JP2023549426A - 免疫応答及び／又は安定性を改善するために共有結合で修飾された抗原 - Google Patents

免疫応答及び／又は安定性を改善するために共有結合で修飾された抗原 Download PDF

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Abstract

本明細書は、改善された免疫原性及び／又は安定性を有する共有結合で修飾ポリペプチド抗原、並びにそれに関連する組成物、細胞、及び方法を記載する。ポリペプチド抗原は、それらの安定性を改善するために、及び／又は対象への投与時に抗原に対する細胞性免疫の改善若しくは細胞性免疫と体液性免疫の改善を引き起こすために、１つ以上のステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化される。ステロイド酸には、エンドソーム膜内のスフィンゴミエリンのセラミドへの酵素的切断を増強することによって、エンドサイトーシス及び／又はエンドソームに捕捉された搬送物のエンドソーム脱出を増強する胆汁酸及び胆汁酸類似体が含まれる。ステロイド酸部分はペプチドに予めコンジュゲート化し、続いてステロイド酸－ペプチド部分をポリペプチド抗原にコンジュゲート化してもよい。ペプチドは、修飾ポリペプチド抗原に追加の機能性を付与する１つ以上のドメインを含むことができる。

Description

本明細書は、それらの免疫原性及び／又は安定性を増強又は改変するために共有結合で修飾された抗原に関する。より具体的には、本記載は、細胞性免疫の改善及び／又は熱安定性の改善のために１つ以上のステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化されたポリペプチド抗原に関する。
ポリペプチド抗原をベースとしたサブユニットワクチンは一般的に最も安全なワクチンと考えられているが、このような抗原は防御的かつ長期持続性の免疫を生じるための十分に強い免疫応答を誘発しない可能性がある。更に、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに対応したｍＲＮＡベースのワクチンの使用は多くの注目を集めたが、それらの比較的低い安定性及び厳格な冷蔵要件は、世界規模でのそれらの展開に対する障害となっている。したがって、ポリペプチド抗原ベースのワクチンの免疫原性、有効性、及び安定性を改善する方法が非常に望ましい。
第１の態様において、本明細書は、ポリペプチド抗原の免疫原性及び／又は安定性を改善する方法を記載し、方法は、修飾するポリペプチド抗原を供給する工程と、ポリペプチド抗原を１つ以上のステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原は、当該修飾がされていないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化され、対象への投与時に、修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原は、修飾ポリペプチド抗原がコンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性を示すように十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化される。
更なる態様において、本明細書は、本明細書に記載される修飾ポリペプチド抗原を含む細胞集団（例えばインビトロ又はエクスビボ）、又は本明細書に記載される修飾ポリペプチド抗原及び／若しくは細胞集団と、薬学的に許容される賦形剤及び／若しくはアジュバントと、を含む免疫原性組成物を記載する。
更なる態様において、本明細書は、対象における目的の非修飾ポリペプチド抗原に対して増強された適応免疫応答を誘発する方法を記載し、方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
更なる態様において、本明細書は、ワクチン接種及び／又は免疫療法による処置に適した疾患又は障害を処置又は予防するための方法を記載し、方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
更なる態様において、本明細書は、感染症に対して対象にワクチン接種する方法を記載し、方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与することを含み、ポリペプチド抗原は、感染症を引き起こす病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の抗原性断片を含む。
更なる態様において、本明細書は、ワクチン接種及び／又は免疫療法による処置に適した疾患又は障害を処置又は予防するための方法を記載し、方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
更なる態様において、本明細書は、対象における癌を処置する方法を記載し、方法は、本明細書に記載される免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
更なる態様において、対象における免疫応答を生じさせる際に使用するための、又は対象における免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物の製造のための、本明細書に記載される修飾ポリペプチド抗原を記載する。
更なる態様において、本明細書は、ポリペプチド抗原を調製する方法を記載し、方法は、非修飾ポリペプチド抗原を十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化して、コンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示す修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含む。
一般的定義
見出し及び他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書や特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。明細書又は特許請求の範囲における見出し又は他の識別子の使用は、工程又は要素がアルファベット順若しくは数字順に、又はそれらが提示される順で実行されることを必ずしも必要とはしない。
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」と併せて使用される場合の単語ａ又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味する場合もあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの任意の形態の「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）、「ｈａｖｉｎｇ（有している）」（及び「ｈａｖｅ」や「ｈａｓ」などの任意の形態の「ｈａｖｉｎｇ」）「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」や「ｉｎｃｌｕｄｅ」などの任意の形態の「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）又は「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有している）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」や「ｃｏｎｔａｉｎ」などの任意の形態の「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法の工程を除外するものではない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になっている」又は「から本質的になる」という表現は、所与の実施形態に必要とされるそれらの要素を指す。この表現によって、本発明のその実施形態の基本的かつ新規な又は機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない付加的な要素の存在が許容される。本明細書に記載される修飾ポリペプチド抗原の文脈において、「から本質的になっている」又は「から本質的になる」という表現は、（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞による抗原提示を改善することによって）非修飾抗原と比較してポリペプチド抗原の免疫原性を改善するために必要とされる要素を指す。より明確にするために、この表現は、ポリペプチド抗原の免疫原性を改善するためのステロイド酸－ペプチド部分の機能又は能力を実質的に変化させない他の追加の非必須成分（例えば、賦形剤、充填剤、安定剤、又は不活性成分）の可能性を排除するものではない。
用語「約」は、値がその値を決定するために使用される装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。一般に、「約」という用語は１０％までの可能な変動を示すことを意味する。したがって、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０％の変動は「約」という用語に含まれる。別段の指示がない限り、範囲の前の「約」という用語の使用は範囲の両端に適用される。
本説明の他の目的、利点、及び特徴は、添付の図面を参照して単なる例として示される、その特定の実施形態の以下の非限定的な説明を読むことによって、より明らかになる。
添付の図は以下のとおりである。
ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養）たＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付けを示す。図１Ａは、ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表した概略図である。図１Ｂは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、又は２５ｘ（ライン２若しくは５０ｘ（ライン３）のモル比でＯＶＡとコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳを示した典型的なクマシーブルー染色を示す。図１Ｃは、ニワトリＯＶＡのアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出している（＞５０％）と予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測される３つのリジン残基には下線を付している。図１Ｄは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を示す。図１Ｅは、非修飾ＯＶＡ（ライン１）、２５ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン２）、及び５０ｘの比のＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ライン３）を示した典型的なウェスタンブロットを示す。図１Ｆは、熱ストレスに応答したｎＯＶＡ又は様々なＣｈＡｃＮＬＳ対ＯＶＡの比でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、ＤＣによる抗原提示の有効性に対する様々なｃＯＶＡ変異体の効果を示す。図１Ｇに、図１Ｈにおいて試験した様々な変異体の代表的な概略図を示す。図１Ｈは、様々な変異体で処理したＤＣと共培養したＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用した応答を数量化して示す。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、ｎＯＶＡ群と比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 抗原交差提示アッセイの結果を示す。図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の評価に使用される抗原の古典的（ＭＨＣ－ＩＩ）及び交差提示（ＭＨＣ－Ｉ）アッセイを概略的に示す。図２Ｂは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ－γを示す。図２Ｃは、ＤＣ及びもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートしたＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。図２Ｄは、図２Ｃの実験におけるＩＦＮ－γの産生を示す。図２Ｅは、様々な時点におけるＤＣによるＯＶＡ－ＤＱ（商標）（灰色のピーク）対ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱ（赤色のピーク）のプロセシングを検討する代表的なフローサイトメトリー実験の結果を示す。図２Ｆは、図２Ｅに示したＯＶＡ－ＤＱ／ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ－ＤＱシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を数量化して示す。この実験において、ｎ＝５／群であり、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図２Ｇは、ｎＯＶＡ（上のピクトグラム）とｃＯＶＡ（下のピクトグラム）で処理したＧａｌ ３－ＧＰＦ発現ＤＣ２．４細胞の代表的な実験を示す。白い矢印でいくつかの損傷したエンドソームを指している。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する予防的な同系のワクチン接種を示す。図３Ａは、ＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図３Ｂ～３Ｃは、もとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ；緑色）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ；赤色）をパルスしたＤＣを使用した予防的なワクチン接種の後にＥＧ．７腫瘍をチャレンジした動物の腫瘍成長体積（図３Ｂ）及び生存（図３Ｃ）の評価を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図３Ｄは、ＥＬＩＳＡによって定量したワクチン接種した動物の抗体力価を示す。図３Ｅは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ－／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ４ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｆは、本研究のワクチン接種した動物由来のｎＯＶＡ／ｃＯＶＡをパルスしたＤＣで免疫したマウス由来のセントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｆｆ）ＣＤ８ Ｔ細胞を数量化して示す。図３Ｇは、本研究のワクチン接種した動物から単離したＴ細胞のインビトロでの再刺激に応答したサイトカイン／ケモカインの産生のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。最も高い倍数変化を示すサイトカイン／ケモカインを枠で囲んだ。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ及び３Ｅのパネルにおいて、ｎ＝１０／群であり、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＯＶＡタンパク質を直接注射した後の免疫の評価を示す。図４Ａは、ワクチンアジュバントを含む又は含まないＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図４Ｂは、もとのままのＯＶＡ（緑色；ｎＯＶＡ）（１μｇ）、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（赤色；ｃＯＶＡ）（１μｇ）、ＡｄｄａＳ０３（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（青色）、及びＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（紫色）を使用して免疫した動物における平均腫瘍測定値を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図４Ｃは、図４Ａに示した実験の生存結果を示す。図４Ｄは、図４Ａに示した実験の抗体力価を数量化して示す。この実験において、ｎ＝１０／群であり、＊Ｐ＜０．０５である。 ＯＶＡタンパク質を直接注射した後の免疫の評価を示す。図４Ａは、ワクチンアジュバントを含む又は含まないＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図４Ｂは、もとのままのＯＶＡ（緑色；ｎＯＶＡ）（１μｇ）、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（赤色；ｃＯＶＡ）（１μｇ）、ＡｄｄａＳ０３（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（青色）、及びＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（紫色）を使用して免疫した動物における平均腫瘍測定値を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図４Ｃは、図４Ａに示した実験の生存結果を示す。図４Ｄは、図４Ａに示した実験の抗体力価を数量化して示す。この実験において、ｎ＝１０／群であり、＊Ｐ＜０．０５である。 ＯＶＡタンパク質を直接注射した後の免疫の評価を示す。図４Ａは、ワクチンアジュバントを含む又は含まないＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図４Ｂは、もとのままのＯＶＡ（緑色；ｎＯＶＡ）（１μｇ）、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（赤色；ｃＯＶＡ）（１μｇ）、ＡｄｄａＳ０３（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（青色）、及びＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（紫色）を使用して免疫した動物における平均腫瘍測定値を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図４Ｃは、図４Ａに示した実験の生存結果を示す。図４Ｄは、図４Ａに示した実験の抗体力価を数量化して示す。この実験において、ｎ＝１０／群であり、＊Ｐ＜０．０５である。 ＯＶＡタンパク質を直接注射した後の免疫の評価を示す。図４Ａは、ワクチンアジュバントを含む又は含まないＯＶＡタンパク質を使用した予防的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図４Ｂは、もとのままのＯＶＡ（緑色；ｎＯＶＡ）（１μｇ）、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（赤色；ｃＯＶＡ）（１μｇ）、ＡｄｄａＳ０３（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（青色）、及びＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含むｃＯＶＡ（１μｇ）（紫色）を使用して免疫した動物における平均腫瘍測定値を示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図４Ｃは、図４Ａに示した実験の生存結果を示す。図４Ｄは、図４Ａに示した実験の抗体力価を数量化して示す。この実験において、ｎ＝１０／群であり、＊Ｐ＜０．０５である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する治療的なワクチン接種を示す。図５Ａは、治療的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図５Ｂ～５Ｃは、抗ＰＤ－１単独（「αＰＤ－１」）、もとのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣを、抗ＰＤ－１あり（「＋αＰＤ－１」）又は抗ＰＤ－１なしで使用した治療的な同系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｂ及び生存図５Ｃを示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」として示す。図５Ｄ～５Ｅは、抗ＰＤ－１（黒色破線）、抗ＰＤ－１と共に様々な細胞数（３Ｋ、紫色；３０Ｋ、青色；１００Ｋ、緑色；３００Ｋ、赤色）での、又は抗ＰＤ－１なし（３００Ｋ、オレンジ色）でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣの治療的な同種異系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｄ及び生存図５Ｅの評価を示す。全てのパネルにおいて、ｎ＝１０／群である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する治療的なワクチン接種を示す。図５Ａは、治療的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図５Ｂ～５Ｃは、抗ＰＤ－１単独（「αＰＤ－１」）、もとのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣを、抗ＰＤ－１あり（「＋αＰＤ－１」）又は抗ＰＤ－１なしで使用した治療的な同系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｂ及び生存図５Ｃを示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」として示す。図５Ｄ～５Ｅは、抗ＰＤ－１（黒色破線）、抗ＰＤ－１と共に様々な細胞数（３Ｋ、紫色；３０Ｋ、青色；１００Ｋ、緑色；３００Ｋ、赤色）での、又は抗ＰＤ－１なし（３００Ｋ、オレンジ色）でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣの治療的な同種異系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｄ及び生存図５Ｅの評価を示す。全てのパネルにおいて、ｎ＝１０／群である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する治療的なワクチン接種を示す。図５Ａは、治療的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図５Ｂ～５Ｃは、抗ＰＤ－１単独（「αＰＤ－１」）、もとのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣを、抗ＰＤ－１あり（「＋αＰＤ－１」）又は抗ＰＤ－１なしで使用した治療的な同系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｂ及び生存図５Ｃを示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」として示す。図５Ｄ～５Ｅは、抗ＰＤ－１（黒色破線）、抗ＰＤ－１と共に様々な細胞数（３Ｋ、紫色；３０Ｋ、青色；１００Ｋ、緑色；３００Ｋ、赤色）での、又は抗ＰＤ－１なし（３００Ｋ、オレンジ色）でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣの治療的な同種異系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｄ及び生存図５Ｅの評価を示す。全てのパネルにおいて、ｎ＝１０／群である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する治療的なワクチン接種を示す。図５Ａは、治療的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図５Ｂ～５Ｃは、抗ＰＤ－１単独（「αＰＤ－１」）、もとのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣを、抗ＰＤ－１あり（「＋αＰＤ－１」）又は抗ＰＤ－１なしで使用した治療的な同系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｂ及び生存図５Ｃを示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」として示す。図５Ｄ～５Ｅは、抗ＰＤ－１（黒色破線）、抗ＰＤ－１と共に様々な細胞数（３Ｋ、紫色；３０Ｋ、青色；１００Ｋ、緑色；３００Ｋ、赤色）での、又は抗ＰＤ－１なし（３００Ｋ、オレンジ色）でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣの治療的な同種異系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｄ及び生存図５Ｅの評価を示す。全てのパネルにおいて、ｎ＝１０／群である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する治療的なワクチン接種を示す。図５Ａは、治療的なワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図５Ｂ～５Ｃは、抗ＰＤ－１単独（「αＰＤ－１」）、もとのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣを、抗ＰＤ－１あり（「＋αＰＤ－１」）又は抗ＰＤ－１なしで使用した治療的な同系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｂ及び生存図５Ｃを示す。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」として示す。図５Ｄ～５Ｅは、抗ＰＤ－１（黒色破線）、抗ＰＤ－１と共に様々な細胞数（３Ｋ、紫色；３０Ｋ、青色；１００Ｋ、緑色；３００Ｋ、赤色）での、又は抗ＰＤ－１なし（３００Ｋ、オレンジ色）でのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（「ｃＯＶＡ」）をパルスしたＤＣの治療的な同種異系のワクチン接種後にＥＧ．７腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍増殖体積図５Ｄ及び生存図５Ｅの評価を示す。全てのパネルにおいて、ｎ＝１０／群である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ細胞リンパ腫に対する腫瘍ライセートベースの治療的なワクチン接種を示す。図６Ａは、治療的な同種異系のワクチン接種に用いたタイムラインの概略図である。図６Ｂ～６Ｃは、抗ＰＤ－１（黒色破線；「ａＰＤ－１」）、ＥＬ４ライセート又はＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＢＡＬＢ／ｃ由来の同種異系ＤＣ（ＥＬ４ライセート、紫色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、赤色）、又は、抗ＰＤ－１なし（ＥＬ４ライセート、緑色；ＥＬ４－ＣｈＡｃＮＬＳライセート、青色）で免疫化した後にＥＬ４腫瘍でチャレンジした動物の腫瘍成長体積図６Ｂ及び生存図６Ｃの評価を示す（ｎ＝１０／群）。ＥＧ．７を注射した非免疫マウスを「対照」（黒色）として示す。図６Ｄは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）研究の実験デザインの概略図を示す。図６Ｅは、図６Ｂ及び６Ｃに示した全ての群に由来する腫瘍における種々の免疫細胞の分析を示す。図６Ｆは、図６Ｂ及び６Ｃに示した腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の評価を示す。図６Ｂ及び６Ｃについては、ｎ＝１０／群である。図６Ｅ～６Ｇについては、ｎ＝５／群であり、７７２＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ２の構築に使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を示す。図７Ａは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基をと共にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｄ６１４Ｇ変異を有する武漢株）のリボン構造の概略図を示す。図７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出（＞５０％）していると予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測されるリジン残基には下線を付している。 ＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ２の構築に使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を示す。図７Ａは、溶媒露出が高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基をと共にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｄ６１４Ｇ変異を有する武漢株）のリボン構造の概略図を示す。図７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列を示す。ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能に溶媒露出（＞５０％）していると予測されるリジン残基を黒色で強調している。溶媒露出が低いと予測されるリジン残基には下線を付している。 異なるＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを使用したＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図８Ａは、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下での全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（コンジュゲート化されていない；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種したマウスの抗体力価を示す。１７週目にマウスに追加のブースト注射を行った。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｂは、図８Ａの研究の異なるアイソタイプの力価を示す。図８Ｃは、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ１－ＲＢＤＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（「ｃＳ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｄは、１８週目にＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ２－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ２－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ２－ＣｏＶ－２（「ｃＳ２－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｅは、生成された抗体に対する中和能を評価するために使用したインビトロの感染性中和アッセイの結果を示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２免疫化マウスから単離された抗体は、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ＨＥＫ細胞のウイルス感染の阻害により効果的であった。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 異なるＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを使用したＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図８Ａは、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下での全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（コンジュゲート化されていない；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種したマウスの抗体力価を示す。１７週目にマウスに追加のブースト注射を行った。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｂは、図８Ａの研究の異なるアイソタイプの力価を示す。図８Ｃは、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ１－ＲＢＤＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（「ｃＳ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｄは、１８週目にＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ２－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ２－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ２－ＣｏＶ－２（「ｃＳ２－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｅは、生成された抗体に対する中和能を評価するために使用したインビトロの感染性中和アッセイの結果を示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２免疫化マウスから単離された抗体は、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ＨＥＫ細胞のウイルス感染の阻害により効果的であった。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 異なるＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを使用したＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図８Ａは、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下での全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（コンジュゲート化されていない；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種したマウスの抗体力価を示す。１７週目にマウスに追加のブースト注射を行った。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｂは、図８Ａの研究の異なるアイソタイプの力価を示す。図８Ｃは、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ１－ＲＢＤＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（「ｃＳ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｄは、１８週目にＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ２－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ２－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ２－ＣｏＶ－２（「ｃＳ２－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｅは、生成された抗体に対する中和能を評価するために使用したインビトロの感染性中和アッセイの結果を示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２免疫化マウスから単離された抗体は、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ＨＥＫ細胞のウイルス感染の阻害により効果的であった。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 異なるＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを使用したＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図８Ａは、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下での全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（コンジュゲート化されていない；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種したマウスの抗体力価を示す。１７週目にマウスに追加のブースト注射を行った。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｂは、図８Ａの研究の異なるアイソタイプの力価を示す。図８Ｃは、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ１－ＲＢＤＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（「ｃＳ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｄは、１８週目にＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ２－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ２－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ２－ＣｏＶ－２（「ｃＳ２－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｅは、生成された抗体に対する中和能を評価するために使用したインビトロの感染性中和アッセイの結果を示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２免疫化マウスから単離された抗体は、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ＨＥＫ細胞のウイルス感染の阻害により効果的であった。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 異なるＣｏＶ－２スパイクタンパク質ドメインを使用したＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図８Ａは、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下での全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（コンジュゲート化されていない；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種したマウスの抗体力価を示す。１７週目にマウスに追加のブースト注射を行った。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｂは、図８Ａの研究の異なるアイソタイプの力価を示す。図８Ｃは、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ１－ＲＢＤＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２（「ｃＳ１－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｄは、１８週目にＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価を示し、ＡｄｄａＳ０３もしくはＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下、又は単独で、「もとのままの」Ｓ２－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳ２－ＣｏＶ－２；黒色のバー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓ２－ＣｏＶ－２（「ｃＳ２－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）を注射した。ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ｅは、生成された抗体に対する中和能を評価するために使用したインビトロの感染性中和アッセイの結果を示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２免疫化マウスから単離された抗体は、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ＨＥＫ細胞のウイルス感染の阻害により効果的であった。このパネルにおいて、ｎ＝５／群であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 インビトロでのＴ細胞の再刺激後のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）によるサイトカインのプロファイリングを示す。図９Ａは、２つの異なるアジュバントと共にｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスに由来するＴ細胞を使用したサイトカインのプロファイリングを示す。図９Ｂは、２つの異なるアジュバントと共にｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスに由来するＴ細胞を使用したサイトカインのプロファイリングを示す。 インビトロでのＴ細胞の再刺激後のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）によるサイトカインのプロファイリングを示す。図９Ａは、２つの異なるアジュバントと共にｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスに由来するＴ細胞を使用したサイトカインのプロファイリングを示す。図９Ｂは、２つの異なるアジュバントと共にｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスに由来するＴ細胞を使用したサイトカインのプロファイリングを示す。 ウサギにおけるワクチンの免疫原性の評価を示す。図１０Ａは、実験デザインの概略図を示す。この実験ではｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２を３つの用量で試験した。図１０Ｂは、２週間毎に採取した血清について評価した抗体力価を示し、ここでｎ＝３／群、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ウサギにおけるワクチンの免疫原性の評価を示す。図１０Ａは、実験デザインの概略図を示す。この実験ではｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２を３つの用量で試験した。図１０Ｂは、２週間毎に採取した血清について評価した抗体力価を示し、ここでｎ＝３／群、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 チャレンジモデルにおけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２の治療有効性の評価を示す。図１１Ａは、ハムスターにおけるワクチンの有効性の研究のための実験デザインの概略図を示す。図１１Ｂは、ＦＤＡに承認された（ＧＭＰグレード）ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ７２０ＶＧアジュバント又はＡｄｄａＳ０３と混合したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンに応答した抗体力価を示す。１０Ｘ及び５０ＸのＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２タンパク質に対するＣｈＡｃＮＬＳの過剰な比を用いてワクチンを試験した。 チャレンジモデルにおけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２の治療有効性の評価を示す。図１１Ａは、ハムスターにおけるワクチンの有効性の研究のための実験デザインの概略図を示す。図１１Ｂは、ＦＤＡに承認された（ＧＭＰグレード）ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ７２０ＶＧアジュバント又はＡｄｄａＳ０３と混合したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンに応答した抗体力価を示す。１０Ｘ及び５０ＸのＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２タンパク質に対するＣｈＡｃＮＬＳの過剰な比を用いてワクチンを試験した。 生成された抗体の様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する交差反応性の評価を示す。図１２Ａは、本研究で使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体、並びにＲＢＤドメインにおける様々な変異の概略図を示す。図１２Ｂは、アジュバント有り又は無しのｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンを接種したマウスから単離された血清を使用した、様々なＲＢＤドメインに対する抗体力価を示す。図１２Ｃは、図１２Ｂに示したデータに基づく全ての試験した変異体との交差反応性のパーセンテージを示す。図１２Ｄは、様々なウイルス変異体に対して得られた中和レベルを示す。この図に示したデータは、ｎ＝５／群、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で行われる。 生成された抗体の様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する交差反応性の評価を示す。図１２Ａは、本研究で使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体、並びにＲＢＤドメインにおける様々な変異の概略図を示す。図１２Ｂは、アジュバント有り又は無しのｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンを接種したマウスから単離された血清を使用した、様々なＲＢＤドメインに対する抗体力価を示す。図１２Ｃは、図１２Ｂに示したデータに基づく全ての試験した変異体との交差反応性のパーセンテージを示す。図１２Ｄは、様々なウイルス変異体に対して得られた中和レベルを示す。この図に示したデータは、ｎ＝５／群、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で行われる。 生成された抗体の様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する交差反応性の評価を示す。図１２Ａは、本研究で使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体、並びにＲＢＤドメインにおける様々な変異の概略図を示す。図１２Ｂは、アジュバント有り又は無しのｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンを接種したマウスから単離された血清を使用した、様々なＲＢＤドメインに対する抗体力価を示す。図１２Ｃは、図１２Ｂに示したデータに基づく全ての試験した変異体との交差反応性のパーセンテージを示す。図１２Ｄは、様々なウイルス変異体に対して得られた中和レベルを示す。この図に示したデータは、ｎ＝５／群、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で行われる。 生成された抗体の様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対する交差反応性の評価を示す。図１２Ａは、本研究で使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体、並びにＲＢＤドメインにおける様々な変異の概略図を示す。図１２Ｂは、アジュバント有り又は無しのｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンを接種したマウスから単離された血清を使用した、様々なＲＢＤドメインに対する抗体力価を示す。図１２Ｃは、図１２Ｂに示したデータに基づく全ての試験した変異体との交差反応性のパーセンテージを示す。図１２Ｄは、様々なウイルス変異体に対して得られた中和レベルを示す。この図に示したデータは、ｎ＝５／群、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で行われる。 Ｅｕｒｏｃｉｎｅ（商標）アジュバントの存在下でインド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体（ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮ）を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図１３Ａは、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン接種に用いたスケジュールの概略図を示す。図１３Ｂ及びＣは、対照の生理食塩水と比較した、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価をそれぞれ示す。図１３Ｃについては、５週目に採取した試料で分析を行った。図１３Ｄ及びＥは、６週目におけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価の分析を示す。この研究において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。二元配置分散分析検定をパネルＢに適用した。パネルＣ、Ｄ及びＥの研究では、一元配置分散分析（ボンフェローニ検定）を行った。 Ｅｕｒｏｃｉｎｅ（商標）アジュバントの存在下でインド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体（ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮ）を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図１３Ａは、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン接種に用いたスケジュールの概略図を示す。図１３Ｂ及びＣは、対照の生理食塩水と比較した、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価をそれぞれ示す。図１３Ｃについては、５週目に採取した試料で分析を行った。図１３Ｄ及びＥは、６週目におけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価の分析を示す。この研究において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。二元配置分散分析検定をパネルＢに適用した。パネルＣ、Ｄ及びＥの研究では、一元配置分散分析（ボンフェローニ検定）を行った。 Ｅｕｒｏｃｉｎｅ（商標）アジュバントの存在下でインド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体（ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮ）を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図１３Ａは、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン接種に用いたスケジュールの概略図を示す。図１３Ｂ及びＣは、対照の生理食塩水と比較した、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価をそれぞれ示す。図１３Ｃについては、５週目に採取した試料で分析を行った。図１３Ｄ及びＥは、６週目におけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価の分析を示す。この研究において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。二元配置分散分析検定をパネルＢに適用した。パネルＣ、Ｄ及びＥの研究では、一元配置分散分析（ボンフェローニ検定）を行った。 Ｅｕｒｏｃｉｎｅ（商標）アジュバントの存在下でインド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体（ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮ）を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図１３Ａは、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン接種に用いたスケジュールの概略図を示す。図１３Ｂ及びＣは、対照の生理食塩水と比較した、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価をそれぞれ示す。図１３Ｃについては、５週目に採取した試料で分析を行った。図１３Ｄ及びＥは、６週目におけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価の分析を示す。この研究において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。二元配置分散分析検定をパネルＢに適用した。パネルＣ、Ｄ及びＥの研究では、一元配置分散分析（ボンフェローニ検定）を行った。 Ｅｕｒｏｃｉｎｅ（商標）アジュバントの存在下でインド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体（ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮ）を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性の評価を示す。図１３Ａは、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン接種に用いたスケジュールの概略図を示す。図１３Ｂ及びＣは、対照の生理食塩水と比較した、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価をそれぞれ示す。図１３Ｃについては、５週目に採取した試料で分析を行った。図１３Ｄ及びＥは、６週目におけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを接種したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＧ及びＩｇＡの力価の分析を示す。この研究において、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。二元配置分散分析検定をパネルＢに適用した。パネルＣ、Ｄ及びＥの研究では、一元配置分散分析（ボンフェローニ検定）を行った。 インド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体を用いたｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンのサイトカイン／ケモカイン分析を示す。組換えＳｐｉｋｅタンパク質を使用してインビトロで脾細胞を３日間再刺激した後のサイトカイン図１４Ａ及びケモカイン図１４Ｂの応答のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。灰色の強調によって示されるサイトカイン又はケモカインは、対照（ｃｔｌ；生理食塩水）動物と比較して有意な変動を有する。示されている単位はｐｇ／ｍＬである。 インド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体を用いたｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンのサイトカイン／ケモカイン分析を示す。組換えＳｐｉｋｅタンパク質を使用してインビトロで脾細胞を３日間再刺激した後のサイトカイン図１４Ａ及びケモカイン図１４Ｂの応答のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析を示す。灰色の強調によって示されるサイトカイン又はケモカインは、対照（ｃｔｌ；生理食塩水）動物と比較して有意な変動を有する。示されている単位はｐｇ／ｍＬである。 インド型（ＩＮ）ＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体を使用したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンをワクチン接種したマウスの血清由来ＩｇＧと様々なＣｏＶ－２スパイクタンパク質変異体との交差反応性を示す。元の武漢株のＳｐｉｋｅタンパク質を、残りの変異体に対する比較として使用した。このアッセイにおいて、ｎ＝５／群であり、元のＳＡＲＳ－ＣＯＶ２株に対して＊Ｐ＜０．０５である。 ＯＶＡ抗原に対して１０Ｘ又は５０Ｘ過剰のモル比の胆汁酸－ＮＬＳ反応物を用いた様々な胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲート調製物の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 ＯＶＡ抗原に対して１０Ｘ又は５０Ｘ過剰のモル比の胆汁酸－ＮＬＳ反応物を用いた様々な胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲート調製物の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 ＯＶＡ抗原に対して１０Ｘ又は５０Ｘ過剰のモル比の胆汁酸－ＮＬＳ反応物を用いた様々な胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲート調製物の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 ＯＶＡ抗原に対して１０Ｘ又は５０Ｘ過剰のモル比の胆汁酸－ＮＬＳ反応物を用いた様々な胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲート調製物の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 様々なタイプの胆汁酸－ＮＬＳ部分（０．１ｍｇ／ｍＬ）とコンジュゲート化されたＯＶＡ抗原の樹状細胞による抗原提示に対する効果を示す。この実験では、ＢＭＤＣをＢ３Ｚレポーター系における抗原提示細胞として使用した。試験の対照には、抗原なし（「ＰＢＳ」）及び抗原単独（すなわち、非コンジュゲート化）（「ＯＶＡ単独」；５ｍｇ／ｍＬ）を含めた。ＯＤ５７０のレベルはＯＶＡ提示のレベルを表し、破線はＯＶＡとコンジュゲート化した元のＣｈＡｃＮＬＳ（「ＣＡ－ＳＶ４０」）で得られたシグナルを表す。ここで、胆汁酸：コール酸（ＣＡ）；グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）；グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）；ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）；ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）；グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）；デオキシコール酸（ＤＣＡ）；グリココール酸（ＧＣＡ）；及びリトコール酸（ＬＣＡ）である。 様々なタイプの胆汁酸－ＮＬＳ部分（０．１ｍｇ／ｍＬ）とコンジュゲート化されたＯＶＡ抗原のＢ細胞による抗原提示に対する効果を示す。この実験では、単離したＢ細胞をＢ３Ｚレポーター系における抗原提示細胞として使用した。試験の対照には、抗原なし（「ＰＢＳ」）及び抗原単独（すなわち、非コンジュゲート化）（「ＯＶＡ単独」；５ｍｇ／ｍＬ）を含めた。ＯＤ５７０のレベルはＯＶＡ提示のレベルを表し、破線はＯＶＡとコンジュゲート化した元のＣｈＡｃＮＬＳ（「ＣＡ－ＳＶ４０」）で得られたシグナルを表す。ここで、胆汁酸：コール酸（ＣＡ）；グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）；グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）；ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）；ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）；グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）；デオキシコール酸（ＤＣＡ）；グリココール酸（ＧＣＡ）；及びリトコール酸（ＬＣＡ）である。
配列表
本出願は２０２１年１１月１日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表を含む。コンピュータ可読形式は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書は、ポリペプチド抗原に対する適応免疫応答を改善若しくは修飾すること、及び／又はポリペプチド抗原の安定性を改善することに関する組成物、細胞、及び方法を記載する。いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド抗原をステロイド酸部分とコンジュゲート化することによって、抗原に対する細胞性免疫の改善、又は細胞性と体液性免疫の改善が誘発されるという本明細書における実証に由来する。いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチド抗原をステロイド酸部分とコンジュゲート化することによって、ポリペプチド抗原の安定性（例えば、熱ストレスに対する）が改善されるという本明細書における実証に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド抗原は、官能化リンカーを介してステロイド酸部分又はステロイド酸＝ペプチド部分と共有結合でコンジュゲート化されてもよい。好ましくは、ポリペプチド抗原がステロイド酸＝ペプチド部分とコンジュゲート化される場合、ペプチドは、所望の機能性（例えば、タンパク質の形質導入及び／又は細胞内の標的化）を修飾ポリペプチド抗原に付与する１つ以上のドメインを含むように設計されてもよく、それにより免疫原性を更に増強することができる。
第１の態様において、本明細書は、ポリペプチド抗原の免疫原性を改善する方法を記載する。方法は一般に、修飾される適切なポリペプチド抗原を選択／供給する工程と、そのポリペプチド抗原をステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原は、対象への投与時にポリペプチド抗原に対する細胞性及び／又は体液性の免疫応答を（例えば、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して）増大させるために十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化される。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原は、細胞内送達時に修飾ポリペプチド抗原のエンドサイトーシス及び／又はエンドソーム脱出を（例えば、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して）増加させるために十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化される。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原は、対象への投与時に、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較してポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答（例えば、改善された細胞性及び／又は体液性の免疫応答）を誘発する。
ポリペプチド抗原は通常、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）によって捕捉されるが、最初はエンドソームに捕捉される。リソソームへのエンドソームの成熟によって、ｐＨが低下し、非特異的な抗原の分解を媒介するタンパク質分解酵素を活性化させる。結果として、生成された抗原性断片のいくつかは、次いで、エンドソーム孔を通過してサイトゾルに到達し、そこで、ＭＨＣクラスＩの提示の前に更なる抗原の分解がプロテアソーム機構によって生じる。このプロセスは自然に生じるが、最終的にエンドソームから放出される生成された抗原性断片は、小さくかつ／又は損傷されている可能性があり、それらはプロテアソーム分解に適切ではなく、それによってそれらのＭＨＣクラスＩの提示が妨げられ、したがってそれに基づく細胞性免疫が妨げられる。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出の増加によって、抗原（又はより大きな抗原性断片）のより天然の立体構造でのサイトゾルへの到達を可能にすることができる。結果として、これらのよりネイティブな抗原のプロテアソーム分解は、抗原提示細胞の表面でＭＨＣクラスＩを介して提示されるより多数の免疫原性の、及び／又は安定なペプチドを生じさせ、それによって強力なＴ細胞の活性化を誘発することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド抗原」とは、任意の長さであるが、一般に少なくとも８、９、１０、１１、又は１２アミノ酸長のアミノ酸の免疫原性ペプチド結合鎖を指す。より明確にするために、本明細書で言及されるポリペプチド抗原には抗原結合抗体又はその断片は含まれない。本明細書中で使用される場合、「タンパク質抗原」とは、少なくとも５０アミノ酸残基の長さを有するポリペプチド抗原を指し、一方、「ペプチド抗原」とは、５０アミノ酸残基未満の長さを有するポリペプチド抗原を指す。より明確にするために、本明細書に記載されるポリペプチド、タンパク質、及びペプチドは、修飾、又は合成若しくは非天然アミノ酸がポリペプチド抗原の抗原性又はそのペプチド（又はそれに含まれるドメイン）の所望の機能を破壊しない限り、任意のタイプの修飾（例えば、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、ＳＵＭＯ化、プレニル化、ユビキチン化などの化学修飾又は翻訳後修飾）を含んでも含まなくてもよく、又は１つ以上の合成若しくは非天然アミノ酸が組み込まれていても組み込まれていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ポリペプチド抗原は、修飾ポリペプチド抗原が、コンジュゲート化の前のポリペプチド抗原の安定性よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示すように、十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化されてもよい（実施例２及び図１Ｇと１Ｈ）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド抗原は、タンパク質抗原であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質抗原は、好ましくは、ステロイド酸又はステロイド酸－ペプチド部分とコンジュゲート化できる複数の溶媒露出した官能基を含んでもよい。反対に、ペプチド抗原は、ステロイド酸のコンジュゲート化のための十分な数の官能基を含まなくてもよい。さらに、Ａｚｕａｒら（２０１９年）によって報告されているように、ステロイド酸－ペプチド抗原コンジュゲートは望ましくないことに、棒状のナノ粒子に自己集合する可能性があり、この場合、異なる修飾ペプチド抗原に由来する疎水性ステロイド酸基が凝集して内部に隔離され、それによって膜と相互作用してエンドソーム脱出を媒介する能力が妨げられる。不十分なエンドソーム脱出は、ＭＨＣクラスＩＩの提示には悪影響を及ぼさない可能性があり、したがって、体液性免疫には有益となる可能性があるが、細胞性免疫に有益となる可能性は低い（Ａｚｕａｒら、２０１９年）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質抗原は、本明細書に記載のステロイド酸又はステロイド－ペプチド部分とのコンジュゲート化に利用可能な１～５０、２～５０、５～５０、又は１０～５０個の官能基（例えば、リジン及び／又はシステイン残基；又は任意の他の基）を含んでもよい（又は含むように操作されてもよい）。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、又は１５０アミノ酸長のタンパク質抗原であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、又は１５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質抗原であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原は、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープ及び／又はＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、ネオアンチゲン、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、ワクチン接種及び／又は免疫療法による処置に適した疾患又は障害に関連する抗原、又はその任意の抗原性断片であってもよく、又はそれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号３）若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ（配列番号４）由来のスパイクタンパク質、又はその抗原性変異体もしくは抗原性断片であってもよく、又はそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＴＡＡ、ＴＳＡ、及び／又はネオアンチゲンは、単一塩基変異体抗原、突然変異フレームシフト抗原、スプライス変異体抗原、遺伝子融合抗原、内因性レトロエレメント抗原、又は別のクラスの抗原、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－体細胞突然変異体由来抗原あるいは翻訳後ＴＳＡであってもよい（Ｓｍｉｔｈら、２０１９）。いくつかの実施形態では、ＴＳＡは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス、又はエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）などのウイルス由来癌の抗原であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、癌－精巣抗原、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ－２、メソテリン（ＭＳＬＮ）、又はＥＧＦＲであってもよく、又はそれらを含んでもよい（Ｐａｔｅｌら、２０１７；Ｔａｇｌｉａｍｏｎｔｅら、２０１４）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原は、細胞ライセート又は腫瘍由来のエクソソームなどの腫瘍由来の他の物質であってもよく、又はそれらを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原は、内在化されたカーゴのエンドサイトーシス及び／又はエンドソーム脱出を増強するステロイド酸部分とコンジュゲート化されてもよい。理論に束縛されるものではないが、ステロイド酸（例えば、胆汁酸及び胆汁酸類似体）は、ウイルスによって利用／活用され、例えば、ウイルスのエンドサイトーシス取り込み及び／又はエンドソーム脱出を増加させてサイトゾルへのアクセスを得ることによって、ウイルスの宿主細胞への感染を促進することが示されている（Ｓｈｉｖａｎｎａら、２０１４；Ｓｈｉｖａｎｎａら、２０１５；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２０２０）。例えば、胆汁酸は、酵素の酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）を始動させて、エンドソームの内側リーフレット上でスフィンゴミエリンをセラミドに切断することが示されている。セラミド量の増加によって、膜が不安定化してエンドソーム脱出が促進される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原とのコンジュゲート化に適したステロイド酸には、エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発し、それによってエンドソーム膜を不安定化させ、細胞内送達時に修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を促進するものが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原とのコンジュゲート化に適したステロイド酸は、セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発するものを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原とのコンジュゲート化に適したステロイド酸は、胆汁酸（例えば、一次胆汁酸又は二次胆汁酸）を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ステロイド酸は、エンドサイトーシスを誘導する；エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発する；セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する；及び／又はコール酸の疎水性よりも大きい疎水性を有する、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、ウルソコール酸（ＵＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、若しくはそれらの任意の類似体であってもよく、又はそれらを含んでもよい。
ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＧＣＡ、及びＣＡなどの疎水性胆汁酸（ＵＤＣＡなどの親水性胆汁酸ではない）は、頂端膜上のＡＳＭに媒介されるセラミド蓄積を介してエンドソーム取り込み及びエンドソーム脱出を増強することによって、宿主腸細胞におけるＧＩＩ．３ヒトノロウイルスの感染と複製を増加させることが示された（Ｍｕｒａｋａｍｉら、２０２０）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原とのコンジュゲート化に適したステロイド酸は、コール酸よりも疎水性である胆汁酸又は胆汁酸類似体を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド抗原とのコンジュゲート化に適したステロイド酸は、コール酸よりも疎水性である胆汁酸又は胆汁酸類似体（例えば、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＧＤＣＡ、又はＧＣＤＣＡ；Ｈａｎａｆｉら、２０１８）を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原当たりのステロイド酸部分の平均数は、例えば、ステロイド酸のタイプ及び／又は選択されたポリペプチド抗原のタイプ（例えば、アミノ酸長、構造、利用可能な官能基の数）に基づいて修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原をモル過剰のステロイド酸又はステロイド酸－ペプチド部分と反応させて、コンジュゲート化されるステロイド酸部分の数を最大にすることができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原を制限された量のステロイド酸又はステロイド酸－ペプチド部分と反応させて、コンジュゲート化されるステロイド酸部分の数を制御又は制限することができる。いくつかの実施形態では、各修飾ポリペプチド抗原分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のステロイド酸部分とコンジュゲート化されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原分子は、ポリペプチド抗原の溶媒露出アミン（例えば、一級アミン）及び／又はスルフヒドリル基においてステロイド酸（又はステロイド酸－ペプチド）部分とコンジュゲート化されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチド抗原分子は、ポリペプチド抗原上に存在するか、又はポリペプチド抗原内に遺伝子操作された任意の他の化学基又は官能基でステロイド酸（又はステロイド酸－ペプチド）部分とコンジュゲート化されてもよい。本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原に含まれるステロイド酸部分の最大数は、コンジュゲート化に利用可能なポリペプチド抗原（又は官能化ポリペプチド抗原）上の利用可能な官能基の数以下であることが理解される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原（及び／又はステロイド酸もしくはステロイド酸－ペプチド部分）は、ポリペプチド抗原をステロイド酸又はステロイド酸－ペプチド部分とコンジュゲート化する反応の前に、例えば、二官能性、三官能性、又は多官能性リンカー基で予め官能化されていてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステロイド酸は、ステロイド酸－ペプチド部分に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ステロイド酸は、例えば、ペプチドのＮ端遊離アミノ基において、又はペプチド内のある種の他の官能基において、ペプチドと予めコンジュゲート化されていてもよい。いくつかの実施形態では、次いで、ポリペプチド抗原を、ペプチドを介して、例えば、ペプチドのＮ又はＣ端残基において、ステロイド酸－ペプチド部分とコンジュゲート化することができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは非免疫原性ペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは水溶性ペプチドであってもよく、ペプチドのステロイド酸とのコンジュゲート化は、ステロイド酸部分単独と比較して、ステロイド酸－ペプチド部分の水溶性を増大させる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、（例えば、血漿及び／又はエンドソーム膜との相互作用を促進する）カチオン性ペプチドであってもよい。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、修飾ポリペプチド抗原にさらなる機能性を付与する１つ以上のドメインを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは一般に、特定の機能性を有するタンパク質の一部を指す。いくつかのドメインはタンパク質の残りの部分から分離されたときにもそれらの機能を保存し、したがって、モジュールの様式で使用することができる。多くのタンパク質ドメインのモジュール特性は、本明細書に記載されるペプチド内でのそれらの配置に関して柔軟性を提供することができる。しかし、いくつかのドメインは、ペプチドの特定の位置（例えば、Ｎ又はＣ端領域、又はその間）で遺伝子操作された場合に、より良好に機能することができる。その内因性タンパク質内でのドメインの位置は、ドメインがペプチド内のどこに遺伝子操作されるべきかの指標であり得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、エンドサイトーシス、エンドソーム形成、又は細胞内送達を細胞非特異的な様式で刺激するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、特定の細胞内区画に対する修飾ポリペプチド抗原の標的化を促進する細胞内標的化シグナルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、修飾ポリペプチド抗原を核に標的化する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。興味深いことに、プロテオソームに媒介されるＭＨＣクラスＩペプチドエピトープのプロセシングがサイトゾルにおいて生じることを考慮すると、サイトゾル区画への標的化が有利であると予想され得るが、本明細書中に示される結果は、驚くべきことに、核局在化シグナルを含む修飾ポリペプチド抗原が抗原の免疫原性の著しい増大を誘発したことを示している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、ＳＶ－４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳ（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７）又は他の古典的ＮＬＳを含んでもよく、又はそれらに由来してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、非古典的ＮＬＳ（例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質中の酸性Ｍ９ドメイン；酵母の転写リプレッサーＭａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ；ＰＹ－ＮＬＳ；リボソームＮＬＳ；又はＵ ｓｎＲＮＰの複合シグナル）を含んでもよく、又はそれらに由来してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、配列番号１又は７～２０のいずれか１つ又はその任意の部分のアミノ酸配列を含むか、又は本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば配列番号：１又は７に含まれる）、ＧＷＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ（例えば配列番号８に含まれる）、ｈｎＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ（例えば配列番号９に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｄ ＮＬＳ（例えば配列番号１０に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｍ ＮＬＳ（例えば配列番号１１に含まれる）、ＰＱＢＰ－１ ＮＬＳ（例えば配列番号１２に含まれる）、ＮＬＳ２－ＲＧ Ｄｏｍａｉｎ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１３に含まれる）、ＮＬＳ１ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１４に含まれる）、ＮＬＳ２ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１５に含まれる）、ＮＬＳ３ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１６に含まれる）、ｃＭｙｃ ＮＬＳ（例えば配列番号１７に含まれる）、ＨｕＲＮＬＳ（例えば配列番号１８に含まれる）、Ｔｕｓ ＮＬＳ（例えば配列番号１９に含まれる）、又はヌクレオプラスミンＮＬＳ（例えば配列番号２０に含まれる）である核局在化シグナルを含むか、又は本質的にそれからなる。いくつかの例では、上で言及した配列番号は、ポリペプチド抗原とのコンジュゲート化を容易にするために使用されたＮ端システイン残基（例えば、Ｎ端システイン残基のチオール基）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で言及されるＮＬＳ配列は、配列番号１及び７～２０の任意の１つに含まれるＮ端システイン残基を除外してもよい。いくつかの実施形態では、所与のポリペプチド抗原とのステロイド酸－ペプチドのコンジュゲート化を容易にするために（例えば、本明細書に記載のペプチドのＮ端部分からＣ端部分に向かって）付加又は挿入される他の官能基もまた想定される（例えば、カルボキシル基、合成アミノ酸など）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核局在化シグナルは、以下の一般コンセンサス配列を含んでもよく、（ｉ）Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）；（ｉｉ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０～１２（Ｋ／Ｒ）３／５、ここで、（Ｋ／Ｒ）３／５は５個の連続するアミノ酸のうちの３個のリジン又はアルギニン残基を表し；（ｉｉｉ）ＫＲＸ１０－１２ＫＲＲＫ；（ｉｖ）ＫＲＸ１０～１２Ｋ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）；又は（ｖ）ＫＲＸ１０－１２Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である（Ｓｕｎら、２０１６）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、サイトゾル送達の増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、修飾ポリペプチド抗原の総細胞送達の増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強を示すことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原への曝露時にＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、（例えば、免疫原性が乏しいエピトープに対する抗体を含む）ポリペプチド抗原に対する抗体種の多様性（又は生物学的多様性）の増大を誘発する。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原を含むか、又はそれで処置された（例えばインビトロ又はエクスビボの）細胞集団を記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、遺伝子操作された抗原提示細胞）、ＭＨＣクラスＩ発現細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原又は本明細書に記載の方法によって生成される修飾ポリペプチド抗原、又は本明細書に記載の細胞集団、又はそれらの任意の組合せと、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバント（例えば、ヒト又は動物への使用に適したワクチンアジュバント）とを含む免疫原性組成物を記載する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルジョンアジュバント（例えば、スクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント）などのエマルジョンアジュバントであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、治療用又は予防用のワクチン（例えば、抗癌ワクチン、抗ウイルスワクチン、又は抗細菌ワクチン）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ポリペプチド抗原は、ステロイド－酸とコンジュゲート化されていない対応する非修飾ポリペプチド抗原を使用する場合の量と比較して、免疫応答を生成するために必要とされる免疫原性組成物（例えば、ワクチン）中に配合される抗原及び／又は抗原提示細胞の量を減らすことができる。
いくつかの態様において、本明細書は、対象における目的のポリペプチド抗原に対する増強された適応免疫応答を誘発する方法を記載し、方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
更なる態様において、本明細書は、ワクチン接種及び／又は免疫療法による処置に適した疾患又は障害を処置又は予防するための方法を記載し、方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、本明細書は、対象における癌を処置する方法を記載し、方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、免疫チェックポイント阻害剤療法又は他の抗癌治療と組み合わせることができる。
いくつかの態様において、本明細書は、対象における免疫応答を生じさせる際に使用するための、本明細書で定義される修飾ポリペプチド抗原を記載する。いくつかの態様において、本明細書は、対象における免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物（例えば、ワクチン又は免疫療法）の製造に使用するための、本明細書で定義される修飾ポリペプチド抗原を記載する。いくつかの態様において、本明細書は、対象における免疫応答を生じさせるための、本明細書で定義される修飾ポリペプチド抗原、本明細書に記載の方法によって生成される修飾ポリペプチド抗原、本明細書に記載の細胞集団、又は本明細書に記載の免疫原性組成物の使用を記載する。いくつかの態様において、本明細書は、対象における免疫応答を生じさせるための医薬（例えば、ワクチン又は免疫療法）の製造のための、本明細書に定義される修飾ポリペプチド抗原、本明細書に記載の方法によって生成される修飾ポリペプチド抗原、本明細書に記載の細胞集団、又は本明細書に記載の免疫原性組成物の使用を記載する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対応する非修飾ポリペプチド抗原から生成されるものと比較して、ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強、ポリペプチド抗原への曝露時のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加、ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
いくつかの態様において、本明細書は、ポリペプチド抗原を調製する方法を記載し、方法は、非修飾ポリペプチド抗原を十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化して、コンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示す修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原にコンジュゲート化されるステロイド酸部分の数は、当該修飾のないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分な数である。実施形態において、修飾ポリペプチド抗原は、本明細書で定義される修飾ポリペプチド抗原である。
項目
様々な態様において、本明細書は以下の項目のうちの１つ以上を記載する。
１．ポリペプチド抗原の免疫原性を改善する方法であって、修飾するポリペプチド抗原を供給する工程と、ポリペプチド抗原を１つ以上のステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含み、修飾ポリペプチド抗原が、当該修飾のないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化されており、修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、対象への投与時に、当該ポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答を誘発する、方法。
２．修飾ポリペプチド抗原が、修飾ポリペプチド抗原がコンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示すように、修飾ポリペプチド抗原が十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化される、項目１に記載の方法。
３．ポリペプチド抗原が、タンパク質抗原であり、及び／又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０ｋＤａの分子量を有する、項目１又は２に記載の方法。
４．ポリペプチド抗原が、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープ及び／又はＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．ポリペプチド抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、ネオアンチゲン、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、ワクチン接種及び／又は免疫療法による治療に適した疾患又は障害に関連する抗原、又はその任意の抗原性断片であるか、又はそれらを含む、項目１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．ポリペプチド抗原が、コロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号３）もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質（配列番号４）又はその抗原性断片、又は単一塩基変異体抗原、突然変異フレームシフト抗原、スプライス変異体抗原、遺伝子融合抗原、内因性レトロエレメント抗原などの癌抗原、又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－体細胞変異体由来抗原あるいは翻訳後ＴＳＡ、ウイルス由来の癌抗原（例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス、又はエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ））、癌－精巣抗原、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ－２、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＧＦＲ、細胞ライセート又は腫瘍由来の他の物質（例えば、腫瘍由来のエクソソーム）などの別のクラスの抗原であるか、又はそれらを含む、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．ステロイド酸がエンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発し、それによってエンドソーム膜を不安定化させ、細胞内送達時のポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を促進する、項目１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．ステロイド酸が、セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する項目１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．ステロイド酸が胆汁酸である、項目１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ステロイド酸が一次胆汁酸又は二次胆汁酸である、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．ステロイド酸が、（ａ）コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、ウルソコール酸（ＵＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、又はグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）である胆汁酸、（ｂ）（ａ）の胆汁酸の類似体であって、エンドサイトーシスを誘導する；エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発する；セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する；及び／又はコール酸の疎水性よりも大きい疎水性を有する類似体、（ｃ）コール酸よりも疎水性である胆汁酸又は胆汁酸類似体（例えば、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＧＤＣＡ、又はＧＣＤＣＡ）、（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せであるか、又はそれらを含む、項目１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．各修飾ポリペプチド抗原分子が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のステロイド酸部分とコンジュゲート化される、項目１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．修飾ポリペプチド抗原分子が、ポリペプチド抗原の溶媒露出アミン（例えば、一級アミン）及び／又はスルフヒドリル基でステロイド酸とコンジュゲート化される、項目１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．修飾ポリペプチド抗原分子が、リンカー（例えば、二官能性、三官能性リンカー、又は多官能性リンカー）を介してステロイド酸とコンジュゲート化される、項目１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステロイド酸がステロイド酸－ペプチドコンジュゲートに含まれて、ポリペプチド抗原がステロイド酸－ペプチドコンジュゲートと（例えば、当該ペプチドを介して、例えば、Ｎ又はＣ端残基において）コンジュゲート化される、項目１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．ペプチドが、（ｉ）エンドサイトーシス及び／又はエンドソーム形成を刺激するタンパク質形質導入ドメインを含む；（ｉｉ）細胞内標的化シグナルを含む；（ｉｉｉ）カチオン性ペプチド（例えば、細胞非透過性カチオン性ペプチド）である；（ｉｖ）非免疫原性ペプチドである；又は（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組合せである、項目１５に記載の方法。
１７．細胞内標的化シグナルが、古典的ＮＬＳ（例えば、ＳＶ－４０ラージＴ抗原（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７）又は他の古典的ＮＬＳ由来のＮＬＳ）又は非古典的ＮＬＳ（例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質中の酸性Ｍ９ドメイン；酵母の転写リプレッサーＭａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ；ＰＹ－ＮＬＳ；リボソームＮＬＳ；及びＵ ｓｎＲＮＰの複合シグナル）などの核局在化シグナルである、項目１６に記載の方法。
１８．核局在化シグナルが、ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば配列番号１又は７に含まれる）、ＧＷＧ－ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば配列番号８に含まれる）、ｈｎＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ（例えば配列番号９に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｄ ＮＬＳ（例えば配列番号１０に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｍ ＮＬＳ（例えば配列番号１１に含まれる）、ＰＱＢＰ－１ ＮＬＳ（例えば配列番号１２に含まれる）、ＮＬＳ２－ＲＧ Ｄｏｍａｉｎ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１３に含まれる）、ＮＬＳ１ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１４に含まれる）、ＮＬＳ２ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１５に含まれる）、ＮＬＳ３ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１６に含まれる）、ｃＭｙｃ ＮＬＳ（例えば配列番号１７に含まれる）、ＨｕＲ ＮＬＳ（例えば配列番号１８に含まれる）、Ｔｕｓ ＮＬＳ（例えば配列番号１９に含まれる）、又はヌクレオプラスミンＮＬＳ（例えば配列番号２０に含まれる）であるか、又は核局在化活性を有するＮＬＳの変異体であり、ここで、ＮＬＳが、配列番号７～２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、項目１６又は１７に記載の方法。
１９．修飾ポリペプチド抗原が、（ｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該修飾ポリペプチド抗原のサイトゾル送達の増加；（ｉｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該修飾ポリペプチド抗原の総細胞送達の増加；（ｉｉｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強；（ｉｖ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原への曝露時のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加；（ｖ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強；（ｖｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、当該ポリペプチド抗原に対する抗体種の多様性の増大；又は（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）の任意の組合せを誘発する、項目１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．項目１～１９のいずれか１つに記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、又は項目１～１９のいずれか１つに定義される修飾ポリペプチド抗原を含む（例えばインビトロ又はエクスビボの）細胞集団。
２１．免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、遺伝子操作された抗原提示細胞）、ＭＨＣクラスＩ発現細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞、又はそれらの任意の組合せを含む、項目２０に記載の細胞集団。
２２．項目１～１９のいずれか一つに記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、項目１～１９のいずれか一つに定義される修飾ポリペプチド抗原、項目２０又は２１に記載の細胞集団、又はそれらの任意の組合せと、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバント（例えば、エマルジョンアジュバント、水中油型エマルジョンアジュバント、又はスクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント）とを含む、免疫原性組成物。
２３．治療用又は予防用ワクチン（例えば、抗癌ワクチン、抗ウイルスワクチン、又は抗細菌ワクチン）である、項目２２に記載の免疫原性組成物。
２４．対象における目的の非修飾ポリペプチド抗原に対する増強された適応免疫応答を誘発する方法であって、項目２２又は２３に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
２５．感染症に対して対象にワクチン接種する方法であって、項目２２又は２３に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、ここで、ポリペプチド抗原が感染症を引き起こす病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の抗原性断片を含む、方法。
２６．対象における癌を治療する方法であって、項目２２又は２３に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
２７．方法が、免疫チェックポイント阻害剤療法と組み合わされる、項目２６に記載の方法。
２８．対象における免疫応答を生じさせる際に使用するための、又は対象における免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物の製造のための、項目１～１９のいずれか一つに定義される修飾ポリペプチド抗原、又は項目１～１９のいずれか１つに記載の方法によって生成される修飾ポリペプチド抗原。
２９．対象における免疫応答を生じさせるための、又は対象における免疫応答を生じさせるための医薬（例えば、ワクチン）の製造のための、項目１～１９のいずれか一つに定義される修飾ポリペプチド抗原、項目１～１９のいずれか一つに記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、項目２０若しくは２１に定義される細胞集団、又は項目２２若しくは２３に定義される免疫原性組成物の、使用。
３０．免疫応答が、対応する非修飾ポリペプチド抗原から生成されるものと比較して、当該ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強、当該ポリペプチド抗原への曝露時のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加、当該ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強、又はそれらの任意の組合せを含む、項目２８に記載の使用、又は項目２９に記載の使用のための修飾ポリペプチド抗原。
３１．ポリペプチド抗原を調製するための方法であって、非修飾ポリペプチド抗原を十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化して、コンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示す修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含む方法。
３２．ポリペプチド抗原にコンジュゲート化されるステロイド酸部分の数が、当該修飾のないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分な数である、項目３１に記載の方法。
３３．修飾ポリペプチド抗原が項目３～１９のいずれか１つに定義されるとおりである、項目３１又は３２に記載の方法。
３４．ポリペプチド抗原の免疫原性を改善する方法であって、修飾するポリペプチド抗原を供給する工程と、ポリペプチド抗原を１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程とを含み、修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、対象への投与時に当該ポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答を誘発するために十分な数の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化され、胆汁酸－ペプチド部分に含まれるペプチドが核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、方法。
３５．修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の修飾ポリペプチド抗原の抗原提示を増加させるために十分な数の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、項目３４に記載の方法。
３６．修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、より高い熱安定性を示すように、修飾ポリペプチド抗原が十分な数の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、項目３４又は３５に記載の方法。
３７．ポリペプチド抗原と１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分との共有結合によるコンジュゲート化が、ポリペプチド抗原をモル過剰の胆汁酸－ペプチド部分と反応させることによって行われる、項目３４～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．ポリペプチド抗原を２倍～１００倍モル過剰の胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、項目３７に記載の方法。
３９．ポリペプチド抗原を２倍～５０倍モル過剰の胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、項目３７に記載の方法。
４０．ポリペプチド抗原を５倍～２５倍モル過剰の胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、項目３７に記載の方法。
４１．修飾ポリペプチド抗原当たりのコンジュゲート化された胆汁酸－ペプチド部分の平均数が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０であるか、又は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０とｎの間であり、ここでｎが、コンジュゲート化に利用可能なポリペプチド抗原上の溶媒露出部位の総数である、項目３４～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．胆汁酸が、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、ウルソコール酸（ＵＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、又はグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）である、項目３４～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．胆汁酸が、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＣＤＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＨＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＵＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ、又はＧＵＤＣＡの類似体であり、類似体が、エンドサイトーシスを誘導する；エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発する；又はセラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を引き起こす、項目３４～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．核局在化シグナルが、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号１又は７）、ＧＷＧ－ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号８）、ｈｎＲＮＰＡ １ Ｍ９ ＮＬＳ（配列番号９）、ｈｎＲＮＰ Ｄ ＮＬＳ（配列番号１０）、ｈｎＲＮＰ Ｍ ＮＬＳ（配列番号１１）、ＰＱＢＰ－１ ＮＬＳ（配列番号１２）、ＮＬＳ２－ＲＧ Ｄｏｍａｉｎ ＲＰＳ１７（配列番号１３）、ＮＬＳ１ ＲＰＳ１７（配列番号：１４）、ＮＬＳ２ ＲＰＳ１７（配列番号１５）、ＮＬＳ３ ＲＰＳ１７（配列番号１６）、ｃＭｙｃ ＮＬＳ（配列番号１７）、ＨｕＲ ＮＬＳ（配列番号１８）、Ｔｕｓ ＮＬＳ（配列番号１９）、又はヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号２０）である、項目３４～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．核局在化シグナルが、核局在化活性を有するＮＬＳの変異体であり、ＮＬＳが、配列番号７～２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、項目３４～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．ポリペプチド抗原が、リンカーを介して１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、項目３４～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．リンカーが二官能性リンカー、三官能性リンカー又は多官能性リンカーである、項目４６に記載の方法。
４８．修飾ポリペプチド抗原分子が、ポリペプチド抗原の溶媒露出官能基を介して１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、項目３４～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ポリペプチド抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、腫瘍由来の細胞ライセート、腫瘍由来のエクソソーム、ネオアンチゲン、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又はワクチン接種及び／もしくは免疫療法による処置に適した疾患もしくは障害に関連する他の抗原であるか、又はそれを含む、項目３４～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．ポリペプチド抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質又はその抗原性断片であるか、又はそれを含む、項目３４～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．項目３４～５０のいずれか１つに記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原又は項目３４～５０のいずれか１つに記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原を含む細胞集団と、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントとを含む、免疫原性組成物。
５２．細胞集団が、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、遺伝子操作された抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩ発現細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞、又はそれらの任意の組合せを含む、項目５１に記載の免疫原性組成物。
５３．対象における目的の非修飾ポリペプチド抗原に対する増強された適応免疫応答を誘発する方法であって、項目５２に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法。
実施例１：一般的な材料及び方法
動物及び倫理
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをジャクソン・ラボラトリー（バーハーバー、メイン州、米国）から購入し、同様の年齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをチャールス・リバー（モントリオール、ケベック州、カナダ）から購入した。同腹仔のマウスを交配させ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ（ＩＲＩＣ）の動物施設において病原体フリーの環境で飼育した。動物実験プロトコルは、モントリオール大学の動物実験委員会によって承認された。
細胞株及び試薬
全ての細胞培養培地及び試薬は、別途示されない限り、Ｗｉｓｅｎｔ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（サンブルーノ、ケベック州、カナダ）から購入した。全てのフローサイトメトリー抗体は、別途示されない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から購入した。ニワトリ卵白由来のアルブミン（オボアルブミン；ＯＶＡ）、ＬＰＳ及びＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートは、シグマ・アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。ＯＶＡ－ＤＱ（商標）は、サーモフィッシャー（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは、ジェンスクリプト（ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）によって合成された。ブラッドフォード試薬は、バイオ・ラッド（ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）から購入した。全てのサイトカインＥＬＩＳＡは、別途示されない限り、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から購入した。組換えＧＭ－ＣＳＧは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ロッキーヒル、ニュージャージー州、米国）から購入した。ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞単離キットは、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（バンクーバー、ブリティッシュ コロンビア州、カナダ）から購入した。インビボの研究で使用したＰＤ－１抗体（クローンＲＭＰ１－１４）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（ウェスト・レバノン、ニューハンプシャー州、米国）から購入した。
骨髄由来ＤＣの生成
マウス骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭのｐ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ（商標）１６４０を使用して、マウス大腿骨から全骨髄を洗い流すことによって生成した。赤血球を溶解させた後、細胞を５０ｎｇ／ｍＬのマウス組換えＧＭ－ＣＳＦを補充した培地中で培養した。培地を２、４、６及び８日目に交換した。９日目に、培地を、組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ及び大腸菌Ｏｌｌｉ由来のＬＰＳ（１ｎｇ／ｍＬ）を含むように置き換えて、ＤＣの成熟を刺激した。成熟したＤＣを、それらの表面のＣＤ３、ＣＤ１９、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＩ－Ａｂの発現についてフローサイトメトリーで評価した。
タンパク質抗原における溶媒露出リジンのモデル化
抗原の３Ｄ構造を、ＲＣＳＢ ＰＤＢ及びＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ Ｅｘｐａｓｙ（商標）フリーアクセスソフトウェアを使用してモデル化した。リジン残基を表す溶媒露出アミノ酸を同定し、それらの溶媒への露出の割合に従って強調した（青色：高；緑：中程度、黄：低）。
癌細胞ライセートの調製
癌細胞ライセートを調製するために、培養したＥＬ４細胞を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して収集し、続いてＰＢＳで２回洗浄して微量のＦＢＳを除去した。次いで、細胞を液体窒素／沸騰水中でそれぞれ５回凍結させ融解させた。大きな粒子を除去するために、Ｇ２６ニードルを用いてライセートを細断し、７０μｍのセルストレーナーに通し、次いで０．４５μｍのフィルターで濾過した。次いで、得られたライセートを、ブラッドフォード試薬を用いて定量し、アリコートに分けて、使用するまで－８０℃で保存した。
ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生成
ＣｈＡｃＮＬＳは、別途示されない限り、以前にＢｅａｕｄｏｉｎら、２０１６に記載されているように合成した。ＯＶＡ、ＯＶＡ－ＤＱ、又は癌細胞ライセートを、他の配合成分を含めて又は含めずに、しかしアミン（ＮＨ３）又はスルフヒドリル（ＳＨ）基は含めずに、滅菌ＰＢＳ中、１～１０ｍｇ／ｍＬで可溶化した。様々なモル過剰比（５ｘ、１０ｘ、２５ｘ、５０ｘ）を使用して、ＳＭ（ＰＥＧ）４架橋リンカーを加えて１時間反応させた。遊離のＳＭ（ＰＥＧ）４架橋リンカーを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）濾過及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムによって除去した。ＣｈＡｃＮＬＳを同じモル過剰比で添加し、１時間インキュベートして、抗原当たりで様々な量で結合したＣｈＡｃＮＬＳ部分を得た。別途示されない限り、実施例で試験したｃＯＶＡコンジュゲートは、５０Ｘモル過剰比を用いて生成した。遊離の未結合ＣｈＡｃＮＬＳをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濾過及びＳｅｐｈａｄｅｘカラムによって除去した。ＣｈＡｃＮＬＳ－修飾抗原を滅菌ＰＢＳ中で濃縮し、ＵＶ吸光度によって決定して最終濃度５～１０ｍｇ／ｍＬを得た。
ＣｈＡｃＮＬＳの担持を評価するために、１０μｇのＯＶＡ又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲートを還元条件下で１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、クマシーブリリアントブルーＲ－２５０（商標）（バイオ・ラッド、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）で染色した。青色色素の先端に対するゲル中の移動距離（Ｒｆ）を測定し、同一条件下で電気泳動したＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅで事前染色した標準品（バイオ・ラッド）についての分子量対１／Ｒｆの対数プロットを参照することによって推定して、ＯＶＡに導入されたＣｈＡｃＮＬＳ部分の数を、低、中、及び高ＣｈＡｃＮＬＳ担持に分類した。さらに、ＯＶＡに対するウェスタンブロット解析を行って、クマシーの結果を確認した。
ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡの生化学的特徴付け
ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ修飾抗原を特徴付けるために、１）示差走査熱量測定又は動的光散乱、２）円二色性（ＣＤ）遠紫外及び近紫外スペクトルスキャン及びフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、３）多角度レーザー光散乱を備えたサイズ排除クロマトグラフィー、４）固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）、５）ペプチドマッピング（ＬＣＭＳ／ＭＳによる参照標準の特徴付け）、ならびに６）ＬＣ－ＭＳによるインタクト及びサブユニット分子量を含む一連の試験を、チャールズリバー（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）で実施した。
胆汁酸－ＮＬＳ部分の生成
胆汁酸－ＮＬＳ部分は、別途示されない限り、以前にＢｅａｕｄｏｉｎら、２０１６に記載されたコール酸－ＮＬＳ（ＣｈＡｃＮＬＳ）の合成と同様に合成した。例えば、ＣＡ－ＳＶ４０ ＮＬＳでは、コール酸を、リンカーアミノ酸に隣接するＳＶ４０ラージＴ抗原（配列番号７）由来の核局在化シグナルを含む１３ｍｅｒペプチド（ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ；配列番号１）のＮ端システイン残基の遊離アミノ基とコンジュゲート化した。
固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）の評価
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ（レザーヘッド、サリー、英国）のＣｈｉｒａｓｃａｎ（商標）Ｑ１００円偏光二色性（ＣＤ）分光計を固有トリプトファン蛍光（ＩＴＦ）分析に使用し、ＶＷＲデジタルヒートブロック（ラドノール、ペンシルバニア州）をドライブロックの温度のインキュベーションに使用した。Ｃｈｉｒｓｃａｎ Ｑ１００オートサンプラーラック冷却システムを全ての４℃のインキュベーションに使用した。データはＭＡＴＬＡＢソフトウェア（ネイティック、マサチューセッツ州）を使用して分析した。簡潔には、試料を－２０℃の貯蔵庫から取り出して、室温に平衡化させた。次いで、試料を４～５ｍｇ／ｍＬの範囲のストック濃度からＰＢＳ中０．８ｍｇ／ｍＬに希釈した。次いで、希釈したサンプルを、熱ストレスに曝露せずに（ネイティブ）、又はドライブロックでのインキュベーションによる１０分間の熱ストレスの後に、ＩＴＦについて分析した。各希釈試料のアリコートを４℃でインキュベートし、第２のアリコートを３７℃でインキュベートし、第３のアリコートを８０℃でインキュベートした。０．８ｍｇ／ｍＬに希釈したＢＳＡを、上記の各熱条件下で試料に含めた。インキュベーションの後、全ての試料を室温に再平衡化した。ＩＴＦ分析は、２８０ｎｍでの励起、２００～６００ｎｍの発光スキャン範囲、１．０ｎｍの帯域幅、１秒のポイント当たりの時間、及び０．５のステップで、８つのトリプリケートで行った。トリプリケートのスペクトルをブランクで減算し、平均し、ＭＡＬＴＡＢソフトウェアを用いてｍｄｅｇ単位から相対蛍光強度に変換した。希釈したＢＳＡ溶液を、サンプルの配列の前と後に対照としてアッセイした。
ＤＣ２．４のトランスフェクション及び顕微鏡による損傷エンドソームの評価
このアッセイのために、１５ｘ１０３個のＤＣ２．４細胞を、２４ウェルプレート中の滅菌カバースライド上に播種した。ｅＧＦＰ－ｈＧａｌ３哺乳動物発現ベクターでＤＣ２．４細胞をトランスフェクションした２日後に、０．１ｍｇ／ｍＬのｎＯＶＡ又はｃＯＶＡを細胞に添加し、次いで３７℃で３時間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄して過剰のタンパク質を除去した後、スライドに載せた。スライドを蛍光顕微鏡（ニコン、エクリプス（商標）Ｔｉ２－Ｕ）で観察し、結果をＩＭＡＧＥ Ｊ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。
フローサイトメトリーによる生成されたＢＭＤＣの表現型の評価
細胞表面マーカーの発現を評価するために、ＢＭＤＣを、染色バッファー（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）を用いて製造業者の説明に従って希釈した様々な抗体と共に、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。染色バッファーを用いて十分に洗浄した後、細胞を４００μＬの染色バッファーに再懸濁した。試料をＣＡＮＴＯＩＩ（商標）上のＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）によって得て、次いでＦｌｏｗＪｏ（商標）ｖ１０を使用して解析した。
抗原プロセシングのモニタリング
ＯＶＡのプロセシングを評価するために、細胞を１０ｐｇ／ｍＬのＯＶＡ－ＤＱ（ＣｈＡｃＮＬＳ修飾有り又は無し）と共に３７℃でインキュベートした。３０分後、細胞を洗浄し、通常の培地を加えた。指定のインキュベーション時間の終わりに、細胞を回収し、２％ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳで洗浄した。フローサイトメトリーで細胞を分析して蛍光をモニターした。
抗原提示アッセイ
抗原交差提示を評価するために、細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｍｉｎｇ、マサチューセッツ、米国）に１ウェル当たり２５×１０３個の細胞で播種し、その後、様々な濃度の抗原を３時間パルスした。パルス時間の終わりに、細胞を洗浄して過剰な抗原を除去し、製造業者のプロトコルに従ってＴ細胞単離キットを使用して、それぞれＯＴ－ＩＩ又はＯＴ－Ｉマウスの脾臓から精製した１０６個／ｍＬのＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞と共培養した。７２時間後、上清を回収して、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってサイトカインの産生を定量するために使用した。
Ｂ３Ｚアッセイでは、５×１０４個のＤＣに最初に選択したタンパク質又はｃＯＶＡ変異体を３時間パルスし、続いて洗浄した後、５×１０４個のＢ３Ｚ細胞を加えた。細胞を１７～１９時間インキュベートした後、それらを溶解し、クロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）溶液と共に３７℃でさらに４～６時間インキュベートした。光学密度信号を、ＳｙｎｅｒｇｙＨ１（商標）マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキー、バーモント州、米国）を使用して検出した。
ＥＬＩＳＡによる抗体力価の定量化
Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、４℃でコーティングバッファー中に希釈した１μｇのＯＶＡで一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄し、次いで３％スキムミルクで室温、１時間ブロッキングした。この工程に続いて、プレートを洗浄した後、希釈血清（２倍希釈液を調製した）を加えた。２時間のインキュベーション時間の後、プレートを洗浄して、１：１０００の希釈でＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体を加えた。２時間後にプレートを洗浄し、次いで室温でＨＲＰと共に１０～２０分間インキュベートした。ＨＲＰをクエンチした後、シグナルを、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキー、バーモント州、米国）を使用して検出した。
免疫化及び腫瘍のチャレンジ
予防的ワクチン接種では、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）に、０日目及び１４日目に、ＯＶＡ／ＯＶＡ－ＣｈＡｃＮＬＳ（１μｇ／投与）、ＯＶＡ製剤（０．１ｍｇ／ｍＬ）又は腫瘍ライセート（０．１ｍｇ／ｍＬ）でパルスした１０４個のＢＭＤＣを皮下（ＳＣ）注射した。２回目のワクチン接種の２週間後に、マウスに５×１０５個のＥＧ．７又はＥＬ４細胞を皮下（ＳＣ）移植し、腫瘍の増殖を経時的に評価した。抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を評価するために、免疫したマウスから単離した脾細胞を最初にインビトロで１μｇ／ｍＬのＯＶＡで刺激し、次いで３日後に上清を回収して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）によってサイトカイン／ケモカインの産生を評価した。
治療的ワクチン接種では、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）に、０日目に５×１０５個のＥＬ４又はＥＧ．７細胞を皮下注射した。５日後（触知可能な腫瘍～４０～６０ｍｍ３の出現）に、マウスに３×１０４個のＯＶＡ－／ＯＶＡ－ＣｈＡｃＮＬＳ又は腫瘍ライセート／ＣｈＡｃＮＬＳ－ライセートをパルスしたＢＭＤＣを皮下注射した（２回注射；１週間間隔）。対照動物には、５×１０５個の腫瘍細胞のみを与えた。その後、処置動物の腫瘍の増殖を追跡した。免疫チェックポイント阻害剤（例えば、αＰＤ－１）と組み合わせた治療的ワクチン接種では、マウスに、抗体又はそのアイソタイプを２００ｐｇ／投与で２日ごとに２週間にわたって合計６回皮下注射した。同様のアプローチを、ＢＡＬＢ／ｃマウスで同種異系投与のワクチン接種について行った。
転換又は浸潤免疫細胞の分析
それらを切除した後、腫瘍塊を最初に秤量し、次いで、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で混合した２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ ＩＶ型を含有する４～５ｍＬのマスターミックス中で外科用ハサミを用いて小片に切断した。次いで、混合物を３７℃の細胞培養インキュベーター中で撹拌した。３０分間インキュベーションした後、１０ｍＬのＤＭＥＭを加えて酵素反応を中和した。消化した溶液を７０μｍの細胞ストレーナーを用いて濾過し、ストレーナーの上部に保持された全ての断片をプランジャーで粉砕し、続いて１～２のＤＭＥＭを加えてストレーナーを洗浄した。次いで、収集した細胞を１２００ｒｐｍ（４℃）で５分間遠心分離し、赤血球溶解バッファーで１分間処理し、次いで、５％ＦＢＳを補充した３～４ｍＬのＤＭＥＭ中に再懸濁した。細胞を洗浄した後、５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中にペレットを再懸濁して、フローサイトメトリー分析のための細胞染色を始めた。
Ｂ３Ｚレポーター系を用いた抗原提示アッセイ
様々な胆汁酸－ＮＬＳ結合体を、Ｂ３Ｚレポーター系を用いてスクリーニングした。Ｂ３Ｚ細胞株は、Ｈ２－Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体に特異的なＴ細胞ハイブリドーマである。そのＴＣＲを介して活性化されると、ＬａｃＺレポーター遺伝子（ＮＦ ＡＴプロモーターの制御下）が発現される。簡潔には、１．５×１０５個のＢＭＤＣ又は単離されたＢ細胞を、オボアルブミン（ＯＶＡ）－胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートで処理した５×１０４個のＢ３Ｚ細胞と、３７℃、５％ＣＯ２で一晩共培養した。翌日、全ての細胞をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で２回洗浄し、細胞ペレットを、０．１５ｍＭのクロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＣＰＧＲ）基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラホヤ、カリフォルニア）、０．１２５％ＮＰ４０（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ラホヤ、カリフォルニア）、９ｍＭのＭｇＣｌ２（アルドリッチ、米国）及び１００ｍＭの２－メルカプトエタノールをＰＢＳ中に含有する１００μＬの溶解バッファーを加えて溶解させた。３７℃で５時間又は２４時間インキュベートした後、６３６ｎｍを参照波長として５７０ｎｍで吸光度を測定した。これらの実験では、胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲート（１０Ｘモル比の胆汁酸－ＮＬＳ部分対ＯＶＡで調製した）をＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に０．１ｍｇ／ｍＬで再懸濁し、ＯＶＡ単独は５ｍｇ／ｍＬで再懸濁した。
統計解析
ｐ－値は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて計算した。結果は、Ｓ．Ｄ．エラーバーと共に平均として表され、統計的有意性は、アスタリスクで表される：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
実施例２：ＣｈＡｃＮＬＳ－抗原構築物の生化学的特徴付け
ステロイド酸－ペプチドのコンジュゲート、ＣｈＡｃＮＬＳを、実施例１に記載のように合成した。簡潔には、コール酸を１３ｍｅｒペプチドのＮ端システイン残基の遊離アミノ基とコンジュゲート化した。ペプチド

は、リンカーアミノ酸に隣接するＳＶ４０ラージＴ抗原由来の核局在化シグナル（下線）を含んでいた。次いで、複数のＣｈＡｃＮＬＳ部分を、プロトタイプのポリペプチド抗原ＯＶＡ（配列番号２；図ＩＣ）の溶媒露出リジン残基のイプシロン－アミノ基とコンジュゲート化した。ＣｈＡｃＮＬＳ部分への所与の抗原の共有結合を表す概略図を図１Ａに示す。次いで、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡを実施例１に記載したように生化学的に特徴付け、結合をクマシーブルー染色図１Ｂ及びウェスタンブロット図１Ｅによって確認した。生化学的特徴付けにより、２５ｘの比でコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（図１Ｂ、ライン２）は、ＯＶＡ当たり平均で約４個のコンジュゲート化されたＣｈＡｃＮＬＳ部分を有し、約８．６ｋＤａのＭＷの増加に対応することが明らかになった。５０ｘの比でコンジュゲート化したＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（図１Ｂ、ライン３）は、ＯＶＡ当たり平均で約８個のコンジュゲート化されたＣｈＡｃＮＬＳ部分を有し、約１９．２ｋＤａのＭＷに対応した。溶媒露出の高い（青色）、中程度の（緑色）又は低い（黄色）リジン残基であると予測されるリジン残基と共にＯＶＡタンパク質のリボン構造を図１Ｄに示す。
さらに、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）の全体的な安定性を評価するために、ＩＴＦ分析を行なって、熱ストレス後のそのアンフォールディングを測定した。このアッセイでは、ポリペプチド残基が溶媒に曝露されて配向が変化する可能性があるため、ピークシフト又は強度の変化はアンフォールディングを示す（図１Ｆ）。様々な比のｃＯＶＡをネイティブ又は熱的に変動する条件下でアッセイした場合、ｎＯＶＡは８０℃で完全に変性し、５０ＸのｃＯＶＡではピーク強度の部分的な減少が観察された（図１Ｆ）。他のｃＯＶＡ試料についてはＩＴＦスペクトルの測定値の変化は観察されず、ＣｈＡｃＮＬＳ部分とのコンジュゲート化が抗原の安定性を大幅に向上させたことが示唆された。
次いで、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚ細胞株を使用して抗原提示アッセイを行って、様々なＯＶＡコンジュゲートを比較した。図１Ｇに概略的に示すように、試験した様々なコンジュゲートには、コール酸－ＮＬＳ部分（「ＣｈＡｃＮＬＳ」）；ＮＬＳペプチド無しでコール酸部分とコンジュゲート化されたＯＶＡ（「ＣｈＡｃ－ＯＶＡ」）；ＰＥＧ４二官能性リンカーを介してコール酸－ＮＬＳ部分とコンジュゲート化されたＯＶＡ（「ＣｈＡｃＮＬＳ－ＰＥＧ４－ＯＶＡ」又は「ｃＯＶＡ」）；及びＰＥＧ６二官能性リンカーを介してコール酸－ＮＬＳ部分とコンジュゲート化されたＯＶＡ（「ＣｈＡｃＮＬＳ－ＰＥＧ６－ＯＶＡ」）が含まれる。図１Ｈに示すように、ＮＬＳペプチドを含まずにコール酸部分単独とＯＶＡとのコンジュゲート化「ＣｈＡｃ－ＯＶＡ」）は、そのままのＯＶＡ（「ｎＯＶＡ」）単独と比較して、抗原提示を改善しなかった。驚くべきことに、ＰＥＧ４二官能性リンカーを介して５０Ｘモル過剰のＣｈＡｃＮＬＳ部分とコンジュゲート化したＯＶＡ（「ｃＯＶＡ（５０Ｘ）」）は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ陽性対照ペプチド（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」）と同じレベルの抗原提示を示した。興味深いことに、ＣｈＡｃＮＬＳ部分のモル過剰を５Ｘ、１０Ｘ及び２５Ｘに減少させても（「ｃＯＶＡ（ＣｈＡｃＮＬＳ－ＰＥＧ４－ＯＶＡ）」）、同等のレベルの抗原提示が得られたが、この高められた抗原提示は２Ｘモル過剰のＣｈＡｃＮＬＳ部分では失われた。ＳＩＩＮＦＥＫＬ陽性対照と同等の抗原提示レベルはまた、ＰＥＧ６二官能性リンカーを介して２Ｘ～２５Ｘモル過剰のＣｈＡｃＮＬＳ部分とコンジュゲート化したＯＶＡ（「ＣｈＡｃＮＬＳ－ＰＥＧ６－ＯＶＡ」）についても観察された。最後に、はるかに長いＰＥＧ２４二官能性リンカーを介して５Ｘ及び１０Ｘモル過剰のＣｈＡｃＮＬＳ部分とコンジュゲート化したＯＶＡ（「ＣｈＡｃＮＬＳ－ＰＥＧ２４－ＯＶＡ」）を使用すると、ｎＯＶＡよりも高いがＳＩＩＮＦＥＫＬ陽性対照ペプチドのそれよりも低い抗原提示レベルが観察されたが、２Ｘ及び２５Ｘモル過剰ではｎＯＶＡを超える抗原提示の増加が失われた（データは示さず）。
実施例３：インビトロでのＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡの交差提示
ＢＭＤＣを生成するために、雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨及び脛骨を洗い流して、全有核細胞を収集した。次いで、細胞を組換えＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に８日間プレート培養し、２日毎に交換した。ＬＰＳを９日目に添加して、抗原をパルスする前にＤＣの成熟を誘発した。ＢＭＤＣの成熟をフローサイトメトリーによって確認した。Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞は９日目に検出されず、ＢＭＤＣの８０％超がＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、及びＩ－Ａｂ＋を発現した。次いで、ＢＭＤＣを、様々な濃度のもとのままのＯＶＡ（ｎＯＶＡ）又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＯＶＡ（ｃＯＶＡ）のいずれかと共にインキュベートし、ＯＴ－ＩＩトランスジェニックマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＯＴ－Ｉトランスジェニックマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを添加した。
図２Ａは、ＯＶＡ応答性ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）及びＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞の活性化を評価するために使用されるＯＶＡペプチド（例えば、ＳＩＩＮＦＥＫＬ［ＣＤ８＋Ｔ細胞のＯＴ－Ｉペプチド；配列番号５］又はＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ［ＣＤ４＋Ｔ細胞のＯＴ－ＩＩペプチド；配列番号６］）の抗原交差提示の設定を示す概略図である。
図２Ｂに、交差提示活性の尺度であるＯＴ－Ｉ由来ＣＤ８ Ｔ細胞を使用して産生されたＩＦＮ－γの量を示す。驚くべきことに、ＢＭＤＣ及びｃＯＶＡとインキュベートしたＣＤ８＋Ｔ細胞は、もとのままの抗原（ｎＯＶＡ）とインキュベートした場合よりも有意に多くのＩＦＮ－γを産生した。図２Ｃ及び２Ｄに、古典的ＭＨＣクラスＩＩ提示活性の尺度であるＯＴ－ＩＩ由来ＣＤ４Ｔ細胞を使用して産生されたＩＬ－２及びＩＦＮ－γの量をそれぞれ示す。驚くべきことに、ＢＭＤＣ及びｃＯＶＡとインキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞は、もとのままの抗原（ｎＯＶＡ）とインキュベートした場合よりも有意に多くのＩＦＮ－γを産生した。これらの観察に照らして、次に、捕捉されたＯＶＡの細胞内プロセシングをモニターした。この目的のために、ＣｈＡｃＮＬＳをＯＶＡ－ＤＱ上に架橋した後、エクスビボで生成した初代骨髄由来ＤＣにパルスした。ＤＣへのパルス後３時間で両方の抗原条件について差の増加を示すことができたが、ＣｈＡｃＮＬＳ連結ＯＶＡ－ＤＱで処理したＤＣにおけるシグナル強度は、パルス後６時間でｎＯＶＡと比較して有意に高かった（図２Ｅ及びＦ）。興味深いことに、３時間又は６時間のｎＯＶＡのパルスの間でシグナル強度の差を検出することはできず、シグナルの飽和を示唆している（図２Ｅ）。それにもかかわらず、これらの観察は、ＯＴ－Ｉ（ＣＤ８）（図２Ｂ）又はＯＴ－ＩＩ（ＣＤ４）Ｔ細胞（図２Ｃ及びＤ）と共培養された初代ＤＣを用いた抗原提示アッセイと相関している。
ｃＯＶＡがエンドソームからサイトゾルへの脱出を増強するかどうかを決定するために、ガレクチン－３（Ｇａｌ３）発現系を損傷した内膜のマーカーとして使用した。より具体的には、Ｇａｌ３は、細胞表面、ゴルジ装置上及びエンドサイトーシス区画のルーメン内に通常存在するβ－ガラクトシドコンジュゲートに対して高い親和性を示す。従って、正常な条件下で発現される場合、Ｇａｌ３は細胞質全体に均一に分布する。逆に、エンドソーム膜の破壊を誘導すると、Ｇａｌ３はルーメンの糖タンパク質に接近して結合することができる。従って、本発明者らは、ＤＣ２，４細胞株を、増強された緑色蛍光タンパク質との融合物としてＧａｌ３（ＥＧＦＰ－Ｇａｌ３）を発現する構築物で一過的にトランスフェクトして、その分布パターンを評価した。予想通り、ｎＯＶＡでＥＧＦＰ－Ｇａｌ３発現ＤＣ２，４細胞を処理した後は、ＧＦＰシグナルがサイトゾル全体に拡散的に分布した（図２Ｇ－上パネル）。対照的に、ｃＯＶＡでＤＣ２．４をパルスするといくつかの斑点の出現が誘導され、損傷エンドソームへのシグナルの再局在化を明確に示している（図２Ｇ－下パネル）。
実施例４：インビボの抗癌活性
予防用ワクチンとしてのＣｈＡｃＮＬＳ修飾ＯＶＡの有効性を決定するために、細胞ベースのワクチン又は単独型ワクチンのいずれかでｃＯＶＡをマウスにワクチン接種した。細胞ベースのワクチンでは、ｎＯＶＡ又はｃＯＶＡのいずれかをパルスしたＢＭＤＣをマウスに皮下注射した後、ＥＧ．７リンパ腫細胞を移植し、続いて再チャレンジした。免疫化のスキームを図３Ａに示す。
驚くべきことに、ｃＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣをワクチン接種したマウスは、腫瘍の増殖を全く示さず、１００％の生存率を示したが、対照（非ワクチン接種）及びｎＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣをワクチン接種したマウスでは、腫瘍が大きく進行し、より死亡しやすくなった（図３Ｂ及び３Ｃ）。さらに、ｃＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣをワクチン接種したマウスは、より高い抗体力価を発現した（図３Ｄ）。加えて、ＣＤ４エフェクターＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）及びＣＤ８セントラルＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｈｉ）及びエフェクターメモリーＴ細胞のレベルは、ｃＯＶＡ－ＤＣ群において実質的により高かった（図３Ｅ及びＦ）。最後に、インビトロで再刺激したＴ細胞に由来するサイトカイン／ケモカインのＬｕｍｉｎｅｘ（商標）分析は、ｎＯＶＡを注射したマウスと比較して、ｃＯＶＡ群ではＩＦＮ－γのレベルが上昇したことを示している（図３Ｇ）。単球／マクロファージ、ＮＫ細胞及び好中球の２つの強力な化学誘引物質であるマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１β及びＭＩＰ－２、並びにＢ細胞の分化及び抗体の産生を助けることが知られている２つのサイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）－６及びＩＬ－１０についても、同様のデータが観察された（図３Ｇ）。まとめると、ｃＯＶＡをパルスしたＤＣをワクチン接種した動物において観察された免疫応答の改善は、複数回のＥＧ．７の再チャレンジに対するそれらの獲得された耐性及び持続的な生存の利益と一致する。
同様の免疫スキームで、マウスにｃＯＶＡ又はｎＯＶＡ単独（パルスしたＢＭＤＣではない）のいずれかをワクチン接種した後に、ＥＧ．７リンパ腫細胞を移植した（図４Ａ）。図４Ｂに示すように、ｃＯＶＡをワクチン接種したマウスは、ｎＯＶＡをワクチン接種したマウス又はワクチン接種していない対照マウスと比較して、腫瘍の進行がより小さく、生存率（図４Ｃ）及び抗体応答（図４Ｄ）が有意に増加した。２つのスクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント、ＡｄｄａＳ０３（商標）又はＡｄｄａＶａｘ（商標）を使用したワクチン接種は両方とも免疫応答の効果を改善し、ｃＯＶＡをワクチン接種したマウスにおいてＡｄｄａＶａｘは優れた効果を誘発した。
実施例５：Ｔ細胞リンパ腫に対するインビボの治療的ワクチン接種
治療ワクチンとしての胆汁酸とコンジュゲート化したポリペプチド抗原の有効性を決定するために、マウスにまずＥＧ．７リンパ腫細胞を移植し、次いで、免疫チェックポイント阻害剤／抗がん剤の抗ＰＤ－１抗体の存在下又は非存在下で、ｎＯＶＡ又はｃＯＶＡのいずれかをパルスしたＢＭＤＣで免疫した。免疫化のスキームを図５Ａに示す。
ｃＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣで免疫したマウスは、抗ＰＤ－１抗体単独又はｎＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣで免疫したマウスと比較して、有意に腫瘍が小さく（図５Ｂ）また生存率が増加した（図５Ｃ）。驚くべきことに、抗ＰＤ－１ＡｂとｃＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣとの併用療法で処置したマウスは、腫瘍体積の減少及び生存率の増加によって示されるように、マウスにおけるＴ細胞リンパ腫の処置において相乗効果を示した。この相乗効果は、マウスに免役したｃＯＶＡをパルスしたＢＭＤＣの数と直接相関した（図５Ｄ及び５Ｅ）。
最後に、ＣｈＡｃＮＬＳをＥＬ４ Ｔ細胞リンパ腫のライセートに共有結合させて、抗原特異的な治療ワクチンの効果を決定した。ＥＬ４ Ｔ細胞リンパ腫細胞を移植したマウスを、抗ＰＤ－１抗体の存在下又は非存在下で、ＥＬ４ライセート単独又はＣｈＡｃＮＬＳ－ＥＬ４ライセートのいずれかをパルスしたＢＭＤＣで免疫した（図６Ａ）。ｃＯＶＡと同様に、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＥＬ４ライセートをパルスしたＢＭＤＣで免疫したマウスは、抗ＰＤ－１Ａｂ単独で免疫したマウス、又は抗ＰＤ－１Ａｂの存在とは無関係にＥＬ４ライセートをパルスしたＢＭＤＣと比較して、有意に腫瘍が小さく、生存率が増加した（図６Ｂ及び６Ｃ）。注目すべきことに、マウスにおける腫瘍の増殖が約３６日でプラトーに達し、マウスが試験終了時（５４日）に７０％の生存率を示したことから、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＥＬ４ライセートでパルスしたＢＭＤＣと抗ＰＤ１Ａｂ処置との組合せの相乗効果が見られた。これらの観察は、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＥＬ４ライセート（「ｃＬｙｓａｔｅ」）をパルスしたＤＣ／ＰＤ－１におけるＣＤ８、ＮＫ及びＣＤ１１ｃの免疫エフェクター細胞の動員の増強（図６Ｅ）を明らかにした腫瘍浸潤リンパ細胞（ＴＩＬ）解析（図６Ｅ）によってさらに裏付けられた。極めて対照的に、制御性ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）のレベルは、同じ群において大きく減少し（図６Ｅ）、ｃライセートをパルスしたＤＣとＰＤ－１との組合せは、抑制系Ｔｒｅｇの浸潤に対してＣＤ８ Ｔ細胞に有利にバランスを傾けることによって、炎症に有利に働く（図６Ｆ）という考えを支持している。全体として、これらの知見は、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＥＬ４ライセート構築物で処理した「既製の」同種異系ＤＣが、強力な抗腫瘍応答を誘発するための汎用ワクチンとして効果的に利用できることを示している。
実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するインビボでの治療的ワクチン接種
微生物感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのウイルス感染に対する治療ワクチンとしての胆汁酸とコンジュゲート化されたポリペプチド抗原の有効性を決定するために、実施例１、２及び４に記載したｃＯＶＡワクチンの構築と同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に共有結合したＣｈＡｃＮＬＳから構成されるワクチンを構築した。
図７Ａ及び７Ｂに、ＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２の構築のために使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク、及びＯＶＡと同様に、高い（青色）、中等度の（緑色）又は低い（黄色）溶媒露出のリジン残基であると予測されるリジン残基と共にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク（武漢株Ｄ６１４Ｇ）のリボン構造の概略図を示す。よりよく示されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３；図７Ｂ）では５０％を超えるリジン残基が、ＣｈＡｃＮＬＳとのコンジュゲート化に利用可能であると予測される（黒色で強調）。
マウスに、ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下で、全長の「もとのままの」Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（非コンジュゲート化；ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２；黒色バー）又はＣｈＡｃＮＬＳ－Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２（「ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２」；灰色のバー）をワクチン接種した（図８Ａ）。いずれかのアジュバントの存在下で、非コンジュゲート化ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスにおいて、Ｓｐｉｋｅタンパクに対するＩｇＧ力価の上昇が観察された。これらのＩｇＧ抗体は大部分がＩｇＧ１アイソタイプであったが、有意なレベルのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが観察された（図８Ｂ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の様々なドメインの免疫原性を評価するために、Ｓ１－ＲＢＤ又はＳ２部分を含有する非コンジュゲート化ワクチン又はコンジュゲート化ワクチンもまたマウスにワクチン接種した。ＡｄｄａＳ０３又はＡｄｄａＶａｘアジュバントの存在下で、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＳ１－ＲＢＤ及びＳ２部分をワクチン接種したマウスの抗体力価は、図８Ｃ及び８Ｄに示すように、有意に上昇した。
ワクチン接種したマウス由来の抗スパイクＩｇＧ抗体が中和活性を有するかどうかを評価するために、Ｓｐｉｋｅ１－シュードタイプウイルス様粒子とＨＥＫ細胞を使用してインビトロの感染性中和アッセイを開発した。図８Ｅに示すように、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウス由来の血清は、ＨＥＫ細胞のウイルス感染をより効果的に阻害し、したがって、ＮＴ５０力価で示されるように、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２と比較して、より強い中和活性を示した。
ＣｈＡｃＮＬＳとコンジュゲート化されたスパイクタンパク質から構成されるワクチンは、強力な体液性応答の生成に有効であることが示された。同じワクチンが細胞性応答の生成に有効かどうかを決定するために、２つの異なるアジュバントの存在下でｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２又はｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスにおいて、インビトロでＴ細胞を再刺激した後にサイトカインプロファイリングを評価した、。結果を図９Ａ及び９Ｂに示す。ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種したマウスでは、ｎＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２のワクチン接種と比較して、いずれのアジュバントでも強いＩＦＮ－γ応答が観察され、これは、ウイルス感染の制御に必要な強く一貫したＴｈ１応答を示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性をさらに評価するために、ウサギ及びハムスターに、異なるアジュバントの存在下で様々な用量のｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２をワクチン接種した。図１０に、様々な時点及び用量でのウサギにおけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２のワクチン接種デザインの概略図（図１０Ａ）及びＩｇＧ力価（図１０Ｂ）を示す。図１１では、チャレンジモデルにおけるｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２の治療効果の評価を示す。図１１に、ハムスターにおけるワクチンの効果の研究のための実験デザインの概略図（図１１Ａ）、及びＦＤＡに承認された（ＧＭＰグレード）ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ７２０ＶＧアジュバント又はＡｄｄａＳ０３と混合したｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２ワクチンに応答したＩｇＧ抗体力価（図１１Ｂ）を示す。ここで、Ｓｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２タンパク質に対して１０Ｘ及び５０Ｘの過剰なモル比のＣｈＡｃＮＬＳを用いてワクチンを試験した。３回目の投与の前に、ハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株を鼻腔内にチャレンジした。概して、全ての用量のワクチンは、ウサギ及びハムスターに十分に忍容されて強い体液性応答を生じた。
最後に、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２によるワクチン接種が異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の感染に対して防御的であるかどうかを評価するために、ワクチン接種したマウス由来の血清を、「野生型」武漢株に対してＲＢＤ（図１２Ａ）に特異的突然変異を有するカリフォルニア、ブラジル、南アフリカ、イギリス、インド、及びデルタ株由来のスパイクタンパクに対する交差反応性について試験した。図１２Ｂ及び１２Ｃに示すように、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２で免疫したマウス由来の血清は、試験したすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株由来のスパイクタンパク質と有意に交差反応性であった。さらに、ワクチン接種したマウスの血清由来の抗体は防御的であり、インビトロの中和アッセイによって示されるように、イギリス、ブラジル、南アフリカ、デルタ、及びカリフォルニア型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して強い中和活性を示した（図１２Ｄ）。
全体として、これらの知見は、ＣｈＡｃＮＬＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質構築物が、強力な抗ウイルス応答を誘発するための汎用ワクチンとして効果的に利用できることを示している。
実施例７：様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対するインビボの治療的ワクチン接種
異なる変異株に由来するスパイクタンパク質を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが同じ構築を用いて有効であるかどうかを決定するために、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンを、インド変異株由来のスパイクタンパク質を使用して生成した。
マウスに様々な用量のｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチン又は生理食塩水（対照）をワクチン接種したところ、血清及びＢＡＦＬ中のＩｇＧ力価の上昇が様々な時点で観察された（図１３）。さらに、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮをワクチン接種したマウス由来のＴ細胞において様々なサイトカイン及びケモカインレベルを検出することによって、強い細胞性応答もまた観察された（図１４）。
最後に、ｃＳｐｉｋｅ－ＣｏＶ－２－ＩＮワクチンをワクチン接種したマウス由来の血清は、試験した全ての異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株由来のスパイクタンパク質と交差反応性であった（図１５）。
全体として、これらの知見は、ＣｈＡｃＮＬＳを異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株由来のスパイクタンパク質に適合させて、広範で防御的かつ強力な抗ウイルス応答を誘発する効果的なワクチンを構築できることを示している。
実施例８：様々な胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートとコンジュゲート化された抗原の増強された抗原提示
ＯＶＡとコンジュゲート化された様々な胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートを生成し、Ｂ３ＺレポーターアッセイにおいてＤＣ又はＢ細胞のＯＶＡ抗原提示を増強するそれらの能力について評価した。胆汁酸－ＮＬＳ－ＯＶＡコンジュゲートは、図１６のＳＤＳ－ＰＡＧＥに示されるように、ＯＶＡに対して１０Ｘ又は５０Ｘのモル過剰比の胆汁酸－ＮＬＳで生成したが、１０Ｘのモル過剰比で生成されたコンジュゲートを用いた結果のみを、図１７（樹状細胞）及び図１８（Ｂ細胞）の抗原表示アッセイに示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から計算された相対移動距離（Ｒｆ）から（例えば、図１６）、１０Ｘモル過剰の胆汁酸－ＮＬＳ反応物では、ＯＶＡ分子当たり約１～４個の胆汁酸－ＮＬＳ部分がコンジュゲート化され、２５Ｘモル過剰の胆汁酸－ＮＬＳ反応物では、ＯＶＡ分子当たり約５～９個の胆汁酸－ＮＬＳ部分がコンジュゲート化され、５０Ｘモル過剰の胆汁酸－ＮＬＳ反応物では、ＯＶＡ分子当たり約１２～２０個の胆汁酸－ＮＬＳ部分がコンジュゲート化された。
抗原提示細胞としての樹状細胞
図１７に示すように、試験した様々な胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートの全てが、ＣＡ－ＳＶ４０のそれ（すなわち、ＣｈＡｃＮＬＳ；図１７に破線で示す）と同等以上のレベルでＢＭＤＣによるＯＶＡの提示を増強した。驚くべきことに、図１７で試験した全ての胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートについて観察された抗原提示の増加は、ＯＶＡコンジュゲート（０．１ｍｇ／ｍＬ）と比較して５０倍高い濃度のＯＶＡ抗原（５ｍｇ／ｍＬ）を使用したという事実にもかかわらず、「ＯＶＡ単独」対照よりも優れていた。興味深いことに、ＣＤＣＡ－ＳＶ４０、ＵＤＣＡ－ＳＶ４０、ＧＤＣＡ－ＳＶ４０、ＧＤＣＡ－ＮＬＳ２－ＲＰＳ１７、及びＬＣＡ－ＮＬＳ２－ＲＰＳ１７などのいくつかの胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートは、ＣＡ－ＳＶ４０）（図１７）と比較して、ＯＶＡの提示を顕著に増強した。さらに、ＯＶＡをＳＶ４０ペプチド単独（胆汁酸なし）とコンジュゲート化し、０．１ｍｇ／ｍＬというより同等の濃度で使用した陰性対照（図１７中の「ＳＶ４０」）は「ＰＢＳ」陰性対照と同様の結果を与えた。胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲート「ＳＶ４０－ＣＡ」は、主にコール酸基の配置においてコンジュゲート「ＣＡ－ＳＶ４０」と異なる。すなわち、「ＳＶ４０－ＣＡ」コンジュゲートにおいて、コール酸基は、ＳＶ４０ ＮＬＳペプチドに付加されたＣ端リジン残基を介してＳＶ４０ ＮＬＳペプチドのＣ端にコンジュゲート化される。図１７に示すように、コンジュゲート「ＳＶ４０－ＣＡ」及び「ＣＡ－ＳＶ４０」の両方は同様のＢ３Ｚ応答を生じ、このことは、ペプチド部分に対するコール酸基の配置が、胆汁酸－ＮＬＳ部分の免疫刺激効果に影響を及ぼさないことを示唆している。
抗原提示細胞としてのＢ細胞
図１８に示すように、試験した様々な胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートの大部分は、５０倍高い用量のＯＶＡ単独（５ｍｇ／ｍＬ）対照と比較して、又はＣＡ－ＳＶ４０（すなわち、ＣｈＡｃＮＬＳ）と比較して、同等又は増強されたＢ細胞による抗原提示を生じた。興味深いことに、ＤＣＡ－ＳＶ４０、ＵＤＣＡ－ＳＶ４０、ＬＣＡ－ＳＶ４０、ＧＤＣＡ－ＧＷＧ－ＳＶ４０、ＧＤＣＡ－ＰＱＢＰ１、ＤＣＡ－ｈｎＲＮＰ Ｍ、ＣＡ－ＮＬＳ２－ＲＰＳ１７、ＧＤＣＡ－ｈｎＲＮＰＡ１ Ｍ９、ＣＡ－ｃＭｙｃ、ＧＤＣＡ－ＳＶ４０、ＧＵＤＣＡ－ＰＱＢＰ１、及びＣＤＣＡ－ＮＬＳ３－ＲＰＳ１７などのいくつかの胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートは、ＣＡ－ＳＶ４０と比較してＯＶＡの提示を顕著に増強した。
全体として、これらの知見は、所与のポリペプチド抗原の（例えば、増強された抗原提示から生じる）免疫原性を改善するための種々の胆汁酸－ＮＬＳコンジュゲートの汎用性を裏付けるものであり、製造するサブユニットワクチンの最も高価な成分であり得るポリペプチド抗原の使用をより低い用量にできる潜在的な可能性がある。
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Claims (53)

  1. ポリペプチド抗原の免疫原性を改善する方法であって、修飾するポリペプチド抗原を供給する工程と、前記ポリペプチド抗原を１つ以上のステロイド酸部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含み、前記修飾ポリペプチド抗原が、前記修飾のないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の前記修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化されており、前記修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、対象への投与時に、前記ポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答を誘発する、方法。
  2. 前記修飾ポリペプチド抗原が、前記修飾ポリペプチド抗原がコンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示すように十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチド抗原が、タンパク質抗原であり、及び／又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、若しくは１５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチド抗原が、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープ及び／又はＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチド抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、ネオアンチゲン、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、ワクチン接種及び／又は免疫療法による治療に適した疾患又は障害に関連する抗原、若しくはその任意の抗原性断片であるか、又はそれらを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ポリペプチド抗原が、コロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号３）若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質（配列番号４）又はその抗原性断片、又は単一塩基変異体抗原、突然変異フレームシフト抗原、スプライス変異体抗原、遺伝子融合抗原、内因性レトロエレメント抗原などの癌抗原、又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－体細胞変異体由来抗原あるいは翻訳後ＴＳＡ、ウイルス由来の癌抗原（例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス、又はエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ））、癌－精巣抗原、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ－２、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＧＦＲ、細胞ライセート又は腫瘍由来の他の物質（例えば、腫瘍由来のエクソソーム）などの別のクラスの抗原であるか、又はそれらを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ステロイド酸が、エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発し、それによってエンドソーム膜を不安定化させ、細胞内送達時の前記ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を促進する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ステロイド酸が、セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ステロイド酸が胆汁酸である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ステロイド酸が一次胆汁酸又は二次胆汁酸である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ステロイド酸が、
    （ａ）コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、ウルソコール酸（ＵＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、又はグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）である胆汁酸、
    （ｂ）（ａ）の胆汁酸の類似体であって、エンドサイトーシスを誘導する；エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発する；セラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する；及び／又はコール酸の疎水性よりも大きい疎水性を有する類似体、
    （ｃ）コール酸よりも疎水性である胆汁酸又は胆汁酸類似体（例えば、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＧＤＣＡ、又はＧＣＤＣＡ）、又は
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せであるか、又はそれらを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 各修飾ポリペプチド抗原分子が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のステロイド酸部分とコンジュゲート化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記修飾ポリペプチド抗原分子が、前記ポリペプチド抗原の溶媒露出アミン（例えば、一級アミン）及び／又はスルフヒドリル基で前記ステロイド酸とコンジュゲート化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記修飾ポリペプチド抗原分子が、リンカー（例えば、二官能性、三官能性リンカー、又は多官能性リンカー）を介して前記ステロイド酸とコンジュゲート化される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ステロイド酸が、ステロイド酸－ペプチドコンジュゲートに含まれて、前記ポリペプチド抗原が、前記ステロイド酸－ペプチドコンジュゲートと（例えば、前記ペプチドを介して、例えば、Ｎ又はＣ端残基において）コンジュゲート化される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ペプチドが、
    （ｉ）エンドサイトーシス及び／又はエンドソーム形成を刺激するタンパク質形質導入ドメインを含む；
    （ｉｉ）細胞内標的化シグナルを含む；
    （ｉｉｉ）カチオン性ペプチド（例えば、細胞非透過性カチオン性ペプチド）である；
    （ｉｖ）非免疫原性ペプチドである；又は
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組合せである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記細胞内標的化シグナルが、核局在化シグナル、例えば、古典的ＮＬＳ（例えば、ＳＶ－４０ラージＴ抗原（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７）又は他の古典的ＮＬＳ由来のＮＬＳ）又は非古典的ＮＬＳ（例えば、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質中の酸性Ｍ９ドメイン；酵母転写リプレッサーＭａｔα２、ＰＹ－ＮＬＳ中の配列ＫＩＰＩＫ；リボソームＮＬＳ；及びＵ ｓｎＲＮＰの複合シグナル）などの核局在化シグナルである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば配列番号１又は７に含まれる）、ＧＷＧ－ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば配列番号８に含まれる）、ｈｎＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ（例えば配列番号９に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｄ ＮＬＳ（例えば配列番号１０に含まれる）、ｈｎＲＮＰ Ｍ ＮＬＳ（例えば配列番号１１に含まれる）、ＰＱＢＰ－１ ＮＬＳ（例えば配列番号１２に含まれる）、ＮＬＳ２－ＲＧ Ｄｏｍａｉｎ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１３に含まれる）、ＮＬＳ１ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１４に含まれる）、ＮＬＳ２ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１５に含まれる）、ＮＬＳ３ ＲＰＳ１７（例えば配列番号１６に含まれる）、ｃＭｙｃ ＮＬＳ（例えば配列番号１７に含まれる）、ＨｕＲ ＮＬＳ（例えば配列番号１８に含まれる）、Ｔｕｓ ＮＬＳ（例えば配列番号１９に含まれる）、又はヌクレオプラスミンＮＬＳ（例えば配列番号２０に含まれる）であるか、又は核局在化活性を有するＮＬＳの変異体であり、前記ＮＬＳが、配列番号７～２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記修飾ポリペプチド抗原が、
    （ｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記修飾ポリペプチド抗原のサイトゾル送達の増加；
    （ｉｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記修飾ポリペプチド抗原の総細胞送達の増加；
    （ｉｉｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強；
    （ｉｖ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記ポリペプチド抗原への曝露時のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加；
    （ｖ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強；
    （ｖｉ）対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、前記ポリペプチド抗原に対する抗体種の多様性の増加；又は
    （ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）の任意の組合せを誘発する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、又は請求項１～１９のいずれか一項に定義される修飾ポリペプチド抗原を含む、（例えば、インビトロ又はエクスビボの）細胞集団。
  21. 免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、遺伝子操作された抗原提示細胞）、ＭＨＣクラスＩ発現細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項２０に記載の細胞集団。
  22. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、請求項１～１９のいずれか一項に記載の修飾ポリペプチド抗原、請求項２０もしくは２１に記載の細胞集団、又はそれらの任意の組合せと、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバント（例えば、エマルジョンアジュバント、水中油型エマルジョンアジュバント、又はスクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント）と、を含む、免疫原性組成物。
  23. 治療用又は予防用ワクチン（例えば、抗癌ワクチン、抗ウイルスワクチン、又は抗細菌ワクチン）である、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
  24. 対象における目的の非修飾ポリペプチド抗原に対する増強された適応免疫応答を誘発する方法であって、請求項２２又は２３に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  25. 感染症に対して対象にワクチン接種する方法であって、請求項２２又は２３に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含み、前記ポリペプチド抗原が、前記感染症を引き起こす病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の抗原性断片を含む、方法。
  26. 対象における癌を治療するための方法であって、請求項２２又は２３に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  27. 前記方法が、免疫チェックポイント阻害剤療法と組み合わされる、請求項２６に記載の方法。
  28. 対象における免疫応答を生じさせる際に使用するための、又は対象において免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物の製造のための、請求項１～１９のいずれか一項に定義される修飾ポリペプチド抗原、又は請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって生成される、修飾ポリペプチド抗原。
  29. 対象において免疫応答を生じさせるための、又は対象において免疫応答を生じさせるための薬剤（例えば、ワクチン）の製造のための、請求項１～１９のいずれか一項に定義される修飾ポリペプチド抗原、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって生成される修飾ポリペプチド抗原、請求項２０又は２１に定義される細胞集団、若しくは請求項２２又は２３に定義される免疫原性組成物の、使用。
  30. 前記免疫応答が、対応する非修飾ポリペプチド抗原から生成されるものと比較して、前記ポリペプチド抗原に対する細胞性免疫の増強、前記ポリペプチド抗原への曝露時のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生の増加、前記ポリペプチド抗原に対する体液性免疫の増強、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項２８に記載の使用又は請求項２９に記載の使用のための修飾ポリペプチド抗原。
  31. ポリペプチド抗原を調製するための方法であって、非修飾ポリペプチド抗原を十分な数のステロイド酸部分とコンジュゲート化して、コンジュゲート化の前のポリペプチド抗原よりも高い安定性（例えば、熱安定性）を示す修飾ポリペプチド抗原を生成する工程を含む方法。
  32. 前記ポリペプチド抗原にコンジュゲート化される前記ステロイド酸部分の数が、前記修飾のないポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の前記修飾ポリペプチド抗原のエンドソーム脱出を増加させるために十分である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記修飾ポリペプチド抗原が、請求項３～１９のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. ポリペプチド抗原の免疫原性を改善する方法であって、修飾するポリペプチド抗原を供給する工程と、前記ポリペプチド抗原を１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分と共有結合でコンジュゲート化して修飾ポリペプチド抗原を生成する工程とを含み、前記修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、対象への投与時に前記ポリペプチド抗原に対する改善された適応免疫応答を誘発するために十分な数の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化され、前記胆汁酸－ペプチド部分に含まれる前記ペプチドが核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、方法。
  35. 前記修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、細胞内送達時の前記修飾ポリペプチド抗原の抗原提示を増加させるために十分な数の前記胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記修飾ポリペプチド抗原が、対応する非修飾ポリペプチド抗原と比較して、より高い熱安定性を示すように、前記修飾ポリペプチド抗原が十分な数の前記胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記ポリペプチド抗原と１つ以上の前記胆汁酸－ペプチド部分との共有結合によるコンジュゲート化が、前記ポリペプチド抗原をモル過剰の前記胆汁酸－ペプチド部分と反応させることによって行われる、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ポリペプチド抗原を２倍～１００倍モル過剰の前記胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ポリペプチド抗原を２倍～５０倍モル過剰の前記胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記ポリペプチド抗原を５倍～２５倍モル過剰の前記胆汁酸－ペプチド部分と反応させる、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記修飾ポリペプチド抗原当たりのコンジュゲートされた前記胆汁酸－ペプチド部分の平均数が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０であるか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０とｎの間であり、ｎが、コンジュゲート化に利用可能な前記ポリペプチド抗原上の溶媒露出部位の総数である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記胆汁酸が、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、ウルソコール酸（ＵＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、又はグリコウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）である、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記胆汁酸が、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＣＤＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＨＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＵＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ、又はＧＵＤＣＡの類似体であり、前記類似体が、エンドサイトーシスを誘導し、エンドソームの内側リーフレット上へのセラミド蓄積を誘発するか、又はセラミドを形成するように酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）に媒介されるスフィンゴミエリンの切断の増加を誘発する、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号１又は７）、ＧＷＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号８）、ｈｎＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ（配列番号９）、ｈｎＲＮＰ Ｄ ＮＬＳ（配列番号１０）、ｈｎＲＮＰ Ｍ ＮＬＳ（配列番号１１）、ＰＱＢＰ－１ ＮＬＳ（配列番号１２）、ＮＬＳ２－ＲＧ Ｄｏｍａｉｎ ＲＰＳ１７（配列番号１３）、ＮＬＳ１ ＲＰＳ１７（配列番号１４）、ＮＬＳ２ ＲＰＳ１７（配列番号１５）、ＮＬＳ３ ＲＰＳ１７（配列番号１６）、ｃＭｙｃ ＮＬＳ（配列番号１７）、ＨｕＲ ＮＬＳ（配列番号１８）、Ｔｕｓ ＮＬＳ（配列番号１９）又はヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号２０）である、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記核局在化シグナルが、核局在化活性を有するＮＬＳの変異体であり、前記ＮＬＳが、配列番号７～２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ポリペプチド抗原が、リンカーを介して前記１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分にコンジュゲート化される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記リンカーが、二官能性リンカー、三官能性リンカー又は多官能性リンカーである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記修飾ポリペプチド抗原分子が、前記ポリペプチド抗原の溶媒露出官能基を介して前記１つ以上の胆汁酸－ペプチド部分とコンジュゲート化される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ポリペプチド抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、腫瘍由来の細胞ライセート、腫瘍由来のエクソソーム、ネオアンチゲン、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又はワクチン接種及び／もしくは免疫療法による処置に適した疾患もしくは障害に関連する他の抗原であるか、又はそれを含む、請求項３４～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ポリペプチド抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質又はその抗原性断片であるか、又はそれを含む、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 請求項３４～５０のいずれか一項に記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原、又は請求項３４～５０のいずれか一項に記載の方法によって生成された修飾ポリペプチド抗原を含む細胞集団と、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと、を含む、免疫原性組成物。
  52. 前記細胞集団が、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、遺伝子操作された抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩ発現細胞、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項５１に記載の免疫原性組成物。
  53. 対象における目的の非修飾ポリペプチド抗原に対する増強された適応免疫応答を誘発する方法であって、請求項５２に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む方法。
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