JP2023545429A

JP2023545429A - 抗がんペプチドのためのナノ粒子およびその使用

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Publication number: JP2023545429A
Application number: JP2023521588A
Authority: JP
Inventors: ウルムシュナイダー，マーティン，バーナード; チェン，チャールズ，ファン; フー，チェ－ミン，ジャック; リュウ，ユ－ハン
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2023-10-30
Also published as: GB202016022D0; US20230372433A1; AU2021356237A9; CN116783139A; EP4225803A1; CA3195200A1; AU2021356237A1; WO2022074402A1

Abstract

モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧ（式中各ｘが、独立して、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）から選択される）を含む配列を有する１つ以上のペプチドを含むナノ粒子を記載する。また、がんの処置に使用するための、本ナノ粒子と１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物が記載される。さらに、がんを有する患者に薬学的に許容される組成物を投与するステップを含むがんの処置方法、および薬学的に許容される組成物を含むがんを処置または予防するためのキットが記載される。【選択図】なし

Description

本発明は、がんの処置に使用され得る抗がんペプチド（ＡＣＰ）のためのナノ粒子に関する。

腫瘍は、細胞レベルで異種性であり、ある範囲の異なるサブタイプのがん細胞からなる。これらサブタイプのうち、がん幹細胞（ＣＳＣ）は、現在の抗がん剤を使用する従来の薬学的処置における主要な障害としてますます認識されている。乳がんは、世界中で二番目に一般的ながんであり、ほとんどの場合女性で発症する。いくつかの研究は、乳がん幹細胞が生存、自己再生、分化、および再発するために従来の抗がん剤に対して耐性を発達さえ得ることを示している。^１－６ＣＳＣは、抗がん剤に対する耐性を容易に発展させ、固形腫瘍の化学療法による処置は、通常、患者での薬物耐性ＣＳＣの構成比の有意な増加をもたらす。これは、再発および転移の形成をもたらし得る。さらに、乳房腫瘍は同じ患者の中で異なり得、従来の抗がん剤が失敗し得る可能性がある。^７－９ドキソルビシンなどの一般に使用される抗がん剤は、全般的に健常な組織に対し高い毒性を有し、肝臓、腎臓、および心臓などの臓器に急性損傷をもたらすため、高い用量での処置は困難である。^{１０－１２}したがって、がん細胞に対する選択性が改善されており、固形腫瘍における全ての塊（ｂｕｌｋ）のがんおよびＣＳＣを殺滅するために十分な用量で健常な組織を傷つけない新規の抗がん剤を開発するための火急なニーズは満たされていない。

膜溶解ペプチドは、通常非がん性細胞に対して細胞傷害性であり、ストレス誘導性変異原性を介して薬物耐性を誘導する傾向がある化学療法剤に代わる、見込みのある抗がん処置を提示する^１－６。抗菌適用のための膜溶解ペプチドの治療上の有用性に関する研究努力が継続されているが^{１３－１５}、抗がん治療薬としてのそれらの成功のための送達方法は、改善される必要がある。ここで、本発明者らは、高い忍容性を有し、有効な腫瘍の増殖阻害または根絶をもたらすナノ粒子での強力であり選択的な抗がんペプチドの効率的なカプセル化を示す。ナノ粒子は、カーゴペプチドの抗がん活性を有意に改善し、同時にその毒性を低減することが示されている。これは、ドキソルビシンのためのＦＤＡに認可された担体であるＤｏｘｉｌ（登録商標）などの小分子ナノ粒子（副作用を低減するが、化学療法用カーゴ（ドキソルビシン）の総合的抗がん効力を改善しない）とは異なる。本発明者らの研究は、膜溶解ペプチドのための新規送達システムを示しており、がんとの闘いにおいて新たな道を開くものである。

本発明の第１の態様では、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧ（式中各ｘが、独立して、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）から選択される）を含む配列を有する１つ以上のペプチドを含むナノ粒子が提供される。

驚くべきことに、本発明者らは、請求される式に係るペプチドのファミリーが、がん細胞に対する選択性を改善させており、固形腫瘍における全ての塊のがんおよびＣＳＣを殺滅するために十分な用量で健常な組織を傷つけないことを見出した。多くの従来の抗がん剤とは異なり、ここで開発された細孔を形成する膜活性ペプチドは、がん細胞を殺滅するために細胞膜を標的とし破壊する。これにより、薬物を細胞質へ輸送する煩雑さが除かれ、よってペプチドは、従来の化学療法剤と比較して腫瘍浸透が改善している。本発明で請求されるペプチドは、がん細胞の細胞膜を選択的に標的とし、その中に細孔を形成し、よって、それらの電気化学勾配を短絡化することにより細胞を殺滅することにより、作用する。理論により拘束されることを望むものではないが、本ペプチドは、がん細胞膜の脂質組成および化学的な微小環境を直接標的とすることが考えられる。結果として、本ペプチドは、腫瘍細胞が脂質組成を改変することは困難であるため、（細胞が界面活性剤に対する耐性を発達させることは困難であることと同様に）耐性を誘導する可能性が非常に低い。^{１６－１８}

開示されるペプチドのいくつかは、サリノマイシンなどの現在認可されている抗がん剤に相当する、塊のがんおよびＣＳＣへのナノモル活性を有する。さらに、現在最良のｉｎｖｉｔｒｏでの乳がんモデルのうちの１つである、細胞を球状の凝集塊に成長させることにより現実の固形腫瘍を模倣するマンモスフェアモデルでは、本明細書中開示されるペプチドのうちのいくつかは、正常であり健常な細胞に対する低減した毒性を保ちつつ、がん細胞に対し優れた活性を呈する。

本ペプチドは、非常に低いマイクロモル濃度、場合によりナノモル濃度で２次元に増殖したがん細胞、および３次元（スフェロイド）がん細胞培養物を選択的に排除するために、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸（後者は、プロテアーゼ分解に対するｉｎｖｉｖｏでの安定性に関して大きな利点がある）の両方で作用する。非がん性ヒト乳房細胞および腎臓細胞を害するためには、３倍～２００倍超高い濃度が必要とされる。

本ペプチドは、高価ではなく、容易に合成され、修飾および高スループットスクリーニングが容易であり、がん細胞を特異的に標的とするための化学的および構造的なレパートリーを提供する。

本発明で請求されるペプチドは、ｄｅｎｏｖｏで設計されており、現存するペプチドデータベースと比較することにより確認されるように、天然の類縁体は知られていない。この種類の短い可動性ペプチドは、免疫原性が低く、よって、薬学的な適用に適している。

本明細書中記載される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸または修飾されたペプチド結合により互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを含む全てのペプチドを表す。ペプチドは、一般に、天然に存在するアミノ酸を含むが、翻訳後プロセスなどの天然のプロセスによるかまたは当該分野でよく知られている化学的な修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含み得る。このような修飾は、基本的なテキストに十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むペプチドのいずれの場所でも起こり得る。同じ種類の修飾が、所定のペプチドのいくつかの部位で同じまたは異なる度合いで存在し得ることが理解されている。また、所定のペプチドは、多くの種類の修飾を含み得る。

好ましくは、本ペプチドは、単離されたペプチドである。用語「単離された」は、ペプチドが、その元の環境から取り出されていることを意味する。たとえば、生きた動物に存在するペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する物質の一部または全てから分離された同ペプチドまたは当該ペプチドのフラグメントは単離されている。このようなペプチドは、ベクターの一部であり得、かつ／またはペプチドは組成物の一部であり得、当該ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない点で、さらに単離され得る。

１つ以上のペプチドが、ナノ粒子上または中に充填される。好ましくは、ナノ粒子は、複数のペプチドを含む。ナノ粒子を使用してペプチドを送達することは、驚くべきことに良好な結果をもたらすことが見出されている。ナノ粒子により提供される局在化した送達は、ペプチドにがん細胞の細胞膜に細孔をより有効に形成させ、これにより、より効率的ながん細胞の殺滅をもたらすと考えられる。

ナノ粒子という用語は、直径約１～約２００ｎｍの粒子を表す。好ましくは、ナノ粒子は、直径約５～約１００ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、さらにより好ましくは約２０ｎｍである。

ペプチドをナノ粒子へ充填することは、吸着またはカプセル化のいずれかにより行われ得る。このような技術は、当業者によく知られている。

好ましくは、本ナノ粒子は、生分解性である。好ましくは、本ナノ粒子は、ポリマーのものである。開示されるナノ粒子の一部を形成し得る適切なポリマーは、限定するものではないが、生分解性α－ヒドロキシポリエステルおよび生体適合性ポリエーテルを含み得る。一部の態様では、例示的なポリエステルとして、たとえばＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ペグ化ポリマー、およびラクチドおよびグリコリドのコポリマー（たとえばペグ化ＰＬＡ、ペグ化ＰＧＡ、ペグ化ＰＬＧＡ）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。他の態様では、適切なポリマーとして、たとえばポリ無水物、ポリ（オルトエステル）ペグ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ペグ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリジン、ペグ化ポリリジン、ポリ（エチレンインライン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｌｉｎｅ））、ペグ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、ポリ［ａ－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］、ならびにそれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられる。特に好ましい実施形態では、本ナノ粒子は、ポリエチレングリコールメチルエーテルポリラクチド－コ－グリコリド（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）を含む。

他の態様では、ポリマーマトリックスは、１つ以上のアクリルポリマーを含み得る。例示的なアクリルポリマーとして、たとえばアクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリラートコポリマー、エトキシエチルメタクリラート、シアノエチルメタクリラート、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（メタクリル酸ポリアクリルアミド）コポリマー、アミノアルキルメタクリラートコポリマー、グリシジルメタクリラートコポリマー、ポリシアノアクリラート、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。マトリックスは、デキストラン、アシル化デキストラン、キトサン（たとえば様々なレベルにアセチル化されている）、ポリ（ビニル）アルコール（たとえば様々な度合いに加水分解）、および／またはアルギン酸塩、たとえばアルギン酸カルシウム錯体などの二価カチオンと錯体形成したアルギン酸塩を含み得る。

本明細書中開示されるナノ粒子は、１、２、３種、またはそれ以上の生体適合性および／または生分解性ポリマーを含み得る。たとえば、企図されるナノ粒子は、約１０～約９９重量パーセントの、生分解性ポリマーおよびポリエチレングリコールを含む１種以上のブロックコポリマー、ならびに約０～約５０重量パーセントの生分解性ホモポリマーを含み得る。例示的なナノ粒子は、約４０～約９０重量パーセントのポリ（乳）酸－ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたは約４０～約８０重量パーセントのポリ（乳）酸－ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含み得る。このようなポリ（乳）酸－ブロック－ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約５～１００ｋＤａの数平均分子量を有するポリ（乳酸）、および約２～約１０ｋＤａ、たとえば約４～約６ｋＤａの数平均分子量を有するポリ（エチレン）グリコールを含み得る。たとえば、開示される治療用ナノ粒子は、約７０～約９９重量パーセントのＰＬＡ－ＰＥＧおよび約１～約２５重量パーセントの有効な作用物質（すなわち開示されるペプチド）、または約３０～約５０重量パーセントのＰＬＡ－ＰＥＧ、約３０～約５０重量パーセントのＰＬＡもしくはＰＬＧＡ、および約５～約２５重量パーセントの有効な作用物質を含み得る。このようなＰＬＡ（（ポリ）乳酸）は、約５～約１０ｋＤａの数平均分子量を有し得る。このようなＰＬＧＡ（ポリ乳酸－コ－グリコール酸）は、約８～約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。開示されるＰＬＡ－ＰＥＧコポリマーは、ＰＬＡブロックおよびＰＥＧブロックの間に、化学的なリンカー、オリゴマー、またはポリマー鎖を含み得、たとえばＰＬＡ－リンカー－ＰＥＧを含み得ることを理解されたい。

最も好ましくは、本発明のナノ粒子は、約９９重量パーセントのポリ（エチレングリコール）メチルエーテル－ブロック－ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ；ＰＥＧ平均Ｍ_ｎ５，０００、ＰＬＧＡＭ_ｎ７，０００）および１重量パーセントの有効成分（すなわちＡＣＰ）を含む。

あるいは、ゆっくりとした放出特性を有し得る開示されるナノ粒子は、約４２～約４５重量パーセントのＰＬＡ－ＰＥＧ（たとえば約１６ｋＤａのＰＬＡおよび約５ｋＤａのＰＥＧを伴う）（たとえば４３．２５％のＰＬＡ－ＰＥＧ）、約４２～４５重量パーセントのＰＬＡ（たとえば約７５ｋＤａ）（たとえば４３．２５％のＰＬＡ／７５ｋＤａ）、および約１～１５重量パーセントの有効な作用物質を含み得る。たとえば、開示されるナノ粒子は、任意選択で、約１～約５０重量パーセントのポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸－コ－ポリ（グリコール）酸（ＰＥＧを含まない、たとえばＰＬＡのホモポリマー）を含み得、または任意選択で約１～約５０重量パーセントまたは約１０～約５０重量パーセントまたは約３０～約５０重量パーセントのポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸－コ－ポリ（グリコール）酸を含み得る。一実施形態では、開示されるナノ粒子は、約３０：６０～約６０：３０、たとえば約４０：６０、約６０：４０、または約５０：５０の重量比で、２種のポリマー、たとえばＰＬＡ－ＰＥＧおよびＰＬＡを含み得る。

このような実質的にホモポリマー性ポリ（乳）またはポリ（乳）－コ－ポリ（グリコール）酸は、約２～約１３０ｋＤａ、たとえば約２０～約３０ｋＤａ、または約１００～約１３０ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。このようなホモポリマー性ＰＬＡは、約５～約９０ｋＤａ、または約５～約１２ｋＤａ、約１５～約３０ｋＤａ、または約６０～約９０ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なホモポリマー性ＰＬＡは、約８ｋＤａの数平均分子量または約１２ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。

特定の態様では、開示されるナノ粒子は、たとえば標的部分の有効量がペプチドの送達のためのナノ粒子に結合するように、ナノ粒子上にて特定の密度の標的部分で最適化され得る。たとえば、標的部分で機能化された生分解性および／または生体適合性ポリマーマトリックスの割合は、合計の８０％未満であり得る。別の実施形態では、標的部分で機能化された生分解性および／または生体適合性ポリマーマトリックスの割合は、合計の約５０％未満である。標的部分の密度の増大は、一部の実施形態では、標的の結合（細胞の結合／標的の取り込み）を増大し得る。

例示的な標的部分として、たとえば、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、糖類、炭水化物、グリカン、サイトカイン、ケモカイン、ヌクレオチド、レクチン、脂質、受容体、ステロイド、神経伝達物質、およびそれらの組み合わせが挙げられる。マーカーの選択は、選択される標的に応じて変動し得るが、一般的に、本発明の実施形態に有用であり得るマーカーとして、限定するものではないが、細胞表面マーカー、がん抗原（ＣＡ）、糖タンパク質抗原、メラノーマ関連抗原（ＭＡＡ）、タンパク質分解酵素、血管新生マーカー、前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ：ＰＭＳＡ）、小細胞肺癌抗原（ＳＣＬＣＡ）、ホルモン受容体、腫瘍サプレッサー遺伝子抗原、細胞周期制御因子抗原、増殖マーカー、およびヒト癌腫抗原が挙げられる。例示的な標的部分として、ＰＥＧにコンジュゲートし得る、

－ｌｙｓ－（尿素）ｇｌｕが挙げられ、たとえば開示されるナノ粒子は、ＰＬＡ－ＰＥＧ－標的部分、たとえばＳ，Ｓ－２－｛３－［１－カルボキシ－５－アミノ－ペンチル］－ウレイド｝－ペンタン二酸を含み得る。

１つ以上のペプチドは、最大５０アミノ酸長を有し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、最大４０アミノ酸長を有する。さらなる実施形態では、ペプチドは、最大３０アミノ酸長を有する。様々な実施形態では、ペプチドは、最大２５アミノ酸長を有する。特定の実施形態では、ペプチドは、最大２０アミノ酸長を有する。多くの実施形態では、ペプチドは、最大１８アミノ酸長を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、最大１６アミノ酸長を有する。さらなる実施形態では、ペプチドは、最大１５アミノ酸長を有する。特定の実施形態では、ペプチドは、１４アミノ酸長を有する。

１つ以上のペプチドは、好ましくは、中性または陰イオン性である。中性または陰イオン性であるペプチドは非常に効果的に作用することが見出されており、これは、正に荷電した陽イオン性ペプチドが細胞膜の負に荷電したリン脂質二重層とより有効に相互作用すると考えられていることから抗がんペプチドは従来陽イオン性であるため、驚くべきものである。

一実施形態では、ペプチドは、配列番号１～３６またはそれらの混合物のいずれか１つから選択される配列を含み得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、配列番号１～３６のいずれか１つの配列からなり得る。

一実施形態では、ナノ粒子は、モチーフＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチドを含む。驚くべきことに、本発明者らは、この配列を有するペプチドががん細胞に対し良好な選択性を有することを見出した。

一実施形態では、配列は、配列番号２９または配列番号３３を含まない。

一実施形態では、本ナノ粒子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１４、配列番号２５、または配列番号２６、およびそれらの混合物から選択される配列を有するペプチドを含む。より好ましくは、薬学的に許容される組成物は、配列番号２、配列番号４、配列番号１４、配列番号２５、または配列番号２６、およびそれらの混合物から選択される配列を含む。さらにより好ましくは、薬学的に許容される組成物は、配列番号２５および／または配列番号２６から選択される配列を含む。本発明者らは、これら配列ががん細胞に特に選択的であることを見出した。

一実施形態では、本ナノ粒子は、ペプチド配列がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧからなるペプチドを含む。

ペプチドは、Ｄ型またはＬ型のいずれかで存在し得る。一実施形態では、ナノ粒子は、Ｌ型のペプチドを含む。驚くべきことに、本明細書中提示されるペプチドは、Ｌ型の場合にがん細胞により選択的であることが、本発明者らにより見出された。

一実施形態では、本ナノ粒子は、αヘリックスのアセンブリを形成するペプチドを含む。好ましくは、ペプチドは、がん細胞膜に細孔を形成する。ペプチドは、がん細胞膜の脂質組成および化学的な微小環境を直接標的とし、その中に、それらの電気化学的な勾配を短絡化することによりがん細胞を殺滅する細孔を形成すると考えられる。

ペプチド配列またはモチーフのＮ末端およびＣ末端は、当業者に知られているいずれかの末端であり得、たとえば、ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋、ＣＯＯＨ、およびＣＯＯ^－を含み得る。

本発明の第２の態様は、がんの処置に使用するための、上述のナノ粒子と１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物に関する。

本発明の第３の態様は、がんの処置のための医薬の製造における、上述のナノ粒子と１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物に関する。

本医薬組成物は、上記に開示される複数のナノ粒子を含み得る。

本発明の薬学的に許容される組成物は、皮膚がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、膀胱がん、リンパ腫、腎臓がん、膵がん、または子宮内膜がんなどのいずれかの種類のがんを処置するために使用され得る。しかしながら、本発明の特定の実施形態では、がんは乳がんである。

本ナノ粒子を含む医薬組成物は、ヒトの医学および獣医学でヒトまたは動物で使用するためのものであり得、通常、１種以上の適切な賦形剤を含む。治療上の使用で許容される賦形剤は、薬学の分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。薬学的な賦形剤の選択は、意図した投与経路および標準的な薬学的実務に関し選択され得る。本医薬組成物は、賦形剤としてまたは賦形剤に加えて、いずれかの適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、または可溶化剤を含み得る。

保存剤、安定剤、および色素が、本医薬組成物に提供され得る。保存剤の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。また、抗酸化剤および懸濁化剤も使用され得る。

また、本医薬組成物は、耐性を促進するアジュバントおよび／または耐性を促進する細胞を含み得る。耐性を促進するアジュバントとして、ＩＬ－１０、組み換え型コレラトキシンＢサブユニット（ｒＣＴＢ）、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド、ならびに免疫応答を調節する生物製剤およびモノクローナル抗体、たとえば抗ＣＤ３および共刺激遮断薬が挙げられ、これらは本ペプチドと共投与され得る。耐性を促進する細胞として、ビタミンＤ３（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）またはその類縁体で処置した未成熟樹状細胞および樹状細胞が挙げられる。

がんが「処置される」場合、これは、がんの１つ以上の臨床症状が寛解されることを意味する。これは、がんが患者にもはや存在しないようにがんの症状が完全に治療されることを意味しないが、一部の方法では、これは、可能性としてあり得る。「処置」は、がんの症状の１つ以上が処置前よりも重篤ではないことをもたらす。たとえば、腫瘍は、大きさが小さくなり得るかまたは完全に根絶され得る。

本発明の一実施形態では、本組成物は、化学療法剤と併用した使用のためのものである。本発明者らは、本発明で請求されるペプチドの細孔を形成する特性により、これが、標準的な化学療法剤に標的がん細胞へ容易にアクセスさせることを見出した。化学療法剤は、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、メトトレキサート、カペシタビン、ビノレルビン、フォリン酸、オキサリプラチン、およびそれらの混合物から選択され得る。好ましくは、化学療法剤は、ドキソルビシンである。本発明のペプチドを化学療法剤にコンジュゲートするための手段の一例は、図１０に提供されている。

選択される送達システムに応じて変化する医薬組成物に関する異なる組成物／製剤の必要条件が存在し得る。例として、本発明の医薬組成物は、非経口的に送達されるように製剤化されてよく、ここで本組成物は、たとえば静脈内、皮内、筋肉内、皮下、または腹腔内の経路による送達のため注射可能な形態で製剤化される。非経口投与では、本組成物は、他の物質、たとえば血液と等張な溶液を作製するために十分な塩または単糖類を含み得る無菌水溶液の形態で最良に使用され得る。皮内投与経路は、たとえば、マイクロニードルベースの注射および注入システム（または皮内の空間を正確に標的とするための他の手段）、皮内空間への液体または散剤の針無またはニードルフリーの弾道注射（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎｔｏｕｘ型皮内注射、マイクロデバイスを介した強化型イオン泳動、および皮膚に本組成物を沈着させるためのパッチの使用を含む皮膚内への液体、固体、または他の投与形態の直接的な沈着を使用した、いずれかの皮膚にアクセスする手段を含む。また本組成物は、経鼻的、経口的、または皮膚上を含む経口または局所経路により投与されるように製剤化され得る。好ましくは、本組成物は、静脈内経路により送達されるように製剤化される。

投与される本医薬組成物の量または用量は、ｉｎｖｉｖｏでがん細胞を効率的に標的とするために十分であるべきである。この用量は、対象における特定の製剤の効力および腫瘍の位置、ならびに処置される対象の体重により決定される。

また、本医薬組成物の用量は、特定の製剤の投与に付随し得るいずれかの有害な副作用の存在、性質、および度合いにより決定される。通常、医師は、年齢、体重、全般的な健康状態、食事、性別、投与される化合物／製剤、投与経路、および処置される病態の重症度などの様々な要因を考慮して、各個別の対象を処置するペプチドの用量を決定する。適切な用量は、当業者により決定され得る。非限定的な例として、本発明の抗がんペプチドの総用量は、約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ（処置される対象の体重）、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、および約０．５ｍｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。別の実施形態では、本ペプチドの総用量は、約１ｎＭ～約１０，０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５，０００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度であり得る。

好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子を含む組成物は、４回の投与の間、少なくとも１カ月あたり１回、好ましくは１～４週間ごとに１回投与される。

本発明の第４の態様は、本発明の薬学的に許容される組成物ががんを有する患者に投与されるがんの処置方法に関する。一実施形態では、がんは乳がんである。

本発明の第５の態様は、本発明の薬学的に許容される組成物を含むがんを処置するためのキットに関する。好ましい実施形態では、本キットは、乳がんを処置するためのものである。本キットは、化学療法剤をさらに含み得る。

当業者は、本発明の全ての態様が、たとえば薬学的に許容される組成物、ペプチド、その使用、または処置方法に関連するかどうかに関わらず、本発明の他の全ての態様に等しく適用可能であることを理解している。特に、薬学的に許容される組成物の態様は、たとえば、本発明の他の態様、たとえばペプチド自体よりも詳細に記載されている場合がある。しかしながら、当業者は、より詳細な情報が本発明の特定の態様で提供されている場合、この情報は、全般的に、本発明の他の態様に等しく適用可能であることを理解している。

本発明の詳細な説明
ここで本発明を、以下の図面を参照して単なる例としてより詳細に記載する。

図１は、コンビナトリアルなロイシンリッチペプチドライブラリの設計ならびに他の細孔を形成するペプチドおよびがんを標的とする膜活性ペプチドとの比較を示す。Ａ）コンビナトリアルなペプチドライブラリ配列が、ヘリックスホイール上のそれらの投影と共に示されており、これは、推定される膜活性立体構造である。Ｂ）他の細孔を形成するペプチドおよびがんを標的とする膜活性ペプチドとライブラリペプチドの等電点および疎水性の比較。抗菌ペプチドデータベース（ＡＰＤ）の２６アミノ酸を含むペプチド、メリチンおよびその類縁体（機能獲得型類縁体および機能喪失型類縁体）、ｐＨ依存性メリチン、ならびにがんを標的とする低ｐＨ挿入ペプチド（ｐＨＬＩＰ）。図２は、３６のコンビナトリアルなペプチド（配列番号１～３６）からなる、本発明で同定された配列のライブラリのｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性スクリーニングの結果を示し、これらは、がん性ヒト組織および健常なヒト組織の両方に由来する、異なるヒト細胞株に対するものである。また、選択されたＤ型ペプチド、ならびに臨床で使用される抗がん剤のサリノマイシンおよびドキソルビシンに関するｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性スクリーニングの結果が示されている。細胞傷害性は、異なるヒト細胞株で評価され、半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を使用して定量化されている：Ａ）ＨＭＬＥＲ対ＭＣＦ－１０Ａ、Ｂ）ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ対ＭＣＦ－１０Ａ、Ｃ）ＨＭＬＥＲ対ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ、Ｄ）ＨＭＬＥＲ対ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｅ）ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ対ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＦ）Ｕ２ＯＳ対ＨＥＫ２９３Ｔ。図３は、２つの選択されたＤ型抗がんペプチド（Ｄ型ＤＥＫおよびＤ型ＥＥＫ）、ならびに３６のロイシンリッチ抗がんペプチドと比較した、２つの臨床で使用される抗がん剤のドキソルビシンおよびサリノマイシンのｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性用量応答を示し、これらは、異なるヒト細胞株、たとえばＨＭＬＥＲ（三角形）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（正方形）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（破線）に対するものである。図４は、ドキソルビシン（塗りつぶされた正方形）、サリノマイシン（塗りつぶされた三角形）、およびロイシンリッチベースの抗がんペプチドＬ型ＥＥＥ（正方形）、Ｌ型ＤＥＫ（円）、Ｌ型ＥＥＫ（灰色の円）、およびＤ型ＥＥＫ（黒色の円）の腫瘍様塊（ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞）のｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性および用量応答を示す。Ａ）細胞のバイアビリティは、腫瘍細胞（ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ）のマンモスフェアに対する抗がん剤の効力を定量化するために測定される。Ｂ）選択された抗がん化合物での処置後のマンモスフェアの集団。破線は、いずれの処置も行わない予測陰性対照を提示する。Ｃ）各抗がん剤の測定したＩＣ_５０（灰色のバー）およびＩＣ_９０（黒色のバー）、ならびに特定の濃度でのマンモスフェアの光学顕微鏡画像。スケールバーは１００μｍである。図５は、ドキソルビシン（塗りつぶされた正方形）、サリノマイシン（塗りつぶされた三角形）、およびロイシンリッチベースの抗がんペプチドＬ型ＥＥＥ（正方形）、Ｌ型ＤＥＫ（円）、Ｌ型ＥＥＫ（灰色の円）、およびＤ型ＥＥＫ（黒色の円）のマンモスフェア（ＭＣＡ－１０Ａ細胞）のｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性および用量応答を示す。細胞のバイアビリティは、健常なヒト乳房内皮細胞（ＭＣＡ－１０Ａ）のマンモスフェアに対する抗がん剤の効力を定量化するために測定する。Ｂ）選択された抗がん化合物での処置後のマンモスフェアの集団。破線は、いずれの処置も行わない陰性対照を提示する。Ｃ）各抗がん剤の測定したＩＣ_５０（ベタ塗りのバー）およびＩＣ_９０（バー）、ならびに特定の濃度でのマンモスフェアの光学顕微鏡画像。スケールバーは１００μｍである。図６は、異なるヒト細胞株：ＨＭＬＥＲ（円）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（灰色で塗りつぶされた円）、Ｕ２ＯＳ（正方形）、ＭＣＦ－１０Ａ（黒色で塗りつぶされた円）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（三角形）に対するドキソルビシン、サリノマイシン、Ｌ型ＥＥＫ、およびＤ型ＥＥＫのｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性および用量応答を示す。影の付いた領域は、正常な細胞株（ＭＣＦ－１０ＡおよびＨＥＫ２９３Ｔ）に対し効果が少ない、がん細胞株に対する細胞選択性を有する理想的な化合物濃度を表す。図７は、トリプトファン蛍光結合アッセイの結果を示す。これは、ペプチドの５０％が単一の脂質種ＰＯＰＣリポソーム（円）または混合した脂質種ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ（比率３：１、正方形）リポソームのいずれかに結合する脂質濃度を示す。簡潔に述べると、５０μＭのペプチドを固定し、リン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）において０、１２．５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、および５０００μＭの濃度の用量設定したＰＯＰＣベシクル（黒色）または３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧベシクル（灰色）とインキュベートした。５０％ペプチド結合をもたらす脂質濃度は、トリプトファン蛍光結合アッセイを使用して決定し、値は、ペプチドあたりの脂質として示されている。このデータは、本発明のペプチドが、中性ベシクル（ＰＯＰＣ）および荷電したベシクル（ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ）の間を区別し得ることを示し、後者は、がん細胞のモデルとして作用する（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。図８は、リポソームからのＡＮＴＳ／ＤＰＸ色素の５０％漏出をもたらすペプチド濃度を示す。簡潔に述べると、０．５ｍＭのＰＯＰＣベシクル（灰色）またはＰＯＰＣ：ＰＯＰＧベシクル（比率３：１、黒色）を、Ａ）塩酸で調節したリン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ４．８）およびＢ）リン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）のそれぞれにおいて０、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３２、０．６４、１．２５、２．５、５、１０、および２０μＭのペプチド濃度とインキュベートした。ペプチドにより誘導される色素の漏出の強度は、ペプチドあたりの脂質の数として記録される（多い数は、脂質膜を破壊する点でより強力であるペプチドを示す）。図９は、ロイシンリッチＡＣＰの作用機構を示す。Ａ）ヒト赤血球細胞に対するＬ型ＥＥＫ（黒色の三角形）およびＤ型ＥＥＫ（灰色の三角形）の溶血活性。Ｂ）ペプチドにより誘導される高親和性核酸染色（ＳＹＴＯＸｇｒｅｅｎ）の、用量設定したペプチド濃度によるヒーラ細胞株への進入率：Ｌ型ＥＥＫ（黒色の三角形）、Ｄ型のＥＥＫ（灰色の三角形）、および陽性対照としてのメリチン（正方形）。Ｃ）Ｌ型ＥＥＫ（黒色の円）およびＤ型のＥＥＫ（灰色の円）の存在下にて、ネクロスタチン（ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ）（ネクロトーシスの阻害剤）およびＺＶＡＤ－ＦＭＫ（アポトーシスの阻害剤）と共にコインキュベートしたＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳腺内皮がん幹細胞）細胞のバイアビリティ。Ｄ）ドキソルビシン（円（ｃｉｒｌｅ））、および５μＭのｃａｐａｓｅ阻害剤ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫと組み合わせたドキソルビシン（正方形）、および２０μＭのネクロスタチン－１を伴うドキソルビシン（三角形）で処置したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞のバイアビリティ。図１０は、銅ベースの小分子抗がん剤と本発明のＡＣＰのコンジュゲートのための合成戦略を示す。図１１は、ＥＥＫナノ粒子（ＮＰ）の開発を示す。ａ．Ｌ－ＥＥＫＮＰおよびＮＰの調製の模式図。ｂ．Ｌ－ＥＥＫＮＰの透過型電子顕微鏡画像。スケールバーは２００ｎｍ（黒色）および挿入図では２０ｎｍ（白色）である。ｃ．Ｌ－ＥＥＫＮＰ（ｎ＝３）およびＬ－ＥＥＫカーゴを伴わない対照ＮＰの動的光散乱の性質決定。ｄ．遊離Ｌ型ＥＥＫ、Ｌ－ＥＥＫＮＰ、および対照ＮＰの相対溶血活性。ｅ．乳がん細胞株（ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、およびＺＲ－７５－１）に対するＬ－ＥＥＫ、Ｌ－ＥＥＫＮＰ、および対照ＮＰ処置でのＣＣＫ－８アッセイによる細胞のバイアビリティの評価。乳がん細胞に対するＬ－ＥＥＫおよびＬ－ＥＥＫＮＰのＩＣ_５０値は、それぞれ緑色および赤色である。ｆ．対照ナノ粒子およびＥＥＫペプチドナノ粒子の処置スケジュールを用いたＭＤＡ－ＭＢ－２３１トリプルネガティブ乳がんのマウスモデルの概略図。Ｇ．Ｌ型ＥＥＫＮＰ処置でのがん増殖の効率的な阻害。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（４×１０^６個の細胞）での皮下接種から１１日後の蝕知できる腫瘍の確立の後、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＥＥＫ－ＮＰまたは同等の用量の対照ＮＰで、１４日間の処置期間にわたり処置した。腫瘍体積をモニタリングした。＊＊＊ｐ＜０．００５（ｎ＝４）。ｈ．Ｌ－ＥＥＫＮＰでの処置および対照ＮＰでの処置の開始から３３日目のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の画像。ｉ．１２０日の観察期間にわたる腫瘍播種後のマウス生存率のカプランマイヤー曲線。マウス生存率は、１０００ｍｍ^３未満の腫瘍の大きさとして定義される（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。図１２は、Ｌ－ＥＥＫＮＰの物理化学的特性を示す。ａ．対照ＮＰのＴＥＭ画像。スケールバー＝２００ｎｍおよび挿入図で２０ｎｍ。ｂ．ＨＰＬＣ下のＬ－ＥＥＫのクロマトグラム。ｃ．Ｌ－ＥＥＫＮＰにおけるＬ－ＥＥＫのカプセル化効率。ｄ．３７℃でのｐＨ７．４およびｐＨ５．０でのナノ粒子からのＬ－ＥＥＫの放出。ｅ．乳がん細胞株における遊離したＡｌｅｘａ６４７で標識したＬ－ＥＥＫおよびナノ粒子でカプセル化したＡｌｅｘａ６４７で標識したＬ－ＥＥＫの細胞の取り込み。図１３は、Ｌ－ＥＥＫＮＰ処置での抗がん効力を示す。ａ．およびｃ．対照ナノ粒子で処置したマウス（ｎ＝４）での個々のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖曲線および体重曲線。ｂ．およびｄ．Ｌ－ＥＥＫナノ粒子で処置したマウス（ｎ＝４）の個々のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖曲線および体重曲線。図１４は、原子的に詳細なＡＣＰ膜の細孔構造および膜穿孔機構を示す。分子動力学シミュレーションは、ａ．自発的なＡＣＰ膜吸着、ｂ．挿入、およびｃ．細孔形成（大きく不均一な完全に水に充填されたＥＥＫ細孔が示されている）の完全な原子的な詳細を明らかにする。ｄ．、ｅ．結合したペプチドは、膜を通して水（中央）およびイオン（下部）の両方を伝導する２～１６ペプチド（上部）の一過性の細孔のアンサンブルを形成する。図１５は、がん細胞膜へのペプチドＥＥＫ－ナノキャリアの結合の分子シミュレーションである。ペプチドＥＥＫなどのＡＣＰは、ナノキャリアの中で自由に移動し、直接的な分配を介して標的膜へ入る。ポリマーのナノキャリアの流体の性質は、このプロセスに重要である。直径２０ｎｍのナノキャリアの大きさは、ＡＣＰが標的膜の小さな約１０ｎｍの直径の領域上に局所的に送達され、膜穿孔を改善する局所的なＡＣＰの高濃度を提供することを確保する。

実施例１
材料および方法
ペプチドの合成および精製
ペプチドは、固相合成し、９８％の純度に精製した。ペプチドの純度および同一性は、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ質量分析により確認した。Ｎ末端は遊離アミン基であり、Ｃ末端は遊離カルボキシル基かまたはアミド化されている。

リポソームの生成
脂質の１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎグリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＰＯＰＧ）は、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓから購入し、クロロホルムに溶解した。ＬＵＶ（巨大単層ベシクル：Ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）は、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓから購入した押し出し機およびフィルターを使用して１００ｎｍの細孔フィルターを通して押し出すことにより生成した。

細胞株および細胞培養条件
ＨＭＬＥＲ（ヒト乳腺内皮がん細胞）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳腺内皮がん幹細胞）、およびＭＣＦ－１０Ａ（健常なヒト乳腺内皮）細胞を、栄養補助剤および増殖因子：ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、インスリン、およびゲンタマイシン／アンホテリシン－Ｂを含む乳腺上皮細胞増殖培地（ＭＥＧＭ）において維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児由来腎臓細胞）、およびＵ２ＯＳ（ホモサピエンス骨肉腫）細胞を、１０％のウシ胎児血清の最終濃度でのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。これら細胞は、５％のＣＯ_２を含む湿潤した大気において３１０ＫにてＴ７５フラスコで増殖させた。

細胞傷害性アッセイ
比色ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して、抗がんペプチドおよび従来の抗がん剤の毒性を決定した。５×１０^３個の細胞を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに播種した。これら細胞を一晩インキュベートした。上昇した濃度の化合物（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６、３．１、６．３、１２．５、２５、５０、および１００μＭ）を添加し、総体積２００μＬで７２時間インキュベートした。化合物のストック溶液は、ＤＭＳＯにおいて５ｍＭの溶液として調製し、培地を使用するかまたは純水で希釈した。各ウェルにおけるＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％または０％であり、この量は、処置されていない対照に存在した。７２時間後、ＰＢＳにおいて４ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに添加し、プレートをさらに４時間インキュベートした。ＭＥＧＭ／ＭＴＴ混合物を吸引し、１００μＬのＤＭＳＯを添加して、得られた紫色のホルマザン結晶を溶解した。各ウェルにおける溶液の吸光度は、５５０ｎｍの波長で読み取った。吸光度の値は、ＤＭＳＯを含有するかまたはＤＭＳＯを含有しない対照のウェルのいずれかに対し正規化し、試験化合物の濃度ｖｓ細胞のバイアビリティ（％）としてプロットした。ＩＣ_５０値は、得られた用量依存性曲線から内挿した。記録したＩＣ_５０値は、それぞれが濃度の値あたり６つの反復からなる（合計ｎ＝１２）、２つの独立した実験の平均値である。３６のロイシンリッチベースのペプチドのＩＣ_５０値は、２つの独立した実験の平均値である（合計ｎ＝２）。

腫瘍様塊の形成およびバイアビリティのアッセイ
ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞（５×１０^３）を、超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングし、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および４μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭＥＧＭにおいて５日間インキュベートした。試験は、抗がんペプチド、ドキソルビシン、およびサリノマイシンの非存在下および存在下で行った。抗がんペプチド、ドキソルビシン、およびサリノマイシンで処置したマンモスフェアを計測し、反転ベースの試薬（ｉｎｖｅｒｔｅｄｂａｓｅｄｒｅａｇｅｎｔ）ＴＯＸ８（Ｓｉｇｍａ）を使用してイメージングした。１６時間インキュベートした後、溶液の蛍光を、５９０ｎｍ（λ_ｅｘ＝５６０ｎｍ）で読み取った。生きたマンモスフェアは、酸化したＴＯＸ８の量を低減し、同時に蛍光性ＴＯＸ８中間体の量を増大させ、これは試験化合物によりもたらされるマンモスフェアの細胞傷害性の度合いを表す。蛍光値は、ＤＭＳＯを含む対照またはＤＭＳＯを含まない対照に対し正規化し、試験化合物の濃度ｖｓマンモスフェアのバイアビリティ（％）としてプロットした。ＩＣ_５０値は、得られた用量依存性曲線から内挿した。記録したＩＣ_５０値は、それぞれが濃度の値あたり２つの反復からなる（合計ｎ＝４）、２つの独立した実験の平均値である。

トリプトファン蛍光結合アッセイ
ペプチド（５０μＭ）およびＰＯＰＣ／ＰＯＰＧＬＵＶ（６００μＭ）を、１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）において調製した。この溶液をインキュベートし、６０分後に測定した。励起を、２８０ｎｍ（スリット９ｎｍ）で固定し、発光を、３００～４５０ｎｍ（スリット９ｎｍ）から回収した。スペクトルは、ＢｉｏＴｅｋ製のＳｙｎｅｒｇｙＨ１ＨｙｂｒｉｄＭｕｌｔｉ－ＭｏｄｅＲｅａｄｅｒ（図３Ａ）およびＣｙｔａｔｉｏｎ（商標）５ＣｅｌｌＩｍａｇｉｎｇＭｕｌｔｉ－ＭｏｄｅＲｅａｄｅｒ（図２）を使用して記録し、３つのスキャンを平均値化した。

リポソーム漏出アッセイ
５ｍＭのＡＮＴＳ（８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸、二ナトリウム塩）および１２．５ｍＭのＤＰＸ（ｐ－キシレン－ビス－ピリジニウムブロミド）を、脂質を含む直径０．１μｍの押し出されたベシクルに捕捉した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、中身を捕捉したＬＵＶから外部の遊離ＡＮＴＳ／ＤＰＸを除去した。ＬＵＶを０．５ｍＭに希釈し、ペプチドのアリコートを添加することにより漏出活性を測定するために使用した。漏出は、３時間のインキュベーション後に測定した。１０％のトリトンを、ベシクルの最大漏出を測定するため陽性対照として使用した。蛍光発光スペクトルは、ＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨ１ＨｙｂｒｉｄＭｕｌｔｉ－ＭｏｄｅＲｅａｄｅｒを使用して、ＡＮＴＳ／ＤＰＸに関する３５０ｎｍおよび５１０ｎｍの励起波長および発光波長を使用して記録した。

溶血アッセイ
ペプチドは、１００μＭの濃度で開始してＰＢＳで段階希釈した。各ウェルにおけるペプチドの最終容量は、５０μＬであった。各ウェルに、２×１０^８個の細胞／ｍＬのＲＢＣを含むＰＢＳ５０μＬを添加した。陽性溶解対照として、１％のトリトンを使用した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、これらを１０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、１０μＬの上清を、９０μＬのＤＩＨ_２Ｏの入った未処置の９６ウェルプレートに移した。４１０ｎｍで放出したヘモグロビンの吸光度を記録し、溶血率を、１００％および０％の溶解対照に基づき計算した。

ヒーラ細胞に対する細胞傷害性を測定するためのＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎアッセイ
ヒーラ細胞を、完全ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ）においてＴ－７５フラスコでコンフルエンスとなるまで増殖させた。細胞傷害性実験の前日に、細胞をトリプシン処理し、フラスコから取り出し、１３００ｒｐｍでペレット状にした。トリプシンおよび使用済みの培地を廃棄し、細胞を完全ＤＭＥＭに再懸濁した。細胞の計数は、細胞計測器を使用して入手した。次に、細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにおいて１０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、別の９６ウェルプレートにおいて、ペプチドを完全ＤＭＥＭ（ＦＢＳは１０％）および０．１％のｓｙｔｏｘｇｒｅｅｎに、１００μＭの濃度（第１）６７μＭ（第２）の濃度で開始して段階希釈し、続いて２：３の段階希釈を行った。各ウェルにおけるペプチドの最終容量は１００μＬであった。細胞傷害性アッセイを行うため、培地をウェルから除去し、ペプチド／ＤＭＥＭ／ｓｙｔｏｘｇｒｅｅｎ溶液と置き換えた。ペプチドなしおよび２０μＭのＭｅｌＰ５を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。プレートは、蛍光に関して５０４ｎｍの励起波長および５２３ｎｍの発光波長にて１時間の間５分ごとに読み取った。細胞傷害性は、細胞壁の不安定化により細胞へ侵入したｓｙｔｏｘｇｒｅｅｎに基づき１００％の溶解対照および０％の溶解対照に基づき計算した。

ペプチドナノ粒子の調製および性質決定
通常の調製では、メタノールにおいて５ｍｇ／ｍＬのＬ－ＥＥＫペプチド０．１ｍＬを、アセトニトリルにおいて２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－ＰＬＧＡ１ｍＬと混合した。次にこの混合物を、２５ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ８．０）１５ｍＬに添加し、溶液を、５０ｍＬのガラスのビーカーにおいて磁性撹拌バーを用いて４００ｒｐｍで１５分間撹拌した。次に、メタノールおよびアセトニトリルを、１５分間の窒素ガス衝撃を介し、また、サンプル溶液を真空に１時間置いて、完全に溶液から蒸発させた。次に、ナノ粒子溶液を酢酸セルロースシリンジフィルター（細孔の大きさ０．４５μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を介してろ過した。ろ過したＬ－ＥＥＫナノ粒子を、３０ｋＤａの遠心分離フィルターチューブ（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）で洗浄し、最終容量１ｍＬまで濃縮した。回収したナノ粒子は、実験のため新鮮な状態で調製した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
Ｌ－ＥＥＫナノ粒子溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）の液滴（１０μＬ）を、グロー放電したグリッド上に沈着させた。ネガティブ染色は、室温でのＬ－ＥＥＫナノ粒子の構造の検査のため、１ｗｔ％の酢酸ウラニルを用いて行った。ネガティブ染色したサンプルは、ＦＥＩ１２０ｋＶＳｐｈｅｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦＥＩＴｅｃｎａｉＦ２０）を使用して可視化した。

ナノ粒子中のＬ－ＥＥＫの定量化
ナノ粒子中のＬ－ＥＥＫペプチドを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量化した。ＨＰＬＣ分析は、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳｅｒｉｅｓ１１００ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。分析カラムは、粒径５μｍ（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）でＡｓｃｅｎｔｉｓＥｘｐｒｅｓｓＣ１８ｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅｃｏｌｕｍｎ（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）であった。カラムの温度は、定量化の間２５℃に維持した。移動相は、相Ａ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）および相Ｂ（蒸留水において０．１％のＴＦＡ）からなるものであった。サンプルは、２５分間にわたり相Ａの４０％から８０％までの直線勾配溶出で開始し、２５～３０分まで相Ａの８０％から１００％、１０分間一定に保った。次に、溶離液を５分以内に最初の組成に戻し、５分間一定に保った。検出の波長はＬ－ＥＥＫに関して２２０ｎｍに設定し、流速は０．７ｍＬ／分であった。

ナノ粒子からのＬ－ＥＥＫ放出速度の測定
ナノ粒子からのＬ－ＥＥＫの放出を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および０．１５Ｍの酢酸バッファー溶液（ｐＨ５．０）において、２０ｋＭＷＣＯＳｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＭＩＮＩｄｉａｌｙｓｉｓｄｅｖｉｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて透析チューブを使用して試験した。リン酸バッファーおよび酢酸バッファー溶液は、０．３（ｖ／ｖ）％の酢酸および１．３（ｗ／ｖ）％の酢酸ナトリウムを含んでいた。サンプルは、ゆっくりと撹拌しながら３７℃にて透析チューブ内に置いた。所定の時点（１、４、８、１２、２４、４８、７２、および９６時間）で、ナノ粒子サンプルを回収し、ＨＰＬＣを使用してＬ－ＥＥＫに関して分析した。

溶血（新鮮なマウス赤血球）
新鮮なマウスの赤血球を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスから採取し、上清が透明となるまでＰＢＳで徹底的に洗浄した。Ｌ－ＥＥＫおよびＬ－ＥＥＫＮＰは、２００μＭの濃度で開始してＰＢＳに段階希釈した。対照ＮＰの段階希釈は、ＥＥＫＮＰと比較したポリマーの量に基づくものであった。各ウェルにおけるペプチドの最終的な容量は５０μＬであった。各ウェルに、ＰＢＳにおいて２×１０^８個の細胞／ｍＬのＲＢＣ５０μＬを添加した。陽性溶解対照として、１％のトリトンを使用した。この混合物を、３７℃で１時間インキュベートした後、これらを１０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離した後、上清１０μＬを９０μＬの蒸留水の入った未処置の９６ウェルプレートに移した。４１０ｎｍで放出されたヘモグロビンの吸光度を記録し、溶血率を、１００％および０％の溶解対照に基づき計算した。

細胞のバイアビリティおよび細胞傷害性アッセイ
比色分析ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８）アッセイを使用して、抗がんペプチドおよび従来の抗がん剤の細胞増殖および細胞傷害性における細胞のバイアビリティを決定した。簡潔に述べると、１×１０^４個の細胞を、９６ウェルのマイクロプレートの各ウェルに播種した。遊離ペプチド、または様々な濃度のペプチド（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６、３．１、６．３、１２．５、２５、５０、および１００μＭ）を含むナノ粒子を細胞に添加し、５％のＣＯ_２を含む湿潤した大気において３７℃で７２時間インキュベートした。次に、プレートの各ウェルにＣＣＫ－８溶液１０μＬを添加し、さらに４時間インキュベートした。各ウェルにおける溶液の吸光度を、４６０ｎｍで測定した。ＩＣ_５０値は、得られた用量依存性曲線から内挿した。記録したＩＣ_５０値は、それぞれが濃度の値あたり６つの反復からなる（合計ｎ＝３）、２つの独立した実験の平均値である。

共焦点顕微鏡による乳がん細胞株へのＬ－ＥＥＫナノ粒子の細胞の取り込みの試験
フルオロフォアとコンジュゲートしたＬ－ＥＥＫを、メタノールにおいてＬ－ＥＥＫをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＮＨＳエステルと１０：１のモル比で７２時間インキュベートすることにより調製した。コンジュゲートの後、メタノール中５ｍｇ／ｍＬの色素標識したＬ－ＥＥＫペプチド０．１ｍＬを、アセトニトリル中２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－ＰＬＧＡ１ｍＬと混合した。次に、この混合物を、２５ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ８．０）１５ｍＬに添加し、溶液を、５０ｍＬのガラスのビーカーにおいて磁性撹拌バーを用いて４００ｒｐｍにて１５分間撹拌した。次に、メタノールおよびアセトニトリルを、１５分間の窒素ガス衝撃を介し、また、サンプル溶液を１時間真空に置いて、溶液から完全に蒸発させた。次に、このナノ粒子溶液を、酢酸セルロースシリンジフィルター（細孔の大きさ０．４５μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を介してろ過した。ろ過したＬ－ＥＥＫナノ粒子を、１００ｋＤａの遠心分離フィルターチューブ（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ）で洗浄し、最終容量１ｍＬまで濃縮した。回収したナノ粒子は、実験のため新鮮な状態で調製した。細胞およびＬ－ＥＥＫナノ粒子の間の細胞の取り込みを観察するために、ＰＢＳに懸濁した蛍光Ｌ－ＥＥＫナノ粒子を、４つの乳がん細胞株（６×１０^４個の細胞／ウェル）とインキュベートした。共焦点用ディッシュ（カバー付のガラス底のディッシュ、ＳＰＬ２００３５０）において２時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで３回（ｔｒｅｅ）洗浄して、結合していない遊離ペプチドおよびペプチドナノ粒子を除去した。得られた細胞を、１０μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで染色し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、共焦点蛍光顕微鏡（ＺｅｉｓｓＬＳＭ８８０ｗｉｔｈＡｉｒｙｓｃａｎ）を使用して試験した。

マウスにおけるトリプルネガティブＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖に対するＬ型ＥＥＫペプチドナノ粒子の評価
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞（マウスあたり４×１０^６個の細胞）を、右側腹部に皮下的に播種した。腫瘍の播種から１１日後に、マウスを無作為に２つのグループに分けた。マウスは、対照ナノ粒子（Ｌ－ＥＥＫペプチドを含まない）および１０ｍｇ／ｋｇのＬ－ＥＥＫペプチドを含むペプチドナノ粒子で静脈内注射の投与により処置した。処置期間の間、腫瘍体積および体重を、１週間あたり３回測定した。生存エンドポイントは、腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達したと同時に設定された。個々のグループの生存曲線は、ログランク（ｍａｎｔｅｌ－ｃｏｘ）検定により比較した。

分子動力学シミュレーションおよび分析
不偏の全ての原子のＭＤシミュレーションを、ＧＲＯＭＡＣＳ２０１８．３（ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ）、ＨｉｐｐｏＢＥＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｗｅｒｋｚｅｕｇ．ｃｏｍ）およびＶＭＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／）を使用して行い分析した。

伸長したペプチド構造を、ＨｉｐｐｏＢＥＴＡを使用して作製した。これらの最初の構造は、２００のモンテカルロステップを介してｒｅｌａｘａｔｉｏｎが行われ、水はＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄＢｏｒｎｓｏｌｖｅｎｔを使用して暗示的に処置した。ｒｅｌａｘａｔｉｏｎの後、ペプチドを、ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈａｒｍｍ－ｇｕｉ．ｏｒｇ／）を使用して、１００ｍＭのＫイオンおよびＣｌイオンを伴うモデル膜を含む原子に関して詳細なペプチド／脂質／水の系に置いた。タンパク質フォールディングのシミュレーションは、ペプチドに位置拘束を適用して１０ｎｓで平衡化された。細孔を形成するシミュレーションでは、単一のペプチドを、約６００ｎｓで二層の上にフォールディングさせた。安定した表面状態が得られた後、その後、系は、ｘ方向およびｙ方向（ｚ方向ではない）に４×４で増幅され、１６ペプチドを有する系をもたらした。膜の両側からのペプチドで開始する場合、最初の構造は、上部の小葉（ｌｅａｆｌｅｔ）に１つのペプチドおよび下部の小葉に１つのペプチドを有していた。その後、大きな系が、１８ペプチドのシミュレーションボックスを得るために、３×３で多重化することにより構築された。ＭＤシミュレーションは、ＴＩＰ３Ｐ水モデルと併せてＣＨＡＲＭＭ３６力場を使用してＧＲＯＭＡＣＳ２０１８．３で行われた。静電相互作用は、ＰＭＥを使用してコンピュータ処理し、１０Åのカットオフが、ファンデルワールス相互作用で使用された。積分時間ステップは２ｆｓであり、ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｌｉｓｔは、５ステップごとに更新された。全てのシミュレーションは、いずれの拘束またはバイアスポテンシャルも伴わずに、ＮＰＴアンサンブルで行った。水およびタンパク質は、それぞれ、速度リスケール温度カップリングを使用して時間定数τ_Ｔ＝０．５ｐｓを用いて熱浴に別々にカップリングした。１ｂａｒの大気圧が、圧縮率κ_ｚ＝κ_ｘｙ＝４．６・１０^－５ｂａｒ^－１および時間定数τ_Ｐ＝１ｐｓでの弱い準等方性圧（ｓｅｍｉ－ｉｓｏｔｒｏｐｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ）のカップリングを使用して維持された。

オリゴマー集団の分析
シミュレーション中に最も数が多かった細孔アセンブリを明らかにするために、全てのオリゴマーの完全なリストを、各トラジェクトリーフレームで構築した。位数ｎのオリゴマーは、３．５Å未満の重原子（Ｎ、Ｃ、Ｏ）の最小距離として定義される、相互接触しているｎ個ペプチドのいずれかのセットとみなした。しばしば、この定義は、オリゴマーのコアを作製する膜貫通型の挿入されたペプチドに単にゆるく結合した多くの一過性の表面結合した（Ｓ状態の）ペプチドにより、オリゴマーの状態を過大評価する。これらＳ状態のペプチドは頻繁に位置を変更するか、または細孔の安定した位置に出入りする。真の長く保たれるＴＭ細孔に関する分析に焦点を当てるため、７５°のカットオフ基準を、ペプチドの傾斜角τに導入した。τ≧７５°の全てのペプチドは、Ｓ状態にあるとみなし、オリゴマー分析から除外された。この戦略は、真の長く保たれる細孔構造に焦点を当てることによりオリゴマークラスタリングのアルゴリズムのノイズを大きく低減した。次に、オリゴマーｎの占有率にそのペプチドの数ｎを乗算した集団プロットを構築した。これらは、シミュレーション時間の間オリゴマー状態にペプチド質量がどれほど濃縮したかを明らかにする。

置換クラスター分析
同じ位数ｎの全てのオリゴマーを、４Åの骨格のＲＭＳＤの類似性のカットオフの基準を伴うクラスタリングアルゴリズムを使用して立体構造的にクラスタリングした。各オリゴマーは、異なるペプチドから構成され得、または同じペプチドではあるが異なる順序で構成され得、クラスタリングは、１つのオリゴマーを、別のオリゴマーのペプチド配置の全てのｎ！の置換と比較する。置換は、Ｈｅａｐアルゴリズムを使用して作製された。立体構造的な類似性の最終的なＲＭＳＤ値を、ｎ！置換の比較から得た最小のＲＭＳＤ値とみなした。クラスタリングの結果は一般に平坦であり、構造が著しく一時的であり、動的であることを表している。

膜貫通フラックス
膜細孔を介した水およびイオンのフラックスを、全二層パッチを介した一時的なフラックスの合計を決定することにより計算した。ｚ＝－７Åおよびｚ＝＋７Åで膜の法線と直交する２つの平面を考え、これら平面を横切る全ての遷移イベントを計数した。次に、フラックスを、膜パッチの面積および各トラジェクトリーフレームでの経過時間で遷移計数を除算することにより得た。その後、曲線は、１０００フレームにわたり平均化することにより平滑化した。

実施例２
ペプチドの原理
以下の表１は、本開示の範囲内にある３６のペプチドを含む。

†Ｎ末端は遊離しており、Ｃ末端：Ｗ－ＮＨ２。等電点、推定界面結合自由エネルギー、および疎水性モーメントのコンピュータ上の予測値が示されている。

界面結合自由エネルギーは、どのくらいペプチドが膜に結合し得るかの尺度であり、疎水性モーメントは、どの程度疎水性残基が、ヘリックス状の膜に挿入された立体構造においてペプチドの表面の周辺に等しく分布しているかの尺度である。

ペプチド濃度を定量化するため、さらにトリプトファンを、Ｃ末端に導入した。荷電したカルボキシＣ末端（－ＣＯ_２ ^－）もまた、膜貫通をさらに促進するため、中性アミド基（－ＮＨ_２）に改変された。ペプチドは、荷電した残基が、ヘリックス構造の同じ極性表面に局在するように設計される。よって、電荷分布は、ペプチドの疎水性モーメント、ｐＫａ、がん細胞膜上の結合強度、および最終的にはがん細胞膜内のペプチドアセンブリの構造に影響し得る（図１Ａ）。がんを標的とする生物医学的な適用を有する多くのｐＨ依存性ペプチドは、約４．０のｐＫａを有する。これは、がん細胞のわずかにより酸性の微小環境から生じ得、これはＷａｒｂｕｒｇ効果によるものである。よって、がん細胞膜は、本発明の陰性アミノ酸をプロトン付加し得、ｐＨにより誘発される膜活性をもたらし得ると考えられる（図１Ｂおよび表１）。^{１９－２２}

全ての３６のロイシンリッチペプチド配列は、Ｌ型として合成された。ΔＧ_{ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ}は、水と膜界面との間のペプチドの区分けの結合自由エネルギーを表す。ΔＧ_{ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ}および疎水性モーメントは、ＭＰＥｘソフトウェアを使用してＷｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ疎水性スケールを使用して推定した。結合自由エネルギーは、膜へのペプチドの結合後に放出されるエネルギーである。０ではペプチドは、水の中に５０％、膜上に５０％があり、負である場合これは優先的に挿入され、正の場合は水相を好む。疎水性モーメントは、どのように疎水性残基がヘリックスホイールの周辺に置かれているかの尺度であり、モーメントが大きい場合、これらは、全てが片側にあり、小さなモーメントの場合、これらは等しく周辺に置かれている。大きなモーメントは、表面結合にとって良好である（すなわち、疎水性の面は二重層に入り込み、親水性の表面は水を向く）。

実施例３
細胞傷害性および効力
本ペプチドを、いくつかの異なるヒト細胞株に対しスクリーニングし、それらの細胞傷害性を決定した。利用した細胞株は、ＭＣＦ－１０Ａ（ヒト乳房上皮細胞）、ＨＭＬＥＲ（ヒト乳がんバルク細胞）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳がん幹細胞）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児由来腎臓細胞）、およびＵ２ＯＳ（ヒト骨肉腫）を含む。本ペプチドは、低いマイクロモル濃度でがん細胞を排除し得る従来のがん用薬物と同等に有効であり、多くががん細胞株に対し高い選択性を有することが明らかとなった（図２および表１）。ドキソルビシンおよびサリノマイシンもまた両方とも、健常なＭＣＦ－１０Ａ細胞よりもがん性ＨＭＬＥＲに対する選択性を有するが、これらは両方とも、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対しより有意に毒性である。さらに、両薬物は、現在固形腫瘍のはるかにより正確なｉｎｖｉｔｒｏモデルとみなされている、３次元マンモスフェアとして増殖したがん細胞を除去する際にあまり効率的ではない。２次元のＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄに対するドキソルビシンおよびサリノマイシンの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）は、それぞれ２．５±０．３ｎＭおよび３７０±０．５ｎＭであるが、ｉｎｖｉｖｏでの条件により関連しているより現実的な３次元細胞培養物モデルであるマンモスフェアでは、これらの値は、それぞれ４３±６μＭおよび２２±５μＭに下がり、ドキソルビシンでは、活性が１７００倍減少し、サリノマイシンでは６３倍減少する。以下の表２および図３を参照されたい。比較すると、選択された配列ＥＥＫ（ＧＬＬＥＬＬＥＬＬＬＫＡＡＧＷ）およびそのＤ型ペプチドは、ＨＭＬＥＲ、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ、およびＵ２ＯＳ細胞の２次元培養物に対しナノ～低マイクロモル濃度の活性、ならびにマンモスフェアに対し７～１３μＭの活性で、２次元および３次元のマンモスフェアの腫瘍モデルの両方に対し有効である。図４～６を参照されたい。

全てのデータ点は、二連で行った。選択されたＤ型ペプチド、従来の抗がん剤、ＥＥＫペプチド、および２５Ｂ２ペプチドは、６回反復された。†Ｎ末端は遊離しており、Ｃ末端：－ＷＮＨ２。

実施例４
トリプトファン結合アッセイおよびリポソーム漏出アッセイ
本開示のペプチドは、ほとんどが中性または陰イオン性であり、配列に多くの正電荷を含まない（表１）。本発明者らは、がん細胞株に対し非常に選択的であり、ＭＣＦ－１０Ａに及ぼす効果がほとんどなく（ＩＣ_５０≧１００μＭ）、ＨＥＫ２９３Ｔに対し比較的低い細胞傷害性を有する６つの配列を同定した：ＥＥＥ、ＫＥＥ、ＥＨＥ、ＥＥＨ、ＤＥＫ、およびＥＥＫ（図２および表２）。これらの正味の電荷は、３．８５－７．９６のｐＫａで－２～０であり、これらの配列は、１つの正電荷（正に荷電したＮ末端）または２つの正電荷（１つの正に荷電したＮ末端および４もしくは１１位に１つのリジン）のいずれかを含む。いくつかの研究は、がん細胞膜が、負に荷電した膜表面を有し得ることを示している。^{２３、２４}Ｉｓｈｉｋａｗａらは、ＨＭＬＥＲに類似している乳がん細胞株ＭＣＦ－７が、膜表面上に負に荷電したシアル酸の量が少ないことを見出した。^２３これは、本発明のロイシンリッチペプチドの抗がん活性および細胞選択性が、静電相互作用によってのみでは説明できず、がん細胞の微小環境でのＷａｒｂｕｒｇ効果による電荷分布も関与し得ることを示唆している。この仮説を確認するために、本発明者らは、それぞれｐＨ７．４（生理的状態）およびｐＨ４．８（弱酸）にて２つの異なる脂質モデルベシクル（双性イオン性ＰＯＰＣおよび陰イオン性３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧ混合物）を用いて、トリプトファン結合アッセイ（以下の表３および図７を参照）ならびにＡＮＴＳ／ＤＰＸリポソーム漏出アッセイ（以下の表４および図８を参照）を行った。

表３は、脂質濃度により誘導されるリポソーム上の５０％ペプチド結合を示す。５０μＭのペプチドを固定し、リン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）において０、１２．５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、および５０００μＭの濃度に用量設定した脂質（ＰＯＰＣベシクルまたは３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧベシクル）とインキュベートした。５０％ペプチド結合をもたらす脂質濃度を、トリプトファン蛍光結合アッセイを使用して決定し、これら値は、ペプチドあたりの脂質として示されている。†Ｎ末端は遊離しており、Ｃ末端：－Ｗ－ＮＨ_２。

表４は、ペプチド濃度により誘導される５０％のＡＮＴＳ／ＤＰＸリポソーム漏出を示す。０．５ｍＭのＰＯＰＣおよび３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧのベシクルを固定し、リン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）および塩酸により調節したリン酸緩衝食塩水（１Ｘ、ｐＨ４．８）のそれぞれにおいて用量設定したペプチド濃度（０、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３２、０．６４、１．２５、２．５、５、１０、および２０μＭ）とインキュベートした。これら値は、ペプチドあたりの脂質として示されている。†Ｎ末端は遊離しており、Ｃ末端：－Ｗ－ＮＨ_２。

これら結果は、細胞選択性ペプチドが、中性ｐＨにて、双性イオン性ベシクルと陰イオン性ベシクルとの間に有意な結合選択性およびペプチドにより誘導されるリポソーム漏出を全く有さないが、６つの膜選択性ペプチドのうち４つ（ＥＨＥ、ＥＥＨ、ＤＥＫ、およびＥＥＫ）が、ｐＨ４．８で比較的高い陰イオン性ベシクルからのリポソーム漏出活性を有することを示している。これは、これら４つのペプチドが、脂質の組成およびｐＨ条件に依存する環境により誘発される膜活性ペプチドであることを示唆している；しかしながら、他の２つの膜選択性ペプチド（ＥＥＥおよびＫＥＥ）の機構は、依然として不透明である。

実施例５
ロイシンリッチペプチドの作用機構
図９は、Ｌ型のＥＥＫが９０μＭの濃度未満で最小限の溶解をもたらし、治療濃度は約１０μＭをはるかに下回ることを示す。Ｄ型のＥＥＫはより溶解性である。ヒーラ細胞内への高親和性核酸染色であるＳＹＴＯＸｇｒｅｅｎの濃度依存性の進入の比較は、Ｌ型ＥＥＫおよびＤ型ＥＥＫが、強力な細孔形成ペプチドのメリチンと類似して挙動することを示している。まとめると、これら結果は、作用機構としてがん細胞細胞膜の選択的な細孔形成を示す。

図９Ｃは、Ｌ型またはＤ型ＥＥＫで処置したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞の細胞のバイアビリティが、ネクロトーシス阻害剤ネクロスタチンとの共インキュベーションによっても、アポトーシス阻害剤ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫとの共インキュベーションによっても改善できないことを示しており、ＡＣＰが細胞膜での細孔形成によりネクローシスをもたらすことを示唆している。対照的に、図９Ｄは、ドキソルビシンで処置したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞の細胞のバイアビリティが、ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫまたはネクロスタチンのいずれかとの共インキュベーションにより顕著に改善され得ることを示している。

まとめると、これら結果は、ＡＣＰ抗がん活性の主要機構として、ネクローシスをもたらすがん細胞細胞膜での選択的な細孔形成を示唆している。

実施例６
ナノ粒子の生成
静脈内抗がんペプチド（ＡＣＰ）送達を可能にし、溶解性ペプチドベースの治療薬の移行を妨げ得る溶解性、薬物動態、および安定性の問題に対処するために、上述の最適化されたナノ沈殿法（ペプチドナノ粒子の調製および性質決定）を使用して、直径２０ｎｍの、ＡＣＰを充填したポリエチレングリコールメチルエーテルポリラクチド－コ－グリコリド（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）ナノ粒子（ＮＰ）を調製した。これら超小型のナノ粒子は、腫瘍に浸透する特性が高く、大きな担体よりも有用である。さらに、本発明者らは、小さな寸法の２０ｎｍの担体が、ペプチドが膜穿孔作用のため自身の分子の自由度を再度獲得する必要があるため、膜溶解ペプチド治療薬に適した、より加速した放出プロファイルを可能にすると推測している。Ｌ－ＥＥＫは、このペプチドファミリーのその高いがんに特異的な選択性に基づきＮＰ調製に有効なＡＣＰとして選択された（Ｌ－ＥＥＫ－ＮＰ）。

ナノ沈殿プロトコルの最適化（図１ａ）により、直径２１．７±１．４ｎｍおよび－１６．０±０．６ｍＶのゼータ電位を有する単様式ＮＰが、容易に形成された（図１ｂ、ｃ）。ＥＥＫカーゴを伴わない対照ＮＰは、同様の物理化学的特性を示し（図２ａ）、ＥＥＫの充填が、表面吸着よりはポリマーのコアの中のカプセル化を介して仲介されることが示唆される。ＥＥＫ－ＮＰのＨＰＬＣ分析は、８２．３±３．４％での高いＥＥＫのカプセル化効率を示し（図２ｂ、ｃ）、これはポリマー１ｍｇあたり１６．４μｇのペプチド充填収率に変換される。Ｌ－ＥＥＫ－ＮＰのペプチド放出の動力学は、著しくｐＨ感受性であり、ｐＨ５．０では４時間以内にペプチドの９５．３％を放棄し、７．４の生理的ｐＨでは４８時間後でペプチド含有量の約５０％を保持している（図２ｄ）。

小さな寸法の酸に不安定な生分解性ポリマーから構成される場合、ペプチドナノ粒子は、カプセル化されたペプチドの膜溶解活性に重要な、著しくｐＨ感受性の放出プロファイルを呈する。

実施例７
ナノ粒子の抗がん効力
対照ＮＰ、Ｌ－ＥＥＫペプチド、およびＬ－ＥＥＫ－ＮＰの処置でのＣＣＫ－８アッセイにより評価される細胞のバイアビリティは、ＮＰ製剤化が、４つの異なる乳がん細胞株（ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、およびＺＲ－７５－１）に対するＥＥＫの抗がん効力を４倍増加させることを示した（図１ｅ）。がん細胞に対するペプチドの細胞傷害性を高めつつ、ＮＰは、赤血球とのペプチドの相互作用を低減することがさらに示された（図１ｄ）。

実施例８
ナノ粒子は、マウスモデルにおいて転移性乳がんを処置できる。
Ｌ－ＥＥＫ－ＮＰの治療的妥当性を、予後が不十分であり処置選択肢が限定されることが知られている、高悪性度転移性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１トリプルネガティブ乳がんのマウスモデルにおいて評価した（図１ｆ）。触知できる腫瘍が確立した後、マウスを、２週間の処置過程にわたり対照ＮＰまたはＬ－ＥＥＫ－ＮＰのいずれかで処置した。処置期間の後に腫瘍を観察したとき、対照グループのマウスは、有意な腫瘍体積の成長を呈した（図１ｇ、ｉ；図３ａ）。対照的に、ＥＥＫ－ＮＰ処置を受けたマウスは、腫瘍の成長が有意に阻害されることを示し（図１ｇ、ｉ；図３ｂ）、このうち４匹の処置したマウスのうち２匹は、完全な腫瘍の根絶を示した。特に、対照ＮＰおよびＬ－ＥＥＫ－ＮＰ処置は、無視できるほどの体重減少を示しており（図１ｈ；図３ｃ、ｄ）、抗がんペプチドのナノ製剤化の安全性が証明された。

実施例９
ＡＰＣの細孔の構造および機能
膜を穿孔するペプチドは、通常、現在の技術では実験的決定を逃れる一過性の細孔を形成する。膜穿孔を支持する分子機構を明らかにするために、本発明者らは、偏りのない長い時間尺度での原子の詳細な分子動力学シミュレーションを使用してＥＥＫのフォールディング－分配および細孔アセンブリを試験した。ＡＣＰは、膜界面上で容易に吸着し、フォールディングする（図１４ａ）。その後、数十μｓの時間尺度で、ＡＰＣは脂質二重層を通して協調的に挿入および移動し、両方の膜界面に定着し（図１４ｂ）、細孔のアンサンブルを形成する（図１４ｄ）。構造分析は、膜において連続して形成および解散する６～１０ペプチドから大部分が構成される、著しく不均一な細孔構造を明らかにする（図１４ｅ）。細孔は水およびイオンの両方を伝導し（図１４ｄ）、漏出は、極性側鎖および荷電した側鎖に沿った（ｌｉｎｅｄｗｉｔｈ）大きな水性チャネルを形成する、１０～１２ペプチドからなるより大きく安定した細孔により支配される（図１４ｃ）。

参照文献
本明細書に記載される全ての特許および文献の参照文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
１．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｖ．；Ｖａｎｎｅｒ，Ｒ．；Ｄｉｒｋｓ，Ｐ．；Ｅａｖｅｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ａｎｅｖｏｌｖｉｎｇｃｏｎｃｅｐｔ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２０１２，１２（２），１３３－４３．

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３．Ｄｅａｎ，Ｍ．；Ｆｏｊｏ，Ｔ．；Ｂａｔｅｓ，Ｓ．，Ｔｕｍｏｕｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００５，５（４），２７５－８４．

４．Ｍａｒｘ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃａｎｃｅｒ’ｓｐｅｒｐｅｔｕａｌｓｏｕｒｃｅ？Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７，３１７（５８４１），１０２９－３１．

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６．Ｐａｔｔａｂｉｒａｍａｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｔａｃｋｌｉｎｇｔｈｅｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ－ｗｈａｔｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｄｏｔｈｅｙｐｏｓｅ？ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ２０１４，１３（７），４９７－５１２．

７．Ｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｂ．；Ｏｎｄｅｒ，Ｔ．Ｔ．；Ｊｉａｎｇ，Ｇ．；Ｔａｏ，Ｋ．；Ｋｕｐｅｒｗａｓｓｅｒ，Ｃ．；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．；Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｃｅｌｌ２００９，１３８（４），６４５－６５９．

８．Ｂａｏ，Ｓ．；Ｗｕ，Ｑ．；ＭｃＬｅｎｄｏｎ，Ｒ．Ｅ．；Ｈａｏ，Ｙ．；Ｓｈｉ，Ｑ．；Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ，Ａ．Ｂ．；Ｄｅｗｈｉｒｓｔ，Ｍ．Ｗ．；Ｂｉｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．；Ｒｉｃｈ，Ｊ．Ｎ．，ＧｌｉｏｍａｓｔｅｍｃｅｌｌｓｐｒｏｍｏｔｅｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｙｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤＮＡｄａｍａｇｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ２００６，４４４（７１２０），７５６－６０．

９．Ｐａｐａｃｃｉｏ，Ｆ．；Ｐａｉｎｏ，Ｆ．；Ｒｅｇａｄ，Ｔ．；Ｐａｐａｃｃｉｏ，Ｇ．；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，Ｖ．；Ｔｉｒｉｎｏ，Ｖ．，ＣｏｎｃｉｓｅＲｅｖｉｅｗ：ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ，ＣａｎｃｅｒＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ａｎｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｉｎＣａｎｃｅｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄ２０１７，６（１２），２１１５－２１２５．

１０．Ｉｚｚｅｄｉｎｅ，Ｈ．；Ｐｅｒａｚｅｌｌａ，Ｍ．Ａ．，Ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒＤｒｕｇ－ＩｎｄｕｃｅｄＡｃｕｔｅＫｉｄｎｅｙＩｎｊｕｒｙ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔＲｅｐ２０１７，２（４），５０４－５１４．

１１．Ｒｏｓｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．；Ｐｅｒａｚｅｌｌａ，Ｍ．Ａ．，ＡｃｕｔｅＫｉｄｎｅｙＩｎｊｕｒｙｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣａｎｃｅｒ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１７，３７７（５），５００－５０１．

１２．Ｒｏｓｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．；Ｃａｐａｓｓｏ，Ｇ．；Ｐｅｒａｚｅｌｌａ，Ｍ．Ａ．，Ａｃｕｔｅｋｉｄｎｅｙｉｎｊｕｒｙａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓｉｎｔｈｅｃｒｉｔｉｃａｌｌｙｉｌｌｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｃａｎｃｅｒ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｒｉｔＣａｒｅ２０１７，２３（６），４７５－４８３．

１３．ＧｕｈａＳ，ＧｈｉｍｉｒｅＪ，ＷｕＥ，ＷｉｍｌｅｙＷＣ．ＭｅｃｈａｎｉｓｔｉｃＬａｎｄｓｃａｐｅｏｆＭｅｍｂｒａｎｅ－ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅｓ．ＣｈｅｍＲｅｖ．２０１９０８；１１９（９）：６０４０－８５．

１４．ＬａｚｚａｒｏＢＰ，ＺａｓｌｏｆｆＭ，ＲｏｌｆｆＪ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍｅｄｂｙｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０２００１；３６８（６４９０）．

１５．ＣｈｅｎＣＨ，ＬｕＴＫ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＣｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅｓｆｏｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＡｎｔｉｂｉｏｔＢａｓｅｌＳｗｉｔｚ．２０２０Ｊａｎ１３；９（１）．

１６．Ｗｉｍｌｅｙ，Ｗ．Ｃ．；Ｈｒｉｓｔｏｖａ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓａｎｄｕｎａｎｓｗｅｒｅｄｑｕｅｓｔｉｏｎｓ．ＪＭｅｍｂｒＢｉｏｌ２０１１，２３９（１－２），２７－３４．

１７．Ｓｈａｉ，Ｙ．，Ｍｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｍｅｍｂｒａｎｅａｃｔｉｖｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２００２，６６（４），２３６－４８．

１８．Ｇａｓｐａｒ，Ｄ．；Ｖｅｉｇａ，Ａ．Ｓ．；Ｃａｓｔａｎｈｏ，Ｍ．Ａ．，Ｆｒｏｍａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｏａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｒｅｖｉｅｗ．ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２０１３，４，２９４．

１９．Ａｎｄｒｅｅｖ，Ｏ．Ａ．；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ，Ｙ．Ｋ．，ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｐＨＬＩＰｓ）ａｓａｎｏｖｅｌｃｌａｓｓｏｆｄｅｌｉｖｅｒｙａｇｅｎｔｓ．ＭｏｌＭｅｍｂｒＢｉｏｌ２０１０，２７（７），３４１－５２．

２０．Ａｎｄｒｅｅｖ，Ｏ．Ａ．；Ｋａｒａｂａｄｚｈａｋ，Ａ．Ｇ．；Ｗｅｅｒａｋｋｏｄｙ，Ｄ．；Ａｎｄｒｅｅｖ，Ｇ．Ｏ．；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ，Ｙ．Ｋ．，ｐＨ（ｌｏｗ）ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅ（ｐＨＬＩＰ）ｉｎｓｅｒｔｓａｃｒｏｓｓａｌｉｐｉｄｂｉｌａｙｅｒａｓａｈｅｌｉｘａｎｄｅｘｉｔｓｂｙａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｔｈ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２０１０，１０７（９），４０８１－６．

２１．Ａｎ，Ｍ．；Ｗｉｊｅｓｉｎｇｈｅ，Ｄ．；Ａｎｄｒｅｅｖ，Ｏ．Ａ．；Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ，Ｙ．Ｋ．；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｐＨ－（ｌｏｗ）－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｐｅｐｔｉｄｅ（ｐＨＬＩＰ）ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｍｂｒａｎｅｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅｐｈａｌｌｏｉｄｉｎｔｏｘｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２０１０，１０７（４７），２０２４６－５０．

２２．Ｗｙａｔｔ，Ｌ．Ｃ．；Ｍｏｓｈｎｉｋｏｖａ，Ａ．；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｔ．；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｄ．Ｍ．；Ａｎｄｒｅｅｖ，Ｏ．Ａ．；Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ，Ｙ．Ｋ．，ＰｅｐｔｉｄｅｓｏｆｐＨＬＩＰｆａｍｉｌｙｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｃａｒｇｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔｏｔｕｍｏｒｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２０１８，１１５（１２），Ｅ２８１１－Ｅ２８１８．

２３．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．；Ｍｅｄｉｎａ，Ｓ．Ｈ．；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｐ．；Ｋｌａｒ，Ａ．Ｊ．Ｓ．，ＧｌｙｃａｎＡｌｔｅｒａｔｉｏｎＩｍｐａｒｔｓＣｅｌｌｕｌａｒＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａＭｅｍｂｒａｎｅ－ＬｙｔｉｃＡｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒＰｅｐｔｉｄｅ．ＣｅｌｌＣｈｅｍＢｉｏｌ２０１７，２４（２），１４９－１５８．

２４．Ｆｒｅｉｒｅ，Ｊ．Ｍ．；Ｇａｓｐａｒ，Ｄ．；Ｖｅｉｇａ，Ａ．Ｓ．；Ｃａｓｔａｎｈｏ，Ｍ．Ａ．，Ｓｈｉｆｔｉｎｇｇｅａｒｉｎａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｎｄａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒｐｅｐｔｉｄｅｓｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ：ｆｒｏｍｖｅｓｉｃｌｅｓｔｏｃｅｌｌｓ．ＪＰｅｐｔＳｃｉ２０１５，２１（３），１７８－８５．

Claims

モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧ（式中各ｘが、独立して、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン酸（Ｅ）から選択される）を含む配列を有する１つ以上のペプチドを含むナノ粒子。
前記モチーフがＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧである、請求項１に記載のナノ粒子。
前記配列が、配列番号１～３６およびそれらの混合物のうちのいずれか１つから選択される配列を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
前記配列が、配列番号２９または配列番号３３を含まない、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１４、配列番号２５、または配列番号２６、およびそれらの混合物から選択される配列を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
前記配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号１４、配列番号２５、または配列番号２６、およびそれらの混合物から選択される配列を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
前記配列が、配列番号２５および／または配列番号２６から選択される配列を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
前記１つ以上のペプチドが、最大２０アミノ酸長を有する、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記ペプチド配列が、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧからなる、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記１つ以上のペプチドが、中性または陰イオン性である、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記ペプチドが、Ｌ型にある、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記ナノ粒子が、約１～約２００ｎｍ、約５～約１００ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、または約２０ｎｍの直径を有する、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
ポリエチレングリコールメチルエーテルポリラクチド－コ－グリコリド（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）を含む、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記ペプチドが、αヘリックスのアセンブリを形成する、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
前記ペプチドが、がん細胞膜に細孔を形成する、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子。
がんの処置に使用するための、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子と１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的に許容される組成物。
がんの処置のための医薬の製造に使用するための、先行する請求項のいずれかに記載のナノ粒子と１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物。
前記がんが乳がんである、請求項１６または１７に記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、化学療法剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項１６～１８のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、静脈内投与のためのものである、請求項１６～１９のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、１ｎＭ～約１０，０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５，０００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの範囲の用量での投与のためのものである、請求項１６～２０のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物。
請求項１６～２１のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物を、好ましくは乳がんであるがんを有する患者に投与する、がんの処置方法。
請求項１６～２１のいずれかに記載の薬学的に許容される組成物を含む、がんを処置または予防するためのキット。
前記がんが乳がんである、請求項２３に記載のキット。
化学療法剤をさらに含む、請求項２３または２４に記載のキット。