JP2023543982A - 電場により支援される試料の調製 - Google Patents

Abstract

本方法及び機器は、分析のために試料を調製するために、試料に電場を印加する。いくつかの実施形態においては、電場は、組織切片の乾燥、染色及びカバースリップのために印加され、分析及び保存のための改善された組織切片を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、一般的に、限定するものではないが、ヒト及び動物の組織、更には培養細胞、細胞学的標本、細胞塗抹標本、並びに一般的に言えば任意の細胞調製物（cell preparation）を含む、生体試料の乾燥、染色及びカバースリップを含む、分析のための組織切片等の試料（sample）の調製（preparation）に関する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２０年９月３０日付で出願された米国仮特許出願第６３／０８５，３１９号の利益を主張し、その内容の全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

組織学、病理学及び他の分野において、細胞組織等の生体試料は、ヒト又は動物から収集され、次いで、様々な分析手順のための調製において又は該手順の一部として、様々な処理ステップに供される。生体試料の処理において典型的なステップのいくつかは、固定、包埋、切片化、乾燥、染色又は他の検定、装着、及びカバースリップを実施することを含む。

１つの実施の形態によれば、試料を調製する方法は、本明細書に開示される目的のうちの１つ以上を達成するのに有効な電場を試料に印加することを含む。

別の実施の形態によれば、組織調製装置は、本明細書に開示される方法のいずれかに従って及び／又は本明細書に開示される目的のうちの１つ以上を達成するよう電場を印加するように構成された（つまり、本明細書に開示される方法のいずれかに従って、又は本明細書に開示される目的のうちの１つ以上を達成するよう電場を印加するように構成された、あるいはそれらの両方の）、電場発生装置を含む。

本発明の他の装置、機器、システム、方法、特徴、及び利点は、添付図面及び以下の詳細な記載を検討することで、当業者には明らかであるか、又は明らかになるであろう。全てのそのような更なるシステム、方法、特徴、及び利点は、本明細書内に含まれ、本発明の範囲内にあり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。

本発明は、添付図面を参照することによってよりよく理解することができる。図中の構成要素は、必ずしも縮尺どおりでなく、本発明の原理を例示するにあたり、代わって強調されている。図において、同様の参照符号は、異なる図にわたって対応する部分を示している。なお、ここで、「及び／又は」は、その句によってつながれる二以上の要素の一要素、それらの任意の組み合わせ、あるいはそれらの総体をカバーする意味で使われる。

一実施形態による組織試料調製装置（tissue sample preparation device）（又はパラフィン除去装置）の概略斜視図である。 図１に示された組織試料調製装置の、その動作を説明する概略立面図である。 別の実施形態による組織試料調製装置の概略図である。 別の実施形態による組織試料調製装置の概略図である。 組織切片（tissue section）とスライドとの間に閉じ込められた水が除去される、本方法の一実施形態を示す図である。 抗原回復（antigen recovery）のために電場を印加することにより免疫組織化学分析（immunohistochemistry analysis）のために調製された試料を示す図である。 抗原回復のためのイオン性塩を用いた、電場を印加することにより免疫組織化学分析のために調製された試料を示す図である。 抗原回復のためのイオン性塩を用いた、電場を印加することにより免疫組織化学分析のために調製された試料を示す図である。 電場を印加することによりｉｎ ｓｉｔｕ（インサイチュ）ハイブリダイゼーション分析（in situ hybridization analysis）のために調製された試料を示す図である。 電場を印加することによりｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のために調製された試料を示す図である。 ペプシン（パネルＡ及びＣ）又は電場（パネルＢ及びＤ）を用いて処置された乳腺癌の２つの患者試料についてのＦＩＳＨ ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７の結果を示す図である。 本方法の一実施形態による、流動性被覆媒体を用いて安定化する染色組織を示す図である。 試料上に封入剤を広げるために電場が印加される、本方法の一実施形態を示す図である。 試料上に封入剤を広げるために電場が印加された、カバースリップされた試料スライドを示す図である。

組織学、病理学及び他の分野において、細胞組織等の生体試料は、ヒト又は動物から収集され、次いで、様々な分析手順のための調製において又は該手順の一部として、様々な処理ステップに供される。試料はしばしば潜在的に長期間保存され、その後、光学顕微鏡、電子顕微鏡、又は撮像若しくは走査システム等の分析計器によって検査される。一例として、生検又は外科的処置が実行されて、後続する研究のための組織を収集する。収集された組織は次いで、自然劣化プロセスを防止又は低減させるために、ホルマリン等の化学的固定剤（chemical fixative）を含む容器に入れられる。固定剤は、タンパク質を架橋し、組織を分解する酵素の機能を破壊する。容器は、更なる処理に回すことができる。しばしば、組織試料は、グロッシング（grossing）に回される。技術者（例えば病理学者又は他の適切にトレーニングされた人物）が、固定された組織を検査し、更なる検査のために組織の適切な部分（複数の場合もある）を選択する。この組織の部分（複数の場合もある）は、組織カセット（複数の場合もある）内に容易にフィットするサイズにまで切断される。典型的な組織カセットは、約７．８ｃｍ^３の容積と、ヒンジ式の蓋と、組織が組織カセット内にしっかりと収容されたまま液体に浸漬されることを可能とする貫通スロット又は穴とを有する。組織カセットは次いで、数時間の間、固定剤槽に浸漬されてもよい。

組織試料は次いで、手動のもの又は適切な処理機器を使用して自動化されたものとすることができる処理が施されうる。１つの目的は、組織を完全に脱水して、組織がパラフィン（又は他の包埋媒体）で浸潤させられうるようにし、後に切断するのに十分な硬さとすることを可能とすることである。組織は典型的には、例えば７０％エタノール槽に１５分間、続いて９０％エタノール槽に１５分間、続いて一連の１００％エタノール槽に長時間といった、次第に増大するアルコール濃度のアルコール槽に浸漬される。いくつかの処理器は、溶媒の交換を加速させるために、マイクロ波又は音響法を含む。次に、脱水した組織がキシレン（又は他の清澄剤）槽に２０分～１時間の間浸漬され、アルコールはパラフィンと混和しないので、アルコールを完全に除去する。次いで組織が溶融パラフィンを用いて浸潤させられ（通常は約６０℃で）、次いで組織を室温にまで冷却する。

技術者は次いで、組織を含む閉じた組織カセットを収集し、それらを包埋ステーション（embedding station）に持ち込む。包埋ステーションは、溶融パラフィンを含むホットメルトガン（hot melt gun）及びチルプレートを含む。技術者は、組織カセットを開き、組織カセット内に組織を快適にフィットさせる型（mold）を選択する。技術者は、型のベースに少量のパラフィンを入れ、次いでパラフィンがチルプレート上で固まったときに、型の中に組織を配置する。組織は、型の底部に最も近い組織が最初にミクロトームにより切断されるように配向される。技術者は次いで、溶融パラフィンで型の残りを満たす。次に、技術者は、組織カセットの裏側をパラフィンに当てて置き、更なる量のパラフィンを追加してもよい。組織カセットは、バーコード又は他の情報を保持し、組織ブロックの保持器として機能しうる。技術者は次いで、パラフィンが硬化するまで型を置いておき、次いで型から組織ブロックを取り出す。その結果の組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ：formalin fixed paraffin embedded）組織と呼ばれる。

技術者は次いで、ミクロトーム（microtome）を使用して組織ブロックを切断又はスライスして、組織切片と呼ばれる、硬くされた組織の１枚以上の薄いスライスを得ることができる。通常、これらの組織切片の厚さは４マイクロメートル（μｍ）～６マイクロメートル（μｍ）のオーダーであるが、１マイクロメートル～３０マイクロメートルの範囲も珍しくはない。組織ブロックの上部における余分なパラフィンを切り取った後、技術者はいくつかの切片を切断するが、これらはリボン（ribbon）を形成する傾向がある。リボンは、パラフィン及び組織の両方を平らにするために、加熱された水槽に注意深く入れられる。技術者は次いで、リボンを個々の切片に分離し、各切片をガラス製の顕微鏡用スライド上に整列させる。この時点において、各スライドは、組織及びパラフィン（浸潤パラフィン及び包埋パラフィンの両方）のうちの１つ又は２つ若しくはいくつかの切片を、非常に薄い水の膜からの表面張力によりスライドの主面に保持された状態で有する。各スライドは、識別のためにバーコード又は他の方法でマークされてもよい。

ほとんどの染色プロトコルについて、切片がスライドに完全に接着することが重要であるため、組織切片がスライド上で注意深く乾燥させられる必要がある。しかしながら、切片を水から除去することは、切片とスライドガラスとの間に閉じ込められた可変の水の層を残すことができる。スライドが焼成される前に完全に乾燥していない場合、切片がガラスに接着しないこと又はしわを含むこととなりうる。これらの事象はいずれも、成功する染色プロセスを妨げる見込みが高い。閉じ込められた水を除去するために使用される典型的な方法は、スライドを垂直の向きで約２０分～６０分間空気乾燥させて、水が切片の底部に流れて蒸発することを可能とすることである。他の水の除去方法は、スライドの上に能動的に空気を流して水分の蒸発を支援すること、又はスライドをタッピングして閉じ込められた水分を追い出すことを含む。これらの方法は、水が除去されるのに必要とされる時間を短縮するのに役立つが、乾燥を確実にするためには依然として長い時間を必要とする。

乾燥の後、組織切片を有するスライドは、約６０℃で焼成される。スライドは通常、約２０分～６０分間、加熱板上又は加熱チャンバ（例えばオーブン）内に垂直に置かれる。利用可能な加熱機器にはいくつかのバリエーションがあるが、いずれも基本的に何らかの形で加熱チャンバ又は加熱板の使用を伴う。乾燥及び焼成は、染色プロセスの間、及び１０年以上が望ましいものとなりうる後続する保存の間の、スライドへの組織の接着を確実にするために行われる。スライドから分離した組織は失われ、その結果は、例えば組織試料を得るために手術を受けた患者の場合においては、深刻なものとなりうる。組織は帯電していないスライドには好適に接着しないものでありうるが、Ｈ＆Ｅ染色された切片については日常的に実行されている。接着性を高めるために、一部の研究室は、正に帯電したスライドを用いて、試料のタンパク質及び核酸（デオキシリボ核酸すなわちＤＮＡ、及びリボ核酸すなわちＲＮＡ）上の負の電荷が正に帯電したスライドと相互作用するようにしている。他の研究室は、組織がスライドに接着することを確実にしようとして、平坦なスライドガラス上に試料を装着するために使用される水槽に接着剤を入れている。乾燥及び焼成の時間の長さは、実行されるべき後続する染色プロセスに依存して変えることができる。焼成プロトコルは、免疫組織化学（ＩＨＣ：immunohistochemistry）のために染色されるスライドについては、標準的なヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ：hematoxylin and eosin）染色よりも長くなるが、これはＩＨＣがより積極的な化学的手順であり、それゆえ組織切片がスライドから落ちる可能性を高くするためである。

組織がスライドに接着させられた後、組織は染色されてもよい。組織切片に対して実行されうる、多くの種類の染色がある。例えば、組織切片は、Ｈ＆Ｅ染色のためにスライド上に装着されてもよい。ヘマトキシリンは核酸を青色に染色し、かくして細胞核のマーカとして有用である。エオジンはタンパク質をピンク色に染色し、かくして細胞膜、細胞質、及び細胞外基質のマーカとして有用である。病理医はしばしば、組織構造の形態を見るために、Ｈ＆Ｅ染色されたスライドを使用する。いくつかの場合においては、病理医は、更なる分析なしで、Ｈ＆Ｅ染色されたスライドの検査から診断を得ることができる。

組織切片を染色する前に、スライドに接着させられ、組織と混在しているパラフィンが、除去される。パラフィンの除去に関与する従来のステップのシーケンスは、試料にパラフィンを塗布するために上記で説明されたものとは、本質的に逆である。スライドがキシレン又は別の清浄剤（cleaning agent）に浸されて、パラフィンを溶解して除去する。イソプロピルアルコール等の他の溶剤もパラフィン除去に使用されうるが、一般的にキシレンほど好適には作用しない。スライドは次いで、キシレンを除去するための１００％エタノールから始まり、続いて組織を再水和させるための７０％のエタノール／３０％の水の組成まで下がる、低下する濃度を有する一連のエタノール溶液に入れられる。次いで、スライドは脱イオン水の中に入れられる。

パラフィンを除去した後、スライドが染色される。例えば、スライドは、ヘマトキシリン溶液に入れられて、核を染色し、次いで洗浄することができる。続いて、スライドは、エオジン溶液に入れられ（試料中のタンパク質を染色するため）、次いで洗浄されてもよい。次に、染色された組織の上に封入液が置かれ、薄いカバースリップ（通常は非常に薄いガラス又はプラスチック）が組織の上に置かれ、端がスライドに付着させられる。カバースリップは、顕微鏡下でのより容易な観察を可能にする。

いくつかの診断又は分析は、他のタイプの染色の使用を必要とする。例えば、微生物感染（microbial infection）を診断するためには、特殊な染色が使用される。別の例として、免疫組織化学（ＩＨＣ）は、様々なポリペプチド上の特定の抗原の存在を検査するために、抗体ベースの試薬を使用することを指す。ＩＨＣはしばしば、癌をより特異的に特徴付けるために使用される。ＩＨＣ染色プロセスは一般的に、パラフィンが除去されることを必要とし、組織が再水和されるという点で、Ｈ＆Ｅに類似する。

しかしながら、ＩＨＣのためには通常、組織中の抗原（特に抗体試薬により結合されるべき抗原）が、適切な緩衝液中で所望の温度にまで組織を加熱することによって「賦活化（retrieved）」される、余分なステップがある。抗原が賦活化されると、抗体が適用される。スライドが次いで洗われ、抗体が組織に固着したスライドにカラー染色を施すための標識付け（labeling）ステップが実行される。緩い定義では、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ：heat-induced epitope retrieval）は、標的抗原を含むポリペプチドの分子構造を変化させることによって、一般的には元の又は「固定前（pre-fixative）」の構造に戻すことによって、染色性を向上させるために、免疫組織化学染色に先立ってしばしば使用される手順である。ＨＩＥＲの手順は、スライド装着された標本材料（切片化された組織及び他の細胞調製物）の、加熱された緩衝液への曝露を含む。「タンパク質アンマスキング（protein unmasking）」、「デクローキング（decleaking）」、「抗原賦活化（antigen retrieval）」及び「エピトープ回復（epitope recpvery）」等の代替の用語もまた、これらの手順を説明するために使用されてきた。この賦活化プロセスは、アルデヒド系の固定剤は細胞形態を保存するのに優れているが、ポリペプチドの架橋も引き起こし、一部の抗原が相補的な抗体へ結合できなくなることに帰着させることができるため、使用される。熱は架橋された抗原を展開（unfold）させ（ＤＮＡの変性と同様の方法で）、緩衝液は展開されたタンパク質の構造を維持することを支援する。様々なＨＩＥＲ法の間の主な違いは、かかる溶液が加熱され、スライドに曝露又は塗布される手段による。ＨＩＥＲは一般に、ＩＨＣ染色反応内で様々な抗原の反応性を改善する手段として、酵素分解と組み合わせて使用される。

家庭用電子レンジは、しばしばＨＩＥＲのために使用されるが、温度を調節することにおける困難性、沸騰の可能性、及びこれらのユニットが時間とともに電力を失うこと等の、いくつかの欠点を有する。野菜スチーマは、水槽と同様に、しばしば９５℃を超える溶液の加熱が不可能なものであり、格段に長いＨＩＥＲプロトコルをもたらす。これに加えて、野菜スチーマは他の機器に比べ、あまり多くのスライドを保持しない。加圧調理器は、より短いプロトコルを可能とし、沸騰の可能性を排除する、より高い動作温度及び閉じたシステム設計という利点を有する。デジタル制御パネル及び圧力計を組み合わせたユニットは、より好適な温度調整を提供し、操作者が手続中に性能を監視することを可能とする。家庭用電化製品は、研究室環境内で一般的に使用されているが、科学者らは、より標準化され特別に設計された計器が望ましいことに同意している。

ＨＩＥＲ用に特別に設計された、いくつかの市販の装置がある。例えば、Pick Cell Laboratories社は、加圧調理器のような装置である２１００ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ（登録商標）を発売している（類似のユニットに見られる圧力計及び時間／温度表示は有さない）。BioGenex Laboratories社のＥＺ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ（登録商標）は、基本的に工業用電子レンジであり、４つのテフロン（登録商標）反応チャンバと、温度モニタプローブとを含む。これらの動作が基づいている装置（すなわち加圧調理器及び電子レンジ）と同様に、これらの新しい器具も多くの欠点を持っている。Lab Vision Corporation社のＰＴ（Pre Treatment）Ｍｏｄｕｌｅ（商標）は、主にLab Vision社のＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）のスライドラックと併用するために設計された半自動化された計器であり、ＨＩＥＲ手順の完了時に、スライドがＰＴ Ｍｏｄｕｌｅ（商標）からＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）に直接に移送されることを可能とする。この装置の主な欠点は、操作者が２つの大きな着脱可能なステンレス鋼の「タンク」を充填したり、そこから試薬を排出したりすることを必要とし、不釣り合いに大量の賦活化溶液を消費することである。

市場には様々なＩＨＣ染色器があり、そのうちのいくつかはＨＩＥＲ能力を提供する。多数のスライドが同時に加熱緩衝液に浸される、以上に説明された装置とは異なり、ＩＨＣ染色器内で実行されるＨＩＥＲは通常、スライドを個別に処理することを含む。例えば、Ventana Medical Systems社のＢｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）染色器は基本的に、回転式の「カルーセル」内で水平に向けられた個々のスライドにＨＩＥＲ溶液を「噴霧」し、次いで各スライドを予め設定された温度にまで加熱し、このプロセスを他のスライドに対しても繰り返すためにカルーセルを回転させる。ほとんどのプロトコルにおいては、ＨＩＥＲが完了したとみなされるまでに、ＨＩＥＲ溶液が９回も適用される。同様に、Vision-Biosystems社のＢｏｎｄ－ｍａＸ（商標）染色器は、水平に配置されたスライドの列にピペッタ機構（pipettor mechanism）を介してＨＩＥＲ試薬を分注し、次いで列全体が一緒に加熱される。

ＩＨＣスライド染色器へのＨＩＥＲ能力の追加は、検体の損失の見込みを高め、そうでなければ「安価な」この手順を実行するコストを上昇させる。前者の問題は、操作者は通常、高価なＩＨＣ手順全体が完了するまで検体の損失に気付かず、その後で操作者がＩＨＣ染色を繰り返すことを要求されることになってしまうため、特に重要である。

ＨＩＥＲの別の重要な側面は、様々な方法及び装置の費用対効果である。このことは、自動化されたプロトコルへのＨＩＥＲ又は脱パラフィン化及びＨＩＥＲの追加が、ＩＨＣの全体的なコストを著しく増大させることができることを考慮すると、特に当てはまる。ＨＩＥＲ装置の重要な特徴は、ＨＩＥＲ手順の間に消費される試薬の量であり、装置間で著しい違いがある。例えば、自動化されたＩＨＣ染色器上でＨＩＥＲを実行するコストは、改良された加圧調理器の中でＨＩＥＲを実行するよりも６倍も大きくなりうることを、いくつかの研究が実証している。

最も単純な形態においては、ほとんどのＨＩＥＲ装置は、二次容器内の液体を加熱するための信頼性の高い機構によって囲まれた、二次試薬容器が入れられる一次チャンバからなる。かかる装置が保持することができるスライド（二次試薬容器）の数の限界は、一次チャンバの大きさである。安定した結果をもたらすことの重要性を考慮すると、望ましいＨＩＥＲ装置は、Ａ）１００℃以上の温度を維持することが可能な、精密に制御される熱源を内蔵し、Ｂ）適切な量の賦活化緩衝液及びスライドを保持し、Ｃ）ＨＩＥＲ溶液の蒸発及び沸騰の可能性を最小化する。これらの要件は、過度の蒸発が、Ａ）緩衝液の塩濃度を変動させ、Ｂ）沸騰が標本をスライドから放出させ、Ｃ）沸騰してこぼれることが、「生の」標本材料の大気への曝露に導き、不十分な賦活化、及びアーティファクトの乾燥による理想的でない形態をもたらすことができるため、重要である。温度と暴露時間との間の逆比例関係に応じて、１００℃より高い温度で動作し、沸騰を防止する装置（例えば加圧調理器）は、可能な限り短い時間枠で良好な結果をもたらすので、非常に普及している。

別のタイプの染色は、標識付けされた相補的ＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して、試料中の特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を位置特定する、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ：in situ hybridization）である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検定は、蛍光、銀又は発色性の標識核酸プローブ（labeled nucleic acid probe）を使用して、凍結組織又はホルマリン固定されたパラフィン包埋組織標本（全組織、細胞ペレット又は細胞塗抹標本）中の遺伝子増幅の有無を定量的に決定するために使用されうる。この染色は、疾患の処置のための治療の選択に関連する、癌における遺伝子マーカを決定するために使用されうる。ＩＳＨに続いて、ＤＮＡにおけるアデニン－チミンに富む領域のための蛍光青色染色であるＤＡＰＩ封入剤（DAPI mounting media）を使用して、スライドが被覆される。

標識核酸プローブを適用する前に、組織試料は通常、タンパク質分解消化（proteolytic digestion）される。凍結組織については、組織はクリオスタット（cryostat：定温保持装置）を使用して切断され、その後に組織の固定、次いでタンパク質分解消化、その後に標識プローブ（labeled probe）のハイブリダイゼーションが行われてもよい。ＦＦＰＥ組織については、（以上に説明されたように）切断されスライドガラスに接着された組織切片から、パラフィンが除去される。脱パラフィン化及び再水和の後、試料は水性緩衝液中で加熱前処置ステップを施され、ホルマリンにより誘導されたジスルフィド結合を切断することにより、後続するプロテアーゼ（protease）の消化を容易にする。次いで、ペプシン又はプロテイナーゼＫ等のプロテアーゼを使用してタンパク質分解消化が実行され、タンパク質を消化し、又はペプチド結合を切断して、ゲノム標的ＤＮＡに対する標識核酸プローブのアクセスを容易にする。タンパク質分解消化はまた、無傷のタンパク質により発生する自家蛍光を低減させる。酵素消化の手順は、組織固定時間に適合されてもよく、温度、及び例えば３０秒～最大で５０分までのような時間によって変化する。タンパク質分解消化は、細胞質の透過性を高め、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）プローブの、組織の核酸へのアクセスを可能にする。適切に消化された細胞においては、自家蛍光は主に核に限定され、そのレベルは赤色プローブ信号及び緑色プローブ信号を妨害しない。

タンパク質分解消化を使用する現在のＩＳＨ法は、いくつかの欠点を有する。タンパク質分解消化は、異なる研究室及び組織タイプ間の分析前固定方法の変動により、ＩＳＨにおいて最も変動しやすいステップである傾向がある。消化不足及び消化過多が非常に頻繁に起こり、ＩＳＨ検定の繰り返しを必要としうる。タンパク質分解ＩＳＨがないと、結果は、高レベルの自家蛍光、不規則なＤＡＰＩ核染色パターン、及び好ましくないプローブの信号分布を伴う、最適には及ばないものとなる。消化が非常に不足した試料はしばしば、細胞質及び細胞外基質における緑色の自家蛍光により特徴付けられる。タンパク質及びペプチド鎖の多い存在により、プローブのハイブリダイゼーションが妨げられ、より多い自家蛍光及び低いプローブハイブリダイゼーションのために、信号強度を低減させ、それにより信号対雑音比を低減させる。基準プローブ信号は、最適には及ばない試料の消化不足にもかかわらず、緑色の信号の存在をもたらしうる。消化過多は、不十分なＤＮＡ ＤＡＰＩ複合体の形成をもたらし、核の染色を不均一に見えるようにする。この染色パターンは、ドーナツ化又は損傷核膜と呼ばれる。強度の消化過多は、何も入っていない「ゴースト」核及び破壊された核の形態をもたらす。これらのアーティファクトは、再検査を必要とし、病理医によるスコアの解釈に影響を与え、その結果、患者の処置に影響を与えうる。

多重（multiplex）ＩＨＣ染色とは、単一のスライド上で複数の抗原標的に対する抗体を用いる、試料の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を指す。多重染色は、スライドあたりの増大した価値、簡略化された手順、及び短縮されたターンアラウンドタイムを含む、複数のＩＨＣの利点を有する。多重マルチポリマー（又は色原体）検出は、ステップ数を減らすことによりプロトコルを簡素化する。多重ＩＨＣのための用途は、（１）疾患の診断又は処置に関連すると考えられるタンパク質マーカのパネルの臨床評価と、（２）多くの癌に対する免疫療法又はケア処置の標準の選択に情報を与える、腫瘍微小環境の構成又は腫瘍細胞に浸潤する免疫細胞の検出の臨床評価とを含む。用途（２）のいくつかの例示的な事例においては、腫瘍細胞と形態が非常に類似してみえる免疫細胞又はマクロファージの識別が、非常に望ましい。腫瘍細胞の中でもＢ細胞とＴ細胞との区別は、免疫療法の選択のために重要である。免疫細胞及び腫瘍細胞は、免疫細胞のみによって又は腫瘍細胞のみによって発現されるタンパク質に特異的な抗体を含む、多重ＩＨＣを使用して区別されうる。

組織切片に対する多重ＩＨＣのための典型的なワークフローは、以下のステップのいくつか又は全てを含んでもよい。

１．スライドを脱パラフィン化する。

２．組織切片を、一連の段階的アルコール中で水に水和させる。

３．バックグラウンド染色を増大させうる内因性ペルオキシダーゼをブロックする。

４．組織切片を、塩を含む高ｐＨ緩衝液中で９５°にまで加熱することによる、抗原賦活化。

５．非特異的なタンパク質がＩＨＣ抗体に結合するのを防ぐための、タンパク質をブロックする。

６．組織標本中の特異的抗原（もしあれば）に結合する一次抗体＃１を適用する。

７．一次抗体＃１の周りにＨＲＰ二次抗体を結合させる：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ポリマーが、一次抗体＃１に結合する。

８．ポリマーまたは色原体：色原体（ＤＡＢ、ＨＲＰマゼンタ又は他の色原体）を一次抗体＃１の周りに沈殿させる。

９．組織に結合した利用可能な抗体を変性させる：硫酸等の変性試薬の添加が、依然として利用可能な賦活化された抗原に影響を与えることなく、一次抗体＃１を変性させることとなる。

１０．核の識別のためにヘマトキシリンを用いて対比染色する。このステップは、この時点では任意選択的であり、一次抗体＃２のその抗原への結合、並びに二次抗体及び色原体への抱合の後に、実行されてもよい。

１１．このステップにおいて、組織切片が一連の段階的アルコール中で脱水され、全スライド撮像器による走査による分析等の分析のためにカバースリップされてもよい。

１２．カバースリップを除去し、キシレンを用いて洗浄し、一連の段階的アルコール中で水に再水和させる。

１３．組織切片中のその特異的抗原（もしあれば）に結合する一次抗体＃２を添加する。

１４．一次抗体＃２の周りにＨＲＰ二次抗体を結合させる：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ポリマーは、一次抗体＃２に結合する。

１５．ポリマー／色原体：色原体（ＤＡＢ、ＨＲＰマゼンタ又は他の色原体）を一次抗体＃２の周りに沈殿させる。

１６．核の識別のためにヘマトキシリンを用いて対比染色する。

１７．組織切片を脱水し、封入剤（mounting medium）を使用して組織切片上にカバースリップを装着する。

以上から、後続する研究のための収集された組織の処理は、多くのステップ及びかなりの時間を伴うことが明らかである。かくして、これらのステップのうちの１つ以上を排除する、及び／又は必要とされる（つまり、排除する又は必要とされるあるいはそれらの両方の）時間を削減する、かかる処理における何らかの改善が望ましいものとなりうる。

前述の問題の全部又は一部、及び／又は当業者によって観察されうる他の問題に対処するために、本開示は、以下に規定される実施態様において例として説明されるような、方法、プロセス、システム、機器、器具、及び／又は装置（つまり、方法、プロセス、システム、機器、器具、又は装置、あるいはそれらの全て）を提供する。本方法、プロセス、システム、機器、器具、及び／又は装置の様々な実施形態のいずれも、他の実施形態のうちの１つ以上と組み合わせられてもよいことが考えられる。

本明細書で使用される場合、「固体基板（solid substrate）」という用語は、生物学的又は化学的試料のための少なくとも１つの表面を有する任意の試料ホルダ、支持体又は基板を指す。固体基板は、限定するものではないが、スライド、プレート、フリット、ビーズ、多孔質媒体、フィルタ、及び容器を含む。かくして、固体基板は、少なくとも１つの試料を支持することができる担体（carrier）、試験管、チップ、アレイ、又はディスクでありうる。いくつかの実施形態においては、固体基板はスライドである。スライドは典型的には、第１の主スライド表面及び第２の主スライド表面を有し、これらは平坦状又は湾曲状とすることができる。スライド及び他の固体基板は、ソーダライムガラス、ホウケイ酸ガラス若しくは溶融石英等のガラス、又は透明プラスチック、又は他の透明若しくは半透明材料で作られてもよい。

本明細書で使用される場合、「試料（sample）」という用語は、組織試料、血液試料、又は細胞試料等の、分析が望まれる生物学的、化学的、又は工業的な試料を意味する。いくつかの実施形態においては、組織試料は、患者から得られた組織生検の試料であってもよい。対象となる生検は、皮膚（メラノーマ、癌腫等）の腫瘍生検及び非腫瘍生検の両方、軟組織、骨、乳房、結腸、肝臓、腎臓、副腎、胃腸、膵臓、胆嚢、唾液腺、子宮頸、卵巣、子宮、精巣、前立腺、肺、胸腺、甲状腺、副甲状腺、下垂体（腺腫等）、脳、脊髄、眼、神経、及び骨格筋等を含む。

本明細書で使用される場合、「包埋媒体（embedding medium）」という用語は、組織試料等の生体試料を包埋するのに適したパラフィン及び同様の材料を指す。

本明細書で使用される場合、「電極（electrode）」という用語は、電場が生じるような電流を伝える任意の固体構造を指す。電極は、アルミニウム又は他の金属等の、いずれの適切な材料を含んでもよい。電極は、細長いロッド状の幾何学的形状又は薄い平面状（プレート状）の幾何学的形状等の、いずれの望ましいサイズ又は形状を有してもよい。例えば、好適な電極は、金属（例えばアルミニウム）の箔でありうる。例示的な電極は、プレート電極及びピン電極等の平坦な電極と、一方若しくは両方が静止しているか又は一方若しくは両方が可動である電極の対と、並びに室温での又は上昇した温度若しくは低下した温度での動作のために構成された電極とを含む。

試料に電場を印加する機器の一実施形態の限定するものではない例が、ここで説明される。

図１は、例示的な組織調製装置（tissue preparation device）１００の概略的な斜視図である。装置１００は、電場印加装置とも呼ぶことができる。図１はまた、固体基板１１２（例えば顕微鏡スライド）の上面上に配置された、一般に試料の例示であり組織試料とも呼ぶことができる組織１０８を含む、支持組織構成１０４を示している。組織１０８は、固体基板１１２上に拘束されない様式で自由に載置されてもよい。例えば、組織試料１０８は、以上に説明されたように収集され処理されていてもよい。装置１００は、組織１０８に電場を印加するように構成されており、このことは、染色のため及び／又は他の所望の（つまり、染色のため及び／又は他の所望のためあるいはそれらの両方のための）処理又は分析のための調製において行われてもよい。

電場は、所望の効果を生み出すために重要である。多くの他の手段及び実施形態が、必要な電場を生成するために想到される場合があり、当業者には知られている。かかる手段及び実施形態は、以下に説明される例示的な実施形態内の種々の寸法及び電圧、並びに当該電場を生成する他の物理的手段（例えば光学的生成、変化する磁場を介した誘導的な生成、エレクトレット（electret）ベースのもの等）を包含する。これらの手段のいずれも、必要な電場を発生させるために使用することができ、本明細書で説明される本発明の範囲内に留まる。これに加えて、本発明は、本明細書に記載される例示的な電場強度に限定されるものではないが、異なる材料及びプラットフォームの選択に対して、より大きな又はより小さな電場が当業者によって想到されうる。

電場印加装置１００は、電場発生装置１１６を含み、加熱装置１２０を更に含んでもよい。電場発生装置１１６は、１つ以上の可動の又は静止した第１の電極（又は放電電極）１２４及び１つ以上の（典型的には静止した）第２の電極（又は対電極）１２８等の電極配置と、適切な電圧源（又は電源）１３２とを含む。電圧源１３２は、直流（ＤＣ）電圧源であってもよいし、又は交流（ＡＣ）電圧源であってもよい。いくつかの実施形態においては、電圧源１３２はＡＣ電圧源であり、無線周波数（ＲＦ）電圧源又はマイクロ波周波数電圧源等の高周波電圧源であってもよい。少なくとも第１の電極１２４は、電圧源１３２と電気的に通信している。実施形態に依存して、第２の電極１２８は、電圧源１３２と電気的に通信していてもよいし、又は電気的な接地電位に結合されていてもよい。いくつかの実施形態においては、電圧源１３２は、キロボルト（ｋＶ）のオーダーのＤＣ電圧電位を第１の電極１２４に印加することが可能な高電圧源である。例えば、いくつかの実施形態においては、電圧の電位（接地電位に対する）は、約４０００Ｖ（４ｋＶ）～約３００００Ｖ（３０ｋＶ）の範囲内（絶対値）であってもよく、この範囲内の電圧の全てを含み、限定するものではないが例えば１．５ＭＶ／ｍ～８ＭＶ／ｍの範囲内の電場を伴う。印加される電位は、正の電位であってもよいし又は負の電位であってもよく、すなわち、範囲は、約＋４０００Ｖ～約＋３００００Ｖ又は約－４０００Ｖ～約－３００００Ｖであってもよい。限定するものではない例として、電極の間隔は、－１．５ＭＶ／ｍ～－８ＭＶ／ｍ又は＋１．５ＭＶ／ｍ～＋８ＭＶ／ｍの範囲内の電場を発生するように設定されてもよい。前述の範囲は、単なる一例である。いくつかの実施形態においては、電位は３００００Ｖよりも大きく、３０ＭＶ／ｍを超える電場をもたらしてもよい。コロナ放電が必須ではないいくつかの実施形態においては、電圧電位は１０００Ｖ未満であり、３ＭＶ／ｍ未満の電場をもたらしてもよい。より一般的には、電圧源１３２は、第１の電極１２４及び組織１０８が位置する環境において、コロナ放電又はプラズマを発生し維持するのに十分な又は有効な大きさ（又はＡＣ電源の場合には、ピーク間振幅及び周波数）で、ＤＣ又はＡＣ電圧を第１の電極１２４に印加することが可能である。

いくつかの実施形態においては、第１の電極１２４は、第１の電極１２４を囲む増大した（elevated）電場強度の領域を発生させるように構成された、（極めて）湾曲した形状部を含んでもよい。例えば、湾曲した形状部は、エッジ若しくは尖った先端部、又は小径のワイヤ等の、鋭い又は幾何学的に急激な形状部であってもよい。図示された実施形態においては、第１の電極１２４は、遠位電極先端部１３６において終端する細長いロッドとして構成される。遠位電極先端部１３６において終端する第１の電極１２４又は少なくともその先端部分は、遠位電極先端部１３６が鋭いもの又は尖ったものとなるように、テーパ状であってもよい。一般的に、より鋭い遠位電極先端部１３６は、より鈍い幾何学的形状と比較して、遠位電極先端部１３６においてより強い電場を発生させる。かくして、いくつかの実施形態においては、第１の電極１２４は、針又はピン（例えばコロナ放電針）として構成されてもよい。いくつかの実施形態においては、第１の電極１２４は、電気絶縁材料で構成される本体１４０（図１に断面を示す）によって同軸的に囲まれてもよい。電気絶縁材料は、十分に断熱性の材料であってもよく、又は、本体１４０は、電気絶縁材料を同軸的に囲む断熱材料を更に含んでもよい。絶縁体１４０は、ユーザにより手で保持されるように構成されてもよい。すなわち、第１の電極１２４は、ペンのようにユーザによって保持されるハンドピースとして構成されてもよい。代替としては、絶縁体１４０は、自動化された装置（例えば電動ステージ又はロボット）に装着されるように構成されてもよい。かくして、実施形態に依存して、第１の電極１２４は、手動の又は自動化された方法で、組織１０８に対して可動のものであってもよい。

第２の電極１２８は、典型的には、対向電極（counter-electrode）又は接地面（ground plane）として機能するように構成される。第２の電極１２８は、印加電圧によって発生する電場及びプラズマの位置及び空間的な向きを定義する際に、第１の電極１２４と協働するように位置決めされてもよい。いくつかの実施形態においては、図示されるように、第２の電極１２８は、第１の電極１２４とは反対側の組織１０８の側面に位置決めされる。換言すれば、組織１０８は、第１の電極１２４と第２の電極１２８との間に位置決めされる。他の実施形態においては、第２の電極１２８は、組織１０８の上方に位置決めされてもよいし、又は、何らかの基準面に対して組織１０８とほぼ同じ高さに並置されてもよい。図示された実施形態においては、第２の電極１２８は、支持された組織構成１０４のものよりも大きな平面面積の薄い平面状の（プレート状の）幾何学的形状を有し、支持された組織構成１０４は、第２の電極１２８の上に置かれる。例えば、第２の電極１２８は、金属（例えばアルミニウム）の箔であってもよい。いくつかの実施形態においては、第２の電極１２８は、第１の電極１２４の図示された例と同様の細長いロッド型の幾何学的形状を有していてもよい。いくつかの実施形態においては、１つよりも多い第１の電極１２４及び／又は１つよりも多い第２の電極１２８（つまり、１つよりも多い第１の電極１２４、又は１つよりも多い第２の電極１２８、あるいはそれらの両方）が備えられてもよい。

いくつかの実施形態においては、特にＡＣ電源が利用される場合、本体の電気絶縁部分が第１の電極と第２の電極との間に介挿されるように、第２の電極が第１の電極を同軸状に囲むことができる。この場合においては、第２の電極は次いで、電気絶縁性及び／又は断熱性の（つまり、電気絶縁性の又は断熱性のあるいはそれらの両方を備える）材料によって同軸状に囲まれてもよい。

装置１００は、電圧源１３２及び他の適切な要素を含む電子部品を含んでもよい。該電子部品は、例えば、第１の電極１１６への電圧電位の印加を制御するためのＯＮ／ＯＦＦスイッチ（特に図示せず）、第１の電極１１６に印加される電圧電位のレベルを調整するように構成され構成た要素（例えば制御つまみ（図示せず））等を含んでもよい。これら電子部品のいくつか又は全ては、装置１００の制御コンソールに配置されてもよい。手持ち式の実施形態においては、ＯＮ／ＯＦＦスイッチ（又はＯＮ／ＯＦＦスイッチ及び電圧レベル調節要素の両方）は、ユーザにより容易にアクセスされるように絶縁体１４０に配置されていてもよい。代替としては、ＯＮ／ＯＦＦスイッチ及び電圧レベル調節要素等の制御部は、制御コンソール又は足で操作するモジュールに位置していてもよい。

加熱装置１２０は、一般的に、熱エネルギーを発生させ加熱装置１２０の上部加熱面１４４に伝達するのに有効な、いずれの構成を有してもよい。したがって、例えば、加熱装置１２０は、加熱面１４４と熱的に接触している１つ以上の抵抗加熱要素（特に図示せず）を含む本体１４８と、加熱要素に電流を供給する電圧源（電源）１５２とを含んでもよい。したがって、図示された実施形態においては、第２の電極１２８は、加熱装置１２０の加熱面１４４上に置かれ又は取り付けられ、組織１０８及び支持基板１１２が次いで、第２の電極１２８上に置かれる又は取り付けられる。本実施形態においては、加熱装置１２０を含む装置１００は、開放構造を有する。代替としては、加熱装置１２０は、第１の電極１２４、第２の電極１２８及び加熱面１４４が中に位置決めされ、組織１０８及び支持基板１１２が中へと装填されるチャンバを含んでもよい。抵抗加熱要素に対する代替として、加熱装置１２０は、赤外線（ＩＲ）ランプ等の１つ以上の放射加熱源を備えてもよい。

図２は、組織調製装置１００の、その動作を説明する概略立面図である。組織１０８及び支持基板１１２は、第２の電極１２８上に配置されること等によって、加熱装置１２０の加熱面１４４と熱的に接触するように位置決めされる。加熱装置１２０は次いで、熱エネルギー２５６を発生させ加熱面１４４に伝達し、続いて熱伝導を介して組織１０８に伝達するように作動させられる。十分な量の熱エネルギー２５６が組織１０８に蓄積されて、分析（以下に説明されるような）のために組織１０８を調製する際の１つ以上の目的を達成する。

いくつかの実施形態においては、電場発生装置１１６は次いで、第１の電極１２４の電極先端部１３６の周りの領域においてコロナ放電又はプラズマ２６０を発生させ維持するのに十分な大きさであるが、第１の電極１２４と第２の電極１２８等の別の物体との間の電気アークを引き起こすほど大きくはない強度の、電場を発生させるよう作動させられる。電場は、空気（又は他の気体媒体）中の自由電子を加速させて、空気（又は他の気体媒体）中の中性物質（中性原子及び分子）と衝突させる。衝突の一部は、衝突を受ける中性物質をイオン化するのに十分高いエネルギーで起こり、それによってより多くの電子を解放し、自由電子と中性物質との更なる衝突に導く。電場が存在し、かつそれが十分な強さである限り、イオン化の事象は電子なだれ（electron avalanche）と呼ばれる連鎖反応で継続する。また、電子と正イオンとの再結合事象により、プラズマ２６０中に光子（photon）が発生し、同様に中性物質のイオン化に寄与する。電場発生装置１１６によって発生したプラズマ２６０は、一般的に、荷電粒子（イオン及び電子）と中性物質との、更には準粒子と光子とのような他の高エネルギー種の混合物である。

いくつかの実施形態においては、第１の電極１２４は、第２の電極１２８に対して正の極性を有する。この場合においては、プラズマ２６０は、正のコロナ放電であってもよい。正イオンは、第１の電極１２４から反発され、第２の電極１２８に向かって引き寄せられる。一方、負イオンは、第１の電極１２４に向かって引き寄せられ、第２の電極１２８から反発される。同様に、電子は、第１の電極１２４の方に引き寄せられ、第２の電極１２８から反発される。他の実施形態においては、第１の電極１２４は、第２の電極１２８に対して負の極性を有していてもよく、その場合には、プラズマ２６０は、負のコロナ放電となりうる。

図２において、本明細書でプラズマ２６０と呼ばれる閉じた破線は、プラズマ２６０（又は少なくとも活性プラズマ）の外側の空間的な存在範囲を概略的に描いており、これはイオン化領域又はプラズマ形成領域とも呼ぶことができる。この領域（プラズマ２６０）の外側では、電場は、空気（又は他の気体媒体）中のプラズマを維持するのに十分に強くはない。換言すれば、プラズマは、この領域の外側では消滅する。プラズマ２６０が説明のために概略的に描かれていることは理解されよう。実際には、プラズマ２６０の実際のサイズ及び形状（例えば雲、プルーム等）は、図２に示された概略的な描写とはかなり異なりうる。

図２に描かれているように、通電された第１の電極１２４は、組織１０８の上方に位置決めされ、第１の電極１２４は、組織１０８が高エネルギープラズマ２６０に曝露されるように組織１０８に十分に近い。その結果、プラズマ２６０の高エネルギー種は、試料と相互作用する。第１の電極１２４は、本明細書に記載される目的のうちの１つ以上を達成するよう電場を印加するために、組織１０８及びその下にある基板１１２にわたって（その上を）、任意の所望の方向に移動させることができる。例えば、いくつかの実施形態においては、所与の方向における第１の電極１２４の移動は、閉じ込められた液体又は封入剤を所望の方向に押すか又は引くこととなる。１つの限定するものではない例として、図２は、水平矢印２６４によって示されるように、（図２に向かって）左方向に、組織１０８の上を（接触せずに）移動させられる第１の電極１２４を描いている。

組織を調製する方法の限定するものではない例が、以上に説明され図１及び図２に示された例を使用して、ここで説明される。パラフィン包埋された組織１０８が準備される。組織１０８を準備することは、最初に供給源から組織１０８を取得した後に、本明細書に記載されるような固定、脱水、アルコール除去、パラフィン浸潤／包埋、切片化等の様々な処理ステップを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、組織１０８を準備することは、固体基板１１２上に組織１０８を位置決めする（置く又は取り付ける）ことと、（基板１１２上に支持された）組織１０８を（第２の）電極１２８上又はその近くに位置決めする（置く又は装着する）こととを含む。熱エネルギー２５６は、例えば、抗原賦活化を支援するために、所望に応じて組織１０８に加えられる。組織１０８に電場を印加するのに有効な電場が印加される。この例においては、電場は、電極間隔に依存する電場を発生させる電圧電位を第１の電極１２４に印加することによって、第１の電極１２４と第２の電極１２８との間に発生する。さらに、この例においては、印加される電場は、少なくとも第１の電極１２４の電極先端部１３６と組織１０８との間に広がる領域において、プラズマ２６０を発生させるのに有効である。第１の電極１２４は、所望に応じて組織１０８に対して１つ以上の方向に移動させられ、電場を繰り返し印加する。典型的には、組織１０８は静止したまま、第１の電極１２４が移動させられる。代替として又はこれに加えて、組織１０８が、第１の電極１２４に対して移動させられてもよい。

組織１０８等の試料に電場を印加する前、印加する間、及び／又は印加した後に、（つまり、電場を印加する前、印加する間、又は印加した後、あるいはそれらの全てについて）組織１０８に対して染色プロセス又は他の調製プロセスが実行されてもよい。例えば、組織１０８は、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）等の標準的な染色試薬、若しくは免疫組織化学（ＩＨＣ）染色試薬、又は他の特別な染色試薬を用いて、染色されてもよい。別の例としては、組織１０８は、電場の印加後、封入剤及び／又は蛍光染色（ＤＡＰＩ封入剤等）（つまり、封入剤、又は蛍光染色（ＤＡＰＩ封入剤等）、あるいはそれらの両方）を用いて処置されてもよい。他の所望のプロセスが、組織１０８に対して実行されてもよい。例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を実行するために、核酸プローブが組織１０８に適用されてもよい。別の例としては、核酸が組織１０８から分離され、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）による増幅、ハイブリダイゼーション等の、更なる処理に供されてもよい。

１つの態様として、本技術は、電場を印加することによって基板表面上及び／又は他の液体上の（つまり、基板表面上の、又は他の液体上の、あるいはそれらの両方上の）試料を乾燥させるための方法及び機器を提供することが、ここで説明される。この技術は、焼成前に試料が乾燥していることを確実にするために必要な時間を短縮することができる。例として、通常、スライドを乾燥させるために６０分間放置する研究室は、その時間を約５分にまで短縮することができる。

いくつかの実施形態においては、本技術は、固体基板上に試料を置く方法を提供する。本方法は、パラフィン包埋組織を含む試料を液体槽中に入れることと、試料が基板表面上に広がるようにパラフィン包埋組織を固体基板（スライド等）に接触させることと、基板表面と試料の間に閉じ込められた液体を、該閉じ込められた液体に電場を印加することによって、除去することとを含むことができる。例として、固体基板は、第１のスライド表面及び第２のスライド表面を有するスライドであってもよく、試料は、組織切片であってもよい。本方法はまた、閉じ込められた液体が除去されるときに、スライド表面が実質的に垂直になるように、スライドを移動させることを含んでもよい。この文脈においては、「垂直」とは、例えば、主スライド表面が重力に対して平行であるような、重力に対する位置を指す。いくつかの実施形態においては、スライド表面は実質的に垂直であり、それにより、組織が上端及び底端を有し、第１の電極が底端よりも下に位置するようにされる。電場を印加しながら第１の電極が上端から底端に移動させられ、閉じ込められた液体が底端に向かって移動するようにしてもよい。次いで、第１の電極が上端における位置に戻され、電場を印加しながらの第１の電極の底端への移動が、任意の所望の回数だけ繰り返されてもよい。

数ある利点の中でも、本乾燥方法は、閉じ込められた液体を引き出すために力及びエネルギーを能動的に使用する。組織とスライドとの間に閉じ込められた水が、非常に薄い層に達した場合、その水を除去するために多くのエネルギーを必要とする。以前の方法は、そのエネルギーを供給する能力を有さない。また、組織切片は様々な厚さで提供されるものであり、典型的には２ミクロンから１０ミクロンの間である。より厚い切片については、組織の上面に空気を吹き付けることもうまく作用しないので、閉じ込められた水を除去することはより困難となる。いくつかの実施形態においては、本乾燥方法は、この問題を有さない。

いくつかの実施形態においては、本方法は、組織とスライドとの間に閉じ込められた水を除去するために電場を印加することを含む。いくつかの実施形態においては、閉じ込められた水に十分に近い距離において、大きな電位が金属ピンに印加される。電気アークを生成するために、基準接地（reference ground）がピンの近くに置かれる。例えば、接地面（ground plane）として金属ブロックが使用されてもよい。パラフィン包埋組織切片とスライドガラスとの間に水が閉じ込められた湿潤組織スライドが、ピンと接地面との間に垂直に置かれてもよい。ブロックはパラフィンの融点より低い温度に保たれる。ピンは、組織切片の底端近くに位置し、それにより、重力と電場とが実質的に同じ方向に水を引き寄せるようにする。ピンは、スライドから約４ｍｍ離して置かれてもよい。いくつかの実施形態においては、電源は－２０ｋＶ又は別の適切な電圧にまで調整され、コロナ放電及び５ＭＶ／ｍを超えることができる電場を生成する。電源がオンにされると、切片とスライドとの間に閉じ込められた水が経路を見つけ、ピンに向かって移動する。接地へのいくつかのアーク経路が形成される。これらのアークは、水を蒸発させるのに十分なエネルギーを発生させる。水が蒸発すると、より多くの水が接地及びピンの方向に引きつけられる。この経路は組織とスライドとの間にありうるので、水は組織の下から能動的に引きつけられる。

閉じ込められた水を除去する本方法のいくつかの実施形態においては、電圧は少なくとも５ｋＶ、又は１０ｋＶ、又は２０ｋＶであり、及び／又は、第２の電極は接地電極（grounded electrode）であり、及び／又は、第１の電極は組織から約１ｍｍ～約７ｍｍ、代替的に約３ｍｍ～約５ｍｍだけ離れ、３５０ｋＶ／ｍ～４０ＭＶ／ｍの範囲内の電場をもたらすことができる。いくつかの実施形態においては、組織は、第１のスライド表面に接触し、第１の電極は、第２のスライド表面に面して位置決め又は配置される。いくつかの実施形態においては、組織は、第１のスライド表面に接触し、第２の電極は、第２のスライド表面に接触し、第２の電極は、パラフィンの融点よりも低い温度である。

別の態様として、本技術は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む試料に電場を印加することと、試料を１つ以上の標識核酸プローブと接触させることとを含む、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための試料を調製する方法を提供する。試料は、パラフィン包埋組織試料（全組織、細胞ペレット、又は細胞塗抹標本等）であってもよく、１つ以上の細胞を含んでもよい。対象となるポリヌクレオチドは、細胞の核内にあってもよい。本技術は、タンパク質分解（proteolytic digestion）消化なしで、試料内の標的ポリヌクレオチドへのＩＳＨプローブの結合を可能にする。いくつかの実施形態においては、本方法は、高レベルの自家蛍光、核アーティファクト、及び低レベルのプローブ信号を含む、タンパク質分解消化アーティファクトを回避する。それゆえ、電場を印加することは、プローブ信号の定量化及び検定結果の定量化を改善しうる。また、いくつかの実施形態においては、タンパク質分解消化ステップを排除することによって、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検定を実行するのに必要とされる時間を短縮することができる。いくつかの実施形態においては、電場は、対象となるＤＮＡを露出させるのに十分な強さで及び十分な時間の間印加され、プローブが核酸にアクセスして結合することができる前に、これらの細胞構造をタンパク質分解酵素（ペプシン又はプロテイナーゼＫ等）を用いて消化するステップを回避する。いくつかの実施形態においては、試料は、ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされた蛍光標識プローブの分析の間に、無傷のタンパク質からの自家蛍光が実質的にない状態にされうる。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、試料に電場を印加することと、脱パラフィン化溶媒を用いて試料を洗浄することとの組み合わせ等によって、標識プローブとの接触の前に、試料から実質的に全てのパラフィン又は他の包埋媒体を除去することを含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、本方法は、試料中のＤＮＡを露出させることを含む。いくつかの実施形態においては、このことはタンパク質分解消化なしで行われる。ＤＮＡの露出のために電場を印加することにより、タンパク質分解消化ステップが必要なくなり、本方法は高レベルの自家蛍光（autofluorescence）及び核アーティファクト（nuclear artifact）を減少させ、検定のための処理時間を短縮させる。核アーティファクトがないことはまた、プローブ信号のスコアリング又は定量化を容易にし、より正確な試験結果に帰着することとなる。いくつかの実施形態においては、本技術は、いくつかの検定について、プローブ信号を改善し、背景雑音（background）を低減する。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡの露出は、コロナ放電を発生させるために必要とされる大きさよりも小さい電場に組織を曝露することによって達成することができる。例えば、限定するものではないが、タンパク質分解消化の代わりに、約５００ｋＶ／ｍの電場をもたらすことができる、１分間の１ｍｍの距離における５００Ｖが、高品質のＩＳＨ結果を発生させる。このステップは、標準的なプロセスによる脱パラフィン化の前に完了させられてもよい。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡを露出させる方法は、５００Ｖ未満、又は１２０Ｖ未満、及び／又は１２Ｖ未満の電圧電位で電場を印加することを含む。印加される電圧電位は、正であってもよいし又は負であってもよく、１つ以上の電極にＤＣ又はＡＣ電圧を印加することによって提供されてもよい。本方法における使用のための例示的な電極は、プレート及びピン電極等の平坦な電極、一方若しくは両方が静止しているか又は一方若しくは両方が可動である電極の対、並びに室温の、冷却された又は加熱された電極を含む。

本技術によって生成される電場は、タンパク質分解消化と同様の効果を有することができる。発生した電場は、重度のペプシンの消化過多で見られるような核物質の損傷は、もたらさない。組織試料中の核酸の品質は、電気泳動及び真核生物１８Ｓ ｒＲＮＡについての定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ：quantitative real-time polymerase chain reaction）により評価することができる。本方法は、核酸損傷を回避又は低減することが見出されており、それゆえ核酸損傷なしに検定のためにＤＮＡを露出させることを支援する。いくつかの実施形態においては、これらの方法は、コロナ放電を生じさせることなく実行することができる。

別の態様としては、本技術は、試料が１つ以上のポリペプチドを含み、試料がホルムアルデヒド等のアルデヒドで固定された場合に、分析のために試料を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本方法は、アルデヒドによる架橋又はメチレンブリッジ形成を逆転させること等、１つ以上の固定効果を逆転させるのに有効な電場を印加することを含む。本方法は、賦活化されるべき１つ以上の抗原をポリペプチドが含む組織切片等の組織試料に、特に適している。熱源、パラフィン、及び電極のアレイを含む簡単なセットアップを用いて、緩衝液のない状態での抗原の賦活化のための方法及び機器が提供される。それゆえ、電場を試料に印加することは、複雑で高価な抗原賦活化方法に対する改善であり、組織試料の損失を回避し、スライドへの組織の接着を改善するものである。本方法は、組織の酵素消化の必要性、さらには緩衝液の使用、及びタンパク質分解消化ステップによって達成することができる潜在的に高価な自動染色器の使用を、排除することができる。本技術を使用することにより、緩衝液の使用及びタンパク質分解消化ステップが不要となる。

いくつかの実施形態においては、本方法は、電場を試料上で選択された通過回数だけ移動させることを含む。いくつかの実施形態においては、電場は移動させられない。いくつかの実施形態においては、電場は、試料においてオゾンを発生させる。本方法はまた、試料における湿度を調節することを含むことができる。

いくつかの実施形態においては、本方法は、電場を印加しながら、１つ以上のイオン性塩、及び／又は、１１０°よりも高い又は２００°よりも高い沸点を有する流動パラフィン、溶融パラフィン、又は他の疎水性媒体に、試料を接触させることを含む。イオン性塩の例は、塩化イミダゾリニウム（Ｃ_５Ｈ_１０Ｃｌ_２Ｎ_２）、テトラフルオロホウ酸リチウム（ＬｉＢＦ_４）、トリフルオロ酢酸アンモニウム（ＣＦ_３ＣＯ_２ＮＨ_４）、メチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_４Ｈ_６Ｎ_２ ＨＣｌ）、ブチルメチルイミダゾリウムニトラート（Ｃ_８Ｈ_１５Ｎ_３Ｏ_３）、ヘキシルメチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_１０Ｈ_１９ＣｌＮ_２）、１－エチル－３－メチルイミダゾリウムアセタート（Ｃ_８Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２）、及びこれらの混合物を含む。例えば、本方法は、５０°未満の融点及び１１０℃より高い融点を有する疎水性媒体中の１つ以上のイオン性塩の混合物に、試料を接触させることを含んでもよい。電場は、固定効果を逆転させるのに十分な時間、例えば少なくとも約５分、又は少なくとも約３０分の間、印加されてもよい。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、固定効果を逆転させるのに十分な温度、例えば少なくとも約９０℃又は少なくとも約１１０℃で、組織試料を加熱することを含む。本方法の使用により、組織試料に対して抗原賦活化緩衝液を適用することなく、試料中の抗原が賦活化されうる。

本技術の別の態様として、分析されるべき１つ以上のポリペプチドを含む試料についての、抗原賦活化のための機器が提供される。本機器は、複数の固体基板上の複数の試料に電場を印加するように構成された、電場発生装置を含んでもよい。電場発生装置は、湾曲した形状部を含む複数の電極を含んでもよい。本機器はまた、複数の固体基板を保持し、試料に熱を加えるように構成されたホルダと、固体基板上で反復的な又は所定のパターンで複数の電極を移動させるように構成されたアクチュエータとを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本機器はまた、固体基板における湿度を調節することが可能な、湿度コントローラを含む。本機器は、ホルダ及び電場発生装置が収容される筐体と、該筐体の内部における温度センサ、湿度センサ及びオゾンセンサのうちの１つ以上とを含んでもよく、該センサ（複数の場合もある）はコントローラと通信している。いくつかの実施形態においては、本機器は、流動パラフィン等の２５ｍＰａ・ｓ以上の粘度を有する媒体を分注することが可能なディスペンサを更に含む。該機器は、１つ以上のイオン性塩、疎水性媒体、又はそれらの混合物を含むリザーバを含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、本方法及び機器は、スライド（又は他の固体基板）への組織（又は他の試料）の接着を改善し、それによってＩＨＣプロセスの間の組織の損失を防止する。電場は、組織処理の最初のステップである組織のホルマリン固定の間に、タンパク質エピトープ及び核酸を架橋するメチレンブリッジと相互作用しうる、組織に対して局所的な領域においてオゾンを発生させることができる。電場によって生成されたオゾンは、空気中の湿気と相互作用してメチレンブリッジを逆転させ、それゆえ、次いで抗体に結合することができるエピトープを首尾良く賦活化することができると考えられる。

いくつかの実施形態においては、本技術は、混和性イオン性塩を含む媒体を適用することによって、水性緩衝液がない状態で抗原を賦活化することを可能にする。抗原賦活化は、熱源、パラフィン、及び負電極のアレイを含むセットアップを用いて達成されうる。いくつかの実施形態においては、電場の使用は、スライドへの組織の接着を改善するので、組織試料の損失なしに、複雑で費用のかかる抗原賦活化方法を改善することとなる。いくつかの実施形態においては、組織の酵素消化の必要性を排除することとなる。

塩は、酸と塩基との中和反応によって形成されうるイオン性化合物である。塩は、生成物が電気的に中性（正味の電荷を有さない）となるように、関連する数の陽イオン（正に帯電したイオン）と陰イオン（負イオン）とで構成されている。これらの構成イオンは、塩化物イオン（Ｃｌ^－）等の無機物であってもよいし、又は酢酸イオン（ＣＨ_３ＣＯ^２－）等の有機物であってもよく、フッ化物イオン（Ｆ^－）等の単原子であってもよいし、又は硫酸イオン（ＳＯ_４ ^２－）等の単原子のものであってもよい。

多くのイオン性化合物は、水又は他の極性溶媒に大きな溶解度を示す。分子化合物とは異なり、塩は溶液中で陰イオン成分と陽イオン成分とに解離する。固体内でのこれらのイオン間の凝集力である格子エネルギーが、溶解度を決定する。溶解度は、各イオンが溶媒とどの程度相互作用するかに依存する。

塩は、特徴的に高い融点を有する。低い格子エネルギーを有するいくつかの塩は、室温で又は室温付近で液体である。これらは、通常は塩の混合物である溶融塩、及び通常は有機陽イオンを含むイオン性液体を含む。これらの液体は、溶媒として特異な性質を呈する。本明細書で採用される「イオン性塩（ionic salt）」は、極性溶媒には混和せず、疎水性の化学的部分によって非極性溶媒には混和する塩である。この文脈におけるイオン性塩は、流動パラフィン油及びパラフィン等の有機炭化水素に著しい溶解性を有する塩を指す。抗原賦活化のための本方法のいくつかの実施形態においては、電場を生成するために使用されるイオナイザ（ionizer）に加えて、電子の伝導性を高めるために、イオン性塩を含む流動又は溶融パラフィンが採用される。

別の態様としては、本技術は、多重ＩＨＣ検定におけるような複数の染色試薬を用いて染色することによって試料を分析する方法を提供する。本方法は、第１の染色試薬を用いて試料を染色することと、パラフィン等の流動性被覆媒体で試料を被覆することと、試料の第１の染色パターンを検出することと、Ｃｌｅａｒｉｆｙ等の脱パラフィン化溶媒を用いて洗浄する、又は電場を印加する、又は加熱されたエアナイフ（air knife）を適用すること等によって、試料から流動性被覆媒体を除去することと、第２の染色試薬を用いて試料を染色して、第２の染色パターンを形成することと、試料をカバースリップ（coverslip）又は流動性被覆媒体で被覆することとを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、試料は、１つ以上のポリペプチドを含む組織試料であり、第１の染色試薬及び第２の染色試薬の一方又は両方は、１つ以上のポリペプチドの抗原を特異的に見出す一次抗体を含む。

多重ＩＨＣ検定については、安定化のための、及び第１の染色試薬を用いて染色した後にカバースリップを交換するための、流動性の被覆媒体の使用は、いくつかの潜在的な利点を提供する。これは、カバースリップするステップを省略することによって、多重ＩＨＣ検定に必要とされる時間を短縮することができる。また、手荒い組織の操作に起因する画像の歪みの量を低減することができる。本方法においては、最初の染色手順の後、組織切片及びスライドに対するパラフィンの保護層又は他の流動性の被覆媒体が、手短に加熱されて、前の溶媒を追い出す。余分なパラフィンは、６５℃で１分間、加熱されたエアナイフ又は電場のいずれかを使用して除去されうる。組織切片はこのとき、走査の準備ができたことになる。このことは、Ｃｌｅａｒｉｆｙ等の脱パラフィン化溶媒による手短な洗浄によって後続され、その後に第２の染色試薬の適用のための再水和が行われてもよい。

本方法は、１つ以上のポリペプチドを含む組織試料に特に適しており、第１の染色試薬及び第２の染色試薬の一方又は両方は、１つ以上のポリペプチドの抗原と特異的に（specifically）結合する一次抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、第１の染色試薬を用いて染色する前に、標的賦活化を実行することを含む。標的賦活化（target retrieval）は、（本開示によって説明されるように）電場を印加することによって、又は他の技術によって（例えばタンパク質分解消化によって）、実行されてもよい。

いくつかの実施形態においては、第１の染色試薬は、第１の抗原と特異的に結合する第１の一次抗体と、一次抗体と結合する第１の二次抗体と、第１の標識（label）とを含む。第１の標識（及び本明細書に言及される他の標識）は、蛍光性、発光性、放射性若しくは発色性（例えば化学発光性）のものであってもよく、又は該標識は、発色性生成物又は可視生成物を生成する反応を触媒する酵素（例えばＤＡＢ又はＢＣＩＰ／ＮＢＴを切断して茶色又は紫色を生じさせるアルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ）であってもよい。代替としては、標識は、ビオチン、又は別の部分（ストレプトアビジン又はアビジンタンパク質等）と特異的に結合する他の部分を含んでもよい。標識は、一般的に、二次抗体に付着されるか、又は他の方法で二次抗体に関連付けられる。いくつかの実施形態においては、第２の染色試薬は、第２の抗原を特異的に結合する第２の一次抗体を含む。第２の染色試薬は、第２の二次抗体と、第２の標識とを含んでもよい。

本方法のいくつかの実施形態は、第１の染色試薬を用いた染色の前にタンパク質ブロック剤に試料を接触させること等、ＩＨＣ手順のための追加的なステップを含んでもよく、このときタンパク質ブロック剤は、非特異的タンパク質が第１の染色試薬に結合することをブロックする。いくつかの実施形態においては、第１の染色試薬及び第２の染色試薬は、一次抗体又は核酸プローブを含み、本方法は、ヘマトキシリンを用いて試料を染色することを更に含む。

いくつかの実施形態においては、本方法はまた、試料を第２の一次抗体と接触させることに先立って、第１の一次抗体を変性させることを含む。いくつかの実施形態においては、第１の一次抗体は、硫酸等の変性剤と接触させることによって変性させられる。いくつかの実施形態においては、変性は、第１の染色パターンの検出に先立って実行される。いくつかの実施形態においては、第１の一次抗体は、プロテアーゼと接触させることによって変性させられる。本方法において使用されるプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼを含む、いずれの適切なプロテアーゼであってもよい。本方法において使用されるプロテアーゼの量は、試料中にある組織切片及び他の抗原を構造的に無傷のままとしつつ、第１の抗体及び／又は第２の抗体（つまり、第１の抗体、又は第２の抗体、あるいはそれらの両方）をタンパク質分解の消化をするのに十分なものであるべきである。

いくつかの実施形態においては、第１の染色試薬又は第２の染色試薬のうちの少なくとも一方は、腫瘍細胞抗原を結合させ、第１の染色試薬又は第２の染色試薬のうちの少なくとも一方は、免疫細胞抗原を結合させる。免疫細胞抗原及び腫瘍細胞抗原は、異なる色の沈殿染色等の染色剤を用いて標識付けされうる。

例えば、第１の一次抗体及び第２の一次抗体は、癌バイオマーカ等のバイオマーカに特異的に結合する抗体であってもよい。例示的な癌バイオマーカは、限定するものではないが、癌胎児性抗原（腺癌の識別用）、サイトケラチン（cytokeratin）（癌腫の識別用のものであるが一部の肉腫においても発現しうる）、ＣＤ１５及びＣＤ３０（ホジキン病（Hodgkin’s disease）用）、アルファフェトプロテイン（alpha fetoprotein）（卵黄嚢腫瘍及び肝細胞癌用）、ＣＤ１１７（消化管間質腫瘍用）、ＣＤ１０（腎細胞癌及び急性リンパ性白血病用）、前立腺特異抗原（前立腺癌用）、エストロゲン（estrogen）及びプロゲステロン（progesterone）（腫瘍の識別用）、ＣＤ２０（Ｂ細胞リンパ腫の識別用）、並びにＣＤ３（Ｔ細胞リンパ腫の識別用）を含む。

いくつかの実施形態においては、標識は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンザゾール、ボラポリアザインダセン、キサンテン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される蛍光体等の、蛍光体である。多重分析の本方法においては、蛍光体は、互いに区別可能となるように、すなわち独立して検出可能となるように選ばれてもよく、このことは、標識が混合された場合であっても、標識が独立して検出及び測定されうることを意味する。換言すれば、標識が（例えば同じチューブ内に又は試料の同じ領域内に）併置されている場合であっても、標識の各々について存在する標識の量（例えば蛍光の量）が、別個に決定可能である。

蛍光性の標識の例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）、６－カルボキシフルオレセイン（一般にＦＡＭ及びＦの略称により知られている）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ：hexachlorofluorescein）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ又はＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ又はＲ）、５－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ^５又はＧ^５）、６－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ^６又はＧ^６）及びローダミン１１０；例えばＣｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７色素のようなシアニン色素；例えばウンベリフェロンのようなクマリン；例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８のようなベンズイミド色素；例えばテキサスレッドのようなフェナンスリジン色素；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素；ＢＯＤＩＰＹ色素、並びにキノリン色素を含む。

蛍光標識を用いた試料の染色は、蛍光顕微鏡及び各蛍光標識のための適切なフィルタを用いて、又は複数の蛍光体を観察するためにデュアル又はトリプルバンドパスフィルタのセットを使用することによって、見ることができる。

いくつかの実施形態においては、本方法は、例えば、従来のカバースリップ法よりも小さい組織の歪み及び時間の節約を伴った、組織切片中の免疫細胞及び腫瘍細胞の、より正確な空間的位置特定を可能にしうる。本方法は、全スライド撮像（whole slide imaging）又は他の分析に先立つ組織のカバースリップの必要性を排除する。この多重ＩＨＣのためのワークフローにおけるカバースリップのための現在のプロセスは過酷なものであり、組織の歪みをもたらす。組織の歪みは、アルゴリズムを教示するために全スライド画像間で細胞の位置を「マッピング」する、アルゴリズム開発プロセスを妨げる。この方法は、アルゴリズムの精度の改善をもたらすはずである。

いくつかの実施形態においては、多重ＩＨＣ検出の本方法は、腫瘍関連タンパク質の発現について、より正確なスコアを導出するために、免疫細胞（マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びその他）を腫瘍細胞から区別するために使用される。例えば、ＰＤ－Ｌ１ ２２ｃ３ ｐｈａｒｍＤｘは、腫瘍細胞及びまた免疫細胞を染色するＰＤ－Ｌ１に対する抗体を使用する。スコアリングの目的のため、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現が重要であり、免疫細胞の染色は省略される必要がある。現在、スコアリング方法は、Ｈ＆Ｅ染色切片及びＰＤ－Ｌ１染色切片に依存しており、それらについて、病理医は２つの異なる組織切片に基づいて検討し、免疫細胞をスコアリングから除外するよう試みる必要がある。第２の染色試薬を用いた同じ組織切片における腫瘍細胞に結合した標識とは異なる、第１の染色試薬を用いて免疫細胞を標識する能力は、別個のＨ＆Ｅ染色切片を使用するよりも簡単にこれらの細胞を区別することを可能とすることとなる。第１の染色試薬の後に、さらに第２の染色試薬の後に再び、切片を走査する能力は、腫瘍細胞の中の免疫細胞の、より正確な位置の決定を可能とする。組織切片が、第１の染色試薬の後にカバースリップされて走査される場合、カバースリップ及び封入剤の除去を必要とする後続のステップは、第２の染色試薬が適用された後の視覚化についての組織切片の歪みをもたらす。カバースリップするステップは、組織切片にとって非常に過酷なものである。これに加えて、カバースリップを除去することは、封入剤を浸漬して剥がすことを必要とし、このことはプロセスに約１０分～１時間を追加する。

別の態様として、本技術は、分析のために試料を調製する方法を提供する。本方法は、スライド（又は他の固体基板）上の試料（組織切片等）を封入剤に接触させることと、封入剤を試料上に広げるのに十分な時間の間、封入剤に電場を印加することと、スライド上の試料をカバースリップ又は流動性被覆媒体で被覆することとを含む。本技術は、封入剤の塗布に先立って組織を湿潤させるために使用される溶媒を均一に広げることを可能とし、それによりアーティファクトの発生率を低減させる。電場の印加はまた、カバースリップに対して均一な圧力をかけることとなり、このことは、より正確なカバースリップの設置を可能とする。

いくつかの実施形態においては、封入剤は、カバースリップの領域にわたって液滴を離隔させること等によって、試料との接触に先立って複数の液滴でカバースリップに塗布される。いくつかの実施形態においては、封入剤がカバースリップに塗布され、次いでカバースリップが試料上に置かれ、次いで電場が印加される。本方法はまた、封入剤が硬化している間、静電気力がカバースリップを適所に保持するように、被覆された試料に電場を印加することを含んでもよい。電場は、カバースリップと試料との間のいずれの気泡をも除去するのに十分な時間の間、印加されてもよい。

本方法の利点は、カバースリップのために使用される封入剤の量を最小化すること、粘着する接着剤の残留を防止すること、及びＣｌｅａｒｉｆｙ等の湿潤溶媒を均一に広げることによって気泡の存在を排除することを含む。このことは、組織にわたる封入剤の均一な硬化、及びカバースリップのより正確な設置を提供し、それによりずれを回避する。組織の外観及び形態を改善するプロセスは、病理医の評価に有益であり、組織切片は、長年にわたって評価可能であり続ける必要がある。本方法は、接着剤の残り及びずれたカバースリップが望ましくない、顕微鏡及びスキャナ等の器具を使用する後続のプロセスのための、スライドの取り扱いの容易さのためにも有益である。

いくつかの実施形態においては、本方法は、Ｃｌｅａｒｉｆｙ等の溶媒を移動させるように電場を印加し、それゆえ、封入剤及びカバースリップの適用に先立って、組織上に溶媒の薄層の均一な広がりをもたらす。電極によって発生した静電場はまた、カバースリップの表面に圧力を加えて、スライドへのカバースリップの接着を可能にし、設置後にカバースリップが動くことを防止することができる。

いくつかの実施形態においては、本方法は、組織切片又は他の試料上に溶媒を均一に広げて、該組織切片又は他の試料への均一な浸透を可能とする。次いで、小分量（３０μＬ）の封入剤が、カバースリップに又はスライド及び組織切片に直接に塗布され、次いで、ガラスのカバースリップが、スライド及び封入剤の上に置かれることができる。次いで、封入剤が硬化しているときに該カバースリップを適所に保持するために、カバースリップの表面に静的な力を加えるために電極が使用されてもよい。

図１３は、高電位にある電極がどのように負イオンを発生させることができるかの例示的な実施形態を示している。これらのイオンは、溶媒の表面上に集まることとなる。表面帯電した溶媒は次いで、ピンから生成される電場によってはじかれ、均一な広がりを可能とする。染色された組織を有するスライドガラスのカバースリップに、少量の封入剤が塗布されてもよい。次いで、ピンにより発生する静電気が、カバースリップの表面に力を加えて、正確な位置へのカバースリップの適用を支援することができる。

いくつかの実施形態においては、本技術は、カバースリップの適用に先立って、又はカバースリップの代わりに、Ｈ＆Ｅ、ＩＨＣ又はＩＳＨ染色された組織切片の表面上に、パラフィン又は他の被覆媒体の薄いコーティングを均一に広げることを目的とするものである。この薄膜は、乾燥及び酸化から組織を保護するものである。このプロセスは、染色プロセスからの全ての溶媒が完全に除去されていることを確認することによって開始される。このことは、染色された組織の上に溶融パラフィンを塗布することにより行われるが、このことは、溶融パラフィンの直接的なパイプ供給、又はパラフィンが注入されたワックスシートを介するもの等、様々な方法で行われうる。染色されたスライドは次いで、全ての溶媒が蒸発するまで加熱され、いくつかの場合においては、溶媒は、エタノール、キシレン、又はＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ（商標）であってもよい。パラフィンは、染色プロセスにおいて使用される溶媒よりも高い沸点を有するため、パラフィンは蒸発しない。溶媒が蒸発しても、試料はパラフィンの層の下に残り、染色された組織が酸素に曝露されることを防ぐ。全ての溶媒が蒸発すると、電場が組織切片からパラフィンを除去するのと同様に、電場を印加することによってスライドが処理される。標準的なプロトコルは、６５℃の加熱板にスライドを置き、－２０ｋＶの電位に帯電したピンを、スライド表面上に３回通過（pass）させることである。このプロセスは、パラフィンの薄層を、組織の上部に及び組織内で包埋された状態で残す。

被覆媒体の薄層を適用した後は、スライドは安定したものとなり、任意のカバースリップ技術を使用してカバースリップされうる。いくつかの実施形態においては、本方法は、封入剤以外の追加的な溶媒の適用を排除する。図１２は、パラフィンを用いて安定化した後の、染色された組織の安定性の例を示す。

染色された組織切片の表面上にパラフィンの薄いコーティングを均一に広げるための電場の使用に対する代替は、加熱されたエアナイフを使用してパラフィンを広げることである。

別の態様としては、本技術は、分析のための試料を調製する方法であって、スライド上の染色された試料を、パラフィン等の流動性被覆媒体と接触させることと、実質的に全ての染色された試料上に、流動性被覆媒体を広げることと、流動性被覆媒体を固化して、試料上に被覆されたコーティングを形成することとを含む方法を提供する。本方法は、免疫組織化学染色試薬、標識核酸プローブ、又はヘマトキシリン及び／又はエオジンのうちの１つ以上を用いて染色された組織を含む染色された試料に、特に適している。本技術は、カバースリップに先立って又はカバースリップのない状態で、パラフィン又は他の流動性被覆媒体の薄いコーティングの、組織切片上における均一な広がりを可能として、それによって、時間経過に伴う組織の乾燥及びヘマトキシリンの酸化を低減させることとなる。この薄膜は、カバースリップの下で可視ではないが、組織への酸素の拡散を制限するのに十分な障壁を提供する。

いくつかの実施形態においては、本方法は、電場を印加して流動性被覆媒体を広げるステップと、染色された試料上に溶融パラフィン又は他の流動性被覆媒体を分注（dispense）するステップと、パラフィンが注入されたシート又は被覆媒体が注入されたシートを染色された試料上に置くステップであって、その流動性被覆媒体はそのパラフィンを含むものである置くステップと、及び／又は、溶融パラフィン又は被覆媒体を含む槽の中にその染色された試料を浸漬するステップとのうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、流動性被覆媒体が酸素への試料の曝露を防止している間に、被覆された試料を加熱して試料から溶媒を除去することを含む。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、被覆された試料にカバースリップを接着させることを含む。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、スライドに接着させられたカバースリップなしに、被覆された試料を保存することを含む。いくつかの実施形態においては、試料は、染色又は信号の著しい損失なしに、少なくとも１ヶ月、又は少なくとも３ヶ月、又は少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年、又は少なくとも５年、又は少なくとも１０年、１２年、１５年、２０年、２４年若しくは３０年の間、保存される。

本方法のいくつかの実施形態の利点は、電場を印加することによってパラフィン又は他の流動性被覆媒体の薄膜を組織上に均一に置くことにより、組織の酸素曝露の量を低減させる又は排除することを含む。いくつかの実施形態においては、本方法は、組織の外観及び形態を改善し、組織切片を長年にわたって安定かつ評価可能なものにする。本方法のいくつかの実施形態は、薄いコーティングが目に見えないため、顕微鏡及びスキャナ等の器具を使用する後続のプロセスのためのスライドの取り扱いが容易となるため、有益である。

本技術は、カバースリップの適用に先立ち、又はカバースリップの代わりとして、Ｈ＆Ｅ、ＩＨＣ又はＩＳＨ染色された組織切片の表面上に、パラフィン又は他の流動性被覆媒体の薄いコーティングを均一に広げることができる。この薄膜は、組織を乾燥及び酸化から保護するものである。いくつかの実施形態においては、本方法はまた、染色プロセスの間に添加された実質的に全ての溶媒を、試料から除去することを含む。

いくつかの実施形態においては、溶融パラフィン又は溶融被覆媒体が、染色された組織の上に置かれる。このことは、溶融パラフィンの直接的なパイプ供給、又はパラフィンが注入されたワックスシートを介するもの等、様々な方法で行われうる。スライド上の染色された試料は次いで、全ての溶媒が蒸発するまで加熱される。いくつかの場合においては、溶媒は、エタノール、キシレン、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（商標）であってもよい。パラフィンは、染色プロセスにおいて使用されるいずれの溶媒よりも高い沸点を有するので、パラフィンは蒸発しない。溶媒が蒸発しても、パラフィンの層の下にあるため、染色された組織が酸素に曝露されることを防ぐ。全ての溶媒が蒸発すると、電場を印加することによって試料が処理される。いくつかの実施形態においては、６５℃の加熱板上にスライドが置かれ、－２０ｋＶの電位に帯電した電極が試料又はスライドの表面上を３回以上通過させられる。このプロセスは、パラフィンの薄層を、組織の上部に残し、及び組織内で包埋された状態で残す。

更に別の態様として、試料を染色し、流動性被覆媒体を塗布するための機器が提供される。染色器具は、加熱されたパラフィンタンクとすることができ、スライドが浸漬される最終タンクとすることができる。スライドは、組織から実質的に全ての溶媒を蒸発させるのに十分な時間の間、タンク中に浸漬される。次いで、スライドがタンクから取り出されるときに、電場を印加する電極がタンクの上に置かれ、組織及びスライドに依然として結合されているパラフィンを除去し、残りの量のパラフィンだけを残すことができる。この時点において、スライドはパラフィンで安定化されたものとなり、カバースリップされていてもよいし、又はカバースリップのないままとされてもよい。

以上から、分析のために組織を調製するための本方法及び機器が、多くの利点を提供しうることが明らかである。本開示の背景のセクションにおいて上述したように、パラフィン包埋組織が薄いスライスに薄片化された後、その結果の組織切片は従来、分析のためにそれらを調製するための多くのプロセスを施される。それに比べて、本組織調製装置１００及び方法のいくつかの実施形態は、より迅速に、かつ改善させられた品質で、試料を調製するのに有効である。

さらに、いくつかの実施形態においては、本開示の電場ベースの方法は、予想外にも、単に標準的なヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色に適合するだけではなく、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための抗原賦活化及び染色にも適合することが見出された。

本明細書に説明される組織の調製は便利にも、周囲条件下で実施されうる。周囲の空気が、プラズマ形成ガス混合物として利用されてもよい。すなわち、利用されるプラズマは、空気プラズマであってもよい。他の実施形態においては、プラズマ形成プロセスは、第１の電極の近傍におけるイオン化（プラズマ形成）領域に、１つ以上の特定のプラズマ形成ガスの流れを提供することによって、強化されてもよい。特定のプラズマ形成ガスの例は、限定するものではないが、二原子酸素（Ｏ_２）、二原子窒素（Ｎ_２）、アルゴン（Ａｒ）等の希ガス等を含む。特定のプラズマ形成ガスは、印加された電場によってガスが励起されうるイオン化領域にガスを導くように構成されたノズルによって、提供されてもよい。代替としては、装置１００及び組織１０８は、（周囲に対して）制御された環境を提供するエンクロージャ内に位置決めされてもよく、プラズマ形成ガスが、エンクロージャ内に流入されてもよい。イオン化領域における空気の組成を変更するための特定のプラズマ形成ガス（複数の場合もある）の使用、空気の代わりのかかるガス（複数の場合もある）の使用は、プラズマが発生し及び維持される条件（例えば電圧パラメータ）を調整するため、イオン化される必要のない組織１０８の他の成分よりもパラフィンが優先的にイオン化されることを確実にするため等に、望ましいものとなりうる。

これまで、イオン化の機構又は技術が、主にコロナ放電型プラズマの文脈で説明されてきた。しかしながら、そのより広い態様においてここで開示されている主題は、イオン化のいかなる特定の機構にも限定されるものではない。より一般的に、パラフィン除去のプロセスに適したいずれのタイプのイオン化も利用されうる。典型的には、大気圧イオン化（ＡＰＩ：atmospheric-pressure ionization）技術は、排気された環境における動作を必要としないので、立案される。ＡＰＩ技術の例は、限定するものではないが、大気圧プラズマベースのイオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ：atmospheric-pressure chemical ionization）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ：atmospheric-pressure photoionization）（例えばレーザー、紫外線ランプ等を使用する）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ：inductively coupled plasma）イオン化、マイクロ波誘導プラズマ（ＭＩＰ：microwave induced plasma）イオン化、誘電体障壁放電（ＤＢＤ：dielectric barrier discharge）プラズマイオン化等を含む。代替としては、装置１００及び組織１０８が、適切に構成された真空チャンバ内に位置決めされる場合、真空状態でのイオン化が実施されてもよい。真空中で実行されるイオン化技術の例は、限定するものではないが、グロー放電（ＧＤ：glow discharge）イオン化、熱イオン放射のためのフィラメントを使用する電子イオン化（ＥＩ：electron ionization）、及び熱イオン放射のためのフィラメントを使用する化学イオン化（ＣＩ：chemical ionization）を含む。

図３は、別の実施形態による組織調製装置３００の概略図である。以上に説明され図１及び図２に示された実施形態と同様に、装置３００は、電場発生装置３１６と、支持された組織構成３０４（例えば顕微鏡スライド３１２上のパラフィン含浸組織３０８）がその上に支持された加熱装置３２０とを含む。本実施形態においては、電場発生装置３１６は、複数の可動の第１の電極３２４を含む。第１の電極３２４は、１次元又は２次元のアレイ状に配置されてもよい。第１の電極３２４は、一定の距離（すなわちピッチ）だけ互いから離隔されてもよい。第１の電極３２４は、第１の電極３２４の互いに対する位置及び間隔を決定する、適切に構成された電極支持体３７６に（取り外し可能に）装着されてもよい。いくつかの実施形態においては、電極支持体３７６は、第１の電極３２４と電圧源（電源）３３２との間に必要とされる電気配線３８０の量を最小にするために、導電性のものであってもよい。電場発生装置３１６は、組織３０８上の第１の電極３２４の手動の又は自動化された移動を容易化にするために、必要に応じて電極支持体３７６及び／又は第１の電極３２４（つまり、電極支持体３７６又は第１の電極３２４あるいはそれらの両方）に取り付けられるか、又は他の方法で機械的に参照される、電気絶縁性及び／又は断熱性（つまり、電気絶縁性又は断熱性あるいはそれらの両方の）構造（図示せず）を更に含んでもよい。例えば、電気絶縁性及び／又は断熱性構造は、ユーザが把持可能なハンドル又は電動ステージ若しくはロボットへの結合のために構成された固定具の形で備えられてもよい。また、図示された例においては、電圧源３３２は、電圧、又はＡＣ電圧源の場合には電圧及び周波数の両方を調節するための、ユーザにより操作される制御つまみを含む、制御コンソールに備えられる。

複数の第１の電極３２４は、電場発生装置３１６によって発生するプラズマ３６０の活性領域の全体的なサイズ又は到達範囲を増大させるのに有用でありうる。この場合においては、プラズマ３６０は、広いカーテンとして形成されてもよい。装置３００は、他の点においては、一般的に、以上に説明され図１及び図２に示された装置１００と同様に構成され操作されてもよい。

対向電極又は接地電極として利用される１つ以上の第２の電極（特に図示せず）は、加熱装置３２０上に配置されるか若しくは加熱装置３２０と一体化されるか、又はそうでなければ組織３０８に近接して位置決めされてもよい。

図３に更に示されるように、装置３００（又は本明細書に開示される組織調製装置の他の実施形態のうちのいずれか）は、組織３０８にパラフィンを塗布するために利用されるパラフィン塗布装置３０６を含んでもよい。パラフィン塗布装置３０６は、カバースリップに対する支援として又はカバースリップの代わりに、パラフィン又は他の流動性被覆媒体を塗布するために使用されうる。パラフィン塗布装置３０６は、（主）加熱装置３２０の加熱面に対して移動可能であってもよいし、又はその位置が調節可能であってもよい。いくつかの実施形態においては、パラフィン塗布装置３０６は、熱伝導性材料で構成されてもよく、動作時には、流動性媒体を提供することを補助するために加熱されてもよい。

図４は、別の実施形態による組織調製装置４００の概略図である。本明細書に記載された他の実施形態と同様に、装置４００は、電場発生装置３１６と、支持された組織構成４０４が近くに位置決めされる加熱装置４２０とを含む。例として、以上に説明された複数の第１の電極３２４を有する電場発生装置３１６も本実施形態において備えられているが、本明細書に説明された他の電場発生装置のいずれも組織調製装置４００に含まれてもよい。本実施形態においては、パラフィン含浸組織４０８は、多孔質フリット４１２の形をとって固体基板上に支持されており、該フリットは、組織除去の間に加えられる熱に耐えることが可能なガラス又は他の材料で作られてもよい。フリット４１２は、液体容器４８４（例えばカラム、バイアル、試験管、ベッセル、フラスコ、マイクロタイタープレートのウェル等）内において、容器４８４の開放頂部又はその近傍等に、取り外し可能に装着されてもよい。容器４８４は、容器支持体４９２（例えば１つ以上の開口を有する支持板）の開口４８８に取り外し可能に取り付けられてもよい。容器支持体４９２は、それぞれの容器４８４、並びに対応する組織４０８及びフリット４１２を支持するための、開口４８８のアレイを含んでもよい。

本実施形態においては、加熱装置４２０の全体又は一部は、容器支持体４９２と一体化されてもよい。例えば、加熱装置４２０は、組織４０８と熱的に接触するように組織試料４０４に十分に近接して容器支持体４９２の上又は中に位置決めされた、複数の円周方向に離隔された（容器支持体４９２の長軸に対して）加熱要素を含んでもよい。本文脈において、「熱的に接触する」という用語は、一般的に、加熱要素がアクティブにされたときに、例えば１分以内又は数分以内のような短い時間内で、或る量の熱を組織４０８に伝達するのに有効な熱勾配を確立するように、加熱要素が組織４０８と十分近くに位置決めされることを意味すると解釈されうる。

対向電極又は接地電極として利用される１つ以上の第２の電極（特に図示せず）は、加熱装置４２０上に配置されるか若しくは加熱装置４２０と一体化されるか、又は他の方法で組織４０８に近接して位置決めされてもよい。

本実施形態においては、溶媒又はパラフィンは、フリット４１２の穴又は細孔を通って排出され、容器４８４中で収集されてもよい。いくつかの実施形態においては、容器４８４は、溶媒又はパラフィンが容器４８４から排出されることを可能にするために、その基部に開口４９６を含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、試料は、液体容器（例えばカラム、バイアル、試験管、ベッセル、フラスコ、マイクロタイタープレートのウェル等）の表面上に直接に配置されてもよく、この場合には、液体容器は、試料のための固体支持体として機能する。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態においては、試料（及び、提供される場合には、その下にある基板）は、水平又は垂直に配向されているように描かれ又は説明されている。しかしながら、試料（及び、提供される場合には、その下にある基板）は、（特定の配向が特に明記されていない限り）代わりに垂直若しくは水平に配向されてもよく、又は水平の及び垂直な基準面の間の任意の角度（水平の基準面に対して０度～９０度の範囲内）で配向されてもよい。例として、試料を水平に対して或る角度で配向させることは、重力の補助による水の除去を強化しうる。

本開示によって包含される試料調製装置の様々な他の実施形態は、以上に説明された種々の実施形態からの特徴の組み合わせを含んでもよい。本開示によって包含される方法の様々な実施形態は、以上に説明された種々の実施形態からの特徴の組み合わせを含んでもよい。

［実施例］
［実施例１］
この実施例は、電場を使用した、試料（より詳細には組織切片）と固体基板（より詳細にはスライド）との間に閉じ込められた水の除去を例示するものである。第１の電極（より詳細にはピン）が－２０ｋＶで帯電させられ、それによってコロナ放電を発生させた。ピンが、組織切片に十分に近づけられて、それにより電場が印加され、閉じ込められた水を下方に移動させた。図５に示されるように、組織とスライドとの間から水が引かれると、ピンの下に水がたまりはじめた。水が引かれる傾向がある位置は、接地点へのアークがどこにあるかに依存する。

ピンに溜まった水が十分に大きくなると、重力が液滴を落下させ、乾燥時間を早めることとなる。必ずしも液滴が落下する必要はないが、このことは乾燥性能を改善する。水が排出される経路は、接地点へのアークがどこにあるかに依存する。例えば、図５においては、組織の上部及び下部の両方において、アーク点がスライドの左側にあり、このことが、右上に閉じ込められた水を効率よく排出することを妨げた。したがって、いくつかの実施形態においては、アークは、水の除去を向上させるように調節される。

初期試験は、この電場乾燥法への３分間の曝露を含むものであった。乾燥が完了した後、パラフィンを溶融させるためにブロック上の温度が上昇させられたが、切片を脱パラフィン化して組織を接着させるために電場が使用されてもよい。代替的に、標準的なプロセスを使用して、切片が脱パラフィン化されてもよい。この脱パラフィン化プロセスにより、乾燥効率の定性的な結果の観察が可能になった。５回の試験のうち、１回だけが、スライド上に残留水を残した。その組織は、接地へのアーク経路が存在しない領域において、残留水を有していた。

電場を印加するための別の構成は、組織の右側にピンを有し、左側に接地点へのアークを有する。ピンは組織の上部において始まり、スライドを下るように延びる。このことは、組織をその上部から始めて下方へと乾燥させ、より一貫した方法で組織の全領域が乾燥したものとなることを確実にする。他の接地及びピンの構成は、両方の電極をピンとするものを含み、この構成は或る程度は機能するが、接地板とピンとの組み合わせほどには好適には機能しない。

［実施例２］
この実施例においては、乳癌の組織切片におけるビメンチン（vimentin）を染色するためのＩＨＣプロトコルの文脈において、抗原回復のための電場の使用が検討された。ビメンチンは、間葉細胞において発現するフィラメントタンパク質である。

組織切片は、ＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓ自動染色プラットフォームを使用して染色された。このプラットフォームは、ＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ高ｐＨ緩衝液）を使用して、個々の組織切片に対してＨＩＥＲを実行することが可能である。この例においては、実験用組織切片について、ＤＡＫＯ ＯｍｎｉｓプラットフォームのＨＩＥＲステップが、ＩＨＣプロトコルから省略された。その代わりに、実験用組織切片について、負に帯電したピンが組織切片の表面上を常に移動する状態で、電場が１１０℃で３０分間印加された。

この実験の結果が、図６に示されている。ＩＨＣが、ＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓ自動染色プラットフォームを使用して、ＨＩＥＲを用いて（Ａ）、又はＨＩＥＲの代わりに１１０℃で３０分間電場を印加して（Ｃ）、実行された。陽性対照（positive control）組織及び電場で処置される組織切片の間質細胞で、ビメンチンの発現（茶色のＤＡＢ染色）が見られる。陰性対照（negative control）（Ｂ）は、わずかなビメンチンの発現しか示さないか、又はビメンチンの発現を示さない。図６は、１００倍の拡大図である。実験用組織切片においては、ＩＨＣプロトコルの結果として、ビメンチンの正の発現が可視である。このことは、電場を印加することによって、抗原回復緩衝液に試料を接触させることなく、抗原回復が首尾良く実行されうることを実証している。

［実施例３］
この実施例においては、抗原回復のためのイオン性塩を用いた電場の使用が検討された。熱誘導されたエピトープ賦活化（epitope retrieval）に対する、イオン性塩が添加された電場処置（電場）の効果を評価するために、ビメンチンＩＨＣプロトコルが使用された。Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ高ｐＨ緩衝液であるＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して個々の組織切片に対してＨＩＥＲを実行するＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓ自動染色プラットフォームを使用して染色することにより、組織切片が比較された。実験用組織切片については、標準的なＩＨＣプロトコルからＨＩＥＲステップが省略された。その代わりに、負に帯電したピンが表面上を常に移動する状態で、電場が実験組織切片に９５℃で５分間印加された。

電場処置及びイオン性塩パラフィン溶液又は標準緩衝液ベースのＨＩＥＲ法を使用した、ビメンチンに対する大腸癌の免疫染色。ＩＨＣが、ＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓ自動染色プラットフォームを使用して、ＨＩＥＲを用いて９７℃で３０分間（Ａ）、又はＨＩＥＲの代わりに電場処置を９５℃で５分間使用して（Ｂ）、実行された。パラフィン油に溶解した１０ｍＭのイオン性塩製剤が、９５℃で５分間電場処置され（Ｃ～Ｈ）、９５℃で５分間の単独の電場処置（Ｂ）と比較した。この実験において使用されたイオン性塩は、（Ｃ）塩化イミダゾリニウム（Ｃ_５Ｈ_１０Ｃｌ_２Ｎ_２）、（Ｄ）テトラフルオロホウ酸リチウム（ＬｉＢＦ_４）、（Ｅ）トリフルオロ酢酸アンモニウム（ＣＦ_３ＣＯ_２ＮＨ_４）、（Ｆ）メチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_４Ｈ_６Ｎ_２ ＨＣｌ）、（Ｇ）ブチルメチルイミダゾリウムニトラート（Ｃ_８Ｈ_１５Ｎ_３Ｏ_３）、及び（Ｈ）ヘキシルメチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_１０Ｈ_１９ＣｌＮ_２）である。陽性対照組織であるイオン性塩パラフィン溶液中でコーティングされた電場処置された組織切片の間質細胞において、ビメンチンの発現（茶色のＤＡＢ染色）が見られる。イオン性塩パラフィンでコーティングされた組織（Ｃ～Ｈ）について、電場処置された対照（Ｂ）と比較して、ビメンチンの発現レベルが上昇した。

図７は、１００倍に拡大した染色した試料を示す。大腸癌の実験組織切片は、ＩＨＣによりビメンチンの正の発現を示す。電場処置を用いた流動パラフィン溶液へのイオン性塩の添加は、単独の電場処置と比較して、増大したビメンチンの染色強度をもたらした。

この実施例においては、抗原賦活化のためのパラメータ、すなわち熱、イオン性塩、及び電場処置が、更に試験された。（ＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓプラットフォームにより使用される標準的な抗原賦活化で行われるような）高熱（１１０℃）への２時間の曝露が、高熱で２時間の電場処置と比較された。電場処置は、単独の高熱と比較して、より高いレベルの抗原賦活化を示した。また、１：１のイオン性塩／流動パラフィン溶液の組織への添加と、単独の高熱又は３０分間の電場処置を用いた場合との比較も行われた。図８は、イオン性塩の添加の有無にかかわらず、高熱処置された組織においては、非常にわずかな抗原賦活化しか見られなかったことを示す。抗原賦活化は、高熱及び３０分の処置の間の電場を加えることにより調製された組織切片について、最も高くなった。このことは、イオン性塩及び電場処置には、抗原賦活化のための付加的な利益があることを示唆している。イオン性塩と流動パラフィンとの混合物の３０分間の使用は、電場処置を２時間適用することよりも有効であり、イオン性塩が、単独の電場と比較して、抗原賦活化のために必要とされる時間を短縮したことを示している。

１０倍の対物レンズを使用して撮像された図８に結果が示されている（元の倍率、１００倍）。標準的な緩衝液ベースのＨＩＥＲを使用したビメンチンに対する腎臓組織の免疫染色が、熱、時間、及び電場処置を用いた１：１のイオン性塩：流動パラフィン混合物の添加のバリエーションと比較された。ＩＨＣが、ＤＡＫＯ Ｏｍｎｉｓ自動染色プラットフォームを使用して、ＨＩＥＲを用いて９７℃で３０分間（パネルＡ）、若しくはオーブンを使用して１１０℃で２時間（パネルＢ）、１１０℃で２時間の電場処置で（パネルＣ）、３５分間のオーブンにおけるイオン性塩／流動パラフィン混合物で（パネルＤ）、又はイオン性塩／流動パラフィンを用いた１１０℃で３０分間の電場処置で（パネルＥ）、実行された。イオン性塩１－エチル－３－ヘキシルメチルイミダゾリウムアセタート（Ｃ_８Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２）が、流動パラフィン油と１：１の割合で混合された。陽性対照及び処置された組織の糸球体において、ビメンチンの発現（茶色のＤＡＢ染色）が見られる。１１０℃で３０分間のイオン性塩：流動パラフィン混合物の電場処置で、ビメンチンの発現のレベルが最も増大した。図８。

［実施例４］
この実施例においては、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための試料の調製における電場の印加の効果が評価された。この実施例は、電場を用いて処置された試料を、ペプシンを用いたタンパク質分解消化により処置された試料と比較するものである。３回のキシレンの５分間の洗浄を使用して又は電場を印加することにより脱パラフィン化された乳房組織の切片に対して、調製が行われた。組織切片は、標準的なＦＩＳＨプロトコルＨＥＲ２及びＮＥＡＴ１ ＲＮＡ ＦＲＩＧＧ ＦＩＳＨ検定に従ってハイブリダイゼーションされた。ＨＥＲ２増幅は乳癌で頻繁に見られ、ハーセプチン（Herceptin）を用いた治療のための有用なバイオマーカとなりうる。ＮＥＡＴ１は核内ＲＮＡであり、パラスペックル（paraspeckle）と呼ばれる不連続な病巣に局在する。標準的なＦＩＳＨプロトコルは、５分間のペプシン消化を含むものであったが、実験試料（電場が印加されたもの）については、このペプシン消化ステップは省略された。

ＦＩＳＨ検定の結果が図９に示され、これは６０倍の対物レンズを使用して撮像されたものである（元の倍率、６００倍）。ＨＥＲ２ ＦＲＩＧＧ ＦＩＳＨが、ペプシン処置を用いて（パネルＡ及びＢ）又はペプシン処置を用いずに（パネルＣ及びＤ）、組織において実行された。ＮＥＡＴ １ ＦＲＩＧＧ ＦＩＳＨは、キシレンで脱パラフィン化された組織試料（パネルＡ、Ｅ、Ｃ及びＧ）又は電場処置された組織試料（パネルＢ、Ｆ、Ｄ及びＨ）に対して、ペプシン処置を用いて（パネルＥ及びＦ）、及びペプシン処置を用いずに（パネルＧ及びＨ）、組織において実行された。パネルＢ及びＦにおいては、試料内の細胞核（ＤＡＰＩ標識；青色）が、望ましくない核アーティファクト又はゴースト細胞を示しており、これは電場及びペプシン処置の両方を使用したことによる消化過多によるものである。ＨＥＲ２（ＦＩＴＣ；緑色）は、キシレンで脱パラフィン化され、ペプシン処置された対照試料（パネルＡ）、及びペプシンなしで電場処置された組織（パネルＤ）において同等に見えた。ＮＥＡＴ１（ＦＩＴＣ；緑色）信号は、キシレンで脱パラフィン化されたペプシン処置された対照（パネルＥ）におけるよりも、ペプシン処置なしで電場処置された組織（パネルＨ）において、より明るくバックグラウンドも少ない（良好な信号対雑音比）ものであった。

ペプシン処置と電場処置との組み合わせで、望ましくない核アーティファクトが見られたが、これらのアーティファクトは実験組織（電場を用いたがペプシンなしで調製されたもの）にはなかった。ペプシン処置を含むキシレンを用いて脱パラフィン化された乳癌対照におけるＨＥＲ２ ＦＲＩＧＧ ＦＩＳＨは、ペプシン処置なしで電場処置された乳癌と同等であり、電場を用いたタンパク質分解の必要がないことを示している。電場を印加することにより調製された乳房組織におけるＮＥＡＴ１ ＦＲＩＧＧ ＦＩＳＨは、キシレンで脱パラフィン化されたペプシン処置された対照と比較して、背景雑音の少ないより明るい信号、すなわちより良好な信号対雑音比を示した。これらの結果は、ＦＩＳＨにおいては電場処置が細胞質へのプローブ浸透に十分であり、いくつかの検定についてはプローブ信号及び背景雑音を改善しうることを示している。背景雑音が排除されたより明るいプローブ信号は、信号の定量化の容易性を向上させる。本方法による核アーティファクトの排除が示され、電場使用による検定を実行するために必要とされる時間の短縮もあった。

［実施例５］
この実施例においては、電場による処置後の残留パラフィンを除去するために、Ｃｌｅａｒｉｆｙ（登録商標）の手短な洗浄を加えたＤＮＡ ＦＩＳＨ検定が実行された。

図１０は、ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７に対するＤＮＡプローブを使用した乳癌のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７ ＦＩＳＨが、ペプシン処置を用いて（パネルＡ）又はペプシン処置を用いずに（パネルＢ）、キシレンで脱パラフィン化された組織において実行された。ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７ ＦＩＳＨは、ペプシン消化なしで電場処置されＣｌｅａｒｉｆｙ（登録商標）で脱パラフィン化された組織において実行された（パネルＣ）。ペプシン消化ステップのない従来のワークフローは、パネルＢに示されるように、対照（パネルＡ）と比較して、プローブ信号がなく形態も悪い、許容可能でないＦＩＳＨの結果に帰着する。手短なＣｌｅａｒｉｆｙ（登録商標）洗浄と組み合わせられた電場処置は、対照と同等のＦＩＳＨ結果に帰着し、ペプシンの消化過多による望ましくない核アーティファクト又はゴースト細胞がなくなった。ＨＥＲ２（ＣＹ３；赤色）プローブ信号は、キシレンで脱パラフィン化されペプシン処置された対照（Ａ）と、ペプシンなしで電場で脱パラフィン化された組織（パネルＣ）とで、同等に見えた。ＣＥＮ１７（ＦＩＴＣ；緑色）信号は、ペプシン消化なしで電場処置された組織と比較して、対照において同等であった。ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７の比は、１．５５（ｎ＝３の実験組織）に対して平均１．５２（ｎ＝２の制御群）であり、同等の結果を示している。図１０は、１００倍の対物レンズを使用して撮像されたものである（元の倍率、１０００倍）。

ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７ ＦＩＳＨの結果は、対照試料と実験試料（電場を印加することにより処置されたもの）との間で、形態及びプローブ結合に関して同等であった。ＣＥＮ１７に対するＨＥＲ２の比の病理学者のスコアリングは、同等の結果に帰着した（対照についてのＨＥＲ２／ＣＥＮ１７比は１．５２であったのに対し、電場を用いて処置された実験組織については１．５５であった）。電場の印加と組み合わせられた手短なＣｌｅａｒｉｆｙ（登録商標）洗浄は、プローブ結合を促進し、核アーティファクトの存在を排除した。この例は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための試料を調製するために、Ｃｌｅａｒｉｆｙ（登録商標）又は同様の溶媒が、電場の印加と組み合わせて使用されうることを示している。

図１１は、ペプシン（パネルＡ及びＣ）又は電場（パネルＢ及びＤ）を用いて処置された乳腺癌の２つの患者試料についての、ＦＩＳＨ ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７の結果を示す。ＤＡＰＩ染色により示される核形態は、（Ａ）におけるペプシン処置された対照では良好であり、（Ｃ）におけるペプシン処置された対照については最適には及ばないものとなっている。ＨＥＲ２（赤色）及びＣＥＮ１７（緑色）のプローブ信号は、ペプシン処置された対照（Ａ）においては良好であるが、ペプシン処置された対照（Ｃ）においては、ＨＥＲ２プローブ信号が存在していない。電場処置された組織試料（Ｂ及びＤ）はいずれも、良好な核の形態を有し、より明るく豊富なＨＥＲ２及びＣＥＮ１７のプローブ信号を有する。このデータは、ＦＩＳＨについてはペプシンによる酵素消化よりも電場処置のほうが優れたものでありうることを示している。図１１の画像は、１００倍の対物レンズを使用して撮像された写真の挿入図である（元の倍率、１０００倍）。

［実施例６］
この実施例においては、流動性被覆媒体としてのパラフィンの使用が評価された。乳房組織試料が染色され、次いで０日目に試料を完全に被覆するために流動性パラフィンが使用された。パラフィンを無傷で残しつつ、組織試料から全ての液体を除去するために、熱が加えられた。余分なパラフィンを除去するために、試料を伴うスライドが、接地された加熱板上に置かれ、－２０ｋＶに帯電したピンが、試料の上を５ｍｍの距離で３回通過させられた。これらの通過が、余分なパラフィンを除去し、試料の組織上に残りの量だけを残した。３日目にスライドが６５℃のオーブンに入れられ、Ａ）５日目、Ｂ）１１日目、及びＣ）１４日目に、組織の画像が撮影された。この加熱は、加速度的な経年変化をシミュレートするものである。図１１は、パラフィンを用いた安定化の後の染色された組織を示す。

およそ３ヶ月の経年変化をシミュレートする２週間の期間中、組織に対する染色は変化しなかった。通常の環境下では、組織を湿ったままに保つための溶媒がない状態でスライドが放置された場合、組織は、暗い核によって示される乾燥の可視の兆候を有し始めることとなる。この実施例は、流動性被覆媒体が首尾良く試料を安定させ、熱による損失又は不安定性からその染色を保護したことを示している。

［実施例７］
この実施例においては、Ｈ＆Ｅ染色された組織切片が、電場の支援によりカバースリップされた。電場を使用して、溶媒（Ｃｌｅａｒｉｆｙ）が均一に広げられた。余分なＣｌｅａｒｉｆｙを除去するために、試料を伴うスライドが、室温で接地されたプレート上に置かれ、－２０ｋＶに帯電したピンが、試料の上を５ｍｍの距離で３回通過させられた。これらの通過が、余分なＣｌｅａｒｉｆｙを除去し、試料の組織上に残りの量だけを残した。図１３におけるように、３０ｕｌの封入剤がカバースリップに塗布された。カバースリップが、スライド及び組織切片の上に置かれた。次いで電場が印加されて、スライドに対するカバースリップの接着を補助した。この電場は、ピンがスライド及びカバースリップから５ｍｍの距離にある状態で生成された。ピンは－２０ｋＶに帯電させられ、封入剤がＵＶ光を使用して硬化させられる間、３分間往復させられた。

図１４は、カバースリップされた試料スライドを示す。気泡又は組織乾燥のアーティファクトは存在せず、カバースリップが歪みを起こすことなく試料に接着させられたことを示している。

［例示的な実施形態］
ここで開示されている主題により提供される例示的な実施形態は、以下を含むが、これらに限定されない。

実施形態１．
組織試料を乾燥させる方法であって、
組織試料と固体基板との間に水を有する固体基板上の組織試料に電場を印加することであって、電場は、水の少なくとも一部を第１の電極に向かって移動させるのに十分な強さで及び十分な時間の間印加される、印加すること
を含む方法。

実施形態２．
実質的に全ての水が、第１の電極に向かって移動する、実施形態１の方法。

実施形態３．
包埋された組織を含む組織試料を液体槽中に入れることと、
組織が固体基板の表面上に広がるように、包埋された組織を固体基板に接触させることと、
組織試料に電場を印加することによって、基板表面と試料との間に閉じ込められた液体を除去することと
を更に含む、実施形態１又は２の方法。

実施形態４．
固体基板は、第１のスライド表面及び第２のスライド表面を有するスライドである、実施形態１～３のいずれかの方法。

実施形態５．
閉じ込められた液体が除去されるときに、スライド表面が実質的に垂直となるようにスライドを移動させることを更に含む、実施形態１～４のいずれかの方法。

実施形態６．
電場を印加することは、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加することを含む、実施形態１～５のいずれかの方法。

実施形態７．
電場を印加することは、第１の電極の周りの領域においてコロナ放電を生成し、閉じ込められた液体をコロナ放電に曝露させるように第１の電極を位置決めすることを更に含む、実施形態６の方法。

実施形態８．
スライド表面は、組織が上端及び底端を有するように実質的に垂直であり、第１の電極は、底端の下に位置する、実施形態６又は７の方法。

実施形態９．
電場を印加しつつ第１の電極を上端から底端に移動させ、それにより、閉じ込められた液体が底端に向かって移動するようにすることを更に含む、実施形態６～８のいずれかの方法。

実施形態１０．
第１の電極を上端における位置に戻し、電場を印加しつつ底端への第１の電極の移動を繰り返すことを更に含む、実施形態９の方法。

実施形態１１．
電圧は、少なくとも５ｋＶである、実施形態６～１０のいずれかの方法。

実施形態１２．
電圧は、少なくとも１０ｋＶである、実施形態６～１０のいずれかの方法。

実施形態１３．
電圧は、少なくとも２０ｋＶである、実施形態６～１０のいずれかの方法。

実施形態１４．
第１の電極は、組織から約１ｍｍ～約７ｍｍだけ離れている、実施形態６～１３のいずれかの方法。

実施形態１５．
第１の電極は、約３ｍｍ～約５ｍｍである、実施形態６～１３のいずれかの方法。

実施形態１６．
組織は、第１のスライド表面に接触し、第１の電極は、第２のスライド表面に面して位置決めされる、実施形態６～１５のいずれかの方法。

実施形態１７．
組織は、第１のスライド表面に接触し、第２の電極は、第２のスライド表面に接触し、第２の電極は、パラフィンの融点より低い温度である、実施形態６～１６のいずれかの方法。

実施形態１８．
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための試料を調製する方法であって、本方法は、
標的ポリヌクレオチドを含む試料に電場を印加することと、
電場が印加されている間、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する１つ以上の検出可能な核酸プローブに、試料を接触させることと
を含む方法。

実施形態１９．
試料は、パラフィン包埋組織標本である、実施形態１８の方法。

実施形態２０．
試料は、全組織である、実施形態１８又は１９の方法。

実施形態２１．
試料は、全組織のスライスを含む、実施形態１８～２０のいずれかの方法。

実施形態２２．
試料は、１つ以上の細胞ペレットである、実施形態１８～２０のいずれかの方法。

実施形態２３．
試料は、１つ以上の細胞塗抹標本である、実施形態１８～２０のいずれかの方法。

実施形態２４．
試料は、１つ以上の細胞を含み、標的ポリヌクレオチドは、細胞の核内にある、実施形態１８～２３のいずれかの方法。

実施形態２５．
電場は、ＤＮＡを露出させるのに十分な強さで及び十分な時間の間印加される、実施形態１８～２４のいずれかの方法。

実施形態２６．
電場は、５００Ｖ以下の電位で印加される、実施形態２５の方法。

実施形態２７．
試料は、核酸プローブとの接触の前に、タンパク質分解酵素と接触しない、実施形態１８～２６のいずれかの方法。

実施形態２８．
試料は、ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされた標識プローブの分析の間に、無傷のタンパク質からの自家蛍光を実質的に含まない、実施形態１８～２７のいずれかの方法。

実施形態２９．
標識プローブとの接触の前に、試料から実質的に全てのパラフィンを除去することを更に含む、実施形態１８～２８のいずれかの方法。

実施形態３０．
パラフィンは、試料に電場を印加することと、脱パラフィン化溶媒を用いて試料を洗浄することとの組み合わせによって除去される、実施形態１８～２９のいずれかの方法。

実施形態３１．
分析のための試料を調製する方法であって、試料は、１つ以上の固定されたポリペプチドを含み、本方法は、
１つ以上の固定効果の少なくとも一部を逆転させるのに有効な電場を印加すること
を含む方法。

実施形態３２．
試料は、アルデヒドで固定されたものであり、１つ以上の固定効果は、アルデヒドによる架橋又はメチレンブリッジ形成を含む、実施形態３１の方法。

実施形態３３．
試料は、組織試料であり、ポリペプチドは、１つ以上の抗原を含む、実施形態３１又は３２の方法。

実施形態３４．
組織試料は、組織切片である、実施形態３１～３３のいずれかの方法。

実施形態３５．
電場は、試料においてオゾンを発生させる、実施形態３１～３４のいずれかに記載の方法。

実施形態３６．
試料における湿度を調節することを更に含む、実施形態３１～３６のいずれかの方法。

実施形態３７．
電場を印加しつつ、１つ以上のイオン性塩に試料を接触させることを更に含む、実施形態３１～３６のいずれかの方法。

実施形態３８．
イオン性塩は、塩化イミダゾリニウム（Ｃ_５Ｈ_１０Ｃｌ_２Ｎ_２）、テトラフルオロホウ酸リチウム（ＬｉＢＦ_４）、トリフルオロ酢酸アンモニウム（ＣＦ_３ＣＯ_２ＮＨ_４）、メチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_４Ｈ_６Ｎ_２ ＨＣｌ）、ブチルメチルイミダゾリウムニトラート（Ｃ_８Ｈ_１５Ｎ_３Ｏ_３）、ヘキシルメチルイミダゾリウムクロリド（Ｃ_１０Ｈ_１９ＣｌＮ_２）、１－エチル－３－メチルイミダゾリウムアセタート（Ｃ_８Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２）及びこれらの混合物からなる群から選択される、実施形態３７の方法。

実施形態３９．
試料は、パラフィン及び疎水性包埋媒体からなる群から選択される媒体に包埋され、本方法は、電場を印加することにより媒体を溶融させることを更に含む、実施形態３１～３８のいずれかの方法。

実施形態４０．
媒体は、１１０℃よりも高い沸点を有する、実施形態３９の方法。

実施形態４１．
媒体は、２００℃よりも高い沸点を有する、実施形態３９の方法。

実施形態４２．
２００℃よりも低い融点及び１１０℃よりも高い融点を有する疎水性媒体中の１つ以上のイオン性塩の混合物に、試料を接触させることを更に含む、実施形態３１～４１のいずれかの方法。

実施形態４３．
電場は、固定効果の少なくとも一部を逆転させるのに十分な時間の間及び十分な強さで印加される、実施形態３１～４２のいずれかの方法。

実施形態４４．
電場は、少なくとも約５分間印加される、実施形態４３の方法。

実施形態４５．
電場は、約３０分間印加される、実施形態４３の方法。

実施形態４６．
固定効果を逆転させるのに十分な温度で組織試料を加熱することを更に含む、実施形態３１～４５のいずれかの方法。

実施形態４７．
組織試料は、少なくとも約９０℃の温度にまで加熱される、実施形態４６の方法。

実施形態４８．
組織試料は、少なくとも約１１０℃の温度にまで加熱される、実施形態４６の方法。

実施形態４９．
試料中の抗原は、組織試料に緩衝剤を適用することなく賦活化される、実施形態３１～４８のいずれかの方法。

実施形態５０．
組織試料に電場を印加する機器であって、本機器は、
複数の固体基板上の複数の組織試料に電場を印加するように構成された、電場発生装置であって、湾曲した形状部を含む複数の電極を含む電場発生装置と、
複数の固体基板を保持し、組織試料に熱を加えるように構成されたホルダと、
固体基板上で反復的な又は所定のパターンで複数の電極を移動させるように構成されたアクチュエータと
を含む、機器。

実施形態５１．
固体基板における湿度を調節することが可能な湿度コントローラを更に含む、実施形態５０の機器。

実施形態５２．
筐体の内部に温度センサ、湿度センサ及びオキソンセンサのうちの１つ以上を更に含む、実施形態５０又は５１の機器。

実施形態５３．
センサ（複数の場合もある）は、コントローラと通信している、実施形態５２の機器。

実施形態５４．
流動パラフィンを分注することが可能なディスペンサを更に含む、実施形態５０～５３のいずれかの機器。

実施形態５５．
１つ以上のイオン性塩、疎水性媒体、又はそれらの混合物を含むリザーバを更に含む、実施形態５４の機器。

実施形態５６．
複数の染色試薬を用いて染色することによって試料を分析する方法であって、本方法は、
第１の染色試薬を用いて試料を染色することと、
第１の染色試薬を用いて染色された試料を、流動性被覆媒体で被覆することと、
試料の第１の染色パターンを検出することと、
試料から流動性被覆媒体を除去することと、
第２の染色試薬を用いて試料を染色して、第２の染色パターンを形成することと、
試料をカバースリップ又は流動性被覆媒体で被覆することと
を含む方法。

実施形態５７．
流動性被覆媒体は、パラフィンである、実施形態５６の方法。

実施形態５８．
流動性被覆媒体は、脱パラフィン化溶媒で洗浄することによって除去される、実施形態５６又は５７の方法。

実施形態５９．
流動性被覆媒体は、電場を印加することによって除去される、実施形態５６又は５７の方法。

実施形態６０．
流動性被覆媒体は、加熱されたエアナイフを適用することによって除去される、実施形態５６又は５７の方法。

実施形態６１．
試料は、１つ以上のポリペプチドを含む組織試料であり、第１の染色試薬及び第２の染色試薬の一方又は両方は、１つ以上のポリペプチドの抗原に特異的に結合する一次抗体を含む、実施形態５６～６０のいずれかの方法。

実施形態６２．
試料は、１つ以上のポリペプチドを含む組織試料であり、第１の染色試薬及び第２の染色試薬の一方又は両方は、一次抗体と特異的に結合する二次抗体を含む、実施形態５６～６１のいずれかの方法。

実施形態６３．
第１の染色試薬を用いて染色する前に、標的賦活化を実行することを更に含み、標的賦活化は、電場を印加することによって実行される、実施形態５６～６２のいずれかの方法。

実施形態６４．
第１の染色試薬は、第１の抗原と特異的に結合する第１の一次抗体と、一次抗体と結合する第１の二次抗体と、第１の標識とを含む、実施形態５６～６３のいずれかの方法。

実施形態６５．
第２の染色試薬は、第２の抗原と特異的に結合する第２の一次抗体を含む、実施形態５６～６４のいずれかの方法。

実施形態６６．
第２の染色試薬は、第２の二次抗体と、第２の標識とを更に含む、実施形態６５の方法。

実施形態６７．
第１の染色試薬又は第２の染色試薬のうちの少なくとも一方が腫瘍細胞抗原を結合させ、第１の染色試薬又は第２の染色試薬のうちの少なくとも一方が免疫細胞抗原を結合させる、実施形態５６～６６のいずれかの方法。

実施形態６８．
染色剤を用いて免疫細胞抗原及び腫瘍細胞抗原を染色することを更に含む、実施形態６７の方法。

実施形態６９．
異なる色の沈殿した染色剤を用いて免疫細胞抗原及び腫瘍細胞抗原を染色することを更に含む、実施形態６７の方法。

実施形態７０．
第１の染色試薬を用いた染色の前に、タンパク質ブロック剤に試料を接触させることを更に含み、タンパク質ブロック剤は、非特異的タンパク質が第１の染色試薬に結合することをブロックする、実施形態５６～６９のいずれかの方法。

実施形態７１．
第１の染色試薬及び第２の染色試薬は、一次抗体、核酸プローブ又はその両方を含み、本方法は、ヘマトキシリンを用いて試料を染色することを更に含む、実施形態５６～７０のいずれかの方法。

実施形態７２．
試料を第２の一次抗体と接触させることに先立って、第１の一次抗体を変性させることを更に含む、実施形態７１の方法。

実施形態７３．
第１の一次抗体は、変性剤と接触させることによって変性させられる、実施形態７２の方法。

実施形態７４．
変性剤は、硫酸を含む、実施形態７３の方法。

実施形態７５．
変性は、第１の染色パターンの検出に先立って実行される、実施形態７３の方法。

実施形態７６．
分析のために試料を調製する方法であって、本方法は、
スライド上の試料を、封入剤と反応する溶媒に接触させることと、
溶媒を試料上に広げるのに十分な時間の間及び十分な強さで電場を印加することと、
溶媒を封入剤に接触させることと、
スライド上の試料をカバースリップ又は流動性被覆媒体で被覆することと
を含む方法。

実施形態７７．
試料は、組織切片である、実施形態７６の方法。

実施形態７８．
試料との接触に先立って、複数の液滴でカバースリップに封入剤を塗布することを更に含む、実施形態７６又は７７の方法。

実施形態７９．
液滴は、カバースリップの領域上で離隔される、実施形態７８の方法。

実施形態８０．
封入剤がカバースリップに塗布され、次いでカバースリップが試料上に置かれる、実施形態７６～７９のいずれかの方法。

実施形態８１．
封入剤が硬化している間、静的な力がカバースリップを適所に保持するように、被覆された試料に電場を印加することを更に含む、実施形態７６～８０のいずれかの方法。

実施形態８２．
電場は、カバースリップと試料との間のいずれの気泡をも除去するのに十分な時間の間及び十分な強さで印加される、実施形態７６～８１のいずれかの方法。

実施形態８３．
分析のための試料を調製する方法であって、
スライド上の染色された試料を、流動性被覆媒体に接触させることと、
実質的に全ての染色された試料上に流動性被覆媒体を広げるのに十分な時間の間及び十分な強さで、染色された試料に電場を印加することと、
流動性被覆媒体を固化して、試料上に被覆されたコーティングを形成することと
を含む方法。

実施形態８４．
流動性被覆媒体は、パラフィンである、実施形態８３の方法。

実施形態８５．
染色された試料は、免疫組織化学染色試薬、標識核酸プローブ、又はヘマトキシリン及び／又はエオジンのうちの１つ以上を用いて染色された組織を含む、実施形態８３又は８４の方法。

実施形態８６．
染色された試料上に、流動性被覆媒体として溶融パラフィンを分注することを含む、実施形態８３～８５のいずれかの方法。

実施形態８７．
パラフィンが注入されたシートを染色された試料上に置くことを含み、流動可能な被覆媒体は、パラフィンを含む、実施形態８３～８６のいずれかの方法。

実施形態８８．
染色された試料を、溶融パラフィンを含む槽の中に浸漬することを含む、実施形態８３～８７のいずれかの方法。

実施形態８９．
流動性被覆媒体が酸素への試料の曝露を防止している間に、被覆された試料を加熱して試料から溶媒を除去することを更に含む、実施形態８３～８８のいずれかの方法。

実施形態９０．
被覆された試料にカバースリップを接着させることを更に含む、実施形態８３～８９のいずれかの方法。

実施形態９１．
スライドに接着させられたカバースリップなしに、被覆された試料を保存することを更に含む、実施形態８３～９０のいずれかの方法。

実施形態９２．
電場は、複数のピンを用いて印加される、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態９３．
１つ以上のピンが、試料の表面上で移動させられる、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態９４．
組織に液体を加えることなく、試料からパラフィンを除去することを更に含む、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態９５．
パラフィンを溶融させるのに有効な熱エネルギーを試料に加えることを更に含む、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態９６．
熱エネルギーを加えることは、組織試料を表面上に置いて表面を加熱することと、組織試料をチャンバの中に入れてチャンバを加熱することと、放射熱エネルギーを加えることと、赤外線を当てることと、パラフィンを約３５℃～約７０℃の範囲内の温度にまで加熱するように熱エネルギーを加えることと、前述のうちの２つ以上の組み合わせとからなる群から選択される１つ以上の方法によって実行される、実施形態９５の方法。

実施形態９７．
試料が曝露されるイオン化領域においてプラズマを生成するように電場を印加することを含む、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態９８．
プラズマは、空気分子から生成される、実施形態９７の方法。

実施形態９９．
電場を印加することは、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加することを含む、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

実施形態１００．
電場を印加することは、第１の電極の周りの領域においてコロナ放電を生成し、パラフィンをコロナ放電に曝露するように第１の電極を位置決めすることを更に含む、実施形態９９の方法。

実施形態１０１．
第１の電極は、
第１の電極が、第１の電極を囲む増大させられた電場強度の領域を発生させるように構成された湾曲した形状部を含む構成と、
第１の電極が、第１の電極を囲む増大させられた電場強度の領域を発生させるように構成された湾曲した形状部を含み、ここで湾曲した形状部が、第１の電極の端部又は先端部を含む構成と
からなる群から選択される構成を有する、実施形態９９の方法。

実施形態１０２．
第２の電極は、平面状の電極である、実施形態９９の方法。

実施形態１０３．
第１の電極及び試料の少なくとも一方を他方に対して移動させることを含む、実施形態９９の方法。

実施形態１０４．
第１の電極は、電極のアレイを含む、実施形態９９の方法。

実施形態１０５．
組織は、第１の電極と第２の電極との間に位置決めされる、実施形態９９の方法。

実施形態１０６．
電場を印加しつつ熱エネルギーを加えることを含む、実施形態９５の方法。

実施形態１０７．
固体基板上に試料を置くことと、スライド上に試料を置くことと、プレート上に試料を置くことと、ビーズ上に試料を置くことと、多孔質媒体上に試料を置くことと、フィルタ上に試料を置くことと、液体容器の中に試料を入れることと、パラフィンよりも高い表面エネルギーを有する基板表面上に試料を置くこととからなる群から選択されるステップを含む、前述の実施形態のうちのいずれかの方法。

「通信（連通）する（communicate）」及び「通信（連通）している（in communication with）」（例えば、第１の構成要素が第２の構成要素と「通信（連通）する」又は「通信（連通）している」）等の用語は、２つ以上の構成要素又は要素間の構造的、機能的、機械的、電気的、信号、光学的、磁気的、電磁的、イオン又は流体的な関係性を示すために本明細書において使用されることが理解されよう。その場合に、１つの構成要素が第２の構成要素と通信（連通）すると言われることは、更なる構成要素が、第１の構成要素と第２の構成要素との間に存在する場合があり、及び／又は第１の構成要素及び第２の構成要素と動作可能に関連付けられるか、又は関与する場合がある（つまり、第１の構成要素と第２の構成要素との間に存在する場合があり、又は第１の構成要素及び第２の構成要素と動作可能に関連付けられるか又は関与する場合がある、あるいはそれらの両方の場合がある）という可能性を除外することを意図するものではない。

本発明の種々の態様又は詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更することができることが理解されよう。さらに、上述の記載は、単に例示目的のものであり、限定する目的はない。本発明は、特許請求の範囲によって規定される。

Claims (13)

1. 標的ポリヌクレオチドを含む試料に電場を印加することと、
   前記電場が印加されている間、前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する１つ以上の検出可能な核酸プローブに、前記試料を接触させることと
   を含む、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための試料を調製する方法方法。
2. 前記試料は、パラフィン包埋組織標本である、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料は、全組織である、請求項１に記載の方法。
4. 前記試料は、全組織のスライスを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記試料は、１つ以上の細胞ペレットである、請求項１に記載の方法。
6. 前記試料は、１つ以上の細胞塗抹標本である、請求項１に記載の方法。
7. 前記試料は、１つ以上の細胞を含み、前記標的ポリヌクレオチドは、前記細胞の核内にある、請求項１に記載の方法。
8. 前記電場は、ＤＮＡを露出させるのに十分な強さで及び十分な時間の間印加される、請求項１に記載の方法。
9. 前記電場は、５００Ｖ以下の電位で印加される、請求項８に記載の方法。
10. 前記試料は、前記核酸プローブとの接触の前に、タンパク質分解酵素と接触しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記試料は、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされた前記標識プローブの分析の間に、無傷のタンパク質からの自家蛍光を実質的に含まない、請求項１０に記載の方法。
12. 前記標識プローブとの接触の前に、前記試料から実質的に全てのパラフィンを除去することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記パラフィンは、前記試料に電場を印加することと、脱パラフィン化溶媒を用いて前記試料を洗浄することとの組み合わせによって除去される、請求項１２に記載の方法。