JP2023548111A - 造血悪性腫瘍を治療するための組成物および方法 - Google Patents

造血悪性腫瘍を治療するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示の態様は、造血悪性腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病）を治療するための方法および組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、遺伝子操作されたＣＤ３３欠損造血細胞の集団および抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を使用して治療する方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０６，１３６号、および２０２１年３月２５日に出願された米国仮出願第６３／１６５，９５０号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
造血細胞移植（ＨＣＴ）を使用して、完全寛解にあるが、再発のリスクが高い急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者、特に、中程度または有害な疾患に関連遺伝的性質を有する患者を治療することができる。過去数十年にわたって移植に関連する死亡率が減少していることから、ＨＣＴ後の白血病の再発は、全体的な予後の改善に対する障害のままである。いくつかの最近の研究により、ＨＣＴ時の形態学的完全寛解中の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在が、白血病の再発および死亡のリスクの有意な増加と独立して関連することが明らかになった。さらに、骨髄において残存白血病芽球の証拠を示す患者は、ＨＣＴ後の早期再発のリスクが非常に高い個体である。
本明細書に記載される方法は、急性骨髄性白血病を有する患者における白血病の再発のリスクを低減し、全体的な予後を改善するための新しい方法を提供する。一部の態様では、本開示は、対象に、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、有効量の遺伝子操作された造血細胞、またはその子孫の集団、および抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む、有効量の細胞毒性剤を投与することを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、対象に、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む、有効量の細胞毒性剤を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、有効量の遺伝子操作された造血細胞、またはその子孫の集団を受けているか、または受けた。
一部の態様では、本開示は、対象に、ＣＤ３３剤の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、有効量の遺伝子操作された造血細胞、またはその子孫の集団を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む、有効量の細胞毒性剤を受けているか、または受けた。
一部の実施形態では、細胞毒性剤は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量は、約１０６細胞／対象の体重のキログラム～約１０７細胞／対象の体重のキログラムである。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重のキログラムである。
一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤は、近い時間に投与される。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時に投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時的に投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を順次投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団を細胞毒性剤の投与の１２０日以内（例えば、細胞毒性剤の投与の９０日以内、細胞毒性剤の投与の６０日以内）に投与することを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、細胞毒性剤の前に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、単回治療レジメンで投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、静脈内投与される。
一部の実施形態では、細胞毒性剤は、四週間毎に有効量の複数回用量で投与される。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、四週間毎に約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、投与前に凍結保存された形態から解答される。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、投与前に凍結乾燥形態から再構成される。
一部の実施形態では、対象は、細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の集団の投与前にプレコンディショニングされている。一部の実施形態では、方法は、細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の集団の投与前に対象をプレコンディショニングすることをさらに含む。一部の実施形態では、プレコンディショニングすることは、一つまたは複数の化学療法剤を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、プレコンディショニングすることは、対象の全身照射を含む。一部の実施形態では、化学療法剤は、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される。一部の実施形態では、プレコンディショニングすることは、ヒトＴ細胞（Ｔリンパ球）に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、抗体は、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、造血悪性腫瘍は、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在によって特徴付けられるか、または造血前悪性腫瘍疾患は、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在によって特徴付けられる。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている。一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、対象は、急性骨髄性白血病を発症するリスクが高い。
一部の実施形態では、対象は、化学療法および／または放射線療法に対して未感作である。一部の実施形態では、対象は、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処することを目的とする任意の治療に対して未感作である。
一部の実施形態では、対象は、以前に化学療法を受けている。一部の実施形態では、対象は、以前に誘導療法を受けている。一部の実施形態では、対象は、既に完全な血液学的寛解に入っており、任意選択的に、完全な血液学的寛解は、末梢計数の不完全な回復によって特徴付けられる。一部の実施形態では、対象は、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する。一部の実施形態では、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子は、中または高いリスクの疾患に関連遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄、細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在、細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄、および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される。
一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてのホモ接合性優性遺伝子型を有していない。一部の実施形態では、対象は、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有していない。一部の実施形態では、対象は、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有しておらず、任意選択的に、遺伝子転座は、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である。一部の実施形態では、対象は、以前に自己または同種幹細胞移植を受けていない。一部の実施形態では、対象は、以前に細胞毒性剤を受けていない。
一部の実施形態では、方法は、対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、造血幹細胞は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である。一部の実施形態では、造血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である。一部の実施形態では、造血細胞は、自己である。一部の実施形態では、方法は、対象から自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、方法は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように自己幹細胞を遺伝子操作すること、および遺伝子操作された造血幹細胞を対象に戻すことをさらに含む。
一部の実施形態では、造血細胞は、同種である。一部の実施形態では、造血細胞は、対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である。一部の実施形態では、方法は、対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３３抗原をコードする造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、遺伝子操作された造血細胞の集団を調製することをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする内在遺伝子の全体または部分は、欠失されている。一部の実施形態では、内在遺伝子の全体または部分は、ゲノム編集を使用して欠失されている。一部の実施形態では、ゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを必要とする。
一部の態様では、本開示は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫の集団を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、造血細胞は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の造血幹細胞である。一部の実施形態では、造血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である。
一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部は、欠失されている。一部の実施形態では、内在遺伝子の全体または部分は、ゲノム編集を使用して欠失されている。一部の実施形態では、行われるゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを必要とする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９～１５のいずれか一つの配列を含む標的ドメインを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変された造血細胞のいずれかの集団および抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を含む組み合わせを提供する。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、ゲムツズマブオゾガマイシンである。
一部の態様では、本開示は、培地中の１ミリリットル（ｍＬ）当たり少なくとも１×１０６細胞の集団を含む組成物を提供し、細胞の集団は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫を含む。一部の実施形態では、培地は、約４０～５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約５～１５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約１０～１００ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約２５～７５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３０～７０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０～６０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約５５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約６０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約７０ｍＬの体積を有する。
一部の実施形態では、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である。一部の実施形態では、集団は、１ｍＬ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６個の細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、１ｍＬ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６個の細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０９個の生細胞、少なくとも２×１０９個の生細胞、少なくとも３×１０９個の生細胞、少なくとも４×１０９個の生細胞、少なくとも５×１０９個の生細胞、少なくとも６×１０９個の生細胞、少なくとも７×１０９個の生細胞、少なくとも８×１０９個の生細胞、少なくとも９×１０９個の生細胞、少なくとも１×１０１０個の生細胞、少なくとも２×１０１０個の生細胞、少なくとも３×１０１０個の生細胞、少なくとも４×１０１０個の生細胞、少なくとも５×１０１０個の生細胞、少なくとも６×１０１０個の生細胞、少なくとも７×１０１０個の生細胞、少なくとも８×１０１０個の生細胞、少なくとも９×１０１０個の生細胞、または少なくとも１×１０１１個の生細胞を含み、一部の実施形態では、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である。
一部の実施形態では、培地は、抗凍結剤を含む凍結保存培地である。一部の実施形態では、抗凍結剤は、約１０％（ｖ／ｖ）の量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
一部の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である。一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部は、欠失されている。一部の実施形態では、内在遺伝子の全体または部分は、ゲノム編集を使用して欠失されている。一部の実施形態では、行われるゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを必要とする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９～１５のいずれか一つの配列を含む標的ドメインを含む。一部の実施形態では、組成物は、検出可能なレベルのＲＮＡガイドヌクレアーゼを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、凍結された状態にある。
一部の実施形態では、組成物は、凍結保存プロセスに供されている。一部の実施形態では、凍結保存プロセスは、速度を制御した凍結である。
上記の要約は、非限定的な様式で、本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のうちのいくつかを例証するように意図されている。本明細書に開示される技術のその他の実施形態、利点、特徴、及び使用が、発明を実施するための形態、図面、実施例、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を示し、説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
図１は、臨床試験の対象のための投薬レジメンの例を示す概略図である。 図２は、本明細書に記載される方法の有効性を評価するための実験設計例を示す概略図である。簡潔に述べると、ヒトドナーから得られた動員化ＰＭＢＣ（ｍＰＢＭＣ）由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）。ＨＳＰＣを、モックエレクトロポレーションする（「対照」）か、または例えば、ＣＤ３３ ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、ＣＤ３３抗原（ＣＤ３３ＫＯ）の発現を低減または除去するためのゲノム編集に供し、次いで、亜致死照射したＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ、ＮＳＧ（商標））マウスに投与する。血液試料を、ＨＳＰＣ移植の８週および１２週後の時間点で取得する。マウスに、約１５週後に、用量０．３３ｍｇ／ｋｇで、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）などの抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤、またはビヒクル対照を投与する。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置の約８日後（ＨＳＰＣ移植の１６週後）、マウスを屠殺し、終末骨髄（ＢＭ）、血液、および脾臓試料を回収し、例えば、フローサイトメトリーによる分析に供する。 図３Ａ～３Ｅは、図２に示す実験設計に従い、ドナー１由来のヒトＨＳＰＣの移植後の細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を示すプロットを示す。図３Ａは、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントによって決定したヒト白血球キメラ化を示す。 図３Ｂは、ＣＤ３３＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図３Ｃは、ＣＤ１４＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図３Ｄは、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図３Ｅは、ＣＤ１４＋骨髄細胞におけるＣＤ３３の存在を示し、これは、ＣＤ３３について編集したＣＤ１４＋細胞を、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）細胞傷害から保護したことを示している。各プロットについて、モックＥＰは、モックエレクトロポレーションしたヒトＨＳＰＣを用いた移植を指し、ＣＤ３３ ｇＲＮＡは、ＣＤ３３ ｇＲＮＡを使用して編集したヒトＨＳＰＣを用いた移植を指す。「Ｍｙｌｏｔａｒｇ」は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置を受けたマウスを指し、「ビヒクル」は、ビヒクル対照を受けた対照マウスを指す。各データ点は、示した平均および標準偏差と共に、マウスの個々の値を表す（ｎ＝９～１０）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。 図４Ａ～４Ｃは、図２に示す実験設計に従い、ドナー１由来のヒトＨＳＰＣの移植後の細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を示すプロットを示す。図４Ａは、ＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図４Ｂは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図４Ｃは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－原始ＨＳＰＣをヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。各プロットについて、モックＥＰは、モックエレクトロポレーションしたヒトＨＳＰＣを用いた移植を指し、ＣＤ３３ ｇＲＮＡは、ＣＤ３３ ｇＲＮＡを使用して編集したヒトＨＳＰＣを用いた移植を指す。「Ｍｙｌｏｔａｒｇ」は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置を受けたマウスを指し、「ビヒクル」は、ビヒクル対照を受けた対照マウスを指す。各データ点は、示した平均および標準偏差と共に、マウスの個々の値を表す（ｎ＝９～１０）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。 図５Ａ～５Ｄは、図２に示す実験設計に従い、ドナー２由来のヒトＨＳＰＣの移植後の細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を示すプロットを示す。図５Ａは、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントによって決定したヒト白血球キメラ化を示す。 図５Ｂは、ＣＤ３３＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図５Ｃは、ＣＤ１４＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図５Ｄは、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。各プロットについて、モックＥＰは、モックエレクトロポレーションしたヒトＨＳＰＣを用いた移植を指し、ＣＤ３３ ｇＲＮＡは、ＣＤ３３ ｇＲＮＡを使用して編集したヒトＨＳＰＣを用いた移植を指す。「Ｍｙｌｏｔａｒｇ」は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置を受けたマウスを指し、「ビヒクル」は、ビヒクル対照を受けた対照マウスを指す。各データ点は、示した平均および標準偏差と共に、マウスの個々の値を表す（ｎ＝９～１０）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。 図６Ａ～６Ｃは、図２に示す実験設計に従い、ドナー２由来のヒトＨＳＰＣの移植後の細胞集団のフローサイトメトリー分析の結果を示すプロットを示す。図６Ａは、ＣＤ３＋Ｔ細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図６Ｂは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞をヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。 図６Ｃは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－原始ＨＳＰＣをヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントとして示す。各プロットについて、モックＥＰは、モックエレクトロポレーションしたヒトＨＳＰＣを用いた移植を指し、ＣＤ３３ ｇＲＮＡは、ＣＤ３３ ｇＲＮＡを使用して編集したヒトＨＳＰＣを用いた移植を指す。「Ｍｙｌｏｔａｒｇ」は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置を受けたマウスを指し、「ビヒクル」は、ビヒクル対照を受けた対照マウスを指す。各データ点は、示した平均および標準偏差と共に、マウスの個々の値を表す（ｎ＝９～１０）。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。
本開示は、既存の療法における限界を克服する造血悪性腫瘍の治療で使用するための標的化治療アプローチを提供する。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のための現在のＣＤ３３標的化療法は、ＣＤ３３を発現する正常な健常骨髄系細胞に対する「オンターゲット、オフ白血病」細胞傷害に限定されている。非癌性ＣＤ３３＋細胞の消失は、患者の造血系を枯渇させ得る。この枯渇に対処するために、対象に、ＣＤ３３遺伝子に改変を含むレスキュー細胞（例えば、造血細胞）を投与することができる。これらのＣＤ３３を改変した細胞は、抗ＣＤ３３癌療法に抵抗性であり得、したがって、抗ＣＤ３３療法中または後に造血系を再配置させることができる。このようにして、正常な骨髄区画を、ＣＤ３３標的化剤のオンターゲット効果から保護し、これらの剤の治療指標の改善および患者予後の改善をもたらす。
細胞
本開示の態様は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子操作された造血細胞（ｅＨＳＣもしくはｅＨＳＰＣとしても本明細書で言及される）、またはその子孫に関するものであった。一部の実施形態では、ＣＤ３３をコードする遺伝子の改変を有する本開示の遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ））は、当該技術分野で公知の、任意の遺伝子編集方法を使用して遺伝子操作されている。
一部の実施形態では、ＣＤ３３をコードする遺伝子の改変を有する本開示の遺伝子操作された造血細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ））は、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡを使用して遺伝子操作されている。一部の実施形態では、ＣＤ３３の改変および第二の系統特異的細胞表面抗原の改変を有する細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡを使用して作製される。細胞は、細胞自体をヌクレアーゼおよび／もしくはｇＲＮＡと接触させることによって作製され得るか、または細胞は、ヌクレアーゼおよび／もしくはｇＲＮＡと接触させた細胞の娘細胞であり得ることは理解される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、対象の造血系を再構成することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣ又はＨＰＣ）は、ヒト対象に生着すること、骨髄系細胞を産生すること、及びリンパ系細胞を産生することのうちの一つ以上（例えば、全て）が可能である。
一部の実施形態では、細胞は、一つの遺伝子改変のみを含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３３のエクソン３の配列中などの、ＣＤ３３遺伝子座のみで遺伝子改変されている。一部の実施形態では、細胞は、第二の遺伝子座で遺伝子改変されている。一部の実施形態では、細胞は、トランスジェニックタンパク質を含まず、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含まない。
用語「ＣＤ３３抗原」および「ＣＤ３３タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、ＣＤ３３タンパク質、または抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤などの、抗ＣＤ３３剤によって標的化される部分などの、その部分もしくは断片を指す。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞は、ＣＤ３３タンパク質（ＣＤ３３抗原）を実質的に含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞は、野生型ＣＤ３３タンパク質を実質的に含まないが、変異ＣＤ３３タンパク質を含む。一部の実施形態では、変異ＣＤ３３タンパク質は、治療目的のためＣＤ３３を標的化する剤によって結合されない。本明細書で使用される場合、細胞が、ＣＤ３３の発現の低減を有するか、または有さないように、遺伝子操作されている遺伝子操作された造血細胞は、「ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＣ」または「ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ」として言及さ得る。
一部の実施形態では、細胞は、循環血液細胞、例えば、網状赤血球、巨核球赤芽球前駆（ＭＥＰ）細胞、骨髄前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ系前駆（ＬＰ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ）であり、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、または内皮細胞（ＥＣ）として言及されてもよい。一部の実施形態では、細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球細胞（例えば、赤芽球）、巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ細胞）、骨髄前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ球優性（ＬＰ）細胞、赤血球前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血性内皮細胞（ＨＥ）細胞、または多能性幹細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、骨髄前駆細胞（例えば、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）細胞または顆粒球マクロファージ前駆（ＧＭＰ）細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、リンパ系前駆細胞、例えば、共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）細胞である。一部の実施形態では、細胞は、赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞、または系統制限前駆（ＬＲＰ）細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９＾ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＡ細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋、またはＣＤ１３３＋細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞、または胎盤造血ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、動員された末梢血造血ＣＤ３４＋細胞である（患者が、動員剤、例えば、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはプレリキサホルで処置された後）。一部の実施形態では、細胞は、末梢血内皮細胞、または細胞の集団である。
一部の実施形態では、細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、典型的には、骨髄系前駆細胞およびリンパ系前駆細胞の両方を生じさせることができる幹細胞であり、それら前駆細胞はさらに骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）をそれぞれ生じさせることができる。ＨＳＣは、細胞表面マーカーのＣＤ３４の発現を特徴としており（例えば、ＣＤ３４＋）、これをＨＳＣの特定および／または単離に使用することができ、細胞表面マーカーの不在は、細胞系統への傾倒に関連付けられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の造血幹細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の造血幹細胞または複数の造血前駆細胞を含む。
一部の実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、赤血球（赤血球または赤血球（ＲＢＣ））、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、ならびに樹状細胞）、ならびにリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、全ての血液細胞型を生じる幹細胞系統の細胞を指す。一部の実施形態では、本明細書で使用される細胞は、循環血液細胞、動員された血液細胞、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ系前駆細胞、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＳＣは、非臍帯血供給源、臍帯供給源、または臍帯血供給源由来である。一実施形態では、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞である。一部の実施形態では、ＨＳＣ細胞は、対象への移植後にインビボで分化することができる。一部の実施形態では、ＨＳＣ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球細胞、および／または骨髄細胞に分化することができる。一部の実施形態では、ＨＳＣ細胞は、対象における造血を再構成することができる。一部の実施形態では、造血幹細胞は、造血前駆細胞の細胞表面マーカー特徴：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、およびＣ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋の少なくとも一つを有する。一部の実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋である。
一部の実施形態では、造血幹細胞は、対象が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）（任意選択的に、プレリキサホルとの組み合わせ）で処置された後に、対象から得られる末梢血幹細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して濃縮される。一部の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に、サイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）を含む無血清培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗ ＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）において弱く刺激される。一部の実施形態では、ＳＲ１およびｄｍＰＧＥ２ならびに／または他の因子の付加は、長期生着を改善するために企図される。
一部の実施形態では、本開示による投与のための遺伝子操作された造血細胞の集団は、一つまたは複数のドナーから得られる同種の造血前駆細胞であってもよい。本明細書で使用される場合、「同種」は、一つまたは複数の遺伝子座の遺伝子が、同一ではない、同じ種の一つまたは複数の異なるドナーから得られた造血前駆細胞を含む造血前駆細胞または生物学的試料を指す。例えば、対象に投与されている造血細胞集団は、一つ以上の関連していないドナー対象、または一つまたは複数の非同一同胞から得られた臍帯血から誘導することができる。一部の実施形態では、遺伝的に同一の動物、または同一の双生児から得られるものなどの、同系造血細胞集団を使用することができる。一部の実施形態では、造血細胞は、自己細胞であり、すなわち、造血前駆細胞は、対象から得られるか、または単離され、同じ対象に投与される（すなわち、ドナーおよびレシピエントが同じである）。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団は、複数の遺伝子操作された造血幹細胞および複数の遺伝子操作された造血前駆細胞を含む。
一部の実施形態では、ＨＳＣまたはＨＰＣは、ヒト対象などの、対象から得られる。ＨＳＣを取得する方法は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１６／０５７３３９号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、哺乳類対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウス若しくはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、又は家畜である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、造血悪性腫瘍を有するヒト対象などのヒト対象から取得される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣまたはＨＰＣは、健康なドナーから取得される。一部の実施形態では、ＨＳＣまたはＨＰＣは、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤が、その後投与される対象から得られる。細胞が取得された同じ対象に投与されるＨＳＣまたはＨＰＣは、自己細胞と称される一方で、細胞が投与される対象ではない対象から取得されるＨＳＣまたはＨＰＣは、同種異系細胞と称される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団は、細胞の異種集団、例えば、異なるＣＤ３３変異を含む遺伝子操作された造血細胞の異種集団である。一部の実施形態では、細胞の集団内のＣＤ３３のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチ、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって影響される変異を有する。一例として、集団は、複数の異なるＣＤ３３変異を含むことができ、複数の各変異は、変異を有する細胞の集団内のＣＤ３３のコピーの割合に寄与する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞上のＣＤ３３の発現は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＣＤ３３の発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上のＣＤ３３の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のＣＤ３３の発現レベルの低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＣＤ３３の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）上の野生型ＣＤ３３の発現と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の野生型ＣＤ３３の発現レベルの低減をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型対応物）と比較して、ＣＤ３３の２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満を発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作は、好適な対照（例えば、細胞または複数の細胞）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の野生型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）の発現レベルの低減をもたらす。いくつかの実施形態では、好適な対照は、同じ対象からの複数の操作されていない細胞において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、健康な対象からの複数の細胞において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、健康な個人（例えば、１０、２０、５０、又は１００人の個人）のプールからの細胞の集団において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、本明細書に記載される治療、例えば、抗ＣＤ３３療法を必要とする対象、例えば、対象ががんを有し、がんの細胞がＣＤ３３を発現する、対象において測定又は予期される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの実施形態では、好適な対照は、ＣＤ３３の発現を低減または除去するための遺伝子操作の対象に供される前の細胞において測定される野生型系統特異的細胞表面抗原のレベルを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞を作製する方法は、野生型細胞、例えば、野生型造血幹または前駆細胞を用意する工程を含む。いくつかの実施形態では、野生型細胞は、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）の二つの機能的コピーを含む（例えば、発現する）未編集の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１６によるＣＤ３３遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１６でコードされるＣＤ３３タンパク質をコードするＣＤ３３遺伝子配列を含み、例えば、ＣＤ３３遺伝子配列は、配列番号１６に対して一つ以上のサイレント変異を含み得る。一部の実施形態では、野生型細胞は、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を発現するか、あるいはＨＬ６０またはＭＯＬＭ－１３細胞と同等のレベル（または９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、もしくは５０％～１５０％以内）で系統特異的細胞表面抗原を発現するより分化した細胞を生じる。一部の実施形態では、野生型細胞は、系統特異的細胞表面抗原（例えば、抗ＣＤ３３抗体、例えば、Ｐ６７．６）に結合する抗体に結合するか、あるいは抗体のＨＬ６０またはＭＯＬＭ－１３細胞への結合と同等（または９０％～１１０％、８０％～１２０％、７０％～１３０％、６０～１４０％、もしくは５０％～１５０％以内）のレベルで抗体に結合するより分化した細胞を生じる。抗体結合は、例えば、フローサイトメトリーによって測定され得る。
一部の態様では、遺伝子操作された造血幹または前駆細胞は、内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含み、遺伝子変異は、本明細書に記載される部位にある（表１を参照）。本開示の一態様は、内在性ＣＤ３３遺伝子のエクソン３中に遺伝子変異を含む遺伝子操作された造血幹および／または前駆細胞を提供し、遺伝子変異は、表１に提示されるｇＲＮＡのいずれかなどの、ｇＲＮＡによって標的化された部位にある。
一部の実施形態では、本明細書に記載される操作された細胞は、二つの変異を含み、第一の変異は、ＣＤ３３にあり、第二の変異は、第二の系統特異的細胞表面抗原にある。このような細胞は、一部の実施形態では、二つの抗原：抗ＣＤ３３剤および第二の系統特異的細胞表面抗原を標的とする剤に耐性であり得る。一部の実施形態では、このような細胞は、本明細書に記載される二つ以上のｇＲＮＡ、例えば、表３のｇＲＮＡおよび第二のｇＲＮＡを使用して産生することができる。一部の実施形態では、細胞は、例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ使用して産生することができる。本開示は、本明細書に記載される細胞を含む集団も提供する。
一部の実施形態では、第二の変異は、本明細書に記載される系統特異的細胞表面抗原のいずれかなどの、系統特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子にある。
典型的には、本明細書に提供される方法および組成物によって影響される変異、例えば、ＣＤ３３などの標的遺伝子中の変異は、例えば、ＣＤ３３遺伝子中の変異の場合、ＣＤ３３タンパク質の機能の喪失における、標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の機能の喪失をもたらす。一部の実施形態では、機能の喪失は、遺伝子産物の発現のレベルの低減、例えば、より低いレベルの発現への低減、または遺伝子産物の発現の完全な無効化である。一部の実施形態では、変異は、遺伝子産物の非機能的バリアントの発現をもたらす。例えば、コード配列、短縮遺伝子産物において未成熟終止コドンを生成する変異の場合、またはナンセンスもしくはミスセンス変異を生成する変異の場合、遺伝子産物を非機能的にする改変されたアミノ酸配列によって特徴付けられる遺伝子産物。一部の実施形態では、遺伝子産物の機能は、結合パートナーを結合または認識するものである。一部の実施形態では、遺伝子産物、例えば、ＣＤ３３、第二の系統特異的細胞表面抗原、または両方の発現の低減は、野生型または操作されていない対応細胞におけるレベルの５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、または１％以下である。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法により、および／または組成物を使用して生成された遺伝子操作された造血細胞の集団におけるＣＤ３３のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上は、変異を有する。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団における第二の系統特異的細胞表面抗原のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団におけるＣＤ３３および第二の系統特異的細胞表面抗原のコピーの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、変異を有する。一部の実施形態では、集団は、一つまたは複数の野生型細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、ＣＤ３３の一つの野生型コピーを含む一つまたは複数の細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、第二の系統特異的細胞表面抗原の一つの野生型コピーを含む一つまたは複数の細胞を含む。
細胞毒性剤
本開示の態様は、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤に関するものであった。抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤の投与は、ＣＤ３３を発現している細胞と相互作用し、細胞傷害を誘導した。本明細書に記載されるように、このような細胞毒性剤の投与は、ＣＤ３３を発現している癌細胞だけでなく、ＣＤ３３をまた発現する正常な健常細胞の細胞傷害、例えば、「オンターゲット、オフ白血病」作用を誘導し得る。
一部の実施形態では、本開示の細胞毒性剤は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。ＡＤＣは、毒素又は薬物分子にコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片を含む分子であり得る。対応する抗原への抗体又はその断片の結合は、その細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、標的細胞）への毒素又は薬物分子の送達を可能にし、それによって、標的細胞の死をもたらす。
一部の実施形態では、ＡＤＣの細胞表面系統特異的タンパク質（例えば、ＣＤ３３）のエピトープへの結合は、ＡＤＣの内部移行を誘導し、薬物（または毒素）は、細胞内に放出され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへのＡＤＣの結合は、毒素又は薬物の内部化を誘発し、これは、毒素又は薬物が系統特異的タンパク質が、系統特異的タンパク質を発現する細胞を殺傷することを可能にする。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープへのＡＤＣの結合は、毒素又は薬物の内部化を誘発し、これは、系統特異的タンパク質を発現する細胞の活性を調節し得る。本明細書に記載されるＡＤＣで使用される毒素又は薬物のタイプは、いかなる具体的なタイプにも限定されない。
ＡＤＣでの使用に適合する毒素又は薬物は、当技術分野で公知であり、当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ（２０１７）１６：３１５－３３７；Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８；Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照。
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、抗体及び薬物分子を付着させるリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）を更に含み得る。
一部の実施形態では、本開示の細胞毒性剤は、ゲムツズマブオゾガマイシンである。ゲムツズマブオゾガマイシンは、二官能性リンカー（４－（４－アセチルフェノキシ）ブタン酸）を介して（共有結合された）細胞傷害性抗腫瘍抗生物質カリチアマイシン（Ｎ－アセチル－ｙ－カリチアマイシン）と結合した組換えヒト化抗ＣＤ３３モノクローナル抗体（ＩｇＧ４ Ｋ抗体ｈＰ６７．６）である。ゲムツズマブオゾガマイシンは、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）として市販されている。ｈＰ６７．６と称されるゲムツズマブオゾガマイシンの抗体部分は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合する。
ゲムツズマブオゾガマイシンは、約９８．３％がヒト起源のものである、アミノ酸配列を含有する。定常領域およびフレームワーク領域は、ヒト配列を含有し、一方、相補性決定領域は、ＣＤ３３に結合するマウス抗体（Ｐ６７．６）に由来する。この抗体は、二官能性リンカーを介してＮ－アセチル－ガンマカリチアマイシンに連結される。ゲムツズマブオゾガマイシンは、抗体１モル当たりカリチアマイシン４～６モルを負荷した抗体の約５０％を有する。抗体の残りの５０％は、カリチアマイシン誘導体に連結されていない。ゲムツズマブオゾガマイシンは、分子量１５１～１５３ｋＤａを有する。ゲムツズマブオゾガマイシンおよびそれを作製する方法は、米国特許第５，７３３，００１号；第５，７３９，１１６号；第５，７６７，２８５；第５，８７７，２９６号；第５，６０６，０４０号；第５，７１２，３７４号；および第５，７１４，５８６号に記載され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の重鎖配列のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＩＴＤＳＮＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＤＹＮＱＫＦＫＮＲＡＴＬＴＶＤＮＰＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＦＹＹＣＶＮＧＮＰＷＬＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳ
ＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２６）
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の軽鎖配列のアミノ酸配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＬＤＮＹＧＩＲＦＬＴＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＭＹＡＡＳＮＱＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＫＥＶＰＷＳＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７）
本明細書に記載されるＣＤ３３を標的とする細胞毒性剤の構築において使用するための抗ＣＤ３３抗体結合ドメインは、配列番号２６および配列番号２７のものと同じ重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ領域を含み得る。このような抗体は、フレームワーク領域のうちの一つまたは複数におけるアミノ酸残基変動を含んでもよい。ある場合には、抗ＣＤ３３抗体断片は、ゲムツズマブオゾガマイシンの重鎖可変領域（配列番号２６の重鎖配列で提供される）と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）を共有する重鎖可変領域を含んでもよく、および／またはゲムツズマブオゾガマイシンの軽鎖可変領域（配列番号２７の軽鎖配列で提供される）と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）を共有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
ＣＤ３３はまた、抗ＣＤ３３免疫毒素バダスツキシマブタリリン（ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、３３Ａとも呼ばれる）（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）の標的でもある。ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａは、ゲムツズマブオゾガマイシンを用いた治療に応答して観察される多剤耐性を低減し得る抗体－薬物コンジュゲートである。一部の実施形態では、ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａを使用して、対象を治療する。一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンおよびＳＧＮ－ＣＤ３３Ａを組み合わせて、例えば、同時または順次使用して、対象を治療する。一部の実施形態では、対象はまた、化学療法を用いて治療される。
ＡＤＣのさらなる例としては、限定されるものではないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブべドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマホドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルトマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイキサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１に含まれる毒素及び薬物が挙げられる。
治療および投与の方法
本開示の態様は、対象に、有効量の本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団（ｅＨＳＣまたはｅＨＳＰＣとして本明細書で言及される）、および有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、造血悪性腫瘍と診断され、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団、および有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤の投与を含む、併用治療を受ける。当業者によって理解されるように、併用治療は、一緒に行われ（例えば、同時に、または単一の組成物で投与され）得る治療の一つより多くの態様を含むが、悪性腫瘍、またはその任意の症状もしくは徴候を治療することを目的とした治療レジメン内の一つより多くの治療を包含する。例えば、本明細書に記載される幾つかの方法は、有効量の、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団、および有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む、造血悪性腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病）を治療するための併用治療を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、有効量の、本明細書に記載される遺伝子操作された造血細胞の集団、および有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む、造血悪性腫瘍（例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ））の前悪性ステージを治療するための併用治療を含む。本明細書において提供されるいくつかの併用治療方法は、例えば、遺伝子操作された造血細胞の投与後の、細胞毒性剤（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））の投与を含む、遺伝子操作された造血細胞の集団（例えば、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ）および細胞毒性剤（例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））の連続投与を含む。本明細書において提供される併用治療、例えば、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤の治療モダリティは、併用治療の一部として、同じまたは異なる投薬レジメン（投薬頻度、量、投与経路を含む）に従い投与され得、このような投薬レジメンは、時間が重複してもよいか、または連続であってもよい。
一部の実施形態では、有効数の遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞は、抗ＣＤ３３抗原結合ドメイン（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）などの抗ＣＤ３３癌療法）を含む細胞毒性剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、改変されたＣＤ３３および改変された第二の系統特異的細胞表面抗原を含む有効数の細胞は、細胞毒性剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、抗体、ＡＤＣ、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を含む。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、ゲムツズマブオゾガマイシンを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０２細胞／対象の体重キログラム～約１０１０細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０４細胞／対象の体重キログラム～約１０８細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０６細胞／対象の体重キログラム～約１０８細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０５細胞／対象の体重キログラム～約１０７細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０６細胞／対象の体重キログラム～約１０７細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１０５細胞／対象の体重キログラム、約１０６細胞／対象の体重キログラム、約１０７細胞／対象の体重キログラム、または約１０８細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、少なくとも１０２細胞、少なくとも１０３細胞、少なくとも１０４細胞、少なくとも１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、またはその複数を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約１．０×１０５、約２．０×１０５、約３．０×１０５、約４．０×１０５、約５．０×１０５、約６．０×１０５、約７．０×１０５、約８．０×１０５、約９．０×１０５、約１．０×１０６、約２．０×１０６、約３．０×１０６、約４．０×１０６、約５．０×１０６、約６．０×１０６、約７．０×１０６、約８．０×１０６、約９．０×１０６、約１．０×１０７、約２．０×１０７、約３．０×１０７、約４．０×１０７、５．０×１０７、約６．０×１０７、約７．０×１０７、約８．０×１０７、約９．０×１０７、または約１．０×１０８細胞／対象の体重キログラムを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重キログラムを含む。
少なくとも一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞を生成するための出発材料として作用し得る造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、一つまたは複数のドナーに由来し得るか、または自己供給源から得ることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞は、それを必要とする対象への投与前に培養で拡大される。
哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される細胞、例えば、免疫細胞または造血細胞の典型的な数は、例えば、１００万～１，０００億個の細胞の範囲内であってもよいが、この例示的な範囲を下回る、または上回る量も、本開示の範囲内である。
一部の実施形態では、細胞毒性剤、例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、例えば、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団と組み合わせて、治療上有効量で使用される。一部の実施形態では、細胞毒性剤（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン）の有効量は、約０．０１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約３．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約０．０５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、または約１．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約０．０５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、または約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤の有効量は、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。
一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンは、例えば、遺伝子操作された造血幹細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の集団と組み合わせて、治療上有効量で使用される。一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．０１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約３．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．０５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、または約１．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２～約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．０５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．１ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約１．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２、または約２．５ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約２．０ｍｇ／対象の体表面積ｍ２である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約１０４細胞／対象の体重キログラム～約１０８細胞／対象の体重キログラムであり、細胞毒性剤（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン）の有効量は、約０．０１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約３．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約１０６細胞／対象の体重キログラム～約１０７細胞／対象の体重キログラムであり、細胞毒性剤の有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重キログラムであり、細胞毒性剤の有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重キログラムであり、細胞毒性剤の有効量は、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約１０４細胞／対象の体重キログラム～約１０８細胞／対象の体重キログラムであり、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．０１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約３．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約１０６細胞／対象の体重キログラム～約１０７細胞／対象の体重キログラムであり、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重キログラムであり、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団、例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３が改変された造血幹細胞の有効量は、約３．０×１０６細胞／対象の体重キログラムであり、ゲムツズマブオゾガマイシンの有効量は、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン）は、同じ時間、または近い時間の異なる時間に投与される。本明細書で使用される場合、一部の実施形態では、近い時間は、細胞毒性剤の投与と比べた、遺伝子操作された造血細胞の集団の投与のタイミングを指す。当然のことながら、順序付けが明示的に記載されていない限り、特定の順序付けは、この用語の使用において黙示的ではない。例えば、近い時間での遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤の投与は、細胞毒性剤の投与前、後、またはほぼ同時の造血細胞の投与を含み得る。さらに、治療は、混ぜられてもよいか、または別個の体積であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、組み合わせでの投与は、同じ治療過程における、例えば、抗ＣＤ３３療法を用いた治療過程における投与を含み、対象は、有効数のＣＤ３３が改変された細胞を、細胞毒性剤と同時に、又は連続的に、例えば、治療の前、間、若しくは後に投与され得る。
一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血幹細胞の集団および細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血幹細胞の集団および細胞毒性剤を同時または同時的に投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、遺伝子操作された造血幹細胞の集団および細胞毒性剤を順次投与すること（例えば、他方の治療前に一方の治療を投与すること）を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞の集団は、細胞毒性剤の前に投与される。一部の実施形態では、近い時間の投与は、細胞毒性剤の投与の１２０日以内（例えば、９０日以内、６０日以内、３０日以内、２０日以内、１０日以内、７日以内、または１日以内）での遺伝子操作された造血幹細胞の集団を投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、対象への細胞毒性剤の投与前１２０日以内（例えば、９０日以内、６０日以内、３０日以内、２０日以内、１０日以内、７日以内、または１日以内）での遺伝子操作された造血幹細胞の集団を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、近い時間の投与は、対象への細胞毒性剤の投与後１２０日以内（例えば、９０日以内、６０日以内、３０日以内、２０日以内、１０日以内、７日以内、または１日以内）での遺伝子操作された造血幹細胞の集団を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、対象は、遺伝子操作された造血細胞の集団の投与後、かつ本明細書に記載される細胞毒性剤の投与前の、生着のレベルなどの、一つまたは複数のパラメータに基づき評価される。一部の実施形態では、対象は、細胞毒性剤の投与前に閾値（例えば、少なくとも１０００／ｄＬ）より上のＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する。
一部の実施形態では、細胞毒性剤は、例えば、規則的な間隔（例えば、毎週、二週間毎、三週間毎、四週間毎、毎月、二か月毎、三か月毎、四か月毎、五か月毎、または六か月毎）で、複数回用量で投与される。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、四週間毎に、有効量の複数回用量で投与される。例えば、一部の実施形態では、有効量の細胞毒性剤は、第一の用量で投与され、その後、一つまたは複数の続く用量である有効量が投与され、各用量は、約四週間（例えば、２８日）離される。一部の実施形態では、各用量は、約二週間～約六週間（例えば、約二週間、約三週間、約四週間、約五週間、約六週間、約三週間～約五週間、または約四週間～約六週間）離される。一部の実施形態では、有効量の細胞毒性剤は、少なくとも一回用量、少なくとも二回用量、少なくとも三回用量、一回～六回用量、一回～四回用量、一回～三回用量、または四回用量で対象に投与される。一部の実施形態では、細胞毒性剤の各用量は、約２．０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、細胞毒性剤は、四週間毎に約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される。
一部の実施形態では、本開示による治療を必要とする対象は、新たに診断された新規ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有するものとして特定されている。新たに診断された新規ＣＤ３３陽性ＡＭＬの治療のための併用レジメンの一部として与えられるとき、ゲムツズマブオゾガマイシンを含む推奨治療コースは、１回の導入サイクルおよび２回の地固めサイクルからなる。誘導サイクルについては、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨用量は、１日目、４日目、および７日目に、３ｍｇ／ｍ２（最大一つの４．５ｍｇバイアル）を、ダウノルビシンおよびシタラビンと組み合わせたものである。第二の導入サイクルを必要とする対象については、ゲムツズマブオゾガマイシンは、第二の導入サイクルの間に導入されない。地固めサイクルについては、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨用量は、ダウノルビシンおよびシタラビンと組み合わせた、１日目での３ｍｇ／ｍ２（最大一つの４．５ｍｇのバイアル）である。
一部の実施形態では、本開示による治療を必要とする対象は、新たに診断されたＣＤ３３陽性ＡＭＬを有するものとして特定されている。新たに診断されたＣＤ３３陽性ＡＭＬの治療のための単剤療法として与えられるとき、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨される治療コースは、１回の導入サイクルおよび最大８サイクルの継続療法からなる。導入サイクルについては、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨用量が、単剤として、１日目に６ｍｇ／ｍ２、８日目に３ｍｇ／ｍ２投与される。継続については、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨用量は、４週間毎に１日目に単剤としての２ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、本開示による治療を必要とする対象は、ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有すると診断されているか、または有すること、再発しているか、もしくは難治性であることが疑わされる。再発または難治性ＣＤ３３陽性ＡＭＬの治療のため単剤療法として与えられるとき、ゲムツズマブオゾガマイシンの推奨用量は、１、４、および７日目に３ｍｇ／ｍ２（最大一つの４．５ｍｇのバイアル）である。
一部の実施形態では、対象は、ゲムツズマブオゾガマイシンの投与前に、コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、およびアセトアミノフェンのうちの一つまたは複数で前治療される。一部の実施形態では、対象は、ゲムツズマブオゾガマイシンの投与の約１時間（例えば、約３０分間～１．５時間、約４５分間～１．５時間、約１～２時間、または約４５分間～１時間）前に前処理される。一部の実施形態では、対象は、ゲムツズマブオゾガマイシンの投与１時間前に、アセトアミノフェン約６５０ｍｇ（例えば、経口）およびジフェンヒドラミン約５０ｍｇ（例えば、経口または静脈内）で前治療される。一部の実施形態では、対象は、ゲムツズマブオゾガマイシンの投与前３０分以内に、約１ｍｇ／ｋｇメチルプレドニゾロンまたは同等の容量の代替コルチコステロイドで前治療される。小児対象は、経口または静脈内で、アセトアミノフェン１５ｍｇ／ｋｇ（最大６５０ｍｇ）、ジフェンヒドラミン１ｍｇ／ｋｇ（最大５０ｍｇ）、および１ｍｇ／ｋｇメチルプレドニゾロンで前治療されてもよく、追加用量のアセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンは、開始前治療容量の４時間毎に投与されてもよい。前治療は、注入中または注入後４時間以内の発熱、悪寒、低血圧、または呼吸困難などの、注入反応の任意の徴候のため、同じ用量のメチルプレドニゾロンまたは同等のコルチコステロイドで繰り返されてもよい。
一部の実施形態では、対象は、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてのホモ接合性優性遺伝子型を有していない。一部の実施形態では、対象は、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有していない。一部の実施形態では、対象は、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有しておらず、任意選択的に、遺伝子転座は、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である。一部の実施形態では、対象は、自己または同種幹細胞移植を以前に受けていない。一部の実施形態では、対象は、以前に細胞毒性剤を受けていない。
一部の実施形態では、方法は、対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、ゲムツズマブオゾガマイシンは、投与前に凍結乾燥形態から再構成される。一部の実施形態では、凍結乾燥形態は、凍結乾燥ケーキまたは粉末約４．５ｍｇを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥形態は、再構成および／または希釈のための単回投与バイアル中の凍結乾燥ケーキまたは粉末を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３３、またはその抗原結合断片に選択的に結合する一つまたは複数の他の抗体を使用して、対象を治療してもよい。一部の実施形態では、ＣＤ３３に選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、毒素に連結されて、対象におけるＣＤ３３発現癌細胞を標的にする。ＣＤ３３に選択的に結合する任意の抗体を使用してもよい。
一部の実施形態では、対象は、細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血幹細胞の集団の投与前にプレコンディショニングされている。一部の実施形態では、対象のプレコンディショニングは、対象に一つまたは複数の化学療法剤を投与することを含む。化学療法剤の例としては、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プレコンディショニングは、対象の全身照射を含む。一部の実施形態では、プレコンディショニングは、ヒトＴ細胞（例えば、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ））に結合する抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、プレコンディショニングは、細胞毒性剤および／または造血細胞の投与前２週間以内（例えば、１４日以内、１２日以内、１０日以内、９日以内、７日以内）に生じる。一部の実施形態では、プレコンディショニングは、約１日～約１０日の期間にわたって生じる。一部の実施形態では、プレコンディショニングは、約９日の期間にわたって生じる。
一部の実施形態では、本開示の組成物（例えば、造血細胞の集団、細胞毒性剤）は、非限定的に、経腸（腸内）、経胃腸、硬膜外（硬膜内）、経口（口経由）、経皮、硬膜外、脳内（大脳内）、脳室内（脳室内）、皮膚上（皮膚に適用）、皮内（皮膚自体内）、皮下（皮膚の下）、鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈内）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内）、筋肉内（筋肉内）、心臓内（心臓内）、骨内注入（骨髄内）、くも膜下腔内（脊柱管内）、腹腔内（腹膜内注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介して）、空洞内注射（病的洞内）、腔内（陰茎の付け根内）、腟内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無処置の皮膚を介した分散）、経粘膜（粘膜を介して分散）、経腟、ガス注入（鼻息）、舌下、口唇下、注腸、点眼（結膜上）、点耳薬内、耳介（耳内または経由）、口腔（頬方向）、結膜、皮膚、歯（葉または複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、内副鼻洞、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆汁内、気管支内、嚢状内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（馬尾内）、大槽内（大槽小脳延髄内）、角膜内（角膜内）、歯科角膜内、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の陰核海綿体の膨張可能な空間内）、円板内（乳頭内）、管内（腺の管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または下）、表皮内（表皮内）、食道内（食道内）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の遠位部内）、病巣内（局所病変内または局所病変への直接導入）、腔内（管腔内）、リンパ内（リンパ液内）、髄内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻内（鼻または眼窩周囲洞内）、脊髄内（脊柱内）、滑膜内（関節の滑膜腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、くも膜下腔内（脳脊髄軸の任意のレベルでの脳脊髄液内）、胸腔内（胸部内）、管内（器官の尿細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳内）、血管内（血管または複数の血管内）、脳室内（室内）、イオン導入（可溶性塩イオンが身体の組織内に侵入する、電流密度による）、灌注（開放創または体腔を浸す、または流すため）、喉頭（喉頭に直接）、鼻腔胃（鼻を介し、かつ胃内）、密封包帯技術（局所経路投与、次いで、包帯によって覆った範囲の封鎖）、点眼（眼の外側）、中咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸性（局所または全身作用のための経口または経鼻吸入による気道内）、眼球後（橋裏または眼球裏）、心筋内（心筋内）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を介して、または超えて）、経気管（気管壁を介して）、中耳（鼓室を超えて、または介して）、尿管（尿管に）、尿道（尿道に）、膣、仙骨ブロック、診断法、神経ブロック、胆汁灌流、心灌流、フォトフェレーシスおよび脊髄などの経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるように、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤の投与は、同じ投与経路（例えば、静脈内注入）によって、または異なる投与経路によって行われてもよい。
投与様式には、注射、点滴、点滴、および／または摂取が含まれる。「注射」は、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、水晶体内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮下、関節内、水晶体下、くも膜下、脊髄内、脳室内、ならびに胸骨内注射および注入を含む。いくつかの例では、経路は静脈内である。細胞の送達については、注射または注入による投与を行うことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された造血幹細胞の集団は、全身投与することができる。語句「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」および「末梢投与された」は、標的部位、組織、または器官への直接以外の前駆細胞の集団の投与を指し、その結果、それは、対象の循環系に進入し、したがって代謝および他の類似のプロセスの対象となる。
造血悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の治療のための組成物を有する治療の有効性は、当業者によって決定され得る。しかしながら、造血悪性腫瘍の徴候もしくは症状のいずれか一つもしくはすべてが、有益な様式で変化した場合、または他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、改良もしくは改善される場合、治療は、「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院または医学的介入の必要性（例えば、疾患の進行が停止されるかまたは少なくとも遅延される）によって評価されるように、個体が悪化しないことによって測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、および／または本明細書に記載される。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例は、ヒトまたは哺乳類を含む）における疾患の任意の治療を含み、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の退縮を引き起こすこと、および（３）症状の発症の可能性を防止または低減することを含む。
本明細書に記載される遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫のいずれかを含む、細胞の集団を含む臨床調製物もまた、本明細書において提供される。一部の実施形態では、組成物は、培地中の１ミリリットル（ｍＬ）当たり少なくとも１×１０６細胞の集団を含み、細胞の集団は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫を含む。一部の実施形態では、集団は、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６細胞を含む。
一部の実施形態では、培地は、約５～１５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約１０～１００ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約２５～７５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３０～７０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０～６０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約３５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約５５ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約６０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約７０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０～５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４０ｍＬ、４１ｍＬ、４２ｍＬ、４３ｍＬ、４４ｍＬ、４５ｍＬ、４６ｍＬ、４７ｍＬ、４８ｍＬ、４９ｍＬ、または約５０ｍＬの体積を有する。一部の実施形態では、培地は、約４５ｍＬの体積を有する。
一部の実施形態では、組成物は、培地中トータル約１×１０６～１×１０８細胞の集団を含む。一部の実施形態では、組成物は、培地中トータル約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、または１×１０８細胞の集団を含む。一部の実施形態では、集団は、１ｍＬ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６個の細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、１ｍＬ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６個の細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１×１０９個の生細胞、少なくとも２×１０９個の生細胞、少なくとも３×１０９個の生細胞、少なくとも４×１０９個の生細胞、少なくとも５×１０９個の生細胞、少なくとも６×１０９個の生細胞、少なくとも７×１０９個の生細胞、少なくとも８×１０９個の生細胞、少なくとも９×１０９個の生細胞、少なくとも１×１０１０個の生細胞、少なくとも２×１０１０個の生細胞、少なくとも３×１０１０個の生細胞、少なくとも４×１０１０個の生細胞、少なくとも５×１０１０個の生細胞、少なくとも６×１０１０個の生細胞、少なくとも７×１０１０個の生細胞、少なくとも８×１０１０個の生細胞、少なくとも９×１０１０個の生細胞、または少なくとも１×１０１１個の生細胞を含み、一部の実施形態では、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である。
一部の実施形態では、集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である。
一部の実施形態では、培地は、抗凍結剤を含む凍結保存培地である。一部の実施形態では、培地は、抗凍結剤を含む凍結保存培地である。抗凍結剤の非限定的な例としては、セタミド、アガロース、アルギン酸塩、１－アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、ａ－グリセロールリン酸塩、グリセロールモノアセテート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ－オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、尿素、バリン、およびキシロースが挙げられる。一部の実施形態では、抗凍結剤は、約１０％（ｖ／ｖ）の量でＤＭＳＯを含む。
一部の実施形態では、組成物は、凍結された状態にある。一部の実施形態では、組成物は、凍結保存プロセスに供されている。当業者であれば明らかであるように、凍結保存プロセスは、例えば、細胞を含む試料を低温（例えば、－８０℃以下で）で冷却し、貯蔵することによって、（生存可能な）細胞を保存することを目的とした方法である。一部の実施形態では、凍結保存プロセスは、速度を制御した凍結である。
ゲノム編集
本開示の態様は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子操作された造血細胞、またはその子孫の集団に関する。ＣＤ３３をコードする遺伝子は、細胞が、ＣＤ３３抗原の発現を低減するか、または除去するように、当該技術分野で公知の任意の手段によって操作されてもよい。
標的ドメインとのｇＲＮＡ相互作用に関して本明細書で使用される場合、用語「結合する」は、ｇＲＮＡ分子および複合体を形成する標的ドメインを指す。複合体は、二本鎖構造を形成する二つの鎖、または多鎖の複合体を形成する三つ以上の鎖を含んでもよい。結合は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的ドメインの切断などの、より広範なプロセスにおける工程を構成し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、完全相補性で標的ドメインに結合し、他の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、一つまたは複数のミスマッチで、部分相補性を有する標的ドメインに結合する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡが標的ドメインに結合するとき、ｇＲＮＡ塩基の全標的ドメインは、標的ドメインと対形成する。他の実施形態では、標的ドメインの部分のみ、および／または標的ドメイン塩基の部分のみが、他と対形成する。一実施形態では、相互作用は、標的ドメイン介在性切断現象を介在するのに十分である。
本明細書で使用される用語である「Ｃａｓ９分子」は、ｇＲＮＡと相互作用し、ｇＲＮＡと協調して、標的ドメインを含む部位に向かうか、または局在化することができる分子またはポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子、および例えば、天然に存在するＣａｓ９分子と少なくとも一つのアミノ酸残基によって異なる、操作、変更または改変されたＣａｓ９分子を含む。
用語「ｇＲＮＡ」および「ガイドＲＮＡ」は、全体を通して互換的に使用され、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の標的核酸への特異的標的化またはホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡは、本明細書ではｓｇＲＮＡと称されることもある、単分子（単一のＲＮＡ分子を有する）、またはモジュール式（一つより多く、典型的には、二つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡは、宿主細胞のゲノム中の標的ドメインに結合してもよい。ｇＲＮＡ（例えば、その標的化ドメイン）は、標的ドメインに対して部分的または完全に相補的であってもよい。ｇＲＮＡはまた、（例えば、ｇＲＮＡ配列の標的化ドメインによって）ｇＲＮＡ配列に結合された標的ドメインにＣａｓ９分子をリクルートする、「足場配列」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含んでもよい。足場配列は、少なくとも一つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼをリクルートしてもよい。例示的な足場配列は、例えば、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９３６９４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号において見ることができる。
用語「変異」は、参照配列、例えば、対応する野生型核酸と比較して、核酸の遺伝子変化（例えば、挿入、欠失、または置換）を指すために本明細書において使用される。一部の実施形態では、遺伝子に対する変異は、遺伝子によって産生されるタンパク質を脱標的化する。一部の実施形態では、脱標的化されたＣＤ３３タンパク質は、ＣＤ３３を標的とする薬剤によって結合されず、またはより低いレベルで結合される。
ｇＲＮＡの「標的ドメイン」は、標的核酸上の「標的ドメイン」に対して相補的である。ｇＲＮＡのコアドメインに相補的なヌクレオチド配列を含む標的核酸の鎖は、本明細書において標的核酸の「相補鎖」と称される。標的ドメインの選択に関するガイダンスは、例えば、Ｆｕ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１４）３２：２７９－２８４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５０７（７４９０）：６２－７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）に見出すことができる。
ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞（例えば、ＨＳＣまたはＨＰＣ）は、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して作製される。例示的なヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡと組み合わせて使用される（例えば、表３に従う）。
Ｃａｓ９分子
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９分子と複合体化される。様々なＣａｓ９分子が使用され得る。一部の実施形態では、ＣＤ３３中の標的ドメインに対してｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体を標的とする所望のＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９分子が選択される。一部の実施形態では、細胞を遺伝子操作することは、一つまたは複数（例えば、１、２、３つ以上）のＣａｓ９分子を細胞に導入することを含む。
様々な種のＣａｓ９分子を、本明細書に記載される方法および組成物に使用することができる。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）またはストレプトコッカス・サーモフィラスのものであるか、または由来する。追加の好適なＣａｓ９分子としては、黄色ブドウ球菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ属、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ属、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、若しくはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅのもの、又はそれらに由来するものが含まれる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、例えば、少なくとも一つのアミノ酸残基だけ、参照配列、例えば、最も類似する天然に存在するＣａｓ９分子、又は参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１５７０７０号の表５０の配列と異なる、操作、改変、又は修飾されたＣａｓ９分子である。
天然に存在するＣａｓ９分子は、典型的には、二つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブ及びヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、その各々は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号、例えば、その中の図９Ａ～９Ｂ（その出願が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されるドメインを更に含む。
ＲＥＣローブは、アルギニン豊富ブリッジヘリックス（ＢＨ）、ＲＥＣ１ドメイン、及びＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９特異的機能ドメインであると考えられる。ＢＨドメインは、長いアルファヘリックス及びアルギニン豊富領域であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸６０～９３を含む。ＲＥＣ１ドメインは、例えば、ｇＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡの反復：抗反復二本鎖の認識に関与する。ＲＥＣ１ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸９４～１７９及び３０８～７１７に二つのＲＥＣ１モチーフを含む。これら二つのＲＥＣ１ドメインは、線形一次構造ではＲＥＣ２ドメインによって分離されているが、三次構造に集合し、ＲＥＣ１ドメインを形成する。ＲＥＣ２ドメイン又はその一部はまた、反復：抗反復二本鎖の認識において役割を果たし得る。ＲＥＣ２ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１８０～３０７を含む。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン（本明細書ではＲｕｖＣ様ドメインとも称される）、ＨＮＨドメイン（本明細書ではＨＮＨ様ドメインとも称される）、及びＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、それぞれ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１～５９、７１８～７６９、及び９０９～１０９８において、三つの分割ＲｕｖＣモチーフ（当技術分野ではしばしば、ＲｕｖＣＩドメイン、又はＮ末端ＲｕｖＣドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインと一般的に称される、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩ）から組み立てられる。ＲＥＣ１ドメインと同様に、三つのＲｕｖＣモチーフは、一次構造内の他のドメインによって直線的に分離されるが、三次構造では、三つのＲｕｖＣモチーフは、集合してＲｕｖＣドメインを形成する。ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩ－ＩＩＩモチーフの間に存在し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸７７５～９０８を含む。ＰＩドメインは、標的核酸分子のＰＡＭと相互作用し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の配列のアミノ酸１０９９～１３６８を含む。
結晶構造が、天然に存在する細菌Ｃａｓ９分子（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１４）３４３（６１７６）：１２４７９９７を参照）、及びガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合）を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６：９３５－９４９、及びＡｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３５７９を参照）について決定されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、ヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼの触媒残基のうちの一つを不活化するように修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ニッカーゼであり、一本鎖切断を生じる。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照されたい。酵素のＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の一つ以上の変異が、Ｃａｓ９効率を改善し得ることが示されている。例えば、Ｓａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、第二のドメイン、例えば、ＤＮＡ又はクロマチンを修飾するドメイン、例えば、デアミナーゼ又はデメチラーゼドメインに融合される。いくつかのそのような実施形態では、Ｃａｓ９分子は、そのエンドヌクレアーゼ活性を排除するように修飾される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、相同誘導型修復（ＨＤＲ）のためのテンプレートとともに投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓ９分子は、ＨＤＲテンプレートなしで投与される。
いくつかの実施形態では、酵素の特異性を強化する（例えば、標的外効果を低減し、堅調な標的上切断を維持する）ように修飾される、Ｃａｓ９分子が使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、強化特異性Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照されたい。
様々なＣａｓ９分子が、当技術分野で公知であり、様々な供給源から入手され、酵素の一つ以上の活性又は特異性を調節するように操作／修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、一つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子が操作／修飾を伴わずに認識するＰＡＭ配列とは異なる一つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、酵素の標的外活性を低減するように操作／修飾されている。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を改変する（例えば、標的外切断を低減し、細胞内のエンドヌクレアーゼ活性又は存続期間を減少させ、相同誘導型組換えを増加させ、非相同末端結合を低減する）ように更に修飾される、Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列がさらに改変される。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識を変えるように改変される。例えば、Ｃａｓ９分子ＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識し、一方、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）の一つまたは複数の修飾を含むＳｐＣａｓ９の不完全バリアントは、ＰＡＭ配列ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧを認識し得る。改変されたＣａｓ９分子のＰＡＭ認識は、Ｃａｓ９分子が、改変されていないＣａｓ９分子と比較して、より多くの潜在的なＰＡＭ配列を認識する場合、「不完全」とみなされる。例えば、Ｃａｓ９分子ＳａＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識する一方で、一つ以上の修飾を含むＳａＣａｓ９の不完全なバリアント（例えば、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。一例は、Ｃａｓ９分子ＦｎＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識する一方で、エンドヌクレアーゼの一つまたは複数の改変を含むＦｎＣａｓ９の不完全なバリアント（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。一例は、Ｃａｓ９分子は、置換変異Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。一例は、Ｃａｓ９分子は、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、およびＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、一つより多く（例えば、２つ、３つ、又はそれ以上）のＣａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子が使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子のうちの少なくとも一つは、Ｃｐｆ１酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子のうちの少なくとも一つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、少なくとも一つのＣａｓ９分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓではない生物に由来する。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、塩基エディタである。塩基エディタエンドヌクレアーゼは、概して、機能ドメインに融合された触媒的に不活性なＣａｓ９分子を含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、ｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子（ｄＣａｓ９）は、一つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、低減した活性を有し、ｎＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、一つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合されたｎＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｎＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｎＣａｓ９を含む。
塩基エディタの例としては、限定されるものではないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰが挙げられる。塩基エディタの追加の例は、例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１８／０３１２８２５Ａ１号、米国公開第２０１８／０３１２８２８Ａ１号、及びＰＣＴ公開第２０１８／１６５６２９Ａ１号で見出すことができる。
一部の実施形態では、塩基エディタは、標的部位での塩基除去修復を阻害し、細胞ミスマッチ修復を誘導するようさらに改変されている。本明細書に記載されるＣａｓ９分子のいずれかは、Ｇａｍドメイン（バクテリオファージＭｕタンパク質）に融合されて、分解およびエクソヌクレアーゼ活性からＣａｓ９分子を保護することができる。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４を参照されたい。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのクラス２Ｖ型に属する。クラス２のＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、及びＶ－Ｕ型として更に分類することができる。例えば、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼなどのＶ－Ａ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼなどのＶ－Ｂ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｍａｄ７（商標）（Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ）である。あるいは、または加えて、Ｃａｓ９分子は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはそのバリアントである。当業者によって理解されるように、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼはまた、Ｃａｓ１２ａと呼んでもよい。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物または方法は、プレボテラ属もしくはフランシセラ属、アシダミノコッカス属（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ細菌（ＬｐＣｐｆ１）、またはユウバクテリウム・レクターレに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むか、または宿主細胞は、それを発現する。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現に最適化されたコドンであってもよい。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を変化させるためにさらに改変される。
一部の実施形態では、Ｃａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）の触媒的に不活性なバリアントは、本明細書に記載される方法に従って使用される。Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）の触媒的に不活性なバリアントは、ｄＣａｓ１２ａと呼ばれてもよい。本明細書に記載されるように、Ｃｐｆ１の触媒的に不活性なバリアントは、機能ドメインに融合されて、塩基エディタを形成してもよい。例えば、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照されたい。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９分子は、ｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、一つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合されたｄＣａｓ１２ａを含む。
あるいは、または加えて、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントである。Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは、古細菌に由来し、サイズが小さい傾向がある（例えば、４００～７００アミノ酸）。さらに、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を必要としない。例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）３６２（６４１６）を参照されたい。
本明細書に記載されるＣａｓ９分子のいずれかは、所望の時点で、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルを制御するように調節されてもよい。例えば、細胞周期の特定相（複数可）の間にＣａｓ９分子の発現および／または活性のレベルを増加させることが有利であり得る。細胞周期のＧ１相の間に相同性指定修復のレベルが低減されることが実証されており、従って、Ｓ相、Ｇ２相、および／またはＭ相の間のＣａｓ９分子の発現および／または活性のレベルの増加は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ編集後の相同性指定修復を増加させ得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルは、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、および／またはＭ期の間に増加する。一例では、Ｃａｓ９分子は、ヒトゲミニンのＮ末端領域に融合されている。例えば、Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（２０１６）１４（６）：１５５５－１５６６を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子の発現および／または活性のレベルは、細胞周期のＧ１期の間に低減する。一例では、Ｃａｓ９分子は、Ｇ１期の間に活性が低下するように改変される。例えば、Ｌｏｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２０１８）３７（２）：２８４－２９４を参照されたい。
あるいは、または追加で、本明細書に記載されるＣａｓ９分子のいずれかは、エピジェネティック修飾剤（例えば、クロマチン修飾酵素、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ）に融合されてもよい。例えば、Ｋｕｎｇｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．（２０１６）３２（２）：１０１－１１３を参照されたい。エピジェネ修飾剤に融合されたＣａｓ９分子は、「エピエフェクター」と呼ばれ、一時的および／または一時的なエンドヌクレアーゼ活性を可能にし得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、クロマチン修飾酵素に融合されたｄＣａｓ９である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞集団は、亜鉛フィンガー（ＺＦＮ）テクノロジーを使用して産生される。一部の実施形態では、ＺＦＮは、本明細書、例えば、表１に記載される標的ドメインを認識する。一般に、亜鉛フィンガー媒介ゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を伴い、典型的には、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。亜鉛フィンガー結合ドメインは、対象の任意の標的ドメインを認識し、結合するように操作されてもよく、例えば、約３ヌクレオチド～約２１ヌクレオチド長、または約８～約１９ヌクレオチド長の範囲のＤＮＡ配列を認識するよう設計されてもよい。亜鉛フィンガー結合ドメインは、典型的には、少なくとも三つの亜鉛フィンガー認識領域（例えば、亜鉛フィンガー）を含む。
（認識部位での）ＤＮＡへの配列特異的結合および結合部位またはその近傍でのＤＮＡの切断が可能な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、当該技術分野で公知であり、ゲノム編集で使用するためのＺＦＮを形成するために使用され得る。例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。一例では、ＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼから誘導されてもよい。
ＴＡＬＥＮ
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞集団は、ＴＡＬＥＮテクノロジーを使用して産生される。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、本明細書、例えば、表１に記載される標的ドメインを認識する。一般に、ＴＡＬＥＮは、所望の標的ＤＮＡ分子に特異的に結合し、切断することができる操作された制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、典型的には、ＤＮＡ切断ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＤＮＡ結合ドメインは、１２位および１３位に、分岐２アミノ酸ＲＶＤ（反復可変ジペプチドモチーフ）を有する高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含有してもよい。ＲＶＤモチーフは、核酸配列への結合特異性を決定し、所望のＤＮＡ配列に特異的に結合するように操作することができる。一例では、ＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼから誘導されてもよい。一部の実施形態では、ＦｏｋＩドメインは、適切な向き、および間隔で標的ゲノム中の部位に対して固有のＤＮＡ結合ドメインを有する二つの構築物を使用して、二量体として機能する。
対象の標的遺伝子に特異的なＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生することができる。修復機構が、非相同末端結合を介して破損を不適切に修復する場合、変異は、切断部位に導入され得る。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を生じさせ得る。あるいは、所望の配列を有する外来ＤＮＡ分子を、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入することができる。外来ＤＮＡの配列および染色体配列に応じて、このプロセスを使用して、欠陥を補正するか、もしくはＤＮＡ断片を対象の標的遺伝子に導入するか、またはそのような欠陥を内在遺伝子に導入し、従って、標的遺伝子の発現を減少することができる。
本明細書において提供されるガイドＲＮＡおよび遺伝子操作法に関連して使用するのに適したエンドヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントのいくつかの例示的な非限定的な実施形態は、上記に記載されている。追加の好適なヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントは、本開示および当該技術分野の知見に基づき、当業者に明らかであろう。本開示は、この点に関して限定されない。
ｇＲＮＡ配列および配置
ｇＲＮＡは、多数のドメインを含み得る。一実施形態では、一分子、ｓｇＲＮＡ、またはキメラｇＲＮＡは、例えば、５’から３’に、標的ドメイン（ＣＤ３３遺伝子中の標的核酸に対して相補的である）、第一の相補性ドメイン、連結ドメイン、第二の相補性ドメイン（第一の相補性ドメインに対して相補的である）、近位ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む。これらのドメインの各々が、ここでより詳細に記載される。
標的ドメインは、例えば、標的核酸上の標的配列に対して少なくとも８０、８５、９０、または９５％の相補性、例えば、完全な相補性であるヌクレオチド配列を含んでもよい。標的ドメインは、ＲＮＡ分子の一部であり、したがって、塩基ウラシル（Ｕ）を含み、一方、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含む。理論によって拘束されることを所望しないが、一実施形態では、標的ドメインの標的配列との相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的ドメインおよび標的配列対において、標的ドメイン中のウラシル塩基は、標的配列中のアデニン塩基と対形成することが理解される。一実施形態では、標的ドメイン自体は、５’から３’方向に、任意の二次ドメイン、およびコアドメインを含む。一実施形態では、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。一実施形態では、標的ドメインは、長さが５～５０個のヌクレオチドである。標的ドメインは、１５～２５ヌクレオチド長、１８～２２ヌクレオチド長、または１９～２１ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、標的ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的ドメインは、１０～３０、または１５～２５ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、参照によりその全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号に記載されるように、コアドメインと、二次標的化ドメインとを含む。一実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３’末端から約８～約１３個のヌクレオチド（例えば、標的化ドメインの最も３’位の８～１３個のヌクレオチド）を含む。一実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５’に位置付けられる。多くの実施形態では、コアドメインは、標的配列の対応する領域と正確な相補性を有する。他の実施形態では、コアドメインは、標的配列の対応するヌクレオチドと相補性でない１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。
第一の相補性ドメインは、第二の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第二の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一実施形態では、第一の相補性ドメインは、長さが５～３０個のヌクレオチドである。一実施形態では、第一の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。一実施形態では、５’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。一実施形態では、中央サブドメインは、長さが１個、２個、又は３個、例えば、１個のヌクレオチドである。一実施形態では、３’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。第一の相補性ドメインは、天然に存在する第一の相補性ドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一実施形態では、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの第一の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
上述のドメインの配列及び配置は、その中のページ８８～１１２を含む、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１５７０７０号により詳細に記載されている。
結合ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第一の相補性ドメインを第二の相補性ドメインと結合する役割を果たす。結合ドメインは、第一及び第二の相補性ドメインを共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。一実施形態では、結合は、共有結合である。一実施形態では、結合ドメインは、第一の相補性ドメインと第二の相補性ドメインとの間に介在する共有結合であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、一つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２６１７６号に開示される、少なくとも一つの非ヌクレオチド結合を含む。
第二の相補性ドメインは、少なくとも部分的に、第一の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第二の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。一実施形態では、第二の相補性ドメインは、第一の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループを作る配列を含むことができる。一実施形態では、第二の相補性ドメインは、長さが５～２７個のヌクレオチドである。一実施形態では、第二の相補性ドメインは、第一の相補性領域よりも長い。一実施形態では、相補ドメインは、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチドである。一実施形態では、第二の相補性ドメインは、５’から３’の方向に、５’サブドメイン、中央サブドメイン、及び３’サブドメインである、３つのサブドメインを含む。一実施形態では、５’サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。一実施形態では、中央サブドメインは、長さが１個、２個、３個、４個、又は５個、例えば、３個のヌクレオチドである。一実施形態では、３’サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。一実施形態では、第一の相補性ドメインの５’サブドメイン及び３’サブドメインは、それぞれ、第二の相補性ドメインの３’サブドメイン及び５’サブドメインと相補的、例えば、完全に相補的である。
一実施形態では、近位ドメインは、長さが５～２０個のヌクレオチドである。一実施形態では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一実施形態では、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ近位ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。
広範囲のテールドメインが、ｇＲＮＡで使用するために好適である。一実施形態では、テールドメインは、長さが０（不在）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然に存在するテールドメインの５’末端からの配列に由来するか、又はそれと相同性を共有する。一実施形態では、テールドメインは、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する配列を含む。一実施形態では、テールドメインは、存在しないか、又は長さが１～５０個のヌクレオチドである。一実施形態では、テールドメインは、天然に存在する近位テールドメインと相同性を共有するか、又はそれに由来し得る。一実施形態では、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、又はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓテールドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。一実施形態では、テールドメインは、３’末端に、インビトロ又はインビボ転写の方法に関連するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、例えば、５’から３’に、標的ドメイン（ＣＤ３３遺伝子中の標的核酸に相補的である）、および第一の相補性ドメインを含む第一の鎖、ならびに好ましくは５’から３’に、任意選択的に、５’伸長ドメイン、第二の相補性ドメイン、近位ドメイン、および任意選択的に、テールドメインを含む第二の鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾されている。例えば、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾糖（例えば、３’末端および５’末端の一方または両方）、２’－Ｆ修飾糖、リボース糖の二環式ヌクレオチド－ｃＥｔでの置換、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される一つまたは複数の修飾を含んでもよい。適切なｇＲＮＡ修飾は、例えば、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（５１）Ｅ７１１０－Ｅ７１１７およびＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５）Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８９に記載され、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、例えば、少なくとも２、３、４、５、又は６個の２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、三つの末端位置及び５’末端に、並びに／又は三つの末端位置及び３’末端に、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、参照によりそれらの全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／２１４４６０号、同ＷＯ２０１６／０８９４３３号、及び同ＷＯ２０１６／１６４３５６号に記載されるように、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、化学的に修飾されている。例えば、ｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端の両方に、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及び３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸塩結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の２’－Ｏ修飾及び３’－リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’及び３’末端に、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、一つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾及び３’リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の非架橋酸素原子は、硫黄原子に置き換えられている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、一つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端からの第二のヌクレオチド、５’末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端からの第四のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。
本明細書において提供されるガイドＲＮＡおよび遺伝子操作法に関連して使用するのに適した修飾、例えば、化学修飾のいくつかの例示的な非限定的な実施形態は、上記に記載されている。追加の適切な修飾、例えば、化学修飾は、本開示ならびに非限定的に、Ｈｅｎｄｅｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１５）Ｖｏｌ ３３，Ｎｏ．９；ＰＣＴ公開第２０１７／２１４４６０号；第２０１６／０８９４３３号；および／または第２０１６／１６４３５６号当該技術分野の知見に基づき当業者に明らかとなり、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＣＤ３３を標的とするｇＲＮＡ
本開示は、エンドヌクレアーゼをヒトＣＤ３３に標的化することができる多数の有用なｇＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるｇＲＮＡは、ＣＤ３３のエクソン３中の配列を標的とする。以下の表１は、本明細書に記載されるｇＲＮＡによって結合され得るヒト内因性ＣＤ３３遺伝子内の標的ドメインを例証する。
表１．ヒトＣＤ３３の例示的なＣａｓ９標的部位配列が提供され、そのような部位を標的化するために有用である例示的な標的化ドメイン配列も同様である。各標的部位について、第一の配列は、ＤＮＡ標的ドメイン配列を表し、第二の配列は、その逆補体を表し、第三の配列は、それぞれの標的部位を標的とするために使用され得るｇＲＮＡの例示的な標的化ドメイン配列を表す。
ＣＤ３３（ＣＣＤＳ３３０８４．１）ｃＤＮＡ配列は、配列番号１６として以下で提供される。エクソン３に下線を付す。
ＣＤ３３のエクソン３は、配列番号１７として以下で提供される。下線は、ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｂ、ｇＲＮＡ Ｃ、ｇＲＮＡ Ｄ（またはその逆補体）に対して相補的な領域を示す。ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ Ｂ、およびｇＲＮＡ Ｄの標的領域が部分的に重複していることに注意されたい。
二重ｇＲＮＡ組成物及びその使用
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、表１のｇＲＮＡ）は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをゲノム内の二つの部位に標的化するために、第二のｇＲＮＡと組み合わせて使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞が、二つの薬剤：抗ＣＤ３３剤及び第二の系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤に耐性を示し得るように、ＣＤ３３及び第二の系統特異的細胞表面抗原などが欠損している造血細胞を産生することが所望される。いくつかの実施形態では、例えば、二回の切断を行い、二つの切断部位の間に欠失を作製するために、細胞を、ＣＤ３３の異なる領域を標的とする二つの異なるｇＲＮＡと接触させることが望ましい。したがって、本開示は、ｇＲＮＡの様々な組み合わせを提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される二つ以上（例えば、２、３、４つ以上）のｇＲＮＡが混合される。一部の実施形態では、各ｇＲＮＡは、別個の容器中にある。一部の実施形態では、本明細書に記載されるキット（例えば、表１による一つまたは複数のｇＲＮＡを含むキット）はまた、Ｃａｓ９分子、またはＣａｓ９分子をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、第一および第二のｇＲＮＡは、表１によるｇＲＮＡまたはそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１のｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＳ１、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、限定されるものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞性ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（一般的な（Ｂ前）急性リンパ性白血病及び悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ２６（上皮及びリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科がん、胆管がん、及び膵管腺がん）、並びに前立腺特異的膜抗原などの特定のタイプの癌と関連する系統特異的細胞表面抗原を標的とする。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５６、９６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１７４、ＣＬＬ－１、ＢＣＭＡ、葉酸受容体β、ＩＬ１ＲＡＰ、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＫＧ２ＤＬ、ＴＩＭ－３、またはＷＴ１。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２またはＣＤ３６３
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＥＣＬ１）；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＣＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｅｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；タンパク質分解酵素セリン２１（テスチシンまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胚抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（Ｐｒｏｓｏｍｅ、Ｍａｃｒｏｐａｉｎ）サブユニット、ベータ型９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；限界点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ－ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量－メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍血管内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨ糖セラミド（ＧｌｏｂｏＨ）のヘキササッカリド部分；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体；遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；味覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；メラノーマ癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；メラノーマ癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座限界点；アポトーシスのメラノーマインヒビター（ＭＬ－１ＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型タンパク質分解酵素、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対形成ボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子ニューロブラストーマ由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；チトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（インプリント部位の制御因子のＢＯＲＩＳまたは同類）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）；対形成ボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ限界点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）を含有するＥＧＦ様モジュール、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１５７、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２１７、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３０５、ＣＤ３１７、ＣＤ３２１、およびＣＬＬ１。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ１２３、ＣＬＬ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１）、ＣＤ１１７（ｃ－ＫＩＴ）、ＦＲβ（ＦＯＬＲ２）、ＣＤ４７、ＣＤ８２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＣＤ１２０Ｂ）、ＣＤ１９１、ＣＤ９６、ＰＴＰＲＪ（ＣＤ１４８）、ＣＤ７０、ＬＩＬＲＢ２（ＣＤ８５Ｄ）、ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒａｌｐｈａ）、ＣＤ４４、ＣＤ９６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、およびＣＤ８２。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、以下から選択される系統特異的細胞表面抗原を標的とする：ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＤ８２、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０Ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１９１、ＣＤ２１７、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３０５、ＣＤ３１７、ＣＤ３２１、ＣＬＬ１、ＦＲβ（ＦＯＬＲ２）、またはＮＫＧ２Ｄリガンド。
いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、ＣＬＬ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、第一のｇＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、表１によるｇＲＮＡ又はそのバリアント）であり、第二のｇＲＮＡは、ＣＤ１２３を標的とする。
本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のうちのいくつかが、以下の実施例からより完全に理解されるであろう。実施例は、本開示の利益のうちのいくつかを例証し、かつ特定の実施形態を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。
実施例１．ＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む遺伝子操作された造血細胞の生成
表１に示すＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを、標的領域への近接したＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（５′－ＮＧＧ－３′）に基づき設計し、オンライン検索アルゴリズム（例えば、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇアルゴリズム、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１６、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３）を用いてヒトゲノム内の潜在的な標的外部位を最小限化することによって、予測した特異性に従って評価した。
Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡを、以下で提供するｇＲＮＡ標的ドメインおよびＣａｓ９ ｓｇＲＮＡスキャホールド配列を使用して合成する
５’－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣ
ＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号１８）。
例えば、ｓｇＲＮＡ Ａのヌクレオチド配列は、
（配列番号１９、標的化ドメイン配列は太字）。
例えば、ｓｇＲＮＡ Ｂのヌクレオチド配列は、
（配列番号２０、標的化ドメインは太字）。
例えば、ｓｇＲＮＡ Ｃのヌクレオチド配列は、
（配列番号２１、標的化ドメインは太字）。
例えば、ｓｇＲＮＡ Ｄのヌクレオチド配列は、
（配列番号２２、標的化ドメインは太字）。
例えば、ｓｇＲＮＡ Ｅのヌクレオチド配列は、
（配列番号２３、標的化ドメインは太字）。
全ての設計された合成ｓｇＲＮＡを、５’及び３’末端の両方における三つの末端位置で、化学的に修飾されたヌクレオチドを用いて生産した。修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ｍｓ」と省略される）を含み、ｍｓ－ｓｇＲＮＡをＨＰＬＣ精製する。Ｃａｓ９タンパク質を、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから購入する。
例えば、修飾ヌクレオチドを示すｓｇＲＮＡ Ａのヌクレオチド配列は、
（配列番号２４、標的化ドメインは太字）。
例えば、修飾ヌクレオチドを示すｓｇＲＮＡ Ｅのヌクレオチド配列は、
（配列番号２５、標的化ドメインは太字）。
末梢血単核細胞を、造血幹細胞の動員後のアフェレーシスによって、健康なドナー対象から収集する。ドナーＣＤ３４＋細胞を、Ｃａｓ９タンパク質および例えば、表１および３に提供する標的化ドメイン配列を有する、本明細書に開示する示したＣＤ３３標的化Ｃａｓ９ｇＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ Ａ、ｇＲＮＡ、Ｂ、ｇＲＮＡ Ｃ、ｇＲＮＡ Ｄ、またはｇＲＮＡ Ｅでエレクトロポレーションする。
編集した細胞を、４８時間未満培養する。採取後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。
編集したＨＳＣの代表的な試料を、抗ＣＤ３３抗体（例えば、Ｐ６７．７）を使用してＣＤ３３について染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ３３の生存率および発現、またはその不在について評価する。電気穿孔の４８時間後に、少なくとも７０％の細胞生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率（すなわち、細胞集団内の細胞の少なくとも４５％におけるＣＤ３３発現の不在）を示す編集したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＨＣＴに使用する。
実施例２：ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）を用いた併用治療
ＣＤ３３は、正常な骨髄細胞、ならびに多くの白血病性骨髄芽球で発現する膜貫通型受容体である（例えば、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ（２００５）１０４（７）：１４４２－１４５２；Ｋｅｎｄｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１５）２９（８）：１６３７－４７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１５）２３（１）：１８４－９１；Ｐｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１６）３４（７：７４７－５５）。ＣＤ３３の発現を低減または除去するように遺伝子操作されている造血幹細胞（「ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＣ」または「ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ」）は、ＣＤ３３指向療法に関連すると報告されているオンターゲット、オフ癌細胞障害に感受性がないため、ＣＤ３３指向療法の安全性および有効性を改善する可能性を有し、従って、最適な用量およびスケジュール、例えば、治療の遅延または用量最適化なく、ＣＤ３３指向療法の投与を可能にする。
本明細書に提供する治療レジメンは、急性骨髄性白血病、またはその前悪性段階、例えば、骨髄異形成症候群を有する対象に関する。現在、ＣＤ３３指向療法は、正常な骨髄系細胞を対象とするオンターゲット細胞傷害によって制限されている。本明細書に提供するアプローチは、ＣＤ３３標的化療法が認識するＣＤ３３エピトープの発現を欠く遺伝子操作したＨＳＰＣを投与することによって、このオンターゲット毒性を除去する。その後、正常な骨髄区画を、ＣＤ３３標的化療法のオンターゲット効果から保護し、これらの薬剤に対する治療指数の改善、およびＡＭＬを有する対象にとって可能性のある良好な予後をもたらす。
本実施例は、ＣＤ３３の発現を欠く、同種または自己ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを使用した治療レジメンを提供する。同種ｅＨＳＰＣを、レシピエントとＨＬＡが一致した健康なドナー、すなわち、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを受けている対象から得たＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）濃縮幹細胞を処理することによって得る。自家ｅＨＳＰＣを、治療している同じ対象から得たＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）濃縮幹細胞を処理することによって得、すなわち、ＨＳＰＣドナーとＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを受けている対象は同じである。ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを、造血細胞移植（ＨＣＴ）の一部としてコンディショニングレジメンを受けた後のレシピエント対象に注入する。
ゲムツズマブオゾガマイシン
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）は、新たに診断したＡＭＬを有するＣＤ３３陽性（ＣＤ３３＋）成人対象、ならびに生後１ヶ月以上の再発または難治性ＡＭＬ（Ｒ／Ｒ ＡＭＬ）を有する対象を治療するための、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したＣＤ３３指向抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
ＡＭＬを有する再発または難治性対象の場合、現在、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が、唯一の、米国ＦＤＡが承認したＣＤ３３指向療法である。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の米国処方情報（Ｍｙｌｏｔａｒｇ ２０２０）の「処方情報のハイライト」ならびに承認の概要に関する米国ＦＤＡ刊行物において提供されてる分析は、用量２ｍｇ／ｍ２（Ｎｏｒｓｗｏｒｔｈｙ ２０１８）で、入手可能なＣＤ３３が、ＡＭＬを有する対象において飽和していることを示唆する。さらに、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）投与に関連する重度かつ時に致死的な毒性である、正弦波閉塞症候群／静脈閉塞性疾患（ＳＯＳ／ＶＯＤ）のリスクは、低用量で大幅に低減する。この潜在的により大きな安全性限界は、対象が、ＳＯＳ／ＶＯＤのリスクがより高いことが知られている、ＨＣＴ後の設定での用量の低減を支持する。現在のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）米国ＦＤＡ承認製品ラベルでは、最大８サイクルの間、４週間毎に１日目に投与した２ｍｇ／ｍ２の「継続」用量およびスケジュールを、疾患の進行の証拠のないＡＭＬを有する対象について挙げる。
本明細書において提供する臨床治療レジメンでは、同様の「継続」用量およびスケジュールを、それらのＨＣＴの一部としてＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを受け取った対象において、ＨＣＴのほぼ６０日後に使用する。これは、早期の白血病の再発を抑制するための、ＨＣＴ後の設定でのゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与における安全性の可能性のあるより大きな限界をもたらし、これにより、対象がより強固な免疫学的再構成を受けることができ、それによって、より長期の「移植片対白血病」効果をもたらすという論拠がある。
対象
本明細書において提供する、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を含む幹細胞移植を用いて、ＡＭＬまたはその前悪性形態を有する対象を治療するための臨床レジメンは、ＣＤ３３の発現によって特徴付けられるＡＭＬ、または例えば、ＣＤ３３の発現によって特徴付けられる、ＡＭＬの前悪性形態、例えばＭＤＳを有するか、または診断された対象を治療するのに有用である。これは、ＡＭＬ療法を受けなかった対象；例えば、誘導療法を含む、いくつかの形態のＡＭＬ療法を受けた対象；ＡＭＬ療法に応答して完全な血液学的寛解（末梢計数［ＣＲｉ］の不完全な回復を伴う完全寛解を含む、ＣＲ１またはＣＲ２）を経験した対象；および例えば、骨髄芽球数≦１０％を有し、循環芽球の臨床的証拠のない対象を含む、残存疾患を有する対象を含む、残存疾患または進行性疾患を有する対象を含む。本明細書に提供されるレジメンはまた、例えば、ＭＤＳからＡＭＬへの進行のリスクが高い対象を含む、ＣＤ３３の発現によって特徴付けられる骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する対象を治療するのに有用である。
本明細書において提供するレジメンとして、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を含む造血幹細胞移植を含む、ＡＭＬ、またはその前悪性腫瘍を有する対象を治療するための臨床レジメンは、以下の有害なリスク特性：１）ＨＣＴの時点でＭＲＤ＋の証拠を有するプレゼンテーションおよび骨髄での中または高いリスクの疾患に関連遺伝的性質；または２）ＨＣＴの時点で骨髄のみの白血病芽球（≦１０％）の持続（プレゼンテーションでの任意のリスクカテゴリーの疾患に関連する遺伝的性質を有する）のうちの一つまたは複数を示す対象を治療するのにさらに有用である。
ＨＣＴ前コンディショニング
典型的には、本明細書の実施例の一部で提供するように、例えば、ＨＬＡ一致同種ＨＣＴを含む、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む造血幹細胞移植を含む、臨床治療レジメンは、完全なコンディショニングレジメンを含む。コンディショニングレジメンは、例えば、ブスルファン／メルファラン／フルダラビン／ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）；または全身照射／シクロホスファミド／チオテパ／ｒＡＴＧを含んでもよい。適切なコンディショニングレジメンを、対象の健康および既往歴を考慮して、臨床ガイドラインに従って所与の対象に対して選択する。
臨床モニタリング
本明細書に提供する、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を含む造血幹細胞移植を含む臨床レジメンを受けている対象を、治療レジメンの過程中、ならびに示し得る任意のコンディショニングまたは導入レジメン中、治療に関連する副作用についてモニターし、治療中および／または治療レジメンの完了後に、疾患状態ならびにＨＣＴ移植片および造血系の状態について評価する。
実施例３：ｇＲＮＡ ＡおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを用いたＡＭＬを有する対象の治療
ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有する対象を、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む同種ＨＣＴおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で治療する。
ＨＣＴについては、ＣＤ３４＋造血幹細胞を含む細胞の集団を、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）で対象とＨＬＡが一致している健康ドナーから得る。
Ｇ－ＣＳＦ／プレリキサホル動員後、処理および続くレシピエント対象への投与のため、ドナーから少なくとも１０×１０６個の生細胞／ｋｇ（ｋｇは、レシピエント対象の体重を指す）を得るために、最大二回のアフェレーシス手順を行う。このアフェレーシス産物から、少なくとも３．０×１０６の生細胞／ｋｇ（レシピエント重量）は、最小限の操作を受け、例えば、レスキュー用量として使用するために、バックアップ幹細胞源として役立つように凍結保存される。残りのアフェレーシス産物を、ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団の処理および調製に使用する。ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＣＤ３４＋細胞のためのアフェレーシス産物を濃縮し、続いてヌクレオチド配列
（配列番号１９、標的ドメイン配列は太字、 実施例１に記載した化学修飾）を含むＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを使用して、実施例１に記載した通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体でエレクトロポレーションおよび編集することによって調製する。
編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。細胞生存率および編集効率を、実施例１に記載した通り、代表的な試料を使用して確認し、実施例１に記載した基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団（少なくとも７０％の生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率）をＨＣＴに使用する。対象への投与のための集団は、少なくとも３×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇのこれらの生存率および編集効率基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を含み、好ましくは、少なくとも４×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、５×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、６×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、または７×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇを含む。
コンディショニングレジメンの完了後、対象は、解凍したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含むＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して受ける。ＨＣＴの日は、治療レジメンの０日目である。
対象を、対象におけるＣＤ３３ＫＯ（ＣＤ３３－）好中球の絶対末梢好中球数（ＡＮＣ）を測定することによって、２８日目にＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ生着について評価する。対象が、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴの２８日後、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ ＡＮＣの絶対末梢ＣＤ３３ＫＯ好中球カウントを示す場合、対象は、好中球回復（良好なＣＤ３３ＫＯ好中球生着とも称される）を示すとみなされる。
対象が、２８日目に好中球の回復を示す場合、疾患状態および造血系回復を評価するために、６０日目に対象から骨髄生検を得る。さらに、ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、この時点で末梢血から決定する。対象が、６０日目に良好なＣＤ３３－ ＨＳＣ生着およびＣＤ３３－造血を示す場合、対象に、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。ＣＤ３３－ＡＮＣを、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、対象においてモニターし、対象は、好ましくは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受ける前に、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを有するべきである。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与を、好ましくは、６０日目での骨髄生検の３０日以内に開始し、すなわち、好ましくは、９０日目までに開始する。しかしながら、例えば、ＨＣＴ関連併存疾患を含む併存疾患に照らして、対象の臨床状態が、対象において≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを達成することを可能にするために、例えば、そのような遅延を必要とする場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始を、１２０日目まで遅延してもよい。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、６０日目の骨髄生検から３０日以降に開始する場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始前に、反復骨髄生検を完了する。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、０．１ｍｇ／ｍ２～２ｍｇ／ｍ２の範囲内の用量、例えば、０．１ｍｇ／ｍ２、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または２ｍｇ／ｍ２の用量で対象に投与する。ほとんどの対象に対して、用量２ｍｇ／ｍ２のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象を、より低い用量、例えば、治療に関連した副作用、例えば、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合、または個々の対象の健康状態、併存疾患、もしくは既往歴を考慮して投与してもよい。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、４週間（２８日）の治療サイクルのレジメンで対象に投与し、対象は、例えば、２ｍｇ／ｍ２ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で、それぞれの４週間（２８日）の治療サイクルの１日目に、それぞれの治療サイクルの全用量を受ける。
ほとんどの対象について、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の四回の連続治療サイクル、およびそれゆえ、互いに４週間離れた四用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象では、追加のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクル、例えば、最大四回のさらなる「継続」治療サイクルを、例えば、最初の四回の治療サイクルの同じ用量で、または臨床上望ましい場合、例えば、対象の臨床状態に基づき、より低い用量で開始してもよい。
最終のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクルの完了時に、対象を、疾患状態および造血キメラ化についてモニターし、これらのパラメータについて、最終の治療サイクルの完了後五年間、六ヶ月毎にモニターする。
実施例４：ｇＲＮＡ ＢおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを用いたＡＭＬを有する対象の治療
ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有する対象を、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む同種ＨＣＴおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で治療する。
ＨＣＴについては、ＣＤ３４＋造血幹細胞を含む細胞の集団を、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）で対象とＨＬＡが一致している健康ドナーから得る。
Ｇ－ＣＳＦ／プレリキサホル動員後、処理および続くレシピエント対象への投与のため、ドナーから少なくとも１０×１０６個の生細胞／ｋｇ（ｋｇは、レシピエント対象の体重を指す）を得るために、最大二回のアフェレーシス手順を行う。このアフェレーシス産物から、少なくとも３．０×１０６の生細胞／ｋｇ（レシピエント重量）は、最小限の操作を受け、例えば、レスキュー用量として使用するために、バックアップ幹細胞源として役立つように凍結保存される。残りのアフェレーシス産物を、ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団の処理および調製に使用する。
ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＣＤ３４＋細胞のためのアフェレーシス産物を濃縮し、続いてヌクレオチド配列
（配列番号２０、標的ドメイン配列は太字、ｇＲＮＡについて実施例１に記載した化学修飾）を含むＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを使用して、実施例１に記載した通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体でエレクトロポレーションおよび編集することによって調製する。
編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。細胞生存率および編集効率を、実施例１に記載した通り、代表的な試料を使用して確認し、実施例１に記載した基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団（少なくとも７０％の生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率）をＨＣＴに使用する。対象への投与のための集団は、少なくとも３×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇのこれらの生存率および編集効率基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を含み、好ましくは、少なくとも４×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、５×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、６×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、または７×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇを含む。
コンディショニングレジメンの完了後、対象は、解凍したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含むＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して受ける。ＨＣＴの日は、治療レジメンの０日目である。
対象を、対象におけるＣＤ３３ＫＯ（ＣＤ３３－）好中球の絶対末梢好中球数（ＡＮＣ）を測定することによって、２８日目にＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ生着について評価する。対象が、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴの２８日後、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ ＡＮＣの絶対末梢ＣＤ３３ＫＯ好中球カウントを示す場合、対象は、好中球回復（良好なＣＤ３３ＫＯ好中球生着とも称される）を示すとみなされる。
対象が、２８日目に好中球の回復を示す場合、疾患状態および造血系回復を評価するために、６０日目に対象から骨髄生検を得る。さらに、ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、この時点で末梢血から決定する。対象が、６０日目に良好なＣＤ３３－ ＨＳＣ生着およびＣＤ３３－造血を示す場合、対象に、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。ＣＤ３３－ＡＮＣを、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、対象においてモニターし、対象は、好ましくは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受ける前に、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを有するべきである。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇの投与を、好ましくは、６０日目での骨髄生検の３０日以内に開始し、すなわち、好ましくは、９０日目までに開始する。しかしながら、例えば、ＨＣＴ関連併存疾患を含む併存疾患に照らして、対象の臨床状態が、対象において≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを達成することを可能にするために、例えば、そのような遅延を必要とする場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始を、１２０日目まで遅延してもよい。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、６０日目の骨髄生検から３０日以降に開始する場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始前に、反復骨髄生検を完了する。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、０．１ｍｇ／ｍ２～２ｍｇ／ｍ２の範囲内の用量、例えば、０．１ｍｇ／ｍ２、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または２ｍｇ／ｍ２の用量で対象に投与する。ほとんどの対象に対して、用量２ｍｇ／ｍ２のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象を、より低い用量、例えば、治療に関連した副作用、例えば、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合、または個々の対象の健康状態、併存疾患、もしくは既往歴を考慮して投与してもよい。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、４週間（２８日）の治療サイクルのレジメンで対象に投与し、対象は、例えば、２ｍｇ／ｍ２ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で、それぞれの４週間（２８日）の治療サイクルの１日目に、それぞれの治療サイクルの全用量を受ける。
ほとんどの対象について、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の四回の連続治療サイクル、およびそれゆえ、互いに４週間離れた四用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象では、追加のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクル、例えば、最大四回のさらなる「継続」治療サイクルを、例えば、最初の四回の治療サイクルの同じ用量で、または臨床上望ましい場合、例えば、対象の臨床状態に基づき、より低い用量で開始してもよい。
最終のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクルの完了時に、対象を、疾患状態および造血キメラ化についてモニターし、これらのパラメータについて、最終の治療サイクルの完了後五年間、六ヶ月毎にモニターする。
実施例５：ｇＲＮＡ ＣおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを用いたＡＭＬを有する対象の治療
ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有する対象を、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む同種ＨＣＴおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で治療する。
ＨＣＴについては、ＣＤ３４＋造血幹細胞を含む細胞の集団を、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）で対象とＨＬＡが一致している健康ドナーから得る。
Ｇ－ＣＳＦ／プレリキサホル動員後、処理および続くレシピエント対象への投与のため、ドナーから少なくとも１０×１０６個の生細胞／ｋｇ（ｋｇは、レシピエント対象の体重を指す）を得るために、最大二回のアフェレーシス手順を行う。このアフェレーシス産物から、少なくとも３．０×１０６の生細胞／ｋｇ（レシピエント重量）は、最小限の操作を受け、例えば、レスキュー用量として使用するために、バックアップ幹細胞源として役立つように凍結保存される。残りのアフェレーシス産物を、ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団の処理および調製に使用する。
ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＣＤ３４＋細胞のためのアフェレーシス産物を濃縮し、続いてヌクレオチド配列
（配列番号２１、標的ドメイン配列は太字、ｇＲＮＡについて実施例１に記載した化学修飾）を含むＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを使用して、実施例１に記載した通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体でエレクトロポレーションおよび編集することによって調製する。
編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。細胞生存率および編集効率を、実施例１に記載した通り、代表的な試料を使用して確認し、実施例１に記載した基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団（少なくとも７０％の生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率）をＨＣＴに使用する。対象への投与のための集団は、少なくとも３×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇのこれらの生存率および編集効率基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を含み、好ましくは、少なくとも４×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、５×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、６×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、または７×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇを含む。
コンディショニングレジメンの完了後、対象は、解凍したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含むＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して受ける。ＨＣＴの日は、治療レジメンの０日目である。
対象を、対象におけるＣＤ３３ＫＯ（ＣＤ３３－）好中球の絶対末梢好中球数（ＡＮＣ）を測定することによって、２８日目にＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ生着について評価する。対象が、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴの２８日後、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ ＡＮＣの絶対末梢ＣＤ３３ＫＯ好中球カウントを示す場合、対象は、好中球回復（良好なＣＤ３３ＫＯ好中球生着とも称される）を示すとみなされる。
対象が、２８日目に好中球の回復を示す場合、疾患状態および造血系回復を評価するために、６０日目に対象から骨髄生検を得る。さらに、ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、この時点で末梢血から決定する。対象が、６０日目に良好なＣＤ３３－ ＨＳＣ生着およびＣＤ３３－造血を示す場合、対象に、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。ＣＤ３３－ＡＮＣを、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、対象においてモニターし、対象は、好ましくは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受ける前に、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを有するべきである。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇの投与を、好ましくは、６０日目での骨髄生検の３０日以内に開始し、すなわち、好ましくは、９０日目までに開始する。しかしながら、例えば、ＨＣＴ関連併存疾患を含む併存疾患に照らして、対象の臨床状態が、対象において≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを達成することを可能にするために、例えば、そのような遅延を必要とする場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始を、１２０日目まで遅延してもよい。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、６０日目の骨髄生検から３０日以降に開始する場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始前に、反復骨髄生検を完了する。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、０．１ｍｇ／ｍ２～２ｍｇ／ｍ２の範囲内の用量、例えば、０．１ｍｇ／ｍ２、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または２ｍｇ／ｍ２の用量で対象に投与する。ほとんどの対象に対して、用量２ｍｇ／ｍ２のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象を、より低い用量、例えば、治療に関連した副作用、例えば、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合、または個々の対象の健康状態、併存疾患、もしくは既往歴を考慮して投与してもよい。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、４週間（２８日）の治療サイクルのレジメンで対象に投与し、対象は、例えば、２ｍｇ／ｍ２ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で、それぞれの４週間（２８日）の治療サイクルの１日目に、それぞれの治療サイクルの全用量を受ける。
ほとんどの対象について、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の四回の連続治療サイクル、およびそれゆえ、互いに４週間離れた四用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象では、追加のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクル、例えば、最大四回のさらなる「継続」治療サイクルを、例えば、最初の四回の治療サイクルの同じ用量で、または臨床上望ましい場合、例えば、対象の臨床状態に基づき、より低い用量で開始してもよい。
最終のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクルの完了時に、対象を、疾患状態および造血キメラ化についてモニターし、これらのパラメータについて、最終の治療サイクルの完了後五年間、六ヶ月毎にモニターする。
実施例６：ｇＲＮＡ ＤおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを用いたＡＭＬを有する対象の治療
ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有する対象を、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む同種ＨＣＴおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で治療する。
ＨＣＴについては、ＣＤ３４＋造血幹細胞を含む細胞の集団を、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）で対象とＨＬＡが一致している健康ドナーから得る。
Ｇ－ＣＳＦ／プレリキサホル動員後、処理および続くレシピエント対象への投与のため、ドナーから少なくとも１０×１０６個の生細胞／ｋｇ（ｋｇは、レシピエント対象の体重を指す）を得るために、最大二回のアフェレーシス手順を行う。このアフェレーシス産物から、少なくとも３．０×１０６の生細胞／ｋｇ（レシピエント重量）は、最小限の操作を受け、例えば、レスキュー用量として使用するために、バックアップ幹細胞源として役立つように凍結保存される。残りのアフェレーシス産物を、ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団の処理および調製に使用する。
ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＣＤ３４＋細胞のためのアフェレーシス産物を濃縮し、続いてヌクレオチド配列
（配列番号２２、標的ドメイン配列は太字、ｇＲＮＡについて実施例１に記載した化学修飾）を含むＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを使用して、実施例１に記載した通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体でエレクトロポレーションおよび編集することによって調製する。
編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。細胞生存率および編集効率を、実施例１に記載した通り、代表的な試料を使用して確認し、実施例１に記載した基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団（少なくとも７０％の生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率）をＨＣＴに使用する。対象への投与のための集団は、少なくとも３×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇのこれらの生存率および編集効率基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を含み、好ましくは、少なくとも４×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、５×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、６×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、または７×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇを含む。
コンディショニングレジメンの完了後、対象は、解凍したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含むＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して受ける。ＨＣＴの日は、治療レジメンの０日目である。
対象を、対象におけるＣＤ３３ＫＯ（ＣＤ３３－）好中球の絶対末梢好中球数（ＡＮＣ）を測定することによって、２８日目にＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ生着について評価する。対象が、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴの２８日後、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣの絶対末梢ＣＤ３３ＫＯ好中球カウントを示す場合、対象は、好中球回復（良好なＣＤ３３ＫＯ好中球生着とも称される）を示すとみなされる。
対象が、２８日目に好中球の回復を示す場合、疾患状態および造血系回復を評価するために、６０日目に対象から骨髄生検を得る。さらに、ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、この時点で末梢血から決定する。対象が、６０日目に良好なＣＤ３３－ＨＳＣ生着およびＣＤ３３－造血を示す場合、対象に、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。ＣＤ３３－ＡＮＣを、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、対象においてモニターし、対象は、好ましくは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受ける前に、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを有するべきである。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与を、好ましくは、６０日目での骨髄生検の３０日以内に開始し、すなわち、好ましくは、９０日目までに開始する。しかしながら、例えば、ＨＣＴ関連併存疾患を含む併存疾患に照らして、対象の臨床状態が、対象において≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを達成することを可能にするために、例えば、そのような遅延を必要とする場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始を、１２０日目まで遅延してもよい。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、６０日目の骨髄生検から３０日以降に開始する場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始前に、反復骨髄生検を完了する。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、０．１ｍｇ／ｍ２～２ｍｇ／ｍ２の範囲内の用量、例えば、０．１ｍｇ／ｍ２、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または２ｍｇ／ｍ２の用量で対象に投与する。ほとんどの対象に対して、用量２ｍｇ／ｍ２のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象を、より低い用量、例えば、治療に関連した副作用、例えば、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合、または個々の対象の健康状態、併存疾患、もしくは既往歴を考慮して投与してもよい。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、４週間（２８日）の治療サイクルのレジメンで対象に投与し、対象は、例えば、２ｍｇ／ｍ２ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で、それぞれの４週間（２８日）の治療サイクルの１日目に、それぞれの治療サイクルの全用量を受ける。
ほとんどの対象について、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の四回の連続治療サイクル、およびそれゆえ、互いに４週間離れた四用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象では、追加のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクル、例えば、最大四回のさらなる「継続」治療サイクルを、例えば、最初の四回の治療サイクルの同じ用量で、または臨床上望ましい場合、例えば、対象の臨床状態に基づき、より低い用量で開始してもよい。
最終のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクルの完了時に、対象を、疾患状態および造血キメラ化についてモニターし、これらのパラメータについて、最終の治療サイクルの完了後五年間、六ヶ月毎にモニターする。
実施例７：ｇＲＮＡ ＥおよびＣＤ３３標的化ＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを用いたＡＭＬを有する対象の治療
ＣＤ３３陽性ＡＭＬを有する対象を、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含む同種ＨＣＴおよびＡＤＣゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で治療する。
ＨＣＴについては、ＣＤ３４＋造血幹細胞を含む細胞の集団を、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）で対象とＨＬＡが一致している健康ドナーから得る。
Ｇ－ＣＳＦ／プレリキサホル動員後、処理および続くレシピエント対象への投与のため、ドナーから少なくとも１０×１０６個の生細胞／ｋｇ（ｋｇは、レシピエント対象の体重を指す）を得るために、最大二回のアフェレーシス手順を行う。このアフェレーシス産物から、少なくとも３．０×１０６の生細胞／ｋｇ（レシピエント重量）は、最小限の操作を受け、例えば、レスキュー用量として使用するために、バックアップ幹細胞源として役立つように凍結保存される。残りのアフェレーシス産物を、ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団の処理および調製に使用する。
ＨＣＴ用のＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を、ＣＤ３４＋細胞のためのアフェレーシス産物を濃縮し、続いてヌクレオチド配列
（配列番号２３、標的ドメイン配列は太字、実施例１に提供した化学修飾、配列番号２５を参照）を含むＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを使用して、実施例１に記載した通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体でエレクトロポレーションおよび編集することによって調製する。
編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。細胞生存率および編集効率を、実施例１に記載した通り、代表的な試料を使用して確認し、実施例１に記載した基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団（少なくとも７０％の生存率および少なくとも４５％のＣＤ３３編集効率）をＨＣＴに使用する。対象への投与のための集団は、少なくとも３×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇのこれらの生存率および編集効率基準を満たすＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ集団を含み、好ましくは、少なくとも４×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、５×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、６×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇ、または７×１０６細胞／レシピエント対象の体重ｋｇを含む。
コンディショニングレジメンの完了後、対象は、解凍したＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣを含むＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して受ける。ＨＣＴの日は、治療レジメンの０日目である。
対象を、対象におけるＣＤ３３ＫＯ（ＣＤ３３－）好中球の絶対末梢好中球数（ＡＮＣ）を測定することによって、２８日目にＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ生着について評価する。対象が、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴの２８日後、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣの絶対末梢ＣＤ３３ＫＯ好中球カウントを示す場合、対象は、好中球回復（良好なＣＤ３３ＫＯ好中球生着とも称される）を示すとみなされる。
対象が、２８日目に好中球の回復を示す場合、疾患状態および造血系回復を評価するために、６０日目に対象から骨髄生検を得る。さらに、ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、この時点で末梢血から決定する。対象が、６０日目に良好なＣＤ３３－ＨＳＣ生着およびＣＤ３３－造血を示す場合、対象に、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。ＣＤ３３－ＡＮＣを、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、対象においてモニターし、対象は、好ましくは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受ける前に、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを有するべきである。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与を、好ましくは、６０日目での骨髄生検の３０日以内に開始し、すなわち、好ましくは、９０日目までに開始する。しかしながら、例えば、ＨＣＴ関連併存疾患を含む併存疾患に照らして、対象の臨床状態が、対象において≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣを達成することを可能にするために、例えば、そのような遅延を必要とする場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始を、１２０日目まで遅延してもよい。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、６０日目の骨髄生検から３０日以降に開始する場合、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の開始前に、反復骨髄生検を完了する。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、０．１ｍｇ／ｍ２～２ｍｇ／ｍ２の範囲内の用量、例えば、０．１ｍｇ／ｍ２、０．２５ｍｇ／ｍ２、０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、または２ｍｇ／ｍ２の用量で対象に投与する。ほとんどの対象に対して、用量２ｍｇ／ｍ２のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象を、より低い用量、例えば、治療に関連した副作用、例えば、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合、または個々の対象の健康状態、併存疾患、もしくは既往歴を考慮して投与してもよい。
ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を、４週間（２８日）の治療サイクルのレジメンで対象に投与し、対象は、例えば、２ｍｇ／ｍ２ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で、それぞれの４週間（２８日）の治療サイクルの１日目に、それぞれの治療サイクルの全用量を受ける。
ほとんどの対象について、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の四回の連続治療サイクル、およびそれゆえ、互いに４週間離れた四用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が好ましい。しかしながら、一部の対象では、追加のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクル、例えば、最大四回のさらなる「継続」治療サイクルを、例えば、最初の四回の治療サイクルの同じ用量で、または臨床上望ましい場合、例えば、対象の臨床状態に基づき、より低い用量で開始してもよい。
最終のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）治療サイクルの完了時に、対象を、疾患状態および造血キメラ化についてモニターし、これらのパラメータについて、最終の治療サイクルの完了後五年間、六ヶ月毎にモニターする。
実施例８：併用療法
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象は、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）に基づき、健康な幹細胞ドナーと一致する。レシピエント対象に対して最小である１０×１０６個の生細胞／ｋｇを得るために、最大二つのアフェレーシス手法を、ドナー対象に対して行う。
ＣＤ３４＋健常ドナー細胞のレシピエントについて少なくとも約１０×１０６個の生細胞／ｋｇを使用して、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴ産物およびバックアップ移植片（すなわち、レスキュー用量）を産生するための最小である３．０×１０６個の生細胞／ｋｇを製造する。ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴ製造工程は、ＣＤ３４＋細胞濃縮、続いて電気穿孔およびＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いた編集、例えば、本明細書（表１を参照のこと）に記載するＣＤ３３ ｇＲＮＡのいずれかを使用した編集からなる。編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。
レシピエント対象は、ＣＤ３３編集した造血細胞の投与前に骨髄アブレーションコンディショニングレジメン（プレコンディショニング）を受けてもよい。コンディショニングレジメンの完了後、ＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣ ＨＣＴを、静脈内（ＩＶ）注入を介して０日目に対象に投与する。対象を、注入の２８日後の末梢好中球カウントの回復として定義する、好中球回復についてモニターする。６０日目に、対象が、良好な好中球生着を有する場合、対象は、疾患状態および造血系回復を評価するための骨髄生検を受ける。ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、末梢血から決定する。対象は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、閾値（例えば、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣ）を超える好中球カウントを有していなければならない。次に、対象に、用量約０．１ｍｇ／ｍ２～２．０ｍｇ／ｍ２で、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。
対象を継続して評価し、以前の用量と同じ投薬量または異なる（増加もしくは減少した）投薬量で、一つまたは複数のさらなる用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受け取ってもよい。
実施例９：多重編集を用いた併用治療
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象は、８／８遺伝子座（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、ＤＲＢ１）に基づき、健康な幹細胞ドナーと一致する。レシピエント対象に対して最小である１０×１０６個の生細胞／ｋｇを得るために、最大二つのアフェレーシス手法を、ドナー対象に対して行う。
ＣＤ３４＋健常ドナー細胞のレシピエントについて少なくとも約１０×１０６個の生細胞／ｋｇを使用して、二重編集造血細胞産物およびバックアップ移植片（すなわち、レスキュー用量）を産生するための最小である３．０×１０６個の生細胞／ｋｇを製造する。遺伝子編集製造工程は、ＣＤ３４＋細胞濃縮、続いてＣＤ３３ ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体、例えば、本明細書（表１を参照のこと）に記載するＣＤ３３ ｇＲＮＡのいずれか、ならびに本明細書に記載するもののいずれかなどの、第二の系統特異的細胞表面抗原を標的化するｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いたエレクトロポレーションおよび編集からなる。二重編集した細胞を、続いて＜４８時間培養する。ＣＤ３３および第二の系統特異的細胞表面抗原の細胞表面レベルを、例えば、フローサイトメトリーによって、二重編集細胞において評価してもよい。
採取の際、培養時間を終えた後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。
レシピエント対象は、二重編集した造血細胞の投与前に骨髄アブレーションコンディショニングレジメン（プレコンディショニング）を受けてもよい。コンディショニングレジメンの完了後、二重編集造血細胞を、静脈内（ＩＶ）注入を介して０日目に対象に投与する。対象を、注入の２８日後の末梢好中球カウントの回復として定義する、好中球回復についてモニターする。６０日目に、対象が、良好な好中球生着を有する場合、対象は、疾患状態および造血系回復を評価するための骨髄生検を受ける。ドナーキメラ化のパーセントおよびＣＤ３３陰性（ＣＤ３３－）骨髄性造血を、末梢血から決定する。対象は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の投与前に、閾値（例えば、≧１０００／ｄＬ ＣＤ３３－ＡＮＣ）を超える好中球カウントを有していなければならない。次に、対象に、用量約０．１ｍｇ／ｍ２～２．０ｍｇ／ｍ２で、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を投与する。
対象を継続して評価し、以前の用量と同じ投薬量または異なる（増加もしくは減少した）投薬量で、一つまたは複数のさらなる用量のゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を受け取ってもよい。
実施例１０：ｇＲＮＡ ＥおよびＣＤ３３標的化ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）を使用して生成したヒトＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣの使用のための異種移植モデル
この研究の目的は、ＣＤ３３の発現を低減もしくは除去するよう遺伝子操作しているヒト造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、またはその誘導細胞（その子孫）を、マウスモデルを使用して、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の細胞傷害から保護しているかどうかを調べることであった。
動員したＰＢＭＣを、二人のヒトドナー（ドナー１およびドナー２）から得て、細胞が、全長ＣＤ３３アイソフォームの発現の減少をもたらす、エクソン２を欠く代替的にスプライシングされた転写物バリアント生じ、従って、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）が認識せず、または標的化しない、ｒｓ１２４５９４１９での一塩基多型（ＳＮＰ）についてホモ接合性でないことを確認するためにスクリーニングする。
簡潔に述べると、図２に示すように、ドナー由来のＣＤ３４＋ ＨＳＰＣを、実施例１に記載する通り、ＣＤ３３ ｇＲＮＡ Ｅ Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体とエレクトロポレーションした。同じドナー由来の細胞を、ＲＮＰなしでエレクトロポレーションし、陰性対照（「偽ＥＰ」）として使用した。ＣＤ３３編集効率を、表４に示す。細胞数および生存率も、エレクトロポレーションの前および後に定量化した（表５）。
ＣＤ３３編集ＨＳＰＣ（ＣＤ３３ＫＯ）および偽ＥＰ対照ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、亜致死照射したＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ、ＮＳＧ（商標））マウスに尾静脈を介して注射した。移植の８週間後、フローサイトメトリー分析のため各マウスから眼窩後方血液を採取し、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの生着を評価した。後眼窩出血も、移植の１２週後に行い、血漿および細胞ペレットを収集し、これをさらなる分析のために保存した。移植の１５週後、移植したヒトＨＳＰＣによる造血系再構成後、マウスに、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（０．３３ ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照（「ビヒクル」）としてのＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）のいずれかを静脈内投与した。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）またはビヒクルでの処置の８日後（移植後１６週目）、マウスを安楽死させ、フローサイトメトリー分析のため、骨髄、血液、および脾臓を採取した。ドナー１およびドナー２から得た細胞の実験グループを、それぞれ、表６および７に示す。
図３Ａに示す通り、ドナー１由来の偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスについては、ヒト白血球再構成（ｈＣＤ４５＋細胞）は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置によって低減し、ドナー１由来のＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）による影響を受けなかった。さらに、ＣＤ３３遺伝子編集は、ヒトＣＤ４５染色によって証明するように、ヒト細胞白血球キメラ化の有意な変化をもたらさなかった。ドナー２由来のＨＳＰＣを移植したマウスについては、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置対ビヒクル対照を受けた群間、またはＣＤ３３編集ＨＳＰＣ対偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスの比較でのヒト細胞キメラ化において統計的有意差を観察しなかった（図５Ａ）。
移植した動物の骨髄中の全ヒト白血球（ｈＣＤ４５＋細胞）中のＣＤ３３＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。各ドナー由来のＨＳＰＣについては、偽ＥＰ ＨＳＰＣ移植し、続いてゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）で処置したマウスは、ビヒクル単独での処置と比較して、ＣＤ３３＋細胞の有意な低減を有していた（図３Ｂ、５Ｂ）。さらに、ＣＤ３３編集したＨＳＰＣを移植したマウスは、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）またはビヒクル対照を用いた処置に関わらず、偽ＥＰ ＨＳＰＣを用いて移植したマウスと比較して、ほぼ完全なＣＤ３３＋細胞の喪失を示した（図３Ｂ、５Ｂ）。いかなる特定の理論にも束ねられることを意図するものではないが、これらの結果は、ドナーヒトＨＳＰＣの非常に効率的な編集に起因すると考えられ、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）によるＣＤ３３＋細胞の堅牢なアブレーションを示す。これは、この異種移植モデルにおいて、ＣＤ３３編集細胞の長期持続性があることを示唆する。
ヒトＣＤ４５＋（マウスＣＤ４５－）集団由来の異なるヒト骨髄系マーカーを発現する細胞も評価した。移植したマウスの骨髄中の全ヒト白血球（ｈＣＤ４５＋）中の単球（ＣＤ１４＋骨髄細胞）の分画を分析した。両方のドナーについて、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置は、偽ＥＰ ＨＳＰＣ群を用いて移植したマウスにおいてＣＤ１４＋骨髄細胞のほぼ完全な除去を導いた（図３Ｃ、５Ｃ）。対照的に、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置は、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスにおけるＣＤ１４＋骨髄細胞の割合にあまり影響を与えなかった（図３Ｃ、５Ｃ）。これらの結果は、ＣＤ３３編集細胞を、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の細胞傷害から保護したことを示す（図３Ｅ）。偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスとＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスとの間で、ＣＤ１４＋骨髄細胞の割合に有意差を観察せず、これは、ＣＤ３３の消失が、ＨＳＰＣ由来のＣＤ１４＋骨髄細胞の長期分化を損なわないことを支持している。
ｈＣＤ４５＋細胞集団内のＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞も分析した。いずれかのドナー由来の偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスについては、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置は、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の大部分を絶やした（図３Ｄ、５Ｄ）。対照的に、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置は、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の割合にあまり影響を与えなかった（図３Ｄ、５Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ３３の低減が、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）に対してＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞を保護することを支持する。偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスとＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスとの間で、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の割合に有意差を観察せず、これは、ＣＤ３３の消失が、ＨＳＰＣ由来のＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の長期分化を損なわないことを支持している。
骨髄細胞に加えて、移植したマウスの骨髄中の全ヒトＣＤ４５＋細胞中のＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を分析した。ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスと比較して、偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスにおけるＣＤ３＋Ｔ細胞の割合において、統計的に有意な差を観察しなかった（図４Ａ、６Ａ）。予想通り、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置によって影響を受けなかった。
移植した動物の骨髄中の全ヒトＣＤ４５＋細胞中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合を分析した。ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスと比較して、偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスにおけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合において、統計的に有意な差を観察しなかった（図４Ｂ、６Ｂ）。予想通り、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置によって影響を受けなかった。
ビヒクル処置群を比較すると、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣおよび偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスは、同等のレベルのＢ細胞を有し、これは、ＨＳＰＣからのＢ細胞分化が、ＣＤ３３ＫＯによって妨害されないことを示唆している。ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置を受けたマウスを比較すると、偽ＥＰ ＨＳＰＣを移植したマウスは、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスよりも、全ヒト白血球中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合が高かった（図４Ｂ、６Ｂ）。このことは、骨髄系およびリンパ系分画が、このマウスモデルの骨髄における全ヒト白血球画分の大部分を占めるため、骨髄系保護の減少（ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置による）は、偽ＥＰ ＨＳＰＣを受けたマウスにおいて、リンパ系分画の明白な比例増加をもたらすことを反映している可能性が高い。
さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ヒト原始ＨＳＰＣの割合を、移植したマウスの骨髄において評価した。偽ＥＰ ＨＳＰＣ対ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを受け取ったマウス、およびゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置対ビヒクル対照を受け取ったマウス間でのＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞の割合において、統計的有意差は観察しなかった（図４Ｃ、６Ｃ）。これらの結果は、ＣＤ３３の消失が、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－原始ＨＳＰＣに影響を与えず、原始ＨＳＰＣが、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）細胞傷害によって標的化されないことを示唆している。
まとめると、これらの分析は、ＣＤ３３欠損細胞を、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ 細胞傷害から保護することを示している。生着の際、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣは、同等レベルのヒト白血球キメラ化、リンパ系および骨髄系、ならびに対照のＨＳＰＣとしての原始ＨＳＰＣを含む、多系列造血系を再構成した。さらに、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植したマウスにおいて、ＣＤ３３＋細胞の有意な喪失を観察し、これは、１６週間後の非常に効率的なＣＤ３３分布およびＣＤ３３欠損細胞の長期持続を示している。対照（未編集）ＨＳＰＣを移植したマウスにおいて、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置は、ＣＤ１４＋骨髄細胞およびＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞を効率的に除去した。対照的に、ＣＤ３３編集ＨＳＰＣを移植した動物において、ゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）処置後に、有意に高レベルの骨髄細胞を保持した。まとめると、これらの知見は、ＣＤ３３の枯渇が、インビボでのゲムツズマブオゾガマイシン／Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）細胞傷害に対する骨髄細胞に実質的な保護をもたらすことを示す。
実施例１１：ヒトＣＤ３３ＫＯ ｅＨＳＰＣの臨床スケール製造
ＣＤ３３タンパク質を欠いた同種ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の二つの臨床スケールバッチを、高リスクＣＤ３３＋急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合患者の治療のため製造した。結果として生じるＨＳＰＣ集団は、造血細胞移植を受けているＨＬＡ適合ヒトＡＭＬ患者、例えば、白血病再発および移植後の死亡率のリスクが高いことが知られている患者への注入に適している。
最終的なＨＳＰＣ集団を、凍結保存の準備のできた凍結保存培地中４５ｍＬの体積で製剤化し、液体窒素の気相で保存し、その後解凍し、レシピエント患者に静脈内（ＩＶ）注入により投与した。
各バッチを、単独のドナーから得た白血球アフェレーシス出発材料から製造し、一人のドナーから一人のレシピエントへのＨＬＡ適合産物を生成し、これにより、特異的に適合した患者のための製品の製造を可能にした。
各バッチについて、健康なドナーを、白血球アフェレーシス手法に供した。白血球アフェレーシス出発材料を収集し、細胞操作開始前に２～８℃で保存した。白血球アフェレーシス出発材料の細胞数および生存率を、フローサイトメトリーにより試験した。細胞生存率が、≧８０％であることを確認した。細胞分析および他の評価のため、試料を取り出した。
白血球アフェレーシスレスキュー用量を、白血球アフェレーシス材料から取り出して、３×１０６個のＣＤ３４＋細胞／患者ｋｇを含む体積を得た。レスキュー用量材料を凍結保存し、－１４０℃での液体窒素の気相で保存した。
レスキュー用量の取得後、白血球アフェレーシス出発材料を処理して、赤血球、血小板、および血漿を取り出した。次いで、処理した物質を、ＣＤ３４陽性細胞について濃縮し、次いで、２５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を、滅菌条件下でＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ Ｅを混合することによって、エレクトロポレーションの前に調製した。２５０ｍＬのコニカルチューブ内の細胞を、２００×ｇでスピンダウンし、エレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁し、調製したＲＮＰ複合体と混合し、単回使用の滅菌エレクトロポレーションカセットにおいてエレクトロポレーションした。
エレクトロポレーション後、細胞を、カセットから取り出し、培養培地に移し、３７℃および５％ ＣＯ２で懸濁培養した。細胞培養物を、細胞数および生存率についてモニターした。細胞を、電気穿孔から回収すると（細胞生存率が８０％以上であると決定した）、細胞を洗浄して、細胞残渣および他の残渣を低減し、１０％ＤＭＳＯを含有する無血清の動物成分を含まない画定した凍結保存培地中に再懸濁した。細胞を、４５ｍＬの体積で製剤化し、制御した速度冷凍庫（ＣＲＦ）中で凍結保存した。以下の表８に示すように、細胞数、生存率、特定のマーカーを発現する細胞の割合（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１９、ＣＤ５６）、編集効率、および残渣Ｃａｓ９を決定した。
列挙された実施形態
１．対象に、有効量の、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子操作された造血細胞の集団、またはその子孫；および
有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む、方法。
２．細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、実施形態１に記載の方法。
３．ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、実施形態２に記載の方法。
４．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約１０６細胞／対象の体重のキログラム～約１０７細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態１～３のいずれか一つに記載の方法。
５．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約３．０×１０６細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態４に記載の方法。
６．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。
７．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態６に記載の方法。
８．細胞毒性剤の有効量が、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態７に記載の方法。
９．遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤が、近い時間に投与される、実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。
１０．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、実施形態９に記載の方法。
１１．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時に投与することを含む、実施形態９に記載の方法。
１２．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、実施形態９に記載の方法。
１３．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を順次投与することを含む、実施形態９に記載の方法。
１４．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の１２０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態９に記載の方法。
１５．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の９０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の６０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態１５に記載の方法。
１７．遺伝子操作された造血細胞の集団が、細胞毒性剤の前に投与される、実施形態１～９または１２～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．遺伝子操作された造血細胞の集団が、単回治療レジメンで投与される、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．遺伝子操作された造血細胞の集団および／または細胞毒性剤が、静脈内投与される、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．細胞毒性剤が、四週間毎に、有効量の複数回用量で投与される、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．遺伝子操作された造血細胞の集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．対象が、細胞毒性剤および／または造血細胞の投与前にプレコンディショニングされる、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．細胞毒性剤および／または造血細胞の投与前に、対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を対象に投与することを含む、実施形態２４または実施形態２５に記載の方法。
２７．プレコンディショニングすることが、対象の全身照射を含む、実施形態２４～２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、実施形態２４～２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、抗体は、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、実施形態２４～２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、造血悪性腫瘍は、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または造血前悪性腫瘍疾患は、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、実施形態１～２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の方法。
３２．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の方法。
３４．対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．対象が、以前に化学療法を受けている、実施形態１～３４のいずれか一つに記載の方法。
３６．対象が、以前に誘導療法を受けている、実施形態１～３５のいずれか一つに記載の方法。
３７．対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、実施形態１～３６のいずれか一つに記載の方法。
３８．対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の方法。
３９．早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄；細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在；細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄；および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、実施形態３８に記載の方法。
４０．対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、実施形態１～３９のいずれか一つに記載の方法。
４１．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、実施形態１～４０のいずれか一つに記載の方法。
４２．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、実施形態１～４１のいずれか一つに記載の方法。
４３．対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、実施形態１～４２のいずれか一つに記載の方法。
４４．対象が、以前に細胞毒性剤を受けていない、実施形態１～４３のいずれか一つに記載の方法。
４５．対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、実施形態１～４４のいずれか一つに記載の方法。
４６．対象が、細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、実施形態１～４５のいずれか一つに記載の方法。
４７．造血系細胞が、造血系幹細胞である、実施形態１～４６のいずれか一つに記載の方法。
４８．造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、実施形態４７に記載の方法。
４９．造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、実施形態４７または実施形態４８に記載の方法。
５０．造血系細胞が、自己である、実施形態１～４９のいずれか一つに記載の方法。
５１．対象から自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、自己幹細胞をＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および遺伝子操作された造血幹細胞を対象に戻すことをさらに含む、実施形態５０に記載の方法。
５２．造血系細胞が、同種である、実施形態１～５１のいずれか一つに記載の方法。
５３．造血細胞が、対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、実施形態５２に記載の方法。
５４．対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、実施形態１～５３のいずれか一つに記載の方法。
５５．ＣＤ３３抗原をコードする造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、造血細胞を調製することをさらに含む、実施形態１～５４のいずれか一つに記載の方法。
５６．ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、実施形態５５に記載の方法。
５７．内在遺伝子の全体または部分が、ゲノム編集を使用して欠失されている、実施形態５５または実施形態５６に記載の方法。
５８．ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．対象に、有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む方法であって、対象が、ＣＤ３３剤の発現を低減または減少するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、有効量の遺伝子改変された造血細胞の集団、またはその子孫を受けているか、または受けた、方法。
６０．細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、実施形態５９に記載の方法。
６１．ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、実施形態６０に記載の方法。
６２．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約１０６細胞／対象の体重のキログラム～約１０７細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態５９～６１のいずれか一つに記載の方法。
６３．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約３．０×１０６細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態６２に記載の方法。
６４．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の方法。
６５．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態６４に記載の方法。
６６．細胞毒性剤の有効量が、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態６５に記載の方法。
６７．有効量の細胞毒性剤が、有効量の遺伝子操作された造血細胞の集団と近い時間に投与される、実施形態５９～６６のいずれか一つに記載の方法。
６８．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
６９．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時に投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７０．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７１．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を順次投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７２．近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団の投与の１２０日以内に細胞毒性剤を投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７３．近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の集団の投与の９０日以内に細胞毒性剤を投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７４．近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の造血細胞集団の投与の６０日以内に細胞毒性剤を投与することを含む、実施形態６７に記載の方法。
７５．遺伝子操作された造血細胞の集団が、細胞毒性剤の前に投与される、実施形態５９～７４のいずれか一つに記載の方法。
７６．遺伝子操作された造血細胞の集団が、単回治療レジメンで投与される、実施形態５９～７５のいずれか一つに記載の方法。
７７．遺伝子操作された造血細胞の集団および／または細胞毒性剤が、静脈内投与される、実施形態５９～７６のいずれか一つに記載の方法。
７８．細胞毒性剤が、四週間毎に、有効量の複数回用量で投与される、実施形態５９～７７のいずれか一つに記載の方法。
７９．細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、実施形態５９～７８のいずれか一つに記載の方法。
８０．遺伝子操作された造血細胞の集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、実施形態５９～７９のいずれか一つに記載の方法。
８１．細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、実施形態５９～８０のいずれか一つに記載の方法。
８２．対象が、細胞毒性剤および／または造血細胞の投与前にプレコンディショニングされる、実施形態５９～８１のいずれか一つに記載の方法。
８３．細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の集団の投与前に、対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、実施形態５９～８２のいずれか一つに記載の方法。
８４．プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を対象に投与することを含む、実施形態８２または実施形態８３に記載の方法。
８５．プレコンディショニングすることが、対象の全身照射を含む、実施形態８２～８４のいずれか一つに記載の方法。
８６．化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、実施形態８２～８５のいずれか一つに記載の方法。
８７．プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、抗体は、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、実施形態８２～８６のいずれか一つに記載の方法。
８８．対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、造血悪性腫瘍は、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または造血前悪性腫瘍疾患は、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、実施形態５９～８７のいずれか一つに記載の方法。
８９．対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、実施形態５９～８８のいずれか一つに記載の方法。
９０．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、実施形態５９～８８のいずれか一つに記載の方法。
９１．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、実施形態５９～８８のいずれか一つに記載の方法。
９２．対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、実施形態５９～９１のいずれか一つに記載の方法。
９３．対象が、以前に化学療法を受けている、実施形態５９～９１のいずれか一つに記載の方法。
９４．対象が、以前に誘導療法を受けている、実施形態５９～９３のいずれか一つに記載の方法。
９５．対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、実施形態５９～９４のいずれか一つに記載の方法。
９６．対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、実施形態５９～９５のいずれか一つに記載の方法。
９７．早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄；細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在；細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄；および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、実施形態９６に記載の方法。
９８．対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、実施形態５９～９７のいずれか一つに記載の方法。
９９．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、実施形態５９～９８のいずれか一つに記載の方法。
１００．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、実施形態５９～９９のいずれか一つに記載の方法。
１０１．対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、実施形態５９～１００のいずれか一つに記載の方法。
１０２．対象が、以前に細胞毒性剤を受けていない、実施形態５９～１０１のいずれか一つに記載の方法。
１０３．対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、実施形態５９～１０２のいずれか一つに記載の方法。
１０４．対象が、細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、実施形態５９～１０３のいずれか一つに記載の方法。
１０５．造血系細胞が、造血系幹細胞である、実施形態５９～１０４のいずれか一つに記載の方法。
１０６．造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、実施形態１０５または実施形態１０６に記載の方法。
１０８．造血系細胞が、自己である、実施形態５９～１０７のいずれか一つに記載の方法。
１０９．対象から自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、自己幹細胞をＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および遺伝子操作された造血幹細胞を対象に戻すことをさらに含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．造血系細胞が、同種である、実施形態５９～１０７のいずれか一つに記載の方法。
１１１．造血細胞が、対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、実施形態１１０に記載の方法。
１１２．対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、実施形態５９～１１１のいずれか一つに記載の方法。
１１３．ＣＤ３３抗原をコードする造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、造血細胞を調製することをさらに含む、実施形態５９～１１２のいずれか一つに記載の方法。
１１４．ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．内在遺伝子の全体または部分が、ゲノム編集を使用して欠失されている、実施形態１１３または実施形態１１４に記載の方法。
１１６．ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．対象に、有効量の、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞の集団、またはその子孫を投与することを含む、方法であって、対象は、有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を受けているか、または受けた、方法。
１１８．細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、実施形態１１８に記載の方法。
１２０．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約１０６細胞／対象の体重のキログラム～約１０７細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態１１７～１１９のいずれか一つに記載の方法。
１２１．遺伝子操作された造血細胞の集団の有効量が、約３．０×１０６細胞／対象の体重のキログラムである、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態１１７～１２１のいずれか一つに記載の方法。
１２３．細胞毒性剤の有効量が、約０．１ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態１２２に記載の方法。
１２４．細胞毒性剤の有効量が、約２．０ｍｇ／対象の体表面積のｍ２である、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．有効量の細胞毒性剤が、有効量の遺伝子操作された造血細胞の集団と近い時間に投与される、実施形態１１７～１２４のいずれか一つに記載の方法。
１２６．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１２７．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時に投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１２８．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１２９．近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の集団および細胞毒性剤を順次投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１３０．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の１２０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１３１．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の９０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１３２．近い時間の投与が、細胞毒性剤の投与の６０日以内に遺伝子操作された造血細胞の集団を投与することを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１３３．遺伝子操作された造血細胞の集団が、細胞毒性剤の前に投与される、実施形態１１７～１３２のいずれか一つに記載の方法。
１３４．遺伝子操作された造血細胞の集団が、単回治療レジメンで投与される、実施形態１１７～１３３のいずれか一つに記載の方法。
１３５．遺伝子操作された造血細胞の集団および／または細胞毒性剤が、静脈内投与される、実施形態１１７～１３４のいずれか一つに記載の方法。
１３６．細胞毒性剤が、四週間毎に、有効量の複数回用量で投与される、実施形態１１７～１３５のいずれか一つに記載の方法。
１３７．細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、実施形態１１７～１３６のいずれか一つに記載の方法。
１３８．遺伝子操作された造血細胞の集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、実施形態１１７～１３７のいずれか一つに記載の方法。
１３９．細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、実施形態１１７～１３８のいずれか一つに記載の方法。
１４０．対象が、細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の集団の投与前にプレコンディショニングされている、実施形態１１７～１３９のいずれか一つに記載の方法。
１４１．細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の集団の投与前に、対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、実施形態１１７～１４０のいずれか一つに記載の方法。
１４２．プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を対象に投与することを含む、実施形態１４０または実施形態１４１に記載の方法。
１４３．プレコンディショニングすることが、対象の全身照射を含む、実施形態１４０～１４２のいずれか一つに記載の方法。
１４４．化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、実施形態１４２または実施形態１４３に記載の方法。
１４５．プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、抗体は、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、実施形態１４０～１４４のいずれか一つに記載の方法。
１４６．対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、造血悪性腫瘍は、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または造血前悪性腫瘍疾患は、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、実施形態１１７～１４５のいずれか一つに記載の方法。
１４７．対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、実施形態１１７～１４６のいずれか一つに記載の方法。
１４８．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、実施形態１１７～１４６のいずれか一つに記載の方法。
１４９．対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、実施形態１１７～１４６のいずれか一つに記載の方法。
１５０．対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、実施形態１１７～１４９のいずれか一つに記載の方法。
１５１．対象が、以前に化学療法を受けている、実施形態１１７～１４９のいずれか一つに記載の方法。
１５２．対象が、以前に誘導療法を受けている、実施形態１１７～１５１のいずれか一つに記載の方法。
１５３．対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、実施形態１１７～１５２のいずれか一つに記載の方法。
１５４．対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、実施形態１１７～１５３のいずれか一つに記載の方法。
１５５．早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄；細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在；細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄；および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、実施形態１５４に記載の方法。
１５６．対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、実施形態１１７～１５５のいずれか一つに記載の方法。
１５７．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、実施形態１１７～１５６のいずれか一つに記載の方法。
１５８．対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、実施形態１１７～１５７のいずれか一つに記載の方法。
１５９．対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、実施形態１１７～１５８のいずれか一つに記載の方法。
１６０．対象が、以前に細胞毒性剤を受けていない、実施形態１１７～１５９のいずれか一つに記載の方法。
１６１．対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、実施形態１１７～１６０のいずれか一つに記載の方法。
１６２．対象が、細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、実施形態１１７～１６１のいずれか一つに記載の方法。
１６３．造血系細胞が、造血系幹細胞である、実施形態１１７～１６２のいずれか一つに記載の方法。
１６４．造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、実施形態１６３に記載の方法。
１６５．造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、実施形態１６３または実施形態１６４に記載の方法。
１６６．造血系細胞が、自己である、実施形態１１７～１６５のいずれか一つに記載の方法。
１６７．対象から自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、自己幹細胞をＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および遺伝子操作された造血幹細胞を対象に戻すことをさらに含む、実施形態１６６に記載の方法。
１６８．造血系細胞が、同種である、実施形態１１７～１６５のいずれか一つに記載の方法。
１６９．造血細胞が、対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、実施形態１６８に記載の方法。
１７０．対象のＨＬＡハプロタイプと一致するＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、実施形態１１７～１６９のいずれか一つに記載の方法。
１７１．ＣＤ３３抗原をコードする造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、造血細胞を調製することをさらに含む、実施形態１１７～１７０のいずれか一つに記載の方法。
１７２．ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、実施形態１７１に記載の方法。
１７３．内在遺伝子の全体または部分が、ゲノム編集を使用して欠失されている、実施形態１７１または実施形態１７２に記載の方法。
１７４．ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、実施形態１７３に記載の方法。
１７５．ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞の集団、またはその子孫を含む、組成物。
１７６．造血細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の造血幹細胞である、実施形態１７５に記載の組成物。
１７７．造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、実施形態１７６に記載の組成物。
１７８．ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、実施形態１７５～１７７のいずれか一つに記載の組成物。
１７９．内在遺伝子の全体または部分が、ゲノム編集を使用して欠失されている、実施形態１７５～１７８のいずれか一つに記載の組成物。
１８０．行われるゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、実施形態１７９に記載の組成物。
１８１．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、実施形態１８０に記載の組成物。
１８２．ｇＲＮＡが、配列番号９～１５のいずれか一つに記載の配列を含む標的ドメインを含む、実施形態１８１に記載の組成物。
１８３．実施形態１７５～１８２のいずれか一つに記載の遺伝子改変された造血細胞の集団、および抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を含む、組み合わせ。
１８４．細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、実施形態１８３に記載の組み合わせ。
１８５．ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、実施形態１８４に記載の組み合わせ。
１８５．培地中の１ミリリットル（ｍＬ）当たり少なくとも１×１０６細胞の集団を含む、組成物であって、細胞の集団は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫を含む、組成物。
１８６．培地が、体積約４５ｍＬを有する、実施形態１８５に記載の組成物。
１８７．集団の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である、実施形態１８５または実施形態１８６に記載の組成物。
１８８．集団が、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６細胞を含む、実施形態１８５～１８７のいずれか一つに記載の組成物。
１８９．培地が、抗凍結剤を含む凍結保存培地である、実施形態１８５～１８８のいずれか一つに記載の組成物。
１９０．抗凍結剤が、量約１０％（ｖ／ｖ）でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、実施形態１８９に記載の組成物。
１９１．造血細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、実施形態１８５～１９０のいずれか一つに記載の組成物。
１９２．ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、実施形態１８５～１９１のいずれか一つに記載の組成物。
１９３．内在遺伝子の全体または部分が、ゲノム編集を使用して欠失されている、実施形態１８５～１９２のいずれか一つに記載の組成物。
１９４．行われるゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、実施形態１９３に記載の組成物。
１９５．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、実施形態１９４に記載の組成物。
１９６．ｇＲＮＡが、配列番号９～１５のいずれか一つに記載の配列を含む標的ドメインを含む、実施形態１９５に記載の組成物。
１９７．検出可能なレベルのＲＮＡガイドヌクレアーゼを含まない、実施形態１９５または実施形態１９６に記載の組成物。
１９８．凍結された状態にある、実施形態１８５～１９７のいずれか一つに記載の組成物。
１９９．凍結保存プロセスに供された、実施形態１８５～１９８のいずれか一つに記載の組成物を含む、凍結保存された組成物。
２００．凍結保存プロセスが、速度を制御した凍結である、実施形態１９９に記載の凍結保存された組成物。
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される例示的な実施形態の多くの均等物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図していない。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、一つ又は一つより多くを意味し得る。群の二つ以上のメンバーの間に「又は」を含む、請求項又は明細書は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの一つ、一つより多く、又は全てが存在する場合に満たされるとみなされる。二つ以上の群のメンバーの間に「又は」を含む群の開示は、群の正確に一つのメンバーが存在する実施形態、群の一つより多くのメンバーが存在する実施形態、及び群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。
本発明は、請求項のうちの一つ以上、又は明細書の一つ以上の関連部分からの一つ以上の制限、要素、節、又は説明用語が、別の請求項に導入される、全ての変形例、組み合わせ、及び順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項で見出される制限のうちの一つ以上を含むように修正され得る。更に、請求項が組成物を列挙する場合、別段の指示がない限り、又は矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明白ではない限り、本明細書に開示される作製若しくは使用方法のうちのいずれかによる、又は存在する場合、当技術分野で公知の方法による、組成物を作製若しくは使用する方法が含まれることを理解されたい。
要素が、リストとして提示される場合、要素の全ての可能な個々の要素又は部分群も開示されており、任意の要素又は要素の部分群が群から削除され得ることを理解されたい。また、「含む」という用語は、開放的であることを意図し、追加の要素、特性又はステップの包含を可能にすることにも留意されたい。一般的に、実施形態が、特定の要素、特徴、又はステップを含むと言及される場合、そのような要素、特徴、若しくはステップからなる、又はそれらから本質的になる実施形態も同様に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別段に指示しない限り、いくつかの実施形態では、範囲の下限の単位の１／１０まで、記載された範囲内の任意の特定の値を想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲内の値は、本明細書には個別に詳述されていないが、これらの値の各々は、本明細書に提供され、具体的に主張又は否認され得ることが理解されるであろう。また、別段の指示がない限り、又は文脈及び／若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の終点は、範囲の下限の単位の１／１０と同程度の精度で表されることも理解されたい。
加えて、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか一つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか一つ以上から明示的に除外され得る。簡潔にするために、一つ以上の要素、特徴、目的、又は態様が除外される実施形態の全ては、本明細書に明示的に記載されていない。本開示は、前述の実施形態のうちのいずれか一つまたは複数のすべての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載される実施形態のうちのいずれか一つまたは複数の組み合わせを企図する。
本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が本明細書に記述されている。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、本明細書、例えば、本明細書の任意の表において言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ配列、Ｕｎｉｇｅｎｅ配列、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。別段の指定がない限り、本明細書に明記される配列受託番号は、本明細書の任意の表において、２０１９年５月２３日現在のデータベースエントリーを指す。一つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、配列バリアントの全てが包含される。

Claims (201)

  1. 対象に、
    有効量の、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子操作された造血細胞の集団、またはその子孫；および
    有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含む、方法。
  2. 前記細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、請求項２に記載の方法。
  4. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約１０６細胞／前記対象の体重のキログラム～約１０７細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約３．０×１０６細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項７に記載の方法。
  9. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤が、近い時間に投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時に投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  12. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  13. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を順次投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  14. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の１２０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項９に記載の方法。
  15. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の９０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の６０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、前記細胞毒性剤の前に投与される、請求項１～９または１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、単回治療レジメンで投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団および／または前記細胞毒性剤が、静脈内投与される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、前記有効量の複数回用量で投与される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記対象が、前記細胞毒性剤および／または前記造血細胞の投与前にプレコンディショニングされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記細胞毒性剤および／または前記造血細胞の投与前に、前記対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を前記対象に投与することを含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
  27. 前記プレコンディショニングすることが、前記対象の全身照射を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、前記抗体が、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、前記造血悪性腫瘍が、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または前記造血前悪性腫瘍疾患が、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、前記対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記対象が、以前に化学療法を受けている、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記対象が、以前に誘導療法を受けている、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、前記完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 早期の白血病の再発と関連する前記一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連する遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄、細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在、細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄、および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、前記遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記対象が、以前に前記細胞毒性剤を受けていない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記対象が、前記細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記造血細胞が、造血幹細胞である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 前記造血細胞が、自己である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記方法が、前記対象から前記自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記自己幹細胞を前記ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および前記遺伝子操作された造血幹細胞を前記対象に戻すことをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記造血細胞が、同種である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記造血細胞が、前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ＣＤ３３抗原をコードする前記造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、前記造血細胞を調製することをさらに含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする前記内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記内在遺伝子の前記全てまたは前記一部が、ゲノム編集を使用して欠失されている、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 前記ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 対象に、
    有効量の、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を投与することを含み、
    前記対象が、ＣＤ３３剤の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、有効量の遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫の集団を受けているか、または受けた、方法。
  60. 前記細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、請求項６０に記載の方法。
  62. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約１０６細胞／前記対象の体重のキログラム～約１０７細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約３．０×１０６細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記有効量の前記細胞毒性剤が、前記有効量の遺伝子操作された造血細胞の前記集団と近い時間に投与される、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時に投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  71. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を順次投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  72. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団の投与の１２０日以内に前記細胞毒性剤を投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  73. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団の投与の９０日以内に前記細胞毒性剤を投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  74. 近い時間の投与は、遺伝子操作された造血細胞の前記造血細胞集団の投与の６０日以内に前記細胞毒性剤を投与することを含む、請求項６７に記載の方法。
  75. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、前記細胞毒性剤の前に投与される、請求項５９～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、単回治療レジメンで投与される、請求項５９～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団および／または前記細胞毒性剤が、静脈内投与される、請求項５９～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、前記有効量の複数回用量で投与される、請求項５９～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、請求項５９～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、請求項５９～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、請求項５９～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記対象が、前記細胞毒性剤および／または前記造血細胞の投与前にプレコンディショニングされる、請求項５９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の前記集団の投与前に、前記対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、請求項５９～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を前記対象に投与することを含む、請求項８２または請求項８３に記載の方法。
  85. 前記プレコンディショニングすることが、前記対象の全身照射を含む、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、前記抗体が、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、前記造血悪性腫瘍が、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または前記造血前悪性腫瘍疾患が、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、請求項５９～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、請求項５９～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、請求項５９～８８のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、前記対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、請求項５９～８８のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、請求項５９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記対象が、以前に化学療法を受けている、請求項５９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記対象が、以前に誘導療法を受けている、請求項５９～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、前記完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、請求項５９～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、請求項５９～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 早期の白血病の再発と関連する前記一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連する遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄、細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在、細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄、および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、請求項５９～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、請求項５９～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、前記遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、請求項５９～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、請求項５９～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記対象が、以前に前記細胞毒性剤を受けていない、請求項５９～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、請求項５９～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記対象が、前記細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、請求項５９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記造血細胞が、造血幹細胞である、請求項５９～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項１０５または請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記造血細胞が、自己である、請求項５９～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記方法が、前記対象から前記自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記自己幹細胞を前記ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および前記遺伝子操作された造血幹細胞を前記対象に戻すことをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記造血細胞が、同種である、請求項５９～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記造血細胞が、前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、請求項５９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記ＣＤ３３抗原をコードする前記造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、前記造血細胞を調製することをさらに含む、請求項５９～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする前記内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記内在遺伝子の前記全てまたは前記一部が、ゲノム編集を使用して欠失されている、請求項１１３または請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 対象に、
    有効量の、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞の集団、またはその子孫を投与することを含み、
    前記対象が、抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む、有効量の細胞毒性剤を受けているか、または受けた、方法。
  118. 前記細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、請求項１１８に記載の方法。
  120. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約１０６細胞／前記対象の体重のキログラム～約１０７細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団の前記有効量が、約３．０×１０６細胞／前記対象の体重のキログラムである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２～約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約０．１ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．２５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約０．５ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、約１．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２、または約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記細胞毒性剤の前記有効量が、約２．０ｍｇ／前記対象の体表面積のｍ２である、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記有効量の前記細胞毒性剤が、前記有効量の遺伝子操作された造血細胞の前記集団と近い時間に投与される、請求項１１７～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を単回治療レジメンで投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時に投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  128. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を同時的に投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  129. 近い時間の投与が、遺伝子操作された造血細胞の前記集団および前記細胞毒性剤を順次投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  130. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の１２０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  131. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の９０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  132. 近い時間の投与が、前記細胞毒性剤の投与の６０日以内に遺伝子操作された造血細胞の前記集団を投与することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  133. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、前記細胞毒性剤の前に投与される、請求項１１７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、単回治療レジメンで投与される、請求項１１７～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団および／または前記細胞毒性剤が、静脈内投与される、請求項１１７～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、前記有効量の複数回用量で投与される、請求項１１７～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記細胞毒性剤が、四週間毎に、約２．０ｍｇ／ｍ２の複数回用量で投与される、請求項１１７～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 遺伝子操作された造血細胞の前記集団が、投与前に凍結保存された形態から融解される、請求項１１７～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記細胞毒性剤が、投与前に凍結乾燥形態から再構成される、請求項１１７～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記対象が、前記細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の前記集団の投与前にプレコンディショニングされている、請求項１１７～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記細胞毒性剤および／または遺伝子操作された造血細胞の前記集団の投与前に、対象をプレコンディショニングすることをさらに含む、請求項１１７～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記プレコンディショニングすることが、一つまたは複数の化学療法剤を前記対象に投与することを含む、請求項１４０または請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記プレコンディショニングすることが、前記対象の全身照射を含む、請求項１４０～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記化学療法剤が、ブスルファン、メルファラン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびチオテパからなる群から選択される、請求項１４２または請求項１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記プレコンディショニングすることが、ヒトＴ細胞に結合する抗体を投与することを含み、任意選択的に、前記抗体が、ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ｒＡＴＧ）を含む、請求項１４０～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患を有するか、または診断されており、前記造血悪性腫瘍が、ＣＤ３３陽性悪性細胞の存在により特徴付けられるか、または前記造血前悪性腫瘍疾患が、ＣＤ３３陽性前悪性細胞の存在により特徴付けられる、請求項１１７～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記対象が、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病を有するか、または診断されている、請求項１１７～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されている、請求項１１７～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記対象が、ＣＤ３３陽性骨髄異形成症候群を有するか、または診断されており、前記対象が、急性骨髄性白血病の発症のリスクが高い、請求項１１７～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記対象が、化学療法および／または放射線療法に対して未感作であり、任意選択的に、前記対象が、造血悪性腫瘍または造血前悪性腫瘍疾患に対処する目的の任意の治療に対して未感作である、請求項１１７～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記対象が、以前に化学療法を受けている、請求項１１７～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記対象が、以前に誘導療法を受けている、請求項１１７～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記対象が、以前に完全な血液学的寛解に入り、任意選択的に、前記完全な血液学的寛解が、末梢計数の不完全な回復により特徴付けられる、請求項１１７～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記対象が、早期の白血病の再発と関連する一つまたは複数のリスク因子を有する、請求項１１７～１５３のいずれか一項に記載の方法。
  155. 早期の白血病の再発と関連する前記一つまたは複数のリスク因子が、中または高いリスクの疾患に関連する遺伝的性質の存在を伴う形態学的完全寛解の骨髄、細胞減少療法後の微小残存疾患（ＭＲＤ）の存在、細胞減少療法後の残存白血病芽球を有する骨髄、および循環芽球を含まない約１０％以下の骨髄芽球数からなる群から選択される、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記対象が、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９についてホモ接合性優性遺伝子型を有さない、請求項１１７～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病を有さない、請求項１１７～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記対象が、急性前骨髄球性白血病または慢性骨髄性白血病と関連する遺伝子転座を有さず、任意選択的に、前記遺伝子転座が、ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）またはｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）である、請求項１１７～１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記対象が、以前に幹細胞移植を受けていない、請求項１１７～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 前記対象が、以前に前記細胞毒性剤を受けていない、請求項１１７～１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記対象由来の末梢血試料におけるドナーキメラ化のパーセントおよび／またはＣＤ３３陰性骨髄性造血のレベルを決定することをさらに含む、請求項１１７～１６０のいずれか一項に記載の方法。
  162. 前記対象が、前記細胞毒性剤を受ける前に少なくとも１０００／ｄＬのＣＤ３３陰性絶対好中球数（ＡＮＣ）を有する、請求項１１７～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記造血細胞が、造血幹細胞である、請求項１１７～１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記造血幹細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記造血系幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項１６３または請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記造血細胞が、自己である、請求項１１７～１６５のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記方法が、前記対象から前記自己造血幹細胞を得ることをさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記自己幹細胞を前記ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するように遺伝子操作すること、および前記遺伝子操作された造血幹細胞を前記対象に戻すことをさらに含む、請求項１６６に記載の方法。
  168. 前記造血細胞が、同種である、請求項１１７～１６５のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記造血細胞が、前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから得られた同種造血幹細胞である、請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記対象のＨＬＡハプロタイプと一致する前記ＨＬＡハプロタイプを有するドナーから造血細胞を得ることをさらに含む、請求項１１７～１６９のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記ＣＤ３３抗原をコードする前記造血細胞の内在遺伝子を改変することによって、前記造血細胞を調製することをさらに含む、請求項１１７～１７０のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記ＣＤ３３細胞表面抗原をコードする前記内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記内在遺伝子の前記全てまたは前記一部が、ゲノム編集を使用して欠失されている、請求項１７１または請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、請求項１７３に記載の方法。
  175. ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞の集団、またはその子孫を含む、組成物。
  176. 前記造血細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の造血幹細胞である、請求項１７５に記載の組成物。
  177. 前記造血幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項１７６に記載の組成物。
  178. 前記ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、請求項１７５～１７７のいずれか一項に記載の組成物。
  179. 前記内在遺伝子の前記全てまたは前記一部が、ゲノム編集を使用して欠失されている、請求項１７５～１７８のいずれか一項に記載の組成物。
  180. 行われる前記ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、請求項１７９に記載の組成物。
  181. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、請求項１８０に記載の組成物。
  182. 前記ｇＲＮＡが、配列番号９～１５のいずれか一つに記載の配列を含む標的ドメインを含む、請求項１８１に記載の組成物。
  183. 請求項１７５～１８２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された造血細胞の集団、および抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む細胞毒性剤を含む、組み合わせ。
  184. 前記細胞毒性剤が、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項１８３に記載の組み合わせ。
  185. 前記ＡＤＣが、ゲムツズマブオゾガマイシンである、請求項１８４に記載の組み合わせ。
  186. 培地中の１ミリリットル（ｍＬ）当たり少なくとも１×１０６細胞の集団を含む、組成物であって、細胞の前記集団は、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有するよう操作されているＣＤ３３をコードする改変遺伝子を含む、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫を含む、組成物。
  187. 前記培地が、体積約４５ｍＬを有する、請求項１８５に記載の組成物。
  188. 集団の前記細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、ＣＤ３３抗原の発現の低減または除去を有している、遺伝子改変された造血細胞、またはその子孫である、請求項１８５または請求項１８６に記載の組成物。
  189. 前記集団が、１ｍＬ当たり少なくとも２×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも３×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも４×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも５×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも６×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも７×１０６細胞、１ｍＬ当たり少なくとも８×１０６細胞、または１ｍＬ当たり少なくとも９×１０６細胞を含む、請求項１８５～１８７のいずれか一項に記載の組成物。
  190. 前記培地が、抗凍結剤を含む凍結保存培地である、請求項１８５～１８８のいずれか一項に記載の組成物。
  191. 前記抗凍結剤が、約１０％（ｖ／ｖ）の量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１８９に記載の組成物。
  192. 前記造血細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項１８５～１９０のいずれか一項に記載の組成物。
  193. 前記ＣＤ３３抗原をコードする内在遺伝子の全てまたは一部が、欠失されている、請求項１８５～１９１のいずれか一項に記載の組成物。
  194. 前記内在遺伝子の前記全てまたは前記一部が、ゲノム編集を使用して欠失されている、請求項１８５～１９２のいずれか一項に記載の組成物。
  195. 行われる前記ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、請求項１９３に記載の組成物。
  196. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、ｇＲＮＡおよびＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、請求項１９４に記載の組成物。
  197. 前記ｇＲＮＡが、配列番号９～１５のいずれか一つに記載の配列を含む標的ドメインを含む、請求項１９５に記載の組成物。
  198. 前記組成物が、検出可能なレベルの前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼを含まない、請求項１９５または請求項１９６に記載の組成物。
  199. 前記組成物が、凍結された状態にある、請求項１８５～１９７のいずれか一項に記載の組成物。
  200. 凍結保存プロセスに供された、請求項１８５～１９８のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結保存された組成物。
  201. 前記凍結保存プロセスが、速度を制御した凍結である、請求項１９９に記載の凍結保存された組成物。
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