JP2023544614A - Ｃｌｅｃ９ａ抗体 - Google Patents

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マキネス タレット、カースティーン
カミンスキ、イリナ
ジェーン ラドフォード、クリステン
ロバート、レミー
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Abstract

本発明は、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ９Ａに結合するための抗原結合性タンパク質及び関連するその断片、該抗原結合性タンパク質及び断片の製造、並びに、種々の状態、特に炎症、感染及び腫瘍学、の検出及び治療のための該抗原結合性タンパク質及び断片の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ９Ａへの結合のための抗原結合性タンパク質及び関連するその断片、該抗原結合性タンパク質及び断片の製造、並びに種々の状態、特に炎症、感染及び腫瘍学、の検出又は治療のための該抗体及び断片の使用に関する。
先の出願の相互参照
この出願は、オーストラリア仮出願第２０２０９０３５８６号の優先権を主張し、ここで参照することによって、その内容はすべて本明細書に組み込まれる。
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び維持に重要な、骨髄由来の細胞であり、リンパ器官、血液及び末梢組織にまばらに分布している。ＤＣは、抗原（Ａｇ）のプロセッシングやナイーヴＴ細胞の活性化能などの共通の性質を共有し、免疫応答を開始及び維持する。しかし、ＤＣは不均質であり、マウス及びヒトで検出される複数の異なるサブタイプがある。
ＤＣは従来型ＤＣ（ｃＤＣ）と形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）とに大まかに分類される。ｐＤＣは、高レベルのＩＦＮαを分泌し、抗ウイルス応答において重要な役割を果たすことができる。ｃＤＣは、末梢組織からリンパ液を介してリンパ節（ＬＮ）に遊走する古典的な「遊走性」ＤＣ（例えば、ランゲルハンス細胞等）と、そのように遊走はせず血液由来の前駆体から生じる「リンパ組織常在」ＤＣ（脾臓、胸腺及びＬＮ中に見出される）とに分けることができる。
マウス及びヒトＤＣは異なるサブタイプにさらに細分することができる。これらのＤＣサブタイプは多くの機能、とりわけ、ナイーヴＴ細胞を活性化するための抗原（Ａｇ）の取り込み、プロセッシング及び提示、を共有する。
重要なことに、ＤＣはまた、サブセット特異的な役割を示す。異なるＤＣサブタイプは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含む異なるパターンのパターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現し、その結果、異なる感染に応答する能力において異なる。一例として、マウス及びヒトのｃＤＣ１サブセットは、死細胞や感染細胞に由来するような外因性Ａｇに対処して、これらのＡｇをＭＨＣクラスＩ分子上に交差提示するのに特に効率が良い。このことによって、これらのＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するウイルスＡｇも主要な提示細胞となり得る。
ＤＣの表面上の分子は、ＤＣの認識、伝達及び活性化機能において重要である。ＤＣサブタイプ間で異なる当該分子は、これらのサブタイプ間で観察される機能の相違を支持するものであり得るので、興味深い。さらに、ＤＣサブタイプ間で異なる表面分子は、免疫応答を操作するために、Ａｇ又は治療剤をＤＣへ選択的に送達するための案内役として働き得るので、特に興味深い。
ＣＬＥＣ９Ａは、樹状細胞上で発現するグループＶ Ｃ型レクチン様受容体（ＣＴＲ）である。ＣＬＥＣ９Ａは、死細胞由来の物質の取り込みとプロセッシングに特化した小サブセットの樹状細胞上のエンドサイトーシス受容体として機能し得る。ＣＬＥＣ９Ａは、細胞骨格アクチン結合性タンパク質と会合することができ、細胞膜が損傷した場合に露出することができ、死細胞関連抗原の交差提示を媒介し得るフィラメント状のアクチンを認識する。
ＣＬＥＣ９Ａに対する抗体は以前に、ＷＯ２００９０２６６６０に記載されているが、それらの抗体はラット由来であり、それゆえ、ヒト用途には不適切であった。
ヒトにおいて使用することができるＣＬＥＣ９Ａに結合する抗体が望まれている。
本明細書におけるいかなる先行技術の参照も、当該先行技術が任意の法域において技術常識の一部を形成することや、当該先行技術が、当業者が理解し、関連があるとみなし、及び／又は他の先行技術の要素と組み合わせると、合理的に予測され得るであろうことに同意するものでも示唆するものでもない。
一側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７～２４からなる群より選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一の、１以上の配列を含む。
本発明はまた、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ａ） 配列番号１７に示される配列と、少なくとも約５８％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号１８に示される配列と、少なくとも約９５％同一の配列を含むＦＲ２、配列番号１９に示される配列と、少なくとも約９５％同一の配列を含むＦＲ３、及び配列番号２０に示される配列と、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ４；
（ｂ） 配列番号２１に示される配列と、少なくとも約８８％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ１、配列番号２２に示される配列と、少なくとも約８８％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ２、配列番号２３に示される配列と、少なくとも約８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ３、及び配列番号２４に示される配列と、少なくとも約８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ４；あるいは
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の各々
を含む。
本発明はまた、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ａ） 配列番号１７に示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と比較して、０個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号１９に示される配列と比較して、１個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び配列番号２０に示される配列と比較して、１もしくは２個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４；
（ｂ） 配列番号２１に示される配列と比較して、１もしくは２個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号２２に示される配列と比較して、１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び配列番号２４に示される配列と比較して、１個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４；あるいは
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）の各々
を含む。
いかなる側面においても、配列相違は保存的又は非保存的であり得る。
本発明はまた、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は、配列番号３８に示される配列を含むＶＨ及び配列番号３７もしくは４３に示される配列を含むＶＬを含む抗体の、ＣＬＥＣ９Ａへの結合を競合的に阻害し、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７～２４からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、７もしくは８個の配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、少なくとも１つのフレームワーク領域を含む。
本発明はまた、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は、配列番号８に示される配列を含むＶＨ及び配列番号７に示される配列を含むＶＬを含む抗体の、ＣＬＥＣ９Ａへの結合を競合的に阻害し、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７～２４からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、７もしくは８個の配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む、少なくとも１つのフレームワーク領域を含む。
いかなる実施態様においても、該抗原結合性タンパク質は、配列番号３５に示されるエピトープ配列への抗体の結合を競合的に阻害する。
好ましくは、該抗原結合性タンパク質は、哺乳動物のＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する。いっそう好ましくは、該抗原結合性タンパク質は、ヒトＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する。
任意の側面において、該抗原結合性タンパク質は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み：
－ ＣＤＲＬ１は、ＱＳＬＬＨＳＤＧＮＴＹ（配列番号１）又は配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
－ ＣＤＲＬ２は、ＲＩＳ（配列番号２）又は配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１もしくは２個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
－ ＣＤＲＬ３は、ＬＱＳＳＨＦＰＰＴ（配列番号３）又は配列番号３のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有する、
並びに／あるいは
－ ＣＤＲＨ１は、ＧＦＴＦＮＮＹＷ（配列番号４）又は配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
－ ＣＤＲＨ２は、ＩＴＴＡＡＧＧＴ（配列番号５）又は配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
－ ＣＤＲＨ３は、又は、ＴＲＶＧＲＤＩＷＤＹ（配列番号６）又は配列番号６のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有する。
任意の側面において、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７からのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３、並びに／あるいは、配列番号８からのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号４に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含むＣＤＲ２、配列番号６に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含むＣＤＲ３、及び、配列番号２１～２４に示される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の、１、２、３もしくは４個の配列を含むフレームワーク領域を含むＶＨ；並びに／あるいは
（ｉｉ） 配列番号１に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含むＣＤＲ１、配列番号２に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含むＣＤＲ２、配列番号３に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を含むＣＤＲ３、及び、配列番号１７～２０に示される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の、１、２、３もしくは４個の配列を含むフレームワーク領域を含むＶＬ
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号４に示される配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５に示される配列を含むＣＤＲ２、配列番号６に示される配列を含むＣＤＲ３、及び、配列番号２１～２４に示される１、２、３もしくは４個の配列を含むフレームワーク領域を含むＶＨ；並びに／あるいは
（ｉｉ） 配列番号１に示される配列を含むＣＤＲ１、配列番号２に示される配列を含むＣＤＲ２、配列番号３に示される配列を含むＣＤＲ３、及び、配列番号１７～２０に示される１、２、３もしくは４個の配列を含むフレームワーク領域を含むＶＬ
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号８に示される配列と少なくとも約８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むＶＨ；並びに／あるいは
（ｉｉ） 配列番号７に示される配列と少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むＶＬ
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号８に示される配列を含むＶＨ；及び／又は
（ｉｉ） 配列番号７に示される配列を含むＶＬ
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号３３又はリーダー配列を除く配列番号３３に示される配列と、少なくとも約８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含み、好ましくは該リーダー配列は表１に示されるものである、重鎖；並びに／あるいは
（ｉｉ） 配列番号３４又はリーダー配列を除く配列番号３４に示される配列と、少なくとも約８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含み、好ましくは該リーダー配列は表１に示されるものである、軽鎖
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 配列番号３３又はリーダー配列を除く配列番号３３に示される配列を含み、好ましくは該リーダー配列は表１に示されるものである、ＶＨ；及び／又は
（ｉｉ） 配列番号３４又はリーダー配列を除く配列番号３４に示される配列を含み、好ましくは該リーダー配列は表１に示されるものである、ＶＬ
を含む、から実質的になる、又は、からなる。
別の側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－リンカー－ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａを含み、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々相補性決定領域であり；
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、配列番号１７～２０に示される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又は１００％同一の配列を有し、
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは、配列番号２１～２４に示される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又は１００％同一の配列を有する、並びに
ＣＤＲ１はＱＳＬＬＨＳＤＧＮＴＹ（配列番号１）という配列を有し、
ＣＤＲ２はＲＩＳ（配列番号２）という配列を有し、
ＣＤＲ３はＬＱＳＳＨＦＰＰＴ（配列番号３）という配列を有し、
ＣＤＲ１ａはＧＦＴＦＮＮＹＷ（配列番号４）という配列を有し、
ＣＤＲ２ａはＩＴＴＡＡＧＧＴ（配列番号５）という配列を有し、
ＣＤＲ３ａはＴＲＶＧＲＤＩＷＤＹ（配列番号６）という配列を有する。
上記した本発明の任意の側面において、該抗原結合性タンパク質は以下の配置：ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－-ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ－リンカー－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４でフレームワーク領域及び相補性決定領域を含んでいてもよい。
本明細書において定義されるリンカーは、化学物質、１以上のアミノ酸（ポリペプチドを含む）、又は２つのシステイン残基間に形成されるシスルフィド結合であり得る。
一側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は、配列番号７及び８のアミノ酸配列を、（ＮからＣ末端又はＣからＮ末端の順序で）含むか、該配列から実質的になる、又は、からなる。
一側面において、本発明は、ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供し、ここで該抗原結合性タンパク質は、配列番号３３及び３４（又はリーダー配列を除く配列番号３３及び３４）のアミノ酸配列を、（ＮからＣ末端又はＣからＮ末端の順序で）含むか、該配列から実質的になる、又は、からなる。
任意の側面において、該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） 単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ） 二量化ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ） 抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ；あるいは
（ｉｖ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ
の形態であってよい。
任意の側面において、該抗原結合性タンパク質は：
（ｉ） ダイアボディ；
（ｉｉ） トリアボディ；
（ｉｉｉ） テトラボディ
（ｉｖ） 二重特異性抗体；
（ｖ） Ｆａｂ；
（ｖｉ） Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉｉ） Ｆｖ；
（ｖｉｉｉ） 抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に連結した（ｉ）から（ｖｉｉ）の１つ；
（ｖｉｉｉ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結した（ｉ）から（ｖｉｉ）の１つ
の形態であってよい。
本発明はまた、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含むＣＬＥＣ９Ａ抗体を提供し、ここで該軽鎖可変領域は：
配列番号１に示されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号２に示されるＣＤＲ Ｌ２及び配列番号３に示されるＣＤＲ Ｌ３；並びに
配列番号１７に示されるＦＲ Ｌ１、配列番号１８に示されるＦＲ Ｌ２、配列番号１９に示されるＦＲ Ｌ３及び配列番号２０に示されるＦＲ Ｌ４；
を含み、かつ
該重鎖可変領域は：
配列番号４に示されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号５に示されるＣＤＲ Ｈ２及び配列番号６に示されるＣＤＲ Ｈ３；並びに
配列番号２１に示されるＦＲ Ｈ１、配列番号２２に示されるＦＲ Ｈ２、配列番号２３に示されるＦＲ Ｈ３及び配列番号２４に示されるＦＲ Ｈ４；
を含む。
前記タンパク質は、抗体の抗原結合ドメインということもできる。典型的には、該タンパク質は抗体、例えば、モノクローナル抗体である。
任意の側面又は実施態様において、該抗体は裸の抗体である。具体的には、該抗体は非コンジュゲート型であり、コンジュゲートを形成するように適応していない。
一例において、相補性決定領域配列（ＣＤＲｓ）は、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される。
本明細書でいうＣＬＥＣ９Ａに「結合する」タンパク質又は抗体は、ＣＬＥＣ９Ａ「特異的に結合する」又はＣＬＥＣ９Ａ「に特異的に結合する」タンパク質又は抗体を文字通りサポートしている。
別の側面において、本発明はまた、前記抗原結合性タンパク質又は抗体の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片を提供する。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、該融合タンパク質は、抗原などの分子をさらに含む。一実施態様において、該抗原は、抗原結合性タンパク質のＶＨのＮ又はＣ末端に融合される。別の実施態様において、該抗原は、抗原結合性タンパク質のＶＬのＮ又はＣ末端に融合される。別の実施態様において、該抗原は、抗原結合性タンパク質の定常領域のＮ又はＣ末端に融合される。任意の側面において、抗原結合性タンパク質と融合タンパク質の他の部分（例、抗原）とは、リンカーによって隔てられている。該リンカーは、アミノ酸であるアラニン、又はグリシン及びセリンを含むか、それらからなるリンカーを含めて、本明細書に記載される任意のリンカーであってよい。例示のリンカーとしては、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ及び（ＧＳ）１－４が挙げられる。
別の実施態様において、本発明は、標識にコンジュゲートされるか、治療剤にコンジュゲートされた、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質又は融合タンパク質の形態のコンジュゲートを提供する。そのような剤の例として、抗原、細胞傷害性物質、薬物及び／又は薬理学的物質が挙げられるが、それらに限定されない。一実施態様において、抗原結合性タンパク質又は融合タンパク質は、治療薬の送達のためのナノ粒子又はエマルジョンにコンジュゲートされてもよい。
任意の側面において、該抗原は、動物において免疫応答を誘発する任意の分子であり得る。例示として、がん抗原、自己抗原、アレルゲン、並びに／あるいは、病原性及び／又は感染性の生物由来の抗原が挙げられるが、それらに限定されない。例示となる抗原は本明細書に記載される。
本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートへの結合のための抗体を提供する。
本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートをコードする核酸を提供する。好ましくは、該核酸は、配列番号１～６に対応するアミノ酸配列のいずれか１つ以上と、配列番号１７～２４に対応する１以上の配列とをコードするヌクレオチド配列を有する。好ましくは、該核酸は、配列番号７及び／又は配列番号８に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、該核酸は、配列番号３３及び／又は配列番号３４に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。一実施態様において、該核酸は、配列番号１６に示される抗原結合性タンパク質のＶＨフレームワーク領域のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、該核酸は、配列番号１５に示される抗原結合性タンパク質のＶＬフレームワーク領域のヌクレオチド配列を含む。任意の実施態様において、該核酸は、配列番号２５、２６、２７及び／又は２８に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、該核酸は、配列番号２９、３０、３１及び／又は３２に示されるヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様において、該核酸は、配列番号２５～３２に示されるヌクレオチド配列を含む。任意の側面又は実施態様において、該核酸は、配列番号９～１１、１２～１４、又は９～１４のヌクレオチド配列をさらに含む。
別の側面において、該核酸は、配列番号１６及び／又は１５に示されるヌクレオチド配列を含む。
一例において、そのような核酸は、該核酸がプロモーターに作動可能に連結した発現コンストラクト中に含まれる。そのような発現コンストラクトは、ベクター、例えばプラスミド中に存在し得る。
任意の側面において、該核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。一実施態様において、該核酸はｍＲＮＡである。
単一のポリペプチド鎖抗原結合性タンパク質に関する発明の例において、該発現コンストラクトは、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に連結したプロモーターを含み得る。
抗原結合性タンパク質を形成する複数のポリペプチド鎖に関する例において、発現コンストラクトは、プロモーターに作動可能に連結した、例えばＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸、並びに、プロモーターに作動可能に連結した、例えばＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
別の例において、該発現コンストラクトは、例えば、以下の作動可能に連結した要素：
（ｉ） プロモーター；
（ｉｉ） 第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ） 内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ） 第２のポリペプチドをコードする核酸
を５’から３’の順に含むバイシストロニックな発現コンストラクトであり、
該第１のポリペプチドはＶＨを含み、該第２のポリペプチドはＶＬを含む、あるいはその逆も同様である。
本発明はまた、それらの１つはＶＨを含む第１のポリペプチドをコードし、もう１つはＶＬを含む第２のポリペプチドをコードする、別個の発現コンストラクトをも考慮している。例えば、本発明はまた、
（ｉ） プロモーターに作動可能に連結したＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト；及び
（ｉｉ） プロモーターに作動可能に連結したＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
を含む組成物を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載されるベクター又は核酸を含む細胞を提供する。好ましくは、該細胞は、単離され、実質的に精製されるか、あるいは組換えである。一例において、該細胞は本発明の発現コンストラクト、あるいは
（ｉ） プロモーターに作動可能に連結したＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト；及び
（ｉｉ） プロモーターに作動可能に連結したＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
であって、該第１及び第２のポリペプチドが会合して本発明の抗原結合性タンパク質を形成するもの
を含む。
本発明の細胞の例示として、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられる。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート、及び医薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、該医薬組成物は、アジュバント又はＤＣ活性化剤をさらに含有する。
別の側面において、該医薬組成物は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート以外の、いかなる樹状細胞活性化剤もアジュバントも含有しない。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート、希釈剤及び任意選択で標識を含有する診断組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートを含むキット又は製品を提供する。
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４定常領域又はそれらの混合物等のＩｇＧ定常領域を含んでもよい。ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はタンパク質の場合、該ＶＨは重鎖定常領域に連結することができ、該ＶＬは軽鎖定常領域に連結することができる。
一例において、本明細書に記載されるタンパク質又は抗体は、ＩｇＧ４抗体の定常領域又はＩｇＧ４抗体の安定化された定常領域を含む。一例において、該タンパク質又は抗体は、（Ｋａｂａｔのナンバリングシステム （Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８７及び／又は１９９１） による）２４１位、あるいは、配列番号３３のとおりのナンバリングで２４４位に、プロリンを有するＩｇＧ４定常領域を含む。
一例において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４定常領域もしくは安定化されたＩｇＧ４定常御領域（例、上述のとおり）に連結又は融合した、本明細書に開示されるＶＨ、並びに、κ軽鎖定常領域に連結又は融合したＶＬを含む。
本発明の抗原結合性タンパク質の機能特性は、変更すべきところは変更して、本発明の抗体に適用するように利用されよう。
一例において、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質又は抗体は、単離され、実質的に精製され、及び／又は組換えである。
一例において、本発明の抗原結合性タンパク質又は抗体は、別の化合物、例えば、検出可能な標識や、ポリエチレングリコールやアルブミン結合性タンパク質等の、該タンパク質又は抗体の半減期を延長する化合物にコンジュゲートされる。他の適切な化合物は本明細書に記載される。
別の側面において、本発明は、本発明の抗原結合性タンパク質又は抗体の製造方法をさらに提供する。例えば、そのような方法は、本発明の発現コンストラクトを、抗原結合性タンパク質又は抗体が産生されるのに十分な条件下で維持することを含む。
一例において、本発明の抗原結合性タンパク質又は抗体の製造方法は、本発明の細胞を該タンパク質又は抗体が産生され、任意で分泌されるのに十分な条件下で培養することを含む。
一例において、本発明の抗原結合性タンパク質又は抗体の製造方法は、該タンパク質又は抗体を単離し、任意で、該抗原結合性タンパク質又は抗体を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。
本発明は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質又は抗体、及び医薬上許容される担体を含有する組成物をさらに提供する。
別の側面において、本発明はまた、本発明の抗原結合性タンパク質及びＣＬＥＣ９Ａを含む複合体を提供する。一例において、該ＣＬＥＣ９Ａは組換えＣＬＥＣ９Ａである。
別の側面において、本発明は、対象における免疫応答の調節方法を提供し、当該方法は、該対象に本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を調節することを含む。
一実施態様において、抗原に対する免疫応答が誘発及び／又は増強される。好ましくは、該融合タンパク質又はコンジュゲートの一部である抗原に対する免疫応答が誘発及び／又は増強される。
特に好適な実施態様において、該免疫応答はヘルパーＴ細胞応答を増強することによって調節される。
さらなる好適な実施態様において、該免疫応答はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によって調節される。
別の好適な実施態様において、該免疫応答はＢ細胞の抗体産生を増強することによって調節される。産生する抗体の例としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４抗体アイソタイプが挙げられるが、必ずしもそれらに限定されない。
さらなる好適な実施態様において、該免疫応答は記憶応答を生じさせることによって調節される。
さらなる側面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答の調節方法を提供し、当該方法は、樹状細胞又はその前駆体をインビトロで本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物に曝露し、該細胞を該対象に投与し、それによって該対象における該抗原に対する免疫応答を調節することを含む。
一実施態様において、該細胞は該対象から単離されたものである。好ましくは、液性応答及び／又はＴ細胞介在性応答が調節される。
さらなる実施態様において、ナイーヴＣＤ８＋Ｔ細胞活性化及び／又はナイーヴＣＤ４＋Ｔ細胞活性化が調節される。
さらに別の実施態様において、該液性応答はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び／又はＩｇＧ４抗体アイソタイプの産生を含む。
別の実施態様において、該液性応答は、少なくともＩｇＧ１抗体アイソタイプの産生を含む。
好ましくは、該樹状細胞は、動物の樹状細胞又は動物樹状細胞の前駆体である。より好ましくは、該樹状細胞はヒト樹状細胞である。いっそう好ましくは、該ヒト樹状細胞は、ＮＥＣＬ－２＋、ＨＬＡ ＤＲ＋、ＸＣＲ－１＋、ＣＬＥＣ９Ａ＋及び／又はＢＤＣＡ－３＋である。
さらに別の側面において、本発明は、樹状細胞もしくはその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防方法を提供し、当該方法は、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物を対象に投与し、それによって樹状細胞もしくはその前駆体が関与する疾患を治療及び／又は予防することを含む。
樹状細胞もしくはその前駆体が関与する疾患の例としては、がん、感染、自己免疫疾患又はアレルギーが挙げられるが、それらに限定されない。感染症の例としては、コロナウイルス（例、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザ、デング熱、手足口病が挙げられる。
本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物は、感染症という観点では、予防的に、即ち、予防方法において使用することができる。あるいは、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物は、がんという観点では、治療的に、即ち、治療方法において使用することができる。
別の側面において、本発明は、対象における免疫応答を調節するための医薬の製造のための、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物の使用を提供する。
さらなる側面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答を調節するための医薬の製造のための、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物にインビトロで曝露した樹状細胞又はその前駆体の使用を提供する。
さらに別の側面において、本発明は、対象における樹状細胞もしくはその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防用の医薬の製造のための、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物の使用を提供する。
別の側面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答の調節における使用のための、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、樹状細胞もしくはその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防における使用のための、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、サンプルからの樹状細胞又はそのサブセット又はその前駆体の富化方法であって、
（ｉ） 樹状細胞又はその前駆体を含むサンプルを、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物と接触させること、及び
（ｉｉ） 本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲートに結合した細胞を単離すること
を含む、方法を提供する。
さらなる側面において、本発明は、サンプル中の樹状細胞又はそのサブセット又はその前駆体の検出方法であって、
（ｉ） 樹状細胞又はその前駆体を含むサンプルを、本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲートと接触させること、
（ｉｉ） 本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲートに結合した細胞を検出すること
を含む、方法を提供する。
好適な実施態様において、該樹状細胞は、以下のマーカー、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＮＥＣＬ－２（細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、ＢＬ２、ＩＧＳＦ４、ＲＡ１７５、ＳＴ１７、ＳＹＮＣＡＭ、ＴＳＬＣ１ともいう）、ＣＤ１１ｃ（インテグリンα Ｘともいう）、ＨＬＡＤＲ、ＸＣＲ－１（ＸＣＬ１－１に対する受容体、ＡＴＡＣ、リンホタクチン－１又はＳＣＭ－１ともいう）、ＣＬＥＣ９Ａ及びＢＤＣＡ３（トロンボモジュリン、ＴＨＢＤ、ＡＨＵＳ６、ＴＨＰＨ１２、ＴＨＲＭ、ＴＭ、ＣＤ１４１ともいう）の１以上を発現する。
好ましくは、該樹状細胞は、以下のマーカー、ＮＥＣＬ－２、ＨＬＡＤＲ、ＸＣＲ－１、ＣＬＥＣ９Ａ及びＢＤＣＡ３の１以上を発現するヒト樹状細胞である。
好ましくは、前駆樹状細胞は、培養中で、及び／又は放射線照射したレシピエントへの移入で、樹状細胞に分化し得る中間又は後期の前駆樹状細胞である。
好ましくは、対象は動物である。より好ましくは、該対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ又はヒツジなどの哺乳動物である。最も好ましくは、該対象はヒトである。
文脈上別の解釈を必要とする場合を除き、本明細書で用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」等の当該用語の変形は、さらなる添加物、成分、整数（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）又は工程を排除することを意図しない。
本発明のさらなる側面及び先行する段落に記載された側面のさらなる実施態様は、実施例として与えられる以下の記載から、また添付の図面を参照して、明らかとなるであろう。
Ａ．精製したヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ ＡｂのＥＬＩＳＡによる結合。プレートを可溶性ヒトＣＬＥＣ９Ａでコーティングし、ヒト／ラットキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂとヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの結合を、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジンＨＲＰとを用いて検出した。データは６回の独立した実験の代表的なものである。Ｂ．ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの細胞表面ＣＬＥＣ９Ａへの結合。２９３Ｆ細胞をヒトＣＬＥＣ９Ａをコードする発現コンストラクトでトランスフェクトし、示された濃度でのヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの結合を、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジン－ＰＥとを用いて、フローサイトメトリーにより検出した。 Ｃ．ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂのヒト血液ＤＣへの結合。ＰＢＭＣから富化したヒト血液ＤＣを抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂで染色し、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチン及びストレプトアビジン－ＰＥ、並びにｃＤＣ１（ＣＤ１４１）、ｃＤＣ２（ＣＤ１ｃ）及びｐＤＣ（ＣＤ１２３）を区別するマーカーを用いて検出した。データは２回の独立した実験の代表的なものである。 Ａ．及びＢ．精製したヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－ＡｇのＥＬＩＳＡによる結合。プレートを可溶性ＣＬＥＣ９Ａでコーティングし、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジンＨＲＰとを用いて、抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１（Ａ）又は抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＲＢＤ（Ｂ）について、Ａｂ結合を検出した。データは２回の独立した実験の代表的なものである。 Ｃ．ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ、抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１、抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ｍ２ｅ、抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＮＹ－ＥＳＯ－１及び抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＲＢＤを発現させ、精製して、ヒトＣＬＥＣ９Ａでトランスフェクトした２９３Ｆ細胞又は非トランスフェクト対照へのＡｂ結合（５μｇ／ｍｌ）を、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジン－ＰＥとを用いて、フローサイトメトリーにより検出した。データは２回の独立した実験の代表的なものである。 Ｄ．ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇのヒト血液ＤＣへの結合。ＰＢＭＣから富化したヒト血液ＤＣを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ又は抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇで染色し、抗ヒトＩｇＧ４－ビオチン及びストレプトアビジン－ＰＥ、並びにｃＤＣ１（ＣＤ１４１）、ｃＤＣ２（ＣＤ１ｃ）及びｐＤＣ（ＣＤ１２３）を区別するマーカーを用いて検出した。データは、抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ、抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１及び抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＲＢＤについては、３回の独立した実験、抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ｍ２ｅ及び抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＮＹ－ＥＳＯ－１については１回の実験の代表的なものである。 脾臓中でヒトナイーヴＷＴ１２３５－２４３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレパートリー及びヒト樹状細胞サブセットを発生するヒト化マウスを作製した。脾臓細胞を単離し、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１抗体及び対照（１０μｇ／ｍｌ）とともに培養した。データはトリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均＋ＳＤを示し、２回の独立した実験の代表的なものである。一晩培養後、Ｔ細胞活性化をＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
本明細書に開示され、定義される発明は、本テキスト又は図面から述べられ又は証される２以上の個々の特徴すべての択一的な組み合わせまで拡張する。これらの異なる組み合わせのすべてが本発明の種々の択一的な側面を構成する。
本発明のさらなる側面及び先行する段落に記載された側面のさらなる実施態様は、例示として提供される以下の記載から、また添付の図面を参照して、明らかとなるであろう。
これから、本発明のある特定の実施態様について詳細に述べる。本発明を当該実施態様とともに説明するが、本発明をそれらの実施態様に限定することを何ら意図するものではない。それとは反対に、本発明は、請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、改変及び均等物を包含することが意図される。
本発明者らは、ＣＬＥＣ９Ａに結合する抗原結合性タンパク質、例えば抗体を開発した。本発明者らはまた、ＣＬＥＣ９Ａ、好ましくはヒトＣＬＥＣ９Ａに結合するが、フレームワーク領域の改変によりヒトにおける免疫原性が低下した抗体を開発した。具体的には、フレームワーク領域を改変、即ちヒト化して、ヒト対象が該抗体に対して免疫応答を生じる可能性を低減した。
驚くべきことに、フレームワーク領域に改変を有する抗体は、依然としてＣＬＥＣ９Ａに対して強力な親和性と特異性とを保持し、抗原性のアミノ酸配列と融合してもそうである。例えば、本発明者らは、腫瘍抗原ＷＴ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１、あるいは感染症抗原ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ及びインフルエンザＭ２ｅ（Ｍ２の細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ））に融合させたヒト化ＣＬＥＣ９Ａ抗体を含む融合タンパク質を作製した。従って、本発明の抗原結合性タンパク質は、免疫応答の誘導のために、ワクチン／腫瘍抗原や他の積荷等のペイロードを、インビトロ及びインビボの両方でヒト樹状細胞に送達する手段を提供する。
全般
本明細書を通じて、特にそうでないとことわらないか、文脈上そうでない必要がなければ、単一の工程、組成物、工程群又は組成物群は、１つ及び複数（即ち、１以上）の工程、組成物、工程群又は組成物群を包含するものと解釈される。従って、本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことを示していなければ、複数の場合を含み、その逆もまた然りである。例えば、「ａ」という場合、単一及び２以上を含む；「ａｎ」という場合、単一及び２以上を含む；「ｔｈｅ」という場合、単一及び２以上を含む、等である。
当業者は、本発明が、具体的に記載される以外の変形や改変を許容し得ると理解するであろう。本発明はそのようなすべての変形及び改変を含むと理解すべきである。本発明はまた、本明細書において言及され、又は示されるすべての工程、特徴、組成物及び化合物を、個別に又は包括的に含み、当該工程又は特徴の、任意かつすべての組み合わせ、あるいは、それらの任意の２以上を含む。
当業者は、本発明の実施に用い得るであろう、本明細書に記載される方法及び物質と類似の、又は均等な、多くの方法及び物質を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び物質に何ら限定されない。
本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施例の範囲に限定されるべきではなく、それらは単なる例示目的であることが意図される。機能的に等価な物質、組成物及び方法は、明らかに本発明の範囲内である。
本明細書における本発明のいかなる例示又は実施態様も、特にそうでないとことわらなければ、本発明の任意の他の例示又は実施態様に、変更すべきところは変更して適用されるものと解釈される。
特に別の定義をしない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学における）当業者が通常理解するのと同じ意味を有するものと解釈される。
別段示さなければ、本開示に利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技術は、当業者に公知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までのすべての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），及びＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）等のソースにおいて、当該文献を通じて記載され、説明されている。
本明細書における可変領域及びその一部、イムノグロブリン、抗体及びその断片の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２，３０９－３２０，１９９４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３，１９８９及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３，９２７－９４８，１９９７における考察により、さらに明確となり得る。
用語「及び／又は」例えば「Ｘ及び／又はＹ」は「Ｘ及びＹ」か「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと理解され、両方の意味といずれかの意味の明示的な裏付けが提供されるものと解釈される。
本明細書で用いられる用語「に由来する」は、特定の整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）が、ある特定のソースから（必ずしもそのソースから直接である必要はないが）得られうることを示すものであると解釈される。
本明細書において言及する、例えば残基の、範囲は包括的であると理解されよう。例えば、「アミノ酸５６から６５を含む領域」という場合は、包括的な様式で、即ち、当該領域が、特定の配列中、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５と番号づけされたアミノ酸の配列を含むと理解されよう。
選択された定義
ＣＬＥＣ９Ａ（ＤＮＧＲ１、ＵＮＱ９３４１、ＣＤ３７０、ＤＮＧＲ－１、Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ９ ｍｅｍｂｅｒ Ａ、Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ９Ａとしても知られる）は、活性化受容体として機能し、樹状細胞上で発現する、グループＶ Ｃ型レクチン様受容体（ＣＬＲ）である。ＣＬＥＣ９Ａは、死細胞由来の物質の取り込み及びプロセッシングに特化した樹状細胞の小サブセット上でエンドサイトーシス受容体として機能し得る。ＣＬＥＣ９Ａは、アクチン結合性タンパク質と会合することができ、細胞膜が損傷した場合に露出することができ、死細胞関連抗原の交差提示を媒介し得るフィラメント状のアクチンを認識する。
本明細書において提供される用語「ＣＬＥＣ９Ａ」は、ＣＬＥＣ９Ａタンパク質の天然型、ＣＬＥＣ９Ａの活性を維持する（例、ネイティブなタンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性）ホモログ又はバリアントのいずれをも包含する。いくつかの実施態様において、バリアント又はホモログは、天然型と比較して、該配列の全配列又は一部（例、５０、１００、１５０又は２００個の連続するアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施態様において、ＣＬＥＣ９Ａタンパク質は配列番号３６で特定されるタンパク質、そのホモログ又は機能的断片である。
命名目的のみで限定のためではなく、ヒトＣＬＥＣ９Ａのアミノ酸配列の例は配列番号３６である。
本明細書で用いられる用語「Ｃ型レクチン様ドメイン」又は「ＣＴＬＤ」とは、多くの動物種から単離された多くのタンパク質中で同定されているタンパク質ドメインファミリーをいう。最初、ＣＴＬＤドメインは、いわゆるＣ型レクチン（カルシウム依存性糖結合タンパク質）に共通のドメインとして同定され、「糖認識ドメイン」（「ＣＲＤ」）と命名された。より最近、このドメインは多くの真核タンパク質の間で共有され、それらのうちのいくつかは糖部分に結合せず、そのため、古典的なドメインはＣＴＬＤと命名された。ＣＴＬＤは、糖、脂質及びタンパク質を含む非常に多様な化合物に結合することが報告されている。ＣＴＬＤは、約１２０アミノ酸残基からなり、特徴的に、２又は３つの鎖内ジスルフィド架橋を含む。異なるタンパク質由来のＣＴＬＤ間のアミノ酸配列レベルでの類似性は比較的低いが、多くのＣＴＬＤの３Ｄ構造は高度に保存されており、いわゆるループ領域に本質的に限られた、しばしば５つのループまでで規定される構造的変異を有することが分かってきた。
本明細書で用いられる用語「免疫応答」とは、抗原に応答した、対象の免疫系の反応性における変化をいい、抗体産生、細胞介在性免疫の誘導、補体活性化及び／又は免疫寛容の発生を含み得る。
本明細書で用いられる「サンプル」は、樹状細胞又はその前駆体を含むことが疑われる任意の生物材料であり得る。例としては、血液、例えば全末梢血、臍帯血、胎児血、骨髄、血漿、血清、尿、培養細胞、唾液又は尿道スワブ、リンパ組織、例えば扁桃腺、パイエル板、虫垂、胸腺、脾臓及びリンパ節等が挙げられるが、それらに限定されない。サンプルは直接試験してもよいし、試験に先立ってなんらかの形の処理を必要としてもよい。例えば、生検サンプルは試験に先立ってホモジナイズして細胞懸濁液を作製する必要があり得る。さらに、生物サンプルが液状でない範囲で（例えば、固形、半固形又は無水液体サンプルであり得る）、サンプルは、緩衝液等の試薬を添加して可動化する必要があり得る。可動化試薬は、サンプルを、例えば本発明の抗原結合性タンパク質と接触させる前に、該サンプルと混合してもよい。
用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」は、それが由来する起源又はソースにより、ネイティブな状態でそれと共にある天然に付随する成分が付随せず、同じソースに由来する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質又はポリペプチドである。タンパク質は、当該技術分野で公知のタンパク質精製技術を用いて、単離により天然に付随する成分を実質的に含まなくなる、即ち、実質的に精製され得る。「実質的に精製される」とは、夾雑物質を実質的に含まない、例えば、少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％夾雑物質が除かれていることを意味する。
用語「組換え」は、人工的な遺伝子組換えの産物を意味するものと理解される。従って、抗体の抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質の文脈では、この用語は、Ｂ細胞成熟化の間に起こる自然組換えの産物である、対象の体内に天然に存在する抗体を包含しない。しかし、そのような抗体が単離されれば、抗体の抗原結合ドメインを含む単離されたタンパク質であるとみなすべきである。同様に、該タンパク質をコードする核酸を単離し、組換え手段を用いて発現させれば、結果として生じるタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質である。また、組換えタンパク質は、例えば、それを発現する細胞、組織又は対象内にある場合、人工的な組換え手段により発現したタンパク質を包含する。
用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、即ち、ペプチド結合により連結した一連の連続するアミノ酸、あるいは、お互いに共有的もしくは非共有的に結合した複数の一連のポリペプチド鎖（即ち、ポリペプチド複合体）を含むものと解釈される。例えば、複数の一連のポリペプチド鎖は、適切な化学結合もしくはジスルフィド結合を用いて、共有的に結合させることができる。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用等が挙げられる。
用語「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」は、先行する段落からペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸を意味することが理解されよう。
本明細書で用いられる用語「抗原結合性タンパク質」は、「抗原結合ドメイン」と互換的に用いられ、抗原に特異的に結合し得る抗体の領域、即ち、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨとＶＬの両方を含むＦｖを意味するものと解釈される。抗原結合ドメインは、完全抗体の状態にある必要はなく、例えば、単離されていてもよいし（例、ドメイン抗体）、あるいは別の形態、例えば、ｓｃＦＶ等の本明細書に記載される形態であってもよい。
本開示のために、用語「抗体」は、Ｆｖ中に含まれる抗原結合ドメインにより、１又は数個の非常に関連した抗原（例、ＣＬＥＣ９Ａ）に特異的に結合し得るタンパク質を含む。この用語は、４本鎖抗体（例、２本の軽鎖と２本の重鎖）、組換えもしくは改変抗体（例、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、類似ヒト化抗体、半抗体、二重特異性抗体）を含む。抗体は、一般的に、定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片内に配置され得る定常ドメインを含む。抗体の例示的な形態は、基本単位として４本鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合した２本の重鎖（約５０～７０ｋＤ）と２本の軽鎖（各約２３ｋＤ）を含む。軽鎖は、一般に、可変領域（もし存在すれば）及び定常ドメインを含み、哺乳動物ではκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は、一般に、可変領域と、ヒンジ領域によってさらなる定常ドメインと連結された１つ又は２つの定常ドメインとを含む。哺乳動物の重鎖は、以下のタイプα、δ、ε、γ又はμのいずれか１つである。各軽鎖はまた、重鎖の１つに共有結合している。例えば、２本の重鎖と、重鎖及び軽鎖とが、鎖間ジスルフィド結合及び非共有的相互作用によって一緒に保持されている。鎖間ジスルフィド結合の数は、異なる抗体の種類により変動し得る。各鎖はＮ末端可変領域（各々が約１１０アミノ酸長であるＶＨ又はＶＬ）及びＣ末端に１以上の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（約１１０アミノ酸長であるＣＬ）は、重鎖の第一の定常ドメイン（３３０～４４０アミノ酸長であるＣＨ１）とアラインし、それにジスルフィド結合している。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域とアラインしている。抗体重鎖は２以上のさらなるＣＨドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３等のような）を含むことができ、ＣＨ１及びＣＨ２定常ドメインの間にヒンジ領域を含むことができる。抗体は、任意のタイプ（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。一例において、抗体はネズミ（マウス又はラット）抗体又は霊長類（例えば、ヒト等）抗体である。一例において、抗体重鎖はＣ末端リジン残基がない。一例において、抗体はヒト化、類似ヒト化、キメラ化、ＣＤＲ移植化又は脱免疫化されている。
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」又は「完全抗体」は互換的に用いられ、抗体の抗原結合断片とは反対に、実質的にインタクトな形態の抗体のことをいう。具体的には、完全抗体は、Ｆｃ領域を含めて重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、野生型配列の定常ドメイン（例、ヒト野生型配列の定常ドメイン）であっても、そのアミノ酸配列バリアントであってもよい。
本明細書で用いられる「可変領域」とは、抗原に特異的に結合することができ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される抗体の軽鎖及び重鎖の部分のことをいう。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲとともに、３つもしくは４つのＦＲ（例、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意にＦＲ４）を含む。ＶＨとは重鎖の可変領域のことをいい、ＶＬとは軽鎖の可変領域のことをいう。
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」（同義語：ＣＤＲ；即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とは、抗体可変領域のアミノ酸残基のことをいい、それらの存在が特異的な抗原結合に対して主に寄与する。各可変領域ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲを有する。本明細書では、ＶＨのＣＤＲを、それぞれＣＤＲ Ｈ１（もしくはＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ Ｈ２（もしくはＨＣＤＲ２）及びＣＤＲ Ｈ３（ＨＣＤＲ３）ともいい、ＣＤＲ Ｈ１はＶＨのＣＤＲ１に相当し、ＣＤＲ Ｈ２はＶＨのＣＤＲ２に相当し、ＣＤＲ Ｈ３はＶＨのＣＤＲ３に相当する。同様に、本明細書では、ＶＬのＣＤＲを、それぞれＣＤＲ Ｌ１（もしくはＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ Ｌ２（もしくはＬＣＤＲ２）及びＣＤＲ Ｌ３（ＬＣＤＲ３）ともいい、ＣＤＲ Ｌ１はＶＬのＣＤＲ１に相当し、ＣＤＲ Ｌ２はＶＬのＣＤＲ２に相当し、ＣＤＲ Ｌ３はＶＬのＣＤＲ３に相当する。一例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１（本明細書において「Ｋａｂａｔのナンバリングシステム」ともいう）に従って定義される。別の例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って定義される。本発明は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによって定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されず、古典的なナンバリングシステム、あるいはＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３，１９８９；及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８，１９９７のナンバリングシステム；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕ（ウムラウト付き）ｋｔｈｕｎ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９：６５７－６７０，２００１のナンバリングシステム；又はＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２０６－２１１，１９９７において考察されるＩＭＧＴシステムを含めて、すべてのナンバリングシステムを包含する。一例において、ＣＤＲはＫａｂａｔのナンバリングシステムに従って定義される。任意で、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによる重鎖ＣＤＲ２は、本明細書に列挙される５個のＣ末端アミノ酸を含まないか、それらのアミノ酸のいずれか１個以上が別の天然アミノ酸で置換されている。この点に関し、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ９：１３３－１３９，１９９５は、重鎖ＣＤＲ２の当該５つのＣ末端アミノ酸が、一般に抗原結合に関与しないことを実証した。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）はＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。本明細書では、ＶＨのＦＲを、それぞれＦＲ Ｈ１（もしくはＨＦＲ１）、ＦＲ Ｈ２（もしくはＨＦＲ２）、ＦＲ Ｈ３（もしくはＨＦＲ３）及びＦＲ Ｈ４（もしくはＨＦＲ４）ともいい、ＦＲ Ｈ１はＶＨのＦＲ１に相当し、ＦＲ Ｈ２はＶＨのＦＲ２に相当し、ＦＲ Ｈ３はＶＨのＦＲ３に相当し、ＦＲ Ｈ４はＶＨのＦＲ４に相当する。同様に、本明細書では、ＶＬのＦＲを、それぞれＦＲ Ｌ１（もしくはＬＦＲ１）、ＦＲ Ｌ２（もしくはＬＦＲ２）、ＦＲ Ｌ３（もしくはＬＦＲ３）及びＦＲ Ｌ４（もしくはＬＦＲ４）ともいい、ＦＲ Ｌ１はＶＬのＦＲ１に相当し、ＦＲ Ｌ２はＶＬのＦＲ２に相当し、ＦＲ Ｌ３はＶＬのＦＲ３に相当し、ＦＲ Ｌ４はＶＬのＦＲ４に相当する。
本明細書で用いられる用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチド又は単一のポリペプチドで構成されようが、ＶＬとＶＨとが会合して抗原結合ドメインを有する複合体を形成する、即ち、抗原に特異的に結合し得る、任意のタンパク質を意味するものと解釈される。抗原結合ドメインを形成するＶＨとＶＬとは、単一のポリペプチド鎖中にあってもよいし、異なるポリペプチド鎖中にあってもよい。さらに、本発明のＦｖ（並びに本発明の任意のタンパク質）は、同一の抗原に結合してもしなくてもよい複数の抗原結合ドメインを有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片並びに組換え手段を用いて製造されるそのような断片に対応するタンパク質を包含するものであると理解される。いくつかの例において、ＶＨは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に連結していない、及び／又はＶＬは軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結していない。Ｆｖ含有ポリペプチド又はタンパク質の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はより高次の複合体、あるいは、定常領域又はそのドメイン、例えばＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインに連結した前記のいずれか、例えば、ミニボディが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、イムノグロブリンの１価の抗原結合断片からなり、完全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖と重鎖の一部からなる断片を得ることにより製造することができ、あるいは組換え手段を用いて製造することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、完全抗体をペプシンで処理した後還元し、インタクトな軽鎖と、ＶＨ及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部とからなる分子を得ることにより取得することができる。この方法で処理した抗体あたり２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は組換え手段によっても製造することができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合により一緒に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、完全抗体分子を、その後の還元なしで酵素ペプシンで処理することにより得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパーやＣＨ３ドメインを用いて連結した２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とが、適切なフレキシブルなポリペプチドリンカーにより共有的に連結した、抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組換え分子である。
抗原結合性タンパク質又はその抗原結合ドメインと抗原との相互作用に関連して、本明細書で用いられる用語「結合する」とは、当該相互作用が、抗原上の特定の構造（例、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質全般ではなく、むしろ特定のタンパク質構造を認識して結合する。もし抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識した「Ａ」とタンパク質とを含む反応において、エピトープ「Ａ」（もしくはフリーの未標識「Ａ」）を含む分子が存在すると、該抗体に結合する標識化「Ａ」の量は低下するだろう。
本明細書で用いられる用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、本発明の抗原結合性タンパク質が、特定の抗原又はそれを発現する細胞に、それが別の抗原又は細胞に対してそうであるよりも、より高頻度かつより急速に、より持続的及び／又はより高親和性で、反応し会合することを意味するものと解釈される。例えば、抗原結合性タンパク質は、それが１以上の他の非常に関連したタンパク質に対するよりも、顕著に高親和性で（例、１．５倍又は２倍又は５倍又は１０倍又は２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍又は１００倍又は１５０倍又は２００倍）、ＣＬＥＣ９Ａ（例、ヒトＣＬＥＣ９Ａ）に結合する。本発明の一例において、ＣＬＥＣ９Ａ（好ましくは、ヒト）に「特異的に結合する」抗原結合性タンパク質は、それがＣＴＬＤを含む別のタンパク質に対するよりも、少なくとも１．５倍又は２倍以上（例、５倍又は１０倍又は２０倍又は５０倍又は１００倍又は２００倍）の親和性で結合する。一般に、結合という場合は特異的な結合を意味するが、必ずしもそうではなく、各用語は他の用語の明示的なサポートを提供するものであると理解される。
本明細書で用いられる用語「検出可能に結合しない」は、抗原結合性タンパク質、例えば抗体が、バックグラウンドよりも１０％未満又は８％未満又は６％未満又は５％未満高いレベルで、候補抗原に結合することを意味するものと理解される。バックグラウンドは該タンパク質の非存在下及び／又はネガティブコントロールタンパク質（例、アイソタイプコントロール抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、並びに／あるいは、ネガティブコントロール抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合のレベルは、当該技術分野で公知の結合アッセイ、例えば、バイオセンサー分析（例、ビアコア）、フローサイトメトリー、抗原結合性タンパク質を固相化し、抗原と接触させるＥＬＩＳＡ等を用いて検出され、あるいは、抗原が細胞表面上に発現する場合、結合はフローサイトメトリーを用いて検出される。
本明細書で用いられる用語「有意に結合しない」は、本発明の抗原結合性タンパク質のポリペプチドへの結合のレベルが、バックグラウンド、例えば、該抗原結合性タンパク質の非存在下及び／又はネガティブコントロールタンパク質（例、アイソタイプコントロール抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、並びに／あるいは、ネガティブコントロールポリペプチドの存在下で検出される結合のレベルよりも、統計学的に有意に高くないことを意味するものと理解される。結合のレベルは、当該技術分野で公知の結合アッセイ、例えば、バイオセンサー分析（例、ビアコア）、フローサイトメトリー、抗原結合性タンパク質を固相化し、抗原と接触させるＥＬＩＳＡ等を用いて検出され、あるいは、抗原が細胞表面上に発現する場合、結合はフローサイトメトリーを用いて検出される。
本明細書で用いられる用語「エピトープ」（同義語「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗原結合性タンパク質が結合する、ＣＬＥＣ９Ａの領域を意味するものと理解される。特段の定義がなければ、この用語は、必ずしも抗原結合性タンパク質が接触する特定の残基又は構造に限定されない。例えば、この用語は、抗原結合性タンパク質が接触するアミノ酸と、この領域の外側の５～１０（もしくはそれ以上の）アミノ酸又は２～５アミノ酸又は１～３アミノ酸とにまたがる領域を含む。いくつかの例において、エピトープは、抗原結合性タンパク質が折り畳まれたとき、お互いに近くに位置する一連の不連続なアミノ酸、即ち、「コンフォーメーションエピトープ」を含む。当業者はまた、用語「エピトープ」はペプチドやポリペプチドに限定されないことをも認識するだろう。例えば、用語「エピトープ」は、糖側鎖、ホスホリル側鎖、スルフォニル側鎖等の化学的に活性な、分子の表面集団を含み、また、ある例においては、特異的な三次元構造的特徴及び／又は特異的な荷電特性を有していてもよい。
本明細書で用いられる用語「状態」とは、正常な機能の破壊又は障害のことをいい、いかなる特定の状態にも限定されず、疾患や障害を包含するであろう。
本明細書で用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防」は、本発明の抗原結合性タンパク質を投与し、それによって、状態の少なくとも１つの症状の発生を止める又は遅らせることを含む。この用語はまた、再発の予防又は遅延のための緩和における対象の処置をも包含する。
本明細書で用いられる用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療」は、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を投与し、それによって、特定の疾患又は状態の少なくとも１つの症状を低減する、又は取り除くことを含む。
本明細書で用いられる用語「対象」とは、ヒトを含む任意の動物、例えば哺乳動物を意味するものであると解釈される。対象の例としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるがそれらに限定されない。例えば、対象はヒトである。
抗体
一例では、任意の実施例により本明細書に記載される抗原結合性タンパク質又はＣＬＥＣ９Ａ結合性タンパク質は抗体である。
抗体の作製方法は当該技術分野で知られ、及び／又はＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。一般的に、そのような方法において、ＣＬＥＣ９Ａ（例、ヒトＣＬＥＣ９Ａ）又はその領域（例、細胞外領域）又はその免疫原性断片もしくはエピトープ又はそれらを発現し提示する細胞（即ち、免疫原）を、任意選択で、任意の適切もしくは所望の担体、アジュバント又は医薬上許容される賦形剤と製剤化して、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ又はブタに投与する。該免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内に、又は他の公知の経路によって投与し得る。
ポリクローナル抗体の製造は、免疫後の種々の時点で免疫した動物の血液をサンプリングすることによってモニタリングすることができる。所望の抗体価を達成するのに必要であれば、１回以上の追加免疫を行うことができる。追加免疫及び力価測定のプロセスは、適切な力価が得られるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫した動物から採血し、血清を単離し保存する、及び／又は該動物を用いてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製する。
モノクローナル抗体は、本発明が意図する１つの例示的な形態である。用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」とは、同一の抗原、例えば、抗原内の同一エピトープに結合し得る均一な抗体集団のことをいう。この用語は、抗体のソースやそれが作られる方法に関して限定されることを意図しない。
ｍＡｂの製造のために、例えば、ＵＳ４１９６２６５やＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），上述に例示される手順等の、多くの公知技術のいずれか１つを使用することができる。
例えば、適切な動物を、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下、免疫原で免疫する。ウサギ、マウス及びラット等の齧歯類が動物として例示される。また、例えばマウス抗体を発現しない、ヒト抗体を発現するように遺伝子操作されたマウスも、本発明の抗体を作製するのに用いることができる（例えば、ＷＯ２００２／０６６６３０に記載のとおり）。
免疫後、抗体産生能を有する体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を、ｍＡｂ作製プロトコールに使用するために選択する。これらの細胞は脾臓、扁桃腺又はリンパ節の生検から取得するか、末梢血サンプルから取得することができる。次に、免疫動物由来のＢ細胞を、一般に、免疫原で免疫した動物と同種由来の不死ミエローマ細胞と融合させる。
ハイブリッドを、組織培養培地中での新規な核酸合成を遮断する薬剤を含む選択培地中で培養することにより増幅させる。薬剤の例としては、アミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンが挙げられる。
増幅されたハイブリドーマを、例えば、フローサイトメトリー及び／又は免疫組織化学的検査及び／又はイムノアッセイ（例、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫法、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイ等）により、抗体特異性及び／又は力価の機能的選択に供する。
あるいは、ＡＢＬ－ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１３，ＵＳＡ）を用いて、ＭＡｂを分泌する細胞株（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９７：８５－９５，１９９６に記載される）を製造する。
抗体はまた、ディスプレイライブラリー、例えば、ＵＳ６３０００６４及び／又はＵＳ５８８５７９３に記載されるファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによっても製造又は単離することができる。例えば、本発明者らは、ファージディスプレイライブラリーから完全ヒト抗体を単離した。
本発明の抗体は、合成抗体であっても、組換え抗体であってもよい。
抗体結合ドメイン含有タンパク質
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」なる用語と互換的に用いられる）であるか、それを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。ある例において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ、例えば、ＵＳ６２４８５１６参照）。
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、ＷＯ９８／０４４００１及び／又はＷＯ９４／００７９２１に記載されるような、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又は高次タンパク質複合体であるか、それを含む。
例えば、ダイアボディは、２つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造ＶＬ－Ｘ－ＶＨ又はＶＨ－Ｘ－ＶＬを含み、ここでＶＬは抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖中のＶＨとＶＬとが会合する（又はＦｖを形成する）のを可能にするには不十分な残基を含むリンカーであるか、あるいは存在しない。ポリペプチド鎖のＶＨは他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して抗原結合ドメインを形成し、即ち、１以上の抗原に特異的に結合する能力があるＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖で同一であってもよいし、二重特異性抗体（即ち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）を形成するように、ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖で異なっていてもよい。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖中にＶＨ及びＶＬ領域と、ｓｃＦｖが抗原結合のために（即ち、単一のポリペプチド鎖のＶＨとＶＬとがお互いに会合してＦｖを形成するために）所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬの間のポリペプチドリンカーを含むことを認識するであろう。例えば、該リンカーは、ｓｃＦｖ用のより好適なリンカーの１つである（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む１２を超えるアミノ酸残基を含む。
本発明はまた、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、それらシステイン残基がジスルフィド結合により連結して安定なＦｖが得られる、ジスルフィド安定化Ｆｖ（もしくはｄｉＦｖもしくはｄｓＦｖ）を企図する。
あるいは、又はそれに加えて、本発明は、二量体ｓｃＦｖ、即ち、非共有もしくは共有結合、例えばロイシンジッパードメイン（例、Ｆｏｓ又はＪｕｎ由来）により連結した２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。あるいは、２つのｓｃＦｖは、例えばＵＳ２００６０２６３３６７に記載されるように、両ｓｃＦｖが形成されて抗原に結合することを可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによっれ連結される。
重鎖抗体
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まないという限りにおいて、多くの他の形態の抗体とは構造的に異なる。従って、これらの抗体は、「重鎖のみ抗体」とも呼ばれる。重鎖抗体は、例えばラクダや軟骨魚類にみられる（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）。
天然の重鎖抗体に存在する可変領域は、通常の４本鎖抗体に存在する重鎖可変領域（それらは「ＶＨドメイン」という）及び通常の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（それらは「ＶＬドメイン」という）と、それらを区別するために、一般にラクダ抗体においては「ＶＨＨドメイン」、ＩｇＮＡＲにおいてはＶ－ＮＡＲと呼ばれる。
ラクダ由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの製造及び／又は単離及び／又は使用方法の一般的記載は、とりわけ以下の文献：ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９７／４９８０５及びＷＯ９７／４９８０５にみられる。
軟骨魚類由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの製造及び／又は単離及び／又は使用方法の一般的記載は、とりわけＷＯ２００５／１１８６２９にみられる。
他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質
本発明はまた、他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質、例えば：
（ｉ） ＵＳ５７３１１６８に記載されるような「鍵と鍵穴」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ） 例えば、ＵＳ４６７６９８０に記載されるようなヘテロコンジュゲートタンパク質；
（ｉｉｉ） 例えば、ＵＳ４６７６９８０に記載されるような化学的クロスリンカーを用いて製造されるヘテロコンジュゲートタンパク質；及び
（ｉｖ） Ｆａｂ３（例、ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載）
をも企図する。
タンパク質への変異
本発明はまた、本明細書において開示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する抗原結合性タンパク質又はそれをコードする核酸を提供する。一例において、本発明の抗原結合性タンパク質又は核酸は、本明細書において開示される配列と少なくとも約８５％又は９０％又は９５％又は９７％又は９８％又は９９％同一の配列を含む。
あるいは、又はそれに加えて、抗原結合性タンパク質は、任意の側面、実施態様又は例示により本明細書に記載されるＶＨ又はＶＬのＣＤＲと、少なくとも約８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９７％又は９８％又は９９％同一のＣＤＲ（例、３つのＣＤＲ）を含む。
別の例において、本発明の核酸は、任意の側面、実施態様又は例示により本明細書に記載される機能を有する抗原結合性タンパク質をコードする配列と、少なくとも約８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９７％又は９８％又は９９％同一の配列を含む。本発明はまた、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書において例示される配列とは異なる、本発明の抗原結合性タンパク質をコードする核酸をも包含する。
核酸又はポリペプチドの％同一性は、ギャップ生成ペナルティー＝５、及びギャップ伸長ペナルティー＝０．３で、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８，４４３－４５３，１９７０）解析（ＧＣＧプログラム）により決定される。クエリー配列は少なくとも５０残基の長さであり、ＧＡＰ解析は少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインさせる。例えば、クエリー配列は少なくとも１００残基の長さであり、ＧＡＰ解析は少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインさせる。例えば、２つの配列をそれらの全長にわたってアラインさせる。
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質をコードする核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をも企図する。本明細書において「中程度のストリンジェンシー」は、２ ｘ ＳＳＣバッファー、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、４５℃～６５℃の温度で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄、又はそれと同等の条件であると定義される。本明細書において「高ストリンジェンシー」は、０．１ ｘ ＳＳＣバッファー、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中もしくはより低い塩濃度において、少なくとも６５℃の温度で実施されるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄、又はそれと同等の条件であると定義される。本明細書における特定のレベルのストリンジェンシーへの言及は、当業者に公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を用いる同等の条件を包含する。例えば、二本鎖核酸の鎖が解離する温度（融解温度又はＴｍとしても知られる）の計算方法は、当該技術分野で公知である。核酸のＴｍに類似する（例、５℃以内又は１０℃以内）又は等しい温度が高ストリンジェンシーであるとみなされる。中程度のストリンジェンシーは、計算された核酸のＴｍの１０℃～２０℃以内又は１０℃～１５℃以内であるとみなされる。
本発明はまた、本明細書に示される配列と比較して１以上の保存的アミノ酸置換を含む、本発明の抗原結合性タンパク質の変異形態をも企図する。いくつかの例において、抗原結合性タンパク質は、１０個以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基が類似の側鎖及び／又は疎水親水度（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）及び／又は親水性を有するアミノ酸残基で置換されたものである。本明細書で用いられる「配列の相違」は保存的置換であり得る。
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分枝側鎖（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。疎水親水度指数は、例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５－１３２，１９８２に記載され、親水性指数は、例えば、ＵＳ４５５４１０１に記載されている。
本発明はまた、非保存的アミノ酸変化をも企図する。例えば、荷電アミノ酸を別の荷電アミノ酸や中性もしくは正に荷電したアミノ酸で置換することは特に興味深い。いくつかの例において、抗原結合性タンパク質は、１０個以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１個の非保存的アミノ酸置換を含む。本明細書で用いられる「配列の相違」は非保存的置換であり得る。
一例において、変異は、本発明の抗原結合性タンパク質の抗原結合ドメインのＦＲ内で起こる。別の例においては、変異は、本発明の抗原結合性タンパク質のＣＤＲ内で起こる。
変異形態の抗原結合性タンパク質の製造方法の例としては：
・ ＤＮＡ（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３０９－３２２，２００９）又はＲＮＡ（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：１６３－１６８，２００６；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１８，２００７；及びＷＯ１９９９／０５８６６１）の突然変異誘発；
・ 突然変異誘発性細胞、例えば、ＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）への該ポリペプチドをコードする核酸の導入；
・ 例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－９１，１９９４に記載されるようなＤＮＡシャッフリング；及び
・ 例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編） ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（編）（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５中）に記載されるような部位特異的変異誘発
が挙げられる。
本発明の変異抗原結合性タンパク質の生物活性の測定方法の例は当業者には明らかであろうし、加えて／あるいは、本明細書に記載されているであろう（例、抗原結合）。例えば、抗原結合の測定方法、結合の競合的阻害、親和性、会合、解離及び治療有効性の測定方法は、本明細書に記載されている。
定常領域
本発明は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質及び／又は抗体を包含する。これには、Ｆｃに融合させた抗体の抗原結合断片が含まれる。
本発明のタンパク質を製造するのに有用な定常領域の配列は、多くの異なるソースから得ることができる。いくつかの例において、該タンパク質の定常領域又はその部分は、ヒト抗体に由来している。該タンパク質の定常領域又はその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意の抗体クラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプに由来してもよい。一例において、定常領域はヒトアイソタイプＩｇＧ４又は安定化されたＩｇＧ４定常領域である。
一例において、定常領域のＦｃ領域は、例えば、ネイティブ又は野生型のヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦＣ領域と比較して、エフェクター機能を誘導する能力が低下している。一例において、該エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）である。Ｆｃ領域含有タンパク質のエフェクター機能のレベルを評価する方法は、当該技術分野で知られ、及び／又は、本明細書に記載されている。
一例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４のＦｃ領域（即ち、ＩｇＧ４定常領域由来）、例えばヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。適切なＩｇＧ４ Ｆｃ領域の配列は当業者に明らかであろうし、加えて／あるいは、公共に利用可能なデータベースにおいて入手可能であろう（例、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能）。
一例において、定常領域は安定化されたＩｇＧ４定常領域である。用語「安定化されたＩｇＧ４定常領域」とは、Ｆａｂアーム交換又はＦａｂアーム交換を受ける可能性又は半抗体の形成又は半抗体を形成する傾向が低減するように改変されたＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解されよう。「Ｆａｂアーム交換」とは、ＩｇＧ４重鎖と付随する軽鎖（半分子）が別のＩｇＧ４分子由来の重－軽鎖対と交換される、ヒトＩｇＧ４のタンパク質改変の一種のことをいう。そうして、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得し（結果として二重特異性分子を生じ）得る。Ｆａｂアーム交換はインビボで天然に生じ得、また、精製した血液細胞又は還元化グルタチオン等の還元剤によってインビトロで誘導され得る。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が解離して、各々が単一の重鎖と単一の軽鎖を含む２つの分子を形成するときに形成する。
一例において、安定化されたＩｇＧ４定常領域はｋａｂａｔのシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７及び／又は１９９１）によれば、ヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む。この位置は、ＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ２００１及びＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５，１９６９）によれば、ヒンジ領域の２２８位に相当する。ヒトＩｇＧ４において、この残基は一般的にセリンである。セリンのプロリンへの置換の後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。この点に関し、当業者は、「ヒンジ領域」は、Ｆｃ及びＦａｂ領域を連結し、抗体の２つのＦａｂアームに可動性を付与する、抗体重鎖定常領域のプロリンリッチな部分であることを認識するであろう。ヒンジ領域は重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、一般的にヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３に伸びると定義づけられている。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによってＩｇＧ１配列とアラインさせることができる（例えば、ＷＯ２０１０／０８０５３８参照）。本明細書に示すとおり、配列番号３３によるナンバリングで２４４位のＰ（しばしばＳ２４６Ｐと呼ばれる）は、ヒンジを安定化させるための変異である。
安定化されたＩｇＧ４抗体のさらなる例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域中の４０９位のアルギニン（ＥＵナンバリングシステムによる）が、リジン、スレオニン、メチオニン又はロイシンで置換された抗体である（例、ＷＯ２００６／０３３３８６に記載）。定常領域のＦｃ領域は、それに加えて、又はその代わりに、（ＥＵナンバリングシステムによれば）４０５に相当する位置に、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン及びロイシンからなる群より選択される残基を含む。任意で、ヒンジ領域は２４１位にプロリン（即ち、ＣＰＰＣ配列）（上述）を含む。
別の例において、Ｆｃ領域は、エフェクター機能が低下するように改変された領域、即ち、「非免疫刺激性Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０及び３３１からなる群より選択される１以上の位置に置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。別の例において、Ｆｃ領域は、以下の変化：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３６の欠失の１以上、並びに／あるいは、以下の変化：Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３－２６２４，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４，２００１）の１以上を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。非免疫刺激性Ｆｃ領域の更なる例は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１１２９－１１３８，２００６；及び／又はＨｅｚａｒｅｈ Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７５：１２１６１－１２１６８，２００１に記載されている。
別の例において、Ｆｃ領域は、例えば、少なくとも１つのＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン及び少なくとも１つのＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、該Ｆｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９及び４２７（ＥＵナンバリング）からなる群より選択される１以上のアミノ酸位置における置換を含む（例、ＷＯ２０１０／０８５６８２に記載）。置換の例としては、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ及び４２７Ｆが挙げられる。
さらなる改変
本発明はまた、Ｆｃ領域又は定常領域を含む抗体又は抗原結合性タンパク質に対するさらなる改変を企図する。
例えば、抗体は、該タンパク質の半減期を増大させる１以上のアミノ酸置換を含む。例えば、抗体は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）のＦｃ領域に対する親和性を増大させる１以上のアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、より低いｐＨ、例えば約ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する親和性が増大し、エンドソーム内でのＦｃ／ＦｃＲｎ結合を容易にする。一例において、Ｆｃ領域は、約ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する親和性が、約ｐＨ７．４でのその親和性と比較して増大し、そのことが、細胞のリサイクル後の血中へのＦｃの再放出を容易にする。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することにより、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
アミノ酸置換の例としては、ＥＵナンバリングシステムによるＴ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８ＬもしくはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６ＦもしくはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６ＥもしくはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆが挙げられる。さらなる又は代替のアミノ酸置換は、例えば、ＵＳ２００７０１３５６２０又はＵＳ７０８３７８４に記載されている。
あるいは、本発明はまた、ＦｃＲ結合を低減又は阻害するさらなる改変、例えば、配列番号３３によるナンバリングで２５１位のＥ（しばしばＬ２５３Ｅと呼ばれる）を企図する。
抗原
用語「抗原」は、上記のもの等の既知もしくは野生型の抗原の、ペプチドもしくはタンパク質アナログを包含することがさらに意図される。該アナログは、野生型抗原よりも可溶性又はより安定であってよく、該抗原を免疫学的により活性にする変異もしくは改変を含んでもよい。所望の抗原のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質もまた、本発明において有用であり、該相同な抗原は各腫瘍又は生物に対して免疫応答を誘導する。
本明細書で用いられる「がん抗原」は、腫瘍又はがん細胞と関連し、ＭＨＣ分子との関連で抗原提示細胞の表面上に発現させると、免疫応答を誘発し得る分子又は化合物（例、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖及び／又はＤＮＡ）である。がん抗原としては、新抗原及び自己抗原、並びに、がんに特異的に関連しなくてもよい他の抗原が挙げられるが、とはいえ、動物に投与すると、腫瘍又はがん細胞に対する免疫応答を誘導及び／又は増強、及び／又はそれらの増殖を低減する。
本明細書で用いられる「病原及び／又は感染性生物由来の抗原」は、任意の生物の抗原であり、感染性ウイルス（例えば、インフルエンザ又はＳＡＲＳコロナウイルス等）、感染性細菌、原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐ．等）及び蠕虫を含む感染性寄生虫、並びに感染性菌類が挙げられるが、それらに限定されない。典型的には、本発明における使用のために、抗原は、該生物由来のタンパク質又はその抗原性断片、あるいは、対応する生物に特異的な免疫応答を誘導する、天然に存在する抗原と同一又は類似の合成化合物である。天然に存在する生物抗原と類似の化合物又は抗原は当業者に周知である。天然に存在する生物抗原と類似の化合物の非限定的な例は、多糖抗原のペプチド模倣物である。
がん抗原の具体的な実施態様としては、例えば、Ｒａｓ ｐ２１前がん遺伝子のタンパク産物、がん抑制因子ｐ５３、並びにＨＥＲ－２／ｎｅｕ及びＢＣＲ－ａｂｌがん遺伝子、さらにはＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８及びβ－カテニン等の変異抗原；ガレクチン－４、ガレクチン－９、カルボニックアンヒドラーゼ、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ－２及びＫＳＡ等の過剰発現抗原、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等の腫瘍胎児抗原；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｍａｒｔ １／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２等のメラノサイト分化抗原などの自己抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ－Ｐｌ及びＰＳＭ－Ｐ２等の前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ １、ＭＡＧＥ ３、ＭＡＧＥ ４、ＧＡＧＥ １、ＧＡＧＥ ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ等の再活性化した胚性遺伝子産物、並びにＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ２及びＳＣＰ１等の他のがん精巣抗原；Ｍｕｃ－１及びＭｕｃ－２等のムチン；ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３ 等のガングリオシド、中性糖脂質、並びにＬｅｗｉｓ （ｙ）及びｇｌｏｂｏ－Ｈ等の糖タンパク質；並びに、Ｔｎ、トンプソン－フライデンライヒ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎ等の糖タンパク質が挙げられる。一実施態様において、がん抗原はウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）の全部又は一部、好ましくは配列番号３９に示されるアミノ酸配列の全部又は一部である。一実施態様において、がん抗原はＮＹ－ＥＳＯ－１の全部又は一部、好ましくは配列番号４１に示されるアミノ酸配列の全部又は一部である。
がん抗原及びそれらの各腫瘍細胞ターゲットとしては、例えば、サイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９が、上皮性悪性腫瘍に対する抗原として挙げられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚性抗原（ＨＥＡ－１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒＩ、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ－ＥＰ４、１７－ＩＡ、Ｃ２６及びＴ１６もまた、公知の上皮性悪性腫瘍抗原である。デスミン及び筋特異的アクチンは筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリフォスファターゼ、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン及びα－フェトプロテインは、栄養膜及び生殖細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原は前立腺の上皮性悪性腫瘍の抗原であり、大腸腺がんのがん胎児性抗原である。ＨＭＢ－４５はメラノーマの抗原である。子宮頸がんでは、有用な抗原はヒトパピローマウイルスによりコードされ得るだろう。グロモグラニン－Ａ及びシナプトフィジンは神経内分泌及び神経外胚葉の腫瘍の抗原である。壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する浸潤性腫瘍は特に興味深い。
ある特定のがんにかかりやすくすることが知られている病原体由来の抗原もまた、本発明において有利に使用することができる。本明細書で提供されるがんワクチンンにおける使用のための特に興味深い病原体としては、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞がん）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝がん）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭がん、免疫抑制された個体におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発がん性ヒトパピローマウイルス１６、１８、３３、４５型（成人子宮頸がん）、及び細菌ヘリコバクター・ピロリ（Ｂ細胞胃リンパ腫）が挙げられる。哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として働く他の医学的に関連のある微生物は、広く文献、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，（１９８３）に記載されている。
ウイルス病原体の例としては、哺乳動物、特にヒトに感染する感染性ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。感染性ウイルス及びそれに由来し得る抗原の例としては、レトロウイルス科（例、ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ、もしくはＨＩＶ－ＩＩＩとも呼ばれる）及びＨＩＶ－ＬＰ等の他の分離株などのヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（例、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（例、出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオ―マウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（例、アフリカブタ熱ウイルス）；並びに分類されないウイルス（例、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎（クラス１＝内部感染；クラス２＝非経口感染（即ち、Ｃ型肝炎）の病原体；ノーウォーク及び関連のウイルス、及びアストロウイルス）が挙げられるが、それらに限定されない。一実施態様において、抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来であり、好ましくはスパイクタンパク質由来である（例、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ；好ましくは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列）、Ｓ１サブユニットのみ、Ｓ２サブユニットのみ、又はＳ１＋Ｓ２サブユニット抗原）。一実施態様において、抗原はＡ型インフルエンザ、好ましくはマトリックスタンパク質２の細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）由来であり；好ましくは配列番号４２に示されるアミノ酸配列である。
また、脊椎動物における主題の組成物及び方法によって、グラム陰性及びグラム陽性細菌を標的化することもできる。そのようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ属菌、スタフィロッコッカス属菌及びストレプトコッカス属菌が挙げられるが、それらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌、シュードモナス属、およびサルモネラ属が挙げられるが、これらに限定されない。感染性細菌の特定の例としては、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム属菌（例、結核菌、Ｍ．アニウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、溶血性レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）、β溶血性レンサ球菌（Ｂ群レンサ球菌）、緑色レンサ球菌、フェカリス菌、ウシレンサ球菌、レンサ球菌（嫌気性種）、肺炎球菌、病原性カンピロバクター属菌、エンテロコッカス属菌、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属菌、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス属菌、フソバクテリウム・ヌクレオタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・パーテヌエ、レプトスピラ属、リッケチア属、並びにアクチノマイセス・イスラエリが挙げられるが、それらに限定されない。
主題の組成物における抗原のソースとして使用される細菌病原体のポリペプチドとしては、せっそう病を引き起こすエロモニス・サルモニシダの鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）及びＡ－タンパク質、細菌性腎臓病（「ＢＫＤ」）を引き起こすレニバクテリウム・サルモニナルムのｐ５７タンパク質、エルシニア症菌の主要表面関連抗原（「ｍｓａ」）、表面発現サイトトキシン（「ｍｐｒ」）、表面発現ヘモリシン（「ｉｓｈ」）及び鞭毛抗原；パスツレラ症菌の細胞外タンパク質（「ＥＣＰ」）、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）及び構造タンパク質；ビブリオ・アングイラルム及びＶ．オルダリのＯＭＰ及び鞭毛タンパク質；エドワジエラ・イクタルリ及びＥ．タルダの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ及びｐｕｒＡ；イクチオフチリウスの表面抗原；及びカラムナリス病菌の構造及び調節タンパク質；及びリッケチアの構造及び調節タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。そのような抗原は、組換えにより、あるいは当該技術分野で公知の任意の他の手段により、単離又は調製することができる。
病原体としては、哺乳動物、特にヒトに感染する感染性の菌類及び寄生虫がさらに例示されるが、それらに限定されない。感染性菌類の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラタム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマティティジス、クラミジア・トラコマチス及びカンジダ・アルビカンスが挙げられるが、それらに限定されない。
寄生虫の例としては、細胞内寄生虫及び偏性細胞内寄生虫が挙げられる。寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫、卵型マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫、ネズミバベシア原虫、多型バベシア原虫、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ、旋毛虫、大型リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、ブルギア・チモリ、ヒト回虫、回旋糸状虫及びマンソン住血虫が挙げられるが、それらに限定されない。
哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として働く他の医学的に関連のある微生物は、広く文献に記載されている（例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，（１９８３）参照）。ヒト感染症及びヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物及び方法は、非ヒト哺乳動物の感染を治療するのに有用である。非ヒト病原体の例としては、マウス乳癌ウイルス（「ＭＭＴＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、トリ白血病ウイルス（「ＡＬＶ」）、トリ骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）、マウス白血病ウイルス（「ＭＬＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、マウス肉腫ウイルス（「ＭＳＶ」）、テナガザル白血病ウイルス（「ＧＡＬＶ」）、脾臓壊死ウイルス（「ＳＮＶ」）、細網内皮症ウイルス（「ＲＶ」）、サル肉腫ウイルス（「ＳＳＶ」）、マソン－ファイザーサルウイルス（「ＭＰＭＶ」）、１型サルレトロウイルス（「ＳＲＶ－１」）、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（「ＦＩＶ」）及び馬伝染性貧血ウイルス０（「ＥＩＡＶ」）等のレンチウイルス、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（「ＳＴＬＶ」）及びウシ白血病ウイルス（「ＢＬＶ」）等のＴ細胞白血病ウイルス、並びに、ヒト泡沫状ウイルス（「ＨＦＶ」）、サル泡沫状ウイルス（「ＳＦＶ」）及びウシ泡沫状ウイルス（「ＢＦＶ」）等の泡沫状ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
タンパク質の製造
一例において、任意の例により本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、例えば、本明細書に記載される、及び／又は当該技術分野で公知の、タンパク質を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養することにより製造される。
組換え発現
別の例において、任意の例により本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートは組換え体である。
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸を発現コンストラクト又はベクター中にクローニングし、次いで、さもなくば該タンパク質を産生しない大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、あるいは、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞又はミネローマ細胞等の哺乳動物細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。タンパク質を発現させるのに用いられる細胞の例は、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞又はＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該技術分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が、組換え核酸の構築に適している。組換え抗体の製造方法も当該技術分野で公知ある（例えば、ＵＳ４８１６５６７又はＵＳ５５３０１０１を参照）。
単離後、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は無細胞系もしくは細胞内での発現のために、該核酸を発現コンストラクト又は発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結する。
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、その最も広い意味で解釈されるべきであり、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスや開始因子を含む、ゲノム遺伝子の転写制御配列を含む。例えば、発生及び／又は外部の刺激に応答して、あるいは組織特異的な様式で、核酸の発現を変化させるさらなる調節エレメント（例、上流の活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を含んでも、含まなくもよい。本文脈において、用語「プロモーター」は、組換え、合成又は融合核酸、あるいは、それに作動可能に連結する核酸の発現を付与、活性化又は増強する誘導体を記載するのにも用いられる。例示的なプロモーターは、該核酸の発現をさらに増強する、並びに／あるいは、その発現を空間的及び／又は時間的に変化させるための、１以上の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含むことができる。
本明細書で用いられる用語「作動可能に連結した」とは、プロモーターを核酸に対して、該核酸の発現が該プロモーターにより調節されるように位置させることを意味する。
細胞内での発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素としては、一般に、以下の１以上が挙げられるが、それらに限定されない：シグナル配列、タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書において提供される情報に由来する）、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現のための適切な配列を認識するであろう。シグナル配列の例としては、原核分泌シグナル（例、ｐｅｌＢ、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例、インベルターゼリーダー、α因子リーダー又は酸性ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
哺乳動物細胞で活性なプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１）、小核ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α－ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメント、又はイムノグロブリンプロモーターもしくはその活性断片が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によりトランスフォームされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３又は懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞；乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
例えば、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシエ及びＳ．ポンべを含む群より選択される酵母細胞等の酵母細胞における発現に適した典型的なプロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、又はＴＥＦ１プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
単離された核酸又はそれを含む発現コンストラクトを発現用の細胞に導入する手段は当業者に知られている。所定の細胞に用いられる技術は既知のうまくいった技術に依拠する。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段としては、とりわけ、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び／又はセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いる等のリポソームを介したトランスフェクション、ＰＥＧ介在性のＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション及びＤＮＡでコーティングしたタングステンもしくは金粒子を用いた微粒子衝撃（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。
タンパク質を産生させるのに用いられる宿主細胞は、用いる細胞種に応じて、種々の培地中で培養することができる。ＨａｍのＦｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭｌ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が哺乳動物細胞の培養に適している。本明細書で議論される他の細胞種を培養するための培地は当該技術分野で公知である。
タンパク質の単離
タンパク質の単離方法は当該技術分野で公知、及び／又は本明細書に記載されている。
抗原結合性タンパク質が培養培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、まずは市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外ろ過ユニットを用いて濃縮することができる。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を前記工程のいずれかにおいて含ませ、タンパク質分解を阻害してもよいし、抗生物質を含ませて偶発的な夾雑物の増殖を阻止してもよい。あるいは、又はそれに加えて、上清をろ過、及び／又は、例えば、連続遠心分離を用いて、タンパク質を発現する細胞から分離することができる。
細胞から調製された抗原結合性タンパク質は、例えば、イオン交換、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー又はプロテインＧクロマトグラフィー）、又は前記の任意の組み合わせを用いて、精製することができる。これらの方法は当該技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４やＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。
また、当業者は、タンパク質を、精製又は検出を容易にするためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ（例、ヘキサヒスチジンタグ）又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タグ又はシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ又はＦＬＡＧタグ又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように、タンパク質を改変し得ることを認識するであろう。得られたタンパク質は、次いで、アフィニティー精製等の当該技術分野で公知の方法を用いて精製される。例えば、ヘキサ－ｈｉｓタグを含むタンパク質は、該タンパク質を含むサンプルを、固形もしくは半固形支持体上に固相化した、ヘキサ－ｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）と接触させ、該サンプルを洗浄して結合していないタンパク質を除去した後、結合したタンパク質を溶出することにより精製される。あるいは、又はそれに加えて、タグに結合するリガンド又は抗体がアフィニティー精製法に使用される。
抗原結合性タンパク質の活性評価
ＣＬＥＣ９Ａ及びその変異体への結合
本明細書における開示から、本発明の抗原結合性タンパク質がＣＬＥＣ９Ａに結合することは当業者に明らかであろう。タンパク質への結合を評価する方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４中）に記載されるように、当該技術分野で公知である。そのような方法は、一般に、抗原結合性タンパク質を固相化し、それを標識した抗原（ＣＬＥＣ９Ａ）と接触させることを含む。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、標識量、結果として結合した抗原量が検出される。もちろん、抗原結合性タンパク質を標識し、抗原を固相化することもできる。パニング型のアッセイを用いることもできる。あるいは、又はそれに加えて、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることができる。
任意で、固相化された抗原結合性タンパク質のＣＬＥＣ９Ａ又はそのエピトープに対する解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）及び／又はアフィニティー定数（ＫＤ）が測定される。一例において、ＣＬＥＣ９Ａ結合性タンパク質についての「Ｋｄ」又は「Ｋａ」又は「ＫＤ」は、放射性標識又は蛍光標識ＣＬＥＣ９Ａリガンド結合アッセイにより測定される。「Ｋｄ」の場合、このアッセイは、非標識ＣＬＥＣ９Ａの滴定シリーズの存在下で、抗原結合性タンパク質を最小濃度の標識ＣＬＥＣ９Ａ又はそのエピトープと平衡化する。洗浄により未結合のＣＬＥＣ９Ａ又はそのエピトープを除去した後、タンパク質のＫｄを示す標識量を測定する。
別の例によれば、Ｋｄ、Ｋａ又はＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えば、ビアコア表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を固相化したＣＬＥＣ９Ａ又はその一領域又は固相化した抗原結合性タンパク質とともに用いて、測定される。
通常、抗原結合性タンパク質はＣＬＥＣ９Ａに結合するが、樹状細胞を検出できる程度には活性化しない。
組成物
いくつかの例において、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物は、通常の無毒の医薬上許容される担体を含む剤形で、あるいは任意の他の通常の剤形で、経口的に、非経口的に、吸入噴霧、吸着、吸収により、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、経口腔的に、経腟的に、脳室内に、埋め込み容器を介して、投与することができる。本明細書で用いられる用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内及び頭蓋内の注射又は注入技術を含む。
抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートを、対象に投与するのに適切な形態（例、医薬組成物）に調製する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）及びＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８４）に記載される方法が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、静脈内投与や器官又は関節の体腔又は内腔への投与等の非経口投与に特に有用である。投与用組成物は、医薬上許容される担体、例えば、水性担体に溶解した抗原結合性タンパク質の溶液を共通して含有するであろう。種々の水性担体、例えば緩衝生理食塩水等を用いることができる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の、生理的条件に近づけるために必要とされる医薬上許容される補助的物質を含有してもよい。これらの製剤における本発明の抗原結合性タンパク質の濃度は広く変動してよく、選択される特定の投与形態及び患者のニーズに従って、主に液体の容量、粘度、体重等に基づいて選択されよう。担体の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルを用いることもできる。リポソームを担体として用いることもできる。ビヒクルは、等張性や化学的安定性を増強する微量の添加剤、例えば、緩衝剤や保存剤を含んでもよい。
製剤化の後、本発明の抗原結合性タンパク質は、剤形に適合した様式で、且つ治療上／予防上有効な量で投与されるだろう。製剤は、上記のように注射可能な溶液のタイプ等の、種々の剤形で容易に投与されるが、他の医薬上許容される形態、例えば、経口投与用の錠剤、丸薬、カプセルもしくは他の固形物、坐剤、ペッサリー、点鼻液もしくはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態などもまた、企図される。医薬上「徐放性の」カプセル又は組成物を用いることもできる。徐放製剤は、一般に、延長された期間にわたって持続的に薬物を供給するように設計され、本発明の抗原結合性タンパク質を送達するのに用いることができる。
ＷＯ２００２／０８０９６７には、例えば喘息の治療のための抗体を含有するエアロゾル化された組成物を投与するための組成物及び方法が記載されており、それらは本発明の抗原結合性タンパク質の投与にも適している。
投与量及び投与のタイミング
本発明の抗原結合性タンパク質の適切な投与量は、具体的な抗原結合性タンパク質、治療すべき状態及び／又は治療対象によって変動するだろう。適切な投与量を決定することは当業者の能力の範囲内であり、例えば、最適投与量より少ない投与量から開始して、投与量を徐々に増やすように改変することにより最適又は有用な投与量が決定される。あるいは、治療／予防のための適当な投与量を決定するために、細胞培養アッセイや動物研究からのデータが用いられ、そこで適切な用量は、毒性がほとんど又は全くなく、活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、この範囲内で、用いる剤形や利用する投与経路によって変動させることができる。治療上／予防上有効な用量は、最初に細胞内容アッセイから見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する化合物の濃度又は量）を含む循環血漿濃度の範囲を実現すべく、動物モデルにおいて用量を策定することができる。そのような情報を用いて、より正確にヒトにおいて有用な用量を決定することができる。血漿レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
いくつかの例において、本発明の方法は、予防上又は治療上有効な量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む。
用語「治療上有効な量」は、治療を必要とする対象に投与した場合に、該対象の予後及び／又は状態を改善する、並びに／あるいは、本明細書に記載される臨床上の状態の１以上の症状を、その状態であると臨床上診断されるか、その状態に臨床上特有であると観察され認められるレベルよりも下のレベルにまで低減又は阻害する量である。対象への投与量は、治療すべき状態の特定の状態の特徴、治療する状態のタイプ及びステージ、投与様式、並びに、一般健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型及び体重等の対象の特徴に依存するであろう。当業者は、これらの、及び他の要因に応じて、適切な投与量を決定することができるだろう。従って、この用語は、本発明を特定の量、例えばタンパク質の重量又は量に限定するものと解すべきではなく、むしろ、本発明は、対象において述べられた結果を達成するのに十分な、抗原結合性タンパク質のいかなる量をも包含する。
本明細書で用いられる用語「予防上有効な量」とは、臨床上の状態の１以上の検出可能な症状の発症を阻止又は阻害する又は遅延させるのに十分なタンパク質の量を意味するものであると解釈されるべきである。当業者は、そのような量は、例えば、投与される特定の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート、及び／又は、特定の対象、及び／又は、状態のタイプもしくは重症度もしくはレベル、及び／又は、該状態に対する素因（遺伝的もしくはそれ以外の）により変動するだろう。従って、この用語は、本発明を特定の量、例えば抗原結合性タンパク質の重量又は量に限定するものと解すべきではなく、むしろ、本発明は、対象において述べられた結果を達成するのに十分な、抗原結合性タンパク質のいかなる量をも包含する。
キット
本発明は、以下のものの１以上を含むキットをさらに含む：
（ｉ） 本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質もしくはコンジュゲート又はそれをコードする発現コンストラクト；
（ｉｉ） 本発明の細胞；
（ｉｉｉ） 本発明の複合体；又は
（ｉｖ） 本発明の医薬組成物。
ＣＬＥＣ９Ａを検出するためのキットの場合、該キットは、例えば本発明の抗原結合性タンパク質に結合した検出手段をさらに含み得る。
治療的／予防的使用のためのキットの場合、該キットは、医薬上許容される担体をさらに含み得る。
任意で、本発明のキットは、任意の例示により本明細書に記載される方法における使用のための説明書とともにパッケージングされる。
本発明はまた、本発明の方法に使用する場合の、本明細書に記載されるキットを提供する。
Figure 2023544614000001
Figure 2023544614000002
Figure 2023544614000003
Figure 2023544614000004
Figure 2023544614000005
実施例１－ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体の設計
ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ（上記表１のＡｂ１）をコードするコンストラクトを、ヒトキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ（クローン４Ｃ６）をコードする配列に基づいて、ヒトＩｇＧ４及びκ定常領域と該ＩｇＧ４定常領域中のＦｃＲ結合を消滅させ、ジスルフィド結合を安定化する２つの点変異－２４４位のＰ（しばしばＳ２４６Ｐという）はヒンジを安定化するための変異であり、２５１位のＥ（しばしばＬ２５３Ｅという）はＦｃＲ結合を止めるための変異である－とともに、作製した。
ヒト化Ａｂ １を、標準的な分子技術を用いて、４Ｃ６ ｍＡｂのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１；ＣＤＲ－Ｈ２；ＣＤＲ－Ｈ３；ＣＤＲ－Ｌ１；ＣＤＲ－Ｌ２；及びＣＤＲ－Ｌ３）をヒトフレームワーク領域上に移植することにより作製した。ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ及びＩＭＧＴ／Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ解析ツールを用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域由来の配列がラット抗体のそれらと近接にアラインするヒト生殖系列遺伝子を同定した。これら選択されたヒト生殖系列遺伝子のフレームワーク配列を４Ｃ６ ＣＤＲに対するアクセプター配列として用いた（ＩＭＧＴデータベースによると、ＩＧＨＶ３－２３＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ－２９＊０１ヒト遺伝子）。しかし、重要な「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンにはラット残基を保持した。ＨＥＫ細胞における発現のためにコドン最適化もしたヒト化ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡ遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。
実施例２－ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体の製造
精製：フリースタイル２９３Ｆ細胞をヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの重鎖及び軽鎖（Ａｂ１ ｃｏｍｖｅｃ１２：ＩｇＧ４ ａｎｄ ｋａｐｐａ）、又は腫瘍関連抗原ＷＴ１（配列番号３９）、腫瘍関連抗原ＮＹ－ＥＳＯ１（配列番号４１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－ＲＢＤ（配列番号４０）及びインフルエンザＭ２ｅ（配列番号４２）抗原に遺伝的に融合させた抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの重鎖をコードするコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションから６日後の培養上清から、結合バッファー（１．５Ｍ グリシン、３Ｍ ＮａＣｌ（ＮａＯＨでｐＨ８．９に調整）及びｐＨ３．５の酢酸溶出バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ 酢酸 ｐＨ３．５）か、ｐＨ３のクエン酸溶出バッファー（１００ｍＭ クエン酸（ＮａＯＨでｐＨ３に調整）を用いて、プロテインＡ上でＡｂを精製した。精製されたＡｂをＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析した。
ＥＬＩＳＡ：プレートを可溶性ヒトＣＬＥＣ９Ａ（１μｇ／ｍｌ）又は可溶性マウスＣＬＥＣ１２Ａ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ（０．１μｇ／ｍｌ）、抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇ（０．２μｇ／ｍｌ）を加えてＥＬＩＳＡプレートを滴定した。結合したＡｂを抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジン－ＨＲＰを用いて検出した。ＥＬＩＳＡプレートをＡＢＴＳを用いて４０５ｎｍにおける吸光度により可視化し、４９０ｎｍでバックグランドを差し引いた。
２９３Ｆ細胞への結合：２９３Ｆ細胞を、全長ヒトＣＬＥＣ９Ａをコードするコンストラクトでトランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間後に、５、２．５、１．２５及び０．６２５μｇ／ｍｌのヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ａｂ又は抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇで染色した。結合したＡｂを抗ヒトＩｇＧ４－ビオチンとストレプトアビジン－ＰＥを用いて、生細胞上で検出した。死細胞をヨウ化プロピジウム又はｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－Ａｑｕａを用いて排除した。
血中ＤＣへの結合：ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ密度遠心により全血から単離した。ヒト汎ＤＣ富化キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＤＣを富化し、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングし、抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ａｂ、抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ａｂ－Ａｇ又はアイソタイプコントロールＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ１４１、ＣＤ１ｃ、及び死細胞を排除するためのｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ａｑｕａで染色した。抗ヒトＩｇＧ４－ビオチン及びストレプトアビジン－ＰＥを用いて、抗ＣＬＥＣ９Ａ－Ａｂ結合を検出した。
ヒト／ラットキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ（クローン４Ｃ６、Ｔｕｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）から、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂをコードするコンストラクトを、ヒトＩｇＧ４及びκ定常領域と該ＩｇＧ４定常領域中のＦｃＲ結合を消滅させ、ジスルフィド結合を安定化する２つの点変異とともに作製した。ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂを哺乳動物発現系（フリースタイル２９３細胞）を用いて発現させ、プロテインＡを用いて、８５．５ｍｇ／Ｌの収量で精製した。
実施例３－ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体の結合及び特異性の検証
次に、本発明者らは、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの結合を検証した。ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ及び元のヒトキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂは、ＥＬＩＳＡにより可溶性ＣＬＥＣ９Ａに（図１Ａ）、及びトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞上の細胞表面ＣＬＥＣ９Ａに、同程度に結合することをフローサイトメトリー分析により確認した（図１Ｂ）。さらに、本発明者らは、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂがヒト血中ｃＤＣ１に特異的に結合するが、ｃＤＣ２やｐＤＣには特異的に結合しないことを更に確認した（図１Ｃ）。アイソタイプコントロールはいずれのＤＣサブセットにも結合しなかった。
実施例４－抗体－抗原融合タンパク質の設計及び製造
本発明者らはまた、腫瘍抗原ＷＴ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１由来の抗原、並びに感染症ワクチン候補については、スパイクタンパク質由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びインフルエンザＭ２ｅ抗原を担持する、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂを作製した。簡単に言えば、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＲＢＤ及びＭ２ｅの抗原性配列に融合させたヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ重鎖をコードするコンストラクトを作製した。ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ及び抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇを２９３Ｆ細胞において発現させ、トランスフェクトされた２９３Ｆ細胞の表面上に発現するＣＬＥＣ９Ａに結合することを示した（図２）。
次いでＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＲＢＤ及びＭ２ｅを担持するヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂをトランスフェクトし、ラージスケールの２９３Ｆ細胞の培養上清からプロテインＡ上で精製した。ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇコンストラクトは、フローサイトメトリーによるＣＬＥＣ９Ａでトランスフェクトした細胞の表面上に発現するＣＬＥＣ９Ａ（図２Ｃ）又はＥＬＩＳＡによる可溶性ＣＬＥＣ９Ａ（図２Ａ、Ｂ）を含む結合研究を用いて検証した。抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ－Ａｇは、ヒト血中ＤＣを用いてさらに検証し、ヒト血中ｃＤＣ１には結合するが、ｃＤＣ２やｐＤＣには結合しないことを示した（図２Ｄ）。
実施例５－ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の評価
ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂ担持ＷＴ１はまた、ＷＴ１特異的Ｔ細胞を活性化することが分かり、ＤＣへのＡｇ送達及び免疫調節に関するヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ Ａｂの効力が実証された（図３）。
ヒトナイーヴＷＴ１２３５-２４３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びヒトｃＤＣ１樹状細胞を発生するヒト化マウスの作製：ヒトＨＬＡ－Ａ＊２４０２＋ＣＤ３４＋造血前駆細胞を、ＣＤ３４＋細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて臍帯血から単離し、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２拘束性ＷＴ１２３５-２４３ペプチドエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするレンチウイルスを形質導入した。２～５日齢のＮＳＧ－Ａ２４（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｈｌ Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ２４／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）３Ｄｖｓ／Ｓｚ）マウスを放射線照射（１０Ｇｙ）後に、形質導入したヒトＣＤ３４＋前駆細胞を肝臓内注射した。ヒト免疫系の再構成（「ヒト化マウス」）を１０～１４週目に血中のヒトＣＤ４５＋細胞を検出することにより確認した。Ｆｌｔ３Ｌ（Ｂｉｏ－Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ；４日おきに２ ｘ ５０μｇ）を皮下投与してヒトｃＤＣ１をインビボで増幅させた。
ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の活性化：２回目のＦｌｔ３Ｌ投与から１０日後に、ヒト化マウスから脾臓を集め、コラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配で分離し、Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒａ ＥａｓｙＳｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてヒト白血球を富化した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした対応するテトラマー、次いで抗ラットＣＤ２－ＰＥ（クローンＯＸ－３４）及び抗ヒトＡｂｓ抗ＣＤ４５－ＢＵＶ３９５（クローンＨＩ３０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅもしくは抗ＣＤ３－ＢＶ７１１（クローンＯＫＴ３）、並びに抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＲＰＡ－Ｔ８）で染色後に、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２拘束性ＷＴ１２３５-２４３ ＴＣＲを発現するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を、フローサイトメトリーにて確認した。
Ｔ細胞活性化を評価するために、ヒト白血球を、１０％ ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ Ｕ／ｍＬ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）、及び２－メルカプトエタノール（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培養培地ＲＰＭ１ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中、１０μｇ／ｍＬのキメラもしくはヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１抗体又はネガティブコントロール（抗体なし、キメラコントロール－ＷＴ１又はヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａコントロール）とともに、一晩インキュベートした。
ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１に応答したＴ細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）産生を、ヒトキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１、ヒトキメラコントロール－ＷＴ１（ＷＴ１を有する無関係の抗体コントロールとしての抗β－ガラクトシダーゼ－ＷＴ１）、及びヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ（ＷＴ１ペプチドを含まない抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体コントロール）と比較した。コントロール（抗原なし、キメラコントロール－ＷＴ１、ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａコントロール）で処理した脾臓細胞は、相対的にわずかしかＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化しなかったのに対し、ヒト／ラットキメラ抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１とヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１は、いずれも実質的なＩＦＮγ産生を誘導した。ヒト化抗ＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１は、同濃度のキメララット抗ヒトＣＬＥＣ９Ａ－ＷＴ１と比較して、有意により多くのＩＦＮγ産生を誘導した（ｐ＜０．０００１、図３）。
本明細書に開示され、定義された発明は、テキスト又は図面で述べられた、又は証された、個々の特徴の２以上のすべての択一的組み合わせにまで拡張するものと理解されよう。これらの異なる組み合わせのすべてが、本発明の種々の択一的側面を構成する。

Claims (50)

  1. ＣＬＥＣ９Ａに結合もしくは特異的に結合する抗原結合性タンパク質であって、該抗原結合性タンパク質は：
    （ａ） 配列番号１７に示される配列と、少なくとも約５８％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号１８に示される配列と、少なくとも約９５％同一の配列を含むＦＲ２、配列番号１９に示される配列と、少なくとも約９５％同一の配列を含むＦＲ３、及び配列番号２０に示される配列と、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ４；又は
    （ｂ） 配列番号２１に示される配列と、少なくとも約８８％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ１、配列番号２２に示される配列と、少なくとも約８８％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ２、配列番号２３に示される配列と、少なくとも約８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ３、及び配列番号２４に示される配列と、少なくとも約８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の配列を含むＦＲ４
    を含む、抗原結合性タンパク質。
  2. 前記抗原結合性タンパク質は：
    （ｃ） 配列番号１７に示されるアミノ酸と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と比較して、０個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と比較して、１個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列と比較して、１もしくは２個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４；又は
    （ｄ） 配列番号２１に示されるアミノ酸と比較して、１もしくは２個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と比較して、１個のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ３、及び配列番号２４に示される配列と比較して、１個の配列相違を有するアミノ酸配列を含むＦＲ４
    を含む、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  3. 前記抗原結合性タンパク質が（ａ）及び（ｂ）の各々を含む、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  4. 前記抗原結合性タンパク質が（ｃ）及び（ｄ）の各々を含む、請求項２に記載の抗原結合性タンパク質。
  5. 前記抗原結合性タンパク質が、配列番号３５の配列を含むか、それからなるＣＬＥＣ９Ａのエピトープに結合もしくは特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  6. 前記抗原結合性タンパク質が：
    （ｅ） 配列番号１７～２０に示される配列の各々を含むフレームワーク領域；又は
    （ｆ） 配列番号２１～２４に示される配列の各々を含むフレームワーク領域
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  7. 前記フレームワーク領域が配列番号１７～２４に示される配列の各々を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  8. 前記抗原結合性タンパク質が相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み：
    ＣＤＲ１は、ＱＳＬＬＨＳＤＧＮＴＹ（配列番号１）又は配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
    ＣＤＲ２は、ＲＩＳ（配列番号２）又は配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１もしくは２個の配列相違を有する配列、という配列を有し、かつ
    ＣＤＲ３は、ＬＱＳＳＨＦＰＰＴ（配列番号３）又は配列番号３のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有する、
    請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  9. 前記抗原結合性タンパク質が相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み：
    ＣＤＲ１は、ＱＳＬＬＨＳＤＧＮＴＹ（配列番号１）の配列を有し、
    ＣＤＲ２は、ＲＩＳ（配列番号２）の配列を有し、かつ
    ＣＤＲ３は、ＬＱＳＳＨＦＰＰＴ（配列番号３）の配列を有する、
    請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  10. 前記抗原結合性タンパク質が相補性決定領域を含み：
    ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＮＮＹＷ（配列番号４）又は配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、
    ＣＤＲ２は、ＩＴＴＡＡＧＧＴ（配列番号５）又は配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有し、かつ
    ＣＤＲ３は、又は、ＴＲＶＧＲＤＩＷＤＹ（配列番号６）又は配列番号６のアミノ酸配列と比較して、１、２、３もしくは４個の配列相違を有する配列、という配列を有する、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  11. 前記抗原結合性タンパク質が相補性決定領域を含み：
    ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＮＮＹＷ（配列番号４）の配列を有し、
    ＣＤＲ２は、ＩＴＴＡＡＧＧＴ（配列番号５）の配列を有し、かつ
    ＣＤＲ３は、又は、ＴＲＶＧＲＤＩＷＤＹ（配列番号６）の配列を有する、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  12. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号７に示される配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  13. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号８に示される配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  14. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号７及び８に示される配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  15. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号３３に示される配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  16. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号３４に示される配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  17. 前記抗原結合性タンパク質が配列番号３３及び３４に示される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  18. 前記抗原結合性タンパク質が：
    （ｉ） 単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
    （ｉｉ） 二量化ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）；
    （ｉｉｉ） 抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ；あるいは
    （ｉｖ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ
    の形態である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  19. 前記抗原結合性タンパク質が：
    （ｉ） ダイアボディ；
    （ｉｉ） トリアボディ；
    （ｉｉｉ） テトラボディ
    （ｉｖ） 二重特異性抗体；
    （ｖ） Ｆａｂ；
    （ｖｉ） Ｆ（ａｂ’）２；
    （ｖｉｉ） Ｆｖ；
    （ｖｉｉｉ） 抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／もしくはＣＨ３に連結した（ｉ）から（ｖｉｉ）の１つ；
    （ｉｘ） 免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結した（ｉ）から（ｖｉｉ）の１つ
    の形態である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  20. 前記抗原結合性タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質。
  22. 前記融合タンパク質が抗原をさらに含む、請求項２１に記載の融合タンパク質。
  23. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質又は請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質が、標識又は治療剤にコンジュゲートした形態である、コンジュゲート。
  24. 前記治療剤が、抗原、細胞傷害性物質、薬物及び／又は薬理学的物質である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. 前記抗原が、がん抗原、自己抗原、アレルゲン並びに／あるいは病原性及び／又は感染性生物由来の抗原である、請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３もしくは２４に記載のコンジュゲート。
  26. 前記病原性及び／又は感染性生物がウイルス又は細菌である、請求項２５に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
  27. 前記抗原が、ＷＴ－１もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片である、請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３もしくは２４に記載のコンジュゲート。
  28. 前記抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である、請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３もしくは２４に記載のコンジュゲート。
  29. 前記抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＢＤ又はその断片である、請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３もしくは２４に記載のコンジュゲート。
  30. 前記抗原がインフルエンザ由来である、請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質又は請求項２３もしくは２４に記載のコンジュゲート。
  31. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲートをコードする核酸であって、好ましくはｍＲＮＡである、核酸。
  32. 請求項３１に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくはウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、ベクター。
  33. 請求項３２に記載のベクター又は請求項３１に記載の核酸を含む細胞。
  34. 請求項１～３３のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート、核酸、ベクター又は細胞と、医薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  35. 前記組成物が、前記抗原結合性タンパク質、融合タンパク質又はコンジュゲート以外の、樹状細胞活性化剤又はアジュバントを含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 対象における免疫応答を調節する方法であって、前記方法は、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含み、それによって対象における免疫応答を調節する、方法。
  37. 抗原に対する免疫応答が誘導及び／又は増強される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記免疫応答がヘルパーＴ細胞応答を増強することにより調節される、請求項３６又は３７に記載に方法。
  39. 前記免疫応答がＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化により調節される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記免疫応答がＢ細胞の抗体産生を増強することにより調節される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記免疫応答が記憶応答を生じさせることにより調節される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  42. 樹状細胞又はその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防方法であって、前記方法は、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含み、それによって樹状細胞又はその前駆体が関与する疾患を治療及び／又は予防する、方法。
  43. 前記樹状細胞又はその前駆体が関与する疾患が、がん、感染、自己免疫疾患又はアレルギーからなる群より選択され、好ましくは、前記感染症がコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザ、デング、手足口病のいずれか１以上である、請求項４２に記載の方法。
  44. 対象における免疫応答を調節するための医薬の製造のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物の使用。
  45. 対象における樹状細胞又はその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防薬の製造のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物の使用。
  46. 対象における抗原に対する免疫応答の調節における使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
  47. 樹状細胞又はその前駆体が関与する疾患の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物。
  48. サンプル由来の樹状細胞又はそのサブセット又はその前駆体を富化する方法であって、
    （ｉ） 樹状細胞又はその前駆体を含むサンプルを、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３３に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物に接触させること、並びに
    （ｉｉ） 本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲートに結合した細胞を単離すること
    を含む、方法。
  49. サンプル中の樹状細胞又はそのサブセット又はその前駆体を検出する方法であって、
    （ｉ） 樹状細胞又はその前駆体を含むサンプルを、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質、請求項２１、２２、２５～３０に記載の融合タンパク質、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１に記載の核酸、請求項３２に記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、あるいは請求項３４又は３５に記載の医薬組成物に接触させること、
    （ｉｉ） 本発明の抗原結合性タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲートに結合した細胞を検出すること
    を含む、方法。
  50. 前記樹状細胞が、以下のマーカー：ＣＬＥＣ９Ａ、ＨＬＡＤＲ及びＢＤＣＡ３の１以上を発現する、請求項４８又は４９に記載の方法。
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