JP2023551071A - Ｓ－エクオールを用いた分子マーカーの調節 - Google Patents

Abstract

本発明は、分子マーカーを調節する、したがって、Ｓ－エクオール又はＳ－エクオールを含む医薬組成物を薬学的有効量用いて乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）及び黒色腫を処置又は予防するための方法及び組成物を提供する。Ｓ－エクオールは、単独で、又は１つ以上の細胞傷害性若しくは免疫療法の化合物若しくは分子と組み合わせて投与され得る。【選択図】図２４Ａ

Description

［政府支援についての記載］
本発明は、米国国立衛生研究所により認められた助成番号ＣＡ２０５９６５、ＣＡ２０６５２９、ＣＡ２１２６７４、ＣＡ２３１３２５のもと米国政府支援により、及びテキサス州がん予防研究所により認められた助成番号ＤＰ１５００５５のもとテキサス州がん研究助成契約により実現した。この研究はまた、国防総省及びＣＰＲＩＴ博士課程終了後研修助成制度（ＲＰ１７０３４５）により認められたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０００７助成により支援を受けた。米国政府及びテキサス州政府は、本発明における一定の権利を有する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２０年１１月２４日に出願の米国仮出願第６３／１１７，８８８号の優先権を主張する。この仮出願、並びに、２０１８年６月１５日に出願の米国仮出願第６２／６８５，３９２号、及び２０１８年９月１０日に出願の米国仮出願第６２／７８２，９８１号、及び両方とも２０１９年４月１５日に出願の米国出願第１６／３８４，４１７号及び第１６／３８４，４２８号は、参照によってそれらの全体がすべての目的で本明細書に援用される。

[本発明の分野]
本発明は、分子マーカーを調節する、したがって、Ｓ－エクオール又はＳ－エクオールを含む医薬組成物を薬学的有効量用いて乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）及び黒色腫を処置又は予防するための方法及び組成物に関する。該方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を促進し得、ＥＲβスイッチを刺激し得、免疫療法を増強し得る。好ましい実施形態において、本方法は、Ｓ－エクオールと、免疫療法などの他の抗がん処置とを使用する組合せ療法に関する。

［関連技術の説明］
本発明の方法及び組成物は、種々のタイプのがん、特にエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の標的応答性のものに適する。乳がんの処置に適すること（２０１８年６月１５日に出願の米国仮出願第６２／６８５，３９２号明細書）に加え、本発明の方法及び組成物は黒色腫の処置に適する（２０１８年９月１０日に出願の米国仮出願第６２／７２８，９８１号明細書参照）。

乳がんは、不均一性が高く、複数のサブタイプからなる。トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）の発現がない、乳がんのサブタイプである（Ｃｌｅａｔｏｒ他（２００７）、Ｋａｎｇ他（２００８）、Ｃｈｉａ及びＴｕｔｔ（２００７）、Ｄｉａｚ他（２００７）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｎｇｕｌｏ（２００７）、Ｒｅｉｓ－Ｆｉｌｈｏ及びＴｕｔｔ（２００８）、Ｉｒｖｉｎ及びＣａｒｅｙ（２００８））ＴＮＢＣはすべての乳がんのおよそ１５％を占めるが、ＴＮＢＣの患者の死亡率は、他のサブタイプの乳がんの患者に比べて不相応な程高い。ＴＮＢＣは、さらに急速な増悪が起こりやすいが（Ｇｅｒｓｏｎ他（２００８）、Ｄｅｎｔ他（２００７）、Ｈａｆｆｔｙ他（２００６）、Ｋａｐｌａｎ及びＭａｌｍｇｒｅｎ（２００８））、「トリプルネガティブ」という特徴が、ＴＮＢＣ患者に、標準的なホルモン療法及びＨＥＲ２標的療法の利益を得られなくしている（Ｂａｕｍ他（２００２）、Ｄａｖｉｅｓ他（２０１３）、Ｇｏｓｓ他（２００５）、Ｓａｎｔｅｎ他（２００９）、Ｓｈｏｕ他（２００４）、Ｓｍｉｔｈ他（２００５））。ＴＮＢＣに対して治療の展望がいくらかあるにもかかわらず、化学療法は、ＴＮＢＣ患者にとって依然として唯一の標準的な処置である。現在の化学療法に抵抗性を示す患者は、実質的な臨床的利益がなく、不必要な毒性を被ってしまう。したがって、ＴＮＢＣにとってさらに安全で有効な処置を開発することが、急務である。

悪性黒色腫には、メラノサイトと呼ばれる色素細胞の制御されない増殖からもたらされる深刻な皮膚がんの可能性がある。黒色腫は、皮膚におけるＵＶ誘発による変化の結果とすることができ、その発症は種々の遺伝子突然変異の結果増加することがある。細胞分裂を調節するｃ－Ｋｉｔ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の負の調節因子であるＭＤｍ２遺伝子、網膜芽細胞腫ＲＢ１遺伝子、及びＭＣ１Ｒ（メラノコルチンー１受容体）遺伝子において生じる突然変異は、黒色腫を発症するリスクを増加させることがある。黒色腫の処置は、外科的処置、化学療法、及び／又は免疫療法の使用を含み得る（Ｇｕｐｔａ他、２０１６、Ｃｌａｒｋ他、２０１６、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ他、２０１７）。

近年、がん免疫療法において、大きな臨床上の飛躍的前進があり（Ｍｅｌｌｍａｎ他（２０１１）、Ｋａｕｆｍａｎ他（２０１３）、Ｂｒｏｗｅｒ（２０１５）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１５））、これには、免疫抑制用免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４又はＣＤ１５２［表面抗原分類１５２］）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）及びＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１、Ｈｏｄｉ他（２０１０）、Ｗｏｌｃｈｏｋ他（２０１３）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１４））を阻害することが含まれる。ＰＤ－１は、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃することを妨げるように「オフスイッチ」として機能する、Ｔ細胞に対するチェックポイントタンパク質である。ＰＤ－１は、腫瘍細胞に、ＰＤ－Ｌ１とともに相互作用する。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１と相互作用すると、Ｔ細胞が腫瘍細胞を攻撃するのを妨げてしまう。ＰＤ－１阻害薬は、現在、黒色腫及び他のがんを処置することに使用されている。

チェックポイント阻害を用いたがん免疫療法の考察が、Ｒｉｂａｓ及びＷｏｌｃｈｏｋ（２０１８）（本明細書の参考文献リストを参照）にあるように公開されており、その全体が、参照により、特に、免疫療法で標的とされる経路と、そのチェックポイント阻害に使用する抗体とを検討する目的で、本明細書に援用される。その上、患者の「ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）」、すなわち、自家Ｔ細胞が異物と認識し得るがん特有のネオエピトープを生成する体細胞突然変異のセットに基づいて、がんワクチンの標的を合理的に選択する方法が、Ｓａｈｉｎ及びＴｕｒｅｃｉ（２０１８）に論じられている（本明細書の参考文献リストを参照）。この公開もまた、その全体が、参照により本明細書に援用され、免疫系の細胞（例えば、ＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性細胞）を活性化して腫瘍細胞を攻撃させ得るような腫瘍抗原を個別に標的にすることを論じたものである。図１及び図２を参照のこと。このようなタイプのがん免疫療法の双方を、本発明に係るＳ－エクオールの使用と組み合わせることができる。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、健康な免疫系を機能させる際主要な役割を果たす。それらは、抗体を作るようにＢ細胞を支援し、微生物を死滅させるマクロファージの能力を活性化させ、他の免疫細胞を身体の感染領域又は炎症領域に動員する。このような活性は、種々のサイトカイン及びケモカインの産生によって統制される。未関与のＣＤ４^＋Ｔ細胞が、支配的な炎症性又は抗炎症性環境に基づいて、Ｔｈ１細胞又はＴｈ２細胞に分化することができ、このように活性化したＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞が、特定のサイトカインの産生パターン及び機能を有することが、先頃から分かってきている。一般に、Ｔｈ１細胞は、細胞内の病原体の根絶と関連付けられる一方で、Ｔｈ２細胞は、細胞外の病原体及び寄生体に対する応答に深く関わるものである。制御が利かなくなったＴｈ１の応答は、自己免疫に関与し、異常なＴｈ２の応答は、アレルギー及び喘息の発症と関連付けられる。しかしながら、このモデルでは、Ｔｈ１のシグナリング及び／又はサイトカインにおける欠損によって、関節リウマチ及び多発性硬化症などの自己免疫疾患がなお発症し得るという知見の説明がつかなかった。さらに最近（２００６）、ＣＤ４Ｔ細胞の第３のサブセットであり、炎症性バイアスを有している、Ｔｈ１７細胞が同定された。動物モデルを用いたその後の研究及びヒトの研究が、Ｔｈ１７細胞について、このような細胞によるＩＬ－１７の分泌が媒介する、細胞外の細菌及び真菌に対する免疫系の防御と自己免疫疾患の発症とにおいて、主要な役割を果たしていることを示した。病原体を取り込み処理することにより活性化される、樹状細胞などの抗原提示細胞からのＩＬ－２３の分泌は、次に、Ｔｈ１７細胞を活性化する。（Ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙより：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐｕｂｉｌｃ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ－ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌｓ／ｔｈ１７－ｃｅｌｌｓ）図２を参照のこと。

ＣＤ８^＋（細胞傷害性）Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞と同様に、胸腺において生成され、Ｔ細胞受容体を発現する。しかしながら、ＣＤ４分子ではなく、細胞傷害性Ｔ細胞の方が、二量体の共受容体、ＣＤ８を発現し、このＣＤ８は、通常１つのＣＤ８α鎖と１つのＣＤ８β鎖とからなる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、すべての有核細胞に認められるＭＨＣクラスＩ分子により提示されるペプチドを認識する。ＣＤ８ヘテロ二量体は、Ｔ細胞／抗原提示細胞の相互作用中にＭＨＣクラスＩの保存部分（α３領域）に結合している（図１を参照）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球又はＣＴＬと呼ばれることが多い）は、ウイルス及び細菌を含む細胞内の病原体に対する免疫防御及び腫瘍の監視のために非常に重要である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、その抗原を認識し活性化するとき、感染又は悪性細胞を死滅させる主要な仕組みを３つ有する。第１が、主にＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γである、サイトカインの分泌であって、これらは、抗腫瘍性と抗微生物作用を有する。第２の主要な機能は、細胞傷害性顆粒の産生と放出である。この顆粒はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に認められるものであって、パーフォリン及びグランザイムの２つのタンパク質ファミリーを含む。パーフォリンは、補体の膜侵襲複合体と同様に、標的細胞の膜に孔を形成する。この孔によって、細胞傷害性顆粒に含まれるグランザイムも、感染又は悪性細胞の中に入ることができる。グランザイムは、細胞内のタンパク質を切断するセリンプロテアーゼであり、ウイルス性のタンパク質の産生を停止させ、最終的に標的細胞のアポトーシスをもたらすことになる。細胞傷害性顆粒は、健康な周りの組織への非特異的な周囲の損傷（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｄａｍａｇｅ）を避けられるように、免疫シナプスに沿ってアライメントする、標的細胞の方向にのみ放出される（図１を参照）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、その顆粒を放出し、感染細胞を死滅させ、そして、新しい標的へと移動し繰り返し死滅させることができ、これは、シリアルキリング（ｓｅｒｉａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）と呼ばれることがある。ＣＤ８^＋Ｔ細胞による感染細胞の破壊という第３の主要な機能は、Ｆａｓ／ＦａｓＬの相互作用によるものである。活性化したＣＤ８^＋Ｔ細胞が、細胞表面にＦａｓＬを発現し、ＦａｓＬが、標的細胞の表面の受容体、Ｆａｓに結合する。この結合によって、標的細胞の表面のＦａｓ分子が、三量体を形成し、三量体が、シグナリング分子を引き合わせる。このシグナリング分子によって、カスパーゼのカスケードが活性化され、これによってまた、標的細胞がアポトーシスに至る。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は両方の分子を発現可能であるので、Ｆａｓ／ＦａｓＬの相互作用は、兄弟殺しと呼ばれる、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が相互に死滅させ合って、免疫応答の最後の収縮段階の間に、免疫エフェクター細胞が排除される仕組みである。ウイルス、細胞内細菌、腫瘍に対する免疫防御における重要な役割の上に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞はまた、免疫病理、すなわち、免疫が媒介する損傷につながる過剰な免疫応答を助長する可能性もある。（Ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙより： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐｕｂｌｉｃ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ－ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌｓ／ｃｄ８－ｔ－ｃｅｌｌｓ）

ＮＫ細胞について、ＰＫ１３６モノクローナル抗体は、Ｃ５７ＢＬ及びＮＺＢを含むＮＫ１．１マウスの系統のナチュラルキラー細胞及びＴ細胞のサブセットにより発現される抗原、マウスＮＫ１．１と反応する。ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＪＬ、ＡＫＲ、ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ及びＡなどの、一般に使用されるいくつかの研究用マウスの系統は、ＮＫ１．１抗原を発現しない。このような系統におけるＮＫ細胞の検出のため、モノクローナル抗体ＤＸＳ１４－５９７１を用いる。ＰＫ１３６及びＤＸＳでＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を同時に染色すると、大多数の細胞による両方のマーカーの同時発現、並びに少ないＤＸＳ＋ＰＫ１３６－及びＤＸＳ－ＰＫ１３６＋細胞集団の存在を示す。

また、ＣＤ４５（リンパ球共通抗原）とそれに関連する分子とが、Ｔ細胞の活性化に重要であることも示されている。ＣＤ４５は、すべての白血球に発現する受容体型プロテインチロシンホスファターゼであり、このような細胞の機能において非常に重要な役割を果たす。Ｔ細胞において、ＣＤ４５の細胞外ドメインが、いくつかの異なるアイソフォームで発現され、発現される特定のアイソフォームは、細胞の特定の分集団、その成熟状態、それ以前に抗原にさらされたことがあるか否かによって決まる。ＣＤ４５の発現は、ＴＣＲによるＴ細胞の活性化に必須であること、及び各種のＣＤ４５アイソフォームが、Ｔ細胞の活性化を支援する各種の能力を発揮することが、確認されている。ＣＤ４５の細胞内領域のチロシンホスファターゼの活性は、ＴＣＲからのシグナル伝達を支援するため非常に重要であることが示されているが、ＣＤ４５の各種のアイソフォームに対するリガンドの性質は、不明瞭のままである。さらに、潜在的リガンドがＣＤ４５の機能を調節することができる精密な仕組みは、不明である。興味深いことに、Ｔ細胞において、ＣＤ４５は、多数の、膜結合性かつ細胞内の分子と関連し、これには、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体及びＣＤ４／ＣＤ８の構成成分が含まれることが、示されている。その上、ＣＤ４５は、ｓｒｃファミリーのＲ５６ｌｃｋ及びｐ５９ｆｙｎと、ＳｙｋファミリーのＺＡＰ－７０とを含むいくつかの細胞内プロテインチロシンキナーゼ、及び２９～３４ｋＤａの多数のタンパク質と関連することが報告されている。このようなＣＤ４５関連分子は、ＣＤ４５チロシンホスファターゼの活性及び機能を調節する際に重要な役割を果たし得る。しかしながら、ＣＤ４５関連分子（例えばＣＤ４５－ＡＰ及びＬＰＡＰ）のいくつかの役割は、近年、さらに良く理解されるようになってきているものの、その他のものの役割は、なおよく分かっていない。本明細書の参考文献リストのＡｌｔｉｎ及びＳｌｏａｎ（１９９７）を参照のこと。

しかしながら、これらの非常に有望な免疫療法は、がん患者の一部に対してのみ有効であって、通常根治的ではない。特に、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）患者における抗ＰＤ－１抗体臨床試験は、患者の１０～２０％の範囲に客観的応答があり、さらに患者の２０％が、もしそうでなければ急速に進行するであろう病気がある程度安定した、という控えめな有効性しか示していない（Ｎａｎｄａ他（２０１６）、Ｅｍｅｎｓ他（２０１５）、Ｄｉｒｉｘ他（２０１５）、Ｒｕｇｏ他（２０１５）、Ｄａｗｏｏｄ及びＲｕｇｏ（２０１６））。よって、ＴＮＢＣ、黒色腫、及び他のがんの処置ための免疫療法に対する個々の応答が向上するように、よりよい治療法を特定する臨床上の差し迫った必要性がある。

ＰＤ－１及びそのリガンドのＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞の免疫を抑制する免疫チェックポイント分子である（Ｌｉｎ他（２０１０）、Ｃｕｒｉｅｌ他（２００３）、Ｂｒａｈｍｅｒ他（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ及びＤｒａｋｅ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２））。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞及び、Ｔｒｅｇを含む一部の免疫細胞において過剰発現する（Ｌｉｎ他（２０１０）、Ｃｕｒｉｅｌ他（２００３）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他２０１２））。抗ＰＤ－１（αＰＤ－１）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（αＰＤ－Ｌ１）を用いた免疫療法で、種々のがんの処置が良好な結果を示すことが証明されている（Ｂｒａｈｍｅｒ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ及びＤｒａｋｅ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２））。ＴＮＢＣに対する初期の臨床試験は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１が、介入に有効な標的であり、処置の毒性が低いことを示している。前処置歴が多く、化学療法耐性となり、ＰＤ－Ｌ１を発現する転移性ＴＮＢＣの女性２７名の第Ｉ相臨床研究において、応答率は、αＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブに対して１８．４％だった（Ｎａｎｄａ他２０１６）。αＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブの同様の臨床研究は、２１の評価可能な、ＰＤ－Ｌ１を発現するＴＮＢＣ腫瘍において１９％という応答率をもたらした（Ｅｍｅｎｓ他（２０１５）、Ｄａｗｏｏｄ及びＲｕｇｏ（２０１６））。別のグループが、ＰＤ－Ｌ１発現に対して選択されていない１６８のＴＮＢＣ腫瘍において、別のαＰＤ－Ｌ１抗体であるアベルマブへの応答率が８．６％という報告をし（Ｄｉｒｉｘ他２０１５）、ＰＤ－Ｌ１腫瘍発現のレベルは、腫瘍応答に影響を与えることにおいて重要となり得ることを示している。ある程度の疾患の安定化が、このような高悪性のサブタイプの乳がんにおいて、この３つの臨床試験で患者の約２０％に見受けられた。深刻な毒性はほとんどなく、免疫調節に関連していた。このような臨床データは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸が、おそらくは有効性を高めるための組合せの手法で、治療標的となり得ることを示している。

乳がん細胞におけるエストロゲンの様々な生理学的作用を媒介するエストロゲン受容体には、２つの別個のタイプがある。第１の受容体は、エストロゲン依存性の乳腺腫瘍の増殖を支えるＥＲα受容体である。第２は、前臨床モデルにおいて乳腺腫瘍細胞の増殖を著しく抑えるように、逆に作用するとみられるＥＲβ受容体である（Ｃｌａｒｋｅ他（２００３）、Ｄｅｒｏｏ及びＫｏｒａｃｈ（２００６）、Ｄｅｒｏｏ及びＢｕｅｎｓｕｃｅｓｏ（２０１０）、Ｈｏｎｍａ他（２００８）、Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ及びＫａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ（２０００）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ及びＮｏｒｒｉｓ（２００２）、Ｍｕｒｐｈｙ及びＷａｔｓｏｎ（２００６）、Ｓｈａａｂａｎ他（２００８）。よって、ＥＲβは、乳がんにおける腫瘍サプレッサーとみなすことができる。ＥＲβは、ＴＮＢＣがんの約４０％に発現し、ＥＲβを標的とする治療上の可能性は、ＴＮＢＣにおいてはまだ調べられていない。前臨床モデルから臨床研究へ移行することを可能にする進歩が、最近２つあった。第１の進歩は、新たに発見された、ＥＲβの抗腫瘍活性を取り集める仕組みであり（Ｈａｒｒｉｓ（２００７）、Ｈａｒｔｍａｎ他（２００９）、Ｈｅｌｄｒｉｎｇ他（２００７）、Ｔｈｏｍａｓ及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ（２０１１））、第２は、ヒトにおいて臨床上の安全性、薬力学及び耐性上の試験がすでに行なわれているＥＲβアゴニスト（Ｓ－エクオール）の経口製剤の開発である（Ｊａｃｋｓｏｎ他（２０１１ａ＆ｂ）、Ｓｅｔｃｈｅｌｌ他（２００５）、Ｓｅｔｃｈｅｌｌ（２００２）、Ｓｃｈｗｅｎ他（２０１２）。

エストロゲン受容体（ＥＲβ、核又は細胞質）は、ＴＮＢＣのおよそ半数（Ｍａｒｏｔｔｉ他（２０１０）、Ｒｅｅｓｅ他（２０１４））、及び黒色腫（Ｍａｒｚａｇａｌｌｉ他、２０１６）に存在すると報告されている。その腫瘍内因性の活性に加え、宿主細胞のＥＲβはまた、黒色腫腫瘍抑制に関連付けられている（Ｃｈｏ他、（２０１０））。ＥＲβの腫瘍外因性の抗腫瘍活性により、Ｃｈｏ他は、ＥＲβ－ＫＯレシピエント動物に移植した同系マウス黒色腫細胞が、ＷＴレシピエントのものより力強く増殖することを示した。この研究において、執筆者等は、その同系のマウス宿主における３つの異なる皮膚がん細胞株の増殖が、エストロゲン受容体の活性に感応性であることを示した。ゆえに、ＳＳＵＶ照射による皮膚がん誘導モデルとして使用したこれらの移植研究は、ＥＲβによるシグナリングが部分的に免疫学的に媒介される皮膚がん増殖を抑制する内在性防護の仕組みであるということを強く示唆している。選択的ＥＲモジュレーター（ＳＥＲＭ）を組織特異的にエストロゲン作用誘発可能な物質として認識することで、ＥＲリガンド治療から恩恵を受け得る、潜在的集団を増やしている。（Ｓｍｉｔｈ及びＯ’Ｍａｌｌｅｙ、２０１８）

よって、ＥＲβ特異的修飾及び／又はリガンド結合によるＥＲβ抗腫瘍活性を取り集めることは、ＴＮＢＣ及び黒色腫治療のよい機会となる。しかしながら、ＥＲβを標的とする治療の可能性は、部分的には、抗腫瘍活性を利用する方法についての知識が不十分であることから、広範囲には活用されてきていない。ＥＲαではなく、ＥＲβにおけるリン酸化チロシン残基（Ｙ３６）が、ＴＮＢＣ細胞におけるＥＲβの抗腫瘍活性を調節するのに重要であることが、最近確認された（Ｙｕａｎ他（２０１４）、Ｙｕａｎ他（２０１６））。

このリン酸化チロシン残基（ｐＹ３６）が、フェニルアラニン基（Ｙ３６Ｆ）を追加することにより意図的に突然変異させられると、ＥＲβ標的遺伝子の活性化が、ＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）において弱まった。Ｙ３６Ｆの突然変異はまた、ＥＲβが生体内外において腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を消し去った。したがって、この前臨床研究は、ＥＲβの抗腫瘍活性におけるｐＹ３６の重要性を強く支持するものである（Ｙｕａｎ他、２０１４）。

ｐＹ３６の状態が乳がん患者の生存率と相関するという証拠もある。米国国立がん研究所（ＮＣＩ）からの予後組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いて研究が行われており、これは、臨床経過観察記録を伴った、大規模コホートの乳腺腫瘍サンプルからなる。全７２６の読み取り可能なＩＨＣサンプルを用いると、ｐＹ３６－陰性腫瘍を有する患者は、ｐＹ３６－陽性腫瘍を有する患者に比べて、無病生存率及び全生存率が統計学的に有意に短くなることが分かった。興味深いことに、生存率との関連性は、ステージＩＩ及びＩＩＩの疾患においてのみ見受けられ、このことは、ｐＹ３６活性が、局所的な進行性から転移性の乳がんへの疾患進行に作用し得るという興味深い可能性を提起する。まとめると、ｐＹ３６の強度は、すべてのＥＲβよりも強い、患者の予後との相関を有するとみられ、これまで真価を認められていないこのリン酸化チロシンスイッチの臨床上の重要性を明確に示している。図３を参照のこと。

ＥＲβアゴニストであるＳ－エクオールは、ラットの海馬のニューロンにおける呼吸及び最大解糖系フラックス、並びに卵巣切除されたマウスの脳におけるチトクロム酸化酵素（ＣＯＸ）活性及びＣＯＸ１タンパク質レベルを増加させることがこれまでに示され、ヒト対象において、健康への影響及び安全性を評価する研究がなされてきた（Ｙａｏ他（２０１３）、Ｊｅｎｋｓ他（２００２）、Ｊａｃｋｓｏｎ他（２０１１ａ＆ｂ）、Ｕｓｕｉ他（２０１３））。

Ｓ－エクオールは、化学的に（すなわち、化学合成で）、又は大豆及びアカツメクサ見受けられるイソフラボンであるダイゼインの腸内細菌による代謝を介した生体内分解（生合成）によって、産生可能である。Ｓ－エクオールの構造を以下に示す。

エクオールは、キラル中心を有し、よって、２つのエナンチオマーの形態で存在し得る。Ｓ－エクオール、Ｒ－エクオール、ラセミ体エクオール（ｒａｃｅｍｉｃ ｅｑｕｏｌ）、及びエクオールの非ラセミ体混合物（まとめて「エクオール」とする）；エクオールの組成物；エクオールの無水結晶多形形態；エクオールの調製プロセス、並びにエクオールを用いた方法が、米国特許第８，７１６，４９７号明細書（２０１２年９月１０日出願）、米国特許第８，０４８，９１３号明細書（２００９年９月１４日出願）、米国特許第７，９６０，４３２号明細書（２００８年７月３日出願）、米国特許第７，３９６，８５５号（２００３年７月２４日出願）、米国特許第８，２６３，７９０号明細書（２０１１年６月１日出願）、米国特許第７，９６０，５７３号明細書（２００９年５月４日出願）、米国特許第７，５２８，２６７号明細書（２００５年８月１日出願）、米国特許第８，６６８，９１４号明細書（２００９年７月３１日出願）、米国特許第８，５８０，８４６号（２００６年８月１８日出願）、米国特許第８，４５０，３６４号明細書（２０１２年４月９日出願）、及び米国特許第８，１５３，６８４号明細書（２００９年１０月２日出願）、米国特許第９，４０８，８２４号明細書（２０１４年３月５日出願）、及び米国特許第９，９１４，７１８号明細書（２０１５年１０月１４日出願）に記載されており、それぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。

イソフラボン及びそれに由来する生成物を含む製剤が、疾患を処置するために過去に使用されてきた。例えば、エクオール、ゲニステイン及びダイゼインの混合物、又はエクオール、ゲニステイン、ダイゼイン及びＩＢＳＯ０３５６９の混合物は、神経変性及びアルツハイマー病を処置又は予防する可能性を示している。Ｚｈａｏ他（２００９）、米国特許第８，５５２，０５７号明細書、Ｙａｏ他（２０１３）（まとめて「Ｂｒｉｎｔｏｎ他」とする）を参照のこと。また、Ｓ－エクオールが、単独で、アルツハイマー病を処置するためのものとして、記載されている。米国特許出願公開第２０１８／００２８４９１号明細書として公開された米国特許出願第１５／６５９，１１４号及び国際公開第２０１８／０２２６０４号を参照されたく、当該文献は、その全体が参照によって援用される。

しかしながら、当該技術において、過去に処置が困難であった他の病状の処置のためにＳ－エクオールを利用する方法が依然として必要とされている。特に、当該技術において、黒色腫の処置にＳ－エクオールを利用する方法が必要とされている。

以下の簡単な概要は、本発明のすべての特徴及び態様を含むことを意図せず、本発明がこの概要に記載されるすべての特徴及び態様を含む必要があるということを示唆するものではない。

本発明者らは、Ｓ－エクオール、好ましくは単離された純粋なＳ－エクオールが、黒色腫患者に利益をもたらすことを見出した。特に、本発明者らは、免疫療法と組み合わせたＳ－エクオールが特に乳がん及び黒色腫の処置に有効であることを見出した。

したがって、本発明の目的は、以下を提供することである。
１．Ｓ－エクオールを含む製剤を、その必要がある対象に薬学的有効量投与することを含む、がんを処置する又は予防するための方法。
２．製剤は１０～２００ｍｇのＳ－エクオールを含む、項１に記載の方法。
３．製剤は５０～１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項１に記載の方法。
４．製剤は約５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項１に記載の方法。
５．製剤は約１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項１に記載の方法。
６．製剤は、経口、静脈内、腹腔内又は皮下投与される、項１に記載の方法。
７．対象はヒトである、項１に記載の方法。
８．Ｓ－エクオールは、１つ以上の他のがん処置と組み合わせて投与される、項１に記載の方法。
９．Ｓ－エクオールは、免疫療法剤と組み合わせて投与される、項８に記載の方法。
１０．免疫療法剤は抗体である、項９に記載の方法。
１１．抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を対象とする、項１０に記載の方法。
１２．抗体は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）を対象とする、項１１に記載の方法。
１３．抗体はペムブロリズマブである、項１１に記載の方法。
１４．抗体はアテゾリズマブである、項１２に記載の方法。
１５．抗体はアベルマブである、項１２に記載の方法。
１６．製剤は、ゲニステイン、ダイゼイン、及び／又はＩＢＳＯ０３５６９を実質的に含まない、項１に記載の方法。
１７．ゲニステイン、ダイゼイン、及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ－エクオールとともに投与されない、項１に記載の方法。
１８．製剤は、Ｒ－エクオールを実質的に含まない、項１に記載の方法。
１９．Ｓ－エクオールは化学的に製造される、項１に記載の方法。
２０．製剤は１日あたり１回投与される、項１に記載の方法。
２１．製剤は１日あたり２回投与される、項１に記載の方法。
２２．製剤は１日あたり３回投与される、項１に記載の方法。
２３．製剤は１日あたり４回投与される、項１に記載の方法。
２４．がんは乳がんである、項１に記載の方法。
２５．乳がんはトリプルネガティブ乳がんである、項２４に記載の方法。
２６．がんは黒色腫である、項１に記載の方法。
２７．１０～２００ｍｇのＳ－エクオールを含む、がんを処置するための組成物。
２８．組成物は５０～１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項２７に記載の組成物。
２９．組成物は約５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項２８に記載の組成物。
３０．組成物は約１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、項２８に記載の組成物。
３１．組成物は、経口、静脈内、腹腔内、又は皮下に投与するように製剤化される、項２７に記載の組成物。
３２．１つ以上の他のがん処置をさらに含む、項２７に記載の組成物。
３３．１つ以上の他のがん処置は免疫療法剤である、項３２に記載の組成物。
３４．免疫療法剤は抗体である、項３３に記載の組成物。
３５．抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を対象とする、項３４に記載の組成物。
３６．抗体は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）を対象とする、項３４に記載の組成物。
３７．抗体はペムブロリズマブである、項３５に記載の組成物。
３８．抗体はアテゾリズマブである、項３６に記載の組成物。
３９．抗体はアベルマブである、項３６に記載の組成物。
４０．組成物は、ゲニステイン、ダイゼイン、及び／又はＩＢＳＯ０３５６９を実質的に含まない、項１に記載の方法。
４１．ゲニステイン、ダイゼイン、及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ－エクオールとともに投与されない、項２７に記載の組成物。
４２．組成物はＲ－エクオールを実質的に含まない、項２７に記載の組成物。
４３．Ｓ－エクオールは化学的に製造される、項２７に記載の組成物。
４４．項２７～４３のいずれか１項に記載の組成物を薬学的有効量投与することを含む、Ｔ細胞受容体活性化の活性化のための方法。
４５．Ｔ細胞受容体活性化はＥＲβリン酸化チロシンスイッチを刺激する、項４４に記載の方法。
４６．Ｔ細胞受容体活性化は免疫療法を増強する、項４４に記載の方法。
４７．免疫療法は抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）である、項４６に記載の方法。

また、本発明は、本明細書における方法のために記載されるようなＳ－エクオールを含む組成物に関する。

本発明の上述及び他の目的、特徴及び利点は、同様の参照符号が各種の図面において同じ部分を指す添付の図面に示されるように、以下の本発明の好ましい実施形態のより具体的な記載から明らかになるだろう。

本出願願書は、少なくとも１つの色付き図面を含む。色付き図面を含むこの出願のいずれの特許又は特許出願公開公報の写しも、申請及び必要手数料支払いの上、特許庁から提供される。

図１は、ＣＤ８^＋細胞の活動の概略図を示す。 図２は、ＣＤ４^＋細胞の活動の概略図を示す。 図３Ａ－Ｂは、乳がんにおけるｐＹ３６と疾患予後との関係を示す図である。図３Ａは、ｐＹ３６－ＥＲβのＩＨＣ強度と相関する、ステージＩＩ～ＩＩＩのサンプルにおける無病生存率及び全生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。図３Ｂは、（Ａ）及び全ＥＲβのＩＨＣ強度と相関する、ステージＩＩ～ＩＩＩのサンプルにおける無病生存率及び全生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。 図４は、組合せ療法の模式図を示す。マウスに、（１）ビヒクル＋ラットＩｇＧ２ａ、（２）Ｓ－エクオール＋ラットＩｇＧ２ａ、（３）ビヒクル＋抗ＰＤ－１抗体、又は（４）Ｓ－エクオール＋抗ＰＤ－１抗体の１つを投与した。抗ＰＤ－１抗体を投与したマウスには、腹腔内に３日毎２５０μｇを与え、Ｓ－エクオールを投与したマウスには、経口強制投与により１日あたり５０ｍｇ／ｋｇを与えた。Ｂ１６黒色腫による腫瘍負荷の７日後に、処置を開始した。 図５Ａ－Ｄは、免疫細胞におけるＥＲβシグナリングの役割を示す図である。図５Ａはキメラ試験の模式図を示す。図５Ｂは、キメラ化マウス（ＷＴ＞ＷＴ：ｎ＝１０、ＫＩ＞ＷＴ：ｎ＝４）における腫瘍増殖を示す。ｐ＝０．０００３。図５Ｃは、腫瘍からの全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を示す。図５Ｄは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を発現する、腫瘍からのＣＤ８^＋Ｔ細胞を示す。 図６は、１２日にわたってＢ１６黒色腫腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。マウスには、腹腔内に３日毎２５０μｇで抗ＰＤ－１抗体を投与し、経口強制投与により１日あたり５０ｍｇ／ｋｇでＳ－エクオールを投与した。図６は、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍体積を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、負荷後１２日にわたって腫瘍体積をＳ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。 図７は、１９日にわたってＢ１６黒色腫腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。マウスには、腹腔内に３日毎２５０μｇで抗ＰＤ－１抗体を投与し、経口強制投与により１日あたり５０ｍｇ／ｋｇでＳ－エクオールを投与した。図７は、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍体積を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、負荷後１９日にわたって腫瘍体積をＳ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。 図８Ａ－Ｂは、Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞株を負荷したマウスの腫瘍重量における抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。図８Ａは、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍重量を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、腫瘍重量を、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。図８Ｂは、各処置におけるマウスの全体重を示す。 図９Ａ－Ｂは、１６日にわたってＢ１６黒色腫腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体及びＬＹ５００３０７と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。マウスには、腹腔内に３日毎２５０μｇで抗ＰＤ－１抗体を投与し、経口強制投与により１日あたり５０ｍｇ／ｋｇでＳ－エクオールを投与した。図９Ａは、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍体積を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、負荷後１２日にわたって腫瘍体積をＳ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。図９Ｂは、選択的ＥＲβアゴニスト（ＳＥＲＢＡ－１、エルテベレル）であるＬＹ５００３０７の結果を示す。 図１０は、Ｓ－エクオールを用いたヒト臨床試験の一般的プロトコルを示す。 図１１Ａ－Ｂは、腫瘍増殖におけるＥＲβシグナリングの宿主における作用を示す。図１１Ａは、ＷＴ、ＫＯ及びＫＩ動物の組織におけるマウスＥＲβのイムノブロットを示す。ポンソーＳでタンパク質ローディングに対して染色している。図１Ｂは、ＷＴ及びＫＩ雌マウス（ｎ＝８）に、同系マウスの乳房腫瘍細胞を同所性注入したこと（Ｍ－Ｗｎｔｌ、１ｘ１０^４）を示す。＊ｐ＜０．０５。 図１２は、ＡＴ３乳房腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。マウスには、３日毎２００μｇで抗ＰＤ－１抗体を投与し、１日あたり５０ｍｇ／ｋｇでＳ－エクオールを投与した。図１２は、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍体積を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、負荷後３５日にわたって腫瘍体積をＳ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。また、図１２は、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍重量を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、腫瘍重量を、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。また、図１２は、ビヒクル＋ＩｇＧ２ａ、Ｓ－エクオール＋ＩｇＧ２ａ、ビヒクル＋抗ＰＤ－１抗体、及びＳ－エクオール＋抗ＰＤ－１抗体で処置したマウスの腫瘍を示し、個々に、Ｓ－エクオール及び抗ＰＤ－１抗体が、腫瘍の大きさを、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールは、腫瘍の大きさを、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して減少させることを示す。 図１３は、腫瘍浸潤リンパ球の解析を示す。図１３（左上）は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独で処置したマウスと比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体とを併用して処置したマウスにおいて、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋細胞のパーセンテージが増加したことを示す。また、図１３（右上）は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独で処置したマウスと比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体とを併用して処置したマウスにおいて、ＣＤ４^＋細胞が減少したことを示す。図１３（左下）は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独で処置したマウスと比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体とを併用して処置したマウスにおいて、ＣＤ８^＋細胞が増加したことを示す。図１３（右下）は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独で処置したマウスと比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体とを併用して処置したマウスにおいて、ＮＫ１．１^＋細胞が増加したことを示す。 図１４は、Ｅ０７７１乳房腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。マウスには、３日毎２００μｇで抗ＰＤ－１抗体を投与し、１日あたり５０ｍｇ／ｋｇでＳ－エクオールを投与した。図１４は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体との併用では、腫瘍体積が負荷後２８日にわたって減少することを示す。 図１５は、Ｅ０７７１乳房腫瘍細胞株を負荷したマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＳ－エクオールの効果を示す。図１５（上）は、ビヒクル＋ＩｇＧ２ａ、Ｓ－エクオール＋ＩｇＧ２ａ、ビヒクル＋抗ＰＤ－１抗体、及びＳ－エクオール＋抗ＰＤ－１抗体で処置したマウスの腫瘍を示す。図１５（下）は、Ｓ－エクオール又は抗ＰＤ－１抗体単独と比較して、Ｓ－エクオールと抗ＰＤ－１抗体とのを併用では、腫瘍重量が減少することを示す。 図１６は、Ｓ－エクオールが、ｐＹ３６を刺激し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖を抑制することを示す。図１６は、Ｓ－エクオールがＭＤＡ－ＭＢ－２３１の異種移植による腫瘍の増殖を抑制することを示す。 図１７は、パイロット臨床研究の結果を示す（以下の実施例１２）。 図１８は、Ｓ－エクオールを用いたヒト臨床試験の概略を示す。 図１９Ａ－Ｂは、乳がんにおけるｐＹ３６と疾患予後との関係を示す図である。図１９Ａは、ｐＹ３６－ＥＲβのＩＨＣ強度と相関する、ステージＩＩ～ＩＩＩのサンプルにおける無病生存率及び全生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。図１９Ｂは、（Ａ）及び全ＥＲβのＩＨＣ強度と相関する、ステージＩＩ～ＩＩＩのサンプルにおける無病生存率及び全生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。 図２０は、Ｓ－エクオールが、異種移植マウスモデルにおいてＴＮＢＣ細胞の増殖を減少させることを示す。図２０（上）は、対照群とＳ－エクオールで処置したマウス群の腫瘍におけるＫｉ－６７陽性を示す。図２０（下）は、Ｋｉ－６７免疫組織化学的検査（ＩＨＣ；×４０）の画像を示す。 図２１Ａ－Ｃは、ＥＭＴ６乳房腫瘍を用いたＳ－エクオール及び／又はα－ＰＤ－１による処置を示す。マウスに、３×１０^５のＥＭＴ６細胞を注入した。α－ＰＤ－１を、３日毎２００μｇ／ｍｏｕｓｅで腹腔内投与し、Ｓ－エクオールを、強制投与により５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。図２１Ａは、ビヒクルとα－ＩｇＧ２ａとの併用（青色の線（〇））、Ｓ－エクオールとα－ＩｇＧ２ａとの併用（赤色の線（△））、ビヒクルとα－ＰＤ－１との併用（紫色の線（□））及びＳ－エクオールとα－ＰＤ－１との併用（緑色の線（▽））における腫瘍負荷後２８日間にわたる腫瘍体積を示す。図２１Ｂは、ビヒクルとα－ＩｇＧ２ａとの併用（青色の点（〇））、Ｓ－エクオールとα－ＩｇＧ２ａとの併用（赤色の点（△））、ビヒクルとα－ＰＤ－１との併用（紫色の点（□））及びＳ－エクオールとα－ＰＤ－１との併用（緑色の点（▽））における腫瘍負荷後のＥＭＴ６腫瘍重量を示す。図２１Ｃは、ビヒクルとα－ＩｇＧ２ａとの併用（上の行）、Ｓ－エクオールとα－ＩｇＧ２ａとの併用（上から２番目の行））、ビヒクルとα－ＰＤ－１との併用（上から３番目の行）及びＳ－エクオールとα－ＰＤ－１との併用（下の行））における腫瘍負荷後の腫瘍の大きさを示す。 図２２Ａ－Ｈは、処置後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図２２ＡはＣＤ４５の発現を示す。図２２ＢはＣＤ８の発現を示す。図２２ＣはＣＤ４の発現を示す。図２２ＤはＮＫ１．１の発現を示す。図２２Ｃは、ＣＤ３発現パーセントとしてのＣＤ１０７ａの発現を示す。図２２Ｆは、ＣＤ８発現パーセントとしてのＣＤ１０７ａの発現を示す。図２２Ｇは、ＣＤ４発現パーセントとしてのＣＤ１０７ａの発現を示す。図２２Ｈは、ＮＫ１．１発現パーセントとしてのＣＤ１０７ａの発現を示す。 図２３Ａ－Ｇは、リン酸化チロシンスイッチが宿主のＥＲβの腫瘍増殖抑制に重要であることを示す。（２３Ａ）図２３Ａは、ＷＴ及びＫＩマウスのＷＴ及びＫＩアレルの代表的な遺伝子型決定結果である。（２３Ｂ）図２３Ｂは、マウスの骨髄及び脾臓におけるＥＲβタンパク質レベル（ポンソーＳをローディング対象群として示す）を示す。（２３Ｃ）図２３ＣはＷＴ／ＫＩマウスにおけるＭ－Ｗｎｔ乳房腫瘍増殖を示し、（２３Ｄ）図２３ＤはＷＴ／ＫＩマウスにおけるＢ１６黒色腫増殖を示す。図２３Ｅ～図２３Ｇは、フローサイトメトリーのＢ１６黒色腫浸潤（２３Ｅ）ＣＤ３＋、（２３Ｆ）ＣＤ４＋及び（２３Ｇ）ＣＤ８＋細胞パーセンテージを示す。 図２４Ａ－Ｋは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβシグナリングが腫瘍抑制をもたらすことを示す。図２４Ａは、ＷＴ＞ＷＴマウス又はＷＴ＞ＫＩマウスを作製するために用いた骨髄養子移入手法の概略図である。５週齢のＣＤ４５．１＋Ｂ６．ＳＪＬに照射し、これまでに記載されているようにＣＤ４５．２＋ＷＴ又はＫＩの骨髄で再構築した（Ｗａｎｇ、２０１１）。ＷＴ＞ＷＴ及びＫＩ＞ＷＴの雄（図２４Ｂ）と雌（図２４Ｃ）のキメラマウスにおけるＢ１６黒色腫増殖を示す。図２４Ｄは、図２４Ｂと同様に負荷したマウスの全肺溶解物から、表示した遺伝子のｑＰＣＲを示す。図２４Ｅは、（図２４Ｂ）と同様に、Ｂ１６黒色腫浸潤（図２４Ｅ）ＣＤ８＋、（図２４Ｆ）ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞含有量のフローサイトメトリーを示す。フローサイトメトリーを用いて、図２４Ｂと同様に、ＴＤＬＮにおけるＣＤ８＋ＣＸＣＲ３＋細胞の（図２４Ｇ）割合及び（図２４Ｈ）ＭＦＩを解析した。図２４Ｉは、脾臓、並びにマウスの肺及び卵巣の組織溶解物の精製ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）におけるＥＲβタンパク質レベル（ＧＡＰＤＨをローディング対照群として示す）を示す。（図２４Ｊ）図２４Ｊは、ＷＴ又はＫＩマウスからＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入した後のＲａｇ１－／－マウスにおけるＢ１６黒色腫増殖を示す。図２４Ｋは、Ｂ１６黒色腫－４８８浸潤細胞集団における全ＣＤ４５＋のうちのＣＤ８＋のパーセンテージの関係を示している。 図２５Ａ－Ｃは、ＥＲβシグナリングがＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を促進することを示す。図２５Ａは、表示した時間における抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理あり／なしのマウス初代ＣＤ８Ｔ細胞におけるｐＹ３６（上）及び全ＥＲβ（下）のＩＰ－ウェスタンブロットを示す。図２５Ｂは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した、又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８なしで刺激した、ＷＴ又はＫＩマウスから精製したＣＤ８Ｔ細胞によるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ測定を示す。図２５Ｃは、ＷＴ又はＫＩマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって、表示した時間刺激し、表示したリン酸化タンパク質（ｐ－）及び全タンパク質をイムノブロッティングによって解析したことを示す。β－チューブリンはローディング対象群として用いた。図２５Ｄは、表示した時間において抗ＣＤ３／ＣＤ２８で処理したＥＬ４細胞における内在性ＥＲβ、ｐ－Ｌｃｋ、及びｐ－ＺＡＰ－７０のｃｏ－ＩＰを示す。 図２６Ａ－Ｇは、ＥＲβアゴニストであるＳ－エクオールがＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化と抗腫瘍免疫療法を促進することを示す。図２６Ａは、Ｓ－エクオールで４時間前処理し、その後、表示した時間において抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理をしたマウス初代ＣＤ８Ｔ細胞におけるｐＹ３６（上）及び全ＥＲβ（下）のＩＰ－ウェスタンブロットを示す。図２６Ｂ及び図２６Ｃは、４群の処置をした野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスにおけるＢ１６黒色腫増殖及び腫瘍重量を示す。ビヒクル＋α－ＩｇＧ、Ｓ－エクオール＋α－ＩｇＧ、ビヒクル＋α－ＰＤ－１、Ｓ－エクオール＋α－ＰＤ－１。図２６Ｄは、４群の処置をした野生型ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにおけるＥＭＴ－６乳房腫瘍増殖及び（図２６Ｅ）腫瘍重量を示す。ビヒクル＋α－ＩｇＧ、Ｓ－エクオール＋α－ＩｇＧ、ビヒクル＋α－ＰＤ－１、Ｓ－エクオール＋α－ＰＤ－１。低ＥＲβヒト黒色腫ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）に対する高ＥＲβにおけるＧＳＥＡ解析を示す。（図２６Ｆ）ＮＦＡＴ経路と（図２６Ｇ）ＴＮＦαシグナリングのエンリッチメントを評価した。 図２７Ａ－Ｃは、ＥＲβＹ５５Ｆノックインマウスの作製を示す。図２７Ａは相同組換え手法を示す。図２７Ｂは、Ｅｓｒ２天然遺伝子座におけるゲノム変化が確認されたことを示す。図２７ＣはＫＩマウスの写真を示す。 図２８Ａ－Ｃは、リン酸化チロシンスイッチが宿主のＥＲβの腫瘍増殖抑制に重要であることを示す。図２８Ａは、腫瘍負荷後の数日における雄マウスの結腸腫瘍体積を示す。図２８Ｂは、腫瘍負荷後の数日における雌マウスの黒色腫腫瘍体積を示す。図２７ＣはＫＩマウスにおける肺転移を示す。 図２９Ａ－Ｇは、ＷＴ及びＫＩマウスにおける腫瘍及びＴＤＬＮの免疫表現型解析を示す。図２９Ａは、全細胞のうちのＣＤ３^＋％を示す。図２９Ｂは、全細胞のうちのＣＤ４^＋％を示す。図２９Ｃは、全細胞のうちのＣＤ８^＋％を示す。図２９Ｅは、生細胞のうちのＣＤ４５^＋％を示す。図２９Ｆは、全Ｔ細胞のうちのＣＤ４^＋％を示す。図２９Ｇは、全Ｔ細胞のうちのＣＤ８^＋％を示す。 図３０は、ＥＲβシグナリングは、未処置又は担腫瘍マウスにおいてＭＤＳＣの存在量に影響を与えない。 図３１Ａ－Ｃは、ＷＴ又はＫＩ骨髄で再構築したキメラマウスにおける腫瘍増殖を示す。図３１Ａは、担腫瘍マウスのＭＤＳＣの存在量にＥＲβの影響はないことを示すＦＡＣＳプロットである。図３１Ｂは、負荷後の生存日数パーセントを示すグラフである。図３１Ｃは、マウスの腫瘍を示す。 図３２Ａ－Ｆは、キメラマウスの腫瘍の免疫表現型検査を示す。図３２Ａは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるＣＤ４５のうちのＣＤ４^＋細胞％を示す。図３２Ｂは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるＭＨＣＩＩ（ＣＤ１１ｃ^＋のＭＦＩ）を示す。図３２Ｃは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^－（ＣＤ８^＋％）を示す。図３２Ｄは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるＴＮＦα（ＣＤ８^＋のＭＦＩ）を示す。図３２Ｅは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるパーフォリン（ＣＤ８^＋のＭＦＩ）を示す。図３２Ｆは、野生型マウスに対するＫＩマウスにおけるＰＤ１^＋Ｌａｇ３^＋（ＣＤ８^＋％）を示す。 図３３Ａ－Ｄは、ＥＲβ選択的アゴニストであるＳ－エクオールが抗ＰＤ－１免疫療法を増強することを示す。図３３Ａは、Ｅ０７７１における負荷後の数日の腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す。図３３Ｂは、種々の組合せ療法における腫瘍重量（ｇ）を示す。図３３Ｃは、ＡＴ３における負荷後の数日の腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す。図３３Ｄは、種々の組合せ療法における腫瘍重量（ｇ）を示す。 図３４Ａ－Ｇは、ＥＲβと抗腫瘍免疫シグネチャー遺伝子発現との相関を示す。図３４ＡはＥＳＲ２対ＣＤ４の相関を示す。図３４ＢはＥＳＲ２対ＣＤ８Ａの相関を示す。図３４ＣはＥＳＲ２対ＧＺＭＢの相関を示す。図３４Ｄは浸潤レベルに対するマーカーの発現を示す。図３４Ｅはマーカーの発現を示す。

他の定義をしない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用可能であるが、好ましい方法及び材料を記載している。一般的に、細胞及び分子生物学並びに分子化学に関して使用される専門語及びそれらの技術は、周知のものであり、本技術分野において通常使用されるものである。特に規定されない特定の実験方法が、一般に、当該技術において周知の、また、本明細書を通して引用及び述べている種々の全体的な参考文献及びさらに個別の参考文献に記載の従来の方法によって、実施されている。明確にするため、下記の用語を以下において定義する。

「実質的に純粋な」は、純度を低下させる任意のタンパク質が、約９０％の純度、好ましくは９５％の純度、さらに好ましくは９８％の純度であることを意味する。

「実質的に含まない」は、純度を低下させる任意のタンパク質が、約１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満であることを意味する。

「およそ」又は「約」は、測定対象物が、＋／－１０％以内、好ましくは＋／－５％以内、より好ましくは＋／－２％以内であることを意味する。

「ＴＮＢＣ腫瘍」は、ＩＨＣにより、ＥＲ－アルファ及びＰＲについて癌細胞が５％未満又は５％核染色されたものかつＨＥＲ－２について０、１＋又は２＋のいずれかで染色されたものと定義される。蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）のみをＨＥＲ－２に対して実施する場合、ＨＥＲ－２は、２．０未満又は２．０である必要がある。ＥＲ－ベータ又はｐＹ３６全体の明らかな核染色を示す（細胞質の染色に拘わらず）腫瘍細胞は、陽性とスコアリングされることになる。

本発明は、Ｓ－エクオールを用いた乳がん又は黒色腫の予防及び／又は処置に関する。

Ｓ－エクオールの投与量及び投与計画は、Ｓ－エクオールが、黒色腫発症のリスクがある患者に予防的に投与されるか、又は黒色腫とすでに診断されている患者の処置として投与されるかにより異なってくる。黒色腫発症のリスクがある人は、黒色腫の家族歴がある人及び／又はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子、ＭＤｍ２遺伝子、ＲＢ１遺伝子、若しくはＭＣ１Ｒ遺伝子に１つ以上の突然変異を有する可能性のある人であり得る。黒色腫とすでに診断されている患者において、投与量及び投与計画はまた、がんのステージ（ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶ又はステージＶ）、関与するリンパ節の数、腫瘍の大きさ、並びに他の治療法をともに実施することの利用可能性及び／又は判定によって変化し得る。投与量及び投与計画はまた、限定はしないがＨｓｐ９０、ＲＧＳ１、オステオポンチン、ＨＥＲ３、ＩＮＧ４、ＩＮＧ３、ＮＣＯＡ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、Ｋｉ６７、及びｐＹ３６を含む、腫瘍細胞上又は中に存在する種々の分子マーカーにより変化し得る。腫瘍の高悪性及び／又は再発の可能性について予後診断となるマーカー診断テストは、投与計画を決定する要因として使用することができる。（Ｇｏｇａｓ他（２００９）、これは、参照によりその全体がすべての目的のため援用される。）

Ｓ－エクオールは、１日あたり１回以上１服用量あたり１～４００ｍｇ、より好ましくは１０～３２０ｍｇ、より好ましくは５０～１５０ｍｇを投与可能である。非限定的例は、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３２０ｍｇ等の服用量又はおよそ若しくは約そのような服用量を含む。その服用量を、１日あたり１回、２回、３回又は４回、好ましくは１日あたり２回（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）投与することができる。投与計画は、無期限に、すなわち、マーカーが検査され服用量に対する応答性が判定される間隔における時間、継続させることができる。このような間隔の例は、２週間、４週間、２か月、４か月、６か月等の間隔又は約若しくはおよそこのような間隔である。上限は、投与計画に関して、必要ない。

投与されるＳ－エクオールは、好ましくは経口投与用に製剤化されるが、他の投与経路も考えられ、それには、経直腸、点眼、経口腔（例えば、舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内及び静脈内）並びに経皮投与が含まれる。

本発明に係る組成物又は製剤は、１つ以上の薬学的に許容される又は産業標準の充填剤を含むことができる。充填剤は、組成物で処置される対象に有害であってはならない。充填剤は、固体若しくは液体、又は両方であり得る。充填剤は、単位服用量として、例えば錠剤として、活性Ｓ－エクオールとともに製剤化可能であり、Ｓ－エクオールを約１０重量％～８０重量％含み得るのが一般的である。組成物は、周知の製剤技術の任意のものにより、例えば、医薬分野で周知であるように任意選択的に賦形剤、希釈剤（例えば、水）及び助剤を含む成分を混合することにより、調製可能である。

経口投与に適切な組成物は、それぞれが所定量の抽出物を含有する、カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤若しくは錠剤など、散剤若しくは顆粒剤など、水性若しくは非水性液体中の液剤若しくは懸濁剤など、又は水中油若しくは油中水型乳剤などの、個別の単位で提供可能である。このような組成物は、活性Ｓ－エクオールと、１つ以上の適切な担体（上述のように１つ以上の副成分（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）を含有し得る）とを関連付けるステップを含む、任意の適切な製剤方法により、調製可能である。一般に、本発明の組成物は、Ｓ－エクオールを、液体若しくは微粉固体の担体と又はその両方と、均一にかつ密に混合させ、次に、必要な場合は、結果として得られる混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は、任意選択的に１つ以上の副成分とともに、抽出物を含有する粉末又は顆粒を含ませるか又は成形することにより、調製可能である。圧縮錠剤は、任意選択的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤及び／又は界面活性剤／分散剤と混合した粉末又は顆粒の形態の抽出物を、適切な機械で圧縮することにより、調製可能である。成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化複合物を、適切な機械で成形することにより作製可能である。

砂糖など、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール若しくはソルビトール、セルロース製剤、及び／又はリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウム若しくはリン酸水素カルシウムといった適切な充填剤と、さらに、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはバレイショデンプンを用いたデンプンのり、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｕｌｌｏｓｅ）及び／又はポリビニルピロリドンなどの結合剤と、必要に応じて、上述のデンプン、さらに、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニル型ピロリドン、カンテン又はアルギン酸若しくは、アルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤と、である。賦形剤は、滑沢剤及び潤滑剤、例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸若しくはその塩、及び／又はポリエチレングリコールであり得る。糖衣錠には、適切で任意選択的に腸溶性のコーティングが施され、なかでも、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／若しくは二酸化チタンを含み得る濃縮糖液、又は適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物中のコーティング液、又は、腸溶性コーティング製剤のための、微結晶セルロース、酢酸フタル酸セルロース若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの適切なセルロース製剤の溶液が、用いられている。色素又は顔料を、錠剤又は糖衣錠コーティングに、例えば、識別目的で又は有効成分の各種服用量を示すために、添加することができる。

他の経口投与可能な医薬組成物は、例えば、ゼラチンからなる乾燥充填カプセル剤であり、また、ゼラチンと、グリセロール又はソルビトールなどの可塑剤とからなる軟質密封カプセル（ｓｏｆｔ，ｓｅａｌｅｄ ｃａｐｓｕｌｅ）である。乾燥充填カプセル剤は、例えば、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどのグリカント（ｇｌｉｃａｎｔ）、及び適切な場合安定剤との混合物中に、顆粒の形態で抽出物を含み得る。軟質カプセルにおいて、抽出物は、好ましくは、脂肪油、パラフィン油又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁されており、そこに、安定剤も添加することができる。

本発明の一態様によれば、Ｓ－エクオールを含む組成物は、米国特許第７，９６０，４３２号明細書（２００８年７月３日出願）、米国特許第７，３９６，８５５号明細書（２００３年７月２４日出願）及び米国特許第９，４０８，８２４号明細書（２０１４年３月５日出願）に記載のものを含み、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本発明の別の態様によれば、Ｓ－エクオールは、米国特許第８，７１６，４９７号明細書（２０１２年９月１０日出願）、米国特許第８，２６３，７９０号明細書（２０１１年６月１日出願）、米国特許第７，９６０，５７３号明細書（２００９年５月４日出願）、米国特許第７，５２８，２６７号明細書（２００５年８月１日出願）及び米国特許第９，９１４，７１８号明細書（２０１４年１０月１４日出願）に記載のプロセスにより、化学的に（すなわち、化学合成により）調製可能であり、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。例えば、Ｓ－エクオールは、エナンチオ選択的に、キラル配位子を有するイリジウム触媒を用いて調製可能である。Ｓ－エクオールをエナンチオ選択的に調製するこのような方法は、参照により援用される。

本発明の別の態様によれば、Ｓ－エクオールは、米国特許第９，９１４，７１８号明細書（出願番号１４／８８３，６１７、２０１５年１０月１４日出願）に記載のＳ－エクオールの無水結晶多形形態など、Ｓ－エクオールを単一の無水結晶多形形態とすることができ、その開示は、Ｓ－エクオールの無水結晶多形形態を特徴づけるのに用いられる化学的及び物理的特性を含め、その全体が参照により援用される。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１０２０７０号明細書に記載のＳ－エクオールの無水結晶多形形態は、以下の特徴的なＸ線粉体回折パターン波数（ｃｍ^－１）：３４３３、３０２３、３００３、２９０８、２８４４、１８８９、１６１４、１５９４、１５１７、１５０８、１４６９、１４５４、１４３８、１４００、１３６１、１３２３、１２９５、１２７６、１２６１、１２３４、１２１３、１１７６、１１５６、１１１６、１０６４、１０２０、９３５、８９７、８６５、８４０、８２５、８１０、７６９、７３４、６３１、６１６、５４７、５１７、４８０及び４６１を有する。Ｓ－エクオールの無水結晶多形形態の特徴は、参照により援用される。

Ｓ－エクオールは、１つ以上の追加のがん処置と組み合わせて投与することができ、追加のがん処置には、外科的処置、細胞傷害性化学療法、放射線、免疫療法、がんワクチン、細胞経路阻害剤（タンパク質又はペプチド、核酸ベースの［ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ］及び／又はホルモン（アジュバント内分泌）療法が含まれる。黒色腫の処置に適切な細胞傷害性化学療法の例は、これらに限定されないが、イミキモドクリーム剤（ジクララ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、及びテモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）を含む。免疫療法の例は、これらに限定されないが、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、及びイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｖａｃ））、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））、又はインターフェロン及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む。他の選択肢は、Ｔ－ＶＥＣワクチン（Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標））、又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチンの注射を含む。

乳がんの処置に適切な細胞傷害性化学療法の例は、これらに限定されないが、ドキソルビシン（アドリアマイシン）及びエピルビシン（エレンス）等のアントラサイクリン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））等のタキサン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、シクロホスファミド（シトキサン）、並びにカルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））を含む。アジュバント内分泌療法の例は、タモキシフェン、並びにアナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））及びレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））等のアロマターゼ阻害剤を含む。免疫療法の例は、これらに限定されないが、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、トレメリムマブ、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ、トラスツズマブ、ＰＤＲ００１及びＭＧＤ００９を含む。既知の細胞経路阻害剤の例は、ラパチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤である。

免疫療法モノクローナル抗体又は他のがん治療剤の適切な投与量は、効能に基づいて決定され、その決定は、十分、当該技術分野の技術の範囲内である。投薬は、ｍｇ、ｍｇ／ｋｇ又はｍｇ／ｍ^２であってよい。Ｓａｃｈｓ他（２０１６）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が、治療用抗体、低分子及び投与量の例を含めて、すべての目的のため本明細書に援用される。Ｓ－エクオール及び／又は追加の治療用組成物は、服用量、毒性及び効能によって、１日あたり１回、２回、３回又はそれ以上投与することができる。投薬は、数日間、数週間又は数か月にわたって行うことができ、連続して又は断続的に行うことができる。免疫治療剤の典型的な投与量は、５０～５００ｍｇ／ｄａｙであり、より好ましくは１００～４００ｍｇ／ｄａｙであり、より好ましくは１５０～２５０ｍｇ／ｄａｙである。特定の実施形態では、服用量を、１５０ｍｇ／ｄａｙ若しくは１５０ｍｇを１日あたり２回、又は２５０ｍｇ／ｄａｙ若しくは２５０ｍｇを１日につき２回とすることができる。他の実施形態では、投与量は、患者の体重に基づいて、例えば、０．５～１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１、２又は５ｍｇ／ｋｇとすることができる。投与量はまた、ｍｇ／ｍ^２として、例えば、５０～５００ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは１００～３００ｍｇ／ｍ^２、例えば、約１００、１５０、２００、２５０又は３００ｍｇ／ｍ^２とすることができる。

投与量は、前述の範囲の任意の範囲の約下限か若しくは下限より多くすることができ、又は上述の範囲の任意の範囲の約上限か若しくは上限より少なくすることができる。

Ｓ－エクオール＋／－の他のがん治療に対する応答性は、画像診断技術、細胞増殖アッセイ及び腫瘍の直接検査により、１つ以上の細胞マーカーを解析することによって評価することができる。細胞マーカーの解析は、免疫組織化学的若しくは免疫細胞化学的技術を用いて、又はハイブリダイゼーション法及びポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などの核酸検出により、行うことができる。有糸分裂及び腫瘍増殖を評価するための好ましいバイオマーカーは、Ｋｉ６７（Ｂｅｅｌｅｎ他（２０１２）、Ｕｒｒｕｔｉｃｏｅｃｈｅａ他（２００５））である。

以下の実施例は本発明を理解しやすくするために提供するものであって、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。示される方法において、本発明の趣旨を逸脱することなく変形を行うことができるということが理解される。

本発明のプロセスは、以下の実施例に関連してさらによく理解されるであろうが、実施例は、例証に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図していない。開示の実施形態への種々の変更及び改変は、当業者に明らかであろう。また、このような変更及び改変は、限定はしないが、本発明のプロセス、配合物及び／又は方法に関するものを含み、本発明の趣旨及び添付の特許請求の範囲から逸脱せずに行うことができる。

実施例１
新たに特定されたリン酸化チロシンスイッチが、ＥＲβの腫瘍外因性機能を調節するか否かを判定するために、マウス内在性ＥＲβの対応のチロシン残基をフェニルアラニン（Ｙ－Ｆ）に突然変異させた全身ノックイン（ＫＩ）マウスモデル（Ｃ５７ＢＬ／６）を作製した。これまでに報告されているＥＲβノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｋｒｅｇｅ他（１９９８））と一致するが、このようなリン酸化による突然変異ＫＩマウスは、明らかな発育異常はなく、ＷＴ同腹仔と全く区別不可能であった（非公開データ）。ＫＯ及びＫＩマウスにおけるＥＲβ発現の調査は、Ｙ－Ｆ突然変異タンパク質が、骨髄及び脾臓を含めて複数の組織においてＷＴのＥＲβと比較可能なレベルで発現することを示した（図４Ａ）。種々の起源の同系マウスの腫瘍細胞を、基底様（ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ）乳がん特性を有するＭＭＴＶ－Ｗｎｔ乳房腫瘍細胞株を含めて（Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ他（２０１３））、ＷＴ及びＫＩレシピエントマウスに移植した。全例で、腫瘍細胞は、ＥＲβ ＫＩレシピエントマウスにおいて、同系のＷＴ対応動物においてよりも、さらに力強く増殖した（図４Ｂ、データは図示せず）。このようなデータは、明らかに、リン酸化チロシンスイッチが、複数の腫瘍タイプにおけるＥＲβの腫瘍外因性抗腫瘍活性にとって重要であることを示している。

実施例２
以下の実験は、抗腫瘍免疫の役割と、がん免疫療法における最近の臨床上の進歩とに基づいた腫瘍抑制における宿主のＥＲβシグナリングをさらに詳述しようとした（Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１５）、Ｃｈｅｎ及びＦｌｉｅｓ（２０１３）、Ｓｈａｒｍａ及びＡｌｌｉｓｏｎ（２０１５））。骨髄移植を必要とするマウスキメラの実験を行った。図５Ａに図示したように、まず、ＷＴレシピエントマウスに照射（１０Ｇｙ）して内在性骨髄細胞を死滅させ、続いて、同系のＫＩ又はＷＴドナーから骨髄を移植した。ＫＩ＞ＷＴ及びＷＴ＞ＷＴマウスにおいてキメラ化がうまくいくことを確認した後、骨髄を移植してから８週で腫瘍細胞を注入した。腫瘍増殖が、ＷＴ＞ＷＴ対照群に対して、（ＫＩ免疫細胞を伴う）ＫＩ＞ＷＴキメラの方が有意に多かった（図５Ｂ）。このことは、ＫＩ免疫細胞による腫瘍増殖調節が不十分であったことを示唆している。よって、このようなデータは、腫瘍外因性ＥＲβが、免疫応答に対して抗腫瘍活性することの重要性と関連している。

実施例３
次に、腫瘍浸潤免疫細胞集団を解析した。腫瘍浸潤ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の総数は、ＷＴ＞ＷＴマウスと比較してＫＩ＞ＷＴマウスでは減少し（図５Ｃ、データは図示せず）、さらに、ＫＩマウスにおける抗腫瘍免疫が損なわれるという見解を支持するものである。さらに、ＩＦＮγ－産生ＣＤ８^＋（抗腫瘍）細胞の出現率が、ＷＴ＞ＷＴマウスからの腫瘍と比較してＫＩ＞ＷＴマウスからの腫瘍では有意に減少し（図５Ｄ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害の効力が、機能的ＥＲβのシグナリングの欠如で損なわれたことを示唆している。本明細書には図示していない付加的な予備データは、抗腫瘍Ｔ細胞を刺激するものである、樹状細胞の活性化もまた、ＭＨＣ－ＩＩ発現の減少から明らかであるように、ＫＩ＞ＷＴキメラマウスにおいて損なわれたことを、示している。さらに、エフェクターＴ細胞は、活性化が低下し（ＣＤ４４／ＣＤ６２Ｌの減少）、ＫＩ＞ＷＴキメラにおいて他のエフェクター機能が減少してしまっている［例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）α、インターロイキン（ＩＬ）－２及びパーフォリンの減少、データは図示せず］。このようなデータは、抗腫瘍ＣＤ８^＋Ｔ細胞エフェクターの活性が、ＥＲβに応じて増強され、腫瘍内免疫細胞の蓄積が改善されることを強く示唆している。したがって、ＥＲβ抗腫瘍活性を、Ｓ－エクオールなどの臨床的に安全なＥＲβアゴニストで取り集めることによって、既存の抗がん免疫療法の有効性が向上し、黒色腫の処置の有効性が高くなる。

実施例４
腫瘍増殖における、ＰＤ－１阻害薬と、Ｓ－エクオールと、２つの治療剤の組合せとの効果を判定するため、黒色腫細胞株Ｂ１６に試験を行った。この実験デザインは、（１）対照群、（２）αＰＤ－１、（３）Ｓ－エクオール、及び（４）αＰＤ－１＋Ｓ－エクオールの４群（図４）を含み、マウスに５×１０^５細胞を皮下注入することにより行った。抗体はα－ＰＤ－１を３日毎に腹腔内注入により２５０μｇ／ｍｉｃｅ投与し、Ｓ－エクオールを経口強制投与により５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。処置は、腫瘍負荷後７日から開始した。腫瘍増殖トラジェクトリーを、反復測定線形混合モデルを用いて、処置したマウスにおいて比較した。主要評価項目は、腫瘍の大きさの対数であり、検定統計量は、処置×時間の交互作用である。腫瘍を約１０回測定した。研究において使用したレシピエントマウスの数（一群あたりｎ＝６）は、上記研究に基づいたものだった。この実験による結果（図６～９）は、Ｓ－エクオールが抗がん免疫療法を増強することができることを、実証するものである。

実施例５
それぞれの群における腫瘍の大きさ及び重量の測定に加えて、免疫表現型検査を実施して、単一の療法と組合せ療法との抗腫瘍効果により多くの機構的洞察（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔ）を得た。腫瘍、脾臓及び排出リンパ節を採取し秤量した。抗凝固化血液を心臓穿刺により採血した。腫瘍を、免疫組織化学的検査のためパラフィン包埋し、ルミネックスによるｍＲＮＡ及びタンパク質解析のため急速凍結した。フローサイトメトリー（表現型／機能のため）、及びＶｉ－Ｃｅｌｌ（登録商標）（定量化のため）を用いて、腫瘍浸潤物、腫瘍排出リンパ節及び脾臓からの免疫細胞を解析した。解析には、ＣＤ３^＋全Ｔ細胞並びにＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のサブセット、エフェクター機能（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ）、活性化（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ）及び疲弊（例えば、ＰＤ－１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３）が含まれる。また、抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１ｃ^－単球／マクロファージ、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞）、ＮＫｌ．ｌ^＋ＮＫｐ４６^＋ＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＦｏｘｐ３^＋）、及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ－１^ｈｉ）も解析する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞受容体の多様性を、市販のキット（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で評価した。局所的な細胞増殖も、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵの染色で試験した。

実施例６
前臨床の動物モデルにおけるさらなる研究が、Ｓ－エクオールを用いて黒色腫を処置することについての見解を支持する。免疫低下マウスの実験において、ヒト黒色腫転移及び固形腫瘍形成の研究に有用なことが知られるマウス腫瘍細胞株であるＢ１６を使用して、対照群と比較してＳ－エクオール処置により腫瘍の増殖を抑制する。正常なＢＬマウスに０．５×１０^６のＢ１６細胞を注入する。腫瘍量が（接種の約１週間後）５０～８０ｍｍ^３に達するとき、マウスに、毎日（１日あたり２０又は６０ｍｇ／ｋｇの）Ｓ－エクオールを又はビヒクル対照群としてＰＢＳを皮下注入する。腫瘍形成に続いて、ノギス測定を、２つの直交する軸線、長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）とに沿って行い、体積（Ｖ）を、式Ｖ＝［Ｌ×（Ｗ^２）］／２で推定する。マウスから採取した腫瘍を、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンで包埋し、３μｍ厚さの切片にした。ビヒクル対照群及びＳ－エクオールで処置したマウスからの代表的な腫瘍切片に、Ｋｉ－６７発現に対する試験をして細胞増殖を評価し、ＥＲβのｐＹ３６に対する試験をした。実験における統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定により評価した。すべてのアッセイにおいて、ｐ＜０．０５が、統計学的に有意であるとみなされる。

実施例７
パイロットバイオマーカー臨床研究を、黒色腫と確認されている対象２０名に実施して、腫瘍細胞増殖の指標であるＫｉ６７について、ＥＲβアゴニストＳ－エクオールの効果を判定する。腫瘍細胞増殖を、Ｋｉ－６７の免疫組織学的染色を行うことにより測定する染色する。Ｋｉ－６７は、遺伝子ＭＫＩ６７遺伝子によりコードされており、核膜の分解の後に続いて細胞質に分散される個々の有糸分裂染色体を維持することを求められている。腫瘍のＫｉ－６７陽性細胞の画分を測定することが、がん患者の予後を評価するための信頼できるパラメーターとして知られている。ＴＮＢＣを有する対象は、Ｋｉ６７が非常に高レベルであることが分かっている。

研究に登録した患者は、病歴、身体、検査所見、放射線画像診断及び診断用生検を受けた。Ｋｉ６７（増殖マーカー）、全ＥＲβ、ｐＹ３６－ＥＲβ（リン酸化ＥＲβ）、Ｂ７Ｈ１（ＰＤＬ－１としても知られる）及びＭＩＡ及びＳ１００Ｂの免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を、処置に先立ちコア針生検組織サンプルを用いて行った。患者に、予定されている腫瘍手術前に又は一次全身療法の開始前に、Ｓ－エクオール５０ｍｇを１日に２回およそ２週間（１０～２１日）経口投与する。腫瘍サンプルを、外科的処置又は２週間の再生検により得る。Ｋｉ６７、全ＥＲβ、リン酸化ＥＲβ（ｐＹ３６）及びＭＩＡ及びＳ１００Ｂの処置後ＩＨＣ評価を得る。Ｋｉ６７減少をＳ－エクオールでの処置前及び処置後において比較する。Ｓ－エクオールは、測定可能な減少をＫｉ６７に生じさせ、この腫瘍タイプにおける有効性を示す。また、ｃ－ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームを用いて、Ｓ－エクオールによる活性化の結果として得られるＥＲβの下流の転写標的を発見している。

研究対象となる患者は、新たに診断されるとともにこれまでに処置されていない黒色腫を有する。この疾患のすべてのステージが対象となる。患者は、ステージ分類手技又は中心ライン留置など、進行疾患について標準的な術前評価又は処置前の精密検査を受けている間に、Ｓ－エクオールを服用する。一次手術を実施する場合、標準的な診断評価後の組織残渣が、２週間のバイオマーカー評価のために使用される。患者に、２週間のＳ－エクオール処置の終わりに一次手術がなかった場合、生検の第２セットが、標準的な任意の全身療法の開始前に行われる。図１０を参照のこと。

コア生検を行うための標準的手技を、登録前に黒色腫を判定するために用いる。可能な場合はいつでも、ＩＨＣ解析に使用される腫瘍組織を、診断用コア生検と同時に取得する。組織サンプルは、すべてと、ｐＹ３６のＥＲβと、Ｋｉ６７とを染色するために送られ、解析される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製の全ゲノムＤＡＳＬ（登録商標）ＨＴプラットフォームは、極めて低量のＲＮＡ（５０ｐｇ）の入力で遺伝子発現をプロファイリングするために設計されたものであるが、Ｓ－エクオールへの曝露前後に得た対のＦＦＰＥ組織を調べるために用いられる。

統計解析を行い、ＥＲβ発現黒色腫が、Ｋｉ６７の測定可能な程度の低下により明示されるように、Ｓ－エクオールに応答することが示されている。一次解析で、Ｋｉ６７発現の幾何平均の変化を、ベースラインから２週間まで予測する。これは、ログ変換データにおける前後の差分について１標本ｔ検定を用いて実行され、９５％の信頼区間であると大まかに言える。すべての計算を、ＳＡＳ ｖ９．２＋（ノースカロライナ州ケーリー）又はＲ ｖ２．１５＋（オーストリア国ウィーン）で実行する。

実施例８
フォローアップ臨床研究では、新たに黒色腫と診断された患者を登録し、患者に、Ｓ－エクオールの服用量を１日に２回１５０ｍｇに増量したことを除いて、処置及び評価を、実施例７において説明したように行う。Ｓ－エクオールを用いた処置は、１０～２１日間である。Ｋｉ６７を、実施例７において記載したように解析する。

実施例９
腫瘍増殖における、ＰＤ－１阻害薬と、Ｓ－エクオールと、２つの治療剤の組合せとの効果を判定するため、以下の３つのマウス乳房腫瘍株、（１）Ｅ０７７１（Ｂ６バックグラウンド）、（２）ＡＴ－３（Ｂ６バックグラウンド）及び（３）４Ｔ１（ＢａｌｂＣバックグラウンド）に対して、試験した。この実験デザインは、（一例としてＡＴ－３を用いた）４群、（１）対照群、（２）αＰＤ－１、（３）Ｓ－エクオール、及び（４）αＰＤ－１＋Ｓ－エクオール（図３）を含み、マウスの２×１０^５の細胞を、４番目の乳腺脂肪パッドに皮下注入することにより行った。抗体はα－ＰＤ－１を３日毎に腹腔内注入により２００μｇ／ｍｉｃｅ投与し、Ｓ－エクオールを経口強制投与により５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。処置は、腫瘍負荷後７日から開始した。腫瘍増殖トラジェクトリーを、反復測定線形混合モデルを用いて、処置したマウスにおいて比較した。主要評価項目は、腫瘍の大きさの対数であり、検定統計量は、処置×時間の交互作用である。腫瘍を約１０回測定した。研究において使用したレシピエントマウスの数（一群あたりｎ＝８）は、上記研究に基づいたものだった。この実験による結果（図１２～１５）は、Ｓ－エクオールが抗がん免疫療法を増強することができることを、実証するものである。

実施例１０
それぞれの群における腫瘍の大きさ及び重量の測定に加えて、免疫表現型検査を実施して、単一の療法と組合せ療法との抗腫瘍効果により多くの機構的洞察（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔ）を得た。腫瘍、脾臓及び排出リンパ節を採取し秤量した。抗凝固化血液を心臓穿刺により採血した。腫瘍を、免疫組織化学的検査のためパラフィン包埋し、ルミネックスによるｍＲＮＡ及びタンパク質解析のため急速凍結した。フローサイトメトリー（表現型／機能のため）、及びＶｉ－Ｃｅｌｌ（登録商標）（定量化のため）を用いて、腫瘍浸潤物、腫瘍排出リンパ節及び脾臓からの免疫細胞を解析した。解析には、ＣＤ３^＋全Ｔ細胞並びにＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のサブセット、エフェクター機能（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ）、活性化（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ）及び疲弊（例えば、ＰＤ－１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３）が含まれる。また、抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１ｃ^－単球／マクロファージ、ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞）、ＮＫｌ．ｌ^＋ＮＫｐ４６^＋ＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＦｏｘｐ３^＋）、及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ－１^ｈｉ）も解析した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞受容体の多様性を、市販のキット（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で評価した。局所的な細胞増殖も、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵの染色で試験した。

実施例１１
前臨床の動物モデルにおけるさらなる研究が、Ｓ－エクオールを用いてＴＮＢＣ乳がんを処置することについての見解を支持する。免疫不全マウスの異種移植実験では、ヒトＴＮＢＣ乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いたが、腫瘍増殖は、Ｓ－エクオール処置で対照群と比較して６０％抑制された。５×１０^６ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウスの乳腺脂肪パッドに同所注入した（Ｈａｒｌａｎ）。腫瘍量が（接種の約１週間後）５０～８０ｍｍ^３に達したとき、マウスに、毎日（１日あたり２０又は６０ｍｇ／ｋｇの）Ｓ－エクオールを又はビヒクル対照群としてＰＢＳを皮下注入した。腫瘍形成に続いて、ノギス測定を、２つの直交する軸線、長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）とに沿って行い、体積（Ｖ）を、式Ｖ＝［Ｌ×（Ｗ^２）］／２で推定した。マウスから採取した異種移植腫瘍を、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンで包埋し、３μｍ厚さの切片にした。ビヒクル対照群及びＳ－エクオールで処置したマウスからの代表的な腫瘍切片に、Ｋｉ－６７発現に対する試験をして細胞増殖を評価し、ＥＲβのｐＹ３６に対する試験をした。実験における統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定により評価した。すべてのアッセイにおいて、ｐ＜０．０５が、統計学的に有意であるとみなされた。これらの実験の結果を図１６及び図２０に示す。以下のリストに挙げたＹｕａｎ他、２０１６を参照のこと。当該文献は、参照によりすべての目的のため本明細書に援用される。

実施例１２
パイロットバイオマーカー臨床研究を、ＴＮＢＣと確認されている対象２０名に実施して、腫瘍細胞増殖の指標であるＫｉ６７について、ＥＲβアゴニストＳ－エクオールの効果を判定した。腫瘍細胞増殖を、Ｋｉ－６７の免疫組織学的染色を行うことにより測定した。プロトコルの概要について図１８を参照のこと。Ｋｉ－６７は、遺伝子ＭＫＩ６７遺伝子によりコードされており、核膜の分解の後に続いて細胞質に分散される個々の有糸分裂染色体を維持することを求められている。腫瘍のＫｉ－６７陽性細胞の画分を測定することが、がん患者の予後を評価するための信頼できるパラメーターとして知られている。ＴＮＢＣを有する対象は、Ｋｉ６７が非常に高レベルであることが分かっている。

研究に登録した患者は、病歴、身体、検査所見、放射線画像診断及び診断用生検を受けた。Ｋｉ６７（増殖マーカー）、全ＥＲβ、ｐＹ３６－ＥＲβ（リン酸化ＥＲβ）、Ｂ７Ｈ１（ＰＤＬ－１としても知られる）及びＢＲＣＡ１（乳がん、早期発症）、の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を、処置に先立ちコア針生検組織サンプルを用いて行った。患者に、予定されている腫瘍手術前に又は一次全身療法の開始前に、Ｓ－エクオール５０ｍｇを１日に２回およそ２週間（１０～２１日）経口投与した。腫瘍サンプルを、外科的処置又は２週間の再コア針生検により得た。Ｋｉ６７、全ＥＲβ、リン酸化ＥＲβ（ｐＹ３６）及びＢＲＣＡ１の処置後ＩＨＣ評価を得た。Ｋｉ６７の減少は、ヒト乳がんの試験において短期及び長期両方のホルモン療法の有効性を検証済みの代替マーカーであり、Ｓ－エクオールを用いた処置の前と後との比較を行った。Ｓ－エクオールは、測定可能な減少をＫｉ６７に生じさせ、この腫瘍タイプにおける有効性を示した。また、ｃ－ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームを用いて、Ｓ－エクオールによる活性化の結果として得られるＥＲβの下流の転写標的を発見した。

本研究に適格な女性は、これまで未処置で、任意の大きさの無処置の原発性乳腺腫瘍を伴うトリプルネガティブ乳がんと、新たに診断された。この疾患のすべてのステージが対象となった。ステージ分類手技又は中心ライン留置など、進行疾患について標準的な術前評価又は処置前の精密検査を受けている間に、Ｓ－エクオールを服用してもらった。一次手術を実施した場合、標準的な診断評価後の組織残渣が、２週間のバイオマーカー評価のために使用された。患者に、２週間のＳ－エクオール処置の終わりに一次手術がなかった場合、標準的な任意の全身療法の開始前に、１４ゲージコア針生検の第２セットを得た。図１０を参照のこと。

Ｂａｒｄ社製１４ゲージ針を用いたコア生検を取得するための標準的手技を、登録前にＴＮＢＣを判定するために用いた。可能な場合はいつでも、ＩＨＣ解析に使用される腫瘍組織を、診断用コア生検と同時に取得した。組織サンプルは、全ＥＲβと、ｐＹ３６のＥＲβと、Ｋｉ６７とを染色するために送られ、解析された。ＥＲα、ＰＲ及びＨＥＲ－２の試験を、検証済みの方法を用いて実施した。ＴＮＢＣ腫瘍は、ＩＨＣにより、ＥＲα及びＰＲについて癌細胞が５％未満核染色されたものかつＨＥＲ－２について０、１又は２＋のいずれかの染色がされたものと定義した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製の全ゲノムＤＡＳＬ（登録商標）ＨＴプラットフォームは、極めて低量のＲＮＡ（５０ｐｇ）の入力で遺伝子発現をプロファイリングするために設計されたものであるが、Ｓ－エクオールへの曝露前後に得た対のＦＦＰＥ組織を調べるために用いられた。

統計解析を行い、ＥＲβ発現ＴＮＢＣが、Ｋｉ６７の測定可能な程度の低下により明示されるように、Ｓ－エクオールに応答することを示した。一次解析で、Ｋｉ６７発現の幾何平均の変化を、ベースラインから２週間まで予測した。これは、ログ変換データにおける前後の差分について１標本ｔ検定を用いて実行され、９５％の信頼区間であると大まかに言えた。ＩＭＰＡＣＴ試験によれば、２週間後のＫｉ６７発現の幾何平均における変化は、アナストロゾール群、タモキシフェン群及び組合せ群それぞれについて、－７６、－５９．５及び－６３．９％であり、標準偏差は、ログスケールでおよそ１．０だった。このことは、Ｋｉ６７発現における減少に対する検定について、効果量が１．０～１．５、検定力＞９０％であるとともに、両側α＝０．０５、標本サイズが、自然増加及び脱落の可能性における変動を考慮して少なくとも４５名の患者であることを示している。すべての計算を、ＳＡＳ ｖ９．２＋（ノースカロライナ州ケーリー）又はＲ ｖ２．１５＋（オーストリア国ウィーン）で実行した。２０名の患者を登録し研究を完了した。１７名の患者が、評価可能な処置前後のサンプルを有していた。これらの１７名の評価可能な患者のうち、Ｋｉ－６７が、４名の患者で３０％を超える減少をし、１名の患者で２０％を超える減少をし、７名の患者で０～２０％の減少をした（５名の患者は、Ｋｉ－６７の減少なし）。図１７が参照される。

実施例１３
フォローアップ臨床研究では、新たにＴＮＢＣと診断された２５名の患者を登録し、患者に、Ｓ－エクオールの服用量を１日に２回１５０ｍｇに増量したことを除いて、処置及び評価を、実施例１２において説明したように行う。Ｓ－エクオールを用いた処置は、１０～２１日間である。Ｋｉ６７を、実施例１２において記載したように解析する。

実施例１４
背景：腫瘍細胞における、２つのエストロゲン受容体サブタイプであるＥＲａ及びＥＲβの重複していない機能を、広範囲に研究した。しかしながら、宿主細胞におけるそれらの対応物はあまり調べられていない。ＥＲα及びＥＲβ活性がどのようにサブタイプ特異的に調節されているのかについては、さらによく知られていない。腫瘍ＥＲβがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて乳がん細胞増殖を阻害するために重要である、ヒトＥＲβのリン酸化チロシン残基（ｐＹ３６）がこれまでに同定された。宿主のＥＲβの調節におけるこのＥＲβのリン酸化チロシンスイッチの役割は、これまで不明なままであった。

方法：マウス胚性幹細胞においてマウス内在性ＥＲβの対応するチロシン残基（Ｙ５５Ｆ）を突然変異させるため、従来の遺伝子編集を用いた。作製したホモ接合突然変異Ｅｓｒ２Ｙ５５Ｆ／Ｙ５５Ｆマウス系統及びその野生型（ＷＴ）対応物を、それらが腫瘍増殖を支援する能力について種々の移植腫瘍モデルにおいて比較した。さらに、フローサイトメトリーに基づく免疫表現型検査を行って、ＷＴ及び突然変異の宿主の抗腫瘍免疫を評価した。骨髄及び精製ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入を実施して、ＥＲβ依存性抗腫瘍機能を持つ宿主細胞タイプを特定した。さらに、細胞シグナリングアッセイを行って、ＷＴ及び突然変異のマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）惹起シグナリングカスケードを比較した。最後に、ＥＲβ選択的アゴニストであるＳ－エクオールを、免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）に基づく抗がん免疫療法を増強するその有効性について評価した。

結果：担腫瘍宿主においてＥＲβ特異的リン酸化チロシンスイッチを無効にすることによって、腫瘍増殖を悪化させる。さらに、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞における細胞自律性ＥＲβ機能を定義した。機構的に、ＴＣＲ活性化はＥＲβリン酸化を誘発し、その結果として、下流のＴＣＲシグナリングカスケードを増強する。臨床的に安全なＥＲβ選択的アゴニストであるＳ－エクオールは、ＴＣＲ活性化を促進し、ＥＲβリン酸化スイッチを刺激し、抗ＰＤ－１のＩＣＢ免疫療法を増強する。

結論：このマウスの遺伝学的研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβ依存性抗腫瘍免疫の調節におけるＥＲβのリン酸化チロシンスイッチの役割を明らかに実証している。これらの知見は、これまで真価を認められていなかったＥＲβの免疫増強機能を刺激することによる新しい組合せ療法の開発に情報を与えるものである。

略語：ＥＲはエストロゲン受容体、ＴＩＬは腫瘍浸潤リンパ球、ＰＤ－１はプログラム細胞死タンパク質１、ＣＤ８は表面抗原分類８、ＴＣＲはＴ細胞受容体、ＩＣＢは免疫チェックポイント阻害である。

別の遺伝子（ＥＳＲ１及びＥＳＲ２）によってコードされているＥＲα及びＥＲβは、エストロゲンの様々な生理学的作用を媒介する（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ ２０００、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ２００２、Ｈｅｌｄｒｉｎｇ ２００７、Ｄｅｒｏｏ ２００６、Ｔｈｏｍａｓ ２０１１）。配列相同性及び同様の転写活性があるにもかかわらず、これらの２つのＥＲサブタイプは、がんにおいて、別個の、さらに逆の生物学的機能を発揮する（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ ２０００、Ｄｅｒｏｏ ２００６、Ｔｈｏｍａｓ ２０１１）。ＥＲαは、エストロゲン依存性乳腺腫瘍増殖を支援するその役割が最もよく知られている一方、ＥＲβは、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、及び卵巣がん、黒色腫、及び神経膠腫を含む複数のタイプのがんにおける抗腫瘍活性を有する（Ｆａｎ ２０１０、Ｓａｒｅｄｄｙ ２０１２、Ｍａｋ ２００６、Ｎａｎｎｉ ２００９、Ｎａｋａｊｉｍａ ２０１１、Ｌｅｕｎｇ ２０１１）。ＥＲα及びＥＲβの腫瘍関連機能における研究は、主に、腫瘍細胞の増殖及び浸潤を含む、がん細胞の挙動の調節におけるそれらの腫瘍内因性活性に焦点を置いていた。しかしながら、新たに浮上した証拠によって、それらがまた、がん発症及び進行中に宿主細胞において重要な役割を果たしていることが示唆されている（Ｆａｎ ２０１０、Ｓａｒｅｄｄｙ ２０１２、Ｍａｋ ２００６、Ｎａｎｎｉ ２００９、Ｎａｋａｊｉｍａ ２０１１、Ｌｅｕｎｇ ２０１１）。例えば、腫瘍外因性のＥＲαは、卵巣がん進行時の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の免疫抑制活性増強に関連付けられている（Ｓｖｏｒｏｎｏｓ ２０１６）。ＥＲβの腫瘍外因性の抗腫瘍活性により、ＥＲβ－ＫＯレシピエント動物に移植した同系マウス黒色腫細胞が、ＷＴレシピエントマウスのものより力強く増殖した（Ｃｈｏ ２０１０）。さらに最近の研究では、ＥＲβが抗腫瘍免疫の促進に関連付けられている（Ｈｕａｎｇ ２０２０、Ｚｈａｏ ２０１８）。しかしながら、ＥＲβの腫瘍外因性活性がどのようにＥＲサブタイプ特異的に調節されるかは依然として不明である。

ＥＲα及びＥＲβの選択性生物学的作用は、部分的に、タンパク質構造及び転写活性におけるそれらの内因性の差分からもたらされる。２つのＥＲサブタイプは、極めて相同の中心ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、及び活性化機能ドメイン２（ＡＦ２）におけるカルボキシル末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を共に有しているが、活性化機能１（ＡＦ１）ドメインにおけるさらに多様なアミノ末端配列が、サブタイプ特異的活性に関連づけられている（Ｓｍｉｔｈ ２００４、Ｍａｄａｋ－Ｅｒｄｏｇａｎ ２０１３）。それによって、先の研究では、その腫瘍内因性抗腫瘍活性を調節する、ヒトＥＲβのＡＦ１におけるサブタイプ特異的リン酸化チロシン残基（Ｙ３６）が同定された。

標準的な機序では、ＥＲα及びＥＲβの両方が、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）に直接結合すること、又は他の部位特異的転写因子によってそれらの同族の標的遺伝子座に結合することで転写を活性化する。転写活性化における核内機能（「ゲノム作用」）に加えて、膜結合性ＥＲαは、成長ホルモンなどの細胞外の要因に細胞の曝露をしてから数分内に細胞質における急速なシグナリング事象を誘発する（Ｂｊｏｒｎｓｔｒｏｍ ２００５）。後者のＥＲαの機能は、「非ゲノム作用」と呼ばれ、その標準的な転写活性とは別個であって無関係である。同様の非ゲノム機構がＥＲβによって使用されてその抗腫瘍活性を発揮するかどうかは現在のところ知られていない。

本研究において、マウスＥＲβにおけるヒトＹ３６相当のリン酸チロシン残基をフェニルアラニン（Ｆ５５Ｆ）に突然変異させた、遺伝子学的に操作されたマウスモデルを作製した。種々のタイプの腫瘍が、ＷＴ対象群に対してＥＲβ突然変異宿主において有意に速く増殖した。骨髄及び精製免疫細胞の養子移入によって、これらの研究は、ＣＤ８＋免疫細胞におけるＥＲβシグナリングが宿主ＥＲβの抗腫瘍機能を持つことを示している。この研究は、さらに、ＥＲβのチロシンリン酸化がＴＣＲ活性化の際に刺激され、その結果として、おそらくＥＲβの非ゲノム作用を介して、エフェクターＴ細胞活性化に必要とされる下流のシグナリングカスケードを増強することを示している。最後に、抗腫瘍免疫においてＥＲβシグナリングを取り集めることの橋渡し的利用を、ＥＲβ選択的アゴニストのＳ－エクオールと抗ＰＤ－１のＩＣＢ免疫療法とを組み合わせることによって探索した。

（方法）
動物
すべての動物実験は、テキサス大学ヘルスサンアントニオ校及びジョージワシントン大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認を受けた。すべてのマウスに、水を適宜与え、通常の飼料を与えた。Ｒａｇ１－／－１３１、ＢＡＬＢ／Ｃ、及びＣＤ４５．１の類遺伝子マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。ＥＲβのチロシンからフェニルアラニンへ（Ｙ５５Ｆ）の突然変異を持つマウスのＥＳクローンを相同組換えによって得た。この突然変異を含む標的ベクターをエレクトロポレーションによってＣ５７ＢＬ／６のＥＳ細胞に導入した。遺伝子導入した細胞にネオマイシン選択を行い、生存クローンからのＤＮＡサンプルをサザンブロット法によって解析して、正しい相同組換え体を同定した。ＥＲβのＹ５５Ｆ突然変異マウスを突然変異ＥＳ細胞クローンから作製し、その後、Ｆｌｐｏ－Ｃｒｅマウスと交配して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｎｅｏマーカーを取り除いた。純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドである同腹仔のＷＴ及びホモ接合（Ｅｓｒ２ Ｙ５５Ｆ／Ｙ５５Ｆ１４０）突然変異ノックイン（ＫＩ）マウスを、ヘテロ接合Ｅｓｒ２＋／Ｙ５５Ｆ １４１マウスとの交雑によって作製した。６～８週齢の同腹仔を実験に用いた。アメリカ実験動物学会ガイドラインに従って特定の病原体除去設備においてマウスを飼育した。別のケージの同腹仔動物を無作為に実験群に割り当て、これらは、すべての群の細菌叢に等しく曝露されること確実にするために、共に飼育されるか、又は他の群の寝床に計画的に曝露された。

細胞株及び培養条件
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣ３８の結腸腺癌細胞、Ｂ１６Ｆ１０の黒色腫、１４９及びＥＭＴ－６の乳房腫瘍細胞をＡＴＣＣから購入した。Ｅ０７７１の乳房腫瘍細胞をＣＨ３ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カタログ：９４０００１）から購入した。Ｍ－Ｗｎｔの乳房腫瘍細胞は、ノースキャロライナ大学のＳｔｅｖｅｎ Ｈｕｒｓｔｉｎｇ博士からの寄贈であった。ＡＴ－３の乳房腫瘍細胞は、ロズウェルパーク総合がんセンターのＳｃｏｔｔ Ａｂｒａｍｓ博士の研究室によって作製された。ＩＤ８ａｇｇ－Ｌｕｃは、Ｔｙｌｅｒ Ｃｕｒｉｅｌ博士の研究室によって作製された。すべての細胞株はマイコプラズマを含まず、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃１５１４０１２２）を添加した、高グルコースＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃１１９６５）において培養された。

ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍負荷、処置、及び評価
腫瘍研究において、８～１０週齢のマウスを用いた。Ｍ－Ｗｎｔ（５×１０５細胞）、Ｅ０７７１（５×１０５細胞）、ＡＴ－３（２×１０５細胞）、及びＥＭＴ－６（５×１０５細胞）の腫瘍細胞を４番目の乳腺パッドに皮下移植した。Ｂ１６Ｆ１０（０．５×１０６細胞）及びＭＣ３８（５×１０６細胞）の腫瘍細胞を背部の側腹部に皮下移植した。表示した日数でノギスを用いて腫瘍体積を測定した（０．５×長さ×幅２）。抗ＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社、カタログ＃ＢＥ０１４６）及び抗ＰＤ－１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社、カタログ＃ＢＥ００８９）抗体を、腫瘍負荷後の７日目から開始して、表示したような期間、３日毎１００μｇ／ｍｏｕｓｅの服用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって投与した。Ｓ－エクオール（Ａｕｓｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を、腫瘍負荷の日から開始して、毎日５０ｍｇ／ｋｇで経口強制投与によって投与し、腫瘍増殖実験全体にわたって継続した。

骨髄キメラ
ＷＴのＣ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．１）レシピエント雄又は雌に（移植した１７２群あたり１０匹のマウス）に、９．５Ｇｙの全身照射（ＴＢＩ）で照射した。ドナーＷＴ（ＣＤ４５．２）又はＫＩ（ＣＤ４５．２）のＣ５７ＢＬ／６マウスから貯蔵しておいた脛骨及び大腿の骨髄細胞を、ＲＢＣ溶解バッファーで溶解した。ＷＴ又はＫＩマウスからの骨髄細胞を、照射したレシピエントＷＴ（ＣＤ４５．１）マウスの後眼窩に注入した（各レシピエントマウスあたり１×１０７細胞）。動物を、照射前の１日及び照射後の２週間、トリメトプリムスルファメトキサゾール（Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃａｌ社）抗生剤水で維持し、キメラマウスの腫瘍移植を、再構築後の少なくとも８週で行った。実験終了時に、すべての動物の造血再構築を脾細胞のフローサイトメトリーによって検証した。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入
６～８週齢のＷＴ及びＫＩの雄マウスから全脾臓細胞懸濁液を調製した。ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）マウスＣＤ８ａ正選択キットＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ＃１８９５３）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を脾細胞から単離した。濃縮されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞をＲａｇ１－／－１８７レシピエントに静脈内注射によって養子移入した（２×１０６細胞）。翌日、Ｂ１６Ｆ１０（０．５×１０６細胞）の黒色腫細胞を背部の側腹部に皮下移植した。

フローサイトメトリー
細胞を、ＬＳＲＩＩ及びＦＡＣＳＡｒｉａハードウェアを用いて、これまでに記載されたように（Ｃｌａｒｋ、２０１６）染色及び選別し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ社）によって解析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性化。ＣＤ８＋Ｔ細胞を無菌条件下で脾臓から単離した。個々の脾臓をホモジナイズして脾細胞を放出させた。５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞懸濁液を遠心分離し（３００ｇ、室温で５分間）、上清をデカントし、細胞ペレットを残量（約１００μｌ）に再懸濁した。赤血球を９００μｌの滅菌水中に短時間溶解し（１～２秒）、その後１００μｌの１０×ＰＢＳを加えて等浸透圧に戻し、５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を加えた。個々の脾臓からの単細胞懸濁液を貯蔵し、７０μｍ及び４０μｍの細胞濾過器（Ｆｉｓｈｅｒ社）で濾過し、計数した。磁気細胞ソーティング（ＭａｇｎｉＳｏｒｔマウスＣＤ８Ｔ細胞濃縮キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、負の選択によって、製造者の指示に従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離した２×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）及び１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社）で４℃において一晩前処理して、細胞をプレーティングする前にＰＢＳで２回洗浄した、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にプレーティングした。

定量ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ホモジナイズした全肺組織から全ＲＮＡを単離した。ＩｍＰｒｏｍＩＩ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡを１μｇの全ＲＮＡを用いて合成した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を伴って転写物特異的プライマーにより増幅し、製造者の指示に従って行われた。プライマー配列はこれまでに記載された（Ｃｌａｒｋ、２０１６）。

イムノブロッティング
単離したマウスの脾臓及び骨髄をＲＩＰＡ溶解及び２１８抽出バッファー中に溶解した。ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃２３２２５）を用いて、タンパク質量を測定した。一次抗体は、ＥＲβマウスｍＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ＃ＭＡ５－２４８０７）、Ｚａｐ７０（ＣＳＴ社、＃３１６５）、ｐ－Ｚａｐ７０（Ｔｙｒ３１９）／Ｓｙｋ（Ｔｙｒ３５２）（ＣＳＴ社、＃２７１７）、ＬＡＴ（ＣＳＴ社、＃４５５３３）、ｐ－ＬＡＴ（Ｔｙｒ２２０）（ＣＳＴ社、＃２０１７２）、Ｌｃｋ（ＣＳＴ社、＃２７５２）、ｐ－Ｌｃｋ（Ｔｙｒ５０５）（ＣＳＴ社、＃２７５１）、α－チューブリン（ＣＳＴ社、＃３８７３）に対するものであった。対応する二次抗体を使用した。ＥＣＬ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ＃３４５８０）を用いてタンパク質を検出した。

ＴＣＧＡデータ解析
ＥＳＲ２発現と患者の生存率との関連を評価するために、患者の生命状態を、各腫瘍におけるＴ細胞浸潤に対するＥＳＲ２発現レベルとし、細胞傷害性Ｔリンパ球の浸潤を評価するためにＣＤ４、ＣＤ８α、ＧＺＭＢの総発現量（１００万あたりのｌｏｇ２カウント）を用い、相関をＥＳＲ２発現に対して計算した。ＥＳＲ２発現レベルと乳がん患者の生存率との相関は、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤レベルによって算出される。ＴＣＧＡ乳がん研究のすべての患者を、ＥＳＲ２の発現レベルに従って分けた（すべての患者の平均発現値より高い又は低い）。腫瘍がＣＤ８［（ＣＤ８Ａ＋ＣＤ８Ｂ）／２］の発現が多い（＞１ ＳＤ）又は少ない（＜１ ＳＤ）患者について、ＥＳＲ２発現レベルと生存率との相関を示している（Ｐａｎ、２０１８、Ｊｉａｎｇ、２０１８）。ヒト黒色腫腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）解析のために、単細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを公開データベース（ＧＳＥ７２０５６）からダウンロードした。活性化ＣＤ８＋ＴＩＬ（ＣＤ８ａ＞＝５及びＣＤ４４＞＝２）を遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）（ｗｗｗ．ｇｓｅａｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／のＧＳＥＡ＿４．１．０）に使用した。低ＥＳＲ２ＴＩＬに対する高ＥＳＲ２ＴＩＬにおいてＴＮＦαシグナリング及びＮＦＡＴ経路のエンリッチメントを評価した。

統計解析
データは平均値±標準誤差として示す。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）又はＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ社）を用いて統計解析を行った。２つの群間の比較には、対応のないスチューデントｔ検定を用いた。多重比較には、一元配置分散分析又は二元配置分散分析に続いてボンフェローニのポストホック検定を用いた。腫瘍増殖曲線の解析には、反復測定二元配置分散分析（混合モデル）に続いてボンフェローニのポストホック検定を用いた。ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。

（結果）
宿主のＥＲβシグナリングは腫瘍増殖を阻害する
ＥＲβのリン酸化チロシンスイッチの腫瘍外因性機能を調べるために、従来の相同組換えに基づく遺伝子編集手法を用いて、ヒトＥＲβのＹ３６に対応するマウス内在性ＥＲβのチロシン残基Ｙ５５をフェニルアラニン（Ｙ５５Ｆ、図２７Ａ）に突然変異させた。ＰＣＲ及びシークエンシングにより、Ｅｓｒ２天然遺伝子座における正しいゲノム変化が確認された（図２３Ａ、図２７Ｂ）。全身ホモ接合突然変異マウス系統（Ｅｓｒ２Ｙ５５Ｆ／Ｙ５５Ｆ２５９）を、純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて作製し、以後ノックイン（ＫＩ）マウスと呼ぶ。これまでに報告されているＥＲβノックアウト（ＫＯ）マウスと一致して、ＫＩマウスは、明らかな発育異常はなく、ＷＴ同腹仔と全く区別不可能であった（図２７Ｃ）。ＷＴ、ＫＯ及びＫＩマウスにおけるＥＲβ発現の調査は、Ｙ５５Ｆ突然変異タンパク質が骨髄及び脾臓を含めて複数の組織においてＷＴのＥＲβと比較可能なレベルで発現することを示した（図２３Ｂ）。したがって、ＫＩマウスに関連するいずれの表現型も、ＥＲβの発現抑制によるものではなさそうである。

宿主のＥＲβシグナリングが腫瘍増殖に与える影響を測定するため、乳房腫瘍（Ｍ－Ｗｎｔ－１、図２３Ｃ）、結腸直腸腫瘍（ＭＣ３８、図２８Ａ）、及び黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０、図２３Ｄ、図２８Ｂ）を含む種々の同系マウス腫瘍細胞をＷＴ及びＫＩマウスに移植した。試験したすべての腫瘍モデルにおいて、同系の腫瘍がＷＴ対応動物においてよりもＫＩレシピエントマウスにおいて力強く増殖し、この傾向は雌コホート及び雄コホートの両方において観察された（図２３Ｄ、図２８Ｂ）。さらに、担黒色腫ＫＩマウスもまた、ＷＴ対象群よりも明らかな肺転移を示した（図２８Ｃ）。ＫＩマウスにおいて腫瘍増殖がより高悪性であることと一致して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫表現型検査から、ＣＤ３＋免疫細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の全存在量が、ＷＴ対照群よりもＫＩ宿主の腫瘍において実質的に少なかったことが示されている（図２３Ｅ～図２３Ｇ、図２９）。これまでに報告されたＥＲαのＭＤＳＣ１３に対する役割とは対照的に、ＥＲβは担腫瘍宿主におけるＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１ｈｉ）の存在量には影響を与えるとは認められない（図３０）。まとめると、これらのデータは、宿主のＥＲβリン酸化チロシンスイッチは、おそらく抗腫瘍免疫を取り集めることによって、原発性及び転移性腫瘍の増殖を抑制するために重要であることを示す。

ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβシグナリングが宿主の腫瘍抑制活性をもたらす
次の研究では、腫瘍抑制における宿主のＥＲβシグナリングの細胞源を詳述しようとした。ＫＩ宿主の腫瘍においてＴＩＬ存在量が有意に減少したことを考えて、骨髄移植に関与するマウスキメラ実験を行った（図２４Ａ）。まず、雄のＷＴレシピエントマウスに照射（１０Ｇｙ）して内在性骨髄細胞を死滅させ、続いて、同系の雄ＷＴ又はＫＩドナーから骨髄を移植した。ＷＴ＞ＷＴ及びＫＩ＞ＷＴマウスにおいてキメラ化がうまくいくことを確認した後（図３１Ａ）、骨髄を移植してから８週でＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を注入した。腫瘍増殖は、雄及び雌のＷＴ＞ＷＴ対照群に対して雄及び雌のＫＩ＞ＷＴキメラ（ＫＩ免疫細胞あり）において有意に速く（図２４Ｂ～図２４Ｃ）、ＫＩ由来の免疫細胞は腫瘍増殖の抑止が不十分であることを示唆した。親ＫＩレシピエントマウスからの知見と一致して（図２８Ｄ）、黒色腫関連肺転移は、雄のＷＴ＞ＷＴ対照群に対して雄のＫＩ＞ＷＴマウスにおいてより多かった（図２４Ｄ）。別個の実験において、卵巣腫瘍細胞を雌のキメラ宿主に腹膜注入し、ＷＴ＞ＷＴ対照群（３９日、ｐ＝０．０１４３）よりもＫＩ＞ＷＴマウス（３０日）の生存率中央値が、有意に短いことを観察した（図３１Ｂ～図３１Ｃ）。この研究は、ＥＲβシグナリングが雄及び雌の両方のマウスの骨髄由来宿主細胞においてその抗腫瘍活性を調節していることを強く示唆している。

推論の実験において、雄のＢ１６Ｆ１０担腫瘍キメラマウスからのＴＩＬ及び腫瘍排出リンパ節（ＴＤＬＮ）を解析した。ＫＩマウスにおける抗腫瘍免疫応答が損なわれるという見解を裏付けて、腫瘍浸潤ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の総数は、ＷＴ＞ＷＴマウスと比較してＫＩ＞ＷＴマウスでは減少した（図２４Ｅ、図３２）。ＩＦＮｇ－産生ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが、ＷＴ＞ＷＴマウスからの腫瘍と比較してＫＩ＞ＷＴマウスからの腫瘍では有意に減少し（図２４Ｆ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害の効力が、機能的ＥＲβのシグナリングの欠如で損なわれたことを示唆している。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ３のパーセンテージ及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＫＩ＞ＷＴマウスのＴＤＬＮにおいて減少した（図２４Ｇ～図２４Ｈ）。さらに、抗腫瘍Ｔ細胞を刺激するものである、樹状細胞の活性化もまた、ＭＨＣ－ＩＩ発現の減少から明らかであるように、ＫＩ＞ＷＴキメラマウスにおいて損なわれた（図３２）。さらに、エフェクターＴ細胞は、活性化が低下し（ＣＤ４４／ＣＤ６２Ｌ）、ＫＩ＞ＷＴキメラにおいてさらなるエフェクター機能が減少してしまっている（例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）α、インターロイキン（ＩＬ）－２及びパーフォリン、図３２）。また、Ｔ細胞のＰＤ－１及びＬａｇ３も担腫瘍ＫＩマウスにおいて減少した（図３２）。これらのマーカーは、抗腫瘍機能が低下した「疲弊した」Ｔ細胞を特徴づけると考えられていたが、最近の研究は、これらがまた活性化した抗腫瘍Ｔ細胞も同定できることを示している。これらのデータは、共に、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターの活性が、ＥＲβに応じて増強され、腫瘍免疫細胞の輸送が改善され、これは、ＥＲβ促進抗腫瘍活性のための免疫機構としての樹状細胞活性及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の増加からもたらされ得ることを強く示唆している。

公開されている研究では、ＥＲβ依存性抗腫瘍免疫強化をもたらす特定の免疫細胞タイプを同定するために、ＥＲβのｍＲＮＡはＣＤ８＋Ｔ細胞及び樹状細胞を含む種々の免疫細胞タイプにおいて発現されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてほとんど検出できないことが示されている。精製したマウス初代免疫細胞のイムノブロッティングは、ＥＲβタンパク質レベルが、検査した他の免疫細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞において高いことを示す（図２Ｉ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβシグナリングの細胞自律性抗腫瘍効果を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＷＴマウス及びＫＩマウスから精製し、免疫不全のＲａｇ－／－３２４レシピエントマウスにそれらを養子移入した。その後の腫瘍研究から、養子移入されたＷＴのＣＤ８＋Ｔ細胞が、シャム又はＫＩのＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害したことを示す（図２５Ｊ）。ＴＩＬの存在量を検査すると、ＫＩのＣＤ８＋Ｔ細胞の数はＷＴ対象群より実質的に少なかった（図２５Ｋ）。これらのデータは、共に、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβシグナリングが抗腫瘍免疫の刺激において細胞自律的な役割を果たしている有力な証拠となる。

ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβの非ゲノム作用がＴ細胞活性化を増強する
ＥＲβシグナリングがＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の機能を促進する根本的な機構解明するために、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を、マウスの脾細胞から精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗ＣＤ３／ＣＤ２８でそれらを活性化した。ＷＴのＥＲβのＹ５５リン酸化が、Ｔ細胞の活性化後に実質的に増加した（図２５Ａ）。重要な点として、抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理によって、ＥＲβリン酸化チロシンスイッチが消失したＫＩのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＷＴの対応物よりも、ＩＦＮｇ及びＴＮＦａを含む細胞傷害性サイトカインを有意に少なく生成し、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能におけるＥＲβシグナリングの細胞自律的な役割をさらに実証している（図２５Ｂ）。

ＴＣＲシグナリングの開始及び伝播は、Ｌｃｋ、Ｚａｐ７０、及びＬＡＴを含むいくつかの近位シグナリング分子のリン酸化、並びにＡｋｔ及びｐ３８などのさらなる下流シグナリング分子の活性化に関与している（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ、２０１８）。これらの翻訳後事象は、転写レベルでの遺伝子活性化とは無関係であり、ＴＣＲが抗原リガンドに結合した後、数分以内に起こる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理後、ＴＣＲ刺激によるこれらのシグナリング分子のリン酸化は、ＴＣＲ活性化後５分程と早く容易に検出できた（図２５Ｃ）。これとは全く対照的に、ＥＲβリン酸化チロシンスイッチを無効にすることで、ＫＩのＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴＣＲ誘発シグナリングカスケードが著しく抑制された（図２５Ｃ）。ＴＣＲ活性化の初期段階の時間枠が短い（すなわち、数時間ではなく数分）ことを考えると、ＥＲβが抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理後に転写活性化によってこの急速なプロセスを促進する可能性は低いと推論した。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏの活性化前のＷＴ及びＫＩの初代ＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑは、いずれの有意なＥＲβ依存性のベースラインのトランスクリプトーム変化も示さなかった（データは示さず）。したがって、ＥＲβシグナリングがＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲシグナリングカスケードの急速な活性化を促進することは、その標準的な転写活性とは無関係である可能性が高い。

ＥＲβアゴニストであるＳ－エクオールによるＥＲβシグナリングの活性化はａＰＤ－Ｌ１免疫療法を増強する
公開されている研究は、ＥＲβ選択的アゴニストであるＳ－エクオールが、乳がん細胞においてヒトＥＲβのＹ３６でのリン酸化を促進することを示している（Ｙｕａｎ、２０１６）。Ｓ－エクオールは、さらに、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激マウスＥＦ４リンパ腫細胞において、ＴＣＲ活性化ＥＲβチロシンリン酸化を増強した（図２６Ａ）。このｉｎ ｖｉｔｒｏにおける知見を考慮して、いくつかの同系マウス腫瘍モデルにおいて、ａＰＤ－１の抗腫瘍効力の増強におけるＳ－エクオールの効果の可能性を評価しようとした。この実験デザインは、（１）ＩｇＧ対照群、（２）ａＰＤ－１、（３）Ｓ－エクオール、及び（４）ａＰＤ－１＋Ｓ－エクオールの４群を含むものであった。Ｂ１６黒色腫及びＥ０７７１乳房腫瘍モデルにおいて、腫瘍はαＰＤ－１又はＳ－エクオール単独療法に応答したが、組合せ処置に対する応答は単独処置よりも有意に明らかであった（図２６Ｂ～図２６Ｃ、図３３Ａ～図３３Ｂ）。さらに２つの乳房腫瘍モデル（ＡＴ－３及びＥＭＴ６）において、組合せ処置のみが腫瘍を明らかに縮小させた（図２６Ｄ、図２６Ｅ、図３３Ｃ～図３３Ｄ）。腫瘍増殖の評価と一致して、ａＰＤ－１とＳ－エクオールとの組合せにより、対象群及び単独処置群に対して、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞が実質的に増加した（図２６Ｆ～図２６Ｇ）。総じて、これらのデータは、Ｓ－エクオールが種々の同系の腫瘍を抗ＰＤ－１のＩＣＢ免疫療法に感作させる能力を示している。

ＥＲβと抗腫瘍免疫との臨床上の相関を探索するために、生物情報学ツール（ＴＩＭＥＲ）を用いて、ヒト腫瘍サンプルにおける腫瘍－免疫の相関を評価した（Ｗｈｅｒｒｙ ２０１５）。いくつかの固形がんタイプは、ＥＲβのｍＲＮＡレベルと、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、及びＧＺＭＢを含む抗腫瘍免疫に関連する遺伝子との間に有意な正の相関を示す（図Ｓ９Ａ～図Ｓ９Ｃ）。特筆すべきは、ＥＲβとＣＤ８Ａ及びＧＺＭＢとの最も強い相関が乳がんにおいて観察されたことである（図Ｓ９Ｂ～図Ｓ９Ｃ）。免疫マーカー相関を、特に乳がんにおけるＥＳＲ１及びＥＳＲ２ ３７７について比較するとき、ＥＳＲ１は、ＥＳＲ２とは異なって、これらの抗腫瘍免疫マーカーと負の関係を示すことが際立ち、ＥＲα及びＥＲβが腫瘍免疫微小環境において逆の役割を果たしているという見解を支持している。さらに、公開されている乳がん関連の患者生存率データセットの解析から、ＥＳＲ２のより高い発現レベルが患者の生存期間がより長いことと相関しているが、その相関は腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞が比較的多く存在する腫瘍においてのみ有意であることが示されている。これらの臨床上の相関は、共に、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞において強い抗腫瘍免疫応答を取り集めることにおけるＥＲβシグナリングの卓越した役割を示している。

（検討）
ＥＲβシグナリングの病態生理学的意義は重要であるが、歴史的にあまり調べられていない研究上の論題である。その抗がん治療上の可能性に対する認識が高まっているにもかかわらず、これまで、ＥＲβシグナリングを正確かつ相乗的に動員する合理的な努力を弱める、がんの発症及び進行におけるＥＲβシグナリングの決定的な役割についての有力な遺伝学的証拠があった。抗腫瘍免疫におけるＥＲβ特異的かつ腫瘍外因性のＥＲβリン酸化チロシンスイッチの発見は、がん処置におけるＥＲβ活性を評価して取り集めるための、これまで認識されていなかった手法を提供するものである。特に、抗腫瘍免疫におけるＥＲβシグナリングの関与は、ＩＣＢ免疫療法の有効性を最大限に高めて、さらなるがん患者の生存利益を高めることができ得る組合せ療法の展望を広げるものである。さらに、新たに作製されたＥＲβのＫＩマウスモデルは、正常な生理学的状態及び疾患状態、腫瘍外因性の状況に対する腫瘍内因性の状況におけるリン酸化ＥＲβ依存性ＥＲβ機能をさらに解明するための強力なツールを提供する。

これまでに公開された研究では、ｃ－Ａｂｌ及びＥＹＡ２がそれぞれ、乳がん細胞におけるＥＲβのリン酸化チロシンの状態を直接及び正反対に調節するキナーゼ及びホスファターゼであることが同定された（Ｐｉｅｒｄｏｍｉｎｉｃｉ ２０１０）。これらの分子がＣＤ８＋Ｔ細胞のＥＲβリン酸化チロシンスイッチを直接調節しているかどうかは、依然として確認されていない。しかしながら、ｃ－ＡｂｌがＴＣＲ活性化の媒介に関連付けられていることは注目に値する（Ｚｉｐｆｅｌ、２００４）。さらに、固形腫瘍に対するＢＣＲ－Ａｂｌの薬理学的阻害剤の臨床試験では、混在した結果が得られているが、これは腫瘍細胞及び宿主免疫細胞におけるｃ－Ａｂｌの複雑な作用によるものであり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＥＲβリン酸化チロシンは、他のチロシンキナーゼによって調節され得る。哺乳動物発現ライブラリーを、これまでに、すべての既知のヒトチロシンキナーゼについてスクリーニングした。ｃ－Ａｂｌに加え、Ｚａｐ７０もまた、ヒトＥＲβのＹ３６残基でのリン酸化の候補キナーゼとして同定した。したがって、Ｚａｐ７０及びＥＲβは、Ｚａｐ７０がＥＲβをリン酸化する正の調節ループを形成し得、その結果として、ＴＣＲ媒介免疫活性化において、Ｚａｐ７０と他のシグナリング分子との会合を促進することが考えられる。

全長のＥＲβ（ＥＲβ１）に加え、ヒトＥＳＲ２遺伝子は、別個でさらには逆の生物学的活性を有するいくつかのスプライシング変異体（ＥＲβ２～５）も生成する。しかしながら、マウスＥｓｒ２の対応する変異体の性質及び機能は、依然として不明である。すべての既知のヒト変異体は同じＮ末端配列を共有しており、したがってリン酸化チロシンスイッチを共有しているので、マウスＫＩマウスモデルにおける同様の推定される変異体は、全長ＥＲβタンパク質と同様に影響を受け得る。ヒト及びマウスの免疫細胞において、全長及び可能性のあるスプライシング変異体におけるリン酸化チロシンスイッチの影響を区別するためには、今後の研究を要する。

抗がん免疫療法の大きな飛躍的前進にもかかわらず、これは一部の患者にのみ有効であり、通常根治的ではない（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ ２０００、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ２００２、Ｈｅｌｄｒｉｎｇ ２００７、Ｄｅｒｏｏ ２００６）。したがって、新しい独立した免疫療法及び／又は既存の抗がん免疫療法を向上可能な薬剤の開発が不可欠である。複数の臨床試験により、いくつかの合成及び天然のＥＲβ選択的アゴニストのヒトに対する安全性が示されている。特に、腸内細菌の作用による大豆副産物であるＳ－エクオールは、閉経期症状、前立腺肥大症、及びより最近ではトリプルネガティブ乳がんの処置のために、複数の第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験において使用された。単独又はａＰＤ－１との組合せのいずれでも、本研究において観察されたＳ－エクオールの抗腫瘍効果は、ＩＣＢ免疫療法に対する腫瘍抵抗性を克服するという別のＥＲβアゴニストＬＹ５００３０７の最近の報告と一致している（Ｈｕａｎｇ、２０２０）。これらの前臨床の知見を今後の抗がん臨床試験に移すことで、現在の免疫療法から利益を得ることができる患者集団を大幅に拡大する新しい組合せ療法につながる。

実施例１５
ＴＮＢＣ乳がんは、他の乳がんサブタイプと比較して処置結果が劣っており、標的療法も欠いている。Ｓ－エクオールは新しい経口エストロゲン受容体（ＥＲ）ベータアゴニストであり、前臨床データにおいてＴＮＢＣ細胞増殖の抑制を示している。診断用コア針生検でＴＮＢＣが確認された３９人の登録患者に、ネオアジュバント治療試験を行った。１０～２１日間、コホートＡ（２０人の患者）に１日５０ｍｇの服用量を１日あたり２回投与し、コホートＢ（１９人の患者）に１５０ｍｇのより高い服用量を１日あたり２回投与した（図３５）。３６人の患者に対して、対の生検が評価可能であった。主要評価項目は、処置前から処置後のＫｉ－６７の変化であり、二次評価項目は相関性バイオマーカーとして含んだ。処置前の平均Ｋｉ－６７は６８％、処置後は５９％であった。Ｋｉ－６７の平均減少率は８％であった（Ｐ＝０．００２０６、９５％ＣＩ－１３．４６～－３．２６）。Ｋｉ－６７のベースラインから少なくとも２０％の減少が、患者の２８％に観察された。ＥＲベータのＩＨＣ発現はＳ－エクオールへの曝露により減少し、中央値の減少が４５％であった（範囲は－６５．００～－１９．５０）（図３６）。サイクリンＤ１染色もＳ－エクオール曝露により減少し、中央値の減少が１２．５であった（範囲は－２７．５～０．０）（図３７）。処置前及び処置後の対の腫瘍サンプルでは、ＣＤ３又はＣＤ８の染色に有意な変化はなかった。

Ｓ－エクオールは、忍容性が高い、新しい経口用ＥＲベータアゴニストであり、Ｋｉ－７の減少によって測定されるようなＴＮＢＣを有する患者における増殖を抑制する。ＩＨＣによるＥＲベータの発現及びサイクリンＤ１の染色は、両方ともＳ－エクオールへの曝露によって減少した。腫瘍サンプルにおけるＣＤ３及びＣＤ８の発現は、Ｓ－エクオールへの曝露によって有意に変化しなかった。

（参考文献）
本明細書において参照される特許文献及び科学文献は当業者が入手可能な知見を提示するものである。本明細書に引用したすべての米国特許及び公開又は非公開の米国特許出願は、参照により援用される。本明細書に引用したすべての公開外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用した他のすべての公開参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に援用される。
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Claims (47)

1. Ｓ－エクオールを含む製剤を、その必要がある対象に薬学的有効量投与することを含む、がんを処置する又は予防するための方法。
2. 前記製剤は、１０～２００ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記製剤は、５０～１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記製剤は、約５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記製剤は、約１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記製剤は、経口、静脈内、腹腔内又は皮下投与される、請求項１に記載の方法。
7. 前記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｓ－エクオールは、１つ以上の他のがん処置と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｓ－エクオールは、免疫療法剤と組み合わせて投与される、請求項８に記載の方法。
10. 前記免疫療法剤は、抗体である、請求項９に記載の方法。
11. 前記抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を対象とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記抗体は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）を対象とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記抗体は、ペムブロリズマブである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記抗体は、アテゾリズマブである、請求項１２に記載の方法。
15. 前記抗体は、アベルマブである、請求項１２に記載の方法。
16. 前記製剤は、ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
17. ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ－エクオールとともに投与されない、請求項１に記載の方法。
18. 前記製剤は、Ｒ－エクオールを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
19. 前記Ｓ－エクオールは、化学的に製造される、請求項１に記載の方法。
20. 前記製剤は、１日あたり１回投与される、請求項１に記載の方法。
21. 前記製剤は、１日あたり２回投与される、請求項１に記載の方法。
22. 前記製剤は、１日あたり３回投与される、請求項１に記載の方法。
23. 前記製剤は、１日あたり４回投与される、請求項１に記載の方法。
24. 前記がんは乳がんである、請求項１に記載の方法。
25. 乳がんはトリプルネガティブ乳がんである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記がんは黒色腫である、請求項１に記載の方法。
27. １０～２００ｍｇのＳ－エクオールを含む、がんを処置するための組成物。
28. 前記組成物は５０～１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記組成物は約５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記組成物は約１５０ｍｇのＳ－エクオールを含む、請求項２８に記載の組成物。
31. 前記組成物は、経口、静脈内、腹腔内、又は皮下に投与するように製剤化される、請求項２７に記載の組成物。
32. １つ以上の他のがん処置をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
33. 前記１つ以上の他のがん処置は免疫療法剤である、請求項３２に記載の組成物。
34. 前記免疫療法剤は、抗体である、請求項３３に記載の組成物。
35. 前記抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を対象とする、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記抗体は、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）を対象とする、請求項３４に記載の組成物。
37. 前記抗体は、ペムブロリズマブである、請求項３５に記載の組成物。
38. 前記抗体は、アテゾリズマブである、請求項３６に記載の組成物。
39. 前記抗体は、アベルマブである、請求項３６に記載の組成物。
40. 前記組成物は、ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
41. ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ－エクオールとともに投与されない、請求項２７に記載の組成物。
42. 前記組成物は、Ｒ－エクオールを実質的に含まない、請求項２７に記載の組成物。
43. 前記Ｓ－エクオールは、化学的に製造される、請求項２７に記載の組成物。
44. 請求項２７～４３のいずれか１項に記載の組成物を薬学的有効量投与することを含む、Ｔ細胞受容体の活性化のための方法。
45. 前記Ｔ細胞受容体の活性化はＥＲβリン酸化チロシンスイッチを刺激する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記Ｔ細胞受容体の活性化は免疫療法を増強する、請求項４４に記載の方法。
47. 前記免疫療法は、抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）である、請求項４６に記載の方法。
    

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