JP2023548608A

JP2023548608A - 海藻ナンノクロロプシスの変異株およびその生産方法、アスタキサンチンおよびオメガ－３の生産におけるその使用および関連組成物

Info

Publication number: JP2023548608A
Application number: JP2023527706A
Authority: JP
Inventors: バッロッターリ，マッテオ; チェッキン，ミケーラ; カッツァーニーガ，ステファノ; パルトリニエリ，ステファニア
Original assignee: ウニヴェルシタデッリストゥディディヴェローナ
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-11-17
Also published as: CL2023001249A1; CN116710548A; EP4237539A1; IL302576A; WO2022090986A1; CA3199961A1; US20230407237A1

Abstract

本発明は、海藻ナンノクロロプシスの変異株、それを得る方法、およびその生産物の使用に関する。【選択図】なし

Description

微細藻類は、バイオマス、高エネルギーおよび／または高価値の製品を生産するために成長させることができる光合成独立栄養因子である。

これらの生物の中には、実際に、食品添加物またはバイオ燃料の生産に使用および／または使用可能なカロテノイドおよび／または脂質などを大量に生産および蓄積してもよいものもある。

微細藻類によって生産される主な高価値製品の中で、アスタキサンチン（ＡＳＸ）およびオメガ－３（ＥＰＡ）と呼ばれる製品が特に注目されている。

アスタキサンチンは、様々な操作された微細藻類および／または微生物、例えば細菌や酵母によって生産される商業的に価値のあるカロテノイドである。

カロテノイドは、微細藻類および植物に由来する多くの保護機構に関与する生物学的化合物であり、特にフリーラジカルの有害な影響を避けるために不可欠な顕著な抗酸化活性を有するため、ヒトの健康に役立つ。

カロテノイドが豊富な食事は、がん、心血管疾患、および関節炎などのいくつかの病気を予防し、エイズ、糖尿病、黄斑変性症、および神経変性症の患者の健康を改善してもよい。

その特性により、近年、それらは莫大な商業的価値を獲得している。最も価値のあるものは３－カロテンおよびアスタキサンチンで、現在のカロテノイド市場の半分以上をカバーしている。

アスタキサンチンは、例えばビタミンＥおよび３－カロテンよりもそれぞれ４４％～６００％高いなど、最も高い抗酸化能力を示し、完全に安全であることが示されているが、３－カロテンは長期にわたる／過剰な摂取により発がん性があると記載されている。

このため、アスタキサンチンは、食品および／または飼料サプリメント、化粧品、または予防療法における医薬品と直接組み合わせるなどの商業用途の最良の候補となる。

アスタキサンチンは、主に栄養補助食品および水産養殖における色素沈着剤として使用されるカロテノイドである。

合成アスタキサンチン（市場の９５％を占める）は石油化学原料から生産されるが、潜在的な毒性や汚染の問題が生じ、環境の持続可能性への疑問が生じている。

これらの問題により、微細藻類（例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）および／またはクロレラ・ゾフィンゲンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｚｏｆｉｎｇｅｎｓｉｓ））からのアスタキサンチンの生産に当業者の研究努力がますます向けられているが、現在のアプローチには依然として重大な欠点がある。

Ｈ．プルビアリスの培養によって高レベルの蓄積が達成されるにもかかわらず、得られるアスタキサンチンは、この分子の生産、抽出、および精製中に発生するコストが高いため不利である。実際、Ｈ．プルビアリスからのアスタキサンチンの生産には、現在２段階の培養システムが必要である：第１段階では、いわゆる「グリーン」バイオマスが生産され、第２段階では、例えば高光強度、栄養素の枯渇、および当技術分野で一般に知られている他のストレス条件による、細胞培養にストレスを与えることによってアスタキサンチンの生合成が誘導される。

さらに、この微細藻類種の細胞壁は三層シートで構成されており、その分解には複雑で高価な破壊方法が必要である。

最近の大規模研究では、これらの生産コストは最良の場合で１ｋｇあたり約１，５００ユーロになると計算されている。さらに、硬い細胞壁の存在は、回収された生理活性化合物の収量、品質、バイオアベイラビリティに悪影響を及ぼす。

したがって、市場に出ているアスタキサンチンのほとんどが、１ｋｇあたり約８８０ユーロのコストで合成的に生産されているのに対し、Ｈ．プルビアリス由来のアスタキサンチンは販売量のわずか１％未満に相当することは驚くべきことではない。

一方、合成アスタキサンチンは、天然アスタキサンチンよりも抗酸化特性がはるかに劣っており（たとえば、天然アスタキサンチンはフリーラジカルの除去において２０倍強力である）、ＦＤＡ（食品医薬品局、ＵＳＡ）によってヒトの摂取が承認されていない。

別の生産方法では、異なる微細藻類種から始めることでこれらの制限を克服しようと試みられているが、商業的に実行可能なシステムはまだ実装されていない。

Ｈ．プルビアリスに加えて、Ｃ．ゾフィンゲンシスおよびＣ．ニヴァリス（ｎｉｖａｌｉｓ）など、いくつかの藻類種が検出可能なレベルでアスタキサンチンを生産してもよい；しかしながら、アスタキサンチン蓄積のためのこれらの藻類株の工業規模の培養は、所望の物質を高価で有害な抽出方法を必要とする生産収率が低いことと堅牢な細胞壁の存在の両方により持続可能ではない。

オメガ－３（ω－３）は長鎖脂肪酸であり、脊椎動物にとって必須の栄養素である。

ヒトでは、それらは細胞膜、脳機能、および神経インパルス伝達を正常な状態で維持するのに役立つ。

オメガ－３は、血漿への酸素輸送、ヘモグロビン合成、および細胞分裂のプロセスでも重要な役割を果たす。

これらはまた、変性脳疾患を予防するだけでなく、集中力、記憶力、モチベーション、および運動能力を改善することにより、心血管疾患の予防および／または処置および神経学的処置にも適応される。

妊娠中は、産後うつ病および気分変動のリスクが軽減される。

オメガ－３は主に海洋微細藻類から生産されるが、現在の生産方法は生産コストが低いため、魚油またはオキアミ油からの抽出に依存している。

ナンノクロロプシス属に属する藻類種は、開放ポンドと閉鎖システムの両方での大規模培養に最も興味深い単細胞海洋微細藻類の一つと考えられており(Hibberd, 1981)、その高い成長率(Sforza et al., 2010)、高い脂質蓄積（総乾燥重量の最大６５～７０％）、およびさまざまな種類の放射線照射に適応する能力（Boussiba et al., 1987, Hodgson et al., 1991, Rodolfi et al., 2008)によりバイオディーゼル生産の良い候補と考えられてもよい。

さらに、ナンノクロロプシスに含まれる脂肪酸は、３５％が多価不飽和脂肪酸（いわゆるＰＵＦＡ、具体的にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω３））で構成されており、ヒトの健康にとって栄養価の高い化合物である(Gill および Valivety 1997)。

これらの理由から、ナンノクロロプシス属はヒトの使用のためのＥＰＡ生産プラットフォームとして産業的に有望な候補である。

しかしながら、ＥＰＡの生産のためのその使用、特にナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｇａｄｉｔａｎａ）種の使用は、微細藻類の培養に伴うコストが高いため、工業的に利用することができない。

天然アスタキサンチン（野生型、Ｗ．Ｔ．）の主な供給源は、甲殻類、酵母、細菌、および微細藻類である。

甲殻類は、かなりの量のアスタキサンチン（ＡＳＸ）、カロテノイド、長鎖脂肪酸、およびいくつかの価値の高い栄養素を含有する。

ＡＳＸはこれらの原料から化学抽出により得られる。

原料種の栽培、収穫、加工、保管、流通、および消費の際に使用されるプロセス関連の試薬や添加物は、健康リスクまたはアレルギーの問題を引き起こしてもよい。

残念なことに、甲殻類がさまざまな生息地にさらされると、寄生虫、生物毒素、細菌、重金属の存在が伴ってもよい。さらに、甲殻類に含まれるアスタキサンチンの含有量は、他の天然源に比べて低い。

したがって、さまざまな理由により、異なる生産方法が好まれる。

例えば、ファフィア・ロドザイマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ）などの酵母は、生物学的発酵によってアスタキサンチンを生産してもよい。

ファフィア・ロドザイマは、生産プロセスの収量が高いため、現在最も広く使用されている酵母種である。

収量は他の酵母より高くてもよいが、他の微生物より低くてもよい。

アスタキサンチン生産にファフィア・ロドザイマを使用する主な理由は、この微生物の急速な増殖および酵母細胞の破壊の容易さによって提供され、標的分子への容易なアクセスおよび効率的な単離が可能になる。

この微生物を使用することの相対的な欠点は、微生物中の天然に存在する分子の濃度がいずれにせよ非常に低いことである。

商業規模での生産は、元の種の遺伝子変異によって行われるが、得られた製品をヒトの食物連鎖に導入するには安全性および規制の問題が生じる。

したがって、この製品は動物用飼料サプリメントとしてのみ使用される。

アスタキサンチンは、例えば、パラコッカス種、アグロバクテリウム種、スフィンゴモナス種、シュードモナス種などのいくつかの細菌によっても生産されてもよい。

パラコッカス・カロティニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）は、カロテノイドが豊富な細菌であるため、最も研究され使用されている種の１つである。

全体として、それはカロテノイドの豊富な混合物を含有し、その中でＡＳＸが重量で大幅に優勢である（２．２％）。

ファフィア・ロドザイマと同様に、生産の増強は突然変異誘発および遺伝子工学によって達成される。

この細菌は主に動物の飼料に使用されており、ヒトが直接消費することは承認されていない。

自然界に存在する２００，０００～８００，０００種の藻類のうち、藻類誘導体を栄養補助食品成分として市場に出すには厳しい要件があるため、食品用途に使用される藻類はほんのわずかである。

ヘマトコッカス・プルビアリス（ヘマトコッカス・ラクストリス（ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）としても既知である）は、生産される乾燥バイオマス（約１．５から最大５重量％（ｗ／ｗ））に対してアスタキサンチンを生産および蓄積する高い自然能力を特徴とするため、ＡＳＸの生産に最も広く使用されている藻類である。

１９９１年に、Ｈ．プルビアリスは食品医薬品局（ＦＤＡ）によってＧＲＡＳ（つまり、一般に安全と認められる）ステータスを付与された。

２０１７年には、ヨーロッパでも（特定の１日摂取量で）ヒトが消費しても安全であると宣言された。

Ｈ．プルビアリスから得られるアスタキサンチンの構造は、サケおよび他の水生生物から得られるものと非常に似ているため、人体への吸収性が高くなる。

現在、Ｈ．プルビアリスからのアスタキサンチンの工業生産は、第１段階、いわゆる「グリーンステージ」からなる２つのステージのバッチ法によって達成されている。この段階は、通常９～２０日間続き、アスタキサンチンの成長期間に相当する。第２段階、いわゆる「レッドステージ」は通常６日間継続され、その間に藻類細胞は防御機構としてのアスタキサンチンの蓄積を引き起こすストレス条件にさらされる。

Ｈ．プルビアリスからのアスタキサンチンの生産性は、約１０日の合計サイクル（「グリーンステージ」段階で約４日、「レッドステージ」段階で約６日）で重量パーセント濃度（ｗ／ｗ）約４％で８～１０ｍｇ／Ｌ／日に達してもよい。

「レッドステージ」の欠点は、ストレス因子が細胞死を引き起こす可能性があり、プロセス全体の収率が実質的に低下してもよいことである。さらに、この方法は適切な照明を提供するために大量の電力を消費するため、生産コストが高くなる。

さらに、「レッドステージ」では機械的および化学的に耐性のある細胞壁も生産されるため、目的の生産物の抽出には複雑で高価な手順が必要になる。

最近、３ステージまたは単一ステージの生産プロセスを実現する代替方法が提案されている。

単一ステージ生産は、「グリーン」成長段階および「レッド」蓄積段階を１つの操作に組み合わせることで実現される。全体として、このタイプのプロセスはコストの削減を含め、プラントの運用を簡素化する。

しかしながら、一般的に２ステージバッチ法よりも生産性が低くなる。さらに、総プロセス期間は約８～１１日である。

現在、効率的な生産、短い生産サイクル、高いプロセス収率、およびヒトの栄養に関する規制当局の要件への準拠を達成しながら、天然アスタキサンチンの生産を可能にする製剤はほとんどない。

一方、オメガ－３の現在の主な供給源は、水産養殖部門からの海に由来する魚油および魚粉である。

オメガ－３が豊富な油の消費量の増加により、産業が依然として主な供給源として魚に依存しているため、その生産不足が増大している。

魚資源の枯渇を引き起こす乱獲や重金属汚染も、この生産方法の重要性をますます高める重要な要因となっている。

油の不快な味および匂い、および安定性の問題により、生産コストが高くなり、この製品の市場が制限される。

問題は、催奇形性、変異原性、および発がん性物質だけでなく、抗生物質および重金属などの非発がん性物質などの有害な汚染物質が存在する可能性からも生じる。さらに、養殖魚に含まれるオメガ－３の含有量は、基本的に、さまざまな種が食事で摂取する量に依存する。

養殖魚のオメガ－３含有量を高めるために、海産魚油および魚粉が飼料に含まれている。したがって、逆説的であるが、水産養殖部門はオメガ－３脂肪酸の主要な供給者であると同時に、主要な使用者でもある。

この事実は持続不可能なビジネスを生み出し、最終的には多くの倫理的な問題も引き起こす。

業界の専門家は、２０２０年以降、オメガ－３とアスタキサンチンの両方が主に微細藻類から生産されてもよいと予想しているが、市場の潜在力が大きく、天然に生産された高価値の食品成分に対する需要が高まっているにもかかわらず、微細藻類が経済的に実行可能な生産代替物になるにはまだ程遠い。

本特許出願の発明者らは、工業的観点から非常に有利なプロセスに従って、同時に大量のアスタキサンチンおよびオメガ－３を生産できるナンノクロロプシス・ガディタナの変異株を予想外に同定した。

図１は、本発明のＡＳＴＡＯＭＥＧＡ（以前のナンノクロロプシス・ガディタナＤ２３）変異株のＣＣＡＰ－ＳＡＭＳ国際寄託機関への寄託証明書のコピーを示す。

図２は、本発明のＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異株の同定された変異のリストを示す。

本発明の主題
第１の主題では、本発明は、海藻ナンノクロロプシスの変異株について記載する。

第２の主題では、本発明はそれを得る方法を説明する。

第３の主題では、本発明は、前記変異株の使用を含む、アスタキサンチン、ケトカロテノイド、およびオメガ－３（ＥＰＡ）の生産方法を記載する。

第４の主題では、本発明は、変異株により生産される化合物を含む食品および栄養補助食品組成物を記載する。

他の主題において、本発明は、食品サプリメントおよび栄養補助食品産業、製薬産業および／または化粧品産業、および水産養殖産業における使用のための、変異株から生産される化合物の使用について記載する。

発明の詳細な説明
第１の主題によれば、本発明は、海藻ナンノクロロプシスの変異株について記載する。

このＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異株は、ヴェローナ大学バイオテクノロジー学部で、マッテオ・バロッターリ教授率いるグループによって作成され、選択された。

前記株は、２０１６年１月２８日にＣＣＡＰ－ＳＡＭＳ国際寄託機関（CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA (CCAP) - SAMS Limited Scottish Marine 18 Institute, OBAN, Argyll, PA37 1QA, UK）に寄託され、ＣＣＡＰアクセス番号８４９／１６下に登録されている（ナンノクロロプシス・ガディタナＤ２３と示された名前は、最初に著者によってこの株に割り当てられた識別略語であり、後にこの説明で便宜上使用されているように、著者によってＡＳＴＡＯＭＥＧＡに変更された）。

第２の主題によれば、本発明は、前述の変異株を得る方法を記載する。

特に、この方法は、Cecchin ら 2020 （参照としてその全体が本明細書に組み込まれるImproved lipid productivity in Nannochloropsis gaditana in nitrogen-replete conditions by selection of pale green mutants, Cecchin M, Berteotti S, Paltrinieri S, Vigliante I, Iadarola B, Giovannone B, Maffei ME, Delledonne M, Ballottari M. Biotechnol Biofuels. 2020 Apr 21;13:78. doi: 10.1186/s13068-020-01718-8. eCollection 2020）に記載される手順に従って、Ｎ．ガディタナＷ．Ｔ．（ＣＣＡＰ－ＳＡＭＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した株、アクセス番号ＣＣＡＰ８４９／５）をＥＭＳ（メタンスルホン酸エチルまたはメシル酸エチル；Merck Index、第11版、3782）により代表される突然変異誘発剤に曝露することによって実行される無作為化学突然変異誘発の工程を含む。

具体的には、ＥＭＳ化合物を、最終重量／体積パーセンテージ０．７５％、１．５％、２％、および２．５％で１０^８細胞／ｍＬまで添加した。

試料を暗所で２時間インキュベートし、その後１０％チオ硫酸ナトリウム溶液で希釈して変異原活性を不活性化した。

次いで細胞を６０００ｇで遠心分離し、１ＭＮａＣｌで２回洗浄し、５００μｌのｆ／２成長培地（市販）に溶解し、低光条件下で一晩維持した。

次いで、細胞を固形ｆ／２培地に播種し、低照度条件（５０μｍｏｌｍ^－２ｓ^－１）下で少なくとも２週間維持した。

（変異原に曝露していない試料のプレート上のコロニー数と比較したＥＭＳ処理細胞のプレート上のコロニー数として決定する）９５％の死亡率を誘導する濃度のＥＭＳで処理した細胞を、その後のスクリーニング手順に使用した。

この濃度は２％ＥＭＳであることがわかった。

ＥＭＳ処理により、初期のＮ．ガディタナＷ．Ｔ．のゲノムに変異が生産され、変異体のライブラリーが作成された。

プレート上の単一コロニーから得られたさまざまな株を、さまざまな色素組成に従って分類および選択した。

具体的には、異なるカロテノイド／クロロフィル比を有する株が選択され、抽出された総色素の５００／６８０ｎｍ吸収比に基づいてさらに特徴付けられた。

ＡＳＴＡＯＭＥＧＡＣＣＡＰ８４９／１６変異体（以前のナンノクロロプシス・ガディタナＤ２３）は、その後ＨＰＬＣによって検証されたように、アスタキサンチンが乾燥重量の最大1%蓄積されており、カロテノイド／クロロフィル比が高いため、５００／６８０ｎｍ比が高いことで特に注目に値する。

本発明の特定の態様によれば、カロテノイド／クロロフィル比は、野生型株と比較して最大１５０％増加する。

全ゲノム配列決定によるＡＳＴＡＯＭＥＧＡ遺伝子型の特徴付けにより、５０４個の変異の存在が明らかになった。

同定された変異のリストを図２に示す。

同定された５０４個の変異のうち、カロテノイドオキシゲナーゼ酵素のミスセンス変異（Ｎａｇａ＿１０００５０ｇ２３）は、カロテノイド生合成経路の変化の原因となっている可能性があり、ゆえに野生型と比較してこの変異体で観察されたように、アスタキサンチンおよびカンタキサンチンの増加した生産につながる可能性がある。

さらに、グルタミン酸シンターゼ酵素（Ｎａｇａ＿１００００５ｇ２３）の別のミスセンス変異は、窒素同化およびクロロフィル生合成に対するこの重要な酵素の活性が低下している可能性を示唆しており(Gomez-Silva et al., Planta 1985)、したがって、この変異がＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異体で観察される減少したクロロフィル量および増加した脂質蓄積表現型の原因である可能性が高いと考えられる。

葉緑体ＲＮＡポリメラーゼサブユニット（Ｎａｇａ＿１Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ７）の変異も確認された。この変異により葉緑体の転写が減少し、その結果クロロフィル結合サブユニットの蓄積が減少した。

第３の主題によれば、本発明は、変異株を使用したアスタキサンチン、ケトカロテノイド、およびオメガ－３（ＥＰＡ）の生産方法を記載する。

特に、ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異株は、例えば、閉鎖（例えば、フォトバイオリアクター）または開放（一般に開放ポンドまたはレースウェイポンドと呼ばれる）培養システムにおいてｆ／２培地(Guillard, R.R.L. & Ryther, J.H. Studies of marine planktonic diatoms, I, Cyclotella nanna (Hustedt) and Detonula convervacea (Cleve). Can. J. Microbiol. (1962))などの海藻の培養に適した成長培地中で成長させてもよい。

培養は塩水中で行うこともできる。

生産は、異なる光条件、異なる温度、および異なるＣＯ_２濃度で生じてもよい。

次いで、前記培養は、以下の条件の１つ以上の下で実施されてもよい：
－２０～１０００μｍｏｌ光子ｍ^－２ｓ^－１の光条件、
－約２０～３５℃、好ましくは２０～２５℃の温度、
－１５％まで、好ましくは０．０３％～３％（ｖ／ｖ）の間のＣＯ_２濃度。

ＣＯ_２は、例えば炭酸塩の形で成長培地中で直接利用できるようにすることもできる。

生産性を改善するために、グルコース、またはグリセロールまたはエタノールなどの別の還元炭素源を成長培地に添加してもよい。

培養は、飽和期に達するまで、例えば４～８日で実施してもよい。

飽和期でのより長い培養時間は、増加したケトカロテノイド含有量をもたらす。

色素分析により、アスタキサンチン、カンタキサンチン、およびその他の微量ケトカロテノイドの生産が実証される。

得られた生産性の値を平均すると、次のような生産性になる：

グルコースはバイオマス生産性を最大０．２２ｇ／Ｌ／日増加させてもよいが、ケトカロテノイドの割合を減少させてもよく、結果としてケトカロテノイド生産性は０．７５ｍｇ／Ｌ／日になってもよい。

アスタキサンチンおよび脂質は、ヘマトコッカス・プルビアリスによって生産されるアスタキサンチンを抽出するのに使用されるのと同じ方法論に従って細胞から抽出されてもよい。

本発明の好ましい態様によれば、ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ株は、以下の条件のうちの１つ以上の下で増殖されてもよい：
－市販のｆ／２培地、好ましくは８０ｍＬから２０Ｌの範囲の容量のフォトバイオリアクター中で；
－さまざまな濃度の、好ましくは３００ｐｐｍと３０，０００ｐｐｍの間のＣＯ_２を豊富に含むフォトバイオリアクターの底部から吹き込まれる空気によって。いずれの場合でも、吹き込まれた空気のＣＯ_２の富化は、培養微細藻類によるＣＯ_２消費の指標としての成長培地のｐＨに基づいて調節されてもよい。

ＣＯ_２富化空気注入の機能は、細胞の光合成活性を促進するためにＣＯ_２を供給し、Ｏ_２濃度を低下させることによって培地内のガス交換を促進することと、細胞の沈降を防止または軽減することの両方である。

フォトバイオリアクターでの培養は、好ましくは飽和期に達するまで（３～１０日、好ましくは４～８日）、様々な培養時間で実施され、上記と一致するバイオマス、ケトカロテノイド、アスタキサンチン、およびＥＰＡ生産収量を達成する。

本発明の特定の態様によれば、ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ株の培養は、例えばグルコースなどの適切な量の炭素源、好ましくは約０．５～４０ｇ／Ｌの量または同様の量のグリセロールまたはエタノールなどの還元炭素源の存在下で生産性を改善するために行ってもよい。

以下に簡単に説明する多くの例示的な変異を、本発明によるプロセス条件に適用してもよい。

生産は、次の１つ以上の変異を考慮して行ってもよい：
－閉鎖フォトバイオリアクターまたは開放システム（「開放ポンド」または「レースウェイポンド」）、ならびにハイブリッドシステムまたはバイオフィルム培養システムなどの微細藻類培養用に開発された他の装置において；
－不連続（バッチ）、半不連続（半バッチ）、連続または半連続栽培方法によって；
－屋内または屋外で；
－ＬＥＤ照明によって。

さらに、本発明の変異株の調製は、導入された変異の全部または一部を再現することによるＮ．ガディタナゲノムのゲノム特異的編集によっても達成されてもよい。

したがって、本発明の別の主題によれば、本特許出願のＡＳＴＡＯＭＥＧＡ株の同じ突然変異が、他の微細藻類種（海洋種および／または非海洋種）にアスタキサンチンの生産を誘導することが記載される。

本発明のＡＳＴＡＯＭＥＧＡ技術は、アスタキサンチンが代謝中間体または副産物である用途を含め、アスタキサンチンが必要または関与するあらゆる異なる用途に拡張してもよい。

自動藻類収穫段階もプロセスに統合して、生産コストをさらに削減および最適化してもよい。

したがって、本発明の方法は、アスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物の生産を可能にする。

より具体的には、この混合物は、エイコサペンタエン酸／アスタキサンチンの重量比が４．４～７．９の範囲にある。

特定の一態様によれば、記載されたプロセスにより、アスタキサンチンおよびエイコサペンタエン酸が豊富な藻類バイオマスを取得することも可能になる。

より具体的には、このバイオマスは、４．４～７．９の範囲のエイコサペンタエン酸／アスタキサンチン重量比を有する。

第４の主題では、本発明は、変異株によって生産される化合物の混合物を含む食品、医薬品、栄養補助食品、または化粧品組成物を記載する。

本発明の他の主題によれば、食品、製薬、栄養補助食品、および化粧品産業における変異株によって生産される化合物の使用が記載される。

組成物または製剤は、当業者によって、所望の製品の種類および／または投与形態に応じて、適切な添加剤、担体、賦形剤、および／または活性成分を添加するかまたは添加せずに、当技術分野で既知である医薬調製技術の一般的な技術を使用することによって達成可能である。

本発明の特定の態様によれば、生産された化合物は水産養殖産業に応用される。

実際、前記化合物は魚の色素沈着の原因となっており、これは養殖魚で達成するのが難しい品質形質として認識されている。

養殖プロセスから得られるバイオマスは、水産養殖、特に魚の飼料としても使用されてもよい。

この目的のために、自動藻類収穫段階をプロセスに統合して、生産コストをさらに削減および最適化してもよい。

このようにして、アスタキサンチンおよびＥＰＡが豊富に含まれる油は最も価値のある用途に使用されてもよく、一方、いずれの場合もアスタキサンチンおよびＥＰＡが豊富に含まれる油抽出後に残るバイオマスは、魚の飼料として使用されてもよい。

実施例
ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ株は、Ｆ／２培地中、５００μｍｏｌ光子ｍ^－２ｓ^－１の連続白色光下、バッチ空中フォトバイオリアクターで増殖させた。微細藻類の培養に使用した装置は、ＰＳＩ(Photon Systems Instruments) spol. s r.o. Drasov 470, 664 24 Drasov, Czech Republicであった。３％ＣＯ_２を豊富に含む空気を、フォトバイオリアクターの底から泡立てた。

Ｆ／２土壌の組成は次のとおりであった：０．０９２ｇ／ＬＧｕｉｌｌａｒｄ’ｓ（Ｆ／２）、海水濃縮溶液（ＭｅｒｃｋＧ０１５４）、３２ｇ／Ｌ海塩（ＭｅｒｃｋＳ９８８３）、ＴＲＩＳ－ＨＣｌ４．８４ｇ／Ｌ、チアミン０．１ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５μｇ／Ｌ、ビタミンＢ２０．５μｇ／Ｌ。

成長を５日間実施し、成長終了時の総乾燥バイオマス量は０．８７±０．０２ｇ／Ｌ、１日平均バイオマス生産性は０．１７±０．０１ｍｇ／Ｌ／日、１日最大バイオマス生産性は０．３５±０．０１ｍｇ／Ｌ／日となった。この条件では、総脂質生産性は４０．３９±４．４３ｍｇ／Ｌ／日、ＥＰＡ生産性は３．２２±０．３１ｍｇ／Ｌ／日であった。ケトカロテノイドの生産性は、０．６３±０．０４ｍｇ／Ｌ／日である。

同じ条件下で、培地に１０ｇ／Ｌグルコースを添加すると、総乾燥バイオマスは１．０３±０．１４ｇ／Ｌ、１日平均バイオマス生産性は０．２１±０．０１ｍｇ／Ｌ／日、１日最大バイオマス生産性は０．３９±０．０６ｍｇ／Ｌ／日になる。この条件では、総脂質生産性は５０．６２±１６．７ｍｇ／Ｌ／日、ＥＰＡ生産性は３．６７±１．１６ｍｇ／Ｌ／日であった。ケトカロテノイド生産性は、０．７６±０．１２ｍｇ／Ｌ／日であった。

上記の説明から、本発明によってもたらされる利点は当業者には明らかである。

特に、変異株に関しては、アスタキサンチンおよびオメガ－３（特にＥＰＡ）を多量に得ることができる。

これにより、オメガ－３および／またはアスタキサンチンを豊富に含む多数の製剤の調製が可能になる。

実際、既知の製品のうち、オメガ－３とアスタキサンチンの両方はオキアミ油にのみ存在するが、アスタキサンチンの濃度は一般に０．０５％未満である。

ナンノクロロプシス藻類は、ヒトが消費するための新しい食品として最近ヨーロッパで提案され、すでにＦＤＡによって承認されていることを考慮すると(FDA 2015; US Food and Drug Administration - New Dietary Ingredient Notification Report #826. http://www.regulations.gov/#!documentDetail;D=FDA-2014-S-0023-0041)、ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異株の使用は革新的な解決策であると考えられる。

変異株ＡＳＴＡＯＭＥＧＡＣＣＡＰ８４９／１６は非ＧＭＯ（非遺伝子組み換え生物）として識別されているため、ＧＭＯに必要な制限を受けることなく工業レベルでの栽培が許可されている。

Ｎ．ガディタナＷ．Ｔ．からのＡＳＴＡＯＭＥＧＡ変異株は、予想外にも以下のようないくつかの固有の特徴によって特徴付けられる：
－アスタキサンチン（藻類バイオマスの乾燥重量当たり最大１％（ｗ／ｗ））およびオメガ－３ＥＰＡ脂肪酸の蓄積；
－効率的な光合成を維持するために重要である、減少した熱放散；
－アスタキサンチン生産に関連するバイオマス生産の減少なしの種の急速な成長；
－（色素沈着の減少のため）フォトバイオリアクターへの光の透過を良くする、減少したクロロフィル含有量。

アスタキサンチンの生産方法に関しては、次のような利点が挙げられる：
－アスタキサンチンが通常微量しか生産されない出発株ナンノクロロプシス・ガディタナ野生型と比較してアスタキサンチンの顕著な蓄積（乾燥重量の最大１％（ｗ／ｗ））による、増加した生産性；
－ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ株の高い生産性の両方に基づく、生産コストの削減；
－ストレス段階（「レッド」段階）の排除およびアスタキサンチン蓄積の可能性に基づく、生産コストの削減；
－アスタキサンチン生産のための（強い光および高温（増加した光の強度および温度）を提供するために多くのエネルギーを必要とする）上記のストレス段階の除去の両方を通じた、増加した環境の持続可能性。

本発明の化合物に基づいて得られる調製物はさらに、栄養補助食品、医薬品、および化粧品産業においてヒトの使用のために組成物および製剤を提供することを可能にする。

一方、水産養殖産業における本発明の化合物の使用は、魚の養殖業者に、色素沈着およびオメガ－３含有量の両方を増加させることによって魚の品質を改善する機会を与える。

Claims

２０１６年１月２８日に国際寄託機関ＣＣＡＰ－ＳＡＭＳ(CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA (CCAP)-SAMS Limited Scottish Marine Institute; OBAN, Argyll, PA37 1QA, UK)に寄託され、ＣＣＡＰ受託番号８４９／１６で登録された、変異藻類株ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ（以前のナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｇａｄｉｔａｎａ）Ｄ２３）。
添付の図２に実証される通りの５０４個の変異を特徴とする、請求項１に記載のＣＣＡＰ８４９／１６株。
２０１６年１月２８日に国際寄託機関ＣＣＡＰ－ＳＡＭＳ(CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA (CCAP) - SAMS Limited Scottish Marine Institute; OBAN, Argyll, PA37 1QA, UK)に寄託され、ＣＣＡＰ受託番号８４９／１６で登録された変異藻類株ＡＳＴＡＯＭＥＧＡ（以前のナンノクロロプシス・ガディタナＤ２３）を得る方法であって、藻類ナンノクロロプシス・ガディタナＷ．Ｔ．を突然変異誘発剤メタンスルホン酸エチルに曝露することにより無作為化学突然変異段階に曝す段階を含む、方法。
前記曝露が、約２％の最終重量／体積パーセンテージでの突然変異誘発剤メタンスルホン酸エチルへの曝露である、請求項３に記載の方法。
前記曝露が２時間にわたって行われる、請求項３または４に記載の方法。
請求項１または２に記載の変異藻類株を培養する工程を含む、アスタキサンチンおよびオメガ－３脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸を生産する方法。
前記培養が、グルコース、グリセロール、またはエタノールの存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
前記培養が、好ましくは約０．５～４０ｇ／Ｌ、より好ましくは約１０ｇ／Ｌの量のグルコースの存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
前記培養が、２０から１０００μｍｏｌ光子ｍ^－２ｓ^－１の範囲の発光白色光を使用して行われる、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が、約２０～３５℃、好ましくは２０～２５℃の温度で行われる、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が、最大約１５％、好ましくは約０．０３％～３％のＣＯ_２の存在下で行われる、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記方法がさらに藻類バイオマスを生産する、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項６～１２のいずれか一項に従って得られるアスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物。
約４．４～７．９のエイコサペンタエン酸／アスタキサンチン比を含む、請求項１３に従って得られるアスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物。
請求項１２に記載の方法に従って得られる、藻類バイオマス。
請求項１３または１４に記載のアスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物を含む、食品、医薬品、栄養補助食品、化粧品組成物、または動物工学的サプリメントもしくは飼料。
アスタキサンチンおよびエイコサペンタエン酸オメガ－３脂肪酸（ＥＰＡ）の生産のための、請求項１～２に記載の株の使用。
食品、医薬品、栄養補助食品、または化粧品における、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法によって得られるアスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物の使用。
水産養殖における、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法により得られるアスタキサンチンとエイコサペンタエン酸の混合物の使用。
飼料としての、請求項１２に記載の藻類バイオマスの使用。