JP2023550151A - 幹細胞ニッチにおけるｈｉｐｐｏシグナル伝達を抑制することによる骨格筋再生の促進 - Google Patents

Abstract

【課題】 幹細胞ニッチにおけるＨＩＰＰＯシグナル抑制は骨格筋再生を促進する【解決手段】 本開示の実施形態は、ＨＩＰＰＯ経路を標的とすることによって骨格筋を生成する方法を含む。特定の実施形態では、骨格筋生成の必要性を有する個体は、ＳＡＶ１遺伝子を標的とする有効量のｓｈＲＮＡ分子を提供される。特定のｓｈＲＮＡ配列が開示されている。【選択図】図１

Description

本出願は、２０２０年１１月２０日出願の米国仮特許出願第６３／１１６，７５４号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（連邦政府支援の研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＨＬ１２７７１７に基づく政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生化学、及び医学の分野に関連する。

高齢者では下肢虚血の発生率が増加しているが、血管内手術や遺伝子・幹細胞を用いた治療法などの現在の治療法は、四肢の生存能力を回復するのに有効ではない（１－３）。これらの現在の戦略は、灌流を再確立するための血管再生と新生血管に焦点を当てているが、損傷した筋肉を補い筋肉機能を回復する骨格筋の再生はほとんど取り上げられていない（４）。骨格筋は四肢の主要な質量を構成し、四肢の循環に関わる血管の大部分を含んでいる。そのため、骨格筋は血管障害に対して脆弱であり、筋の損傷は虚血の重症度と持続時間に直接相関する（５－６）。したがって、下肢虚血の治療を成功させるには、灌流回復に伴う筋再生が重要である。

加齢に伴う骨格筋の再生能力の漸減は、骨格筋修復における基本的な課題である（７、８）。成体幹細胞の筋再生を促進する一つのアプローチとして、局所環境制約を標的とすることが挙げられる。成体機能骨格筋の再生は、通常、成体筋の静止状態の骨格筋幹細胞である活性化サテライト細胞（ＳＣ）から筋芽細胞が継続して産生されることに依存している（９，１０）。傷害（例えば、虚血時又は筋損傷又は損傷時等）に応じて、ＳＣは活性化し増殖を開始して自己再生し骨格筋細胞へ分化する（１１）。筋原性決定因子ＰＡＸ７（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ転写因子ファミリーのメンバー）を発現するＳＣは、筋繊維の細胞膜と基底膜の間のユニークな解剖学的ニッチ（微小環境）で筋繊維によって保護されており、内皮細胞（ＥＣ）に近接して位置している（１２）。筋繊維とニッチ構成要素（筋繊維、血管細胞、細胞外マトリックス、拡散性因子など）との動的相互作用は、ＳＣの静止、活性化、増殖、分化を支配する（１３）。筋繊維は、ＳＣ上の受容体に結合するシグナル分子を分泌してＳＣとコミュニケーションをとり、ＳＣの運命を方向づける（１４）。筋繊維の生理状態や内在するシグナル伝達経路は、ＳＣの活性化や拡大に影響を与えるように調節でき、それによって、パラクラインおよびオートクラインシグナルによって近隣のＥＣを活性化して血管新生を促進できる（１５）。

ＨＩＰＰＯシグナルは、高度に保存されたキナーゼカスケード経路であり、組織の成長に関連するシグナル伝達の転写物を調節することによって細胞増殖を阻害する（１６）。哺乳類のＨＩＰＰＯシグナル中核成分には、ショウジョウバエのＨＩＰＰＯキナーゼとオーソログなＳｔｅ２０キナーゼＭｓｔ１およびＭｓｔ２がある。Ｍｓｔキナーゼは、Ｓａｌｖａｄｏｒ（ＳＡＶ１またはＳＡＶ）足場タンパク質と複合化すると、Ｌａｒｇｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｌａｔｓ）キナーゼをリン酸化させる。哺乳類のＬａｔｓ１とＬａｔｓ２はＮＤＲファミリーキナーゼであり、ショウジョウバエのＷａｒｔｓとオーソログである。Ｌａｔｓキナーゼは、次に、ＹａｐとＴａｚをリン酸化する。ＹａｐとＴａｚ は、最も下流のＨＩＰＰＯシグナル伝達成分であり、Ｔｅａｄなどの転写因子と連携して遺伝子発現を制御する２つの関連転写共活性化因子である。Ｙａｐはまた、Ｗｎｔシグナルのエフェクターであるβ－カテニンと相互作用し、遺伝子発現を制御している。リン酸化されると、ＹａｐとＴａｚは核から排除され、転写不活性化される。ＨＩＰＰＯ経路の破壊は、組織再生を促進することが判明している（１７）。

加齢に伴う骨格筋再生の漸減は、骨格筋損傷の治療能力を制限する。骨格筋の再生は、独特の解剖学的ニッチで筋線維に守られ、内皮細胞に隣接して存在する常在幹細胞の活性に依存している。筋原細胞のＨｉｐｐｏ経路を阻害することで、筋原繊維のセクレトームの組成を変化させ、新生血管の増強とともに、ＳＣの増殖と分化（筋新生）および隣接ＥＣの血管新生を刺激・促進する因子で局所環境を豊かにすることができる。この戦略は、高齢者集団における機能的な骨格筋再生という現在のハードルを克服する可能性がある。

本開示は、当技術分野において長く求められていた必要性に取り組むものであり、筋繊維におけるＨｉｐｐｏ経路を操作することにより、筋幹細胞ニッチにおけるＳＣ増殖及び自己再生のためのシグナルを活性化して、血管新生及び新生血管形成と同時に筋新生を促進し、骨格筋状態に対する治療を提供する方法及び組成物に関する。

本開示は、例えば、骨格筋における血管新生及び／又は筋新生の増加、骨格筋における筋線維の再生、並びに骨格筋における衛星細胞の増殖及びいくつかの実施形態では分化を誘導する方法を提供する。該方法は、サテライト細胞を含む骨格筋細胞に、少なくとも１つの阻害性核酸を含む有効量の組成物を送達することを含み、ここで、該阻害性核酸はサルバドール（ＳＡＶ１）を標的とする。

いくつかの実施形態では、組成物は、それを必要とする哺乳動物被験体に投与される。例えば、哺乳類の骨格筋は、虚血性または萎縮性であり得る。いくつかの実施形態では、骨格筋は外傷性傷害を受けた。特定の実施形態では、対象は、四肢虚血、末梢血管疾患、およびサルコペニアからなる群から選択される状態を有する。

本開示の方法はまた、インビトロまたはエクスビボの方法であることができる。

本開示はさらに、哺乳類対象における四肢虚血を治療する方法を提供し、この方法は、対象における虚血肢の骨格筋細胞に、少なくとも１つの阻害性核酸を含む有効量の組成物を送達することを含み、ここで阻害性核酸はＳＡＶ１を標的とする。

また、本開示の方法において使用するための、ＳＡＶ１を標的とする阻害性核酸が提供される。

いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するか、またはその配列によってコードされている。

特定の実施形態において、組成物は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、または有する配列によってコードされる阻害性核酸、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも８０％の同一性を有する、または有する配列によってコードされる阻害性核酸、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも８０％の同一性を有する、または有する配列によってコードされる阻害性核酸を含む。

特定の実施形態において、阻害性核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなる群から選択される配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するか、またはそれによってコードされている。特定の実施形態では、阻害性核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなる群から選択される配列を有するか、またはそれによってコードされている。

一実施形態では、組成物は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のヌクレオチド配列を有する核酸、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のヌクレオチド配列を有する核酸；を含む核酸構築物を含み、核酸（ｉ）～（ｉｉｉ）がプロモーターに作動可能に連結されている。

阻害性核酸は、例えば、阻害性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、例えば、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはショートヘアピンＲＮＡ、短干渉ＲＮＡであり得る。一実施形態では、ｓｈＲＮＡは、長さが少なくとも４３ヌクレオチドである。一実施形態では、ｓｈＲＮＡは、長さが１３８ヌクレオチド未満である。ある実施形態では、ｓｈＲＮＡは、長さが５及び１９ヌクレオチドの間、好ましくは長さが４及び１０ヌクレオチドの間のループ構造を含む。

いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が、核酸構築物中に含まれる。そのような実施形態において、阻害性ＲＮＡは、好ましくは骨格筋細胞で発現される。したがって、阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、組織特異的プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、心筋トロポニンＴプロモーターである。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、少なくとも１つの転写後調節要素、例えば、ウッドチャック転写後調節要素を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、３’マイクロＲＮＡ－３０配列および５’マイクロＲＮＡ－３０配列をコードする配列を含んでいる。特定の実施形態では、核酸構築物は、５’および３’逆末端反復を含んでなる。

複数の阻害性ＲＮＡを利用する方法において、各阻害性ＲＮＡをコードする配列は、同じ核酸構築物上にあることも、異なる核酸構築物上にあることもできる。各阻害性ＲＮＡ配列の転写は、それ自身のプロモーターによって制御することができ、または単一のプロモーターが複数の阻害性ＲＮＡ配列の転写を制御することができる。一実施形態では、複数の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、単一のプロモーターによって制御される。

本開示のいくつかの実施形態では、ＳＡＶ１を標的とする阻害性核酸またはＳＡＶ１を標的とする阻害性核酸をコードするヌクレオチド配列は、ベクターに含まれる。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスに由来し得る。いくつかの実施形態では、ベクターは非統合ベクターであり、すなわち、標的細胞ゲノムに統合されることはない。

本開示の１つの実施形態に関して議論される任意の制限は、本開示の任意の他の実施形態に適用され得ることが特に企図される。さらに、本開示の任意の組成物は、本開示の任意の方法において使用され得、本開示の任意の方法は、本開示の任意の組成物を製造するためまたは利用するために使用され得る。実施例に記載された実施形態の側面は、異なる実施例または本願の他の場所、例えば、簡単な要約、詳細な説明、特許請求の範囲、および図面の簡単な説明において議論された実施形態の文脈で実施され得る実施形態であるとも言える。

前述では、以下に続く詳細な説明がよりよく理解されるように、本開示の特徴および技術的利点をむしろ広範に概説した。以下、本明細書の特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴および利点が説明されるであろう。開示された構想および特定の実施形態は、本デザインの同じ目的を遂行するための他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者には理解され得るはずである。また、そのような同等の構造は、添付の特許請求の範囲に規定されるような精神および範囲から逸脱しないことも、当業者には理解されるはずである。本明細書に開示された設計の特徴であると考えられる新規な特徴は、組織および操作方法の両方に関して、さらなる目的および利点とともに、添付の図と関連して考慮される場合、以下の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、各図は、例示および説明の目的のみのために提供され、本開示の限界の定義として意図されていないことが、明示的に理解されるであろう。

本開示のより完全な理解のために、ここで、添付の図面と共に取られる以下の説明を参照されたい。

筋線維により誘導された再生性幹細胞ニッチを再現し、同時での筋形成および血管形成－血管新生を虚血四肢における骨格筋の機能的回復のために促進させる本開示のＡＡＶ９ Ｓａｌｖａｄｏｒ ｓｈＲＮＡ戦略を例示する。これらの筋線維は、様々なパラクリン要素を、（ｉ）サテライト細胞を活性化して、筋形成のために増殖させ、かつ自己再生させるように、また、（ｉｉ）内皮細胞を活性化して、血管形成および血管新生を刺激するように放出する。

ヒトＳＡＶ１のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。陰影領域は阻害性核酸のための標的配列の例を示している。交互のエクソンが二重下線の有無によって示される。タンパク質構造ドメインが一重下線の配列によって示される：５’から３’への順序で、ＷＷドメイン、ＷＷドメイン、ＳＡＲＡＨドメイン。

ＳＡＶ１を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＳＡＶ１のｍＲＮＡ発現を効果的に低下させることを示す。配列番号２、配列番号３または配列番号４に対応する阻害性ＲＮＡを新生児心筋細胞にトランスフェクションした。ＳＡＶ１のｍＲＮＡレベルを、定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して測定した。３つすべてのｓｉＲＮＡがＳＡＶ１のｍＲＮＡレベルを効果的に低下させた。

後肢虚血がＨｉｐｐｏ経路コアタンパク質をアップレギュレーションしたことを示す。図４Ａは、片側後肢虚血誘導後１４日での反対側非虚血脚（ＣＴＬ）および虚血脚（ＩＳＬ）の腓腹筋におけるＳａｌｖａｄｏｒ（ＳＡＶ１）レベル、総ＹＡＰレベルおよびリン酸化ＹＡＰ（ｐＹＡＰ）レベルを示すウエスタンブロットである。ＧＡＰＤＨを負荷コントロールのために使用した。図４Ｂは、ＳＡＶ１、総ＹＡＰおよびｐＹＡＰのアップレギュレーションをＣＴＬと比較してＩＳＬの腓腹筋において示す半定量的分析である。総ＹＡＰに対するｐＹＡＰの比率は変化しなかった。^＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定；ｎ＝４匹のマウス。Ｍ１～Ｍ４：マウス＃１～マウス＃４。データは平均±ＳＥＭである。

ＡＡＶ ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡが、ＳＡＶ１、ＹＡＰおよびｐＹＡＰの発現をダウンレギュレーションしたことを示す。図５Ａおよび図５Ｂは、反対側非虚血脚（ＣＴＬ）および虚血脚（ＩＳＬ）の腓腹筋におけるＳＡＶ１、総ＹＡＰおよびｐＹＡＰのタンパク質レベルを、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡのＩＳＬ内への筋肉内注射の７日後において示すウエスタンブロットである。図５Ｃ～図５Ｆは、低下したＳＡＶ１発現、総ＹＡＰ発現およびｐＹＡＰ発現を、対照処置されたＩＳＬ（対照）と比較して、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置されたＩＳＬ（ＳＡＶ１ ＫＤ）において示す半定量的分析を示す。有意な変化がｐＹＡＰ／ＹＡＰ比において認められなかった。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝５匹のマウス／群、ダネット多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。図５Ｇおよび図５Ｈは、ＳＡＶ１ノックダウン（ＫＤ）の後では、対照処置の後よりも広範な筋形成性ＹＡＰ核局在化（白矢印）をＡＡＶ９投与後１４日において示す代表的な免疫蛍光画像である。図５Ｉは筋線維におけるＹＡＰ核局在化の定量化を示す。^＊Ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定：ｎ＝４匹のマウス／群。データは平均±ＳＥＭである。

ＡＡＶ９ ｓｈＲＮＡ媒介のＳＡＶ１ノックダウンを虚血脚において行った後における後肢虚血の機能的成果を示す。図６Ａは、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置されたマウス（ＳＡＶ１ ＫＤ）における虚血肢への血流の回復に関する経時的研究を示す代表的なレーザードップラー灌流画像をＡＡＶ９対照処置されたマウス（対照）と比較して示す。図６Ｂは、ＳＡＶ１ ＫＤが、対照処置されたマウスと比較して、有意に改善された灌流を５週目～９週目までにもたらしたことを示す（ｎ＝１８匹のマウス／群）。図６Ｃは、より多くの赤色蛍光レクチン染色された毛細血管および細動脈が、対照マウスの腓腹筋に比べて、ＳＡＶ１ ＫＤマウスの腓腹筋において認められたことを示す。図６Ｄは筋線維あたりのレクチン^＋毛細血管の定量化を示す（ｎ＝４匹のマウス／群）。図６Ｅは、ＳＡＶ１ ＫＤが、有意により大きいトレッドミル持久力を７週目までにもたらしたことを示す（ｎ＝１８匹のマウス／群）。データは平均±ＳＥＭである。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定。

虚血脚におけるＡＡＶ９ ｓｈＲＮＡ媒介のＳＡＶ１ノックダウンが細胞増殖を促進させたことを示す。図７Ａは、虚血腓腹筋におけるＳＡＶ１ノックダウンの後では、対照処置の後よりも多いＥｄＵ^＋細胞を例示する代表的な免疫蛍光画像を示す。核のＤＡＰＩ対比染色を行った。白色の免疫蛍光擬似色を、ＥｄＵが取り込まれた核に適用した。図７Ｂは、全核に対するＥｄＵ陽性核の平均比率が、ＳＡＶ１ノックダウンを伴う虚血腓腹筋では、対照処置を伴う虚血腓腹筋に比べて有意に高かったことを示す。ｎ＝４匹のマウス／群。^＊Ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定。図７Ｃは、対照群およびＳＡＶ１ノックダウン群における筋線維周辺のＥｄＵ^＋核の分布を示す腓腹筋切片の代表的な免疫蛍光画像を示す。ラミニン染色を、基底膜を特定するために使用した。黄色矢印は、筋線維間の間質におけるＥｄＵ標識された核を示し、赤色矢印は、縦方向の骨格筋線維の周囲に沿った、または筋線維膜と基底膜との間におけるＥｄＵ標識された核を示す。

ＡＡＶ９ ｓｈＲＮＡ媒介のＳＡＶ１ノックダウンがサテライト細胞および内皮細胞の増殖を促進させたことを示す。図８Ａは、静止状態のＥｄＵ^－Ｐａｘ７^＋サテライト細胞（白矢印）および増殖中のＥｄＵ^＋Ｐａｘ７^＋サテライト細胞（黄色矢印）を示す代表的な免疫蛍光画像を示す。図８Ｂは、全ＥｄＵ^＋核に対するＥｄＵ^＋Ｐａｘ７^＋核の有意により高い比率（百分率）が、対照群に比べて、ＳＡＶ１ ＫＤ群において検出されたことを示す。図８Ｃは、ＥｄＵ^＋の核局在化を示す増殖中のＣＤ３１^＋内皮細胞（紫色矢印）を示す。ＣＤ３１^＋ＥｄＵ^＋血管出芽（緑色矢印）およびＣＤ３１^＋ＥｄＵ^＋側副血管（オレンジ色矢印）が、ＳＡＶ１ ＫＤ群において認められた。白色の免疫蛍光擬似色を、ＥｄＵが取り込まれた核に適用した。図８Ｄは、高倍率視野あたりの総ＣＤ３１^＋細胞に対するＣＤ３１^＋ＥｄＵ^＋細胞の比率（％）を示す。ｎ＝４匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を対での比較のために使用した。

静止状態のＥｄＵ－Ｐａｘ７＋サテライト細胞（白矢印）および増殖中のＥｄＵ＋Ｐａｘ７＋サテライト細胞（黄色矢印）を、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡまたはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡをマウス虚血性後肢に注射した１４日後において示す代表的な免疫蛍光画像を示す。

ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡが筋傷害後の骨格筋再生を促進させたことを示す）。図１０Ａは、心臓毒（ＣＴＸ）注射を受けなかった正常な筋肉、ならびにＣＴＸ注射後３日目における炎症細胞浸潤および筋線維壊死を含有する筋肉を示す前脛骨筋の代表的な画像を示す。図１０Ｂは、ＡＡＶ９対照処置（対照）、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置（ＳＡＶ１ ＫＤ）の後１４日における中心有核筋線維の代表的な画像を示す。図１０Ｃは、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置された前脛骨筋が、対照処置された筋肉と比較して、大きい径の再生された筋線維を有したことを示す。ｎ＝３匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図１０Ｄは、毛細血管および血管を可視化するためにＣＤ３１により染色される前脛骨筋の断面の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１０Ｅは、毛細血管密度が、ＳＡＶ１ ＫＤ群では、対照群に比べて有意に高かったことを示す。ｎ＝４匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を対での比較のために使用した。

ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置が老齢マウスにおいて心臓毒誘発傷害後の骨格筋再生を促進させたことを示す。図１１Ａは、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡによる処置、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡによる処置（ＳＡＶ１ ＫＤ）の１４日後における再生中の前脛骨筋線維の断面積を示すヘマトキシリン・エオシン染色の代表的な画像を示す。図１１Ｂは再生線維断面積の頻度分布分析を示す。ｎ＝３匹／群、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。図１１Ｃは、Ｐａｘ７^＋ＥｄＵ^－細胞（白矢印）およびＰａｘ７^＋ＥｄＵ^＋細胞（黄色矢印）が存在することを示す。図１１Ｄは、Ｐａｘ７^＋ＥｄＵ^－細胞の比率が、ＳＡＶ１ ＫＤ群では、対照群に比べて有意に高かったことを示す。ＥｄＵ陽性核の割合（図１１Ｅ）およびＰａｘ７^＋ＥｄＵ^＋細胞の割合（図１１Ｆ）が、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ処置、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置の後１４日において同程度であった。ｎ＝４匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を対での比較のために使用した。

Ｐａｘ７抗体により染色される老齢マウスの前脛骨筋を、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡの注射を心臓毒誘発筋傷害後に行った１４日後において示す。図１２Ａは、隣接するＰａｘ７^＋ＥｄＵ^－細胞およびＰａｘ７^－ＥｄＵ^＋細胞が存在することを示す（黄色円）。図１２Ｂは、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置された前脛骨筋における活性化サテライト細胞クラスター（２個以上の核、黄色矢印）を示すＥｄＵおよびＰａｘ７の二重陽性核（黄色矢印）を示す；Ｐａｘ７^＋ＥｄＵ^－サテライト細胞（白矢印）が対照群およびＳＡＶ１ ＫＤ群の両方で認められた。図１２Ｃは、高倍率視野（ＨＰＦ）あたりのＰａｘ７^＋ＥｄＵ^＋ＳＣクラスター（２個以上の核）の平均数を示す。ｎ＝４匹のマウス／群。

老齢マウスのＣＴＸ傷害された前脛骨筋におけるＳＡＶ１ノックダウンが血管形成を促進させたことを示す。図１３Ａは、ＣＤ３１陽性毛細血管および血管を示す前脛骨筋の断面の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１３Ｂは、毛細血管密度が、ＳＡＶ１ＫＤ群では、対照群に比べて有意に高かったことを示す。ｎ＝４匹のマウス／群、^＊Ｐ＜０．０５。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定。

炎症性浸潤が、拡がった間質間隙（白矢印）において、ならびに筋線維周辺（黄色矢印）および血管周辺（青色矢印）に存在することを示すＨ＆Ｅ染色された前脛骨筋の代表的な画像を示す。

Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＳＡＶ１サイレンシングから生じる馴化培地がサテライト細胞増殖をインビトロで促進させたことを示す。図１５Ａは、ＳＡＶ１ ｍＲＮＡの相対的発現レベルが、ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡによるＣ２Ｃ１２筋管へのトランスフェクションの後では、陰性対照（ＮＣ）のｓｉＲＮＡによる４８時間のトランスフェクションと比較して有意に減少したことを示しているＲＴ－ｑＰＣＲを示す。対応のないｔ検定を分析のために使用した。データを３つの独立したアッセイから得た。図１５Ｂは、サテライト細胞の核へのＥｄＵの取り込みを、ＳＡＶ１ノックダウン後のＣ２Ｃ１２筋管から回収される馴化培地（ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭ）、およびＳＡＶ１ノックダウンの非存在下でのＣ２Ｃ１２筋管から回収される馴化培地（ＮＣ ｓｉＲＮＡ－ＣＭ）における２４時間の培養の後において示す代表的な蛍光画像を示す。図１５Ｃは、ＮＣ ｓｉＲＮＡ－ＣＭおよびＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭにおいて成長するサテライト細胞におけるＥｄＵ取り込みの定量化を示す。対応のないｔ検定を使用した。データを５つの独立したアッセイから得た。図１５Ｄは、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡが形質導入されるＣ２Ｃ１２筋管の４日目での代表的な位相差・蛍光画像を示す。図１５Ｅは、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるＡＡＶ対照ｓｈＲＮＡの形質導入およびＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡの形質導入の７日後に分析される、ＳＡＶ１ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。対応のないｔ検定を使用した。データを３つの独立したアッセイから得た。図１５Ｆは、ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ誘発ＳＡＶ１ノックダウンを含有するＣ２Ｃ１２筋管からの馴化培地（ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ－ＣＭ）、およびＡＡＶ対照によるＳＡＶ１ノックダウンの非存在下でのＣ２Ｃ１２筋管からの馴化培地（ＡＡＶ ｃｏｎ－ＣＭ）において成長するサテライト細胞のＥｄＵ取り込みの代表的な画像を示す。図１５Ｇは、ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ－ＣＭにおいて成長するサテライト細胞が、ＡＡＶ ｃｏｎ－ＣＭにおいて成長するサテライト細胞よりも高い割合のＥｄＵ^＋核を示したことを示す。対応のないｔ検定を使用した。データを５つの独立したアッセイから得た。^＊Ｐ＜０．０５。^＊＊Ｐ＜０．０１。

Ｉ.例示的な定義
長年にわたる特許法の慣例に従って、「ａ」及び「ａｎ」という語は、特許請求の範囲を含め、構成している用語と合わせて本明細書で使用される場合、「１つ以上」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／または方法からなるか、または本質的になる場合がある。本明細書に記載の任意の方法または組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物と関連付けて実施できると考えられる。
用語「または」および「および／または」は、互いに組み合わせて、または排他的に複数の成分を記述するために利用される。例えば、"x、y、および／またはz "は、"x "単独、"y "単独、"z "単独、「x、y、およびz」、「（xおよびy）またはz」、「xまたは（yおよびz）」、または「xまたはyまたはz」、を指すことができる。x、y、またはzが、実施形態から具体的に除外され得ることが特に企図される。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、細胞生物学及び分子生物学の分野における平易かつ通常の意味に従って用いられ、値を決定するために採用される装置又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示す。
用語「comprising」（含む、含有する）は、「including」、「containing」、または「characterized by」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の、再現されていない要素または方法ステップを排除しない。「からなる」という表現は、特定されていない要素、ステップ、または成分を除外する。「本質的にからなる」という表現は、記載された主題の範囲を、指定された材料またはステップ、およびその基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えないものに限定するものである。用語 "comprising "の文脈で説明される実施形態は、用語"consisting of "または "consisting essentially of "の文脈でも実施され得ることが企図される。

本明細書における値の範囲の言及は、本明細書において特に示されない限り、範囲内に入る各別の値を個別に参照するための方法として機能することを単に意図しており、各別の値は、本明細書において個別に言及されているかのように本明細書に組み込まれる

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所に出現する前述の語句が、必ずしもすべて同じ実施形態を指しているとは限らない。

さらに、特定の特徴、構造、または特性は、1つまたは複数の実施形態において、任意の好適な方法で組み合わせることができる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより良く照らすことを意図しており、特に主張しない限り、本開示の範囲に対する制限を提起するものでない。本明細書におけるいかなる文言も、請求されていない要素を本開示の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド配列」または「核酸」という用語は、プリンおよびピリミジン塩基、糖、およびホスホジエステル結合におけるリン酸基を含むヌクレオシド間の共有結合の組み合わせを有するDNAまたはRNAの重合体を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であり、DNAまたはRNAポリマーに組み込むことができる合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を任意に含むことになる。用語 "ポリヌクレオチド "は、用語 "オリゴヌクレオチド "と互換的に使用される。用語 "ヌクレオチド配列 "は、特に明記されない限り、用語 "核酸配列 "と交換可能である。

場合によっては、代替のバックボーンまたは非天然のヌクレオシド間連結を有し得る核酸アナログが含まれ、例えば、修飾されたリン含有バックボーンおよびモルフォリノバックボーンなどの非リン含有バックボーンからなる；シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸塩、スルホンアミド、およびスルファメート骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；アミド骨格、などなど。例えば、米国特許第７，４１０，９４４号を参照されたい。修飾されたリン含有バックボーンの例としては、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、キラルホスホロチオエート、Ｏ－メチルホロアミドホストリエーター、アミノアルキルホストリエーター、アルキルホストン酸、チオノアルキルホストン酸、ホスフィット、ホスファミド、チオンホスファミド、チオナルキルホストリエーター、ボランホスファートおよびこれらの種々の塩形態が挙げられる。上記の非リン酸含有バックボーンの例は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，６７７，４３９号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。他のアナログ核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号に記載されているものを含む、陽性バックボーン、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを有するものがある。リボース－リン酸骨格の修飾は、標識などの部位の付加を容易にし、または生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させることができる。

核酸は、置換された糖部分または改変された糖部分、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖部分または炭素環式糖を含有することができる。核酸はまた、修飾ヌクレオシド（ヌクレオシド類似体）、すなわち、修飾されたプリン塩基またはピリミジン塩基、例えば、５－置換ピリミジン類、６－アザピリミジン類、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６－トリメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５－ハロリジン（例えば、５－ブロモウリジン）または６－アザピリミジン類または６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウリジン）、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、４－アセチルシチジン、３－メチルシチジン、プロピン、クエソシン（ｑｕｅｓｏｓｉｎｅ）、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、Ｎ－２－、Ｎ－６－およびＯ－置換プリン、イノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニルアデノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、ならびにトレオニン誘導体などを含有することができる。例えば、米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと。

核酸の文脈において、用語「ハイブリダイゼーションする」、用語「結合する」、用語「標的とする（標的化する）」、またはそれらの変形は、十分な程度の相補性または塩基対形成が相補的核酸配列または阻害性核酸配列と、標的ＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡとの間に存在し、その結果、安定かつ特異的な相互作用がそれらの間で生じることを示す。十分な相互作用が、所定の条件のもとで、好ましくは生物学的または生理学的な条件のもとで、相補的核酸配列または阻害性核酸配列とその意図された標的核酸との間で生じ、非標的配列に対する相補的ヌクレオチド配列または阻害性ヌクレオチド配列の非特異的結合が実質的に存在しないとき、特異的なハイブリダイゼーションが生じる。

好ましくは、特異的なハイブリダイゼーションは、阻害、すなわち標的ＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子産物の正常な発現の妨害をもたらす。標的配列と阻害性ＲＮＡとの間での完全な相補性は要求されない。阻害性ヌクレオチド配列、例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、または二本鎖阻害性ＲＮＡのアンチセンス配列は、所定の条件のもとで標的配列に結合し、標的遺伝子発現を阻害するならば、十分に相補的である。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列を、標的遺伝子の複製調節領域または転写調節領域に対して、あるいは翻訳調節領域（例えば、翻訳開始領域およびエクソン／イントロン接合部など）に対して、あるいは標的ｍＲＮＡのコード領域に対して特異的にハイブリダイゼーションするように設計することができる。

本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」核酸配列または「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、標的「センス」配列に塩基対形成を介して結合することができるＤＮＡまたはＲＮＡの配列である。いくつかの事例において、センス配列は、タンパク質をコードする核酸であり、その結果、アンチセンス配列は二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であり、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である。アンチセンス配列はセンス配列に対して完全に、または部分的に相補的であることが可能である。アンチセンスヌクレオチド配列を、所望の標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの特定の領域に特異的にハイブリダイゼーションして、複製、転写または翻訳を妨害するように設計することができる。アンチセンス配列は、どのような長さのセンス配列に対してであれ、例えば、少なくとも約１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドに対して相補的であることが可能である。

用語「阻害性核酸」および用語「阻害性オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、対応するｍＲＮＡの翻訳を妨げることによって標的遺伝子の発現をノックダウンする分子を示す。上記で議論されたように、発現が、阻害性核酸がその標的に配列特異的に結合することによって阻害される。ある種の阻害性ＲＮＡ、例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などでは、配列相補性が、ｍＲＮＡを破壊のために標的とするために利用される。阻害性ＲＮＡは、そのヌクレオチド配列を介して細胞において特異的ｍＲＮＡに対して適切に標的化されるときには、標的遺伝子発現を特異的に抑制し、それにより、対応する標的ｍＲＮＡの細胞レベルを低下させ、また、そのようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを減少させる。

阻害性核酸は一本鎖または二本鎖であることが可能である。阻害性核酸の例には、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ならびにマイクロＲＮＡが含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「ノックダウン」または用語「ノックダウン技術」は、標的遺伝子産物の産生の阻害を引き起こすことができる阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡなど）が導入される前の遺伝子発現と比較して、標的遺伝子または目的とする遺伝子の発現が低下させられる遺伝子サイレンシングの技術を示す。例えば、発現が、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれどころか９９％低下させられる場合がある。発現が、どのような量（％）であれそれらの間隔の範囲内で、例えば、２～４、１１～１４、１６～１９、２１～２４、２６～２９、３１～３４、３６～３９、４１～４４、４６～４９、５１～５４、５６～５９、６１～６４、６６～６９、７１～７４、７６～７９、８１～８４、８６～８９、９１～９４、９６、９７、９８または９９などの量（％）で低下させられる場合がある。遺伝子発現の低下は、例えば、スチューデントＴ検定または他の知られている統計学的方法によって測定される場合、変化がない遺伝子発現または野生型の遺伝子発現と比較して、統計学的に有意であることが可能である。遺伝子発現のノックダウンを、この技術分野において知られている技術によって、例えば、阻害性ＲＮＡの使用、あるいは、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮなどによるゲノム編集の使用などによって導くことができる。

アンチセンス核酸配列がｍＲＮＡ標的配列に対する十分な相補性を有するとき、アンチセンス配列は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの標的部分に特異的に結合し、したがって標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するであろう。阻害性アンチセンス配列は典型的には、標的配列との塩基ミスマッチが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個でしかないであろう。多くの事例において、核酸の配列は正確な一致であること、すなわち、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に対して完全に相補的であること、したがって、相補的区域に沿ったミスマッチがゼロ個であることが望ましい場合がある。高度に相補的な配列は典型的には、ｍＲＮＡの標的配列領域に対して非常に特異的に結合するであろうし、したがって、標的ｍＲＮＡ配列のポリペプチド産物への翻訳を阻害することにおいて非常に効率的であることが可能である。例えば、米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。

特定の実施形態において、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８０パーセント超の相補性（または「％完全一致」）であり、より好ましくは、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約８５パーセント超の相補性であろう。ある特定の局面において、さらにより実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を本開示の実施における使用のために有することが望ましいであろう。そのような事例において、オリゴヌクレオチド配列は、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約９０パーセント超の相補性であり、ある特定の実施形態においては、このオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応するｍＲＮＡ標的配列に対して約９５パーゼント超の相補性である場合があり、また、設計されたオリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的ｍＲＮＡに対して９６％、９７％、９８％、９９％、それどころか１００％の完全一致の相補性を含めて、そのような完全一致の相補性に至る場合さえある。例えば、米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。どのような核酸配列であれ核酸配列のパーセント類似性またはパーセント相補性が、例えば、この技術分野において知られているコンピュータープログラムを利用することによって求められる場合がある。

本明細書中で使用される場合、用語「低分子干渉」または用語「短い干渉ＲＮＡ」または用語「ｓｉＲＮＡ」は、所望の遺伝子に対して標的化され、相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することができるヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖を示す。ＲＮＡ二重鎖は、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の塩基対を形成し、かつ２ヌクレオチドの３’突出部を有する、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドまたは２５ヌクレオチドの２つの相補的な一本鎖ＲＮＡを含む。ＲＮＡ二重鎖が、ＲＮＡ分子の２つの領域の間における相補的な対形成によって形成される。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的となった遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的であるという点で、ｓｉＲＮＡは遺伝子に対して「標的化される」。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。二重鎖は長さにおいて２９ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１１ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドであることが可能である。二重鎖の長さは長さにおいて１７～２５ヌクレオチドであることが可能である。二重鎖ＲＮＡは、ただ１つの構築物から細胞において発現させられることが可能である。

本明細書中で使用される場合、用語「ｓｈＲＮＡ」（低分子ヘアピンＲＮＡ）は、ｓｉＲＮＡの一部がヘアピン構造の一部であるＲＮＡ二重鎖（ｓｈＲＮＡ）を示す。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列の間に配置されるループ部分を含有する場合がある。ループは長さにおいて変化することが可能である。いくつかの実施形態において、ループは長さにおいて５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチドまたは１３ヌクレオチドである。ヘアピン構造はまた、３’突出部分または５’突出部分を含有することが可能である。いくつかの局面において、突出部は、長さにおいて０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの３’突出部または５’突出部である。本開示の１つの局面において、核酸構築物により、センス領域、ループ領域およびアンチセンス領域を含む低分子ヘアピンＲＮＡがコードされる。発現後、センス領域とアンチセンス領域とが二重鎖を形成する。例えば、Ｓａｌｖａｄｏｒ（ＳＡＶ１）のｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ＳＡＶ１の発現を低下させるのが、ｓｈＲＮＡを形成するこの二重鎖である。

「核酸構築物」は、１つまたは複数の機能的なヌクレオチド配列を含む合成された核酸分子である。核酸構築物は、例えば、コード配列および／または調節配列を含めて、遺伝子産物を細胞において発現させるために要求される核酸配列を含むことができる。「コード配列」は、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列である。コード配列はまた、シストロンとして示され得る。したがって、多シストロン核酸構築物は２つ以上のコード配列を含む。「調節配列」は、コード配列の発現を増減させることができるヌクレオチド配列である。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、オペレーターおよび非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「機能的に連結される（された）」は、ポリヌクレオチドにおける複数の核酸配列が会合し、その結果、これらの配列の１つの機能が別の配列によって影響されることになることを示す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にあるように）これら２つの配列が位置しているならば、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（「ＲＮＡコード配列」または「ｓｈＲＮＡコード配列」）、またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「機能的に連結される」と言われる。コード配列はセンス配向またはアンチセンス配向で調節配列に機能的に連結されることが可能である。ＲＮＡコード配列は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ分子の合成のための鋳型として役立ち得る核酸を示す。好ましくは、ＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列である。

「調節エレメント」は、遺伝子発現を調節することに関与する核酸配列であり、これには、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよび応答エレメントが含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、通常はそのコード配列の上流側（５’）にあるヌクレオチド配列であって、適正な転写のために要求されるＲＮＡポリメラーゼおよび他の因子のための認識を提供することによってコード配列の発現を導く、および／または制御するヌクレオチド配列を示す。「プロモーター」として、転写開始部位を指定するために役立つＴＡＴＡボックスおよび他の配列から構成される短いＤＮＡ配列である最小プロモーターのうち、調節エレメントが発現の制御のために付加される最小プロモーターを挙げることができる。「プロモーター」はまた、最小プロモーターならびに調節エレメントを含むヌクレオチド配列のうち、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を示すことができる。このタイプのプロモーター配列は近位の上流エレメントおよびより遠位の上流エレメントからなり、この場合、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激するＤＮＡ配列であって、プロモーターの生得的エレメント、あるいはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列である。エンハンサーは両方の配向（センスまたはアンチセンス）で働くことができ、また、プロモーターの上流側または下流側のどちらに移動させたときでさえも機能することができる。エンハンサーおよび他の上流側プロモーターエレメントは共に、それらの作用を媒介する配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質と結合する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来する場合があり、または自然界に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントから構成される場合さえある。プロモーターはまた、転写開始の有効性を生理学的条件または発達条件に応答して制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含有する場合がある。

本明細書中で使用される場合、用語「レポーターエレメント」または用語「マーカー」は、スクリーニングアッセイで検出することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意味される。レポーターエレメントによってコードされるポリペプチドの例には、ｌａｃＺ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第７，４１６，８４９号を参照のこと。多くのレポーターエレメントおよびマーカー遺伝子がこの技術分野において知られており、本開示の組成物および方法における使用のために想定される。

用語「対象」および用語「個体」は交換可能に使用され、典型的には哺乳動物を含み、ある特定の実施形態においてはヒトまたは非ヒト霊長類を含む。様々な組成物および方法がヒトにおける使用に関して本明細書中に記載されるが、それらはまた、動物使用のために、例えば、獣医学的使用のために好適である。したがって、ある特定の例示的な生物には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、有蹄類、およびウサギ類などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、ある特定の実施形態では、飼い慣らされた哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、実験室哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）などとの使用のための本明細書中に記載される組成物および方法が意図される。

本明細書中で使用される場合、表現「その必要性のある対象」または表現「その必要性のある個体」は、ある症状、疾患または状態に罹患している、あるいは罹患する危険性がある（例えば、素因（例えば、遺伝的素因など）がある、または素因となる環境条件にさらされている）対象または個体を示す。

阻害性ＲＮＡなどの活性な薬剤の「効果的な量」は、具体的に述べられた目的を果たすために、例えば、ＳＡＶ１発現を阻害するなどのために十分である量である。

本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、対象に投与されたときには有効成分の作用に対する阻害影響を何ら伴うことなく、化合物が生理学的に許容可能であり、かつ、許容できないほど毒性でないことを意味する。そのような組成物は無菌であることが可能であり、医薬的に許容され得るキャリアを含むことができる。好適な医薬組成物は、緩衝剤、界面活性剤、安定化剤、保存剤および／または他の可溶化剤もしくは分散化剤の１つまたは複数を含むことができる。

「処置する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または「処置」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または「処置するための」（ｔｏ ｔｒｅａｔ）または「緩和する」（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）または「緩和するための」（ｔｏ ａｌｌｅｖｉａｔｅ）などの用語は、診断された病理学的な状態または障害を治癒する、遅くする、診断された病理学的な状態または障害の症状を軽減する、ならびに／あるいは診断された病理学的な状態または障害の進行を停止させる措置を示す。したがって、処置を必要としている対象または個体には、既に障害を有するものが含まれる。ある特定の実施形態において、対象が、例えば、疾患または障害に関連する症状の総体的な、または部分的な、または一過性の緩和または排除を示すならば、対象は、本明細書中に提供される方法に従って疾患または障害について首尾よく「処置される」。

用語「低下させる」（ｒｅｄｕｃｅ）、用語「阻害する」（ｉｎｈｉｂｉｔ）、用語「減らす」（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）、用語「抑制する」（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）、および文法的同等表現（これには、「より低い」（ｌｏｗｅｒ）、「より小さい」（ｓｍａｌｌｅｒ）などが含まれる）は、発生または活性における測定可能な減少、いくつかの場合には、発生または活性の完全な阻止を含めて、発生または活性における統計学的に有意な減少を示す。例えば、「阻害」は、活性または発生における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を示すことができる。これらの用語は、特定の処置（例えば、本開示の方法）を受けていない「対照」に関して使用することができる。一例において、対照は、非処置のサンプルまたは対象であることが可能である。別の一例において、対照は、処置されたサンプルまたは対象とは異なる処置を受けたサンプルまたは対象であることが可能である。いくつかの実施形態において、「処置された」サンプルまたは対象は、本開示の方法に供されたものである。

本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌ベクター、酵母ベクターまたはバイナリーベクターを含めて、宿主細胞における複製が（ヘルパー配列、例えば、パッケージング配列などの有無にかかわらず）可能であるウイルス核酸配列または非ウイルス核酸配列を示す。ベクターは、二本鎖または一本鎖、線状または環状、場合によっては自己伝達性または可動性であることが可能である。ベクターは、細胞ゲノムへの組み込みによって、または染色体外（例えば、複製起点を有する自律的複製プラスミド）によってそのどちらでも原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を形質転換することができる。様々なウイルスベクターが、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびエンベロープ－シュードタイプ化ウイルスを含めてレトロウイルスから調製される。レンチウイルスベクターの例には、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。ベクターは脂質と複合体形成させることができ、例えば、リポソームにおいてカプセル化すること、またはカチオン性縮合剤と会合させることなどができる。

ＩＩ．一般的な実施形態
本発明者らは、翻訳における関与を潜在的に有する再生性微小環境の、筋線維により誘導された再現の新規なアプローチを開発した。血管形成および筋形成が協調したプログラムをインビボで誘導するための再生性環境を創出するために、本発明者らは、ＳＣを含んでいる筋幹細胞ニッチの重要な細胞成分である筋線維における成長抑制Ｈｉｐｐｏシグナル伝達事象を調節した。本発明者らは、筋形成性Ｈｉｐｐｏ経路のダウンレギュレーションが血管系再構築およびＳＣ活性化のためのシグナルを提供し得るかどうかを調べた。本発明者らは、マウスの虚血筋肉の筋線維におけるＳＡＶ１ ＫＤが内皮細胞増殖を促進させ、灌流回復を加速させ、マウスのトレッドミル運動持久力を改善させることを見出した。心臓毒誘発急性傷害の後、ＴＡ筋の再生性領域は、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ＫＤマウスでは、対照マウスの場合よりも大きい筋線維断面積および多くの毛細血管を有しており、このことは、ＳＡＶ１ ＫＤ処置後における筋肉のより良好な再生能力を反映していた。本発明者らのこれらのインビボ知見を裏付けて、ＳＡＶ１ ＫＤ－筋管の馴化培地で成長するＳＣは、対照筋管の馴化培地で成長するＳＣよりも高い割合のＥｄＵ取り込みを示し、このことは、細胞増殖に対するパラクリン影響を示していた。

蓄積する臨床データは、虚血肢の効果的な処置では、ＥＣ血管形成を刺激するための血管形成因子が利用可能であることだけでなく、同時での筋形成を促進させるために骨格筋ＳＣを活性化するための筋形成スイッチもまた要求されることを示している。他に類を見ないＳＣニッチは、筋線維と、関連したＳＣおよびＥＣとの間における空間的関係を含む。筋線維は、ＳＣを活性化し、周囲の血管系の成長を刺激するための機能的ニッチを確立するために要求されるシグナルを提供する。したがって、筋線維の本来の特性を調節することは、様々なシグナルを、骨格筋再生を促進させるための支持ニッチを再現するために提供するであろう。実際、本発明者らは、筋線維におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を調節したとき、筋線維とそれらの関連したＳＣとの間におけるパラクリン相互作用を見出した。筋線維から分泌される細胞外因子がＳＣ活性化および促進された筋形成を容易にしている。

脚虚血のための遺伝子治療が血管形成治療学に集中している。このアプローチでは、プラスミドまたはアデノウイルスベクターが、様々な増殖因子をコードする遺伝子を虚血脚に放出して、血流を改善するために使用される。そのような研究には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および低酸素誘導因子１－アルファ（ＨＩＦ－１α）をコードする遺伝子を使用することが含まれている^２、４０。これらの無作為化対照試験のメタ分析では、大切断生存率および無切断生存率における明確な差が遺伝子治療とプラセボ処置との間にはないことが示されている^２。このアプローチの大きな制約には、遺伝子送達システム（キャリア）、トランスフェクション効率、および組織虚血を補償するためにただ１つの増殖因子を標的とすることは非効率であることが含まれる。プラスミドベクターは、外因性遺伝子を細胞に送達することにおいて効率的でない。プラスミドベクターは非複製エピソームであり、治療的な導入遺伝子発現の十分なレベルおよび長期間の持続を達成することができない^４１。ＶＥＧＦおよびＦＧＦなどの増殖因子は血管形成を促進させるにもかかわらず、ただ１つの血管形成因子が新しい血管形成の複雑な生物学的プロセスを虚血組織において制御し得るとは考えにくい^{４２、４３}。血管化に関与する一連の事象を協調させる調節遺伝子／経路を標的とすることが、ただ１つの血管形成増殖因子を標的とすることよりも実用的であるかもしれない。そのうえ、いくつかの問題が、脚虚血を処置するためのより良好な臨床成果を達成するためには、効率的かつ堅固な遺伝子治療モダリティが履行され得る前に対処されなければならない。具体的には、好適なキャリアが、遺伝物質を目的とする領域に送達するために使用されなければならず、また、標的化されることになる細胞または組織のタイプが特定されなければならない。

様々な組換えＡＡＶベクターが分裂中の細胞および非分裂の細胞の両方に感染し、宿主ゲノムに直接に一体化することなく存続する。これらのベクターは免疫応答を引き起こさないので、非病原性かつ安全であると考えられており、臨床状況における効果的、長期的かつ組織特異的な遺伝子送達システムとして浮上している^{４４、４５}。本研究において、本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ経路アダプターであるＳＡＶ１を標的とするために、ＡＡＶ９と、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）治療学とを融合した。本発明者らは、最小サイズの骨格筋特異的発現カセットを有する新規なＡＡＶ９ベクターを使用して、そのパッケージングを順応させ、ｍｉＲ３０に基づくプールされたｓｈＲＮＡをマウス筋線維におけるＳＡＶ１ノックダウンのために誘導した。本発明者らは、マウス虚血性後肢における筋形成、灌流回復および改善された骨格筋力を認めた。このアプローチでは、ｓｉＲＮＡ治療学での低いトランスフェクション効率および組織特異性の制約が克服される。

本発明者らは、ＳＣ活性化、筋形成、ＥＣ血管形成および血管新生を保証する再生性微小環境を創出するために「Ｈｉｐｐｏダウンレギュレーション」状態を筋線維において誘導するＡＡＶ９ベクター送達システムを使用した。この方策が図１に例示される。具体的には、Ｈｉｐｐｏ経路アダプター、すなわち、Ｓａｌｖａｄｏｒを、ｍｉＲ３０に基づく三重の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を筋特異的プロモーターによって制御されて発現するアデノ関連ウイルス９（ＡＡＶ９）ベクターを使用することによってノックダウンした。本発明者らはこの新規なアプローチの実現可能性をマウスの後肢虚血モデルおよび骨格筋再生モデルの両方で検証した。マウス後肢虚血モデルにおいて、ＡＡＶ９ Ｓａｌｖａｄｏｒ ｓｈＲＮＡの虚血筋肉における投与は、ＨｉｐｐｏエフェクターＹＡＰの核局在化を誘導し、灌流回復を加速させ、運動持久力を増大させた。血管系の血管内レクチン標識により、増強された血管形成が確認された。５－エチニル－２’－デオキシウリジンを使用して、複製中の細胞のＤＮＡをインビボで標識したとき、Ｓａｌｖａｄｏｒのノックダウンは虚血筋肉におけるペアードボックス転写因子Ｐａｘ７＋筋サテライト細胞の増殖およびＣＤ３１＋内皮細胞の増殖を同時に増大させることが見出された。

血管形成を改善させることに加えて、急性の筋傷害または筋損傷の後におけるＨｉｐｐｏ経路阻害が筋機能を下肢虚血のマウスモデルにおいて改善させたことが本明細書中では示される。ＡＡＶ９ Ｓａｌｖａｄｏｒ ｓｈＲＮＡが傷害筋肉に送達された２週間後、再生筋線維の分布が、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡを受けるマウスと比較して、より大きい断面積の方にシフトした。老齢マウス（２６月齢）コホートにおいて、ＡＡＶ９ Ｓａｌｖａｄｏｒ ｓｈＲＮＡ処置は、対照処置と比較した場合、より大きい断面積を含有する再生筋線維の数を増大させた。

まとめると、本開示では、ＳＡＶ１ノックダウンを介した筋形成性細胞におけるＨｉｐｐｏ阻害が、細胞増殖、灌流回復および骨格筋再生をマウス後肢虚血および骨格筋傷害のモデルにおいて促進させることが規定される。したがって、本開示は、骨格筋再生における加齢に伴う低下での主な障害、および虚血筋肉の再生における血管処置の現在の制約を克服することができるであろう方法を提供する。

本明細書中で明らかにされる１つの実施形態が、Ｈｉｐｐｏ経路メンバーのＳＡＶ１を特異的に標的とする、他に例を見ない、しかし例示的な３つ一組のｓｈＲＮＡである。これらのｓｈＲＮＡはマウスモデルにおいて、遺伝子ノックアウトに類似する、ＳＡＶ１ ｍＲＮＡレベルにおける選択的低下をもたらす。具体的な実施形態において、これらのｓｈＲＮＡは、ＡＡＶ９（アデノ関連ウイルス血清型９）ベクターを使用して送達することができる。本開示の特定の実施形態では、標的ＳＡＶ１に特異的なヌクレオチドのｓｈＲＮＡ配列が意図される。

ＩＩＩ．Ｓａｌｖａｄｏｒ
本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ経路を、アダプタータンパク質Ｓａｌｖａｄｏｒ（ＳＡＶ１）をダウンレギュレーションすることによって阻害した：これは、この経路が、組織再生を阻害する成長制限シグナルを提供するからである^３１。細胞成長を制御することにおけるＳａｌｖａｄｏｒ－Ｗａｒｔｓ－Ｈｉｐｐｏ（ＳＷＨ）経路の役割がショウジョウバエで広く研究されている^３２。ＳＷＨ経路の活性化は、より小さい成虫原基サイズを低下した細胞増殖と共に生じさせている。ＳＡＶは、ＷａｒｔｓキナーゼおよびＨｉｐｐｏキナーゼの両方と結合して、ＳＷＨ経路活性がアップレギュレーションされる下流側のリン酸化事象を容易にする足場タンパク質として働く^３２。ＳＷＨ経路を活性化するための正の成分として、ＳＡＶはまた、ＳＷＨシグナリングファミリーの進化的に保存されたメンバーである。哺乳動物細胞において、ＳＡＶ１はＭＳＴ１／２（ショウジョウバエにおけるＨｉｐｐｏ）キナーゼと物理的に相互作用して、ＬＡＴＳ１／２（ショウジョウバエにおけるＷａｒｔｓ）をリン酸化により活性化する。活性なＬＡＴＳ１／２は下流側エフェクターのＹＡＰをリン酸化し、これによりその核排除を引き起こす。したがって、Ｈｉｐｐｏ経路活性化は、成長に関連した遺伝子発現を促進させるための転写共活性化因子としてのＹＡＰを阻害する^{３１、３３}。研究では、ＳＡＶ１が、器官サイズのＨｉｐｐｏキナーゼカスケード媒介制御のために要求されることが示される^３４。マウスにおけるＳＡＶ１の肝臓特異的ノックアウトは肝臓サイズおよび増殖指数を有意に増大させた。増強された細胞増殖が、増大したインビボでのＢｒｄＵ核取り込みによって確認された^３４。マウスの条件的ノックアウトモデルにおいて、心臓特異的なＳＡＶ１ノックアウトは、肥大した心臓および低下したＹＡＰリン酸化をもたらした^３１。これらの知見は、Ｈｉｐｐｏ経路活性を調節することにおけるＳＡＶ１の非常に重要な役割を強調している。

この遺伝子は、Ｓａｌｖａｄｏｒホモログ１、Ｓａｌｖ、ＳＡＶ１、ＳＡＶ、ＷＷ４５またはＷＷＰ４として示される場合がある。代表的な核酸がＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＣＲ４５７２９７．１で提供され、代表的なタンパク質配列がＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｑ９Ｈ４Ｂ６で提供される。ヒトＳａｌｖａｄｏｒのｃＤＮＡ配列が配列番号１に示される（図２）。

遺伝子は、２つのＷＷドメイン（２つの保存されたトリプトファン残基を含有するモジュール型タンパク質ドメイン、これにより、タンパク質リガンドとの特異的相互作用が媒介される）と、コイルドコイル領域とを含むタンパク質をコードする。タンパク質は成体組織において遍在的に発現される。タンパク質はまた、Ｃ末端におけるＳＡＲＡＨ（Ｓａｖ／Ｒａｓｓｆ／Ｈｐｏ）ドメイン（当該ドメインにその名称を与える３つのクラスの真核生物腫瘍抑制因子）を含む。Ｓａｖ（Ｓａｌｖａｄｏｒ）ファミリーおよびＨｐｏ（Ｈｉｐｐｏ）ファミリーにおいて、ＳＡＲＡＨドメインは、ＨｐｏからＳａｖ足場タンパク質を介して下流側成分Ｗｔｓ（Ｗａｒｔｓ）に至るシグナル伝達を媒介する；ＷｔｓがＨｐｏによってリン酸化されることにより、細胞周期停止およびアポトーシスが、サイクリンＥ、Ｄｉａｐ１および他の標的がダウンレギュレーションされることによって引き起こされる。ＳＡＲＡＨドメインはまた、二量体化に関与する場合がある。

ＩＶ．ＳＡＶ１を標的とする阻害性核酸
本開示の方法では、ＳＡＶ１を標的とし、その結果、ＳＡＶ１の発現を検出可能に低下させるようにする１つまたは複数の阻害性核酸が利用される。阻害性核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである場合がある。具体的な実施形態において、核酸は阻害性ＲＮＡであり、例えば、ｓｈＲＮＡなどである。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、Ｓａｖ１タンパク質のＮ末端領域をコードする配列、ＳＡＶ１タンパク質の中央部をコードする配列、またはＳＡＶ１タンパク質のＣ末端領域をコードする配列を標的とする。１つの実施形態において、阻害性ＲＮＡはヌクレオチド配列ａａｇｔａｃｇｔｇａａｇａａｇｇａｇａｃｇ（配列番号２）を有し、またはそれによってコードされる。１つの実施形態において、阻害性ＲＮＡはヌクレオチド配列ａａｇａｔｔｔａｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｃｔｇ（配列番号３）を有し、またはそれによってコードされる。１つの実施形態において、阻害性ＲＮＡはヌクレオチド配列ａａｔｔｃｃｔｇａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｇｔ（配列番号４）を有し、またはそれによってコードされる。

１つの実施形態において、阻害性ＲＮＡは、センス領域、ループ領域、およびセンス領域に相補的なアンチセンス領域を含む、「ヘアピン」ＲＮＡ分子またはステム－ループＲＮＡ分子を有するｓｈＲＮＡである。他の実施形態において、阻害性ＲＮＡは、塩基対形成を介して非共有結合的に会合して二重鎖を形成する２つの異なった相補的ＲＮＡ分子（鎖）を含むｓｉＲＮＡである。例えば、米国特許第７，１９５，９１６号を参照のこと。

特定の場合において、阻害性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、ステム－ループ構造をインビボで形成する一本鎖ＲＮＡ分子であり、長さにおいて約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ヌクレオチド（ｎｔ）から、長さにおいて１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９または１４０（ｎｔ）までである場合がある。ステム－ループ構造の二重鎖部分は、長さにおいて３０ヌクレオチド未満、例えば、長さにおいて１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、または２９ヌクレオチドなど（これらの長さの範囲内に含まれる範囲を含む）であることが可能である。二本鎖ステムを塩基対形成によってもたらす相補的ＲＮＡ配列は好ましくは１９ｎｔ長～２９ｎｔ長である。ｓｈＲＮＡはさらに突出部領域を含むことができる。そのような突出部は３’突出部領域または５’突出部領域である場合がある。突出部領域は、例えば、長さにおいて１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチドまたは６ヌクレオチドである場合がある。例えば、４ヌクレオチド～１０ヌクレオチド（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０）を含有するループ構造により、ステムを形成する２つの相補的ＲＮＡ配列がつながれる。ｓｈＲＮＡのインビボでの転写および合成がＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによって導かれ、その後、生じたｓｈＲＮＡがＤｉｃｅｒ（ＲＮアーゼＩＩＩ酵素）によって切断されて、成熟ｓｉＲＮＡを生成する。成熟ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体に入る。したがって、具体的な実施形態において、本開示に従うＳＡＶ１発現の阻害のためのｓｈＲＮＡはセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列の両方を含有する。

ある特定の実施形態において、核酸は、配列番号２（あるいは配列番号３または配列番号４）の配列を含み、さらに配列番号２（あるいは配列番号３または配列番号４、それぞれ）のアンチセンス配列を含み、ただし、この配列とそのアンチセンス配列とが一緒にハイブリダイゼーションして、二重鎖構造を形成するときには、この配列とそのアンチセンス配列とはループ構造によって隔てられる。

１つの実施形態において、核酸構築物は、プロモーターに機能的に連結されるｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、第１のセグメント、第１のセグメントのすぐ３’側に位置する第２のセグメント、および第２のセグメントのすぐ３’側に位置する第３のセグメントを含み、ただし、第１および第３のセグメントはそれぞれが長さにおいて３０塩基対未満であることが可能であり、かつ、それぞれが長さにおいて１０塩基対超であることが可能である。第１のセグメントおよび第３のセグメントは標的配列に関して互いに相補的であり、一方がアンチセンス配列を含み、他方がセンス配列を含む。第２のセグメント（これは第１のセグメントのすぐ３’側に位置する）により、ループ構造がコードされる。

本開示における使用のための阻害性ＲＮＡ分子は、ＳＡＶ１配列に対して、および／または配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のいずれか１つに対して実質的に同一である（例えば、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）場合がある。具体的な実施形態において、阻害性ＲＮＡと標的ＳＡＶ１配列との間におけるミスマッチは５個でしかない。具体的な実施形態において、最小１８ｂｐの相同性が、阻害性ＲＮＡ配列とその標的との間における相補性の領域のために利用される。好適なミスマッチを、知られているアルゴリズムによって予測することができ、かつ／または知られているアッセイによって特定することができる。

いくつかの実施形態において、阻害性核酸配列が、例えば、阻害性ＲＮＡをコードする配列などが、核酸構築物に含まれる。特定の実施形態において、核酸構築物が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含めて、ベクターに含まれる。具体的な実施形態において、ベクターは非組み込み型であり、だが、他の実施形態においては組み込み型である。様々な機構が、ベクターまたはベクターセグメントの宿主細胞ゲノムへの組み込みを導くために、あるいは転写ベクターの安定性を確保するために含まれるならば、阻害性核酸は安定的かつ遺伝可能にすることができる。

ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス由来、アデノウイルス由来、アデノ関連ウイルス由来およびレトロウイルス由来である場合がある。非ウイルスベクターには、プラスミドが含まれる。具体的な実施形態において、阻害性核酸はＡＡＶベクターに含まれる。ＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９（Ｐｉｒａｓ他、２０１３）を含めて、どのような血清型であれ可能である。１つの実施形態において、ＡＡＶ９ベクターが用いられる。

阻害性ＲＮＡの発現のために、プロモーターが、阻害性ＲＮＡをコードする配列に機能的に連結される。本開示の核酸構築物はさらに、様々な発現調節配列、例えば、転写を制御するための随意的なオペレーター配列、および転写の終結を制御する配列などを含む場合がある。

本開示において使用されるプロモーターは、標的遺伝子の発現を構成的に誘導する構成的プロモーター、または標的遺伝子の発現を所与の位置および時点で誘導する誘導性プロモーターであることが可能である。具体的な例には、Ｕ６プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＡ）プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３－１９９、１９９１；およびＭｏｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７：２４－３０、２０００）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０－８１２、１９８５）、Ｒｓｙｎ７プロモーター（米国特許出願第０８／９９１，６０１号）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２、１９８９）、およびＡＬＳプロモーター（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）などが含まれる。様々なプロモーターの例が、米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、同第５，６０８，１４２号などに開示される。

ある特定の事例において、プロモーターは、組織特異的または細胞特異的なプロモーター、例えば、筋線維特異的または骨格筋特異的なプロモーターなどであることが可能である。骨格筋における使用のために好適であるプロモーターには、例えば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、デスミン、アクチン、トロポニン（例えば、トロポニンＴ／Ｉまたはニワトリ心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）など）、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、ミオグロビン、ＮＣＸ１に由来するプロモーター、およびそれらのハイブリッドが含まれる。プロモーターの具体的な例には、ラット心室特異的な心筋ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２ｖ）プロモーター、心筋特異的なアルファミオシン重鎖（ＭＨＣ）遺伝子プロモーター、およびＮＣＸ１の－１３７から＋８５までの心臓細胞特異的な最小プロモーターが含まれる。１つの実施形態において、プロモーターは心筋トロポニンＴプロモーターである。

核酸構築物が、ポリシストロン核酸、すなわち、２つ以上の阻害性ＲＮＡをコードする核酸を含む場合、これらの阻害性ＲＮＡは、ただ１つのプロモーターまたは多数のプロモーターの制御下にあることが可能である。１つの実施形態において、それぞれの阻害性ＲＮＡが別個のプロモーターによって調節される。いくつかの事例において、核酸構築物は、阻害性ＲＮＡの転写を導く少数（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ）のヌクレオチドによって隔てられる短い逆方向反復を含む。

したがって、標的細胞において生じる阻害性ＲＮＡの量を、核酸配列の転写を導くために使用されるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるか、または調節可能であるか、強いか、または弱いか）、および細胞に存在する、阻害性ＲＮＡをコードする核酸配列のコピー数のような要因を制御することによって調節することができる。

本開示における使用のための核酸構築物は１つまたは複数の調節エレメントを含むことができる。具体的な場合において、それぞれの阻害性ＲＮＡ配列が同じ調節配列によって調節されることが可能であり、またはそれぞれの阻害性ＲＮＡ配列が異なる調節配列によって調節されることが可能である。いくつかの実施形態において、阻害性ＲＮＡをコードする本開示における使用のための核酸構築物は転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含む。ＰＲＥの例には、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ、およびヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子のイントロンＡが含まれる。さらなる例および詳細については、Ｓｕｎ他（２００９）およびＭａｒｉａｔｉ他（２０１０）を参照のこと。特定の実施形態において、ＰＲＥはＷＰＲＥである。

ある特定の実施形態において、核酸構築物は、１つまたは複数のさらなる特徴、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３ ＵＴＲ、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、および／またはポリアデニル化シグナル（例えば、合成された最小ポリアデニル化シグナルなど）などを含む。（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ他（２００１）を参照のこと。）

核酸構築物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列、例えば、ｍｉＲＮＡ－３０配列を含むことができる。このことは、三重のｓｈＲＮＡが、標的細胞において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターによって、ｓｈＲＮＡとしてではなくむしろｍｉＲＮＡとしてプロセシングされることを可能にし、これによりｓｈＲＮＡの発現効率を増強させる。（Ｄｏｗ他（２０１２）を参照のこと。）

１つの局面において、本開示の方法では、ＳＡＶ１核酸配列の異なる領域に標的化される異なる阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡなど）をそれぞれがコードする多数の核酸構築物が利用される。ただ１つの核酸構築物が、同じ遺伝子の異なる領域に標的化される多数の阻害性ＲＮＡをコードすることが可能であり、例えば、２つ以上の配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む。別の局面において、ただ１つの核酸が、同じ阻害性ＲＮＡの多数のコピー体をコードすることが可能である。さらなる局面において、ただ１つの核酸構築物が多数の阻害性ＲＮＡの多数のコピー体をコードすること、例えば、配列番号２の多数のコピー体、配列番号３の多数のコピー体、および／または配列番号４の多数のコピー体をどのような組み合わせであれコードすることが可能である。それぞれの核酸構築物が異なるベクターに含まれることが可能である。

核酸構築物はさらに、１つまたは複数のマーカー遺伝子、例えば、選択マーカーなど、ならびに／あるいは１つまたは複数のレポーター遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子は、１つまたは複数の連結された遺伝子の発現を追跡するための方法を提供する。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子は、細胞内で発現すると、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段または他の物理的手段によって検出可能である産物（通常的にはタンパク質）をもたらす。遺伝子発現産物は、目的の遺伝子、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子に由来するかどうかにかかわらず、標識することによってもまた検出される場合がある。本開示の組成物および方法における使用のために想定される標識には、蛍光性色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、あるいは、例えば、放射性標識をペプチド内に取り込むことによって検出可能にすることができる、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用することができるハプテンおよびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第７，４１９，７７９号を参照のこと。

特定の実施形態において、本開示の方法では、（ｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する阻害性核酸を含むｓｈＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する阻害性核酸を含むｓｈＲＮＡ、および（ｉｉｉ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する阻害性核酸を含む核酸構築物であって、前記ｓｈＲＮＡが少なくとも１つのプロモーターに機能的に連結される核酸構築物が利用される。プロモーターは好ましくは筋特異的プロモーターであり、例えば、心筋トロポニンＴプロモーターなどである。核酸構築物はベクターに含まれること、例えば、ウイルスベクターに含まれることが可能である。具体的な実施形態には、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ９ベクターなどが含まれる。

本開示において使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術はこの技術分野では広く知られており、下記の文献において見出すことができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、発行：Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）。

Ｖ．阻害性核酸の合成
阻害性核酸を、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を合成するためのこの技術分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これらには、この技術分野において広く知られているオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技術、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成などが含まれる。代替では、ＲＮＡ分子を、阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ転写およびインビボ転写によって生成させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど）を組み込む多種多様なベクターに組み込まれる場合がある。代替では、使用されたプロモーターに依存するが、阻害性ＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞株に安定的に導入することができる。

阻害性ＲＮＡ分子を、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して化学合成することができる。委託合成サービスを様々な商用販売業者から、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、米国）、およびＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、米国）などから利用可能である。例えば、米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと。

ＤＮＡ分子に対する様々な広く知られている改変を、細胞内の安定性および半減期を増大させる手段として導入することができる。可能な改変には、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの隣接配列を分子の５’末端および／または３’末端に付加すること、あるいはホスホジエステラーゼ連結ではなくむしろホスホロチオアートまたは２’Ｏ－メチルをオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内で使用することが含まれるが、これらに限定されない。本開示のアンチセンス核酸は、この技術分野において知られている手順を使用する化学合成反応または酵素連結反応を使用して構築することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大させるために、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるために設計される様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学合成することができる（例えば、ホスホロチオアート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）。

本開示の方法における使用のための阻害性ＲＮＡ分子は、本明細書中に開示されるＳＡＶ１阻害性ＲＮＡの様々な改変等価体であることが可能である。「改変等価体」は、同じ標的特異性を有する（すなわち、改変されていない特定の阻害性ＲＮＡ分子を補完する同じｍＲＮＡ分子を認識する）特定の阻害性ＲＮＡ分子の改変された形態を意味する。したがって、非改変阻害性ＲＮＡ分子の改変等価体は、修飾リボヌクレオチド、すなわち、改変されていないヌクレオチド塩基、糖および／またはリン酸（もしくはホスホジエステル連結）の化学構造において改変を含有するリボヌクレオチドを有することができる。例えば、米国特許第７，４１０，９４４号を参照のこと。

ＶＩ．使用方法
本開示のいくつかの実施形態は、骨格筋を再生させるための方法および組成物に関する。再生には、増強された血管新生および増大した血流と共に、筋線維の再生、サテライト細胞の増殖および分化（筋形成）、ならびに隣接する内皮細胞における血管形成が含まれ得る。骨格筋は、例えば、疾患、根底にある遺伝的状態、年齢および／または外傷のために再生を必要としている場合がある。具体的な実施形態において、骨格筋は、例えば、損傷、萎縮、アポトーシス、壊死および／またはオートファジーを、例えば、下肢の虚血を伴うなどして有する。

虚血は細胞または組織への血液供給の低下または制限であり、その結果、低酸素をもたらす。下肢への血流のそのような欠如、例えば、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患など）における下肢への血流のそのような欠如は、虚血骨格筋における酸素および栄養の欠乏を生じさせ、これにより機能障害を引き起こす。この状況における筋再生のための処置選択肢が欠如している。本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ経路を、筋幹細胞ニッチのための構造的支持を与える筋線維において選択的に標的とすることにより、虚血四肢における機能的筋回復が、血管形成、血管新生および筋形成が促進されることによって容易になることを明らかにする。具体的には、Ｈｉｐｐｏ経路を筋形成性細胞において阻害することにより、筋線維のセクレトームの組成が変化し、局所環境が、血管新生を増強させると共に、サテライト細胞（ＳＣ）の増殖および分化（筋形成）、ならびに隣接する内皮細胞の血管形成を刺激し、促進させる因子により富化される。

したがって、１つの実施形態において、本開示は、肢虚血、とりわけ下肢虚血を対象において処置するための方法を提供する。肢虚血の処置、例えば、慢性肢虚血または急性肢虚血の処置には、疼痛、蒼白（皮膚が青白いこと）、感覚異常（異常な感覚）、または肢における冷たい感触の緩和；肢における改善された遠位脈拍；肢の低減された麻痺；あるいは肢における改善された血流が含まれ得るが、これらに限定されない。肢虚血およびその症状を評価する方法には、脈拍検査、局所温度の測定、皮膚の色の評価、ドップラー評価、超音波、および血管造影が含まれる。

特定の実施形態において、本開示の方法は筋線維再生を老齢対象において促進させる。「老齢」対象は、年齢が少なくとも５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳または７５歳である個体である。筋線維再生を必要としている老齢対象には、サルコペニア、骨格筋損傷、萎縮、アポトーシス、壊死および／またはオートファジーを有する老齢対象が含まれる。

本開示の方法は、骨格筋細胞または骨格筋組織に、ＳＡＶ１を標的とする阻害性核酸を送達することを含む。本開示の方法によるＳＡＶ１の標的化された阻害はいくつかの生理学的効果を生じさせることが可能である。例えば、骨格筋線維は、ＳＣの増殖および自己再生のための様々なシグナルを活性化することができる。加えて、阻害性核酸を投与される個体では、ＨｉｐｐｏエフェクターＹＡＰの核局在化が既存の骨格筋線維において誘導され、灌流回復が加速され、および／または運動持久力が増大する。ペアードボックス転写因子Ｐａｘ７＋筋サテライト細胞およびＣＤ３１＋内皮細胞の増殖が虚血筋肉において増大され得る。損傷した筋肉では、再生筋線維の分布がより大きい断面積の方にシフトし、より大きい断面積を含有する再生筋線維の数が増大する。

本開示の方法は、ＳＡＶ１を標的とする少なくとも１つの阻害性核酸が投与される前の患部筋肉の状態と比較して、患部筋肉の増大した量をもたらすことができる。本開示の方法は、ＳＡＶ１を標的とする少なくとも１つの阻害性核酸が投与される前の患部筋肉の状態と比較して、患部筋肉における血管の側枝形成をもたらすことができる。

筋形成、骨格筋再生および／または筋量を評価する方法には、例えば、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）、バイオインピーダンス分析、ならびに生検および組織学が含まれる。血管形成、血管新生および／または血流を評価する方法には、例えば、脈拍検査および局所温度の測定、皮膚の色の評価、ドップラー評価、超音波、血管造影、ならびに生検および組織学が含まれる。

阻害性核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの形態で、標的細胞に直接に送達されることが可能である^{５０、５１}。代替では、阻害性ＲＮＡは、ＲＮＡが転写され得るベクターに含まれるＤＮＡ構築物を使用して標的細胞内に送達されることが可能である。具体的な実施形態において、阻害性ＲＮＡは標的骨格筋細胞において、好ましくはヒト骨格筋細胞において発現される。本明細書中で使用される場合、「骨格筋細胞」には、筋細胞およびサテライト細胞が含まれる。

阻害性ＲＮＡを含むベクターは個体に全身的または局所的に送達されることが可能である。全身投与は好ましくは非経口経路を介してであり、例えば、腹腔内、静脈内または皮下である。局所投与は好ましくは、所望の器官または組織部位における、例えば、筋組織（例えば、傷害を受けた筋組織または虚血筋肉組織など）への注射を介してである。

阻害性核酸は医薬組成物で送達されることが可能である。組成物は、阻害性核酸に加えて、医薬的に許容され得る賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤または他の材料を含むことができる。一般に使用されるキャリアの例には、通常の（等張性）生理食塩水（例えば、０．９％生理食塩水など）、およびデキストロース（例えば、５％デキストロースなど）が含まれる。組成物は、例えば、４～８のｐＨに緩衝化することができる。

いくつかの実施形態においては、阻害性ＲＮＡ、またはＳＡＶ１に対する阻害性ＲＮＡをコードする核酸構築物は、インビトロまたはエクスビボで骨格筋細胞または骨格筋組織に導入される。導入のための方法には、塩化カルシウムまたはリン酸カルシウムまたはポリエチレンイミンを用いたトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃、エレクトロポレーション、ＰＥＧ媒介融合、マイクロインジェクション、リポソーム媒介法などが含まれる。必要な場合には、阻害性ＲＮＡを含む骨格筋細胞を、例えば、組織移植片として、骨格筋再生を必要としている対象に導入することができる。移植された組織は、同種移植片、および自家移植片、または操作された組織であることが可能である。

下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本開示の方法の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化を、開示される具体的な実施形態において行うことができ、また、多くの変化が依然として、同じような結果または類似する結果を本開示の精神および範囲から逸脱することなくもたらし得ることを理解しなければならない。

実施例１
低分子ヘアピンＲＮＡはＳＡＶ１発現を心筋細胞において阻害する
本発明者らは、配列番号２、配列番号３および配列番号４のそれぞれによってコードされるｓｈＲＮＡが内因性ＳＡＶ１発現を新生児心筋細胞において抑制し得るかを測定した。マウス新生児初代心筋細胞を単離し、６０％～８０％のコンフルエンスにまで２４ウエルプレートで培養した。細胞を、３μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、配列番号２を含む１μＬのｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ；Ｃ_Ｆ＝１０μＭ）によりトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に回収し、ＳＡＶ１のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果が図３Ａに示される。

別の実験において、ブタＳＫ６細胞を７０％～９０％のコンフルエンスにまで６ウエルプレートで培養した。細胞を、３μＬのリポフェクタミン３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、配列番号３をＵ６プロモーターの制御下で含む１μｇのレンチウイルスｓｈＲＮＡプラスミド（Ｕ６－Ｓａｌｖ－ｓｈｍｉＲＮＡ）によりトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に回収し、ＳＡＶ１のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果が図３Ｂに示される。

追加の実験において、ヒトＡＣ１６細胞を７０％～９０％のコンフルエンスにまで６ウエルプレートで培養した。細胞を、３μＬのリポフェクタミン３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、配列番号４をｃＴｎＴプロモーターの制御下で含む１μｇのＡＡＶ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＡＶ－ｃＴｎＴ－Ｓａｌｖ－ｓｈｍｉＲ）によりトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に回収し、ＳＡＶ１のｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果が図３Ｃに示される。

３つすべての阻害性核酸配列がＳＡＶ１発現をおよそ７０％ノックダウンし、配列番号４が最大の効率を示した。

実施例２
虚血脚におけるＡＡＶ９媒介の筋形成性ＳＡＬＶＡＤＯＲノックダウン
本発明者らは最初に、ＳＡＶ１の発現、およびＨｉｐｐｏシグナル伝達下流側エフェクターＹｅｓ関連タンパク質１のセリン残基でのリン酸化（ｐＹＡＰ、Ｓｅｒ１２７）を片側後肢虚血誘導後１４日目に評価した。非虚血の反対側腓腹筋と比較したとき、虚血筋肉は、ＳＡＶ１、総ＹＡＰおよびｐＹＡＰタンパク質の有意により高いレベルを示した。ＹＡＰに対するｐＹＡＰの比率は変化しなかった（図４、ｐ＜０．０５、ｎ＝４匹のマウス／群）。

次に、本発明者らは、ｍｉＲ３０に基づくｓｈＲＮＡを働かせて、ＳＡＶ１をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの虚血脚の筋線維においてノックダウンさせるために、心筋トロポニンＴプロモーターのもとでの筋形成特異的カセットを含有する筋向性ＡＡＶ９ベクターを使用した^１８。ＳＡＶ１はＨｉｐｐｏキナーゼカスケードを調和させて、リン酸化し、ＹＡＰ活性を阻害するため、ＳＡＶ１のノックダウンはＹＡＰ^{ｓｅｒ１２７}のリン酸化をダウンレギュレーションし、これにより、ＹＡＰの活性化および核移行が誘導される^{１８、２４}。片側後肢虚血を二重結紮後３日目に確認した後、本発明者らは、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ、または対照ｓｈＲＮＡ（１×１０１０ウイルスゲノム／マウス）を虚血性後肢の腓腹筋に注射し（ｎ＝５匹のマウス／群）、筋肉をＡＡＶ９投与後７日で採取した。筋肉溶解物のウエスタンブロット、および半定量的分析により、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置後におけるＳＡＶ１ノックダウンならびに低下した総ＹＡＰおよびｐＹＡＰ発現が確認された（図５Ａ～図５Ｅ）。有意な変化が、対照群と、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ群との間で、総ＹＡＰに対するｐＹＡＰの比率において見出されなかった（図５Ｆ）。腓腹筋が筋線維以外の様々な細胞タイプを含むことを考慮して、本発明者らは、腓腹筋筋線維内のＹＡＰ免疫反応性を検出するために免疫染色を使用した。ＡＡＶ処置後１４日での腓腹筋切片の顕微鏡免疫蛍光分析（ｎ＝４匹のマウス／群）により、ＹＡＰの核蓄積が、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ群の筋線維では、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ群に比べて多いことが明らかにされた（図５Ｇ～図５Ｉ）。これらの結果は、ＳＡＶ１ノックダウンがＹＡＰの核局在化を媒介したことを示している。

実施例３
ＳＡＬＶＡＤＯＲノックダウンは後肢虚血後の灌流および筋力の回復を加速させる
本発明者らは、虚血脚における血流回復に対するＳＡＶ１ノックダウンの影響を調べた。灌流を、虚血脚内へのＡＡＶ９注射の直前、およびその後７日毎に９週間まで評価した（図６Ａ、ｎ＝１８匹のマウス／群）。ＡＡＶ投与前において、レーザードップラー灌流画像の定量化により、虚血脚での血液灌流が、その個々の反対側の非虚血脚で見られる低下を超えて劇的に低下したことが示され、虚血灌流低下における差が処置群と対照群との間にはなかった。これらの結果から、虚血が首尾よく誘導されたことが確認された（Ｗ０、図６Ａ、図６Ｂ）。

ＡＡＶ注射の３週間後、マウスは、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ治療に対して応答し始めた。５週目において、灌流が、ＳＡＶ１ノックダウン群では、対照群に比べて有意に良好であり、この利益は９週目にまで及んだ（図６Ａ、図６Ｂ）。ＡＡＶ９ ｓｈＲＮＡ送達後９週目に、本発明者らは、マウスを安楽死させる１０分前に、血管内皮マーカー（トマトレクチン、１００μｇ／マウス）を尾静脈に静脈内注射した（ｎ＝４匹のマウス／群）。共焦点免疫蛍光画像化により、赤色蛍光のトマトレクチン標識された血管構造（すなわち、毛細血管および細動脈）の数が、ＳＡＶ１ノックダウン群の腓腹筋では、対照群の腓腹筋に比べて多いことが示された（図６Ｃ、図６Ｄ）。

ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ治療に伴う改善された灌流が同時に筋力および機能的能力を増大させるかどうかを評価するために、本発明者らは、血流を測定するために使用される同じマウスコホートにおいてトレッドミル疲労試験を行った。ＡＡＶ９ ｓｈＲＮＡ注射の７週間後、ＳＡＶ１ノックダウン群におけるマウスは、成績が、対照処置されたマウスよりも有意により良好であった（図６Ｅ）。

実施例４
ＳＡＬＶＡＤＯＲノックダウンはサテライト細胞の活性化および内皮細胞の増殖を虚血性後肢において促進させる
ＳＡＶ１ノックダウンが細胞増殖に影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、本発明者らは、複製途中のＤＮＡを標識するために、マウスをヌクレオチド類似体ＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）の腹腔内注射によりパルス標識した。本発明者らは、ＥｄＵ＋核の数が、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ注射の２週間後において有意に増大することを見出した（図７Ａ、図７Ｂ；６．６１±０．５４％対２．９４±０．３３％、ＳＡＶ１ノックダウン対対照；ｐ＜０．０５、ｎ＝４匹のマウス／群）。その後、本発明らは筋線維周辺のＥｄＵ＋核の分布を評価した。ＡＡＶ９対照処置群では、ほとんどのＥｄＵ＋核が骨格筋の間質領域に見出され（図７Ｃ、黄色矢印）、これに対して、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置群では、より多くのＥｄＵ＋核が、典型的なＳＣ解剖学的位置で検出された（図７Ｃ、赤色矢印）。縦方向の骨格筋線維の周辺の溝に沿って整列したＥｄＵ＋核、すなわちＥｄｕ＋核が、筋線維膜と、横断面筋領域の基底膜との間に位置していた。この知見は、骨格筋におけるＳＡＶ１ノックダウン後の筋再生が進行中であることを暗示する。

ＳＣ活性化をさらに、ＥｄＵの同時核取り込みおよび転写因子Ｐａｘ７の発現によって検証した。Ｐａｘ７発現はＳＣに特異的であり、骨格筋再生のために要求される^{２５、２６}。活性化されたＳＣはＰａｘ７およびＥｄＵの核共局在化を示した（図８Ａ；図９、黄色矢印）：このことは、静止状態のＰａｘ７＋Ｅｄｕ－ＳＣ（図８Ａ、白矢印）とは反対である。ＳＡＶ１のノックダウンは、高倍率視野あたりのＥｄＵ＋細胞集団内のＰａｘ７＋ＥｄＵ＋の割合を、対照処置により見られる割合を超えて有意に増大させた（図８Ｂ；２６．６５±３．１０％対１３．２５±０．５５％、ＳＡＶ１ ＫＤ対対照；ｐ＜０．０５、ｎ＝４匹のマウス／群）。本発明者らはＣＤ３１染色を使用して、虚血肢における進行中の血管形成を調べた。ＣＤ３１＋細胞をＥｄＵ標識することにより、内皮増殖が示された（図８Ｃ、図８Ｄ、紫色矢印）。ＳＡＶ１ノックダウン群では、ＥｄＵ＋核が毛細血管新芽に沿って見出された（図８Ｃ、緑色矢印）。側副血管の分析において、本発明者らは内皮におけるＥＤＵ＋ＣＤ３１＋内皮細胞を見出した：このことは、ＳＡＶ１ノックダウンが側副血管の増殖活性を促進させたことを示している（図８Ｃ、オレンジ色矢印）。このことはさらに、本発明者らのインビボでのレクチン－血管標識研究およびレーザードップラー灌流研究における知見を裏付けている（図６Ａ～図６Ｄ）。

実施例５
ＳＡＬＶＡＤＯＲノックダウンは骨格筋傷害後の筋形成を促進させる
本発明者らは、筋線維におけるＳＡＶ１ノックダウンが骨格筋再生を増強するかどうかを評価するために心臓毒誘発筋傷害のマウスモデルを使用した（１２週齢～１５週齢のマウス）。心臓毒注射後３日目に、ＡＡＶを腹横（ＴＡ）筋損傷領域に注射した（図１０Ａ）。ＡＡＶ注射後１４日目に、ＴＡ筋切片のヘマトキシリン・エオシン染色では、心臓毒誘発筋損傷は大部分が、中心核を有する再生しつつある筋線維により置き換えられることが示された（図１０Ｂ）。再生しつつある筋線維の断面領域の形態計測学的分析により、線維サイズの分布における差が対照群とＳＡＶ１ノックダウン群との間で明らかにされた（図１０Ｃ）。対照群は、断面積が１０００ｕｍ^２未満である筋線維の割合がＳＡＶ１ノックダウン群よりも高く、再生しつつある線維の割合が、断面積が５００μｍ^２～７５０μｍ^２の間にあるときには有意により高かった（対照対ＳＡＶ１ ＫＤ；ｐ＜０．０１）。対照的に、ＳＡＶ１ノックダウンは、より大きな筋線維サイズの方へのシフトをもたらした。断面積が１０００ｕｍ^２超であるとき、ＳＡＶ１ノックダウン群における筋線維の数が対照群における筋線維の数を超えていた；この割合が、断面積が１７５０μｍ^２～２７５０μｍ^２の間の範囲にあるときには有意により高かった。

骨格筋再生の期間中、血管化が、筋肉機能のための酸素および栄養分を提供するために非常に重要である。したがって、本発明者らはＴＡ筋断面を血管マーカーＣＤ３１に対する抗体により染色し、ＳＡＶ１ ＫＤ群における筋面積あたりの毛細血管の数が対照群における数よりも多いことを見出した（それぞれ、６９８．３０±５３．４０／ｍｍ^２対４８２．６０±１８．００／ｍｍ^２；ｐ＜０．０５、図１０Ｄ、図１０Ｅ）。

まとめると、これらの所見は、ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置された筋肉の内部では肉再生がより良好であることを示しており、このことはさらに、筋形成および血管形成を増強することにおけるＳＡＶ１ノックダウンの正の影響を裏付けている。

加齢はＳＣの筋形成能を低下させ、その結果、小径の筋線維が筋傷害または筋損傷の後で生じることをもたらす^２９。筋形成性ＳＡＶ１ノックダウンが老齢マウス（２６月齢）において筋傷害後のＳＣ再生能力を促進させるかどうかを調べるために、本発明者らは、上記で記載されるようなＡＡＶ９処置が続く心臓毒誘発マウス筋傷害モデルを使用した。本発明者らは、様々なサイズを有する新たに再生された筋線維の領域を、ＡＡＶ９により１４日間にわたって処置されたＴＡ筋のヘマトキシリン・エオシン染色された横断切片に見出した（図１１Ａ）。断面積が２５０ｕｍ２～５００ｕｍ２の間または７５０ｕｍ２～１０００ｕｍ２の間の範囲にあるときには、対照群は、再生しつつある筋線維の割合がＳＡＶ１ノックダウン群よりも有意に高く、断面積が１７５０ｕｍ^２～２７５０ｕｍ^２の間の範囲にあるときには、ＳＡＶ１ノックダウン群は、再生しつつある筋線維の割合が対照群よりも有意により高かった（図１１Ｂ）。したがって、頻度分布分析により、大きい断面積を有する再生線維の数が、ＳＡＶ１ノックダウン群では、対照群に比べて多いことが例示された。

ＡＡＶ９注射の２週間後、ＥｄＵ取り込みおよびＰａｘ７免疫反応性を、新たに再生した筋線維で満たされる領域の内部で定量化した。Ｐａｘ７^＋ＥｄＵ^－ＳＣ（図１１Ｃ、白矢印）が、ＳＡＶ１ ＫＤ群では、対照群よりも高い割合で見出された（それぞれ、３．７０±０．３６％対２．１５±０．１６％、ｐ＜０．０５；図１１Ｄ）。ＥｄＵ^＋核の割合（４．００±０．２６％対３．４０±０．２７％、ＳＡＶ１ ＫＤ対対照；図１１Ｅ）およびＰａｘ７^＋ＥｄＵ^＋細胞の割合（０．２３±０．０４２％対０．１６±０．０６０％、ＳＡＶ１ ＫＤ対対照、図１１Ｆ；図１１Ｃにおける黄色矢印を参照のこと）は、ＳＡＶ１ ＫＤ群と、対照群との間において類似したままであった。加えて、隣接するＰａｘ７^＋ＥｄＵ^－：Ｐａｘ７^－ＥｄＵ^＋細胞（図１２Ａ、黄色丸）が、ＡＡＶ９対照群と、ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ群との両方で見られた。しかしながら、Ｐａｘ７^＋ＥｄＵ^＋ＳＣクラスター（２個以上の核）が、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ群においてのみ検出された（図１２Ｂ、黄色矢印）。これらの知見により、筋形成性ＳＡＶ１ノックダウンは、ＳＣ活性化および運命決定に影響を及ぼすことによって筋再生を促進させるという可能性が提起される。

血管形成が、血管ネットワークを筋再生期間中に再構築するために非常に重要であることを考えると、本発明者らは、ＥＣを特定するためにＣＤ３１染色を使用し、筋面積あたりのＣＤ３１陽性毛細血管を計数した（図１３）。毛細血管密度が、ＳＡＶ１ ＫＤ群では対照群よりも有意に高かった（それぞれ、６４２．２０±４５．４３／ｍｍ^２対３３８．８０±９．７６／ｍｍ^２、Ｐ＜０．０５）：このことは、ＣＴＸ誘発傷害後において、老齢マウスにおけるＴＡ筋再生能力および血管形成が ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ群では増強されたことを示している。ＳＣによる新しい筋線維の形成が明らかであったにもかかわらず、心臓毒損傷ＴＡ筋のヘマトキシリン・エオシン染色はまた、炎症の組織病理学的特徴、および完全に回復した組織構造の欠如を示した。炎症性浸潤物が、間質間隙（図１４、白矢印）に、また、筋線維および血管の周囲に存在していた（図１４、黄色矢印および青色矢印）。

実施例６
ＳＡＬＶＡＤＯＲノックダウンを伴う筋管からの馴化培地はサテライト細胞増殖を促進させた
筋形成性細胞に加えて、骨格筋は、血管細胞、神経線維および結合組織を含有する。筋線維由来パラクリン因子を、インビボで骨格筋から構成される他の細胞タイプによって分泌されるパラクリン因子からインビボ分離することは、技術的に困難である。そのため、本発明者らは、筋形成性ＳＡＶ１を標的とするために、また、筋管におけるＳａｌｖａｄｏｒノックダウンから回収される馴化培地がインビトロでのＳＣ増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために２つのＲＮＡ干渉法を使用した。

最初に、本発明者らは、リポフェクタミンを用いた短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションをＣ２Ｃ１２筋管において行った。ＳＡＶ１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションをＲＴ－ｑＰＣＲによって確認した。陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ ｓｉＲＮＡ）によるトランスフェクションと比較して、筋管におけるＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ＳＡＶ１ ｍＲＮＡのおよそ７０％のノックダウンをもたらした（１．００５±０．１９８対０．３０８±０．０１１、ＮＣ ｓｉＲＮＡ対ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ、Ｐ＜０．０５；図１５Ａ）。馴化培地を、ＮＣ ｓｉＲＮＡトランスフェクション筋管から（ＮＣ ｓｉＲＮＡ－ＣＭ）、ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクション筋管から回収した（ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭ）。ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭの機能的活性を評価するために、本発明者らは、ＳＣを２４時間、ＮＣ ｓｉＲＮＡ－ＣＭにおいて、またはＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭにおいてどちらかで維持した。ＥｄＵパルス標識法を、細胞周期に入るＳＣを標識するために行った。本発明者らは、ＥｄＵ取り込みの割合が、ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ－ＣＭにおいて成長する細胞では、ＮＣ ｓｉＲＮＡ－ＣＭにおいて成長する細胞に比べて高いことを見出した（図１５Ｂ、図１５Ｃ）。

次に、本発明者らは、Ｃ２Ｃ１２筋管への形質導入を、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡを用いて行った（１×１０^５ウイルスゲノム／細胞）。本発明者らは、ＡＡＶ形質導入効率を追跡するためにＧＦＰ蛍光を毎日分析した（図１５ Ｄ）。細胞を７日目に採取した。ＲＴ－リアルタイムＰＣＲによる定量化により、ＳＡＶ１ ｍＲＮＡの相対的発現が、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡにより形質導入された筋管では、ＡＡＶ９対照により形質導入された筋管よりも有意に低いことが確認された（１．００１±０．０３０対０．７３３６±０．０２３、ＡＡＶ９対照対ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ、ｐ＜０．０５；図１５Ｅ）。上述のアプローチと同様に、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡにより形質導入された筋管から回収される馴化培地（ＡＡＶ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ－ＣＭ）を用いて培養されたとき、ＳＣは、ＡＡＶ対照により形質導入された筋管からの馴化培地（ＡＡＶ ｃｏｎ－ＣＭ）を用いて培養される細胞と比較して、ＥｄＵ標識の割合がより高かった（図１５Ｆ、図１５Ｇ）。

まとめると、これらの結果は、ＳＡＶ１がダウンレギュレーションされた筋管から分泌されるパラクリン因子がＳＣ増殖を正に調節することを示唆している。

実施例７
例示的方法
マウスモデル
片側後肢虚血
すべての動物手順を、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所の指針に準拠している、Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って実施した。

片側後肢虚血を作出するために、本発明者らは、イソフルラン吸入（酸素中２％～４％のイソフルラン）によって麻酔されたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、１２週齢～１５週齢；同数の雌雄マウス；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）において左大腿動脈を手術により結紮した。具体的には、本発明者らは、大腿動脈での２本の隣接する縫合糸を外側大腿回旋動脈の分岐点のすぐ下流側に配置した^１９。その後、マウスを無作為に対照群と処置群とに分けた。手術の３日後、本発明者らは、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ（１×１０^１０ウイルスゲノム／マウス）をマウスの腓腹筋に注射した。本発明者らはマウスをモニターし、下記の節に記載される評価試験を行った。

心臓毒誘発の前脛骨筋傷害
骨格筋傷害モデルを作出するために、本発明者らは、Ｎａｊａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ由来の心臓毒（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左脚における前脛骨筋（ＴＡ）筋肉に注射した（１０μｍｏｌ／マウス、１２週齢～１５週齢；ｎ＝２）。心臓毒注射の３日後、マウスを安楽死させ、ＴＡ筋を取り出し、処理した。心臓毒誘発損傷を、ヘマトキシリン・エオシン染色された筋切片を調べることによって確認した。心臓毒誘発ＴＡ傷害の作出に成功した後、本発明者らは同じ手順を成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１２週齢～１５週齢、ｎ＝３／群、両方の性別）および老齢マウス（２６月齢マウス、ｎ＝４／群、雄、Ｄａｒｒｅｎ Ｗｏｏｄｓｉｄｅ博士からの厚意による譲渡）のコホートに対して行った。その後、本発明者らは無作為にマウスを対照群と処置群とに分けた。心臓毒投与の３日後、本発明者らは、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ（１×１０^１０ウイルスゲノム／マウス）を左脚における損傷ＴＡ筋に注射した。ＡＡＶ注射後１４日目に、マウスを体重測定し、その後、ＴＡ筋を、湿重量を得るために取り出した。その後、ＴＡ筋をさらなる分析のために処理した。

ＡＡＶ９ベクター
ＡＡＶ９ベクターの構築および産生は、内因性ＳＡＶ１をノックダウンさせることにおけるそれらの効率と共に、以前に記載されている^{１８、２０}。簡単に記載すると、ＡＡＶ９ ＧＦＰ（ＡＡＶ９対照）ウイルス、およびＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡウイルスが、ベイラー医科大学のＩｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｎｅｕｒｏｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｒｅによって産生された。本発明者らは、単独でのＧＦＰ配列、またはｍｉＲ３０に基づくＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡが続くＧＦＰ配列のどちらかを心筋トロポニンＴプロモーターの制御下に含有するＡＡＶ９対照ベクターまたはＡＡＶ９ ＳＡＶ ｓｈＲＮＡベクターを作出するための骨格として、ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ｃＴＮＴ、ｐ１９６７－Ｑベクターを使用した。ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡベクター、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ ｓｈＲＮＡベクターのどちらも、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ １１ ２８６７）およびｐＡＡＶ２／９ｎ（ＡＡＶ２ Ｒｅｐ、ＡＡＶ９ Ｃａｐを発現するプラスミド、Ａｄｄｇｅｎｅ １１２８６５）と一緒に２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションして、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、ＡＡＶ９ ＳＡＶ ｓｈＲＮＡをそれぞれ作製した。トランスフェクション後９６時間～１２０時間で、培養培地および２９３Ｔ細胞を採取し、ウイルス精製をイオジキサノール勾配超遠心分離によって行った。

レーザードップラー灌流画像化およびトレッドミル疲労試験
レーザードップラー画像化装置（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＡＢ、ドイツ）を使用して、本発明者らは、虚血作出前、虚血後３日目（ＡＡＶ注射の直前）、およびＡＡＶ注射後７日毎に（毎週）、灌流を測定した（ｎ＝１８匹のマウス／群）。温度誘発の血流不安定を最小限に抑えるために、本発明者らは、測定を行う前に、それぞれのマウスを小動物加熱パッドに３７℃で２分間置いた。灌流を、反対側の操作されなかった脚と比較される虚血脚における灌流比として表した。

ＡＡＶ注射の７週間後、マウスにトレッドミル疲労試験を課した２１。ベルトを６メートル／分で設定し（Ｅｃｏ３／６、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）、トレッドミル速度を２分毎に２メートル増大させ、その後、１０メートル／分で一定に保った。疲弊を、マウスがトレッドミルに３回にわたって再び没頭しようとすることなく、連続して１０秒を超えてショックグリッドで費やした時点として定義した。本発明者らは運動時間および距離を記録した。

血管系のインビボレクチン標識およびサンプル処理
マウスを拘束装置に入れ、その尾を露出させた。レクチン注射の前に、尾を温水（３７℃）に５分間～１０分間入れて、静脈を拡張させた（ｎ＝４匹のマウス／群）。トマトレクチン（トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来の標識されたＤｙＬｉｇｈｔ６４９、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を尾静脈に注射した（０．１ｍｇ／マウス）。レクチン注射の１０分後、マウスを、左心室を介してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）における４％パラホルムアルデヒドにより５分間にわたって灌流した。腓腹筋を脚から切開し、４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で一晩固定した。組織サンプルをＰＢＳにおける１５％スクロースに２時間にわたって移し、続いてＰＢＳにおける３０％スクロースにおいて４℃で一晩インキュベーションした。サンプルをドライアイスの中、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋し、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０）で切断した。筋肉凍結切片（１０μｍ）をアセトンと共に５分間にわたって固定し、洗浄し、核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により対比染色した。蛍光画像を、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ＩＩ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて得た。筋線維あたりのレクチン陽性毛細血管の数をそれぞれのマウス筋肉サンプルについて定量化するために、本発明者らは３つの切片をそれぞれのマウスからサンプル採取した。本発明者らは、少なくとも１５０の無作為に選択された筋線維をＡＡＶ９注射部位の中心での１つの筋肉凍結切片から、注射部位の近位領域からの１つの筋肉凍結切片から、そして注射部位の遠位領域からの１つの筋肉凍結切片から計数した。平均を、それぞれのマウスを統計学的分析のために表すために使用した。

ウエスタンブロット分析
腓腹筋を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓａｌ、スイス）を含有する氷冷の溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、０．５％ ＮＰ４０）において氷上で溶解した。溶解物を超音波処理し（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ３００、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、ベルギー）、１２，０００ｇにおいて４℃で１０分間にわたって遠心分離した。上清を回収し、タンパク質の量を求めた（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイ試薬、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。それぞれのサンプルからの３０μｇ総量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４－２０％勾配ゲル、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって分画し、Ｉｍｍｕｎ－Ｂｌｏｔポリフッ化ビニリデンメンブラン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写し、これを、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ溶液において室温で１時間インキュベーションした。その後、ブロットを、マウス抗ＳＡＶ１抗体（ｓｃ－１０１２０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、マウス抗ＹＡＰ抗体（ｓｃ－１０１１９９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびウサギ抗ホスホＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７、４９１１ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）とそれぞれ４℃で一晩インキュベーションし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗マウスカッパまたはＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（共に二次抗体、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）と室温で４５分間インキュベーションした。

タンパク質シグナルを、増強化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用することによって検出した。それぞれのタンパク質サンプルの等量負荷を検証するために、本発明者らはメンブランをストリッピング処理し、メンブランのリプロービングをＧＡＰＤＨに対するＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗体（ｓｃ－２０３５７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により行った。平均タンパク質発現レベルを、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアにおけるデンシトメトリープログラムを使用することによって測定した。

基礎条件でのＳＡＶ１およびｐＹＡＰのタンパク質発現におけるマウス間の変動性のために（図４Ａ、マウス１～マウス４の非虚血の反対側脚に関してのタンパク質発現変動を参照のこと）、本発明者らは半定量的分析を下記の手順に従って行った。最初に、本発明者らは、負荷変動について調節するための内部コントロールＧＡＰＤＨを使用することによって正規化実験を行った。その後、本発明者らは、虚血に対しての正規化されたＳＡＶ１タンパク質応答、総ＹＡＰタンパク質応答およびｐＹＡＰタンパク質応答を、反対側の脚に対する虚血脚におけるそれらの発現の変化倍数を測定することによって求めた（図４）。

図５におけるウエスタンブロットの半適格性について、上記で記載されるような正規化手順を行った後、本発明者らは、ＡＡＶ９ ｃｏｎ ｓｈＲＮＡ処置、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置のいずれかに対しての正規化されたＳＡＶ１タンパク質応答およびｐＹＡＰタンパク質応答を、反対側の脚に対するＡＡＶ９処置虚血脚におけるそれらの発現を測定することによって求めた。最後に、ＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置された虚血脚における相対的なタンパク質レベルを、ＡＡＶ対照ｓｈＲＮＡ処置虚血脚に対するＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ処置虚血脚における変化倍率として表した。

免疫蛍光および組織学的分析
細胞増殖をインビボで標識するために、本発明者らは５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ、５００μｇ／マウス、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を安楽死の３日前および４時間前の両方でマウスに腹腔内注射した。安楽死後、腓腹筋およびＴＡ筋を採取し、発表された方法を使用することによって処理した^２２。筋肉凍結切片（１０μｍ）をアセトンと共に５分間固定し、ＰＢＳにおける０．２％のｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００により１５分間処理した。ＥｄＵ染色を製造者の説明書に従って行った（画像化のためのＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ細胞増殖キット、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。筋肉スライド片を４℃で一晩、下記の一次抗体と個々にインキュベーションした：ウサギ抗ＧＦＰ（ａｂ２９０、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）；ウサギ抗ラミニン（Ｌ９３９３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ウサギ抗ＹＡＰ１（ＮＢ１１０－５８３５８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）；マウス抗Ｐａｘ７（ＤＳＨＢ）；およびウサギ抗ＣＤ３１（ａｂ２８３６４、Ａｂｃａｍ）、それぞれ。その後、切片を対応する二次抗体とインキュベーションした：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５５５ロバ抗ウサギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５５５ロバ抗マウスＩｇＧ（すべてが、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られる）。核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により対比染色した。染色切片の蛍光画像を、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ＩＩ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて撮影した。画像処理および定量的分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することによって行った。それぞれのマウス組織サンプルについて、本発明者らは、ＡＡＶ９注射部位の中心からの１つの筋肉横断切片、近位領域からの１つの筋肉横断切片、および遠位領域からの１つの筋肉横断切片を含めて、合計で３つの切片を定量化のために選択した。平均を、それぞれのマウスを統計学的分析のために表すために使用した。

以前に記載されたように^２２、ＴＡ筋のスライド片（６μｍ）を室温で風乾し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により染色し、その後、永続性封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により封入した。発明者らはＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（ＢＸ－５１）を使用して、画像を得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、それぞれの再生しつつある筋線維の断面積を測定した。それぞれの群における５００本～６００本の線維の合計範囲を測定した。

Ｃ２Ｃ１２筋管馴化培地の調製
ＳＡＶ１のｓｉＲＮＡノックダウン
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）を含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて６ウエル組織培養プレートにおいて、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。筋管へのＣ２Ｃ１２筋芽細胞分化を誘導するために、本発明者らは３７℃での５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、培地を２％のウマ血清および１％のＰＳが補充されるＤＭＥＭと取り換えた。筋管へのＣ２Ｃ１２筋芽細胞分化の４日目に、ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ＳＡＶ１ ｓｉＲＮＡ（アッセイＩＤ１８２２３２）－リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ複合体、またはｓｉｌｅｎｃｅｒ陰性対照ｓｉＲＮＡ（＃ＡＭ４６１１）－リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ複合体を製造者の手順（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って筋管にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、上清を吸引した。筋管を、０．５％のＦＢＳおよび１％のＰＳが補充される基礎ＤＭＥＭにより１回洗浄し、０．５％のＦＢＳおよび１％のＰＳが補充される基礎ＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃でさらに２４時間にわたって維持した。細胞培養上清（馴化培地ストック溶液）を回収し、２０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離し、小分けし、－８０℃で貯蔵した。

ＳＡＶ１のＡＡＶ９媒介ノックダウン
筋芽細胞分化の２日目に、６ウエルプレートにおける細胞を血清非含有ＤＭＥＭにより１回洗浄し、続いて、ＡＡＶ９対照ｓｈＲＮＡ、またはＡＡＶ９ ＳＡＶ１ ｓｈＲＮＡ（１×１０^５ウイルスゲノム／細胞）のどちらかを含有する血清非含有ＤＭＥＭにおけるインキュベーションを５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で行った。１時間後、１００の感染多重度（ｍｏｉ）の野生型アデノウイルス（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）を、ＡＡＶ９形質導入効率を高めるためにＡＡＶ９感染細胞に加えた。アデノウイルス感染の１時間後、２％のウマ血清および１％のＰＳが補充される２ｍＬのＤＭＥＭをそれぞれのウエルに加え、筋管を６日間インキュベーションした。培養上清を吸引し、筋管を、０．５％のＦＢＳおよび１％のＰＳが補充されるＤＭＥＭにより１回洗浄し、その後、同じ培地でさらに２４時間、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。細胞培養上清（馴化培地ストック溶液）を回収し、２０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。上清を小分けし、－８０°Ｃで貯蔵した。生細胞の画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｘ７１蛍光倒立蛍光＆位相差組織培養顕微鏡を用いて撮影した。

ＲＴ－リアルタイムＰＣＲ
上記で記載される処理の後、筋管を冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水により洗浄し、ＲＮＡ単離（ＲＮａｓｅ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）のために回収した。総ＲＮＡ（２μｇ）を、大容量ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＴ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して逆転写した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）を使用して行った。ＳＡＶ１特異的プライマー／プローブ（アッセイＩＤ Ｍｍ０１２９２１７４＿ｍ１）および１８Ｓ ｒＲＮＡ内因性コントロール（ＶＩＣ／ＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ）をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＲＮＡの相対的発現を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲソフトウェア（ΔΔＣｔ法）を使用して計算した。すべての実験を３つの独立した実験において三連で行った。

サテライト細胞の単離、培養、およびＥｄＵによる標識
マウスを安楽死させた後、腓腹筋およびＴＡ筋を採取し、切り刻み、ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）により消化した。細胞を、発表された方法を使用することによって消化組織断片から解離させた^２３。細胞懸濁液を４０μｍのセルストレーナーに通し、赤血球を、１×溶解緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって溶解した。細胞を洗浄し、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより再懸濁した。細胞懸濁液をマウスＳＣ単離キット（＃１３０－１０４－２６８、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）からの抗体カクテルと４℃で２０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、再懸濁し、３０μｍの予備分離フィルターを介して、磁気分離装置に置かれるＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通した。その後、ＬＳカラムを、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳにより３回洗浄した。すべての素通り画分を一緒にし、１５００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。

細胞ペレットを再懸濁し、計数し、ＳＣを、培養皿（６０×１５ｍｍ）において８０％のコンフルエンスに達するまで成長培地（２０％のＦＢＳ、１％のニワトリ胚抽出物および１％のＰＳを含有するＤＭＥＭ）において培養した。細胞を４ウエルのＮｕｎｃ Ｌａｂ Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に入れて２４時間にわたって継代培養した。細胞培養上清を吸引し、細胞を基礎ＤＭＥＭにより１回洗浄し、新鮮な馴化培地（４０％（ｖ／ｖ）の馴化培地ストック溶液を６０％の成長培地と混合することから作製される）と５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベーションした。ＥｄＵを培養培地に加えた（最終濃度、１０μＭ）。

４時間後、培養上清を吸引し、細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、その後、４％パラホルムアルデヒドにより固定した。細胞のＥｄＵ染色を製造者の説明書に従って行った（画像化のためのＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ細胞増殖キット、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８色素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。蛍光画像を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ＩＩ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）およびＯｌｙｍｐｕｓ Ｉｘ７１蛍光倒立蛍光＆位相差組織培養顕微鏡を用いて撮影した。定量的分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することによって行った。すべての実験を５つの独立した実験において三連で行った。

統計学的分析
データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定、または対応のないｔ検定を、同じ時点での２つの群の間における統計学的有意性を判定するために使用した。２群を超える群のウエスタンブロット分析については（図５Ｃ、図５Ｄ）、本発明者らは、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用した（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７）。Ｐが０．０５未満である場合、統計学的に有意であると見なした。

本開示およびその利点について詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって定義される設計の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換および改変を本明細書で行うことができることが理解されよう。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者であれば本開示から容易に理解できるように、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、現在存在するかまたは後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップが、本開示に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことが意図される。
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Claims (46)

1. 血管形成を骨格筋において増大させる方法であって、少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を骨格筋細胞に送達することを含み、前記阻害性核酸がＳａｌｖａｄｏｒを標的とする、方法。
2. 筋線維を骨格筋において再生させる方法であって、少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を骨格筋細胞に送達することを含み、前記阻害性核酸がＳａｌｖａｄｏｒを標的とする、方法。
3. サテライト細胞の増殖を骨格筋において誘導する方法であって、少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記サテライト細胞に送達することを含み、前記阻害性核酸がＳａｌｖａｄｏｒを標的とする、方法。
4. 肢虚血を哺乳動物対象において処置する方法であって、少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記対象における虚血肢の骨格筋細胞に送達することを含み、前記阻害性核酸がＳａｌｖａｄｏｒを標的とする、方法。
5. 前記阻害性核酸が、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％の同一性を有する、またはそのような同一性を有する配列によってコードされる、いずれかの先行請求項に記載の方法。
6. 前記組成物が、（ｉ）配列番号２に対する少なくとも８０％の同一性を有する、またはそのような同一性を有する配列によってコードされる阻害性核酸、（ｉｉ）配列番号３に対する少なくとも８０％の同一性を有する、またはそのような同一性を有する配列によってコードされる阻害性核酸、および（ｉｉｉ）配列番号４に対する少なくとも８０％の同一性を有する、またはそのような同一性を有する配列によってコードされる阻害性核酸を含む、いずれかの先行請求項に記載の方法。
7. 前記阻害性核酸が、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、またはそのような同一性を有する配列によってコードされる、いずれかの先行請求項に記載の方法。
8. 前記阻害性核酸が、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列を有する、またはそのような配列によってコードされる、いずれかの先行請求項に記載の方法。
9. 前記阻害性核酸がアンチセンスＤＮＡ分子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記阻害性核酸がＲＮＡである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記阻害性核酸が短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ｓｈＲＮＡが長さにおいて少なくとも４３ヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ｓｈＲＮＡが長さにおいて１３８ヌクレオチド未満である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ｓｈＲＮＡが長さにおいて５ヌクレオチド～１９ヌクレオチドの間のループ構造を含む、請求項１１に記載の方法。
15. 前記ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が核酸構築物に含まれ、前記ＲＮＡが前記骨格筋細胞において発現させられる、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が組織特異的プロモーターに機能的に連結される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記プロモーターが心筋トロポニンＴプロモーターである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記核酸構築物が転写後調節エレメントを含む、請求項１５に記載の方法。
19. 前記転写後調節エレメントがウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記阻害性核酸をコードするヌクレオチド配列がベクターに含まれる、いずれかの先行請求項に記載の方法。
21. 前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ベクターが非組み込み型ベクターである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
24. 前記ベクターがアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
26. 前記阻害性核酸をコードするヌクレオチド配列がただ１つの核酸構築物に含まれ、前記ヌクレオチド配列のすべてが前記骨格筋細胞またはサテライト細胞において発現させられる、請求項６に記載の方法。
27. 前記阻害性核酸をコードする前記ヌクレオチド配列がただ１つのプロモーターによって調節される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記組成物が、（ｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する核酸、（ｉｉ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸、および（ｉｉｉ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む核酸構築物を含み、核酸（ｉ）～核酸（ｉｉｉ）がプロモーターに機能的に連結される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記プロモーターが心筋トロポニンＴプロモーターである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記核酸構築物が、３’マイクロＲＮＡ－３０配列および５’マイクロＲＮＡ－３０配列をコードする配列を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
31. 前記核酸構築物がウイルスベクターに含まれる、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ベクターがアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３１に記載の方法。
34. 前記核酸構築物が転写後調節エレメントを含む、請求項３１に記載の方法。
35. 前記転写後調節エレメントがウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記核酸構築物が３’逆方向末端反復および５’逆方向末端反復を含む、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. インビトロ方法またはエクスビボ方法である、いずれかの先行請求項に記載の方法。
38. 前記組成物が哺乳動物対象に投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記骨格筋が虚血である、請求項３８に記載の方法。
40. 前記骨格筋が萎縮している、請求項３８に記載の方法。
41. 前記骨格筋が外傷性傷害を受けている、請求項３８に記載の方法。
42. 前記哺乳動物対象が、肢虚血、末梢血管疾患およびサルコペニアからなる群から選択される状態を有する、請求項３８に記載の方法。
43. 血管形成を骨格筋において増大させる方法における使用のための阻害性核酸であって、前記方法が、Ｓａｌｖａｄｏｒを標的とする少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記骨格筋に送達することを含む、阻害性核酸。
44. 筋線維を骨格筋において再生させる方法における使用のための阻害性核酸であって、前記方法が、Ｓａｌｖａｄｏｒを標的とする少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記骨格筋に送達することを含む、阻害性核酸。
45. サテライト細胞の増殖を骨格筋において誘導する方法における使用のための阻害性核酸であって、前記方法が、Ｓａｌｖａｄｏｒを標的とする少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記サテライト細胞に送達することを含む、阻害性核酸。
46. 肢虚血を哺乳動物対象において処置する方法における使用のための阻害性核酸であって、前記方法が、Ｓａｌｖａｄｏｒを標的とする少なくとも１つの阻害性核酸を含む組成物の効果的な量を前記対象における虚血肢の骨格筋に送達することを含む、阻害性核酸。