CN116157540A - 纳米颗粒探针及其在核酸检测中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种使用寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒检测样品中靶向核酸分析物(例如,病原体或病毒核酸)存在情况的方法,其中至少三种不同的寡核苷酸探针与靶向分析物中至少三种不同的靶向序列的杂交引起纳米颗粒的聚集和看得见的颜色变化。本发明还提供了这样的寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群以及和用于检测靶向核酸分析物的相关试剂盒。
Description
本申请要求2020年6月9日提交的EP20382499.0的优先权,其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及靶向核酸的检测,特别是微生物或病毒如幽门螺旋杆菌,SARS-CoV-2或丙肝病毒的核酸的检测。
背景技术
COVID-19
COVID-19是由冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的严重呼吸系统疾病。
成功控制新出现的流行病或世界流行病的关键是识别和隔离有症状或无症状的感染者。随着世界流行病的发展和确立,为了确保社会的持续运转,需要通过开发和随后检测针对疾病的特异性抗体,将已经感染但可能因轻微、混乱或无症状而不知道的个体确定为已产生免疫力的个体。在缺乏有效疫苗或治疗方法的情况下,检验处在感染控制的第一线。
目前存在三种主要类型的SARS-CoV-2检验(抗原、抗体和基因),它们具有非常不同的特性、优点和缺点。抗原检验对病毒的部分(通常是蛋白质)进行检测,是目前最常用的快速检验形式。然而,由于与其他相关蛋白的交叉反应,这些检验往往不如基因检验准确。抗体检验也是对针对病毒的抗体(IgG或IgM)存在情况进行检测的快速检验,并且通常比抗原检验更具特异性,但不能在患者最具传染性时将患者检测出,因为抗体直到感染后10~14天才出现在人体中。病毒检验的黄金标准仍然是检测病毒特异性核酸(RNA)序列的基因检验。目前,市场上所有的基因检验都是基于PCR的。即使对该技术的检测周转时间进行了逐步改进,基于PCR的检验在其可扩展性方面也受到限制,因为它们需要专门的实验室、昂贵的设备、试剂和受过训练的人员。
迫切需要一种可扩展的快速基因检验,无需可随时随地使用的基础设施。本发明解决了这些和其它需求,并提供了如本文所述的相关优点。
检测技术
使用纳米颗粒的比色传感器已经用于检测多种分析物,包括蛋白质和核酸、有机小分子和金属离子。溶液中的球形金纳米颗粒(AuNP)由于其在~520nm处强烈的局部表面等离子体共振而呈现红色。AuNP的聚集诱导电偶极子-偶极子相互作用和相邻颗粒的等离子体之间的耦合,导致颜色从粉红色变为蓝色/紫色或透明,对应于表面等离子体带从523nm向610~670nm移动(图1)。
比色传感器具有许多优点。它们易于使用,通常只涉及单一步骤,不需要受过训练的人员。由于极高的消光系数,它们非常敏感,只需要几个纳米颗粒就能产生可见的颜色变化。此外,既不需要复杂的分析仪器,也不需要昂贵的分析仪器,因为可以用肉眼检测颜色变化。最近,比色测定被用于检测SARS-CoV-2的部分N基因(参考文献6)。
然而,由于灵敏度的限制,当前大多数基于单个或两个探针群的检测体系不容易适应,尽管其针对主要污染物的检测足够灵敏,但针对病原体的检测不够灵敏。需要改进的方法用于检测针对病原体诸如SARS-CoV-2的靶向分析物。本发明解决了这些和其它需求,并提供了如本文所述的相关优点。
发明内容
本发明大体上涉及用于检测样品中靶向核酸的基于纳米颗粒的检测平台。该检测平台基于纳米颗粒依赖于靶向核酸的团聚,其产生看得见的颜色变化。发明人惊奇地发现,仔细选择与靶向核酸中的靶向序列互补的寡核苷酸探针序列使得靶向序列间隔开或者连续且不重叠,为检测平台提供足够的灵敏度和特异度,以快速有效地指示样品中是否存在靶向核酸,甚至在没有复杂分析仪器的情况下,例如在某些情况下通过在数小时或数分钟内提供肉眼看得见的反应溶液的清晰颜色变化。这是对现有技术描述的需要固定的载玻片点样、波导和CMOS传感器的检测平台(诸如WO2005/008222中所描述的检测平台)可喜的改进。此外,Moitra等人2020年描述了一种需要RNA酶处理(并因此在升高的温度下孵育)以产生看得见的颜色变化的方法。
因此,在第一方面,本发明提供了一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的方法,其中靶向核酸分析物包含至少第一靶向序列、第二靶向序列和第三靶向序列,这些靶向序列是间隔开的或者连续且不重叠的,所述方法包含:提供寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群,该群至少包含与第一靶向序列杂交的第一寡核苷酸探针、与第二靶向序列杂交的第二寡核苷酸探针以及与第三靶向序列杂交的第三寡核苷酸探针;以及使包含样品的溶液与纳米颗粒群接触,其中寡核苷酸探针序列与靶向序列之间的多个特异性结合事件引起纳米颗粒团聚,从而导致溶液产生依赖于靶向核酸分析物的看得见的颜色变化。因此,本发明的方法采用检测在“自由浮动”的溶液中接触的纳米颗粒和靶向核酸分析物,而不是如现有技术方法中教导的那样固定在基材上。这大大简化了检测平台的生产和使用,因为简单的管材(例如,由聚丙烯制成的用于制备、混合、离心、运输和存储固体和液体样品以及试剂的一次性管材)可以用于混合纳米颗粒和样品,并且在简单混合或摇动后几分钟或几十分钟内通过肉眼看得见的颜色变化来指示检测结果。
在一些实施方式中,每种类型的纳米颗粒是利用多个拷贝的一种类型的寡核苷酸探针而功能化的。
在一些实施方式中,纳米颗粒群包含多种不同类型的纳米颗粒,每种纳米颗粒是利用多个拷贝的至少三种类型的寡核苷酸探针中的任一种而功能化的。
在一些实施方式中,纳米颗粒群是利用至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95种或至少100种类型的寡核苷酸探针而功能化的,寡核苷酸探针与靶向分析物中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95或至少100种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交。
在某些实施方式中,纳米颗粒群是利用10种类型的寡核苷酸探针而功能化的,该寡核苷酸探针与靶向分析物中的10种相应的间隔开的或者连续且不重叠靶向序列结合。
在一些实施方式中,优选寡核苷酸探针中的一种或多种(例如,全部)与其所杂交的靶向序列完全互补。然而,特别考虑的是,与靶向序列杂交的寡核苷酸探针,例如尽管有一个或多个错配(例如,1、2、3、4或5个碱基错配),也可以在某些实施方式中使用。
在一些实施方式中,将靶向物与总纳米颗粒的摩尔比选择为允许靶向物特异性的纳米颗粒团聚。特别地,靶向物与总纳米颗粒的摩尔比可以在1:1至0.001:1的范围内。在某些实施方式中,该摩尔比可以在0.1至0.001的范围内。在本文中,该比例是特定纳米颗粒-探针类型(“批次”)的浓度与靶向分析物的摩尔比。这将不同于累积探针浓度。因此,例如,在具有10种类型的寡核苷酸探针(10种NP批次)的实施方式中,累积比例可以是10:1的探针:分析物,但是对于每种单独的NP-探针而言摩尔比将是1:1。
在一些实施方式中,该方法包含片段化步骤,在该步骤中将所述靶向核酸分析物断裂成两个或多个片段。在一些情况下,片段化步骤可以包含对样品进行一段时间的超声处理。例如,超声处理可以进行至少10秒、至少30秒或至少60秒。
在一些实施方式中,靶向分析物包含病毒RNA。特别地,靶向分析物可以包含病毒基因组RNA、病毒亚基因组mRNA或病毒mRNA。
在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2 RNA。在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2的E蛋白和/或N蛋白的基因组序列。在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2的E基因和/或N基因的sgmRNA。在一些实施方式中,靶向分析物包括前导E-基因和/或前导N-基因和/或融合序列。
在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:15。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。在一些实施方式中,纳米颗粒具有金属核。特别地,金属核可以包含金或银。
在一些实施方式中,纳米颗粒基本上是球形的。在一些实施方式中,纳米颗粒是非球形的。特别地,非球形纳米颗粒可以是多分支的。例如,多分支的纳米颗粒可以是纳米海胆(nano-urchin)。在一些实施方式中,纳米颗粒可以是椭球或双锥体形态。特别考虑具有不同形态的纳米颗粒的混合物。
在一些实施方式中,纳米颗粒的直径(例如平均直径)为13nm至65nm、20nm至60nm,例如约30nm。
在一些实施方式中,探针包含DNA或非天然核酸。特别地,探针可以包含锁核酸(LNA)、2’-H核酸、2’-OMe核酸、2’-F核酸或肽核酸(PNA)。
在一些实施方式中,纳米颗粒-探针连接位于寡核苷酸探针的5’端。
在一些实施方式中,探针包含C6-巯基连接。在一些实施方式中,探针包含C6-巯基5’连接。
在一些实施方式中,探针序列包含10至100个核苷酸、10至50个核苷酸、任选12至30个核苷酸。在一些实施方式中,探针序列的靶向序列杂交部分包含20个核苷酸。
在一些实施方式中,探针在探针序列的靶向序列杂交部分上游包含核苷酸尾。特别地,核苷酸尾可以包含5至20个核苷酸,例如10个核苷酸。在某些情况下,核苷酸尾是聚胸腺嘧啶(“poly-T”)尾。特别地,核苷酸尾可以包含10个胸腺嘧啶。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为5nm至30nm。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为10nm至18nm。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为12nm。
在一些实施方式中,该方法进一步包含添加额外的盐的步骤。
在一些实施方式中,该方法进一步包含添加十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K的步骤。在一些实施方式中,SDS的终浓度为至少0.5%。
在一些实施方式中,该方法在低于45℃下进行。例如,该方法可在低于40℃、低于35℃、低于25℃或低于20℃下进行。
在一些实施方式中,该方法不涉及添加RNA酶。例如,NP团聚后不添加RNA酶。
在第二方面,本发明提供了寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群,其包含至少第一寡核苷酸探针、第二寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针与靶向核酸分析物中的至少第一间隔开或者连续且不重叠的靶向序列、第二间隔开或者连续且不重叠的靶向序列和第三间隔开或者连续且不重叠的靶向序列杂交。
在一些实施方式中,寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群用于在本发明第一方面的方法中使用。
寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群可以如根据本发明的第一方面那样限定。
在一些实施方式中,每种类型的纳米颗粒是利用多个拷贝的一种类型的寡核苷酸探针而功能化的。
在一些实施方式中,纳米颗粒群包含多种不同类型的纳米颗粒,每种纳米颗粒是利用多个拷贝的至少三种类型的寡核苷酸探针中的任一种而功能化的。
在一些实施方式中,纳米颗粒群是利用至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95种或至少100种类型的寡核苷酸探针而功能化的,寡核苷酸探针与靶向分析物中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、95或至少100种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交。
在某些实施方式中,纳米颗粒群是利用10种类型的寡核苷酸探针而功能化的,该寡核苷酸探针与靶向分析物中的10种相应的间隔开的或者连续且不重叠靶向序列结合。
在一些实施方式中,优选寡核苷酸探针中的一种或多种(例如,全部)与其所杂交的靶向序列完全互补。然而,特别考虑的是,与靶向序列杂交的寡核苷酸探针,例如尽管有单个错配,也可以在某些实施方式中使用。
在一些实施方式中,靶向分析物包含病毒RNA。特别地,靶向分析物可以包含病毒基因组RNA、病毒亚基因组mRNA或病毒mRNA。
在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2 RNA。在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2的E蛋白的基因组序列。在一些实施方式中,靶向分析物包含SARS-CoV-2的E基因的sgmRNA。
在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。在一些实施方式中,探针序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
在一些实施方式中,纳米颗粒具有包含金属或金刚石的核。特别地,该核可以包括金。
在一些实施方式中,纳米颗粒基本上是球形的。
在一些实施方式中,纳米颗粒的直径(例如平均直径)为13nm至65nm、40nm至60nm,例如约50nm。
在一些实施方式中,探针包含DNA或非天然核酸。特别地,探针可以包含锁核酸(LNA)、2'-H核酸、2'-OMe核酸或2'-F核酸。
在一些实施方式中,纳米颗粒-探针连接位于寡核苷酸探针的5’端。
在一些实施方式中,探针包含C6-巯基连接。在一些实施方式中,探针包含C6-巯基5’连接。
在一些实施方式中,探针序列包含10至100个核苷酸、10至50个核苷酸、任选12至30个核苷酸。在一些实施方式中,探针序列的靶向序列杂交部分包含20个核苷酸。
在一些实施方式中,探针在探针序列的靶向序列杂交部分上游包含核苷酸尾。特别地,核苷酸尾可以包含5至20个核苷酸,例如10个核苷酸。在某些情况下,核苷酸尾是聚胸腺嘧啶(“poly-T”)尾。特别地,核苷酸尾可以包含10个胸腺嘧啶。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为5nm至30nm。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为10nm至18nm。
在一些实施方式中,当探针与靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为12nm。
在第三方面,本发明提供了一种用于检测样品中的靶向核酸分析物的试剂盒,该试剂盒包含:本发明第二方面的纳米颗粒群;用于容纳溶液的反应容器,该反应容器至少包含壁部和可密封的开口,其中可见光能够穿过壁部的至少一部分;以及一种或多种用于进行本发明第一方面的方法的试剂或溶液。
在一些实施方式中,试剂盒进一步包含一种或多种用于从样品中分离靶向核酸的试剂或溶液。在一些实施方式中,溶液可以用于从样品中分离和/或提纯靶向核酸。ARCISBiotechnology公司(Daresbury,UK)的冠状病毒RNA提取研究试剂盒中所提供的就是一种这样的示例性溶液。在一些情况下,试剂盒可以包含所述冠状病毒RNA提取研究试剂盒的“试剂1(Reagent 1)”和/或“试剂2a(Reagent 2a)”,如日期为2020年3月28日的操作指南中所描述的,并可在以下URL获得:https://arcisbio.com/wp-content/uploads/2020/03/SARS-CoV-2-Protocols-V3-20200328-1.pdf。在一些实施方式中,试剂盒进一步包含与检测出靶向核酸分析物阳性时预期的颜色变化相对应的颜色基准(例如,色卡)。这可用于帮助使用者识别颜色变化,例如通过将反应容器举到颜色基准的位置。
在第四方面,本发明提供了一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的装置,该装置包含:用于接收样品的进样口,用于使样品经过进样口而到达预先装有一组试剂的储存室的通道,其中试剂包含根据本发明第二方面的纳米颗粒群,以及包含颜色基准的检测窗,其中,在使用中,样品与储存室中的试剂接触,使得对靶向核酸分析物的阳性检测引起通过检测窗看得见的颜色基准中的预期颜色变化。
在一些实施方式中,该装置进一步包含盖构件。特别地,该盖构件可以包含NaCl,使得在关闭盖构件时,NaCl被添加到储存室中。
在一些实施方式中,该装置可以在根据本发明第一方面的方法中使用。
附图说明
图1A是信号放大构思的示意图。图1B是示出使用不同NP-探针群的混合物的示意图,其中每种NP具有多个拷贝的相同探针。图1C是示出在同一NP上使用多个拷贝的不同探针的示意图。图1D是信号放大的示意图。
图2是典型β-冠状病毒的示意图。复制酶基因由ORF 1a和ORF 1b组成,它们位于5′UTR的远侧,并且在基因组的5′端发现前导序列。结构蛋白基因S、E、M以及N位于3′UTR近侧。散布于结构蛋白基因之间的是编码非结构蛋白的辅助基因,它们不是体外复制所必需的。转载自Armesto等人。
冠状病毒感染易感细胞后的复制周期。基因组RNA被释放并用作翻译复制酶蛋白的mRNA。由基因组RNA产生嵌套的亚基因组mRNA(sgmRNA),用于表达结构蛋白和辅助蛋白。图未示出,但可从Armesto等人的文献中获得。
图3是响应于特异性分析物的比色变化。a).显示了存在配对的分析物和相差一个核苷酸的错配分析物的情况下,纳米颗粒探针随时间的颜色变化。b).光谱随时间的移动。c).通过260nm处的吸光度测量的游离核酸分析物随时间的减少。
图4是使用DNA分析物时的结合特异度。通过两个相邻的20-mer寡核苷酸探针与野生型BRAF基因序列或相差1/100个核苷酸的突变序列的表面等离子体共振而评估的结合动力学。
图5是根据纳米颗粒的尺寸,在不同浓度下检测特异性分析物的灵敏度变化。(上侧)63nm(中间)46nm(下侧)13nm纳米颗粒。
图6是使用不同的探针化学物质(未修饰的DNA、2'-OMe和2'-F)时25nm和50nm纳米颗粒检测70nt或140nt ssDNA或dsDNA分析物的比较。
图7A至图7C是随时间变化的团聚稳定性比较。图7A.37℃下照射。图7B.37℃下不照射。图7C.室温下不照射。
图8是使用针对BRCA1和EGFR基因的靶向分析物之间单核苷酸的差异时的检测灵敏度比较。A.配对。B.错配。C.配对和错配。
图9A是对于不同浓度的108nt靶向序列,不同NP组合(150μm)的紫外-可见光光谱。图9B是对于含有不同数量批次的测定,表面等离子体带最大值处的吸光度变化和R值(R=Abs70/Abs530)随分析物浓度变化的变化。
图10A是对于不同浓度的108nt靶向序列,不同NP组合(100um)的紫外-可见光光谱。图10B是对于含有不同数量批次的测定,表面等离子体带最大值处的吸光度的变化和R值(R=Abs70/Abs530)随分析物浓度变化的变化。
图11A至图11E是对于不同浓度的108nt靶向序列,不同NP组合(1、2、3、4和5)在浓度为150μM时的紫外-可见光-近红外光谱。图11F是改变NP的数量和靶向浓度时不同测定的图。图11G是对于含有不同数量批次的测定,R值(R=Abs700/Abs530)随分析物浓度变化的变化。图11H是表面等离子体带最大值530nm处的吸光度变化。图11I是表面等离子体带最大值的位置的移动。测定的检测极限估计为1nM。
图12A至图12D是对于不同浓度的108nt靶向序列,不同NP组合(2、3、4和5)在浓度为100μM时的紫外-可见光-近红外光谱。图12E是改变NP数量和靶向浓度时不同测定的图。图12F是对于含有不同数量批次的测定,R值(R=Abs700/Abs530)随分析物浓度变化的变化。图12G是表面等离子体带最大值530nm处的吸光度变化。图12H是表面等离子体带最大值的位置的移动。对于4种和5种批次的测定,测定的检测极限估计为100pM。
图13A至图13D是对于不同浓度的108nt靶向序列,不同NP组合(分别为2、3、4和5)在浓度为50μM时的紫外-可见光-近红外光谱。图13E是对于含有不同数量批次的测定,R值(R=Abs700/Abs530)随分析物浓度变化的变化。图13F是表面等离子体带最大值530nm处的吸光度变化。图13G是表面等离子体带最大值的位置的移动。
图14A是2、3、4和5种NP批次(E1-E5)在30、60和150秒的超声处理时间下的紫外-可见光光谱。图14B是2、3、4、5种NP批次(E12-E16)在30、60和150秒的超声处理时间下的紫外-可见光。图14C是不同的NP批次数量和超声处理时间下的聚集度R(上图)和Abs@530nm(下图)。
图15A是2、3、4和5种NP批次(E1-E5)的紫外-可见光-近红外光谱。图15B是2、3、4、5种NP批次(E12-E16)的紫外-可见光。图15C是改变NP数量和捕获探针组时不同测定的图。图15D是针对不同的NP批次数量的聚集度(R)。图15E是针对不同的NP批次数量的Abs@530nm。图15F是针对不同的NP批次数量的等离子体带位置。
图16A是2种NP批次的紫外-可见光光谱(上图)和聚集度(下图)。图16B是3、4和5种NP批次的紫外-可见光光谱(上图)和聚集度(下图)。
图17A是根据分析物序列中1、2或3个核苷酸的变化以及根据E1-5的位置,计算不同探针序列的熔解曲线。图17B是根据分析物序列中1、2或3个核苷酸的变化以及根据E12-16的位置,计算不同探针序列的熔解曲线。
图18A和图18B是使用50nm的纳米海胆检测合成的亚基因组E基因分析物的片段。图18A是添加靶向分析物,即E基因的3’一半(120nt长的亚基因组RNA序列)后两分钟的颜色变化图。对照孔含有与AuNP探针不互补的108nt长的RNA序列。图18B是靶向RNA序列和对照的相应紫外-可见光光谱。实验重复进行三次。
图19A和图19B是使用球形的30nm AuNP检测合成的亚基因组E基因分析物的片段。图19A是加入目标分析物,即E基因的3’一半(120nt长的亚基因组RNA序列)后两分钟的颜色变化图。对照孔含有与AuNP探针不互补的108nt长的RNA序列。图19B是靶向RNA序列和对照的相应紫外-可见光谱。实验重复进行三次。
图20是用30nm的纳米球检测合成的N基因RNA。经七种探针(探针N1-7)或六种探针(N8-20)的混合物而功能化的金纳米球检测不同浓度范围(从100nM到0.1nM)的合成的N基因RNA片段(1260nt)的紫外-可见光光谱。实验重复进行三次。W=仅水对照。
图21A和图21B是使用经N基因探针(N1-7和N8-20)的混合物而功能化的30nm AuNP检测SARS-CoV-2全病毒序列。图21A是添加了10fmol或1fmol靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的颜色变化图。图21B是不同浓度的靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的相应紫外-可见光光谱。实验重复进行两次。W=仅水对照。
图22A和图22B是使用经E基因探针(E7-17)混合物而功能化的30nm AuNP检测SARS-CoV-2全病毒序列。图22A是加入了10fmol或1fmol靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的颜色变化图。图22B是不同浓度的靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的相应紫外-可见光谱。实验重复进行两次。W=仅水对照。
图23A和图23B是使用经N和E基因探针混合物而功能化的30nm AuNP检测SARS-CoV-2全病毒序列。图23A是加入了10fmol或1fmol靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的颜色变化图。图23B是不同浓度的靶向分析物(SARS-CoV-2全病毒序列)的相应紫外-可见光谱。实验重复进行两次。W=仅水对照。
图24A和图24B是检测SARS-CoV-2的特异度。图24A是使用来自猫科动物α冠状病毒VR-989的基因组RNA作为靶向分析物与使用来自SARS-CoV-2的基因组RNA作为靶向分析物时的颜色变化图。图24B是不同靶向分析物的相应紫外-可见光光谱。实验重复进行三次。
图25A至图25D示出了添加纳米颗粒后再添加盐增强了检测效果。经不同探针而功能化的AuNP的紫外-可见光光谱:E7-17(图25A);E1-6(图25B);N1-7和N8-20(图25C);N13(图25D),并且在添加0.7M的额外的盐之后,最终盐浓度为1.5M。实验重复进行两次。以水为对照。
图26A和图26B是确定检测极限(LOD)。图26A是经探针E7-17而功能化并用一系列已知浓度的全长基因组SARS-CoV-2 RNA测定的AuNP的颜色变化图。图26B是不同浓度RNA的相应紫外-可见光光谱。
图27A和图27B是确定LOD。图27A是经E基因(11种探针)和前导序列(17种探针)探针而功能化并用一系列已知浓度的全长基因组SARS-CoV-2 RNA测定的AuNP的颜色变化图。图27B是不同浓度RNA的相应紫外-可见光光谱。
图28A和图28B是对唾液中SARS-CoV-2 RNA的检测。图28A是利用唾液中掺入的SARS-CoV-2 RNA测定经E7-E17探针而功能化的AuNP的紫外-可见光光谱。图28B是利用唾液中的SARS-CoV-2并使用SDS和蛋白酶K测定经E7-E17探针而功能化的AuNP的紫外-可见光光谱。实验重复进行两次。
图29A和图29B是使用来源于患者的样品检测唾液中的SARS-CoV-2 RNA。图29A是利用来源于SARS-CoV-2阳性患者的样品,即来自鼻咽样品的掺入有RNA的唾液测定经E7-17探针而功能化的AuNP的颜色变化图。图29B是利用来源于SARS-CoV-2阳性患者的样品并使用SDS和蛋白酶K测定经E7-E17探针而功能化的AuNP的紫外-可见光光谱。
图30A和图30B是对单个样本的临床检验。图30A是由六名独立的观察者以盲法方式通过肉眼将检验标记为阳性或阴性而检验样品的实例。图30B是含有基于A的汇总结果而计算的临床检验参数的表格。
图31是一体式COVID-19分子检验的原型
表1——利用23nt RNA分析物和50nm NP进行的RNA分析物检测
表2——使用70nt RNA分析物和25nm NP进行的RNA分析物检测
表3——寡核苷酸靶向序列和捕获探针
表4——捕获探针的寡核苷酸序列
表5——针对测定中使用的不同浓度Au0和不同浓度的靶向物,靶向分子和金纳米颗粒数量的比例
表6-根据分析物序列中的1、2或3个核苷酸变化和根据变化位置,计算不同探针序列的熔解曲线
具体实施方式
本发明基于使用附着于纳米颗粒(NP)的多种(例如,3种或更多)连续、不重叠的靶向探针序列的原理,该纳米颗粒特异性结合病原体诸如病毒或细菌病原体的核酸序列。特异性的多重结合事件使NP彼此紧密接近,有效地引起NP的团聚。只有在存在分析物的情况下,团聚才会导致肉眼可检测到的视觉颜色变化。可选地,例如,当NP包含金刚石时,团聚导致发生发光的变化,该变化是光学上可检测的并且可转换为肉眼可检测的视觉变化。靶向RNA或DNA分析物的不同区域的多种探针的混合物引起信号的分子间放大,增加了检测体系的灵敏度。
有利的是,通过使用针对特异性的长RNA/DNA序列的多种探针,增强了引起视觉颜色变化的分析物结合的灵敏度和信号放大。探针的数量可以是3至n。添加更多的探针导致检测体系灵敏度的额外提高(图1A)。
本发明可以使用不同的NP-探针群的混合物,其中每种NP具有多个拷贝的相同探针(图1B)。可选地,本发明可以在同一NP上使用多个拷贝的不同探针(图1C)。当对NP进行功能化时,图1C中所示的NP可以通过使用DNA探针的混合物而不是单一序列来制备。不希望受理论的束缚,发明人认为,这在NP上产生了探针的随机分布,并且,由于具有最高亲和力的NP-探针将被选择为比更低亲和力的NP探针优先结合,因此提供了更高的灵敏度。不同的NP-探针群在本文的某些地方可以被描述为“批次”。
本发明提供一种平台技术。本发明发现了针对多种分析物的用途。在优选的实施方式中,本发明可用于在检测来自人、动物、食物或环境中的病原体诸如病毒或细菌的核酸中的用途。本发明可用于快速、简便并经济地从临床获得的样品中检测SARS-CoV-2病毒。
SARS-CoV-2
冠状病毒科(Coronaviridae)形成巢病毒目(Nidovirales)的一部分,其包含两个亚科——冠状病毒亚科(Coronavirinae)和托罗病毒亚科(Torovirinae)。冠状病毒亚科(Coronavirinae)病毒因其在负染色标本中与日冕的视觉相似性而得名。冠状病毒有三个属,即α-冠状病毒、β-冠状病毒和γ-冠状病毒。SARS-CoV-2病毒是一种与严重急性呼吸综合征相关病毒(SARS)密切相关的β-冠状病毒。
冠状病毒是具有26至32kb的单链正义RNA基因组的包膜病毒,且代表了所有RNA病毒中最大的基因组,其中SARS-CoV-2病毒的基因组为29,903个核苷酸(RefSeq NC_045512)。基因组与核蛋白(N)结合,在病毒颗粒内形成螺旋状的核衣壳。它们被包裹在含有刺突(S)糖蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白的脂质包膜内。β-冠状病毒的基因组结构如图2所示。
尽管冠状病毒含有可直接作为蛋白质翻译模板的正链RNA基因组,但在感染周期中,它们也在连续转录过程中产生整个基因组的负链拷贝,以及非连续亚基因组(sg)负链mRNA的子集。这些sgmRNA是通过转录调节序列(TRS)的存在而产生的,该转录调节序列引起转录过程的暂停或该过程的终止,从而导致生成嵌套的sgmRNA片段。由于sgmRNA的转录起始于冠状病毒基因组的3'末端(负链的5'),因此包括E、M和N蛋白在内的3'基因的数量可能高于5'基因诸如ORF1和S的数量。事实上,与正链基因组RNA基因组相比,感染细胞中的sgmRNA转录物明显更多,据报道增加了70倍(Hofmann等人《病毒学杂志(J Virol)》64;4108-4114.)。明确考虑的是,本发明的NP的探针可以靶向基因组正链序列和/或非重叠的mRNA或sgmRNA序列。
检测试剂盒
本发明提供一种检测试剂盒,由此将提纯的分析物添加到溶液中。溶液1是第三方的提纯溶液。在某些实施方式中,溶液1可以是ARCIS Biotechnology公司(Daresbury,UK)的冠状病毒RNA提取研究试剂盒中所提供的。在一些情况下,溶液1可以包含所述冠状病毒RNA提取研究试剂盒的“试剂1(Reagent 1)”和/或“试剂2a(Reagent 2a)”,如日期为2020年3月28日的操作指南中所描述的,并可在以下URL获得:https://arcisbio.
com/wp-content/uploads/2020/03/SARS-CoV-2-Protocols-V3-20200328-1.pdf。“溶液2”包含本发明的纳米颗粒以及用于检测的溶剂/缓冲液。在另一个实施方式中,本发明可以是通过将NP探针固定到检测表面的侧向层析测定的形式。
SDS和蛋白酶K
SalivaDirectTM方法的使用,即添加SDS/蛋白酶K,不需要单独的RNA提取步骤,并允许对靶向分析物使用一步式检测方法(https://publichealth.yale.edu/salivadirect/)。与PCR不同,PCR需要在检验前去除SDS和蛋白酶K,而SDS是众所周知的NP稳定剂。PCR依赖于酶的存在,这就需要除去蛋白酶K。有利的是,在本体系中没有蛋白质,因此不需要去除蛋白酶K。使用SDS/蛋白酶K的方法的另一个优点是SDS使病毒失活,0.5%SDS的浓度足以完全破坏病毒。
能与其它丝氨酸内肽酶诸如枯草杆菌蛋白酶A和金属蛋白酶混合的其它酶可用作蛋白酶K的替代物。
纳米颗粒
检测试剂盒中所使用的纳米颗粒可以优选包含金,但也可以是银或任何其它金属。NP还可以包含金刚石。NP可以是空心的或实心的。NP可以优选是球形的,但也可以是非球形的,例如星形、杆形或其它形状。非球形NP可以是纳米海胆(Sigma)。在一些情况下,NP的直径可以在5nm至200nm的范围,优选20nm至100nm,更优选30nm至70nm,例如直径为约50nm。不希望受理论的束缚,发明人认为,较小的纳米颗粒诸如平均直径为25nm的纳米颗粒在溶液中可能更稳定,而较大的纳米颗粒诸如平均直径约为65nm的纳米颗粒可以提高测定的灵敏度。可以使用Turkevich方法、晶种生长方法或本领域技术人员公知的其它合适方法来制备NP。纳米金刚石的使用是此处明确考虑的。特别地,此处考虑使用荧光纳米金刚石(参考文献8)。纳米金刚石是碳基纳米颗粒,具有金刚石碳的核和部分石墨基的表壳(参考文献9)。它们的尺寸范围为1至100nm。已经对利用生物分子诸如DNA修饰金刚石薄膜表面进行了描述(参考文献10)。
探针
检测试剂盒中所使用的探针可以由DNA或修饰的核酸如PNA、LNA、2'-H、2'-OMe、2'-F来制备。探针可以共价附着于纳米颗粒表面,例如通过巯基连接子。在一些情况下,探针可以通过C6-巯基5'-连接而附着,但也可以是3′或内部的。探针通过巯基连接来附着,并且可以含有PEG或类似的间隔分子以使非特异性团聚最小化。在某些情况下,探针可以通过链长为10至50个原子的间隔基而连接到纳米颗粒。例如,C18间隔基。间隔基可以在巯基连接子之外使用。例如,探针可以通过C6-巯基连接子和C18间隔基而连接到纳米颗粒表面。
探针序列优选为20-mer,尽管它们的长度可以在12至30个核苷酸之间变化。探针序列可以在中等或高严格性条件下与靶向序列杂交。在一些情况下,盐浓度可以是100μm至500μm,例如100μm至500μm的NaCl。在某些实施方式中,盐浓度可以是150μM的NaCl。在某些实施方式中,允许杂交的温度可以在25-30℃的范围内。优选地,探针序列与靶向序列互补。然而,如本文所示,即使当靶向-探针序列表现出一个或多个碱基错配,例如1、2或3个碱基错配时,杂交也可以足够强以至能够对靶向分析物进行检测。针对非特异性靶向物、自身互补性、Tm值和靶向物的进化保守性来筛选探针序列。例如,在冠状病毒或类似物的情况下,它们可以靶向病原体的基因组序列、亚基因组片段或mRNA。
靶向核酸分析物包含至少第一非重叠靶向序列、第二非重叠靶向序列和第三非重叠靶向序列,其中这些靶向序列是不同的并且可以是间隔开的或者连续的。因此,本发明的至少第一寡核苷酸探针序列、第二寡核苷酸探针序列和第三寡核苷酸探针序列是不同的。
纳米颗粒-探针可以称为NP@DNA。其中纳米颗粒具有金核的纳米颗粒-探针可以称为Au@DNA。
纳米颗粒与探针之间的间距
当结合到靶向分析物时,相邻纳米颗粒之间的间距可以是5nm至30nm。当结合到靶向分析物时,相邻纳米颗粒之间的间距可以是13nm至18nm。相邻纳米颗粒之间的间距可以通过电子显微镜来测量。可选地或附加地,相邻纳米颗粒之间的间距可以理论上基于靶向序列的长度和靶向序列之间的距离来确定。核苷酸的平均长度为0.6nm,因此对于20-mer的靶向序列,NP之间的理论距离为12nm。这个距离可以例如通过改变探针序列的结合位置或物理性地延长探针长度而调整。
样品
样品可以包括任何生物液体或组织样品和/或环境样品。在特定实施方式中,样品可以是唾液或鼻咽样品。样品可以来自SARS-CoV-2感染的个体。样品可以是掺入到唾液样品中的来自SARS-CoV2感染个体的RNA。样品也可以是从细胞培养物中获得的。例如,可以从使用感染了SARS-CoV-2的细胞建立的细胞培养物中获得样品。
实施例
实施例1——金纳米颗粒的合成和功能化
金纳米颗粒(AuNP)是采用晶种生长法合成的。晶种生长过程包含金属前体的循环添加和颗粒的提取。在典型的过程中,将晶种溶液冷却至90℃,然后添加HAuCl4溶液(25mM),随后在30分钟后进行第二次添加。再过30分钟后,对生长溶液进行提取并添加柠檬酸钠溶液(60mM)。重复该过程以使所得的AuNP的尺寸增大。
根据Hurst等人的方法,用巯基化的寡核苷酸引物(参见实施例2的示例性寡核苷酸探针序列“引物”)将AuNP功能化。简言之,将含胶体AuNP的SDS(0.1%)和PB(0.01M)添加到3.6μM的寡核苷酸溶液中。将寡核苷酸与AuNP的混合物在室温下孵育20分钟,并且为了提高寡核苷酸结合,进行盐老化过程。将含有NaCl(2M)、SDS(0.01%)和PB(0.01M)的溶液依次添加到混合物中以达到0.2M的NaCl终浓度。每次盐老化步骤与超声处理(10秒)和孵育(20分钟)交替进行,随后孵育12小时。为了去除过量的寡核苷酸,将溶液离心3次,每次都重新分散于SDS(1mL,0.01%)中。
根据最近的操作指南(Mirkin等人,《分析化学(Anal Chem)》,2006,第7卷,第8313-8318页,通过引用并入本文)利用单链DNA(ssDNA)将柠檬酸盐稳定的AuNP功能化。经DNA而稳定的AuNP在含有阴离子表面活性剂——0.01wt%十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液中表现出胶体稳定性,如通过紫外-可见光光谱所证实的。在DNA结合后,所有样品中的等离子带红移-3,表明在纳米颗粒表面周围形成了分子壳。TEM测定证实形成了厚度为~1.4nm的分子壳。
实施例2——响应于特异性分析物的比色变化
团聚过程导致含有特异性探针的胶体纳米颗粒在与分析物结合时颜色发生变化(图3)。在一些情况下,颜色变化可以在几个小时或几十分钟或几分钟的时间内发生。在某些优化的情况下,颜色变化可在10至20分钟内发生。然而,也可以考虑更长的时间。
实施例3——使用DNA分析物时的结合特异度
发明人已经证明,基于纳米颗粒的探针体系可用于区分DNA分析物,即使它们仅有单个核苷酸变化。图4示出了与野生型BRAF序列相比,设计的突变体BRAF探针与突变体BRAF基因序列的优先结合。这表明所设计的探针可以特异性地结合感兴趣的突变序列。
实施例4——根据NP尺寸的灵敏度
检测的特异度随着体系中所使用的纳米颗粒的尺寸而增加(图5)。
实施例5——根据分析物尺寸的灵敏度
对分析物靶向长度的比较表明,较长的靶向长度与较短的靶向长度相比更有效并且具有更快的结合动力学(数据未示出)。
实施例6——不同的核酸探针化学物质检测ssDNA和dsDNA分析物的能力比较
对附着于25nm或50nm直径纳米颗粒的三种不同核酸化学物质(即未修饰的DNA、2'-OMe和2'-F)检测ssDNA或dsDNA分析物的能力进行了比较(图6)。
2'-F修饰提高了ssDNA检测的灵敏度,尤其是较小的NP。不希望受理论的束缚,发明人推测2'-OMe修饰对于dsDNA的检测更好,而2'-F修饰对于ssDNA的检测更好。
还尝试了利用肽核酸(PNA)对金纳米颗粒进行功能化,但由于沿肽链缺乏电荷,无法用这种修饰的寡核苷酸稳定溶液中的颗粒。
实施例7——NP团聚物随温度的稳定性
进行了三个不同的实验来观察所形成的团聚物随温度的变化有多稳定。图7A至图7C的结果显示,在存在或不存在激光照射(600nm)的情况下,所形成的团聚物在室温或更高温度(37℃)下稳定了至少1小时。
实施例8-检测体系对多种分析物的适应性
在许多不同的分析物上对该检测体系进行了检验,这些分析物含有单核苷酸错配,包括EGFR和BRCA1基因中自然发生的突变。图8表明,尽管在两种不同的靶向物中配对和错配结合的动力学之间存在明显的差异,但两种基因都能够在该检测技术的基础上进行区分。
实施例9——RNA分析物检测
使用23nt和70nt RNA分析物的组合,使用2′F修饰的核酸序列检验了纳米颗粒-探针的能力。
在第一个实验中,使用了23nt RNA分析物和50nm的纳米颗粒(参见表1)。利用单个碱基错配的分析物,在约15分钟内观察到视觉颜色的快速差异(数据未示出)。
表1-利用23nt RNA分析物和50nm NP进行的RNA分析物检测
重复相同的实验,但使用较小的纳米颗粒尺寸(25nm)和70nt RNA分析物(参见表2)。在分析物的存在下,光学颜色有明显的差异,尽管该过程比第一个实验慢(数据未示出)。
表2-使用70nt RNA分析物和25nm NP进行的RNA分析物检测
实施例10——靶向物选择和引物设计
基于本文提供的实验证据,设计了靶向E蛋白基因的连续但不重叠的引物。此处明确考虑的是,其它基因(例如SARS-CoV-2的N蛋白基因)中的其它非保守序列也可用于此目的。当设计用于检测其它核酸的引物时,例如当设计用于检测另一种病原体的核酸的引物时,可以应用此处公开的引物设计标准。
选择E基因作为初始靶向物的原因是:
1.它在冠状病毒科成员之间是非保守的,即它是特异性的,并且不太可能与密切相关的病毒序列发生交叉反应。
2.它位于基因组的3′端,因此很可能以sgmRNA的形式高度丰富。
3.尽管技术不同,比较qRT-PCR研究发现,与其他基因相比,E基因检测获得了更高的灵敏度(Corman等人)。
4.E基因很小(228nt),使得产生合成的RNA基因组正链和互补的负链sgmRNA以优化该技术变得切实可行,而不需要使用病毒衍生的或者DNA分析物来进行实验。
此处明确考虑的是,可以靶向SARS-CoV-2中的其它序列。例如,上述原因1和2适用于SARS-CoV-2的N基因。
基于覆盖E基因序列的连续20-mer序列来选择用于原理验证实验的初始引物。理想的是,引物具有以下特性:
1.针对SARS-CoV-2病毒的特异度,如果在设想的适应症下不太可能成为潜在的污染物,某些交叉反应性是可以容忍的。例如,可以容忍与蝙蝠SARS或植物衍生序列的交叉反应。
2.与检验中可能产生假阳性的其他探针序列无显著互补性。
3.熔解温度(TM)理想地为55-68℃,但也可使用其它温度。
表3表征了发明人所设计的靶向序列和捕获探针。选择了两个SARS-CoV-2靶向序列:235nt的病毒序列和108nt的亚基因组E基因序列。设计了三组捕获探针。E1-E5与235nt的病毒序列的一个末端互补。E12-E16与235nt的病毒序列的另一个末端互补。E7-E11和E17与108nt的亚基因组E基因序列互补。表4提供了这些捕获探针的寡核苷酸序列。
所有引物都具有:i)用于附着于NP的5'-巯基修饰和C6间隔基以及ii)互补20-mer序列上游的10(t)5'尾。
引物E#1-6和E#12-17中的至少一些是连续的且与SARS-CoV-2序列的E基因的正链RNA序列(参考序列NC_045512.2)反向互补。
引物E#R7-R11和E17靶向E基因的负链sgmRNA。
表3-寡核苷酸靶向序列和捕获探针
表4——捕获探针的寡核苷酸序列
LS=前导序列
实施例11——捕获探针的二级结构分析
对表3中描述的每个捕获探针的二级结构进行了模拟,并计算了这些二级结构3的自由能。观察到几乎所有捕获探针在25℃下都形成了稳定的二级结构。
E4在25℃下未形成稳定的二级结构。通过“盐老化”方法利用捕获探针E4对纳米颗粒进行表面功能化,导致这些纳米颗粒的胶体稳定性很有限。不希望受理论的束缚,发明人推测E4的二级结构阻碍了其在纳米颗粒表面上的有效吸附。因此,发明人推测捕获探针的序列,特别是是否可以形成稳定的二级结构,对于纳米颗粒-探针的稳定性是重要的。这些纳米颗粒在0.01%SDS中的再分散使得纳米颗粒的稳定性能完全恢复。
实施例12——靶向序列的二级结构分析
对病毒235nt和亚基因组108nt靶向序列的二级结构进行了模拟。观察到每个靶向序列可在25℃、1M NaCl下形成相对低能量的结构。病毒的235nt二级结构的自由能为-77.17kcal/mol,而亚基因组108nt二级结构的自由能为-25.78kcal/mol。
实施例13——包含235nt和108nt以及捕获探针的杂交体二级结构的模拟
为了获得有关捕获序列与靶向序列之间结合的更详细的信息,对25℃下最可能的二级结构进行了模拟。对235nt病毒序列与E1、E2、E3、E4或E5捕获探针的杂交体的二级结构进行了模拟。所有杂交体的能量相当,从-105.59到-100.41kcal/mol不等。
对于235nt病毒序列与E12、E13、E14、E15或E16捕获探针的杂交体,观察到了相似的二级结构。自由能变化稍大,从-110.46到-95.28kcal/mol。与E1-E5相比,E12-E16与235nt病毒序列的相反末端结合。
还观察到108nt亚基因组序列与捕获探针E7、E8、E9、E10和E11形成稳定的杂交体。自由能为-67.12到46.78kcal/mol不等。
实施例14——对108nt亚基因组序列的检测
为了评价对108nt亚基因组序列的检测,使用1、2、3、4或5种NP@DNA批次来检验测定组合物,其中每种批次包含不同的NP@DNA群。每次测定中的颗粒总数保持恒定(表示为Au0的摩尔浓度——150μM)。对于每种测定组合物,使用以下浓度的靶向序列:10000pM、1000pM、100pM、10pM,1pM,0.1pM。将混合物孵育48小时。
图9A示出了对于测定5、4、3、2和1种NP,不同靶向物浓度下溶液的紫外-可见光-近红外光谱。观察到,对于含有1种和2种NP的批次,光谱在整个靶向物浓度范围内保持不变。相反,对于含有3、4和5种批次的测定,观察到紫外-可见光-近红外光谱的急剧变化。这对于含有4和5种批次的样品尤其明显。
对光谱数据的更详细分析表明,含有1种和2种批次的混合物在整个靶向物浓度范围内保持稳定,只有含有3种、4种和5种批次的混合物在100pM以上发生聚集(图9B)。光谱数据也通过肉眼检查得到证实,其表明靶向物浓度越低,样品的颜色强度越低。看不出1种和2种批次的颜色变化(数据未示出)。3、4和5种批次的颜色变化是看得见的,其中4和5种批次的效果比3种批次的效果更明显。
本实验中纳米颗粒的总浓度固定在150μm。因此,可以基于所使用的批次的数量来计算每个群的浓度。例如,对于2种批次,每个群的浓度为75μM。对于3种批次,每个群的浓度为50μM。
为了检查是否可以改善测定性能,通过仅改变一个参数来重复实施例14的实验。纳米颗粒的总浓度设定为100μm(图10A至图10B)。如在先前的实验中,包含1或2种批次的样品的等离子体带对于分析物浓度的变化保持不变(图10A)。但是,对于3、4和5种批次,光学特性随着分析物浓度的增加而改变。
这些数据还表明,通过降低纳米颗粒的总浓度(或者纳米颗粒与靶向物的摩尔比),可以将5批次体系的检测极限提高到100pM(图10B)。因此,通过改变探针对分析物的浓度,可以提高体系的灵敏度。
实施例15——使用不同的颗粒总数在测定中检测108nt亚基因组序列
为了评价对108nt亚基因组序列的检测,使用1、2、3、4或5种NP@DNA批次来检验测定组合物,其中每种批次包含不同的NP@DNA群。每次测定中的颗粒总数(表示为Au0的摩尔浓度)固定为150μm(图11)、100μm(图12)或50μm(图13)。对于每种测定组合物,使用以下浓度的靶向序列:10000pM、1000pM、100pM、10pM和1pM。在每个样品中保持恒定的8小时孵育时间。
图11A至图11E示出了分别对于1、2、3、4和5种批次的测定,不同靶向浓度下溶液的紫外-可见光-近红外光谱。发明人观察到,对于含有1种和2种类型的纳米颗粒的批次(图11A和图11B),光谱在整个靶向物浓度范围内保持不变。相反,对于包含3、4和5种批次的测定(图11C、图11D和图11E),观察到紫外-可见光-近红外光谱的急剧变化。这对于含有4和5种批次的样品尤其明显。
光谱数据也通过肉眼检查得到了证实(图11F)。对光谱数据的更详细分析表明,含有1种和2种批次的混合物在整个靶向物浓度范围内保持稳定,只有含有3种、4种和5种批次的混合物在1nM靶向物浓度下发生聚集。图11G、图11H和图11I表示对于不同的纳米颗粒批次数量,聚集程度、吸光度和等离子体带移动分别相对于靶向物浓度的变化。对于5种NP(150μM)的批次,检测到10和1nM的靶向物浓度。对于3种和4种NP的批次,检测到1nM的靶向物浓度。在更高的靶向物浓度(10nM)下,NP保持稳定。
本实验中纳米颗粒的总浓度固定在150μm。因此,可以基于所使用的批次的数量来计算每个群的浓度。例如,对于2种批次,每个群的浓度为75μM。对于3种批次,每个群的浓度为50μM。
为了检查是否可以改善测定性能,通过仅改变一个参数来重复上述实验。纳米颗粒的总浓度设置为100μm(图12)。对于包含多于两种批次的样品,纳米颗粒的聚集在1nm的靶向物下更明显。同样,在较高量的靶向物(10nM)下,颗粒保持稳定,由于缺乏聚集而导致消极结果。这是因为靶向分子使每个纳米颗粒的表面饱和。
通过将纳米颗粒的总浓度降低至50μm来重复上述实验(图13)。观察到该纳米颗粒浓度是次优的,因为针对使用2种或更多种纳米颗粒批次的实验没有观察到看得见的差异。
不能检测更高量的靶向物与靶向分子使每个纳米颗粒饱和、进而抑制聚集有关。通常,胶体测定的正常功能取决于靶向物与纳米颗粒的摩尔比。在较低的比值下,一小部分颗粒聚集,而绝大多数纳米颗粒保持分散,不会引起颜色变化。在较高的比值下,靶向分子使纳米颗粒的表面饱和,同样不会引起聚集。表4提供了靶向物与纳米颗粒的摩尔比的值。
表5-针对测定中使用的不同浓度Au0和不同浓度的靶向物,靶向分子和金纳米颗粒数量的比例
实施例16——用超声处理使分析物片段化来检测235nt病毒序列
为了检测235nt的靶向序列,使用两组不同的捕获探针:从靶向序列的5'端到中间的捕获探针E1-E5以及从靶向序列的3'端中间的捕获探针E12-E16。为了诱导235nt序列的片段化,将含有NP(150μM)、靶向序列235nt(1nM)和NaCl 0.3M的溶液置于超声浴(1200W)中持续不同的时间:30、60和150秒。随后将样品孵育48小时。E1-E5和E12-E16的结果分别如图14A和14B以及图14C所示。
这些数据表明,无论超声时间如何,含有1种和2种金纳米颗粒批次的体系均保持不变。对于含有4种和5种批次的体系,超声处理的效果更明显。有趣的是,捕获探针与靶向序列的杂交片段对于这种类型的检测策略似乎是重要的。虽然超声处理诱导了经捕获探针E1-E5而稳定的NP的聚集,但当使用经E12-E16而稳定的NP时,它对稳定性没有影响(图14C)。
此处明确考虑的是,这些实验可以重复0、60和300秒的超声时间。不希望受理论的束缚,发明人推测延长超声处理会引起靶向序列片段化,进而没有聚集。
这些实验表明,靶向分析物的长度对于等离子体共振至关重要,因为108nt的亚基因组靶向分析物显示了颜色变化,而235nt的病毒靶向分析物没有颜色变化。发明人使用超声处理来打断235nt的病毒靶向分析物。
此处明确考虑的是,对于长的分析物,例如SARS-CoV-2的基因组RNA(>29kb),片段化步骤(例如通过超声处理或其它合适的方法)可能是必要的。此处明确考虑的是,超声处理的有效性可以是序列特异性的。例如,发明人发现E1-5对超声处理敏感,而E12-E16不敏感。对于多于4种或多于5种NP的批次,超声处理的效果增强,但当使用3种NP时,表现出很小的差异。
实施例17——对235nt序列的检测
对于235nt靶向序列的检测,采用了两组不同的捕获探针:从5'端到序列中部的捕获探针E1-E5以及从3'端中部的捕获探针E12-E16。将含有NP(150μM)、靶向序列235nt(1nM)和NaCl 0.3M的样品孵育48小时(图15A至图15C)。这些数据表明,含有1种和2种批次金纳米颗粒的体系保持不变。对于含有4种和5种批次的体系,聚集更明显。有趣的是,捕获探针与靶向序列的杂交片段对于这种类型的检测策略似乎是重要的。虽然在利用捕获探针E1-E5而稳定的NP的情况下发生聚集,但在利用E12-E16而稳定的NP中观察到了效果(图15D至图15F)。
图15D和图15E显示,对于捕获探针E1-E5,在含有多于两种纳米颗粒的测定中发生聚集。相反,对于捕获探针E12-E16,随着颗粒数量的增加,未发生聚集。
实施例18——使用不同批次数量对紫外-可见光光谱和聚集的影响
为了证明在这种类型的聚集测定中所使用的颗粒数量的重要性,使用i)不同的2种NP的组合(图16A)以及ii)3、4或5种颗粒(图16B)来进行测定。
图16A示出了其中使用两种NP批次的测定的紫外-可见光光谱和聚集程度。使用了与235nt病毒分析物的不同位置结合的四种不同的纳米颗粒群组合。图16B示出了其中使用两种、三种、四种或五种纳米颗粒群体的测定的紫外-可见光光谱和聚集程度。这些测定中所使用的条件是:靶向序列235nt 1nm,[Au]150uM,NaCl 0.3M。
这些结果表明,无论所用探针序列的组合如何,当仅使用两种探针群时,紫外-可见光光谱不变。当使用四种或五种探针群时,紫外-可见光光谱和聚集程度表现出明显的变化。
实施例19——错配对熔解温度的影响
根据它们的靶向分析物序列中的1、2或3nt变化以及变化的位置,对捕获探针序列E1-5、E7-11(数据未示出)和E12-16进行熔解曲线计算。表5中提供了这些实验的结果,并且分别在图17A和17B中提供了针对E1-E5和E12-E16的结果。
在有1或2nt变化的情况下,结合亲和力几乎没有变化。对占捕获探针20-mer序列的15%的3nt变化的容忍度较低。当3nt变化发生在靶向分析物上与捕获探针序列的中间互补的位置时,其容忍度较低。
实施例20——使用非球形的纳米颗粒检测合成的E基因分析物
为了确定是否可以通过使用非球形的纳米颗粒来改善对SARS-CoV-2 E基因的检测,利用与SARS-CoV-2的亚基因组E基因互补的三种单独的DNA探针(E9-E11)对非球形的50nm Au纳米海胆(Sigma)(图18A和图18B)或球形的30nm AuNP(NanoComposix)(图19A和图19B)进行了功能化,并对结果进行了比较。以每孔10nM的浓度添加靶向分析物,即E基因的3′一半(120nt长的亚基因组RNA序列)。对照孔以每孔10nM的浓度含有与AuNP探针不互补的108nt长的RNA序列。两分钟后通过肉眼检测颜色变化,并通过紫外-可见光光谱进行了确认。
图18显示纳米海胆能够特异性且快速地对靶向分析物进行检测,如添加靶向分析物后两分钟从粉红色到蓝色/透明的清晰颜色变化所示(图18A),与清晰的光谱移动相对应(图18B)。
与使用纳米海胆观察到的快速颜色变化相反,使用球形的纳米颗粒时,颜色变化和光谱移动不太明显,但仍然足够(图19)。
这些结果表明,非球形的纳米颗粒可以增强对SARS-CoV-2 E基因的检测。
实施例21——用30nm纳米球检测合成的N基因RNA
用7种(探针N1-7)或6种探针(N8-20)的混合物将30nm金纳米球(NanoComposix)功能化。靶向分析物是合成产生的SARS-CoV-2的完整N基因序列(1260nt)(图20)。在30μL的总体积中使用1μL范围在100nM至0.1nM内的不同浓度。
该实验的结果表明,利用探针混合物而功能化的30nm纳米球可以检测长RNA序列,在这种情况下是SARS-CoV-2的N基因序列。该实验还证明,纳米颗粒可以利用同一纳米颗粒上的多种探针的混合物来功能化,这有利地使得更容易地制造纳米颗粒。
实施例22——SARS-CoV-2全基因组检测
为了检验Au NP是否能用于检测SARS-CoV-2的全基因组,从感染了SARS-CoV-2的细胞的细胞培养物(斯洛伐克科学院生物医学研究中心病毒学研究所,斯洛伐克)中获得全长基因组RNA(~30,000nt)并用作靶向分析物。利用7种(探针N1-7)或6种探针(N8-20)的混合物(图21)、E基因探针的混合物(E7-17)(图22)或N和E基因探针的混合物(图23)将30nm金纳米颗粒功能化。所添加的靶向分析物的量为最终体积30μL中1μL的10nM或1nM。通过确定25分钟和120分钟后是否有看得见的颜色变化来检验对靶向分析物的检测,并且这通过紫外-可见光光谱进行了确认。
这些实验的结果清楚地表明,AuNP允许对SARS-CoV-2的全长RNA序列进行检测。此外,这些实验表明可以对直接从病毒获得的RNA进行检测。
为了证明AuNP特异性地检测SARS-CoV-2,使用相关的冠状病毒(猫α冠状病毒VR-989)作为靶向分析物,并与SARS-CoV-2进行比较(图24)。利用E基因探针(E7-17)的混合物对30nm AuNP进行功能化并添加0.03nM(总体积30μL中1μL的1nM)来自SARS-CoV-2或者猫α冠状病毒株VR-989(从ATCC获得)的基因组RNA作为靶向分析物。以水为对照。
虽然如看得见的颜色变化所示(图24A)功能化的AuNP在孵育25分钟后能够检测出SARS-CoV-2,但VR-898即使孵育120分钟后也不会引起颜色变化或光谱移动(图24B)。
本实验证明本发明的功能化的AuNP对SARS-CoV-2是特异性的,并且不会检测出密切相关的冠状病毒。
为了提高检测速度,在添加AuNP后,向测定中添加额外的盐。不同的探针混合物:E基因:E7-17(图25A)和E1-E6(图25B);N基因:将N1-N7和N8-N20(图25C)以及N13(图25D)共价附着于AuNP,然后用SARS-CoV-2的全长RNA序列或者用水作为阴性对照进行测定。在添加AuNP之后,添加额外的0.7M NaCl,达到1.5M的最终浓度。添加额外的盐允许在仅20分钟后使用经探针混合物而功能化的AuNP进行检测(图25A至图25D),如吸光度降低和明显的光谱移动所示。
总之,在添加AuNP后添加额外的盐提高了测定的灵敏度,而不影响其特异度。
图23——提高检测极限(LOD)
为了确定检测极限,用一系列已知浓度的含有以下拷贝数的全长基因组SARS-CoV-2 RNA对AuNP进行检验:108个拷贝、107个拷贝、106个拷贝和105个拷贝。利用探针E7-E17而功能化的AuNP在15分钟后在107个拷贝或更多的病毒下产生明显的颜色变化(图26)。利用针对E7-17亚基因组(6)、E1-5基因组(5)、N基因混合物(10)和前导序列探针(17)的探针而功能化的AuNP在15分钟后在105个拷贝或更多的病毒下产生明显的颜色变化(图27)。
这些数据表明AuNP能够检测出低至105个拷贝的靶向分析物的浓度。
实施例24——从唾液基质中去除蛋白质
先前的实验表明,唾液基质中的蛋白质成分与纳米颗粒非特异性结合,使得它们不能与靶向分析物结合。因此,有必要研究从基质中除去蛋白质的方法。
蛋白酶K的效果最好。这与耶鲁大学(Yale University)提供的信息一致,该信息显示,蛋白酶K处理与SDS的组合可用于直接灭活SARS-CoV-2病毒和提取RNA用于qRT-PCR(https://publichealth.yale.edu/salivadirect/)。
SDS/蛋白酶K的使用避免了对单独的RNA提取步骤的需要,并允许靶向分析物进行一步式检测的方法。与PCR不同,PCR需要在检验前去除SDS和蛋白酶K,而SDS是众所周知的NP稳定剂。PCR依赖于酶的存在,这就需要除去蛋白酶K。有利的是,在本体系中没有蛋白质,因此不需要去除蛋白酶K。使用SDS/蛋白酶K的方法的另一个优点是SDS使病毒失活,0.5%SDS的浓度足以完全破坏病毒。
为了检验用于本测定的SDS/蛋白酶K处理,发明人使用了10μg蛋白酶K和终浓度为0.5%的SDS的组合(以粉末形式),利用唾液获得了类似的结果,即在<15分钟内检测到SARS-CoV-2 RNA(图28)。在本实验中采用了E7-17 AuNP-探针,并且在65μL的最终体积中使用了1μL的260pM的靶向分析物。
使用添加到唾液中的患者来源的鼻咽样品(提取用于PCR的RNA)重复了本实验(图29),其显示了类似的结果。
总之,这些实验表明,向样品中添加SDS和蛋白酶K去除了蛋白质,从而解决了唾液中的蛋白质成分干扰测定的问题,并允许在患者来源的样品中检测病毒RNA。
实施例25——个体样品的临床检验
为确定该测定是否能够用于检测临床样本中的SARS-CoV-2,从省级(吉普斯夸省(Gipuzkoa))COVID-19检验中心获得175份经PCR检验的已知COVID-19状态的鼻咽临床样本。这些是由六名独立的观察者以盲法方式通过肉眼将检验标记为阳性或阴性而检验的(图30)。将共识的意见进行了采纳,并通过Medcalc计算了临床检验参数的汇总结果(图30B)。
本发明的灵敏度为92.86%,特异度为96.10%,其性能介于标准PCR检验和侧向层析检验之间。侧向层析检验能够检测出72%的感染了病毒并出现症状的人以及78%的在发病第一周内的人。但在没有症状的人群中,降至58%(参考文献7)。虽然比PCR检验更方便用户使用,但现有的侧向层析检验的一个主要缺点是灵敏度差。PCR检测提供了更高的灵敏度,但缺乏可扩展性。本发明检验的灵敏度比侧向层析检验好得多,仅略低于PCR检验。因此,本发明有利地提供了一种方便的、用户友好的可以批量生产的检验,并且与现有的侧向层析检验相比具有更好的灵敏度。
图31提供了本发明的测定的原型实例。该原型包含含有AuNP和SDS/蛋白酶的管材,以及含有额外的盐的盖构件。使用者将唾液提供到漏斗形构件中,盖上盖子,向管材中添加额外的盐,并摇动管材。开发之后,结果将在指示窗口中看得见。颜色从红色变为蓝色指示SARS-CoV-2检验呈阳性,而没有颜色变化则指示检验呈阴性。
实施例26——纳米金刚石用作纳米颗粒
为了进一步提高本发明的灵敏度,本文考虑使用纳米金刚石作为纳米颗粒。纳米金刚石将利用巯基化的寡核苷酸探针而功能化,并且靶向分析物的存在将导致纳米金刚石聚集,引起发光(例如荧光)的变化。这种发光的变化在光学上是可检测的,并且可以转换成视觉指示/变化。
表6:根据分析物序列中1、2或3nt的变化以及根据变化的位置,计算不同探针序列的熔解曲线
表6(续):根据分析物序列中1、2或3nt的变化以及根据变化的位置,计算不同探针序列的解链曲线
结论
总之,本文提供的结果表明,混合物中需要两种以上批次的Au@DNA纳米颗粒来检测108nt和235nt的靶向物。本发明的方法能够检测235nt的靶向序列。E1-E6显示出对235nt靶向序列的最佳检测。此外,Au@DNA纳米颗粒可以特异性地检测SARS-CoV-2的全长RNA序列。结果进一步表明,在检测患者样品中的SARS-CoV2的测定中使用AU@DNA纳米颗粒提供了更方便的检验,该检验可以大量生产,并且与现有技术的检验相比具有提高的灵敏度。
本文引用的所有参考文献通过全文引入并入本文,并且出于所有目的,其程度与每份单独的出版物或专利或专利申请被具体和单独地指明通过全文引入并入本文相同。
这里描述的具体实施方式是以示例的方式提供的,而不是以限制的方式。这里包括的任何副标题仅是为了方便,而不应被解释为以任何方式限制本公开。
参考文献
1.Liu G,Lu M,Huang X,Li T,Xu D.《纳米金比色传感在食品安全快速筛查中的应用(Application of Gold-Nanoparticle Colorimetric Sensing to Rapid FoodSafety Screening)》.
2.Armesto等人,《RNA病毒逆向遗传学》的第2章:应用和展望(Chapter 2ofReverse Genetics of RNA Viruses:Applications and Perspectives)(Wiley&Co.2012)。
3.Hurst,SJ;Lytton-Jean,AKR;Mirkin,CA.“在金纳米颗粒尺寸范围内使DNA负载最大化(Maximizing DNA Loading on a Range of Gold Nanoparticle Sizes)”.《分析化学(Anal Chem)》杂志2006,78(24),8313–8318.https://doi.org/10.1021/ac0613582。
4.Corman VM,Landt O,Kaiser M,Molenkamp R,Meijer A,Chu DKW等人.实时荧光RT-PCR检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)(Detection of 2019novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR).《欧洲检测(Euro Surveill.)》杂志.2020;25(3):2000045.https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
5.Hofmann等人《病毒学杂志(J Virol)》64;4108-4114
6.Moitra G等人.《N基因靶向反义寡核苷酸包裹的等离子体纳米颗粒介导的选择性肉眼检测SARS-CoV-2(Selective naked-eye detection of SARS-CoV-2mediated by Ngene targeted antisense oligonucleotide capped plasmonic nanoparticles)》.《ACS纳米(ACS Nano)》2020;14,6,7617-7627.
7.Dinnes J,Deeks JJ,Berhane S,Taylor M,Adriano A,Davenport C,DittrichS,Emperador D,Takwoingi Y,Cunningham J,Beese S,Domen J,Dretzke J,Ferrante diRuffano L,Harris IM,Price MJ,Taylor-Phillips S,Hooft L,Leeflang MMG,McInnesMDF,Spijker R,Van den Bruel A.《用于诊断SARS-CoV-2感染的快速即时抗原和分子检测(Rapid,point-of-care antigen and molecular-based tests for diagnosis of SARS-CoV-2infection)》.《Cochrane系统评价数据库(Cochrane Database of SystematicReviews)》2021,第3期.Art.No.:CD013705.DOI:10.1002/14651858.CD013705.pub2
8.Miller,B.S.,Bezinge,L.,Gliddon,H.D.等人.《用于超灵敏诊断的自旋增强纳米金刚石生物传感(Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitivediagnostics)》.《自然(Nature)》杂志587,588–593(2020).https://doi.org/10.1038/s41586-020-2917-1.
9.Torres Sangiao E,Holban AM,Gestal MC.《纳米金刚石在感染性疾病检测和治疗中的应用(Applications of Nanodiamonds in the Detection and Therapy ofInfectious Diseases)》.《材料(Materials)》杂志.2019;12(10):1639.https://doi.org/10.3390/ma12101639.
10.Chao JI,Perevedentseva E,Chung PH,Liu KK,Cheng CY,Chang CC,ChengCL.《纳米金刚石颗粒作为生物标记的探针(Nanometer-sized diamond particle as aprobe for biolabeling)》.《生物物理杂志(Biophys J.)》2007年9月15日;93(6):2199-208.doi:10.1529/biophysj.107.108134.
Claims (53)
1.一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的方法,其中所述靶向核酸分析物包括至少第一靶向序列、第二靶向序列和第三靶向序列,这些靶向序列是间隔开的或者连续且不重叠的,所述方法包含:
a)提供寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群,所述群至少包含与所述第一靶向序列杂交的第一寡核苷酸探针、与所述第二靶向序列杂交的第二寡核苷酸探针以及与所述第三靶向序列杂交地第三寡核苷酸探针;以及
b)使包含所述样品的溶液与所述纳米颗粒群接触,其中所述寡核苷酸探针序列与靶向序列之间的多个特异性结合事件引起纳米颗粒团聚,由此引起溶液产生依赖
于靶向核酸分析物的看得见的颜色变化。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述纳米颗粒群包含至少三种、至少四种或者至少五种类型的纳米颗粒,其中每种类型的纳米颗粒是利用多个拷贝的一种类型的寡核苷酸探针而功能化的。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述纳米颗粒群包含多种不同类型的纳米
颗粒,每一种是利用多个拷贝的至少三种类型的寡核苷酸探针中的任一种而功能化的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒群是利用至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或至少25种类型的寡核苷酸探针而功能化的,所述寡核苷酸探针与靶向分析物中的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24或至少25种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒群是利用与所述靶向分析物中的10种相应的间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列结合的10
种类型的寡核苷酸探针而功能化的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述寡核苷酸探针中的一个或多个优选与其所杂交的靶向序列互补或者包含一至三个碱基错配。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中靶向物与总纳米颗粒的摩尔比选择为允许靶向特异性的纳米颗粒团聚。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向物与总纳米颗粒的
摩尔比在1至0.001的范围。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包含片段化步骤,在该步骤中将所述靶向核酸分析物断裂成两个或多个片段。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述片段化步骤包含对样品超声处理一段时间。
11.根据权利要求10所述的方法,其中超声处理的时间为至少10秒、至少30秒或者至少60秒。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向分析物包含病毒RNA。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向分析物包含病毒基
因组RNA、病毒亚基因组mRNA或者病毒mRNA。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向分析物包含SARS-CoV-2RNA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向分析物包含SARS-CoV-2的E蛋白和/或N蛋白的基因组序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶向分析物包含SARS-CoV-2的E基因和/或N基因的sgmRNA。
17.根据权利要求14所述的方法,其中所述探针序列选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
18.根据权利要求14所述的方法,其中所述探针序列选自SEQ ID NO:11、SEQ
ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
19.根据权利要求14所述的方法,其中所述探针序列选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒具有包含金属或金刚石的核。
21.根据权利要求20所述的方法,其中包含金属的所述核包含金或银。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒是球体、非球体、椭球或双锥体。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述纳米颗粒的直径为13nm至65nm。
24.根据权利要求18所述的方法,其中所述纳米颗粒的平均直径为20nm至60nm,任选地其中所述纳米颗粒的平均直径为约30nm。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述探针包含DNA或者非天然核酸或者肽核酸(PNA)。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述探针包含锁核酸(LNA)、2'-H核酸、2'-OMe核酸或2'-F核酸。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中纳米颗粒-探针连接位于寡核苷酸探针的5'端。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述探针包含与纳米颗粒表面的巯基连接。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述探针包含C6-巯基5'连接。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述探针序列包含10至100个核苷酸,任选12至30个核苷酸。
31.根据权利要求30所述的方法,所述探针序列的靶向序列杂交部分包含20个核苷酸。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述探针在探针序列的靶向序列杂交部分上游包含核苷酸尾。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述核苷酸尾包含10个核苷酸。
34.根据权利要求32或33所述的方法,其中所述核苷酸尾包含poly-T序列、任选T10序列。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中当所述探针与所述靶向分析物的所述靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为5nm至30nm。
36.根据权利要求35所述的方法,其中当所述探针与所述靶向分析物的靶向序列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为10nm至18nm。
37.根据权利要求35所述的方法,其中当所述探针与所述靶向分析物的靶向序
列杂交时,相邻纳米颗粒之间的间距为12nm。
38.据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包含添加十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K的步骤。
39.根据权利要求35所述的方法,其中SDS的终浓度为至少0.5%。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包含添加额外的盐的步骤(c)。
41.前述权利要求中任一项所述的方法在低于45℃下进行。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述方法不涉及添加RNA酶。
43.一种寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群,其至少包含至少与靶向核酸分析物中的第一、第二和第三间隔开的或者连续且不重叠的靶向序列杂交的第一、第二和第三寡核苷酸探针。
44.权利要求43所述的寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群在权利要求1至42中任一项中所限定的方法中的用途。
45.根据权利要求43或44所述的寡核苷酸探针功能化的纳米颗粒群,其中所述纳米颗粒是按照权利要求1至42中任一项中那样所限定的。
46.一种用于检测样品中的靶向核酸分析物的试剂盒,所述试剂盒包含:
权利要求43至45中任一项中所限定的纳米颗粒群;
用于容纳溶液的反应容器,所述反应容器至少包含壁部和能密封的开口,其中可见光能够穿过所述壁部的至少一部分和/或所述能密封的开口;以及
用于进行权利要求1至42中任一项的方法的一种或多种试剂或溶液。
47.根据权利要求46所述的试剂盒,其进一步包含一种或多种用于从样品中分离靶向核酸的试剂或溶液。
48.根据权利要求46或47所述的试剂盒,其进一步包含与检测出靶向核酸分析物阳性时预期的颜色变化相对应的颜色基准。
49.一种用于检测样品中靶向核酸分析物存在情况的装置,所述装置包含:
用于接收样品的进样口,
用于使样品经过所述进样口而到达预先装有一组试剂的储存室的通道,
其中所述试剂包含权利要求43至45中所限定的所述纳米颗粒群,
以及包含颜色基准的检测窗,
其中,在使用中,所述样品与所述储存室中的试剂接触,使得检测出靶向核酸分析物阳性时引起通过所述检测窗看得见的颜色基准中的预期颜色变化。
50.根据权利要求49所述的装置,其中所述样品是唾液样品。
51.根据权利要求49至50所述的装置,其进一步包含盖构件。
52.根据权利要求51所述的装置,其中所述盖构件可以包含NaCl,使得在关上所述盖构件时,NaCl被添加到所述储存室中。
53.权利要求中任一项所述的装置在权利要求1至42中任一项中所限定的方法中的用途。
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