CN117500521A - 基于类固醇酸的免疫原增强子 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于与目标抗原混合的免疫原增强子。该增强子通常包括类固醇酸和/或类固醇酸‑肽缀合物，其量足以改善或改变对与其混合的抗原的适应性免疫应答。在实施方案中，该类固醇酸可以是胆汁酸，并且该肽可以包括一个或多个功能结构域，诸如核定位信号，其可促进抗原呈递和/或抗原交叉呈递，从而触发针对该抗原的改善的细胞免疫或改善的细胞和体液免疫。
Description
本说明书涉及增强抗原的免疫原性的方法。更具体地，本说明书涉及用于改善抗原免疫原性的类固醇酸和类固醇酸-肽缀合物。
背景技术
虽然亚单位疫苗通常被认为是最安全的疫苗，但此类抗原可能不会引发足够强的免疫应答以提供保护性和持久的免疫。因此，改善亚单位疫苗的免疫原性和功效的方法将是高度期望的。
发明内容
在第一方面中，本文描述了包括与抗原呈递的增强子混合的抗原的免疫原性组合物，该增强子包括类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物，该类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物的量足以在将该组合物施用于抗原呈递细胞后改善该抗原的呈递(与施用不含该增强子的对应组合物相比)。在实施方案中，该类固醇酸可以是胆汁酸或胆汁酸类似物，并且该肽可包括功能结构域，诸如核定位信号、内体逃逸信号和/或蛋白质转导结构域。
在另一个方面中，本文描述了包括细胞群和如本文所述的免疫原性组合物的细胞培养物。在另一个方面中，本文描述了疫苗，其包括如本文所述的免疫原性组合物，或包括使用如本文所述的该细胞培养物生成的细胞。在另一个方面中，本文描述了一种用于在受试者中触发针对目标抗原的增强的适应性免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如本文所述的组合物，或使用如本文所述的该细胞培养物生成的细胞。
在另一个方面中，本文描述了用于与抗原混合以增强免疫原性，或用于在药物(用于在受试者中产生免疫应答)的制造中使用的类固醇酸-肽缀合物。
一般定义
标题和其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求而呈现的。说明书或权利要求中标题或其他标识符的使用不一定要求步骤或要素按字母或数字顺序或按它们所呈现的顺序来进行。
当在权利要求和/或说明书中连同术语“包含”使用时，词语“一”或“一种”的使用可以意指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
如本说明书和权利要求中所用，词语“包含”(以及任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(以及任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并不排除
另外的、未列举的要素或方法步骤。
术语“约”用于指示值包括为了确定该值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。一般而言，术语“约”意在表示高达10％的可能变化。因此，在术语“约”中包括值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。
本说明书的其他目的、优点和特征将在阅读以下对其具体实施方案的非限制性描述后变得更加明显，这些具体实施方案仅参考附图以举例的方式给出。
附图说明
在附图中：
图1示出用骨髓来源的树突细胞(BMDC)进行的抗原交叉呈递测定以评估OVA应答的OT-I(CD8)细胞的结果。小鼠BMDC用单独的抗原(OVA)、单独的胆酸(CA)、单独的胆酸-NLS肽缀合物(CA-SV40NLS)、不同比例的CA与抗原(CA:OVA＝22:1、12:1、8:1、4:1和2:1)或不同比例的胆酸-NLS肽缀合物与抗原(CA-SV40NLS:OVA＝22:1、12:1、8:1、4:1和2:1)脉冲处理持续3小时。然后将脉冲处理的BMDC与OT-I小鼠来源的CD8 T细胞共培养，并且将IFN-γ水平定量为交叉呈递活性的量度。
图2示出不同胆汁酸对胆汁酸-SV40NLS缀合物的抗原呈递活性的影响。对于该实验，使用BMDC作为抗原呈递细胞(n＝6)并且摩尔比(胆汁酸/肽/缀合物):抗原为4:1。所测试的对照包括无抗原(“PBS”)、单独的抗原(“单独的OVA”)、未缀合的NLS肽(“SV40NLS”)、与OVA混合的未缀合的胆酸(“CA”)、以及与OVA混合的阳性对照肽SIINFEKL(SEQ ID NO:9)(“SIINFEKL”)。虚线表示用单独的OVA获得的信号。胆汁酸：胆酸(CA)；甘氨脱氧胆酸(GDCA)；甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)：熊脱氧胆酸(UDCA)；和石胆酸(LCA)。
图3示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原呈递活性的影响。虚线表示用单独的OVA获得的信号。在孵育24小时后获取读数，并且误差条表示SD(n＝6)。对于该实验，使用BMDC作为抗原呈递细胞。
图4示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原呈递活性的影响。虚线表示用单独的OVA获得的信号。在孵育24小时后从单次实验中获取读数。CA-肽缀合物:OVA的摩尔比为22:1。对于该实验，使用BMDC作为抗原呈递细胞。
图5示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原呈递活性的影响。对于该实验，使用BMDC作为抗原呈递细胞。虚线表示用单独的OVA获得的信号。在孵育24小时后从单次实验中获取读数。CA-肽缀合物:OVA的摩尔比如下：CA-GWG-SV40NLS(12:1)；CA-hnRNP M NLS(12:1)；CA-NLS2-RPS17 NLS(22:1)；CA-HuR NLS(22:1)；CA-cMyc NLS(2:1)；CA-NLS3-RPS17 NLS(22:1)；CA-NLS2-RG-RPS17 NLS(2:1)；CA-PQBP1NLS(8:1)；CA-hnRNPA1 M9 NLS(22:1)；和CA-SV40 NLS(2:1)。
图6示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原呈递活性的影响。对于该实验，使用交叉呈递间充质基质细胞(MSC)系作为抗原呈递细胞。虚线表示用单独的OVA获得的信号。在孵育24小时后获取读数。CA-肽缀合物:OVA的摩尔比如下：CA-GWG-SV40NLS(2:1)；CA-hnRNP M NLS(8:1)；CA-hnRNP D NLS(12:1)；CA-NLS2-RG-RPS17(4:1)；CA-cMyc NLS(12:1)；CA-HuR NLS(12:1)；CA-Tus NLS(2:1)；CA-NLS2-RPS17 NLS(4:1)；CA-PQBP1 NLS(12:1)；CA-hnRNPA1 M9 NLS(2:1)；和CA-SV40NLS(2:1)。
图7A至图7D示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原内化活性的影响。对于该实验，使用交叉呈递间充质基质细胞(MSC)系作为抗原呈递细胞，其使用由Alexa Fluor647(即，OVA647)TM标记的OVA进行脉冲处理。通过流式细胞术测量OVA647荧光。测试了不同比例的CA(NLS1 RPS17[图7A]；NLS3 RPS17[图7B]；PQBP-1[图7C]；和hnRNPA1 M9 NLS[图7D])与抗原(CA:OVA＝22:1、12:1、8:1、4:1和2:1)(hnRNPA1 M9 NLS为2:1)。
图8A至图8D示出不同NLS肽对胆酸-NLS肽缀合物的抗原处理活性的影响。对于该实验，使用交叉呈递间充质基质细胞(MSC)系作为抗原呈递细胞，其使用DQTM卵白蛋白(即，OVADQ)进行脉冲处理。通过流式细胞术测量OVADQ荧光。测试了不同比例的CA(NLS1 RSP17[图8A]；NLS3 RPS17[图8B]；PQBP-1[图8C]；和hnRNPA1 M9 NLS[图8D])与抗原(CA:OVA＝22:1、12:1、8:1、4:1和2:1)(hnRNPA1M9 NLS为2:1)。
序列表
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表1：序列表描述
具体实施方式
本文描述了涉及改善或改变对抗原的适应性免疫应答的组合物、细胞和方法。在一些方面中，本发明源于本文证明抗原与类固醇酸或类固醇酸-肽缀合物的混合物会改善抗原呈递和/或触发针对抗原的改善的细胞免疫，或改善的细胞和体液免疫。在一些实施方案中，本文描述了作为抗原呈递和/或适应性免疫的增强子的类固醇酸或类固醇酸-肽缀合物的用途。有利地，本文所述的增强子不与抗原共价缀合，从而提供能够快速适应于以可针对目标抗原定制的增强子:抗原摩尔比与不同抗原配制的通用平台。
在第一方面中，本文描述了包括与抗原呈递的增强子混合的抗原的组合物。如本文所用，术语“混合(admixture)”或“混合(admixing)”是指将两种单独组分组合成单一组合物，其中组分未共价缀合或以其他方式一起反应。在一些实施方案中，与施用对应缺少增强子的组合物相比，增强子可包括足以在将组合物施用于抗原呈递细胞(例如，体外、离体或体内)后改善抗原呈递的量的类固醇酸。在一些实施方案中，与施用对应缺少增强子的组合物相比，增强子可包括足以在将组合物施用于抗原呈递细胞(例如，体外、离体或体内)后改善抗原呈递的量的类固醇酸-肽缀合物。
多肽抗原通常被抗原呈递细胞(例如，树突细胞)捕获，但最初被俘获在内体中。内体向溶酶体的成熟化导致pH降低和介导非特异性抗原降解的蛋白水解酶的活化。因此，产生的一些抗原性片段然后可以通过内体孔隙到达胞质溶胶，在胞质溶胶中在MHC I类呈递之前通过蛋白酶体机制发生进一步的抗原降解。尽管这个过程是自然发生的，但所产生的最终离开内体的抗原片段可能是小的和/或受损的，致使它们不适合蛋白酶体降解，从而阻碍它们的MHC I类呈递并因此阻碍基于呈递的细胞免疫。不受理论的束缚，抗原与本文所述的免疫原增强子的混合可促进抗原的内化/内体逃逸，允许它们(或更大的抗原片段)以更天然的构象和/或以更大的量到达胞质溶胶。因此，这些更天然的抗原的蛋白酶体降解可产生更高量和/或多种在抗原呈递细胞表面经由MHC I类呈递的免疫原性肽和/或稳定肽，从而引发有效的T细胞激活。
在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸(例如，在增强子中和/或在类固醇酸-肽缀合物中)可以是增强内化的货物(cargoes)的内吞作用和/或内体逃逸的类固醇酸。不受理论的束缚，已经证实类固醇酸(例如，胆汁酸和胆汁酸类似物)被病毒利用/采用以促进它们对宿主细胞的感染，诸如通过增加它们的内吞摄取和/或内体逃逸以能够进入胞质溶胶(Shivanna等人，2014；Shivanna等人，2015；Murakami等人，2020)。例如，已经证实胆汁酸会触发酶酸性鞘磷脂酶(ASM)在内体的内小叶上将鞘磷脂裂解成神经酰胺。增加量的神经酰胺使膜去稳定并促进内体逃逸。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可包括触发神经酰胺在内体的内小叶上积聚的那些类固醇酸，从而使内体膜去稳定并且促进修饰的多肽抗原在细胞内递送后的内体逃逸。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可包括触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂的裂解以形成神经酰胺的那些类固醇酸。
在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以是胆汁酸，诸如初级胆汁酸或次级胆汁酸。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以是包括一个或多个胆汁酸部分的胆汁酸低聚物(Al-Hilal等人，2014)。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以是或包括胆汁酸，其是：胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺猪脱氧胆酸(THDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、熊胆酸(UCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以是或包括：甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、或当应用于本文所述的增强子中时增强抗原呈递和/或针对抗原的适应性免疫的它们的类似物。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可以是或包括本文所述的胆汁酸的类似物，其：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；和/或具有比胆酸的疏水性更高的疏水性。
经证实疏水性胆汁酸诸如GCDCA、TCA、GCA和CA(但不是亲水性胆汁酸诸如UDCA)会通过经由ASM介导的神经酰胺在顶膜上的积聚而增强内体摄取和内体逃逸来增加GII.3人诺如病毒感染和在宿主肠细胞中的复制(Murakami等人，2020)。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可包括比胆酸疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物或由该胆汁酸或胆汁酸类似物组成。在一些实施方案中，适合与本文所述的多肽抗原缀合的类固醇酸包括比胆酸疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物或由该胆汁酸或胆汁酸类似物组成(例如，CDCA、DCA、LCA、TCA、TDCA、TCDCA、GCA、GDCA或GCDCA；Hanafi等人，2018)。
在一些实施方案中，包括在本文所述的类固醇酸-肽缀合物中的肽可包括一个或多个结构域，该结构域赋予缀合物期望的功能性(例如，亚细胞靶向、核定位、核仁定位、内体逃逸和/或蛋白质转导)，这可进一步增强免疫原性。如本文所用，“结构域”通常是指蛋白质的具有特定功能性的一部分。一些结构域当与蛋白质的其余部分分开时，保留它们的功能，因此可以以模块方式使用。许多蛋白质结构域的模块特征可以在它们在本文所述的肽内的布置方面提供灵活性。然而，当在肽的某些位置(例如，N端或C端区域，或介于之间)进行工程改造时，一些结构域可能表现更好。该结构域在其内源性蛋白质内的位置可以是应当在该肽内对该结构域进行工程改造的位置的指示。
在一些实施方案中，该肽可包含促进该修饰的多肽抗原靶向特定亚细胞区室的亚细胞靶向信号。在一些实施方案中，本文所述的肽可包括核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括经典NLS(例如，包括K-K/R-X-K/R基序)、PY-NLS(例如，包括一个或多个PY基序，诸如朝向NLS的C末端)、PL-NLS(例如，包括一个或多个PL基序，诸如朝向NLS的C末端)、核糖体NLS、还包括核仁靶向信号的NLS，或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括一般共有序列：(i)K(K/R)X(K/R)；(ii)(K/R)(K/R)X10–12(K/R)3/5，其中(K/R)3/5表示五个连续氨基酸中的三个赖氨酸或精氨酸残基；(iii)KRX10–12KRRK；(iv)KRX10–12K(K/R)(K/R)；或(v)KRX10–12K(K/R)X(K/R)，其中X是任何氨基酸(Sun等人，2016)。
在一些实施方案中，本文所述的NLS可以是疏水性和/或碱性NLS。在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括至少三个、四个或五个酸性残基(例如，R/K)和/或至少三个、四个或五个碱性残基(例如，E/D)。
在一些实施方案中，本文所述的NLS可以是或源自来自SV-40大T抗原的NLS(例如，SV40 NLS)、c-Myc NLS、hnRNP A1蛋白中的酸性M9结构域(例如，hnRNPA1 M9 NLS)、hnRNP DNLS、hnRNP M NLS、PQBP-1NLS、HuR NLS、Tus NLS、核质蛋白NLS、NLS1 RPS17、NLS2 RPS17、NLS3 RPS17或NLS2-RG结构域RSP17。
在一些实施方案中，本文所述的核定位信号可包含或者源自来自SV-40大T抗原的NLS(例如，PKKKRKV；SEQ ID NO:1或2)或源自其他经典NLS。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号可包括或源自非经典NLS(例如，hnRNP A1蛋白中的酸性M9结构域；酵母转录阻遏因子Matα2中的序列KIPIK；PY-NLS；核糖体NLS；或UsnRNP的复合信号)。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号包括SEQ ID NO:1至8或10至16中任一者的氨基酸序列或它们的任何部分或基本上由该氨基酸序列或它们的任何部分组成。在一些实施方案中，本文所述的核定位信号包括以下核定位信号或基本上由以下核定位信号组成：SV40 NLS(例如，包括在SEQ ID NO:1或2中)、GWG-SV40 NLS(例如，包括在SEQ ID NO:3中)、hnRNPA1 M9 NLS(例如，包括在SEQ ID NO:4中)、hnRNP D NLS(例如，包括在SEQ ID NO:5中)、hnRNP M NLS(例如，包括在SEQ ID NO:10中)、PQBP-1NLS(例如，包括在SEQ ID NO:6中)、NLS2-RG结构域RPS17(例如，包括在SEQ ID NO:11中)、NLS1 RPS17(例如，包括在SEQ ID NO:15中)、NLS2RPS17(例如，包括在SEQ ID NO:7中)、NLS3 RPS17(例如，包括在SEQ ID NO:8中)、cMyc NLS(例如，包括在SEQ ID NO:12中)、HuR NLS(例如，包括在SEQ ID NO:13中)、Tus NLS(例如，包括在SEQ ID NO:14中)或核质蛋白NLS(例如，包括在SEQ ID NO:16中)。在一些情况下，上述SEQ ID NO包括用于促进与多肽抗原缀合的N端半胱氨酸残基(例如，N端半胱氨酸残基的硫醇基基团)。因此，在一些实施方案中，本文所指的NLS序列可不包括在SEQ ID NO:1至8或10至16中的任一者中包括的N端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，还设想了添加或插入(例如，朝向本文所述的肽的N端至C端部分)以促进类固醇酸-肽与给定多肽抗原缀合的其他官能团(例如，羧基、合成氨基酸等)。例如，肽可包括C端酰胺和/或N端半胱氨酸。在一些实施方案中，肽不包括内体逃逸基序、或蛋白质转导、或细胞穿透基序。
在一些实施方案中，本文所述的NLS可以是PQBP-1NLS(例如，至少包括SEQ ID NO:6的残基3至21)或结合到核输入受体Kapβ2的另一种NLS。在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括基序R-X2-5-PY，其被发现是PQBP-1结合到Kapβ2所必需的(Liu等人，2020)。
在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括内体溶解基序，该内体溶解基序在内化至抗原呈递细胞中后促进抗原的内体逃逸。在一些实施方案中，本文所述的NLS可包括刺激内吞作用和/或内体形成的蛋白质转导结构域，从而促进内化入抗原呈递细胞中。在一些实施方案中，本文所述的NLS可缺少蛋白质转导结构域或细胞穿透肽，这可有利于避免触发与抗原相比更快速的类固醇酸缀合物的内化。
在一些实施方案中，本文所述的肽可包括以非细胞特异性方式刺激内吞作用、内体形成或细胞内递送的蛋白质转导结构域(PTD)。
在一些实施方案中，肽优选为非免疫原性肽，从而有利于针对目标抗原而不是针对类固醇酸-肽缀合物增强子中的肽产生的免疫应答。例如，Azuar等人，2019将胆酸缀合至源自组A链球菌的抗原肽，据报道其自组装成棒状纳米颗粒并且触发针对该抗原肽的更强的体液免疫应答。此类针对本文所述增强子的体液免疫应答是不期望的。
在一些实施方案中，本文所述的肽可具有至少7、8、9、10、11或12个氨基酸的长度，具有不超过50至100个氨基酸的长度，和/或具有10至100个氨基酸之间的长度。在一些实施方案中，本文所述的肽可包括SEQ ID NO:1至8或10至16中任一项的肽或它们的变体，或由它们组成，其：(a)与对应的未缀合的类固醇酸的抗原呈递活性相比，当与类固醇酸缀合时，赋予类固醇酸改善的抗原呈递活性；(b)具有核定位和/或内体溶解活性；(c)与SEQ ID NO:1至8或10至16中任一项的肽的差异不超过1、2、3、4或5个氨基酸取代或缺失；或(d)(a)至(c)的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的增强子包括类固醇酸-肽缀合物，其中类固醇酸缀合到肽：(a)以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1或1:1至10:1的类固醇酸:肽摩尔比；(b)在肽的游离氨基基团和/或游离硫醇基基团(例如，赖氨酸或半胱氨酸的)处；(c)在或朝向肽的N末端(例如，在N端残基的游离氨基基团和/或在N端半胱氨酸残基的硫醇基基团处)；或(d)(a)至(c)的任何组合。在一些实施方案中，本文所述的类固醇酸可在肽内的任何合适的官能团处缀合到肽。
在一些实施方案中，如本文所述的组合物中的增强子与抗原的摩尔比可以是至少0.01:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1；为不超过2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1、250:1、500:1、1000:1和/或在1:1至1000:1；1:1至500:1、1:1至250:1、1:1至200:1之间。
在一些实施方案中，本文所述的抗原可以是或可包括肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段。在一些实施方案中，本文所述的抗原可以是或可包括来自SARS-CoV-2或SARS-CoV的刺突蛋白或它们的抗原性变体或抗原性片段。在一些实施方案中，TAA、TSA和/或新抗原可以是单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(HLA)-体细胞突变来源的抗原或翻译后TSA(Smith等人，2019)。在一些实施方案中，TSA可以是病毒来源的癌抗原，诸如来自人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)。在一些实施方案中，TAA可以是或可包括癌-睾丸抗原、HER2、PSA、TRP-1、TRP-2、EpCAM、GPC3、CEA、MUC1、MAGE-A1、NY-ESO-1、SSX-2、间皮素(MSLN)或EGFR(Patel等人，2017；Tagliamonte等人，2014)。在一些实施方案中，本文所述的抗原可以是或可包括细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质，诸如肿瘤来源的外来体。
在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物相比，如本文所述的增强子可使得抗原的胞质递送增加。在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物相比，如本文所述的增强子可使得抗原的总细胞递送增加。在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物相比，如本文所述的增强子可使得针对抗原的细胞免疫增强。在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物相比，如本文所述的增强子可以使得由暴露于抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ增加。在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物相比，如本文所述的增强子可使得针对抗原的体液免疫增强。在一些实施方案中，与对应缺少增强子的组合物(例如，包括针对弱免疫原性表位的抗体)相比，如本文所述的增强子可使得针对抗原的抗体物质的种类(或生物多样性)增加。
在一些方面中，本文描述了包括细胞群和如本文所述的组合物(例如，包括抗原和抗原呈递的增强子)的细胞培养物。在一些实施方案中，细胞可包括免疫细胞(例如，T细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达MHC I类的细胞、表达MHC II类的细胞或它们的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的组合物还可包括药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如，适用于人或动物使用的疫苗佐剂)。
在一些方面中，本文描述了疫苗，其包括如本文所述的组合物，或包括使用如本文所述的细胞培养物或细胞群生成的细胞。在一些实施方案中，疫苗可以是治疗性或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。在一些实施方案中，与不存在免疫原增强子的情况相比，本文所述的免疫原增强子可使得产生免疫应答所需的配制在免疫原性组合物(例如，疫苗)中的抗原和/或抗原呈递细胞的量减少。
在一些方面中，本文描述了一种用于在受试者中触发针对目标抗原的增强的适应性免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如本文所述的组合物，或使用如本文所述的细胞培养物生成的细胞。
在一些方面中，本文描述了一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的组合物，或使用如本文所述的细胞培养物生成的细胞，其中该抗原包括引起该感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原性片段。
在一些方面中，本文描述了用于在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的组合物或使用如本文所述的细胞培养物产生的细胞，其中抗原在引起癌症的细胞中过度表达或异常表达。
在另一个方面，本文描述了一种用于治疗或预防可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
在一些方面中，本文描述了用于与抗原混合的类固醇酸-肽缀合物。在一些实施方案中，类固醇酸-肽缀合物与抗原的混合物使得：(i)与对应缺少增强子的组合物相比，增加了抗原的胞质递送；(ii)与对应缺少增强子的组合物相比，增加了抗原的总细胞递送；(iii)与对应缺少增强子的组合物相比，增强了针对抗原的细胞免疫；(iv)与对应缺少增强子的组合物相比，增加了由暴露于抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ；(v)与对应缺少增强子的组合物相比，增强了针对抗原的体液免疫；(vi)与对应缺少增强子的组合物相比，增加了针对抗原的抗体物质的种类；或(vii)(i)至(vi)的任何组合。
在一些方面中，本文描述了如本文所述的组合物，或使用如本文所述的培养物生成的细胞群，用于在治疗中使用。
在一些方面中，本文描述了如本文所述的组合物或使用如本文所述的培养物生成的细胞群的用途，用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗)。在一些实施方案中，免疫应答与从对应缺少增强子的组合物或细胞培养物产生的相比可包括针对抗原的细胞免疫增强、由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ增加、针对所述的体液免疫增强或它们的任何组合。
条项
在一些方面中，本文描述了以下条项中的一个或多个：
1.一种组合物，所述组合物包括与抗原呈递的增强子混合的抗原，所述增强子包括类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物，所述类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物的量足以在将所述组合物施用于抗原呈递细胞后改善所述抗原的呈递(与施用不含所述增强子的对应组合物相比)。
2.根据条项1所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是触发神经酰胺在内体的内小叶上积聚的类固醇酸，从而使所述抗原呈递细胞内的内体膜去稳定并且促进所述抗原向胞质溶胶的内体逃逸。
3.根据条项1或2所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂的裂解以形成神经酰胺的类固醇酸。
4.根据条项1至3中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是胆汁酸。
5.根据条项1至4中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是初级胆汁酸或次级胆汁酸。
6.根据条项1至5中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是或包括：(a)胆汁酸，其是：胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺猪脱氧胆酸(THDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、熊胆酸(UCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)；(b)(a)的所述胆汁酸的类似物，所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；和/或具有比胆酸的疏水性更高的疏水性；(c)比胆酸(例如CDCA、DCA、LCA、TCA、TDCA、TCDCA、GCA、GDCA或GCDCA)疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物；或(d)(a)至(c)的任何组合。
7.根据条项1至6中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是或包括：甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或石胆酸(LCA)。
8.根据条项1至7中任一项所述的组合物，其中所述肽包括核定位信号(NLS)。
9.根据条项8所述的组合物，其中所述NLS是经典NLS(例如，包括K-K/R-X-K/R基序)、PY-NLS(例如，包括一个或多个PY基序，诸如朝向所述NLS的C末端，或包括基序R-X2-5-PY和/或具有Kapβ2-结合活性)、PL-NLS(例如，包括一个或多个PL基序，诸如朝向所述NLS的所述C末端)、核糖体NLS、还包括核仁靶向信号的NLS，或它们的任何组合。
10.根据条项8或9所述的组合物，其中所述NLS是或来自SV40 NLS、cMyc NLS、hnRNPA1 M9 NLS、hnRNP D NLS、hnRNP M NLS、PQBP-1NLS、HuR NLS、Tus NLS、核质蛋白NLS、NLS1 RPS17、NLS2 RPS17、NLS3 RPS17或NLS2-RG结构域RSP17。
11.根据条项8至10中任一项所述的组合物，其中所述NLS包括至少三个酸性残基(例如，R/K)和/或至少三个碱性残基(例如，E/D)。
12.根据条项1至11中任一项所述的组合物，其中所述肽包括促进内体逃逸的内体溶解基序。
13.根据条项1至12中任一项所述的组合物，其中所述肽包括刺激内吞作用和/或内体形成的蛋白质转导结构域。
14.根据条项1至12中任一项所述的组合物，其中所述肽缺少蛋白质转导结构域或细胞穿透肽。
15.根据条项1至14中任一项所述的组合物，其中所述肽是非免疫原性肽。
16.根据条项1至15中任一项所述的组合物，其中所述肽具有至少7、8、9、10、11或12个氨基酸的长度，具有不超过50至100个氨基酸的长度，和/或具有10至100个氨基酸之间的长度。
17.根据条项1至16中任一项所述的组合物，其中所述肽包括SEQ ID NO:1至8或10至16中任一项所述的肽或它们的变体，或由它们组成，所述肽：(a)与对应的未缀合的类固醇酸的抗原呈递活性相比，当与所述类固醇酸缀合时，赋予所述类固醇酸改善的抗原呈递活性；(b)具有核定位和/或内体溶解活性；(c)与SEQ ID NO:1至8或10至16中任一项所述的肽的差异不超过1、2、3、4或5个氨基酸取代或缺失；或(d)(a)至(c)的任何组合。
18.根据条项1至17中任一项所述的组合物，其中所述增强子包括类固醇酸-肽缀合物，其中所述类固醇酸缀合到所述肽：(a)以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1或1:1至10:1的类固醇酸:肽摩尔比；(b)在所述肽的游离氨基基团和/或游离硫醇基基团(例如，赖氨酸或半胱氨酸的)处；(c)在或朝向所述肽的N末端(例如，在N端残基的所述游离氨基基团和/或在N端半胱氨酸残基的所述硫醇基基团处)；或(d)(a)至(c)的任何组合。
19.根据条项1至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物中增强子与抗原的所述摩尔比至少为0.01:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1；为不超过2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1、250:1、500:1、1000:1和/或在1:1至1000:1；1:1至500:1、1:1至250:1、1:1至200:1之间。
20.根据条项1至19中任一项所述的组合物，其中所述抗原是包括一个或多个MHCI类表位和/或MHC II类表位的多肽抗原。
21.根据条项20所述的组合物，其中所述多肽抗原是或包括：(a)肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段；或(b)冠状病毒抗原(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白、SARS-CoV刺突蛋白或它们的抗原片段；或癌抗原，诸如单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原，或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(HLA)-体细胞突变来源的抗原或翻译后TSA、病毒来源的癌抗原(例如，来自人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、癌-睾丸抗原、HER2、PSA、TRP-1、TRP-2、EpCAM、GPC3、CEA、MUC1、MAGE-A1、NY-ESO-1、SSX-2、间皮素(MSLN)、EGFR、细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质(例如，肿瘤来源的外来体)。
22.根据条项1至21中任一项所述的组合物，其中所述增强子可使得：(i)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的胞质递送；(ii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的总细胞递送；(iii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的细胞免疫；(iv)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ；(v)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的体液免疫；(vi)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了针对所述抗原的抗体物质的种类；或(vii)(i)至(vi)的任何组合。
23.根据条项1至22中任一项所述的组合物，所述组合物还包括药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
24.一种细胞培养物，所述细胞培养物包括细胞群和根据条项1至23中任一项所述的组合物。
25.根据条项24所述的细胞培养物，其中所述细胞包括免疫细胞(例如，T细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达MHC I类的细胞、表达MHC II类的细胞或它们的任何组合。
26.一种疫苗，所述疫苗包括根据条项1至22中任一项所述的组合物，或包括使用根据条项24或25所述的细胞培养物生成的细胞。
27.根据条项26所述的疫苗，所述疫苗是治疗性疫苗或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。
28.一种用于在受试者中触发针对目标抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项1至23中任一项所述的组合物，或使用根据条项24或25所述的细胞培养物生成的细胞。
29.一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项1至23中任一项所述的组合物或使用根据条项24或25所述的细胞培养物生成的细胞，其中所述抗原包括引起所述感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原片段。
30.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项1至23中任一项所述的组合物或使用根据条项24或25所述的细胞培养物生成的细胞，其中所述抗原在引起所述癌症的细胞中过度表达或异常表达。
31.一种用于与抗原混合的类固醇酸-肽缀合物。
32.根据条项31中所述的使用的类固醇酸-肽缀合物，其中所述类固醇酸缀合物和/或所述抗原根据条项1至22中任一项所述。
33.根据条项1至23中任一项所述的组合物或根据条项24或25所述的细胞培养物的用途，用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗)。
34.根据条项33所述的用途，其中所述免疫应答与从对应缺少所述增强子的组合物或细胞培养物产生的相比可包括针对所述抗原的细胞免疫增强、由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ增加、针对所述的体液免疫增强或它们的任何组合。
35.一种改善多肽抗原免疫原性的方法，所述方法包括将多肽抗原与抗原呈递的增强子混合，所述增强子包括胆汁酸-肽缀合物，所述胆汁酸-肽缀合物的量足以在施用于抗原呈递细胞或受试者后改善所述多肽抗原的呈递(与施用对应缺少所述增强子的组合物相比)，其中所述胆汁酸-肽缀合物中包括的所述肽包括核定位信号(NLS)。
36.根据条项35所述的方法，其中所述胆汁酸是：胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺猪脱氧胆酸(THDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、熊胆酸(UCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)。
37.根据条项35或36所述的方法，其中所述胆汁酸是CA、CDCA、DCA、LCA、GCA、TCA、GDCA、GCDCA、TDCA、GLCA、TLCA、THDCA、TCDCA、UCA、TUDCA、UDCA或GUDCA的类似物，其中所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；或触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺。
38.根据条项35或36所述的方法，其中所述类固醇酸是或包括：甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或石胆酸(LCA)。
39.根据条项35至38中任一项所述的方法，其中所述NLS是：SV40 NLS(SEQ ID NO:1或2)、GWG-SV40NLS(SEQ ID NO:3)、hnRNPA1 M9 NLS(SEQ ID NO:4)、hnRNP D NLS(SEQ IDNO:5)、hnRNP M NLS(SEQ ID NO:10)、PQBP-1NLS(SEQ ID NO:6)、NLS2-RG结构域RPS17(SEQID NO:11)、NLS1 RPS17(SEQ ID NO:15)、NLS2 RPS17(SEQ ID NO:7)、NLS3 RPS17(SEQ IDNO:8)、cMyc NLS(SEQ ID NO:12)、HuR NLS(SEQ ID NO:13)、Tus NLS(SEQ ID NO:14)或核质蛋白NLS(SEQ ID NO:16)。
40.根据条项35至38中任一项所述的方法，其中所述NLS是具有核定位活性的NLS的变体，所述NLS包括SEQ ID NO:1至8或10至16中任一者的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
41.根据条项35至40中任一项所述的方法，其中所述肽是非免疫原性肽。
42.根据条项35至41中任一项所述的方法，其中所述肽具有10至100个氨基酸之间的长度。
43.根据条项35至41中任一项所述的方法，其中所述组合物中增强子与抗原的所述摩尔比在1:1至1000:1之间。
44.根据条项35至41中任一项所述的方法，其中所述组合物中增强子与抗原的所述摩尔比在1:1至500:1之间。
45.根据条项35至41中任一项所述的方法，其中所述组合物中增强子与抗原的所述摩尔比在1:1至250:1之间。
46.根据条项35至45中任一项所述的方法，其中所述抗原是包括一个或多个MHC I类表位和/或MHC II类表位的多肽抗原。
47.根据条项35至46中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括：肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)、源自肿瘤的细胞裂解物、肿瘤来源的外来体、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的其他抗原。
48.根据条项35至47中任一项所述的方法，其中所述多肽抗原是或包括SARS-CoV刺突蛋白或其抗原性片段。
49.根据条项35至48中任一项所述的方法，其中所述增强子可使得：(i)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的胞质递送；(ii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的总细胞递送；(iii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的细胞免疫；(iv)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ；(v)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的体液免疫；(vi)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了针对所述抗原的抗体物质的种类；或(vii)(i)至(vi)的任何组合。
50.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括：根据条项35所述的所述多肽抗原和抗原呈递的增强子，或包括根据条项1所述的所述多肽抗原和抗原呈递的增强子的细胞群；和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
51.根据条项50所述的免疫原性组合物，其中所述细胞群包括树突细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞、表达MHC I类的细胞、表达MHC II类的细胞或它们的任何组合。
52.一种用于在受试者中触发针对目标抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据条项50或51所述的免疫原性组合物。
实施例
实施例1：一般材料和方法
胆汁酸-NLS部分的产生
胆汁酸-NLS部分的合成类似于胆酸-NLS(ChAcNLS)的合成，如先前在Beaudolin等人，2016中所述。例如，对于CA-SV40NLS，将胆酸与13-mer肽(CGYGPKKKRKVGG；SEQ ID NO:1)的N端半胱氨酸残基的游离氨基基团缀合，该肽包括来自侧接有连接子氨基酸的SV40大T抗原(SEQ ID NO:2)的核定位信号。
骨髓来源的树突细胞的产生
通过使用补充有10％胎牛血清(FBS)、50U/mL青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1％MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、0.5mMβ-巯基乙醇的RPMITM1640冲洗来自小鼠股骨的整个骨髓来产生小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)。在红细胞裂解后，然后在补充有50ng/mL鼠重组GM-CSF的培养基中培养细胞。在第2、4、6和8天更换培养基。在第9天，将培养基替换为包括重组鼠GM-CSF和来自大肠杆菌O111的LPS(1ng/mL)以刺激树突细胞(DC)成熟。通过流式细胞术评估成熟DC的CD3、CD19、NK1.1、CD11c、CD80、CD86和I-Ab的表面表达。
抗原交叉呈递测定
为了评价抗原交叉呈递，将细胞以25×103个细胞/孔接种在24孔板(Corning；Massachusetts，United States)，然后用不同浓度的抗原或含抗原的混合物脉冲处理持续3小时。在脉冲期结束时，洗涤细胞以去除过量的抗原并使用T细胞分离试剂盒根据制造商的方案与从OT-I小鼠的脾脏纯化的106/mL CD8 T细胞共培养。72小时后，收集上清液并用于通过商业酶联免疫吸附测定(ELISA)定量细胞因子的产生。
使用B3Z报告系统的抗原呈递测定
使用B3Z报告系统筛选各种胆汁酸-NLS缀合物。B3Z细胞系是对H2-Kb-SIINFEKL复合物具有特异性的T-细胞杂交瘤。一旦经由其TCR活化，LacZ报告基因(在NFAT启动子控制下)就表达。简言之，将1.5×105个BMDC或2.5×105个MSC与经卵白蛋白(OVA)和胆汁酸-NLS缀合物的混合条件处理的5×104个B3Z细胞在37℃、5％CO2下共培养过夜。第二天，用PBS(pH7.4)洗涤所有细胞两次，并通过添加100μL在PBS中含有0.15mM氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)底物(Calbiochem,La Jolla,CA)、0.125％NP40(EMD Sciences,La Jolla,CA)、9mMMgCl2(Aldrich,USA)和100mM 2-巯基乙醇的裂解缓冲液来裂解细胞沉淀。在37℃下孵育5或24小时后，在570nm处获取吸光度，使用636nm作为参考波长。对于这些实验，将OVA以5mg/mL至10mg/mL重悬浮于PBS(pH 7.3)中。将不同的胆汁酸-NLS缀合物以10mg/mL重悬浮于H2O中。根据表2以不同摩尔比制备胆汁酸-NLS缀合物:抗原混合物。
表2：胆汁酸-NLS缀合物:OVA的摩尔比
实施例2：胆酸和胆酸-SV40NLS增强OVA抗原的交叉呈递/免疫原性
进行了交叉呈递测定以筛选在与抗原非共价混合后可改善交叉呈递和/或免疫原性的试剂。小鼠BMDC用单独的抗原或以不同比例与候选免疫原增强子混合的抗原进行预脉冲处理。然后将脉冲处理的BMDC与源自OT-I小鼠脾脏的CD8 T细胞共培养，并且将由CD8 T细胞生成的IFN-γ的量定量作为交叉呈递活性的量度。初步筛选将胆酸和胆酸-NLS肽缀合物鉴定为潜在的免疫原增强子。图1示出交叉呈递测定的结果，其中BMDC用单独的抗原卵白蛋白(“单独的OVA”)、单独的胆酸(“单独的CA”)、单独的胆酸-NLS肽缀合物(“单独的CA-SV40NLS”)、或不同比例的胆酸:抗原混合物(“CA:OVA”)或胆酸-NLS肽缀合物:抗原混合物(“CA-SV40NLS:OVA”)进行预脉冲处理。有趣的是，与用单独的OVA抗原进行预脉冲处理的BMDC相比，用所测试的最高比例的胆酸:抗原混合物(CA:OVA)预脉冲处理的BMDC导致生成的IFN-γ的量增加至多3倍。引人注目的是，与用单独的OVA抗原进行预脉冲处理的BMDC相比，用所测试的最高比例的胆酸-NLS肽缀合物:抗原混合物(CA-SV40NLS:OVA)预脉冲处理的BMDC导致生成的IFN-γ的量增加6至7倍。
实施例3：在与不同胆汁酸缀合的SV40NLS的存在下增强抗原呈递
合成了CA-SV40NLS的变体以便探索与针对该缀合物观察到的抗原交叉呈递增强活性相关的结构-活性关系。更具体地，合成了具有与SV40NLS肽(SEQ ID NO:1)缀合的不同胆汁酸的缀合物，并且如实施例1中所述通过使用具有OVA抗原的B3Z报告系统来评价它们对抗原呈递的影响。图2中的结果显示，与单独的OVA抗原(“单独的OVA”，虚线)相比，当OVA与CA--SV40NLS缀合物混合时，观察到增加的抗原交叉呈递。这些结果与使用基于OT-I CD8T细胞的测定(图1)观察到的那些一致。有趣的是，当胆酸被胆汁酸:甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或石胆酸(LCA)替代时，观察到与CA-SV40NLS相当或更高的抗原交叉呈递。在图2中，当OVA与未缀合的胆酸(“CA”)或SV40NLS肽(“SV40NLS”)混合时，与单独的抗原(“OVA”)相比，没有观察到抗原交叉呈递的增加，尽管与图1中使用的基于OT-I CD8 T细胞的测定相比，B3Z报告系统的较低灵敏度可能是一个因素。有趣的是，使用相同B3Z报告系统的后续测定显示，当OVA与未缀合的甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA；22:1)混合时，B3Z应答(OD570)比单独的OVA增加至多约30％(数据未示出)。此外，在所测试的所有GUDCA:OVA摩尔比(即，2:1、4:1、8:1、12:1和22:1)处观察到GUDCA的免疫原增强子活性。
实施例4：在与不同胆汁酸缀合的SV40NLS的存在下增强抗原呈递
合成了CA-SV40NLS的其他变体，其中SV40NLS肽被包括其他NLS的肽替代(表3)，并且使用如实施例1中所述的B3Z报告系统来评价CA-NLS肽缀合物的抗原呈递活性。针对每种缀合物测试了以下缀合物:抗原摩尔比：2:1、4:1、8:1、12:1和22:1。图3至图6中的结果比较了不同缀合物(以对于该缀合物产生最高B3Z应答(OD570)的缀合物:抗原比例)的抗原呈递活性。
表3：在图3至图8D中表征的NLS肽
图3至图6中的结果通常显示，通过在与包括不同类型的核定位信号并且具有不同氨基酸序列的肽缀合的胆酸的存在下，将抗原呈递细胞暴露于抗原，可获得增加的抗原呈递。
使用BMDC作为抗原呈递细胞，富含谷氨酸的肽PQBP-1NLS与显著高的抗原呈递活性(图3和图5)相关联。此外，NLS2-RG结构域RPS17、NLS3-RPS17、cMyc NLS和HuR NLS肽也与高抗原呈递活性相关联。有趣的是，肽GWG-SV40NLS与比SV40NLS更高的抗原呈递活性相关联，提示添加侧翼芳香族氨基酸(WW或GWWG)对于活性是有益的(见图3至图5)。使用DC细胞系(DC2.4)作为抗原呈递细胞观察到类似的结果。
使用MSC的交叉呈递细胞系作为抗原呈递细胞，各种胆酸肽缀合物增强了OVA的抗原呈递(图6)。与BMDC类似，与单独的OVA或与CA-SV40NLS混合的OVA相比，PQBP-1NLS、HuRNLS和GWG-SV40NLS与显著高的抗原呈递活性相关联。
为了进一步详细分析胆汁酸肽缀合物对抗原呈递的影响，评价了抗原内化和处理。在各种摩尔比的不同胆汁酸肽缀合物NLS1-RPS17[图7A]；NLS3 RPS17[图7B]；PQBP-1[图7C]；和hnRNPA1 M9 NLS[图7D])的存在下，用AF647标记的OVA对MSC细胞系进行脉冲处理，通过流式细胞术评估荧光。胆汁酸缀合物显示会增强OVA内化，通常具有增加的比例。通过在与图7A至图7D中相同的胆汁酸肽缀合物的存在下用DQTM-卵白蛋白(OVA-DQ)脉冲处理MSC细胞系来评估OVA处理。胆汁酸缀合物NLS1-RPS17[图8A]；NLS3 RPS17[图8B]；PQBP-1[图8C]；和hnRNPA1 M9 NLS[图8D]显示会增强OVA处理，通常具有增加的比例。
总之，这些数据证明了胆汁酸肽缀合物在增强抗原呈递方面的多功能性和能力。
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<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> NLS3 RPS17
<400> 8
Ser Lys Lys Leu Arg Asn Lys Ile Ala Gly Tyr Val Thr His Leu Met
1 5 10 15
Lys Arg Ile
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> SIINFEKL肽
<400> 9
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> hnRNP M NLS
<400> 10
Cys Asn Glu Lys Arg Lys Glu Lys Asn Ile Lys Arg Gly Gly Asn Arg
1 5 10 15
Phe Glu Pro Tyr
20
<210> 11
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> NLS2-RG结构域RPS17
<400> 11
Cys Asn Lys Arg Val Cys Glu Glu Ile Ala Ile Ile Pro Ser Lys Lys
1 5 10 15
Leu Arg Asn Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gln Arg Gly Pro Val Arg Gly
20 25 30
Ile Ser
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> cMyc NLS
<400> 12
Cys Gly Tyr Gly Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Gly Gly
1 5 10 15
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> HuR NLS
<400> 13
Cys Gly Arg Phe Ser Pro Met Gly Val Asp His Met Ser Gly Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Asn Val Pro Gly
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> Tus NLS
<400> 14
Cys Gly Tyr Gly Lys Leu Lys Ile Lys Arg Pro Val Lys Gly Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> NLS1 RPS17
<400> 15
Cys Met Gly Arg Val Arg Thr Lys Thr Val Lys Lys Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 核质蛋白NLS
<400> 16
Cys Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Leu Asp
20
Claims (34)
1.一种组合物，所述组合物包括与抗原呈递的增强子混合的抗原，所述增强子包括类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物，与施用不含所述增强子的对应组合物相比，所述类固醇酸和/或类固醇酸-肽缀合物的量足以在将所述组合物施用于抗原呈递细胞后改善所述抗原的呈递。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是触发神经酰胺在内体的内小叶上积聚的类固醇酸，从而使所述抗原呈递细胞内的内体膜去稳定并且促进所述抗原向胞质溶胶的内体逃逸。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂的裂解以形成神经酰胺的类固醇酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是胆汁酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是初级胆汁酸或次级胆汁酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是或包括：
(a)胆汁酸，所述胆汁酸为：胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺猪脱氧胆酸(THDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、熊胆酸(UCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)；
(b)(a)的所述胆汁酸的类似物，所述类似物：诱导内吞作用；触发神经酰胺在所述内体的内小叶上的积聚；触发增加的酸性鞘磷脂酶(ASM)介导的鞘磷脂裂解形成神经酰胺；和/或具有比胆酸的疏水性更高的疏水性；
(c)比胆酸(例如CDCA、DCA、LCA、TCA、TDCA、TCDCA、GCA、GDCA或GCDCA)疏水性更高的胆汁酸或胆汁酸类似物；或者
(d)(a)至(c)的任何组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述增强子中或所述类固醇酸-肽缀合物中的所述类固醇酸是或包括：甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)或石胆酸(LCA)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述肽包括核定位信号(NLS)。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述NLS是经典NLS(例如，包括K-K/R-X-K/R基序)、PY-NLS(例如，包括一个或多个PY基序，诸如朝向所述NLS的C末端，或包括基序R-X2-5-PY和/或具有Kapβ2-结合活性)、PL-NLS(例如，包括一个或多个PL基序，诸如朝向所述NLS的所述C末端)、核糖体NLS、还包括核仁靶向信号的NLS，或它们的任何组合。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述NLS是或来自SV40NLS、cMyc NLS、hnRNPA1 M9 NLS、hnRNP D NLS、hnRNP M NLS、PQBP-1NLS、HuR NLS、Tus NLS、核质蛋白NLS、NLS1RPS17、NLS2 RPS17、NLS3 RPS17或NLS2-RG结构域RSP17。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组合物，其中所述NLS包括至少三个酸性残基(例如，R/K)和/或至少三个碱性残基(例如，E/D)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述肽包括促进内体逃逸的内体溶解基序。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述肽包括刺激内吞作用和/或内体形成的蛋白质转导结构域。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述肽缺少蛋白质转导结构域或细胞穿透肽。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述肽是非免疫原性肽。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述肽具有至少7、8、9、10、11或12个氨基酸的长度，具有不超过50至100个氨基酸的长度，和/或具有10至100个氨基酸之间的长度。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述肽包括SEQID NO:1至8或10至16中任一项所述的肽或它们的变体，或由它们组成，所述肽：
(a)与对应的未缀合的类固醇酸的抗原呈递活性相比，当与所述类固醇酸缀合时，赋予所述类固醇酸改善的抗原呈递活性；
(b)具有核定位和/或内体溶解活性；
(c)与SEQ ID NO:1至8或10至16中任一项所述的肽的差异不超过1、2、3、4或5个氨基酸取代或缺失；或者
(d)(a)至(c)的任何组合。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述增强子包括类固醇酸-肽缀合物，其中所述类固醇酸缀合到所述肽：
(a)以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1或1:1至10:1的类固醇酸:肽摩尔比；
(b)在所述肽的游离氨基基团和/或游离硫醇基基团(例如，赖氨酸或半胱氨酸的)处；
(c)在或朝向所述肽的N末端(例如，在N端残基的所述游离氨基基团和/或在N端半胱氨酸残基的所述硫醇基团处)；或者
(d)(a)至(c)的任何组合。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物中增强子与抗原的所述摩尔比至少为0.01:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1；为不超过2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1、250:1、500:1、1000:1和/或在1:1至1000:1；1:1至500:1、1:1至250:1、1:1至200:1之间。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述抗原是包括一个或多个MHCI类表位和/或MHC II类表位的多肽抗原。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述多肽抗原是或包括：
(a)肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)、新抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、与可通过疫苗接种和/或免疫疗法治疗的疾病或病症相关的抗原；或它们的任何抗原性片段；或者
(b)冠状病毒抗原(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白、SARS-CoV刺突蛋白或它们的抗原片段；或癌抗原，诸如单核苷酸变体抗原、突变移码抗原、剪接变体抗原、基因融合抗原、内源性逆转录元件抗原，或另一类抗原，诸如人白细胞抗原(HLA)-体细胞突变来源的抗原或翻译后TSA、病毒来源的癌抗原(例如，来自人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、癌-睾丸抗原、HER2、PSA、TRP-1、TRP-2、EpCAM、GPC3、CEA、MUC1、MAGE-A1、NY-ESO-1、SSX-2、间皮素(MSLN)、EGFR、细胞裂解物或源自肿瘤的其他物质(例如，肿瘤来源的外来体)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述增强子使得：
(i)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的胞质递送；
(ii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了所述抗原的总细胞递送；
(iii)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的细胞免疫；
(iv)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ；
(v)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增强了针对所述抗原的体液免疫；
(vi)与对应缺少所述增强子的组合物相比，增加了针对所述抗原的抗体物质的种类；或者
(vii)(i)至(vi)的任何组合。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，所述组合物还包括药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
24.一种细胞培养物，所述细胞培养物包括细胞群和根据权利要求1至23中任一项所述的组合物。
25.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述细胞包括免疫细胞(例如，T细胞)、抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、工程化抗原呈递细胞)、表达MHCI类的细胞、表达MHCII类的细胞或它们的任何组合。
26.一种疫苗，所述疫苗包括根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，或包括使用根据权利要求24或25所述的细胞培养物生成的细胞。
27.根据权利要求26所述的疫苗，所述疫苗是治疗性疫苗或预防性疫苗(例如，抗癌疫苗、抗病毒疫苗或抗细菌疫苗)。
28.一种用于在受试者中触发针对目标抗原的增强的适应性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，或使用根据权利要求24或25所述的细胞培养物生成的细胞。
29.一种用于针对感染性疾病对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至23中任一项所述的组合物或使用根据权利要求24或25所述的细胞培养物生成的细胞，其中所述抗原包括引起所述感染性疾病的病原体(例如，病毒、细菌、真菌)的抗原片段。
30.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至23中任一项所述的组合物或使用根据权利要求24或25所述的细胞培养物生成的细胞，其中所述抗原在引起所述癌症的细胞中过度表达或异常表达。
31.一种用于与抗原混合的类固醇酸-肽缀合物。
32.根据权利要求31中所述的使用的类固醇酸-肽缀合物，其中所述类固醇酸缀合物和/或所述抗原根据权利要求1至22中任一项所述。
33.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物或根据权利要求24或25所述的细胞培养物的用途，用于在受试者中产生免疫应答或用于制造用于在受试者中产生免疫应答的药物(例如，疫苗)。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述免疫应答与从对应缺少所述增强子的组合物或细胞培养物产生的相比，包括针对所述抗原的细胞免疫增强、由暴露于所述抗原时CD8+T细胞生成的IFN-γ增加、针对所述的体液免疫增强或它们的任何组合。
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