JP2023551771A - 免疫調節剤を用いて免疫療法に対するがんの感受性を高める方法 - Google Patents

Abstract

記載される本発明は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）および他のがん中での免疫細胞ランドスケープを変更する、腫瘍内在化アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｉＲＧＤ）ペプチドの新たに発見された能力に関する。ｉＲＧＤペプチドは、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の免疫チェックポイント阻害剤に対するがんの感受性を高めて、腫瘍内のＴｒｅｇを特異的に枯渇させ、その結果、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）の拡大となる。これは、好ましくは化学療法および免疫療法と相乗的に組み合わせて、ＰＤＡＣなどのがんを治療する方法を提供し、腫瘍量の減少および生存期間の延長につながる。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１日に出願の米国仮出願第６３／１１９，９６３号の利益を主張する。この出願の全内容は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

政府の資金援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１６７１７４の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

１．技術分野
本発明は、医学および腫瘍学の分野に関する。特に、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドを含む免疫調節化合物の組み合わせを使用して特定のがんを治療するための方法を提供する。

２．発明の背景
がんは、世界において、主要な死因の１つである。近年の科学の進歩にもかかわらず、がん免疫療法が疾患の進行および全生存に与える影響は、黒色腫および非小細胞肺がんなどの特定のがんに限定されている。したがって、残念なことに、がん免疫療法は、膵がんなど大多数のがんにおいて応答を誘発することができない。膵がんと診断された患者の約９２％は、診断から５年以内に死亡する。膵管腺がん（ＰＤＡＣ）などのがんは、すべて形態の化学療法および免疫療法に対してほぼ完全に難治性である。多数の制御性Ｔ細胞が存在することを特徴とする高免疫抑制性の腫瘍微小環境では、免疫療法に対する耐性が駆動され得る。したがって、腫瘍微小環境を変化させて様々ながんに対する免疫療法を向上させるための治療剤が必要とされている。

免疫チェックポイントは、免疫系の正常部分であり、体内の健康な細胞を破壊するほど強くならないようにするために、免疫応答を調節するように働く。これらの免疫チェックポイントは、Ｔ細胞の表面にある免疫チェックポイントタンパク質が、他の細胞上のパートナータンパク質を認識して結合したときに係合することができ、これにより、Ｔ細胞に「オフ」シグナルがもたらされる。他の細胞が腫瘍細胞である場合、この免疫応答を阻害することで、免疫系が腫瘍を破壊しないようにすることができる。

「免疫チェックポイント阻害剤」と呼ばれる免疫療法薬は、チェックポイントタンパク質が腫瘍上のパートナータンパク質と結合するのを遮断することによって働く。これにより、「オフ」シグナルが送られるのを防ぎ、Ｔ細胞ががん細胞を死滅させ得る。免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４と呼ばれるチェックポイントタンパク質、またはＰＤ－１と呼ばれるチェックポイントタンパク質、またはそのパートナータンパク質であるＰＤ－Ｌ１に対して作用可能である。一部の腫瘍では、大量のＰＤ－Ｌ１が産生されることによって、Ｔ細胞応答が低下する。

免疫チェックポイントにより治療された多くの患者は、腫瘍の退縮または長期にわたる安定した疾患を明らかに示し、いくつかの顕著な応答が観察されている。しかし、全体として、応答する患者の割合は限られており、かなりの数の患者が副作用を経験している。したがって、免疫調節療法にプラスに反応する患者の数を改善すること、患者が免疫チェックポイント阻害剤療法に反応する可能性を高める方法を提供すること、またはこれらの治療法に対する応答の欠如を回避するかもしくは克服することができるようになることは、非常に有益であろう。

多くの形態のがんを効果的に治療する免疫療法が奏功しない、および多くの患者が免疫チェックポイント阻害剤に応答しないことにより、免疫療法または免疫調節療法によりがんを治療する方法が当技術分野において非常に必要とされている。

がん免疫療法は、大部分の腫瘍において有効でないが、これは、免疫抑制性腫瘍微小環境が抗腫瘍適応Ｔ細胞の浸潤およびエフェクター機能を妨げるためである。本出願は、腫瘍内在化ＲＧＤペプチド（ｉＲＧＤ）の、免疫療法および化学療法のいずれかまたは両方に対して多種多様な難治性がんの感受性を高める免疫調節能力について記載している。したがって、この技術は、既存のがん免疫療法の有効性を大きく向上させ、腫瘍耐性を防ぐ可能性を有する。これまで、以前の研究からは、ｉＲＧＤ自体が免疫調節性であることは認識されていなかった。

ｉＲＧＤペプチドは、腫瘍特異的方法で免疫抑制性制御性Ｔ細胞を標的とし、枯渇させることができる。腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）などの免疫療法難治性腫瘍中に豊富にあり、免疫抑制性腫瘍微小環境に寄与している。Ｔｒｅｇの全身的な枯渇を引き起こす治療は、非特異的根絶後の炎症性、自己免疫性の副作用のために望ましくない。したがって、ｉＲＧＤ受容体は、腫瘍中にのみ存在するため、これらの受容体を特異的に標的とするペプチドを使用することにより、腫瘍内でのエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の拡大が可能になり、全身の制御性Ｔ細胞の枯渇から生じる自己免疫毒性を防ぐ。

９アミノ酸環状ペプチドであるｉＲＧＤは、αｖインテグリンに結合することにより、連結している薬物／タンパク質の腫瘍特異的細胞および組織への浸透が促進される。ｉＲＧＤ療法では、化学療法と免疫チェックポイント遮断の両方に対するＰＤＡＣ腫瘍の感受性を高め、その結果、動物モデルにおいて、腫瘍量の大幅な減少、および生存期間の延長がもたらされる。特に、この技術は、複数の腫瘍タイプにおいて腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞中のｉＲＧＤ受容体を豊富にするため、他の腹膜腫瘍中でも利用され得る。そのため、ｉＲＧＤペプチドは、いくつかの免疫療法難治性がんにおいて、患者の転帰および全生存期間を大幅に改善し得る。さらに、この治療剤は、既存のがん治療薬と相乗効果を発揮し、これにより、膵がんの動物モデルにおける腫瘍量の減少および生存率の改善につながる。

一実施形態によれば、ｉＲＧＤペプチド、またはそのペプチドバリアント、またはｉＲＧＤコンジュゲートを１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて対象に投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態では、ｉＲＧＤペプチドは、配列番号３で定義される配列を含む。さらなる特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ２阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、２つ、３つ、または４つの免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。免疫チェックポイント阻害剤の例としては、イピリムマブ、トレミリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ）、ピジリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、手術、放射線療法、追加の免疫療法、および化学療法からなる群から選択される補助がん療法を対象に施すことをさらに含んでもよい。本明細書に記載の方法の実施形態は、以下でさらに論じるとおり、多種多様ながんを治療することができる。

ゲムシタビン（ＧＥＭ）で治療されたデノボ膵管腺がん（ＰＤＡＣ）担持トランスジェニックＫｒａｓ－ＬＳＬ^ＧＤ１２、ｐ５３－ＬＳＬ^１７２Ｈ、Ｐｄｘ－１－ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウスの生存率を示すグラフである。 図１Ａのマウスから収集した腫瘍の一連の写真であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞について染色している。 無作為に選択した視野を使用して、顕微鏡下で細胞をカウントし、その結果を示している。 ３匹の最も長命のＫＰＣマウスおよび４匹の最も短命のＫＰＣマウスのＰＤＡＣ中のＣＤ８^＋Ｔ細胞を分析した。スケールバー、１００μｍ；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。 精巧な折り畳みおよび管腔（矢印）を有するＫＰＣオルガノイドを示す１組の写真である。 フローサイトメトリーによって分析したルシフェラーゼ陽性ＫＰＣ（ＫＰＣ－ｌｕｃ）オルガノイドにおけるＰＤ－Ｌ１発現に関するデータを示す一連のグラフである。 Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウスにおける同所性ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍の縦発光イメージングの一連の写真である。 ＫＰＣ－ｌｕｃ ＰＤＡＣおよび肝臓および肺転移の一連の画像を示す。原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー：１００μｍ。 正常マウス（ＮＭ）およびＫＰＣ－ｌｕｃマウス（ＰＤＡＣ Ｍ）のＰＤＡＣおよび脾臓（Ｓｐｌ）中のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ（図２Ｅ）、ＮＰＲ－１^＋Ｔｒｅｇ（図２Ｆ）、およびαｖβ３^＋およびαｖβ５^＋Ｔｒｅｇ（図２Ｇ）のフローサイトメトリーの結果を示す。 静脈内注射されたＦＡＭ－ｉＲＧＤ（緑色）がＫＰＣ－ｌｕｃ ＰＤＡＣ中のＣＤ４^＋（マゼンタ）Ｆｏｘｐ３^＋（赤色）Ｔｒｅｇ（白矢印）を標的とすることを示す画像である。一部のｉＲＧＤ標的Ｆｏｘｐ３^＋細胞は、ＣＤ４^ｎｅｇであった（黒矢印）。青＝ＤＡＰＩ。スケールバー：５０μｍ。 単独でまたはＫＰＣ－ｌｕｃ細胞と共に培養した正常マウス脾臓Ｔｒｅｇ中でのαｖβ５およびＮＲＰ－１の発現を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を含むまたは含まないＩＶ ｉＲＧＤ＋ＧＥＭで週３回、２週間治療した同所性ＫＰＣ－ｌｕｃマウスのデータを示す。これらの結果は、ｉＲＧＤ＋ＧＥＭ＋抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ治療後、ｉＲＧＤ＋ＧＥＭが、ＰＤＡＣおよび脾臓中での抗ＰＤ－Ｌ１療法（図２Ｊ）、ＮＲＰ－１^＋αｖβ３インテグリン^＋総Ｔｒｅｇ（図２Ｋ）、およびＣＤ２５^ｈｉｇｈＴｒｅｇ（図２Ｌ、挿入図）ＣＤ８＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合（図２Ｍ）を有意に向上させたことを示す。統計、分散分析；ｎｓ、有意でない；＊＊＊、ｐ＜０．００１。 ヒトＰＤＡＣ Ｔｒｅｇ中でのαｖインテグリンおよびＮＲＰ－１の発現に関する。図３Ａは、ＰＤＡＣ患者からの腫瘍（青）および脾臓（赤）サンプルから単離されたＴｒｅｇ中でのαｖβ５インテグリンの発現を示す。緑は、アイソタイプ対照である。図３Ｂは、ヒトＰＤＡＣ中でのＣＤ３^＋（赤）Ｆｏｘｐ３^＋（マゼンタ）Ｔ細胞中のαｖβ５インテグリン（緑）（白矢印）およびＣＤ３^＋Ｔ細胞中のＮＲＰ－１（緑）（黄矢印）を示す一組の画像である。Ｆｏｘｐ３は、ＮＲＰ－１染色との不適合性のため、右パネルでは染色されなかった。他の色をより良く可視化するために、ＤＡＰＩは、示していない。スケールバー：２０μｍ。 ＩＤ８マウス卵巣がん細胞で生成されたマウスの腹膜腫瘍（ＰＴ）中でのＴ細胞を示す一連のグラフである：図４Ａ、ＣＤ８^＋（４％）およびＣＤ４^＋（１７％）Ｔ細胞；図４Ｂ、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ（３２％）およびＣＤ２５^ｌｏｗ（５８％）Ｔｒｅｇ；図４Ｃ，αｖβ３^＋ＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇ（６３％）；図４Ｄ，αｖβ５^＋ＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇ（２６％）。ＰＴが小さかったため、Ｔ細胞の数は少なかった。 ＫＰＣ由来同系腫瘍マウス（Ｔ Ｍ）の同所性ＰＤＡＣ（Ｔ）および脾臓（Ｓ）、ならびに正常マウス（Ｎ Ｍ）の脾臓から単離されたＴｒｅｇおよびＣＴＬ上でのαｖβ５インテグリンの発現を示す。これらは、フローサイトメトリーにより分析した。ｐ＊＊＜０．０１。 ＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下または非存在下でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存を示す。マウス由来の脾臓Ｔ細胞をＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下で培養し、αｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇを拡大させた。生存は、血球計を使用して細胞数をカウントすることによって決定した。＊，ｐ＜０．０１。 ＫＰＣ由来ＰＤＡＣから単離されたＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ２５^ｎｅｇＣＤ４^＋Ｔ細胞（非Ｔｒｅｇ）へのｉＲＧＤの結合を示す。Ｔ細胞を、フルオレセイン（ＦＡＭ）標識ｉＲＧＤの存在下、３７℃で１時間培養した。ｉＲＧＤ結合は、フローサイトメトリーによって決定した。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ２５^ｎｅｇＣＤ４^＋Ｔ細胞（非Ｔｒｅｇ）へのｉＲＧＤ結合を示す。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよびＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下でマウス脾臓Ｔ細胞を培養することにより、Ｔｒｅｇおよび非Ｔｒｅｇを産生した。図８Ａは、ＴｒｅｇへのＦＡＭ－ｉＲＧＤの結合がフローサイトメトリーによって決定されたことを示す。図８Ｂは、抗αｖβ５インテグリンＡｂが、ＴｒｅｇへのＦＡＭ－ｉＲＧＤの結合を阻害したことを示す。 ＰＤＡＣ組織および脾臓中でのＴｒｅｇおよびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比に対するｉＲＧＤ単独療法の効果を示す。同所性ＰＤＡＣ担持マウスを、全身性ｉＲＧＤまたはＰＢＳにより２週間治療した。図９Ａは、ＰＤＡＣ組織中でのＴｒｅｇの割合の時間依存的変化を示し、図９Ｂは、ＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比の経時変化を示す。 ｉＲＧＤ単独療法後のＰＤＡＣ中でのαｖβ５インテグリン^＋（図１０Ａ）およびＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇ（図１０Ｂ）を示す。 脾臓中でのＴｒｅｇの割合（図１１Ａ）およびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比（図１１Ｂ）の経時変化を示す。＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意でない。 ＫＰＣ由来ＰＤＡＣマウスを、ｉＲＧＤ±抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（Ａ；ｎ＝４～６）またはｉＲＧＤ＋Ｇｅｍ±抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（Ｂ；ｎ＝４）で週３回、２週間治療した。図１２Ｂには、ｉＲＧＤ＋Ｇｅｍ＋抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ療法後の腫瘍および脾臓中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＴｒｅｇおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーデータに示す。ＰＤＡＣ中ではＴｒｅｇは半減し、ＣＴＬは２倍になったが、脾臓ではそうならなかった。ｎｓ、有意でない。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。

１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の様々な方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、好適な方法および材料について以下に記載する。しかし、当業者であれば、使用され、記載された方法および材料は例であり、本発明での使用に好適である唯一のものではない可能性があることを理解する。さらに、測定値は固有の変動の影響を受けるため、温度、重量、体積、時間間隔、ｐＨ、塩分濃度、容量モル濃度または質量モル濃度、範囲、濃度、および本明細書に記載されている任意の他の測定値、量、または数値表現は、概算であることを意図しており、反対のことが明確に述べられていない限り、正確ではないか、または重要な数値ではない。

本明細書で使用される用語「約」は、列挙されている値のプラスまたはマイナス２０パーセントを意味し、例えば、「約０．１２５」は、０．１２５±０．０２５を意味し、「約１．０」は、１．０±０．２を意味する。

本明細書で使用される用語「ｉＲＧＤ」または「ｉＲＧＤペプチド」は、配列（配列：ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ；配列番号２）またはそのバリアントを有する９アミノ酸環状ペプチドを指す。特定の具体例では、ｉＲＧＤのバリアントには、以下のＣＲＧＤ（Ｒ／Ｋ／Ｈ）Ｇ（Ｐ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ／Ｈ）Ｃ（配列番号３）が含まれ、ここで括弧は、その位置におけるアミノ酸の選択肢を示す。他のｉＲＧＤバリアントは、米国特許第２００９０２４６１３３号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。ｉＲＧＤ、ｉＲＧＤペプチドまたはペプチドへの言及は、別段の記載がない限り、ペプチドバリアントを含む。

本明細書で使用する用語「治療」、「治療すること」などは、化合物（複数可）または組成物（複数可）を投与することによって所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。「治療」としては、対象における状態または疾患（またはその症状）の発生を予防すること、部分的に予防すること、反転させること、緩和すること、可能性を低下させること、または阻害することが挙げられる。対象には、腫瘍もしくは癌、前癌と診断された者、または状態もしくは疾患に罹患しやすいが、まだそれを有すると診断されていない者を含み得る。（ｂ）状態または疾患またはその症状を阻害すること、例えば、その発症を阻止すること；および（ｃ）状態または疾患またはその症状を和らげること、緩和すること、または改善すること、例えば、状態または疾患またはその症状の退行を引き起こすこと。治療には、１つ以上の剤を投与すること、手術もしくは放射線の適用などの処置を実施すること、またはその両方が含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語およびその同族語は、剤を対象に導入することを指し、当業者に公知であるとおり、剤または医薬組成物を投与するための様々な方法または送達システムのいずれか、ならびに組成物および対象に好適である任意の経路を使用して実施することができる。投与様式としては、これらに限定されないが、経口投与、静脈内、皮下、筋肉内、もしくは腹腔内注射、または標的組織（膵臓、脳、または腫瘍など）内への直接、または標的組織上への局所投与が挙げられる。薬物または組成物の治療有効量を、標的とする細胞または組織に送達する任意の経路または方法による投与が、本発明での使用に好適である。

本明細書で使用される用語「組み合わせ」は、対象への複数の活性剤の投与、すなわち組み合わせ療法に関して、同時または異なる時点で投与することを指す。１つ以上の剤は、それぞれ１つの活性剤を含む２つまたはいくつかの医薬組成物中で、またはそれぞれが１つ以上の活性剤（複数可）を含む医薬組成物を使用して、送達することができる。異なる医薬組成物は、同じまたは異なる投与経路用に製剤化できる。別の個々の医薬組成物の投与は、同時に、素早く連続して、または分、時間、日、または週ごとに時間を隔てて行うことができる。免疫チェックポイント阻害剤とｉＲＧＤによる組み合わせ治療は、免疫チェックポイント阻害剤と補体阻害剤が同じ医療専門家によって、またはその指示の下でがんに罹患している対象に処方される場合または投与される場合であると推定され得る。組み合わせ医薬組成物は、複数の活性剤および薬学的に許容される担体を含む。

本明細書で使用される「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト哺乳動物を指すために交換可能に使用され、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技用動物、哺乳動物の伴侶動物、サル、非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、ウマ科、げっ歯類、ウサギ目、ウシ科、ブタ科、ヒツジ科、ヤギ科を含むことができる。本発明にとって好適な対象は、好ましくは、過剰増殖性疾患を有する疑いがあるか、有すると診断されているか、またはそれを発症するリスクがあるヒトである。適切な対象または患者を定義する、本発明による治療に適応する状態は、本明細書の開示に基づいて当業者によって容易に識別される。「必要とする対象」とは、がんを発症するリスクがある対象、またはがんの何らかの特徴もしくは症状を示す対象、またはがんと診断された対象である。

本明細書で使用される「がん」という用語は、腫瘍または悪性腫瘍とも呼ばれ、局所的に侵入するおよび／または身体の他の部分に広がる（転移する）可能性を有する異常な細胞増殖（過剰増殖）を伴う一群の疾患のいずれかを指す。「がん」という用語は、一般に、本明細書では「腫瘍」と交換可能に使用され（腫瘍が、隣接する組織に侵入する能力または転移する能力を持たない細胞の異常な塊である「良性」腫瘍と具体的に呼ばれない限り）、悪性固形腫瘍（例えば、癌腫、肉腫）および検出可能な固形腫瘍塊がない可能性がある悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）（例えば、特定の造血器悪性腫瘍）を包含する。特に、免疫チェックポイント阻害剤に対して感受性のあるがんは、本発明による方法による使用が企図されるが、免疫チェックポイント阻害剤耐性がんも本発明の実施形態に従って治療することができる。「がん」という用語は、原発性または転移性腫瘍を指すことができ、切除不能ながんであるがん、およびステージＩＩＩがんおよび／またはステージＩＶがんを含む任意の段階のがんを含む。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリンを指し、完全サイズの抗体および抗原結合部位を含む抗体フラグメントを包含する。本発明の特定の実施形態において有用な抗体は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、または鳥（例えば、ニワトリ）起源であり得るか、またはこれら由来であり得、様々な抗体アイソタイプ、例えば、以下の哺乳動物アイソタイプのいずれかであり得る：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのもの）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、または哺乳動物中には見られないアイソタイプ、例えば、ＩｇＹ（鳥に見られる）またはＩｇＷ（サメに見られる）。

抗体フラグメント（Ｆａｂ）は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、または抗原結合部位を保持または含有する他のフラグメントであり得る。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０－７６５，２００２を参照されたい。また抗体フラグメントに関する開示については上記文献中の参考文献を参照のこと。この参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ダイアボディ、ミニボディ、またはナノボディとして当技術分野で知られている抗体を、様々な実施形態で使用することができる。様々な実施形態において、二重特異性または多重特異性抗体を使用することができる。ＩｇＧ免疫グロブリン（例えば、げっ歯類またはヒトＩｇＧ）の重鎖および軽鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）を含む。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、特に重鎖ＣＤＲ３は、抗体の特異性に大きく関与している。

抗体は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）もしくは非ヒト霊長類起源などの非ヒト起源の可変ドメインがヒト起源の定常ドメインに融合されているキメラ抗体、または抗原結合部位を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸の一部またはすべてが（時には、１つ以上のフレームワークアミノ酸または領域と共に）げっ歯類抗体（例えば、マウス抗体）またはファージディスプレイ抗体からヒト抗体に「グラフト移植」されている「ヒト化」抗体であり得、これにより、げっ歯類またはファージディスプレイ抗体の特異性が保持される。したがって、ヒト化抗体は、抗体相補性決定領域のみが非ヒト起源である組換えタンパク質であり得る。ヒト化プロセスに関与する抗体配列の改変は、一般に、核酸レベルでの技術、例えば標準組換え核酸技術によって行われる。いくつかの実施形態では、特異性決定残基（ＳＤＲ）、すなわち抗体－リガンド相互作用において最も重要なＣＤＲ残基のみがグラフト移植される。ＳＤＲは、例えば、既知の構造の抗原－抗体複合体の三次元構造のデータベースの使用を通じて、または抗体結合部位の突然変異分析によって同定され得る。いくつかの実施形態では、より多くのＣＤＲ残基の保持、すなわち、すべてのＳＤＲを含むＣＤＲ残基のストレッチである、いわゆる「短縮型（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）」ＣＤＲのグラフト移植を含むアプローチが使用される。ＳＤＲグラフト移植の考察については、例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ Ｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６（１）：２５－３４（２００５）、およびヒト化抗体を得るための様々な方法の概説については、Ａｌｍａｇｒｏ Ｊ Ｃ，Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－３３（２００８）を参照されたい。これらの参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。「起源または由来」は、抗体配列またはその一部を特定する遺伝情報の元の供給源を指し、これは、抗体が最初に合成される種とは異なる場合がある。例えば、「ヒト」ドメインは、そのゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を組み込んでいるげっ歯類（例えば、マウス）において生成され得るか、またはファージディスプレイを使用して生成され得る。例えば、完全ヒト抗体を生成するために使用され得る方法の考察については、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５－５３９を参照されたい。この参考文献は、参照により組み込まれる。

そのような抗体の可変領域のアミノ酸配列は、特定の種（例えば、ヒト）の可変ドメイン（Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメイン）をコードする生殖系列配列に由来し、関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてその種の抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在しない可能性がある配列である。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のトランスジェニック動物が使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）を受けている可能性を有し得る。本発明での使用に好適である抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、本発明の目的のためには、モノクローナル抗体が一般に治療剤として好ましい。抗体は、グリコシル化または非グリコシル化させ得る。

事実上任意の目的の分子に特異的に結合する抗体を生成するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、天然源から、（例えば、分子またはその抗原性フラグメントによる免疫後）例えば、抗体を産生する動物の血液または腹水から精製することができるか、または細胞培養で組換えにより産生して、例えば培養培地から精製することができる。アフィニティー精製、例えば、プロテインＡ／Ｇアフィニティー精製および／または抗原をアフィニティー試薬として使用するアフィニティー精製を使用することができる。

ファージディスプレイおよび関連技術を使用して、好適な抗体を同定することができる。さらなる情報については、例えば、Ｋａｓｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．，「Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」およびＳｉｄｈｕ，Ｓ．，「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２００５を参照されたい。この参考文献は、参照により組み込まれる。

抗体フラグメントを生成するための方法は周知である。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、例えば、ＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅＦ（ａｂ’）_２Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））の使用により生成され得、ここでは、固定化ペプシンを使用して抗体を消化させ、固定化プロテインＡカラムにより精製する。消化条件（温度および持続時間など）は、Ｆ（ａｂ’）_２の良好な収量を得るように、当業者によって最適化され得る。消化の結果生じるＦ（ａｂ’）_２の収量は、標準的なタンパク質ゲル電気泳動によってモニターされ得る。Ｆ（ａｂ’）は、抗体のパパイン消化によって、またはＦ（ａｂ’）_２のＳ－Ｓ結合を還元することによって得ることができる。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。典型的には、ｓｃＦｖ抗体は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むが、特定の実施形態ではドメインを接続させるように他のリンカーを使用することができる。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。具体的には、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団の全ての分子内で同一である。

本明細書で使用される「免疫系細胞」という用語は、免疫応答において任意の役割を担う様々な細胞のうちのいずれかを指す。免疫系細胞としては、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および好中球が挙げられる。Ｔ細胞は、免疫応答において様々な役割を担う様々な機能クラスを複数含む。異なる機能クラスは、細胞表面マーカーおよび他の特性に基づいて区別され得る。ほとんどのＴ細胞は、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、これを介して細胞は、適切な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との関連で特定の抗原を認識することができるが、マイナーなサブセットは、これにより、γδＴＣＲを発現する。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、典型的には、細胞表面マーカーＣＤ８に対して陽性であり、抗原特異的Ｔ細胞の活性化および／または応答中に、標的細胞の表面上にあるＭＨＣクラスＩ分子を認識する際にＴＣＲの共受容体として機能する。ＣＴＬ細胞およびＮＫ細胞は、細胞傷害性物質の放出などの様々な機序を介して、感染した宿主細胞および腫瘍細胞を排除することによって重要な役割を担う。

ヘルパーＴ細胞は、典型的には、細胞表面マーカーＣＤ４に対して陽性であり、抗原特異的Ｔ細胞の活性化中に、ＡＰＣの表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子を認識する際にＴＣＲの共受容体として機能する。ヘルパーＴ細胞は、とりわけ、生存、増殖、および／または分化の向上など、様々な効果を有するサイトカインを放出することによって、他の免疫系細胞の活性を促進する（すなわち、「助け」を提供する）。

ナチュラルキラー細胞は、ＭＨＣとの関連で抗原の提示による抗原特異的活性化を必要とせずに、がん性細胞、ストレス細胞、または感染細胞を認識して死滅させる（例えば、溶解またはアポトーシスを引き起こすことによって）能力を有する。代わりに、それらの活性化は、活性化受容体と阻害性受容体およびサイトカインの活性のバランスによって調節される。ＮＫ細胞は、典型的には、特定の抗原に対して高度に特異的であり、抗原に事前にさらされることなく迅速に反応することができる細胞表面受容体を含まない。

本明細書で使用される「エフェクター細胞」は、免疫応答において身体を防御する活性化された免疫系細胞を指す。エフェクターＴ細胞としては、細胞性応答を行う細胞障害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞が挙げられる。エフェクターＢ細胞は、形質細胞と呼ばれ、抗体を分泌する。エフェクター細胞には、エフェクターＮＫ細胞も含まれる。

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と関連して抗原をプロセシングすることおよび表示することができる細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、これらの複合体を認識できる。ＡＰＣは、ナイーブＴ細胞の活性化に必要な他の分子（共刺激タンパク質）を提示することもできる。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞が含まれ、プロフェッショナルＡＰＣと呼ばれることもある。

樹状細胞（ＤＣ）は、身体のほとんどの組織、特に上皮組織内で発生する白血球である。ＤＣは、末梢組織とリンパ器官との間の連係として機能する。未熟ＤＣは、周囲環境をサンプリングし、病原体成分または腫瘍抗原などの抗原性物質を取り込む。これらは成熟を経てリンパ節または脾臓に移動し、そこでＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）複合体を使用して、プロセシングされた抗原のフラグメントを細胞表面に提示する。成熟プロセスの一部として、ＤＣは、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、および／またはＣＤ４０などのＴ細胞活性化において共刺激因子として作用する細胞表面分子をアップレギュレートする。ＤＣは、ヘルパーＴ細胞を、ＭＨＣＩＩ複合体との関連で非抗原特異的共刺激因子と共に抗原を提示することによって活性化する。ＤＣおよび他の様々なＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）－ペプチド複合体（交差提示）および共刺激物質の提示により、細胞傷害性Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化する能力を有する。

本明細書で使用される用語「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、サプレッサーＴ細胞）」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を排除するＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を指す。これらの細胞は、一般にエフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制またはダウンレギュレートし、かつＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７^ｌｏの細胞表面マーカー発現パターンに基づいて同定することができる。Ｔｒｅｇは、ＣＴＬＡ４およびＧＩＴＲの発現も特徴とする。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性サイトカインを分泌するおよび細胞間接触を介するなど、様々な機序によって、他の免疫系細胞サブセットの活性を抑制することができる。それらは、例えば、活性化の誘導時（例えば、Ｔ細胞を刺激するＡＰＣの能力を阻害することによる）およびエフェクター期間など、複数のステップにおいて、免疫応答を阻害することができる。Ｔｒｅｇは、多くの場合腫瘍中で発見され、Ｔｒｅｇ数の増加は、様々な種類のがんにおける予後不良と関連する。本明細書においてＴｒｅｇであるＴ細胞を指すことを意図する場合、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇであることを明らかにする。したがって、明示的に示されない限り、本明細書で使用されるＴ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞ではない。

本明細書で使用される場合、「補助がん療法」という用語は、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、およびレーザー療法などの、免疫チェックポイント阻害剤と任意に組み合わせたｉＲＧＤの投与と併せて投与された場合に、有益な効果をもたらすことができる治療法を指す。「抗がん剤」という用語は、対象に対する従来の化学療法、分子標的抗がん剤、がんワクチン、第２の免疫刺激剤、細胞ベースの免疫療法、またはそれらの組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「補助がん治療剤」は、正常細胞と比較してがん細胞に対して選択的に細胞傷害性または細胞増殖抑制効果を有する剤、化合物、または組成物を指す。補助がん治療剤は、ｉＲＧＤおよび／または免疫チェックポイント阻害剤と同時投与することができる。選択された補助がん治療剤の例の非限定的なリストを以下の表１に提供する。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、約１００アミノ酸以下の２つ以上のアミノ酸の配列である。特定のペプチドの「バリアント」は、元のペプチド配列に対して１つ以上の改変（付加、置換、および／または欠失、これらは、例えば、「突然変異」と総称され得る）を有する。したがって、バリアントは、そのバリアントの元のペプチドよりも短くても長くてもよい。置換がペプチド中で行われる場合、保存的置換が好ましい。保存的置換は、アスパラギン酸をグルタミン酸に、グリシンをアラニンなどのように、アミノ酸を同じタイプの異なるアミノ酸に置換するものである。当業者は、そのような置換について認識している。

「バリアント」という用語には、「フラグメント」も包含する。「フラグメント」は、元のペプチドよりも短いポリペプチドの連続部分である。本発明の特定の実施形態では、バリアントペプチドは、ペプチドの長さの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上を含むバリアントの連続部分において、元のポリペプチドに対して有意な配列同一性を有する。ペプチドは、非伝統的アミノ酸もしくはＤ－アミノ酸など、またはＣ末端アミドなどの末端付加もしくは修飾などを含むことができる。アミノ酸の「差」とは、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を指す。特定の実施形態では、ペプチドバリアントは、ペプチドのペプチドミメティックまたはペプチド模倣物も包含する。

本明細書で使用される「ペプチドミメティック」という用語は、構造的にベースとなるペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。このようなペプチドミメティックには、化学的に修飾されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド様分子、およびペプトイドが含まれ、ペプチドミメティックが由来するような活性を有する（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｖｏｌ．１（ｅｄ．Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９５），８０３－８６１ページを参照されたい）。

本明細書で使用される「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、免疫チェックポイント経路において機能するタンパク質または受容体を指す。免疫チェックポイントタンパク質の例には、免疫チェックポイント経路が開始される阻害性受容体、およびそれらのリガンドが含まれる。免疫チェックポイント経路の例には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）経路およびプログラム細胞死１（ＰＤ１）経路が含まれ、これらの両方について以下でさらに説明する。「免疫チェックポイント分子」という用語は、免疫チェックポイントタンパク質、ならびに免疫チェックポイント経路において任意の役割を担うアデノシンなどの低分子を包含する。

本明細書で使用する場合、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、以下に記載のＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイント分子の活性を遮断または低下させることにより、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃する剤のクラスを指す。

本明細書で使用される場合、活性剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤またはｉＲＧＤペプチドの「有効量」という用語は、例えば、活性剤（または組成物）が投与される対象において、目的の１つ以上の生物学的効果を誘発するのに十分な活性剤の量を指す。いくつかの実施形態では、活性剤の生物学的効果は、第２の剤の有効性を向上させることである。

当業者には理解されるであろうとおり、有効な特定の剤の絶対量は、生物学的エンドポイント、特定の活性剤、標的組織などの要因に応じて変動し得る。剤または組成物の有効量は、一般に、がん患者において以下のうちの１つ以上を達成するのに十分な量である：完全奏効（寛解）、部分奏効、客観的基準によって決定される安定した疾患の達成、症状の改善、無増悪生存期間の延長、または全生存期間の延長。有効量は、腫瘍細胞を直接的または間接的に死滅させるか、または腫瘍細胞の成長を停止させる量であり得る。当業者であれば、「有効量」が単回用量で投与され得るか、または一定期間にわたる複数用量の投与によって達成され得ることをさらに理解するであろう。有効量の１つ以上の剤を含有する医薬組成物の有効量は、組成物全体が有効となるような各剤の量である。

いくつかの実施形態では、剤または組成物の有効量は、感染症に罹患している対象において、病原体の複製を抑制（例えば、排除）する、対象が感染性因子を有しないようにする、対象を非感染性にする、感染症の症状の改善をもたらす、感染による死亡率を低下させる、および／または全生存期間を延長する量であり得る。

２．概要
本発明は、ｉＲＧＤ腫瘍透過性ペプチドが、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて腫瘍の治療に使用できるようにする免疫調節効果を有するという発見に基づいている。本明細書に提示されたデータは、ｉＲＧＤが免疫チェックポイント阻害剤と同時投与されたときに、がん化学療法剤に対する相乗効果を増強させることを示している。この技術は、ｉＲＧＤ（および同時投与される薬物）が、腹腔内に投与されたときに、様々な腹膜腫瘍を標的とすることから、腹腔内化学療法にも適用できる。これにより、卵巣がんなどの様々な腫瘍の腹膜転移の免疫療法に対する感受性を高める可能性があることが示されている（図４を参照）。

Ｔｒｅｇの非特異的根絶が、炎症性副作用を引き起こす可能性があるため、腫瘍特異的免疫療法の概念は、ますます重要になってきている。したがって、本発明により、特定の腫瘍特異的免疫療法が実施可能になる。ｉＲＧＤは、効果を発揮するために共投与される剤のいずれかとコンジュゲートさせる必要はない。この方法では、単純な同時投与による強化された免疫療法による免疫修飾が可能になる。とはいえ、ｉＲＧＤコンジュゲートを産生し、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用してもよい。ｉＲＧＤコンジュゲートの特定の例には、補助がん治療剤とコンジュゲートされたｉＲＧＤが含まれる。

３．結果のまとめ
ｉＲＧＤは、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）における免疫ランドスケープを調節し、免疫チェックポイント阻害剤（すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、および抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ）に対するがんの感受性を高め得る。

ｉＲＧＤは、腫瘍内のＴｒｅｇを特異的に枯渇させる。

ｉＲＧＤは、ＰＤＡＣにおける腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞）の拡大をもたらす。

ｉＲＧＤにより、化学療法および免疫療法との相乗効果が可能になり、ＰＤＡＣマウスモデルにおける腫瘍量の減少および生存期間の延長がもたらされる。

ｉＲＧＤは、抗がん薬物または免疫療法剤にコンジュゲートさせる必要はない。

ｉＲＧＤは、抗がん薬物または他の免疫療法剤との同時投与を介して免疫療法を強化する。

ｉＲＧＤは、腹腔内化学療法に適用することができる。

αｖインテグリンＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇは、複数のがんの腫瘍内で独占的に発現するため、ｉＲＧＤは、がん免疫療法の有効性を改善することができる。

４．本発明の実施形態
Ａ．免疫療法
免疫療法は、がんと闘う際に免疫系を補助する一種のがん治療である。この治療法は、従来のがん化学療法薬のようにがんを直接死滅させるのではなく、免疫系を刺激することで、がん細胞を見つけて攻撃する。ほとんどのがん免疫療法は、多くの場合、腫瘍細胞の表面に、抗体または修飾抗体などの免疫分子によって特異的に認識され、かつ標的化され得る特定の腫瘍抗原を有することを利用している。本発明による免疫療法

Ｂ．免疫チェックポイント
免疫系の重要な機能は、体内の正常細胞と「異物」と見なされる細胞とを区別する能力である。これにより、免疫系は、正常細胞のみ残して、異物細胞を攻撃することができる。これを行うために、「チェックポイント」を用いる。免疫チェックポイントは、免疫応答を開始するために活性化（または不活性化）する必要がある特定の免疫細胞上の分子である。要約すると、免疫チェックポイントは、免疫系が正常細胞を攻撃するのを防ぐ自己寛容にとって重要な免疫系調節因子である。しかし、一部の腫瘍は、免疫系を操作することによって、免疫系による攻撃から保護され得る。これらのチェックポイントを標的とする薬物は、がん治療として多くの見込みを有する。これらの薬物は、チェックポイント阻害剤と呼ばれる。

免疫チェックポイント分子は、刺激性（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＳ４０、ＧＩＴＲ、およびＣＤ１３７などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー）または阻害性（例えば、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、およびＳＩＧＬＥＣ７）であり得る。

ＰＤ－１は、Ｔ細胞上のチェックポイントタンパク質である。これは通常、一部の正常細胞およびがん細胞上に存在するリガンドに結合するときに、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃するのを防ぐのを助ける一種の「オフスイッチ」として機能する。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合したときに、Ｔ細胞が他の細胞を攻撃しないようにメッセージを送る。一部のがん細胞は、免疫攻撃から隠れるのを助けるＰＤ－Ｌ１を大量に有する。例えば、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合することにより、Ｔ細胞が体内の腫瘍細胞を死滅させないようにする。この結合を免疫チェックポイント阻害剤により遮断することで、エフェクターＴ細胞が腫瘍細胞を攻撃して殺すことができる。

Ｃ．免疫チェックポイント阻害剤
免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性チェックポイントタンパク質を遮断することなどにより、免疫系の阻害を阻害または遮断する分子（薬物）である。チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ４、および／またはＰＤ－１、および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２が挙げられる。ペムブロリズマブ（ランブロリズム；キイトルーダ）、ニボルマブ（オプジーボ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（Ｂｅｖａｎｃｉｏ）、セミプリマブ（リブタヨ）、およびデュマルマブ（イミフィニジ）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を阻害するＦＤＡ承認薬であり、本発明で使用するように企図されている。追加の免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤との相乗効果は、前述の免疫チェックポイント阻害剤のいずれか、または前述の阻害性チェックポイントタンパク質または解明すべき他の阻害性チェックポイントタンパク質を標的とする新たに開発された免疫チェックポイント阻害剤に適用されるものとする。（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＪＣＩ １３０：１４０５－１４１６，２０２０を参照されたい）。

好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、アプタマー、非抗体操作結合タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、または阻害性免疫チェックポイント分子、例えばＣＴＬＡ４またはＰＤ１に結合する他の特異的結合剤を含む。

他のＰＤ１経路阻害剤としては、ＰＤ１の発現を阻害するＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドも含まれ得る。

好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかを標的としてこの結合を遮断し、がん細胞に対する免疫応答を強化するモノクローナル抗体である。ＰＤ－１を標的とし、拮抗または遮断する薬物の好ましい例としては、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）；ニボルマブ（オプジーボ）；およびセミプリマブ（リブタヨ）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とし、遮断または拮抗する薬物の好ましい例としては、アテゾリズマブ（テセントリク）；アベルマブ（バベンチオ）およびデュルバルマブ（イミフィンジ）が挙げられる。これらの薬物は、いくつかの種類のがんの治療に有用であり得る。

免疫チェックポイント阻害剤の任意の属、亜属、または種と、補体阻害剤の任意の属、亜属、または種とのすべての組み合わせ、そのような任意の組み合わせを含む組成物、および本明細書に記載の任意の方法における任意のそのような組み合わせの使用は、本明細書に明示的に開示されていると見なされる。ＣＴＬ－４、および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を遮断または阻害できる任意の抗体または他の特異的結合剤、例えば、ナノ粒子、操作細胞、免疫チェックポイントタンパク質に結合し、好ましくは阻害性免疫チェックポイント分子に拮抗するかまたはこれらを遮断する、任意の操作された結合タンパク質、可溶性受容体、アプタマー、ペプチドまたは低分子を本発明の方法で使用することができる。そのような免疫チェックポイント阻害剤のいずれかの組み合わせまたは混合物は、本発明での使用に好適である。

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４経路を阻害するイピリムマブおよび／またはトレメリムマブを含む。本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、キラー様免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）経路を阻害する。例えば、いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＫＩＲまたはＫＩＲリガンドに結合する。本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、Ａ２ＡＲ、またはＡ２ＢＲが関与する免疫チェックポイント経路を阻害する。

ＰＤ１は、ＰＤ１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１；Ｂ７－Ｈ１およびＣＤ２７４としても知られる）とＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣとしても知られる）の２つの既知のリガンドを有する。ＰＤ－１経路は、感染に対する炎症反応時に末梢組織中でのＴ細胞の活性を制限し、自己免疫を制限する。ＰＤ１は、活性化Ｔ細胞に発現するＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーのメンバーである。そのリガンドによるＰＤ１の結合は、サイトカイン産生の減少およびＴ細胞の生存の減少をもたらす阻害シグナルを媒介する。Ｔ細胞が活性化されたときに、ＰＤ１の発現が誘導される。ＰＤ１は、そのリガンドの１つと係合したときに、Ｔ細胞の活性化に関与するキナーゼを阻害する。

ＣＴＬＡ４と同様に、ＰＤ１は、Ｔｒｅｇ細胞上で高度に発現しており、その活性化は、免疫機能をさらに抑制するＰＤ１リガンドの存在下で増殖および／または抑制活性を向上させることができる。多くの腫瘍にはＴｒｅｇ細胞が高度に浸潤しているため、ＰＤ１経路を遮断することにより、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または抑制活性が減少することによって、抗腫瘍免疫応答が増大する。

ＰＤ１阻害剤は、免疫応答を抑制するＰＤ１の能力を低下させる効果で、ＰＤ１またはその天然リガンドの活性を阻害する剤である。ＰＤ１経路阻害剤は、ＰＤ１がＴ細胞活性を制限する能力、またはＴｒｅｇの増殖および／またはサプレッサー機能を増強させる能力を損なう任意の剤を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１に特異的に結合して、その活性化または活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１に特異的に結合して、ＰＤ１とそのリガンドとの相互作用を遮断する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤（またはＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＰＤ－Ｌ２阻害剤）は、約１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下、例えば、１０^－１３Ｍ～１０^－６Ｍ、またはエンドポイントとして前述の値のいずれか２つを有する任意の範囲内のＫｄで結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤ１阻害剤（またはＰＤ－Ｌ１阻害剤もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤）は、同じアッセイを使用して比較した場合に、ニボルマブのＫｄの１０倍以下、ニボルマブのＫｄの最大１０倍低い、または最大１００倍低いＫｄで結合する。

いくつかの実施形態では、そのリガンドへのＰＤ１結合のＰＤ１阻害剤による阻害のＩＣ５０値は、同じアッセイを使用して比較した場合に、そのリガンドへのＰＤ１結合のニボルマブ媒介阻害のＩＣ５０値より、１０倍以下、最大１０倍低い、または最大１００倍低い。

ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上で発現し、その主な機能は、Ｔ細胞活性化の初期段階の程度を調節することである。一般に、Ｔ細胞の活性化は、典型的には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＴ細胞上の共刺激分子とが係合することによって生じる。抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されたその同族抗原（抗原受容体が結合する抗原）のプロセシングされた形態へＴ細胞受容体が結合することにより、活性化のための最初のシグナルが提供される。第２のシグナルは、共刺激から生じ、ここでは、抗原提示細胞の表面分子が、Ｔ細胞上の共刺激受容体に結合し、細胞内シグナル伝達経路を活性化する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化のための最も重要な共刺激受容体であり、ナイーブＴ細胞（同族抗原に遭遇していない細胞）によって構成的に発現する。共刺激がない場合には、Ｔ細胞受容体シグナル伝達のみでアネルギーが生じ得る。

ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上で異なるパターンの発現を提示する：ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上に構成的に発現するが、ＣＴＬＡ４は、ナイーブＴ細胞中では低レベルで検出され、Ｔ細胞の活性化時に、より強く検出される。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８と同じリガンドを有するが、ＣＴＬＡ４の親和性は、ＣＤ２８の約１０倍高い。Ｔ細胞上でのＣＴＬＡ４発現は、リガンド結合について競合することによって、ＣＤ２８の活性に対抗するか、Ｔ細胞に阻害性シグナルを積極的に送達するか、またはその両方を行い得る。これらの機序および／または他の機序を介して、ＣＴＬＡ４はＴ細胞の活性化を阻害し、したがって、免疫応答および抗腫瘍免疫を低下させる。ＣＴＬＡ４は、Ｔｒｅｇによっても発現し、その免疫抑制機能を促進し、腫瘍に対する免疫応答の喪失にさらに寄与する。

ＣＴＬＡ４阻害剤は、ＣＴＬＡ４の生物学的活性を阻害するかまたは低下させる効果で、ＣＴＬＡ４の活性を阻害する剤であり、例えば、Ｔ細胞活性化の阻害を引き起こすＣＴＬＡ４の能力を損なわせるか、またはＴｒｅｇの増殖および／またはサプレッサー機能を強化させるＣＴＬＡ４の能力を損なわせる剤である。好ましいＣＴＬＡ４阻害剤は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、その活性化または活性を阻害する剤である。

米国特許第５，８１１，０９７号；同第５，８５５，８８７号；同第５，９７７，３１８号；同第６，０５１，２２７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，２０７，１５６号；同第６，９８４，７２０号；同第７，１０９，００３号；同第７，１３２，２８１号；および同第７，６０５，２３８号、米国特許出願公開第２００２－００３９５８１号、同第２００２－０８６０１４号、同第２００４－０２０２６５０号、同第２００５－０２０１９９４号、同第２００６－０１６５７０６号、同第２０１１－００８１３５４号、同第２０１２－０１４８５９７号、同第２０１３－００１１４０５号、同第２０１３－０１３６７４９号、同第２０１４－０１０５９１４号、および同第２０１４－００９９３２５号、国際公開第２００１／０１４４２４号、同第０１／１４４２４号、同第００／３７５０４号、同第９８／４２７５２号、および同第２００４／０３５６０７号、ならびに欧州特許第１２１２４２２（Ｂ１）号は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体について記載している。これらの開示内容は、参照により組み込まれる。米国特許出願公開第２００３－００５４３６０号および同第２００６－０２４６１２３号は、本明細書に記載の方法および組成物で使用され得る抗ＣＴＬＡ４アプタマーについて開示している。

本発明のいくつかの実施形態では、対象は、２つ以上の免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせて（同じ二官能性または多官能性組成物中で一緒に投与されるか、または一緒にもしくは別々に投与される別個の組成物中において）治療される。２つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、二官能性または多官能性の剤または化合物の一部として提供または投与することができる。例えば、２つ、３つ、または４つの異なる免疫チェックポイント分子に結合できる二重特異性、三重特異性、または四重特異性抗体（または他の結合剤）を使用することができる。

２つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、同じまたは異なる免疫チェックポイント経路を阻害することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１経路を阻害し、第２または第３の免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４経路を阻害する。例えば、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、トレミリムマブ、ピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはＳＢ００１０７１８Ｃのうちの２つ以上の任意の組み合わせを同じ治療方法で使用することができる。

例えば、いくつかの実施形態では、第１の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４を阻害し、第２の剤は、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ経路阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、またはアデノシン経路阻害剤を含む。特定の実施形態では、方法は、さらなるＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ経路阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、またはアデノシン経路阻害剤と共に、ＰＤ１阻害剤およびＣＴＬＡ４阻害剤の両方を含む。免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の免疫チェックポイント阻害剤を含むことが企図される。

Ｄ．ＲＧＤ
ＲＧＤトリペプチド（ＲＧＤ；配列番号１）は、細胞接着／付着を媒介する細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチン（結合モチーフ）内のアミノ酸配列として最初に同定された。また、インテグリン－リガンド相互作用の阻害剤としても機能し、シグナルおよびインテグリンを介した細胞クラスタリングが存在しない場合にアポトーシスを減少させることができる。ＲＧＤモチーフは、ビトロネクチンおよびラミニンなど、他の細胞外マトリックスタンパク質中でも確認されている。

Ｅ．ｉＲＧＤペプチドおよびペプチドミメティクス
（Ｅ．１）ｉＲＧＤペプチドは、９アミノ酸環状ペプチド（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ；配列番号２）として当技術分野でこれまでに記載されており、担癌マウスのファージディスプレイライブラリのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにおいて、最初に同定された分子模倣剤である。ｉＲＧＤは、腫瘍組織にホーミングすることができ、その二官能性作用に使用されてきた：腫瘍へのホーミング、ならびにニューロピリン－１（ＮＲＰ－１）受容体への特異的結合、およびその後腫瘍へ浸透するための経組織経路の活性化。ＲＧＤモチーフは、腫瘍新生血管系およびがん細胞上に発現する特定のανインテグリンへの結合を媒介する。結合時に、プロテアーゼ切断イベントが活性化され、これにより、ペプチド中のｃ末端モチーフ（Ｒ／ＫＸＸＲ／Ｋ））が明らかになる。次に、このｃ末端モチーフは、ニューロピリン－１に結合し、連結させて、同時投与された抗がん薬物の腫瘍への輸送を促進するために使用できるエンドサイトーシス／エキソサイトーシス輸送経路（ペプチドおよびバイスタンダー薬物を腫瘍細胞のより深い層に運ぶマクロピノソーム様小胞の形成）を活性化することができる。したがって、ｉＲＧＤは、ほぼすべての種類の同時注入されたがん化学療法薬の腫瘍特異的細胞傷害性を向上させる。これらのトピックに関するさらなる考察については、Ｓｕｇａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９，２０１０；Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；および米国特許第９，１１５，１７０号を参照されたい。

しかし、本出願で提示した研究では、ｉＲＧＤペプチドが、それ自体に対して予想外の免疫調節効果を有すること、すなわち、予想外に、免疫チェックポイント阻害剤の効果を、以前に知られている効果に基づいて予想されなかった方法で増強できることを示した。ｉＲＧＤペプチドは予想外に、腫瘍特異的方法でＴｒｅｇを枯渇させるかまたは抑制することができ、これにより、免疫チェックポイント阻害剤の効果を増強する。

開示されるのは、配列番号２のアミノ酸配列を含むアミノ酸セグメントを含む単離されたペプチド、またはそのバリアントに関連する方法および組成物である。特定の例では、バリアントは、配列番号３によって定義されるペプチドに関連する。

別の実施形態では、ｉＲＧＤペプチドまたはバリアントは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列のキメラを含むことができる。そのようなキメラは、１つの配列の配列が別の配列に付加される付加、１つの配列の配列が別の配列の配列と置換される置換、または組み合わせであり得る。開示されたペプチドは、アミノ酸セグメントからなり得る。

ｉＲＧＤペプチドまたはバリアントは、例えば、非環状、線状、円状または環状であり得る。アミノ酸セグメントは、任意の好適な連結、例えばジスルフィド結合を介して円状化または環化することができる。ペプチドは、１００残基未満長など、任意の好適な長さを有し得る。ペプチドは、例えば、５０残基未満長を有し得る。ペプチドは、例えば、２０残基未満長を有し得る。

本明細書で教示される方法および組成物の実施形態に従って使用され得るｉＲＧＤペプチドミメティクスもまた開示される。

本明細書において様々なタンパク質およびタンパク質配列について論じるときに、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されることが理解される。これらの配列は、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸と、タンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸とを含むものとする。したがって、各特定の核酸配列を本明細書に書き出すことはできないが、あらゆる配列が実際は開示され、開示されたタンパク質配列によって本明細書に説明されることを理解されたい。

開示された組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸または上記のものとは異なる機能的置換基を有するアミノ酸が存在する。天然のペプチドの逆の立体異性体と、ペプチドアナログの立体異性体が開示されている。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に最適なアミノ酸をチャージし、例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を作出して部位特異的な方法でペプチド鎖にアミノ酸類似体を挿入することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Ｔｈｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３－７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８－３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７－２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００－４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８－１６３（１９９４）；Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８－６８２（１９９４）（少なくともアミノ酸類似体に関連する資料については、このすべてを参照により本明細書に組み込む）。

異種タンパク質に融合された開示されたペプチドを含むキメラタンパク質もまた開示される。一実施形態では、異種タンパク質は、免疫チェックポイント阻害活性、サイトカイン活性、細胞傷害活性またはアポトーシス促進活性などの治療活性を有し得る。さらなる実施形態では、異種タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。他の実施形態では、キメラタンパク質は、異種タンパク質に融合された、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチド、またはそのペプチドミメティックを含む。開示されたペプチドに融合されたタンパク質に関して本明細書で使用される「異種」という用語は、ペプチドをコードする遺伝子以外のソースに由来するタンパク質、またはペプチドミメティックが由来するタンパク質を意味する。開示されたキメラタンパク質は、限定されないが、１００残基長未満、２００残基長未満、３００残基長未満、４００残基長未満、５００残基長未満、８００残基長未満、または１０００残基長未満など、様々な長さを有し得る。

本明細書で使用される「キメラ」および「キメラの」は、２つ以上の供給源に由来する配列の任意の組み合わせを指す。これには、例えば、サブユニットの単一部分（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸）から、他の配列へ付加、挿入および／または置換されたソース配列全体までを含む。キメラは、例えば、１つの配列の１つ以上の部分が、１つ以上の他の配列の１つ以上の部分に追加される付加；１つの配列の１つ以上の部分が、１つ以上の他の配列の１つ以上の部分で置換されている置換；または組み合わせであり得る。「保存的置換キメラ」は、キメラのソース配列がある程度の構造的および／または機能的関係を有し、同様であるかまたは類似している構造および／または機能を有する配列の部分が互いに置換されている置換キメラを指すために使用することができる。典型的なキメラおよびヒト化抗体は、保存的置換キメラの例である。

別の機能を有する第２のペプチドに融合したｉＲＧＤペプチドを含有する二官能性ペプチドも開示される。そのような二官能性ペプチドは、全長分子の異なる部分によって与えられる少なくとも２つの官能基を有し、例えば、細胞傷害活性および免疫調節活性を示すことができる。

一例では、ｉＲＧＤペプチド、キメラまたは二官能性ペプチドは、ジスルフィド結合を介して円状化または環化され得る。ペプチドに関して本明細書で使用される「環状」という用語は、２つの隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体間の分子内結合を含む構造を意味する。環化は、共有結合または非共有結合による結合を介して行われ得る。分子内結合には、これらに限定されないが、主鎖から主鎖への結合、側鎖から主鎖への結合、および側鎖から側鎖への結合が含まれる。環化の好ましい方法は、隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖間のジスルフィド結合の形成によるものである。ジスルフィド結合を形成できる残基には、例えば、システイン（Ｃｙｓ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、β，β－ペンタメチレンシステイン（Ｐｍｃ）、β，β－ペンタメチレン－β－メルカプトプロピオン酸（Ｐｍｐ）およびそれらの機能的等価物が含まれる。

ペプチドはまた、例えば、アミノ末端残基のＮ末端アミンへの共有結合による付着を形成するために、１つのアミノ酸またはその類似体の側鎖基を利用することができるラクタム結合を介して環化することができる。ラクタム結合を形成できる残基としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、オルニチン（ｏｒｎ）、α，β－ジアミノ－プロピオン酸、γ－アミノ－アジピン酸（Ａｄｐ）およびＭ－（アミノメチル）安息香酸（Ｍａｍｂ）が挙げられる。環化はさらに、例えば、リジン（Ｌｙｓ）残基とロイシン（Ｌｅｕ）残基との間のリシノノルロイシン結合、または２つのチロシン（Ｔｙｒ）残基間のジチロシン結合の形成によって達成され得る。当業者は、これらおよび他の結合が環状ペプチドに含まれ得ることを理解する。

（Ｅ．２）コンジュゲート
開示されるのは、本明細書で定義されている部分およびｉＲＧＤペプチドもしくはペプチドバリアントを含むコンジュゲートである。ｉＲＧＤペプチドまたはペプチドバリアントにコンジュゲートされる部分は、任意の分子であり得る。例えば、治療効果を有する部分などの標的に影響を与える部分、または蛍光分子もしくは放射性核種などの標的の検出、可視化または画像化を容易にする部分は、ｉＲＧＤペプチドまたはペプチドバリアントにコンジュゲートされる。特定の例では、ｉＲＧＤペプチドに連結されている化学療法剤を含有するコンジュゲートが開示される。本明細書に提示されているデータは、ｉＲＧＤのコンジュゲートを必要としない効果を示しているが、ｉＲＧＤコンジュゲートにより、免疫チェックポイント阻害剤との相乗効果がもたらされると考えられている。

ｉＲＧＤペプチドは、例えば、がんの治療、創傷治癒、抗炎症剤、または鎮痛剤を促進することができる部分などと有用に組み合わせることができる。種々の治療剤がコンジュゲートにおいて有用であり、これらに限定されないが、補助化学療法剤、抗血管新生剤、血管新生促進剤、細胞傷害性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、低分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム－１１１、テクネチウム－９９、炭素－１１、炭素－１３、または組み合わせである部分が挙げられる。

複数のｉＲＧＤペプチド分子を含有するコンジュゲートは、例えば、２以上、３以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、１００以上、または２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、または１０００以上のｉＲＧＤペプチド分子を含むことができる。複数のｉＲＧＤペプチド分子を組み込むコンジュゲートにおいて有用な部分としては、限定されないが、ファージ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、粒子（例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子）、金粒子、マイクロデバイス、ナノデバイス、ナノスケール半導体材料が挙げられる。

コンジュゲートは、例えば、少なくとも２つのｉＲＧＤペプチド分子に連結されているリポソームまたは他のポリマーマトリックスを含むことができる。必要に応じて、リポソームまたは他のポリマーマトリックスは、少なくとも１０個、少なくとも１００個、または少なくとも１０００個のｉＲＧＤペプチド分子に連結することができる。リポソームは、そのようなコンジュゲート中において有用であり得る；リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、比較的単純に作製および投与される、無毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体である（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８４））。リポソームまたは他のポリマーマトリックスは、これらに限定されないが、治療剤、補助がん治療剤、細胞傷害性剤、抗血管新生剤、ポリペプチドまたは核酸分子などの別の成分を任意に含むことができる。

開示されたコンジュゲートの成分は、任意の好適な方法で組み合わせ、連結および／またはカップリングすることができる。例えば、部分およびｉＲＧＤペプチド分子は、リンカー部分の有無にかかわらず、共有結合または非共有結合により、直接的または間接的に会合することができる。

（Ｅ．３）部分
開示されるのは、部分を標的に向ける組成物および方法である。本明細書で使用する「部分」という用語は、連結した分子に生物学的に有用な機能を一般に付与する物理的、化学的、または生物学的物質を意味するように広く使用される。部分は、これらに限定されないが、細胞、ファージ、または他のウイルスなどの生物学的物質；低分子などの有機化学物質；放射性核種；核酸分子またはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；またはペプチドなどの任意の天然または非天然の物質であり得る。有用な部分としては、これらに限定するものではないが、抗血管新生剤、血管新生促進剤、補助がん治療剤、抗体、細胞傷害性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、低分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム－１１１、テクネチウム－９９、炭素－１１、炭素－１３、またはその組み合わせである。有用な部分としては、これらに限定されないが、ファージおよび他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または粒子、例えば、金粒子、マイクロデバイスおよびナノデバイス、ならびにナノスケール半導体材料がさらに挙げられる。これらおよび当技術分野において知られている他の部分は、コンジュゲートの成分であり得る。

Ｆ．がんに対する組み合わせ免疫調節治療
免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドおよび／またはｉＲＧＤコンジュゲートによる組み合わせ治療は、上述のとおり阻害性免疫チェックポイント表面分子を発現するあらゆるがんを治療するために有用である。この治療は、免疫チェックポイント阻害剤の有効性を高めるか、または対象にも投与される免疫チェックポイント阻害剤による治療に対する耐性または無応答の可能性を低下させるように、２種類の剤を協調的に投与することを含む。投与は、同時または順次に行うことができる。

これらの本発明の方法は、免疫応答を停止させるかまたは減少させる免疫チェックポイント分子を抑制する免疫チェックポイント阻害剤の効果を予想外に増強することによって、免疫療法に対するＰＤＡＣなどのがんの感受性を高くさせるアプローチとなる。免疫療法に対する耐性は、様々ながんの治療における主要な問題である。様々なアプローチがテストされているが、特にＰＤＡＣの場合、現在までに有効であることが証明されているものはない。これらの本発明の方法は、免疫療法耐性に対する解決策を提供し、免疫療法に対する応答を増大させる。

ｉＲＧＤは、毒性を示していない。ｉＲＧＤ腫瘍透過性ペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤を増強させ、それにより、耐性を示す場合に免疫チェックポイント阻害剤が有効になり、有効性が改善されることが可能になる免疫調節効果を有することが発見されている。本発明の方法では、ｉＲＧＤが、ＰＤＡＣ、黒色腫、卵巣がん、脳がん、乳がん、肺がん、肝がん、胆管がん、消化管がん、前立腺がん、子宮がん、中皮腫、肉腫などの様々な悪性腫瘍に対する標準治療化学療法のアジュバントとして作用できるようになる。腫瘍は、原発性腫瘍、転移性腫瘍、または局所再発腫瘍であり得る。

本発明の方法では、免疫チェックポイント阻害剤と共にｉＲＧＤペプチドまたはそのバリアントを投与することにより免疫チェックポイント療法剤に対するがんの感受性を向上させるために、ｉＲＧＤのがん特異的免疫調節効果を利用する。この技術では、Ｔｒｅｇに対する影響を一般化することによって、全身中の免疫系に影響を与えることなく、がん組織内のＴｒｅｇを選択的に枯渇させ、これにより、がんに対してのみ免疫療法の有効性を向上させる。要約すると、本発明の組み合わせ治療（免疫チェックポイント阻害剤免疫療法へのｉＲＧＤの追加）では、一連の炎症性副作用につながり得るＴｒｅｇの非特異的枯渇の回避が可能になる。この組み合わせ療法は、多種多様ながんの感受性を高めることができ、本発明の併用療法は腫瘍細胞を直接死滅させないため、全身化学療法、放射線、手術、または他の免疫療法などの伝統的ながん治療と同時に、またはそれに続いて投与することができる。これは、本発明の組み合わせ療法が、腫瘍細胞を直接死滅させることはないが、がんに対して利益を最大化するように自然免疫防御が働くことが可能になるためである。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドまたはそのバリアントによる組み合わせ治療は、免疫チェックポイント阻害剤による治療前のｉＲＧＤペプチドによる前治療、またはその逆を含む。組み合わせ治療の両方の成分が対象の体内に同時に存在するように、治療は、好ましくは、重複させる。

２つ以上の剤（例えば、化合物または組成物）が互いに「組み合わせて」使用または投与される場合、「組み合わせ療法」または「共投与」とも呼ばれ、様々な実施形態において、これらは重複する期間内に、または順次同時に（例えば、時間的に最大２～４週間、４～６週間、６～８週間、または８～１２週間離れて）、少なくとも１回、与えられてもよい。剤は、同じ組成物中で投与されてもよいし、別々であるが、所望の治療効果がもたらされるように十分に近い時間で投与され得る。好ましくは、組み合わせの２つの成分は、同時に、または少なくとも重複する時間（すなわち、投与された剤の生物学的効果が重複する）に、治療される対象の体内に存在する。当業者は、本明細書に記載の特定の剤および組成物について、投与の適切なタイミング、順序、および投与量を容易に決定するであろう。

組み合わせの成分のいずれかまたは両方を繰り返し適用することができ、一連の治療において、異なる時間間隔を使用してもよい。第１の剤の１サイクル以上の投与、その後第２の剤の１サイクル以上の投与があってもよく、そのようなサイクルは、１回以上繰り返すことができる。組み合わせて投与される剤は、様々な実施形態において、同じ経路または異なる経路を介して投与され得る。それらは、様々な実施形態においていずれの順序で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、剤は、別の剤の２回の投与間に少なくとも１回投与される。いくつかの実施形態では、剤は、別の剤の２回目、３回目、または４回目の投与間ごとに少なくとも１回投与される。いくつかの実施形態では、剤は、互いに４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間以内に少なくとも１回投与される。いくつかの実施形態では、剤は、互いに４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間以内に複数回投与される。いくつかの実施形態では、第１の剤は、第２の剤の投与の前または後に、例えば、２つの剤が体内で少なくとも１回有用なレベルで一緒に存在するのに十分近い時間に投与される。いくつかの実施形態では、剤は、その前に投与された剤の５０％、７５％、または９０％以下が不活性代謝物に代謝されるか、または体内から排泄されるなどして排除されるように、第２の剤が投与される時間に十分近い時間に投与される。

免疫チェックポイント阻害剤とｉＲＧＤペプチドまたはそのバリアントとの組み合わせ療法では、免疫による腫瘍破壊の増加がもたらされ、免疫チェックポイント阻害剤単独の投与と比較して、全体的な腫瘍応答率および応答期間が改善する。このタイプの効果は、免疫チェックポイント阻害剤のみを使用した治療と比較して、患者の全生存期間の改善に寄与する可能性がある。

全生存は、免疫チェックポイント阻害剤による治療の開始後の中央生存として測定することができる。全生存率は、追加的または代替的に、免疫チェックポイント阻害剤による治療の開始後、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月（１年）、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年などにおける全生存率として測定することができる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドで治療された対象において、同じ免疫チェックポイント阻害剤で治療されたが、ｉＲＧＤペプチドでは、治療されていない対象と比較して、前述の時点のうちの１つ以上での全生存率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２．５倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上上昇させることができる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤、ｉＲＧＤペプチド、および１つ以上の追加の抗がん療法で治療されている対象において、同じ免疫チェックポイント阻害剤および同じ追加の抗がん療法で治療されたが、ｉＲＧＤペプチドでは治療されていない対象と比較して、前述の時点のうちの１つ以上での全生存率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２．５倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上上昇させる。いくつかの実施形態では、全生存中央値は、免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドで治療された対象において、同じ免疫チェックポイント阻害剤で治療されたが、ｉＲＧＤペプチドでは治療されていない対象と比較して、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２年、またはそれ以上延長され得る。いくつかの実施形態では、前述の時点のうちの１つ以上での全生存率は、免疫チェックポイント阻害剤、１つ以上の追加の抗がん療法、およびｉＲＧＤで治療されている対象において、同じ免疫チェックポイント阻害剤および同じ追加の抗がん療法で治療されたが、ｉＲＧＤペプチドで治療されていない対象と比較して、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２年、またはそれ以上上昇され得る。

Ｇ．治療に好適であるがん
本発明に関して、これらの治療に好ましいがんとしては、免疫チェックポイント阻害剤感受性のがんおよび免疫チェックポイント阻害剤耐性のがんが挙げられ、免疫チェックポイント阻害剤治療に以前は応答したが、難治性になったがんが含まれる。本明細書に記載の方法は、一般に、任意の種類のがんに関して使用することができる。

様々な異なる腫瘍型が特定の臓器で発生する可能性がある。これらは、臨床的および／または病理学的特徴および分子マーカーに関して異なり得る。様々な臓器に生じる腫瘍は、ＷＨＯ腫瘍分類シリーズの第４版または第３版（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｓｅｒｉｅｓ，ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ），ＷＨＯ Ｐｒｅｓｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載され、これらは全巻とも、参照により本明細書に組み込まれる。様々な種類のがんおよびその診断および治療に関する広範な情報は、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，ＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，９ｔｈ ｅｄ．（２０１１）に見られる。

本発明の特定の実施形態では、がんの種類は、免疫チェックポイント阻害剤が少なくとも１回の第Ｉ相試験で試験され、少なくとも一部の対象において応答をもたらした治療向けのがんである。特定の実施形態では、がんの種類は、免疫チェックポイント阻害剤が少なくとも１回の第ＩＩ相試験で試験され、少なくとも一部の対象において応答をもたらした治療向けのがんである。特定の実施形態では、がんの種類は、免疫チェックポイント阻害剤が少なくとも１回の第ＩＩＩ相試験で試験され、少なくとも一部の対象で応答をもたらした治療のためのがんである。特定の実施形態では、がんの種類は、免疫チェックポイント阻害剤が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、またはその両方によって使用が承認されている治療向けのものである。

がんの治療を受ける予定であるか、または治療を受けている対象は、そのような状態を有すると開業医により診断された対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、がんおよび／または治療への応答についてモニターされるか、またはモニターされていてもよい。診断および／またはモニタリングは、任意の適切な手段によって実行され得、例えば、身体検査、画像化（例えば、Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、ＰＥＴスキャン、超音波）、生物学的サンプルの組織病理学的検査による腫瘤を検出すること、がん細胞またはがん細胞生成物（例えば、腫瘍抗原）を検出する、がんに関連する症状を検出する他の手段を伴い得る。いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の従来の抗がん剤、放射線療法、またはそれらの組み合わせによる治療にもかかわらず、進行性疾患または再発を呈し得る。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の分子標的抗がん剤および／または放射線療法による治療にもかかわらず、進行性疾患または再発を示した可能性がある。

本発明の特定の実施形態では、がんは、転移性、切除不能、またはその両方である。いくつかの実施形態では、がんは、ステージＩＩＩ、ＩＩＩｂ、またはステージＩＶのがんである。がんの病期は、Ｓｏｂｉｎ Ｌ Ｈ，Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ Ｍ Ｋ，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ Ｃｈ．Ｅｄｓ．ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ，７ｔｈ ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ ２００９またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｓ．Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０に記載のＴＮＭシステムに基づいて割り当てられ得る。ステージＩおよびステージＩＩのがんも治療され得る。

したがって、本発明は、これらに限定されないが、乳がん、胆道がん、膀胱がん、脳がん（例えば、神経膠芽腫、髄芽腫）、子宮頸がん、絨毛がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、血液腫瘍（急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫）、上皮内腫瘍（ボーエン病、パジェット病など）、肝がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がんなど）、リンパ腫（ホジキン病、リンパ球性リンパ腫など）、悪性中皮腫、黒色腫（転移性黒色腫など）、神経芽細胞腫、口腔がん（扁平上皮がんなど）、卵巣がん（上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および／または間葉系細胞から生じる卵巣がんなど）、膵がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、肉腫（血管肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む）、腎がん（腎細胞がん、ウィルムス腫瘍など）、皮膚がん（基底細胞がん、扁平上皮がんなど）、胃がん、精巣がん（セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛がん）などの胚腫瘍など）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍）、および甲状腺がん（甲状腺腺がんおよび髄様がんなど）などの任意のがんでの使用に好適である。

免疫チェックポイント阻害剤は、これらに限定されないが、膵管腺がん、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、大腸がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、肝がん、肺がん、腎細胞がん、皮膚がん、胃がん、直腸がん、およびＤＮＡがコピーされたときに発生するＤＮＡ中のエラーを修復できない固形腫瘍など、様々ながんの種類を治療することが知られている。したがって、これらのがんのいずれも本発明での使用が意図されており、好ましい。さらに、本発明による実施形態による治療に好ましいがんは、卵巣がん、黒色腫、または膵管腺がんなどのαｖインテグリン＋ＮＲＰ－１＋または２、Ｔｒｅｇを有する。これらのがんのいずれか、または前の段落で列挙したがんに罹患している任意の対象は、本明細書に記載の本発明の方法から利益を得ることが企図される。本発明の治療方法にとって非常に好ましいがんは、膵管腺がんである。

Ｈ．追加の治療構成成分
本発明のいくつかの実施形態では、追加の抗がん治療モダリティが、免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドの両方と組み合わせて（同時にまたは連続して）投与される。当技術分野で知られているように、多種多様な抗がん剤のいずれかを使用することができる。特定の追加の剤は、例えば、当業者によって治療される特定の腫瘍に基づいて選択され得る。

本発明における使用に好適である抗がん剤としては、これらに限定されないが、手術、放射線療法、化学療法（薬物療法）、または免疫療法が挙げられる。抗がん剤としては、抗体、ポリペプチド、および低分子など、様々な種類の剤が挙げられる。使用され得るがん化学療法剤の非限定的な例としては、例えば、アルキル化剤およびアルキル化様剤、例えば、窒素マスタード（例えば、ベンダムスチン、クロラムブシル、ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｉｎｅ、シクロホスファミド、イホスファミド、ウラムスチン、およびメルファラン）、ブスルファン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオＴＥＰＡ、トレオスルファン、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）；白金剤（アルキル化様剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、三核白金化合物、例えば、ＢＢＲ３４６４およびＤＨ６Ｃｌなど）；代謝拮抗物質、例えば、葉酸（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）；プリン類、例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン；ピリミジン、例えば、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロキシウリジン、ゲムシタビン；紡錘体毒／有糸分裂阻害剤、例えば、タキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）、ｖｉｎｃａ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、エポチロン；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、およびバルルビシン）、様々の種のストレプトマイセス属によって天然に産生される化合物（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン）およびヒドロキシウレア；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテカ（例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン）およびポドフィルム（例えば、エトポシド、テニポシド）；がん療法用モノクローナル抗体、例えば、抗受容体チロシンキナーゼ（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ）、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、およびトシツモマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、ブリナツモマブ）、および他のもの、例えば、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２抗体）、ゲムツズマブ；アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィンなどの光増感剤；チロシンおよび／またはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、Ａｂｌ、Ｋｉｔ、インスリン受容体ファミリーメンバー（複数可）、ＶＥＧＦ受容体ファミリーメンバー（複数可）、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバー（複数可）、ＰＤＧＦ受容体ファミリーメンバー（複数可）、ＦＧＦ受容体ファミリーメンバー（複数可）の阻害剤、ｍＴＯＲ、Ｒａｆキナーゼファミリー、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩキナーゼ様キナーゼファミリーメンバー、ＭＥＫ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーメンバー、オーロラキナーゼファミリーメンバー（例えば、市販されているか、少なくとも １つの第ＩＩＩ相試験で腫瘍における有効性が示されているキナーゼ阻害剤、例えば、セジラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ）、成長因子受容体アンタゴニスト；レチノイド（例えば、アリトレチノインおよびトレチノイン）；アルトレタミン；アムサクリン；アナグレリド；三酸化ヒ素；アスパラギナーゼ（例えば、ペガスパラガーゼ）；ベキサロテン；プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブ；デニロイキン ジフチトクス；エストラムスチン；イクサベピロン；マソプロコール；ミトタン；テストラクトン；Ｈｓｐ９０阻害剤；血管新生阻害剤、例えば、ベバシズマブ（アバスチン）またはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストまたは可溶性ＶＥＧＦ受容体ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）などの抗血管内皮増殖因子剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。選択された補助がん治療剤については、以下の表１も参照されたい。

Ｉ．その他の治療
種々の感染症はまた、免疫チェックポイント経路によって少なくとも部分的に媒介される免疫機能不全の状態、例えばアネルギーまたは疲弊も特徴とする。免疫チェックポイント阻害剤も、このような障害の治療に有用である。例えば、ＰＤ－１を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞抗原受容体シグナルを減衰させ、がんおよび慢性感染症の両方において、Ｔ細胞のサイトカイン産生および細胞溶解機能を阻害する。慢性ウイルス感染中のＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を遮断することにより、Ｔ細胞機能を回復させ、ウイルス量を減少させることができる。ｉＲＧＤペプチドでもこの効果を増強することができる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、がん、慢性感染症、または慢性炎症性疾患により、免疫応答の増強を必要とする対象を治療する方法を含み、本方法は、免疫チェックポイント阻害剤とｉＲＧＤペプチドとを組み合わせて対象を治療することを含む。

いくつかの実施形態では、対象は、健康な正常対象と比較して、阻害性免疫チェックポイント経路が過剰に活性である対象、例えば、慢性感染症、がん、慢性炎症のうちの１つ以上に罹患している対象である。本発明のいくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象におけるがんまたは慢性感染症による免疫細胞機能不全を軽減または逆転させる方法を含み、本方法は、対象を免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドで治療することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、慢性感染症または慢性炎症にも罹患しているがん患者である。いくつかの実施形態では、対象は、がんではないが、慢性感染症または慢性炎症に罹患している。慢性感染症は、抗生物質または抗ウイルス薬による従来の治療に応答しない、または治療にもかかわらず再発し続ける感染症である。このような感染症は、体内のほぼすべてのシステム、臓器、または組織内で発生する可能性があり、細菌およびウイルス感染症を含む可能性がある。

Ｊ．医薬組成物、剤形および投与経路
好ましい方法の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の本発明の化合物のうちの１つ以上などの１つ以上の薬学的剤、および任意により追加の剤と共に本明細書に記載の本発明の化合物のうちの１つ以上を含む１つ以上の医薬組成物として製剤化され、投与される。薬学的に許容される担体とは、対象に対して毒性がなく、製剤化される治療剤（複数可）の薬理学的活性を破壊しないまたは大幅に減少させない、任意の簡便な化合物または化合物群を指す。このような薬学的に許容される担体またはビヒクルは、当技術分野で論じられているものなど、当技術分野で知られている標準的な薬学的に許容される固体、液体、または気体の担体のいずれかを包含する。

好適な担体は、医薬組成物について企図される投与経路に依存する。投与経路は、簡便性、治療される対象の健康および状態、ならびに治療される状態の位置および段階に従って、当業者によって決定されるが、本発明の方法のための好ましい投与経路は、注射または注入のいずれかによる静脈内投与である。他の好ましい投与経路としては、感染領域、腫瘍または腫瘍周辺領域などの治療を必要とする特定の領域への直接注射、治療される臓器、組織、または腫瘍内に少なくとも部分的に供給するか、または位置する特定の血管への注射、粘膜付着性担体システムによる粘膜投与、動脈内注射、髄腔内注射、皮下注射、筋肉内注射などが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくは、注射または注入、例えば、ボーラス注射など、または断続的または継続的な注入、例えば注入ポンプなどの使用によって、静脈内投与される。

ｉＲＧＤペプチドはまた、好ましくは、注射または注入によって静脈内投与される。
静脈内投与の場合、溶液または懸濁液などの液体または半液体の担体が最も頻繁に使用される。医薬組成物が取り得る形態としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：希釈用の液体、粉末または顆粒、溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、脂質ベシクル、油、ゲルなど、例えば水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム溶液、５％デキストロースなど）、水中油型または油中水型エマルジョン。担体はまた、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、水、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース）、デキストラン、アミノ酸（例えば、グリシン）、ポリオール（例えば、マンニトール、希釈剤、フィラー、増量剤、溶剤、等張化剤、バッファ、ｐＨ調整剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０（商標）、プルロニック－Ｆ１０８／Ｆ６８（商標）、デオキシコール酸、ホスファチジルコリン）、防腐剤、抗酸化剤、乳化剤、キレート剤、抗菌剤（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）（抗菌化合物（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ）、抗真菌化合物、または静菌化合物）、所望のとおり、遅延吸収および／または任意の他の追加の化合物または材料を産生するための剤のうちの１つ以上を含むこともできる。当業者は、そのような化合物をよく知っており、簡便で当技術分野において知られている任意のそのような賦形剤を選択することができる。当業者は、医薬組成物に含まれ得る多数の生理学的に許容される化合物を認識するであろう。

好ましくは、注射用の組成物は、滅菌であり、エンドトキシンを許容できる程度に含まず、シリンジ中で容易に使用するように十分に流動的である。さらに、組成物は、製造および保管の条件下で安定している必要がある。医薬組成物は、パッケージまたはキットに任意により含まれる。パッケージには、複数回投与バイアル、アンプル、プレフィルドシリンジ、輸液バッグ、箱、ボトルなどを含めることができ、使用説明書を含めてもよい。

好ましい実施形態では、医薬組成物は、所望により、緩衝液、（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩またはリン酸塩）、張性を調整するための剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、または重硫酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、および他の好適な成分などの成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に、必要量の活性化合物のうちの１つ以上を組み込み、その後、フィルターベースの滅菌を行うことによって調製される滅菌溶液である。

医薬組成物は、組み合わせ治療の構成成分のそれぞれを単独で含有するように製剤化することができるか、または免疫チェックポイント阻害剤およびｉＲＧＤペプチドの両方を含有するように製剤化することができ、任意により１つ以上の追加の治療剤も含む。補助的活性化合物、例えば、がんまたは感染症に罹患している対象を治療するために独立して有用な化合物もまた、免疫チェックポイント阻害剤、ｉＲＧＤペプチド、またはその両方を含む医薬組成物のいずれかに組み込むことができる。これらの医薬組成物はすべて、例えば本明細書で論じるように、所望の製剤に適切な他の不活性担体または賦形剤も好ましい。したがって、特定の実施形態では、医薬組成物は、それぞれ１つのみの活性剤を含み、いくつかの医薬組成物は、１つの組成物中での２つ以上の活性剤の組み合わせである。

いくつかの態様では、本明細書に記載の発明は、薬学的に許容される免疫チェックポイント阻害剤、または免疫チェックポイント阻害剤を含む薬学的に許容される組成物を含み、これらは、医薬品の規制を行う政府機関、例えばＦＤＡまたはＥＭＡによって承認された添付文書（ラベル）を有する医薬品パックまたはキットに一緒に包装され、このラベルには、ｉＲＧＤペプチドと組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の使用が含まれる。

Ｋ．用量およびレジメン
本発明の方法に好適である治療レジメンには、単回投与、または２日以上、例えば、１週間、２週間、数週間、１ヶ月、２ヶ月、数ヶ月、１年、またはそれ以上など、対象の残りの生涯にわたる投与など、継続する一連の投与が含まれる。レジメンは、例えば、１日に複数回、１日または１週間に１回、または１時間、数時間、１日、またはそれ以上持続する長期注入投与を含むことができる。

投与当たりの投薬量は、開業医によって決定される任意の量を含み、治療される対象のサイズ、対象の健康状態、投与経路、治療または予防される状態などに依存する。一般に、免疫チェックポイント阻害剤、ｉＲＧＤペプチド、または他の活性剤の適切な用量は、剤の効力および投与経路にも少なくとも部分的に依存する。

当業者は、効果的で十分に許容される用量範囲を選択することができる。当業者はまた、特定の剤が、典型的には、他の治療法と組み合わせて使用され、障害を治療するためのそのような剤の「有効量」は、目的の治療効果が、剤と他の治療法との組み合わせによって産生されるような量であり得、それらも有効量で使用されることを理解するであろう。任意により、例えば、予め選択された所望の応答が達成されるまで用量を増加させて投与することにより、特定のレシピエントに合わせて用量を調整することができる。所望であれば、任意の特定の対象に対する特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、治療される特定の状態および／またはその重症度、年齢、体重、一般的な健康状態、投与経路、および／または併用医薬品など、様々な要因に少なくとも部分的に基づいて選択され得る。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の有効量または用量は、約０．００１～約５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明のいくつかの実施形態では、有効量は、約１ｍｇ～約１０，０００ｍｇ、例えば、約１ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ～約２０００ｍｇであり得る。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、約２～６週間ごと、例えば、約２週間ごと、約３週間ごと、約４週間ごと、または約６週間ごとに投与される。

本発明のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤抗体は、約３ｍｇ／ｋｇで１回目の投与、約５ｍｇ／ｋｇで２回目の投与、および約９ｍｇ／ｋｇで３回目の投与を行うなど、漸増投薬レジメンを使用して投与される。別の漸増投薬レジメンは、約３ｍｇ／ｋｇで免疫チェックポイント阻害剤抗体の１回目の投与、約３ｍｇ／ｋｇで２回目の投与、約５ｍｇ／ｋｇで３回目の投与、約５ｍｇ／ｋｇで４回目の投与、および約９ｍｇ／ｋｇで５回目の投与を行うことを含み得る。免疫チェックポイント阻害剤抗体の具体的な投与例としては、イピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに４回投与；イピリムマブ１０ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに８サイクル；１０ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに４サイクル、その後１２週間ごと；ＭＫ－３４７５ １０ｍｇ／ｋｇを２週間または３週間ごと；ＭＫ－３４７５ ２ｍｇ／ｋｇを３週間ごと；トレミリムマブ１５ｍｇ／ｋｇを３ヶ月ごと；ニボルマブ０．１、０．３、１、２、３、または１０ｍｇ／ｋｇを２週間ごと、最大９６週間（またはそれ以上）；ＢＭＳ－９３６５５９ ０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇを２週間ごと、最大９６週間（またはそれ以上）（Ｋｙｉ Ｃ．＆Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ Ａ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（２０１４）５８８（２）：３６８－７６；Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ Ｋ＆Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ Ｄ（２０１３）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ９４：４１－５３）；ペムブロリズマブを２ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間ごと（Ｈａｍｉｄ，Ｏ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１３；３６９（２）：１３４－４４）；ＢＭＳ－９３６５５９ １ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間ごと（Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２；３６６：２４５５－６５）；ピジリズマブ３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与で４週間ごと（Ｗｅｓｔｉｎ，Ｊ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ；１５（１）：６９－７７）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ１経路阻害剤、例えば、ＰＤ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ１の１つ以上の生物学的活性を、好適な対照に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少させるのに十分な量で使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ１経路阻害剤は、ＰＤ１のＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、またはその両方への結合を、好適な対照に対して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％減少させることによって、ＰＤ１の生物学的活性を減少させる。ＰＤ１経路阻害、例えばＰＤ１遮断は、例えば、ＰＤ１またはそのリガンド（複数可）、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を結合する抗体または他の剤と共に、様々な剤のうちのいずれかを使用して、様々な機序によって実現され得る。

本発明のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４阻害剤は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％、ＣＴＬＡ４の発現を阻害する、かつ／または生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４経路阻害剤は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方への結合を、好適な対照に対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、好適な対照に対して５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％減少させることによって、ＣＴＬＡ４の生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。目的の剤の効果を評価または定量化する文脈における好適な対照は、典型的には、目的の剤に曝露されていない、または目的の剤、例えば、ＣＴＬＡ４経路阻害剤で治療されていない（またはごくわずかな量にさらされた、または治療された）同等の生物学的系（例えば、細胞または対象）である。いくつかの実施形態では、生物学的系は、それ自体の対照として機能し得る（例えば、生物学的系は、剤への曝露または剤による治療の前に評価され、曝露または治療が開始または終了した後の状態と比較され得る。いくつかの実施形態では、履歴対照を使用することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の有効用量の組成物を患者に１回投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の有効用量の組成物を患者に繰り返し投与することができる。全身投与の場合、対象は、任意の治療量の本明細書に記載のｉＲＧＤ含有組成物、例えば、対象重量あたり、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上の量のｉＲＧＤを投与することができる。

いくつかの実施形態では、最初の治療レジメン後、治療はより少ない頻度をベースに投与することができる。例えば、隔週で３ヶ月間治療後、１ヶ月に１回を６ヶ月または１年以上繰り返すことができる。本明細書に記載の方法による治療は、状態のマーカーまたは症状のレベル、例えば腫瘍サイズおよび／または成長を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、またはそれ以上減少させることができる。

本明細書に記載のｉＲＧＤまたはｉＲＧＤ組成物の投与量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療効果に適合するように調整することができる。治療の期間および頻度に関して、熟練臨床医は、典型的には、この治療が治療効果をもたらす時を判断するために対象をモニターし、投与量を増減する、投与頻度を増減する、治療を中止する、治療を再開する、または治療レジメンに他の変更を加えるかを決定する。投与スケジュールは、本明細書に記載の組成物に対する対象の感受性など、複数の臨床要因に応じて、週に１回から毎日まで変動し得る。所望の用量または量の活性化は、１回で投与するか、またはサブ用量、例えば２～４サブ用量に分割して投与でき、一定期間にわたって、例えば、１日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することができる。いくつかの実施形態では、投与は、長期にわたる、例えば、数週間または数ヶ月にわたる毎日の１回または複数回の用量および／または治療であり得る。投薬および／または治療スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月、またはそれ以上にわたる１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回以上の投与である。本明細書に記載の組成物は、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間など、ある一定期間にわたって投与することができる。

４．実施例
本発明は、記載された特定のプロセス、組成物、または方法論に限定されず、これらは変動し得る。本明細書で使用される用語は、特定の型または実施形態のみを記載するためのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料についてこれから説明する。本明細書で言及されたすべての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれ、本明細書のいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。

実施例１：ｉＲＧＤ療法では、トランスジェニックＰＤＡＣマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加させる。
図１には、ｉＲＧＤ療法がトランスジェニックＰＤＡＣマウスにおいてＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加させることを示すデータを提示する。ｉＲＧＤ共注射療法による長期治療では、ＧＥＭで治療したトランスジェニックＫｒａｓ－ＬＳＬ^ＧＤ１２、ｐ５３－ＬＳＬ^１７２Ｈ、Ｐｄｘ－１－ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウスの生存が有意に延長した（図１Ａ参照）。マウスを、腹腔内（ＩＰ）ゲムシタビン単独（１００ｍｇ／ｋｇ／注射）、静脈内（ＩＶ）ｉＲＧＤ単独（１００μｇ／注射）、またはゲムシタビンとｉＲＧＤとの同時投与による治療に無作為に割り付けた。連続超音波検査で少なくとも１つの４～５ｍｍの腫瘍結節が触知可能になり、目に見えるようになるまで、マウスを高解像度超音波および手動触診で追跡した。この時点で、マウスは、３つの治療群のいずれかに無作為に割り付けた。動物が苦痛の兆候を示すために屠殺されるまで、４日ごとに治療を行った。データの中間分析により、ｉＲＧＤ治療単独では、文献および以前の観察に基づいていずれかの治療上の利点が得られる可能性が低いことが明らかになり、そのアームは中止した。最終的に、ｉＲＧＤとゲムシタビンの組み合わせにより治療したマウスは、ゲムシタビン単独で治療したマウスよりも有意に長く生存した（ハザード比＝０．５３、ｐ＝０．０３８５）。注目すべき点として、生存期間の中央値には、組み合わせを支持する差があったが（７１日対８４日）、生存曲線の下縁にはさらに顕著な差があり、１８０日での生存率は、ゲムシタビン単独では、ｉＲＧＤ＋ゲムシタビン群に対して、０％対４０％であった。

収集した３つの治療群におけるマウスの腫瘍は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞について染色した。無作為に選択した視野ごとに顕微鏡下で細胞を数えた。これらのＰＤＡＣ組織の研究では、ｉＲＧＤ＋ＧＥＭ療法により、腫瘍内のＣＤ８^＋Ｔ細胞が拡大したことが示された（図１Ｂおよび図１Ｃを参照）。ｉＲＧＤ単独では、生存率に影響を及ぼさなかったが、ｉＲＧＤ＋ＧＥＭよりも程度は低いが、腫瘍内のＣＤ８^＋Ｔ細胞は拡大した。最も寿命の長い３匹のＫＰＣマウスおよび最も寿命の短い４匹のＫＰＣマウスにおけるＰＤＡＣ中のＣＤ８^＋Ｔ細胞を分析した。ｉＲＧＤ＋ＧＥＭアームの長期生存者の腫瘍は、特に多数のＣＤ８^＋Ｔ細胞を有していた（図１Ｄを参照）。これらのデータは、ｉＲＧＤが免疫調節効果を有することを示唆するものであった。

実施例２：ｉＲＧＤによる免疫調節。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に対するｉＲＧＤベースの療法の効果をより効率的に研究するために、ＫＰＣ ＰＤＡＣ腫瘍から樹立されたオルガノイドを使用する同所性同系ＰＤＡＣマウスモデルを使用した。図２Ａは、ＫＰＣオルガノイドが精巧な折り畳みおよび管腔（矢印）を有することを示している。

ＫＰＣオルガノイドは、ＵＣＳＤのＬｏｗｙ ｌａｂによってＣｏｌｕｍｂｉａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳｕｇａｈａｒａ ｌａｂに提供された。ルシフェラーゼ陽性のＫＰＣオルガノイドを調製し、免疫チェックポイント（ＫＰＣ－ｌｕｃ）であるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を発現するクローンを選択した。図２Ｂは、フローサイトメトリーによって分析したＫＰＣ－ｌｕｃオルガノイドにおけるＰＤ－Ｌ１発現に関するデータを示す。

ＫＰＣ－ｌｕｃ同所性腫瘍は、活発に成長した。Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウスにおける同所性ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍の縦方向発光イメージングを示す図２Ｃを参照されたい。腫瘍は、約４週間で肝臓、肺、および腹膜に転移した。ＫＰＣ－ｌｕｃ ＰＤＡＣおよび肝臓および肺転移を示す図２Ｄを参照されたい。原発腫瘍のＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバー：１００μｍ。

ＰＤＡＣは、不規則な管構造および浸潤性がん細胞内に豊富な間質ネットワークを有していた。ＫＰＣ－ｌｕｃマウスの脾臓では、Ｔ細胞の４０％がＣＤ８^＋であり、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の１５％が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、これは正常マウスでの脾細胞と同様であった。図２Ｅを参照のこと。対照的に、（１０日齢）ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍は、最小限のＣＤ８^＋Ｔ細胞を有していたが、多くのＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋Ｔ細胞の６０％）を有し、これは、トランスジェニックＫＰＣマウスにおける以前の研究と一致していた（Ｃｌａｒｋｅｔａｌ，２００７）。腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの約５０～６０％が、脾臓Ｔｒｅｇと同様のＮＲＰ－１を発現した。図２Ｆを参照のこと。驚くべきことに、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの９０％超がαｖβ３インテグリンを発現し、２０％がαｖβ５インテグリンを発現したが、脾臓Ｔｒｅｇは１～２％未満のみがインテグリンを発現した。図２Ｇを参照のこと。図２Ｅ、図２Ｆ、および図２Ｇは、正常マウス（ＮＭ）およびＫＰＣ－ｌｕｃマウス（ＰＤＡＣ Ｍ）のＰＤＡＣおよび脾臓（Ｓｐｌ）中のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ（図２Ｅ）、ＮＰＲ－１^＋Ｔｒｅｇ（図２Ｆ）、ならびにαｖβ３^＋およびαｖβ５^＋Ｔｒｅｇ（図２Ｇ）のフローサイトメトリーの結果を示す。

ＰＤＡＣ中のＴｒｅｇは、αｖインテグリンおよびＮＰＲ－１（ｉＲＧＤの受容体）を発現したが、脾臓中では発現しなかったという発見に基づいて、ｉＲＧＤがＰＤＡＣ浸潤Ｔｒｅｇを選択的に標的とするかを決定するために研究を行った。ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍中において、静脈内注射されたフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ｉＲＧＤにより標的化されたＴｒｅｇを図２Ｈに示す。静脈内注射されたＦＡＭ－ｉＲＧＤ（緑）は、ＫＰＣ－ｌｕｃ ＰＤＡＣ中のＣＤ４＋（マゼンタ）Ｆｏｘｐ３＋（赤）Ｔｒｅｇを標的とする（図２Ｈ参照、白矢印）。一部のｉＲＧＤ標的Ｆｏｘｐ３＋細胞は、ＣＤ４ｎｅｇであった（黒矢印）。青、ＤＡＰＩ；スケールバー、５０μｍ。

ＫＰＣ－ｌｕｃ細胞の存在下で３日間培養した脾臓Ｔｒｅｇは、αｖインテグリンおよびＮＲＰ－１を増加させたので、腫瘍微小環境が主要な寄与を有していた可能性が高い。図２Ｉを参照のこと。この図には、単独でまたはＫＰＣ－ｌｕｃ細胞と共に培養した正常マウス脾臓Ｔｒｅｇ中でのαｖβ５およびＮＲＰ－１の発現を示す。

同所性ＫＰＣ－ｌｕｃマウスを、抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を含むまたは含まないＩＶ ｉＲＧＤ＋ＧＥＭで週３回、２週間治療した。ｉＲＧＤ＋ＧＥＭにより、抗ＰＤ－Ｌ１療法が大幅に向上した。図２Ｊを参照のこと。ｉＲＧＤ＋ＧＥＭ療法後のＰＤＡＣ中でのＴｒｅｇの枯渇およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡大と一致して、ｉＲＧＤ＋ＧＥＭによる同所性ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍マウスの１４日間の短期治療により、免疫チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）が有意に増強された。

この組み合わせでは、αｖβ３インテグリン^＋ＮＲＰ－１^＋（図２Ｋ）およびαｖβ５インテグリン^＋ＮＲＰ－１^＋（図示せず）腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの両方の有意な減少がもたらされた。ＮＲＰ－１^＋脾臓Ｔｒｅｇは、９９％超がインテグリン陰性であり、枯渇していなかった（またはわずかに増加していた）。ｉＲＧＤ＋ＧＥＭ＋抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ治療後のＰＤＡＣおよび脾臓中でのＮＲＰ－１^＋αｖβ３インテグリン^＋総Ｔｒｅｇ（図２Ｋ）およびＣＤ２５^ｈｉｇｈＴｒｅｇ（図２Ｌ、挿入図）、およびＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合（図２Ｍ）。統計、分散分析；ｎｓ、有意でない；＊＊＊、ｐ＜０．００１。免疫抑制性が高いことが知られているＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇ（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｍｉｙａｒａ ｅｔ ａｌ，２００９）は、治療した腫瘍内で有意に減少した（図２Ｌを参照）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＴｒｅｇの約９４％は、αｖβ３インテグリン^＋およびＮＲＰ－１^＋であり、これは、治療後に２３％まで減少した。腫瘍浸潤ＣＤ８^＋細胞は、治療により２倍になった（図２Ｍ参照）。

実施例３：ヒトＰＤＡＣ Ｔｒｅｇ中でのαｖインテグリンおよびＮＲＰ－１の発現。
ヒトＰＤＡＣ組織は、αｖβ５インテグリンを発現するＴｒｅｇを保有する（図３Ａおよび図３Ｂの左パネルを参照）。ＮＲＰ－１^＋Ｔ細胞は、ヒトＰＤＡＣ組織でも認められた（図３Ｂ、右パネル参照）。これらの所見は、ＰＤＡＣ組織中のＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇの存在が、ヒトがん患者におけるＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇの存在を報告した以前の刊行物と一致する可能性が高いことを示唆している。対照的に、ヒトＰＤＡＣ患者の脾臓または健康なドナーの血液（図示せず）中のＴｒｅｇは、αｖインテグリンまたはＮＲＰ－１を発現しなかった。したがって、ｉＲＧＤ療法による腫瘍特異的Ｔｒｅｇ標的化の概念は、ヒトでも保持されるであろう。

図３は、ヒトＰＤＡＣＴｒｅｇ中でのαｖインテグリンおよびＮＲＰ－１の発現を示す。図３Ａは、ＰＤＡＣ患者からの腫瘍（青）および脾臓（赤）サンプルから単離されたＴｒｅｇ中でのαｖβ５インテグリンの発現を示す（細胞計数データ）。緑は、アイソタイプ対照である。スケールバー：２０μｍ。図３Ｂは、ヒトＰＤＡＣ中でのＣＤ３^＋（赤）Ｆｏｘｐ３^＋（マゼンタ）Ｔ細胞中のαｖβ５インテグリン（緑）（白矢印）およびＣＤ３^＋Ｔ細胞中のＮＲＰ－１（緑）（黄矢印）の画像を示す。Ｆｏｘｐ３は、ＮＲＰ－１染色との不適合性のため、右パネルでは染色されなかった。他の色をより良く可視化するために、ＤＡＰＩは、示していない。スケールバー：２０μｍ。

実施例４：ＩＤ８マウス卵巣がん細胞で生成されたマウスでの腹膜腫瘍中のＴ細胞。
ｉＲＧＤペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、および抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂなどの免疫チェックポイント阻害剤に対するがんの感受性を高める。ｉＲＧＤは、腫瘍内のＴｒｅｇを標的とし、ＣＤ８^＋Ｔ細胞などのエフェクター細胞の拡大が可能になる。ｉＲＧＤをＧＥＭなどの１つ以上の追加の化学療法剤と組み合わせたときに、この効果はさらに顕著になる。ｉＲＧＤ受容体を発現するＴｒｅｇは、腫瘍組織中にのみ存在するため、効果は腫瘍特異的である可能性が最も高い。

卵巣がんなどのＰＤＡＣ以外のがんもαｖインテグリン＋ＮＲＰ－１＋Ｔｒｅｇを有するため、ｉＲＧＤベースの化学療法は、様々ながんの種類の感受性を高めることができる（図４参照）。したがって、上記の知見は、様々ながんの治療における主要な問題である免疫療法への耐性を解決するために、すぐに臨床に適用することができる。

図４は、ＩＤ８マウス卵巣がん細胞で生成されたマウス中の腹膜腫瘍におけるＴ細胞に関する。図４Ａは、ＣＤ８^＋（４％）およびＣＤ４^＋（１７％）Ｔ細胞に関するデータを示す；図４Ｂは、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ（３２％）およびＣＤ２５^ｌｏｗ（５８％）Ｔｒｅｇに関するデータを示す；図４Ｃは、αｖβ３^＋ＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇ（６３％）に関するデータを示す；図４Ｄは、αｖβ５^＋ＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇ（２６％）に関するデータを示す。ＰＴが小さかったため、Ｔ細胞の数は少なかった。

実施例５：制御性Ｔ細胞中でのανβ５インテグリンの発現。
ｉＲＧＤペプチド自体は、免疫調節効果を有し、それにより、チェックポイント阻害剤の有効性を増大させる。αｖβ５インテグリンの発現は、マウスの膵管腺がん（ＰＤＡＣ）に浸潤している制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）中一貫して増加している。図５を参照されたい。ここでは、ＫＰＣ由来同系腫瘍マウス（Ｔ Ｍ）の同所性ＰＤＡＣ（Ｔ）および脾臓（Ｓ）、ならびに正常マウス（Ｎ Ｍ）の脾臓から単離されたＴｒｅｇおよびＣＴＬ上でのαｖβ５インテグリンの発現を示す。これらは、フローサイトメトリーにより分析した。ｐ＊＊＜０．０１。これらのデータから、上記の所見が確認される。
αｖβ５インテグリンは、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球中では発現しなかった。

マウス由来の脾臓Ｔ細胞をＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下で培養し、αｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇを拡大させた。生存は、血球計を使用して細胞数をカウントすることによって決定した。＊，ｐ＜０．０１。結果は図６を参照されたい。ＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下または非存在下でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存を示す。興味深いことに、細胞は、その生存期間が大幅に延長され、ここでも、ＰＤＡＣ組織の微小環境が、αｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇの拡大を支援することが示唆された。前述のとおり、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をトランスジェニックＫｒａｓ－ＬＳＬ^ＧＤ１２、ｐ５３－ＬＳＬ^１７２Ｈ、Ｐｄｘ－１－ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウス由来のＰＤＡＣ細胞と共培養することにより、αｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇの拡大がもたらされた。

実施例６：
Ｔ細胞を、フルオレセイン（ＦＡＭ）標識ｉＲＧＤの存在下、３７℃で１時間培養した。ｉＲＧＤ結合は、フローサイトメトリーによって決定した。図７は、ＫＰＣ由来ＰＤＡＣから単離されたＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ２５^ｎｅｇＣＤ４^＋Ｔ細胞（非Ｔｒｅｇ）へのｉＲＧＤの結合を示す。これらのデータは、ｉＲＧＤがｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＤＡＣ浸潤Ｔｒｅｇにホーミングし、ｉＲＧＤがマウスＰＤＡＣから単離されたＴｒｅｇに効果的に結合するが、ＣＤ２５^ｎｅｇＣＤ４^＋Ｔ細胞（非Ｔｒｅｇ）には最小限のみ結合するという以前の発見を裏付けるものである。

実施例７：Ｔ細胞へのｉＲＧＤの結合。
ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよびＫＰＣ由来ＰＤＡＣ細胞の存在下でマウス脾臓Ｔ細胞を培養することにより、Ｔｒｅｇおよび非Ｔｒｅｇを産生した。図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ２５^ｎｅｇＣＤ４^＋Ｔ細胞（非Ｔｒｅｇ）へのｉＲＧＤの結合に関するデータを示す。図８Ａは、ＴｒｅｇへのＦＡＭ－ｉＲＧＤの結合がフローサイトメトリーによって決定されたことを示している。図８Ｂは、抗αｖβ５インテグリンＡｂが、ＴｒｅｇへのＦＡＭ－ｉＲＧＤの結合を阻害したことを示す。ｉＲＧＤはまた、αｖβ５インテグリンの発現を誘導する条件で拡大させた培養Ｔｒｅｇにも結合した（しかし、非Ｔｒｅｇへの結合は最小限であった）。ＴｒｅｇへのｉＲＧＤの結合は、抗αｖβ５インテグリン抗体（Ａｂ）によって阻害され、これにより、ｉＲＧＤの受容体媒介結合が確認された。

実施例８：ＰＤＡＣ組織および脾臓中でのＴｒｅｇおよびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比に対するｉＲＧＤ単独療法の効果。
同所性ＰＤＡＣ担持マウスを、全身性ｉＲＧＤまたはＰＢＳにより２週間治療した。これらに結果は、図９、図１０。図１０および図１１に示し、ＰＤＡＣ組織および脾臓中でのＴｒｅｇおよびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比に対するｉＲＧＤ単独療法の効果を示す。図９Ａおよび図９Ｂは、ＰＤＡＣ組織中でのＴｒｅｇの割合およびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比の経時変化を示す。ｉＲＧＤ単独療法によるＰＤＡＣマウスの全身治療により、ＰＤＡＣ浸潤Ｔｒｅｇが大幅に減少し、ＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比が増加した。

図１０Ａおよび図１０Ｂには、ｉＲＧＤ単独療法後のＰＤＡＣ中でのαｖβ５インテグリン^＋およびＮＲＰ－１^＋Ｔｒｅｇの結果を示す。ＰＤＡＣ組織では、αｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇの大幅な減少が見られた。図１１Ａおよび図１１Ｂは、脾臓中でのＴｒｅｇの割合およびＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比の経時変化を示す。＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意でない。脾臓中ではＴｒｅｇまたはＣＴＬ／Ｔｒｅｇ比に変化はなく、これは、脾臓中には最小のαｖβ５インテグリン^＋Ｔｒｅｇが存在するという本発明者らの発見を裏付けるものである。これらの結果により、ｉＲＧＤが抗がんＴ細胞免疫の回復を助けることが示唆される。

実施例９：抗腫瘍の有効性に対するｉＲＧＤの効果。
ＫＰＣ由来ＰＤＡＣマウスを、ｉＲＧＤ±抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（Ａ；ｎ＝４～６）またはｉＲＧＤ＋Ｇｅｍ±抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（Ｂ；ｎ＝４）により週３回、２週間治療した。ｉＲＧＤ＋Ｇｅｍ＋抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ療法後の腫瘍および脾臓中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＴｒｅｇおよびＣＤ８^＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーデータを図１２に示す。ＰＤＡＣ中ではＴｒｅｇは半減し、ＣＴＬは２倍になったが、脾臓ではそうならなかった。ｎｓ、有意でない。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。ｉＲＧＤは、ＰＤＡＣマウスにおける抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）Ａｂの抗腫瘍の有効性を有意に向上させたが、ｉＲＧＤ単独または抗ＰＤ－Ｌ１Ａｂ単独では効果がなかった（図１２Ａ）。ゲムシタビンを追加することにより、ＰＤＡＣマウスにおけるｉＲＧＤ＋抗ＰＤ－Ｌ１療法の有効性がさらに向上した（図１２Ｂ）。

参考文献
以下および本明細書全体にわたって列挙されているすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (16)

1. 対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に、ｉＲＧＤペプチド、またはそのペプチドバリアント、またはｉＲＧＤコンジュゲートを１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
2. 前記ｉＲＧＤペプチドが、配列番号３を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはＰＤ－Ｌ２阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤が、２つ、３つ、または４つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレミリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ）、ピジリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
6. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレミリムマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記がんが、転移性がんである、請求項１に記載の方法。
8. 前記がんが、免疫療法難治性である、請求項１に記載の方法。
9. 前記がんが、１つ以上の阻害性免疫チェックポイント分子を発現する、請求項１に記載の方法。
10. 前記がんが、切除不能である、請求項１に記載の方法。
11. 前記がんが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶのがんである、請求項１に記載の方法。
12. 前記がんが、膵管腺がん、悪性黒色腫、卵巣がん、脳がん、乳がん、肺がん、肝がん、胆管がん、消化管がん、前立腺がん、子宮がん、中皮腫、肉腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
13. 前記がんが、膵管腺がんである、請求項１に記載の方法。
14. 手術、放射線療法、追加の免疫療法、および化学療法からなる群から選択される補助がん療法を前記対象に施すことをさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記化学療法が、補助がん剤による治療である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記方法が、免疫チェックポイント阻害剤免疫療法に対するがんの感受性を高める、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

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