任意の好適な部分的組み合わせで実施され得る。更に、特徴が特定の組み合わせで機能するものと上述される場合があるが、特許請求された組み合わせからの１つ以上の特徴は、場合によっては組み合わせから削除することができ、その組み合わせは、部分的組み合わせ、又は部分的組み合わせの変形として特許請求され得る。
更に、動作は、図面に示されるか、又は特定の順序で明細書に記載されている場合があるが、このような動作は、所望の結果を得るために、示される特定の順序で若しくは順次実行される、又は全ての動作が実行されることを必要としない。図示又は記載されていない他の操作を、例示的な方法及びプロセスに組み込むことができる。例えば、１つ以上の追加の動作は、記載された動作のうちのいずれかの前、後、同時に、又は間に実行することができる。更に、動作は、他の実施において、再配列又は再順序付けされ得る。当業者は、いくつかの実施例では、図示及び／又は開示されたプロセスで取られた実際のステップが、図に示されるものとは異なり得ることを理解するであろう。実施例に応じて、上記のステップのいくつかを除去することができるか、又は他のステップを追加することができる。更に、上記に開示された特定の実施例の特徴及び属性は、異なる方法で組み合わされて、追加の実施例を形成してもよく、その全ては、本開示の範囲内にある。また、上述の実施態様の種々のシステム構成要素の分離は、全ての実施態様でこのような分離を必要とするとして理解されてはならず、記載した構成要素及びシステムは通常、単一の製品に一緒に統合することができる、又は複数の製品内にパッケージ化することができることを理解すべきである。例えば、本明細書に記載のエネルギー貯蔵システムのための構成要素のいずれも、別々に提供されるか、又は一緒に一体化されて（例えば、一緒に包装されるか、又は一緒に取り付けられて）エネルギー貯蔵システムを形成することができる。
本開示の目的のために、特定の態様、利点、及び新規の特徴が本明細書に記載されている。そのような利点が全て、任意の特定の実施例に従って達成され得るとは限らない。したがって、例えば、当業者は、本開示が、本明細書で教示又は示唆され得る他の利点を必ずしも達成しなくとも、本明細書で教示する１つの利点又は一群の利点を達成するような様式で、具現化又は実行することができることを認識するであろう。
特に明記しない限り、又はその他の方法で使用される際に文脈内で理解される「ｃａｎ」、「ｃｏｕｌｄ」、「ｍｉｇｈｔ」、又は「ｍａｙ」などの条件付き言語は、一般に、特定の特徴、要素、及び／又はステップが、特定の例には含まれるが、その他の例には含まれないことを伝えることを意図している。したがって、そのような条件付き言語は、一般に、特徴、要素、及び／又はステップが、１つ以上の実施例に必要な任意の方法であること、又は１つ以上の実施例が、ユーザ入力若しくはプロンプティングの有無にかかわらず、これらの特徴、要素、及び／又はステップが含まれるか、又は任意の特定の実施例で実行されるべきかを決定するためのロジックを必然的に含むことを意味することを意図するものではなく。
特に明記しない限り、「Ｘ、Ｙ、及びＺのうちの少なくとも１つ」という語句などの結合言語は、項目、用語などが、Ｘ、Ｙ、又はＺのいずれかであり得ることを伝えるために、他の方法で一般に使用されているとおりの文脈で理解されている。したがって、そのような結合言語は、一般に、特定の例が、Ｘのうちの少なくとも１つ、Ｙのうちの少なくとも１つ、及びＺのうちの少なくとも１つの存在を必要とすることを一般的に意味することを意図するものではない。
「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、「一般に」、及び「実質的に」という用語などの本明細書で使用される程度の言語は、所望の機能を依然として実行するか、又は所望の結果を達成する、記載された値、量、又は特性に近い値、量、又は特性を表す。
本開示の範囲は、このセクション又は本明細書の他の場所における好ましい実施例の特定の開示によって限定されることを意図するものではなく、このセクション又は本明細書の他の場所に提示されるか、又は将来提示されるような特許請求の範囲によって定義され得る。特許請求の範囲の言語は、特許請求の範囲に用いられる言語に基づいて、かつ本明細書に記載されている実施例に限定されずに、広く解釈されるべきであり、又は本出願の手続き中に、その実施例は非排他的であると解釈されるべきである。
Claims (34)
- サンプル核酸を処理して標的変異を特定する方法であって、
サンプル特異性を決定するために第１のシーケンシング反応を実行することと、
前記サンプル特異性に基づいて、前記標的変異に関連する第１の統計的尺度を決定することと、
前記第１の統計的尺度を参照することによって、前記第１のシーケンシング反応からの前記標的変異についての第１のリードカバレッジが閾値を超えるか、又は前記閾値未満であるかを判定することと、
判定した前記第１のリードカバレッジが前記閾値を超えない場合、第２のシーケンシング反応を実行するのに十分な量のサンプル核酸が利用可能であるかどうかを判定して、前記閾値を超えて前記第１のリードカバレッジを増加させることと、
十分な量のサンプル核酸が利用可能である場合、第２の有効リードカバレッジを得るために必要なサンプル量を計算し、前記サンプル核酸を再シーケンシングして、前記閾値を超える第２のリードカバレッジを得ることと、を含む、方法。 - 前記第１の統計的尺度が、前記サンプル核酸の胎児分画と前記第１のシーケンシング反応のシーケンシング深度との間の関係である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の統計的尺度が、前記サンプル核酸の腫瘍分画と前記第１のシーケンシング反応のシーケンシング深度との間の関係である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の統計的尺度が、指定された検出確率で対象状態に特異的である、請求項１に記載の方法。
- 十分な量のサンプル核酸が利用可能ではない場合、前記サンプル核酸を再シーケンシングすることが、前記標的変異に関して無益であることを報告することを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル特異性を決定するために前記第１のシーケンシング反応を実行することが、
前記第１のシーケンシング反応から配列リードを得ることと、
前記配列リードを参照配列に位置合わせし、位置合わせ結果を得ることと、を含み、前記参照配列は、代表的なゲノム又はトランスクリプトームの一部を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプル核酸を再シーケンシングすることが、
前記第１のシーケンシング反応後に前記サンプル核酸の残余で前記第２のシーケンシング反応を実行することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第２のシーケンシング反応を実行するのに前記十分な量の前記サンプル核酸が利用可能であるかどうかを判定することが、
前記第２のリードカバレッジＲＣ２を、ＲＣ２／Ｖ２＝ＲＣ１／Ｖ１によって推定することであって、式中、ＲＣ１は、判定した前記第１のリードカバレッジであり、Ｖ１は、前記第１のシーケンシング反応で使用された前記サンプル核酸の体積であり、Ｖ２は、前記サンプル核酸の残余の体積である、ことと、
推定した前記ＲＣ２が前記閾値を超える場合、前記第２のシーケンシング反応を実行するのに前記十分な量の前記サンプル核酸が利用可能であると判定することと、を含む、請求項７に記載の方法。 - 前記第１のシーケンシング反応及び前記第２のシーケンシング反応が、次世代シーケンシングプロセスを利用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル核酸が、ライブラリ調製プロセスによって未処理サンプルから生成され、前記ライブラリ調製プロセスが、次世代シーケンシングプロセスに対応している、請求項９に記載の方法。
- 前記未処理サンプルが血漿を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記未処理サンプルが血清を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記第１のシーケンシング反応からの前記標的変異についての前記第１のリードカバレッジが前記閾値を超えるか、又は前記閾値未満であるかを判定することが、
前記第１のシーケンシング反応の結果に基づいて、前記第１の統計的尺度を決定することと、
決定した前記第１の統計的尺度がカットオフを超えない場合、前記第１のシーケンシング反応の結果に基づいて前記第１のリードカバレッジを決定することと、
決定した前記第１のリードカバレッジを前記閾値と比較することと、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 - 決定した前記第１の統計的尺度が、前記カットオフよりも低い第２のカットオフを超えない場合、前記標的変異の陰性所見を報告することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
- 決定した前記第１の統計的尺度が前記カットオフを超えない場合、かつ決定した前記第１のリードカバレッジが前記閾値を超える場合、前記標的変異の陰性所見を報告することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
- 決定した前記第１の統計的尺度が、前記カットオフを超える場合、前記標的変異の陽性所見を報告することを更に含む、請求項１４又は１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル核酸を再シーケンシングした後に、
更なる配列リードを得ることと、
前記更なる配列リードを参照配列に位置合わせし、更なる位置合わせ結果を得ることであって、前記参照配列は、代表的なゲノム又はトランスクリプトームの一部を含む、ことと、
前記更なる位置合わせ結果に基づいて、前記標的変異を有するように第２の統計的尺度を決定することと、
決定した前記第２の統計的尺度が、前記カットオフを超えない場合、前記標的変異の陰性所見を報告することと、
そうでなければ、前記標的変異の陽性所見を報告することと、を更に含む、請求項１３に記載の方法。 - 前記第２の統計的尺度が、前記第１のシーケンシング反応及び前記第２のシーケンシング反応からの前記配列リードの組み合わせに基づいている、請求項１７に記載の方法。
- 前記第２の統計的尺度が、前記第１の統計的尺度と前記第２のシーケンシング反応に基づく追加の統計的尺度との組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
- 前記第２の統計的尺度が、前記第１の統計的尺度と前記第２のシーケンシング反応に基づく追加の統計的尺度との組み合わせに基づくパラメータである、請求項１７に記載の方法。
- 前記サンプル核酸が、
宿主からの宿主核酸と、
ゲストからのゲスト核酸と、を含み、
前記ホスト及び前記ゲストが同じ種に由来する、請求項１３に記載の方法。 - 前記第１の統計的尺度が、対数尤度比であり、前記対数尤度比を決定することが、
前記第１のシーケンシング反応の結果に基づいて真陽性率を決定することであって、前記真陽性率が、前記ゲスト核酸中の前記標的変異を検出する頻度である、ことと、
前記第１のシーケンシング反応の結果に基づいて偽陽性率を決定することであって、前記偽陽性率が、前記宿主核酸中の前記標的変異を検出する頻度である、ことと、
前記真陽性率を前記偽陽性率で割って、前記尤度比を得ることと、
前記対数尤度比を得るために前記尤度比を対数変換することと、を含む、請求項２１に記載の方法。 - 前記真陽性率を決定すること、及び前記偽陽性率を決定することが、
前記標的変異で検出された核酸が、前記宿主核酸であるか又は前記ゲスト核酸であるかを、前記核酸の長さを核酸長の統計モデルと比較することによって推定することを含み、前記統計モデルが、前記サンプル核酸が由来する方法と同様に導出された生体サンプルから経験的に決定される、請求項２２に記載の方法。 - 前記宿主核酸及び前記ゲスト核酸が、前記宿主を循環するセルフリー核酸に由来する、請求項２１～２３のいずれかに記載の方法。
- 前記宿主が、母親であり、前記ゲストが、胎児であり、前記胎児の前記標的変異が、前記胎児の表現型又は胎児死亡の原因に対応する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的変異が、前記胎児の異数性症候群、微小欠失症候群、又は微小重複症候群に対応する、請求項２５に記載の方法。
- 前記宿主が患者であり、前記ゲストが腫瘍であり、前記腫瘍の前記標的変異は、癌の種類、ステージ、又は治療に対する感受性に対応する、請求項２１に記載の方法。
- 前記カットオフが、
前記サンプル中の前記ゲスト核酸も前記宿主核酸も前記標的変異を含まないと仮定して、前記ゲスト核酸の存在量のレベルが異なる前記サンプルに対応する複数の配列表現を計算的に生成することと、
シーケンシングが異なるリードカバレッジで実行されると仮定して、前記複数の配列表現から位置合わせ結果をシミュレートすることと、
シミュレートした前記位置合わせ結果に基づいて、存在量の前記レベルの各々及び前記リードカバレッジの各々で前記標的変異を有するように前記ゲストの前記第１の統計的尺度を決定することと、
かかる配列表現のプリセットされた割合以上は達成することができない前記第１の統計的尺度の値に、前記カットオフを設定することと、によって設定される、請求項２１に記載の方法。 - 前記プリセットされた割合が、０．１％、０．５％、１％、５％、又は１０％である、請求項２８に記載の方法。
- 前記閾値が、前記サンプル核酸中の前記ゲスト核酸が前記標的変異を含有することが既知であるか、又は含有すると仮定されるとき、また、前記サンプル核酸中の前記宿主核酸が前記標的変異を含有しないことが既知であるか、又は含有しないと仮定されるとき、決定した前記第１の統計的尺度がカットオフを超えることを可能にする最小リードカバレッジとして設定される、請求項２１に記載の方法。
- 前記閾値が、前記標的変異の複雑さ、及び前記サンプル核酸中の前記ゲスト核酸の存在量の関数である、請求項３０に記載の方法。
- 前記サンプル核酸中の前記ゲスト核酸の前記存在量が、
前記第１のシーケンシング反応の結果に基づいて、前記サンプル核酸中の前記核酸の長さ分布を得ることと、
得た前記長さ分布を核酸長の統計モデルと比較することによって前記存在量を推測することと、によって推定され、前記統計モデルが、前記サンプル核酸が由来する方法と同様に導出された生体サンプルから経験的に決定される、請求項３１に記載の方法。 - 前記関数が、
前記サンプル中の前記ゲスト核酸が前記標的変異を含む一方で、前記サンプル中の前記宿主核酸が前記標的変異を含有しないという仮定で、前記ゲスト核酸の存在量のレベルが異なる前記サンプルに対応する複数の配列表現を計算的に生成することと、
シーケンシングが異なるリードカバレッジで実行されると仮定して、前記複数の配列表現から位置合わせ結果をシミュレートすることと、
シミュレートした前記位置合わせ結果に基づいて、前記存在量のレベルの各々及び前記リードカバレッジの各々で前記標的変異を有するように前記ゲストの前記第１の統計的尺度を決定することと、
前記標的変異について、前記存在量のレベルの各々における前記閾値を、決定した前記第１の統計的尺度が前記カットオフを超えることを可能にする前記最小リードカバレッジに設定することと、によって得られる、請求項３１に記載の方法。 - サンプル核酸を処理して標的変異を特定するシステムであって、
前記サンプル核酸をシーケンシングするように構成されたシーケンサと、
請求項１～３３のいずれかに記載の方法を実行するように前記シーケンサを制御するように構成されたプロセッサと、
前記プロセッサと動作可能に接続されたメモリと、を備える、システム。
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