JP2023544822A - Ｉ型ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポザーゼシステム - Google Patents

Ｉ型ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポザーゼシステム Download PDF

Info

Publication number
JP2023544822A
JP2023544822A JP2023521484A JP2023521484A JP2023544822A JP 2023544822 A JP2023544822 A JP 2023544822A JP 2023521484 A JP2023521484 A JP 2023521484A JP 2023521484 A JP2023521484 A JP 2023521484A JP 2023544822 A JP2023544822 A JP 2023544822A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
sequence
cas
composition
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023521484A
Other languages
English (en)
Inventor
フェン チャン
諒 齋藤
ジョナサン ストレッカー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute of Technology filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Publication of JP2023544822A publication Critical patent/JP2023544822A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steering Control In Accordance With Driving Conditions (AREA)
  • Automatic Cycles, And Cycles In General (AREA)
  • Amplifiers (AREA)

Abstract

標的遺伝子修飾、標的挿入、遺伝子転写産物の摂動、及び核酸編集のためのシステム及び方法。新規の核酸標的化システムは、１つ以上のトランスポザーゼの構成要素と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つ以上の構成要素と、転位性エレメントとを含むことができる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６３／０８９，２２０号（２０２０年１０月８日出願）の利益を主張する。上記の参照出願の内容全体は、参照により本明細書に完全に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表（名称ＢＲＯＤ－５１８５ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０２１年１０月８日作成、サイズ５２３，１２２バイト（ディスク上では５２４ＫＢ））を含む。配列表の内容は、全体として本明細書に援用される。
本明細書で開示する主題は、概して、標的遺伝子修飾、標的挿入、遺伝子転写産物の摂動、及び核酸編集に使用される組成物及び方法を対象とする。新規の核酸標的化システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短回文リピート）システムの構成要素及び転位性エレメントを含む。
近年のゲノムシークエンシング技法及び解析方法の進歩により、様々な生体機能及び疾患に関連する遺伝子因子をカタログ化及びマッピングする能力が著しく加速している。個々の遺伝子エレメントを選択的に摂動させることによって原因の遺伝子バリエーションの系統的リバースエンジニアリングを可能にするには、また合成生物学、バイオテクノロジー、及び医学の用途を発展させるには、的確なゲノム標的化技術が必要となる。ゲノム編集技法（例えば、ジンクフィンガー、転写活性化物質様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼ）は、標的化されたゲノム摂動をもたらすために利用可能であるものの、新規の戦略及び分子機構を用いる、そして価格が手頃であり、設定が容易であり、スケーラブルであり、真核生物ゲノム内の複数の位置を標的とするのに適している、新たなゲノム操作技術が、依然として必要とされている。これは、ゲノム操作及びバイオテクノロジーでの新たな用途における主要なリソースをもたらすことになるであろう。
細菌及び古細菌の適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タンパク質組成、ゲノム座位構造、及びシステム機能に極端な多様性を示し、ＣＲＩＳＰＲ様構成要素を含むシステムは広く行き渡っており、継続的に発見されている。新規のマルチサブユニットエフェクター複合体及びシングルサブユニットエフェクターモジュールは、強力なゲノム操作ツールとして開発され得る。
本出願における任意の文書の引用または特定は、このような文書が本発明の先行技術として利用可能であることの容認にはならない。
１つの実施形態において、本開示は、操作された組成物であって、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、ガイド分子であって、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、当該ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することが可能なガイド分子とを含む、組成物を提供する。
１つの実施形態において、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤのうちの１つ以上を含む。１つの実施形態において、１つ以上のＴｎ７トランスポザーゼは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤを含む。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８のうちの１つ以上を含む。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ７を含む。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムの構成要素は、表７～４５のポリヌクレオチドによってコードされる。
１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を欠いている。１つの実施形態において、組成物はさらに、ドナーポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは異種ドナーポリヌクレオチドである。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドインサート、左エレメント配列、及び右エレメント配列を含む。
１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、標的ポリヌクレオチドの未成熟終止コドンを補正する、スプライシング部位を破壊する、スプライシング部位を修復する、またはこれらの組合せを行う。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドによって導入される１つ以上の変異は、置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む。１つの実施形態において、１つ以上の変異は、標的ポリヌクレオチド上のオープンリーディングフレームのシフトを引き起こす。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、１００塩基～３０ｋｂの長さである。１つの実施形態において、組成物はさらに、標的化部分を含む。１つの実施形態において、組成物は、ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と１つ以上の標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することが可能な複数のガイド分子を含む。１つの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは真核細胞内にある。
１つの実施形態において、本開示は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、ガイド分子であって、当該１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、当該ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能なガイド分子とをコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物はさらに、ドナーポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドインサート、左エレメント配列、及び右エレメント配列を含む。１つの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、本明細書の構成要素（ａ）～（ｄ）をコードする。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及び／またはＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ７を含む。１つの実施形態において、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは表７～表４５から選択される。
１つの実施形態において、本開示は、本明細書の１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。１つの実施形態において、本開示は、本明細書のシステムまたは本明細書のベクターを含む、操作された細胞を提供する。１つの実施形態において、細胞は、内在性または非内在性の生物学的産物または化学化合物を産生及び／または分泌する。１つの実施形態において、生物学的産物はタンパク質またはＲＮＡである。
１つの実施形態において、本開示は、本明細書の操作された細胞及びその後代を含む細胞株を提供する。１つの実施形態において、本開示は、本明細書の操作された細胞及びその後代を含む、植物または動物を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書の操作された細胞を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物は、治療薬として使用するために製剤化される。
１つの実施形態において、本開示は、本明細書の操作された細胞によって産生される生物学的産物または化学化合物を提供する。１つの実施形態において、本開示は、本明細書の組成物を用いて操作されている、操作された細胞またはその後代を提供する。１つの実施形態において、細胞またはその後代は単離されている。１つの実施形態において、細胞またはその後代はさらに、治療薬として使用される。１つの実施形態において、細胞またはその後代は、産物が単離されたものである。
１つの実施形態において、本開示は、本明細書の細胞またはその後代によって産生される産物を提供する。１つの実施形態において、産物はタンパク質またはＲＮＡである。１つの実施形態において、タンパク質は変異を含む。
別の態様において、本開示は、疾患または障害の治療のための医薬組成物であって、本明細書の細胞またはその後代を含む、医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、治療は、１つ以上の細胞における遺伝子変化をもたらす。１つの実施形態において、治療は、１つ以上の欠陥遺伝子型の補正をもたらす。１つの実施形態において、治療は、表現型の改善をもたらす。１つの実施形態において、細胞は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質における変異を含む。１つの実施形態において、細胞は、標的配列を含むゲノム領域の欠失を含む。１つの実施形態において、細胞は、相同組換え修復による外来性配列の統合を含む。１つの実施形態において、細胞は、標的配列に関連する遺伝子の転写の減少を含む。１つの実施形態において、細胞は、標的配列に関連する遺伝子の転写の増加を含む。１つの実施形態において、産物は、変異タンパク質または鋳型によってもたらされる産物である。
１つの実施形態において、本開示は、細胞内の標的ポリヌクレオチドにドナーポリヌクレオチドを挿入する方法であって、細胞に、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、当該Ｉ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能なガイド分子と、ドナーポリヌクレオチドとを導入することを含む、方法を提供する。
１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、標的ポリヌクレオチドの未成熟終止コドンを補正する、スプライシング部位を破壊する、スプライシング部位を修復する、またはこれらの組合せを行う。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドによって導入される１つ以上の変異は、置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む。１つの実施形態において、１つ以上の変異は、標的ポリヌクレオチド上のオープンリーディングフレームのシフトを引き起こす。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、１００塩基～３０ｋｂの長さである。１つの実施形態において、構成要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の１つ以上は、調節配列に作用可能に連結した核酸から発現する。１つの実施形態において、構成要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のうちの１つ以上が粒子内に導入される。
１つの実施形態において、粒子はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む。１つの実施形態において、細胞は原核細胞である。１つの実施形態において、細胞は真核細胞である。１つの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である。１つの実施形態において、細胞は植物細胞である。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドを細胞内の標的ポリヌクレオチド内に挿入することで、１つ以上の遺伝子産物の発現レベル改変を含む細胞または細胞集団や、内在性または非内在性の生物学的産物または化学化合物を産生及び／または分泌する細胞または細胞集団が得られる。
例示的な実施形態のこれら及び他の態様、目的、特徴、及び利点は、以下に示す例示的な実施形態の詳細な説明を検討すれば、当業者には明らかになるであろう。
本発明の特徴及び利点については、本発明の原理を利用することができる例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付図面を参照することによって理解されるであろう。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）でタグ付けした１－Ｆ型遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入したドナー及び標的プラスミドとともに用いたトランスポジション実験を示している。
本明細書の図面は、単に説明の目的で示すものであり、必ずしも縮尺通りに描かれているわけではない。
全般的な定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語及び技法の定義については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８刊）（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４刊）（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５刊）（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出すことができる。
本明細書で使用する場合、文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数及び複数のいずれの指示対象も含む。
「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、その後に記載される事象または状況または置換基が生じても生じなくてもよいことを意味し、またその記載が、当該事象または状況が生じる場合と生じない場合とを含むことを意味する。
両端値による数値範囲の記載は、記載された端点だけでなく、それぞれの範囲内に包含される全ての数値及び端数を含む。
本明細書で使用する参照数値及びその文法的等価物に関連する「約」という用語は、数値自体と、その数値からプラスマイナス１０％の範囲の値とを含むことができる。例えば、「約１０」という量は、１０及び９から１１までの任意の量を含む。例えば、参照数値に関する「約」という用語も、その数値からプラスマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「生物学的試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞細片を含むことができる。生物学的試料は、「体液」を含む（またはそれに由来する）ことができる。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ、ペリリンパ、滲出液、糞便、女性射精液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻汁及び痰を含む）、心膜液、腹膜液、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、喀痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、吐物、ならびにこれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生物学的試料は、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物を含む。体液は、例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順により、哺乳類生物から得ることができる。
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指すように互換的に使用される。哺乳類としては、限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、及びペットが挙げられる。また、ｉｎ ｖｉｖｏで得られた、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの後代も包含される。
「例示的」という用語は、本明細書では、例、事例、または例示として機能することを意味するように使用される。本明細書で「例示的」として記載される任意の態様または設計は、必ずしも他の態様または設計よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきものとは限らない。「例示的な」という語の使用は、概念を具体的に提示することが意図されている。
ある種に由来するタンパク質または核酸とは、その種における内在性のタンパク質もしくは核酸またはその一部と同一の配列を有することを意味する。種に由来するタンパク質または核酸は、その種の生物から直接（例えば、単離によって）得てもよく、または、例えば組換え産生もしくは化学合成により、産生してもよい。
様々な実施形態について以下で説明する。具体的な実施形態は、本明細書で論じる広範な態様に対する網羅的な説明としても制限としても意図されていないことに留意されたい。特定の実施形態と組み合わせて説明されている１つの態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、他の任意の実施形態（複数可）とともに実施することができる。本明細書全体において「１つの（ｏｎｅ）実施形態」、「１つの（ａｎ）実施形態」、「１つの例示的な実施形態」と言及された場合、その実施形態に関して説明されている特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体において、様々な箇所で「１つの（ｏｎｅ）実施形態において」、「１つの（ａｎ）実施形態において」、または「１つの例示的な実施形態」という表現が出現した場合、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らないが、その可能性もある。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、当業者には本開示から明らかとなるであろうように、１つ以上の実施形態で任意の好適な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含み、他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内にあることが意図されている。例えば、添付の請求項において、任意の特許請求される実施形態を任意の組合せで使用することができる。
本明細書で引用される全ての刊行物、公開された特許文献、及び特許出願は、個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が、参照により援用されるものとして具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
概要
本開示は、操作された核酸の編集システムと、ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド内の所望の位置に挿入するための方法とを提供する。システム及び方法を使用して、真核細胞（例えば、ヒト細胞）のゲノム内に１つ以上のドナーポリヌクレオチドを挿入することができる。
概して、システムは、１つ以上のトランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、配列特異的ヌクレオチド結合システムの１つ以上の構成要素と（例えば、Ｃａｓタンパク質と、ガイド分子と）を含む。１つの実施形態において、システムはさらに、１つ以上のＣａｓ関連トランスポザーゼ（例えば、Ｃａｓ関連Ｔｎ７トランスポザーゼ）を含む。１つの実施形態において、システムは、１つ以上のＴｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上のＩ型（例えば、Ｉ－Ｆ型）Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能なガイド分子とを含む。１つの実施形態において、システムはさらに、標的ポリヌクレオチド（例えば、真核細胞のゲノム）内の１つ以上の位置に挿入される１つ以上のドナーポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは異種ドナーポリヌクレオチドであり得る。
１つの実施形態において、本開示は、このような核酸標的化システムをコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを含むベクターシステムと、当該ベクターシステムにより生成された１つ以上の細胞と、当該システム及び方法を使用する方法とを提供する。
システム及び組成物
１つの実施形態において、本開示は、１つ以上のトランスポザーゼと、ヌクレオチド結合分子（例えば、ヌクレオチド結合タンパク質）とを含むシステムを提供する。ヌクレオチド結合タンパク質は配列特異的であり得る。当該システムはさらに、１つ以上のトランスポゾン構成要素を含むことができる。１つの実施形態において、システムは、配列特異的ヌクレオチド結合システムと会合する（例えば、連結する、結合する、または他の形で複合体を形成することが可能な）１つ以上のトランスポザーゼを含む。１つの実施形態において、１つ以上のトランスポザーゼ及び配列特異的ヌクレオチド結合システムは、共制御または発現によって会合する。他の例示的な実施形態において、トランスポザーゼ（複数可）及び配列特異的ヌクレオチド結合システムは、配列特異的ヌクレオチド結合ドメインがトランスポザーゼ（複数可）を挿入部位に誘導または動員する能力によって会合し、その部位で、トランスポザーゼ（複数可）は、標的ポリヌクレオチド配列内へのドナーポリヌクレオチドの挿入を誘導する。
配列特異的ヌクレオチド結合システムは、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくはその機能的フラグメント、及び／または配列特異的ＲＮＡ結合タンパク質もしくはその機能的フラグメントであり得る。１つの実施形態において、配列特異的ヌクレオチド結合構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、機能的フラグメント、これらのバリアント、これらの任意の組合せであり得る。したがって、当該システムは、ヌクレオチド結合構成要素と、トランスポザーゼとを含むと考えることもできる。参照を容易にするため、さらなる例示的な実施形態は、例示的なＣａｓ関連トランスポザーゼシステムの文脈で論じられる。
１つの実施形態において、システムは、操作された組成物であって、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上のＣａｓタンパク質と、ガイド分子であって、Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、当該ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能なガイド分子とを含む、組成物であり得る。
トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、本明細書のＣａｓタンパク質と相互作用することができる。１つの実施形態において、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｃａｓタンパク質のＮ末端と相互作用する。１つの例示的な実施形態において、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端と相互作用する。１つの例示的な実施形態において、トランスポザーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｃａｓタンパク質のＮ末端とＣ末端との間のフラグメントと相互作用する。
異種構成要素
１つの実施形態において、システム内の構成要素は異種であり得る。すなわち、これらは、同じ細胞または生物内で天然には一緒に存在しない。
１つの実施形態において、システムは、１つ以上の異種ガイド分子を含む。異種ガイド分子は、システム内のＣａｓタンパク質、トランスポザーゼ、またはドナーポリヌクレオチドと同じ細胞または生物内に天然には存在しないことがある。このようなガイド分子は、ガイド分子の残りの部分と同じ分子内に天然に存在しない異種ガイド配列を含むことができる。１つの実施形態において、ガイド分子は自然界に存在しないことがある。
１つの実施形態において、システムは、１つ以上の異種ドナーポリヌクレオチドを含むことができる。異種ドナーポリヌクレオチドは、システム内のＣａｓタンパク質、トランスポザーゼ、またはガイド分子と同じ細胞または生物内に天然には存在しないことがある。このようなドナーポリヌクレオチドは、ガイド分子の残りの部分と同じ分子内に天然には存在しない異種挿入配列を含むことがある。１つの実施形態において、異種ドナーポリヌクレオチドは自然界に存在しないことがある。
代替的または追加的に、システムは、異種Ｃａｓタンパク質及び／またはトランスポザーゼを含む。
トランスポゾン及びトランスポザーゼ
本明細書で開示するシステムは、トランスポゾンの１つ以上の構成要素及び／または１つ以上のトランスポザーゼを含むことができる。本明細書のシステムにおけるトランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（本明細書ではＣａｓ関連トランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質（ＣＡＳＴとも称され）とも互換的に使用される）またはその機能的フラグメントとすることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の配列特異的結合によって標的ポリヌクレオチドの領域に誘導または動員することができる任意のトランスポザーゼを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける１つ以上の構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質、ガイド分子など）と会合する（例えば、複合体を形成する）任意のトランスポザーゼを含むことができる。１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける１つ以上の構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質、ガイド分子など）と（例えば、リンカーによって）融合または繋留することができる。
本明細書で使用する場合、「トランスポゾン」という用語は、トランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素が認識することができ、トランスポジションが可能な機能的核酸－タンパク質複合体（例えば、トランスポソーム、またはトランスポゾン複合体）の構成要素である、ポリヌクレオチド（または核酸セグメント）を指す。本明細書で使用する場合、「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポジションが可能な機能的核酸－タンパク質複合体の構成要素であり、かつトランスポジションを媒介する酵素を指す。トランスポザーゼは、単一のタンパク質を含むこともあれば、複数のタンパク質サブユニットを含むこともある。トランスポザーゼは、トランスポゾン末端またはトランスポゾン末端配列と機能的な複合体を形成可能な酵素であり得る。また、「トランスポザーゼ」という用語は、１つの実施形態ではインテグラーゼを指すこともある。本明細書で使用する「トランスポジション反応」という表現は、トランスポザーゼがドナーポリヌクレオチド配列を標的ポリヌクレオチド上の挿入部位内にまたはそれに隣接して挿入する際の反応を指す。挿入部位は、トランスポザーゼによって認識される配列もしくは二次構造、及び／またはトランスポザーゼが、ドナーポリヌクレオチド配列に挿入され得る標的ポリヌクレオチドのねじれ形（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）中断を切断または作成する際の挿入モチーフ配列を含むことができる。「トランスポザーゼ」という用語は、完全長のトランスポザーゼタンパク質、またはトランスポザーゼ活性を有する完全長のトランスポザーゼのフラグメントを指すことができる。トランスポジション反応における例示的な構成要素としては、挿入されるドナーポリヌクレオチド配列を含むトランスポゾン、及びトランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素が挙げられる。本明細書で使用する場合、「トランスポゾン末端配列」という用語は、トランスポゾンの遠位端にあるヌクレオチド配列を指す。トランスポゾン末端配列は、トランスポジションのためのドナーポリヌクレオチドを特定する役割を担うことができる。トランスポゾン末端配列は、トランスポゾーム複合体を形成しトランスポジション反応を実施するために転位酵素が使用するＤＮＡ配列であり得る。
トランスポゾンは、様々な調節機構を用いて、トランスポジションを低頻度に維持し、場合によってトランスポジションを様々な細胞プロセスと協調させる。一部の原核生物のトランスポゾンは、宿主に利益をもたらすか、または別の形でエレメントの維持に役立つ機能を動員することができる。
１つの実施形態において、システムは１つ以上のＴｎ７トランスポザーゼを含む。１つの実施形態において、３つのトランスポゾンコードタンパク質：ヘテロメリックトランスポザーゼ（ＴｎｓＡ及びＴｎｓＢ）ならびに調節物質タンパク質（ＴｎｓＣ）が、Ｔｎ７の中心的なトランスポジション機構を形成する。Ｔｎ７エレメントは、中心的なＴｎｓＡＢＣトランスポジションタンパク質に加えて、専用の標的部位選択タンパク質ＴｎｓＤ及びＴｎｓＥをコードする。ＴｎｓＡＢＣと連携して、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質ＴｎｓＤは、トランスポジションを「Ｔｎ７付着部位」（ａｔｔＴｎ７）と称される保存された部位内に誘導する。ＴｎｓＤは、大きなタンパク質ファミリーのメンバーであり、他のタイプの細菌性トランスポゾンに見出されるタンパク質ＴｎｉＱもこのファミリーに含まれる。ＴｎｉＱは、プラスミドの分解部位へのトランスポジションを標的とすることが示されている。本明細書で使用する場合、ＴｎｉＱトランスポザーゼはＴｎｓＤトランスポザーゼであり得る。
Ｔｎ７トランスポザーゼの例としては、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、ＴｎｉＱ、ＴｎｓＤ、及びＴｎｓＥが挙げられる。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及び／またはＴｎｉＱを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及び／またはＴｎｓＤ（例えば、ＴｎｓＤ２）を含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｉＱ（例えば、ＴｎｉＱ２）を含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤ（例えば、ＴｎｓＤ２）を含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｓＡを含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｓＡ（例えば、２つのＴｎｓＡ）を含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｓＢ（例えば、２つのＴｎｓＢ）を含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｓＣ（例えば、２つのＴｎｓＣ）を含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｓＤ（例えば、２つのＴｎｓＤ）を含む。１つの実施形態において、システムは、２つ以上のＴｎｉＱ（例えば、２つのＴｎｉＱ）を含む。ＴｎｉＱまたはＴｎｓＤは、ＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｎｉＱまたはＴｎｓＤのＣ末端にあってもよい。１つの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｎｉＱまたはＴｎｓＤのＮ末端にあっても、Ｎ末端とＣ末端との間にあってもよい。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及び１つのみのＴｎｉＱまたはＴｎｓＤを含み、例えば、このようなＴｎｉＱまたはＴｎｓＤはＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。特定の例において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤ１を含む。別の例において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤ２を含む。別の例において、システムは、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、ＴｎｓＤ１、及びＴｎｓＤ２を含む。システム内の２つ以上の構成要素が、単一のタンパク質（例えば、融合タンパク質）内に含まれてもよい。例えば、ＴｎｓＡ及びＴｎｓＢは、単一のタンパク質に含まれてもよい。Ｔｎ７トランスポザーゼの例としてはさらに、Ｐｅｔｅｒｓ ＪＥ ａｎｄ Ｃｒａｉｇ ＮＬ，Ｔｎ７：ｓｍａｒｔｅｒ ｔｈａｎ ｗｅ ｔｈｏｕｇｈｔ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｎｏｖ；２（１１）：８０６－１４（参照により全体として本明細書に援用される）に記載のものが挙げられる。
本明細書における「Ｔｎ７トランスポゾン」または「Ｔｎ７トランスポザーゼ」という用語は、「Ｔｎ７様トランスポゾン」または「Ｔｎ７様トランスポザーゼ」も包含する。
１つの実施形態において、システムは、Ｔｎ７トランスポザーゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＢをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＣをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＤをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｓＥをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、ＴｎｉＱをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。システムは、同じタイプのトランスポザーゼをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｓＡ（同じまたは異なるＴｎｓＡ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｓＢ（同じまたは異なるＴｎｓＢ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｓＣ（同じまたは異なるＴｎｓＣ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｓＤ（同じまたは異なるＴｎｓＤ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｓＥ（同じまたは異なるＴｎｓＥ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１つの例において、システムは、ＴｎｉＱ（同じまたは異なるＴｎｉＱ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で使用する場合、右端の配列エレメントまたは左端の配列エレメントは、例示的なＴｎ７トランスポゾンを参照して作製される。カノニカルＴｎ７の左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）の配列エレメントの一般的な構造は確立されている。Ｔｎ７末端は、一連の２２ｂｐのＴｎｓＢ結合部位を含む。最も遠位のＴｎｓＢ結合部位に隣接しているのは、５’－ＴＧＴ－３’／３’－ＡＣＡ－５’で終わる８ｂｐの末端配列である。Ｔｎ７の右端は、約９０ｂｐの右端エレメント内に重複する４つのＴｎｓＢ結合部位を含む。左端は、約１５０ｂｐの左端エレメント内に分散する３つのＴｎｓＢ結合部位を含む。ＴｎｓＢ結合部位の数及び分布は、Ｔｎ７エレメントの間で異なり得る。Ｔｎ７関連エレメントの末端配列は、直接的に繰り返される５ｂｐ標的部位重複、末端８ｂｐ配列、及び２２ｂｐ ＴｎｓＢ結合部位を特定することによって決定することができる（Ｐｅｔｅｒｓ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。例示的なＴｎ７エレメント（右端配列エレメント及び左端配列エレメントを含む）としては、Ｐａｒｋｓ ＡＲ，Ｐｌａｓｍｉｄ，２００９ Ｊａｎ；６１（１）：１－１４に記載のものが挙げられる。
本明細書のトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ７）は、野生型トランスポザーゼ、そのバリアント、その機能的フラグメント、及びこれらの任意の組合せを含む。
ドナーポリヌクレオチド
本明細書で開示するシステムは、（例えば、標的ポリヌクレオチド内に挿入するための）１つ以上のドナーポリヌクレオチドを含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に挿入または統合することができる転位性エレメントに相当するものとすることができる。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、挿入されるべきポリヌクレオチドと、左エレメント配列と、右エレメント配列とを含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、トランスポゾンの１つ以上の構成要素であるか、またはそれを含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、任意のタイプのポリヌクレオチド（限定されるものではないが、遺伝子、遺伝子フラグメント、非コードポリヌクレオチド、調節ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドなどを含む）とすることができる。
標的ポリヌクレオチドはＰＡＭ配列を含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのＰＡＭ配列の上流または下流に挿入することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼの場合、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド上のＰＡＭ配列から１０塩基～２００塩基の位置、例えば、２０塩基～１５０塩基、３０塩基～１００塩基、４５塩基～７０塩基、４５塩基～６０塩基、５５塩基～７０塩基、４９塩基～５６塩基、または６０塩基～６６塩基の位置に挿入することができる。１つの実施形態において、挿入は、ＰＡＭ配列の上流の位置にある。１つの実施形態において、挿入は、ＰＡＭ配列の下流の位置にある。１つの実施形態において、挿入は、ＰＡＭ配列から下流の４９～５６塩基または塩基の位置にある。１つの実施形態において、挿入は、ＰＡＭ配列から下流の６０～６６塩基または塩基の位置にある。
ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの編集に使用することができる。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド内に導入される１つ以上の変異を含む。このような変異の例としては、置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せが挙げられる。変異は、標的ポリヌクレオチド上のオープンリーディングフレームのシフトを引き起こし得る。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の終止コドンを改変する。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、未成熟終止コドンを補正することができる。この補正は、終止コドンを削除するか、または終止コドンに１つ以上の変異を導入することにより、達成することができる。他の例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、（例えば、ある特定の疾患文脈で生じ得る）機能喪失変異、欠失、または転座の対処を、遺伝子、またはその機能的フラグメント、または機能的調節配列、または調節配列の機能的フラグメントの機能的コピーを挿入または復元することによって行う。機能的フラグメントとは、野生型遺伝子または非コード調節配列（例えば、長鎖非コードＲＮＡをコードする配列）の機能性を回復するのに十分なヌクレオチド配列を提供することによって遺伝子の全コピー未満であるものを指す。１つの実施形態において、本明細書で開示するシステムを使用して、欠陥遺伝子またはその欠陥フラグメントの単一のアレルを置き換えることができる。別の例示的な実施形態において、本明細書で開示するシステムを使用して、欠陥遺伝子または欠陥遺伝子フラグメントの両方のアレルを置き換えることができる。「欠陥遺伝子」または「欠陥遺伝子フラグメント」とは、発現したときに、対応する野生型遺伝子の機能を有する機能的タンパク質または非コードＲＮＡを生成しない遺伝子または遺伝子の部分のことである。１つの実施形態において、これらの欠陥遺伝子は、１つ以上の疾患表現型に関連することがある。１つの実施形態において、欠陥遺伝子または遺伝子フラグメントは置き換えられないが、本明細書に記載のシステムを使用して、欠陥遺伝子発現を補正または無効化する遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするドナーのポリヌクレオチドを挿入し、欠陥遺伝子発現に関連する細胞表現型が排除されるか、または異なるもしくは望ましい細胞表現型に変化するようにする。したがって、ドナーポリヌクレオチドの挿入は、細胞または細胞集団内の標的ポリヌクレオチド内に挿入した場合、１つ以上の遺伝子産物の発現レベルを改変することもあれば、内在性または非内在性の生物学的産物または化学化合物の産生及びまたは分泌を可能にすることもある。
本発明の１つの実施形態において、ドナーは、限定されるものではないが、遺伝子または遺伝子フラグメント、発現されるべきコードタンパク質またはＲＮＡ転写産物、調節エレメント、修復鋳型などを含むことができる。本発明に従えば、ドナーポリヌクレオチドは、挿入を媒介するトランスポジション構成要素とともに機能する左端及び右端の配列エレメントを含むことができる。
諸実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド上のスプライシング部位を操作する。１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、スプライシング部位を破壊する。この破壊は、ポリヌクレオチドをスプライシング部位に挿入すること、及び／または１つ以上の変異をスプライシング部位に導入することにより、達成することができる。１つの例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、スプライシング部位を修復することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、スプライシング部位配列を含むことができる。
挿入されるべきドナーポリヌクレオチドのサイズは、１０塩基～５０ｋｂの長さ、例えば、５０～４０ｋｂ、１００～３０ｋｂ、１００塩基～３００塩基、２００塩基～４００塩基、３００塩基～５００塩基、４００塩基～６００塩基、５００塩基～７００塩基、６００塩基～８００塩基、７００塩基～９００塩基、８００塩基～１０００塩基、９００塩基～１１００塩基、１０００塩基～１２００塩基、１１００塩基～１３００塩基、１２００塩基～１４００塩基、１３００塩基～１５００塩基、１４００塩基～１６００塩基、１５００塩基～１７００塩基、６００塩基～１８００塩基、１７００塩基～１９００塩基、１８００塩基～２０００塩基、１９００塩基～２１００塩基、２０００塩基～２２００塩基、２１００塩基～２３００塩基、２２００塩基～２４００塩基、２３００塩基～２５００塩基、２４００塩基～２６００塩基、２５００塩基～２７００塩基、２６００塩基～２８００塩基、２７００塩基～２９００塩基、または２８００塩基～３０００塩基の長さとすることができる。
本明細書で開示するシステム内の構成要素は、その（例えば、トランスポザーゼ（複数可）の）ドナーポリヌクレオチドに対する結合親和性を改変する１つ以上の変異を含むことができる。１つの実施形態において、変異は、トランスポザーゼ（複数可）とドナーポリヌクレオチドとの間の結合親和性を増加させる。１つの例示的な実施形態において、変異は、トランスポザーゼ（複数可）とドナーポリヌクレオチドとの間の結合親和性を減少させる。変異は、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）の活性を改変することができる。
挿入は、核酸分子上のＣａｓ結合部位からのある位置で行うことができる。１つの実施形態において、挿入は、Ｃａｓ結合部位から３’側の位置、例えば、Ｃａｓ結合部位から３’側の少なくとも１ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも８５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも９５ｂｐ、または少なくとも１００ｂｐで行うことができる。１つの実施形態において、挿入は、Ｃａｓ結合部位から５’側の位置、例えば、Ｃａｓ結合部位から５’側の少なくとも１ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３５ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも５５ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも６５ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも７５ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも８５ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも９５ｂｐ、または少なくとも１００ｂｐで行うことができる。特定の例において、挿入は、Ｃａｓ結合部位から３’側の６５ｂｐで行うことができる。
１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、共統合機構を介して標的ポリヌクレオチドに挿入される。例えば、ドナーポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドは、ニッキング及び融合することができる。融合したドナーポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドの複製は、ポリメラーゼによって生成することができる。ある特定の場合には、ドナーポリヌクレオチドは、カットアンドペースト機構によって標的ポリヌクレオチドに挿入される。例えば、ドナーポリヌクレオチドを核酸分子内に含め、核酸分子内の別の位置で切り取り挿入することができる。
標的ポリヌクレオチドは、真核細胞内のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞内のゲノムに含まれるポリヌクレオチドであり得る。ゲノムは、核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、または葉緑体ゲノムであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
本明細書のシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つ以上の構成要素を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つ以上の構成要素は、システム内でヌクレオチド結合構成要素として機能することができる。ヌクレオチド結合分子は、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、Ｃａｓエフェクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素と互換的に使用される）、そのフラグメント、またはその変異形態であり得る。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性は、低下していても全くなくてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、不活性または死んだＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であってもよい。死んだＣａｓタンパク質は、１つ以上の変異または切断を含むことができる。１つの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上のクラスＩ（例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＶＩ型）またはクラス２（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。１つの実施形態において、配列特異的ヌクレオチド結合ドメインは、標的配列を含む標的部位にトランスポゾンを誘導し、トランスポザーゼは、標的部位でのドナーポリヌクレオチド配列の挿入を誘導する。１つの実施形態において、トランスポゾン構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を含む、それと会合する、またはそれと複合体化する。１つの例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素は、標的挿入部位にトランスポゾン構成要素及び／またはトランスポザーゼ（複数可）を誘導し、トランスポゾン構成要素は、標的核酸配列内へのドナーポリヌクレオチドの挿入を誘導する。
概して、本明細書及び諸文書（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７））で使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲシステムとは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現または活性の誘導に関与する転写産物及び他のエレメントを総称して指し、これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡもしくは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、または本明細書で用語が使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、ＣａｓをガイドするＲＮＡ（複数可）、例えば、Ｃａｓ９、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡもしくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ座位からの他の配列及び転写産物が含まれる。概して、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサーとも称される）によって特徴付けられる。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照。
１つの実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書で開示するエフェクタータンパク質複合体と目的の標的座位との結合を誘導する。１つの実施形態において、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態において、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であり得る。「ＰＡＭ」という用語は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」という用語と互換的に使用することができる。
１つの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識することができる。１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈ（Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＵ）である３’ＰＡＭを認識することができる。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含むことができる。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるまたはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。すなわち、標的ＲＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部とすることができ、これに対しｇＲＮＡの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｇＲＮＡとを含む複合体が媒介するエフェクター機能が誘導される。１つの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質内に位置する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質及びガイド分子を含むことができる。１つの実施形態において、システムは１つ以上のＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質は、１型Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質であり得る。
本明細書で開示するシステムとともに使用することができるＣａｓタンパク質の例としては、クラス１及びクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質が挙げられる。
１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、クラス１ Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）である。１つの実施形態において、クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓｃａｄｅ（ｃｒＲＮＡアレイを処理する３～５個のタンパク質からなる多量体複合体）と、Ｃａｓ３（標的ＤＮＡの分解を担うヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質）と、ｃｒＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ複合体を安定しＣａｓｃａｄｅ及びＣａｓ３をＤＮＡ標的に誘導する）とを含む。クラス１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、サブタイプ、例えば、Ｉ－Ａ型、Ｉ－Ｂ型、Ｉ－Ｃ型、Ｉ－Ｄ型、Ｉ－Ｅ型、Ｉ－Ｆ型、Ｉ－Ｕ型、ＩＩＩ－Ａ型、ＩＩＩ－Ｂ型、ＩＩＩ－Ｃ型、ＩＩＩ－Ｄ型、またはＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであってもよい。
クラス１Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを使用して、移動性遺伝子エレメントの標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）内へのＲＮＡ先導統合を触媒することができる。例えば、本明細書のシステムは、Ｃａｓｃａｄｅとトランスポゾンタンパク質との複合体を含むことができる。標的核酸の下流の所与の距離に、ドナー核酸（例えば、ＤＮＡ）を挿入することができる。挿入は、２つの可能な方向のうちの一方で行われ得る。このシステムを使用して、所望の長さの核酸配列を統合することができる。１つの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはヌクレアーゼ欠損である。１つの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。
クラス１ Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ３’、及び／またはＣａｓ３を含むことができる。Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）、及び／またはＣａｓ５を含むことができる。Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）、及び／またはＣａｓ７（Ｃｓｄ２）を含むことができる。Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ１、及び／またはＣａｓ６ｄを含むことができる。Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）、及び／またはＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）を含むことができる。Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）、及び／またはＣａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）を含むことができる。例示的なＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、ｃａｓ６、ｃａｓ７、及び天然のｃａｓ８－ｃａｓ５融合物（以下、単にｃａｓ８と称される）の３つの遺伝子によってコードされるＤＮＡ標的複合体Ｃａｓｃａｄｅ（別名Ｃｓｙ複合体）を挙げることができる。Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはさらに、４つのリピート及び３つのスペーサー配列を含むネイティブＣＲＩＳＰＲアレイを含むことができ、異なる成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（ガイドＲＮＡとも称される）をコードする。
さらなる例示的なＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ｆ、Ｃａｓ５ｆ、Ｃａｓ７ｆ、及びＣａｓ６ｆを含むカノニカル１－Ｆサブタイプシステムを挙げることができ、ここで、ｃａｓ５ｆ及びｃａｓ８ｆ遺伝子の各々は、自身のそれぞれのオープンリーディングフレームに含まれる（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１７），ＰＮＡＳ，Ｅ７３５８－Ｅ７３６６；ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０９０３５１１４）。１－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのバリアントが明らかになっている。例えば、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ株ＡＮＡ ３（Ｓｈｅｗａｎ３＿３８５２＿Ｓｈｅｗａｎ３＿３８５４）では、ｃａｓ８ｆ遺伝子はｃａｓ５ｆ１遺伝子と融合し、その下流にｃａｓ７ｆ１及びｃａｓ６ｆ遺伝子が続く（Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１８），ＣＲＩＳＰＲ Ｊ １（５），３２５－３３６）。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ＣＮ－３２（Ｓｐｕｔｃｎ３２＿１８１９＿Ｓｐｕｔｃｎ３２＿１８２３）では、１－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは，Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ７ｆ２、Ｃａｓ５ｆ２、及びｃａｓ６ｆから構成される（Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１８），ＣＲＩＳＰＲ Ｊ １（５），３２５－３３６）。本明細書で開示するＣａｓ５／Ｃａｓ８融合配列を表７～４５に示す。
１つの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、１つ以上の：（ａ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３”ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ａ型）；（ｂ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３”ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｂ型）；（ｃ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｃ型）；（ｄ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｄ型）；（ｅ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｅ型）；及び／または（ｆ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ６ｆポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びＣａｓ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｆ型）；を含むことができる。したがって、Ｉ型Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のＣａｓタンパク質のうちの１つ以上であり得る。
１つの実施形態において、１型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８のうちの１つ以上であり得る。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５及びＣａｓ６を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５及びＣａｓ７を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６及びＣａｓ７を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ７及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ７を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ６をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ７をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ８をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ７をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ８をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチド及びＣａｓ８をコードするポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチドとを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ８をコードするポリヌクレオチドとを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ８をコードするポリヌクレオチドとを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ８をコードするポリヌクレオチドとを含む。１つの実施形態において、システムは、Ｃａｓ５をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ６をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ７をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓ８をコードするポリヌクレオチドとを含む。本明細書のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８）は、野生型トランスポザーゼと、そのバリアントと、その機能的フラグメントとを含む。
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ構成要素の例としては、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７－７５に記載のものが挙げられる。
関連するクラス１のＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、ｃａｓ７ｆ、ｃａｓ８ｆをＣＲＩＳＰＲアレイとともに含むことができる。１つの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、ｃａｓ７ｆ、及びｃａｓ８ｆのうちの１つ以上を含む。例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、ｃａｓ７ｆ、及びｃａｓ８ｆを含む。ある特定の態様において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃａｓ８ｆ－ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、及びｃａｓ７ｆのうちの１つ以上を含む。例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃａｓ８ｆ－ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、及びｃａｓ７ｆを含む。本明細書で使用する場合、Ｃａｓ５６７８ｆという用語は、ｃａｓ５ｆ、ｃａｓ６ｆ、ｃａｓ７ｆ、及びｃａｓ８ｆを含む複合体を指す。
１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとすることができる。クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、サブタイプのものであってもよく、例えば、ＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型、Ｖ－Ｃ型、Ｖ－Ｕ型、ＶＩ－Ａ型、ＶＩ－Ｂ、またはＶＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの定義及び例示的なメンバーとしては、Ｋｉｒａ Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ ａｎｄ Ｅｕｇｅｎｅ Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ，Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７－７５；及びＳｅｒｇｅｙ Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７ Ｍａｒ；１５（３）：１６９－１８２に記載のものが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｋ、ｅｔｃ．）、Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ（例えば、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ１、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ２、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ３）、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄなど）、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはＣａｓタンパク質の操作された形態（例えば、不活性の（ｉｎｖｅｃｔｉｖｅ）死形態、ニッカーゼ形態）が挙げられる。
１つの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ欠損であり得る。ヌクレアーゼ欠損ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有しないことがある。ヌクレアーゼ欠損ヌクレアーゼは、ニッカーゼ活性を有することがある。
１つの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、上記のＣａｓタンパク質のオルソログまたはホモログであり得る。「オルソログ」及び「ホモログ」という用語は当技術分野で周知されている。さらなる指針により、本明細書で使用する場合、タンパク質の「ホモログ」とは、ホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を果たす同じ種のタンパク質のことである。ホモログタンパク質は、構造的に関連する場合もあるがそうである必要はなく、または一部のみ構造的に関連する。本明細書で使用する場合、タンパク質の「オルソログ」とは、オルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を果たす異なる種のタンパク質のことである。オルソログタンパク質は、構造的に関連する場合もあるがそうである必要はなく、または一部のみ構造的に関連する。
１つの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性を欠いている。このようなＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しない天然に存在するＣａｓタンパク質であってもよく、またはＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を低減もしくは除去する変異もしくは切断を有する操作されたＣａｓタンパク質であってもよい。
１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする核酸分子を用いて送達することができる。ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化ＣＲＩＳＰＲタンパク質であり得る。コドン最適化配列の一例は、この場合、真核生物（例えば、ヒト）内での発現に対し最適化された（すなわち、ヒト内での発現に対し最適化されている）配列、または本明細書で論じているような別の真核生物、動物、もしくは哺乳類のための配列である。例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照。
１つの実施形態において、本開示は、１つ以上の目的遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作用可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供または導入される、トランスジェニック細胞を含む。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓトランスジェニック細胞」という用語は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に統合している細胞（例えば、真核細胞）を指す。本発明に従えば、細胞の性質、タイプ、または起源は特に限定されない。また、Ｃａｓ導入遺伝子を細胞内に導入する方法は様々であり得、当技術分野で知られている任意の方法とすることができる。１つの実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離された細胞にＣａｓ導入遺伝子を導入することによって得られる。ある特定の他の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例としては、限定するものではないが、本明細書で言及されるＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック真核生物（例えば、Ｃａｓノックイン真核生物）に由来してもよい。ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７）を参照する（参照により本明細書に援用される）。Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に割り当てられた米国特許公開第２０１２００１７２９０号及び２０１１０２６５１９８号の、Ｒｏｓａ座位を標的とすることを対象とする方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを利用するように修正することができる。また、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに割り当てられた米国特許公開第２０１３０２３６９４６号の、Ｒｏｓａ座位を標的とすることを対象とする方法も、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを利用するように修正することができる。さらなる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて説明しているＰｌａｔｔら（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０－４５５（２０１４））を参照する（参照により本明細書に援用される）。Ｃａｓ導入遺伝子はさらに、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－ＰｏｌｙＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを含むことができ、これによりＣａｓ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能にする。代替的に、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離された細胞内にＣａｓ導入遺伝子を導入することによって得ることができる。導入遺伝子のための送達システムは、当技術分野で周知されている。例として、Ｃａｓ導入遺伝子は、本明細書の他の箇所にも記載されているように、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／または粒子及び／またはナノ粒子送達により、例えば真核細胞内に送達することができる。
当業者であれば、細胞（例えば、本明細書で言及するＣａｓトランスジェニック細胞）は、Ｃａｓを標的座位に誘導することが可能なＲＮＡと複合体化したときに、統合されたＣａｓ遺伝子またはＣａｓの配列特異的作用から生じる変異を有する以外に、さらなるゲノム改変を含み得ることを理解するであろう。
ガイドＲＮＡ（複数可）コード配列及び／またはＣａｓコード配列は、調節エレメント（複数可）に機能的または操作的に連結することができ、よって調節エレメント（複数可）は発現を駆動する。プロモーター（複数可）は、構成的プロモーター（複数可）及び／または条件的プロモーター（複数可）及び／または誘導的プロモーター（複数可）及び／または組織特異的プロモーター（複数可）であり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群より選択することができる。有利なプロモーターは、プロモーターＵ６である。
ガイド分子
本明細書のシステムは、１つ以上のガイド分子を含むことができる。ガイド分子（複数可）は、本明細書のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素（複数可）であり得る。本明細書で使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの文脈における「ガイド配列」及び「ガイド分子」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的核酸配列への核酸－標的複合体の配列特異的結合を誘導するのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書で開示する方法を用いて作製されるガイド配列は、完全長ガイド配列、切断ガイド配列、完全長ｓｇＲＮＡ配列、切断ｓｇＲＮＡ配列、またはＥ＋Ｆ ｓｇＲＮＡ配列とすることができる。１つの実施形態において、ガイド配列の所与の標的配列に対する相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされた場合、約５０％もしくはそれ超、約６０％もしくはそれ超、約７５％もしくはそれ超、約８０％もしくはそれ超、約８５％もしくはそれ超、約９０％もしくはそれ超、約９５％もしくはそれ超、約９７．５％もしくはそれ超、約９９％もしくはそれ超、またはそれ以上である。１つの実施形態において、ガイド分子は、標的配列に対し少なくとも１つのミスマッチを有するように設計することができるガイド配列を含み、その結果、ガイド配列と標的配列との間にＲＮＡ二重鎖が形成される。従って、相補性の程度は、好ましくは９９％未満である。例えば、ガイド配列が２４塩基からなる場合、相補性の程度は、より特定的には約９６％以下である。特定の実施形態において、ガイド配列は、２つ以上の隣接するミスマッチヌクレオチドのストレッチを有するように設計され、その結果、ガイド配列全体での相補性の程度がさらに低下する。例えば、ガイド配列が２４ヌクレオチドからなる場合、相補性の程度は、２つ以上のミスマッチングヌクレオチドのストレッチが２、３、４、５、６、または７ヌクレオチドを包含するか等に応じて、より特定的には約９６％以下、より特定的には約９２％以下、より特定的には約８８％以下、より特定的には約８４％以下、より特定的には約８０％以下、より特定的には約７６％以下、より特定的には約７２％以下である。１つの実施形態において、１つ以上のミスマッチングヌクレオチドのストレッチ以外で、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合の相補性の程度は、約５０％もしくはそれ超、約６０％もしくはそれ超、約７５％もしくはそれ超、約８０％もしくはそれ超、約８５％もしくはそれ超、約９０％もしくはそれ超、約９５％もしくはそれ超、約９７．５％もしくはそれ超、約９９％もしくはそれ超、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。（核酸－標的ガイドＲＮＡ内の）ガイド配列が核酸－標的複合体と標的核酸配列との配列特異的結合を誘導する能力は、任意の好適なアッセイによって評価することができる。例えば、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素（試験されるべきガイド配列を含む）は、（例えば、核酸標的化複合体の構成要素をコードするベクターによる形質移入により、）対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供し、次に標的核酸配列内の優先的標的（例えば、切断）の評価を（例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、）行うことができる。同様に、標的核酸配列（またはその近傍の配列）の切断は、標的核酸配列、核酸－標的複合体の構成要素（試験するガイド配列及び試験するガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む）を用意し、試験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応との間で標的配列でのまたはその近傍での結合または切断率を比較することにより、試験管内で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想到されるであろう。ガイド配列、よって核酸標的化ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択することができる。
１つの実施形態において、ガイド配列またはガイド分子のスペーサー長は１５～５０ｎｔである。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は少なくとも１５ヌクレオチドである。１つの実施形態において、スペーサー長は、１５～１７ｎｔ（例えば、１５、１６、もしくは１７ｎｔ）、１７～２０ｎｔ（例えば、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔ）、２０～２４ｎｔ（例えば、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ｎｔ）、２３～２５ｎｔ（例えば、２３、２４、もしくは２５ｎｔ）、２４～２７ｎｔ（例えば、２４、２５、２６、もしくは２７ｎｔ）、２７～３０ｎｔ（例えば、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ）、３０～３５ｎｔ（例えば３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｔ）、または３５ｎｔ以上である。ある特定の例示的な実施形態において、ガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｔである。
１つの実施形態において、ガイド配列は、長さが１０～５０ｎｔ、ただしより特定的には約２０～３０ｎｔ、有利には約２０ｎｔ、２３～２５ｎｔ、または２４ｎｔのＲＮＡ配列である。ガイド配列は、標的配列とのハイブリダイズを確実にするように選択することができる。選択は、有効性及び特異性を高めるためのさらなるステップを包含することができる。
１つの実施形態において、ガイド配列は、カノニカルな長さ（例えば、約１５～３０ｎｔ）を有し、標的ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズするために使用される。１つの実施形態において、ガイド分子は、カノニカルな長さよりも長く（例えば、３０ｎｔ超）、標的ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせるために使用され、その結果、ガイド配列の領域は、Ｃａｓ－ガイド標的複合体の外側のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の領域とハイブリダイズする。これは、追加の修飾（例えば、ヌクレオチドの脱アミノ化）が目的となる場合に、目的となり得る。代替的な実施形態において、カノニカルなガイド配列長の制限を維持することが目的となる。
１つの実施形態において、ガイド分子の配列（ダイレクトリピート及び／またはスペーサー）は、ガイド分子内の二次構造の程度を低下するように選択される。１つの実施形態において、約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、もしくはそれ以下、またはこれら未満の核酸標的化ガイドＲＮＡのヌクレオチドが、最適に折り畳まれたときに自己相補的塩基対合に関与する。最適な折畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折畳みアルゴリズムによって決定することができる。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づいている。このようなアルゴリズムの一例として、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）が説明しているようなｍＦｏｌｄがある。折畳みアルゴリズムのもう１つの例として、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｅｎｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙが開発したオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄがあり、これは重心構造予測アルゴリズムを使用している（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照）。
１つの実施形態において、ガイド分子は、ガイド分子間（例えば、異なるガイド分子のステムループ領域間）の分子間相互作用を調節するように設計または選択される。塩基対合してステムループを形成するガイド内のヌクレオチドも、塩基対合して第２のガイドと分子間二重鎖を形成することが可能であること、そしてこのような分子間二重鎖が、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成に適合する二次構造を有しないことは理解されよう。したがって、ステムループ形成及びＣＲＩＳＰＲ複合体形成を調節するためにＤＲ配列を選択または設計することは有用と考えられる。１つの実施形態において、核酸標的化ガイドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％未満、またはそれ以下が、分子間二重鎖内にある。ステムループの変異は、ＤＲ－ＣＲＩＳＰＲエフェクター相互作用が課す制限内に収まる場合が多いことは理解されよう。ステムループ形成を調節したり、ステムループと分子間二重鎖との間の平衡状態を変化させたりするための１つの方法は、ＤＲのステムループのステム内のヌクレオチド対を変化させることである。例えば、１つの実施形態において、Ｇ－Ｃ対は、Ａ－ＵまたはＵ－Ａ対によって置き換えられる。別の実施形態において、Ａ－Ｕ対は、Ｇ－ＣまたはＣ－Ｇ対に対し置換される。別の実施形態において、天然ヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログによって置き換えられる。ステムループ形成を調節したり、ステムループと分子間二重鎖との間の平衡状態を変化させるためのもう１つの方法は、ＤＲのステムループのループを修飾することである。理論に束縛されるものではないが、ループは互いに相補的な２つの配列に挟まれた介在配列とみなすことができる。その介在配列が自己相補的でない場合、その効果は分子間二重鎖形成を不安定化することになる。ガイドが多重化される際にも同じ原理が適用され、標的化配列が異なっても、異なるガイドのＤＲのステムループ領域を修飾することが有利になることがある。さらに、ガイドが多重化される際に、各個々のガイドの活性のバランスをとることにより、異なるガイドの相対的活性を調節することができる。１つの実施形態において、分子間ステムループｖｓ分子間二重鎖の平衡状態が決定される。この決定は、物理的または生化学的手段によって行うことができ、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの存在下であっても非存在下であってもよい。
１つの実施形態において、ＲＮＡ切断（例えば、ＲＮＡを切断するＣＲＩＳＰＲシステムによる切断）に対するガイド分子の感受性を低下させることが目的となる。したがって、特定の実施形態において、ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲシステムまたは他のＲＮＡ切断酵素による切断を回避するように調整される。
１つの実施形態において、ガイド分子は、非天然の核酸及び／または非天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学修飾を含む。好ましくは、これらの非天然の核酸及び非天然のヌクレオチドは、ガイド配列の外側に配置される。非天然の核酸は、例えば、天然のヌクレオチドと非天然のヌクレオチドとの混合物を含むことができる。非天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース、リン酸、及び／または塩基部分で修飾することができる。本発明の１つの実施形態において、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。１つのこのような実施形態において、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ガイドは、１つ以上の非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋核酸（ＢＮＡ））を含む。修飾ヌクレオチドの他の例としては、２’－Ｏ－メチルアナログ、２’－デオキシアナログ、または２’－フルオロアナログが挙げられる。修飾塩基のさらなる例としては、限定されるものではないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学修飾の例としては、限定されるものではないが、１つ以上の末端ヌクレオチドでの２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組込みを含む。このような化学修飾ガイドは、非修飾のガイドと比較して、安定性の増加及び活性の増加を含むことができるものの、オンターゲットｖｓオフターゲットの特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ｊｕｎｅ ２０１５ Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６を参照）。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡの５’及び／または３’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグを含む様々な機能的部分によって修飾される（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３を参照）。１つの実施形態において、ガイドは、標的ＲＮＡに結合する領域内のリボヌクレオチドと、Ｃａｓエフェクターに結合する領域内の１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログとを含む。１つの実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造（例えば、限定されるものではないが、ステム－ループ領域及びシード領域）内に組み込まれる。１つの実施形態において、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドが化学修飾される。１つの実施形態において、ガイドの３’または５’末端のいずれかの３～５ヌクレオチドが化学修飾される。１つの実施形態において、軽微な修飾（例えば、２’－Ｆ修飾）のみがシード領域内に導入される。１つの実施形態において、２’－Ｆ修飾がガイドの３’末端に導入される。１つの実施形態において、ガイドの５’及び／または３’末端の３～５ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学修飾される。このような修飾により、ゲノム編集効率を強化することができる（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９を参照）。１つの実施形態において、遺伝子破壊のレベルを高めるために、ガイドの全てのホスホジエステル結合がホスホロチオエート（ＰＳ）で置換される。１つの実施形態において、ガイドの５’末端及び／または３’末端の５ヌクレオチド超が、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、またはＳ拘束エチル（ｃＥｔ）で化学修飾される。このような化学修飾ガイドは、強化されたレベルの遺伝子破壊を媒介することができる（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１を参照）。１つの実施形態において、ガイドは、その３’及び／または５’末端に化学部分を含むように修飾される。このような部分としては、限定されるものではないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミン、ペプチド、核局在化配列（ＮＬＳ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）が挙げられる。ある特定の実施形態において、化学部分は、リンカー（例えば、アルキル鎖）によってガイドと結合体化する。ある特定の実施形態において、化学部分は、リンカー（例えば、アルキル鎖）によってガイドと結合体化する。１つの実施形態において、修飾ガイドの化学的部分を使用して、ガイドを別の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子）に付着させることができる。このような化学修飾ガイドを使用して、ＣＲＩＳＰＲシステムによって一般的に編集された細胞を識別または濃縮することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照）。
１つの実施形態において、３’末端と５’末端の各々で３ヌクレオチドが化学修飾される。特定の実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたはホスホロチオエートアナログを含む。具体的な実施形態において、テトラループ内の１２ヌクレオチド及びステムループ領域内の１６ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルアナログで置き換えられる。このような化学修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏ編集及び安定性を改善する（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８），２２：２２２７－２２３５を参照）。１つの実施形態において、ガイドの６０または７０ヌクレオチド超が化学修飾される。１つの実施形態において、この修飾は、ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロヌクレオチドアナログで置き換えるか、またはホスホジエステル結合をホスホロチオエート（ＰＳ）修飾することを含む。１つの実施形態において、化学修飾は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成されたときにヌクレアーゼタンパク質の外側に拡張するガイドヌクレオチドの２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、またはガイドの３’末端の２０～３０ヌクレオチド以上のＰＳ修飾を含む。特定の実施形態において、化学修飾はさらに、ガイドの５’末端の２’－Ｏ－メチルアナログ、またはシード及びテール領域内の２’－フルオロアナログを含む。このような化学修飾は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を改善し、ゲノム編集活性または効率を維持または強化するが、全てのヌクレオチドを修飾すると、ガイドの機能が消失する可能性がある（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１８），３５（１２）：１１７９－１１８７を参照）。このような化学修飾は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構造の知識（限られた数のヌクレアーゼ及びＲＮＡ ２’－ＯＨ相互作用の知識を含む）によって導くことができる（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１８），３５（１２）：１１７９－１１８７を参照）。１つの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドで置き換えることができる。１つの実施形態において、５’末端テール／シードガイド領域の最大２、４、６、８、１０、または１２個のＲＮＡヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドで置き換えられる。１つの実施形態において、３’末端のガイドＲＮＡヌクレオチドの大部分がＤＮＡヌクレオチドで置き換えられる。特定の実施形態において、３’末端の１６個のガイドＲＮＡヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドで置き換えられる。特定の実施形態において、５’末端のテール／シード領域の８個のガイドＲＮＡヌクレオチド及び３’末端の１６個のＲＮＡヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドで置き換えられる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質の外側に拡張するガイドＲＮＡヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成されたときにＤＮＡヌクレオチドで置き換えられる。このように複数のＲＮＡヌクレオチドをＤＮＡヌクレオチドで置き換えると、未修飾ガイドと比較して、オフターゲット活性の減少に至り、ただしオンターゲット活性は同様のものとなる。しかし、３’末端の全てのＲＮＡヌクレオチドを置き換えると、ガイドの機能が消失する可能性がある（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）１４，３１１－３１６を参照）。このような修飾は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構造の知識（限られた数のヌクレアーゼ及びＲＮＡ ２’－ＯＨ相互作用の知識を含む）によって導くことができる（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）１４，３１１－３１６を参照）。
１つの実施形態において、ガイド分子は、別の非共有結合的に連結した配列（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）とステムループを形成する。特定の実施形態において、ガイドを形成する配列は、最初に、標準的なホスホロアミダイト合成プロトコルを用いて合成される（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））。１つの実施形態において、これらの配列は、当技術分野で知られている標準的なプロトコルを用いてライゲーションのための適切な官能基を含むように官能化することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、限定されるものではないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、及びアジドが挙げられる。この配列が官能化されると、この配列とダイレクトリピート配列との間に共有結合的な化学結合または連結を形成することができる。化学結合の例としては、限定されるものではないが、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン（ｆｕｌｆｏｎｅｓ）、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性結合、Ｃ－Ｃ結合形成基（例えば、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環化付加対または閉環メタセシス対）、及びＭｉｃｈａｅｌ反応対に基づく結合が挙げられる。
１つの実施形態において、これらのステムループ形成配列は化学合成することができる。１つの実施形態において、化学合成は、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）を用いた自動化固相オリゴヌクレオチド合成機械を使用する。
１つの実施形態において、ガイド分子は、（１）標的座位とハイブリダイズすることが可能なガイド配列と、（２）ダイレクトリピート配列がガイド配列の上流（すなわち、５’）または下流（すなわち、３’）に位置するｔｒａｃｒメイトまたはダイレクトリピート配列とを含む。特定の実施形態において、ガイド配列のシード配列（すなわち、標的座位の配列に対する認識及び／またはハイブリダイゼーションに必須で不可欠な配列）は、およそガイド配列の最初の１０ヌクレオチド内にある。
特定の実施形態において、ガイド分子は、ダイレクトリピート配列と連結したガイド配列を含み、ダイレクトリピート配列は、１つ以上のステムループまたは最適化された二次構造を含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピートは、１６ｎｔの最小長及び単一のステムループを有する。さらなる実施形態において、ダイレクトリピートは、１６ｎｔより長い長さ、好ましくは１７ｎｔ超の長さを有し、複数のステムループまたは最適化された二次構造を有する。特定の実施形態において、ガイド分子は、天然ダイレクトリピートの全部または一部に連結したガイド配列を含む、またはそれからなる。ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓガイド分子は、（３’→５’方向または５’→３’方向に）：ガイド配列、第１の相補的ストレッチ（「リピート」）、ループ（典型的には４または５ヌクレオチド長）、第２の相補的ストレッチ（リピートに相補的な「アンチリピート」）、及びポリＡ（しばしばＲＮＡではポリＵ）テール（ターミネーター）を含む。１つの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、その天然のアーキテクチャーを保持し、単一のステムループを形成する。特定の実施形態において、ガイドアーキテクチャーのある特定の態様は、例えば、特徴の追加、減算、または置換によって修飾することができ、その一方でガイドアーキテクチャーのある特定の他の態様は維持される。ガイド分子の修飾（限定されるものではないが、挿入、欠失、及び置換を含む）のための好ましい位置としては、ガイド末端ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／または標的と複合体化したときに露出されるガイド分子の領域（例えば、ダイレクトリピートのステムループ）が挙げられる。
特定の実施形態において、ステムは、相補的なＸ及びＹ配列を含む少なくとも約４ｂｐを含むが、より多い（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２）またはより少ない（例えば、３、２）塩基対のステムも企図されている。したがって、例えば、Ｘ２－１０及びＹ２－１０（Ｘ及びＹは、ヌクレオチドの任意の相補的なセットを表す）を企図することができる。１つの態様において、Ｘ及びＹヌクレオチドから作製されたステムは、ループとともに、全体的な二次構造内で完全なヘアピンを形成し、これは有利と考えられ、塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量と考えられる。１つの態様において、全体的なガイド分子の二次構造が保持される限り、任意の相補的なＸ：Ｙ塩基対配列（例えば、長さに関して）が許容される。１つの態様において、Ｘ：Ｙの塩基対で作製されたステムを接続するループは、ガイド分子の全体的な二次構造を中断しない、同じ長さ（例えば、４または５ヌクレオチド）またはそれ以上の任意の配列とすることができる。１つの態様において、ステムループはさらに、例えば、ＭＳ２アプタマーを含むことができる。１つの態様において、ステムは相補的なＸ及びＹ配列を含む約５～７ｂｐを含むが、より多くのまたはより少ない塩基対のステムも企図されている。１つの態様において、非ワトソン・クリック塩基対合が企図されており、このような対合は概して、別の形で、その位置でステムループのアーキテクチャーを保持する。
特定の実施形態において、ガイド分子の天然のヘアピンまたはステムループ構造は、拡張されるか、または拡張されたステムループによって置き換えられる。ステムを拡張することで、ガイド分子とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のアセンブリを強化し得ることが実証されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１３）；１５５（７）：１４７９－１４９１）。特定の実施形態において、ステムループのステムは、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれ以上の相補的な塩基対（すなわち、ガイド分子内の２、４、６、８、１０、またはそれ以上のヌクレオチドの付加に対応）によって拡張される。特定の実施形態において、これらは、ステムループのループに隣接するステムの端部に位置する。
特定の実施形態において、ＲＮアーゼまたは発現低下に対するガイド分子の感受性は、その機能に影響を及ぼさないガイド分子の配列のわずかな修飾によって低減することができる。例えば、特定の実施形態において、転写の早期終結（例えば、Ｕ６ Ｐｏｌ－ＩＩＩの早期転写）は、ガイド分子配列の推定上のＰｏｌ－ＩＩＩターミネーター（４つの連続したＵ）を修飾することにより、除去することができる。ガイド分子のステムループ内にこのような配列修飾が必要とされる場合、これは、好ましくは塩基対フリップによって保証される。
特定の実施形態において、ダイレクトリピートは、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように修飾することができる。特定の実施形態において、１つ以上のアプタマーが、最適化された二次構造の一部のように含まれてもよい。このようなアプタマーは、本明細書でさらに詳述するように、バクテリオファージのコートタンパク質を結合することが可能である。
１つの実施形態において、ガイド分子は、編集されるべき少なくとも１つの標的シトシン残基を含む標的ＲＮＡと二重鎖を形成する。ガイドＲＮＡ分子が標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、シチジンデアミナーゼが、ガイド配列内のミスマッチによってアクセス可能になった二重鎖内の一本鎖ＲＮＡに結合し、ミスマッチしたヌクレオチドのストレッチ内に含まれる１つ以上の標的シトシン残基の脱アミノを触媒する。
ガイド配列、よって核酸標的化ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択することができる。標的配列はｍＲＮＡであってもよい。
１つの実施形態において、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と会合するべきであり、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体に認識される短い配列である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の性質に応じて、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖内のその相補配列（本明細書では非標的配列とも称される）がＰＡＭの上流または下流にあるように、選択されるべきである。諸実施形態において、標的配列の相補配列は、ＰＡＭの下流もしくは３’側、またはＰＡＭの上流もしくは５’側にある。ＰＡＭにおける正確な配列及び長さの要件は、使用するＣａｓタンパク質によって異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対の配列である。
さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作は、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能にし、標的部位認識の忠実度を改善し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の汎用性を高める。これは、例えば、Ｃａｓ９についてＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２で説明されている。本明細書でさらに詳述するように、当業者であれば、Ｃａｓタンパク質を同様に修飾することができることを理解するであろう。
特定の実施形態において、ガイドは、エスコートされたガイドである。「エスコートされた」とは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体またはガイドが細胞内の選択された時間または場所に送達されて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体またはガイドの活性及び行き先は、アプタマーリガンド（例えば、細胞表面タンパク質または他の局在的な細胞構成要素）に結合親和性を有するエスコートＲＮＡアプタマー配列によって制御され得る。代替的に、エスコートアプタマーは、細胞上または細胞内のアプタマーエフェクター（例えば、一過性エフェクター、例えば、特定の時間に細胞に適用される外部エネルギー源）に応答性を有し得る。
エスコートされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体は、ガイド分子の構造、アーキテクチャー、安定性、遺伝子発現、またはこれらの任意の組合せを改善するように設計された機能的構造を備えたガイド分子を有する。このような構造は、アプタマーを含むことができる。
アプタマーは、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ；Ｔｕｅｒｋ Ｃ，Ｇｏｌｄ Ｌ：“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４９：５０５－５１０）と呼ばれる技法を用いて、他のリガンドに強く結合するように設計または選択することができる生体分子である。核酸アプタマーは、例えば、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから選択することができ、広範囲の生物医学的に関連する標的に対し高い結合親和性及び特異性を有し、アプタマーにおける広範囲の治療有用性を示唆している（Ｋｅｅｆｅ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｄ．，Ｓｕｐｒｉｙａ Ｐａｉ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ．“Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９．７（２０１０）：５３７－５５０）。これらの特性は、薬物送達ビヒクルとしてのアプタマーの広範囲の使用も示唆している（Ｌｅｖｙ－Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ，Ｅｔｇａｒ，ｅｔ ａｌ．“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．” Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６．８（２００８）：４４２－４４９；及びＨｉｃｋｅ ＢＪ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＡＷ．“Ｅｓｃｏｒｔ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００，１０６：９２３－９２８．）。また、アプタマーは、特性を変化させることによりキュー（ｑｕｅ）に応答する分子スイッチとして機能するように構築することもできる（例えば、蛍光色素を結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するＲＮＡアプタマー）（Ｐａｉｇｅ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ．，Ｋａｒｅｎ Ｙ．Ｗｕ，ａｎｄ Ｓａｍｉｅ Ｒ．Ｊａｆｆｒｅｙ．“ＲＮＡ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３．６０４２ （２０１１）：６４２－６４６）。また、アプタマーは、例えば細胞表面タンパク質を標的とする、標的ｓｉＲＮＡ治療薬送達システムの構成要素として使用され得ることが示唆されている（Ｚｈｏｕ，Ｊｉｅｈｕａ，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｒｏｓｓｉ．“Ａｐｔａｍｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．” Ｓｉｌｅｎｃｅ １．１（２０１０）：４）．
したがって、特定の実施形態において、ガイド分子の修飾は、例えば、ガイド分子の送達（例えば、細胞膜を横断する送達、細胞内区画への送達、または核内への送達を含む）を改善するように設計された１つ以上のアプタマー（複数可）によって行われる。このような構造は、１つ以上のアプタマー（複数可）に加えて、またはこのような１つ以上のアプタマー（複数可）なしで、ガイド分子を、選択されたエフェクターに対し送達可能、誘導可能、または応答性にするように、部分（単数または複数）を含むことができる。システムは、正常または病的な生理条件（限定されるものではないが、ｐＨ、低酸素、Ｏ２濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、光曝露、機械的破壊（例えば、超音波）、磁場、電場、または電磁放射を含む）に応答するガイド分子を包含する。
誘導性システムの光応答性は、クリプトクロム－２及びＣＩＢ１の活性化及び結合によって達成することができる。青色光刺激がクリプトクロム－２の活性化立体構造変化を誘導し、その結果、結合パートナーＣＩＢ１が動員される。この結合は高速かつ可逆的であり、パルス刺激後１５秒未満の飽和と、刺激終了後１５分未満のベースライン復帰とを達成し得る。このような急速な結合動態の結果、転写／翻訳及び転写産物／タンパク質の分解の速度によってのみ時間的に制約され、誘導物質の取込み及びクリアランスには制約されないシステムが得られる。また、クリプトクロム－２の活性化は高感度でもあり、それにより低光強度の刺激を使用することができ、光毒性のリスクが軽減される。さらに、インタクトな哺乳類脳などの文脈では、可変の光強度を使用して刺激を受ける領域のサイズを制御することができ、それによりベクターの送達のみで提供され得る精度よりも高い精度が得られる。
エネルギー源は、ガイドを誘導するための電磁波、音エネルギー、または熱エネルギーとすることができる。有利には、電磁放射線は、可視光の構成要素とすることができる。１つの実施形態において、光は、約４５０～約４９５ｎｍの波長を有する青色光である。１つの実施形態において、波長は約４８８ｎｍである。別の好ましい実施形態において、光刺激はパルスによるものである。光パワーは約０～９ｍＷ／ｃｍ２の範囲であり得る。好ましい実施形態において、１５秒ごとに０．２５秒という低い刺激パラダイムが最大の活性化をもたらすべきである。
化学物質やエネルギーに敏感なガイドは、化学的供給源の結合またはエネルギーによる誘導で立体構造変化に供され、ガイドとして機能し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体を機能させることができる。本開示は、ガイド機能及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは複合体の機能を有するように化学的供給源またはエネルギーを適用することと、任意選択でさらに、ゲノム座位の発現が改変されていることを決定することとを含むことができる。
この化学誘導性システムには、いくつかの異なる設計が存在する：１．アブシジン酸（ＡＢＡ）によって誘導可能なＡＢＩ－ＰＹＬベースシステム（例えば、ｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；４／１６４／ｒｓ２を参照）、２．ラパマイシン（またはラパマイシンに基づく関連化学物質）によって誘導可能なＦＫＢＰ－ＦＲＢに基づくシステム（例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｍｅｔｈ７６３．ｈｔｍｌ 参照）、３．ジベレリン（ＧＡ）によって誘導可能なＧＩＤ１－ＧＡＩベースシステム（例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ８／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．９２２．ｈｔｍｌを参照）。
化学誘導性システムは、４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）によって誘導可能なエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースシステムであってもよい（例えば、ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０４／３／１０２７．ａｂｓｔｒａｃｔを参照）。エストロゲン受容体の変異型リガンド結合ドメイン（ＥＲＴ２と呼ばれる）は、４－ヒドロキシタモキシフェンの結合によって細胞の核内に移動する。さらなる実施形態において、任意の核受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体の任意の天然のまたは操作された誘導体は、ＥＲベース誘導性システムに類似する誘導性システムで使用することができる。
別の誘導性システムは、エネルギー、熱、または電波によって誘導可能な一過性受容体電位（ＴＲＰ）イオンチャネルに基づくシステム（例えば、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３３６／６０８１／６０４を参照）を用いた設計に基づくことができる。これらのＴＲＰファミリータンパク質は、光及び熱を含む種々の刺激に応答する。このタンパク質が光や熱によって活性化されると、イオンチャネルが開き、カルシウムなどのイオンが形質膜に進入することができる。このイオン流入が、ガイドを含むポリペプチド及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体またはシステムの他の構成要素に連結した細胞内のイオン相互作用パートナーに結合し、この結合が、ポリペプチドの細胞レベル以下の局在化の変化を誘導し、その結果、ポリペプチド全体が細胞の核に進入する。核の内部に入ると、ガイドタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の他の構成要素が活性となり、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する。
光活性化は有利な実施形態であり得るが、場合によっては、特に、光が皮膚または他の器官に透過しない可能性があるｉｎ ｖｉｖｏ用途では、不利になることもある。この場合には、他のエネルギー活性化の方法が企図され、特定的には、同様の効果を有する電場エネルギー及び／または超音波が企図される。
電場エネルギーは、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍの１つ以上の電気パルスを用いて、当技術分野で説明されているように実質的に投与される。パルスの代わりにまたはそれに加えて、電場を連続的な方式で送達することができる。電気パルスは、１μｓ～５００ミリ秒、好ましくは１μｓ～１００ミリ秒の範囲で適用することができる。電場は、連続的にまたはパルス方式で、約５分適用することができる。
本明細書で使用する場合、「電場エネルギー」とは、細胞が曝露される電気エネルギーである。好ましくは、電場は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で約１ボルト／ｃｍ～約１０ｋボルト／ｃｍまたはそれ以上の強度を有する（国際特許公開第ＷＯ９７／４９４５０号を参照）。
本明細書で使用する場合、「電場」という用語は、可変容量及び電圧における１つ以上のパルスを含み、指数関数及び／または方形波形及び／または変調波形及び／または変調方形波形を含む。電場や電気について言及する場合、細胞の環境内での電位差の存在についての言及を含むと解釈されるべきである。このような環境は、当技術分野で知られているように、静電気、交流（ＡＣ）、直流（ＤＣ）などによってセットアップすることができる。電場は、均一、不均一、または別の形であってもよく、時間依存的方式で強度及び／または方向が変化してもよい。
単一または複数の電場の適用、単一または複数の超音波の適用も、任意の順序及び任意の組合せで可能である。超音波及び／または電場の送達は、単一または複数の連続的な適用としても、パルスとしても（パルス状送達）行うことができる。
エレクトロポレーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方の手順で、生細胞に外来物質を導入するために使用されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用の場合、生細胞の試料を最初に目的の薬剤と混合し、平行プレートなどの電極間に配置する。次に、電極で細胞／インプラント混合物に電場を適用する。ｉｎ ｖｉｔｒｏエレクトロポレーションを行うシステムの例としては、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ＥＣＭ６００製品、及びＥｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０（いずれもＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，ＩｎｃのＢＴＸ部門が製造）が挙げられる（米国特許第５，８６９，３２６号を参照）。
既知のエレクトロポレーション技法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方）は、治療領域の周囲に配置された電極に短時間の高電圧パルスを適用することで機能する。電極間で生成される電場により、細胞膜が一時的に多孔質化し、目的の薬剤の分子が細胞に進入する。既知のエレクトロポレーション適用において、この電場は、約１００ｍｕ．ｓの持続時間で１０００Ｖ／ｃｍ程度の単一の方形波パルスを含む。このようなパルスは、例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０の既知の適用で生成することができる。
好ましくは、電場は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。したがって、電場は、１Ｖ／ｃｍ、２Ｖ／ｃｍ、３Ｖ／ｃｍ、４Ｖ／ｃｍ、５Ｖ／ｃｍ、６Ｖ／ｃｍ、７Ｖ／ｃｍ、８Ｖ／ｃｍ、９Ｖ／ｃｍ、１０Ｖ／ｃｍ、２０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１ｋＶ／ｃｍ、２ｋＶ／ｃｍ、５ｋＶ／ｃｍ、１０ｋＶ／ｃｍ、２０ｋＶ／ｃｍ、５０ｋＶ／ｃｍ、またはそれ以上の強度を有し得る。より好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で約０．５ｋＶ／ｃｍ～約４．０ｋＶ／ｃｍである。好ましくは、電場は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で約１Ｖ／ｃｍ～約１０ｋＶ／ｃｍの強度を有する。ただし、標的部位に送達されるパルス数が増加すると、電場強度が低下することがある。したがって、より低い場強度における電場のパルス状送達が想定される。
好ましくは、電場の適用は、複数のパルス（例えば、同じ強度及び静電容量の二重パルス、あるいは強度及び／または静電容量が変化する連続パルス）の形態をとる。本明細書で使用する場合、「パルス」という用語は、可変容量及び電圧における１つ以上の電気パルスを含み、指数関数及び／または方形波形及び／または変調波形及び／または方形波形を含む。
好ましくは、電気パルスは、指数関数波形、方形波形、変調波形、及び変調方形波形から選択される波形として送達される。
好ましい実施形態は、低電圧での直流を用いる。したがって、出願人は、１Ｖ／ｃｍ～２０Ｖ／ｃｍの電場強度で１００ミリ秒以上、好ましくは１５分以上の期間の間、細胞、組織、または組織塊に適用される電場の使用を開示する。
超音波は、有利には約０．０５Ｗ／ｃｍ２～約１００Ｗ／ｃｍ２のパワーレベルで投与される。診断用もしくは治療用超音波、またはこれらの組合せを使用することができる。
本明細書で使用する場合、「超音波」という用語は、ヒトの聴覚範囲を上回るほど非常に高い周波数の機械的振動からなるエネルギーの形態を指す。超音波スペクトルの下限周波数は、概して約２０ｋＨｚとみなすことができる。超音波のほとんどの診断用途では、１～１５ＭＨｚの範囲の周波数が用いられている（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐ．Ｎ．Ｔ．Ｗｅｌｌｓ，ｅｄ．，２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ［Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｌｏｎｄｏｎ ＆ ＮＹ，１９７７］）。
超音波は、診断及び治療の両方の用途で使用されている。診断ツール（「診断用超音波」）として使用される場合、超音波は、典型的には最大約１００ｍＷ／ｃｍ２（ＦＤＡ推奨）のエネルギー密度範囲で使用されるが、最大７５０ｍＷ／ｃｍ２のエネルギー密度が使用されてきた。理学療法では、超音波は、典型的にはエネルギー源として約３～４Ｗ／ｃｍ２（ＷＨＯ勧告）の範囲で使用される。他の治療用途では、より高い強度の超音波が用いられることがあり、例えば、１００Ｗ／ｃｍ～１ｋＷ／ｃｍ２（またはさらにそれ以上）のＨＩＦＵが短時間使用される。本明細書で使用する場合、「超音波」という用語は、診断用、治療用、及び集束超音波を包含することが意図されている。
集束超音波（ＦＵＳ）は、侵襲的なプローブを伴わない熱エネルギーの送達を可能にする（Ｍｏｒｏｃｚ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐｐ．１３６－１４２を参照）。集束超音波の別の形態としては、高密度集束超音波（ＨＩＦＵ）があり、これはＭｏｕｓｓａｔｏｖら（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ（１９９８）Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐｐ．８９３－９００）及びＴｒａｎＨｕｕＨｕｅら（Ａｃｕｓｔｉｃａ （１９９７）Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１０３－１１０６）によって概説されている。
好ましくは、診断用超音波と治療用超音波との組合せが用いられる。ただし、この組合せは限定を意図するものではなく、当業者であれば、超音波の任意の様々な組合せが使用され得ることを理解するであろう。加えて、エネルギー密度、超音波の周波数、及び曝露期間を変化させることができる。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０５～約１００Ｗｃｍ－２のパワー密度で行われる。さらに好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約１～約１５Ｗｃｍ－２のパワー密度で行われる。
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０１５～約１０．０ＭＨｚの周波数で行われる。より好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約０．０２～約５．０ＭＨｚまたは約６．０ＭＨｚの周波数で行われる。最も好ましくは、超音波は、３ＭＨｚの周波数で適用される。
好ましくは、曝露は、約１０ミリ秒～約６０分の期間とする。好ましくは、曝露は、約１秒～約５分の期間とする。より好ましくは、超音波は、約２分間適用される。ただし、破壊されるべき特定の標的細胞に応じて、曝露はより長い時間（例えば、１５分間）であってもよい。
有利には、標的組織は、約０．０１５～約１０ＭＨｚの範囲の周波数及び約０．０５Ｗｃｍ－２～約１０Ｗｃｍ－２の音響パワー密度で超音波エネルギー源に曝露される（ＷＯ９８／５２６０９を参照）。ただし、代替形態も可能であり、例えば、１００Ｗｃｍ－２を上回る音響パワー密度で、ただし時間期間を低減して、例えば、１０００Ｗｃｍ－２でミリ秒以下の期間の間、超音波エネルギー源に曝露することも可能である。
好ましくは、超音波の適用は複数のパルスの形態をとる。したがって、連続波及びパルス波（超音波のパルス状送達）の両方を任意の組合せで用いることができる。例えば、連続波超音波を適用し、続いてパルス波超音波を適用しても、その逆を行ってもよい。これは、任意の順序及び組合せで任意の回数繰り返すことができる。パルス波超音波は、連続波超音波のバックグラウンドに対し適用することができ、任意の数のパルスを任意の数の群で使用することができる。
好ましくは、超音波は、パルス波超音波を含むことができる。非常に好ましい実施形態において、超音波は、連続波として０．７Ｗｃｍ－２または１．２５Ｗｃｍ－２の電力密度で適用される。パルス波超音波を使用する場合は、より高いパワー密度が用いられ得る。
超音波は、光のように、対象に正確に焦点を合わせることができるため、超音波の使用は有利である。さらに、超音波は、光と異なり、より深く組織内に焦点を合わせることができるため、有利である。そのため、超音波は、全組織透過（例えば、限定されるものではないが、肝臓の葉）または全器官（例えば、限定されるものではないが、肝臓全体または筋肉全体、例えば心臓）の療法により良好に適合している。もう１つの重要な利点は、超音波が、多種多様な診断及び治療用途に使用されている非侵襲的な刺激であることである。例えば、超音波は、医用画像処理技法で周知されており、加えて整形外科療法でも周知されている。さらに、対象脊椎動物への超音波の適用に適した装置は広く入手可能であり、その使用は当技術分野で周知されている。
特定の実施形態において、ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特異性を高めるために二次構造によって修飾され、二次構造は、エキソヌクレアーゼ活性から保護することができ、ガイド配列への５’付加を可能にする（ガイド配列は、本明細書では保護ガイド分子とも称される）。
１つの態様において、本開示は、「プロテクターＲＮＡ」をガイド分子の配列とハイブリダイズさせることを提供し、ここで「プロテクターＲＮＡ」とは、ガイド分子の３’末端に相補的であることにより、部分的な二重鎖のガイドＲＮＡを生成するＲＮＡのことである。１つの実施形態において、ミスマッチ塩基（すなわち、ガイド配列の一部を形成しないガイド分子の塩基）を完全に相補的なプロテクター配列で保護すると、標的ＲＮＡが３’末端でミスマッチ塩基対に結合する可能性が減少する。特定の実施形態において、拡張された長さを含む追加の配列がガイド分子内に存在して、ガイドがガイド分子内にプロテクター配列を含むようにすることもできる。この「プロテクター配列」は、ガイド分子が「曝露配列」（標的配列とハイブリダイズするガイド配列の一部）に加えて「保護配列」を含むことを確実にする。特定の実施形態において、ガイド分子は、プロテクターガイドの存在により、ヘアピンなどの二次構造を含むように修飾される。有利には、保護配列、ガイド配列、またはその両方に対し相補性を有する３または４～３０またはそれ以上、例えば、約１０以上の連続した塩基対が存在する。保護された部分が、標的と相互作用するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの熱力学を阻害しないことが有利である。このような部分的に二本鎖のガイド分子を含む拡張を提供することにより、ガイド分子は保護されているとみなされ、その結果、特異的な活性を維持しながらＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の特異的結合が改善される。
特定の実施形態において、切断されたガイド（ｔｒｕ－ガイド）、すなわち、カノニカルなガイド配列長に対し長さが切断されているガイド配列を含むガイド分子が使用される。Ｎｏｗａｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１６）４４（２０）：９５５５－９５６４）が説明しているように、このようなガイドは、触媒的に活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素が標的ＲＮＡの切断なしでその標的に結合することを可能にし得る。特定の実施形態において、標的の結合を可能にするが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素のニッカーゼ活性のみを保持する切断ガイドが使用される。
本明細書で提供する方法及びツールは、ある特定のＣａｓエフェクターのために例示される。同様の特性を有するさらなるヌクレアーゼは、当技術分野で説明されている方法を用いて特定することができる（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５，６０：３８５－３９７；Ａｂｕｄａｙｅｈ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５；３５３（６２９９））。特定の実施形態において、新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を特定するためのこのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ座位の存在を特定する種をコードするデータベースから配列を選択するステップと、選択した配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、種から１０ｋｂ以内に位置する座位を特定するステップと、そこから、ＯＲＦを含む座位であって、そのうち１つのＯＲＦのみが、７００超のアミノ酸を有し既知のＣＲＩＳＰＲエフェクターに対し９０％以下の相同性を有する新規ＣＲＩＳＰＲエフェクターをコードする、座位を選択するステップとを含むことができる。特定の実施形態において、シードは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに共通するタンパク質（例えば、Ｃａｓ１）である。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、新たなエフェクタータンパク質を同定するためのシードとして使用される。
また、“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｈｅｎｇｄａｒ Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ Ｊｏｕｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９－７７（２０１４）は、拡張配列を認識し、ヒト細胞内で内在性遺伝子を高効率で編集することができる二量体ＲＮＡ先導ＦｏｋＩヌクレアーゼに関するものである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、その構成要素、及びその構成要素、このような構成要素（方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶを含む）の送達、ならびに量と製剤を含むその作製及び使用（量及び製剤に関するものを含む）についての一般的な情報は、全て本発明の実施に有用であり、以下を参照する：米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８９５，３０８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９９３，２３３号、及び同第８，９９９，６４１号、米国特許公開第ＵＳ２０１４－０３１０８３０Ａ１号（米国出願第１４／１０５，０３１号）、同第ＵＳ２０１４－０２８７９３８Ａ１号（米国出願第１４／２１３，９９１号）、同第ＵＳ２０１４－０２７３２３４Ａ１号（米国出願第１４／２９３，６７４号）、同第ＵＳ２０１４－０２７３２３２Ａ１号（米国出願第第１４／２９０，５７５号）、同第ＵＳ２０１４－０２７３２３Ａ１号（米国出願第第１４／２５９，４２０号）、同第ＵＳ２０１４－０２５６０４６Ａ１号（米国出願第１４／２２６，２７４号）、同第ＵＳ２０１４－０２４８７０２Ａ１号（米国出願第第１４／２５８，４５８号）、同第ＵＳ２０１４－０２４２７００Ａ１号（米国出願第第１４／２２２，９３０号）、同第ＵＳ２０１４－０２４２６９９Ａ１号（米国出願第第１４／１８３，５１２号）、同第ＵＳ２０１４－０２４２６６４Ａ１号（米国出願第１４／１０４，９９０号）、同第ＵＳ２０１４－０２３４９７２Ａ１号（米国出願第第１４／１８３，４７１号）、同第ＵＳ２０１４－０２２７７８７Ａ１号（米国出願第第１４／２５６，９１２号）、同第ＵＳ２０１４－０１８９８９６Ａ１号（米国出願第第１４／１０５，０３５号）、同第ＵＳ２０１４－０１８６９５８Ａ１号（米国出願第１４／１０５，０１７号）、同第ＵＳ２０１４－０１８６９１９Ａ１号（米国出願第１４／１０４，９７７号）、同第ＵＳ２０１４－０１８６８４３Ａ１号（米国出願第１４／１０４，９００号）、同第ＵＳ２０１４－０１７９７７０Ａ１号（米国出願第第１４／１０４，８３７号）及びＵＳ２０１４－０１７９００６Ａ１号（米国出願第第１４／１８３，４８６号）、同第ＵＳ２０１４－０１７０７５３Ａ１号（米国出願第１４／１８３，４２９号）、同第ＵＳ２０１５－０１８４１３９号（米国出願第 第１４／３２４，９６０号）、同第１４／０５４，４１４号、欧州特許出願第ＥＰ２７７１４６８号（ＥＰ１３８１８５７０．７）、同第ＥＰ２７６４１０３号（ＥＰ１３８２４２３２．６）、及び同第ＥＰ２７８４１６２号（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１４／０９３６６１号号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３）、同第ＷＯ２０１４／０９３６９４号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０）、同第ＷＯ２０１４／０９３５９５号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１）、同第ＷＯ２０１４／０９３７１８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５）、同第ＷＯ２０１４／０９３７０９号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２）、同第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）、同第ＷＯ２０１４／０９３６３５号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１）、同第ＷＯ２０１４／０９３６５５号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６）、同第ＷＯ２０１４／０９３７１２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９）、同第ＷＯ２０１４／０９３７０１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００）、同第ＷＯ２０１４／０１８４２３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２３号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２４号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２５号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２６号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２７号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８）、同第ＷＯ２０１４／２０４７２９号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９）、同第ＷＯ２０１５／０８９３５１号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７）、同第ＷＯ２０１５／０８９３５４号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９０２）、同第ＷＯ２０１５／０８９３６４号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９９２５）、同第ＷＯ２０１５／０８９４２７号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００６８）、同第ＷＯ２０１５／０８９４６２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１２７）、同第ＷＯ２０１５／０８９４１９号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７）、同第ＷＯ２０１５／０８９４６５号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１３５）、同第ＷＯ２０１５／０８９４８６号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１７５）、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１６９１号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５１８３０号。
また、米国仮出願第６１／７５８，４６８号、同第６１／８０２，１７４号、同第６１／８０６，３７５号、同第６１／８１４，２６３号、同第６１／８１９，８０３号、及び同第６１／８２８，１３０号（それぞれ２０１３年１月３０日、２０１３年３月１５日、２０１３年３月２８日、２０１３年４月２０日、２０１３年５月６日、及び２０１３年５月２８日に出願）も参照する。また、米国仮出願第６１／８３６，１２３号（２０１３年６月１７日出願）も参照する。さらに、米国仮出願第６１／８３５，９３１号、同第６１／８３５，９３６号、同第６１／８３５，９７３号、同第６１／８３６，０８０号、同第６１／８３６，１０１号、及び同第６１／８３６，１２７号（いずれも２０１３年６月１７日出願）も参照する。さらに、米国仮出願第６１／８６２，４６８号及び同第６１／８６２，３５５号（２０１３年８月５日出願）、同第６１／８７１，３０１号（２０１３年８月２８日出願）、同第６１／９６０，７７７号（２０１３年９月２５日出願）、ならびにならびに同第６１／９６１，９８０号（２０１３年１０月２８日出願）を参照する。またさらに、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号（２０１４年１０月２８日出願）、ならびに米国仮特許出願第６１／９１５，１４８号、同第６１／９１５，１５０号、同第６１／９１５，１５３号、同第６１／９１５，２０３号、同第６１／９１５，２５１号、同第６１／９１５，３０１号、同第６１／９１５，２６７号、同第６１／９１５，２６０号、及び同第６１／９１５，３９７号（いずれも２０１３年１２月１２日出願）、ならびに同第６１／７５７，９７２号（２０１３年１月２９日出願）及び同第６１／７６８，９５９号（２０１３年２月２５日出願）；同第６２／０１０，８８８号及び同第６２／０１０，８７９号（いずれも２０１４年６月１１日出願）；同第６２／０１０，３２９号、同第６２／０１０，４３９号、及び同第６２／０１０，４４１号（いすれも２０１４年６月１０日出願）；同第６１／９３９，２２８号及び同第６１／９３９，２４２号（いずれも２０１４年２月１２日出願）；同第６１／９８０，０１２号（２０１４年４月１５日出願）；同第６２／０３８，３５８号（２０１４年８月１７日出願）；同第６２／０５５，４８４号、同第６２／０５５，４６０号、及び同第６２／０５５，４８７号（２０１４年９月２５日出願）；ならびに同第６２／０６９，２４３号（２０１４年１０月２７日出願）も参照する。とりわけ、米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号（２０１４年６月１０日出願）を指定するＰＣＴ出願を参照する。米国仮出願第６１／９３０，２１４号（２０１４年１月２２日出願）を参照する。とりわけ、米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号（２０１４年６月１０日出願）を指定するＰＣＴ出願を参照する。
また、言及は、米国仮出願第６２／１８０，７０９号（２０１５年１月１７日出願、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））；米国仮出願第６２／０９１，４５５号（２０１４年１２月１２日出願、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））；米国仮出願第６２／０９６，７０８号（２０１４年１２月２４日出願、ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ ＧＵＩＤＥ ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））；米国仮出願第６２／０９１，４６２号（２０１４年１２月１２日出願）、同第６２／０９６，３２４号（２０１４年１２月２３日出願）、同第６２／１８０，６８１号（２０１５年１月１７日出願）、及び同第６２／２３７，４９６号（２０１５年１０月５日出願）（ＤＥＡＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＳ）；米国仮出願第６２／０９１，４５６号（２０１４年１２月１２日出願）及び同第６２／１８０，６９２号（２０１５年１月１７日出願）（ＥＳＣＯＲＴＥＤ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０９１，４６１号（２０１４年１２月１２日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＡＳ ＴＯ ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ））；米国仮出願第６２／０９４，９０３号（２０１４年１２月１９日出願、ＵＮＢＩＡＳＥＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＯＵＢＬＥ－ＳＴＲＡＮＤ ＢＲＥＡＫＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＩＣ ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ ＢＹ ＧＥＮＯＭＥ－ＷＩＳＥ ＩＮＳＥＲＴ ＣＡＰＴＵＲＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）；米国仮出願第６２／０９６，７６１号（２０１４年１２月２４日出願、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）；米国仮出願第６２／０９８，０５９号（２０１４年１２月３０日出願）、同第６２／１８１，６４１号（２０１５年１月１８日出願）、及び同第６２／１８１，６６７号（２０１５年１月１８日出願）（ＲＮＡ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ）；米国仮出願第６２／０９６，６５６号（２０１４年１２月２４日出願）及び同第６２／１８１，１５１号（２０１５年１月１７日出願）（ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＤＯＭＡＩＮＳ）；米国仮出願第６２／０９６，６９７号（２０１４年１２月２４日出願、ＣＲＩＳＰＲ ＨＡＶＩＮＧ ＯＲ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＡＡＶ）；米国仮出願第６２／０９８，１５８号（２０１４年１２月３０日出願、ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／１５１，０５２号（２０１５年４月２２日出願、ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＦＯＲ ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＸＯＳＯＭＡＬ ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ）；米国仮出願第６２／０５４，４９０号（２０１４年９月２４日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）；米国仮出願第６１／９３９，１５４号（２０１４年２月１２日、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０５５，４８４号（２０１４年９月２５日出願、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０８７，５３７号（２０１４年１２月０４日出願、ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０５４，６５１号（２０１４年９月２４日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）；米国仮出願第６２／０６７，８８６号（２０１４年１０月２３日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ ＯＦ ＭＵＬＴＩＰＬＥ ＣＡＮＣＥＲ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＶＩＶＯ）；米国仮出願第６２／０５４，６７５号（２０１４年９月２４日出願）及び同第６２／１８１，００２号（２０１５年１月１７日出願）（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＮＥＵＲＯＮＡＬ ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ）；米国仮出願第６２／０５４，５２８号（２０１４年９月２４日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ）；米国仮出願第６２／０５５，４５４号（２０１４年９月２５日出願、ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＣＥＬＬ ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ））；米国仮出願第６２／０５５，４６０号（２０１４年９月２５日出願、ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）；米国仮出願第６２／０８７，４７５号（２０１４年１２月４日出願）及び同第６２／１８１，６９０号（２０１５年１月１８日出願）（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０５５，４８７号（２０１４年９月２５日出願、ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＷＩＴＨ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮出願第６２／０８７，５４６号（２０１４年１２月４日出願）及び同第６２／１８１，６８７号（２０１５年１月１８日出願）（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ ＡＮＤ／ＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ－ＣＲＩＳＰＲ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；ならびに米国仮出願第６２／０９８，２８５号（２０１４年１２月３０日出願、ＣＲＩＳＰＲ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＮ ＶＩＶＯ ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＴＵＭＯＲ ＧＲＯＷＴＨ ＡＮＤ ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ）でもなされている。
言及は、米国仮出願第６２／１８１，６５９号（２０１５年６月１８日出願）及び同第６２／２０７，３１８号（２０１５年８月１９日出願）（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ，ＥＮＺＹＭＥ ＡＮＤ ＧＵＩＤＥ ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ ＯＦ ＣＡＳ９ ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ ＡＮＤ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）でなされている。言及は、米国仮出願第６２／１８１，６６３号（２０１５年６月１８日出願）及び同第６２／２４５，２６４号（２０１５年１０月２２日出願）（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）、米国仮出願第６２／１８１，６７５号（２０１５年６月１８日出願）、同第６２／２８５，３４９号（２０１５年１０月２２日出願）、同第６２／２９６，５２２号（２０１６年２月１７日出願）、及び同第６２／３２０，２３１号（２０１６年４月８日出願）（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）、米国仮出願第６２／２３２，０６７号（２０１５年９月２４日出願）、米国出願第１４／９７５，０８５号（２０１５年１２月１８日出願）、欧州出願第１６１５０４２８．７号、米国仮出願第６２／２０５，７３３号（２０１５年８月１６日出願）、米国仮出願第６２／２０１，５４２号（２０１５年８月５日出願）、米国仮出願第６２／１９３，５０７号（２０１５年７月１６日出願）、及び米国仮出願第６２／１８１，７３９号（２０１５年６月１８日出願）（いずれの表題もＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）、ならびに米国仮出願第６２／２４５，２７０号（２０１５年１０月２２日出願）（ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ）でなされている。また、言及は、米国仮出願第６１／９３９，２５６号（２０１４年２月１２日出願）及びＷＯ２０１５／０８９４７３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０１５２）（２０１４年１２月１２日出願）（いずれの表題もＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＧＵＩＤＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＷＩＴＨ ＮＥＷ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）でもなされている。また、言及は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５５０４号（２０１５年４月１５日出願）、米国仮出願第６２／１８０，６９９号（２０１５年６月１７日出願）、及び米国仮出願第６２／０３８，３５８号（２０１４年８月１７日出願）（いずれの表題もＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳ９ ＮＩＣＫＡＳＥＳ）でもなされている。
加えて、言及は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／７００５７号、弁護士参照４７６２７．９９．２０６０及びＢＩ－２０１３／１０７（表題“ＤＥＬＩＶＥＲＹ， ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＵＳＩＮＧ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）（米国仮出願第６２／０５４，４９０号（２０１４年９月２４日出願）；同第６２／０１０，４４１号（２０１４年６月１０日出願）；ならびに同第６１／９１５，１１８号、同第６１／９１５，２１５号、及び同第６１／９１５，１４８号（いずれも２０１３年１２月１２日出願）（“ｔｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＰＣＴ”）（参照により本明細書に援用される）のうちの１つ以上または全ての優先権を主張する）、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／７０１２７号、弁護士参照４７６２７．９９．２０９１及びＢＩ－２０１３／１０１（表題“ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＧＥＮＯＭＥ ＥＤＩＴＩＮＧ”（ｃｌａｉｍｉｎｇ ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｏｒ ａｌｌ ｏｆ 米国仮出願第６１／９１５，１７６号；同第６１／９１５，１９２号；同第６１／９１５，２１５号；同第６１／９１５，１０７号、同第６１／９１５，１４５号；同第６１／９１５，１４８号；及び同第６１／９１５，１５３号（いずれも２０１３年１２月１２日出願）（“ｔｈｅ Ｅｙｅ ＰＣＴ”）（参照により本明細書に援用される）のうちの１つ以上または全ての優先権を主張する）でも、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓエフェクタータンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質、及びアルコールを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる混合物と混和させることを含む、方法に関してなされている。例えば、Ｃａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡは、好適な（例えば、３：１～１：３または２：１～１：２または１：１の）モル比で、好適な温度（例えば、１５～３０℃、例えば２０～２５℃、例えば室温）で、好適な時間（例えば、１５～４５分、例えば３０分）の間、有利には無菌のヌクレアーゼを含まないバッファー（例えば、１Ｘ ＰＢＳ）中で一緒に混合した。これとは別に、以下のような、または以下を含む粒子構成要素：界面活性剤（例えば、カチオン性脂質、例えば、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ））；リン脂質（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ））；生分解性ポリマー（例えば、エチレングリコールポリマーまたはＰＥＧ）；及びリポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質、例えば、コレステロール）を、アルコール、有利にはＣ１～６アルキルアルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば、１００％エタノール）中に溶解した。２つの溶液を一緒に混合し、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を含む粒子を形成した。したがって、ｓｇＲＮＡをＣａｓタンパク質と予め複合体化させてから、複合体全体を製剤化して粒子にすることができる。製剤は、核酸の細胞内への送達を促進することが知られている異なる構成要素（例えば、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール）を用いて、異なるモル比で作製することができる。例えば、ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比は、ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０、またはＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０、またはＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５、ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０とすることができる。他の例示的なヌクレオチド結合システム及びタンパク質
他の例示的なヌクレオチド結合分子及びシステム
１つの実施形態において、ヌクレオチド結合分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムではないシステムの１つ以上の構成要素であってもよい。他のヌクレオチド結合分子の例としては、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、その機能的フラグメント、そのバリアント、及びこれらの任意の組合せの構成要素が考えられる。
ＴＡＬＥシステム
いくつかの実施形態において、システム内のヌクレオチド結合分子は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ、その機能的フラグメント、またはそのバリアントであり得る。また本開示は、ＴＡＬＥシステムの１つ以上の構成要素である、またはそれをコードするヌクレオチド配列も含む。本明細書で開示しているように、編集は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムによって行うことができる。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、ほぼ任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮシステムを用いたゲノム編集の例示的な方法は、例えば、Ｃｅｒｍａｋ Ｔ．Ｄｏｙｌｅ ＥＬ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ．Ｗａｎｇ Ｌ．Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１；３９：ｅ８２；Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｃｏｎｇ Ｌ．Ｌｏｄａｔｏ Ｓ．Ｋｏｓｕｒｉ Ｓ．Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ．Ａｒｌｏｔｔａ Ｐ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：１４９－１５３ならびに米国特許第８，４５０，４７１号、同第８，４４０，４３１号、及び同第８，４４０，４３２号に見出すことができ、これらの全てが参照により明確に援用される。
１つの実施形態において、本明細書で提供されるものには、単離された非天然の組換えまたは操作されたＤＮＡ結合タンパク質であって、その組織構造の一部として、効率が改善され特異性が拡大した核酸配列の標的化を可能にするＴＡＬＥ単量体を含む、ＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。
天然のＴＡＬＥ、すなわち「野生型ＴＡＬＥ」は、プロテオバクテリアの多くの種で分泌される核酸結合タンパク質である。ＴＡＬＥポリペプチドは、主に３３、３４、または３５アミノ酸の長さであり、主にアミノ酸位置１２と１３で互いに異なる、高度に保存された単量体ポリペプチドのタンデムリピートから構成された核酸結合ドメインを含む。１つの実施形態において、核酸はＤＮＡである。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド単量体」、または「ＴＡＬＥ単量体」という用語は、ＴＡＬＥ核酸結合ドメイン内の高度に保存された反復ポリペプチド配列を指すために使用し、「反復可変二残基」または「ＲＶＤ」という用語は、ポリペプチド単量体の位置１２及び１３の高可変アミノ酸を指すために使用される。本開示全体で示されるように、ＲＶＤのアミノ酸残基は、アミノ酸のためのＩＵＰＡＣ単一文字コードを用いて記述される。ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれるＴＡＬＥ単量体の一般的な表現は、Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５であり、ここで、下付き文字はアミノ酸位置を示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。Ｘ１２Ｘ１３はＲＶＤを示す。いくつかのポリペプチド単量体では、位置１３の可変アミノ酸が欠損または存在せず、このようなポリペプチド単量体では、ＲＶＤは単一アミノ酸からなる。このような場合、ＲＶＤは、代替的にＸ＊と表すことができる（ＸはＸ１２を表し、（＊）はＸ１３が存在しないことを示す）。ＤＮＡ結合ドメインは、いくつかのＴＡＬＥ単量体のリピートを含み、これは、（Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５）ｚとして表すことができ、有利な実施形態において、ｚは少なくとも５～４０である。さらに有利な実施形態において、ｚは少なくとも１０～２６である。
ＴＡＬＥ単量体は、そのＲＶＤにおけるアミノ酸の同一性によって決定されるヌクレオチド結合親和性を有する。例えば、ＮＩのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン（Ａ）に優先的に結合し、ＮＧのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、チミン（Ｔ）に優先的に結合し、ＨＤのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、シトシン（Ｃ）に優先的に結合し、ＮＮのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の両方に優先的に結合する。本発明のまた別の実施形態において、ＩＧのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、Ｔに優先的に結合する。したがって、ＴＡＬＥの核酸結合ドメイン内のポリペプチド単量体のリピートの数及び順序が、その核酸標的特異性を決定する。本発明のなおさらなる別の実施形態において、ＮＳのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、４つ全ての塩基対を認識し、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣに結合することができる。ＴＡＬＥの構造及び機能についてはさらに、例えば、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１（２００９）；Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２（２００９）；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）で説明されている（これらの各々が参照により全体として援用される）。
諸方法に使用されるＴＡＬＥポリペプチドは、特定の核酸配列を標的とするように設計されたポリペプチド単量体リピートを含む核酸またはＤＮＡ結合領域を有する単離された非天然の組換えまたは操作された核酸結合タンパク質である。
本明細書に記載のように、ＨＮまたはＮＨのＲＶＤを有するポリペプチド単量体はグアニンに優先的に結合して、グアニン含有標的核酸配列に対し高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。好ましい実施形態において、ＲＮ、ＮＮ、ＮＫ、ＳＮ、ＮＨ、ＫＮ、ＨＮ、ＮＱ、ＨＨ、ＲＧ、ＫＨ、ＲＨ、及びＳＳのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合する。はるかに有利な実施形態において、ＲＮ、ＮＫ、ＮＱ、ＨＨ、ＫＨ、ＲＨ、ＳＳ、及びＳＮのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合して、グアニン含有標的核酸配列に対し高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。なおより有利な実施形態において、ＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、及びＳＳのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、グアニンに優先的に結合して、グアニン含有標的核酸配列に対し高い結合特異性を有するＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。さらに有利な実施形態において、グアニンに対し高い結合特異性を有するＲＶＤは、ＲＮ、ＮＨ、ＲＨ、及びＫＨである。さらに、ＮＶのＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン及びグアニンに優先的に結合する。より好ましい実施形態において、Ｈ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、及びＳ＊のＲＶＤを有するポリペプチド単量体は、アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンに同等の親和性で結合する。
核酸またはＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のポリペプチド単量体の所定のＮ末端→Ｃ末端の順序により、ＴＡＬＥポリペプチドが結合する対応する所定の標的核酸配列が決定される。本明細書で使用する場合、ポリペプチド単量体及び少なくとも１つ以上の半ポリペプチド単量体は、目的のゲノム座位または遺伝子を「標的とするように特異的に並べられている」。植物ゲノムの場合、天然のＴＡＬＥ結合部位は常にチミン（Ｔ）で開始し、これはＴＡＬＥポリペプチドの非反復Ｎ末端内の暗号シグナルによって指定することができる。１つの実施形態において、この領域はリピート０と称され得る。動物ゲノムの場合、ＴＡＬＥ結合部位は必ずしもチミン（Ｔ）で開始する必要はなく、ＴＡＬＥポリペプチドは、Ｔ、Ａ、Ｇ、またはＣで開始するＤＮＡ配列を標的とすることができる。ＴＡＬＥ単量体のタンデムリピートは常に半分の長さのリピートまたは反復性完全長ＴＡＬＥ単量体の最初の２０アミノ酸のみと同一性を共有することができる配列のストレッチで終了する。この半分のリピートは半単量体と称されることがあり、これは「ＴＡＬＥ単量体」という用語に含まれる。そのため、標的とされる核酸またはＤＮＡの長さは、完全なポリペプチド単量体の数に２を足したものに等しい。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、ＴＡＬＥポリペプチド結合効率は、天然のＴＡＬＥのＤＮＡ結合領域の直接Ｎ末端またはＣ末端にある「キャッピング領域」からのアミノ酸配列を、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合領域のＮ末端またはＣ末端の位置にある操作されたＴＡＬＥ内に含めることにより、高めることができる。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドはさらに、Ｎ末端キャッピング領域及び／またはＣ末端キャッピング領域を含む。
Ｎ末端キャッピング領域の例示的なアミノ酸配列は、以下の通り。
Ｍ Ｄ Ｐ Ｉ Ｒ Ｓ Ｒ Ｔ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｒ Ｅ Ｌ Ｌ Ｓ Ｇ Ｐ Ｑ Ｐ Ｄ Ｇ Ｖ Ｑ Ｐ Ｔ Ａ Ｄ Ｒ Ｇ Ｖ Ｓ Ｐ
Ｐ Ａ Ｇ Ｇ Ｐ Ｌ Ｄ Ｇ Ｌ Ｐ Ａ Ｒ Ｒ Ｔ Ｍ Ｓ Ｒ Ｔ Ｒ Ｌ Ｐ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｆ Ｓ Ａ Ｄ Ｓ
Ｆ Ｓ Ｄ Ｌ Ｌ Ｒ Ｑ Ｆ Ｄ Ｐ Ｓ Ｌ Ｆ Ｎ Ｔ Ｓ Ｌ Ｆ Ｄ Ｓ Ｌ Ｐ Ｐ Ｆ Ｇ Ａ Ｈ Ｈ Ｔ Ｅ Ａ Ａ Ｔ Ｇ
Ｅ Ｗ Ｄ Ｅ Ｖ Ｑ Ｓ Ｇ Ｌ Ｒ Ａ Ａ Ｄ Ａ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｍ Ｒ Ｖ Ａ Ｖ Ｔ Ａ Ａ Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ａ
Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ａ Ａ Ｑ Ｐ Ｓ Ｄ Ａ Ｓ Ｐ Ａ Ａ Ｑ Ｖ Ｄ Ｌ Ｒ Ｔ Ｌ Ｇ Ｙ Ｓ Ｑ Ｑ Ｑ Ｑ Ｅ Ｋ Ｉ Ｋ Ｐ
Ｋ Ｖ Ｒ Ｓ Ｔ Ｖ Ａ Ｑ Ｈ Ｈ Ｅ Ａ Ｌ Ｖ Ｇ Ｈ Ｇ Ｆ Ｔ Ｈ Ａ Ｈ Ｉ Ｖ Ａ Ｌ Ｓ Ｑ Ｈ Ｐ Ａ Ａ Ｌ Ｇ
Ｔ Ｖ Ａ Ｖ Ｋ Ｙ Ｑ Ｄ Ｍ Ｉ Ａ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ａ Ｔ Ｈ Ｅ Ａ Ｉ Ｖ Ｇ Ｖ Ｇ Ｋ Ｑ Ｗ Ｓ Ｇ Ａ Ｒ Ａ Ｌ
Ｅ Ａ Ｌ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｇ Ｅ Ｌ Ｒ Ｇ Ｐ Ｐ Ｌ Ｑ Ｌ Ｄ Ｔ Ｇ Ｑ Ｌ Ｌ Ｋ Ｉ Ａ Ｋ Ｒ Ｇ Ｇ Ｖ Ｔ Ａ Ｖ
Ｅ Ａ Ｖ Ｈ Ａ Ｗ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｔ Ｇ Ａ Ｐ Ｌ Ｎ（配列番号１）
Ｃ末端キャッピング領域の例示的なアミノ酸配列は、以下の通り。
Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｅ Ｓ Ｉ Ｖ Ａ Ｑ Ｌ Ｓ Ｒ Ｐ Ｄ Ｐ Ａ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｔ Ｎ Ｄ Ｈ Ｌ Ｖ Ａ Ｌ Ａ Ｃ Ｌ Ｇ
Ｇ Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｄ Ａ Ｖ Ｋ Ｋ Ｇ Ｌ Ｐ Ｈ Ａ Ｐ Ａ Ｌ Ｉ Ｋ Ｒ Ｔ Ｎ Ｒ Ｒ Ｉ Ｐ Ｅ Ｒ Ｔ Ｓ Ｈ Ｒ
Ｖ Ａ Ｄ Ｈ Ａ Ｑ Ｖ Ｖ Ｒ Ｖ Ｌ Ｇ Ｆ Ｆ Ｑ Ｃ Ｈ Ｓ Ｈ Ｐ Ａ Ｑ Ａ Ｆ Ｄ Ｄ Ａ Ｍ Ｔ Ｑ Ｆ Ｇ Ｍ
Ｓ Ｒ Ｈ Ｇ Ｌ Ｌ Ｑ Ｌ Ｆ Ｒ Ｒ Ｖ Ｇ Ｖ Ｔ Ｅ Ｌ Ｅ Ａ Ｒ Ｓ Ｇ Ｔ Ｌ Ｐ Ｐ Ａ Ｓ Ｑ Ｒ Ｗ Ｄ Ｒ
Ｉ Ｌ Ｑ Ａ Ｓ Ｇ Ｍ Ｋ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ｓ Ｐ Ｔ Ｓ Ｔ Ｑ Ｔ Ｐ Ｄ Ｑ Ａ Ｓ Ｌ Ｈ Ａ Ｆ Ａ Ｄ Ｓ Ｌ Ｅ
Ｒ Ｄ Ｌ Ｄ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ｍ Ｈ Ｅ Ｇ Ｄ Ｑ Ｔ Ｒ Ａ Ｓ（配列番号２）
本明細書で使用する場合、Ｎ末端キャッピング領域、リピートＴＡＬＥ単量体を含むＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端キャッピング領域の所定の「Ｎ末端」→「Ｃ末端」方向は、ｄ－ＴＡＬＥまたはポリペプチドにおける異なるドメインの組織化に構造的基盤をもたらす。
ＤＮＡ結合領域の結合活性を強化する上で、全体のＮ末端及び／またはＣ末端キャッピング領域は必要とされない。そのため、１つの実施形態において、Ｎ末端及び／またはＣ末端キャッピング領域のフラグメントが、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドに含まれる。
１つの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｎ末端キャッピング領域の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、５４、６０、７０、８０、８７、９０、９４、１００、１０２、１１０、１１７、１２０、１３０、１４０、１４７、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、または２７０アミノ酸を含んだＮ末端キャッピング領域フラグメントを含む。１つの実施形態において、Ｎ末端キャッピング領域フラグメントアミノ酸は、Ｎ末端キャッピング領域のＣ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、Ｃ末端の２４０アミノ酸を含むＮ末端キャッピング領域フラグメントは、完全長キャッピング領域に等しい結合活性を強化し、一方、Ｃ末端の１４７アミノ酸を含むフラグメントは、完全長キャッピング領域の有効性の８０％超を保持し、Ｃ末端の１１７アミノ酸を含むフラグメントは、完全長キャッピング領域の活性の５０％超を保持する。
１つの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｃ末端キャッピング領域の少なくとも６、１０、２０、３０、３７、４０、５０、６０、６８、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２７、１３０、１４０、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０アミノ酸を含んだＣ末端キャッピング領域フラグメントを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端キャッピング領域フラグメントアミノ酸は、Ｃ末端キャッピング領域のＮ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、Ｃ末端の６８アミノ酸を含むＣ末端キャッピング領域フラグメントは、完全長キャッピング領域に等しい結合活性を強化し、一方、Ｃ末端の２０アミノ酸を含むフラグメントは、完全長キャッピング領域の有効性の５０％超を保持する。
１つの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書で提供するキャッピング領域配列と同一の配列を有する必要がない。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書で提供するキャッピング領域アミノ酸配列に対し少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または同一性を共有する配列を有する。配列同一性は、配列相同性に関係する。相同性比較は目視で行うことができるが、より通例的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸または核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャッピング領域は、本明細書で提供するキャッピング領域アミノ酸配列に対し少なくとも９５％同一であるか、または同一性を共有する配列を有する。
配列相同性は、当技術分野で知られている複数のコンピュータープログラムのいずれかによって生成することができ、これには、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡが含まれる。また、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージのようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムも使用することができる。ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
本明細書に記載の１つの実施形態において、ＴＡＬＥポリペプチドは、１つ以上のエフェクタードメインと連結した核酸結合ドメインを含む。「エフェクタードメイン」または「調節及び機能ドメイン」という用語は、核酸結合ドメインが認識する核酸配列との結合以外の活性を有するポリペプチド配列を指す。核酸結合ドメインを１つ以上のエフェクタードメインとを組み合わせることにより、ポリペプチドを使用して、エフェクタードメインによって媒介される１つ以上の機能または活性の標的を、核酸結合ドメインが特異的に結合する特定の標的ＤＮＡ配列に向けることができる。
本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドの１つの実施形態において、エフェクタードメインによって媒介される活性は生物学的活性である。例えば、１つの実施形態において、エフェクタードメインは、転写阻害物質（すなわち、リプレッサードメイン）、例えば、ｍＳｉｎ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＳＩＤ４Ｘドメイン、またはクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、またはＫＲＡＢドメインのフラグメントである。１つの実施形態において、エフェクタードメインは、転写のエンハンサー（すなわち、活性化ドメイン）、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、またはｐ６５活性化ドメインである。１つの実施形態において、核酸結合は、例えば、エフェクタードメイン（限定されるものではないが、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写リプレッサー、転写アクチベーター、転写因子動員、タンパク質核局在シグナル、または細胞取込みシグナルを含む）と連結している。
１つの実施形態において、エフェクタードメインは、活性（限定されるものではないが、トランスポザーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リゾルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル伝達活性、転写リプレッサー活性、転写アクチベーター活性、転写因子動員活性、または細胞取込みシグナル伝達活性を含む）を示すタンパク質ドメインである。他の好ましい実施形態としては、本明細書に記載の活性の任意の組合せを挙げることができる。
Ｚｎ－フィンガーヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、システムのヌクレオチド結合分子は、Ｚｎ－フィンガーヌクレアーゼ、その機能的フラグメント、またはそのバリアントであり得る。組成物は、１つ以上のＺｎ－フィンガーヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸を含むことができる。１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、Ｚｎ－Ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼのコード配列を含むことができる。本明細書で使用するゲノム編集のための他の好ましいツールとしては、ジンクフィンガーシステム及びＴＡＬＥシステムが挙げられる。１つのタイプのプログラム可能ＤＮＡ結合ドメインが、人工ジンクフィンガー（ＺＦ）技術によって提供され、これはゲノム内の新たなＤＮＡ結合部位を標的とするためのＺＦモジュールのアレイを含む。ＺＦアレイ内の各フィンガーモジュールは、３つのＤＮＡ塩基を標的とする。個々のジンクフィンガードメインのカスタマイズされたアレイが、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）に集成される。
ＺＦＰは機能的ドメインを含むことができる。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩの触媒ドメインにＺＦタンパク質を融合させることによって開発された（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，８８３－８８７；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｏｋ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１１５６－１１６０）。対になったＺＦＮヘテロ二量体（各々が短いスペーサーによって区切られた異なるヌクレオチド配列を標的とする）を使用することにより、オフターゲット活性の減少とともに切断特異性の増加を達成することができる（Ｄｏｙｏｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，７４－７９）。また、ＺＦＰは、転写アクチベーター及びリプレッサーとして設計することができ、多種多様な生物内の多くの遺伝子を標的とするために使用されている。ＺＦＮを用いたゲノム編集の例示的な方法は、例えば米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第６，４７９，６２６号に見出すことができ、これらの全てが参照により明確に援用される。
メガヌクレアーゼ
１つの実施形態において、ヌクレオチド結合ドメインは、メガヌクレアーゼ、その機能的フラグメント、またはそのバリアントであり得る。組成物は、１つ以上のメガヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸を含むことができる。本明細書で開示するように、編集は、メガヌクレアーゼ（大きな認識部位（１２～４０塩基対の二重鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼ）によって行うことができる。１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、メガヌクレアーゼのコード配列を含むことができる。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、米国特許第８，１６３，５１４号；同第８，１３３，６９７号；同第８，０２１，８６７号；同第８，１１９，３６１号；同第８，１１９，３８１号；同第８，１２４，３６９号；及び同第８，１２９，１３４号に見出すことができ、これらは参照により明確に援用される。
１つの実施形態において、本明細書に記載の修飾ヌクレアーゼを含む任意のヌクレアーゼを方法、組成物、及びキットに使用することができる。特定の実施形態において、非修飾ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を本明細書に記載のいずれかの修飾ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性と比較して、例えば、オフターゲットまたはオンターゲット効果を比較することができる。代替的に、異なる修飾ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性（または本明細書に記載の修飾活性）を比較して、例えば、オフターゲット効果またはオンターゲット効果を比較することができる。
リンカー
トランスポザーゼ（複数可）及びＣａｓタンパク質（複数可）は、リンカーを介して会合することができる。「リンカー」という用語は、タンパク質を連結して融合タンパク質を形成する分子を指す。概して、このような分子は、タンパク質間の何らかの最小距離または他の空間的関係をつなぐまたは保持すること以外には、特定の生物学的活性を有しない。ただし、１つの実施形態において、リンカーは、リンカー及び／または融合タンパク質の何らかの特性（例えば、リンカーの折畳み、正味電荷、または疎水性）に影響を及ぼすように選択することができる。
本明細書の方法で使用するのに適したリンカーとしては、直鎖状もしくは分枝状鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。ただし、本明細書で使用する場合、リンカーは、共有結合（炭素間結合または炭素－ヘテロ原子結合）であってもよい。特定の実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質及びトランスポザーゼを、各タンパク質がその必要な機能的性質を保持することを確実にするのに十分な距離だけ離すために使用される。ペプチドリンカー配列は、柔軟な拡張された立体構造をとることができ、秩序化された二次構造を形成する傾向を示さない。１つの実施形態において、リンカーは、単量体、二量体、多量体、または重合体であり得る化学部分とすることができる。好ましくは、リンカーはアミノ酸を含む。フレキシブルリンカーにおける典型的なアミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが挙げられる。したがって、特定の実施形態において、リンカーは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒのアミノ酸のうちの１つ以上の組合せを含む。また、中性に近いアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａ）もリンカー配列に使用することができる。例示的なリンカーは、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－６２；米国特許第４，９３５，２３３号；及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている。
例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＳＧを使用することができる。ＧＧＳ、ＧＳＧ、ＧＧＧＳ（配列番号３）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）リンカーは、３のリピート（例えば、（ＧＧＳ）３（配列番号５）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）、または５、６、７、９、またはさらに１２もしくはそれ以上のリピートで使用して、好適な長さを提供することができる。１つの実施形態において、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）３－１５（配列番号６－１８）とすることができ、例えば、１つの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３～１１（配列番号６～１４）、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１９）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号７）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号８）、（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号９）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号１０）、（ＧＧＧＧＳ）８（配列番号１１）、（ＧＧＧＧＳ）９（配列番号１２）、（ＧＧＧＧＳ）１０（配列番号１３）、または（ＧＧＧＧＳ）１１（配列番号１４）とすることができる。
特定の実施形態において、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６）などのリンカーが、本明細書では好ましく使用される。代替形態として、（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号９）、（ＧＧＧＧＳ）９（配列番号１２）、または（ＧＧＧＧＳ）１２ （配列番号１５）を使用してもよい。他の代替形態としては、（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号４）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１９）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号７）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号８）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号１０）、（ＧＧＧＧＳ）８（配列番号１１）、（ＧＧＧＧＳ）１０（配列番号１３）、または（ＧＧＧＧＳ）１１（配列番号１４）が挙げられる。またさらなる実施形態において、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号２０）がリンカーとして使用される。また追加的な実施形態において、リンカーはＸＴＥＮリンカーである。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号２０）リンカーにより、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインと連結している。さらなる特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号２０）リンカーにより、デアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端とＣ末端側で連結している。加えて、Ｎ末端及びＣ末端のＮＬＳも、リンカーとして機能することができる（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＳＰＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号２１））。表１は、本開示で目的となる可能なリンカーを収載している。
Figure 2023544822000002
リンカーは、ガイドＲＮＡと機能的ドメイン（アクチベーターまたはリプレッサー）との間、またはＣａｓタンパク質とトランスポザーゼ（複数可）との間で使用することができる。リンカーを使用して、適切な量の「機械的柔軟性」を操作することができる。
１つの実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、制御可能であり、例えば誘導可能である。
核局在化シグナル
１つの実施形態において、本明細書のシステム及び組成物はさらに、細胞の核内で構成要素（例えば、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可））が所望の量まで蓄積するのを駆動することが可能な１つ以上の核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む。
１つの実施形態において、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに付着させる。１つの実施形態において、１つ以上のＣ末端またはＮ末端のＮＬＳが付着している（よって、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）をコードする核酸分子（複数可）は、発現産物がＮＬＳ（複数可）を付着または接続させるようにＮＬＳ（複数可）のコードを含むことができる）。１つの実施形態において、Ｃ末端ＮＬＳは、真核細胞（例えば、ヒト細胞）内での発現及び核標的化のために付着させる。１つの実施形態において、ＮＬＳ（複数可）は、Ｃ末端またはＮ末端ではない位置にあってもよい。例えば、ＮＬＳ（複数可）は、２つのポリペプチド間（例えば、Ｃａｓタンパク質とトランスポザーゼとの間）にあってもよい。
ＮＬＳの非限定的な例としては、ＳＶ４０ウイルスラージＴ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、ヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；ｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインのＮＬＳ；筋腫Ｔタンパク質のＮＬＳ；ヒトｐ５３のＮＬＳ；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶのＮＬＳ；インフルエンザウイルスＮＳ１のＮＬＳ；デルタ型肝炎ウイルス抗原のＮＬＳ；マウスＭｘ１タンパク質のＮＬＳ；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼのＮＬＳ；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドのＮＬＳに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。例示的なＮＬＳ配列としては、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇら（ＷＯ２０１６１０６２３６Ａ１）の段落［００１０６］に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、ＮＬＳは異種ＮＬＳである。例えば、ＮＬＳは、自らが付着する分子（例えば、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可））内では天然に存在しない。
概して、核局在化活性の強度は、核酸標的化エフェクタータンパク質内のＮＬＳの数、使用する特定のＮＬＳ、またはこれらの因子の組合せに由来し得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施することができる。例えば、細胞内の位置を可視化できるように、例えば、核の位置を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて、検出可能なマーカーを核酸標的化タンパク質と融合することができる。
１つの実施形態において、本明細書に記載のベクター（例えば、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含むもの）は、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み、例えば、約１もしくはそれ超、約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約６もしくはそれ超、約７もしくはそれ超、約８もしくはそれ超、約９もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、またはそれ以上のＮＬＳを含む。より特定的には、ベクターは、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）に天然に存在しない１つ以上のＮＬＳを含む。最も特定的には、ＮＬＳは、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）配列のベクター５’及び／または３’に存在する。１つの実施形態において、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）は、アミノ末端またはその付近に約１もしくはそれ超、約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約６もしくはそれ超、約７もしくはそれ超、約８もしくはそれ超、約９もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、またはそれ以上のＮＬＳ、カルボキシ末端またはその付近に約１もしくはそれ超、約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約６もしくはそれ超、約７もしくはそれ超、約８もしくはそれ超、約９もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、またはそれ以上のＮＬＳ、あるいはこれらの組合せ（例えば、アミノ末端にゼロまたは少なくとも１つ以上のＮＬＳ、かつカルボキシ末端にゼロまたは１つ以上のＮＬＳ）を含む。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のものから独立して選択することができ、そのため、単一のＮＬＳが複数のコピー内に存在しても、及び／または１つ以上のコピー内に存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在してもよい。１つの実施形態において、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸内にあるとき、ＮＬＳはＮ末端またはＣ末端の付近にあるとみなされる。
１つの実施形態において、他の局在化タグを、例えば、限定されるものではないが、細胞内の特定の部位に（例えば、オルガネラ、例えば、ミトコンドリア、色素体、葉緑体、小胞、ゴルジ、（核または細胞）膜、リボソーム、核小体、ＥＲ、細胞骨格、液胞、セントロソーム、ヌクレオソーム、顆粒、中心粒などに）局在化するために、Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）に融合することができる。
標的化部分
システムはさらに、１つ以上の標的化部分を含むことができる。標的化部分は、例えば、表面受容体タンパク質に結合することにより、特定の細胞または組織に結合することができる。同様に、表２は、このような標的化部分を含むシステムを提供する各態様に関して、実施の際に使用することができる例示的な標的化部分を示している。

Figure 2023544822000003
したがって、システムの１つの実施形態において、標的化部分は、受容体リガンド（例えば、ＣＤ４４受容体に対するヒアルロン酸、肝細胞に対するガラクトース）、または抗体もしくはそのフラグメント（例えば、所望の表面受容体に対する結合抗体フラグメント）を含み、受容体リガンド、または抗体もしくはそのフラグメント（例えば、その結合フラグメント（例えば、所望の表面受容体に対するもの））を含む標的化部分の各々に関しては、システムが、受容体リガンド、または抗体もしくはそのフラグメント（例えば、その結合フラグメント（例えば、所望の表面受容体に対するもの）、またはＣＤ４４受容体に対するヒアルロン酸、肝細胞に対するガラクトース）を含む標的化部分を含む態様が存在する（例えば、Ｓｕｒａｃｅ ｅｔ ａｌ，“Ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ４４ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ６（４）：１０６２－７３；ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００２１５ｄ（２００９）；Ｓｏｎｏｋｅ ｅｔ ａｌ，“Ｇａｌａｃｔｏｓｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ａ ｌｉｖｅｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，”Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．３４（８）：１３３８－４２（２０１１）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，”Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．５（９），１００３－１０２５（２００８）；Ｍａｎｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅａｌｔｈ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ，”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １５０（１），２－２２（２０１１）；Ｓｏｆｏｕ Ｓ “Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ，”Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．５（２）：１８９－２０４（２００８）；Ｇａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，”Ｍｉｎｉ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（１４）：２０２６－２０３５（２０１３）；Ｍｏｌａｖｉ ｅｔ ａｌ，“Ａｎｔｉ－ＣＤ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ，”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４（３４）：８７１８－２５（２０１３）を参照（これらの各々及びそこで引用されている文書は、参照により本明細書に援用される）。
さらに、本明細書における教示を考慮すると、当業者は、脂質実体に関して所望の標的化部分を容易に選択及び適用することができる。１つの実施形態において、システムは、標的化部分を有する脂質実体を含む。
ポリヌクレオチド及びベクター
本明細書のシステムは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチド（複数可）は、Ｃａｓタンパク質（複数可）、トランスポザーゼ（複数可）、ガイド分子（複数可）、ドナーポリヌクレオチド（複数可）、またはこれらの任意の組合せのコード配列を含むことができる。本開示はさらに、本明細書の１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターまたはベクターシステムを提供する。ベクターまたはベクターシステムとしては、本明細書の送達のセクションに記載されているものが挙げられる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログのいずれかを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、また既知または未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例は以下の通り：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される座位（ｌｏｃｉ）（座位（ｌｏｃｕｓ））、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。またこの用語は、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ－Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド及びそのアナログ）を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、多量体の集成の前に付与されても後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば標識構成要素との結合体化によってさらに修飾することができる。本明細書で使用する場合、「野生型」という用語は、当業者が理解している技術用語であり、自然界に生じる生物、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味し、変異形態またはバリアント形態とは区別される。「野生型」はベースラインとすることができる。本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、自然界に生じるものから逸脱したパターンを有する性質の提示を意味するものと解釈されるべきである。「非天然」または「操作された」という用語は互換的に使用され、人の手が関与することを示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に会合し、自然界で見出される少なくとも１つの他の構成要素から、少なくとも実質的に遊離していることを意味する。「相補性」とは、伝統的なワトソン－クリック塩基対合または他の非伝統的タイプのいずれかによって核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成し得る核酸分子内の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０中５、６、７、８、９、１０であれば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的となる）。「完全に相補的」とは、ある核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列内の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェント条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェント条件」とは、標的配列に対し相補性を有する核酸が標的配列と支配的にハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は、概して配列依存的であり、多くの因子に応じて変動する。概して、配列が長いほど、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェント条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．で詳細に記載されている。ポリヌクレオチド配列を参照する場合、相補的または部分的に相補的な配列も想定する。これらは、好ましくは、高度なストリンジェント条件下で参照配列とハイブリダイズすることが可能である。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大化するため、比較的ストリンジェンシーが低いハイブリダイゼーション条件：熱融点（Ｔｍ）より約２０～２５℃低い温度が選択される。Ｔｍとは、定義されたイオン強度及びｐＨの溶液中で、特定の標的配列の５０％が完全に相補的なプローブとハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズする配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求するために、Ｔｍより約５～１５℃低い、非常にストリンジェントな洗浄条件が選択される。所与の配列とハイブリダイズが可能な配列は、その配列の「相補物」と称される。
本明細書で使用する場合、「ゲノム座位」または「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数形はｌｏｃｉ）という用語は、染色体上の遺伝子またはＤＮＡ配列の特定の位置のことである。「遺伝子」とは、生物内で機能的な役割を有するポリペプチドまたはＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのストレッチを指し、したがってこれは生物における遺伝の分子単位である。遺伝子が遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと考えられ得、このような調節配列がコード及び／または転写配列に隣接しているか否かは問わない。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、座位制御領域を含む。本明細書で使用する場合、「ゲノム座位の発現」または「遺伝子発現」とは、遺伝子からの情報が機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスのことである。遺伝子発現の産物はタンパク質であることが多いが、非タンパク質コード遺伝子（例えば、ｒＲＮＡ遺伝子またはｔＲＮＡ遺伝子）の場合、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、生存するための機能的な産物を生成するために、既知の全ての生命（真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、ならびにウイルス）が使用している。本明細書で使用する場合、遺伝子または核酸の「発現」は、細胞の遺伝子発現を包含するだけではなく、クローニングシステム及び他の任意の文脈における核酸（複数可）の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用する場合、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から転写されるプロセス（例えば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写産物）、及び／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスも指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と称することができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内でのｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体を指す。多量体は、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これらの用語は、修飾（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作（例えば、標識構成要素との結合体化））がなされたアミノ酸多量体も含む。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、天然及び／または非天然もしくは合成のアミノ酸を含み、これにはグリシン及びＤ型またはＬ型両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣体が含まれる。本明細書で使用する場合、「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」という用語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立して存在し機能することができるタンパク質配列の一部分を指す。諸態様で説明しているように、配列同一性は配列相同性に関係する。相同性比較は目視で行うことができるが、より通例的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸または核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は組換えＤＮＡである。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列はさらに、本明細書の他の箇所に記載されているような追加の配列を含む。１つの実施形態において、核酸配列はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される。
本開示の諸態様は、本明細書の任意の実施形態で言及されているようなシステムの１つ以上の構成要素をコードするポリヌクレオチド分子に関係する。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらなる調節配列を含むことができる。教示としてであり、限定するものではないが、ポリヌクレオチド配列は、発現プラスミド、ミニサークル、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクター、ピギーバックベクター、またはｔｏｌ２ベクターの一部であり得る。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド配列はバイシストロニック発現コンストラクトであってもよい。さらなる実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は、細胞ゲノムに組み込むことができる。またさらなる実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は、細胞ゲノムの一部であり得る。さらなる実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は、人工染色体中に含まれてもよい。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列の５’及び／または３’末端は、分解を積極的に回避する配列の安定性を改善するように修飾することができる。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージに含まれてもよい。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム種に含まれてもよい。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチド配列は凍結乾燥される。
コドン最適化
本開示の諸態様は、本明細書の実施形態のいずれかに記載のシステムの１つ以上の構成要素をコードするポリヌクレオチド分子であって、ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つ以上の領域が、真核細胞内での発現にコドン最適化されてもよい、ポリヌクレオチド分子に関する。１つの実施形態において、本明細書のいずれかの実施形態に記載のシステムの１つ以上の構成要素をコードするポリヌクレオチド分子は、哺乳類細胞または植物細胞内での発現に最適化されている。
コドン最適化配列の一例は、この場合、真核生物（例えば、ヒト）内での発現に対し最適化された（すなわち、ヒト内での発現のために最適化されている）配列、または本明細書で論じているような別の真核生物、動物、もしくは哺乳類に対し最適化された配列である。例えば、コドン最適化配列の例として、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照（当技術分野及び本開示の知識から、コドン最適化コード核酸分子（複数可）（特にエフェクタータンパク質に関して）は、当業者の範囲内にある）。これが好ましいものの、他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、または特定の器官に対するコドン最適化が知られていることは理解されよう。１つの実施形態において、Ｃａｓタンパク質及び／またはトランスポザーゼをコードする酵素コード配列は、特定の細胞（例えば、真核細胞）内での発現に対しコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、植物または哺乳類（限定されるものではないが、ヒト、または本明細書で論じているような非ヒト真核生物または動物または哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳類もしくは霊長類を含む）のものであっても、それに由来してもよい。１つの実施形態において、ヒトの生殖細胞系列の遺伝子内容を修飾するためのプロセス、及び／または、ヒトもしくは動物に対するいかなる実質的な医学的利益も伴わずに動物に苦しめる可能性のある動物の遺伝子内容を修飾するためのプロセス、そしてまたそのプロセスから生じる動物は、除外することができる。概して、コドン最適化とは、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１もしくはそれ超、約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、約１５もしくはそれ超、約２０もしくはそれ超、約２５もしくはそれ超、約５０もしくはそれ超、または以上のコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持しながらその宿主細胞の遺伝子内でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、目的の宿主細胞内で発現の強化のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。
様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対し特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の違い）は、しばしばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、ひいては、とりわけ翻訳されるコドンの性質及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内で選択されたｔＲＮＡが優勢であることは、概してペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、コドンの最適化に基づき、所与の生物内で最適な遺伝子発現をさせるように遺伝子を調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用頻度データベース」で容易に利用可能であり、このような表を多くの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ： ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）のも利用可能である。１つの実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的Ｃａｓタンパク質をコードする配列内の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対し最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
ポリヌクレオチドを挿入する方法
本開示はさらに、細胞内の標的核酸内にポリヌクレオチドを挿入する方法であって、細胞内に、（ａ）１つ以上のトランスポザーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ）またはその機能フラグメントと、（ｂ）核酸結合システム、例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドと、（ｃ）１つ以上のドナーポリヌクレオチドとを導入することを含む。方法を提供する。
構成要素（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のうち１つ以上は、細胞内で発現する調節配列に作用可能に連結した核酸から発現することができる。１つの実施形態において、構成要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のうちの１つ以上は、粒子内に導入することができる。粒子はリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を含むことができる。細胞は原核細胞であってもよい。細胞は真核細胞であってもよい。例えば、細胞は、哺乳類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞であってもよい。細胞は植物細胞であってもよい。
１つの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド内に挿入する方法が提供される。ドナーポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチド内に挿入する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、細胞内）で実施される。標的ポリヌクレオチドに導入されるシステムの構成要素は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（またはその機能的フラグメント）と、本明細書に詳述する１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、Ｉ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質及びドナーポリヌクレオチドと複合体化することが可能なガイド分子とを含む。１つの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）内に含まれる。１つの例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、標的ポリヌクレオチドの未成熟終止コドンを補正する、スプライシング部位を破壊する、スプライシング部位を修復する、またはこれらの組合せを行う。変異は、本明細書の他の箇所で説明されている通りとすることができ、例えば、標的ポリヌクレオチドに対する置換、欠失、及び／または挿入を含むことができる。標的ポリヌクレオチドに対するオープンリーディングフレームのシフトは、ドナーポリヌクレオチドを挿入する方法の１つの例示的な実施形態である。好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチドに導入された１つ以上の構成要素は、本明細書の他の箇所でさらに説明するように、調節配列に作用可能に連結した核酸から発現する。この方法での１つ以上の構成要素の導入は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を含むことができる粒子で導入することができる。
１つの実施形態において、細胞内の標的ポリヌクレオチド内にドナーポリヌクレオチドを挿入する方法は、細胞内に、１つ以上のトランスポザーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ）と、Ｃａｓタンパク質と、ガイド分子であって、Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的核酸の標的配列との配列特異的結合を誘導することとが可能なガイド分子とを導入することを含む。１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連トランスポゾンは、１つ以上のトランスポザーゼ及び挿入されるドナーポリヌクレオチドを含むことができる。
免疫直交オルソログ
１つの実施形態において、本明細書のシステムの１つ以上の構成要素（例えば、トランスポザーゼ、ヌクレオチド結合分子）を対象内に発現または投与される必要があるとき、構成要素の免疫原性は、トランスポゾン複合体の構成要素の免疫直交オルソログを対象に連続的に発現または投与することにより、低減することができる。本明細書で使用する場合、「免疫直交オルソログ」という用語は、類似するまたは実質的に同じ機能または活性を有するが、互いによって生じる免疫応答との交差反応性がないまたは低い直交タンパク質を指す。１つの実施形態において、このようなオルソログの連続的な発現または投与は、ほとんどまたは全く二次的免疫応答を誘発しない。免疫直交オルソログは、抗体（例えば、オルソログが発現または投与される前に宿主内に存在する抗体）によって中和されるのを回避することができる。オルソログを発現する細胞は、宿主の免疫系によって（例えば、活性化したＣＴＬによって）除去されるのを回避することができる。１つの実施形態において、異なる種からのＣＲＩＳＰＲ酵素及び／またはトランスポザーゼのオルソログは、免疫直交オルソログであり得る。
免疫直交オルソログは、候補オルソログのセットの配列、構造、及び／または免疫原性を解析することによって特定することができる。例示的な方法において、免疫直交オルソログのセットは、ａ）候補オルソログのセット（例えば、異なる種からのオルソログ）の配列を比較して、配列類似性が低いかまたはない候補のサブセットを特定し、ｂ）候補のサブセットのメンバー間の免疫重複を評価して、免疫重複がないまたは低い候補を特定することにより、特定することができる。１つの実施形態において、候補間の免疫重複は、候補オルソログと宿主のＭＨＣ（例えば、ＭＨＣ Ｉ型及び／またはＭＨＣ ＩＩ）との間の結合（例えば、親和性）を決定することにより、評価することができる。代替的または追加的に、候補間の免疫重複は、候補オルソログのＢ細胞エピトープを決定することにより、評価することができる。１つの例において、免疫直交オルソログは、Ｍｏｒｅｎｏ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｊａｎｕａｒｙ １０，２０１８，ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２４５９８５に記載の方法を用いて特定することができる。
送達及び投与の方法
本開示は、本明細書のシステム及び組成物の構成要素を細胞、組織、器官、または生物に導入するための送達システムも提供する。送達システムは、１つ以上の送達ビヒクル及び／またはカーゴを含むことができる。例示的な送達システム及び方法としては、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２０１６１０６２３６Ａ１）の段落［００１１７］～［００２７８］、及びＬｉｎｏ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ，２０１８，ＶＯＬ．２５，ＮＯ．１，１２３４－１２５７の１２４１～１２５１ページ及び表１に記載のものが挙げられ、これらは参照により全体として本明細書に援用される。
１つの実施形態において、送達システムを使用して、システム及び組成物の構成要素を植物細胞に導入することができる。例えば、構成要素は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、植物細胞プロトプラストのエアロゾルビーム注射、バイオリスティック法、ＤＮＡ粒子ボンバードメント、及び／またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を用いて植物に送達することができる。植物のための方法及び送達システムの例としては、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ；９（１）：１１－９；Ｋｌｅｉｎ ＲＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９２；２４：３８４－６；Ｃａｓａｓ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９３ Ｄｅｃ １；９０（２３）：１１２１２－１１２１６；及び米国特許第５，５６３，０５５号；Ｄａｖｅｙ ＭＲ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８９ Ｓｅｐ；１３（３）：２７３－８５に記載のものが挙げられ、これらは参照により全体として本明細書に援用される。
カーゴ
送達システムは、１つ以上のカーゴを含むことができる。カーゴは、本明細書のシステム及び組成物の１つ以上の構成要素を含むことができる。カーゴは以下のうちの１つ以上を含むことができる：ｉ）１つ以上のＣａｓタンパク質をコードするプラスミド、ｉｉ）１つ以上のガイドＲＮＡをコードするプラスミド、ｉｉｉ）１つ以上のＣａｓタンパク質のｍＲＮＡ、ｉｖ）１つ以上のガイドＲＮＡ、ｖ）１つ以上のＣａｓタンパク質、ｖｉ）これらの任意の組合せ。１つの実施形態において、カーゴは、１つ以上のＣａｓタンパク質をコードするプラスミドと、１つ以上の（例えば、複数の）ガイドＲＮＡとを含むことができる。１つの実施形態において、プラスミドは、組換え鋳型（例えば、ＨＤＲ用）もコードすることができる。１つの実施形態において、カーゴは、１つ以上のＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと、１つ以上のガイドＲＮＡとを含むことができる。
１つの実施形態において、カーゴは、１つ以上のＣａｓタンパク質と、１つ以上のガイドＲＮＡとを、例えば、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形態で含むことができる。リボ核タンパク質複合体は、本明細書の方法及びシステムによって送達することができる。１つの実施形態において、リボ核タンパク質は、ポリペプチドベースシャトル剤によって送達することができる。１つの例において、リボ核タンパク質は、細胞透過性ドメイン（ＣＰＤ）に、ヒスチジンリッチドメイン及びＣＰＤに作用可能に連結したエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを用いて送達することができる（例えば、ＷＯ２０１６１６１５１６に記載の通り）。また、ＲＮＰは、組成物及びシステムを植物細胞に送達するために使用することができる（例えば、Ｗｕ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；３３（１１）：１１６２－４に記載の通り）。
物理的送達
１つの実施形態において、カーゴは、物理的な送達方法によって細胞に導入することができる。物理的方法の例としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び流体力学的送達が挙げられる。核酸及びタンパク質のいずれも、このような方法を用いて送達することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製し、単離し、（再折畳みを行い、精製し（必要な場合））、細胞に導入することができる。
マイクロインジェクション
カーゴの直接細胞へのマイクロインジェクションは、例えば９０％超または約１００％といった高い効率を達成することができる。１つの実施形態において、マイクロインジェクションは、顕微鏡及びニードル（例えば、直径０．５～５．０μｍ）を用いて、細胞膜を貫通し、細胞内の標的部位にカーゴを直接送達するように実施することができる。マイクロインジェクションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの送達に使用することができる。
Ｃａｓタンパク質及び／またはガイドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／またはガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドは、マイクロインジェクションすることができる。１つの実施形態において、マイクロインジェクションを使用して、ｉ）ＤＮＡを細胞核に直接送達する、及び／またはｉｉ）ｍＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたもの）を細胞核もしくは細胞質に送達することができる。１つの例示的な実施形態において、マイクロインジェクションを使用して、ｓｇＲＮＡを核に直接送達し、ＣａｓコードｍＲＮＡを細胞質に送達して、例えば、Ｃａｓの核への翻訳及びシャトリングを促進することができる。
マイクロインジェクションを使用して遺伝子修飾動物を生成することができる。例えば、遺伝子編集カーゴを接合子に注射して、効率的な生殖系列修飾を可能にすることができる。このようなアプローチにより、正常な胚及び所望の修飾（複数可）を有する満期産のマウスの仔を得ることができる。また、マイクロインジェクションを使用して、例えばＣＲＩＳＰＲａ及びＣＲＩＳＰＲｉを用いて、細胞のゲノム内の特定の遺伝子を一過性に上方または下方制御することもできる。
エレクトロポレーション
１つの実施形態において、カーゴ及び／または送達ビヒクルは、エレクトロポレーションによって送達することができる。エレクトロポレーションは、パルス状高電圧電流を使用して、緩衝液に懸濁した細胞の細胞膜内にナノメートルサイズの孔を一過性に開け、数十ナノメートルの流体力学的直径を有する構成要素を細胞内に流入させることができる。１つの実施形態において、エレクトロポレーションは、様々な細胞タイプに使用することができ、効率的にカーゴを細胞内に移入することができる。エレクトロポレーションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの送達に使用することができる。
また、エレクトロポレーションを使用して、例えばヌクレオフェクションにより、特定の電圧及び試薬を適用することにより、哺乳類細胞の核にカーゴを送達することもできる。このようなアプローチとしては、Ｗｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５：６７－７９；Ｙｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１：９５９１－６；Ｃｈｏｉ ＰＳ，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ Ｍ．（２０１４）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３７２８；Ｗａｎｇ Ｊ，Ｑｕａｋｅ ＳＲ．（２０１４）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１１：１３１５７－６２に記載のものが挙げられる。また、エレクトロポレーションを使用して、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６：７３９１に記載の方法を用いて、カーゴをｉｎ ｖｉｖｏで送達することもできる。
流体力学的送達
流体力学的送達も、例えばｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、カーゴの送達に使用することができる。１つの実施形態において、流体力学的送達は、遺伝子編集カーゴを含む大容量（８～１０％体重）溶液を、対象（例えば、動物またはヒト）の血流に（例えば、マウスの場合は尾静脈を介し）急速に押し込むことにより、実施することができる。血液は圧縮できないため、液体を大量に急速投与すると、流体力学的圧力が上昇して一時的に内皮細胞及び実質細胞内への透過性が強化され、通常は細胞膜を横断できないカーゴが細胞内に通過できるようになる。このアプローチは、裸のＤＮＡプラスミド及びタンパク質の送達に使用することができる。送達されたカーゴは、肝臓、腎臓、肺、筋肉、及び／または心臓内で濃縮され得る。
形質移入
カーゴ（例えば、核酸）は、核酸を細胞内に導入するための形質移入法により、細胞に導入することができる。形質移入法の例としては、リン酸カルシウム媒介形質移入、カチオン形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、ヒートショック形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光学的形質移入、独自の薬剤で強化された核酸の取込みが挙げられる。
送達ビヒクル
送達システムは、１つ以上の送達ビヒクルを含むことができる。送達ビヒクルは、細胞、組織、器官、または生物（例えば、動物または植物）内にカーゴを送達することができる。カーゴは、パッケージ化し、運搬し、または別の形で送達ビヒクルに会合することができる。送達ビヒクルは、送達されるカーゴのタイプに基づき、及び／または送達がｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏであることに基づき、選択することができる。送達ビヒクルの例としては、ベクター、ウイルス、非ウイルスビヒクル、及び本明細書に記載の他の送達試薬が挙げられる。
送達は、本明細書の他の箇所に記載のように、１つ以上のサブユニットまたはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を別々に、１つ以上の融合タンパク質として、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、送達することを含むことができる。上記のように、Ｉ型システムを含む多量体クラスＩ複合体の送達は当技術分野で知られており、例えば、Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９ Ｄｅｃ；３７（１２）：１４９３－１５０１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０２３５－７を参照。Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｅｒは、システムの各サブユニットにＣＭＶプロモーターを利用し、さらにＮ末端のＦｌａｇエピトープタグ及び核局在化システムを含めた。Ｐｉｃｋａｒ－Ｏｌｉｖｉｅｒは、複合体の各サブユニットを別々のベクターに送達し、複数のサブユニットの送達が同じコンストラクト上であるのに対し、Ｄｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ３上のＣ末端ＮＬＳを利用したＲＮＰエレクトロポレーションにより、またエレクトロポレーションにより送達される６つのＣａｓ７サブユニットの各々のＣ末端に、ｈＥＳＣでのゲノム編集のためのＴ．ｆｕｓｃａ Ｉ－Ｅ型を送達した。Ｄｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，（２０１９）；７４（５）：９３６－９５０．ｅ５；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１９．０３．０１４；また、Ｍｏｒｉｓａｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，５３０２（２０１９）；Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９ Ｄｅｃ；３７（１２）：１４７１－１４７；．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０３１０－０（ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｓｕｂｕｎｉｔ ｃａｓｃａｄｅ ｔｏ Ｆｏｋ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｏｎ ｓｅｐａｒａｔｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）；及びＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ．（Ｏｃｔ．１８，２０１９）；２：３８３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０６３７－６（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｌａｓｓ １ ｔｙｐｅ １－Ｅ Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｚｅａ ｍａｙｓ ｂｙ ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｔｏ ３ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｓｃａｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）も参照。ヒトのコドン使用頻度に基づくコドン最適化、及び／またはＡＴＵＭ／ＤＮＡ２．０などの最適化ツールによるさらなるコドン最適化を実施して、さらに発現を最適化することができる。
１つの実施形態において、本明細書で開示する操作されたベクター及び組成物の送達は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、１つ以上の１－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、ガイド分子であって、１つ以上の１－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体の標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能なガイド分子と、ドナーポリヌクレオチドとを含む、１つ以上の操作された組成物を細胞内に送達することを含むことができる。１つの例示的な実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの送達は、標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、標的ポリヌクレオチドの未成熟終止コドンを補正する、スプライシング部位を破壊する、スプライシング部位を修復する、またはこれらの組合せを行う。
本開示に従う送達ビヒクルは、１００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば、直径）を有することができる。１つの実施形態において、送達ビヒクルは、１０μｍ未満の最大寸法を有する。１つの実施形態において、送達ビヒクルは、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有することができる。１つの実施形態において、送達ビヒクルは、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有することができる。１つの実施形態において、送達ビヒクルは、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有することができる。１つの実施形態において、送達ビヒクルは、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有することができる。
１つの実施形態において、送達ビヒクルは、粒子であっても、粒子を含んでもよい。例えば、送達ビヒクルは、ナノ粒子（例えば、１０００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する粒子）であっても、それを含んでもよい。粒子は、異なる形態で、例えば、固体粒子（例えば、金属（例えば、銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベース固体、ポリマー）、粒子の懸濁液、またはこれらの組合せとして提供することができる。金属、誘電体、及び半導体粒子、さらにハイブリッド構造（例えば、コアシェル粒子）を準備することができる。また、ナノ粒子を使用して、例えば、国際特許公開第ＷＯ２００８０４２１５６号、米国公開出願第ＵＳ２０１３０１８５８２３号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１５／０８９４１９号に記載のように、組成物及びシステムを植物細胞に送達することもできる。
ベクター
本開示は、１つ以上のベクターを含むベクターシステムを提供する。ベクターは、本明細書のＣａｓ関連トランスポザーゼシステムにおける構成要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含むことができる。特定の例において、本開示は、Ｃａｓ関連トランスポザーゼシステムの全ての構成要素または構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む単一のベクターを提供する。ベクターは、単一のプロモーターを含むことができる。他の実施形態において、システムは、複数のベクターであって、各々がＣａｓ関連トランスポザーゼシステムの１つまたはいくつかの構成要素、または構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む、複数のベクターを含むことができる。
ベクターシステムにおける１つ以上のポリヌクレオチドは、ポリペプチド（複数可）及び／または核酸構成要素（複数可）を発現するように作用可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含むことができ、任意選択で、この１つ以上の調節エレメントは誘導性プロモーターを含む。Ｃａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、真核細胞内での発現に対しコドン最適化されている。
Ｃａｓ及び／またはトランスポザーゼ（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、翻訳の早期または未成熟の終結を低減または防止するように変異させることができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、（例えば、５’末端で）ポリ－Ｕストレッチを有するＲＮＡをコードする。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリ－Ｕストレッチをコードする配列内で、早期または未成熟の終結を低減または防止するように変異させることができる。
ベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型）を有することができ、そこで、ベクターの本質的な生物学的機能を損なうことなく決定可能な様式で配列を切断することができ、またその中に、核酸フラグメントを、複製及びクローニングをもたらすためにスプライシングまたは挿入することができる。また、ベクターは、２つの核酸分子間の核酸配列の交換を可能にする１つ以上の組換え部位も含むことができる。ベクターはさらに、例えばＰＣＲのための、プライマー部位、転写及び／または翻訳の開始及び／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどを提供することができる。ベクターはさらに、ベクターで形質転換された細胞の識別に使用するのに適した１つ以上の選択マーカーを含むことができる。
前述のように、適切な宿主細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、または哺乳類細胞）内で、作用可能に連結した遺伝子及び／または核酸配列の発現を誘導することが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。所望の核酸配列の翻訳が必要とされる場合、ベクターは、典型的には、核酸配列の適切な翻訳に必要とされる配列も含むことができる。発現ベクターに関して本明細書で使用する「発現」という用語は、核酸配列産物の生合成を指し、すなわち、ヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。また、発現とは、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉの生合成も指し、これは、ポリペプチド配列への翻訳を必要としないＲＮＡｉ作用物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ）の発現及び転写を指す。
概して、本明細書に記載のポリペプチドを生成する方法及びそれを含むことができる組成物において有用な発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態をとる。プラスミドとは、ベクター形態において、染色体に結合していない環状二重鎖ＤＮＡループを指す。本明細書に記載の態様の１つの実施形態において、所与のポリペプチドの全ての構成要素は、単一のベクター内でコードすることができる。例えば、１つの実施形態において、本明細書に記載の機能的ポリペプチドに必要な全ての構成要素を含む、またはそれらを含むことができるベクターを構築することができる。１つの実施形態において、個々の構成要素（例えば、１つ以上の単量体単位及び１つ以上のエフェクタードメイン）は、異なるベクター内で別々にコードされ、１つ以上の細胞内に別々に導入することができる。さらに、本明細書に記載の任意のベクターは、それ自体が構成要素配列をコードする所定のＣａｓ及び／またはレトロトランスポゾンポリペプチド（例えば、エフェクタードメイン及び／または他のポリペプチド）を、任意の位置または位置の組合せで（例えば、１つ以上の構成要素Ｃａｓ及び／またはクローニングされるべき配列をコードするレトロトランスポゾンポリペプチドを含むことができる外来核酸分子に対し５’→３’または５’及び３’の両方で）含むことができる。このような発現ベクターは、本明細書では「バックボーン配列」を含むことができると称される。
システム、組成物、及び／または送達システムは、１つ以上のベクターを含むことができる。本開示はベクターシステムも含む。ベクターシステムは、１つ以上のベクターを含むことができる。１つの実施形態において、ベクターとは、それが連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、一本鎖、二重鎖、または部分的な二重鎖である核酸分子；１つ以上の自由末端を含むまたは含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこの両方を含む核酸分子；及び当技術分野で知られている他のポリヌクレオチドの変種が挙げられる。ベクターは、プラスミド（例えば標準的な分子クローニング技法により、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二重鎖ＤＮＡループ）であり得る。ある特定のベクターは、導入される宿主細胞内で自己複製することが可能であり得る（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。いくつかのベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに統合されて、宿主ゲノムに連動して複製される。１つの例示的な実施形態において、ベクターは、例えば、作用可能に連結した遺伝子の発現を誘導することが可能な発現ベクターであり得る。１つの実施形態において、発現ベクターは、真核細胞内での発現に用いることができる。組換えＤＮＡ技法で有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態をとる。
ベクターの例としては、ｐＧＥＸ、ｐＭＡＬ、ｐＲＩＴ５、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（例えば、ｐＴｒｃ、ｐＥＴ １１ｄ）、酵母発現ベクター（例えば、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２、及びｐｉｃＺ）、バキュロウイルスベクター（例えば、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞内での発現用）（例えば、ｐＡｃシリーズ及びｐＶＬシリーズ）、哺乳類発現ベクター（例えば、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ）が挙げられる。
ベクターは、ｉ）Ｃａｓコード配列（複数可）、及び／またはｉｉ）単一、または少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも３２個、少なくとも４８個、少なくとも５０個のガイドＲＮＡ（複数可）コード配列を含むことができる。単一のベクター内に、各ＲＮＡコード配列用のプロモーターが存在してもよい。代替的または追加的に、単一のベクター内に、複数のＲＮＡコード配列を制御する（例えば、転写及び／または発現を駆動する）プロモーターが存在してもよい。
さらに、組成物またはシステムは、ベクター（例えば、本明細書の組成物及びシステムの構成要素をコードする別々のベクターまたは同じベクター）を介して送達することができる。別々のベクターで提供される場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、順次でも同時でも投与することができる。順次投与する場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、例えば遺伝子編集または遺伝子操作が意図されているＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの後に投与されることになる。この期間は、分単位の期間（例えば、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分）であってもよい。この期間は、時間単位の期間（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間）であってもよい。この期間は、日単位の期間（例えば、２日、３日、４日、７日）であってもよい。この期間は、週単位の期間（例えば、２週間、３週間、４週間）であってもよい。この期間は、月単位の期間（例えば、２か月、４か月、８か月、１２か月）であってもよい。この期間は、年単位の期間（２年、３年、４年）であってもよい。このようにして、Ｃａｓ酵素は、第１の標的（例えば、目的のゲノム座位（単数または複数））にハイブリダイズすることが可能な第１のｇＲＮＡと会合し、組成物またはシステムに所望される機能（複数可）（例えば、遺伝子操作）に着手し、続いてＣａｓ酵素は、ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲカセットの少なくとも一部を含む配列とハイブリダイズすることが可能な第２のｇＲＮＡに会合することができる。ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質の発現をコードする配列を標的とする場合、酵素が妨害され、システムは自己不活性化状態になる。同様の方式で、例えば、本明細書で説明するようなリポソーム、リポフェクション、粒子、微小胞を介して適用されるＣａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、順次または同時に投与することができる。同様に、自己不活性化は、１つ以上の標的を標的とするために使用される１つ以上のガイドＲＮＡの不活性化に使用することができる。
調節エレメント
ベクターは１つ以上の調節エレメントを含むことができる。調節エレメント（複数可）は、Ｃａｓタンパク質、アクセサリータンパク質、ガイドＲＮＡ（例えば、単一のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ）、あるいはこれらの組合せのコード配列に作用可能に連結することができる。「作用可能に連結した」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入された際の宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で、調節エレメント（複数可）に連結されることを意味するように意図されている。１つの例示的な実施形態において、ベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した第１の調節エレメントと、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した第２の調節エレメントとを含むことができる。１つの実施形態において、ベクターはさらに、トランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した第３の調節エレメントを含むことができる。１つの例示的な実施形態において、ベクターはさらに、ドナーポリヌクレオチドであるかまたはそれをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した第３の調節エレメントを含むことができる。
調節エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列などの転写終結シグナル）が挙げられる。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及びある特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主に所望の目的組織（例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球））内で、発現を誘導することができる。また、調節エレメントは、時間依存的方式（例えば、細胞周期依存的方式または発生段階依存的方式）で発現を誘導することもでき、これは組織または細胞タイプに特異的であってもそうでなくてもよい。
プロモーターの例としては、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはその組合せが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。
ウイルスベクター
カーゴは、ウイルスによって送達することができる。１つの実施形態において、ウイルスベクターが使用される。ウイルスベクターは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージ化するためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことができる。また、ウイルスベクターは、宿主細胞への形質移入のためにウイルスが運搬するポリヌクレオチドも含む。ウイルス及びウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／または ｉｎ ｖｉｖｏの送達に使用することができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本明細書のシステム及び組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって送達することができる。ＡＡＶベクターをこのような送達に使用することができる。ＡＡＶ（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科）は一本鎖ＤＮＡウイルスである。１つの実施形態において、ＡＡＶ送達ゲノム材料は、例えば、外来性ＤＮＡとして、またはいくつかの修飾を伴って宿主ＤＮＡに直接統合されるかのいずれかで、細胞内に無期限に存在することができるため、ＡＡＶは、提供されるＤＮＡの持続的な供給源を提供することができる。１つの実施形態において、ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる疾患も引き起こさず、またいかなる疾患にも関係しない。ウイルス自体は、自然もしくは適応免疫応答、または関連する毒性をほとんどまたは全く誘発せずに、効率的に細胞に感染することができる。
本明細書で使用することができるＡＡＶの例としては、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９が挙げられる。ＡＡＶのタイプは、標的とする細胞に関して選択することができ、例えば、脳または神経細胞を標的とするためには、ＡＡＶ血清型１、２、５もしくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはこれらの任意の組合せを選択することができ、心臓組織を標的とするためにはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。ＡＡＶ－２ベースのベクターは、当初はＣＦＴＲをＣＦ気道に送達するために提唱され、他の血清型（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、及びＡＡＶ－９）は、肺上皮の様々なモデルで遺伝子移入の効率の改善を示している。ＡＡＶが標的とする細胞タイプの例は、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２： ５８８７－５９１１（２００８））に記載され、また以下のように表３に示される。
Figure 2023544822000004
ＡＡＶ粒子は、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞内で作成することができる。特定のトロピズムを有する粒子が作成されたら、これらを使用して、ネイティブウイルス粒子と同じように標的細胞株に感染させる。これにより、感染した細胞タイプ内に持続的に構成要素を存在させることを可能にし得るため、この送達バージョンは、長期間の発現が望ましい場合に特に適したものとなる。使用され得るＡＡＶの用量及び製剤の例としては、米国特許第８，４５４，９７２号及び同第８，４０４，６５８号に記載のものが挙げられる。
本明細書のシステム及び組成物をＡＡＶで送達するために様々な戦略を使用することができる。１つの実施形態において、Ｃａｓ及びｇＲＮＡのコード配列は、１つのＤＮＡプラスミドベクターに直接パッケージ化し、１つのＡＡＶ粒子を介して送達することができる。１つの実施形態において、ＡＡＶを使用して、Ｃａｓを発現するように予め操作された細胞内にｇＲＮＡを送達することができる。１つの実施形態において、Ｃａｓ及びｇＲＮＡのコード配列は、２つの別々のＡＡＶ粒子にすることができ、これらは標的細胞の共形質移入に使用される。１つの実施形態において、マーカー、タグ、及び他の配列は、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡのコード配列と同じＡＡＶ粒子にパッケージ化することができる。
レンチウイルス
本明細書のシステム及び組成物は、レンチウイルスによって送達することができる。レンチウイルスベクターをこのような送達に使用することができる。レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び有糸分裂後細胞の両方に感染しその遺伝子を発現する能力を有する複雑なレトロウイルスである。
レンチウイルスの例としてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられ、これは、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範な細胞タイプを標的とすることができる。最小限の非霊長類用レンチウイルスベクターは、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づいており、眼科治療に使用することができる。１つの実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通エキソンを標的とするｓｉＲＮＡ、核小体局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照）を有する自己不活性化レンチウイルスベクターを本明細書に記載の核酸標的化システムに使用及び／または適合することができる。
レンチウイルスは、他のウイルスタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質）とシュードタイピングすることができる。そうする際に、レンチウイルスの細胞トロピズムを、所望に応じ広くまたは狭く改変することができる。１つの実施形態において、安全性を高めるために、第２世代及び第３世代のレンチウイルスシステムは、必須遺伝子を３つのプラスミドに分割することができる。これにより、細胞内で生存可能なウイルス粒子が偶発的に再構成される可能性を低減することができる。
１つの実施形態において、統合能力を活用して、レンチウイルスを使用して、例えば、遺伝子及びシグナル伝達経路のスクリーニング及び／または研究のために、様々な遺伝子修飾を含む細胞のライブラリーを作成することができる。
アデノウイルス
本明細書のシステム及び組成物は、アデノウイルスによって送達することができる。アデノウイルスベクターをこのような送達に使用することができる。アデノウイルスには、二本鎖ＤＮＡゲノムを含む正二十面体のヌクレオカプシドを有する非エンベロープ型ウイルスが含まれる。アデノウイルスは、分裂細胞にも非分裂細胞にも感染することができる。１つの実施形態において、アデノウイルスは宿主細胞のゲノム内に統合しないことから、遺伝子編集用途において組成物及びシステムのオフターゲット効果を制限するために使用することができる。
植物に送達するためのウイルスビヒクル
システム及び組成物は、ウイルスビヒクルを用いて植物細胞に送達することができる。特定の実施形態において、植物ウイルスベクターを用いて、組成物及びシステムを植物細胞に導入することができる（例えば、Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３に記載の通り）。このようなウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス、例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ縮葉ウイルス、マメ黄化萎縮ウイルス、コムギ萎縮ウイルス、トマト縮葉ウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、タバコ縮葉ウイルス、もしくはトマトゴールデンモザイクウイルス）、またはナノウイルス（例えば、ソラマメえそ黄斑ウイルス）からのベクターとすることができる。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルス、例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＸ）、またはホルデイウイルス（例えば、オオムギ班葉モザイクウイルス）からのベクターとすることができる。植物ウイルスの複製ゲノムは、非統合型ベクターであり得る。
非ウイルスビヒクル
送達ビヒクルは、非ウイルスビヒクルを含むことができる。概して、核酸及び／またはタンパク質を送達することが可能な方法及びビヒクルは、本明細書のシステム及び組成物の送達に使用することができる。非ウイルスビヒクルの例としては、脂質ナノ粒子、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ＤＮＡナノクルー、金ナノ粒子、ストレプトリジンＯ、多機能エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）、脂質コーティングメソポーラスシリカ粒子、及び他の無機ナノ粒子が挙げられる。
脂質粒子
送達ビヒクルは、脂質粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びリポソームを含むことができる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
ＬＮＰは、カチオン性脂質粒子（例えば、リポソーム）内に核酸をカプセル化し、比較的容易に細胞に送達することができる。１つの実施形態において、脂質ナノ粒子はウイルス構成要素を含まず、それにより安全性及び免疫原性の懸念を最小限に抑える一助となる。脂質粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏの送達に使用することができる。脂質粒子は、様々な規模の細胞集団に使用することができる。
１つの実施形態において、ＬＮＰは、ＤＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡのコード配列を含むもの）及び／またはＲＮＡ分子（例えば、ＣａｓのｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）の送達に使用することができる。ある特定の場合には、ＬＮＰは、Ｃａｓ／ｇＲＮＡのＲＮＰ複合体の送達に使用することができる。
ＬＮＰ中の構成要素は、カチオン性脂質１，２－ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシケトーＮ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－〔１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２”－（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、Ｒ－３－［（ロ－メトキシ－（ポリエチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオクスル（ｏｘｌ）プロピル－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）、及びこれらの任意の組合せを含むことができる。ＬＮＰの調製及びカプセル化は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１から適合させることができる。
リポソーム
１つの実施形態において、脂質粒子はリポソームとすることができる。リポソームは、内部の水性区画を囲む単層または多重層の脂質二分子膜と、比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二分子膜とから構成された球状小胞構造である。１つの実施形態において、リポソームは、生体適合性であり、無毒であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてその積荷を輸送する。
リポソームは、いくつかの異なるタイプの脂質、例えばリン脂質から作製することができる。リポソームは、天然のリン脂質及び脂質（例えば、１，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、モノシアロガングリオシド、またはこれらの任意の組合せ）を含むことができる。
リポソームの構造及び性質を変更するために、いくつかの他の添加物を加えることがある。例えば、リポソームは、例えば安定性を高めるため、及び／またはリポソーム内部のカーゴの漏出を防止するため、さらにコレステロール、スフィンゴミエリン、及び／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むことができる。
安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）
１つの実施形態において、脂質粒子は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）とすることができる。ＳＮＡＬＰは、イオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）（例えば、低ｐＨでカチオン性）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。１つの実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリエチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性１，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含むことができる。１つの実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及び１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含むことができる。
その他の脂質
脂質粒子はまた、１つ以上の他のタイプの脂質、例えば、カチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００、ならびに共脂質ジステロイルフォスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧも含むことができる。
リポプレックス／ポリプレックス
１つの実施形態において、送達ビヒクルは、リポプレックス及び／またはポリプレックスを含む。リポプレックスは、負に帯電した細胞膜に結合し、細胞内にエンドサイトーシスを誘導することができる。リポプレックスの例としては、脂質（複数可）及び非脂質構成要素を含む複合体が考えられる。リポプレックス及びポリプレックスの例としては、ＦｕＧＥＮＥ－６試薬（脂質及び他の構成要素を含む非リポソーム溶液）、双性イオン性アミノ脂質（ＺＡＬ）、
Figure 2023544822000005
（例えば、ＤＮＡ／Ｃａ２＋マイクロ複合体を形成）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、分枝状ＰＥＩ）、及びポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）が挙げられる。
細胞透過性ペプチド
１つの実施形態において、送達ビヒクルは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＣＰＰは、様々な分子カーゴ（例えば、ナノサイズ粒子から小型の化学分子及び大型のＤＮＡフラグメントに至るまで）の細胞取込みを促進する短いペプチドである。
ＣＰＰは、サイズ、アミノ酸配列、及び電荷が異なり得る。１つの実施形態において、ＣＰＰは、細胞膜を移動し、様々な分子カーゴを細胞質またはオルガネラへ送達するのを促進することができる。ＣＰＰは、種々の機構（例えば、膜への直接透過、エンドサイトーシス媒介進入、一過性構造の形成を通じた移動）を介して細胞内に導入することができる。
ＣＰＰは、相対的に高い存在量の正電荷アミノ酸（例えば、リジンもしくはアルギニン）を有するか、または極性／荷電アミノ酸と非極性／疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有することができる。これらの２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性または両親媒性と称される。ＣＰＰの第３のクラスは疎水性ペプチドであり、これは無極性残基のみを含み、正味電荷は低く、または細胞取込みに不可欠な疎水性アミノ酸基を有する。ＣＰＰのもう１つのタイプは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）である。ＣＰＰの例としては、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘはアミノヘキサノイルを指す）、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇｓ配列、グアニンリッチ分子トランスポーター、及びスイートアローペプチドが挙げられる。また、ＣＰＰの例及び関連する用途としては、米国特許第８，３７２，９５１号に記載のものも挙げられる。
ＣＰＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの作業で非常に容易に使用することができ、各カーゴ及び細胞タイプに対する詳細な最適化が必要となり得る。１つの実施形態において、ＣＰＰはＣａｓタンパク質に直接共有結合することができ、これが次にｇＲＮＡと複合体化し、細胞に送達される。１つの実施形態において、ＣＰＰ－Ｃａｓ及びＣＰＰ－ｇＲＮＡを複数の細胞に別々に送達することができる。ＣＰＰは、ＲＮＰの送達にも使用することができる。
ＣＰＰを使用して、組成物及びシステムを植物に送達することができる。１つの実施形態において、ＣＰＰを使用して、構成要素を植物プロトプラストに送達することができ、このプロトプラストは植物細胞に再生され、さらに植物に再生される。
ＤＮＡナノクルー
１つの実施形態において、送達ビヒクルはＤＮＡナノクルーを含む。ＤＮＡナノクルーとは、ＤＮＡの球様構造（例えば、毛糸玉のような形状）を指す。ナノクルーは、構造の自己組織化で助けとなるパリンドローム配列を伴ったローリングサークル増幅によって合成することができる。そして、この球体にペイロードを搭載することができる。ＤＮＡナノクルーの例は、Ｓｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２－５；及びＳｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９－３３に記載されている。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓ：ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体内のｇＲＮＡと部分的に相補的であるようにパリンドローム配列を有することができる。ＤＮＡナノクルーは、エンドソームエスケープを誘導するために、例えばＰＥＩでコーティングすることができる。
金ナノ粒子
１つの実施形態において、送達ビヒクルは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰまたはコロイド金とも称される）を含む。金ナノ粒子は、カーゴ（例えば、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ ＲＮＰ）と複合体を形成することができる。金ナノ粒子は、例えば、ケイ酸塩及びエンドソーム崩壊性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）でコーティングすることができる。金ナノ粒子の例としては、ＡｕｒａＳｅｎｓｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））コンストラクト、及びＭｏｕｔ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１７） ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：２４５２－８；Ｌｅｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １：８８９－９０１に記載のものが挙げられる。
ｉＴＯＰ
１つの実施形態において、送達ビヒクルはｉＴＯＰを含む。ｉＴＯＰとは、任意の形質導入ペプチドから独立して、ネイティブタンパク質の高効率な細胞内送達を駆動する小分子の組合せを指す。ｉＴＯＰは、オスモサイトーシス（ｏｓｍｏｃｙｔｏｓｉｓ）及びプロパンベタイン（ｐｒｏｐａｎｅｂｅｔａｉｎｅ）による誘導された形質導入に使用することができ、ＮａＣｌ媒介高浸透圧を形質導入化合物（プロパンベタイン）とともに用いて、細胞外巨大分子の細胞内へのマイクロピノサイトーシス的取込みを誘発する。ｉＴＯＰの方法及び試薬の例としては、Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ ＤＳ，Ｐａｇｌｉｅｒｏ ＲＪ，Ｐｒａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｃｅｌｌ １６１：６７４－６９０に記載のものが挙げられる。
ポリマーベース粒子
１つの実施形態において、送達ビヒクルは、ポリマーベース粒子（例えば、ナノ粒子）を含むことができる。１つの実施形態において、ポリマーベース粒子は、膜融合のウイルス機構を模倣することができる。ポリマーベース粒子は、インフルエンザウイルス機構の合成コピーであってもよく、様々なタイプの核酸（（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ）と形質移入複合体を形成し、細胞は、エンドサイトーシス経路（酸性区画の形成を含むプロセス）を介してこれを取り込む。後期エンドソームにおける低ｐＨは、粒子表面を疎水化し、膜横断を容易にする化学スイッチとして機能する。サイトゾル内に入ると、粒子は、細胞作用のためにそのペイロードを放出する。このアクティブエンドソームエスケープ技術は、天然の取込み経路を使用しているため、安全であり、形質移入の効率を最大化することができる。１つの実施形態において、ポリマーベース粒子は、アルキル化及びカルボキシアルキル化された分枝状ポリエチレンイミンを含むことができる。１つの実施形態において、ポリマーベース粒子はＶＩＲＯＭＥＲ（例えば、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＮＡｉ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＥＤ、ＶＩＲＯＭＥＲ ｍＲＮＡ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＣＲＩＳＰＲ）である。本明細書のシステム及び組成物を送達する例示的な方法としては、Ｂａｗａｇｅ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｃａｓ１３ａ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／３７０４６０ｖ１．ｆｕｌｌ ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３７０４６０，Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ，ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１６９９３．６１２８１，Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－Ｆａｃｔｂｏｏｋ ２０１８：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｕｓｅｒｓ’ｄａｔａ．，ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．２３９１２．１６６４２に記載のものが挙げられる。
ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）
送達ビヒクルは、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）であってもよい。ＳＬＯは、Ａ群連鎖球菌が産生する毒素であり、これは、哺乳類の細胞膜に孔を作出することによって機能する。ＳＬＯは可逆的に作用することができ、このため、細胞のサイトゾルへのタンパク質の送達（例えば、最大１００ｋＤａ）を全体の生存能を損なわずに行うすることができる。ＳＬＯの例としては、Ｓｉｅｒｉｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：４４６－５５；Ｗａｌｅｖ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８：３１８５－９０；Ｔｅｎｇ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２５４６０に記載のものが挙げられる。
多機能エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）
送達ビヒクルは、多機能エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）を含むことができる。ＭＥＮＤは、凝縮プラスミドＤＮＡ、ＰＬＬコア、及び脂質膜シェルを含むことができる。ＭＥＮＤはさらに、細胞透過性ペプチド（例えば、ステアリルオクタアルギニン）を含むことができる。細胞透過性ペプチドは、脂質シェル内にあり得る。脂質エンベロープは、１つ以上の機能的構成要素、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、血管循環時間を増加）、特定の組織／細胞を標的とするためのリガンド、追加の細胞透過性ペプチド（例えば、より大きな細胞送達向け）、エンドソームエスケープを強化する脂質、及び核送達タグのうちの１つ以上で修飾することができる。１つの実施形態において、ＭＥＮＤは、細胞核及びミトコンドリアを標的とすることができる四層ＭＥＮＤ（Ｔ－ＭＥＮＤ）であり得る。１つの例示的な実施形態において、ＭＥＮＤは、膀胱癌細胞を標的とすることができるＰＥＧ－ペプチド－ＤＯＰＥ結合体化ＭＥＮＤ（ＰＰＤ－ＭＥＮＤ）であり得る。ＭＥＮＤの例としては、Ｋｏｇｕｒｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ９８：３１７－２３；Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ４５：１１１３－２１に記載のものが挙げられる。
脂質コーティングメソポーラスシリカ粒子
送達ビヒクルは、脂質コーティングメソポーラスシリカ粒子を含むことができる。脂質コーティングメソポーラスシリカ粒子は、メソポーラスシリカナノ粒子コアと、脂質膜シェルとを含むことができる。シリカコアは、大きな内部表面積を有するため、カーゴ搭載能力が高い。１つの実施形態において、孔径、孔化学、及び全体の粒子サイズは、異なるタイプのカーゴを装填するために変更することができる。また、粒子の脂質コーティングは、カーゴ搭載を最大化し、循環時間を増加させ、正確な標的化及びカーゴ放出をもたらすように変更することもできる。脂質コーティングメソポーラスシリカ粒子の例としては、Ｄｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５：５５８０－９０；Ｄｕｒｆｅｅ ＰＮ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １０：８３２５－４５に記載のものが挙げられる。
無機ナノ粒子
送達ビヒクルは、無機ナノ粒子を含むことができる。無機ナノ粒子の例としては、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）（例えば、Ｂａｔｅｓ Ｋ ａｎｄ Ｋｏｓｔａｒｅｌｏｓ Ｋ．（２０１３）．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６５：２０２３－３３に記載の通り）、裸のメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）（例えば、Ｌｕｏ ＧＦ，ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４：６０６４に記載の通り）、及び高密度シリカナノ粒子（ＳｉＮＰ）（Ｌｕｏ Ｄ ａｎｄ Ｓａｌｔｚｍａｎ ＷＭ．（２０００）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：８９３－５に記載の通り）が挙げられる。
エクソソーム
送達ビヒクルは、エクソソームを含むことができる。エクソソームは膜結合型細胞外小胞を含み、これは、様々なタイプの生体分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、及び核酸、ならびにこれらの複合体（例えば、ＲＮＰ））の収容及び送達に使用することができる。エクソソームの例としては、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊａｎ；２６７（１）：９－２１；Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２－２６；Ｕｎｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｊｕｎ；２２（６）：７１１－９；Ｚｏｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；２２（４）：４６５－７５に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、エクソソームは、カーゴの１つ以上の構成要素と（例えば、直接的または間接的に結合することによって）複合体を形成することができる。１つの例示的な実施形態において、エクソソームの分子は第１のアダプタータンパク質と融合することができ、カーゴの構成要素は第２のアダプタータンパク質と融合することができる。第１のアダプタータンパク質及び第２のアダプタータンパク質は、互いに特異的に結合することができ、そのためカーゴがエクソソームと会合する。このようなエクソソームの例としては、Ｙｅ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．２０２０ Ａｐｒ ２８．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｄ０ｂｍ００４２７ｈに記載のものが挙げられる。
動物以外の生物における用途
本明細書に記載の組成物、システム、及び方法を使用して、植物及び真菌において遺伝子またはゲノムの照合または編集または操作を行うことができる。例えば、本出願は、植物の遺伝子またはゲノムの研究及び／または選択及び／または照合及び／または比較及び／または操作及び／または形質転換、例えば、植物に対し形質（複数可）または特性（複数可）を創出、特定、開発、最適化、または付与すること、あるいは植物または真菌のゲノムを形質変換することを含む。これにより、植物の産生量の改善、新たな形質もしくは特性の組合せを有する新たな植物、または形質が強化された新たな植物が生じる可能性がある。組成物、システム、及び方法は、部位特異的統合（ＳＤＩ）または遺伝子編集（ＧＥ）または任意の準リバースブリーディング（ＮＲＢ：Ｎｅａｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）またはリバースブリーディング（ＲＢ）技法において植物に対し使用することができる。
本明細書の組成物、システム、及び方法を使用して、本質的に任意の植物及び真菌、ならびにそれらの細胞及び組織に、所望の形質（例えば、栄養品質の強化、疾患に対する抵抗性、ならびに生物的及び非生物学的ストレスに対する抵抗性の向上、ならびに商業的に価値のある植物製品または異種化合物の産生量の向上）をもたらすことができる。組成物、システム、及び方法を使用して、任意の外来遺伝子のゲノムに恒久的に導入せずに、内在性遺伝子を修飾するか、またはそれらの発現を修飾することができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、植物におけるゲノム編集で、またはＲＮＡｉもしくは類似のゲノム編集技法が以前に使用されたところで使用することができる。例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，“Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｄｅ ｅａｓｙ： ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６－４８１１－９－３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ ｐｐ １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，６８６－６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９－１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；Ｘｉｅ，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３ Ｎｏｖ；６（６）：１９７５－８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ １７；Ｘｕ，“Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｒｉｃｅ，”Ｒｉｃｅ ２０１４，７：５（２０１４），Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ＳＮＰｓ ｆｏｒ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ ｗｏｏｄｙ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ４－ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ ｌｉｇａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ，”Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１－４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにてオンラインでのみ利用可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ ｓｔａｂｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｇｅｎｏｍｅ，ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第７，８６８，１４９号（Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）；及びＵＳ２００９／０１００５３６（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓ）；Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５－９６を参照（これらの各々の全ての内容及び開示は、参照により全体として本明細書に援用される）。組成物、システム、及び方法を利用する態様は、植物における組成物及びシステムの利用に類似していると考えられ、言及がＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａのウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ－ＰＬＡＮＴ」（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩが支援）でなされている。
また、本発明の組成物、システム、及び方法は、プロトプラストにも使用することができる。「プロトプラスト」とは、例えば機械的または酵素的な手段を用いて、保護細胞壁を完全または部分的に除去された植物細胞を指し、これは結果的に、適切な成長条件下で、細胞壁を再形成し、増殖し、再生して完全な植物に成長することができる、生きた植物のインタクトな生化学的にコンピテントな単位となる。
本発明の組成物、システム、及び方法は、目的の遺伝子（例えば、内在性、変異）のスクリーニングに使用することができる。１つの実施形態において、目的の遺伝子は、種、門、及び植物界を越えて、栄養価が付加された構成要素の産生に関与する酵素をコードする遺伝子、または全般的に、目的の農学的形質に影響を及ぼす遺伝子を含む。例えば代謝経路の酵素をコードする遺伝子を選択的に標的とすることにより、植物のある特定の栄養的側面に関与する遺伝子を特定することができる。同様に、望ましい農学的形質に影響を及ぼし得る遺伝子を選択的に標的とすることにより、関連する遺伝子を特定することができる。したがって、本開示は、特定の栄養価及び／または農学的形質を有する化合物の産生に関与する酵素をコードする遺伝子に対するスクリーニング方法を包含する。
また、本明細書で動物細胞に言及した場合、特に明らかでない限り、植物または真菌細胞にも必要な変更を考慮して適用できること、そして、オフターゲット効果が低下した本明細書の酵素及びこのような酵素を用いるシステムは、本明細書で言及されるものを含めて植物用途に使用され得ることも理解されたい。
１つの実施形態において、植物及び真菌に導入される核酸は、植物及び真菌内での発現に対しコドン最適化することができる。コドン最適化の方法としては、Ｋｗｏｎ ＫＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｙｉｅｌｄｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６ Ｓｅｐ；１７２（１）：６２－７７に記載のものが挙げられる。
組成物及びシステムにおける構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質）はさらに、本明細書に記載の１つ以上の機能ドメインを含むことができる。１つの実施形態において、機能的ドメインはエキソヌクレアーゼであってもよい。このようなエキソヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質の機能の効率、例えば、変異誘発の効率を高めることができる。機能的ドメインの例としてはＴｒｅｘ２がある（Ｗｅｉｓｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０４．１１．０３７５７２ｖ１，ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１１．０３７５７２に記載の通り）。
植物の例
本明細書の組成物、システム、及び方法は、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するために使用することができる。多種多様な植物及び植物細胞システムを、所望の生理的及び農学的特性のために操作することができる。概して、「植物」という用語は、特徴的に細胞分裂によって成長し、葉緑体を含み、セルロースを含む細胞壁を有する、植物界における任意の様々な光合成、真核、単細胞、または多細胞の生物に関する。植物という用語は、単子葉植物及び双子葉植物を包含する。
組成物、システム、及び方法は、広範囲の植物、例えば、以下の目に属する双子葉植物の例：Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｖｉｏｌａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｓａｎ ｔａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、及びＡｓｔｅｒａｌｅｓ；以下の目に属するような単子葉植物：Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、及びＯｒｃｈｉｄ ａｌｅｓ、またはＧｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅに属する植物、例えば、以下の目に属する植物：Ｐｉｎａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、Ｃｙｃａｄａｌｅｓ、Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ、及びＧｎｅｔａｌｅｓに使用することができる
組成物、システム、及び方法は、以下の非限定的な双子葉、単子葉、または裸子植物属のリストに含まれる広範囲の植物種にわたって使用することができる：Ａｔｒｏｐａ、Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｃｕｌｕｓ、Ｃｒｏｔｏｎ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｕｇｕｅｔｉａ、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ、Ｆｉｃｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｉｔｓｅａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ、Ｓｔｅｐｈａｎｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｌｉｓ、及びＶｉｇｎａ；ならびにＡｌｌｉｕｍ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｖｅｎａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌｅｍｎａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｍｕｓａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ａｂｉｅｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｐｉｃｅａ、Ｐｉｎｕｓ、及びＰｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ。
１つの実施形態において、操作のための標的植物及び植物細胞としては、例えば、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）、果物作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料用作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ）、葉菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツ（例えば、マツ、モミ、トウヒ）、ファイトレメディエーションに使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、実験目的に使用される植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のような単子葉及び双子葉植物が挙げられる。具体的には、植物は、限定されるものではないが、被子植物及び裸子植物、例えば、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、トネリコ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビーツ、カバノキ、ブナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクラ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、フェンネル、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ピーナッツ、ホオズキ、ガムヘムロック、ヒッコリー、ケール、キウイフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、クジャクシダ、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、マッシュルーム、マスタード、ナッツ、オーク、エンバク、アブラヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、装飾用の植物または花または木、パパイヤ、パーム、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、ナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、チコリ、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、木、ライコムギ、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニを含むことが意図されている。
また、植物という用語は藻類も包含する。藻類は、主に光合成独立栄養生物であり、主に高等植物を特徴付ける根、葉、及び他の器官の欠如により統一されている。本発明の組成物、システム、及び方法は、広範な「藻類」または「藻類細胞」に使用することができる。藻類の例としては、真核生物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ（紅藻類）、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ（緑藻類）、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ（褐藻類）、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ（珪藻類）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ、及び渦鞭毛藻類を含む）、ならびに原核生物門のＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（青緑藻類）が挙げられる。藻類種の例としては、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎｉｋｓｔｒｏｄｅｓｍｉｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｅｍｉｌｉａｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｎｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ、Ｐａｖｌｏｖａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｌａｙｔｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｏｒｈｙｒａ、Ｐｓｅｕｄｏａｎａｂａｅｎａ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍが挙げられる。
植物プロモーター
植物細胞における適切な発現を保証するため、本明細書の構成要素及びシステムの構成要素は、植物プロモーターの制御下に置くことができる。植物プロモーターは、植物細胞内で作用可能なプロモーターである。植物プロモーターは、その起源が植物細胞であるかどうかを問わず、植物細胞内で転写を開始することが可能である。種々のタイプのプロモーターの使用が想定される。
１つの実施形態において、植物プロモーターは構成的植物プロモーターである。これは、植物の全てのまたはほぼ全ての発生段階で、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を植物の全てのまたはほぼ全ての組織で発現する（「構成的発現」と称される）ことができるプロモーターである。構成的プロモーターの一例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターがある。１つの実施形態において、植物プロモーターは、構成的にではなく、時間的及び／または空間的に調節された方法で遺伝子発現を誘導する調節プロモーターであり、これには組織特異的、組織優先的、及び誘導的プロモーターが含まれる。種々のプロモーターが、種々の組織もしくは細胞タイプにおいて、種々の発生段階で、または種々の環境条件に応答して、遺伝子の発現を誘導することができる。１つの実施形態において、植物プロモーターは組織優先的プロモーターであり、これは、特定の植物組織内のある特定の細胞タイプ（例えば、葉もしくは根の脈管細胞、または種子の特定の細胞）内での発現強化を標的とするために利用することができる。
植物プロモーターの例としては、植物から得られるもの、植物ウイルス、植物細胞で発現する遺伝子を含む細菌（例えば、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ）が挙げられる。プロモーターの追加の例としては、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８，Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２；及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、植物プロモーターは誘導的プロモーターであってもよく、これは誘導性であり、遺伝子編集または遺伝子発現の時空間的制御を可能にし、エネルギーの一形態を使用することができる。エネルギーの形態としては、音エネルギー、電磁放射、化学エネルギー、及び／または熱エネルギーを挙げることができる。誘導性システムの例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－ＯｎもしくはＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、または光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、もしくはクリプトクロム）、例えば配列特異的に転写活性の変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。特定の例では、光誘導性システムの構成要素は、Ｃａｓタンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）、及び転写活性化／抑制ドメインを含む。
１つの実施形態において、プロモーターは、化学物質調節プロモーター（外来性化学物質の適用が遺伝子発現を誘導）または化学物質抑制性プロモーター（化学物質の適用が遺伝子発現を抑制）であり得る。化学物質誘導性プロモーターの例としては、トウモロコシｌｎ２－２プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤により活性化）、トウモロコシＧＳＴプロモーター（発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化）、タバコＰＲ－１ ａプロモーター（サリチル酸により活性化）、抗生物質によって制御されたプロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター）が挙げられる。
植物のゲノム内への安定的統合
１つの実施形態において、組成物及びシステムの構成要素をコードするポリヌクレオチドを、植物細胞のゲノム内での安定的な統合のために導入することができる。１つの実施形態において、ベクターまたは発現システムをこのような統合のために使用することができる。ベクターまたは発現システムの設計は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ遺伝子をいつ、どこで、どのような条件で発現させるかに応じて調整することができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、植物のオルガネラ、例えば、色素体、ミトコンドリア、または葉緑体内で統合させることができる。発現システムのエレメントは、環状（例えば、プラスミドもしくは形質転換ベクター）または非環状（例えば、線状二本鎖ＤＮＡ）である１つ以上の発現コンストラクト上に存在し得る。
１つの実施形態において、統合の方法は、概して、好適な宿主細胞または宿主組織を選択するステップと、コンストラクト（複数可）を宿主細胞または宿主組織内に導入するステップと、そこから植物細胞または植物を再生するステップとを含む。１つの実施形態において、植物細胞のゲノム内での安定的な統合のための発現システムは、以下のエレメントのうちの１つ以上を含むことができる：ＲＮＡ及び／またはＣａｓ酵素を植物細胞で発現させるために使用できるプロモーターエレメント；発現を強化するための５’非翻訳領域；ある特定の細胞（例えば、単子葉植物細胞）内の発現をさらに強化するためのイントロンエレメント；ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓ遺伝子配列ならびに他の所望のエレメントを挿入するための好都合な制限部位を提供するマルチクローニング部位；ならびに発現した転写産物の効率的な終結をもたらすための３’非翻訳領域。
植物における一過性発現
１つの実施形態において、組成物及びシステムの構成要素は、植物細胞内で一過性に発現させることができる。１つの実施形態において、組成物及びシステムは、ゲノム修飾をさらに制御することができるように、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質の両方が細胞内に存在する場合にのみ標的核酸を修飾することができる。Ｃａｓタンパク質の発現は一過性であるため、このような植物細胞から再生された植物は、典型的には外来性ＤＮＡを含まない。１つの例示的な実施形態において、Ｃａｓタンパク質は安定的に発現し、ガイド配列は一過性に発現する。
ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を一過性発現のために植物細胞に導入することができる。このような場合、導入された核酸は、細胞を修飾するのに十分な量で提供することができるが、企図された時間期間の経過後または１回以上の細胞分裂後は残存しない。
一過性発現は、好適なベクターを用いて達成することができる。一過性発現に使用することができる例示的なベクターとしては、ｐＥＡＱベクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介一過性発現用に調整することができる）及びキャベツ縮葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）、ならびにＳａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２００９ Ｓｅｐ；７（７）：６８２－９３；及びＹｉｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ５，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ：１４９２６（２０１５）に記載のベクターが挙げられる。
上記の異なる方法の組合せも想定される。
特定の植物オルガネラへの移動及び／またはそこでの発現
本明細書の組成物及びシステムは、特定の植物オルガネラへの移動及び／またはそこでの発現のためのエレメントを含むことができる。
葉緑体の標的化
１つの実施形態において、組成物及びシステムを使用して、葉緑体遺伝子を特異的に修飾すること、または葉緑体内での発現を確実にすることが想定される。組成物及びシステム（例えば、Ｃａｓタンパク質、ガイド分子、またはこれらをコードするポリヌクレオチド）は、葉緑体に対し形質転換、区画化、及び／または標的化を行うことができる。一例では、色素体ゲノムに遺伝子修飾を導入することで、花粉による遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を低減することができる。
葉緑体の形質転換方法の例としては、粒子ボンバードメント、ＰＥＧ処理、及びマイクロインジェクション、及び形質転換カセットを核ゲノムから色素体に移動させる方法が挙げられる。１つの実施形態において、葉緑体の標的化は、葉緑体局在化配列及び／または発現コンストラクトに、組成物及びシステムの構成要素をコードする配列の５’領域に作用可能に連結した葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）または色素体輸送ペプチドをコードする配列を組み込むことにより、達成することができる。葉緑体の形質転換、標的化、及び局在化の追加の例としては、ＷＯ２０１００６１１８６；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，２０１０，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１：１５７－１８０；及びＵＳ２００４０１４２４７６に記載のものが挙げられ、これらは参照により全体として本明細書に援用される。
植物における例示的な用途
組成物、システム、及び方法を使用して、目的の植物（例えば、作物）において遺伝子バリエーション（複数可）を生成することができる。ゲノム内の１つ以上の位置を標的とする１つ以上のガイド分子、例えばそのライブラリーを提供し、Ｃａｓエフェクタータンパク質とともに植物細胞に導入することができる。例えば、ゲノム規模の点変異及び遺伝子ノックアウトの集合を生成することができる。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、このように得られた細胞から植物部分または植物を生成し、目的の形質について細胞をスクリーニングすることができる。標的遺伝子は、コード領域及び非コード領域の両方を含むことができる。１つの実施形態において、形質はストレス耐性であり、方法は、ストレス耐性作物変種の生成のための方法である。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、内在性遺伝子の修飾、またはその発現の修飾に使用される。構成要素の発現により、Ｃａｓヌクレアーゼの直接的な活性と、任意選択で組換え鋳型ＤＮＡの導入、または標的とする遺伝子の修飾とにより、ゲノムの標的修飾を誘導することができる。本明細書の上記に記載の種々の戦略により、植物ゲノム内への構成要素の導入を必要とすることなく、Ｃａｓ媒介の標的ゲノム編集が可能になる。
１つの実施形態において、修飾は、植物のゲノム内にいかなる外来遺伝子（構成要素をコードするものを含む）も恒久的に導入することなく、植物のゲノム内に外来性ＤＮＡが存在するのを回避するように実施することができる。非トランスジェニック植物に対しては規制要件が厳しくないことから、これは関心対象となり得る。植物細胞内に一過性に導入された構成要素は、典型的には交配時に除去される。
例えば、修飾は、組成物及びシステムの構成要素の一過性発現によって実施することができる。一過性発現は、ウイルスベクターによる組成物及びシステムの構成要素の送達、プロトプラスト内への送達、粒子分子（例えば、ナノ粒子またはＣＰＰ）を利用して実施することができる。
所望の形質を有する植物の生成
本明細書の組成物、システム、及び方法を使用して、植物に所望の形質を導入することができる。このアプローチは、目的の形質を付与するための１つ以上の外来遺伝子の導入と、目的の形質を付与するための内在性遺伝子の編集または調節とを含む。
農学的形質
１つの実施形態において、作物植物は、特定の植物形質に影響を及ぼすことによって改善することができる。形質の例としては、改善された農学的形質、例えば、除草剤抵抗性、病害抵抗性、非生物的ストレス耐性、高収量、及び優れた品質、除草剤抵抗性、病害抵抗性、昆虫及び線虫抵抗性、寄生雑草に対する抵抗性、乾燥耐性、栄養価、ストレス耐性、自家受粉回避（ｖｏｉｄａｎｃｅ）、飼料消化性バイオマス、及び穀物収量が挙げられる。
１つの実施形態において、有害生物または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子を植物に導入することができる。このような抵抗性を付与する内在性遺伝子が植物に存在する場合は、その発現及び機能を強化することができる（例えば、付加的なコピーの導入、発現及び／または活性を強化する修飾により）。
抵抗性を付与する遺伝子の例としては、植物病害抵抗性遺伝子（例えば、Ｃｆ－９、Ｐｔｏ、ＲＳＰ２、ＳｌＤＭＲ６－１）、有害生物に対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／３０５１７号に記載のもの）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質、レクチン、ビタミン結合タンパク質（例えば、アビジン）、酵素阻害剤（例えば、プロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤）、昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン（例えば、エクジステロイドまたは幼若ホルモン、そのバリアント、それに基づく模倣物、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト）またはそのホルモン及びフェロモンの産生及び調節に関与する遺伝子、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド、昆虫特異的毒液（例えば、ヘビ、スズメバチなどが産生するもの、またはそのアナログ）、殺虫活性を有するモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体、または他の非タンパク質分子の超集積に関与する酵素、生物学的活性分子の修飾に関与する酵素（例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、及びグルカナーゼ（天然または合成））、シグナル伝達を刺激する分子、ウイルス侵入タンパク質またはそれに由来する複合毒素、病原体または寄生体が自然界で産生する発生抑止的タンパク質、植物が自然界で産生する発生抑止的タンパク質、あるいはこれらの組合せが挙げられる。
組成物、システム、及び方法を使用して、ある特定の病原体、例えば、宿主特異的病原体に対する感受性を生じさせる遺伝子可変性につながる変異または配列を特定、スクリーニング、導入、または除去することができる。このようなアプローチにより、非宿主抵抗性である（例えば、宿主及び病原体が不適合であるか、あるいは病原体の全ての種に対する部分的な抵抗性（典型的には多くの遺伝子により制御される）、及び／または病原体の一部の種に対する（ただし他の種には該当しない）完全な抵抗性が存在し得る）植物を生成することができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、植物の疾患に関与する遺伝子を修飾することができる。このような遺伝子は、除去、不活性化、または別の形で調節または修飾することができる。植物病害の例としては、ＵＳ２０１４０２１３６１９Ａ１（参照により全体として本明細書に援用される）の［００４５］～［００８０］に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子を植物に導入することができる。除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子の例としては、成長点または分裂組織を阻害する除草剤（例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素）に対する抵抗性を付与する遺伝子、グリホサート耐性を付与する遺伝子（例えば、抵抗性は、それぞれ変異体５－エノールピルビルシキメート－３－ホスフェートシンターゼ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子、及びグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によって付与される）、または、例えばグルホシネートによる他のホスホノ化合物に対する抵抗性（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓを含む）からのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、ならびにＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子によるピリジンオキシまたはフェノキシプロプリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）及びシクロヘキソン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅ）に対する抵抗性、光合成を阻害する除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、トリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子））、除草剤を解毒する酵素または阻害に抵抗性である変異グルタミンシンターゼ酵素をコードする遺伝子、解毒酵素（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする酵素）をコードする遺伝子（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種からのｂａｒまたはｐａｔタンパク質）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤をコードする遺伝子、ならびに変異またはキメラＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
１つの実施形態において、非生物的ストレス耐性に関与する遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子の例としては、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現及び／または活性を低減することが可能な遺伝子、ＰＡＲＧコード遺伝子の発現及び／または活性を低減することが可能な導入遺伝子、ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド・サルベージ合成経路の植物機能的酵素（ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンターゼ、またはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含む）、糖質生合成に関与する酵素、ポリフルクトース（例えば、イヌリン及びレバンタイプ）の産生、アルファ－１，６分岐α－１，４－グルカンの産生、アルテルナンの産生、ヒアルロナンの産生に関与する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
１つの実施形態において、乾燥抵抗性を改善する遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子の例は、ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質（ＵＰＬ）タンパク質（ＵＰＬ３）、ＤＲ０２、ＤＲ０３、ＡＢＣトランスポーター、及びＤＲＥＢ１Ａである。
栄養的に改善された植物
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、栄養的に改善された植物を産生することができる。１つの実施形態において、このような植物は、機能性食品、例えば、それが含む従来の栄養素を超えて健康上の利益を提供し得る修飾された食品または食品成分を提供することができる。１つの例示的な実施形態において、このような植物は、栄養補助食品（例えば、食品または食品の一部とみなされ、疾患の予防及び治療を含む健康上の利益を提供し得る物質）を提供することができる。栄養補助食品は、動物及びヒトにおける疾患（例えば、がん、糖尿病、心血管疾患、及び高血圧）の予防及び／または治療に有用であり得る。
改善された植物は、１つ以上の所望の化合物を天然に産生することができ、修飾によって化合物のレベルまたは活性または品質を強化することができる。１つの実施形態において、改善された植物は、天然には化合物（複数可）を産生しない場合もあるが、修飾によって、植物がこのような化合物（複数可）を産生することが可能になる。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、これらの化合物の内在性合成の間接的な修飾を、例えば、この化合物の代謝を制御する１つ以上の転写因子を修飾することによって行う。
栄養的に改善された植物の例としては、修飾されたタンパク質品質、含有量、及び／またはアミノ酸組成、必須アミノ酸含有量、油脂及び脂肪酸、炭水化物、ビタミン及びカロテノイド、機能的二次代謝物、及びミネラルを含む植物が挙げられる。１つの実施形態において、改善された植物は、健康上の利点を有する化合物を含むまたは産生することができる。栄養的に改善された植物の例としては、Ｎｅｗｅｌｌ－ＭｃＧｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ ２００８，Ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．９３９－９５３に記載のものが挙げられる。
産生され得る化合物の例としては、カロテノイド（例えば、α－カロテンもしくはβ－カロテン）、ルテイン、リコピン、ゼアキサンチン、食物繊維（例えば、不溶性繊維、β－グルカン、可溶性繊維）、脂肪酸（例えば、ω－３脂肪酸、共役リノール酸、ＧＬＡ）、フラボノイド（例えば、ヒドロキシケイ皮酸、フラボノール、カテキン、及びタンニン）、グルコシノレート、インドール、イソチオシアネート（例えば：、スルフォラファン）、フェノール（例えば、スチルベン、コーヒー酸及びフェルラ酸、エピカテキン）、植物スタノール／ステロール、フルクタン、イヌリン、フラクトオリゴ糖、サポニン、ダイズタンパク質、フィトエストロゲン（例えば、イソフラボン、リグナン）、硫化物及びチオール（例えば、ジアリルスルフィド、アリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン）、タンニン（例えば、プロアントシアニジン）、またはこれらの組合せが挙げられる。
また、組成物、システム、及び方法を使用して、タンパク質／デンプンの機能性、貯蔵寿命、食味／美観、繊維品質、及びアレルゲン、抗栄養素、及び毒素低減形質を修飾することができる。
形質を導入するために修飾され得る遺伝子及び核酸の例としては、ステアリル－ＡＣＰデサチュラーゼ、単一アレルに関連するＤＮＡ（低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ変異体の原因となり得る）、Ｔｆ ＲＡＰ２．２及びその相互作用パートナーＳＩＮＡＴ２、Ｔｆ Ｄｏｆ１、ＤＯＦ Ｔｆ ＡｔＤｏｆ１．１（ＯＢＰ２）が挙げられる。
倍数体植物の修飾
組成物、システム、及び方法を使用して、倍数体植物を修飾することができる。倍数体植物は、そのゲノムの重複コピー（例えば、コムギにおけるような６コピーといった多数のコピー）を保有する。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、遺伝子の全てのコピーに影響を及ぼすように、または一度に数十の遺伝子を標的とするように多重化することができる。例えば、組成物、システム、及び方法を使用して、疾患に対する防御を抑制する役目を果たす異なる遺伝子の機能喪失変異を同時に確保することができる。この修飾は、コムギ植物がウドンコ病に抵抗性を有することを確実にするために、コムギ植物細胞内でのＴａＭＬＯ－Ａｌ、ＴａＭＬＯ－Ｂｌ、及びＴａＭＬＯ－Ｄｌ核酸配列の発現を同時に抑制し、そこからコムギ植物を再生することであってもよい（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５１０９７５２号に記載の通り）。
果実熟成の調節
組成物、システム、及び方法を使用して、果実の熟成を調節することができる。熟成は、果物及び野菜の成熟プロセスにおける正常な段階である。熟成が始まるとわずか数日で果物または野菜が食用にできなくなることがあり、農家及び消費者の両方に著しい損失をもたらし得る。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、エチレン生成の低減に使用される。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、ＡＣＣシンターゼの発現及び／または活性の抑制、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子またはその機能的フラグメントの挿入、ＳＡＭヒドロラーゼ遺伝子またはその機能的フラグメントの挿入、ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子の発現抑制を行うことができる。
代替的または追加的に、組成物、システム、及び方法を使用して、エチレン受容体の修飾（例えば、ＥＴＲ１の抑制）及び／またはポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）の修飾を行うことができる。遺伝子の抑制は、遺伝子の変異、アンチセンス配列、及び／または切断コピーをゲノムに導入することによって達成することができる。
植物の貯蔵寿命の向上
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、植物または植物部分の貯蔵寿命に影響を及ぼす化合物の産生に関与する遺伝子を修飾する。修飾は、ジャガイモ塊茎の還元糖の蓄積を防止する遺伝子に行うことができる。高温処理を行うと、この還元糖は遊離アミノ酸と反応し、その結果、褐色で苦味のある製品となり、潜在的な発がん物質であるアクリルアミドのレベルが上昇する。特定の実施形態において、本明細書で提供する方法は、スクロースをグルコース及びフルクトースに分解するタンパク質をコードする液胞インベルターゼ遺伝子（ＶＩｎｖ）の発現を低下または阻害するために使用される。
植物中のアレルゲンの低減
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、消費者にとってより安全な、アレルゲンのレベルが低下した植物の生成に使用される。この目的に向けて、組成物、システム、及び方法を使用して、植物アレルゲンの産生を担う１つ以上の遺伝子を特定し修飾（例えば、抑制）することができる。このような遺伝子の例としては、Ｌｏｌ ｐ５、及びピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤインゲン、リョクトウの遺伝子、例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１１（３）：２２２（参照により全体として本明細書に援用される）に記載のものが挙げられる。
雄性不稔植物の生成
組成物、システム、及び方法は、雄性不稔植物の生成に使用することができる。ハイブリッド植物は、典型的には、近交系植物と比較して有利な農学的形質を有する。しかし、自家受粉植物の場合、ハイブリッドの生成は困難であり得る。種々の植物タイプ（例えば、トウモロコシ及びイネ）において、植物の稔性、より特定的には雄性稔性にとって重要な遺伝子が特定されている。このように遺伝子改変した植物は、ハイブリッド育種プログラムに使用することができる。
組成物、システム及び方法を使用して、雄性稔性に関与する遺伝子を修飾して、例えば、（変異を導入することなどにより）雄性稔性に必要な遺伝子を不活性化することができる。雄性稔性に関与する遺伝子の例としては、シトクロムＰ４５０様遺伝子（ＭＳ２６）、またはメガヌクレアーゼ遺伝子（ＭＳ４５）、ならびにＷａｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１９ Ｍａｒ ４；１２（３）：３２１－３４２；及びＫｉｍ ＹＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ；２３（１）：５３－６５に記載のものが挙げられる。
植物の稔性期の増加
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、イネなどの植物の稔性期を延長することができる。例えば、遺伝子内に変異を生成するためにＥｈｄ３などのイネ稔性期遺伝子を標的とすることができ、再生植物稔性期の延長のために苗を選択することができる。
製品の早期収穫物の産生
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、製品の早期収穫物を産生することができる。例えば、開花プロセスは、ＳＰ５Ｇなどの開花リプレッサー遺伝子を変異させることにより、調節することができる。このようなアプローチの例としては、Ｓｏｙｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１７ Ｊａｎ；４９（１）：１６２－１６８に記載のものが挙げられる。
石油及びバイオ燃料の産生
組成物、システム、及び方法を使用して、石油及びバイオ燃料の産生用の植物を生成することができる。バイオ燃料は、植物及び植物由来の資源から作製される燃料を含む。バイオ燃料は、炭素固定のプロセスを通じてエネルギーが得られた有機物質から抽出することができ、またはバイオマスの使用もしくは変換によって作製される。このバイオマスは、直接バイオ燃料として使用してもよく、または熱変換、化学変換、及び生化学変換によって便利なエネルギー含有物質に変換してもよい。このバイオマス変換の結果、固体、液体、または気体形態の燃料となる。バイオ燃料は、バイオエタノール及びバイオディーゼルを含む。バイオエタノールは、トウモロコシ及びサトウキビに由来し得るセルロース（デンプン）の糖発酵プロセスにより、産生することができる。バイオディーゼルは、ナタネ、パーム、及びダイズなどの油料作物から産生することができる。バイオ燃料は輸送に利用することができる。
植物油及びバイオ燃料を産生するための植物の生成
組成物、システム、及び方法を使用して、高レベルの油またはバイオ燃料を発現または過剰発現する藻類（例えば、珪藻）及び他の植物（例えば、ブドウ）を生成することができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、脂質の量及び／または脂質の質の修飾に関与する遺伝子を修飾することができる。このような遺伝子の例としては、脂肪酸合成の経路に関与するもの、例えば、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、３－ケトアシル＿アシル－キャリアタンパク質シンターゼＩＩＩ、グリセロール－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、エノイル－アシル－キャリアタンパク質レダクターゼ（エノイル－ＡＣＰ－レダクターゼ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジックアシルトランスフェラーゼもしくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、脂肪酸チオエステラーゼ、例えば、パルミトイプロテインチオエステラーゼ、またはリンゴ酸酵素活性が挙げられる。
さらなる実施形態において、脂質の蓄積が増加した珪藻を生成することが想定される。これは、脂質の異化を減少させる遺伝子を標的とすることにより、達成することができる。遺伝子の例としては、トリアシルグリセロール及び遊離脂肪酸の活性化、脂肪酸のβ酸化に関与するもの、例えば、アシル－ＣｏＡシンターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－ＣｏＡオキシダーゼ活性、及びホスホグルコムターゼの遺伝子が挙げられる。
１つの実施形態において、藻類は、脂肪酸（例えば、酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）及び脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）などの脂肪エステル）を含めた油及びバイオ燃料の産生のために修飾することができる。微細藻類を修飾する方法の例としては、Ｓｔｏｖｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．，２０１５；２：１；米国特許第８，９４５，８３９号；及び国際特許公開第ＷＯ２０１５／０８６７９５号に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、１つ以上の遺伝子は、炭素源（例えば、アルコール）から油及びバイオ燃料（例えば、脂肪酸）を産生するために植物（例えば、藻類）に導入する（例えば、過剰発現させる）ことができる。遺伝子の例としては、アシル－ＣｏＡシンターゼ、エステルシンターゼ、チオエステラーゼ（例えば、ｔｅｓＡ、’ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ｆａｔＡｌ、またはｆａｔＡ）、アシル－ＣｏＡシンターゼ（例えば、ｆａｄＤ、ＪａｄＫ、ＢＨ３１０３、ｐｆｌ－４３５４、ＥＡＶ１５０２３、ｆａｄＤｌ、ｆａｄＤ２、ＲＰＣ＿４０７４、ｆａｄＤＤ３５、ｆａｄＤＤ２２、ｆａａ３９）、エステルシンターゼ（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ ｊａｄｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、もしくはＡｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、またはこれらのバリアントに由来するシンターゼ／アシルＣｏＡ：ジアシルグリセリルアシルトランスフェラーゼ）が挙げられる。
追加的または代替的に、植物（例えば、藻類）における１つ以上の遺伝子を不活性化（例えば、遺伝子の発現を減少）させてもよい。例えば、１つ以上の変異を遺伝子に導入することができる。このような遺伝子の例としては、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例えば、ｆａｄｅ）、外膜タンパク質受容体をコードする遺伝子、及び脂肪酸生合成の転写調節物質（例えば、リプレッサー）をコードする遺伝子（例えば、ｆａｂＲ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（例えば、ｐｆｌＢ）、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例えば、ＩｄｈＡ）が挙げられる。
有機酸の産生
１つの実施形態において、植物は、乳酸などの有機酸を産生するように修飾することができる。植物は、糖、ペントース、またはヘキソースを用いて有機酸を産生することができる。この目的に向けて、１つ以上の遺伝子を植物内に導入する（例えば、そして過剰発現させる）ことができる。このような遺伝子の例として、ＬＤＨ遺伝子がある。
１つの実施形態において、１つ以上の遺伝子が不活性化される（例えば、遺伝子の発現が低下する）ことがある。例えば、１つ以上の変異を遺伝子に導入することができる。遺伝子としては、目的の有機酸以外の代謝物を産生する内在性代謝経路、及び／または有機酸を消費する内在性代謝経路に関与するタンパク質をコードするものを挙げることができる。
修飾または導入され得る遺伝子の例としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、フマル酸還元酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄ－ｌｄｈ）、Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌ－ｌｄｈ）、乳酸２－モノオキシゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、シトクロム依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（例えば、シトクロムＢ２依存性Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼ）をコードするものが挙げられる。
バイオ燃料産生のための植物特性の強化
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、植物の細胞壁の特性を改変して、発酵のためのより効率的な糖の放出のために、主要な加水分解剤によるアクセスを容易にする。植物中のリグニンの割合を低減することにより、セルロースの割合が増加し得る。特定の実施形態において、植物内で、発酵性炭水化物を増加させるようにリグニン生合成を下方調節することができる。
１つの実施形態において、１つ以上のリグニン生合成遺伝子を下方調節することができる。このような遺伝子の例としては、４－クマル酸３－ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、フェニルアラニンアンモニア－リアーゼ（ＰＡＬ）、ケイ皮酸４－ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＨＣＴ）、コーヒー酸Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、カフェオイルＣｏＡ ３－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、フェルラ酸５－ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、シンナモイルＣｏＡ－レダクターゼ（ＣＣＲ）、４－クマル酸－ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、モノリグノール－リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、ならびにＷＯ２００８０６４２８９に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、発酵中に低レベルの酢酸を産生する植物質量を低減することができる。この目的に向けて、多糖のアセチル化に関与する遺伝子（例えば、Ｃａｓ１Ｌ、及び国際特許公開第ＷＯ２０１００９６４８８号に記載のもの）を不活性化することができる。
その他の油及びバイオ燃料産生用の微生物
１つの実施形態において、植物以外の微生物は、本明細書の組成物、システム、及び方法を用いた油及びバイオ燃料の産生に使用することができる。微生物の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のものが挙げられる。
植物の培養及び再生
１つの実施形態において、修飾された植物または植物細胞を培養して、形質転換または修飾遺伝子型、したがって所望の表現型を有する全植物を再生することができる。再生技法の例としては、組織培養成長培地中のある特定の植物ホルモンの操作に依存するもの、所望のヌクレオチド配列とともに導入された殺生物剤及び／または除草剤マーカーに依存するもの、培養したプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚、またはこれらの一部から得るものが挙げられる。
植物ゲノムの修飾の検出（選択マーカー）
組成物、システム、及び方法を使用して植物を修飾する場合、好適な方法を使用して、植物になされた修飾を確認及び検出することができる。１つの実施形態において、様々な修飾がなされた場合、１つ以上の所望の修飾または修飾から得られた形質を、選択及び検出することができる。検出及び確認は、生化学及び分子生物学の技法、例えば、サザン解析、ＰＣＲ、ノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素－ＰＣＲ、酵素アッセイ、リボザイム活性、ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫測定、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色によって実施することができる。
１つの実施形態において、１つ以上のマーカー（例えば、選択マーカー及び検出マーカー）を植物に導入することができる。このようなマーカーは、所望の修飾及び形質を有する細胞及び植物の選択、モニタリング、単離に使用することができる。選択マーカーは、ポジティブ選択及びネガティブ選択を付与することができ、外部基質の存在に条件的または非条件的である。このようなマーカーの例としては、抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子及びタンパク質（例えば、ハイグロマイシン（ｈｐｔ）及びカナマイシン（ｎｐｔＩＩ））、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、ホスフィノトリシン（ｂａｒ）及びクロロスルフロン（ａｌｓ））、着色物質を産生または処理することが可能な酵素（例えば、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）が挙げられる。
真菌における用途
本明細書に記載の組成物、システム、及び方法を使用して、真菌または真菌細胞（例えば、公募）において、効率的かつ費用効果の高い遺伝子またはゲノムの照合または編集または操作を実施することができる。植物におけるアプローチ及び用途は、真菌にも適用することができる。
真菌細胞は、真菌界内の任意のタイプの真核細胞、例えば、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ門、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ門、及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ門であり得る。真菌または真菌細胞の例としては、酵母、カビ、及び糸状菌が挙げられる。
１つの実施形態において、真菌細胞は酵母細胞である。酵母細胞とは、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門に属する任意の真菌細胞を指す。酵母の例としては、出芽酵母、分裂酵母、及びカビ、Ｓ．ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ならびにＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、及びＣａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）が挙げられる。
１つの実施形態において、真菌細胞は、フィラメント（例えば、菌糸（ｈｙｐｈａｅ）または菌糸（ｍｙｃｅｌｉａ））で成長する糸状菌細胞である。糸状菌細胞の例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）が挙げられる。
１つの実施形態において、真菌細胞は工業用株のものである。工業用株には、工業プロセス（例えば、商業または工業規模での製品の産生）に使用される、またはそこから単離される真菌細胞の任意の株が含まれる。工業用株は、典型的に工業用プロセスで使用される真菌種を指す場合もあれば、非工業用目的（例えば、実験室の研究）にも使用され得る真菌種の単離株を指す場合もある。工業用プロセスの例としては、発酵（例えば、食品または飲料製品の産生）、蒸留、バイオ燃料の産生、化合物の産生、及びポリペプチドの産生が挙げられる。工業用株の例としては、限定されるものではないが、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４が挙げられる。
１つの実施形態において、真菌細胞は、ゲノムが複数のコピーで存在する倍数体細胞である。倍数体細胞には、倍数体状態で天然に見出される細胞、及び倍数体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、改変、不活性化、活性化、または修飾）が含まれる。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞の場合もあれば、目的の特定のゲノム座位において倍数体である細胞の場合もある。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡの存在量は、単数体細胞よりも倍数体細胞のゲノム操作において律速構成要素となることが多く、したがって、本明細書に記載の組成物及びシステムを用いる方法は、ある特定の真菌細胞タイプの使用を活用することができる。
１つの実施形態において、真菌細胞は、ゲノムが２つのコピーで存在する二倍体細胞である。二倍体細胞には、二倍体状態で天然に見出される細胞、及び二倍体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、改変、不活性化、活性化、または修飾）が含まれる。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指すこともあれば、特定のゲノム座位が二倍体である細胞を指すこともある。
１つの実施形態において、真菌細胞は、ゲノムが１コピーで存在する単数体細胞である。単数体細胞には、単数体状態で天然に見出される細胞、または単数体状態で存在するように誘導された細胞（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の調節、改変、不活性化、活性化、または修飾）が含まれる。単数体細胞は、ゲノム全体が単数体である細胞を指すこともあれば、特定のゲノム座位が単数体である細胞を指すこともある。
本発明の組成物及びシステム、ならびにこれらをコードする核酸は、本明細書の送達システム及び方法を用いて真菌細胞に導入することができる。送達システムの例としては、酢酸リチウム処理、ボンバードメント、エレクトロポレーション、及びＫａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３に記載のものが挙げられる。
１つの実施形態において、酵母発現ベクター（例えば、１つ以上の調節エレメントを有するもの）を使用することができる。このようなベクターの例としては、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列または遺伝子に作用可能に連結したプロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）、ターミネーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター）、複製起点、マーカー遺伝子（例えば、栄養要求性、抗生物質、または他の選択マーカー）が挙げられる。酵母内で使用するための発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母統合型プラスミド、酵母複製型プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドを挙げることができる。
真菌によるバイオ燃料及び材料の産生
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、バイオ燃料及び材料の産生のための修飾真菌の生成に使用することができる。例えば、発酵性糖類からバイオ燃料やバイオポリマーを産生するための修飾菌は、任意選択で、発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物に由来する植物由来のリグノセルロースを分解することができる。バイオ燃料の産生及び合成に必要とされる外来遺伝子を真菌に導入することができる。１つの実施形態において、遺伝子は、ピルビン酸からエタノールまたは別の目的の産物への変換、セルロースの分解（例えば、セルラーゼ）、バイオ燃料産生経路と競合する内在性代謝経路に関与する酵素をコードすることができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法は、キシロースまたはセロビオースの利用、イソプレノイド生合成、及び／または乳酸産生量が改善された酵母株を生成及び／または選択するために使用することができる。これらの化合物の代謝及び合成に関与する１つ以上の遺伝子を修飾し、及び／または酵母細胞に導入することができる。方法及び遺伝子の例としては、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰＤＣ１、及びＰＤＣ５、ならびにＨａ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２）：５０４－９及びＧａｌａｚｋａ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０（６０００）：８４－６；Ｊａｋｏｃｉｕｎａｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１５ Ｍａｒ；２８：２１３－２２２；Ｓｔｏｖｉｃｅｋ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１７ Ａｕｇ １；１７（５）に記載のものが挙げられる。
改善された植物及び酵母細胞
本開示はさらに、改善された植物及び真菌を提供する。改善された真菌は、本明細書の組成物、システム、及び方法によって導入された１つ以上の遺伝子及び／または修飾された１つ以上の遺伝子を含むことができる。改善された植物及び真菌は、食品または飼料産生量の増加（例えば、タンパク質、炭水化物、栄養素、またはビタミンレベルの向上）、油及びバイオ燃料産生量の増加（例えば、メタノール、エタノール）、害虫、除草剤、乾燥、低温または高温、過剰水などに対する耐性を有することができる。
植物または真菌は、改善された１つ以上の部分（例えば、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉）を有することができる。部分は、生存可能、生存不能、再生可能、及び／または再生不能であってもよい。
改善された植物及び真菌は、改善された植物及び真菌の配偶子、種子、胚、接合体または体細胞のいずれか、後代及び／またはハイブリッドを含むことができる。後代は、産生された植物または真菌のクローンであることもあれば、その子孫にさらに望ましい形質を移入するために同じ種の他の個体と交配することにより、有性生殖の結果として生じることもある。細胞は、多細胞生物、特に植物の場合はｉｎ ｖｉｖｏであってもｅｘ ｖｉｖｏであってもよい。
植物におけるさらなる用途
植物及び真菌における組成物、システム、及び方法のさらなる用途としては、遺伝子エレメント動態の可視化（例えば、ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｃｈｅｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｄｅｃ １９；１５５（７）：１４７９－９１に記載のもの）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの標的遺伝子破壊ポジティブ選択（Ｍａｌｉｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１３ Ｄｅｃ １；２７（２３）：２６０２－１４に記載）、エピジェネティック修飾（例えば、Ｃａｓ及びヒストン修飾酵素を用いたもの）（例えば、Ｒｕｓｋ Ｎ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ｊａｎ；１１（１）：２８に記載）、転写調節物質の同定（例えば、Ｗａｌｄｒｉｐ ＺＪ，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１４ Ｓｅｐ；９（９）：１２０７－１１に記載のもの）、ＲＮＡ及びＤＮＡ両方のウイルスに対する抗ウイルス治療（例えば、Ｐｒｉｃｅ ＡＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５ Ｍａｙ １２；１１２（１９）：６１６４－９；Ｒａｍａｎａｎ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｎ ２；５：１０８３３に記載のもの）、染色体数などのゲノム複雑性の改変（例えば、Ｋａｒｉｍｉ－Ａｓｈｔｉｙａｎｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５ Ｓｅｐ ８；１１２（３６）：１１２１１－６；Ａｎｔｏｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｕｓ．２０１４ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：１６３－７２に記載のもの）、不活性化／活性化の制御のためのＣＲＩＳＰＲシステムの自己切断（例えば、Ｓｕｇａｎｏ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ Ｍａｒ；５５（３）：４７５－８１に記載のもの）、多重化遺伝子編集（Ｋａｂａｄｉ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｏｃｔ ２９；４２（１９）：ｅ１４７に記載のもの）、多重化ゲノム編集のためのキット開発（Ｘｉｎｇ ＨＬ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ ２９；１４：３２７に記載のもの）、デンプン産生（Ｈｅｂｅｌｓｔｒｕｐ ＫＨ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１５ Ａｐｒ ２３；６：２４７に記載のもの）、ファミリーまたは経路における複数遺伝子の標的化（例えば、Ｍａ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１５ Ａｕｇ；８（８）：１２７４－８４に記載のもの）、非コード遺伝子及び配列の調節（例えば、Ｌｏｗｄｅｒ ＬＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；１６９（２）：９７１－８５に記載のもの）、樹木における遺伝子編集（例えば、Ｂｅｌｈａｊ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ １１；９（１）：３９；Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１４ Ｓｅｐ １；２８（１７）：１８５９－７２；Ｚｈｏｕ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．２０１５ Ｏｃｔ；２０８（２）：２９８－３０１に記載のもの）、宿主特異的な病原体及び有害生物に対する抵抗性のための変異の導入が挙げられる。
組成物、システム、及び方法を用いて実施することができる植物及び真菌の修飾の追加の例としては、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０９９８８７号、同第ＷＯ２０１６／０２５１３１号、同第ＷＯ２０１６／０７３４３３号、同第ＷＯ２０１７／０６６１７５号、同第ＷＯ２０１７／１００１５８号、同第ＷＯ２０１７／１０５９９１号、同第ＷＯ２０１７／１０６４１４号、同第ＷＯ２０１６／１００２７２号、同第ＷＯ２０１６／１００５７１号、同第ＷＯ２０１６／１００５６８号、同第ＷＯ２０１６／１００５６２号、及び同第ＷＯ２０１７／０１９８６７号に記載のものが挙げられる。
非ヒト動物における用途
組成物、システム、及び方法を使用して、非ヒト動物の研究及び修飾（例えば、望ましい形質及び疾患耐性の導入、疾患の治療、繁殖の促進など）を行うことができる。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、繁殖及び所望の形質の導入の改善（例えば、形質関連アレルの頻度の増加、リンケージドラッグを伴わない他の育種／種からのアレルの導入、及び新規の好ましいアレルの創出）を行うことができる。標的となり得る遺伝子及び他の遺伝子エレメントをスクリーニングし特定することができる。用途及びアプローチの例としては、Ｔａｉｔ－Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ２．０ － ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｆｉｔｔｅｒ，ｈｅａｌｔｈｉｅｒ，ａｎｄ ｍｏｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆａｒｍｅｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｎｏｖ ２６；１９（１）：２０４；Ｌｉｌｌｉｃｏ Ｓ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ａｎｉｍａｌｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２０１９ Ａｕｇ；２８（Ｓｕｐｐｌ ２）：５７－６０；Ｈｏｕｓｔｏｎ ＲＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏ ｆａｓｔ－ｔｒａｃｋ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０２０ Ａｐｒ １６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０２０－０２２７－ｙに記載のものが挙げられ、これらの文献は、参照により全体として本明細書に援用される。治療、診断などの他のセクションに記載されている用途も、本明細書の動物に使用することができる。
本発明の組成物、システム、及び方法は、魚類、両生類、爬虫類、哺乳類、及び鳥類などの動物に使用することができる。動物は、家畜及び農業用動物、またはペットであってもよい。家畜及び農業用動物の例としては、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカ、鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、及びガチョウが挙げられる。動物は、非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、キヌザル、タマリン、クモザル、リスザル、及びベルベットモンキーであってもよい。ペットの例としては、イヌ、ネコ、ウマ、オオカミ、ウサギ、フェレット、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット、カナリア、インコ、及びオウムが挙げられる。
１つの実施形態において、１つ以上の遺伝子を動物内に導入して（例えば、過剰発現させて）、１つ以上の所望の形質を得るか、または強化することができる。成長ホルモン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）を導入して、動物、例えば、ブタまたはサケの成長を増大させることができる（例えば、Ｐｕｒｓｅｌ ＶＧ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．１９９０；４０：２３５－４５；Ｗａｌｔｚ Ｅ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７；５４８：１４８に記載の通り）。Ｆａｔ－１遺伝子（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来）は、より大きなｎ－３脂肪酸：ｎ－６脂肪酸の比の産生のために導入することができ、例えばブタにおいて誘導することができる（例えば、Ｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１８；８：１７４７－５４に記載の通り）。フィターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）、キシラナーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来）、ベータ－グルカナーゼ（例えば、ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来）は、リン及び窒素の放出低減により環境的影響を低減するために、例えばブタにおいて導入することができる（例えば、Ｇｏｌｏｖａｎ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；１９：７４１－５；Ｚｈａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．，ｅｌｉｆｅ．２０１８に記載の通り）。ｓｈＲＮＡデコイは、例えばニワトリにおいて、鳥インフルエンザの耐性を誘導するために導入することができる（例えば、Ｌｙａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１；３３１：２２３－６に記載の通り）。リゾチームまたはリゾスタフィンは、例えばヤギ及びウシにおいて、乳房炎の耐性を誘導するために導入することができる（例えば、Ｍａｇａ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇ Ｄｉｓ．２００６；３：３８４－９２；Ｗａｌｌ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３：４４５－５１に記載の通り）。ＨＤＡＣ６などのヒストンデアセチラーゼは、例えばブタにおいて、ＰＲＲＳＶ耐性を誘導するために導入することができる（例えば、Ｌｕ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２：ｅ０１６９３１７に記載の通り）。ＣＤ１６３は、ブタにおいて、ＰＲＲＳＶ耐性を導入するために修飾（例えば、不活性化または除去）することができる（例えば、Ｐｒａｔｈｅｒ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ｏｃｔ １７；７（１）：１３３７１に記載の通り）。同様のアプローチは、動物からヒトに感染する可能性のあるウイルスや細菌（例えば、インフルエンザＣやＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３と呼ばれるインフルエンザＡの亜型を含むブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）株、肺炎、髄膜炎、浮腫）を抑制または除去するためにも使用できる。
１つの実施形態において、１つ以上の遺伝子は、疾患抵抗性及び産生形質のために修飾または編集することができる。ミオスタチン（例えば、ＧＤＦ８）は、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ナマズ、及びブタにおいて、筋肉の成長を増加させるように修飾することができる（Ｃｒｉｓｐｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅに記載されているようなものである。２０１５；１０：ｅ０１３６６９０；Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；４９：４３－５１；Ｋｈａｌｉｌ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７；７：７３０１；Ｋａｎｇ Ｊ－Ｄ，ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．２０１７；７：１２５４１－９） 。Ｐｃ ＰＯＬＬＥＤは、例えばウシにおいて、無角（ｈｏｒｌｅｓｓｎｅｓｓ）を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ ＤＦ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４：４７９－８１に記載の通り）。ＫＩＳＳ１Ｒは、例えばブタにおいて、豚の雄臭（ｂｏｒｅｔａｉｎｔ）（性成熟時のホルモン放出により好ましくない肉の食味になる）を誘発するように修飾することができる。デッドエンドタンパク質（ｄｎｄ）は、例えばサケにおいて、生殖不能を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｗａｒｇｅｌｉｕｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６；６：２１２８４に記載の通り）。Ｎａｎｏ２及びＤＤＸは、例えばブタ及びニワトリにおいて、（例えばサロゲート宿主において）生殖不能を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｐａｒｋ Ｋ－Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７；７：４０１７６；Ｔａｙｌｏｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１７；１４４：９２８－３４に記載の通り）。ＣＤ１６３は、例えばブタにおいて、ＰＲＲＳＶ抵抗性を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ＫＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３４：２０－２に記載の通り）。ＲＥＬＡは、例えばブタにおいて、ＡＳＦＶの耐性を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｌｉｌｌｉｃｏ ＳＧ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６；６：２１６４５に記載の通り）。ＣＤ１８は、例えばウシにおいて、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの耐性を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｓｈａｎｔｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１６；１１３：１３１８６－９０に記載の通り）。ＮＲＡＭＰ１は、例えばウシにおいて、結核の耐性を誘導するように修飾することができる（例えば、Ｇａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１７；１８：１３に記載の通り）。内在性レトロウイルス遺伝子は、異種移植のために修飾または除去することができる（例えば、Ｙａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３５０：１１０１－４；Ｎｉｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７；３５７：１３０３－７に記載の通り）。筋肉量の負の調節因子（例えば、ミオスタチン）は、例えばイヌにおいて、筋肉量を高めるために修飾（例えば、不活性化）することができる（Ｚｏｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｄｅｃ；７（６）：５８０－３に記載の通り）。
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するブタなどの動物は、再生医療、異種移植（本明細書の他の箇所でも論じる）、及び腫瘍発生のための有用なモデルを提供するために（例えば、ＲＡＧ２の修飾によって）生成することができる。方法及びアプローチの例としては、Ｌｅｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１１１（２０）：７２６０－５；及びＳｃｈｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｐｒｉｌ ２０１６；３０（１）：Ｓｕｐｐｌ ５７１．１に記載のものが挙げられる。
動物におけるＳＮＰを修飾することができる。方法及びアプローチの例としては、Ｔａｎ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｏｃｔ ８；１１０（４１）：１６５２６－３１；Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－６に記載のものが挙げられる。
幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞）は、例えば、Ｈｅｏ ＹＴ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ｆｅｂ １；２４（３）：３９３－４０２に記載のように、修飾し所望の後代細胞に分化させることができる。
経済的形質に関連する遺伝子バリエーションをスクリーニングし特定するために、プロファイル解析（例えば、Ｉｇｅｎｉｔｙ）を動物に実施することがある。遺伝子バリエーションは、枝肉組成、枝肉品質、母性及び繁殖形質、１日当たりの平均体重増加などの形質を導入または改善するように修飾することができる。
遺伝子及びエピジェネティック状態のモデル
本明細書で開示する方法は、例えば、目的の変異のモデルまたは疾患モデルを通じて、目的の遺伝的またはエピジェネティックな状態をモデル化及び／または研究するために使用することができる植物、動物、または細胞を作成するために使用することができる。本明細書で使用する場合、「疾患」とは、対象における疾患、障害、または徴候を指す。例えば、疾患に関連する１つ以上の核酸配列の修飾を含む動物もしくは細胞、または疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が修飾された植物、動物、または細胞を作成するための方法を使用することができる。このような核酸配列は、疾患関連タンパク質配列をコードしても、疾患関連制御配列であってもよい。したがって、諸実施形態において、植物、対象、患者、生物、または細胞は、非ヒト対象、患者、生物、または細胞であり得ることを理解されたい。したがって、本開示は、本発明の方法によって産生された植物、動物、もしくは細胞、またはその後代を提供する。後代は、産生された動植物のクローンであることもあれば、同じ種の他の個体と交配して後代にさらに望ましい形質を導入する有性生殖によって生じることもある。細胞は、多細胞生物、特に動物または植物の場合、ｉｎ ｖｉｖｏであってもｅｘ ｖｉｖｏであってもよい。細胞を培養する場合、適切な培養条件が満たされていれば、そして好ましくは細胞がこの目的に好適に適合していれば（例えば、幹細胞）、細胞株を確立させることができる。産生する細菌細胞株も想定される。よって、細胞株も想定される。
いくつかの方法では、疾患モデルを使用して、変異が動物または細胞に及ぼす影響、及び疾患の研究で一般的に使用される手段を用いた疾患の発生及び／または進行について研究することができる。代替的に、このような疾患モデルは、医薬活性化合物が疾患に及ぼす効果を研究するのに有用である。
いくつかの方法において、疾患モデルは、潜在的な遺伝子治療戦略の有効性を評価するために使用することができる。すなわち、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドを、疾患の発症及び／または進行が阻害または低減されるように修飾することができる。詳細には、方法は、改変タンパク質が産生され、結果として動物または細胞の応答が改変するように、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドを修飾することを含む。したがって、いくつかの方法では、遺伝子修飾動物を疾患発症の素因がある動物と比較して、遺伝子療法事象の効果を評価することができる。
別の実施形態において、本開示は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達事象を調節する生物学的活性薬剤を開発する方法を提供する。方法は、試験化合物を、システムの構成要素の１つ以上の発現を駆動する１つ以上のベクターを含む細胞に接触させることと、例えば、細胞に含まれる疾患遺伝子の変異に関連する細胞シグナル伝達事象の減少または増大を示す読出し値の変化を検出することとを含む。
細胞機能の変化をスクリーニングするために、本開示の方法と組み合わせて細胞モデルまたは動物モデルを構築することができる。このようなモデルは、本明細書のシステム及び方法によって修飾されたゲノム配列が目的の細胞機能に及ぼす影響について研究するために使用することができる。例えば、細胞機能モデルを使用して、修飾されたゲノム配列が細胞内シグナル伝達または細胞外シグナル伝達に及ぼす影響について研究することができる。代替的に、細胞機能モデルを使用して、修飾ゲノム配列が感覚に及ぼす影響について研究することができる。いくつかのこのようなモデルにおいて、モデル内のシグナル伝達生化学経路に関連する１つ以上のゲノム配列が修飾される。
いくつかの疾患モデルが具体的に検討されている。これには、新規の自閉症リスク遺伝子ＣＨＤ８、ＫＡＴＮＡＬ２、及びＳＣＮ２Ａ、ならびに症候群性自閉症（アンジェルマン症候群）遺伝子ＵＢＥ３Ａが含まれる。これらの遺伝子及び結果的に得られた自閉症モデルはもちろん好ましいが、これは、遺伝子と対応するモデルにおいて本開示が広く適用できることを示す役割を果たしている。シグナル伝達の生化学的経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の改変は、候補薬剤に接触させたときに、試験モデル細胞と対照細胞との間の対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより、決定することができる。代替的に、シグナル伝達生化学経路に関連する配列の発現の差は、コードされたポリペプチドまたは遺伝子産物のレベルの差を検出することによって決定される。
ｍＲＮＡ転写産物または対応するポリヌクレオチドのレベルにおける薬剤誘導性改変を測定するため、まず、試料に含まれる核酸を当業界の標準的な方法に従って抽出する。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載の手順に従って、様々な溶解酵素もしくは化学溶液を用いて単離することができ、または製造業者が提供する添付の説明書に従って核酸結合樹脂により抽出することができる。次に、抽出された核酸試料に含まれるｍＲＮＡは、当技術分野で広く知られている方法または本明細書で例示する方法に基づいて、増幅手順または従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット解析）によって検出される。
増幅は、プライマーと、標的配列を合理的な忠実度で複製することが可能なポリメラーゼとを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント、及び逆転写酵素）によって行うことができる。好ましい増幅方法として、ＰＣＲがある。詳細には、単離したＲＮＡは、シグナル伝達生化学経路に関連する配列の発現レベルを定量化するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）と結合させた逆転写アッセイに供することができる。
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイでリアルタイムに実施することができる。１つの態様において、増幅産物は、蛍光性ＤＮＡ結合剤（例えば、限定されるものではないが、ＤＮＡインターカレーター及びＤＮＡグルーブバインダーを含む）を用いて直接可視化することができる。二重鎖ＤＮＡ分子に組み込まれたインターカレーターの量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、当技術分野における従来の光学システムを用いてインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を簡便に決定できる。本出願に適したＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ ｂｌｕｅ、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨード、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。
別の態様において、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて、増幅産物の検出及び定量を容易にすることができる。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的な検出に依存する。これは蛍光標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用し、その結果、特異性及び感度が高められる。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は、当技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号で教示されている。
また別の態様では、シグナル伝達生化学経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを用いた従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施することができる。典型的には、プローブは、ハイブリダイゼーション反応において、試験対象に由来する生物学的試料に含まれるシグナル伝達生化学経路に関連する配列と安定した複合体を形成することができる。当業者には、プローブ核酸としてアンチセンスが使用される場合、試料に提供される標的ポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸の配列に相補的であるように選択されることが理解されよう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列に相補的であるように選択される。
ハイブリダイゼーションは、様々なストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本開示の実施に適したハイブリダイゼーション条件は、プローブとシグナル伝達生化学経路に関連する配列との間の認識相互作用が、十分に特異的で十分に安定であるような条件である。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、当技術分野で広く知られ、公開されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照。ハイブリダイゼーションアッセイは、任意の固体支持体（限定されるものではないが、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、及び様々な遺伝子アレイを含む）に固定化されたプローブを用いて形成することができる。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号で説明されているような高密度遺伝子チップで行う。
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されたプローブと標的の複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブは検出可能な標識と結合体化する。本開示で使用するのに適した検出可能な標識としては、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を含む。多種多様な適切な検出可能な標識が当技術分野で知られており、これには蛍光標識または化学発光標識、放射性同位体標識、酵素、または他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態において、蛍光標識または酵素タグ、例えば、ジゴキシゲニン、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体を用いることが望まれ得る。
ハイブリダイゼーション強度の検出または定量化に使用される検出方法は、典型的には、上記で選択された標識に依存する。例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて検出することができる。蛍光マーカーは、発光を検出する光検出器を用いて検出及び定量化することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、酵素の基質への作用によって産生される反応産物を測定することによって検出され、最後に、比色標識は、単に着色された標識を可視化することによって検出される。
シグナル伝達の生化学的経路に関連する配列の発現の薬剤誘導性変化は、対応する遺伝子産物を調べることによって決定することもできる。タンパク質レベルの決定は、典型的には、ａ）生物学的試料に含まれるタンパク質を、シグナル伝達の生化学的経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤に接触させることと、ｂ）形成された薬剤：タンパク質複合体を識別することとを含む。この実施形態の１つの態様において、シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
反応は、薬剤を、試験試料に由来するシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質の試料に、薬剤とシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質との間に複合体が形成されるような条件下で、接触させることによって実施される。複合体の形成は、当技術分野における標準的な手順に従って、直接的または間接的に検出することができる。直接検出法では、検出可能な標識を薬剤に供給し、未反応の薬剤は複合体から除去することができる。それにより、残存する標識の量が形成された複合体の量を示す。このような方法の場合、標識は、ストリンジェントな洗浄条件下であっても薬剤への付着を保つものを選択することが好ましい。標識は、結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的または酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用することができる。望ましい標識は、概して、得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合も安定性も阻害しない。ただし、標識は、典型的には、効果的な結合と、よって検出可能なシグナルの生成とのために抗体にアクセスしやすいように設計されている。
タンパク質レベルの検出に適した多種多様な標識が当技術分野で知られている。非限定的な例としては、放射性同位体、酵素、コロイド状金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。
結合反応中に形成される薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量的アッセイによって定量化することができる。上記に示したように、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残存する標識の量によって直接測定することができる。代替として、シグナル伝達の生化学的経路に関連するタンパク質は、特定の薬剤の結合部位で標識アナログと競合する能力を試験される。この競合アッセイでは、捕捉された標識の量は、試験試料中に存在するシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
上記で概説した一般的な原理に基づくタンパク質解析のための多くの技法が当技法分野で利用可能である。このような技法としては、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連動免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または、放射性同位体の標識を使用）、ウエスタンブロット解析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光測定アッセイ、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥが挙げられる。
前述のタンパク質解析を行うためには、シグナル伝達の生化学的経路に関連するタンパク質を特異的に認識するかまたはそれに結合する抗体が好ましい。所望に応じて、特定のタイプの翻訳後修飾（例えば、シグナル伝達生化学経路誘導性修飾）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、及びリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、市販のベンダーから購入することができる。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを含む多くのベンダーから入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答したチロシン残基のリン酸化が異なるタンパク質を検出するのに特に有用である。このようなタンパク質としては、限定されるものではないが、真核生物翻訳開始因子２アルファ（ｅＩＦ－２α）が挙げられる。代替的に、これらの抗体は、従来のポリクローナルまたはモノクローナル抗体の技術を用いて、所望の翻訳後修飾を示す標的タンパク質で宿主動物または抗体産生細胞を免疫することにより、作製することができる。
主題方法を実施する際に、異なる身体組織、異なる細胞タイプ、及び／または異なる細胞内構造におけるシグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましい可能性がある。これらの研究は、ある特定の組織、細胞タイプ、または細胞下構造で優先的に発現するタンパク質マーカーに結合することが可能な組織特異的、細胞特異的、または細胞下構造特異的な抗体を用いて試験することができる。
シグナル伝達の生化学的経路に関連する遺伝子の発現の改変は、対照細胞に対する遺伝子産物の活性の変化を調べることによっても決定することができる。シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質の活性における薬剤誘導性変化のアッセイは、調査下にある生物学的活性及び／またはシグナル伝達経路に依存することになる。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の基質（複数可）をリン酸化する能力の変化は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定されるものではないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体を用いたイムノブロッティング及び免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ハイスループット化学発光アッセイ（例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能）及びｅＴａｇ（商標）アッセイ（Ｃｈａｎ－Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１１：１６２－１７４））によって検出することができる。
シグナル伝達生化学経路に関連するタンパク質が、細胞内ｐＨ条件の揺動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。シグナル伝達生化学的経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／または細胞内イオン濃度の揺動をモニターすることができる。多くの市販キット及びハイスループット装置が、イオンチャネルのモジュレーターの迅速かつロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な装置としては、ＦＬＩＰＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）、ＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの装置は、マイクロプレートの１０００超の試料ウェルの反応を同時に検出し、１秒またはさらには１ミリ秒以内にリアルタイム測定及び機能データを提供することができる。
本明細書で開示する方法のいずれかを実施する際に、当技術分野で知られている１つ以上の方法により、好適なベクターを細胞または胚に導入することができ、このような方法には、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック、リン酸カルシウム媒介形質移入、カチオン性形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、ヒートショック形質移入、ヌクレオフェクション形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光学的形質移入、独自薬剤で強化された核酸の取込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロゾーム、または人工ビリオンによる送達が含まれる。いくつかの方法では、ベクターはマイクロインジェクションによって胚内に導入される。ベクター（単数または複数）は、胚の核または細胞質内にマイクロインジェクションすることができる。いくつかの方法では、ベクター（単数または複数）は、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入することができる。
組成物及びシステムの標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対し内在性または外来性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドとすることができる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）とすることができる。
標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナル伝達生化学経路に関連する配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連の遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連の遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連の」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、疾患に罹患した組織に由来する細胞において転写または翻訳産物を、非疾患対照の組織または細胞に比べて異常なレベルまたは異常な形態で生成している任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。それは、異常に高いレベルで発現する遺伝子である場合も、異常に低いレベルで発現する遺伝子である場合もあり、この発現の変化が疾患の発生及び／または進行と相関している。そのため、改変された発現レベル（例えば、増加または減少）の測定値は、特定の対象または細胞における時点に対し相対的なものであり得、例えば、調節剤もしくは治療を投与する前後か、時点の経過にわたるか、または対象もしくは細胞におけるベースライン測定値に対し相対的なものであり得る。１つの実施形態において、改変された発現レベルは、設定または測定された対照、正常範囲、または標準に対し相対的なものである。また、疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接的に担う、または疾患の病因を担う遺伝子（複数可）と連鎖不平衡状態にある、変異（複数可）または遺伝子バリエーションを有する遺伝子を指す。転写または翻訳された産物は、既知の場合も未知の場合もあり、正常なレベルの場合も異常なレベルである場合もある。
本明細書のシステムの標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対し内在性または外来性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドとすることができる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）とすることができる。理論に束縛されることを望むものではないが、標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわち、複合体に認識される短い配列と会合するべきであると考えられている。ＰＡＭの正確な配列及び長さの要件は、使用するＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の例のセクションに示す。当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素で使用するためのさらなるＰＡＭ配列を特定できるようになるであろう。さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作は、ＰＡＭの特異性のプログラミングを可能にし、標的部位認識の忠実性を改善し、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のゲノム操作プラットフォームの汎用性を高めることができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）は、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２で説明されているように、そのＰＡＭ特異性を改変するように操作することができる。
システムの標的ポリヌクレオチドは、多くの疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド、ならびにシグナル伝達生化学経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドを含むことができ、これらは、参照が広範にわたる米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号及び同第６１／７４８，４２７号（それぞれＢＩ－２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３－７０１．１０１、ＢＩ－２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３－７０１．１０２；いずれの表題もＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ；それぞれ２０１２年１２月１２日出願、２０１３年１月２日出願）、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号（２０１３年１２月１２日出願；表題「ＤＥＬＩＶＥＲＹ， ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」に収載されており、これらの全ての内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナル伝達生化学経路に関連する配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連の遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連の遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連の」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、疾患に罹患した組織に由来する細胞において転写または翻訳産物を、非疾患対照の組織または細胞に比べて異常なレベルまたは異常な形態で生成している任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。それは、異常に高いレベルで発現する遺伝子である場合も、異常に低いレベルで発現する遺伝子である場合もあり、この発現の変化が疾患の発生及び／または進行と相関している。また、疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接的に担う、または疾患の病因を担う遺伝子（複数可）と連鎖不平衡状態にある、変異（複数可）または遺伝子バリエーションを有する遺伝子を指す。転写または翻訳された産物は、既知の場合も未知の場合もあり、正常なレベルの場合も異常なレベルである場合もある。
治療用途
また、本明細書では、対象のまたは対象における、疾患、障害、状態、または状態を診断、予測、治療、及び／または予防する方法が提供される。概して、対象の疾患、状態、または状態を診断、予測、治療、及び／または予防する方法は、本明細書に記載の組成物、システム、もしくはその構成要素を用いて、対象もしくはその細胞内のポリヌクレオチドを修飾することを含む、及び／または本明細書に記載の組成物、システム、もしくは構成要素を用いて、対象もしくはその細胞内の疾患もしくは健康ポリヌクレオチドを検出することを含むことができる。１つの実施形態において、治療または予防の方法は、対象またはその細胞内の感染性生物（例えば、細菌またはウイルス）のポリヌクレオチドを修飾するために組成物、システム、またはその構成要素を使用することを含むことができる。１つの実施形態において、治療または予防の方法は、対象内の感染性生物または共生性生物のポリヌクレオチドを修飾するために組成物、システム、またはその構成要素を使用することを含むことができる。組成物、システム、及びその構成要素は、疾患、状態、または条件のモデルを開発するために使用することができる。組成物、システム、及びその構成要素は、例えば、本明細書に記載の治療または予防の方法により、疾患状態の検出またはその補正に使用することができる。組成物、システム、及びその構成要素は、例えば、本明細書に記載の治療または予防として使用できる細胞をスクリーニング及び選択するために使用することができる。組成物、システム、及びその構成要素は、対象またはその細胞における１つ以上の生物学的機能または活性の修飾に使用することができる生物学的活性薬剤を開発するために使用することができる。
概して、方法は、好適な送達技法及び／または組成物によって、組成物、システム、及び／またはその構成要素を、対象もしくはその細胞に、または感染性もしくは共生性の生物に送達することを含むことができる。構成要素は、ひとたび投与されると、本明細書の他の箇所に記載のように作動して、核酸修飾事象を誘発することができる。いくつかの態様において、核酸修飾事象は、ゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームレベルで生じ得る。ＤＮＡ及び／またはＲＮＡの切断、遺伝子活性化、及び／または遺伝子不活性化を行うことができる。追加の特徴、使用、及び利点については、以下でより詳細に説明する。この概念に基づけば、いくつかのバリエーションが、ゲノム座位の事象（ＤＮＡ切断、遺伝子活性化、または遺伝子不活性化を含む）を誘発するのに適切である。提供された組成物を用いて、当業者は、同じまたは異なる機能ドメインを有する単一または複数の座位を有利にかつ特異的に標的として、１つ以上のゲノム座位事象を誘発することができる。対象における疾患の治療及び／または予防に加えて、組成物は、細胞におけるライブラリーでのスクリーニング及びｉｎ ｖｉｖｏでの機能モデリング（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的で細胞株及びトランスジェニック動物を確立するための組成物の使用）に広く適用することができる。
本明細書の他の箇所で説明している組成物、システム、及びその構成要素は、対象における疾患（例えば、遺伝子的及び／またはエピジェネティック疾患）の治療及び／または予防に使用することができる。本明細書の他の箇所で説明している組成物、システム、及びその構成要素は、対象における遺伝子感染性疾患（例えば、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生体感染、及びこれらの組合せ）の治療及び／または予防に使用することができる。本明細書の他の箇所に記載されている組成物、システム、及びその構成要素は、対象のマイクロバイオームの組成またはプロファイルを修飾するために使用することができ、ひいては対象の健康状態を修飾することができる。本明細書に記載の組成物、システムは、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞を修飾するために使用することができ、次いでこれを対象に投与することができ、それにより修飾細胞は、疾患またはその症状を治療または予防することができる。これは、いくつかの文脈では養子療法とも呼ばれる。本明細書に記載の組成物、システムは、ミトコンドリア病（ミトコンドリア病の病因はミトコンドリアＤＮＡの変異を伴う）の治療に使用することができる。
また、対象、例えば、それを必要とする対象を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物、システム、もしくは複合体の１つ以上の構成要素、またはポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかをコードするポリヌクレオチドで対象を形質転換することにより、遺伝子編集を誘導することと、それを対象に投与を含むこととを含む、方法も提供される。また、例えば当該修復鋳型を含むベクターによって送達される、好適な修復鋳型も提供される。本明細書では、修復鋳型は組換え鋳型であってもよい。また、対象（例えば、それを必要とする対象）を治療する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで対象を形質転換することにより、複数の標的座位の転写活性化または抑制を誘導することを含み、当該ポリヌクレオチドまたはベクターが、複数のＣａｓエフェクターを含む組成、システム、複合体またはその構成要素の１つ以上の構成要素をコードするかまたはそれを含む、方法も提供される。任意の治療がｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、細胞培養下で）行われる場合、「対象」という用語が「細胞または細胞培養物」という表現に置き換えられ得ることが理解されよう。
また、対象（例えば、それを必要とする対象）を治療する方法であって、対象をＣａｓエフェクター（複数可）で形質転換することによって遺伝子編集を誘導することと、有利には、組成物、システム（例えば、ＲＮＡ、ガイド）の残りの部分をｉｎ ｖｉｖｏでコードし発現させることとを含む方法も提供される。また、例えば当該修復鋳型を含むベクターによって送達される、好適な修復鋳型も提供される。また、対象（例えば、治療を必要とする対象）を治療する方法であって、組成物、システム（例えば、ＲＮＡ、ガイド）をｉｎ ｖｉｖｏで有利にコード及び発現するＣａｓエフェクター（複数可）を用いて対象を形質転換することにより、転写の活性化または抑制を誘導することを含む、方法も提供される。有利には、１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒的に不活性のＣａｓエフェクターであり、１つ以上の関連する機能的ドメインを含む。任意の治療がｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、細胞培養下で）行われる場合、「対象」という用語が「細胞または細胞培養物」という表現に置き換えられ得ることが理解されよう。
本明細書に記載の組成物及びシステムの１つ以上の構成要素は、組成物（例えば、医薬組成物）に含まれ、個々にまたはまとめて宿主に投与することができる。代替的に、これらの構成要素は、宿主に投与するための単一の組成物として提供することができる。宿主への投与は、当業者に知られている、または宿主への送達のために本明細書に記載されているウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を介して実施することができる。本明細書で説明しているように、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスｇＲＮＡ選択のためのもの）及びｇＲＮＡの濃度（例えば、複数のｇＲＮＡが使用されるかどうかに応じる）の使用は、効果の改善を引き出すために有利であり得る。
したがって、本明細書では、対象、感染性生物、及び／または対象のマイクロバイオームの生物の真核細胞もしくは原核細胞またはその構成要素（例えば、ミトコンドリア）において、１つ以上のポリヌクレオチド修飾を誘導する方法についても説明する。修飾は、１つ以上の細胞（複数可）のポリヌクレオチドの標的配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
１つの実施形態において、真核生物または非ヒト生物におけるゲノム座位の１つ以上の変異によって引き起こされる状態または疾患を処置または阻害する方法は、それを必要とする対象または非ヒト対象における当該ゲノム座位のコード、非コード、または調節エレメント内の標的配列の操作を含むことができ、当該操作は、ヒトまたは非ヒト対象を、標的配列の操作によって修飾することを含み、疾患の状態は、上記の実施形態のいずれか１つに記載の粒子送達システムもしくは送達システムもしくはウイルス粒子、または上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞を含む組成物を送達することを含む治療を提供することを含む、標的配列の操作による治療または阻害に感受性である。
また、本明細書では、上記の実施形態のいずれか１つに記載の粒子送達システムもしくは送達システムもしくはウイルス粒子の使用、あるいはｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子もしくはゲノム編集における、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療における使用のための、上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞が、提供される。また、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子もしくはゲノム編集のための医薬の製造で使用される、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療で使用するための、あるいは疾患に関連するゲノム座位内の標的配列の操作により、生物もしくは非ヒト生物を修飾する方法において、または真核生物もしくは非ヒト生物においてゲノム座位内の１つ以上の変異によって引き起こされる状態または疾患を治療もしくは阻害する方法において使用するための、上記の実施形態のいずれか１つに記載の粒子送達システム、非ウイルス送達システム、及び／またはウイルス粒子、あるいは上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞が提供される。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド修飾は、当該細胞（複数可）の当該ポリヌクレオチドの各標的配列における１～７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、各標的配列における少なくとも１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、当該細胞（複数可）の各標的配列における少なくとも５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、当該細胞（複数可）の各標的配列における少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、当該細胞（複数可）の各標的配列における少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、当該細胞（複数可）の各標的配列における少なくとも４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。修飾は、当該細胞（複数可）の各標的配列における少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、または９９００～１００００ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。
１つの実施形態において、修飾は、核酸構成要素（例えば、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可））（例えば、本明細書の他の箇所に記載の組成物、システム、またはその構成要素によって媒介されるもの）を介して、当該細胞（複数可）の各標的配列におけるヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。１つの実施形態において、修飾は、組成物、システム、または技法を介して、当該細胞（複数可）の標的またはランダム配列におけるヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含むことができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を促進することができる。したがって、組成物、システム、またはその構成要素によるポリヌクレオチドの修飾（例えば、疾患ポリヌクレオチド）は、ＮＨＥＪを含むことができる。組成物、システム、またはその構成要素によるこの修復経路の促進を使用して、遺伝子またはポリヌクレオチドに特異的なノックアウト及び／またはノックインを標的とすることができる。組成物、システム、またはその構成要素によるこの修復経路の促進を使用して、ＮＨＥＪ媒介インデルを生成することができる。また、ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪを使用して、目的の遺伝子の配列を除去（例えば、欠失）することもできる。概して、ＮＨＥＪは、ＤＮＡにおける二重鎖切断を、両端を結合することによって修復するが、概して、２つの適合性の端部が、正確に二重鎖切断によって形成されたかのように完全にライゲーションされる場合にのみ、元の配列が復元される。二重鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素処理の対象となり、その結果、末端を再結合する前に、一方または両方の鎖でヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。この結果、ＮＨＥＪ修復の部位のＤＮＡ配列に挿入及び／または欠失（インデル）変異の存在がもたらされる。インデルは１～５０またはそれ以上の塩基対をサイズ範囲とし得る。１つの実施形態において、インデルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００塩基対、またはそれ以上とすることができる。二重鎖切断が、短い標的配列付近を標的とする場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失変異は多くの場合、不要なヌクレオチドにまたがり、そのためこれが除去される。より大きなＤＮＡセグメントの欠失の場合、２つの二重鎖切断を配列の各側面に１つずつ導入すると、末端間でＮＨＥＪが生じ、介在配列全体が除去される結果となり得る。これらのアプローチはいずれも、特定のＤＮＡ配列の削除に使用することができる。
１つの実施形態において、ＮＨＥＪを媒介する組成物、システム、またはその構成要素は、小さな配列モチーフを削除する方法で使用することができる。組成物、システム、またはその構成要素が媒介するＮＨＥＪは、遺伝子を標的とすることができるＮＨＥＪ媒介インデルを生成する方法で使用することができ、例えば、目的の遺伝子のコード領域（例えば、初期コード領域）は、目的の遺伝子のノックアウト（すなわち、発現の排除）に使用することができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード領域は、転写開始部位の直後、コード配列の第１エキソン内、または転写開始部位から５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０ｂｐ未満）の配列を含む。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエフェクターが、ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で二重鎖切断を生成する場合、ガイドＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドの近傍で１つの二重鎖切断を配置するように構成することができる。１つの実施形態において、切断部位は、標的位置から０～５００ｂｐ（例えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離れてもよい。例示的な実施形態において、１つ以上のＣａｓニッカーゼと複合体化する２つのガイドＲＮＡが、ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で２つの一本鎖切断を誘導する場合、２つのガイドＲＮＡは、２つの一本鎖切断を配置して、ＮＨＥＪ修復に標的位置のヌクレオチドを提供するように構成することができる。
毒性及びオフターゲット効果を最小限に押さえるためには、Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの送達濃度を制御することが重要であり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞または非ヒト真核生物の動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、ディープシーケンシングを使用して潜在的なオフターゲットのゲノム座位における修飾の程度を解析することにより、決定することができる。代替的に、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小限に抑えるために、ＣａｓニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）は、目的の部位を標的とする一対のガイドＲＮＡとともに送達することができる。毒性及びオフターゲット効果を最小化するためのガイド配列及び戦略は、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）にある通りに、または変異を介して行うことができる。その他については、本明細書の他の箇所に記載の通りである。
典型的には、内在性ＣＲＩＳＰＲまたはシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲまたは複合体（標的配列とハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化したガイド配列を含む）の形成により、標的配列内またはその付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内）の一方または両方の鎖の切断、ニッキング、及び／または別の修飾がもたらされる。１つの実施形態において、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列のうちの約２０もしくはそれ超、約２６もしくはそれ超、約３２もしくはそれ超、約４５もしくはそれ超、約４８もしくはそれ超、約５４もしくはそれ超、約６３もしくはそれ超、約６７もしくはそれ超、約８５もしくはそれ超、またはそれ以上のヌクレオチド）を含むかまたはそれらからなることができるｔｒａｃｒ配列は、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に作用可能に連結したｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とハイブリダイズすることにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成することもできる。
疾患を治療または予防するために細胞内の標的ポリヌクレオチドを修飾する方法は、組成物、システム、またはその構成要素が、標的ポリヌクレオチドに結合して、例えば、組成物、システムが当該標的ポリヌクレオチドに対し可能である切断、ニッキング、または他の修飾をもたらすことを可能にし、それにより標的ポリヌクレオチドを修飾する。ここで、組成物、システム、またはその構成要素は、ガイド配列と複合体化し、当該ガイド配列を標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズさせ、当該ガイド配列は、任意選択でｔｒａｃｒメイト配列と連結し、ひいてはｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズすることができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、組成物、システム、またはその構成要素は、ガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターであるか、またはそれを含むことができる。修飾は、標的配列の位置で１本または２本の鎖を、組成物、システム、またはその構成要素の１つ以上の構成要素によって切断またはニッキングすることを含むことができる。
組成物、システムによって実施されることが可能な切断、ニッキング、または他の修飾は、標的ポリヌクレオチドの転写を修飾することができる。１つの実施形態において、転写の修飾は、標的ポリヌクレオチドの転写を減少させることを含むことができる。１つの実施形態において、修飾は、標的ポリヌクレオチドの転写を増加させることを含むことができる。方法は、組換え鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えにより、当該切断された標的ポリヌクレオチドを修復することができ、当該修復は、当該標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの修飾（例えば、限定されるものではないが、挿入、欠失、または置換）をもたらす。１つの実施形態において、当該修飾は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質において１つ以上のアミノ酸の変化をもたらす。１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素によって付与される修飾は、疾患またはその症状（限定されるものではないが、本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるもののいずれかを含む）を補正することができる転写産物及び／またはタンパク質を提供する。
疾患を治療または予防する方法は、１つ以上のベクターまたはベクターシステムを細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）に送達することを含むことができ、１つ以上のベクターまたはベクターシステムは、組成物、システム、またはその構成要素を含む。１つの実施形態において、ベクター（複数可）またはベクターシステム（複数可）は、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターシステムなどのウイルスベクターまたはベクターシステムとすることができ、これについては本明細書の他の箇所でより詳細に説明する。１つの実施形態において、疾患を治療または予防する方法は、組成物、システム、またはその構成要素を含む１つ以上のウイルス粒子（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス粒子）を送達することを含むことができる。１つの実施形態において、ウイルス粒子は、組織特異的なトロピズムを有する。１つの実施形態において、ウイルス粒子は、肝臓、筋肉、眼、心臓、膵臓、腎臓、ニューロン、上皮細胞、内皮細胞、星細胞、グリア細胞、免疫細胞、または赤血球に特異的なトロピズムを有する。
組成物及びシステム、例えば、本明細書に記載のような方法で使用するための組成物及びシステムは、組成物、システムにおいて知られている任意のタイプの用途、好ましくは真核生物において、好適に使用され得ることが理解されよう。ある特定の態様において、用途は治療的であり、好ましくは、真核生物（例えば、限定されるものではないが、動物（ヒトを含む）、植物、藻類、真菌（酵母を含む）などを含む）において治療的である。代替的にまたは追加的に、ある特定の態様において、本出願は、本明細書の他の箇所でも記載のように、１つ以上の特定の形質または特性（例えば、遺伝子型及び／または表現型の形質または特性）を達成または誘導することを含むことができる。
循環系疾患の治療
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、及び／またはその構成要素は、循環系疾患の治療及び／または予防に使用することができる。１つの実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エクソソームを使用して、本明細書に記載の組成物、システム、及び／またはその構成要素を血液に送達することができる。１つの実施形態において、循環系疾患は、本明細書に記載の組成物、システムを送達するためにレンチウイルスを使用して、造血幹細胞（ＨＳＣ）をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで修飾することにより、治療することができる（例えば、Ｄｒａｋｏｐｏｕｌｏｕ，“Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ，Ｔｈｅ Ｏｎｇｏｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ β－Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ，”Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９８７９８０，１０ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１１／９８７９８０を参照。これは、本明細書の説明に鑑みて、組成物、システムを伴う使用に適合させることができる）。１つの実施形態において、循環系障害は、本明細書の組成物、システム、またはその構成要素を用いて補正することにより、治療することができ、この組成物、システムは、任意選択で、好適なＨＤＲ修復鋳型を含む（例えば、Ｃａｖａｚｚａｎａ，“Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ β－Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｍａｊｏｒ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｅｘ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ βＡ－Ｔ８７Ｑ－Ｇｌｏｂｉｎ Ｖｅｃｔｏｒ．”；Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ，“Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ ＨＭＧＡ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ β－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ”，Ｎａｔｕｒｅ ４６７，３１８－３２２（１６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３２８；Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１１８３３（２０１２），ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５，ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ β－ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ（βＡ－Ｔ８７Ｑ）；及びＸｉｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ β－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉＰＳＣｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ｐｉｇｇｙｂａｃｋ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒ．１７３４２７．１１４（２０１４）ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１１０１／ｇｒ．１７３４２７．１１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｔｔｓ，“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １３（１０）：１１６４－１１７１．ｄｏｉ：１０．３１０９／１４６５３２４９．２０１１．６２０７４８（２０１１）を参照。これらは、本明細書の説明に鑑みて、本明細書の組成物、システムを伴う使用に適合させることができる）。１つの実施形態において、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の組成物、システムを用いて、循環系疾患に関連する疾患ポリヌクレオチドを補正するように修飾することができる。この点について、ｉＰＳＣの修飾に関するＸｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｌ ９；５：１２０６５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１２０６５）の教示及びＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ｍａｙ １；２４（９）：１０５３－６５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１４．０３４７．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｆｅｂ ５）の教示は、本明細書の説明に鑑みて、本明細書に記載の組成物、システムに適合させることができる。
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、ＨＳＣとみなされる細胞を広く指し、例えば、他の全ての血球を生じ、中胚葉に由来し、ほとんどの骨の中心部に含まれる赤色骨髄に位置する血球である。本明細書のＨＳＣは、小さなサイズ、系統（ｌｉｎ）マーカーの欠如、及びＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５のような分化系列のクラスターに属するマーカー、さらにｃ－ｋｉｔ（幹細胞因子の受容体）によって識別される、造血幹細胞の表現型を有する細胞を含むことができる。造血幹細胞は、系列関係付け（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の検出に使用されるマーカーが陰性であるため、Ｌｉｎ－と呼ばれる。ＦＡＣＳによる精製の際には、最大１４種の成熟血液系列マーカー、例えば、ヒトの場合はＣＤ１３及びＣＤ３３（骨髄系）、ＣＤ７１（赤血球系）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ６１（巨核球）などがある。さらにＢ２２０（マウスＣＤ４５；Ｂ細胞）、Ｍａｃ－１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８；単球）、Ｇｒ－１（顆粒球）、Ｔｅｒ１１９（赤血球）、Ｉｌ７Ｒａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（Ｔ細胞）など。マウスＨＳＣマーカーはＣＤ３４ｌｏ／－、ＳＣＡ－１＋、Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏ、ＣＤ３８＋、Ｃ－ｋｉｔ＋、ｌｉｎ－、ヒトＨＳＣマーカーはＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－である。ＨＳＣはマーカーによって識別される。したがって、本明細書で論じられる実施形態において、ＨＳＣはＣＤ３４＋細胞であり得る。またＨＳＣは、ＣＤ３４－／ＣＤ３８－である造血幹細胞であってもよい。細胞表面でｃ－ｋｉｔが欠如し得る幹細胞は、当技術分野ではＨＳＣとみなされ、ＣＤ１３３＋細胞も同様に当技術分野ではＨＳＣとみなされる。
１つの実施形態において、循環系または血液疾患を治療するための治療または予防は、本明細書に記載の任意の修飾を用いてヒト臍帯血細胞を修飾することを含むことができる。１つの実施形態において、循環系または血液疾患を治療するための治療または予防は、本明細書に記載の任意の修飾を用いて顆粒球コロニー刺激因子動員末梢血細胞（ｍＰＢ）を修飾することを含むことができる。１つの実施形態において、ヒト臍帯血細胞またはｍＰＢはＣＤ３４＋であり得る。１つの実施形態において、修飾臍帯血細胞（複数可）またはｍＰＢ細胞（複数可）は、自己由来であり得る。１つの実施形態において、臍帯血細胞（複数可）またはｍＰＢ細胞（複数可）は同種異系であり得る。疾患遺伝子（複数可）の修飾に加えて、同種異系細胞はさらに、本明細書に記載の組成物、システムを用いて修飾して、レシピエントに送達されたときの細胞の免疫原性を低減することができる。このような技法は、本明細書内の他の箇所、及び例えばＣａｒｔｉｅｒ，“ＭＩＮＩ－ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ：Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙｐａ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，”Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（２０１０）８５７－８６２で説明されており、これを本明細書の組成物、システムとともに使用するように適合させることができる。修飾臍帯血細胞（複数可）またはｍＰＢ細胞（複数可）は、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することができる。修飾臍帯血細胞（複数可）またはｍＰＢ細胞（複数可）は、任意の好適な送達技法を用いて、それを必要とする対象に誘導することができる。
組成物及びシステムは、ＨＳＣにおける座位（単数または複数）を標的とするように操作することができる。１つの実施形態において、Ｃａｓエフェクター（複数可）は、真核細胞、特に哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣに対しコドン最適化することができ、ＨＳＣ内の座位（単数または複数）（例えば、循環器疾患）を標的とするｓｇＲＮＡを準備することができる。これらは、粒子を介して送達することができる。粒子は、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡが混和されることにより形成することができる。ｇＲＮＡ及びＣａｓエフェクタータンパク質の混合物は、例えば、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質、及びアルコールから本質的になるまたはなる混合物と混和させて、ｇＲＮＡ及びＣａｓエフェクタータンパク質を含む粒子を形成することができる。本開示は、粒子をこのように作製すること、このような方法からの粒子及びその使用を包含する。血液もしくは循環系の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達に適した粒子、または血液もしくは循環系へのＨＳＣ送達については、本明細書の他の箇所でより詳細に説明する。
１つの実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ修飾後、ＨＳＣまたはｉＰＣＳは、対象に投与する前に拡大することができる。ＨＳＣの拡大は、Ｌｅｅ，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ＣＵＬ４－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＯＸＢ４．” Ｂｌｏｏｄ．２０１３ Ｍａｙ １６；１２１（２０）：４０８２－９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１２－０９－４５５２０４．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｍａｒ ２１によって説明されているような、任意の好適な方法を介して行うことができる。
１つの実施形態において、修飾されたＨＳＣまたはｉＰＳＣは自己由来であり得る。１つの実施形態において、ＨＳＣまたはｉＰＳＣは同種異系であり得る。疾患遺伝子（複数可）の修飾に加えて、同種異系細胞はさらに、本明細書に記載の組成物、システムを用いて修飾して、レシピエントに送達されたときの細胞の免疫原性を低減することができる。このような技法は、本明細書内の他の箇所、及び例えばＣａｒｔｉｅｒ，“ＭＩＮＩ－ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ：Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙｐａ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，”Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（２０１０）８５７－８６２で説明されており、これを本明細書の組成物、システムとともに使用するように適合させることができる。
神経疾患の治療
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システムは、脳及びＣＮＳの疾患の治療に使用することができる。脳の送達選択肢には、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態でのＣＲＩＳＰＲ酵素、トランスポザーゼ、及び／またはガイドＲＮＡのリポソーム内へのカプセル化と、血液脳関門（ＢＢＢ）送達のための分子的トロイの木馬との結合体化が含まれる。分子的トロイの木馬は、Ｂ－ｇａｌ発現ベクターを非ヒト霊長類の脳に送達するのに有効であることが示されている。同じアプローチをＣＲＩＳＰＲ酵素、トランスポザーゼ、及び／またはガイドＲＮＡを含むベクターの送達に使用することができる。例えば、Ｘｉａ ＣＦ ａｎｄ Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．” Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２００９ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；６（３）：７４７－５１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００１９４）は、受容体特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びアビジンビオチン技術の併用による、培養下及びｉｎ ｖｉｖｏの細胞への短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達の可能性について説明している。また、著者は、標的化ｍＡｂとｓｉＲＮＡとの結合がアビジン－ビオチン技術により安定しているため、標的ｓｉＲＮＡの静脈内投与後に脳などの離れた部位でのＲＮＡｉの作用がｉｎ ｖｉｖｏで観察されることも報告しており、その教示は、本明細書の組成物、システム、の使用に適合させることができる。他の実施形態において、人工ウイルスをＣＮＳ及び／または脳への送達のために生成することができる。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｊａｎ；７（１）：１１－８．）を参照（この教示は、本明細書の組成物、システムを伴う使用のために適合させることができる。
聴覚疾患の治療
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物及びシステムは、片耳または両耳の聴覚疾患または難聴の治療に使用することができる。難聴は、多くの場合、喪失または損傷した有毛細胞が聴覚ニューロンに信号を伝えることができないために生じる。このような場合には、蝸牛インプラントを使用して、音に応答し、電気信号を神経細胞に伝送することができる。しかし、これらのニューロンは、損傷した有毛細胞から放出される成長因子が少なくなるため、しばしば変性し、蝸牛から後退する。
１つの実施形態において、組成物、システム、または修飾細胞は、任意の好適な方法または技法により、聴覚疾患または損失を治療または予防するために片耳または両耳に送達することができる。好適な方法及び技法としては、限定されるものではないが、米国特許公開第２０１２０３２８５８０号に記載のものが挙げられ、当該文献は、耳への医薬組成物の注射（例えば、耳介投与）について説明しており、例えば蝸牛の管腔（例えば、中心階、前庭階、及び鼓室階ｉ）への、例えば、シリンジ（例えば、単回投与シリンジ）を用いた投与である。例えば、本明細書に記載の１つ以上の化合物は、鼓膜内注射（例えば、中耳への注射）、及び／または外耳、中耳、及び／または内耳への注射；カテーテルまたはポンプを介したｉｎ ｓｉｔｕ投与（例えば、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，（米国特許公開第２００６／００３０８３７号）及びＪａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第７，２０６，６３９号）を参照）；機械的デバイス（例えば、米国特許公開第２００７／００９３８７８号を参照；外耳に装着される蝸牛インプラントまたは補聴器）と組み合わせた投与（例えば、本明細書に記載の組成物、システム、耳への送達に適した例示的な蝸牛インプラントを提供）によって投与することができる。このような方法は、例えば、ヒトの耳にステロイド及び抗生物質を投与するために、当技術分野で日常的に使用されているものである。注射は、例えば、耳の正円窓から、または蝸牛カプセルから行うことができる。他の内耳投与法は当技術分野で知られている（例えば、Ｓａｌｔ ａｎｄ Ｐｌｏｎｔｋｅ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，１０：１２９９－１３０６，２００５を参照）。１つの実施形態において、カテーテルまたはポンプは、例えば、外科手術中に患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／または内耳）内に配置することができる。１つの実施形態において、カテーテルまたはポンプは、例えば、外科手術を必要とせずに患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／または内耳）内に配置することができる。
概して、米国特許公開第２０１２０３２８５８０号に記載の細胞治療方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、内耳の成熟細胞タイプ（例えば、有毛細胞）への、またはそれに向けての細胞の完全または部分的分化を促進することができる。このような方法から得られた細胞は、次にこのような治療を必要とする患者に移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）または移植（ｉｍｐｌａｎｔ）することができる。これらの方法の実施に必要とされる細胞培養方法（好適な細胞タイプを特定及び選択する方法、選択した細胞の完全または部分的分化を促進するための方法、完全または部分的に分化した細胞タイプを特定するための方法、及び完全または部分的に分化した細胞を移植するための方法を含む）を以下に説明する。
本開示で使用するのに適した細胞としては、限定されるものではないが、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上に、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させたときに、内耳の成熟細胞、例えば有毛細胞（例えば、内有毛細胞及び／または外有毛細胞）に完全または部分的に分化することが可能な細胞が挙げられる。有毛細胞に分化することが可能な例示的な細胞としては、限定されるものではないが、幹細胞（例えば、内耳幹細胞、成人幹細胞、骨髄由来幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、ｉＰＳ細胞、及び脂肪由来幹細胞）、前駆細胞（例えば、内耳前駆細胞）、支持細胞（例えば、ダイテルス細胞、柱状細胞、内指節細胞、被蓋細胞、ヘンゼン細胞）、及び／または生殖細胞である。内耳感覚細胞の置換のための幹細胞の使用については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許公開第２００５／０２８７１２７号）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願第１１／９５３，７９７号）に記載されている。内耳感覚細胞の置換のための骨髄由来幹細胞の使用については、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８４６５４に記載されている。ｉＰＳ細胞については、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １３１，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｐａｇｅｓ ８６１－８７２（２００７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６，６６３－７６ （２００６）；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，２６０－２６２（２００７）；Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７－１９２０（２００７）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；及びＺａｅｈｒｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｅｒ， Ｃｅｌｌ １３１（５）：８３４－８３５ （２００７）に記載されている。このような好適な細胞は、１つ以上の組織特異的遺伝子の存在を解析する（例えば、定性的または定量的に）ことによって同定することができる。例えば、１つ以上の組織特異的な遺伝子のタンパク質産物を検出することにより、遺伝子発現を検出することができる。タンパク質検出技法は、適切な抗原に対する抗体を用いてタンパク質を染色する（例えば、細胞抽出物または全細胞を使用）ことを含む。この場合、適切な抗原は、組織特異的な遺伝子発現のタンパク質産物である。原理上は、第１の抗体（すなわち、抗原に結合する抗体）を標識することはできるが、第１の抗体に対し指向性のある第２の抗体（例えば、抗ＩｇＧ）を使用することがより一般的である（そして可視化が向上する）。この第２の抗体は、一次抗体の位置、すなわち抗原を認識できるように、蛍光色素、または比色反応に適切な酵素、または金ビーズ（電子顕微鏡用）、またはビオチン－アビジンシステムと結合体化させる。
組成物及びシステムは、米国特許公開第２０１１０１４２９１７号から変更した組成物を用いて、外耳への医薬組成物の直接適用によって耳に送達することができる。１つの実施形態において、医薬組成物は外耳道に適用される。また、耳への送達は、耳（ａｕｒａｌ）または耳（ｏｔｉｃ）送達と称されることもある。
１つの実施形態において、組成物、システム、もしくはその構成要素、及び／またはベクターもしくはベクターシステムは、核酸標的化システムに適用することができる新規のタンパク質送達技術により、インタクトな正円窓を通じて内耳への形質移入により耳に送達することができる（例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２０１３），１－９を参照）。耳への投与のための投薬量として、約４０μｌの１０ｍＭ ＲＮＡが企図され得る。
Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｊｕｎ；２２８（１－２）：１８０－７）によると、蝸牛インプラントの機能は、渦状神経節ニューロン（インプラントによる電気刺激の標的）の良好な保存によって改善することができ、また、実験的に聴力を失わせた耳において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が渦状神経節の生存率を強化することが過去に示されている。Ｒｅｊａｌｉらは、ＢＤＮＦ遺伝子を挿入したウイルスベクターによって形質導入した線維芽細胞のコーティングを含む蝸牛インプラント電極の変更設計を試験した。このタイプのｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移入を達成するために、Ｒｅｊａｌｉらは、ＢＤＮＦ遺伝子カセットインサートを伴うアデノウイルスを用いてモルモット線維芽細胞に形質導入し、これらの細胞がＢＤＮＦを分泌することを確認し、次にアガロースゲルを介してＢＤＮＦ分泌細胞を蝸牛インプラント電極に付着させ、鼓室階に電極を移植した。Ｒｅｊａｌｉらは、ＢＤＮＦを発現する電極は、対照電極と比較すると、移植から４８日後に蝸牛の基底回転で有意に多くの渦状神経節ニューロンを多く保存できることを確認し、渦状神経節ニューロンの生存率を高めるために蝸牛移植治療とｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移入を組み合わせることの実現可能性を実証した。このようなシステムは、耳への送達のための核酸標的化システムに適用することができる。
１つの実施形態において、Ｍｕｋｈｅｒｊｅａ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ＆ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｎｕｍｂｅｒ ５，２０１０）に記載のシステムは、組成物、システム、またはその構成要素の耳への経鼓室投与に適合させることができる。１つの実施形態において、ヒトへの投与用のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量は約２ｍｇ～約４ｍｇである。
１つの実施形態において、［Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２１ ｎｏ．４，８３４－８４１ ａｐｒ．２０１３）］に記載のシステムは、組成物、システム、またはその構成要素の耳への前庭上皮送達に適合させることができる。１つの実施形態において、ヒトへの投与用のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量は約１～約３０ｍｇである。
非分裂性細胞における疾患の治療
１つの実施形態において、補正されるべき遺伝子または転写産物は、非分裂細胞内にある。例示的な非分裂細胞としては、筋肉細胞またはニューロンがある。非分裂（特に非分裂完全分化）細胞タイプは、例えばＧ１細胞周期では一般に相同組換え（ＨＲ）が抑制されるため、遺伝子標的化またはゲノム操作における問題が生じる。しかし、Ｄｕｒｏｃｈｅｒは、細胞が正常なＤＮＡ修復システムを制御する機構を研究中に、非分裂細胞でＨＲを「オフ」に保つこれまで知られていなかったスイッチを発見し、このスイッチを再びオンに切り替える戦略を考案した。Ｏｒｔｈｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｎｉｅｌ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ’ｓ ｌａｂ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｉｎ Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）は、最近の報告で（Ｎａｔｕｒｅ １６１４２，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ９ Ｄｅｃ ２０１５）、ＨＲの抑制を解除することができ、腎臓（２９３Ｔ）及び骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）の両方の細胞で首尾よく遺伝子標的化を完了したことを示した。腫瘍サプレッサーＢＲＣＡ１、ＰＡＬＢ２、及びＢＲＡＣ２は、ＨＲによるＤＮＡ ＤＳＢ修復を促進することが知られている。ＢＲＣＡ１とＰＡＬＢ２－ＢＲＡＣ２との複合体形成は、ＰＡＬＢ２上のユビキチン部位に制御されており、この部位上でＥ３ユビキチンリガーゼが作用することが見出された。このＥ３ユビキチンリガーゼは、ｃｕｌｌｉｎ－３（ＣＵＬ３）－ＲＢＸ１と複合体化したＫＥＡＰ１（ＰＡＬＢ２相互作用タンパク質）から構成されている。ＰＡＬＢ２のユビキチン化はＢＲＣＡ１との相互作用を抑制し、それ自体は細胞周期制御下にあるデユビキチナーゼＵＳＰ１１によって打ち消される。ＢＲＣＡ１－ＰＡＬＢ２相互作用の回復とＤＮＡ末端切除の活性化との組合せは、ＵＳＰ１１またはＫＥＡＰ１（ｐＸ４５９ベクターから発現）に向けられたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベース遺伝子標的化アッセイを含む多数の方法による測定において、十分にＧ１における相同組換えを誘導する。しかし、ＫＥＡＰ１枯渇またはＰＡＬＢ２－ＫＲ変異体発現を用いて、切除能力があるＧ１細胞においてＢＲＣＡ１－ＰＡＬＢ２相互作用を回復させると、遺伝子標的化事象のロバストな増加が検出された。これらの教示は、本明細書に記載のＣａｓ組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
したがって、細胞、特に非分裂性で完全に分化した細胞タイプにおけるＨＲの再活性化は、１つの実施形態において好ましい。１つの実施形態において、ＢＲＣＡ１－ＰＡＬＢ２相互作用の促進が好ましい。１つの実施形態において、標的細胞（ｅｌｌ）は、非分裂細胞である。１つの実施形態において、標的細胞は、ニューロンまたは筋肉細胞である。１つの実施形態において、標的細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的とされる。１つの実施形態において、細胞はＧ１にあり、ＨＲが抑制されている。１つの実施形態において、ＫＥＡＰ１枯渇の使用、例えば、ＫＥＡＰ１活性の発現の阻害が好ましい。ＫＥＡＰ１枯渇は、例えばＯｒｔｈｗｅｉｎらにおいて示されているように、ｓｉＲＮＡによって達成することができる。代替的に、ＫＥＡＰ１枯渇と組み合わせて、または単独でＰＡＬＢ２－ＫＲ変異体（ＢＲＣＡ１－相互作用ドメインの８つ全てのＬｙｓ残基が欠損）を発現させることが好ましい。ＰＡＬＢ２－ＫＲは、細胞周期の位置に関係なくＢＲＣＡ１と相互作用する。したがって、特にＧ１細胞において、ＢＲＣＡ１－ＰＡＬＢ２相互作用の促進または回復が好ましい。１つの実施形態において、特に標的細胞が非分裂性である場合、または除去及び復帰（ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子標的化）が問題となる場合、例えばニューロンまたは筋肉細胞の場合。ＫＥＡＰ１ ｓｉＲＮＡはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒから入手可能である。１つの実施形態において、ＢＲＣＡ１－ＰＡＬＢ２複合体は、Ｇ１細胞に送達することができる。１つの実施形態において、ＰＡＬＢ２脱ユビキチン化は、例えば、デユビキチナーゼＵＳＰ１１の発現の増加によって促進することができるため、デユビキチラーゼＵＳＰ１１の発現または活性を促進または上方調節するようにコンストラクトが提供されてもよいことが想定される。
眼の疾患の治療
１つの実施形態において、治療されるべき疾患は、眼に影響を及ぼす疾患である。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、またはその構成要素は、片眼または両眼に送達される。
組成物、システムを使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２でさらに記載されているいくつかの遺伝子変異から生じる眼球障害を補正することができる。
１つの実施形態において、治療されるまたは標的とされるべき状態は、眼の障害である。１つの実施形態において、眼の障害は、緑内障を含むことができる。１つの実施形態において、眼の障害は、網膜変性疾患を含む。１つの実施形態において、網膜変性疾患は、シュタルガルト病、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、青錐体１色覚、脈絡膜症、錐体杆体ジストロフィー、先天性非進行性夜盲症、Ｓ錐体増強症候群、若年性Ｘ連鎖網膜分離症、レーバー先天性黒内障、Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｓｅ、ノリエ病またはＸ連鎖家族性浸出性硝子体網膜症、パターンジストロフィー、ソースビージストロフィー、アッシャー症候群、網膜色素変性、１色覚または黄斑ジストロフィーもしくは変性、網膜色素変性、１色覚、及び加齢性黄斑変性から選択される。１つの実施形態において、網膜変性疾患は、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）または網膜色素変性である。他の例示的な眼疾患については、本明細書の他の箇所でより詳細に説明される。
１つの実施形態において、組成物、システムは、任意選択で硝子体内注射または網膜下注射を介して、眼に送達される。眼内注射は、手術用顕微鏡を利用して実施することができる。網膜下及び硝子体内注射の場合、眼球を優しく指で押すことにより逸脱させ、ガラス製顕微鏡スライドカバースリップで覆った角膜上の接触媒質溶液の液滴からなるコンタクトレンズシステムを用いて、眼底を可視化することができる。網膜下注射の場合、５μｌのハミルトン注射器に取り付けた１０ｍｍの３４ゲージ針の先端を、直接可視化下で、強膜赤道上部から後極に向かって接線方向に、針の開口部が網膜下腔に見えるまで進めることができる。次に、２μｌのベクター懸濁液を注射して、上部に水疱性網膜剥離を生じさせることにより、網膜下ベクター投与を確認することができる。このアプローチでは、自己密封性の強膜切開を作出することで、ベクター懸濁液が、ＲＰＥに吸収されるまで（通常は手順から４８時間以内）網膜下空間に保持される。この手順を下半球で繰り返して、下部の網膜剥離を生じさせることができる。この技法により、神経感覚網膜及びＲＰＥのおよそ７０％がベクター懸濁液に曝露される。硝子体内注射の場合、針の先端を強膜から角強膜縁の１ｍｍ後方に進め、２μｌのベクター懸濁液を硝子体腔に注射することができる。前房内注射の場合、中心角膜に向けて針の先端を角強膜縁の穿刺に進め、２μｌのベクター懸濁液を注射することができる。前房内注射の場合、中心角膜に向けて針の先端を角強膜縁の穿刺に進め、２μｌのベクター懸濁液を注射することができる。これらのベクターは、１．０～１．４×１０１０または１．０～１．４×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌのいずれかの力価で注射することができる。
１つの実施形態において、眼への投与のために、レンチウイルスベクターを使用することができる。１つの実施形態において、レンチウイルスベクターはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクターである。眼球送達のための例示的なＥＩＡＶベクターは、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５ ｉｎ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５；Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）に記載されており、これらは、本明細書に記載の組成物、システムを伴う使用に適合させることができる。１つの実施形態において、投薬量は、１００μｌの総容量中片眼当たり１．１×１０５形質導入単位（ＴＵ／眼）とすることができる。
他のウイルスベクターも、眼への送達に使用することができ、例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１６７－１７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６），Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９ ｎｏ．４，６４２－６４９ ａｐｒ．２０１１；Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ７６（２０１３））に記載のものを使用することができ、これらは、本明細書に記載の組成物、システムを伴う使用に適合させることができる。１つの実施形態において、用量は、約１０６～１０９．５粒子単位を範囲とすることができる。Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄ ＡＡＶベクターの文脈では、約２×１０１１～約６×１０１３個のウイルス粒子の用量を投与することができる。Ｄａｌｋａｒａベクターの文脈では、約１×１０１５～約１×１０１６ｖｇ／ｍｌの用量がヒトに投与される。
１つの実施形態において、ＲＸｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのｓｄ－ｒｘＲＮＡ（登録商標）システムは、組成物、システムを眼に送達するために使用する／適合させることができる。このシステムでは、３μｇのｓｄ－ｒｘＲＮＡの単回硝子体内投与を行うと、結果的にＰＰＩＢ ｍＲＮＡレベルが１４日間にわたって配列特異的に低下する。ｓｄ－ｒｘＲＮＡ（登録商標）システムを核酸標的化システムに適用することができ、約３～２０ｍｇのＣＲＩＳＰＲの用量のヒトへの投与が企図される。
他の実施形態において、米国特許公開第２０１３１８３２８２号の方法（ヒトロドプシン遺伝子から標的配列を切断する方法を対象とする）も、核酸標的化システムに対し変更することができる。
他の実施形態において、米国特許公開第２０１３２０２６７８号の方法（Ｐｕｆ－Ａ遺伝子（眼組織の網膜神経節細胞及び色素細胞内で発現し、独特の抗アポトーシス活性を示す）を眼の網膜下空間または硝子体内空間に送達することに関する網膜症及び視力を脅かす眼科障害の治療のための方法）を使用するか、または適合させることができる。特定的には、望ましい標的は、ｚｇｃ：１９３９３３、ｐｒｄｍ１ａ、ｓｐａｔａ２、ｔｅｘ１０、ｒｂｂ４、ｄｄｘ３、ｚｐ２．２、Ｂｌｉｍｐ－１及びＨｔｒＡ２であり、これらは全て、組成物、システムによって標的とすることができる。
Ｗｕ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３：６５９－６２，２０１３）は、マウスにおいて白内障の原因となる単一の塩基対変異にＣａｓ９を導くガイドＲＮＡを設計し、そこでＤＮＡ切断を誘導した。次に、他方の野生型アレルまたは接合子にもたらされたオリゴを用いて、修復機構は、変異マウスにおいて、壊れたアレルの配列を補正し、白内障の原因となる遺伝子欠陥を補正した。このアプローチは、本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
米国特許公開第２０１２０１５９６５３号は、黄斑変性症（ＭＤ）に関連する細胞、動物、及びタンパク質を遺伝的に修飾するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用について説明しており、その教示は、本明細書に記載の組成物、システムに適用及び／または適合させることができる。
米国特許公開第２０１２０１５９６５３号の１つの態様は、核酸標的システムに適用することができるＭＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列の編集に関する。
筋肉疾患及び心血管疾患の治療
１つの実施形態において、組成物、システムは、筋肉疾患及び関連する循環系または心血管の疾患または障害の治療及び／または予防に使用することができる。また、本開示は、本明細書に記載の組成物、システム、例えばＣａｓエフェクタータンパク質システムを心臓に送達することも企図している。心臓については、心筋向性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶＭ）が好ましく、特に心臓で優先的な遺伝子移入を示したＡＡＶＭ４１が好ましい（例えば、Ｌｉｎ－Ｙａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ １０，２００９，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．１０を参照）。投与は、全身的であっても局所的であってもよい。全身投与には、約１～１０×１０１４個のベクターゲノムの投薬量が企図される。また、例えば、Ｅｕｌａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４９２：３７６及びＳｏｍａｓｕｎｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：７７９０も参照。これらの教示は、本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
例えば、その教示が本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる米国特許公開第２０１１００２３１３９号は、心血管疾患に関連する細胞、動物、及びタンパク質を遺伝子修飾するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用について説明している。心血管疾患には、概して高血圧、心臓発作、心不全、ならびに脳卒中及びＴＩＡが含まれる。心血管疾患に関与する任意の染色体配列または心血管疾患に関与する任意の染色体配列によってコードされるタンパク質は、本開示に記載の方法で利用することができる。心血管関連タンパク質は、典型的には、心血管疾患の発症と心血管関連タンパク質との実験的関連性に基づいて選択される。例えば、心血管障害を有する集団では、心血管障害が欠如した集団と比較して、心血管関連タンパク質の産生率または循環濃度が上昇したり抑制されたりすることがある。タンパク質レベルの差は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオーム技法を用いて評価することができる。代替的に、心血管関連タンパク質は、ゲノム技法（限定されるものではないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）を含む）を用いて、タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより、同定することができる。例示的な染色体配列は表２に見出すことができる。
本明細書の組成物、システム、は、筋肉系疾患を治療するために使用することができる。また、本開示は、本明細書に記載の組成物、システム、エフェクタータンパク質システムを筋肉（複数可）に送達することも企図している。
１つの実施形態において、治療されるべき筋疾患は、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーである。１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、例えばＲＮＡ修飾が可能なシステムを使用してエキソンスキッピングを達成して、疾患遺伝子の補正を達成することができる。本明細書で使用する場合、「エキソンスキッピング」という用語は、プレｍＲＮＡ内のスプライスドナー及び／またはアクセプター部位を、１つ以上の相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド（複数可）（ＡＯＮ）で標的化することによるプレｍＲＮＡスプライシングの修飾を指す。スプライソソームが１つ以上のスプライスドナーまたはアクセプター部位にアクセスするのを阻害することにより、ＡＯＮは、スプライシング反応を防止して、完全にプロセシングされたｍＲＮＡから１つ以上のエキソンを欠失させることができる。エキソンスキッピングは、プレｍＲＮＡの成熟プロセス中に核内で達成され得る。１つの実施形態において、エキソンスキッピングは、ＲＮＡ修飾が可能な本明細書に記載の組成物、システムを用いて、標的エキソンのスプライシングに関与する重要配列をマスクすることを含むことができる。１つの実施形態において、エキソンスキッピングは、ジストロフィンｍＲＮＡにおいて達成することができる。１つの実施形態において、組成物、システムは、ジストロフィンｍＲＮＡのエキソン１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、またはこれらの任意の組合せにおけるエキソンスキッピングを誘導することができる。１つの実施形態において、組成物、システムは、ジストロフィンｍＲＮＡのエキソン４３、４４、５０、５１、５２、５５、またはこれらの任意の組合せにおけるエキソンスキッピングを誘導することができる。また、これらのエキソンの変異は、非エキソンスキッピングポリヌクレオチド修飾法を用いて補正することもできる。
１つの実施形態において、筋肉疾患の治療のために、Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１９ ｎｏ．１１，２０５５－２０６４ Ｎｏｖ．２０１１）の方法をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ発現ＡＡＶに適用し、約２×１０１５または２×１０１６ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射することができる。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．の教示は、本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
１つの実施形態において、Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．５，８８１－８８７ Ｍａｙ ２０１０）の方法をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ発現ＡＡＶに適用し、例えば、約１０１４～約１０１５ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射することができる。本明細書に記載のＤｕｍｏｎｃｅａｕｘの教示は、本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
１つの実施形態において、Ｋｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１１２６－１１３０）の方法を本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムに適用し、例えば、約５００～１０００ｍｌの投薬量の４０μＭ溶液をヒトの筋肉に注射することができる。
１つの実施形態において、Ｈａｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，Ａｕｇｕｓｔ ２００４）の方法を本明細書の組成物、システムに適合及び／または適用することができ、約１５～約５０ｍｇの用量でヒトの大伏在静脈に注射される。
１つの実施形態において、方法は、鎌状赤血球関連疾患、例えば、鎌状赤血球形質、鎌状赤血球疾患（例えば、鎌状赤血球貧血、β－サラセミア）を治療することを含む。例えば、方法及びシステムを使用して、例えば、β－グロビン遺伝子の１つ以上の変異を修飾することにより、鎌状赤血球のゲノムを修飾することができる。β－サラセミアの場合、ＨＳＣをシステムで修飾することにより、鎌状赤血球貧血を補正することができる。このシステムは、ＤＮＡを切断し次に自己修復させることにより、細胞のゲノムの特異的編集を可能にする。Ｃａｓタンパク質が挿入され、ＲＮＡガイドによって変異点に誘導されると、次にそこでＤＮＡを切断する。同時に、健康なバージョンの配列が挿入される。この配列は、細胞自身の修復システムが誘導された切断を修正するために使用する。このようにして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、先に得られた幹細胞において変異の補正を可能にする。方法及びシステムを使用して、変異を標的とし補正するシステム（例えば、β－グロビン、有利には非鎌状β－グロビンのためのコード配列を送達する好適なＨＤＲ鋳型を伴う）を用いて、鎌状赤血球貧血に関しＨＳＣを補正することができる。具体的には、ガイドＲＮＡは、鎌状赤血球貧血を生じる変異を標的とすることができ、ＨＤＲは、β－グロビンの好適な発現のためのコードを提供することができる。変異及びＣａｓタンパク質含有粒子を標的とするガイドＲＮＡを、変異を有するＨＳＣに接触させる。また、粒子は、β－グロビンの適切な発現のために変異を補正するための好適なＨＤＲ鋳型を含んでもよく、またはＨＳＣを、ＨＤＲ鋳型を含むもしくは送達する第２の粒子もしくはベクターに接触させてもよい。このように接触させた細胞を、投与し、任意選択で治療／拡大することができる（参照：Ｃａｒｔｉｅｒ）。ＨＤＲ鋳型は、操作されたβ－グロビン遺伝子（例えば、βＡ－Ｔ８７Ｑ）、またはβ－グロビンを発現するようにＨＳＣに提供することができる。
肝臓及び腎臓の疾患の治療
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、またはその構成要素は、腎臓または肝臓の疾患の治療に使用することができる。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＲＰ－Ｃａｓシステムまたはその構成要素の送達は、肝臓または腎臓への送達である。
治療用核酸の細胞への取り込みを誘導するための送達戦略には、物理的力、またはベクターシステム、例えば、ウイルス／脂質／複合体ベース送達、またはナノキャリアが含まれる。臨床的な関連性が低い初期の用途から（全身的な流体力学的高圧注入による腎細胞への核酸投与）、既に広範囲の遺伝子治療用ウイルス及び非ウイルス担体が、ｉｎ ｖｉｖｏの種々の動物腎疾患モデルにおいて転写後事象を標的として適用されている（Ｃｓａｂａ Ｒｅｖｅｓｚ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｈａｍａｒ（２０１１）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｆ．Ｃｈｕｎｓｈｅｎｇ Ｋａｎｇ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８－９５３－３０７－５４１－９，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｇｅｎｅ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｍｅｔｈｏｄｓ－ｔｏ－ｔａｒｇｅｔ－ｒｎａｓ－ｉｎｔｈｅ－ｋｉｄｎｅｙ）。腎臓への送達方法としては、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｆ６０５－Ｆ６１７，２００８）のものを挙げることができる。Ｙｕａｎｇらの方法は、腎臓への送達のためにコレステロールと結合体化したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓをヒトに１～２ｇ皮下注射することを企図しているＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムに適用することができる。１つの実施形態において、Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０：１７５４－１７６４，２００９）の方法をＣＲＩＳＲＰ－Ｃａｓシステムに適合させることができ、ヒトに対し１２～２０ｍｇ／ｋｇの累積用量を腎臓の近位尿細管細胞への送達に使用することができる。１つの実施形態において、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２２，Ｎｕｍｂｅｒ ４，２０１２）の方法をＣＲＩＳＲＰ－Ｃａｓシステムに適合させることができ、最大２５ｍｇ／ｋｇの用量を静脈内投与により送達することができる。１つの実施形態において、Ｓｈｉｍｉｚｕら（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２１：６２２－６３３，２０１０）の方法をＣＲＩＳＲＰ－Ｃａｓシステムに適合させることができ、腹腔内投与用の約１～２リットルの生理的液体中のナノキャリアと複合体化した約１０～２０μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量を使用することができる。
他の様々な送達ビヒクル（例えば、ウイルス、流体力学、脂質、ポリマーナノ粒子、アプタマー、及びこれらの様々な組合せ）を使用して組成物、システムを腎臓に送達することができる（例えば、Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，（Ａｕｇ ２００７），Ｖｏｌ．１４２，Ｎｏ．２，ｐｐ．（２６２－２６９）；Ｈａｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，（Ｏｃｔ ２００４），Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．４１，ｐｐ．（１４８８３－１４８８８）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，（Ｏｃｔ ２００８），Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．４，ｐｐ．（９７３－９８０）；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，（Ｍａｙ ２００９），Ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．９，ｐｐ．（１２８３－１２８９）；Ｑ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ＯＮＥ，（Ｊｕｌ ２０１０），Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．７，ｅ１１７０９，ｐｐ．（１－１３）；Ｋｕｓｈｉｂｉｋｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（Ｊｕｌ ２００５），Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．３，ｐｐ．（３１８－３３１）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ｊｕｌ ２００６），Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１４，ｐｐ．（１０９７－１１０３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（Ｆｅｂ ２００４），Ｖｏｌ．３０８，Ｎｏ．２，ｐｐ．（６８８－６９３）；Ｗｏｌｆｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｓｅｐ ２００７），Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１０，ｐｐ．（１１４９－１１５７）；Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，（Ａｕｇ ２００９），Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．８ ｐｐ．（１７５４－１７６４）；Ｍｉｋｈａｙｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ｍａｒ ２０１１），Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．３，ｐｐ．（２１７－２２６）；Ｙ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，（Ａｐｒ ２００６），Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．４，ｐｐ．（１０９０－１１０１）；Ｓｉｎｇｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，（Ｍａｙ ２００９），Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．１０，ｐｐ．（４２４４－４２５１）；Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（Ａｐｒ ２００９），Ｖｏｌ．２３６，Ｎｏ．１，ｐｐ．（９７－１０８）；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，（Ａｐｒ ２０１０），Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．４，ｐｐ．（６２２－６３３）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，（Ｍａｙ－Ｊｕｎ ２００９），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３，ｐｐ．（７２７－７３７）；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（Ｊｕｎ ２０１０），Ｖｏｌ．１４４，Ｎｏ．２，ｐｐ．（２０３－２１２）；Ｎｉｎｉｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，（Ｍａｒ ２００８），Ｖｏｌ．１７２，Ｎｏ．３，ｐｐ．（６２８－６３７）；Ｐｕｒｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，（Ｍａｒ ２００６），Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．１３，ｐｐ．（５１７３－５１７８）を参照）。
１つの実施形態において、送達は肝臓細胞への送達である。１つの実施形態において、肝臓細胞（ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）は肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）である。本明細書の組成物及びシステムの送達は、ウイルスベクター、特にＡＡＶ（特にＡＡＶ２／６）ベクターを介して行うことができる。これらは、静脈注射により投与することができる。肝臓にとって好ましい標的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏかｉｎ ｖｉｖｏにかかわらず、アルブミン遺伝子である。アルブミンは非常に高いレベルで発現するため、遺伝子編集に成功した後のアルブミンの産生量のいくらかの低下は許容されるため、これはいわゆる「セーフハーバー」である。また、アルブミンプロモーター／エンハンサーから見られる発現が高レベルであり、ごく一部の肝細胞しか編集しない場合であっても、（挿入された組換え鋳型から）有用なレベルの正しいまたは導入遺伝子産生が達成できることからも好ましい。Ｗｅｃｈｓｌｅｒらが特定するサイトを参照（ｔｈｅ ５７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙでの報告；アブストラクトはａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８６４９５．ｈｔｍｌでオンライン入手可能；２０１５年１２月６日発表）。これは本明細書の組成物、システムとの使用に適合させることができる。
治療及び／または予防することができる例示的な肝臓及び腎臓の疾患は、本明細書の他の箇所に記載されている。
上皮及び肺の疾患の治療
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物及びシステムによって治療または予防される疾患は、肺または上皮の疾患であり得る。本明細書に記載の組成物及びシステムは、上皮及び／または肺の疾患を治療するために使用することができる。また、本開示は、本明細書に記載の組成物、システムを一方または両方の肺に送達することも企図している。
１つの実施形態において、ウイルスベクターは、組成物、システム、またはその構成要素を肺に送達するために使用することができる。１つの実施形態において、ＡＡＶは、肺への送達用のＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、及び／またはＡＡＶ－９である（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７－２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照）。１つの実施形態において、ＭＯＩは、１×１０３～４×１０５ベクターゲノム／細胞で変動し得る。１つの実施形態において、送達ベクターは、Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ Ｖｏｌ １８３．ｐｐ ５３１－５３８，２０１１）におけるようなＲＳＶベクターであり得る。Ｚａｍｏｒａらの方法は、核酸標的化システムに適用することができ、例えば、投薬量が０．６ｍｇ／ｋｇのエアロゾル化ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
肺疾患の治療を受ける対象は、例えば、肺ごとに医薬有効量のエアロゾル化ＡＡＶベクターシステムを投与することができ、これが自発呼吸中に気管支内に送達される。そのため、エアロゾル化送達は、概してＡＡＶ送達に好ましい。アデノウイルスまたはＡＡＶ粒子を送達に使用することができる。各々が１つ以上の調節配列に作用可能に連結した好適な遺伝子コンストラクトは、送達ベクター内にクローニングすることができる。この場合、以下のコンストラクトが例として提供される：ＣａｓのためのＣｂｈまたはＥＦ１ａプロモーター、ガイドＲＮＡのためのＵ６またはＨ１プロモーター）。好ましい配置は、ＣＦＴＲｄｅｌｔａ５０８標的化ガイド、ｄｅｌｔａＦ５０８変異のための修復鋳型、及びコドン最適化されたＣａｓ酵素、ならびに任意選択で１つ以上の核局在化シグナルまたは配列（複数可）（ＮＬＳ（複数可）、例えば、２つのＮＬＳ）を使用することである。
皮膚の疾患の治療
本明細書に記載の組成物及びシステムは、皮膚疾患の治療のために使用することができる。また、本開示は、本明細書に記載の組成物及びシステムを皮膚に送達することも企図している。
１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素の皮膚への送達（皮内送達）は、１つ以上のマイクロニードルまたはマイクロニードル収容デバイスを介して行うことができる。例えば、１つの実施形態において、Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１２９）のデバイス及び方法を使用及び／または適合して、本明細書に記載の組成物、システムを、例えば、最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの投薬量で皮膚に送達することができる。
１つの実施形態において、Ｌｅａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１８ ｎｏ．２，４４２－４４６ Ｆｅｂ．２０１０）の方法及び技法を本明細書に記載のＣＩＲＰＳＲ－Ｃａｓシステムの皮膚への送達に使用及び／または適合することができる。
１つの実施形態において、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｊｕｌｙ ２４，２０１２，ｖｏｌ．１０９，ｎｏ．３０，１１９７５－１１９８０）の方法及び技法を本明細書に記載のＣＩＲＰＳＲ－Ｃａｓシステムの皮膚へのナノ粒子送達に使用及び／または適合することができる。１つの実施形態において、１回の適用で約２５ｎＭの投薬量として、皮膚における遺伝子ノックダウンを達成することができる。
がんの治療
本明細書に記載の組成物、システムは、がんの治療のために使用することができる。また、本開示は、本明細書に記載の組成物、システムを細胞に送達することも企図している。また、本明細書の他の箇所で説明しているように、組成物、システムは、免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＣＡＲ Ｔ細胞）の修飾に使用することができ、ひいてはこの細胞は、がんの治療及び／または予防に使用することができる。これは、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号（その開示内容は参照により本明細書に援用され、本明細書で以下に説明される）にも記載されている。
がんの治療または予防に適した標的遺伝子としては、表２及び表３に記載のものを挙げることができる。１つの実施形態において、がんの治療及び予防のための標的遺伝子は、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０４８５７７号に記載のものも含むことができ、その開示内容は参照により本明細書に援用され、また本明細書に記載の組成物、システムに適合及び／または適用することができる。
養子細胞療法
本明細書に記載の組成物、システム、及びその構成要素は、養子細胞療法のための細胞の修飾に使用することができる。１つの態様において、標的核酸配列の編集、または標的核酸配列の発現の調節を含む方法及び組成物、及びがん免疫療法に関連するその用途は、組成物、システムを適合させることによって理解される。１つの実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して幹細胞（例えば、誘導多能性細胞）を修飾して、修飾ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びアルファベータＴ細胞（これらは養子細胞療法に使用することができる）を導出することができる。１つの例示的な実施形態において、組成物、システム、及び方法を使用して、修飾ナチュラルキラー細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びアルファベータＴ細胞を修飾することができる。
本明細書で使用する場合、「ＡＣＴ」、「養子細胞療法」、及び「養子細胞移入」は、互換的に使用することができる。１つの実施形態において、養子細胞療法（ＡＣＴ）とは、細胞の生着により、機能及び特性を新たな宿主に移すことを目標とする患者への細胞の移入を指すことができる（例えば、Ｍｅｔｔａｎａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎ α－ｇｌｏｂｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｓｅｐ ４；８（１）：４２４を参照）。本明細書で使用する場合、「生着する」または「生着」という用語は、組織の既存の細胞との接触により、細胞がｉｎ ｖｉｖｏで目的の組織に組み込まれるプロセスを指す。養子細胞療法（ＡＣＴ）とは、免疫機能及び特性を新しい宿主に移すことを目的として、細胞（最も一般的には免疫由来細胞）を同じ患者に戻すかまたは新しい宿主に移すことを指すことができる。可能な場合、自己由来細胞の使用は、ＧＶＨＤの問題を最小限に抑えることによってレシピエントの助けとなる。自己由来腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入（Ｚａｃｈａｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８ Ｊｕｎ；２４（６）：７２４－７３０；Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６（９）２６４６－５５；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８（５５９４）：８５０－４；及びＤｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３（１０）：２３４６－５７．）または遺伝子的に再誘導された末梢血単核細胞（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（３）：５３５－４６；及びＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（５７９６）１２６－９）は、黒色腫、転移性乳癌、及び結腸直腸癌を含む進行固形腫瘍を有する患者、ならびにＣＤ１９発現血液学的悪性腫瘍を有する患者の治療に首尾よく使用されている（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（９５）：９５ｒａ７３）。１つの実施形態において、同種異系細胞免疫細胞が移入される（例えば、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３（９）２２５５－２２６６を参照）。本明細書でさらに説明するように、同種異系細胞を編集して、アロ活性を低減し、移植片対宿主病を予防することができる。このように、同種異系細胞を使用することで、診断後に患者からの自己由来細胞を準備するのとは対照的に、細胞を健康なドナーから入手し、患者において使用するために準備することができる。
諸態様は、選択された抗原（例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的ネオ抗原）に特異的な免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子移入を含む（例えば、Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２：１８９－２２５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３４８ ｎｏ．６２３０ ｐｐ．６２－６８；Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（４）：２６９－２８１；及びＪｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ，２０１４，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２５７（１）：１２７－１４４；及びＲａｊａｓａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊｕｌ １７；１２４（３）：４５３－６２を参照）。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原（例えば、腫瘍抗原）は、以下からなる群より選択することができる：ＭＲ１（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ｍｏｎｏｍｏｒｐｈｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＲ１，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２１，ｐａｇｅｓ１７８－１８５を参照）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＢＣＭＡ－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｍａｒ ８；Ｂｅｒｄｅｊａ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｄｕｒａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｕｐｄａｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｂ２１２１ ａｎｔｉ－Ｂｃｍａ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０：７４０；及びＭｏｕｈｉｅｄｄｉｎｅ ａｎｄ Ｇｈｏｂｒｉａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｔｈｅ Ｅｒａ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔ，Ｍａｙ－Ｊｕｎｅ ２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ １５，ｉｓｓｕｅ ３を参照）；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）；チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１；線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；がん胎児性抗原抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；メソテリン；ヒト上皮成長因子受容体２（ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ））；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異体（ＥＬＦ２Ｍ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）；ｇｐｌＯＯ；ＢＣＲ－ＡＢＬ（ブレイクポイントクラスター領域－アベルソン）；チロシナーゼ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ扁平上皮癌１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；κ－軽鎖、ＬＡＧＥ（Ｌ抗原）；ＭＡＧＥ（黒色腫抗原）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＭＡＧＥ Ａ３；ＭＡＧＥ Ａ６；レグマイン；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；プロステイン；サバイビン；ＰＣＴＡ１（ガレクチン８）；Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１；Ｒａｓ変異体；ＴＲＰ－１（チロシナーゼ関連タンパク質１、またはｇｐ７５）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）；ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２（ＴＲＰ－２／イントロン２）；ＲＡＧＥ（腎抗原）；終末糖化産物受容体１（ＲＡＧＥ１）；腎ユビキタス１、２（ＲＵ１、ＲＵ２）；腸カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）；ヒートショックタンパク質７０－２（ＨＳＰ７０－２）変異体；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１２３；ＣＤ１７１；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２６；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ４４ｖ７／８（分化４４のクラスター、エキソン７／８）；ＣＤ５３；ＣＤ９２；ＣＤ１００；ＣＤ１４８；ＣＤ１５０；ＣＤ２００；ＣＤ２６１；ＣＤ２６２；ＣＤ３６２；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、及び１９Ａ２４）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；Ｔｎ抗原（Ｔｎ Ａｇ）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；ＣＤ３８；ＣＤ１３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２）；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；段階特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；ムチン１６（ＭＵＣ１６）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（Ｐｒｏｓｏｍｅ、Ｍａｃｒｏｐａｉｎ）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；エフリンＢ２；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体アルファ；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ交互リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；１２ｐ染色体に位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；血管タンパク質結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；ＣＴ（がん／精巣（抗原））；黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原 １；ｐ５３；ｐ５３変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレイクポイント；黒色腫アポトーシス阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子Ｂ（ジンクフィンガータンパク質様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞－１または３に認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント－１、－２、－３、または－４（ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄ストローマ細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）；リビン；アルファ胎児タンパク質（ＡＦＰ）；膜貫通活性化物質及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）；Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）；Ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）；７０７－ＡＰ（７０７アラニンプロリン）；ＡＲＴ－４（Ｔ４細胞が認識する腺癌抗原）；ＢＡＧＥ（Ｂ抗原；ｂ－カテニン／ｍ、ｂ－カテニン／変異型）；ＣＡＭＥＬ（黒色腫上のＣＴＬ認識抗原）；ＣＡＰ１（がん胎児抗原ペプチド１）；ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ－８）；ＣＤＣ２７ｍ（細胞分裂周期２７変異型）；ＣＤＫ４／ｍ（サイクリン依存性キナーゼ４変異型）；Ｃｙｐ－Ｂ（シクロフィリンＢ）；ＤＡＭ（分化抗原黒色腫）；ＥＧＰ－２（上皮糖タンパク質２）；ＥＧＰ－４０（上皮糖タンパク質４０）；Ｅｒｂｂ２、３、４（赤芽球性白血病がん遺伝子ホモログ－２、－３、４）；ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質；ｆＡｃｈＲ（胎児アセチルコリン受容体）；Ｇ２５０（糖タンパク質２５０）；ＧＡＧＥ（Ｇ抗原）；ＧｎＴ－Ｖ（Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ）；ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ抗原）；ＵＬＡ－Ａ（ヒト白血球抗原－Ａ）；ＨＳＴ２（ヒト印環細胞腫瘍２）；ＫＩＡＡ０２０５；ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）；ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（低密度脂質受容体／ＧＤＰ Ｌ－フコース：ｂ－Ｄ－ガラクトシダーゼ２－ａ－Ｌフコシルトランスフェラーゼ）；Ｌ１ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）；ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）；ミオシン／ｍ（ミオシン変異型）；ＭＵＭ－１、－２、－３（黒色腫ユビキタス変異型１、２、３）；ＮＡ８８－Ａ（患者Ｍ８８のＮＡ ｃＤＮＡクローン）；ＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラーグループ２、メンバーＤ）リガンド；がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）；ｐ１９０ ｍｉｎｏｒ ｂｃｒ－ａｂｌ（１９０ＫＤ ｂｃｒ－ａｂｌのタンパク質）；Ｐｍｌ／ＲＡＲａ（前骨髄球性白血病／レチノイン酸受容体ａ）；ＰＲＡＭＥ（黒色腫の優先発現抗原）；ＳＡＧＥ（肉腫抗原）；ＴＥＬ／ＡＭＬ１（転座Ｅｔｓ－ファミリー白血病／急性骨髄性白血病１）；ＴＰＩ／ｍ（トリオースリン酸イソメラーゼ変異型）；ＣＤ７０；ならびにこれらの組合せ。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原は、ネオ抗原である。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原は、ユニバーサル腫瘍抗原である。ある特定の好ましい実施形態において、ユニバーサル腫瘍抗原は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ １（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、リビン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３、サイクリン（Ｄｌ）、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される。
１つの実施形態において、疾患（例えば、特定的には腫瘍またはがん）の養子細胞療法（例えば、特定的にはＣＡＲまたはＴＣＲ Ｔ細胞療法）で標的とされるべき抗原（例えば、腫瘍抗原）は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＬＬ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ６、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＷＴ１、ＣＤ２２、ＣＤ１７１、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１６、及びＳＳＸ２からなる群より選択することができる。ある特定の好ましい実施形態において、抗原はＣＤ１９であってもよい。例えば、ＣＤ１９は、血液学的悪性腫瘍（例えば、リンパ腫、より特定的にはＢ細胞リンパ腫、例えば、限定されるものではないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（成人及び小児ＡＬＬを含む）、非ホジキンリンパ腫、低悪性度非ホジキンリンパ腫、または慢性リンパ性白血病）において標的とすることができる。例えば、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫または形質細胞白血病において標的とすることができる（例えば、２０１８ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＡＣＲ）Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ：Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎを参照）。例えば、ＣＬＬ１は、急性骨髄性白血病において標的とすることができる。例えば、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ６、ＳＳＸ２、及び／またはＫＲＡＳは、固形がんにおいて標的とすることができる。例えば、ＨＰＶ Ｅ６及び／またはＨＰＶ Ｅ７は、子宮頸癌または頭頸部癌において標的とすることができる。例えば、ＷＴ１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、大腸癌、または中皮腫において標的とすることができる。例えば、ＣＤ２２は、Ｂ細胞悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または急性リンパ芽球性白血病を含む）において標的とすることができる。例えば、ＣＤ１７１は、神経芽腫、神経膠芽腫、または肺、膵臓、もしくは卵巣癌において、標的とすることができる。例えば、ＲＯＲ１は、非小細胞肺癌、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、前立腺癌、ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病、またはマントル細胞リンパ腫を含むＲＯＲ１＋悪性腫瘍において、標的とすることができる。例えば、ＭＵＣ１６は、ＭＵＣ１６ｅｃｔｏ＋上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌において標的とすることができる。例えば、ＣＤ７０は、血液学的悪性腫瘍ならびに固形がん（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経膠腫（ＧＢＭ）、頭頸部癌（ＨＮＳＣＣ））の両方で標的とすることができる。ＣＤ７０は、血液学的悪性腫瘍及び固形がんの両方で発現しているが、正常組織での発現はリンパ球系のサブセットに限定されている（例えば、２０１８ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＡＣＲ）Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｏｓｔｅｒ：Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉ－ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂｏｔｈ Ｓｏｌｉｄ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓを参照）。
例えば、選択されたペプチド特異性を有する新たなＴＣＲα及びβ鎖を導入することによってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異性を改変することにより、Ｔ細胞を遺伝子修飾するために様々な戦略を用いることができる（米国特許第８，６９７，８５４号；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００３０２０７６３号、同第ＷＯ２００４０３３６８５号、同第ＷＯ２００４０４４００４号、同第ＷＯ２００５１１４２１５号、同第ＷＯ２００６０００８３０号、同第ＷＯ２００８０３８００２号、同第ＷＯ２００８０３９８１８号、同第ＷＯ２００４０７４３２２号、同第ＷＯ２００５１１３５９５号、同第ＷＯ２００６１２５９６２号、同第ＷＯ２０１３１６６３２１号、同第ＷＯ２０１３０３９８８９号、同第ＷＯ２０１４０１８８６３号、同第ＷＯ２０１４０８３１７３号、米国特許第８，０８８，３７９号を参照）。
ＴＣＲ修飾の代替または追加として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、選択された標的（例えば、悪性細胞）に特異的な免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を生成するために使用され、多種多様な受容体キメラコンストラクトについて説明されている（米国特許第５，８４３，７２８号、同第５，８５１，８２８号、同第５，９１２，１７０号、同第６，００４，８１１号、同第６，２８４，２４０号、同第６，３９２，０１３号、同第６，４１０，０１４号、同第６，７５３，１６２号、同第８，２１１，４２２号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ９２１５３２２号を参照）。
概して、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインから構成され、細胞外ドメインは、所定の標的に特異的な抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、しばしば抗体または抗体フラグメント（例えば、単鎖可変フラグメント、ｓｃＦｖ）であるが、結合ドメインは、標的を特異的に認識する限りにおいて、特に限定されることはない。例えば、１つの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが受容体のリガンドに結合することが可能であるように、受容体を含むことができる。代替的に、抗原結合ドメインは、ＣＡＲがそのリガンドの内在性受容体を結合することが可能であるように、リガンドを含むことができる。
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、概して、ヒンジまたはスペーサーによって膜貫通ドメインから分離されている。また、スペーサーも特に限定されず、ＣＡＲに柔軟性を提供するように設計されている。例えば、スペーサードメインは、ヒトＦｃドメインの一部（ＣＨ３ドメインの一部を含む）、または任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭ、またはそのバリアント）のヒンジ領域を含むことができる。さらに、ヒンジ領域は、ＦｃＲまたは他の潜在的な干渉物によるオフターゲット結合を防止するように修飾することができる。例えば、ヒンジは、ＦｃＲへの結合を減少させるために、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及び／またはＮ２９７Ｑ変異（Ｋａｂａｔ番号付けによる）のありまたはなしでＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含むことができる。追加のスペーサー／ヒンジとしては、限定されるものではないが、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２８ヒンジ領域が挙げられる。
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、天然由来であっても合成源由来であってもよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来することができる。本開示で特に有用な透過膜領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来するものであり得る。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、この場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を圧倒的に含む。フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三つ組が合成系粘膜ドメインの各末端に見られることが好ましい。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間の連結を形成することができる。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーとなる。
代替的なＣＡＲコンストラクトは、連続的世代に属するものとして特徴付けることができる。第一世代ＣＡＲは、典型的には、抗原に特異的な抗体の単鎖可変フラグメントからなり、例えば、特異性抗体のＶＨに連結したＶＬを含み、フレキシブルリンカーにより、例えば、ＣＤ８αヒンジドメイン及びＣＤ８α膜貫通ドメインにより、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζまたはＦｃＲγ）と連結している（ｓｃＦｖ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＦｃＲγ；米国特許第７，７４１，４６５号；米国特許第５，９１２，１７２号；米国特許第５，９０６，９３６号を参照）。第二世代ＣＡＲは、１つ以上の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７））の細胞内ドメインをエンドドメイン内に組み込んでいる（例えばｓｃＦｖ－ＣＤ２８／ＯＸ４０／４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９１１，９９３号；同第８，９１６，３８１号；同第８，９７５，０７１号；同第９，１０１，５８４号；同第９，１０２，７６０号；同第９，１０２，７６１号を参照）。第三世代ＣＡＲは、共刺激エンドドメインの組合せを含む：ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩ ｌａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＬＦＡ－１、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、またはＣＤ２８シグナル伝達ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζまたはｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ；米国特許第８，９０６，６８２号；米国特許第８，３９９，６４５号；米国特許第５，６８６，２８１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１３４１６５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０７９０００号を参照）。１つの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲＩＧ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２からなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の好ましい実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγの機能的シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、及びＮＫＧ２Ｄからなる群より各々独立して選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＣＤ２８からなる群より各々独立して選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。１つの実施形態において、キメラ抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号に記載のような設計を有することができ、ＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメイン（例えば、ＵＳ７，４４６，１９０の配列番号１４に示されているような、ヒトＣＤ３ゼータ鎖のアミノ酸残基５２～１６３）、ＣＤ２８からのシグナル伝達領域及び抗原結合エレメント（または部分もしくはドメイン；例えば、ｓｃＦｖ）を含む。ＣＤ２８部分は、ゼータ鎖部分と抗原結合エレメントとの間にあるとき、好適には、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号１０のアミノ酸残基１１４～２２０、ＵＳ７，４４６，１９０の配列番号６に示されている全配列；これらはＧｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ＿００６１３９に記載のＣＤ２８の以下の部分を含むことができる。代替的に、ゼータ配列がＣＤ２８配列と抗原結合エレメントとの間にある場合、ＣＤ２８の細胞内ドメインを単独で使用することもできる（例えば、ＵＳ７，４４６，１９０の配列番号９に記載のアミノ配列）。したがって、ある特定の実施形態は、（ａ）ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインを含むゼータ鎖部分と、（ｂ）共刺激シグナル伝達領域と、（ｃ）抗原結合エレメント（または部分もしくはドメイン）とを含むＣＡＲを用いる（共刺激シグナル伝達領域はＵＳ７，４４６，１９０の配列番号６によってコードされるアミノ酸配列を含む）。
代替的に、抗原特異的Ｔ細胞内でＣＡＲを発現させることにより、共刺激を編成することができ、Ｔ細胞は、例えば、専門の抗原提示細胞上の抗原により、それらのネイティブαβＴＣＲと係合し、付随する共刺激の後に活性化及び拡大されるように選択される。加えて、追加の操作された受容体を免疫応答性細胞上に提供して、例えば、Ｔ細胞攻撃の標的化を改善する、及び／または副作用を最小限に抑えることができる。
例としてであり、限定するものではないが、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２（７）：６８９－７０２は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）について説明している。ＦＭＣ６３－２８Ｚ ＣＡＲは、ＦＭＣ６３マウスハイブリドーマ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４：１１５７－１１６５に記載）に由来するＣＤ１９を認識する単鎖可変領域部分（ｓｃＦｖ）と、ヒトＣＤ２８分子の一部と、ヒトＴＣＲ－ζ分子の細胞内構成要素とを含む。ＦＭＣ６３－ＣＤ８２８ＢＢＺ ＣＡＲは、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖと、ＣＤ８分子のヒンジ及び膜貫通領域と、ＣＤ２８及び４－１ＢＢの細胞質部分と、ＴＣＲ－ζ分子の細胞質構成要素とを含む。ＦＭＣ６３－２８Ｚ ＣＡＲに含まれるＣＤ２８分子の正確な配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ＿００６１３９に対応しており、この配列には、アミノ酸配列ＩＥＶＭＹＰＰＹ（配列番号２）で開始する全てのアミノ酸が含まれ、タンパク質のカルボキシ末端まで続いている。ベクターの抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ構成要素をコードするために、著者らは、過去に公表されたＣＡＲ（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：１６３７－１６４４）の一部に基づいたＤＮＡ配列を設計した。この配列は、５’末端→３’末端にかけインフレームで以下の構成要素をコードした：ＸｈｏＩ部位、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）受容体α鎖シグナル配列、ＦＭＣ６３軽鎖可変領域（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前掲）、リンカーペプチド（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，前掲）、ＦＭＣ６３重鎖可変領域（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，前掲）、及びＮｏｔＩ部位。この配列をコードするプラスミドをＸｈｏＩとＮｏｔＩで消化した。ＭＳＧＶ－ＦＭＣ６３－２８Ｚレトロウイルスベクターを形成するため、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖをコードするＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ消化フラグメントを、ＭＳＧＶレトロウイルス骨格（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６：４５７－４７２）をコードする第２のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ消化フラグメント、ならびにヒトＣＤ２８の細胞外部分の一部、ヒトＣＤ２８の膜貫通及び細胞質部分の全体、及びヒトＴＣＲ－ζ分子の細胞質部分（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：７０－７５）にライゲーションした。ＦＭＣ６３－２８Ｚ ＣＡＲは、Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．が特に再発性／難治性の高悪性度Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の患者の治療のために開発中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ療法製品ＫＴＥ－Ｃ１９（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）に含まれている。したがって、１つの実施形態において、養子細胞療法が意図された細胞、より特定的にはＴ細胞などの免疫応答性細胞は、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら（前掲）によって説明されているように、ＦＭＣ６３－２８Ｚ ＣＡＲを発現することができる。したがって、１つの実施形態において、養子細胞療法が意図された細胞、より特定的にはＴ細胞などの免疫応答性細胞は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合エレメント（または部分もしくはドメイン；例えば、ｓｃＦｖ）と、ＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域とを含むＣＡＲを含むことができる。好ましくは、ＣＤ２８アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＩＥＶＭＹＰＰＰＹで開始し、タンパク質のカルボキシ末端まで続くＧｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ＿００６１３９（配列バージョン１、２、または３）に記載されている通りである。好ましくは、抗原はＣＤ１９であり、より好ましくは、抗原結合エレメントは抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖであり、さらにより好ましくは、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら（前掲）によって説明されているような抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖである。
追加の抗ＣＤ１９ ＣＡＲについては、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１８７５２８号でさらに説明されている。より特定的には、ＷＯ２０１５１８７５２８（参照により本明細書に援用される）の実施例１及び表１は、完全ヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ＵＳ２０１００１０４５０９に記載の４７Ｇ４）及びマウス抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に記載、上記で説明）に基づく抗ＣＤ１９ ＣＡＲの生成を示す。シグナル配列（ヒトＣＤ８－アルファまたはＧＭ－ＣＳＦ受容体）、細胞外及び膜貫通領域（ヒトＣＤ８－アルファ）、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ；４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；ＣＤ２７－ＣＤ３ζ；ＣＤ２８－ＣＤ２７－ＣＤ３ζ，４－１ＢＢ－ＣＤ２７－ＣＤ３ζ；ＣＤ２７－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；ＣＤ２８－ＣＤ２７－ＦｃεＲＩガンマ鎖；またはＣＤ２８－ＦｃεＲＩガンマ鎖）の様々な組合せが開示された。したがって、１つの実施形態において、養子細胞療法が意図された細胞、より特定的にはＴ細胞などの免疫応答性細胞は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合エレメントと、ＷＯ２０１５１８７５２８号の表１に記載の細胞外及び膜貫通領域と、ＷＯ２０１５／１８７５２８号の表１に記載の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲかを含むことができる。好ましくは、抗原はＣＤ１９であり、より好ましくは、抗原結合エレメントは抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖであり、さらにより好ましくは、ＷＯ２０１５／１８７５２８の実施例１に記載のマウスまたはヒト抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖである。１つの実施形態において、ＣＡＲは、ＷＯ２０１５１８７５２８の表１に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
例としてであり、限定するものではないが、ＣＤ７０抗原を認識するキメラ抗原受容体については、ＷＯ２０１２０５８４６０Ａ２に記載されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ７０ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ｍａｒ；７８：１４５－１５０；及びＪｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ７０，ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｌｉｏｍａｓ，Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ｊａｎ １０；２０（１）：５５－６５）。ＣＤ７０は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫によって発現し、またホジキンリンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び多発性骨髄腫の悪性細胞によっても、またＨＴＬＶ－１及びＥＢＶに関連悪性腫瘍によっても発現する（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５；１４７：１１５２－１１６０；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０４：４８８１．２６；Ｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４：６２１２－６２１９；Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：３８４３－３８５２．）。加えて、ＣＤ７０は、腎細胞癌及び膠芽腫などの非血液学的悪性腫瘍によっても発現する。（Ｊｕｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｒｏｌ．２００５；１７３：２１５０－２１５３；Ｃｈａｈｌａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：５４２８－５４３８）。生理的には、ＣＤ７０発現は一過性であり、高度に活性化したＴ、Ｂ、樹状細胞のサブセットに制限される。
例としてであり、限定するものではないが、ＢＣＭＡを認識するキメラ抗原受容体について説明されている（例えば、ＵＳ２０１６００４６７２４Ａ１；ＷＯ２０１６０１４７８９Ａ２；ＷＯ２０１７２１１９００Ａ１；ＷＯ２０１５１５８６７１Ａ１；ＵＳ２０１８００８５４４４Ａ１；ＷＯ２０１８０２８６４７Ａ１；ＵＳ２０１７０２８３５０４Ａ１；及びＷＯ２０１３１５４７６０Ａ１を参照）。
１つの実施形態において、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲまたは外来性ＴＣＲに加えて、さらに、第２の標的抗原に特異的に結合し、第２の標的抗原の認識時に細胞に対し阻害性または免疫抑制性または抑制性シグナルを誘導することが可能なキメラ阻害性受容体（阻害性ＣＡＲ）を含むことができる。１つの実施形態において、キメラ阻害性受容体は、標的抗原に特異的に結合するように構成された細胞外抗原結合エレメント（または部分もしくはドメイン）と、膜貫通ドメインと、細胞内免疫抑制または抑制シグナル伝達ドメインとを含む。１つの実施形態において、第２の標的抗原は、がん細胞もしくは感染細胞の表面で発現しないか、またはがん細胞もしくは感染細胞上でその発現が下方調節される抗原である。１つの実施形態において、第２の標的抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子である。１つの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ－１またはＣＴＬＡ４）の機能的シグナル伝達部分を含む。有利には、このような阻害性ＣＡＲを含めることで、操作された免疫細胞が非標的（例えば、非がん）組織を攻撃する可能性を低減することができる。
代替的に、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、オフターゲット効果を低減するため、内在性ＴＣＲの発現を低減または除去するようにさらに修飾することができる。内在性ＴＣＲを低減または除去することで、オフターゲット効果を低減し、Ｔ細胞の有効性を高めることができる（Ｕ．Ｓ．９，１８１，５２７）。機能的なＴＣＲの発現を安定的に欠くＴ細胞は、様々なアプローチを用いて作製することができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体全体を複合体として内在化し、選別し、分解し、半減期は静止Ｔ細胞で約１０時間、刺激Ｔ細胞で３時間である（ｖｏｎ Ｅｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：３８４－３９３）。ＴＣＲ複合体が適切に機能するには、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論的比率が必要とされる。ＴＣＲ機能には、ＩＴＡＭモチーフを有する２つの機能するＴＣＲゼータタンパク質も必要とされる。ＴＣＲがそのＭＨＣペプチドリガンドに結合して活性化するためには、同じＴ細胞上の複数のＴＣＲが係合し、その全てが適切にシグナル伝達を行う必要がある。したがって、適切に会合しないまたは最適なシグナル伝達ができないタンパク質によってＴＣＲ複合体が不安定化すると、Ｔ細胞は十分に活性化されず、細胞応答を開始しない。
したがって、１つの実施形態において、ＴＣＲ発現は、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ＣＲＩＳＰＲ、あるいは初代Ｔ細胞において特定のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ－α及びＴＣＲ－β）及び／またはＣＤ３鎖をコードする核酸を標的とする他の方法を用いて排除することができる。これらのタンパク質の１つ以上の発現を遮断することにより、Ｔ細胞はＴＣＲ複合体の重要な構成要素のうちの１つ以上を産生しなくなるため、ＴＣＲ複合体が不安定化し、機能的なＴＣＲの細胞表面発現が妨げられる。
１つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの発現及び／または活性化を制御するためのスイッチ機構も含むことができる。例えば、ＣＡＲは、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むことができ、細胞外ドメインは、標的細胞上にあるまたは標的細胞によって発現される標的抗原以外の分子に特異的な標識、結合ドメイン、またはタグを含む標的特異的結合エレメントを含むことができる。このような実施形態において、ＣＡＲの特異性は、標的抗原結合ドメイン（例えば、標的抗原及びＣＡＲ上の標識またはタグの両方に特異的なｓｃＦｖまたは二重特異性抗体）と、ＣＡＲ上の標識、結合ドメインまたはタグによって認識されるかまたはそれに結合するドメインとを含む、第２のコンストラクトによって提供される。例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０４４２２５号、同第ＷＯ２０１６／０００３０４号、同第ＷＯ２０１５／０５７８３４号、同第ＷＯ２０１５／０５７８５２号、及び同第ＷＯ２０１６／０７００６１号、ＵＳ９，２３３，１２５、及びＵＳ２０１６／０１２９１０９を参照。このように、ＣＡＲを発現するＴ細胞を対象に投与することはできるが、ＣＡＲは、抗原特異的結合ドメインを含む第２の組成物が投与されるまで、その標的抗原に結合できない。
代替的なスイッチ機構としては、シグナル伝達機能を活性化するために多量体化を必要とするＣＡＲ（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５／０３６８３４２号、同第ＵＳ２０１６／０１７５３５９号、同第ＵＳ２０１５／０３６８３６０号参照）、及び／またはＴ細胞応答を引き出すための、低分子薬物などの外来シグナル（ＵＳ ２０１６／０１６６６１３；Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５）が挙げられる。また、いくつかのＣＡＲは、治療後にＣＡＲ Ｔ細胞の細胞死を誘導するために（Ｂｕｄｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３）、または標的抗原への結合後にＣＡＲの発現を下方調節するために（国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１１２１０号）「自殺スイッチ」も含むことができる。
代替的な技法を使用して、標的免疫応答性細胞を形質転換することができる（例えば、プロトプラスト融合、リポフェクション、形質移入、またはエレクトロポレーション）。多種多様なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミド、またはトランスポゾン、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（米国特許第６，４８９，４５８号；同第７，１４８，２０３号；同第７，１６０，６８２号；同第７，９８５，７３９号；同第８，２２７，４３２号を参照））を使用して、（例えば、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８またはＣＤ１３７のいずれかを介しシグナル伝達を行う第２世代抗原特異性ＣＡＲを用いて）ＣＡＲを導入することができる。ウイルスベクターは、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づいたベクターを含むことができる。
形質転換の標的となる細胞としては、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはリンパ系細胞が分化し得る多能性幹細胞を挙げることができる。所望のＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、がん抗原と共刺激分子を共発現するγ照射活性化増殖細胞（ＡａＰＣ）との共培養により選択することができる。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、可溶性因子（例えば、例えば、ＩＬ－２やＩＬ－２１）の存在下でＡａＰＣ上で共培養することにより、拡大することができる。この拡大は、例えば、メモリーＣＡＲ＋Ｔ細胞（これは、例えば、非酵素的デジタルアレイ及び／またはマルチパネルフローサイトメトリーによってアッセイすることができる）を提供するように実施することができる。このようにして、抗原を有する腫瘍に対し特異的な細胞傷害活性を有する（任意選択で、インターフェロン－γなどの所望のケモカインの産生を伴う）ＣＡＲ Ｔ細胞を提供することができる。この種類のＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、動物モデルにおいて、例えば、腫瘍異種移植片を処置するために使用することができる。
１つの実施形態において、ＡＣＴは、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞及びＣＤ８＋ＣＴＬを共移入して、相乗的な抗腫瘍応答を誘導することを含む（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＣＤ４＋ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７ Ｏｃｔ；６（１０）：ｅ１６０を参照）。
１つの実施形態において、Ｔｈ１７細胞は、それを必要とする対象に移入される。Ｔｈ１７細胞は、マウスにおける黒色腫腫瘍をＴｈ１細胞よりも高い程度に直接的に根絶することが報告されている（Ｍｕｒａｎｓｋｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｈ１７－ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｌａｒｇｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ｊｕｌ １５；１１２（２）：３６２－７３；及びＭａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １７ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９ Ｎｏｖ ２０；３１（５）：７８７－９８）。これらの研究は、チロシナーゼ腫瘍抗原を認識するＴＣＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を利用する、養子Ｔ細胞移入（ＡＣＴ）療法のアプローチを含む。ＴＣＲを活用することで、自己由来腫瘍を有する宿主に再注入するためのＴｈ１７集団の急速な拡大がｅｘ ｖｉｖｏで大きな数字でもたらされる。
１つの実施形態において、ＡＣＴは、自己由来ｉＰＳＣベースワクチン（例えば、自己抗腫瘍ワクチンにおける照射ｉＰＳＣ）を含むことができる（例えば、Ｋｏｏｒｅｍａｎ，Ｎｉｇｅｌ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉＰＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｅｌｉｃｉｔ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２，１－１３，２０１８，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１８．０１．０１６を参照）。
ＭＨＣに限定されているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とは異なり、ＣＡＲは任意の細胞表面発現抗原に潜在的に結合し得るため、より汎用的に患者の治療に使用することができる（Ｉｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｒａｃｉｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｄｏｎ’ｔ Ｆｏｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｆｕｅｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，０３ Ａｐｒｉｌ ２０１７，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００２６７を参照）。１つの実施形態において、ＴＩＬ療法及び免疫チェックポイント遮断の使用を妨げる内在性Ｔ細胞浸潤（例えば、異常な抗原処理及び提示に起因するもの）の不在下では、ＣＡＲ Ｔ細胞の移入を患者の治療に使用することができる（例えば、Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ＣＳ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）：５６－７１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３２を参照）。
前述のようなアプローチは、例えば、選択された抗原に結合する抗原認識受容体を含む免疫応答性細胞の有効量を投与することにより（この結合が免疫応答性細胞を活性化して、疾患（新生物、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植反応を含む）を治療または予防する）、疾患を有する対象を治療する及び／またはその生存期間を増加させる方法を提供するように適合させることができる。
１つの実施形態において、治療は、化学療法（典型的にはシクロホスファミドとフルダラビンとの組合せ）または放射線療法の形態でリンパ球を枯渇させる前治療を行った後に、投与することができる。ＡＣＴの初期の研究では、応答が短命であり、移入した細胞はｉｎ ｖｉｖｏでそれほど長い間は残存しなかった（Ｈｏｕｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔ－ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ（２０１５）３（１０）：１１１５－２２；及びＫａｍｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１７）７：６４）。Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣのような免疫サプレッサー細胞は、必要なサイトカインを奪うことにより、移入された細胞の活性を減弱することができる。理論に束縛されるものではないが、リンパ球枯渇の前処置によってサプレッサー細胞が排除され、ＴＩＬが残存できるようになる可能性がある。
１つの実施形態において、治療は、免疫抑制治療（例えば、グルココルチコイド治療）を受けている患者に投与することができる。細胞または細胞集団は、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化により、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して抵抗性になり得る。１つの実施形態において、免疫抑制治療は、患者内の免疫応答性Ｔ細胞の選択及び拡大をもたらす。
１つの実施形態において、治療は、一次治療の前に腫瘍を縮小するために、一次治療（例えば、手術または放射線療法）の前に投与することができる。別の実施形態において、治療は、任意の残存するがん細胞を除去するために、一次治療の後に投与することができる。
１つの実施形態において、ＡＣＴまたはＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する応答を強化し、内在性免疫を支援するために、ＡＣＴの前及び／または最中に免疫代謝バリアを治療的に標的とすることができる（例えば、Ｉｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｒａｃｉｎｇ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｄｏｎ’ｔ Ｆｏｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｆｕｅｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，０３ Ａｐｒｉｌ ２０１７，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００２６７を参照）。
細胞または細胞集団、例えば、免疫系細胞または細胞集団、例えば、より特定的には、本明細書で開示するような、免疫抑制性細胞または細胞集団の投与は、任意の好都合な方式（エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によるものを含む）で行うことができる。細胞または細胞集団は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、髄腔内、静脈内もしくはリンパ内注射により、または腹腔内に投与することができる。１つの実施形態において、本開示のＣＡＲは、腫瘍組織の切除によって形成された空洞に送達もしくは投与（すなわち、空洞内送達）するか、または切除前の腫瘍に直接送達もしくは投与（すなわち、腫瘍内送達）することができる。１つの実施形態において、細胞組成物は静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞集団の投与は、ｋｇ体重当たり１０４～１０９細胞、好ましくはｋｇ体重あたり１０５～１０６細胞の投与からなり得る（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）。ＣＡＲ Ｔ細胞療法における投与は、例えばシクロホスファミドを用いた、リンパ枯渇処理の過程を伴うまたは伴わない、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与を含むことができる。細胞または細胞集団は、１回以上の用量で投与することができる。別の実施形態において、有効量の細胞が、単回用量として投与される。別の実施形態において、有効量の細胞が、複数回用量として一定期間にわたり投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態によって異なる。細胞または細胞集団は、任意の供給源（例えば、血液バンクまたはドナー）から得ることができる。個々のニーズは様々であるが、特定の疾患または状態に対する所与の細胞タイプの有効量の最適な範囲の決定は、当業者の技量の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。投与する投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、及び体重、併用治療の種類（存在する場合）、治療の頻度、及び所望される効果の性質に依存する。
別の実施形態において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。投与は、腫瘍内に注射することにより、直接行うことができる。
考えられる有害反応に備えるため、操作された免疫応答性細胞に、特定のシグナルに曝露すると細胞が脆弱になる導入遺伝子の形態で、遺伝子導入安全スイッチを搭載することができる。例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を、例えば、幹細胞移植後のドナーリンパ球輸液として使用する同種異系Ｔリンパ球に導入することにより、このように使用することができる（Ｇｒｅｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６：９５）。このような細胞の場合、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシドプロドラッグの投与により、細胞死が引き起こされる。代替的な安全スイッチコンストラクトとしては、誘導性カスパーゼ９が挙げられ、これは例えば、２つの非機能的なｉｃａｓｐ９分子を集めて活性酵素を形成する低分子二量体化剤の投与によって誘発される。細胞増殖制御を実装するための多種多様な代替的アプローチが説明されている（米国特許公開第２０１３００７１４１４号；国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４６８６２号；国際特許公開第ＷＯ２０１４／０１１９８７号；国際特許公開第ＷＯ２０１３／０４０３７１号；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，２０１４，１２３／２５：３８９５－３９０５；Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１６７３－１６８３；Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１７３５－１７３；Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８（６）：１１０７－１５（２０１０））。
養子縁組療法のさらなる改良において、ゲノム編集は、例えば編集されたＣＡＲ Ｔ細胞を提供するような代替実施態様に免疫応答性細胞を調整するために使用することができる（Ｐｏｉｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ“ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ”ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７５（１８）：３８５３；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＰＤ１ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｍａｙ １；２３（９）：２２５５－２２６６．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１６－１３００．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｎｏｖ ４；Ｑａｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｎｔ Ｂ－ＡＬＬ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＴＡＬＥＮ ｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ｊａｎ ２５；９（３７４）；Ｌｅｇｕｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１８，ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＴＣＲ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１３１（３），３１１－３２２；及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＲ－Ｃｏｕｐｌｅｄ “Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ”Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉ－ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｏｆ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｏｎｌｉｎｅ ６ Ｍａｒｃｈ ２０１８を参照）。細胞は、本明細書に記載の任意のＣＲＩＳＰＲシステム及びその使用方法を用いて編集することができる。組成物、システムは、本明細書に記載の任意の方法によって免疫細胞に送達することができる。好ましい実施形態において、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで編集され、それを必要とする対象に移入される。免疫応答性細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、または養子細胞移入に使用される任意の細胞を編集することができる。編集は、例えば、外来遺伝子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外来遺伝子）を細胞内の予め選択された座位（例えば、ＴＲＡＣ座位）に挿入またはノックインするため；潜在的なアロ活性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を排除するため、または内在性及び外来性のＴＣＲ鎖間の不適切な対合（例えば、細胞内での内在性ＴＣＲのノックアウトまたはノックダウン発現）を防止するため；細胞内で化学療法剤の標的を破壊するため；免疫チェックポイントを遮断するため、例えば、細胞内での免疫チェックポイントタンパク質または受容体の発現をノックアウトまたはノックダウンするため；細胞内での他の遺伝子（単数または複数）の発現をノックアウトまたはノックダウンするため（その発現の低下または発現の欠如により、細胞を用いた養子療法の有効性を高めることができる）；外来性ＣＡＲまたはＴＣＲによって標的とされる抗原をコードする内在性遺伝子の細胞内での発現をノックアウトまたはノックダウンするため；細胞内での１つ以上のＭＨＣ構成タンパク質の発現をノックアウトまたはノックダウンするため；Ｔ細胞を活性化する；細胞が疲弊または機能不全に対して耐性があるように細胞を調節するため；及び／または機能的に疲弊したまたは機能不全のＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び／または増殖を増大するため（国際特許公開第ＷＯ２０１３／１７６９１５号、同第ＷＯ２０１４／０５９１７３号、同第ＷＯ２０１４／１７２６０６号、同第ＷＯ２０１４／１８４７４４号、及び同第ＷＯ２０１４／１９１１２８号を参照）、実施される。
１つの実施形態において、編集は、遺伝子の不活性化をもたらし得る。遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現しないことが意図されている。特定の実施形態において、システムは、１つの標的遺伝子の切断を特異的に触媒して、当該標的遺伝子を不活性化する。引き起こされる核酸鎖切断は、一般的に、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）という独特の機構を通じて修復される。しかし、ＮＨＥＪは、しばしば切断部位のＤＮＡ配列に変化をもたらす不完全な修復プロセスである。非相同末端接合（ＮＨＥＪ）による修復は、しばしば小さな挿入及び欠失（インデル）をもたらし、特定の遺伝子ノックアウトの作成に使用することができる。切断誘導性変異誘発事象が発生した細胞は、当技術分野で周知されている方法によって特定及び／または選択することができる。１つの実施形態において、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ）を不活性化することと、不活性化された座位内に内在性ＴＣＲまたはＣＡＲを挿入することとを同時に行う。
したがって、１つの実施形態において、細胞、特定的には養子細胞療法が意図されている細胞、より特定的には免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の編集は、外来遺伝子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外来遺伝子）を細胞内の予め選択された座位に挿入またはノックインするように実施することができる。従来、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸分子は、ランダムに統合するベクターを用いて細胞に形質移入または形質導入するが、統合の部位によっては、クローン拡大、腫瘍形成性形質転換、多様な導入遺伝子発現、及び／または導入遺伝子の転写サイレンシングを引き起こすことがある。細胞内の特定の座位に導入遺伝子（複数可）を誘導することで、このようなリスクを最小源に抑えるまたは回避することができ、細胞による導入遺伝子（複数可）の均一な発現を有利に提供することができる。限定されるものではないが、誘導性導入遺伝子統合に適した「セーフハーバー」座位としては、ＣＣＲ５またはＡＡＶＳ１が挙げられる。導入遺伝子を所望の座位（例えば、ＴＲＡＣ座位）に挿入できる相同組換え修復（ＨＤＲ）戦略は知られており、本明細書の他の箇所で説明する。
導入遺伝子、特にＣＡＲまたは外来性ＴＣＲ導入遺伝子の挿入にさらに適した座位としては、限定されるものではないが、内在性Ｔ細胞受容体の構成要素をコードする遺伝子を含む座位、例えば、Ｔ細胞受容体アルファ座位（ＴＲＡ）またはＴ細胞受容体ベータ座位（ＴＲＢ）、例えばＴ細胞受容体アルファコンスタント（ＴＲＡＣ）座位、Ｔ細胞受容体ベータコンスタント１（ＴＲＢＣ１）座位、またはＴ細胞受容体ベータコンスタント２（ＴＲＢＣ１）座位が挙げられる。有利には、このような座位内に導入遺伝子を挿入することで、内在性プロモーターによって制御される可能性がある導入遺伝子の発現と、内在性ＴＣＲのノックアウト発現とを同時に達成することができる。このアプローチは、Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７に例示されており、著者らはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲをコードするＤＮＡ分子を内在性プロモーターの下流のＴＲＡＣ座位にノックインし、ＣＲＩＳＰＲによって得られたＣＡＲ－Ｔ細胞、はトニックＣＡＲシグナル伝達及び疲弊が低減している点で著しく優れていた。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する細胞表面受容体である。ＴＣＲは概してα及びβの２本の鎖から構成され、これらが集合してヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３形質導入サブユニットと会合して、細胞表面に存在するＴ細胞受容体複合体を形成する。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖は各々、免疫グロブリン様のＮ末端可変領域（Ｖ）と、定常領域（Ｃ）と、疎水性膜貫通ドメインと、短い細胞質領域とからなる。免疫グロブリン分子については、α鎖及びβ鎖の可変領域がＶ（Ｄ）Ｊ組み換えによって生成されるため、Ｔ細胞集団内で抗原特異性の大きな多様性が生み出される。しかし、インタクトな抗原を認識する免疫グロブリンとは対照的に、Ｔ細胞はＭＨＣ分子と関連して処理されたペプチドフラグメントによって活性化されるため、Ｔ細胞による抗原認識には、ＭＨＣ拘束性として知られる追加の次元が導入される。Ｔ細胞受容体を介してドナーとレシピエントとの間でＭＨＣの差異を認識すると、Ｔ細胞の増殖を招き、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症する可能性が生じる。ＴＣＲαまたはＴＣＲβの不活性化により、Ｔ細胞の表面からＴＣＲが消失し、アロ抗原の認識が妨げられるため、ＧＶＨＤが生じ得る。しかし、ＴＣＲの破壊は、概してＣＤ３シグナル伝達構成要素の排除をもたらし、さらなるＴ細胞拡大の手段を改変する。
したがって、１つの実施形態において、細胞、特定的には養子細胞療法が意図されている細胞、より特定的には免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の編集は、細胞内での内在性ＴＣＲの発現をノックアウトまたはノックダウンするために実施することができる。例えば、ＮＨＥＪベースまたはＨＤＲベースの遺伝子編集アプローチを用いて、内在性のＴＣＲアルファ鎖及び／またはベータ鎖遺伝子を破壊することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単数または複数）などの遺伝子編集システム（単数または複数）は、ベータ１及びベータ２定常領域遺伝子（ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２）間で保存されたＴＣＲベータ鎖内に見られる配列を標的とするように、及び／またはＴＣＲアルファ鎖（ＴＲＡＣ）遺伝子の定常領域を標的とするように設計することができる。
同種異系細胞は、宿主の免疫系によって迅速に拒絶される。非照射血液製剤に含まれる同種異系白血球の残存は５～６日以下であることが実証されている（Ｂｏｎｉ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｌｏｏｄ １；１１２（１２）：４７４６－５４）．したがって、同種異系細胞の拒絶反応を防止するには、通常は、ある程度まで宿主の免疫系を抑制する必要がある。しかし、養子細胞移入の場合、免疫抑制薬の使用は、導入した治療用Ｔ細胞にも有害な作用がある。そのため、このような条件下で養子免疫療法のアプローチを効果的に使用するには、導入された細胞が免疫抑制治療に抵抗性である必要がある。したがって、特定の実施形態において、本開示はさらに、好ましくは、免疫抑制剤の標的をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化することにより、Ｔ細胞を免疫抑制剤に対し抵抗性にするように修飾するステップを含む。免疫抑制剤とは、複数の作用機序のうちの１つによって、免疫機能を抑制する薬剤のことである。免疫抑制剤としては、限定されるものではないが、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的薬、インターロイキン２受容体α鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、コルチコステロイド、または免疫抑制代謝拮抗物質が考えられる。本開示では、Ｔ細胞内で免疫抑制剤の標的を不活性化することにより、免疫療法に用いるＴ細胞に免疫抑制抵抗性を付与することができる。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーなどの免疫抑制剤の受容体が考えられる。
１つの実施形態において、細胞、特定的には養子細胞療法が意図されている細胞、より特定的には免疫応答精細胞（例えば、Ｔ細胞）の編集は、免疫チェックポイントをブロックする（例えば、細胞内での免疫チェックポイントタンパク質または受容体の発現をノックアウトまたはノックダウンする）ために実施することができる。免疫チェックポイントとは、免疫反応を減速または停止させ、免疫細胞の制御されない活動からの過剰な組織損傷を防止する阻害性経路のことである。１つの実施形態において、標的とされる免疫チェックポイントは、プログラム死－１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態において、標的とされる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）である。追加の実施形態において、標的とされる免疫チェックポイントは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバー、例えば、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１、またはＫＩＲである。さらなる追加の実施形態において、標的とされる免疫チェックポイントは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、またはＴＩＭ－３である。
追加の免疫チェックポイントとしては、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）が挙げられる（Ｗａｔｓｏｎ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．，ＳＨＰ－１：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１６ Ａｐｒ １５；４４（２）：３５６－６２）。ＳＨＰ－１は、広く発現する阻害性タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。Ｔ細胞においては、これは、抗原依存的な活性化及び増殖の負の調節物質である。これは細胞基質タンパク質であるため、抗体媒介療法には適さないが、活性化及び増殖における役割により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などの養子移入戦略における遺伝子操作の魅力的な標的になっている。免疫チェックポイントは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ／Ｖｓｔｍ３／ＷＵＣＡＭ／ＶＳＩＧ９）及びＶＩＳＴＡも含むことができる（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｅｙｏｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１，ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｚ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１８）。
国際特許公開第ＷＯ２０１４／１７２６０６号は、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／または活性を高め、ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊を減少させる（例えば、機能的に疲弊したまたは応答しないＣＤ８＋免疫細胞を減少させる）ためのＭＴ１及び／またはＭＴ２阻害剤の使用に関するものである。１つの実施形態において、メタロチオネインは、養子移入Ｔ細胞において遺伝子編集により標的とされる。
１つの実施形態において、遺伝子編集の標的は、免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する少なくとも１つの標的座位とすることができる。このような標的としては、限定されるものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＰＤＬ１、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＶＩＳＴＡ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＭＴ１、ＭＴ２、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＨＰ－１、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、またはＣＥＡＣＡＭ－５が挙げられる。好ましい実施形態において、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４遺伝子の発現に関与する遺伝子座位が標的とされる。他の好ましい実施形態において、遺伝子の組合せ（例えば、限定されるものではないが、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ）が標的とされる。
例としてであり、限定するものではないが、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１９６３８８号は、（ａ）抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体であって、ＣＡＲであってもよい、抗原受容体と、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１をコードする破壊された遺伝子、ＰＤ－Ｌ１をコードする遺伝子の破壊及び／またはＰＤ－Ｌ１をコードする遺伝子の破壊のための薬剤とを含み、遺伝子の破壊が、遺伝子編集ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、及び／またはＴＡＬＥＮによって媒介され得る、操作されたＴ細胞に関する。ＷＯ２０１５１４２６７５は、がんの治療において免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤（例えば、本明細書の組成物またはシステム）と組み合わせた、ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞に関し、薬剤は、免疫阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、またはＣＥＡＣＡＭ－５）を阻害することができる。Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３（９）２２５５－２２６６は、ＣＡＲのレンチウイルス導入と、内在性ＴＣＲ、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びＰＤ１を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの電気泳動転写とを同時に実施して、ＴＣＲ、ＨＬＡクラスＩ分子、及びＰＤ１が欠損した遺伝子破壊同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。
１つの実施形態において、細胞をＣＡＲを発現するように操作することができ、細胞内でのメチルシトシンジオキシゲナーゼ遺伝子（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、及び／またはＴＥＴ３）の発現及び／または機能は低減または除去される（例えば、本明細書の組成物またはシステム）（例えば、ＷＯ２０１７０４９１６に記載の通り）。
１つの実施形態において、細胞、特定的には養子細胞療法が意図されている細胞、より特定的には免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の編集を実施して、細胞内での内在性遺伝子のノックアウトまたはノックダウン発現を実施することができ、当該内在性遺伝子は、外来性ＣＡＲまたはＴＣＲによって標的とされる抗原をコードして、操作された細胞の標的化の可能性を低減する。１つの実施形態において、標的抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＳ－１、ＣＤ３３、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ５３、ＣＤ９２、ＣＤ１００、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２００、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ３６２、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、リビン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３、サイクリン（Ｄ１）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通活性化物質及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）、ならびにＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１１２１０号及び同第ＷＯ２０１７／０１１８０４号に記載の通り）からなる群より選択される、１つ以上の抗原であり得る。
１つの実施形態において、細胞、特定的には養子細胞療法を意図した細胞、より特定的には免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の編集は、細胞内で１つ以上のＭＨＣ構成タンパク質（例えば、１つ以上のＨＬＡタンパク質及び／またはベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ））のノックアウトまたはノックダウン発現を実施することができ、それにより、レシピエントの免疫系による非自己由来（例えば、同種異系）細胞の拒絶反応を低減または回避することができる。好ましい実施形態において、１つ以上のＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及び／またはＣ、及び／またはＢ２Ｍ）をノックアウトまたはノックダウンさせることができる。好ましくは、Ｂ２Ｍは、ノックアウトまたはノックダウンすることができる。例として、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３（９）２２５５－２２６６は、ＣＡＲのレンチウイルス導入と、内在性ＴＣＲ、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びＰＤ１を標的とするＣａｓ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの電気泳動転写とを同時に実施して、ＴＣＲ、ＨＬＡクラスＩ分子、及びＰＤ１が欠損した遺伝子破壊同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。
他の実施形態において、少なくとも２つの遺伝子が編集される。遺伝子の対としては、限定されるものではないが、ＰＤ１及びＴＣＲα、ＰＤ１及びＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲβ、ＬＡＧ３及びＴＣＲα、ＬＡＧ３及びＴＣＲβ、Ｔｉｍ３及びＴＣＲα、Ｔｉｍ３及びＴＣＲβ、ＢＴＬＡ及びＴＣＲα、ＢＴＬＡ及びＴＣＲβ、ＢＹ５５及びＴＣＲα、ＢＹ５５及びＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲα、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲα、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲβ、２Ｂ４及びＴＣＲα、２Ｂ４及びＴＣＲβ、Ｂ２Ｍ及びＴＣＲα、Ｂ２Ｍ及びＴＣＲβが挙げられる。
１つの実施形態において、細胞は、本明細書で教示しているように多重編集（マルチプレックスゲノム編集）して、（１）内在性ＴＣＲ（例えば、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及び／またはＴＲＡＣ）のノックアウトまたはノックダウン発現、（２）免疫チェックポイントタンパク質または受容体（例えば、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ４）のノックアウトまたはノックダウン発現、ならびに（３）１つ以上のＭＨＣ構成タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、及び／またはＣ、及び／またはＢ２Ｍ、好ましくはＢ２Ｍ）のノックアウトまたはノックダウン発現を行うことができる。
Ｔ細胞の遺伝子修飾の前か後かにかかわらず、Ｔ細胞は概して、例えば米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び同第７，５７２，６３１号に記載の方法を用いて活性化及び拡大することができる。Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで拡大することができる。
免疫細胞は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて得ることができる。１つの実施形態において、同種異系Ｔ細胞は、健康な対象から得ることができる。１つの実施形態において、腫瘍に浸潤したＴ細胞が単離される。Ｔ細胞は手術時に除去することができる。Ｔ細胞は、生検によって腫瘍組織を除去した後に単離することができる。Ｔ細胞は、当技術分野で知られている任意の手段で単離することができる。１つの実施形態において、Ｔ細胞はアフェレーシスによって得られる。１つの実施形態において、方法は、当技術分野で知られている任意の好適な方法により、腫瘍試料からＴ細胞のバルク集団を得ることを含むことができる。例えば、Ｔ細胞のバルク集団は、腫瘍試料を細胞懸濁液に入れて解離させ、そこから特定の細胞集団を選択することにより、腫瘍試料からＴ細胞のバルク集団を取得することができる。Ｔ細胞のバルク集団を得る好適な方法としては、限定されるものではないが、腫瘍の機械的解離（例えば、細かく刻む）、腫瘍の酵素的解離（例えば、消化）、及び吸引（例えば、針によるもの）のうちの任意の１つ以上が挙げられる。
腫瘍試料から得られたＴ細胞のバルク集団は、任意の好適なタイプのＴ細胞を含むことができる。好ましくは、腫瘍試料から得られたＴ細胞のバルク集団は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。
腫瘍試料は、任意の哺乳類から得ることができる。別段の記載がない限り、本明細書で使用する場合、「哺乳類」という用語は、限定されるものではないが、Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ目（例えば、ウサギ）、Ｃａｒｎｉｎｖｏｒａ目（ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む）、Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目（ウシ科（ウシ）及びブタ科（ブタ）を含む）、またはＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目（ウマ科（ウマ）を含む）の哺乳類を含む任意の哺乳類を指す。哺乳類は、非ヒト霊長類、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ、Ｃｅｂｏｉｄ、もしくはＳｉｍｏｉｄ目（サル）、またはＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄ目（ヒト及び類人猿）であってもよい。哺乳類は、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳類（例えば、マウス及びハムスター）であってもよい。好ましくは、哺乳類は、非ヒト霊長類またはヒトである。特に好ましい哺乳類はヒトである。
Ｔ細胞は複数の供給源から得ることができ、これには末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、及び腫瘍が含まれる。本開示の１つの実施形態において、細胞は、当業者に知られている任意の数の分離技法（例えば、フィコール分離）を用いて、対象から採取した血液単位から得ることができる。好ましい１つの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む）を含む。１つの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、この後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。１つの実施形態において、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形態において、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠くことがあり、または全ての二価カチオンではないとしても多くの二価カチオンを欠くことがある。カルシウムの不在下での初期の活性化ステップにより、活性化が拡大される。当業者であれば容易に理解するであろうように、洗浄ステップは、当業者に知られている方法により、例えば、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を製造業者の指示に従って使用することにより、遂行することができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａフリー、ＭｇフリーＰＢＳに再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない構成要素を除去し、細胞を培養基に直接再懸濁させてもよい。
別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることにより、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心処理により、末梢血リンパ球から単離される。特定のＴ細胞のサブ集団（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤＣ、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）は、ポジティブまたはネガティブ選択技法によってさらに単離することができる。例えば、好ましい１つの実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち３×２８）－結合体化ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ、またはＸＣＹＴＥ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））を、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間期間にわたりインキュベートすることにより、単離される。１つの実施形態において、時間期間は約３０分である。さらなる実施形態において、時間期間は、３０分～３６時間またはそれ以上、及びこれらの値間の全ての整数値を範囲とする。さらなる実施形態において、時間期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい実施形態において、時間期間は１０～２４時間である。好ましい１つの実施形態において、インキュベーション時間期間は２４時間である。白血病の患者からＴ細胞を単離する場合、長い培養時間（例えば、２４時間）を使用することで、細胞の収量を高めることができる。他の細胞タイプに比べてＴ細胞が少ない任意の状況（例えば、腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際）では、より長いインキュベート時間をＴ細胞の単離に使用することができる。さらに、より長いインキュベート時間を使用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を高めることができる。
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択が行われた細胞にユニークな表面マーカーを対象とする抗体を組み合わせることによって遂行することができる。好ましい方法は、ネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択であり、これは、ネガティブ選択が行われた細胞に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。
さらに、単球集団（例えば、ＣＤ１４＋細胞）は、様々な方法（抗ＣＤ１４コーティングビーズもしくはカラム、または除去を促進するためのこれらの細胞の食作用の利用を含む）により、血液調製物から枯渇させることができる。したがって、１つの実施形態において、貪食性単球に飲み込まれるのに十分な大きさの常磁性粒子が使用される。１つの実施形態において、常磁性粒子は、市販のビーズ、例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓがＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）の商品名で製造しているビーズである。１つの実施形態において、他の非特異的な細胞は、常磁性粒子を「無関係な」タンパク質（例えば、血清タンパク質または抗体）でコーティングすることによって除去される。無関係なタンパク質及び抗体には、単離されるべきＴ細胞を特異的に標的としないタンパク質及び抗体またはそのフラグメントが含まれる。１つの実施形態において、無関係なビーズには、ヒツジ抗マウス抗体、ヤギ抗マウス抗体、及びヒト血清アルブミンでコーティングされたビーズが含まれる。
簡潔に説明すると、このような単球の枯渇は、全血、アフェレーシス末梢血、または腫瘍から単離したＴ細胞を、単球の除去を可能にする任意の量（およそ２０：１のビーズ：細胞の比）の１つ以上の種類の無関係なまたは非抗体結合常磁性粒子とともに、２２～３７℃で約３０分～２時間プレインキュベートし、続いて常磁性粒子に付着または吸い込まれた細胞を磁気除去することにより、実施される。このような分離は、当技術分野で利用可能な標準的な方法を用いて実施することができる。例えば、市販されている様々なものを含めて、任意の磁気分離方法を使用することができる（例えば、ＤＹＮＡＬ（登録商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＤＹＮＡＬ ＭＰＣ（登録商標）））。必須とする枯渇の保証は、枯渇の前後におけるＣＤ１４陽性細胞のフローサイトメトリー解析を含めて、当業者に知られている様々な方法によってモニターすることができる。
ポジティブまたはネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させてもよい。１つの実施形態においてに、細胞及びビーズが最大限接触するように、ビーズ及び細胞を混合する体積を著しく減らす（すなわち、細胞の濃度を高める）ことが望ましい場合がある。例えば、１つの態様において、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。１つの実施形態において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる実施形態において、１，０００万、１，５００万、２，０００万、２，５００万、３，０００万、３，５００万、４，０００万、４，５００万、または５，０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。また別の実施形態において、７，５００万、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、または１億細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度で使用することで、細胞収率の増加、細胞の活性化、細胞の拡大がもたらされ得る。さらに、高い細胞濃度を使用することで、目的の標的抗原（例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞）の発現が弱い可能性のある細胞の捕捉、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞の捕捉をより効率的に行うことが可能になる。このような細胞集団は治療的価値を持つ可能性があり、入手が望ましいと考えられる。例えば、高濃度の細胞を使用することで、ＣＤ２８の発現が通常は弱いＣＤ８＋Ｔ細胞をより効率的に選択することが可能になる。
関連する実施形態において、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を顕著に希釈することで、粒子と細胞間の相互作用を最小限に抑えることができる。これにより、粒子に結合する多量の目的抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞はより高いレベルのＣＤ２８を発現し、希薄な濃度ではＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。１つの実施形態において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の実施形態において、使用する濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、及びこれらの値間の任意の整数値であり得る。
また、Ｔ細胞は凍結してもよい。理論に束縛されるものではないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球を除去することにより、より均質の製品をもたらすことができる。血漿及び血小板を除去するための洗浄ステップの後に、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で知られており、この文脈では有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次に細胞を１分間に１℃の速度で－８０℃にして凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存することを含む。他の制御された凍結の方法も、直ちに－２０℃で凍結したり液体窒素中で凍結したりする制御されない凍結と同様に使用することができる。
Ｔ細胞は抗原特異的Ｔ細胞であってもよい。例えば、腫瘍特異的なＴ細胞を使用してもよい。抗原特異的Ｔ細胞は、目的の患者（例えば、がんまたは感染性疾患に罹患している患者）から単離することができる。１つの実施形態において、ネオエピトープを対象について決定し、これらの抗原に特異的なＴ細胞を単離する。また、拡大に使用するための抗原特異的細胞は、当技術分野で知られているあらゆる方法、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００４０２２４４０２号（表題：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ）、または米国特許第６，０４０，１７７号に記載の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することもできる。本明細書で使用するための抗原特異的細胞も、当技術分野で知られているあらゆる方法を用いて、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（いずれもＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓから出版）に記載のようにして生成することができる。
関連する実施形態において、１ラウンドまたは２ラウンドの拡大の前または後に、抗原特異的細胞を選別または別の形でポジティブ選択する（例えば、磁気選択を介して）ことが望ましいことがある。抗原特異的細胞の選別またはポジティブ選択は、ペプチド－ＭＨＣ四量体を用いて行うことができる（Ａｌｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｏｃｔ．４；２７４（５２８４）：９４－６）。別の実施形態において、適合性四量体技術アプローチが使用される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．７：８９１－９０２）。四量体は、事前の仮説に基づいて予測された結合ペプチドを利用する必要性と、特定のＨＬＡに限定されることとによる制限を受ける。ペプチド－ＭＨＣ四量体は、当技術分野で知られている技法を用いて生成することができ、本明細書に記載されているように、任意の目的のＭＨＣ分子及び任意の目的の抗原を用いて作製することができる。この文脈において使用されるべき特定のエピトープは、当技術分野で知られている多数のアッセイを用いて特定することができる。例えば、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、１２５Ｉ標識β２－ミクログロブリン（β２ｍ）のＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への組込みを促進する能力をモニタリングすることにより、間接的に評価することができる（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４を参照）。
１つの実施形態において、細胞を、フローサイトメトリーによる単離のためにエピトープ特異的試薬で直接標識し、次に表現型及びＴＣＲの特性決定を行う。１つの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞特異的抗体との接触によって単離される。抗原特異的Ｔ細胞、または一般的に任意の細胞の選別は、様々な市販のセルソーター（限定されるものではないが、ＭｏＦｌｏソーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏｌｏ．）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩ、及びＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ）を含む）のいずれかを用いて行うことができる。
好ましい実施形態において、方法は、ＣＤ３も発現する細胞を選択することを含む。方法は、任意の好適な方式で細胞を特異的に選択することを含むことができる。好ましくは、選択は、フローサイトメトリーを用いて行われる。フローサイトメトリーは、当技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて行うことができる。フローサイトメトリーは、任意の好適な抗体及び染色を用いることができる。好ましくは、抗体は、選択される特定のバイオマーカーを特異的に認識し、それに結合するように選択される。例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢ、またはＰＤ－１の特異的選択は、それぞれ抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗４－ｌＢＢ抗体、または抗ＰＤ－１抗体を用いて実施することができる。抗体（単数または複数）は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）または蛍光色素と結合体化することができる。好ましくは、フローサイトメトリーは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。Ｔ細胞上に発現するＴＣＲは、自己由来腫瘍に対する反応性に基づいて選択することができる。加えて、腫瘍に反応性のＴ細胞は、特許公開第ＷＯ２０１４１３３５６７号及び同第ＷＯ２０１４１３３５６８号（参照により全体として本明細書に援用される）に記載の方法を用いて、マーカーに基づいて選択することができる。加えて、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ１０７ａの表面発現に基づいて選択することができる。
１つの実施形態において、方法はさらに、濃縮された細胞集団のＴ細胞の数を拡大することを含む。このような方法は、米国特許第８，６３７，３０７号に記載されており、参照により全体として本明細書に援用される。Ｔ細胞の数は、少なくとも約３倍（または４、５、６、７、８、または９倍）増加することができ、より好ましくは少なくとも約１０倍（または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０倍）、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１０００倍、最も好ましくは少なくとも約１００，０００倍増加することができる。Ｔ細胞の数は、当技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて増やすことができる。細胞数を拡大する例示的な方法は、特許公開第ＷＯ２００３／０５７１７１号、米国特許第８，０３４，３３４号、及び米国特許公開第２０１２／０２４４１３３号に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に援用される。
１つの実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞拡大は、Ｔ細胞を単離し、続いて刺激または活性化し、次にさらに拡大することにより、実施することができる。１つの実施形態において、Ｔ細胞は、単一の薬剤によって刺激または活性化することができる。別の実施形態において、Ｔ細胞は、２つの薬剤で刺激または活性化される。一方は一次シグナルを誘導し、二次は共刺激シグナルである。単一のシグナルを刺激する、または一次シグナル及び二次シグナルを刺激するアクセサリー分子を刺激するのに有用なリガンドは、可溶な形態で使用することができる。リガンドは、細胞表面、人工多価シグナル伝達プラットフォーム（ＥＭＳＰ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）、または表面に固定化した状態で付着させることができる。好ましい実施形態において、一次剤及び二次剤の両方が、表面（例えば、ビーズまたは細胞）に共固定化される。１つの実施形態において、一次活性化シグナルを提供する分子はＣＤ３リガンドとすることができ、共刺激分子はＣＤ２８リガンドまたは４－１ＢＢリガンドとすることができる。
１つの実施形態において、ＣＡＲまたは外来性ＴＣＲを含むＴ細胞は、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１２００９６号に記載のように、ドナー対象から得られたリンパ球の集団を濃縮することと、活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、リンパ球の集団を１つ以上のＴ細胞刺激剤で刺激することであって、当該刺激が、無血清培養基を用いて閉鎖系で実施される、刺激することと、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、単一サイクルの形質導入を用いて、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターにより活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、当該形質導入が、無血清培養基を用いて閉鎖系で実施される、形質導入することと、操作されたＴ細胞の集団を産生するために、形質導入されたＴ細胞の集団を所定の時間の間拡大することであって、当該拡大が、無血清培養培養基を用いて閉鎖系で実施される、拡大することとを含む方法により、製造することができる。１つの実施形態において、ＣＡＲまたは外来性ＴＣＲを含むＴ細胞は、ＷＯ２０１５／１２００９６号に記載のように、リンパ球の集団を得ることと、活性化Ｔ細胞の集団を産生するために、リンパ球の集団を１つ以上の刺激剤で刺激することであって、当該刺激が、無血清培養基を用いて閉鎖系で実施される、刺激することと、形質導入されたＴ細胞の集団を産生するために、少なくとも１サイクルの形質導入を用いて、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターにより活性化Ｔ細胞の集団に形質導入することであって、当該形質導入が、無血清培養基を用いて閉鎖系で実施される、形質導入することと、操作されたＴ細胞の集団を産生するために、形質導入されたＴ細胞の集団を拡大することであって、当該拡大が、無血清培養培養基を用いて閉鎖系で実施される、拡大することとを含む方法により、製造することができる。形質導入したＴ細胞集団を拡大するための所定の時間は、３日であり得る。リンパ球集団を濃縮してから、操作されたＴ細胞を産生するまでの時間は６日であり得る。閉鎖システムは、クローズドバッグシステムであり得る。さらに、当該方法によって取得可能なまたは取得したＣＡＲまたは外来性ＴＣＲを含むＴ細胞集団、及びこのような細胞を含む医薬組成物が提供される。
１つの実施形態において、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの成熟または分化は、国際特許公開第ＷＯ２０１７／０７０３９５号に記載のような方法によって遅延または阻害することができ、当該方法は、Ｔ細胞療法を必要とする対象からの１つ以上のＴ細胞を、ＡＫＴ阻害剤（例えば、ＷＯ２０１７０７０３９５の請求項８で開示している１つの、または２つ以上の組合せのＡＫＴ阻害剤）と、外来性インターロイキン－７（ＩＬ－７）及び外来性インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のうちの少なくとも１つとに接触させることであって、得られたＴ細胞が成熟もしくは分化の遅延を示し、及び／または得られたＴ細胞が、ＡＫＴ阻害剤の不在下で培養されたＴ細胞のＴ細胞機能と比較して、Ｔ細胞機能の改善（例えば、Ｔ細胞増殖の増加、サイトカイン産生の増加、及び／または細胞溶解活性の増加）を示す、接触させることを含む。
Ｔ細胞療法を必要とする患者は、２００ｍｇ／ｍ２／日～２０００ｍｇ／ｍ２／日の用量のシクロホスファミドと、２０ｍｇ／ｍ２／日～９００ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビンの用量とを患者に投与することを含む、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１９１７５６号に記載のような方法によって条件付けることができる。
疾患
遺伝子疾患ならびに遺伝子的及び／またはエピジェネティックな側面を有する疾患
本発明の組成物、システム、またはその構成要素は、遺伝子疾患、または遺伝子的及び／またはエピジェネティックな側面を有する疾患の治療及び／または予防に使用することができる。本明細書で例示している遺伝子及び条件は網羅的なものではない。１つの実施形態において、遺伝子疾患を治療及び／または予防する方法は、組成物、システム、及び／またはその１つ以上の構成要素を対象に投与することを含むことができ、組成物、システム、及び／またはその１つ以上の構成要素は、対象の１つ以上の細胞において、遺伝子疾患または遺伝子的側面及び／またはエピジェネティック側面を有する疾患に関連する１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーを修飾することが可能である。１つの実施形態において、対象における遺伝子疾患または遺伝子的及び／もしくはエピジェネティックな側面を有する疾患に関連する１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーを修飾することは、対象における遺伝子疾患またはその症状を排除することができる。１つの実施形態において、対象における遺伝子疾患または遺伝子的及び／もしくはエピジェネティックな側面を有する疾患に関連する１つ以上の遺伝子の１つ以上のコピーを修飾することは、対象における遺伝子疾患またはその症状の重症度を低下させることができる。１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、遺伝子疾患を含む１つ以上の疾患、及び／または遺伝子的側面及び／またはエピジェネティックな側面を有するものに関連する１つ以上の遺伝子またはポリヌクレオチドを修飾することができ、このようなものには、限定されるものではないが、表４に記載の任意の１つ以上が含まれる。本明細書に記載の疾患及び関連遺伝子は、非網羅的かつ非限定的であることが理解されよう。さらに、いくつかの遺伝子は複数の疾患の発症に関与する。
Figure 2023544822000006
Figure 2023544822000007
Figure 2023544822000008
Figure 2023544822000009
Figure 2023544822000010
Figure 2023544822000011
Figure 2023544822000012
Figure 2023544822000013
Figure 2023544822000014
Figure 2023544822000015
Figure 2023544822000016
Figure 2023544822000017
Figure 2023544822000018
Figure 2023544822000019
Figure 2023544822000020
Figure 2023544822000021
Figure 2023544822000022
Figure 2023544822000023
Figure 2023544822000024
Figure 2023544822000025
Figure 2023544822000026
Figure 2023544822000027
Figure 2023544822000028
Figure 2023544822000029
Figure 2023544822000030
Figure 2023544822000031
Figure 2023544822000032
Figure 2023544822000033
Figure 2023544822000034
Figure 2023544822000035
Figure 2023544822000036
Figure 2023544822000037
Figure 2023544822000038
Figure 2023544822000039
Figure 2023544822000040
Figure 2023544822000041
Figure 2023544822000042
Figure 2023544822000043
Figure 2023544822000044
Figure 2023544822000045
Figure 2023544822000046
Figure 2023544822000047
Figure 2023544822000048
Figure 2023544822000049
Figure 2023544822000050
Figure 2023544822000051
Figure 2023544822000052
Figure 2023544822000053
１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素を使用して、表５のいずれか１つ以上の細胞機能に関連する１つ以上の遺伝子を修飾することにより、対象における疾患を治療または予防することができる。１つの実施形態において、疾患は遺伝子疾患または障害である。いくつかの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、１つ以上の遺伝子疾患に関連する１つ以上の遺伝子またはポリヌクレオチド（例えば、表５に記載のいずれか）を修飾し得る。
Figure 2023544822000054
Figure 2023544822000055
Figure 2023544822000056
Figure 2023544822000057
Figure 2023544822000058
Figure 2023544822000059
Figure 2023544822000060
Figure 2023544822000061
Figure 2023544822000062
Figure 2023544822000063
Figure 2023544822000064
Figure 2023544822000065
Figure 2023544822000066
Figure 2023544822000067
Figure 2023544822000068
Figure 2023544822000069
Figure 2023544822000070
Figure 2023544822000071
Figure 2023544822000072
Figure 2023544822000073
Figure 2023544822000074
Figure 2023544822000075
１つの実施形態において、本開示は、遺伝子疾患の個別化（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）または個別化（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ）治療を、このような治療を必要とする対象において行う方法であって、（ａ）組織、器官、もしくは細胞株においてｅｘ ｖｉｖｏで、またはトランスジェニック非ヒト哺乳類においてｉｎ ｖｉｖｏで１つ以上の変異を導入することであって、組織、器官、細胞または哺乳類の細胞（複数可）に、上記の実施形態のいずれか１つに記載の粒子送達システムまたは送達システムまたはウイルス粒子または上記実施形態のいずれか１つに記載の細胞を含む組成物を送達することを含み、特定の変異または精密な配列置換が、遺伝子疾患に相関する、または相関していた、導入することと、（ｂ）遺伝子疾患に相関する特異的変異または精密配列置換を有する、ベクターが送達された細胞に対して、遺伝子疾患に対する治療（複数可）を試験することと、（ｃ）ステップ（ｂ）の治療（複数可）の試験からの結果に基づいて対象を治療することとを含む、方法を提供する。
感染性疾患
１つの実施形態において、組成物、システム（複数可）、またはその構成要素（複数可）は、微生物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生体、またはこれらの組合せ）によって引き起こされる感染症の診断、予測、治療、及び／または予防に使用することができる。
１つの実施形態において、システム（複数可）またはその構成要素（複数可）は、混合集団内の特定の微生物を標的とすることが可能であり得る。このような技法の例示的な方法は、例えば、Ｇｏｍａａ ＡＡ，Ｋｌｕｍｐｅ ＨＥ，Ｌｕｏ ＭＬ，Ｓｅｌｌｅ Ｋ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ，Ｂｅｉｓｅｌ ＣＬ．２０１４．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ｍＢｉｏ ５：ｅ００９２８－１３；Ｃｉｔｏｒｉｋ ＲＪ，Ｍｉｍｅｅ Ｍ，Ｌｕ ＴＫ．２０１４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ｕｓｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：１１４１－１１４５で説明されており、これらの教示は、本明細書に記載の組成物、システム、及びその構成要素を伴う使用に適合させることができる。
１つの実施形態において、組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素は、病原性微生物及び／または薬剤抵抗性微生物（例えば、細菌、ウイルス、寄生体、及び真菌）を標的とすることが可能であり得る。１つの実施形態において、組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素は、病原性微生物中の１つ以上のポリヌクレオチドを標的化して修飾し、微生物が病原性を低下させ、殺滅され、阻害され、あるいは別の形で、宿主細胞において疾患を引き起こし、及び／または感染し、及び／または複製することが不可能であるようにすることが可能である。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数）が標的とする及び／または修飾することができる病原性細菌としては、限定されるものではないが、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂａｃｔｅｒｅｏｉｄｅｓ属（例えば、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂ．ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ、及びＢ．ｒｅｃｕｒｒｅｅｎｔｉｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属（例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、及びＢ．ｓｕｉｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属（例えば、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属（例えば、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ．Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃ．ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属（Ｅ．ｃａｎｉｓ及びＥ．ｃｈａｆｆｅｎｓｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属（例えば、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属（例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属（例えば、Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ、Ｌ．ｗｅｉｌｉｉ、Ｌ．ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｅｉａ属（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＮ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｎｏｃａｒｄｉａ属（例えば、Ｎ．ａｓｔｅｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属（Ｓ．ｔｙｐｈｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ及びＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、及びＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｕｒｅｅａｐｌａｓｍａ属（例えば、Ｕ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｖｉｂｒｉｏ属（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｅｎｔｅｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、及びＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の細菌が挙げられる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数）が標的とする及び／または修飾することができる病原性ウイルスとしては、限定されるものではないが、二重鎖ＤＮＡウイルス、部分二重鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス、または二重鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。１つの実施形態において、病原性ウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、アデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｅｓｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型）、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒトパピローマウイルス）、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、天然痘）、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｂ型肝炎）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、パルボウイルスＢ１９）、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒトアストロウイルス）、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ノーウォークウイルス）、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、株：重症急性呼吸器症候群ウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９））、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、風疹ウイルス）、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、インフルエンザウイルス）、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ラッサウイルス）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンターンウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、エボラウイルス及びマールブルグウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（狂犬病ウイルス）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、バンナウイルス）由来とすることができる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）が標的とする及び／または修飾することができる病原性真菌としては、限定されるものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（例えば、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属（例えば、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属（例えば、Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｅｃｉｉ）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ属（例えば、Ｓ．ｃｈａｒｔａｒｕｍ）が挙げられる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数）が標的とする及び／または修飾することができる病原性寄生体としては、限定されるものではないが、原生動物、蠕虫、及び外部寄生体が挙げられる。１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）が標的とする及び／または修飾することができる病原性原生動物としてはは、限定されるものではないが、Ｓａｒｃｏｄｉｎａ（例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａなどのアメーバ）、Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｇｉａｒｄｉａ及びＬｅｉｓｈｍａｎｉａなどの鞭毛虫）、Ｃｉｌｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｂａｌａｎｔｉｄｕｍなどの繊毛虫）、ならびに胞子虫（例えば、プラスモジウム及びクリプトスポリジウム）が挙げられる。１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数）が標的とする及び／または修飾することができる病原性蠕虫としてはは、限定されるものではないが、扁形動物（ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｓ）、鉤頭虫（ａｃａｎｔｈｏｃｅｅｐｈａｌｉｎｓ）、及び回虫（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）が挙げられる。１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）が標的とする及び／または修飾することができる病原性外部寄生体としては、限定されるものではないが、マダニ（ｔｉｃｋ）、ノミ、シラミ、及びコダニ（ｍｉｔｅ）が挙げられる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）が標的とする及び／または修飾することができる病原性寄生体としては、限定されるものではないが、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐｐ．、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｂａｂｅｓｉａ Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ、Ｂ．ｅｑｕｉ、Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｔｉ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ）、Ｂａｌａｎｔｉｄｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、Ｉｓｏｓｐｏｒｉａｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｃｕｒｔｉｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｗａｌｌｉｋｅｒｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｏｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｂｏｖｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、Ｔａｐｅｗｏｒｍ（例えば、Ｃｅｓｔｏｄａ、Ｔａｅｎｉａ ｍｕｌｔｉｃｅｐｓ、Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ、Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ ｓｐｐ．、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ、Ｅ．ｖｏｇｅｌｉ、Ｅ．ｏｌｉｇａｒｔｈｒｕｓ）、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、Ｂｅｒｔｉｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｂｅｒｔｉｅｌｌａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ、Ｂｅｒｔｉｅｌｌａ ｓｔｕｄｅｒｉ）、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ（例えば、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ ｅｒｉｎａｃｅｉｅｕｒｏｐａｅｉ）、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ；Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ）、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、Ｍｅｔｏｒｃｈｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｅｔｏｒｃｈｉｓ ｃｏｎｊｕｎｃｔｕｓ）、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｆｅｌｉｎｅｕｓ）、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｃａｌｉｅｎｓｉｓ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｋｅｌｌｉｃｏｔｔｉ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｓｋｒｊａｂｉｎｉ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｕｔｅｒｏｂｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍｅｋｏｎｇｉ、及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ）、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｅ．ｅｃｈｉｎａｔｕｍ）、Ｔｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ ｒｅｇｅｎｔ）、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、Ｎｅｃａｔｏｒ ｓｐｐ．（例えば、Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｐｐ．、Ａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ）、Ｂｒｕｇｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ、Ｂｒｕｇｉａ ｔｉｍｏｒｉ）、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ ｒｅｎａｌｅ）、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｇｒｅｇｏｒｉｉ）、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｈｉｓｐｉｄｕｍ）、Ｈａｌｉｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｈａｌｉｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、Ｌｏａ ｌｏａ ｓｐｐ．（例えば、Ｌｏａ ｌｏａ ｆｉｌａｒｉａ）、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｅｒｃａ）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｓｐｐ．（例えば、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、Ｔｈｅｌａｚｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｈｅｌａｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｌａｚｉａ ｃａｌｌｉｐａｅｄａ）、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ ｌｅｏｎｉｎｅ）、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｂｒｉｔｏｖｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎｅｌｓｏｎｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎａｔｉｖａ）、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｖｕｌｐｉｓ）、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｔｕｎｇａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｕｎｇａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｅｒｒａｔａ）、Ａｒｃｈｉａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ ｓｐ．、Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｓｐ．（例えば、Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ）、Ｐｔｈｉｒｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、Ａｒａｃｈｎｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌｉｄａｅ、Ｉｘｏｄｉｄａｅ、Ａｒｇａｓｉｄｅ）、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ ｓｐｐ（例えば、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ：Ｐｕｌｉｃｉｎａｅ）、Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ ｓｐｐ．（例えば、Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ 及びＣｉｍｅｘ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）、Ｄｉｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、Ｄｅｍｏｄｅｘ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｅｍｏｄｅｘ ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｒｕｍ／ｂｒｅｖｉｓ／ｃａｎｉｓ）、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ）、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｓｙｌｖｉａｒｕｍ、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｂｕｒｓａ、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｂａｃｏｔｉ）、Ｌａｅｌａｐｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｌａｅｌａｐｓ ｅｃｈｉｄｎｉｎａ）、Ｌｉｐｏｎｙｓｓｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｌｉｐｏｎｙｓｓｏｉｄｅｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）が挙げられる。
１つの実施形態において、遺伝子標的は、Ｓｔｒｉｃｈ ａｎｄ Ｃｈｅｒｔｏｗ．２０１９．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．５７：４ ｅ０１３０７－１８（当該文献は、あたかも全体として本明細書で表現されているかのように、参照により本明細書に援用される）の表１に記載のもののいずれかであってもよい。
１つの実施形態において、方法は、組成物、システム、及び／またはその構成要素を本明細書に記載の病原性生物に送達することと、組成物、システム、及び／またはその構成要素を病原性生物内の１つ以上の標的に特異的に結合及び修飾させることにより、当該修飾が病原性生物を殺滅する、阻害する、病原性生物の病原性を低減する、または別の方法で病原性生物の病原性を非病原性にすることを含むことができる。１つの実施形態において、組成物、システムの送達は、ｉｎ ｖｉｖｏで（すなわち、治療されている対象で）行われる。１つの実施形態において、送達は、対象に対し非病原性であるが、ポリヌクレオチドの移行及び／または病原性微生物への感染が可能な中間体（例えば、微生物またはファージ）によって行われる。１つの実施形態において、中間微生物は、組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）、及び／またはベクター及び／またはベクターシステムを含む操作された細菌、ウイルス、またはファージとすることができる。方法は、組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素（複数可）、及び／またはベクター及び／またはベクターシステムを含む中間微生物を、治療されるべき対象に投与することを含むことができる。次に、中間微生物は、システム及び／またはその構成要素を産生したり、あるいは組成物、システム、ポリヌクレオチドを病原性生物に移行したりすることができる。諸実施形態において、システム及び／またはその構成要素、ベクター、あるいはベクターシステムが病原性微生物に移入される場合、次に組成物、システム、またはその構成要素は、病原性微生物内で産生され、病原性微生物を修飾して、病原性が低くなる、殺滅される、阻害されるようにするか、あるいは別の方法で、疾患を引き起こすこと及び／またはその宿主または細胞において感染及び／または複製することを不可能にする。
１つの実施形態において、病原性微生物がその遺伝子材料を宿主細胞のゲノム内に挿入する場合（例えば、ウイルス）、組成物、システムは、宿主細胞の機構によって機能的ウイルス内でウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡを複製できないように宿主細胞のゲノムを修飾するように設計することができる。１つの実施形態において、病原性微生物がその遺伝子材料を宿主細胞のゲノムに挿入する場合（例えば、ウイルス）、組成物、システムは、宿主細胞のゲノムからウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡが削除されるように宿主細胞のゲノムを修飾するように設計することができる。
病原性微生物を阻害または殺滅することで、その感染が対象内で引き起こす疾患及び／または状態が治療または予防され得ることが理解されよう。したがって、本明細書では、任意の１つ以上の病原性微生物（例えば、本明細書に記載の任意の病原性微生物）によって引き起こされる１つ以上の疾患またはその症状を治療及び／または予防する方法も提供される。
ミトコンドリア病
最も困難なミトコンドリア障害のいくつかは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）（母性遺伝する高コピー数のゲノム）の変異によって生じる。１つの実施形態において、ｍｔＤＮＡ変異は、本明細書に記載の組成物、システムを用いて修飾することができる。１つの実施形態において、診断、予測、治療、及び／または予防することができるミトコンドリア病は、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアミオパチー脳症、及び乳酸アシドーシス及び脳卒中様エピソード）、ＣＰＥＯ／ＰＥＯ（慢性進行性外眼筋麻痺症候群／進行性外眼筋麻痺）、ＫＳＳ（カーンズ・セイアー症候群）、ＭＩＤＤ（母系遺伝性糖尿病及び難聴）、ＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）、ＮＩＤＤＭ（非インスリン依存性糖尿病）、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経萎縮症、ＬＳ（リー症候群）、アミノグリコシド誘導性聴覚障害、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、及び色素性網膜症）、アキネジア硬直、精神障害、及びＳＮＨＬを伴う錐体外路障害、非症候性難聴、心筋症、脳筋症、ピアソン症候群、またはこれらの組合せであり得る。
１つの実施形態において、対象のｍｔＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで修飾することができる。１つの実施形態において、ｍｔＤＮＡがｅｘ ｖｉｖｏで修飾される場合、修飾後、修飾されたミトコンドリアを含む細胞を対象に投与して戻すことができる。１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、ｍｔＤＮＡ変異またはその組合せを補正することが可能であり得る。
１つの実施形態において、１つ以上のｍｔＤＮＡ変異のうちの少なくとも１つ以上が、Ａ３２４３Ｇ、Ｃ３２５６Ｔ、Ｔ３２７１Ｃ、Ｇ１０１９Ａ、Ａ１３０４Ｔ、Ａ１５５３３Ｇ、Ｃ１４９４Ｔ、Ｃ４４６７Ａ、Ｔ１６５８Ｃ、Ｇ１２３１５Ａ、Ａ３４２１Ｇ、Ａ８３４４Ｇ、Ｔ８３５６Ｃ、Ｇ８３６３Ａ、Ａ１３０４２Ｔ、Ｔ３２００Ｃ、Ｇ３２４２Ａ、Ａ３２５２Ｇ、Ｔ３２６４Ｃ、Ｇ３３１６Ａ、Ｔ３３９４Ｃ、Ｔ１４５７７Ｃ、Ａ４８３３Ｇ、Ｇ３４６０Ａ、Ｇ９８０４Ａ、Ｇ１１７７８Ａ、Ｇ１４４５９Ａ、Ａ１４４８４Ｇ、Ｇ１５２５７Ａ、Ｔ８９９３Ｃ、Ｔ８９９３Ｇ、Ｇ１０１９７Ａ、Ｇ１３５１３Ａ、Ｔ１０９５Ｃ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５５５Ｇ、Ｇ１５４１Ａ、Ｃ１６３４Ｔ、Ａ３２６０Ｇ、Ａ４２６９Ｇ、Ｔ７５８７Ｃ、Ａ８２９６Ｇ、Ａ８３４８Ｇ、Ｇ８３６３Ａ、Ｔ９９５７Ｃ、Ｔ９９９７Ｃ、Ｇ１２１９２Ａ、Ｃ１２２９７Ｔ、Ａ１４４８４Ｇ、Ｇ１５０５９Ａ、位置３０５－３１４及び／または９５６－９６５におけるＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣ－タンデムリピートの重複、８，４６９～１３，４４７、４，３０８～１４，８７４、及び／または４，３９８～１４，８２２の位置における欠失、９６１ｉｎｓ／ｄｅｌＣ、ミトコンドリア共通欠失（例えば、ｍｔＤＮＡ ４，９７７ｂｐ欠失）、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される。
１つの実施形態において、ミトコンドリア変異は、Ｍｉｔｏｍａｐに記載の、またはそこで利用可能な１つ以上のバイオインフォマティックツール（ｍｉｔｏｍａｐ．ｏｒｇで利用可能）の使用によって特定される、任意の変異であり得る。このようなツールとしては、限定されるものではないが、「Ｖａｒｉａｎｔ Ｓｅａｒｃｈ（別名Ｍａｒｋｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ）」、「Ｆｉｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ａｎｙ Ｈａｐｌｏｇｒｏｕｐ（別名「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｉｎｄｅｒ」）、「Ｖａｒｉａｎｔ Ｉｎｆｏ」、「ＰＯＬＧ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒ」、「ＭＩＴＯＭＡＳＴＥＲ」、「Ａｌｌｅｌｅ Ｓｅａｒｃｈ」、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ」、「Ｄａｔａ Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ」が挙げられる。ＭｉｔｏＭａｐは、疾患と関連する可能性があるｍｔＤＮＡの変異の報告を含み、報告されたミトコンドリアＤＮＡ塩基置換疾患：ｒＲＮＡ／ｔＲＮＡ変異のデータベースを管理している。
１つの実施形態において、方法は、組成物、システム、及び／またはその構成要素を細胞に、より具体的には細胞内の１つ以上のミトコンドリアに送達することと、組成物、システム、及び／またはその構成要素が、細胞内の、より具体的には細胞内の１つ以上のミトコンドリアにおける１つ以上の標的ポリヌクレオチドの修飾を可能にすることとを含む。標的ポリヌクレオチドは、ｍｔＤＮＡにおける変異（例えば、本明細書に記載のいずれか１つ以上）に対応することができる。１つの実施形態において、修飾は、ミトコンドリアが正常に機能するように、または少なくとも、修飾されていないミトコンドリアと比較して機能不全が少ないように、ミトコンドリアの機能を改変することができる。修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。修飾がｅｘ ｖｉｖｏで実施される場合、修飾ミトコンドリアを含む細胞は、自己または同種異系の方式で、それを必要とする対象に投与することができる。
マイクロバイオーム修飾
マイクロバイオームは、健康及び疾患において重要な役割を担う。例えば、腸マイクロバイオームは、消化の制御、病原性微生物の成長の防止により、健康に関与することができ、また、気分及び感情に影響を及ぼすことが示唆されている。不均衡なマイクロバイオームは疾患を促進する恐れがあり、また、体重増加、血糖値の非調節、高コレステロール、がん、及び他の障害に寄与することが示唆されている。健康なマイクロバイオームは、不健康な個体と区別され得る一連の共同特性を有するため、疾患に関連するマイクロバイオームの検出及び特定を、個体における疾患の診断及び検出に使用することができる。組成物、システム、及びその構成要素は、マイクロバイオーム細胞集団のスクリーニングに使用することができ、また、疾患に関連するマイクロバイオームの特性に使用することがもできる。組成物、システム、及びその構成要素を利用した細胞スクリーニング方法は、本明細書の他の箇所に記載されており、マイクロバイオーム（例えば、対象の腸、皮膚、膣、及び／または口腔マイクロバイオーム）のスクリーニングに適用することができる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、及び／またはその構成要素を用いて、対象におけるマイクロバイオームの微生物集団を修飾することができる。１つの実施形態において、組成物、システム、及び／またはその構成要素を使用して、マイクロバイオーム内の１つ以上の細胞タイプを識別及び選択し、マイクロバイオーム集団からそれらを除去するために使用することができる。組成物、システム、及び／またはその構成要素を用いて細胞を選択する例示的な方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。このようにして、マイクロバイオームの構成や微生物プロファイルを改変することができる。１つの実施形態において、改変は、疾患マイクロバイオーム組成物から健康マイクロバイオーム組成物への変化を引き起こす。このようにして、あるタイプまたは種の微生物と別の微生物との比率を、病的な比率から健康な比率に変更することができる。１つの実施形態において、選択される細胞は病原性微生物である。
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物及びシステムは、対象におけるマイクロバイオームの微生物におけるポリヌクレオチドを修飾するために使用することができる。１つの実施形態において、微生物は病原性微生物である。１つの実施形態において、微生物は、常在性かつ非病原性の微生物である。対象の細胞内のポリヌクレオチドを修飾する方法は、本明細書の他の箇所に記載されており、これらの実施形態に適用することができる。
疾患及び状態のモデル
１つの態様において、本開示は、真核生物または非ヒト生物におけるゲノム座位に関連する疾患をモデル化する方法であって、当該ゲノム座位のコード、非コード、または調節エレメント内の標的配列の操作を含み、非天然のまたは操作された組成物を送達することを含み、組成物、その発現のために組成物を作用可能にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクターを含み、組成物が、粒子送達システムまたは送達システムまたは上記の実施形態のいずれか１つに記載のウイルス粒子または上記の実施形態のいずれか１つに記載の細胞を含む、方法を提供する。
１つの態様において、本開示は、１つ以上の変異した疾患遺伝子及び／または感染性微生物を含むことができるモデル真核細胞を生成する方法を提供する。１つの実施形態において、疾患遺伝子とは、疾患を有するか、またはそれを発症するリスクの上昇に関連する任意の遺伝子のことである。１つの実施形態において、方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞内に導入することであって、１つ以上のベクターが、組成物、システム、及び／またはその構成要素、及び／または組成物、システム、及び／またはその構成要素の発現を駆動することが可能なベクターまたはベクターシステム（限定されるものではないが、ｔｒａｃｒメイト配列に作用可能に連結したガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、１つ以上のＣａｓエフェクター、及びこれらの組合せ）を含む、導入することと、（ｂ）例えば、当該疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断、ニッキング、または他の修飾をもたらすために、組成物、システム、または複合体を１つ以上の標的ポリヌクレオチドに結合させることであって、組成物、システム、または複合体が、（１）標的ポリヌクレオチド（複数可）内の標的配列（複数可）とハイブリダイズする１つ以上のガイド配列、及び任意選択で（２）ｔｒａｃｒ配列（複数可）とハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列（複数可）、と複合体化した１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターから構成されている、結合させることとを含み、それにより、１つ以上の変異した疾患遺伝子（複数可）を含むモデル真核細胞を生成する。したがって、１つの実施形態において、組成物及びシステムは、Ｃａｓエフェクター、ｔｒａｃｒメイト配列に連結したガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列、及び／または相同組換え鋳型、及び／または安定化リガンド（Ｃａｓエフェクターが不安定化ドメインを有する場合）のうちの１つ以上のための核酸分子を含み、その発現を駆動する。１つの実施形態において、当該切断は、Ｃａｓエフェクター（複数可）によって標的配列の位置で１本または２本の鎖を切断することを含む。１つの実施形態において、ニッキングは、Ｃａｓエフェクター（複数可）によって標的配列の位置で１本または２本の鎖をニッキングすることを含む。１つの実施形態において、当該切断またはニッキングは、標的ポリヌクレオチドの修飾された転写をもたらす。１つの実施形態において、修飾は、標的ポリヌクレオチドの転写の減少をもたらす。１つの実施形態において、方法はさらに、組換え鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって当該切断またはニックされた標的ポリヌクレオチドを修復することを含み、当該修復は、当該標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。１つの実施形態において、当該変異は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質に１つ以上のアミノ酸の変化をもたらす。
モデル化される疾患は、遺伝子的またはエピジェネティックな構成要素を有する任意の疾患とすることができる。１つの実施形態において、モデル化される疾患は、本明細書の他の箇所で論じされている任意の疾患とすることができ、これには限定されるものではないが、本明細書の表４及び５に記載の疾患が含まれる。
ｉｎ ｓｉｔｕ疾患検出
組成物、システム、及び／またはその構成要素は、診断的検出方法、例えば、ＣＡＳＦＩＳＨ（例えば、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１２（３８）：１１８７０－１１８７５を参照）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｌｉｖｅ ＦＩＳＨ（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６５（６４５９）：１３０１－１３０５を参照）、ｓｍ－ＦＩＳＨ（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｊｅｆｃｏａｔｅ．２０１７．Ｆｒｏｎｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｅｎｄｏ．２０１７．００２８９）、連続的ＦＩＳＨ ＣＲＩＳＰＲａｉｎｂｏｗ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３４（２０１６），ｐｐ．５２８－５３０）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｓｉｒｉｕｓ（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５（２０１８），ｐｐ．９２８－９３１）、Ｃａｓｉｌｉｏ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２６（２０１６），ｐｐ．２５４－２５７）、Ｈａｌｏ－タグベースのゲノム座位可視化技法（例えば、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１２（３８）：１１８７０－１１８７５；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５０（２０１５），ｐｐ．８２３－８２６）、ＲＮＡ－アプタマーベースの方法（例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２１４（２０１６），ｐｐ．５２９－５３７）、分子ビーコン法（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１００（２０１６），ｐｐ．１７２－１８３；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１８））、量子ドットベースシステム（例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８９（２０１７），ｐｐ．１２８９６－１２９０１）、多重化法（例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１２（２０１５），ｐｐ．３００２－３００７；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，７（２０１６），ｐ．１１７０７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３４（２０１６），ｐｐ．５２８－５３０；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４４（２０１６），Ａｒｔｉｃｌｅ ｅ８６）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，６（２０１６），ｐ．２６８５７）、ｃ、及び他のｉｎ ｓｉｔｕ ＣＲＩＳＰＲ－ハイブリダイゼーションベースの方法（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５５（２０１３），ｐｐ．１４７９－１４９１；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９（２０１８），ｐｐ．１０５０－１０５５；Ｔａｎｅｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，１５９（２０１４），ｐｐ．６３５－６４６；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，８（２０１７），ｐｐ．８５３－８５５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，９（２０１８），ｐ．５０６５；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ（２０１７）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，７（２０１６），ｐ．１１７０７；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４４（２０１６），Ａｒｔｉｃｌｅ ｅ８６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，６（２０１６），ｐ．２６８５７）における方法に使用することができ、これらの全ては、あたかも全体として表現されているかのように参照により本明細書に援用され、これらの教示は、本明細書の説明に鑑みて、本明細書に記載の組成物、システム、及びその構成要素に適合させることができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、検出方法（例えば、本明細書に記載のｉｎ ｓｉｔｕ検出方法）で使用することができる。１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素は、本明細書に記載の触媒的に不活性のＣａｓエフェクターを含み、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの検出方法または本明細書に記載の任意の他の方法でこのシステムを使用することができる。１つの実施形態において、ＤＮＡ二重鎖切断をもたらす能力を欠いた不活性化Ｃａｓエフェクターは、マーカー（例えば、蛍光タンパク質、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＥＧＦＰ））と融合し、小ガイドＲＮＡと共発現して、ｉｎ ｖｉｖｏで中心周囲、中心、及びテロメアのリピートを標的とすることができる。ｄＣａｓエフェクターまたはそのシステムを使用して、ヒトゲノムにおける反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化することができる。標識化ｄＣａｓエフェクター及びその組成物、システムのこのような新しい用途は、特に核の体積が小さい場合や複雑な３Ｄ構造を伴う場合に、細胞のイメージング及び機能的な核アーキテクチャーの研究に重要であり得る。
細胞選択
１つの実施形態において、本明細書に記載の組成物、システム、及び／またはその構成要素は、細胞をスクリーニング及び／または選択する方法で使用することができる。１つの実施形態において、組成、システムに基づくスクリーニング／選択方法を使用して、細胞集団内で疾患細胞を特定することができる。１つの実施形態において、細胞の選択は、選択された細胞が死ぬような細胞の修飾をもたらす。このようにして、疾患細胞を特定し、健康な細胞集団から除去することができる。１つの実施形態において、疾患細胞は、がん細胞、前がん細胞、ウイルスもしくは他の病原性生物に感染した細胞、または他の異常細胞とすることができる。１つの実施形態において、修飾は、所望の細胞の選択を容易にする、選択されるべき細胞における別の検出可能な変化（例えば、機能的変化及び／またはゲノムバーコード）を付与することができる。１つの実施形態において、ネガティブ選択スキームを使用して所望の細胞集団を得ることができる。これらの実施形態において、選択されるべき細胞は修飾されているため、細胞に付与された検出可能な変化に基づいて、その死または識別または選別に基づいて細胞集団から除去することができる。したがって、これらの実施形態において、選択後に残った細胞が、所望の細胞集団となる。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチド修飾を含む１つ以上の細胞（複数可）を選択する方法は、１つ以上の組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素、及び／またはベクターもしくはベクターシステムを細胞（複数可）内に導入することを含むことができ、組成物、システム（複数可）、及び／またはその構成要素、及び／またはベクターもしくはベクターシステムは、Ｃａｓエフェクター、ｔｒａｃｒメイト配列に任意選択で連結したガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、及び組換え鋳型のうちの１つ以上を含むか、またはそれを発現することが可能であり、例えば、発現されるものは、組成物、システム、ベクターまたはベクターシステムによってｉｎ ｖｉｖｏで発現され、
及び／または組換え鋳型は、Ｃａｓエフェクターの切断を無効にする１つ以上の変異を含み、選択されるべき細胞（複数可）において組換え鋳型の標的ポリヌクレオチドとの相同組換えを可能にし、組成物、システム、または複合体が標的ポリヌクレオチドに結合して、当該遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすことを可能にし、
ＡＡＶ複合体は、Ｃａｓエフェクターを含み、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリッドされるガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列と複合体化し、複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合が細胞死を誘導するか、細胞に他の何らかの検出可能な変化を付与して、１つ以上の変異が導入された１つ以上の細胞（複数可）が選択されるようにする。１つの実施形態において、選択されるべき細胞は、真核細胞とすることができる。１つの実施形態において、選択されるべき細胞は、原核細胞とすることができる。本明細書の方法を介した特定の細胞の選択は、選択マーカー、または対抗選択システムを含む可能性のある２段階のプロセスを必要とせずに実施することができる。
治療剤の開発
本明細書に記載の組成物、システム、及びその構成要素を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベース及び非ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースの生物学的活性薬剤（例えば、低分子治療薬）を開発することができる。したがって、本明細書では、疾患及び／または疾患遺伝子に関連する細胞機能及び／またはシグナル伝達事象を調節する生物学的活性薬剤を開発するための方法について説明する。１つの実施形態において、方法は、（ａ）試験化合物を、疾患細胞及び／または疾患遺伝子細胞を含む細胞に接触させることと、（ｂ）当該疾患または疾患遺伝子に関連する細胞シグナル事象または他の細胞の機能性の低下または増大を示す表示の変化を検出して、当該細胞シグナル事象または当該疾患遺伝子に関連する他の機能性を調節する当該生物学的活性薬剤を開発することとを含む。１つの実施形態において、疾患細胞は、本明細書の他の箇所に記載されているモデル細胞である。１つの実施形態において、疾患細胞は、治療を必要とする対象から単離された疾患細胞である。１つの実施形態において、試験化合物は低分子薬剤である。１つの実施形態において、試験化合物は低分子薬剤である。１つの実施形態において、試験化合物は生物学的分子薬剤である。
１つの実施形態において、方法は、本明細書に記載の組成物、システムに基づく治療薬を開発することを含む。特定の実施形態において、治療薬は、目的の標的配列にハイブリダイズすることが可能なＣａｓエフェクター及び／またはガイドＲＮＡを含む。特定の実施形態において、治療薬は、ベクターまたはベクターシステムであって、ａ）Ｃａｓエフェクタータンパク質（複数可）をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した第１の調節エレメントと、ｂ）ガイド配列、ダイレクトリピート配列を含むガイドＲＮＡを含む１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作用可能に連結した第２の調節エレメントとを含むことができる、ベクターまたはベクターシステムであり、構成要素（ａ）及び（ｂ）は同じまたは異なるベクター上に位置する。特定の実施形態において、生物学的活性薬剤は、組成物、システム、もしくはその構成要素、及び／または当該構成要素を含むもしくはコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列、ベクター、もしくはベクターシステムを細胞内に送達するように作用可能に構成され、本明細書の組成物及びシステムの構成要素と複合体を形成することが可能であり、当該複合体が細胞内で動作可能である、送達システムを含む組成物である。１つの実施形態において、複合体は、本明細書に記載のＣａｓエフェクタータンパク質（複数可）、ガイド配列を含むガイドＲＮＡ、及びダイレクトリピート配列を含むことができる。任意のこのような組成物において、送達システムは、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、バイオリスティックシステム、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸結合体、もしくは人工ビリオン、または本明細書に記載の任意の他のシステムであり得る。特定の実施形態において、送達は、粒子、ナノ粒子、脂質、または細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を介して行われる。
また、本明細書では、組成物、システム、任意選択で組成物、システムに基づいた療法または治療薬を開発または設計するための方法であって、（ａ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、及び当該選択した標的部位から標的部位をサブ選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、サブ選択すること、または（ｂ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、もしくは目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、選択すること、及び任意選択で、集団を治療するか、もしくは別の形で調節または操作するために必要な、（サブ）選択された標的部位の数を推定すること、及び任意選択で、個々の対象に対し（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を検証すること、任意選択で当該（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を認識する１つ以上のｇＲＮＡを設計すること、を含む方法について説明する。
１つの実施形態において、組成物、システム、任意選択で組成物、システムに基づいた療法または治療薬に使用するための、ｇＲＮＡを開発または設計する方法は、（ａ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、及び当該選択した標的部位から標的部位をサブ選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、サブ選択すること、または（ｂ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、もしくは目的の（治療）座位としてＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、選択すること、及び任意選択で、集団を治療するか、もしくは別の形で調節または操作するために必要な、（サブ）選択された標的部位の数を推定すること、任意選択で、個々の対象に対し（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を検証すること、任意選択で当該（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を認識する１つ以上のｇＲＮＡを設計すること、を含むことができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、任意選択で集団内での組成物、システムに基づいた療法または治療薬を開発または設計するための方法は、（ａ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、及び当該選択した標的部位から標的部位をサブ選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、サブ選択すること、または（ｂ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、もしくは目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、選択すること、及び任意選択で、集団を治療するか、もしくは別の形で調節または操作するために必要な、（サブ）選択された標的部位の数を推定すること、任意選択で、個々の対象に対し（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を検証すること、任意選択で当該（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を認識する１つ以上のｇＲＮＡを設計すること、を含むことができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、任意選択で集団内での組成物、システムに基づいた療法または治療薬に使用するための、ｇＲＮＡを開発または設計するための方法は、（ａ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、及び当該選択した標的部位から標的部位をサブ選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、サブ選択すること、または（ｂ）目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位が、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する、選択すること、もしくは目的の（治療）座位としてｇＲＮＡ標的部位を選択することであって、当該標的部位に対し誘導されたｇＲＮＡが、当該集団全体にわたる最小数のオフターゲット部位を認識する、選択すること、及び任意選択で、集団を治療するか、もしくは別の形で調節または操作するために必要な、（サブ）選択された標的部位の数を推定すること、任意選択で、個々の対象に対し（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を検証すること、任意選択で当該（サブ）選択された標的部位のうちの１つ以上を認識する１つ以上のｇＲＮＡを設計すること、を含むことができる。
１つの実施形態において、組成物、システム、任意選択で集団における組成物、システムに基づいた療法または治療薬などの組成物、システム、任意選択で集団における組成物、システム、ベースの療法または治療薬で使用するためのｇＲＮＡを開発または設計するための方法は、標的集団における１つ以上の座位に対する標的配列セットを選択することであって、標的配列が、標的集団における閾値アレル頻度を超えて生じるバリアントを含まない（すなわち、プラチナ標的配列）、選択することと、当該選択された（プラチナ）標的配列から、（セット内の他の（プラチナ）標的と比較して）高い頻度のオフターゲット候補を有する標的配列を除去して、最終標的配列セットを定義することと、最終標的配列セットに基づいて、１つ以上の、例えば組成物のセット、システムを準備することであって、任意選択で、準備されるＣＲＩＳＰ－Ｃａｓシステムの数を標的集団のサイズに（少なくとも一部）基づく、準備することとを含むことができる。
１つの実施形態において、オフターゲット候補／オフターゲット、ＰＡＭ制限性、標的切断効率、またはエフェクタータンパク質特異性は、本明細書の他の箇所で説明しているようなシークエンシングベースの二重鎖切断（ＤＳＢ）検出アッセイを用いて特定または決定される。１つの実施形態において、オフターゲット候補／オフターゲットは、本明細書の他の箇所で説明しているようなシークエンシングベースの二重鎖切断（ＤＳＢ）検出アッセイを用いて特定または決定される。１つの実施形態において、オフターゲット、またはオフターゲット候補は、少なくとも１つ、好ましくは１～３つのミスマッチまたは（遠位）ＰＡＭミスマッチ、例えば１つ以上、例えば１、２、３、またはそれ以上の（遠位）ＰＡＭマスマッチを有する。１つの実施形態において、シークエンシングベースのＤＳＢ検出アッセイは、本明細書の他の箇所に記載のように、プライマー結合部位を含むアダプターでＤＳＢの部位を標識することと、バーコードまたは固有の分子識別子、またはこれらの組合せでＤＳＢの部位を標識することとを含む。
ｇＲＮＡのガイド配列は、標的部位と１００％相補的であり、すなわち、標的部位とのいかなるミスマッチも含まないことが理解されよう。ｇＲＮＡによる（オフ）ターゲット部位の「認識」が、組成物、システム、機能性を前提とすること、すなわち、ｇＲＮＡによって（オフ）ターゲット部位が認識されるのは、ｇＲＮＡの（オフ）ターゲット部位との結合が組成物、システム、活性（例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の誘導、転写調節など）につながる場合のみであることが、さらに理解されるであろう。
１つの実施形態において、集団全体で最小限の配列バリエーションを有する標的部位は、集団の少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％で配列バリエーションが存在しないことを特徴とする。１つの実施形態において、標的位置の最適化は、集団の少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％で配列バリエーションが存在しない標的配列または座位を選択することを含む。これらの標的は、本明細書の他の箇所では「プラチナ標的」とも称される。１つの実施形態において、当該集団は、少なくとも１０００個体、例えば少なくとも５０００個体、例えば少なくとも１００００個体、例えば少なくとも５００００個体を含む。
１つの実施形態において、オフターゲット部位は、オフターゲット部位とｇＲＮＡとの間の少なくとも１つのミスマッチによって特徴付けられる。１つの実施形態において、オフターゲット部位は、オフターゲット部位とｇＲＮＡとの間の最大５つ、好ましくは最大４つ、より好ましくは最大３つのミスマッチによって特徴付けられる。１つの実施形態において、オフターゲット部位は、オフターゲット部位とｇＲＮＡとの間の少なくとも１つのミスマッチ、かつオフターゲット部位とｇＲＮＡとの間の最大５つ、好ましくは最大４つ、より好ましくは最大３つのミスマッチによって特徴付けられる。
１つの実施形態において、当該集団全体におけるオフターゲット部位の当該最小数は、当該集団における高頻度のハプロタイプについて決定される。１つの実施形態において、当該集団全体のオフターゲット部位の当該最小数は、当該集団におけるオフターゲット部位座位の高頻度のハプロタイプについて決定される。１つの実施形態において、当該集団全体のオフターゲットサイトの当該最小数は、当該集団における標的部位座位の高頻度のハプロタイプについて決定される。１つの実施形態において、高頻度ハプロタイプは、集団の少なくとも０．１％に発生することによって特徴付けられる。
１つの実施形態において、集団の治療に必要な（サブ）選択された標的部位の数は、低頻度配列バリエーション（例えば、大規模なシークエンシングデータセットに取り込まれた低頻度配列バリエーション）に基づいて推定される。１つの実施形態において、所与のサイズの集団の治療に必要な（サブ）選択された標的部位の数が推定される。
１つの実施形態において、方法はさらに、治療されるべき対象のゲノムシークエンシングデータを得ることと、組成物、システムのセットから選択される組成物、システムで対象を治療することであって、選択される組成物、システムが個体のゲノムシークエンシングデータに（少なくとも部分的に）基づく、治療することとを含む。１つの実施形態において、（（サブ）選択）標的は、ゲノムシークエンシング、好ましくは全ゲノムシークエンシングによって検証される。
１つの実施形態において、本明細書に記載の標的配列または座位は、１つ以上のパラメーター、例えば、ＰＡＭタイプ（天然または修飾）、ＰＡＭヌクレオチド含有量、ＰＡＭ長、標的配列長、ＰＡＭ制限性、標的切断効率、及び遺伝子、座位または他のゲノム領域内の標的配列位置の最適化に基づき（さらに）選択される。最適化の方法については、本明細書の他の箇所でより詳細に論じる。
１つの実施形態において、本明細書に記載の標的配列または座位は、標的座位の位置、標的長、標的特異性、及びＰＡＭ特性のうちの１つ以上の最適化に基づき（さらに）選択される。本明細書で使用する場合、ＰＡＭ特性は、例えば、ＰＡＭ配列、ＰＡＭ長、及び／またはＰＡＭ ＧＣ含量を含むことができる。１つの実施形態において、ＰＡＭ特性の最適化は、ＰＡＭのヌクレオチド含有量を最適化することを含む。１つの実施形態において、ＰＡＭのヌクレオチド含有量の最適化は、１つ以上の標的座位における存在量を最大化する、変異頻度を最小化する、またはその両方を行うモチーフを有するＰＡＭを選択することである。変異頻度の最小化は、例えば、ＣｐＧがないか、少ないか、または最小限であるＰＡＭ配列を選択することにより、達成することができる。
１つの実施形態において、組成物、システムのセットにおける、各組成物、システムのエフェクタータンパク質は、エフェクタータンパク質のサイズ、エフェクタータンパク質がクロマチンアクセシビリティの高い領域にアクセスする能力、ゲノム標的にわたる均一な酵素活性の程度、エピジェネティック耐性、ミスマッチ／バルジ耐性、エフェクタータンパク質特異性、エフェクタータンパク質の安定性または半減期、エフェクタータンパクの免疫原性、または毒性からなる群より選択される１つ以上のパラメーターの最適化に基づいて選択される。最適化の方法については、本明細書の他の箇所でより詳細に論じる。
システムの最適化
本開示の方法は、本明細書のさらに別の箇所で説明するように、組成物、システム、及び／またはその機能性に関連する選択されたパラメーターまたは変数の最適化を含むことができる。本明細書に記載の方法における組成物、システムの最適化は、標的（複数可）、例えば治療標的（単数または複数）、組成物、システム、ｊ調節のモードまたはタイプ、例えば、組成物、システム、ベースとなる治療標的（複数可）、調節、修飾、または操作、ならびに組成物、システム、構成要素の送達に依存し得る。遺伝子型及び／または表現型の結果に応じて、１つ以上の標的を選択することができる。例えば、（遺伝子）疾患の病因や所望の治療結果に応じて、１つ以上の治療標的を選択することができる。（治療）標的（複数可）は、単一の遺伝子、座位、または他のゲノム部位であっても、複数の遺伝子、座位、または他のゲノム部位であってもよい。当技術分野で知られているように、単一の遺伝子、座位、または他のゲノム部位は、複数のｇＲＮＡを使用することなどにより、複数回標的とされることがある。
治療または治療薬などの組成物及び／またはシステムの活性は、標的破壊、例えば、標的変異、例えば、遺伝子ノックアウトにつながるようなものを含むことができる。スプライシング部位の破壊または修復は、システムで使用するためのドナーポリヌクレオチドの設計に利用することができる例示的なアプローチである。組成物及び／またはシステム（例えば、療法または治療薬）の活性は、（例えば、標的補正につながる）特定の標的部位の置換えを含むことができる。治療または治療薬は、標的の欠失につながるような、特定の標的部位の除去を伴う場合がある。療法または治療薬などの組成物及び／またはシステムの活性は、例えば（転写的及び／またはエピジェネティックな）遺伝子またはゲノム領域の活性化または遺伝子またはゲノム領域のサイレンシングにつながる、標的部位活性またはアクセシビリティなどの標的部位機能性の調節を含むことができる。当業者であれば、標的部位機能性の調節は、本明細書の他の箇所に記載のように、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの変異（例えば、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクターの生成）及び／または機能化（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクターと異種機能ドメイン（例えば、転写アクチベーターまたはリプレッサー）との融合）を含み得ることを理解するであろう。
したがって、１つの態様において、本開示は、本明細書に記載のような方法であって、１つ以上の（治療）標的の選択と、組成物及び／またはシステムの１つ以上の機能性の選択と、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及び／またはその機能性に関連する選択されたパラメーターまたは変数の最適化とを含む、方法に関する。関連する態様において、本開示は、本明細書に記載の方法であって、（ａ）１つ以上の（治療）標的座位を選択することと、（ｂ）１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム機能性を選択することと、（ｃ）任意選択で１つ以上の送達様式を選択することと、ステップ（ａ）～（ｃ）に基づいて選択されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを調製、開発、または設計することとを含む、方法に関する。
１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、ゲノム変異を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一のゲノム変異を含む。１つの実施形態において、組成物の機能性及び／またはシステムの機能性は、複数のゲノム変異を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、遺伝子ノックアウトを含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一の遺伝子ノックアウトを含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数の遺伝子のノックアウトを含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、遺伝子補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一の遺伝子補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数の遺伝子補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、ゲノム領域補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一のゲノム領域補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数のゲノム領域補正を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、遺伝子欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一の遺伝子欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数の遺伝子欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、ゲノム領域の欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一のゲノム領域の欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数のゲノム領域の欠失を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、遺伝子またはゲノム領域の機能性の調節を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一の遺伝子またはゲノム領域の機能性の調節を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数の遺伝子またはゲノム領域の機能性の調節を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、遺伝子またはゲノム領域の機能性（例えば、遺伝子またはゲノム領域の活性）を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、単一の遺伝子またはゲノム領域の機能性（例えば、遺伝子またはゲノム領域の活性）を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、複数の遺伝子またはゲノム領域の機能性（例えば、遺伝子またはゲノム領域の活性）を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、任意選択で転写的及び／またはエピジェネティックな遺伝子またはゲノム領域の活性化または遺伝子またはゲノム領域のサイレンシングにつながる、遺伝子活性またはアクセシビリティの調節を含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、任意選択で転写的及び／またはエピジェネティックな遺伝子もしくはゲノム領域の活性化または遺伝子もしくはゲノム領域のサイレンシングにつながる、単一の遺伝子活性またはアクセシビリティを調節することを含む。１つの実施形態において、組成物及び／またはシステムの機能性は、任意選択で転写的及び／またはエピジェネティックな遺伝子またはゲノム領域の活性化または遺伝子またはゲノム領域のサイレンシングにつながる、複数の遺伝子活性またはアクセシビリティを調節することを含む。
本明細書に記載の方法における選択されたパラメーターまたは変数の最適化は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムベースの療法または治療、特異性、有効性、及び／または安全性などのシステムの最適化または改善をもたらし得る。１つの実施形態において、以下のパラメーターまたは変数の１つ以上が、本明細書に記載の本開示の方法において考慮され、選択され、または最適化される：Ｃａｓタンパク質アロステリック相互作用、Ｃａｓタンパク質機能ドメイン及び機能ドメイン相互作用、ＣＲＩＳＰＲエフェクター特異性、ｇＲＮＡ特異性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体特異性、ＰＡＭ制限性、ＰＡＭタイプ（天然または修飾）、ＰＡＭ核酸含有量、ＰＡＭ長、ＣＲＩＳＰＲエフェクター活性、ｇＲＮＡ活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体活性、標的切断効率、標的部位選択、標的配列長、クロマチンアクセシビリティの高い領域へのエフェクタータンパク質のアクセス能力、ゲノム標的間の酵素活性均一化度、エピジェネティック耐性、ミスマッチ／バルジ耐性、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの安定性、ＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡの安定性、ｇＲＮＡの安定性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の安定性、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡの免疫原性または毒性、ｇＲＮＡ免疫原性または毒性、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ複合体の免疫原性または毒性、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質量またはｍＲＮＡ質量、ｇＲＮＡの用量または力価、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の用量または力価、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質サイズ、ＣＲＩＳＰＲエフェクター発現レベル、ｇＲＮＡ発現レベル、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体発現レベル、ＣＲＩＳＰＲエフェクター時空間的発現、ｇＲＮＡ時空間的発現、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の時空間的発現。
例として、限定されるものではないが、パラメーターまたは変数の最適化は、以下のように達成することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターの特異性は、最も特異的なＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することによって最適化することができる。これは、例えば、最も特異的なＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログを選択すること、または特異性を高める特定のＣＲＩＳＰＲエフェクター変異によって達成され得る。ｇＲＮＡの特異性は、最も特異的なｇＲＮＡを選択することによって最適化することができる。これは、例えば、低い相同性、すなわち、オフターゲット部位に対するミスマッチを少なくとも１つ、好ましくはより多く、例えば少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ有するｇＲＮＡを選択することによって達成することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の特異性は、上記のようにＣＲＩＳＰＲエフェクターの特異性及び／またはｇＲＮＡの特異性を高めることにより最適化することができる。ＰＡＭの制限性は、最も制限的なＰＡＭ認識を有するＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することにより最適化することができる。これは、例えば、より制限的なＰＡＭ認識を有するＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログを選択することによって、またはＰＡＭ制限性を増加または変更する特定のＣＲＩＳＰＲエフェクター変異によって達成することができる。ＰＡＭタイプは、例えば、所望のＰＡＭタイプを認識する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することによって最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターまたはＰＡＭタイプは、天然であってもよく、または例えば、改変したＰＡＭ認識、またはＰＡＭ認識レパートリーを有するＣＲＩＳＰＲエフェクター変異体に基づき最適化されてもよい。ＰＡＭヌクレオチド含有量は、例えば、所望のＰＡＭヌクレオチド含有量を認識する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターまたはＰＡＭタイプは、天然であってもよく、または例えば、改変したＰＡＭ認識、またはＰＡＭ認識レパートリーを有するＣＲＩＳＰＲエフェクター変異体に基づき最適化されてもよい。ＰＡＭ長は、例えば、所望のＰＡＭヌクレオチド長を認識する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターまたはＰＡＭタイプは、天然であってもよく、または例えば、改変したＰＡＭ認識、またはＰＡＭ認識レパートリーを有するＣＲＩＳＰＲエフェクター変異体に基づき最適化されてもよい。
標的長または標的配列長は、例えば、所望の標的または標的配列のヌクレオチド長を認識する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することにより、最適化することができる。代替的にまたは追加的に、標的（配列）長は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲエフェクターなどのＣＲＩＳＰＲエフェクターに典型的に関連する標的（配列）長から逸脱した長さを有する標的を提供することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターまたは標的（配列）長は、天然であってもよく、例えば、標的（配列）長の認識、または標的（配列）長の認識レパートリーが変化したＣＲＩＳＰＲエフェクター変異体に基づき最適化することができる。例えば、標的（配列）長の増減は、標的認識やオフターゲット認識に影響を与える可能性がある。ＣＲＩＳＰＲエフェクターの活性は、最も活性の高いＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することにより、最適化することができる。これは、例えば、最も活性の高いＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログを選択することにより、または活性を高める特定のＣＲＩＳＰＲエフェクターの変異によって達成することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がクロマチンアクセシビリティの高い領域にアクセスする能力は、適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターまたはその変異体を選択することによって最適化することができ、ＣＲＩＳＰＲエフェクターのサイズ、充電、または他の寸法変数等を考慮することができる。均一なＣＲＩＳＰＲエフェクター活性の程度は、適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターまたはその変異体を選択することによって最適化することができ、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの特異性及び／または活性、ＰＡＭ特異性、標的長、ミスマッチ耐性、エピジェネティック耐性、ＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／またはｇＲＮＡ安定性及び／または半減期、ＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／またはｇＲＮＡ免疫原性、毒性などを考慮することができる。ｇＲＮＡ活性は、最も活性のｇＲＮＡを選択することによって最適化することができる。１つの実施形態において、これはＲＮＡ修飾を通じてｇＲＮＡの安定性を高めることにより、達成することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体活性は、上記のようにＣＲＩＳＰＲエフェクター活性及び／またはｇＲＮＡ活性を高めることにより、最適化することができる。
標的部位の選択は、遺伝子、座位、または他のゲノム領域内の標的部位の最適な位置を選択することによって最適化することができる。標的部位の選択は、標的位置を最適化することによって最適化され得、これは、標的配列を、変動性が低い遺伝子、座位、または他のゲノム領域により選択することを含む。これは、例えば、初期及び／または保存されたエキソンまたはドメイン（すなわち、集団内で多型などの変動が少ない）内の標的部位を選択することによって達成することができる。
１つの実施形態において、標的（配列）長を最適化することは、１つ以上の標的座位内の標的配列を５～２５ヌクレオチドの間で選択することを含む。１つの実施形態において、標的配列は２０ヌクレオチドである。
１つの実施形態において、標的特異性の最適化は、オフターゲット候補を最小化する標的座位を選択することを含む。
１つの実施形態において、標的部位は、オフターゲット効果（例えば、標的と比較して１～５、１～４、または好ましくは１～３のミスマッチを有すると認定されるオフターゲット、及び／または遠位ＰＡＭミスマッチなどの１つ以上のＰＡＭミスマッチを有する）の最小化、好ましくは集団内の変動も考慮して選択することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターの安定性は、適切な半減期を有するＣＲＩＳＰＲエフェクター、例えば、十分な活性を維持しつつも好ましくは半減期が短いＣＲＩＳＰＲエフェクターを選択することによって最適化することができる。１つの実施形態において、これは、特定の半減期を有する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターオルソログを選択することにより、または半減期もしくは安定性に影響を及ぼす特定のＣＲＩＳＰＲエフェクターの変異もしくは修飾、例えば、安定化もしくは不安定化ドメインもしくは配列の包含（例えば、融合）により達成することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡの安定性は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡの安定性を増加または減少させることにより、最適化することができる。１つの実施形態において、これは、ｍＲＮＡ修飾を通じてＣＲＩＳＰＲエフェクターのｍＲＮＡ安定性を増加または減少させることにより、達成することができる。ｇＲＮＡ安定性は、ｇＲＮＡ安定性を増加または減少させることにより、最適化することができる。１つの実施形態において、これは、ＲＮＡ修飾を通じてｇＲＮＡの安定性を増加または減少させることにより、達成することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ 複合体の安定性は、上記のようにＣＲＩＳＰＲエフェクターの安定性及び／またはｇＲＮＡの安定性を増加または減少させることにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡの免疫原性または毒性は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡの免疫原性もしくは毒性を減少させることにより、最適化することができる。１つの実施形態において、これは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の修飾により、達成することができる。同様に、ＤＮＡベースの発現システムの場合、ＤＮＡの免疫原性または毒性を減少させることができる。ｇＲＮＡの免疫原性または毒性は、ｇＲＮＡの免疫原性または毒性を減少させることにより、最適化することができる。１つの実施形態において、これは、ｇＲＮＡの修飾によって達成することができる。同様に、ＤＮＡベースの発現システムの場合、ＤＮＡの免疫原性や毒性を減少させることができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の免疫原性または毒性は、上記のようにＣＲＩＳＰＲエフェクターの免疫原性または毒性及び／またはｇＲＮＡの免疫原性または毒性を減少させることにより、あるいは免疫原性または毒性が最も低いＣＲＩＳＰＲエフェクター／ｇＲＮＡの組合せを選択することにより、最適化することができる。同様に、ＤＮＡベースの発現システムの場合、ＤＮＡの免疫原性や毒性を低下させることができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡの用量または力価は、毒性を最小化し、及び／または特異性及び／または有効性を最大化するように投薬量または力価を選択することにより、最適化することができる。ｇＲＮＡの用量または力価は、毒性を最小化し、及び／または特異性及び／または有効性を最大化するように。投薬量または力価を選択することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の用量または力価は、毒性を最小化し、及び／または特異性及び／または有効性を最大化するように投薬量または力価を選択することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のサイズは、送達の効率、特にウイルス媒介送達の効率を高めるために最小限のタンパク質サイズを選択することにより、最適化することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクター、ｇＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の発現レベルは、発現期間の制限（または延長）及び／または発現レベルの制限（または増加）により、最適化することができる。これは、例えば、自己不活性化組成物、システム、例えば、自己標的化（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクター標的化）ｇＲＮＡを含むものを使用することにより、限られた発現期間を有するウイルスベクターを使用することにより、低い（または高い）発現レベルに対して適切なプロモーターを使用することにより、個々のＣＲＩＳＰ－Ｃａｓシステム構成要素に異なる送達方法を組み合わせることにより（例えば、ｇＲＮＡの非ウイルス媒介送達と組み合わせたＣＲＩＳＰＲエフェクターコード核酸のウイルス媒介送達、またはＣＲＩＳＰＲエフェクトタンパク質またはｍＲＮＡの非ウイルス媒介送達と組み合わせたｇＲＮＡのウイルス媒介伝達）、達成することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクター、ｇＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の時空間的発現は、制御可能なＣＲＩＳＰＲエフェクター活性、任意選択で不安定化したＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／または分割したＣＲＩＳＰＲエフェクター、ならびに細胞または組織特異的発現システムを含む条件付き発現システム、誘導性発現システムの適切な選択により最適化することができる。
１つの態様において、本開示は、１つ以上の（治療）標的の選択、組成物及び／またはシステムの機能性の選択、送達様式の選択、送達ビヒクルまたは発現システムの選択、及びシステム及び／またはその機能性に関連する選択されたパラメーターまたは変数の最適化を含む、本明細書に記載の方法に関する、任意選択で、パラメーターまたは変数が、ＣＲＩＳＰＲエフェクター特異性、ｇＲＮＡ特異性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ 複合体特異性、ＰＡＭ制限性、ＰＡＭタイプ（天然または修飾）、ＰＡＭ核酸含有量、ＰＡＭ長、ＣＲＩＳＰＲエフェクター活性、ｇＲＮＡ活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体活性、標的切断効率、標的部位選択、標的配列長から選ばれる１または複数である場合、エフェクタータンパク質がクロマチンアクセシビリティの高い領域にアクセスする能力、ゲノム標的全体で均一な酵素活性の程度、エピジェネティック耐性、ミスマッチ／バルジ耐性、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの安定性、ＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡの安定性、ｇＲＮＡの安定性、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ 複合体の安定性、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡ免疫原性または毒性、ｇＲＮＡ 免疫原性または毒性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の免疫原性または毒性、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはｍＲＮＡの用量または力価、ｇＲＮＡの用量または力価、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ 複合体の用量または力価、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンのサイズ、ＣＲＩＳＰＲエフェクター発現レベル、ｇＲＮＡ 発現レベル、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体発現レベル、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの時空間的発現、ｇＲＮＡ時空間的発現、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ複合体の時空間的発現。
最適化すべきパラメーターまたは変数、ならびに最適化の性質は、（治療）標的、組成物及び／またはシステムの機能性、システムの送達モード、及び／または送達ビヒクルもしくは発現システムに依存し得ることが理解されよう。
１つの態様において、本開示は、集団レベルでのｇＲＮＡ特異性の最適化を含む、本明細書に記載の方法に関する。好ましくは、ｇＲＮＡ特異性の当該最適化は、集団全体のｇＲＮＡ標的部位配列のバリエーションを最小化すること、及び／または集団全体のｇＲＮＡオフターゲットの発生率を最小化することを含む。
１つの実施形態において、最適化は、天然のまたは修飾されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターの選択をもたらし得る。１つの実施形態において、最適化は、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、デアミナーゼ、トランスポザーゼを有する、及び／または１つ以上のエフェクター機能性が不活性化または排除されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターの選択をもたらし得る。１つの実施形態において、ＰＡＭ特異性を最適化することは、修飾されたＰＡＭ特異性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを選択することを含むことができる。１つの実施形態において、最適化は、最小限のサイズを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを選択することを含むことができる。１つの実施形態において、エフェクタータンパク質の安定性を最適化することは、特定の半減期または安定性を有する適切なＣＲＩＳＰＲエフェクターオルソログを選択することなどにより、十分な活性を維持しながら短い半減期を有するエフェクタータンパク質を選択することを含む。１つの実施形態において、免疫原性または毒性の最適化は、タンパク質修飾によってエフェクタータンパク質の免疫原性または毒性を最小化することを含む。１つの実施形態において、機能特異的な最適化は、ガイドＲＮＡと１つ以上の標的座位との間のミスマッチ及び／またはバルジに対する耐性が低下したタンパク質エフェクターを選択することを含む。
１つの実施形態において、有効性の最適化は、全体的な効率、エピジェネティック耐性、またはその両方を最適化することを含む。１つの実施形態において、全体的な効率を最大化することは、クロマチンの複雑さが異なる標的座位にわたって均一な酵素活性を有するエフェクタータンパク質を選択することと、クロマチンアクセシビリティが開いている領域に限定して酵素活性を有するエフェクタータンパク質を選択することとを含む。１つの実施形態において、クロマチンアクセシビリティは、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、またはＤＮＡ近接ライゲーションアッセイのうちの１つ以上を用いて測定される。１つの実施形態において、エピジェネティック耐性の最適化は、メチル化耐性、エピジェネティックマーク競合、またはその両方を最適化することを含む。１つの実施形態において、メチル化耐性の最適化は、メチル化ＤＮＡを修飾するエフェクタータンパク質を選択することを含む。１つの実施形態において、エピジェネティック耐性を最適化することは、染色体のサイレンサー領域を修飾できないエフェクタータンパク質を選択すること、染色体のサイレンサー領域を修飾できるエフェクタータンパク質を選択すること、またはエピジェネティックマーカーが濃縮されていない標的座位を選択することを含む。
１つの実施形態において、最適化されたガイドＲＮＡを選択することは、ｇＲＮＡ安定性、ｇＲＮＡ免疫原性、またはその両方、または本明細書の他の箇所に記の他のｇＲＮＡ関連パラメーターもしくは変数を最適化することを含む。
１つの実施形態において、ｇＲＮＡ安定性及び／またはｇＲＮＡ免疫原性を最適化することは、ＲＮＡ修飾、または本明細書の他の箇所に記載の他のｇＲＮＡ関連パラメーターもしくは変数を含む。１つの実施形態において、修飾は、ｇＲＮＡの標的相補性領域の３’末端から１～３ヌクレオチド除去することを含む。１つの実施形態において、修飾は、オフターゲット座位におけるｇＲＮＡの塩基対形成と競合するｇＲＮＡの安定構造を作り出す、またはｇＲＮＡと標的配列との間の拡張した相補的ヌクレオチドを作り出す、またはその両方を作り出す、拡張ｇＲＮＡ及び／またはトランスＲＮＡ／ＤＮＡ要素を含む。
１つの実施形態において、送達の態様は、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を送達すること、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡを送達すること、またはＤＮＡベースの発現システムとしてｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクターを送達することを含む。１つの実施形態において、送達の様式はさらに、リポソーム、脂質粒子、ナノ粒子、バイオリスティック、またはウイルスベース発現／送達システムからなる群から、送達ビヒクル及び／または発現システムを選択することを含む。１つの実施形態において、発現は時空間的発現であり、条件付き及び／または誘導性発現システムの選択によって最適化され、制御可能なＣＲＩＳＰＲエフェクター活性、任意選択で不安定化したＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／または分割したＣＲＩＳＰＲエフェクター、及び／または細胞もしくは組織特異的発現システムが含まれる。
本明細書に記載の方法はさらに、送達モードの選択を含むことができる。１つの実施形態において、ｇＲＮＡ（及びｔｒａｃｒ、必要に応じて、任意選択でｓｇＲＮＡとして提供される）及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が送達されるか、または送達される予定である。１つの実施形態において、ｇＲＮＡ（及びｔｒａｃｒ、必要に応じて、任意選択でｓｇＲＮＡとして提供される）及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡが送達されるか、または送達される予定である。１つの実施形態において、及び／またはＤＮＡベースの発現システムで提供されるｇＲＮＡ（及び必要に応じてｔｒａｃｒ、任意選択でｓｇＲＮＡとして提供される）、ＣＲＩＳＰＲエフェクター、トランスポザーゼが送達されるか、または送達される予定である。１つの実施形態において、個々のシステム構成要素の送達は、上記の送達モードの組合せを含む。１つの実施形態において、送達は、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、及び／またはトランスポザーゼを送達すること、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクターｍＲＮＡを送達すること、またはＤＮＡベースの発現システムとしてｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／またはトランスポザーゼを送達することを含む。
本明細書に記載の方法はさらに、組成物、システム送達ビヒクル、及び／または発現システムの選択を含むことができる。送達ビヒクル及び発現システムについては、本明細書の他の箇所に記載されている。例として、核酸及び／またはタンパク質の送達ビヒクルとしては、ナノ粒子、リポソーム等が挙げられる。ＤＮＡのための送達ビヒクル（例えば、ＤＮＡベースの発現システム）としては、例えば、バイオリスティック、ウイルスベースベクターシステム（例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス）などが挙げられる。当業者は、送達の様式、及び送達ビヒクルまたは発現システムの選択が、例えば、標的とされるべき細胞または組織に依存し得ることを理解するであろう。１つの実施形態において、組成物、システム、またはその構成要素を送達するための送達ビヒクル及び／または発現システムとしては、リポソーム、脂質粒子、ナノ粒子、バイオリスティック、またはウイルスベース発現／送達システムが挙げられる。
治療用途における考慮事項
ゲノム編集療法における考慮事項としては、配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼのバリアント）の選択がある。各ヌクレアーゼ変異体は、それ自身に固有の強み及び弱みを有し得、その多くについて、治療効果の最大化のために治療の文脈でバランスをとらなければならない。特異的な編集療法が効果的であるためには、標的細胞集団内で十分に高いレベルの修飾を達成して疾患症状を回復させなければならない。この治療修飾「閾値」は、治療後の編集細胞の適応度と、症状の回復に必要な遺伝子産物の量とによって決定される。適応度に関しては、編集により、未編集の対応細胞と比較しての治療細胞における３つの潜在的な転帰：適応度の増加、中立、または減少が生じる。適応度が増加した場合、補正細胞は、疾患細胞よりも相対的に拡大して治療を媒介できると考えられる。この場合、編集細胞が選択的優位性を有し、少数の編集細胞であっても、拡大を通じて増幅され、患者に治療上の利益をもたらすことができる。編集細胞の適応度に変化がない場合、治療修飾閾値の増加が求められると考えられる。そのため、編集によって標的細胞に対する適応度が中立となる疾患を治療するためには、編集によって適応度が増加する疾患よりも著しく高いレベルの編集が必要となると考えられる。編集によって適応度が不利になる場合（がん細胞におけるがん抑制遺伝子の機能回復の場合のように）、修飾細胞は対応する疾患細胞に負け、治療の利益は編集率に対し低くなるであろう。これは、編集細胞の効力及び／または適応度を、対応する疾患細胞と比較して増加させるための補足的療法を用いて克服することができる。
細胞の適応度に加えて、疾患の治療に必要な遺伝子産物の量も、疾患またはその症状を治療または予防することができる治療ゲノム編集の最小レベルに影響を及ぼし得る。遺伝子産物レベルの小さな変化が臨床転帰に大きな変化をもたらす場合、治療的ゲノム編集の最小レベルは、臨床的に関連する応答を得るために遺伝子産物レベルの大きな変化が必要な場合に比べ、より少ないものである。１つの実施形態において、治療的ゲノム編集の最小レベルは、０．１～１％、１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、または５０～５５％の範囲であり得る。このように、遺伝子産物レベルのわずかな変化が臨床転帰に影響を及ぼし得る場合、編集された細胞の適応度に優位性がある疾患は、治療上の修飾の閾値が十分に低く高い成功確率を許容するため、ゲノム編集治療の理想的な標的となる。
ＮＨＥＪ及びＨＤＲのＤＳＢ修復の活性は、細胞タイプ及び細胞状態によって異なり得る。ＮＨＥＪは細胞周期によって高度に制御されることはなく、細胞種にまたがって効率的であるため、アクセス可能な標的細胞集団において高レベルの遺伝子破壊が可能となる。これに対し、ＨＤＲは主にＳ／Ｇ２期に作用するため、活発に分裂している細胞に限定され、分裂細胞に対して精密なゲノム修飾を必要とする治療には限界がある［Ｃｉｃｃｉａ，Ａ．＆ Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ４０，１７９－２０４ （２０１０）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ４７，４９７－５１０（２０１２）］。
ＨＤＲを介した補正の効率は、標的とする座位のエピジェネティック状態または配列、または使用する特定の修復鋳型構成（一本鎖ｖｓ二本鎖、長いｖｓ短い相同性アーム）によって制御することができる［Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４６，１１８５－１１９３（２００２）；Ｇａｓｐａｒ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６４，２１８１－２１８７（２００４）；Ｂｅｕｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｇ３（２０１３）］。また、標的細胞におけるＮＨＥＪ及びＨＤＲ機構の相対的活性は、これらの経路がＤＳＢの解決に競合する可能性があるため、遺伝子補正効率に影響を及ぼすことがある［Ｂｅｕｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，１９８２１－１９８２６（２００８）］。またＨＤＲは、ヌクレアーゼ及び修復鋳型の同時送達を使用するため、ＮＨＥＪ戦略では見られない送達の課題も課せられる。したがって、これらの違いは、本明細書の他の箇所でより詳細に説明するように、治療法を設計、最適化、及び／または選択する際に念頭に置くことができる。
ポリヌクレオチド修飾用途は、タンパク質、低分子ＲＮＡ分子、及び／または修復鋳型の組合せを含むことができ、１つの実施形態において、これらの複数の部分の送達は、例えば、従来の低分子治療薬よりも実質的に困難となる可能性がある。組成物、システム、及びその構成要素を送達するための２つの主要な戦略：ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏが開発されている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の１つの実施形態において、疾患細胞を対象から取り出し、編集し、そして再び患者に移植する。他の実施形態において、健康な同種異系ドナーから細胞を採取し、組成物、システム、またはその構成要素を用いて修飾して様々な機能性を付与し及び／または免疫原性を低減し、治療を必要とする同種異系レシピエントに投与する。ｅｘ ｖｉｖｏ編集は、標的細胞集団を十分に定義でき、細胞に送達する治療用分子の特定の投薬量を指定できるという利点を有する。後者の考慮は、オフターゲット修飾が懸念となる場合には、ヌクレアーゼの量の滴定によりこのような変異を減少させることができるため、特に重要であり得る。（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ｅｘ ｖｉｖｏアプローチのもう１つの利点は、典型的には、高い編集率が達成され得ることであり、これは、研究用や遺伝子治療の用途で培養下細胞へのタンパク質及び核酸の効率的な送達システムが開発されてきたためである。
組成物、システム、及び／またはその構成要素を用いたｉｎ ｖｉｖｏのポリヌクレオチド修飾は、組成物、システム、及び／またはその構成要素を、そのナイーブ組織内の細胞タイプに直接送達することを含む。組成物、システム、及び／またはその構成要素を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのポリヌクレオチド修飾により、罹患細胞集団がｅｘ ｖｉｖｏ操作では治療に対応できない疾患も可能になる。さらに、組成物、システム、及び／またはその構成要素をｉｎ ｓｉｔｕで細胞に送達することで、複数の組織及び細胞タイプの治療が可能になる。
例えば、ウイルスベクターシステムを使用して、組成物、システム、及び／またはその構成要素を細胞に送達するためのウイルス粒子を生成するような１つの実施形態において、ベクターシステムは、そこから発現することができるポリヌクレオチドのサイズ及び／またはウイルス粒子内のカーゴにパッケージ化することができるサイズに制限を有し得るため、組成物、システム、及び／または構成要素の総カーゴサイズを考慮する必要がある。１つの実施形態において、ベクターシステム（例えば、ウイルスベクターシステム）のトロピズムは、組成物、システム、またはその構成要素が効率的及び／または効果的に送達することができる細胞タイプに影響を及ぼし得るため、考慮が必要である。
ウイルスベースシステムでシステムまたはその構成要素を送達する場合、対象または細胞（複数可）に送達されたときにウイルス粒子によって誘発することができる免疫応答を考慮するように、治療効果を達成するために必要となるウイルス粒子の量を考慮することが重要であり得る。ウイルスベースのシステムでシステムまたはその構成要素を送達する場合、システムのｉｎ ｖｉｖｏでの分布及び／または投薬量を制御する機構を考慮することは重要であり得る。概して、オフターゲット効果の潜在可能性を低減するには、システムの量を最小または最小有効用量に近づけることが最適であるが、必ずしも要求されるものではない。
１つの実施形態において、システムまたはその構成要素の免疫原性を考慮することが重要であり得る。諸実施形態において、システムまたはその構成要素の免疫原性が懸念される場合、システムまたはその構成要素の免疫原性を低減することができる。単に例として、システムまたはその構成要素の免疫原性は、Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌ．に記載のアプローチを用いて低減することができる。したがって、指向性進化または合理的設計を使用して、宿主種（ヒトまたは他の種）におけるＣＲＩＳＰＲ酵素及び／またはトランスポザーゼの免疫原性を低減することができる。
異種移植
また、本開示は、移植のための修飾組織の提供に使用するように適合されたＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼを提供するための、本明細書に記載の組成物及びシステム（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質システム）の使用も企図している。例えば、ＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、動物（例えば、トランスジェニックブタ（例えば、ヒトヘムオキシゲナーゼ－１トランスジェニックブタ系統））において、例えば、ヒト免疫系によって認識されるエピトープをコードする遺伝子（すなわち、異種抗原遺伝子）の発現を途絶することにより、選択された遺伝子をノックアウト、ノックダウン、または破壊することができる。破壊の候補となるブタ遺伝子としては、例えば、α（１，３）－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシチジンモノホスフェート－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を挙げることができる（国際特許公開第ＷＯ２０１４／０６６５０５号を参照）。加えて、内在性レトロウイルスをコードする遺伝子（例えば、全てのブタ内在性レトロウイルスをコードする遺伝子）は、破壊することができる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＰＥＲＶ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５：Ｖｏｌ．３５０ ｎｏ．６２６４ ｐｐ．１１０１－１１０４を参照）。加えて、ＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、異種移植ドナー動物において追加的な遺伝子を統合するための部位（例えば、超急性拒絶反応に対する保護を改善するためのヒトＣＤ５５遺伝子）を標的とすることもできる。
本明細書の実施形態はまた、ＤＮＡリピート不安定性及び神経障害に関連する遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅、及び特定の変異の修復に関係する方法及び組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１－Ｍｅｄｉｃａｌ）。タンデムリピート配列の特定の態様が、２０超のヒト疾患の原因であることが分かっている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；７（５）：５５１－８）。本発明のエフェクタータンパク質システムを利用して、このようなゲノム不安定性の欠陥を補正することができる。
本明細書のいくつかのさらなる態様は、広範囲の遺伝子疾患に関連する欠陥の矯正に関し、このような遺伝子疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイトのトピックのサブセクション「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（ウェブサイト：ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓ）でさらに説明されている。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁無形成、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性、ファブリー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病及び他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ・ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチー、及びＮＩＮＤＳ脳梁欠損症を挙げることができる。これらの疾患については、米国国立衛生研究所のウェブサイトのサブセクション「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」でさらに説明されている。
１つの実施形態において、システムまたは複合体は、核酸分子を標的とすることができ、標的ＤＮＡ分子を切断もしくはニッキングするか、または単にその上に乗る（エフェクターがそれにニッカーゼまたは「死」をもたらす変異を有するかどうかによる）ことができる。このようなシステムまたは複合体は、疾患候補遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された標的欠失の達成に適用できる。例としては、限定されるものではないが、障害の中でもコレステロール及び脂肪酸の代謝、アミロイド疾患、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染に関与する遺伝子が挙げられる。したがって、このようなシステムまたは複合体の標的配列は、例えば、表６に示すような候補疾患遺伝子内にあり得る。
Figure 2023544822000076
Figure 2023544822000077
キット
別の態様において、本開示は、キット及び部品のキットを対象とする。本明細書を通じて使用される「部品キット」及び「キット」という用語は、指定された方法（例えば、本明細書で教示している免疫細胞を検出、定量化、または単離する方法）を行うのに必要な構成要素を含み、それらの輸送及び保管ができるように包装された製品を指す。キットに含まれる構成要素を包装するのに適した材料としては、水晶、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ボトル、フラスコ、バイアル、アンプル、紙、封筒、または他のタイプの容器、キャリア、または支持体が挙げられる。キットが複数の構成要素を含む場合、少なくとも構成要素のサブセット（例えば、複数の構成要素のうちの２つ以上）または構成要素の全ては、物理的に区切られてもよく、例えば、別々の容器、キャリア、または支持体の中または上に含まれてもよい。キットに含まれる構成要素は、指定された方法を実施するのに十分である場合もあれば、十分でない場合もあり、それぞれ、外部の試薬または物質が必要でない場合もあれば、必要な場合もある。典型的には、キットは、標準的な実験機材とともに、例えば、液体操作機材、環境（例えば、温度）制御機器、分析機器などとともに用いられる。本明細書で教示される結合剤（複数可）、例えば、抗体、ハイブリダイゼーションプローブ、増幅及び／またはシークエンシングプライマー（任意選択でアレイまたはマイクロアレイ上に提供される）に加えて、本発明のキットは、溶媒、緩衝液（例えば、限定するものではないがヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、安息香酸緩衝液、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン）緩衝液またはマレイン酸緩衝液、またはこれらの混合物）、酵素（例えば、限定するものではないが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、検出用標識、検出試薬、及び対照製剤（陽性及び／または陰性）（特定の方法で有用）の一部または全てを含む典型的には、キットは、その使用のための説明書（例えば、印刷された添付文書またはコンピューター可読媒体）も含むことができる。この用語は、本発明の文脈で使用される場合、任意の人工の有形構造製品を広く包含する「製造品」という用語と互換的に使用することができる。
実施例１：例示的なＩ－Ｆ型Ｃａｓ関連トランスポザーゼシステム及び座位
Ｉ－Ｆ型Ｃａｓ関連トランスポザーゼシステムの例を以下の表７～４５に示す。
２３３１９｜４｜ＡｒｃＯｃｅＭｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿４＿＄Ｆ＿３３００００９４３２｜０１１５００５＿１００００００５｜２００６５０｜Ｇａ０１１５００５＿１００００００５（ＩＤ：９７）
Figure 2023544822000078
Figure 2023544822000079
Figure 2023544822000080
Figure 2023544822000081
Figure 2023544822000082
Figure 2023544822000083
Figure 2023544822000084
２４８９７｜６９２｜ＣｒＴｏｉｌｍｅｔ３ＳＰＡｄｅｓ＿＄Ｆ＿３３０００２７７４２｜０２０９１２１＿１００００６９３｜３５６２５｜Ｇａ０２０９１２１＿１００００６９３（ＩＤ：９８）
Figure 2023544822000085
Figure 2023544822000086
Figure 2023544822000087
Figure 2023544822000088
Figure 2023544822000089
Figure 2023544822000090
Figure 2023544822000091
２６７０５｜１０５１｜ＧＯＭＧＴｌｍｅｓｏＳＰＡｄｅｓ＿２＿＄Ｆ＿３３０００２５７３１｜ａ０２０９３９６＿１００１０５２｜３１４３２｜Ｇａ０２０９３９６＿１００１０５２（ＩＤ：９９）
Figure 2023544822000092
Figure 2023544822000093
Figure 2023544822000094
Figure 2023544822000095
Figure 2023544822000096
Figure 2023544822000097
Figure 2023544822000098
２７７５４｜４４｜ＩＭＧ＿３３００００３９８０＿＄Ｆ＿３３００００３９８０｜Ｇａ００６４２３２＿１００４５｜１３４４１４｜Ｇａ００６４２３２＿１００４５（ＩＤ：１００）
Figure 2023544822000099
Figure 2023544822000100
Figure 2023544822000101
Figure 2023544822000102
Figure 2023544822000103
Figure 2023544822000104
Figure 2023544822000105
３２４５０｜４８０２｜Ｍａｒｓｅｄｏｆ８ｓａｍｐｌｅｓ＿＄Ｆ＿３３０００１０４３０｜１１８７３３＿１００００４８０３｜４０１６２｜Ｇａ０１１８７３３＿１００００４８０３（ＩＤ：１０１）
Figure 2023544822000106
Figure 2023544822000107
Figure 2023544822000108
Figure 2023544822000109
Figure 2023544822000110
Figure 2023544822000111
Figure 2023544822000112
１６９７｜３７｜ＭＴＬＥ０１．１｜ＭＴＬＥ０１００００３８．１｜１００８６６｜Ｂｉｏｆｉｌｍ（ＩＤ：１０２）
Figure 2023544822000113
Figure 2023544822000114
Figure 2023544822000115
Figure 2023544822000116
Figure 2023544822000117
Figure 2023544822000118
Figure 2023544822000119
６２１５｜１｜ＯＪＢＣ０１．１｜ＯＪＢＣ０１０００００２．１｜２９９６５５｜ｓｅａｗａｔｅｒ（ＩＤ：１０３）
Figure 2023544822000120
Figure 2023544822000121
Figure 2023544822000122
Figure 2023544822000123
Figure 2023544822000124
Figure 2023544822000125
Figure 2023544822000126
３９６８３｜０｜ＧＣＡ＿００００１４８８５．１＿ＡＳＭ１４８８ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０００４７２．１｜５３９６４７６｜Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（ＩＤ：１０４）
Figure 2023544822000127
Figure 2023544822000128
Figure 2023544822000129
Figure 2023544822000130
Figure 2023544822000131
Figure 2023544822000132
Figure 2023544822000133
４０６３３｜４｜ＧＣＡ＿０００１５３２６５．１＿ＡＳＭ１５３２６ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＨ９０２６０１．１｜４９２６１７｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１０５）
Figure 2023544822000134
Figure 2023544822000135
Figure 2023544822000136
Figure 2023544822000137
Figure 2023544822000138
Figure 2023544822000139
Figure 2023544822000140
４３６６８｜７｜ＧＣＡ＿０００２３８２７５．３＿ＰＴｎｄ＿２．０＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＡＨＣＦ０２００００４２．１｜２１８１０４｜ＰｓｅＴｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１０６）
Figure 2023544822000141
Figure 2023544822000142
Figure 2023544822000143
Figure 2023544822000144
Figure 2023544822000145
Figure 2023544822000146
Figure 2023544822000147
４３６６７｜０｜ＧＣＡ＿０００２３８２５５．４＿ＡＳＭ２３８２５ｖ４＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０１１０３９．１｜３１５４１７５｜ＰｓｅＴｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１０７）
Figure 2023544822000148
Figure 2023544822000149
Figure 2023544822000150
Figure 2023544822000151
Figure 2023544822000152
Figure 2023544822000153
Figure 2023544822000154
４３６７４｜０｜ＧＣＡ＿０００２３８３９５．４＿ＡＳＭ２３８３９ｖ４＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０１１０２５．１｜３８４０８３４｜ＰｓｅＴｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１０８）
Figure 2023544822000155
Figure 2023544822000156
Figure 2023544822000157
Figure 2023544822000158
Figure 2023544822000159
Figure 2023544822000160
Figure 2023544822000161
４５４６３｜２６｜ＧＣＡ＿０００２７９２８５．１＿ＡＳＭ２７９２８ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＡＬＥＤ０１００００２７．１｜１０２３５７６｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１０９）
Figure 2023544822000162
Figure 2023544822000163
Figure 2023544822000164
Figure 2023544822000165
Figure 2023544822000166
Figure 2023544822000167
Figure 2023544822000168
６４５４５｜３｜ＧＣＡ＿０００６９５２５５．１＿Ｐｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ２７５３＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＪＭＩＢ０１０００００４．１｜３３９０３８｜ＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉＴｍ （ＩＤ：１１０）
Figure 2023544822000169
Figure 2023544822000170
Figure 2023544822000171
Figure 2023544822000172
Figure 2023544822000173
Figure 2023544822000174
Figure 2023544822000175
７５５０２｜１｜ＧＣＡ＿００１０４８６７５．１＿ＶＤＩＡＢｖ１＿ＰＲＪＥＢ５８９８＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＣＫＫ０１０００００２．１｜１０３８２１２｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１１１）
Figure 2023544822000176
Figure 2023544822000177
Figure 2023544822000178
Figure 2023544822000179
Figure 2023544822000180
Figure 2023544822000181
８７３４７｜８｜ＧＣＡ＿００１２９３８０５．１＿ＡＳＭ１２９３８０ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＢＣＡＩ０１０００００９．１｜１９０４３１｜ＰｓｅＴｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１１２）
Figure 2023544822000182
Figure 2023544822000183
Figure 2023544822000184
Figure 2023544822000185
Figure 2023544822000186
Figure 2023544822000187
Figure 2023544822000188
９８３２６｜０｜ＧＣＡ＿００１５４３５０５．１＿ＡＳＭ１５４３５０ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＪＮＴＸ０１０００００１．１｜４４４２５９｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１１３）
Figure 2023544822000189
Figure 2023544822000190
Figure 2023544822000191
Figure 2023544822000192
Figure 2023544822000193
Figure 2023544822000194
Figure 2023544822000195
９８５９７｜１６｜ＧＣＡ＿００１５５０１３５．１＿ＡＳＭ１５５０１３ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＬＲＴＥ０１００００２４．１｜５１９２７５｜ＰｓｅＴｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１１４）
Figure 2023544822000196
Figure 2023544822000197
Figure 2023544822000198
Figure 2023544822000199
Figure 2023544822000200
Figure 2023544822000201
Figure 2023544822000202
９８９０１｜０｜ＧＣＡ＿００１５５８４１５．２＿ＡＳＭ１５５８４１ｖ２＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０１４０３４．２｜１６７１８９５｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１１５）
Figure 2023544822000203
Figure 2023544822000204
Figure 2023544822000205
Figure 2023544822000206
Figure 2023544822000207
Figure 2023544822000208
Figure 2023544822000209
１００３２９｜０｜ＧＣＡ＿００１５９３２４５．１＿ＡＳＭ１５９３２４ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０１２５０４．１｜４９２３００９｜Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１１６）
Figure 2023544822000210
Figure 2023544822000211
Figure 2023544822000212
Figure 2023544822000213
Figure 2023544822000214
Figure 2023544822000215
Figure 2023544822000216
１０２２２２｜４３｜ＧＣＡ＿００１６３９７２５．１＿ＡＳＭ１６３９７２ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＬＴＡＷ０１０００００５．１｜４２１６７６｜Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１１７）
Figure 2023544822000217
Figure 2023544822000218
Figure 2023544822000219
Figure 2023544822000220
Figure 2023544822000221
Figure 2023544822000222
Figure 2023544822000223
１０３６７６｜４６｜ＧＣＡ＿００１６７５９３５．１＿ＡＳＭ１６７５９３ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＬＺＦＶ０１００００４７．１｜１９４５４０｜Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（ＩＤ：１１８）
Figure 2023544822000224
Figure 2023544822000225
Figure 2023544822000226
Figure 2023544822000227
Figure 2023544822000228
Figure 2023544822000229
Figure 2023544822000230
１１５５１８｜２３｜ＧＣＡ＿００１９５７１３５．１＿ＡＳＭ１９５７１３ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＭＰＨＫ０１０００００４．１｜２５８２４７｜Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（ＩＤ：１１９）
Figure 2023544822000231
Figure 2023544822000232
Figure 2023544822000233
Figure 2023544822000234
Figure 2023544822000235
Figure 2023544822000236
Figure 2023544822000237
１２３７８７｜４４｜ＧＣＡ＿００２１５６４７５．１＿ＡＳＭ２１５６４７ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＭＶＪＥ０１０００００５．１｜１４２１５９｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１２０）
Figure 2023544822000238
Figure 2023544822000239
Figure 2023544822000240
Figure 2023544822000241
Figure 2023544822000242
Figure 2023544822000243
Figure 2023544822000244
１５１５４３｜０｜ＧＣＡ＿００２８９２８８５．１＿ＡＳＭ２８９２８８ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＰＯＳＩ０１０００００１．１｜７４４３６８｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１２１）
Figure 2023544822000245
Figure 2023544822000246
Figure 2023544822000247
Figure 2023544822000248
Figure 2023544822000249
Figure 2023544822000250
Figure 2023544822000251
１５４４４１｜０｜ＧＣＡ＿００２９６６４９５．１＿ＡＳＭ２９６６４９ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０１６４９０．１｜３６５０４９２｜Ｈａｌｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１２２）
Figure 2023544822000252
Figure 2023544822000253
Figure 2023544822000254
Figure 2023544822000255
Figure 2023544822000256
Figure 2023544822000257
Figure 2023544822000258
Figure 2023544822000259
１５６６２３｜１７｜ＧＣＡ＿００３０２５４２５．１＿ＡＳＭ３０２５４２ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＰＹＬＸ０１００００２５．１｜５２４０１｜ＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉＴｍ（ＩＤ：１２３）
Figure 2023544822000260
Figure 2023544822000261
Figure 2023544822000262
Figure 2023544822000263
Figure 2023544822000264
Figure 2023544822000265
Figure 2023544822000266
１６２４４５｜１８｜ＧＣＡ＿００３２０１８８５．１＿ＡＳＭ３２０１８８ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＱＪＪＧ０１００００１９．１｜１２８０６７｜Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（ＩＤ：１２４）
Figure 2023544822000267
Figure 2023544822000268
Figure 2023544822000269
Figure 2023544822000270
Figure 2023544822000271
Figure 2023544822000272
Figure 2023544822000273
Figure 2023544822000274
１６８５４０｜５｜ＧＣＡ＿００３３５０２９５．１＿ＡＳＭ３３５０２９ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＱＬＹＹ０１０００００６．１｜３２７４４７｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１２５）
Figure 2023544822000275
Figure 2023544822000276
Figure 2023544822000277
Figure 2023544822000278
Figure 2023544822000279
Figure 2023544822000280
Figure 2023544822000281
１７５３０２｜７３｜ＧＣＡ＿００３５８５３６５．１＿ＡＳＭ３５８５３６ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＮＯＪＩ０１０００００９．１｜１４９４６１｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１２６）
Figure 2023544822000282
Figure 2023544822000283
Figure 2023544822000284
Figure 2023544822000285
Figure 2023544822000286
Figure 2023544822000287
Figure 2023544822000288
１８３４７７｜２２｜ＧＣＡ＿９０００９９９５５．１＿ＩＭＧ－ｔａｘｏｎ＿２６１９６１８９６０＿ａｎｎｏｔａｔｅｄ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＦＮＥＦ０１０００００６．１｜１９１９７６｜Ｈａｌｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１２７）
Figure 2023544822000289
Figure 2023544822000290
Figure 2023544822000291
Figure 2023544822000292
Figure 2023544822000293
Figure 2023544822000294
Figure 2023544822000295
１８６１５６｜３２｜ＧＣＡ＿９００１２９１５５．１＿ＩＭＧ－ｔａｘｏｎ＿２５８２５８１２７０＿ａｎｎｏｔａｔｅｄ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＦＱＶＦ０１０００００９．１｜１９６８５０｜Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１２８）
Figure 2023544822000296
Figure 2023544822000297
Figure 2023544822000298
Figure 2023544822000299
Figure 2023544822000300
Figure 2023544822000301
Figure 2023544822000302
２０１０２５｜１１｜ＧＣＡ＿００３６７５８９５．１＿ＡＳＭ３６７５８９ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＭＬ０１４７６４．１｜８７０４８｜Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｃｅａｅ（ＩＤ：１２９）
Figure 2023544822000303
Figure 2023544822000304
Figure 2023544822000305
Figure 2023544822000306
Figure 2023544822000307
Figure 2023544822000308
Figure 2023544822000309
２０１７３６｜１｜ＧＣＡ＿００３６９１５０５．１＿ＡＳＭ３６９１５０ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０３３１３８．１｜２５０７９７７｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１３０）
Figure 2023544822000310
Figure 2023544822000311
Figure 2023544822000312
Figure 2023544822000313
Figure 2023544822000314
Figure 2023544822000315
Figure 2023544822000316
２０９５５９｜１２｜ＧＣＡ＿００３９４７３５５．１＿ＡＳＭ３９４７３５ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＰＳＺＩ０１０００００３．１｜４１２９９２｜Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１３１）
Figure 2023544822000317
Figure 2023544822000318
Figure 2023544822000319
Figure 2023544822000320
Figure 2023544822000321
Figure 2023544822000322
Figure 2023544822000323
２１２５９７｜１｜ＧＣＡ＿００４０２２５４５．１＿ＡＳＭ４０２２５４ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０３４９７１．１｜１９８５７５３｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１３２）
Figure 2023544822000324
Figure 2023544822000325
Figure 2023544822000326
Figure 2023544822000327
Figure 2023544822000328
Figure 2023544822000329
Figure 2023544822000330
２５５４０３｜０｜ＧＣＡ＿００４３５８４４５．１＿ＡＳＭ４３５８４４ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＣＰ０３７９５１．１｜４２２２１９１｜Ｐａｒａｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（ＩＤ：１３３）
Figure 2023544822000331
Figure 2023544822000332
Figure 2023544822000333
Figure 2023544822000334
Figure 2023544822000335
Figure 2023544822000336
Figure 2023544822000337
２５６２９６｜４０｜ＧＣＡ＿００４３７８３５５．１＿ＡＳＭ４３７８３５ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＳＮＴＢ０１００００３０．１｜４２０８９｜Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ（ＩＤ：１３４）
Figure 2023544822000338
Figure 2023544822000339
Figure 2023544822000340
Figure 2023544822000341
Figure 2023544822000342
Figure 2023544822000343
Figure 2023544822000344
２６４７８８｜１１７｜ＧＣＡ＿００５１４６８０５．１＿ＡＳＭ５１４６８０ｖ１＿ｇｅｎｏｍｉｃ｜ＳＹＶＱ０１００００７６．１｜７５７０５｜Ｖｉｂｒｉｏ（ＩＤ：１３５）
Figure 2023544822000345
Figure 2023544822000346
Figure 2023544822000347
Figure 2023544822000348
Figure 2023544822000349
Figure 2023544822000350
Figure 2023544822000351
実施例２：ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミド標的化
核局在シグナルタグ化（ＮＬＳ）１－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子を発現するプラスミドを形質移入した細胞のトランスポジションを判定するため、ＮＬＳ－ＴｎｓＡ、ＮＬＳ－ＴｎｓＢ、ＮＬＳ－ＴｎｓＣ、ＮＬＳ－ＴｎｓＤ、ＮＬＳ－Ｃａｓ５／８、ＮＬＳ－Ｃａｓ６、ＮＬＳ－Ｃａｓ７、Ｕ６－ｃｒＲＮＡをｐＤｏｎｏｒ及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドとともにクローニングし、発現させた。形質移入したＨＥＫ ２９３細胞を７２時間後に採取し、ＰＣＲ及びそれに続く次世代シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって挿入部位を検出した。ＰＡＭ部位からの挿入部位の距離を塩基対（ｂｐ）単位で図１に示す。Ｗｅｂロゴは、挿入部位内及びその周囲のヌクレオチドの配列保存を示す（図１、挿入部）。
記載している本発明の方法、医薬組成物、及びキットの様々な変更形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者にとっては明らかなものであろう。本発明を特定の実施形態とともに説明してきたが、さらなる変更形態が可能であり、特許請求される発明がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。実際に、当業者には明らかである、本発明を実施するための記載の様式の様々な修正形態は、本発明の範囲内であるように意図されている。本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の変形、使用、または適応を網羅し、本開示からの逸脱は、本発明が属する技術分野における既知の慣行内にあり、ここで前に規定した本質的特徴に適用できるものを含むことを意図している。

Claims (65)

  1. 操作された組成物であって、前記組成物が、
    ａ．１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼと、
    ｂ．１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、
    ｃ．ガイド分子であって、前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、前記ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能な前記ガイド分子とを含む、前記組成物。
  2. 前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼが、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記１つ以上のＴｎ７トランスポザーゼが、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、及びＴｎｓＤを含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ７を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む、請求項４に記載の組成物。
  7. （ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、表７～４５のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を欠いている、請求項１に記載の組成物。
  9. ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記ドナーポリヌクレオチドが異種ドナーポリヌクレオチドである、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ドナーポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドインサート、左エレメント配列、及び右エレメント配列を含む、請求項９に記載の組成物。
  12. 前記ドナーポリヌクレオチドが、
    ａ．前記標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、
    ｂ．前記標的ポリヌクレオチド内の未成熟終止コドンを補正する、
    ｃ．スプライシング部位を破壊する、
    ｄ．スプライシング部位を修復する、または
    ｅ．これらの組合せを行う、請求項９に記載の組成物。
  13. 前記ドナーポリヌクレオチドによって導入される前記１つ以上の変異が、置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記１つ以上の変異が、前記標的ポリヌクレオチド上のオープンリーディングフレームのシフトを引き起こす、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記ドナーポリヌクレオチドが１００塩基対～３０ｋｂの長さである、請求項９に記載の組成物。
  16. 標的化部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と１つ以上の標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することが可能な複数のガイド分子を含む、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記標的ポリヌクレオチドが真核細胞内にある、請求項１に記載の組成物。
  19. １つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物であって、
    ａ．１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼと、
    ｂ．１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、
    ｃ．ガイド分子であって、前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、前記ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能な前記ガイド分子とを含む、前記組成物。
  20. ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ドナーポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドインサート、左エレメント配列、及び右エレメント配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記１つ以上のポリヌクレオチドが、請求項１～１７のいずれか１項に記載の構成要素（ａ）～（ｃ）をコードする、請求項１９に記載の組成物。
  23. 前期１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及び／またはＣａｓ８を含む、請求項１９に記載の組成物。
  24. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、及びＣａｓ７を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、及びＣａｓ８を含む、請求項２３に記載の組成物。
  26. 前記１つ以上のポリヌクレオチドが、表７～４５から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  27. 請求項１９～２５のいずれか１項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
  28. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のシステム、または請求項２７に記載のベクターを含む、操作された細胞。
  29. 前期細胞が、内在性または非内在性の生物学的産物または化学化合物を産生及び／または分泌する、請求項２８に記載の操作された細胞。
  30. 前記生物学的産物がタンパク質またはＲＮＡである、請求項２９に記載の操作された細胞。
  31. 請求項２８に記載の操作された細胞及びその後代を含む細胞株。
  32. 請求項２８に記載の操作された細胞及びその後代を含む植物または動物。
  33. 請求項２８に記載の操作された細胞を含む組成物。
  34. 治療薬として使用するために製剤化される、請求項３３に記載の組成物。
  35. 請求項２８に記載の操作された細胞によって産生される、生物学的製剤または化学化合物。
  36. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物を用いて操作されている、操作された細胞またはその後代。
  37. 前記細胞が、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質内に変異を含む、請求項３６に記載の細胞またはその後代。
  38. 前記細胞が、前記標的配列を含むゲノム領域の欠失を含む、請求項３７に記載の細胞またはその後代。
  39. 前記細胞が、相同組換え修復による外来性配列の統合を含む、請求項３７に記載の細胞またはその後代。
  40. 前記細胞が、前記標的配列に関連する遺伝子の転写の減少を含む、請求項３７に記載の細胞またはその後代。
  41. 前記細胞が、前記標的配列に関連する遺伝子の転写の増加を含む、請求項３７に記載の細胞またはその後代。
  42. 単離されている、請求項３６に記載の細胞またはその後代。
  43. 治療薬としてさらに使用される、請求項３６に記載の細胞またはその後代。
  44. 前記細胞から産物が単離される、請求項３６に記載の細胞またはその後代。
  45. 請求項３６に記載の細胞またはその後代によって産生される産物。
  46. 前記産物がタンパク質またはＲＮＡである、請求項４５に記載の産物。
  47. 前記産物が、変異タンパク質または鋳型によってもたらされる産物である、請求項３５に記載の産物。
  48. 前記タンパク質が変異を含む、請求項４６に記載の産物。
  49. 請求項３６に記載の細胞またはその後代を含む、疾患または障害の治療のための医薬組成物。
  50. 前記治療が、１つ以上の細胞における遺伝的変化をもたらす、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 前記治療が、１つ以上の欠陥遺伝子型の補正をもたらす、請求項４９に記載の医薬組成物。
  52. 前記治療が、表現型の改善をもたらす、請求項４９に記載の医薬組成物。
  53. 細胞内の標的ポリヌクレオチドにドナーポリヌクレオチドを挿入する方法であって、前記方法が、前記細胞に、
    ａ．１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連Ｔｎ７トランスポザーゼまたはその機能的フラグメントと、
    ｂ．１つ以上のＩ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と、
    ｃ．ガイド分子であって、前記Ｉ－Ｆ型Ｃａｓタンパク質と複合体化することと、前記ガイド－Ｃａｓタンパク質複合体と標的ポリヌクレオチドとの結合を誘導することとが可能な前記ガイド分子と、
    ｄ．前記ドナーポリヌクレオチドとを導入することを含む、前記方法。
  54. 前記ドナーポリヌクレオチドが、
    前記標的ポリヌクレオチドに１つ以上の変異を導入する、
    前記標的ポリヌクレオチド内の未成熟終止コドンを補正する、
    スプライシング部位を破壊する、
    スプライシング部位を修復する、または
    これらの組合せを行う、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ドナーポリヌクレオチドによって導入される前記１つ以上の変異が、置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記１つ以上の変異が、前記標的ポリヌクレオチド上のオープンリーディングフレームのシフトを引き起こす、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記ドナーポリヌクレオチドが１００塩基～３０ｋｂの長さである、請求項５３に記載の方法。
  58. 構成要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のうちの１つ以上が、調節配列に作用可能に連結した核酸から発現する、請求項５３に記載の方法。
  59. 構成要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のうちの１つ以上が粒子内に導入される、請求項５３に記載の方法。
  60. 前記粒子がリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含む、請求項５３に記載の方法。
  61. 前記細胞が原核細胞である、請求項５３に記載の方法。
  62. 前記細胞が真核細胞である、請求項５３に記載の方法。
  63. 前記細胞が、哺乳類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項５３に記載の方法。
  64. 前記細胞が植物細胞である、請求項５３に記載の方法。
  65. 前記ドナーポリヌクレオチドを前記細胞内の前記標的ポリヌクレオチド内に挿入することが、
    １つ以上の遺伝子産物の発現レベルの変化を含む細胞または細胞集団、
    内在性または非内在性の生物学的産物または化学化合物を産生及び／または分泌する細胞または細胞集団をもたらす、請求項５３に記載の方法。
JP2023521484A 2020-10-08 2021-10-08 Ｉ型ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポザーゼシステム Pending JP2023544822A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063089220P 2020-10-08 2020-10-08
US63/089,220 2020-10-08
PCT/US2021/054190 WO2022076830A1 (en) 2020-10-08 2021-10-08 Type i crispr-associated transposase systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023544822A true JP2023544822A (ja) 2023-10-25

Family

ID=81126112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023521484A Pending JP2023544822A (ja) 2020-10-08 2021-10-08 Ｉ型ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポザーゼシステム

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230383315A1 (ja)
EP (1) EP4204562A1 (ja)
JP (1) JP2023544822A (ja)
CN (1) CN116234918A (ja)
AU (1) AU2021356560A1 (ja)
CA (1) CA3194645A1 (ja)
WO (1) WO2022076830A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363554B (zh) * 2023-12-08 2024-04-09 清华大学 一种工程改造的嗜盐微生物及其构建方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020131862A1 (en) * 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
AU2020232850A1 (en) * 2019-03-07 2021-10-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York RNA-guided DNA integration using Tn7-like transposons

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021356560A1 (en) 2023-06-08
EP4204562A1 (en) 2023-07-05
CA3194645A1 (en) 2022-04-14
US20230383315A1 (en) 2023-11-30
CN116234918A (zh) 2023-06-06
WO2022076830A1 (en) 2022-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020348879A1 (en) Novel type VI CRISPR enzymes and systems
KR20230149886A (ko) 재프로그램가능한 tnpb 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2021102042A1 (en) Retrotransposons and use thereof
WO2020236972A2 (en) Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
EP4291202A1 (en) Nuclease-guided non-ltr retrotransposons and uses thereof
EP4034659A2 (en) Programmable polynucleotide editors for enhanced homologous recombination
WO2021097118A1 (en) Small type ii cas proteins and methods of use thereof
JP2023546671A (ja) 再プログラム可能なｉｓｃｂヌクレアーゼ及びその使用
WO2020236967A1 (en) Random crispr-cas deletion mutant
WO2023097228A1 (en) Reprogrammable iscb nucleases and uses thereof
WO2022147321A1 (en) Type i-b crispr-associated transposase systems
WO2022150651A1 (en) Dna nuclease guided transposase compositions and methods of use thereof
WO2021087394A1 (en) Type i-b crispr-associated transposase systems
WO2021041922A1 (en) Crispr-associated mu transposase systems
CN116583599A (zh) 可重编程IscB核酸酶及其用途
WO2021173734A1 (en) Novel type iv and type i crispr-cas systems and methods of use thereof
JP2023544822A (ja) Ｉ型ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポザーゼシステム
WO2022076425A1 (en) T-dna mediated genetic modification
CN117616126A (zh) 可重新编程的tnpb多肽及其用途
WO2023170535A2 (en) Novel nucleic acid-guided nucleases and use thereof
EP4204559A1 (en) Nucleic acid-guided nucleases and use thereof
WO2023230483A2 (en) Engineered chimeric iscb polypeptides and uses thereof
WO2024015920A1 (en) Hybrid crispr-cas systems and methods of use thereof
WO2023097224A1 (en) Reprogrammable isrb nucleases and uses thereof
WO2024030961A2 (en) Type lb crispr-associated transposase systems