JP2023544942A - ナノ粒子プローブ及び核酸検出におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子を用いて、サンプル中の標的核酸分析物（例えば、病原体、又はウイルス核酸）の存在を検出するための方法を提供し、少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドプローブの標的分析物中の少なくとも３つの異なる標的配列へのハイブリダイゼーションは、ナノ粒子の凝集及び目に見える色の変化を引き起こす。また、本発明は、そのようなオリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団及び標的核酸分析物の検出のための関連キットを提供する。【選択図】図１Ｄ

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０２０年６月９日に提出されたＥＰ２０３８２４９９．０の優先権を主張し、その内容及び要素は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、標的核酸の検出に関し、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの微生物又はウイルスの核酸の検出に関する。

「ＣＯＶＩＤ－１９」
ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルス重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる重度の呼吸器疾患である。２０１９年１２月に中国の湖北省の省都、武漢で最初に確認された。その発生から急速に広がって世界的に定着し、現在のパンデミックを引き起こし、数万人が死亡し、数十万人ないしは数百万人が感染しており、そして普遍的な混乱と世界的な経済不況を引き起こしている。

新たな流行又はパンデミックの管理に成功するためのカギは、症状があるかどうかに関わらず、感染した個人を特定し、隔離することである。パンデミックの発生と確立に伴い、社会の継続的な機能を確保するためには、開発とその後、疾患に対する特異的抗体の検出により、すでに感染しているが、軽症、混乱又は症状がないために気付いていない個人を、免疫ができた個人として特定する必要がある。効果的なワクチン又は治療法を欠く場合に、感染管理の最前線にあるのは検査である。

現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査には主に３つのタイプ（抗原、抗体、遺伝子）があり、特性、長所、短所が大きく異なる。抗原検査は、ウイルスの部分（通常はタンパク質）を検出するもので、現在採用されている最も一般的な迅速検査でもある。しかし、他の関連タンパク質との交差反応性のために、これらの検査は遺伝子検査に比べてかなり正確さが低い傾向にある。抗体検査の方も、ウイルスに対する抗体（ＩｇＧ又はＩｇＭ）の存在を検出する迅速な検査であり、一般に抗原検査よりも特異的であるが、感染後１０～１４日までに抗体が現れないため、最も感染力の強い時期の患者を検出できない。ウイルス検査のゴールド・スタンダードは、依然としてウイルスの特異的核酸（ＲＮＡ）配列を検出する遺伝子検査である。現在、市場に出回っている全ての遺伝子検査はＰＣＲに基づく。当該技術のターン・アラウンド・タイムが徐々に改善されるとしても、ＰＣＲベースの検査は、専門の実験室、高価な装置、試薬、訓練を受けた人員を必要とするため、その拡張性に限界がある。

必要な時にいつどこでも使用できる基礎設備を必要とせずに拡張可能な迅速な遺伝子検査が緊急に必要とされている。本発明は、これら及び他の要望を解決し、本明細書に記載の関連の利点を提供する。

「検出技術」
ナノ粒子を使用する比色センサーは、タンパク質、核酸から小さな有機分子、金属イオンまで、複数の分析物を検出するために使用されている。溶液中の球状の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、約５２０ｎｍまでは局在表面プラズモン共鳴が強いため、赤く見える。ＡｕＮＰの凝集は、電気双極子－双極子相互作用及び隣接する粒子のプラズモン間の結合を誘導し、表面プラズモンバンドが５２３ｎｍから６１０～６７０ｎｍにシフトすることに対応して、色はピンクから青／紫又は透明に変化する（図１）。

比色センサーは多くの利点を有する。それが使用しやすく、一般には、訓練を受けた人員を必要とせずに１つのステップだけで済む。吸光係数が非常に高いため、目に見える色の変化を生じるのに数個のナノ粒子だけを必要とするので感度が高い。さらに、色の変化は肉眼でも検出できるため、複雑なあるいは高価な分析機器を必要としない。最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子の一部を検出するために、比色測定が用いられている（参考文献６）。

しかしながら、単一のプローブ又は２つのプローブの集団に基づく現在の検出システムの殆どは、主要な汚染物質の検出には十分な感度があるが、病原体の検出には感度が不十分であるという感度の制限により、容易に適応するものではない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの病原体の標的分析物を検出するための改善された方法が必要である。本発明は、これら及び他の要望を解決し、本明細書に記載の関連の利点を提供する。

本発明は、概ね、サンプル中の標的核酸を検出するためのナノ粒子ベースの検出プラットフォームに関する。当該検出プラットフォームは、目に見える色の変化を生じるナノ粒子の標的核酸依存性凝集に基づくものである。驚くべきことに、本発明者らは、標的配列が離間した又は連続的かつ重畳しないよう、標的核酸中の標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を入念に選択することにより、サンプル中の標的核酸の存在又は非存在を迅速で効率的に示すよう、当該検出プラットフォームに十分な感度及び特異度を提供できるということを見出した。たとえ複雑な分析機器がなくても、例えば、場合によっては、数時間又は数分以内に肉眼で見える反応溶液の明確な色の変化を提供する。これは、ＷＯ２００５／００８２２２に記載されているような、固定されたガラススライドスポットと、導波路と、ＣＭＯＳセンサーとを必要とする従来の検出プラットフォームに対する喜ばしい改善である。さらに、Ｍｏｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２０では、目に見える色の変化を生じるためにＲＮＡｓｅ処理（結果的に高温でのインキュベーション）を必要とする方法が説明されている。

したがって、本発明の第１態様において、サンプル中の標的核酸分析物の存在を検出するための方法を提供し、前記標的核酸分析物は、少なくとも第１、第２及び第３の標的配列を含み、これらの標的配列は、離間した又は連続的かつ重畳せず、当該方法は、オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団を提供することであって、前記集団は、少なくとも、前記第１標的配列にハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドプローブと、前記第２標的配列にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブと、前記第３標的配列にハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドプローブとを含むことと、前記サンプルを含む溶液を前記ナノ粒子の集団に接触させることであって、前記オリゴヌクレオチドプローブ配列と前記標的配列との間の複数の特異的な結合事象が前記ナノ粒子の凝集を引き起こすことにより、前記溶液は標的核酸分析物に依存する目に見える色の変化を生じることとを含む。したがって、本発明の方法は、従来技術の方法で教示されているように基質に固定されるものではなく、「自由浮遊」溶液の中で接触するナノ粒子と標的核酸分析物の検出を採用している。これにより、シンプルなチューブ（例えば、固体及び液体のサンプルと試薬を調製、混合、遠心分離、輸送、保存するためのポリプロピレン製の使い捨てチューブ）でもナノ粒子とサンプルを混合するために使用でき、且つ、検出結果は単純な混合又は振とう後、数分又は数十分以内に肉眼で見える色の変化によって示されるため、検出プラットフォームの製造と使用を大幅に簡素化させる。

いくつかの実施形態において、各タイプのナノ粒子は、１つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで機能化される。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、少なくとも３つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの複数のコピーでそれぞれ機能化された複数の異なるタイプのナノ粒子を含む。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、標的分析物中の少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、９５個、又は少なくとも１００個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列にハイブリダイズする、少なくとも４つのタイプ、５つのタイプ、６つのタイプ、７つのタイプ、８つのタイプ、９つのタイプ、１０タイプ、１１タイプ、１２タイプ、１３タイプ、１４タイプ、１５タイプ、１６タイプ、１７タイプ、１８タイプ、１９タイプ、２０タイプ、２１タイプ、２２タイプ、２３タイプ、２４タイプ、２５タイプ、３０タイプ、３５タイプ、４０タイプ、４５タイプ、５０タイプ、５５タイプ、６０タイプ、６５タイプ、７０タイプ、７５タイプ、８０タイプ、９５タイプ、又は少なくとも１００タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される。

特定の実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、前記標的分析物中の１０個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列に結合する１０タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される。

いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプローブの１つ又は複数（例えば、全て）は、それがハイブリダイズする前記標的配列に完全に相補的である。しかしながら、前記標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、１つ又は複数のミスマッチ（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個の塩基のミスマッチ）があるにもかかわらず、特定の実施形態では使用できることが特に考えられる。

いくつかの実施形態において、標的と全ナノ粒子のモル比は、標的特異的なナノ粒子の凝集を可能にするよう選択される。特に、前記標的と全ナノ粒子のモル比は、１：１～０．００１：１の範囲にあってもよい。特定の実施形態において、前記モル比は、０．１～０．００１の範囲にあってもよい。本明細書において、当該比とは、特定のナノ粒子－プローブのタイプ（「バッチ」）の濃度と標的分析物のモル比である。これは累積プローブ濃度とは異なる。したがって、例えば、１０タイプのオリゴヌクレオチドプローブ（１０バッチのＮＰ）を有する実施形態では、前記累積比は１０：１のプローブ：分析物である可能性があるが、個々のＮＰ－プローブの前記モル比は１：１である。

いくつかの実施形態において、前記方法は、前記標的核酸分析物を２つ以上の断片に分解する断片化ステップを含む。場合によっては、前記断片化ステップは、前記サンプルに対する一定時間の超音波処理を含んでもよい。例えば、超音波処理は、少なくとも１０秒、少なくとも３０秒、又は少なくとも６０秒実施してもよい。

いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ウイルスＲＮＡを含む。特に、前記標的分析物は、ウイルスゲノムＲＮＡ、ウイルスサブゲノムｍＲＮＡ又はウイルスｍＲＮＡを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥタンパク質及び／又はＮタンパク質のゲノム配列を含む。いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ遺伝子及び／又はＮ遺伝子のｓｇｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、リーダーＥ遺伝子及び／又はリーダーＮ遺伝子及び／又は融合配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１～１５から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１、２、３、４、５から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号６、７、８、９、１０から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５から選択される。いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、金属コアを有する。特に、前記金属コアは、金又は銀を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、実質的に球状である。いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、非球状である。特に、前記非球状のナノ粒子は、多分岐であってもよい。例えば、前記多分岐ナノ粒子は、ナノウニ（ｎａｎｏ－ｕｒｃｈｉｎ）であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、楕円体又は両錐体の形態であってもよい。異なる形態を有するナノ粒子の混合物が特に考えられる。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、１３～６５ｎｍ、２０～６０ｎｍ、例えば、約３０ｎｍの直径（例えば、平均直径）を有する。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、ＤＮＡ又は非天然核酸を含む。特に、前記プローブは、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｈ核酸、２’－ＯＭｅ核酸、２’－Ｆ核酸又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子－プローブ結合は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端にある。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、Ｃ６－チオール結合を含む。いくつかの実施形態において、前記プローブは、Ｃ６－チオール５’結合を含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、１０～１００個のヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド個を含み、任意に１２～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分は、２０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分の上流にヌクレオチド尾部を含む。特に、前記ヌクレオチド尾部は、５～２０個のヌクレオチド、例えば、１０個のヌクレオチドを含んでもよい。場合によっては、前記ヌクレオチド尾部は、ポリチミン（「ポリＴ」）尾部である。特に、前記ヌクレオチド尾部は、１０個のチミンを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、５～３０ｎｍである。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１０～１８ｎｍである。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１２ｎｍである。

いくつかの実施形態において、前記方法は、追加で塩を添加するステップをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫを添加するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＳＤＳの最終濃度は、少なくとも０．５％である。

いくつかの実施形態において、前記方法は、４５℃未満で実施される。例えば、前記方法は、４０℃未満、３５℃未満、２５℃未満、又は２０℃未満で実施されてもよい。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ＲＮＡｓｅの添加を伴わない。例えば、ＮＰ凝集後にＲＮＡｓｅが添加されない。

本発明の第２態様において、標的核酸分析物中の少なくとも第１、第２及び第３の離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列にハイブリダイズする少なくとも第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団を提供する。

いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団は、本発明の第１態様の方法で使用するためのものである。

前記オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団は、本発明の第１態様において定義されるとおりであってもよい。

いくつかの実施形態において、各タイプのナノ粒子は、１つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで機能化される。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、少なくとも３つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの複数のコピーでそれぞれ機能化された複数の異なるタイプのナノ粒子を含む。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、標的分析物中の少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、９５個、又は少なくとも１００個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列にハイブリダイズする、少なくとも４つのタイプ、５つのタイプ、６つのタイプ、７つのタイプ、８つのタイプ、９つのタイプ、１０タイプ、１１タイプ、１２タイプ、１３タイプ、１４タイプ、１５タイプ、１６タイプ、１７タイプ、１８タイプ、１９タイプ、２０タイプ、２１タイプ、２２タイプ、２３タイプ、２４タイプ、２５タイプ、３０タイプ、３５タイプ、４０タイプ、４５タイプ、５０タイプ、５５タイプ、６０タイプ、６５タイプ、７０タイプ、７５タイプ、８０タイプ、９５タイプ、又は少なくとも１００タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される。

特定の実施形態において、前記ナノ粒子の集団は、前記標的分析物中の１０個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列に結合する１０タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される。

いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプローブの１つ又は複数（例えば、全て）は、それがハイブリダイズする前記標的配列に完全に相補的である。しかしながら、前記標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、単一の塩基のミスマッチがあるにもかかわらず、特定の実施形態では使用できることが特に考えられる。

いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ウイルスＲＮＡを含む。特に、前記標的分析物は、ウイルスゲノムＲＮＡ、ウイルスサブゲノムｍＲＮＡ又はウイルスｍＲＮＡを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥタンパク質のゲノム配列を含む。いくつかの実施形態において、前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ遺伝子のｓｇｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４から選択される。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、配列番号７、８、９から選択される。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、金属又はダイヤモンドを含むコアを有する。特に、前記コアは、金を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、実質的に球状である。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子は、１３～６５ｎｍ、４０～６０ｎｍ、例えば、約５０の直径（例えば、平均直径）を有する。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、ＤＮＡ又は非天然核酸を含む。特に、前記プローブは、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｈ核酸、２’－ＯＭｅ核酸又は２’－Ｆ核酸を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子－プローブ結合は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端にある。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、Ｃ６－チオール結合を含む。いくつかの実施形態において、前記プローブは、Ｃ６－チオール５’結合を含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブ配列は、１０～１００個のヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド個を含み、任意に１２～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分は、２０個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記プローブは、前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分の上流にヌクレオチド尾部を含む。特に、前記ヌクレオチド尾部は、５～２０個のヌクレオチド、例えば、１０個のヌクレオチドを含んでもよい。場合によっては、前記ヌクレオチド尾部は、ポリチミン（「ポリＴ」）尾部である。特に、前記ヌクレオチド尾部は、１０個のチミンを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、５～３０ｎｍである。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１０～１８ｎｍである。

いくつかの実施形態において、前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１２ｎｍである。

本発明の第３態様において、サンプル中の標的核酸分析物を検出するためのキットを提供し、前記キットは、本発明の第２態様のナノ粒子の集団と、溶液を保持するための反応容器であって、少なくとも壁と密閉可能な開口部とを含み、可視光は前記壁の少なくとも一部を通過できる前記反応容器と、本発明の第１態様の方法を実施するための１つ又は複数の試薬又は溶液とを含む。

いくつかの実施形態において、前記キットは、サンプルから標的核酸を分離するための１つ又は複数の試薬又は溶液をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記溶液は、サンプルから標的核酸を分離及び／又は精製するためのものであってもよい。ＡＲＣＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（イギリス・デアズベリー）のコロナウイルスＲＮＡ抽出研究キットにおいて提供されているのは、そのような例示的な溶液の１つである。場合によっては、当該キットは、ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｃｉｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２０／０３／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ－Ｖ３－２０２００３２８－１．ｐｄｆにて利用可能な２０２０年３月２８日付のマニュアルに記載されているように、前記コロナウイルスＲＮＡ抽出研究キットの「試薬１（Ｒｅａｇｅｎｔ １）」及び／又は「試薬２ａ（Ｒｅａｇｅｎｔ ２ａ）」を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、前記標的核酸分析物の陽性検出時に予想される色の変化に対応する色基準（例えば、カラーカード）をさらに含む。これは、例えば、前記反応容器を色基準の位置まで持ち上げることにより、使用者による色の変化の認識に役立つために用いることができる。

本発明の第４態様において、サンプル中の標的核酸分析物の存在を検出するための装置を提供し、当該装置は、サンプルを受け取るための入口と、前記サンプルが前記入口から、試薬一式が予め装填された保管室に到達するための通路であって、前記試薬は本発明の第２態様によるナノ粒子の集団を含む前記通路と、色基準を含む検出窓とを含み、使用時は、前記サンプルが保管室内の試薬に接触することにより、標的核酸分析物の陽性検出は、前記検出窓を通して見える、色基準における予想される色の変化を引き起こす。

いくつかの実施形態において、前記装置は、蓋部品をさらに含む。特に、前記蓋部品はＮａＣｌを含んでもよく、前記蓋部品を閉めるとＮａＣｌは前記保管室に添加される。

いくつかの実施形態において、前記装置は、本発明の第１態様による方法において使用することができる。

図１Ａは、シグナル増幅の概念の模式図である。 図１Ｂは、各ＮＰが同じプローブの複数のコピーを持つＮＰプローブの異なる集団の混合物の使用を示す模式図である。 図１Ｃは、同じＮＰにおける異なるプローブの複数コピーの使用を示す模式図である。 図１Ｄは、シグナル増幅の模式図である。 図２は、典型的なβコロナウイルスの模式図である。レプリカーゼ遺伝子は、５’ＵＴＲの遠位に位置し、且つゲノムの５’末端にリーダー配列が発見されたＯＲＦ １ａ及び１ｂで構成される。構造タンパク質遺伝子Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮは、３’ＵＴＲの近位に位置する。構造タンパク質遺伝子の間に散在しているのは、非構造タンパク質をコードする、インビトロ複製に必須ではないアクセサリー遺伝子である。Ａｒｍｅｓｔｏらの文献を引用している。 感受性細胞の感染後のコロナウイルスの複製サイクルである。ゲノムＲＮＡが放出され、レプリカーゼタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡとして機能する。ネストされたサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）は、構造タンパク質及びアクセサリータンパク質の発現のためにゲノムＲＮＡから生成される。図は示されていないが、Ａｒｍｅｓｔｏらの文献から利用できる。 図３は、特異的な分析物に応答する比色変化である。ａ）マッチする分析物と１個のヌクレオチドが違ってミスマッチする分析物の存在下でのナノ粒子プローブの経時的な色の変化を示す。ｂ）経時的なスペクトルシフトである。ｃ）２６０ｎｍでの吸光度によって測定される遊離核酸分析物の経時的な減少である。 図４は、ＤＮＡ分析物を使用する時の結合の特異度である。２つの隣接する２０－ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブの野生型ＢＲＡＦ遺伝子配列又は１／１００個のヌクレオチドが違う変異配列との表面プラズモン共鳴によって評価される結合速度論である。 図５は、ナノ粒子のサイズに基づく異なる濃度での特異的な分析物の検出感度の変化である。（上）６３ｎｍのナノ粒子、（中）４６ｎｍのナノ粒子、（下）１３ｎｍのナノ粒子。 図６は、異なるプローブ化学物質（未修飾ＤＮＡ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ）を使用する時の７０ｎｔ又は１４０ｎｔ（ヌクレオチド）のｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ分析物を検出する２５ｎｍ及び５０ｎｍのナノ粒子の比較である。 図７Ａは、経時的な凝集安定性の比較である。３７℃×照射である。 図７Ｂは、経時的な凝集安定性の比較である。３７℃×照射なしである。 図７Ｃは、経時的な凝集安定性の比較である。室温×照射なしである。 図８は、ＢＲＣＡ１及びＥＧＦＲ遺伝子に対する標的分析物では単一のヌクレオチドが違う時の検出感度の比較である。Ａはマッチである。Ｂはミスマッチである。Ｃはマッチとミスマッチである。 図９Ａは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１５０μＭ）のＵＶ－Ｖｉｓ（紫外－可視）スペクトルである。 図９Ａ－２は、図９Ａは続きである。 図９Ａ－３は、図９Ａは続きである。 図９Ｂは、異なる数のバッチを含む測定に対して、表面プラズモンバンドの最大値での吸光度の変化、及び分析物濃度の変化に従うＲ値（Ｒ＝Ａｂｓ_７０／Ａｂｓ_５３０）の変化である（Ａｂｓ_７０は７０ｎｍでの吸光度を表す。以下、同様の表記を使う）。 図１０Ａは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１００μＭ）のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図１０Ａ－２は、図１０Ａの続きである。 図１０Ｂは、異なる数のバッチを含む測定に対して、表面プラズモンバンドの最大値での吸光度の変化、及び分析物濃度の変化に従うＲ値（Ｒ＝Ａｂｓ_７０／Ａｂｓ_５３０）の変化である。 図１１Ａ～図１１Ｅは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ（紫外－可視－近赤外）スペクトルである。 図１１Ａ～図１１Ｅは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ（紫外－可視－近赤外）スペクトルである。 図１１Ａ～図１１Ｅは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ（紫外－可視－近赤外）スペクトルである。 図１１Ａ～図１１Ｅは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ（紫外－可視－近赤外）スペクトルである。 図１１Ａ～図１１Ｅは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ（紫外－可視－近赤外）スペクトルである。 図１１Ｆは、ＮＰの数及び標的の濃度を変える時の異なる測定の画像である。 図１１Ｇは、異なる数のバッチを含む測定に対して、分析物濃度の変化に従うＲ値（Ｒ＝Ａｂｓ_７００／Ａｂｓ_５３０）の変化である。 図１１Ｈは、表面プラズモンバンドの最大値、５３０ｎｍでの吸光度の変化である。 図１１Ｉは、表面プラズモンバンドの最大値の位置の移動である。測定の検出限界は１ｎＭと推定される。 図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１００μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１００μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１００μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度１００μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１２Ｅは、ＮＰの数及び標的の濃度を変える時の異なる測定の画像である。 図１２Ｆは、異なる数のバッチを含む測定に対して、分析物濃度の変化に従うＲ値（Ｒ＝Ａｂｓ_７００／Ａｂｓ_５３０）の変化である。 図１２Ｇは、表面プラズモンバンドの最大値５３０ｎｍでの吸光度の変化である。 図１２Ｈは、表面プラズモンバンドの最大値の位置の移動である。４つ及び５つのバッチの測定に対して、測定の検出限界は１００ｐＭと推定される。 図１３Ａ～図１３Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（それぞれ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１３Ａ～図１３Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（それぞれ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１３Ａ～図１３Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（それぞれ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１３Ａ～図１３Ｄは、異なる濃度の１０８ｎｔ標的配列に対して、異なるＮＰの組み合わせ（それぞれ、２つ、３つ、４つ、５つ）の濃度５０μＭでのＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１３Ｅは、異なる数のバッチを含む測定に対して、分析物濃度の変化に従うＲ値（Ｒ＝Ａｂｓ_７００／Ａｂｓ_５３０）の変化である。 図１３Ｆは、表面プラズモンバンドの最大値５３０ｎｍでの吸光度の変化である。 図１３Ｇは、表面プラズモンバンドの最大値の位置の移動である。 図１４Ａは、３０秒、６０秒、１５０秒の超音波処理時間での２つ、３つ、４つ、５つのＮＰバッチ（Ｅ１～Ｅ５）のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図１４Ａ－２は、図１４Ａの続きである。 図１４Ｂは、３０秒、６０秒、１５０秒の超音波処理時間での２つ、３つ、４つ、５つのＮＰバッチ（Ｅ１２～Ｅ１６）のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図１４Ｂ－２は、図１４Ｂの続きである。 図１４Ｃは、異なる数のＮＰバッチ及び超音波処理時間での凝集度Ｒ（上のパネル）及びＡｂｓ_５３０（下のパネル）である。 図１４Ｃ－２は、図１４Ｃの続きである。 図１５Ａは、２つ、３つ、４つ、５つのＮＰバッチ（Ｅ１～Ｅ５）のＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルである。 図１５Ｂは、２つ、３つ、４つ、５つのＮＰバッチ（Ｅ１２～Ｅ１６）のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図１５Ｃは、ＮＰの数及び捕捉プローブセットを変える時の異なる測定の画像である。 図１５Ｄは、異なる数のＮＰバッチに対する凝集度（Ｒ）である。 図１５Ｅは、異なる数のＮＰバッチに対するＡｂｓ_５３０である。 図１５Ｆは、異なる数のＮＰバッチに対するプラズモンバンドの位置である。 図１６Ａは、２つのＮＰバッチのＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（上のパネル）及び凝集度（下のパネル）である。 図１６Ｂは、３つ、４つ、５つのＮＰバッチのＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（上のパネル）及び凝集度（下のパネル）である。 図１７Ａは、分析物配列中の１、２又は３ｎｔの変化及びＥ１～５の位置に基づく、異なるプローブ配列の融解曲線の計算である。 図１７Ａ－２は、図１７Ａの続きである。 図１７Ｂは、分析物配列中の１、２又は３ｎｔの変化及びＥ１２～１６の位置に基づく、異なるプローブ配列の融解曲線の計算である。 図１７Ｂ－２は、図１７Ｂの続きである。 図１８は、５０ｎｍのナノウニを使用する合成サブゲノムＥ遺伝子分析物の断片の検出である。図１８Ａは、標的分析物、即ちＥ遺伝子の３’側半分（長さが１２０ｎｔのサブゲノムＲＮＡ配列）を添加して２分後の色の変化の画像である。対照ウェルは、ＡｕＮＰプローブに非相補的な長さが１０８ｎｔのＲＮＡ配列を含んでいる。図１８Ｂは、標的ＲＮＡ配列及び対照の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は３回繰り返して実施された。 図１９は、球状の３０ｎｍ ＡｕＮＰを使用する合成サブゲノムＥ遺伝子分析物の断片の検出である。図１９Ａは、標的分析物、即ちＥ遺伝子の３’側半分（長さが１２０ｎｔのサブゲノムＲＮＡ配列）を添加して２分後の色の変化の画像である。対照ウェルは、ＡｕＮＰプローブに非相補的な長さが１０８ｎｔのＲＮＡ配列を含んでいる。図１８Ｂは、標的ＲＮＡ配列及び対照の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は３回繰り返して実施された。 図２０は、３０ｎｍのナノスフェアを用いる合成Ｎ遺伝子ＲＮＡの検出である。７つのプローブ（プローブＮ１～７）又は６つのプローブ（Ｎ８～２０）の混合物で機能化された金ナノスフェアを用いて異なる濃度範囲（１００～０．１ｎＭ）の合成Ｎ遺伝子ＲＮＡ断片（１２６０ｎｔ）を検出するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は３回繰り返して実施された。Ｗは水のみの対照。 図２１は、Ｎ遺伝子プローブの混合物（Ｎ１～７及びＮ８～２０）で機能化された３０ｎｍのＡｕＮＰを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列の検出である。図２１Ａは、１０ｆｍｏｌ又は１ｆｍｏｌの標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）を添加する時の色の変化の画像である。図２１Ｂは、異なる濃度の標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は２回繰り返して実施された。Ｗは水のみの対照。 図２２は、Ｅ遺伝子プローブの混合物（Ｅ７～１７）で機能化された３０ｎｍのＡｕＮＰを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列の検出である。図２２Ａは、１０ｆｍｏｌ又は１ｆｍｏｌの標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）を添加する時の色の変化の画像である。図２２Ｂは、異なる濃度の標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は２回繰り返して実施された。Ｗは水のみの対照。 図２３は、Ｎ及びＥ遺伝子プローブの混合物で機能化された３０ｎｍのＡｕＮＰを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列の検出である。図２３Ａは、１０ｆｍｏｌ又は１ｆｍｏｌの標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）を添加する時の色の変化の画像である。図２３Ｂは、異なる濃度の標的分析物（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ウイルス配列）の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は２回繰り返して実施された。Ｗは水のみの対照。図２４Ａ、図２４Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の特異度である。 ネコ科アルファコロナウイルスＶＲ－９８９に由来するゲノムＲＮＡを標的分析物として使用する時と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡを標的分析物として使用する時の色の変化の画像である。 異なる標的分析物の対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は３回繰り返して実施された。 図２５Ａ～図２５Ｄは、ナノ粒子の添加後の塩添加による検出効果の強化である。異なるプローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。図２５ＡはＥ７～１７であり、図２５ＢはＥ１～６であり、図２５ＣはＮ１～７及びＮ８～２０であり、図２５ＤはＮ１３であり、且つ追加で０．７Ｍの塩の添加後に、最終の塩濃度は１．５Ｍである。実験は２回繰り返して実施された。水を対照として使用した。 図２５Ａ～図２５Ｄは、ナノ粒子の添加後の塩添加による検出効果の強化である。異なるプローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。図２５ＡはＥ７～１７であり、図２５ＢはＥ１～６であり、図２５ＣはＮ１～７及びＮ８～２０であり、図２５ＤはＮ１３であり、且つ追加で０．７Ｍの塩の添加後に、最終の塩濃度は１．５Ｍである。実験は２回繰り返して実施された。水を対照として使用した。 図２５Ａ～図２５Ｄは、ナノ粒子の添加後の塩添加による検出効果の強化である。異なるプローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。図２５ＡはＥ７～１７であり、図２５ＢはＥ１～６であり、図２５ＣはＮ１～７及びＮ８～２０であり、図２５ＤはＮ１３であり、且つ追加で０．７Ｍの塩の添加後に、最終の塩濃度は１．５Ｍである。実験は２回繰り返して実施された。水を対照として使用した。 図２５Ａ～図２５Ｄは、ナノ粒子の添加後の塩添加による検出効果の強化である。異なるプローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。図２５ＡはＥ７～１７であり、図２５ＢはＥ１～６であり、図２５ＣはＮ１～７及びＮ８～２０であり、図２５ＤはＮ１３であり、且つ追加で０．７Ｍの塩の添加後に、最終の塩濃度は１．５Ｍである。実験は２回繰り返して実施された。水を対照として使用した。 図２６は、検出限界（ＬＯＤ）の決定である。図２６Ａは、プローブＥ７～１７で機能化されたＡｕＮＰの色の変化の画像であり、一連の既知の濃度の完全長ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡで測定された。図２６Ｂは、異なる濃度のＲＮＡの対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図２７は、ＬＯＤの決定である。図２７Ａは、Ｅ遺伝子（１１のプローブ）及びリーダー配列（１７のプローブ）プローブで機能化されたＡｕＮＰの色の変化の画像であり、一連の既知の濃度の完全長ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡで測定された。図２７Ｂは、異なる濃度のＲＮＡの対応するＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図２８Ａ、図２８Ｂは、唾液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出である。図２８Ａは、唾液に入ったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡで測定したＥ７～Ｅ１７プローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図２８Ａ、図２８Ｂは、唾液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出である。図２８Ｂは、唾液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて、ＳＤＳとプロテイナーゼＫを使用して測定したＥ７～Ｅ１７プローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。実験は２回繰り返して実施された。 図２９Ａ、図２９Ｂは、患者由来のサンプルを使用する唾液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出である。図２９Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者由来のサンプル、即ち鼻咽頭サンプルからのＲＮＡの入った唾液で測定したＥ７～１７プローブで機能化されたＡｕＮＰの色の変化の画像である。 図２９Ａ、図２９Ｂは、患者由来のサンプルを使用する唾液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの検出である。図２９Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者由来のサンプルを用いて、ＳＤＳとプロテイナーゼＫを使用して測定したＥ７～Ｅ１７プローブで機能化されたＡｕＮＰのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。 図３０Ａ、図３０Ｂは、個体のサンプルの臨床検査である。図３０Ａは、６人の独立な観察者が盲検法で、目視でサンプルを陽性か陰性とマークして検査する例である。 図３０Ａ、図３０Ｂは、個体のサンプルの臨床検査である。図３０Ｂは、Ａの集計結果に基づいて計算された臨床検査パラメータを含む表である。 図３１は、オールインワンＣＯＶＩＤ－１９分子検査のプロトタイプである。

表１は、２３ｎｔのＲＮＡ分析物及び５０ｎｍのＮＰを用いるＲＮＡ分析物の検出である。
表２は、７０ｎｔのＲＮＡ分析物及び２５ｎｍのＮＰを用いるＲＮＡ分析物の検出である。
表３は、オリゴヌクレオチド標的配列及び捕捉プローブである。
表４は、捕捉プローブのオリゴヌクレオチド配列である。
表５は、測定で使用する異なる濃度のＡｕ_０及び異なる濃度の標的に対する標的分子の割合及び金ナノ粒子の数である。
表６は、分析物配列中の１、２又は３ｎｔの変化及び変化の位置に基づく、異なるプローブ配列の融解曲線の計算である。

本発明は、ウイルス又は細菌病原体などの病原体の核酸配列に特異的に結合するナノ粒子（ＮＰ）に付着した複数（例えば、３つ以上）の連続的かつ重畳しない標的プローブ配列を使用するという原理に基づく。複数の特異的な結合事象により、ＮＰが互いに極めて近接することで効果的にＮＰの凝集を引き起こす。分析物の存在下でのみ、前記凝集は肉眼で検出できる視覚的な色の変化をもたらす。任意に、例えば、ＮＰがダイヤモンドを含む場合に、当該凝集は発光の変化をもたらし、当該変化は光学的に検出可能であり、肉眼で検出できる視覚的変化に変換できる。ＲＮＡ又はＤＮＡ分析物の異なる領域を標的とする複数のプローブの混合物は、シグナルの分子間増幅を引き起こして、検出システムの感度を高める。

有利なことに、視覚的な色の変化をもたらす分析物結合の感度及びシグナル増幅は、特異的な長いＲＮＡ／ＤＮＡ配列に対する複数のプローブの使用によって増強される。プローブの数は３からｎであってもよい。より多くのプローブを添加すると、検出システムの感度の更なる向上をもたらす（図１Ａ）。
本発明は、異なるＮＰ－プローブの集団の混合物を使用してもよく、各ＮＰは同じプローブの複数のコピーを有する（図１Ｂ）。任意に、本発明は、同じＮＰにおいて異なるプローブの複数のコピーを使用してもよい（図１Ｃ）。ＮＰの機能化を行う時に、図１Ｃに示されるＮＰは、単一の配列ではなくＤＮＡプローブの混合物を使用して作製することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、これによりＮＰにプローブのランダムな分布が生じ、親和性の最も高いＮＰ－プローブが親和性のより低いＮＰ－プローブよりも優先的に結合するように選択されるため、より高い感度を提供すると考えている。ＮＰ－プローブの異なる集団は、本明細書の特定の文脈で「バッチ」とも記載される。

本発明は、プラットフォーム技術を提供する。本発明は、複数の分析物に対する用途を見出している。好ましい実施形態において、本発明は、ヒト、動物、食物又は環境中のウイルス又は細菌などの病原体からの核酸の検出に使用するためのものであってもよい。本発明は、臨床的に得られたサンプルからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの迅速かつシンプルで経済的な検出に使用することができる。

「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」
コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）は、コロナウイルス亜科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）とトロウイルス亜科（Ｔｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ）の２つの亜科を含むニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）の一部を構成する。コロナウイルス亜科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）のウイルスは、ネガティブ染色された標本で太陽コロナに視覚的に似ていることから名付けられた。コロナウイルスには、アルファ－コロナウイルス、ベータ－コロナウイルス、ガンマ－コロナウイルスの３つの属がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連ウイルス（ＳＡＲＳ）に密接に関連するベータ－コロナウイルスである。

コロナウイルスは、２６～３２ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを持つエンベロープウイルスであり、あらゆるＲＮＡウイルスの中の最大のゲノムを代表しており、そのうちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは２万９９０３個のヌクレオチドのゲノムを持っている（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０４５５１２）。当該ゲノムは核タンパク質（Ｎ）に結合して、ウイルス粒子内で螺旋状のヌクレオキャプシドを形成させる。これらは、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質を含む脂質エンベロープに封入されている。ベータ－コロナウイルスのゲノム構成は、図２に示されるとおりである。

コロナウイルスは、タンパク質翻訳のテンプレートとして直接機能できるプラス鎖ＲＮＡゲノムを含んでいるが、感染サイクルにおいて、連続転写中にゲノム全体のマイナス鎖コピーと、非連続サブゲノム（ｓｇ）マイナス鎖ｍＲＮＡのサブセットの両方を生成する。これらのｓｇｍＲＮＡは、ネストされたｓｇｍＲＮＡ断片の生成につながる転写プロセスの一時停止又はプロセスの終了のいずれかを引き起こす転写調節配列（ＴＲＳ）の存在によって生成される。ｓｇｍＲＮＡの転写はコロナウイルスゲノムの３’（マイナス鎖の５’）末端で開始されるため、Ｅ、Ｍ、Ｎタンパク質を含む３’遺伝子の方が、ＯＲＦ１、Ｓなどの５’遺伝子よりも確率的に多量に存在する。実際には、プラス鎖ゲノムＲＮＡゲノムと比べて、感染細胞にはｓｇｍＲＮＡ転写産物が大幅に増加しており、７０倍の増加が報告されている（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４；４１０８－４１１４）。本発明のＮＰのプローブは、ゲノムのプラス鎖配列及び／又は非重畳ｍＲＮＡ又はｓｇｍＲＮＡ配列を標的とし得ることが、本明細書では明確に考えられることである。

「検出キット」
本発明は、精製された分析物が溶液に添加される検出キットを提供する。溶液１は、第三者による精製溶液である。特定の実施形態において、溶液１は、ＡＲＣＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（イギリス・デアズベリー）のコロナウイルスＲＮＡ抽出研究キットにおいて提供されているものであってもよい。場合によっては、当該キットは、溶液１は、ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｃｉｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２０／０３／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ－Ｖ３－２０２００３２８－１．ｐｄｆにて利用可能な２０２０年３月２８日付のマニュアルに記載されているように、前記コロナウイルスＲＮＡ抽出研究キットの「試薬１（Ｒｅａｇｅｎｔ １）」及び「試薬２ａ（Ｒｅａｇｅｎｔ ２ａ）」の２つの試薬を含んでもよい。「溶液２」は、本発明のナノ粒子及び検出用の溶媒／バッファーを含む。別の実施形態において、本発明は、検出表面へのＮＰ－プローブの固定化によるラテラルフロー測定の形態であってもよい。

「ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫ」
ＳａｌｉｖａＤｉｒｅｃｔ（商標）法を利用し、即ちＳＤＳ／プロテイナーゼＫを添加する場合に、別のＲＮＡ抽出ステップが不要になり、標的分析物に対するワンステップ検出法が可能となる（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｓａｌｉｖａｄｉｒｅｃｔ／）。検査前にＳＤＳ及びプロテイナーゼＫの両方を除去する必要があるＰＣＲと異なっており、ＳＤＳはよく知られているＮＰ安定剤である。ＰＣＲは、酵素の存在を必要とするため、プロテイナーゼＫの除去が必要となる。有利なことに、当システムにはタンパク質が存在しないため、プロテイナーゼＫを除去する必要はない。ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ法の利用のもう１つの利点は、ＳＤＳはウイルスを不活性化し、ウイルスを完全に破壊するのに濃度０．５％のＳＤＳが十分だということである。

サブチリシンＡ、メタロプロテアーゼなどの他のセリンエンドペプチダーゼと混合し得る他の酵素は、プロテイナーゼＫの代替として使用することができる。

「ナノ粒子」
検出キットにおいて使用されるナノ粒子は、金を含むことが好ましいが、銀又は任意の他の金属でもよい。ＮＰはダイヤモンドをさらに含んでもよい。ＮＰは、中空でもよいし中実でもよい。ＮＰは、球状であることが好ましいが、星、棒又は他の形状など非球状であってもよい。非球状のＮＰは、ナノウニ（Ｓｉｇｍａ）であってもよい。場合によっては、ＮＰの直径は、５～２００ｎｍであってもよく、２０～１００ｎｍであることが好ましく、３０～７０ｎｍであることがより好ましく、例えば、直径は約５０ｎｍである。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、２５ｎｍの平均直径を有するなどより小さいナノ粒子は溶液中でより安定的であり、約６５ｎｍの平均直径を有するなどより大きいナノ粒子は測定の感度を高める可能性があると考えている。ＮＰは、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ法、種結晶成長法、又は当業者によく知られる他の適切な方法を用いて作製することができる。ナノダイヤモンドの使用は、本明細書では明確に考えられる。特に、蛍光ナノダイヤモンドの使用が本明細書で考えられる（参考文献８）。ナノダイヤモンドは、ダイヤモンドカーボンのコアと部分的にグラファイト系である表面シェルを持つ炭素系ナノ粒子である（参考文献９）。これらのサイズの範囲は、１～１００ｎｍである。ＤＮＡなどの生体分子によるダイヤモンド膜の表面修飾が既に説明されている（参考文献１０）。

「プローブ」
検出キットにおいて使用されるプローブは、ＤＮＡ、又はＰＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｈ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆなどの修飾核酸から作製することができる。当該プローブは、例えば、チオールリンカーを介して、ナノ粒子の表面に共有結合してもよい。場合によっては、プローブは、Ｃ６－チオールの５’結合を介して付着されてもよいが、３’又は内部のものでもよい。プローブは、チオール結合を介して付着され、非特異的な凝集を最小に抑えるためにＰＥＧ又は類似するスペーサー分子を含んでもよい。場合によっては、プローブは、鎖長が１０～５０原子のスペーサーを介してナノ粒子に結合されてもよい。例えば、Ｃ１８スペーサーである。スペーサーは、チオールリンカーに加えて使用されてもよい。例えば、プローブは、Ｃ６－チオールリンカー及びＣ１８スペーサーを介してナノ粒子の表面に結合されてもよい。

プローブ配列は、長さが１２～３０個のヌクレオチドの間で変動してもよいが、２０－ｍｅｒであることが好ましい。プローブ配列は、中又は高ストリンジェンシー条件下で標的配列にハイブリダイズすることができる。場合によっては、塩濃度は、１００～５００μＭであってもよく、例えば、１００～５００μＭのＮａＣｌである。特定の実施形態において、塩濃度は、１５０μＭのＮａＣｌであってもよい。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションが可能な温度は、２５～３０℃の範囲にあってもよい。プローブ配列は標的配列に相補的であることが好ましい。しかしながら、本明細書に示されるように、ハイブリダイゼーションは、標的－プローブ配列が１つ、２つ又は３つのミスマッチなど、１個又は複数の塩基のミスマッチを示している時でも、標的分析物の検出を可能にするのに十分に強力な場合がある。非特異的な標的、自己相補性、Ｔｍ値及び標的の進化的な保存についてプローブ配列をスクリーニングする。例えば、コロナウイルス又は類似するものである場合に、それらは、病原体のゲノム配列、サブゲノム断片又はｍＲＮＡを標的にすることができる。

標的核酸分析物は、少なくとも第１、第２及び第３の非重畳標的配列を含み、それらの標的配列は異なり、離間したもの又は連続的ものであってもよい。したがって、本発明の少なくとも第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブ配列は異なる。

ナノ粒子－プローブは、ＮＰ＠ＤＮＡとも呼ばれる。ナノ粒子が金コアを有するナノ粒子－プローブは、Ａｕ＠ＤＮＡとも呼ばれる。

「ナノ粒子－プローブ間の間隔」
標的分析物に結合する時の隣接するナノ粒子の間の間隔は、５～３０ｎｍであってもよい。標的分析物に結合する時の隣接するナノ粒子の間の間隔は、１３～１８ｎｍであってもよい。隣接するナノ粒子間の間隔は、電子顕微鏡によって測定することができる。任意に又はさらに、隣接するナノ粒子の間の間隔は、標的配列の長さ及び標的配列間の距離に基づいて理論的に決定してもよい。ヌクレオチドの平均長さは０．６ｎｍであるため、２０－ｍｅｒの標的配列に対して、ＮＰ間の理論的な距離は１２ｎｍになる。この距離は、例えば、プローブ配列の結合位置を変化させるか、又はプローブの長さを物理的に延長することにより調整することができる。

「サンプル」
サンプルは、あらゆる生物学的液体又は組織サンプル及び／又は環境サンプルを含んでもよい。特定の実施形態において、当該サンプルは、唾液又は鼻咽頭サンプルであってもよい。当該サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体からであってもよい。サンプルは、唾液サンプルに入っている、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体からのＲＮＡであってもよい。サンプルは、細胞培養物から取得してもよい。例えば、サンプルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞を使用して確立された細胞培養物から取得してもよい。

（実施例）
実施例１：金ナノ粒子の合成と機能化
種結晶成長法を用いて金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を合成した。種結晶成長プロセスは、金属前駆体の周期的な添加と粒子の抽出を含む。典型的なプロセスにおいて、種結晶溶液を９０℃に冷却し、次にＨＡｕＣｌ_４溶液（２５ｍＭ）を添加し、続いて３０分後、２回目に添加する。さらに３０分後、成長溶液を抽出し、クエン酸ナトリウム溶液（６０ｍＭ）を添加する。当該プロセスを繰り返すことにより、最終的なＡｕＮＰのサイズを増加させる。

Ｈｕｒｓｔらの方法に従って、チオール化オリゴヌクレオチドプライマー（例示的なオリゴヌクレオチドプローブ配列「プライマー」については実施例２を参照する）でＡｕＮＰを機能化する。簡単に言えば、コロイドＡｕＮＰを含むＳＤＳ（０．１％）及びＰＢ（０．０１Ｍ）を３．６μＭのオリゴヌクレオチド溶液に添加する。オリゴヌクレオチドとＡｕＮＰの混合物を室温で２０分間インキュベートし、オリゴヌクレオチドの結合を改善するために、塩熟成プロセスを実施する。ＮａＣｌ（２Ｍ）、ＳＤＳ（０．０１％）、ＰＢ（０．０１Ｍ）を含む溶液をこの順に混合物に添加して、最終のＮａＣｌ濃度を０．２Ｍにする。各塩熟成ステップは、超音波処理（１０秒）及びインキュベーション（２０分）と交互に行い、続いて１２時間インキュベーションする。過剰なオリゴヌクレオチドを除去するために、溶液を３回遠心分離し、そのたびにＳＤＳ（１ｍＬ、０．０１％）に再分散させる。

最新の操作マニュアル（Ｍｉｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００６，Ｖｏｌ．７，ｐｐ８３１３－８３１８を参照により本明細書に組み込む）に従って、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で、クエン酸で安定化したＡｕＮＰを機能化した。ＤＮＡで安定化したＡｕＮＰは、陰イオン界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．０１ｗｔ％含む水溶液においてコロイド安定性を示しており、これは紫外－可視分光法で確認している。ＤＮＡ結合後、全てのサンプルにおけるプラズモンバンドの赤方偏移－３は、ナノ粒子の表面の周りに分子シェルが形成されていることを示唆している。ＴＥＭ分析は、厚さが１．４ｎｍ以下の分子シェルの形成を確認している。

実施例２：特異的な分析物に応答する比色変化
凝集プロセスは、分析物への結合時に特異的なプローブを含むコロイドナノ粒子の色の変化をもたらす（図３）。場合によっては、色の変化は数時間又は数十分又は数分にわたって発生することがある。最適化した特定の状況において、色の変化は１０～２０分以内で発生する。しかしながら、より長い時間も考えられる。

実施例３：ＤＮＡ分析物を使用する時の結合特異度
ナノ粒子ベースのプローブシステムは、単一のヌクレオチドだけが変わっても、ＤＮＡ分析物を区別するために利用できることを本発明者らは実証した。図４は、野生型ＢＲＡＦ配列と比べて、設計された変異ＢＲＡＦプローブは変異ＢＲＡＦ遺伝子配列に優先的に結合することを示している。これは、設計されたプローブが対象となる変異配列に特異的に結合できることを示している。

実施例４：ＮＰのサイズに応じる感度
検出の特異度は、システムで使用されるナノ粒子のサイズに従って増加する（図５）。

実施例５：分析物のサイズに応じる感度
分析物の標的長さを比較して分かるように、標的長さが長いほど、より短い長さと比べて効率的で結合速度論が速い（データは示されていない）。

実施例６：異なる核酸プローブ化学物質のｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ分析物を検出する能力の比較
直径２５ｎｍ又は５０ｎｍのナノ粒子に付着した３つの異なる核酸化学物質（即ち、未修飾ＤＮＡ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ）に対して、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ分析物を検出する能力について比較した（図６）。

２’－Ｆ修飾は、ｓｓＤＮＡ検出の感度を改善しており、特に小さなＮＰの場合はそうである。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、２’－ＯＭｅ修飾の方がｄｓＤＮＡの検出に有益で、２’－Ｆ修飾の方がｓｓＤＮＡの検出に有益であると推定している。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）による金ナノ粒子の機能化も試みたが、ペプチド鎖に沿った電荷が不足しているため、この修飾オリゴヌクレオチドを用いて溶液中の粒子を安定化させることができなかった。

実施例７：ＮＰ凝集体の温度に従う安定性
形成させた凝集体が温度に対してどれだけ安定しているかを確認するために、３つの異なる実験を実施した。図７Ａ～図７Ｃの結果は、形成させた凝集体が、レーザー照射（６００ｎｍ）の有無にかかわらず、室温又は高温（３７℃）で少なくとも１時間安定していたことを示している。

実施例８：複数の分析物に対する検出システムの適応性
ＥＧＦＲ及びＢＲＣＡ１遺伝子に自然に発生する変異を含む単一のヌクレオチドのミスマッチを含む多くの異なる分析物において検出システムをテストした。図８は、２つの異なる標的の間でマッチとミスマッチ結合の反応速度論に明らかな違いがあるものの、両方の遺伝子とも当該検出技術に基づいて区別できることを示している。

実施例９：ＲＮＡ分析物の検出
２３ｎｔ及び７０ｎｔのＲＮＡ分析物の組み合わせを利用し、２’－Ｆ修飾核酸配列を使用してナノ粒子－プローブの能力をテストした。

最初の実験では、２３ｎｔのＲＮＡ分析物及び５０ｎｍのナノ粒子を使用した（表１を参照する）。単一の塩基のミスマッチする分析物を用いて、約１５以内で迅速な視覚的な色の違いが観察された（データは示されていない）。

同じ実験を繰り返し、今度はより小さなナノ粒子サイズ（２５ｎｍ）及び７０ｎｔのＲＮＡ分析物を使用した（表２を参照する）。このプロセスは最初の実験より遅かったが、分析物の存在下で光学的な色に明らかな違いがあった（データは示されていない）。

実施例１０：標的の選択とプライマーの設計
本明細書で提供されている実験的証拠に基づいて、Ｅタンパク質遺伝子を標的とする連続的かつ重畳しないプライマーを設計した。他の遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質遺伝子）の他の非保存配列もこの目的で使用できることが、本明細書で明確に考えられる。他の核酸の検出に使用するためのプライマーを設計する場合、例えば、別の病原体の核酸の検出のためのプライマーを設計する場合に、本明細書で開示されているプライマー設計の基準を適用することができる。

Ｅ遺伝子を最初の標的として選択する理由は、次のとおりであった。

１．コロナウイルスファミリーのメンバーの間では非保存的である。即ち、特異的である。また、密接に関連するウイルス配列と交差反応する可能性が低い。

２．それはゲノムの３’末端に位置するため、ｓｇｍＲＮＡの形態で非常に豊富である可能性がある。

３．技術は異なるが、比較ｑＲＴ－ＰＣＲの研究により、Ｅ遺伝子の検出は他の遺伝子よりも高い感度が得られることが分かった（Ｃｏｒｍａｎら）。

４．Ｅ遺伝子は小さい（２２８ｎｔ）ため、実験にウイルス由来の又はＤＮＡ分析物を使用しなくても、技術の最適化のために合成ＲＮＡゲノムプラス鎖及び相補的なマイナス鎖ｓｇｍＲＮＡを作製することが実用的である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の配列を標的にしてもよいということが、本明細書では明確に考えられる。例えば、上記の理由１と２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子に適している。

Ｅ遺伝子配列をカバーする連続的な２０－ｍｅｒ配列であることに基づいて、原理証明実験のための最初のプライマーを選択した。プライマーは次の特性を有することが望ましい。

１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに特異度があり、想定される適応症に対して潜在的な汚染物質になる可能性が低い場合、特定の交差反応性が許容できる。例えば、コウモリＳＡＲＳ又は植物由来の配列との交差反応性は許容される。

２．検査で偽陽性を示す生じる可能性のある他のプローブ配列と有意な相補性がない。

３．融解温度（ＴＭ）として理想的に５５～６８℃であるが、他の温度でもよい。

表３は、本発明者らによって設計された標的配列及び捕捉プローブを特徴付けている。２３５ｎｔウイルス配列と１０８ｎｔサブゲノムＥ遺伝子配列である２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的配列を選択した。３群の捕捉プローブを設計した。Ｅ１～Ｅ５は、２３５ｎｔウイルス配列の一方の末端に相補的である。Ｅ１２～Ｅ１６は、２３５ｎｔウイルス配列のもう一方の末端に相補的である。Ｅ７～Ｅ１１及びＥ１７は、１０８ｎｔサブゲノムＥ遺伝子配列に相補的である。表４は、これらの捕捉プローブのオリゴヌクレオチド配列を提供している。

全てのプライマーは、ｉ）ＮＰへの付着のための５’－チオール修飾及びＣ６スペーサーと、ｉｉ）相補的な２０－ｍｅｒ配列の上流の１０（ｔ）５’尾部を有する。

プライマーＥ＃１～６及びＥ＃１２～１７の少なくとも一部は連続的であり、且つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のＥ遺伝子のプラス鎖ＲＮＡ配列（参照配列ＮＣ＿０４５５１２．２）に逆相補的である。

プライマーＥ＃Ｒ７～Ｒ１１及びＥ１７は、Ｅ遺伝子のマイナス鎖ｓｇｍＲＮＡを標的とする。

実施例１１：捕捉プローブの二次構造分析
表３に記載されている各捕捉プローブの二次構造をシミュレートし、これらの二次構造３の自由エネルギーを計算した。ほぼ全ての捕捉プローブが２５℃で安定的な二次構造を形成することが観察された。

Ｅ４は、２５℃で安定的な二次構造を形成しなかった。「塩熟成」法により捕捉プローブＥ４を用いてナノ粒子の表面を機能化することにより、これらのナノ粒子のコロイド安定性が制限された。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、Ｅ４の二次構造がナノ粒子の表面へのその効率的な吸着を妨げると推定した。したがって、本発明者らは、捕捉プローブの配列、とりわけ安定的な二次構造を形成できるかどうかが、ナノ粒子－プローブの安定性にとって重要であると推定している。これらのナノ粒子を０．０１％ＳＤＳに再分散させることで、ナノ粒子の安定性は完全に回復した。

実施例１２：標的配列の二次構造分析
ウイルスの２３５ｎｔ及びサブゲノムの１０８ｎｔ標的配列の二次構造をシミュレートした。各標的配列は、２５℃、１Ｍ ＮａＣｌにおいて比較的低エネルギーの構造を形成できることが観察された。ウイルスの２３５ｎｔ二次構造の自由エネルギーは－７７．１７ｋｃａｌ／ｍｏｌであったが、サブゲノムの１０８ｎｔ二次構造の自由エネルギーは－２５．７８ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。

実施例１３：２３５ｎｔと１０８ｎｔ及び捕捉プローブを含むハイブリッドの二次構造のシミュレーション
捕捉配列と標的配列間の結合に関してより詳細な情報を得るために、２５℃で最も可能性の高い二次構造をシミュレートした。２３５ｎｔウイルス配列とＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４又はＥ５捕捉プローブのハイブリッドの二次構造をシミュレートした。全てのハイブリッドのエネルギーは同等で、－１０５．５９～－１００．４１ｋｃａｌ／ｍｏｌと変化していた。

２３５ｎｔウイルス配列とＥ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５又はＥ１６捕捉プローブのハイブリッドについて、同様の二次構造が観察された。自由エネルギーは、－１１０．４６～－９５．２８ｋｃａｌ／ｍｏｌと少し大きく変化していた。Ｅ１－Ｅ５と比べると、Ｅ１２～Ｅ１６は、２３５ｎｔウイルス配列の反対側の末端に結合する。

１０８ｎｔサブゲノム配列は捕捉プローブＥ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０及びＥ１１と安定的なハイブリッドを形成することも観察された。自由エネルギーは、－６７．１２～－４６．７８ｋｃａｌ／ｍｏｌと変化していた。

実施例１４：１０８ｎｔサブゲノム配列の検出
１０８ｎｔサブゲノム配列の検出を評価するために、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのＮＰ＠ＤＮＡバッチを用いて測定組成物をテストし、各バッチは異なるＮＰ＠ＤＮＡ集団を含む。各測定の粒子総数は一定にした（Ａｕ^０のモル濃度は１５０μＭと表記する）。各測定組成物に対して、１００００ｐＭ、１０００ｐＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、０．１ｐＭの濃度の標的配列を使用した。混合物を４８時間インキュベートした。

図９Ａは、５つ、４つ、３つ、２つ、１つのＮＰの測定に対して、異なる標的濃度における溶液のＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルを示す。１つ、２つのＮＰを含むバッチに対して、スペクトルは標的濃度の全範囲にわたって変化しないままであることが観察された。逆に、３つ、４つ、５つのバッチを含む測定では、ＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルの急激な変化が観察された。これは、４つ、５つのバッチを含むサンプルでは特に顕著であった。

スペクトルデータのより詳細な分析は、１つ、２つのバッチを含む混合物が標的濃度の全範囲にわたって安定したままであり、３つ、４つ、５つのバッチを含む混合物だけが１００ｐＭ以上で凝集が起きていることを示した（図９Ｂ）。また、目視でスペクトルデータを確認したところ、標的濃度が低いほど、サンプルの色強度は低いことが分かった。１つと２つのバッチでは、色の変化は見られなかった（データは示されていない）。３つ、４つ、５つのバッチでは色の変化が見られ、４つ、５つのバッチは３つのバッチより効果が顕著であった。

この実験では、ナノ粒子の総濃度を１５０μＭに固定していた。したがって、使用するバッチの数から、各集団の濃度を計算できる。例えば、２つのバッチの場合、各集団の濃度は７５μＭであった。３つのバッチの場合、各集団の濃度は５０μＭであった。

測定性能を改善できるかどうかを確認するために、１つのパラメータだけを変更して実施例１４の実験を繰り返した。ナノ粒子の総濃度は１００μＭに設定した（図１０Ａ、図１０Ｂ）。以前の実験と同様に、１つ又は２つのバッチを含むサンプルのプラズモンバンドは、分析物濃度の変化に対して変化しない不変のままであった（図１０Ａ）。しかし、３つ、４つ、５つのバッチでは、光学特性は分析物濃度の増加に伴って変化した。

これらのデータは、ナノ粒子の総濃度（又はナノ粒子と標的のモル比）を下げることで、５つのバッチのシステムの検出限界を１００ｐＭまで改善できることも示している（図１０Ｂ）。したがって、分析物に対してプローブの濃度を変化させることにより、システムの感度を高めることができる。

実施例１５：異なる総数の粒子を用いる測定による１０８ｎｔサブゲノム配列の検出
１０８ｎｔサブゲノム配列の検出を評価するために、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのＮＰ＠ＤＮＡバッチを用いて測定組成物をテストし、各バッチは異なるＮＰ＠ＤＮＡ集団を含む。各測定における粒子の総数（Ａｕ^０のモル濃度として表記する）は、１５０μＭ（図１１）、１００μＭ（図１２）、又は５０μＭ（図１３）に固定していた。各測定組成物に対して、１００００ｐＭ、１０００ｐＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭの濃度の標的配列を使用した。各サンプルには、４８時間のインキュベーション時間が保たれた。

図１１Ａ～図１１Ｅは、それぞれ、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのバッチの測定に対して、異なる標的濃度における溶液のＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルを示す。本発明者らは、１つのタイプ、２つのタイプのナノ粒子を含むバッチ（図１１Ａ、図１１Ｂ）に対して、スペクトルは標的濃度の全範囲にわたって変化しないままであることを観察した。逆に、３つ、４つ、５つのバッチを含む測定（図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）では、ＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲスペクトルの急激な変化が観察された。これは、４つ、５つのバッチを含むサンプルでは特に顕著であった。

また、目視でスペクトルデータを確認した（図１１Ｆ）。スペクトルデータのより詳細な分析は、１つ、２つのバッチを含む混合物が標的濃度の全範囲にわたって安定したままであり、３つ、４つ、５つのバッチを含む混合物だけが１ｎＭの標的濃度で凝集が起きていることを示した。図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉは、異なる数のナノ粒子のバッチに対して、標的濃度に対する凝集度、吸光度、プラズモンバンドシフトの変化をそれぞれ示す。５つのＮＰ（１５０μＭ）のバッチでは、１０ｎＭ、１ｎＭの標的濃度が検出された。３つ、４つのＮＰのバッチでは、１ｎＭの標的濃度が検出された。より高い標的濃度（１０ｎＭ）では、ＮＰは安定したままでしあった。

この実験では、ナノ粒子の総濃度を１５０μＭに固定していた。したがって、使用するバッチの数から、各集団の濃度を計算できる。例えば、２つのバッチの場合、各集団の濃度は７５μＭであった。３つのバッチの場合、各集団の濃度は５０μＭであった。

測定性能を改善できるかどうかを確認するために、１つのパラメータだけを変更して上記の実験を繰り返した。ナノ粒子の総濃度は１００μＭに設定した（図１２）。２つ以上のバッチを含むサンプルの場合に、ナノ粒子の凝集は１ｎＭの標的でより顕著である。同様に、標的の量が多い場合（１０ｎＭ）、粒子は安定したままであり、凝集の欠如により不利な結果をもたらす。これは、標的分子が各ナノ粒子の表面を飽和させるためである。

ナノ粒子の総濃度を５０μＭに下げて上記の実験を繰り返した（図１３）。このナノ粒子の濃度は準最適であることが観察され、２つ以上のバッチのナノ粒子を使用する実験では目に見える違いが観察されなかったためである。

標的のさらに高い量を検出できないことは、標的分子による各ナノ粒子の飽和、さらには凝集の阻害に関係している。一般に、コロイド測定が適切に機能することは、標的とナノ粒子のモル比に依存している。比値が低い場合には、粒子のごく一部が凝集するが、ナノ粒子の殆どは分散したままであるため、色の変化が起きない。比値が高い場合には、標的分子はナノ粒子の表面を飽和させるため、同様に凝集を引き起こさない。表４は、標的とナノ粒子のモル比の値を提供している。

実施例１６：超音波処理を用いる分析物の断片化による２３５ｎｔウイルス配列の検出
２３５ｎｔ標的配列を検出するために、２つの異なる捕捉プローブセットを用いた。標的配列の５’末端から中間までの捕捉プローブＥ１～Ｅ５と、標的配列の３’末端の中間からの捕捉プローブＥ１２～Ｅ１６である。２３５ｎｔ配列の断片化を誘導するために、ＮＰ（１５０μＭ）、標的配列２３５ｎｔ（１ｎＭ）、ＮａＣｌ ０．３Ｍを含む溶液を、超音波浴（１２００Ｗ）に３０秒、６０秒、１５０秒入れていた。続いて、サンプルを４８時間インキュベートした。Ｅ１～Ｅ５の結果を図１４Ａ、１４Ｂに、Ｅ１２～Ｅ１６の結果を図１４Ｃにそれぞれ示す。

これらのデータは、１つ、２つのバッチの金ナノ粒子を含むシステムは、超音波処理時間に関係なく不変のままであることを示唆している。４つ、５つのバッチを含むシステムでは、超音波処理の効果がより顕著である。興味深いことに、捕捉プローブと標的配列のハイブリダイゼーション断片は、このタイプの検出方式にとって重要なようである。超音波処理は捕捉プローブＥ１～Ｅ５によって安定化されたＮＰの凝集を誘導するが、Ｅ１２～Ｅ１６によって安定化されたＮＰを使用すると、安定性に影響がない（図１４Ｃ）。

これらの実験は、０秒、６０秒、３００秒の超音波処理時間で繰り返すことができることが、本明細書では明確に考えられる。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、超音波処理を延長させると標的配列の断片化を引き起こし、凝集が起こらないと推定している。

これらの実験は、標的分析物の長さがプラズモン共鳴にとって重要であることを示唆しており、１０８ｎｔのサブゲノム標的分析物では色の変化が示されていたが、２３５ｎｔのウイルス標的分析物では示されなかったためである。本発明者らは、超音波処理を用いて、２３５ｎｔのウイルス標的分析物を分解させた。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２９ｋｂを超える）のゲノムＲＮＡなどの長い分析物には、断片化ステップ（例えば、超音波処理又は他の適切なプロセスによる）が必要であるかもしれないことが、本明細書では明確に考えられる。超音波処理の有効性は配列特異的であるかもしれないことが、本明細書では明確に考えられる。例えば、本発明者らは、Ｅ１～Ｅ５は超音波処理に感受性があったが、Ｅ１２～Ｅ１６はそうではなかったことを見出した。超音波処理の効果は、４つ以上又は５つ以上のＮＰのバッチでは向上していたが、３つのＮＰを使用する場合に殆ど差がなかった。

実施例１７：２３５ｎｔ配列の検出
２３５ｎｔの標的配列を検出するために、２つの異なる捕捉プローブセットを用いた。配列の５’末端から中間までの捕捉プローブＥ１～Ｅ５と、３’末端の中間からの捕捉プローブＥ１２～Ｅ１６である。ＮＰ（１５０μＭ）、標的配列２３５ｎｔ（１ｎＭ）、ＮａＣｌ ０．３Ｍを含むサンプルを４８時間インキュベートした（図１５Ａ～図１５Ｃ）。これらのデータは、１つ、２つのバッチの金ナノ粒子を含むシステムは不変のままであることを示唆した。４つ、５つのバッチを含むシステムでは、凝集がより顕著であった。興味深いことに、捕捉プローブと標的配列のハイブリダイゼーション断片は、このタイプの検出方式にとって重要なようである。捕捉プローブＥ１～Ｅ５によって安定化されたＮＰでは凝集が起こるが、Ｅ１２～Ｅ１６によって安定化されたＮＰでは効果が観察された（図１５Ｄ～図１５Ｆ）。

図１５Ｄ、図１５Ｅは、捕捉プローブＥ１～Ｅ５について、２つを超えるナノ粒子を含む測定では凝集が起こることを示している。逆に、捕捉プローブＥ１２～Ｅ１６については、粒子数の増加に伴う凝集がない。

実施例１８：ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルと凝集に対する異なるバッチ数の影響
このタイプの凝集測定で使用する粒子数の重要性を実証するために、ｉ）２つのＮＰの異なる組み合わせ（図１６Ａ）、ｉｉ）３つ、４つ又は５つの粒子（図１６Ｂ）を使用して測定を実施した。

図１６Ａは、２つのバッチのＮＰを使用した測定のＵＶ－Ｖｉｓスペクトル及び凝集度を示している。２３５ｎｔウイルス分析物の異なる位置に結合するナノ粒子の集団の４つの異なる組み合わせを使用した。図１６Ｂは、２つ、３つ、４つ又は５つのナノ粒子の集団を使用した測定のＵＶ－Ｖｉｓスペクトル及び凝集度を示す。これらの測定で用いる条件は、標的配列２３５ｎｔ １ｎＭ、［Ａｕ］１５０μＭ、ＮａＣｌ ０．３Ｍであった。

これらの結果は、使用するプローブ配列の組み合わせに関わらず、２つのプローブの集団だけを使用する場合に、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルは変化しないことを示している。４つ又は５つのプローブの集団を使用する場合に、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル及び凝集度は明らかな変化を示した。

実施例１９：融解温度に対するミスマッチの影響
捕捉プローブ配列Ｅ１～５、Ｅ７～１１（データは示されていない）及びＥ１２～１６に対して、それらの標的分析物の配列における１、２又は３ｎｔの変化及び変化の位置から、融解曲線を計算した。これらの実験の結果を表５に示し、Ｅ１～Ｅ５については図１７Ａに、Ｅ１２～Ｅ１６については図１７Ｂにそれぞれ示す。

１又は２ｎｔの変化では、結合親和性はほぼ変化がなかった。捕捉プローブの２０－ｍｅｒ配列の１５％を占める３ｎｔの変化は、許容度が低かった。３ｎｔの変化は標的分析物における捕捉プローブ配列の中間に相補的な位置で発生した場合に、許容度が低かった。

実施例２０：非球状のナノ粒子を用いる合成Ｅ遺伝子分析物の検出
非球状のナノ粒子を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ遺伝子の検出を改善できるかどうかを決定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のサブゲノムＥ遺伝子に相補的な３つの単独なＤＮＡプローブ（Ｅ９～Ｅ１１）を用いて、非球状の５０ｎｍ Ａｕナノウニ（Ｓｉｇｍａ）（図１８Ａ、図１８Ｂ）、又は球状の３０ｎｍ ＡｕＮＰ（ＮａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ）（図１９Ａ、図１９Ｂ）を機能化し、結果を比較した。標的分析物、即ちＥ遺伝子の３’側半分（長さが１２０ｎｔのサブゲノムＲＮＡ配列）を１ウェルあたり１０ｎＭの濃度で添加した。対照ウェルは、ＡｕＮＰ－プローブに非相補的な長さが１０８ｎｔのＲＮＡ配列を１ウェル当たり１０ｎＭの濃度で含んでいた。２分後に目視で色の変化を検出し、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルで確認した。

図１８は、ナノウニが標的分析物を特異的かつ迅速に検出できることを示しており、標的分析物を添加してから２分後のピンク色から青／透明への明確な色の変化が示されており（図１８Ａ）、明確なスペクトルシフトに対応する（図１８Ｂ）。

ナノウニを使用して観察された迅速な色の変化とは対照的に、球状のナノ粒子を使用する場合に、色の変化とスペクトルシフトはそれほど顕著ではなかったが、十分であった（図１９）。

これらの結果は、非球状のナノ粒子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ遺伝子の検出を増強できることを示している。

実施例２１：３０ｎｍのナノスフェアを用いる合成Ｎ遺伝子ＲＮＡの検出
７つ（Ｎ１～７）又は６つ（Ｎ８～２０）のプローブの混合物を用いて、３０ｎｍの金ナノスフェア（ＮａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ）を機能化した。標的分析物は、合成的に生成したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全なＮ遺伝子配列（１２６０ｎｔ）であった（図２０）。３０μＬの総量に対して、１００～０．１ｎＭの間の異なる濃度の１μＬを用いた。

この実験の結果は、プローブの混合物で機能化された３０ｎｍのナノスフェアが、長いＲＮＡ配列を、この場合にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子配列を検出できることを示している。この実験は、ナノ粒子を同じナノ粒子上の複数のプローブの混合物で機能化できることも実証しており、これによりナノ粒子はより製造しやすくなるという利点がある。

実施例２２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ゲノム検出
ＡｕＮＰを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ゲノムを検出できるかどうかをテストするために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の細胞培養物（スロバキア科学アカデミー生物医学研究センター・ウイルス学研究所、スロバキア）から完全長のゲノムＲＮＡ（３万ｎｔまで）を取得して標的分析物として使用した。７つ（Ｎ１～７）若しくは６つ（Ｎ８～２０）のプローブの混合物（図２１）、Ｅ遺伝子プローブの混合物（Ｅ７～１７）（図２２）、又はＮ及びＥ遺伝子プローブの混合物（図２３）で、３０ｎｍの金ナノ粒子を機能化した。添加した標的分析物の量は、３０μＬの最終容量中、１０ｎＭ又は１ｎＭが１μＬであった。２５分後及び１２０分後に目に見える色の変化があったかどうかを決定することにより標的分析物の検出をテストし、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトルで確認した。

これらの実験の結果は、ＡｕＮＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長ＲＮＡ配列の検出を可能にすることを明確に示している。さらに、これらの実験は、ウイルスから直接取得したＲＮＡを検出できることを示している。

ＡｕＮＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出することを実証するために、関連するコロナウイルス（ネコ科アルファコロナウイルスＶＲ－９８９）を標的分析物として使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較した（図２４）。Ｅ遺伝子プローブ（Ｅ７～１７）の混合物で３０ｎｍのＡｕＮＰを機能化し、０．０３ｎＭ（総量３０μＬ中１ｎＭが１μＬ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は猫科アルファコロナウイルス株ＶＲ－９８９（ＡＴＣＣから取得）からのゲノムＲＮＡを標的分析物として添加した。水を対照として使用した。

目に見える色の変化から示されるように、機能化されたＡｕＮＰは２５分間のインキュベーション後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できたが（図２４Ａ）、ＶＲ－８９８は１２０分間のインキュベーション後でも色の変化又はスペクトルシフトを引き起こさなかった（図２４Ｂ）。

この実験は、本発明の機能化されたＡｕＮＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的であり、密接に関連するコロナウイルスを検出しないことを実証している。

検出速度を向上させるために、ＡｕＮＰを添加した後に、測定には追加で塩を添加した。ＡｕＮＰには、プローブの異なる混合物として、Ｅ遺伝子であるＥ７～１７（図２５Ａ）及びＥ１～Ｅ６（図２５Ｂ）、Ｎ遺伝子であるＮ１～Ｎ７及びＮ８～Ｎ２０（図２５Ｃ）並びにＮ１３（図２５Ｄ）を共有結合させ、次にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長ＲＮＡ配列又は陰性対照として水を使用して測定した。ＡｕＮＰを添加した後、追加で０．７Ｍ ＮａＣｌを添加し、１．５Ｍの最終濃度にした。追加の塩の添加により、わずか２０分後に、プローブの混合物で機能化されたＡｕＮＰのいずれかを使用して検出することが可能になり（図２５Ａ～図２５Ｄ）、これは吸光度の低下及び明確なスペクトルシフトによって実証された。

結論として、ＡｕＮＰの添加後に追加で塩を添加すると、測定の特異度に影響を与えることなく、その感度を改善している。

実施例２３：検出限界（ＬＯＤ）の改善
検出限界を決定するために、既知の濃度範囲で１０^８のコピー、１０^７のコピー、１０^６のコピー、１０^５のコピーを含む完全長ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡでＡｕＮＰをテストした。プローブＥ７～Ｅ１７で機能化されたＡｕＮＰは、１５分後に１０^７のコピー以上のウイルスにおいて明確な色の変化を生じた（図２６）。Ｅ７～１７サブゲノム（６）、Ｅ１～５ゲノム（５）、Ｎ遺伝子の混合物（１０）、及びリーダー配列プローブ（１７）に対するプローブで機能化したＡｕＮＰは、１５分後に１０^５のコピー以上のウイルスにおいて明確な色の変化を生じた（図２７）。

これらのデータは、ＡｕＮＰは１０^５のコピーという低い濃度でも標的分析物を検出できることを示している。

実施例２４：唾液基質からのタンパク質の除去
これまでの実験は、唾液基質中のタンパク質成分がナノ粒子に非特異的に結合することで、ナノ粒子は標的分析物に結合できなくなることを示した。したがって、基質からタンパク質を除去する方法を検討する必要があった。

プロテイナーゼＫは最良の効果を示した。これは、プロテイナーゼＫ処理とＳＤＳの組み合わせは、ｑＲＴ－ＰＣＲでの使用に備え、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを直接不活化しＲＮＡを抽出することに利用できることを示すエール大学によって提供された情報と一致していた（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｓａｌｉｖａｄｉｒｅｃｔ／）。

ＳＤＳ／プロテイナーゼＫを使用すると、別のＲＮＡ抽出ステップが不要になり、標的分析物のワンステップ検出が可能になる。検査前にＳＤＳ及びプロテイナーゼＫの両方を除去する必要があるＰＣＲと異なっており、ＳＤＳはよく知られているＮＰ安定剤である。ＰＣＲは、酵素の存在を必要とするため、プロテイナーゼＫの除去が必要となる。有利なことに、当システムにはタンパク質が存在しないため、プロテイナーゼＫを除去する必要はない。ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ法の利用のもう１つの利点は、ＳＤＳはウイルスを不活性化し、ウイルスを完全に破壊するのに濃度０．５％のＳＤＳが十分だということである。

当測定で用いるＳＤＳ／プロテイナーゼＫ処理をテストするために、本発明者らは、１０μｇのプロテイナーゼＫと最終濃度０．５％のＳＤＳ（粉末形態）の組み合わせを使用し、唾液を用いて同様の結果を得た。即ち、１５分以内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出した（図２８）。当実験では、Ｅ７～１７のＡｕＮＰ－プローブを用い、６５μＬの最終容量において２６０ｐＭの標的分析物を１μＬ使用した。

唾液に加えた患者由来の鼻咽頭サンプル（ＰＣＲ用に抽出されたＲＮＡ）を用いて、当実験を繰り返し（図２９）、同様の結果が示された。

結論として、これらの実験は、サンプルにＳＤＳとプロテイナーゼＫを添加してタンパク質を除去することで、唾液中のタンパク質成分が測定に干渉するという問題を解決しており、患者由来のサンプルにおけるウイルスＲＮＡの検出が可能になるということを実証している。

実施例２５：個体のサンプルの臨床検査
当測定は臨床サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できるかどうかを決定するために、ギプスコア県のＣＯＶＩＤ－１９テストセンタから、ＰＣＲでＣＯＶＩＤ－１９を検出した１７５件の鼻咽頭臨床サンプルを取得した。これらは、６人の独立な観察者が盲検法で、目視でサンプルを陽性か陰性とマークして検査する例であった（図３０）。統一した見解を認め、Ｍｅｄｃａｌｃを用いて、臨床検査パラメータについて集計結果を計算した（図３０Ｂ）。

本発明は感度が９２．８６％で特異度が９６．１０％であるため、その性能は標準的なＰＣＲ検査とラテラルフロー検査の間にある。ラテラルフロー検査はウイルスに感染し症状が出ている人を７２％、病気になって最初の１週間にある人を７８％検出することができる。しかし、症状のない人では、５８％に低下している（参考文献７）。ＰＣＲ検査よりも利用しやすいが、従来のラテラルフロー検査の１つの主な欠点は感度の低さである。ＰＣＲ検査はより高い感度を提供するが、拡張性が欠如している。本発明の検査の感度は、ラテラルフロー検査をはるかに上回り、ＰＣＲ検査の感度よりわずかに低いだけである。このように本発明は、大量生産が可能で、従来のラテラルフロー検査と比べて改善された感度を有しており、便利で使いやすい検査を有利に提供する。

図３１は、本発明の測定のプロトタイプの例を提供する。当該プロトタイプは、ＡｕＮＰ及びＳＤＳ／プロテイナーゼを含むチューブと、追加で塩を含む蓋部品を含む。使用者は、漏斗状の構造に唾液を入れ、蓋を閉め、追加でチューブに塩を添加して、チューブを振る。発色後に、指示窓から結果が見える。赤から青への色の変化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査が陽性であることを示し、色の変化がないことは検査が陰性であることを示す。

実施例２６：ナノ粒子としてのナノダイヤモンドの使用
本発明の感度をさらに高めるために、本明細書ではナノ粒子としてのナノダイヤモンドの使用が考えられる。ナノダイヤモンドはチオール化オリゴヌクレオチドプローブで機能化し、標的分析物の存在はナノダイヤモンドの凝集を引き起こして、例えば、蛍光など、発光の変化をもたらす。この発光の変化は光学的に検出可能であり、視覚的な指標／変化に変換できる。

「結論」
要するに、本明細書で提供される結果は、１０８ｎｔ及び２３５ｎｔの標的を検出するために混合物中には２つ以上のバッチのＡＵ＠ＤＮＡナノ粒子を必要とすることを示唆している。本発明の方法は、２３５ｎｔの標的配列の検出を可能にする。Ｅ１～Ｅ６は、２３５ｎｔの標的配列に対する最適な検出を示した。さらに、ＡＵ＠ＤＮＡナノ粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長ＲＮＡ配列を特異的に検出できる。結果は、患者サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための測定でＡＵ＠ＤＮＡナノ粒子を使用することで、大量生産が可能で、先行技術による検査と比べて改善された感度を有する、より便利な検査を提供することをさらに示している。

本明細書に引用された全ての参考文献は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が全体として参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指示される場合と同じ程度に、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載された特定の実施形態は、限定ではなく例として提供される。本明細書の見出しは、取り扱いやすさのために含まれているものに過ぎず、本開示を何らかの形で限定するものと解釈されるべきではない。
「参考文献」

1.Liu G,Lu M,Huang X,Li T,Xu D.Application of Gold-Nanoparticle Colorimetric Sensing to Rapid Food Safety Screening.Sensors(Basel).2018;18(12):4166.Published 2018 Nov 27.doi:10.3390/s18124166.
2.Armesto et al.,Chapter 2 of Reverse Genetics of RNA Viruses:Applications and Perspectives(Wiley&Co.2012).
3.Hurst,SJ;Lytton-Jean,AKR;Mirkin,CA.“Maximizing DNA Loading on a Range of Gold Nanoparticle Sizes”.Anal Chem 2006,78(24),8313-8318.https://doi.org/10.1021/ac0613582.
4.Corman VM,Landt O,Kaiser M,Molenkamp R,Meijer A,Chu DKW,et al.,Detection of 2019 novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020;25(3):2000045.https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
5.Hofmann et al J Virol 64;4108-4114.
6.Moitra G,et al.,Selective naked-eye detection of SARS-CoV-2 mediated by N gene targeted antisense oligonucleotide capped plasmonic nanoparticles.ACS Nano 2020;14,6,7617-7627.
7.Dinnes J,Deeks JJ,Berhane S,Taylor M,Adriano A,Davenport C,Dittrich S,Emperador D,Takwoingi Y,Cunningham J,Beese S,Domen J,Dretzke J,Ferrante di Ruffano L,Harris IM,Price MJ,Taylor-Phillips S,Hooft L,Leeflang MMG,McInnes MDF,Spijker R,Van den Bruel A.Rapid,point-of-care antigen and molecular-based tests for diagnosis of SARS-CoV-2 infection.Cochrane Database of Systematic Reviews 2021,Issue 3.Art.No.:CD013705.DOI:10.1002/14651858.CD013705.pub2.
8.Miller,B.S.,Bezinge,L.,Gliddon,H.D.et al.,Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics.Nature 587,588-593(2020).https://doi.org/10.1038/s41586-020-2917-1.
9.Torres Sangiao E,Holban AM,Gestal MC.Applications of Nanodiamonds in the Detection and Therapy of Infectious Diseases.Materials.2019;12(10):1639.https://doi.org/10.3390/ma12101639.
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Claims (53)

1. サンプル中の標的核酸分析物の存在を検出するための方法であって、前記標的核酸分析物は、少なくとも第１、第２及び第３の標的配列を含み、これらの標的配列は、離間した又は連続的かつ重畳せず、
   ａ）オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団を提供することであって、前記集団は、少なくとも、前記第１標的配列にハイブリダイズする第１オリゴヌクレオチドプローブと、前記第２標的配列にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブと、前記第３標的配列にハイブリダイズする第３オリゴヌクレオチドプローブとを含むことと、
   ｂ）前記サンプルを含む溶液を前記ナノ粒子の集団に接触させることであって、前記オリゴヌクレオチドプローブ配列と前記標的配列との間の複数の特異的な結合事象が前記ナノ粒子の凝集を引き起こすことにより、前記溶液は標的核酸分析物に依存する目に見える色の変化を生じることとを含む、方法。
2. 前記ナノ粒子の集団は、少なくとも３つのタイプ、少なくとも４つのタイプ、又は少なくとも５つのタイプのナノ粒子を含み、各タイプのナノ粒子は、１つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーで機能化される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ナノ粒子の集団は、少なくとも３つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの複数のコピーでそれぞれ機能化された複数の異なるタイプのナノ粒子を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ナノ粒子の集団は、標的分析物中の少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は少なくとも２５個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列にハイブリダイズする、少なくとも４つのタイプ、５つのタイプ、６つのタイプ、７つのタイプ、８つのタイプ、９つのタイプ、１０タイプ、１１タイプ、１２タイプ、１３タイプ、１４タイプ、１５タイプ、１６タイプ、１７タイプ、１８タイプ、１９タイプ、２０タイプ、２１タイプ、２２タイプ、２３タイプ、２４タイプ、又は少なくとも２５タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ナノ粒子の集団は、前記標的分析物中の１０個の対応する離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列に結合する１０タイプのオリゴヌクレオチドプローブで機能化される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記オリゴヌクレオチドプローブの１つ又は複数は、それがハイブリダイズする標的配列に完全に相補的であるか又は１個から３個の塩基のミスマッチを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 標的と全ナノ粒子のモル比は、標的特異的なナノ粒子の凝集を可能にするよう選択される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記標的と全ナノ粒子のモル比は、１～０．００１の範囲にある、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記方法は、前記標的核酸分析物を２つ以上の断片に分解する断片化ステップを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記断片化ステップは、サンプルに対する一定時間の超音波処理を含む、請求項９に記載の方法。
11. 超音波処理の時間は、少なくとも１０秒、少なくとも３０秒、又は少なくとも６０秒である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記標的分析物は、ウイルスＲＮＡを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記標的分析物は、ウイルスゲノムＲＮＡ、ウイルスサブゲノムｍＲＮＡ、又はウイルスｍＲＮＡを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥタンパク質又はＮタンパク質のゲノム配列を含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記標的分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ遺伝子又はＮ遺伝子のｓｇｍＲＮＡを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記プローブ配列は、配列番号１、２、３、４、５から選択される、請求項１４に記載の方法。
18. 前記プローブ配列は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５から選択される、請求項１４に記載の方法。
19. 前記プローブ配列は、配列番号６、７、８、９、１０から選択される、請求項１４に記載の方法。
20. 前記ナノ粒子は、金属又はダイヤモンドを含むコアを有する、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記金属を含むコアは、金又は銀を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ナノ粒子は、球状、非球状、楕円体又は両錐体である、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記ナノ粒子は、１３～６５ｎｍの直径を有する、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記ナノ粒子の平均直径は、２０～６０ｎｍであり、任意に、前記ナノ粒子の平均直径は、約３０ｎｍである、請求項１８に記載の方法。
25. 前記プローブは、ＤＮＡ、非天然核酸、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記プローブは、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｈ核酸、２’－ＯＭｅ核酸、又は２’－Ｆ核酸を含む、請求項２５に記載の方法。
27. ナノ粒子－プローブ結合は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端にある、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記プローブは、ナノ粒子の表面へのチオール結合を含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記プローブは、Ｃ６－チオール５’結合を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記プローブ配列は、１０～１００個のヌクレオチドを含み、任意に１２～３０個のヌクレオチドを含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分は、２０個のヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記プローブは、前記プローブ配列の標的配列にハイブリダイズする部分の上流にヌクレオチド尾部を含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記ヌクレオチド尾部は、１０個のヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ヌクレオチド尾部は、ポリＴ配列を含み、任意にＴ_１０配列を含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
35. 前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、５～３０ｎｍである、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１０～１８ｎｍである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記プローブが前記標的分析物の前記標的配列にハイブリダイズされる時の隣接するナノ粒子間の間隔は、１２ｎｍである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記方法は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫを添加するステップをさらに含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
39. ＳＤＳの最終濃度は、少なくとも０．５％である、請求項３８に記載の方法。
40. 前記方法は、追加で塩を添加するステップ（ｃ）をさらに含む、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
41. ４５℃未満で実施される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記方法は、ＲＮＡｓｅの添加を伴わない、請求項４１に記載の方法。
43. 標的核酸分析物中の少なくとも第１、第２及び第３の離間した又は連続的かつ重畳しない標的配列にハイブリダイズする少なくとも第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団。
44. 請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法における請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団の使用。
45. 請求項４３又は請求項４４に記載のオリゴヌクレオチドプローブで機能化されたナノ粒子の集団であって、前記ナノ粒子は、請求項１～４２のいずれか１項において定義されるとおりである、ナノ粒子の集団。
46. サンプル中の標的核酸分析物を検出するためのキットであって、
    請求項４３～４５のいずれか１項において定義されるナノ粒子の集団と、
    溶液を保持するための反応容器であって、少なくとも壁と密閉可能な開口部とを含み、可視光は前記壁の少なくとも一部及び／又は前記密閉可能な開口部を通過できる前記反応容器と、
    請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法を実施するための１つ又は複数の試薬又は溶液とを含む、キット。
47. サンプルから標的核酸を分離するための１つ又は複数の試薬又は溶液をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
48. 前記標的核酸分析物の陽性検出時に予想される色の変化に対応する色基準をさらに含む、請求項４６又は４７に記載のキット。
49. サンプル中の標的核酸分析物の存在を検出するための装置であって、
    サンプルを受け取るための入口と、
    前記サンプルが前記入口から、試薬一式が予め装填された保管室に到達するための通路であって、前記試薬は請求項４３～４５において定義されるナノ粒子の集団を含む前記通路と、
    色基準を含む検出窓とを含み、
    使用時は、前記サンプルが保管室内の試薬に接触することにより、標的核酸分析物の陽性検出は、前記検出窓を通して見える、色基準における予想される色の変化を引き起こす、装置。
50. 前記サンプルは、唾液サンプルである、請求項４９に記載の装置。
51. 蓋部品をさらに含む、請求項４９又は５０に記載の装置。
52. 前記蓋部品はＮａＣｌを含み、前記蓋部品を閉めるとＮａＣｌは前記保管室に添加される、請求項５１に記載の装置。
53. 請求項１～４２において定義される方法における、いずれか１項の請求項に記載の装置の使用。