JP2023539117A - ヌクレアーゼ媒介性核酸改変 - Google Patents

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Abstract

遺伝子及びゲノムの分子生物学的操作に、並びに限定はされないが詳細には、改善された遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート。）方法、組成物、システム、及びキットに関する技術が、本明細書に提供される。

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０６７，３７９号の優先権を主張する。
分野
遺伝子及びゲノムの分子生物学的操作に、並びに限定はされないが詳細には、改善された遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）方法、組成物、システム、及びキットに関する技術が、本明細書に提供される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、遺伝子編集のために広く使用されている。しかし、遺伝子編集のために使用されるＣＲＩＳＰＲ及び関連技術は、大きな断片配列（例えば、レポーター遺伝子）を標的部位に「ノックイン」（ＫＩ）する効率が低い。特に、ノックインの効率は、しばしば１％未満である。したがって、改善された技術が必要である。
（要旨）
標的部位でのノックイン核酸挿入物の組入れ改善のための改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に関する技術が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、この技術は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞）における一連の座位での大サイズの挿入物のＫＩ効率を数倍増加させる。さらに、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲ技術は、例えば、従来のＣａｓ９タンパク質を使用する従来のＣＲＩＳＰＲアプローチと比べてオフターゲット組入れを顕著に低減する。本明細書に記載される場合、改善されたＣＲＩＳＰＲ技術は、遺伝子編集の研究及び治療法に関係する幅広い応用に用いられる。
関連技術は、ある特定のペプチドをゲノム編集ヌクレアーゼ（ＧＥＮ）と融合させて、ＧＥＮ及びペプチドを含むタンパク質融合物を使用するゲノム編集の有効性及び安全性を向上させた。特に、一部の従来技術は、ＢＲＣＡ２遺伝子由来のエクソン２７（「ＢＲＣＡ２エクソン２７」又は「ＢＥ２７」としても知られる。）、アミノ酸（ＡＡ）３６個のペプチドを、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）と融合した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０９１３を参照されたい。
本明細書に提供される技術は、相同組換え修復過程に関与するＢＥ２７ポリペプチド中にアミノ酸の置換を導入することによって特異的に改変されている新しいＧＥＮタンパク質融合物を提供する。本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間に、相同組換え修復（ＨＤＲ）過程に重要な、ＢＥ２７の個々のアミノ酸が同定された。特に、これらの実験の間に収集されたデータは、アミノ酸１５位のセリン（Ｓ１５）及び／又はアミノ酸２２位のセリン（Ｓ２２）がＨＤＲに特に関与することを示した。続く実験で、ｓｐＣａｓ９を、Ｓ１５及び／又はＳ２２にアミノ酸置換を含むＢＥ２７バリアントと融合することによって、新しいＣａｓ９バリアント（「ｍｉＣａｓ９－Ａ」、「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」）が構築された。特に、ｓｐＣａｓ９を、アミノ酸１５でセリンのアラニンへの置換（Ｓ１５Ａ）、アミノ酸２２でセリンのチロシンへの置換（Ｓ２２Ｙ）、又はアミノ酸２２でセリンのアスパラギン酸への置換（Ｓ２２Ｄ）を有するＢＥ２７ポリペプチドと融合することによって、Ｃａｓ９バリアントが構築された。ＢＥ２７ポリペプチドバリアントは、それぞれＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及びＢＥ２７－Ｓ２２Ｄと名付けられ、ｓｐＣａｓ９と融合されて、それぞれｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄと名付けられた新しいＣａｓ９融合ポリペプチドバリアントを産生した（まとめて、「ｍｉＣａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄ」又は「ｍｉＣａｓ９バリアント」）。
本明細書に記載される技術の実施形態の開発の間に、産生されたｍｉＣａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄバリアントは、精密な遺伝子編集効率を損なわずにオンターゲット及びオフターゲットの挿入及び欠失（インデル）事象を顕著に低減した。さらに、実験は、ｍｉＣａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄバリアントが大サイズ遺伝子ノックイン率の増加も産生したことを示した。したがって、ＢＥ２７バリアントペプチド（ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ）の各々は、核酸中に二重鎖切断を産生して核酸の改変（例えば、遺伝子編集）を改善する、例えば、ゲノム編集応用において改善された有効性及び安全性プロファイルを有するＧＥＮ－ＢＥ２７－Ａ／Ｙ／Ｄ融合タンパク質を産生する、任意のＧＥＮと融合することができるユニバーサルモチーフを提供する。
したがって、遺伝子編集ヌクレアーゼドメイン及びＢＥ２７バリアントドメインを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質に関する技術が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連システムタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体（例えば、Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９））を含む。一部の実施形態では、選択されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、又はｘＣａｓ９；その一部分；そのホモログ；又はその改変体である。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む。
一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１個のＢＥ２７バリアントドメインを含む。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、複数のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個よりも多いＢＥ２７バリアントドメイン）を含む。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、複数のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個よりも多いＢＥ２７バリアントドメイン）を含み、各ＢＥ２７バリアントドメインは、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄから独立して選択される。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１～１０個のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のＢＥ２７バリアントドメイン）を含む。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１～１０個のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のＢＥ２７バリアントドメイン）を含み、各ＢＥ２７バリアントドメインは、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄから独立して選択される。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントドメインは、Ｓ１５Ａ置換を含む。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントドメインは、Ｓ２２Ｙ置換を含む。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントドメインは、Ｓ２２Ｄ置換を含む。
さらに、一部の実施形態では、技術は、本明細書に記載されるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ｇＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ドナー核酸をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、標的核酸をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、１００～１０００ｂｐ（例えば、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ｂｐ）を含むドナー核酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、１０００～１０，０００ｂｐ（例えば、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、又は１００００ｂｐ）を含むドナー核酸を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＲＡＤ５１タンパク質又はＲＡＤ５１タンパク質をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、複数のＲＡＤ５１タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ノックインを含む核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ノックインを含む核酸は、ドナー核酸の配列を含む。
一部の実施形態では、技術は、方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、技術は、標的核酸中にノックインを生成する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、標的核酸をＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質と接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、標的核酸を、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及び標的核酸と相補的な配列を含むｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質と接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、ノックイン配列を含むドナー核酸を提供することを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞内にリボ核タンパク質を導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞内に前記リボ核タンパク質及び前記ドナー核酸を導入することを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、Ｓ１５Ａ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、Ｓ２２Ｙ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、Ｓ２２Ｄ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連システムタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９））、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２及びｘＣａｓ９からなる群から選択されるＣａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、ＴＡＬＥＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む。方法の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、ＺＦＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む。
さらなる実施形態は、キットに関する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）を含む。
さらなる実施形態は、システムに関する。一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物。）を含む。
さらなる実施形態は、トランスジェニック細胞を産生するためのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）の使用を提供する。一部の実施形態では、技術は、トランスジェニック動物を産生するためのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）の使用を提供する。
一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）をコードする核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）をコードする核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）を発現している細胞を提供する。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）をコードする核酸を発現している細胞を提供する。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）を発現しているトランスジェニック動物。一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及び／又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）をコードする核酸を発現しているトランスジェニック動物を提供する。
追加的な実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて関連技術の専門家に明らかである。
本技術のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の図面を考慮してより良く理解されるようになる。
ＥＭＸ１でのオフターゲットインデル事象を評価するために使用されたＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ（Ｔ７ＥＩアッセイ；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｓｃｈｉｎら（２０１０）「Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７～５６頁を参照のこと。）からの産物の電気泳動後のアガロースゲルの写真である。実験結果は、両方ともＥＭＸ１で検出可能なオフターゲットインデル事象を産生した野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）及びＣａｓ９の野生型ＢＥ２７との融合物（ｍｉＣａｓ９）と比べて、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄが、ＥＭＸ１で減少したか、又は検出不可能なオフターゲットインデル事象を産生したことを示した。アミノ酸２２でグルタミン酸のセリンへの置換を含む、ｓｐＣａｓ９のＢＥ２７との融合物（ｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅ）は、ＥＭＸ１でオフターゲットインデル事象を産生することが検出された。 ＦＡＮＣＦ２でのオフターゲットインデル事象を評価するために使用されたＴ７ＥＩアッセイからの産物の電気泳動後のアガロースゲルの写真である。実験結果は、両方ともＦＡＮＣＦ２で検出可能なオフターゲットインデル事象を産生した野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）及びＣａｓ９の野生型ＢＥ２７との融合物（ｍｉＣａｓ９）と比べて、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄが、ＥＭＸ１で減少したか、又は検出不可能なオフターゲットインデル事象を産生したことを示した。 ＶＥＧＦＡ３でのオフターゲットインデル事象を評価するために使用されたＴ７ＥＩアッセイからの産物の電気泳動後のアガロースゲルの写真である。実験結果は、両方ともＶＥＧＦ３で検出可能なオフターゲットインデル事象を産生した野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）及びＣａｓ９の野生型ＢＥ２７との融合物（ｍｉＣａｓ９）と比べて、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄが、ＶＥＧＦＡ３で減少したか、又は検出不可能なオフターゲットインデル事象を産生したことを示した。 野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）と比べてＡＡＶＳ１標的部位に大サイズノックインを生成するためのｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｄ、及びｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅの相対効率の増加を示す棒プロットである。ｍｉＣａｓ９－Ａはまた、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）及びＣａｓ９の野生型ＢＥ２７との融合物（ｍｉＣａｓ９）と比べて、ＡＡＶＳ１標的部位で大サイズノックインを生成する効率の増加を有することが検出された。
図面は必ずしも一定の縮尺で描かれておらず、図面中の物体も、必ずしも互いに関連して一定の縮尺で描かれているわけではないことを理解されたい。図面は、本明細書に開示される装置、システム、及び方法の様々な実施形態を明確にし、理解させることが意図される描写である。可能な限り、同一又は類似の部品を指すために図面全体にわたり同じ参照番号が使用される。そのうえ、図は、本教示の範囲を限定することがどのようにも意図されていないことが、認識されるべきである。
標的部位へのノックイン核酸挿入物の改善された組入れのための改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に関する技術が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、技術は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞）中の一連の座位での大サイズの挿入物のＫＩ効率を提供する。さらに、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲ技術は、例えば従来のＣａｓ９タンパク質を使用する、従来のＣＲＩＳＰＲアプローチと比べてオフターゲット組入れを顕著に低減する。本明細書に記載される場合、改善されたＣＲＩＳＰＲ技術は、遺伝子編集の研究及び治療法に関係する幅広い応用に用いられる。
様々な実施形態のこの詳細な説明では、説明のために、開示された実施形態の徹底的な理解を提供するために数多くの具体的詳細が示される。しかし、当業者は、これらの様々な実施形態がこれらの具体的詳細と共に、又はそれなしに実施され得ると認識している。他の例では、構造及び装置は、ブロック図の形態で示される。さらに、当業者は、方法が提示及び実行される具体的な順序が例示であると容易に認識することができ、順序が変更され、それでもまだ、本明細書に開示される様々な実施形態の精神及び範囲内に収まり得ることが企図される。
特許、特許出願、論文、書籍、専門書、及びインターネットのウェブページを含むが、それに限定されるわけではない、本出願に引用された全ての文献及び同様の資料は、その全てをいかなる目的のためにも参照により明確に組み込まれる。特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載される様々な実施形態が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。組み込まれた参照内の用語の定義が、本教示に提供される定義と異なるように見える場合、本教示に提供される定義が優先されるものとする。本明細書に使用されるセクション見出しは、単に構成のためであり、記載された主題を何らかの方法で限定するものとして解釈されるべきではない。
定義
本技術の理解を促すために、いくつかの用語及び語句が下に定義される。追加的な定義は、詳細な説明の全体にわたり示される。
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたり、以下の用語は、文脈が他のことを明らかに指示しない限り、本明細書に明示的に関連する意味をもつ。本明細書に使用される場合、「一実施形態では」という語句は、同じ実施形態を指し得るものの、必ずしもそれを指すわけではない。さらに、本明細書に使用される場合、「別の実施形態では」という語句は、異なる実施形態を指し得るものの、必ずしもそれを指すわけではない。したがって、下記のように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲又は精神から逸脱せずに容易に組み合わされる場合がある。
加えて、本明細書に使用される場合、「又は」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、包括的な「又は」演算子であり、用語「及び／又は」と等価である。「に基づいて」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り排他的でなく、記載されていない追加的な要素に基づくことを可能にする。加えて、本明細書全体にわたり、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の意味は、複数の参照を含む。「中に（ｉｎ）」の意味は、「中に（ｉｎ）」及び「上に（ｏｎ）」を含む。
本明細書に使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「顕著に」という用語は、当業者によって理解されており、それらが使用される文脈に応じてある程度変動する。これらの用語が使用されている文脈からして、当業者に明らかではないそれらの使用があれば、「約」及び「およそ」は、特定の用語のプラス又はマイナス１０％以下を意味し、「実質的に」及び「顕著に」は、特定の用語のプラス又はマイナス１０％超を意味する。
本明細書に使用される場合、「を含まない（－ｆｒｅｅ）」という接尾語は、「を含まない」が付属している単語の基本語根の特徴を削除する技術の実施形態を指す。すなわち、「Ｘを含まない」という用語は、本明細書に使用される場合、「Ｘなしに」を意味し、その際、Ｘは、「Ｘを含まない」技術において削除された技術の特徴である。例えば、「カルシウムを含まない」組成物は、カルシウムを含まず、「シーケンシングを含まない」方法は、シーケンシング段階を含まないなどである。
本明細書に使用される場合、「遺伝子編集ヌクレアーゼ－ＢＥ２７バリアント融合物」又は「ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物」という用語は、１）遺伝子編集ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連システムタンパク質（Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ｓｐＣａｓ９）又は本明細書に記載される類似物））、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、又はそのバリアント若しくは改変体）；及び２）ＢＲＣＡ２からの改変エクソン２７（例えば、「ＢＥ２７バリアント」（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を、例えば、セリン１５及び／又はセリン２２に含む、ＢＲＣＡ２からのエクソン２７；下記の考察を参照）を含む１つ以上のアミノ酸配列を含むドメインを含むポリペプチドを指す。したがって、一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、Ｃａｓ９バリアント、例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄを産生するために１つ以上のアミノ酸置換を含むＢＥ２７ポリペプチドと融合されたＣａｓ９を含むＣａｓ９バリアント、例えば、アミノ酸１５のセリンのアラニンへの置換（Ｓ１５Ａ）、アミノ酸２２のセリンのチロシンへの置換（Ｓ２２Ｙ）、又はアミノ酸２２のセリンのアスパラギン酸への置換（Ｓ２２Ｄ）を有するＢＥ２７ポリペプチド（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ）と（例えばそのＣ末端で）融合されたｓｐＣａｓ９ポリペプチドである。すなわち、一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、本明細書において、ｓｐＣａｓ９であるＮ末端ドメイン及びそれぞれＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄを含むＣ末端ドメインを含む、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄと称されるＣａｓ９バリアントである。
本明細書に使用される場合、「ＢＥ２７」という用語は、ＢＲＣＡ２遺伝子からのエクソン２７のヌクレオチド配列又はＢＲＣＡ２遺伝子からのエクソン２７によってコードされるポリペプチドを指す。
本明細書に使用される場合、用語「ＢＥ２７バリアント」は、１つ以上の変異を含む、ＢＲＣＡ２遺伝子からのエクソン２７のヌクレオチド配列又は１つ以上の変異を含む、ＢＲＣＡ２遺伝子からのエクソン２７によってコードされるポリペプチド、例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントは、アミノ酸１５でセリンのアミノ置換（Ｓ１５）若しくはアミノ酸２２でセリンのアミノ酸置換（Ｓ２２）を有する、ＢＥ２７ポリペプチドをコードするＢＥ２７ヌクレオチド配列又はＢＥ２７ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントは、アミノ酸１５でセリンのアラニンへの置換（Ｓ１５Ａ）、アミノ酸２２でセリンのチロシンへの置換（Ｓ２２Ｙ）、若しくはアミノ酸２２でセリンのアスパラギン酸への置換（Ｓ２２Ｄ）を有する、ＢＥ２７ポリペプチド（例えば、本明細書においてそれぞれ「ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ」、「ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ」、及び「ＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ」と称される）をコードするＢＥ２７ヌクレオチド配列又はＢＥ２７ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、又はそれよりも多いＢＥ２７バリアントドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるリボ核タンパク質は、本明細書に記載されるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物であるポリペプチド及び本明細書に記載されるｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１個以上のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は２５個のＢＥ２７バリアントドメイン）と融合された、Ｃａｓ９又はＣａｓ９に類似の活性を有するタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１又は本明細書に記載される他のＣａｓ９様タンパク質若しくはＣａｓ９ホモログ）である遺伝子編集ヌクレアーゼを含む。
本明細書に使用される場合、「ｍｉＣａｓ９」という用語は、ＢＥ２７バリアントに融合されたＣａｓ９を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はＢＥ２７バリアントに融合されたＣａｓ９を含むポリペプチドを指す。本明細書に使用される場合、「ｍｉＣａｓ９－Ａ」、「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」という用語は、それぞれＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及びＢＥ２７－Ｓ２２Ｄに融合されたＣａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９）を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそれぞれＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及びＢＥ２７－Ｓ２２Ｄに融合されたＣａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９）を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ｍｉＣａｓ９は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、又はそれよりも多いＢＥ２７バリアントドメインを含む。本技術は、Ｃａｓ９を含むｍｉＣａｓ９に限定されず、任意のゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、任意のＣＲＩＳＰＲタンパク質及び／又はＣＲＩＳＰＲ活性若しくはＣａｓ９に類似の活性を有するタンパク質）を含む。
本明細書に使用される場合、「核酸」又は「核酸配列」は、ピリミジン並びに／又はプリン塩基、それぞれ好ましくはシトシン、チミン、及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンのポリマー又はオリゴマーを指す（参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７９３～８００頁（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）を参照されたい。）。本技術は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はペプチド核酸構成要素、並びにそれらの任意の化学バリアント、例えば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、又はグリコシル化形態、その他を企図している。ポリマー又はオリゴマーは、組成が不均一な場合も均一な場合もあり、天然起源から単離される場合も、人工的若しくは合成的に産生される場合もある。加えて、核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの混合物であってもよく、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む単鎖又は二重鎖形態で永続的に又は一過性に存在し得る。一部の実施形態では、核酸又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａａｓｃｈ及びＣｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、４１（１４）、４５０３～４５１０頁、並びに参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号を参照のこと。）、ロックド核酸（ＬＮＡ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３～５６３８頁を参照のこと。）、シクロヘキセニル核酸（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００、１２２、８５９５～８６０２頁を参照のこと。）、及び／又はリボザイムなどの他の種類の核酸構造を含む。したがって、「核酸」又は「核酸配列」という用語はまた、天然ヌクレオチドと同じ機能を示すことができる非天然ヌクレオチド、改変ヌクレオチド、及び／又は非ヌクレオチド基本単位（例えば、「ヌクレオチド類似体」）を含む鎖を包含する場合があり；さらに、「核酸配列」という用語は、本明細書に使用される場合、単鎖又は二重鎖であり得、センス又はアンチセンス鎖を表し得る、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は部分、並びにゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡを指す。
さらに、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する場合があり、公知又は未知の任意の機能を果たす場合がある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、連鎖解析から定義された座位（ｌｏｃｉ又はｌｏｃｕｓ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を包含する。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、１９９１；Ｂａｓｅｒｇａら、１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ、１９９３；ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ、１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ－Ｓｏｕｋｕｐ、１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ、１９９６を参照のこと。ポリヌクレオチドは、１種以上の改変ヌクレオチド、例えば。メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーの組立ての前又は後に授けられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどによって、さらに改変され得る。ＤＮＡ中のヌクレオチドは、本明細書において以下のような一文字コードを使用して表示される：Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、及びＧ（グアニン）；ＲＮＡ中のヌクレオチドは、以下のような一文字コードを使用して表示される：Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、及びＣ（シトシン）。これらのヌクレオチドは、相補的塩基対合と呼ばれる組み合わせで互いに特異的に結合する。すなわち、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と対合し（しかし、ＲＮＡの場合、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合する）、シトシン（Ｃ）は、グアニン（Ｇ）と対合し、その結果、これらの塩基対は各々、二重鎖を形成する。本明細書に使用される場合、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の縮重塩基についての標準的なコードは、以下のように使用される：Ｒ（Ｇ又はＡ）、Ｙ（Ｔ／Ｕ又はＣ）、Ｍ（Ａ又はＣ）、Ｋ（Ｇ又はＴ／Ｕ）、Ｓ（Ｇ又はＣ）、Ｗ（Ａ又はＴ／Ｕ）、Ｂ（Ｇ又はＣ又はＴ／Ｕ）、Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ／Ｕ）、Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ／Ｕ）、Ｖ（Ａ又はＧ又はＣ）、又はＮ（Ａ又はＧ又はＣ又はＴ／Ｕ）、ギャップ（－）。
「ヌクレオチド類似体」という用語は、本明細書に使用される場合、変更されたスタッキング相互作用を有する類似体、例えば、７－デアザプリン（すなわち、７－デアザ－ｄＡＴＰ及び７－デアザ－ｄＧＴＰ）；代替的な水素結合立体配置を有する塩基類似体（例えば、イソ－Ｃ及びイソ－Ｇ、並びに参照により本明細書に組み込まれるＳ．Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第６，００１，９８３号に記載された他の非標準的塩基対など。）；非水素結合性類似体（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂ．Ａ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ及びＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、５９、７２３８～７２４２頁、Ｂ．Ａ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ及びＥ．Ｔ．Ｋｏｏｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５、１１７、１８６３～１８７２頁によって記載された非極性芳香族ヌクレオシド類似体、例えば、２，４－ジフルオロトルエン）；「ユニバーサル」塩基、例えば、５－ニトロインドール及び３－ニトロピロール；並びにユニバーサルプリン及びピリミジン（例えば、それぞれ「Ｋ」及び「Ｐ」ヌクレオチド；各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐ．Ｋｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８９、１７、１０３７３～１０３８３頁、Ｐ．Ｋｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５１４９～５１５２頁）を含むが、それらに限定されない改変又は非天然ヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、糖部分に改変を有するヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチド及び２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。ヌクレオチド類似体は、デオキシリボヌクレオチドのみならず、リボヌクレオチドの改変形態を含む。
「ペプチド核酸」は、ペプチド様ポリアミド骨格を組み込んでいるＤＮＡ模倣物を意味する。
本明細書に使用される場合、「配列同一％」という用語は、最大の同一パーセントを達成するように２つの配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、参照配列中で対応するヌクレオチドと同一である、核酸配列中のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のパーセンテージを指す。したがって、この技術による核酸が、参照配列よりも長い場合、参照配列とアラインメントしない核酸中の追加的なヌクレオチドは、配列同一性を決定するために考慮されない。ＢＬＡＳＴ、Ａｌｉｇｎ ２、及びＦＡＳＴＡを含むアラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野において周知である。
「相同」及び「相同な」という用語は、同一度を指す。部分的相同又は完全相同があり得る。部分的相同配列は、別の配列と１００％未満同一な配列である。
「配列変動」という用語は、本明細書に使用される場合、２つの核酸の間の核酸配列における１つ以上の差異を指す。例えば、野生型核酸（例えば、ＢＥ２７をコードする核酸）及びこの野生型核酸の変異型（例えば、ＢＥ２７バリアントをコードする核酸）は、１つ以上の一塩基置換の存在によって、又は１つ以上のヌクレオチドの欠失及び／若しくは挿入によって、配列が変動し得る。これらの２つの形態の核酸は、互いに配列が異なると言われる。核酸の第２の変異型が存在し得る。この第２の変異型は、配列が野生型遺伝子及び核酸の第１の変異型の両方と異なると言われる。
本明細書に使用される場合、「相補的な」、「ハイブリダイズ可能な」、又は「相補性」という用語は、塩基対合則によって関係付けられたポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド又は標的核酸などのヌクレオチド配列）に関連して使用される。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」と相補的である。相補性は、塩基対合則により核酸塩基の一部だけがマッチする「部分的」であり得る。又は、核酸間に「完全な」又は「全くの」相補性もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に顕著な影響を有する。これは、増幅反応のみならず、核酸間の結合に依存する検出方法に特に重要である。いずれの用語も、個々のヌクレオチドに関連して特にポリヌクレオチドの文脈内で使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、それと別の核酸鎖内のヌクレオチドとのその相補性又はその欠如について、オリゴヌクレオチドの残りとこの核酸鎖との間の相補性と対比又は比較して注記される場合がある。
一部の文脈で、「相補性」という用語及び関連する用語（例えば、「相補的な」、「相補体」）は、水素結合を経由して別の核酸配列に結合することができる核酸配列のヌクレオチド、例えば、塩基対合、例えば、ワトソン・クリック塩基対合又は他の塩基対合が可能なヌクレオチドを指す。塩基対を形成することができるヌクレオチド、例えば、互いに相補的なヌクレオチドは、以下の対である：シトシン及びグアニン、チミン及びアデニン、アデニン及びウラシル、並びにグアニン及びウラシル。相補性パーセンテージは、核酸配列の全長にわたり計算する必要がない。相補性パーセンテージは、塩基対合している核酸配列の特定領域、例えば、最初の塩基対合ヌクレオチドから開始し、最後の塩基対合ヌクレオチドで終止するものに限られ得る。本明細書に使用される核酸配列の相補体は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列とアラインメントされた場合に、「逆平行会合」の状態であるオリゴヌクレオチドを指す。天然核酸中に通常見出されないある特定の塩基が、本発明の核酸中に含まれる場合があり、それらには、例えば、イノシン及び７－デアザグアニンが含まれる。相補性は完全である必要がなく；安定な二本鎖がミスマッチ塩基対又はマッチしていない塩基を含有する場合がある。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度並びにミスマッチ塩基対の出現率を含むいくつかの変数を経験的に考慮して、二本鎖安定性を決定することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、ハイブリダイズ可能な、又は特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないことが、当技術分野において理解されている。そのうえポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたりハイブリダイズする場合があり、その結果、介在又は隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、それらが標的付けられる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含み得る。例えば、核酸の２０個のヌクレオチドのうち１８個が標的領域と相補的である、したがって特異的にハイブリダイズする当該核酸は、９０パーセントの相補性に相当する。この例では、残りの非相補性ヌクレオチドは、クラスター化されている場合があり、又は、残りの非相補性ヌクレオチドに相補性ヌクレオチドが散在している場合もあり、非相補性ヌクレオチドは、相互に連続している必要も、相補性ヌクレオチドと連続している必要もない。核酸内の核酸配列の特定のセグメント間のパーセント相補性は、当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本局所アラインメント探索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３～４１０頁；Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９～６５６頁）を使用して、又はデフォルトの設定を使用して、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（参照により本明細書に組み込まれる、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２～４８９頁。）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって日常的に決定することができる。
したがって、一部の実施形態では、「相補的な」は、第２のヌクレオチド配列の相補体と、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、若しくはそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である第１のヌクレオチド配列を、又は２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。「完全に相補的な」は、第１の核酸の各ヌクレオチドが、第２の核酸中の対応する位置で各ヌクレオチドと対合可能であることを意味する。例えば、ある特定の実施形態では、各ヌクレオチドが核酸に対する相補性を有するオリゴヌクレオチドは、核酸の相補体と、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、又はそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたり同一であるヌクレオチド配列を有する。
「ミスマッチ」は、ヌクレオチドと第２の核酸の対応する位置で対合不可能な第１の核酸のヌクレオチドを意味する。
本明細書に使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に関連して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、及び形成されたハイブリッドのＴｍなどの要因によって影響される。「ハイブリダイゼーション」方法は、１つの核酸の、別の相補性核酸、例えば、相補性ヌクレオチド配列を有する核酸へのアニーリングを伴う。相補性配列を含む核酸の２つのポリマーが互いを見出し、塩基対合相互作用により「アニール」又は「ハイブリダイズ」する能力は、よく認識された現象である。各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｍｕｒ及びＬａｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４５３（１９６０）並びにＤｏｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４６１（１９６０）による「ハイブリダイゼーション」過程の最初の観察は、この過程の現代生物学の必須のツールへの精密化によって追跡されている。例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、現在周知であり、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１；並びにＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示される。温度及びイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
本明細書に使用される場合、「二重鎖核酸」は、核酸の一部分、より長い核酸の領域、又は核酸全体であり得る。「二重鎖核酸」は、例えば、二重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどであり得るが、それに限定されない。例えば、二次構造（例えば、塩基対合した二次構造）及び／又はより高次の構造（例えば、ステム－ループ構造）を有する単鎖核酸は、「二重鎖核酸」を含む。例えば、三本鎖構造は「二重鎖」であるとみなされる。一部の実施形態では、任意の塩基対合した核酸が「二重鎖核酸」である。
本明細書に使用される場合、「ゲノム座位」又は「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数形「ｌｏｃｉ」）という用語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の部位である。
本明細書に使用される場合、「遺伝子」という用語は、非コード機能を有するＲＮＡ（例えば、リボゾーム又は転移ＲＮＡ）、ポリペプチド、又は前駆体の産生に必要な制御及びコード配列を含むＤＮＡヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡ又はポリペプチドは、完全長コード配列によって、又は所望の活性若しくは機能が保持される限りコード配列の任意の部分によって、コードされ得る。したがって、「遺伝子」は、生物において果たすべき機能的役割を有するポリペプチド又はＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの部分を指す。本明細書に記載される技術のために、このような調節配列がコード配列及び／又は転写された配列に隣接するにせよ、隣接しないにせよ、遺伝子が遺伝子産物の産生を調節する領域を含むことが考慮され得る。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、並びに座位制御領域が含まれるが、それに限定される必要はない。
「野生型」という用語は、天然起源から単離された場合に核酸（例えば、遺伝子又は遺伝子産物）の特性を有するその核酸（例えば、遺伝子又は遺伝子産物）を指す。野生型核酸（例えば、遺伝子）は、集団中に最も頻繁に観察されるものであり、したがって、「正常」又は「野生型」形態の核酸（例えば、遺伝子）と随意に名付けられている。対照的に、「改変された」、「変異体」、又は「多形性」という用語は、野生型核酸（例えば、遺伝子）又は遺伝子産物と比較した場合に、配列中の改変及び／又は機能的性質（すなわち、変更された特性）を示す核酸（例えば、遺伝子）又は遺伝子産物を指す。天然変異体が単離される場合があり、これらは、野生型核酸（例えば、遺伝子）又は遺伝子産物と比較した場合に変更された特性を有するという事実によって特定されることに留意されたい。
本明細書に使用される場合、ポリペプチドの「機能的誘導体」という用語は、前記ポリペプチドと共通する定性的生物学的性質を有する化合物である。「機能的誘導体」には、ポリペプチドの断片並びにポリペプチド及びその断片の誘導体が含まれるが、それに限定されず、それらが対応するポリペプチドと共通する生物学的活性を有することを条件とする。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾、及びそれらの融合物のいずれをも包含する。「融合」ポリペプチドは、別の異種ポリペプチドと融合又は結合されたポリペプチド又はその部分（例えば、１つ以上のドメイン）を含むポリペプチドである。
「非天然」又は「操作された」という用語は、互換的に使用され、ヒトの手の関与を示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドを指す場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然界で自然に関連する及び自然界で見出される、少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
本明細書に使用される場合、「ヌクレアーゼ欠損」という用語は、例えば、タンパク質のヌクレアーゼ活性を低減、最小化、及び／又は除去するアミノ酸置換の結果として、低減したヌクレアーゼ活性、最小化されたヌクレアーゼ活性（例えば、ニッカーゼ）、検出不可能なヌクレアーゼ活性を含む、及び／又はヌクレアーゼ活性を有しない、タンパク質を指す。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、「デッド（ｄｅａｄ）型」タンパク質と表現される。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書に使用される場合、２個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０～１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５～５０個のヌクレオチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、又は５０個以上のヌクレオチド）を含む分子として定義される。正確なサイズは、多くの要因に依存し、これらは、今度は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はそれらの組合せを含む任意の様式で生成され得る。
モノヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’ホスフェートが一方向でその隣の３’酸素とホスホジエステル結合を介して結合されるやり方でオリゴヌクレオチドを作るように反応されるので、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’ホスフェートがモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていないならば「５’末端」、その３’酸素が続くモノヌクレオチドのペントース環の５’ホスフェートに連結されていないならば「３’末端」と称される。本明細書に使用される場合、核酸配列はまた、たとえより大きなオリゴヌクレオチドの内部であっても、５’及び３’末端を有すると言われ得る。核酸鎖に沿って５’から３’方向に移動した場合に核酸鎖に沿った第１の領域の３’末端が第２の領域の５’末端の手前にあるならば、第１の領域は、もう一方の領域の上流にあると言われる。
２つの異なる非重複オリゴヌクレオチドが同じ直鎖相補性核酸配列の異なる領域にアニールし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が、他方のオリゴヌクレオチドの５’末端の方を向いている場合、前者は、「上流」オリゴヌクレオチド、後者は、「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。同様に、２つの重複するオリゴヌクレオチドが同じ直鎖相補性核酸配列にハイブリダイズし、その際、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の上流であり、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第２のオリゴヌクレオチドの３’末端の上流であるように第１のオリゴヌクレオチドが位置する場合、第１のオリゴヌクレオチドは、「上流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得、第２のオリゴヌクレオチドは、「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。
「ペプチド」及び「ポリペプチド」並びに「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸の任意の長さのポリマー形態を指し、これらのアミノ酸は、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。従来の一及び三文字アミノ酸コードは、本明細書において以下のように使用される － アラニン：Ａｌａ、Ａ；アルギニン：Ａｒｇ、Ｒ；アスパラギン：Ａｓｎ、Ｎ；アスパルテート：Ａｓｐ、Ｄ；システイン：Ｃｙｓ、Ｃ；グルタメート：Ｇｌｕ、Ｅ；グルタミン：Ｇｌｎ、Ｑ；グリシン：Ｇｌｙ、Ｇ；ヒスチジン：Ｈｉｓ、Ｈ；イソロイシン：Ｉｌｅ、Ｉ；ロイシン：Ｌｅｕ、Ｌ；リジン：Ｌｙｓ、Ｋ；メチオニン：Ｍｅｔ、Ｍ；フェニルアラニン：Ｐｈｅ、Ｆ；プロリン：Ｐｒｏ、Ｐ；セリン：Ｓｅｒ、Ｓ；トレオニン：Ｔｈｒ、Ｔ；トリプトファン：Ｔｒｐ、Ｗ；チロシン：Ｔｙｒ、Ｙ；バリン：Ｖａｌ、Ｖ。本明細書に使用される場合、Ｘａａ及びＸというコードは、任意のアミノ酸を指す。
「結合する」という用語は、本明細書に（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインに関連して）使用される場合、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の非共有結合的相互作用を指す。非共有結合的相互作用状態の間、高分子は、「会合」又は「相互作用」又は「結合」していると言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが分子Ｙと非共有結合的に結合することが意味される）。結合相互作用の構成要素の全てが配列特異的である必要があるわけではない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）が、結合相互作用のいくつかの部分は、配列特異的であり得る。結合相互作用は、一般に、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ、又は１０－１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
「結合ドメイン」によって、タンパク質ドメインが別の分子に非共有結合的に結合することが可能であることが意味される。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質ドメイン結合タンパク質の場合、これは、（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するために）それ自体に結合することができ、かつ／又はこれは、１種以上の異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。
本明細書に使用される場合、「リボ核タンパク質」という用語、略して「ＲＮＰ」は、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質、又はＣａｓ９若しくはＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質に類似する活性を有するタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ１－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質、又は他のＣａｓ９様タンパク質、Ｃａｓ９ホモログ、及び／若しくはそれらのＢＥ２７バリアント融合物）））及びリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ））を含む多分子複合体を指す。一部の実施形態では、ポリペプチド及びリボ核酸は、非共有結合的相互作用によって結合されている。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり；酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタメート及びアスパルテートからなり；硫黄含有側鎖アミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。
「組換え」は、本明細書に使用される場合、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、自然システムに見出される内在性核酸と識別可能な構造的コード又は非コード配列を有する構築物をもたらす、クローニング、制限、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））、及び／又はライゲーション段階の様々な組合せの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片から、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞又は無細胞転写翻訳システムに含まれる組換え転写ユニットから発現されることが可能な合成核酸を提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子又は転写ユニットの形成に使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’又は３’に存在する場合があり、その際、このような配列は、コード領域の操作又は発現を妨害せず、実際に、様々なメカニズムによる所望の産物の産生をモジュレートするように作用し得る。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ＤＮＡを標的付けているＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列もまた、組換えとみなされ得る。したがって、例えば、「組換え」核酸という用語は、天然でないもの、例えば、介入がなければ離れている２つの配列のセグメントを、ヒトの介入により人工的に組み合わせることによって作られたものを指す。この人工的な組合せは、化学合成手段によって、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子操作技術によってしばしば達成される。このようなものは、通常、コドンを、同じアミノ酸、保存的アミノ酸、又は非保存的アミノ酸をコードするコドンにより置き換えるために（例えば、ＢＥ２７バリアントを産生するために）行われる。あるいは、これは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に繋いで、機能の所望の組合せを生成するために行われる。この人工的な組合せは、化学合成手段によって、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子操作技術によってしばしば達成される。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然（「野生型」）の場合があり、また、天然配列のバリアント（例えば、変異体）の場合もある。したがって、「組換え」ポリペプチドという用語は、その配列が天然ではないポリペプチドを必ずしも指すわけではない。その代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然（「野生型」）又は非天然（例えば、バリアント、変異体など）であり得る。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒトの介入の結果であるが、天然アミノ酸配列であってもよい。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンであって、それに結合したセグメントの複製が細胞中で起こるように、別のＤＮＡセグメント、例えば「挿入物」を結合させることができるものである。
細胞は、外因性ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクターが細胞内に導入された場合、このようなＤＮＡによって「遺伝子改変」又は「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。外因性ＤＮＡの存在は、永続的又は一過性の遺伝子変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム内に組み入れられる（共有結合的に連結される）場合があり、また、組み入れられない場合もある。原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核細胞に関連して、安定形質転換細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体複製を経由して娘細胞によって遺伝されるように染色体内に組み入れられたものである。この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞集団を含む細胞株又はクローンを樹立する能力によって実証される。「クローン」は、単一細胞又は共通祖先から有糸分裂によって派生した細胞集団である。「細胞株」は、多世代の間インビトロで安定成長することが可能な初代細胞のクローンである。
遺伝子改変（「形質転換」とも称される。）の適切な方法には、例えば、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介核酸送達が含まれる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｎｙａｍ及びＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ（２０１２）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、６４（補遺）：６１～７１頁を参照のこと）。遺伝子改変の方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類及び形質転換が行われている状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）に依存する。これらの方法の一般的考察は、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９５に見出すことができる。
「標的核酸」（例えば、「標的ＤＮＡ」）は、本明細書に使用される場合、「標的部位」又は「標的配列」を含むポリヌクレオチド（核酸、遺伝子、染色体、ゲノムなど）である。「標的部位」又は「標的配列」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのＤＮＡ標的付けセグメントが結合する、標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を指すために互換的に使用されるが、ただし、結合に十分な条件が存在することを条件とする。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、通常、細胞において存在する生理条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞システムにおける条件）は、当技術分野において公知である。例えば、本明細書において参照され、参照により組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。ＤＮＡ標的付けＲＮＡと相補的で、ハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」と相補的な（したがって、ＤＮＡ標的付けＲＮＡと相補的でない。）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ又はｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）鎖」と称される。
ＲＮＰ中のポリペプチドに結合し、ポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の場所に標的付けるＲＮＡ分子は、本明細書において、「ＤＮＡ標的付けＲＮＡ」又は「ＤＮＡ標的付けＲＮＡポリヌクレオチド」と称される（本明細書において、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」とも称される。）。ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、２つのセグメント、「ＤＮＡ標的付けセグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２つのＲＮＡ（例えば、ｄｇＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つのＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。
「セグメント」によって、分子のセグメント又はセクション又は部分又は領域、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質中のヌクレオチドの連続セグメントが意味される。セグメントはまた、セグメントが１種よりも多い分子の領域を含み得るように複合体のセグメント又はセクション又は部分又は領域を意味することができる。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメント（下記）は、１つのＲＮＡ分子であり、したがって、タンパク質結合セグメントは、そのＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合に、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメント（下記）は、相補性領域に沿ってハイブリダイズされる２つの別個の分子を含む。例示的で非限定的な例として、２つの別個の分子を含むＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、（ｉ）１００塩基対長である第１のＲＮＡ分子の４０～７５塩基対；及び（ｉｉ）５０塩基対長である第２のＲＮＡ分子の１０～２５塩基対を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の文脈で特に具体的な定義がない限り、特定数の合計塩基対に限定されず、所与のＲＮＡ分子からのいかなる特定数の塩基対にも限定されず、複合体内の特定数の別個の分子に限定されず、任意の合計長のＲＮＡ分子の領域を含む場合があり、他の分子との相補性を有する領域を含む場合も含まない場合もある。
ＤＮＡ標的付けセグメント（又は「ＤＮＡ標的付け配列」）は、標的ＤＮＡ内の特異配列と相補的なヌクレオチド配列（標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、ＲＮＰのポリペプチドと相互作用する。ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二重鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成する、ヌクレオチドの２つの相補性セグメントを含む。
ＤＮＡ標的付けＲＮＡ及びポリペプチドは、ＲＮＰ複合体を形成する（例えば、非共有結合的相互作用を介して結合する。）。ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列を含むことによってＲＮＰ複合体への標的特異性を提供する。ＲＮＰ複合体のポリペプチドは、部位特異的結合を提供し、一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性（例えば、ゲノム編集（例えば、ノックアウト、ノックイン、又は他のゲノム及び／若しくは遺伝子改変による）のためのもの）を提供する。言い換えると、ＲＮＰのポリペプチドは、それがＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントと会合するおかげで、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体核酸内の標的配列；染色体外核酸（例えば、エピソーム核酸、ミニサークルなど）内の標的配列；ミトコンドリア核酸内の標的配列；クロロプラスト核酸内の標的配列；プラスミド内の標的配列など）にガイドされる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子（例えば、２つのＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、「アクティベーター－ＲＮＡ」及び「ターゲター－ＲＮＡ」）を含み、本明細書において「二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ」又は「二分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ」又は「二重ガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」と称される。他の実施形態では、ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（例えば、単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、本明細書において「単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と称される。「ＤＮＡ標的付けＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）及び単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の両方を指しており、包括的である。
例示的な二分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲター－ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクティベーター－ＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲター－ＲＮＡ）は、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのＤＮＡ標的付けセグメント（単鎖）及びＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の２分の１を形成する領域（「二本鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクティベーター－ＲＮＡ）は、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の残りの２分の１を形成する領域（二本鎖形成セグメント）を含む。言い換えると、ｃｒＲＮＡ様分子の一部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の一部分と相補的であり、それとハイブリダイズして、ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する。このように、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡ様分子は、追加的に、単鎖ＤＮＡ標的付けセグメントを提供する。
したがって、ｃｒＲＮＡ様分子（例えば、ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、（対応する対として）ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的付けＲＮＡを形成する。所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が見出される種に特徴的である。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、当技術分野において公知である。対象の二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）は、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの対を含み得る。対象の二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの対を含み得る。
「アクティベーター－ＲＮＡ」という用語は、本明細書において、二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意味するために使用される。「ターゲター－ＲＮＡ」という用語は、本明細書において、二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）のｃｒＲＮＡ様分子を意味するために使用される。用語「二本鎖形成セグメント」は、本明細書において、対応するアクティベーター－ＲＮＡ又はターゲター－ＲＮＡ分子のセグメントにハイブリダイズすることによってｄｓＲＮＡ二本鎖の形成に寄与するアクティベーター－ＲＮＡ又はターゲター－ＲＮＡのセグメントを意味するために使用される。言い換えると、アクティベーター－ＲＮＡは、対応するターゲター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメントに相補的な二本鎖形成セグメントを含む。このように、アクティベーター－ＲＮＡが、二本鎖形成セグメントを含むのに対し、ターゲター－ＲＮＡは、ＤＮＡ標的付けＲＮＡの二本鎖形成セグメント及びＤＮＡ標的付けセグメントの両方を含む。したがって、対象の二重分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、任意の対応するアクティベーター－ＲＮＡ及びターゲター－ＲＮＡの対から構成され得る。
本明細書に使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、まとめて、Ｃａｓ遺伝子、ｄＣａｓ遺伝子、Ｃａｓホモログ、及び／若しくはＣｐｆ１遺伝子をコードする配列；ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性型部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）；ｃｒ（ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｃｒＲＮＡ又は活性型部分ｃｒＲＮＡ）；並びに／又はＣＲＩＳＰＲ座位からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現及び／又は活性の指示に関与する転写物及び他のエレメントを指す。技術の一部の実施形態では、「ガイド配列」及び「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）という用語は、互換的に使用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１種以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１種以上のエレメントは、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスに由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体の形成を（例えば、インビトロ又はインビボで）促進し、それを細胞内の標的配列の部位に（例えば、ＲＮＰの導入後に）方向付けるエレメントによって特徴付けられる。
本明細書に使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、植物、微生物、及び動物（例えば、イヌ、ネコ、家畜、及びヒトなどの哺乳動物）を含む任意の生物を指す。
「処置」、「処置すること」、その他の用語は、本明細書において一般に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防する点から予防的であり得、並びに／又は疾患及び／若しくは疾患に起因し得る有害作用についての部分若しくは完全治癒の点から治療的であり得る。「処置」は、本明細書に使用される場合、哺乳動物における疾患又は症状の任意の処置を包含し、（ａ）疾患若しくは症状を獲得する素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患若しくは症状が出現することを予防すること；（ｂ）疾患若しくは症状を阻害すること、例えば、その発生を停止させること；又は（ｃ）疾患を軽減すること、例えば、疾患の後退を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患又は傷害の発生の前、途中、又は後に投与され得る。処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減する、進行中の疾患の処置に、特に関心がもたれる。このような処置は、望ましくは、罹患組織における完全な機能喪失の前に行われる。対象治療法は、望ましくは、疾患の症候ステージの途中に、一部の実施形態では疾患の症候ステージの後に、投与される。
本明細書及び特許請求の範囲における「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。一方で、これは、標本又は培養物（例えば、微生物培養物）を含むことが意味される。他方で、これは、生体試料及び環境試料の両方を含むことが意味される。試料は、合成起源の標本を含み得る。
本明細書に使用される場合、「生体試料」は、生体組織又は生体液の試料を指す。例えば、生体試料は、動物（ヒトを含む）から得られた試料；液体、固体、又は組織試料のみならず；液体及び固形の食品並びに飼料製品及び成分、例えば、乳製品、野菜、肉及び肉副産物、並びに廃棄物であり得る。生体試料は、様々な科の飼育動物の全てのみならず、有蹄動物、クマ、魚、ウサギ、げっ歯動物、その他などの動物を含むが、それに限定されない野生化又は野生動物から得られ得る。生体試料の例には、組織切片、血液、血液分画、血漿、血清、尿、若しくは他の末梢起源からの試料、又は細胞培養物、細胞コロニー、単一細胞、若しくは単一細胞の収集物が含まれる。さらに、生体試料には、上述の試料のプール又は混合物が含まれる。生体試料は、対象から細胞の試料を取り出すことによって提供される場合があるが、以前に単離された試料を使用することによって提供することもできる。例えば、組織試料は、疾患を有する疑いがある対象から、従来の生検技術によって取り出すことができる。一部の実施形態では、血液試料は、対象から採取される。患者からの生体試料は、疾患に冒されている疑いのある対象からの試料を意味する。
環境試料には、例えば、表面物質、土壌、水、及び工業試料などの環境物質のみならず、食品及び酪農品の加工機器、装置、器具、用具、使い捨て物品及び非使い捨て物品から得られた試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
「標識」という用語は、本明細書に使用される場合、検出可能な（好ましくは定量化可能な）効果を提供するために使用することができる、及び核酸又はタンパク質と結び付けることができる、任意の原子又は分子を指す。標識には、色素（例えば、蛍光色素又は部分）；放射標識、例えば３２Ｐ；結合部分、例えばビオチン；ハプテン、例えばジゴキシゲニン；発光、リン光、又は蛍光発生部分；質量タグ；及び単独の、又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルを抑制若しくはシフトすることができる部分と組み合わせた、蛍光色素が含まれるが、それに限定されない。標識は、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、Ｘ線回折又は吸収、磁性、酵素活性によって検出可能なシグナル、質量又は質量によって影響される挙動（例えば、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析；蛍光偏光）の特性、その他を提供し得る。標識は、荷電部分（正又は負電荷）であり得、又はその代わりに中性電荷であり得る。標識は、標識を含む配列が検出可能な限り、核酸又はタンパク質配列を含む、又はそれからなり得る。
本明細書に使用される場合、「部分」は、例えば、オリゴヌクレオチド、分子、化学基、ドメイン、プローブなどの様々な部分などの、何かが分割され得る２つ以上の部分のうちの１つを指す。
本明細書に使用される場合、「ステム－ループ構造」は、二重鎖を形成することが知られているか、又は予測されるヌクレオチドの領域（ステム部分）が、主として単鎖ヌクレオチドの領域（ループ部分）の一端に連結されたものを含む二次構造を有する核酸を指す。「ヘアピン」及び「フォールドバック」構造という用語もまた、本明細書において、ステム－ループ構造を指すために使用される。このような構造は、当技術分野において周知であり、これらの用語は、当技術分野におけるそれらの公知の意味と一致して使用される。当技術分野において公知のように、ステム－ループ構造は、正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは、１つ以上の塩基ミスマッチを含み得る。あるいは、塩基対合は正確であり得、例えば、ミスマッチを全く含まない。
本明細書に使用される場合、「相同組換え」という用語は、相同配列又は相同アームとして知られる２つの類似又は同一なＤＮＡ分子間でヌクレオチド配列が交換される、一種の遺伝子組換えを指す。相同組換えは、しばしば、以下の基本段階を伴う：ＤＮＡの両方の鎖に二重鎖切断（ＤＳＢ）が起きた後、切除と呼ばれる工程でＤＳＢの５’末端周辺のＤＮＡセクションが切断除去される。続くストランド侵入段階では、壊れたＤＮＡ分子の突出した３’末端が、壊れていない類似又は同一な（又は相同な）ＤＮＡ分子、例えば「相同アーム」に「侵入する」。ストランド侵入の後、さらなる一連の事象が、２つの主要経路、ＤＳＢＲ（二重鎖切断修復）経路又はＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）経路のいずれかに続き得る。
本明細書に使用される場合、「内在性ゲノムＤＮＡ」という用語は、例えば、ノックインにより挿入配列で置き換えるべき、ゲノムＤＮＡのある特定のセグメントを指す。例えば、置換え又は欠失すべき内在性ゲノムＤＮＡ、挿入配列を含むドナー核酸が両方とも同じ又は類似の相同アームに隣接している限り、内在性ゲノムＤＮＡは、ドナー核酸と配列が相同であっても、相同でなくてもよい。
本明細書に使用される場合、「ノックアウト」という用語は、染色体座位内にコードされる遺伝情報の破壊に起因する遺伝子改変である。
本明細書に使用される場合、「ノックイン」という用語は、染色体座位内にコードされる遺伝情報の異なる核酸配列による置換に起因する遺伝子改変である。
本明細書に使用される場合、「ノックアウト生物」という用語は、生物細胞のかなりの割合がノックアウトを有する生物である。
本明細書に使用される場合、「ノックイン生物」という用語は、生物細胞のかなりの割合がノックインを有する生物である。
説明
遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど、及び関連ツール）の使用は、広く使用される遺伝子編集技術となった。しかし、依然として改善されるべき一態様は、大きな断片性核酸挿入物（例えば、レポーター遺伝子）を標的部位にノックイン（ＫＩ）する効率が低いことである。例えば、従来のＣＲＩＳＰＲ法は、しばしば、大きな断片のＫＩについて１％未満の効率を有する。加えて、重要な一関心事は、ＣＲＩＳＰＲノックインの不十分な特異性に関係するオフターゲット編集である。
ＢＥ２７バリアントドメイン
一部の実施形態では、本技術は、遺伝子編集ヌクレアーゼがＢＲＣＡ２遺伝子からの改変エクソン２７（例えば、ＢＥ２７バリアント）と融合されたＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物の使用を含む。例えば、本明細書における実施例を参照のこと。一部の実施形態では、遺伝子編集ヌクレアーゼは、複数のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は２５個以上のＢＥ２７バリアントドメイン）と融合されている。一部の実施形態では、ポリペプチドは、連続的に、例えば縦列に、配置された複数のＢＥ２７バリアントドメインを含む。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、１つ以上のリンカー配列によって分離された（例えば、複数のＢＥ２７バリアントドメインのうち１つ以上を分離している）複数のＢＥ２７バリアントドメインを含む。
一部の実施形態では、ＢＥ２７アミノ酸配列は、ヒトＢＲＣＡ２の残基３２７０～３３０５、例えば：
Figure 2023539117000002
 によって提供される。
ＢＲＣＡ２遺伝子配列は、参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ受託番号ＮＧ＿０１２７７２．３によって提供される。一部の実施形態では、技術は、ＢＥ２７ポリペプチドの同じ又は類似の機能を提供する配列番号１の置換バリアント（例えば、１つ以上の保存的置換を含む配列番号１）を含む。一部の実施形態では、技術は、例えば、ＢＥ２７バリアントを提供するために、ＢＥ２７ポリペプチドの改善された機能を提供する配列番号１の置換バリアント（例えば、１つ以上の置換を含む配列番号１）を含む。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントは、１５位でのセリン（Ｓ１５）及び／又は２２位でのセリン（Ｓ２２）の別のアミノ酸による置換を含む、ＢＥ２７アミノ酸配列の置換バリアントである。一部の実施形態では、ＢＥ２７バリアントは、１５位でのセリンのアラニンへの置換（ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ）、２２位でのセリンのチロシンへの置換（ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ）、又は２２位でのセリンのアスパラギン酸への置換（ＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ）を含む、ＢＥ２７アミノ酸配列の置換バリアントである。これらの特定の例示的なＢＥ２７バリアントのアミノ酸配列は、下に提供される：
Figure 2023539117000003
技術は、配列番号１、１０、１１、又は１２をコードする任意の核酸配列、例えば、配列番号７を含む核酸及びその変異型を含む。：
Figure 2023539117000004
特に技術は、１５位でのセリン（Ｓ１５）についてのコドンが、アラニンをコードするコドン（ＧＣＮ）を産生するように変異された、及び／又は２２位でのセリン（Ｓ２２）についてのコドンが、チロシン若しくはアスパラギン酸をコードするコドン（それぞれＴＡＹ若しくはＧＡＹ）を産生するように変異された、配列番号７によるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、技術は、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、又は９９．９％同一）であるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
一部の実施形態では、ＢＥ２７ポリペプチドのバリアントをコードする核酸（例えば、配列番号１による）は、変異型の配列番号８を含む：
Figure 2023539117000005
特に技術は、１５位でのセリン（Ｓ１５）についてのコドンが、アラニンをコードするコドン（ＧＣＮ）を産生するように変異された、及び／又は２２位でのセリン（Ｓ２２）についてのコドンが、チロシン若しくはアスパラギン酸をコードするコドン（それぞれＴＡＹ若しくはＧＡＹ）を産生するように変異された、配列番号８によるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、技術は、配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、又は９９．９％同一）であるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
ＲＮＰ複合体、ポリペプチド、リボ核酸
一部の実施形態では、技術は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の使用を含む。一部の実施形態では、技術は、Ｃａｓ９又はＣａｓ９様タンパク質及びＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ（例えば、対象ＤＮＡ標的付けＲＮＡ、アクティベーター－ＲＮＡ及びターゲター－ＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ；ｄｇＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ））を含むＲＮＰ複合体の使用を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、本明細書に記載されるＢＥ２７バリアントドメイン（「Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント」又は「Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物」）と融合されたＣａｓ９又はＣａｓ９様タンパク質である。したがって、一部の実施形態では、技術は、本明細書に記載されるＢＥ２７バリアントドメイン（「Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント」又は「Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物」）と融合されたＣａｓ９又はＣａｓ９様タンパク質及びＲＮＡ（例えば、例えば、ｇＲＮＡ（例えば、対象ＤＮＡ標的付けＲＮＡ、アクティベーター－ＲＮＡ及びターゲター－ＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ；ｄｇＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ））を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む。
ＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列を含むことによってＲＮＰ複合体に対する標的特異性を提供する。複合体のポリペプチドは、結合及びヌクレアーゼ活性を提供する。言い換えると、ポリペプチドは、それが少なくともＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合セグメントと会合するおかげで、ＤＮＡ配列（例えば、染色体配列又は染色体外配列（例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、クロロプラスト配列など））にガイドされる。
様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、様々な種類及び種の細胞におけるゲノム編集に広く使用されているが、Ｃａｓ９及びＣａｓ９様タンパク質などの組換え及び操作核酸結合タンパク質は、特異的核酸への検出可能な標識を指示するために本技術に用いられる。技術の実施形態は、ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物、又は関連する若しくは類似のタンパク質を含むＲＮＰを提供する。Ｃａｓ９タンパク質は、細菌適応免疫システムの構成要素として発見された（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｒａｎｇｏｕら（２００７）「ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９～１７１２頁を参照のこと。）。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と外来ＤＮＡとの間のＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対合を使用して細菌における外来ＤＮＡを標的付け及び破壊して、配列特異性を提供する、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。近年、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰ）は、ゲノム編集における使用が見出されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｄｎａら（２０１４）「Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６：６２１３頁を参照のこと。）。
したがって、いくつかのＣａｓ９／ＲＮＡ ＲＮＰ複合体は、２つのＲＮＡ分子を含む：（１）標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；及び（２）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）。この様式では、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を使用して、標的配列を認識及び切断する、ＲＮＡガイドヌクレアーゼとして機能する。近年、アニールされたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの構造を模倣する単鎖キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡよりも広く使用されるようになった。それは、ｇＲＮＡアプローチが、２つの構成要素（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物及びｇＲＮＡ）だけを有する単純化システムを提供するからである。したがって、ＲＮＰの核酸への配列特異的結合は、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを２つの別個のＲＮＡに含む、二重ＲＮＡ複合体（例えば「ｄｇＲＮＡ」）によって、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを単一のＲＮＡに含むキメラ単鎖ガイドＲＮＡ（例えば「ｓｇＲＮＡ」）によってガイドすることができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）「Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ－ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１頁を参照のこと。）。
本明細書に使用される場合、ｃｒＲＮＡ（２－ＲＮＡ ｄｇＲＮＡシステム）又はｓｇＲＮＡ（単鎖ガイドシステム）の標的付け領域は、「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）と称される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１０～５０個の塩基、例えば、１５～４０個の塩基、例えば、１５～３０個の塩基、例えば、１５～２５個の塩基（例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、又は５０個の塩基）を含む、それからなる、又は本質的にそれからなる。Ｃａｓ９についての最も効率的な標的認識を提供するｇＲＮＡの長さを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら（２０１６）「Ｔｈｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４：６４５頁（２０１６）を参照のこと。
したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９又はＣａｓ９－ＢＥ２７結合のための「足場配列」（タンパク質結合セグメント）及びおよそ２０ヌクレオチド長であり、かつ標的核酸の標的部位に相補的な、ユーザ定義された「ＤＮＡ標的付け配列」（ＤＮＡ標的付けセグメント）を含む短鎖合成ＲＮＡである。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けの特異性は、２つの要因によって決定される：１）ｇＲＮＡ標的付け配列とマッチするＤＮＡ配列及び標的配列のすぐ下流のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。いくつかのＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列及びｇＲＮＡに相補的なおよそ２０個の塩基を含む隣接配列を含むＤＮＡ配列を認識する。カノニカルＰＡＭ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスからのＣａｓ９についてのＮＧＧ又はＮＡＧ及びナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＣａｓ９についてのＮＮＮＮＧＡＴＴである。一部の実施形態では、技術は、拡大されたＰＡＭ認識を有するＣａｓ９（例えば、ｘＣａｓ９タンパク質）の使用を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列へのハイブリダイゼーションによるＤＮＡ認識の後、Ｃａｓ９は、固有のヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ配列を切断する。ゲノム編集及び他の目的のために、Ｓ．ピオゲネスからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（「ｓｐＣａｓ９」）が最も頻繁に使用されている。このシステムを使用して、ＰＡＭの５’に隣接するＤＮＡ配列（例えば、およそ２０個のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列。）と相補的なヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡを設計することによって所与の標的核酸を標的付けることができる（例えば、編集又は他の操作のために）。Ｃａｓ９について（したがってＣａｓ９－ＢＥ２７について）の効率的な標的認識を提供するＰＡＭ配列を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら（２０１３）「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｌｉｍｉｔ ｎａｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５０：４８８～５０３頁；参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、上記を参照のこと。
一部の例示的な実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号６による配列
Figure 2023539117000006
 ［式中、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」は、標的配列（例えば、編集（例えば、ノックイン）に供されるべき核酸のもの）に相補的なＤＮＡ標的付け配列を表す］を表す。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの５’末端は、検出可能な標識、例えば色素、例えば蛍光色素を含む。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然ｔｒａｃｒＲＮＡの配列、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の図６、３５、及び３７、並びに配列番号２６７～２７２及び４３１～５６２によって提供される配列を含む。
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する配列、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の図７及び配列番号５６３～６７９によって提供される配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の図３７によって提供される配列を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の配列番号４３１～６７９に示されるｔｒａｃｒＲＮＡ分子の１つ又はその相補体と少なくとも約６０％同一である。
したがって、一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡシステムに含まれる例示的（であるが、それに限定されない）ヌクレオチド配列には、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示される配列、又は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示される任意の配列と対合するその相補体、又はハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントを形成することができるその相補体のいずれかが含まれる。
一部の実施形態では、単一分子ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補性ストレッチを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示されるｔｒａｃｒＲＮＡ分子の１つ、又はその相補体と少なくとも８つの連続ヌクレオチドにわたり少なくとも約６０％同一である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示されるｔｒａｃｒＲＮＡ分子の１つ、又はその相補体と少なくとも８つの連続ヌクレオチドにわたり少なくとも約６０％同一である。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの適切な天然対は、適切な同族対を決定する場合に種名及び塩基対合（タンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖について）を考慮することによって日常的に決定することができる。
一部の実施形態では、技術は、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物であるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物／ｇＲＮＡ複合体は、標的核酸に、ｇＲＮＡによって提供される配列特異性を有して結合して、核酸中に二重鎖切断を産生する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物／ｇＲＮＡ ＲＮＰは、標的核酸に配列特異性を有して結合し；一部の実施形態では、ＲＮＰは、標的配列を「融解」して、標的核酸の単鎖領域を配列特異的に提供する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｉら（２０１３）「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｃｅｌｌ １５２（５）：１１７３～８３頁を参照のこと。）。
さらに、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムがＰＡＭに隣接する配列を最初に標的付けたのに対し、一部の実施形態では、本明細書に使用されるＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物／ｇＲＮＡシステムは、任意のヌクレオチド配列を結合のために標的付けるように操作されている（例えば、本明細書に記載される技術はＰＡＭ非依存性である。）。また、Ｃａｓ９構成要素のインビトロのクローニング及び操作を改善する、コンパクトな遺伝子によってコードされるＣａｓ９オルソログ（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのＣａｓ９）は、公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎら（２０１５）「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９」Ｎａｔｕｒｅ ５２０：１８６～１９１頁を参照のこと。）。技術は、本明細書に記載されるＢＥ２７バリアントに融合されたこれらのコンパクトな遺伝子の使用を含む実施形態を包含する。
一部の実施形態では、異なるＣａｓ９タンパク質（例えば、様々な種からのＣａｓ９タンパク質及びその改変体（例えば、ヌクレアーゼ欠損バージョン））は、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な特性（例えば、異なるＰＡＭ配列優先度；ＰＡＭ配列の不要性；増加又は減少した結合活性；増加又は減少したレベルの細胞毒性；増加又は減少したインビトロＲＮＰ形成効率；増加又は減少した細胞内導入能（例えば、生きた細胞、例えば、生きた初代細胞）などについて）を活用するために、様々な提供される方法での使用に有利であり得る。様々な種からのＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。したがって、好みの特定のＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の必要性は、上記の５’－ＸＧＧ－３’配列と異なってもよい。一部の実施形態では、タンパク質は、拡大されたＰＡＭ適合性を有するｘＣａｓタンパク質（例えば、ＮＧ、ＧＡＡ及びＧＡＴを含む広範囲のＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９バリアント。）、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕら（２０１８）「Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ＰＡＭ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７～６３頁に記載されているものである。
一部の実施形態では、技術は、他のＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１及びその改変体）の使用を含む。例えば、一部の実施形態では、他のＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１及びその改変体）の使用は、利点を提供し、例えば、一部の実施形態では、異なるヌクレアーゼの特性は、本明細書に記載される方法に適している（例えば、他のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、異なるＰＡＭ配列優先度についての優先度を有する；他のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体以外の単鎖ｃｒＲＮＡを使用して作動し；他のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、より短いガイドＲＮＡにより作動するなど。）。一部の実施形態では、技術は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，４９０号に記載されるようなＣｐｆ１酵素の使用を含む。
幅広い種から多くのＣａｓ９オルソログが同定されており、これらのタンパク質は、わずかな同一アミノ酸を共有する。同定されたＣａｓ９オルソログの全ては、セントラルＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びスプリットＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する同じドメイン構成を有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存された構造を有する４つの主要モチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨ－モチーフである。一部の実施形態では、適切なポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１～４の各々は、公知のＣａｓ９及び／又はＣｓｎ１アミノ酸配列のモチーフ１～４と少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの細菌はＣａｓ９タンパク質バリアントを発現する。ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｐＣａｓ９）からのＣａｓ９が現在最も一般的に使用されている；他のＣａｓ９タンパク質の一部は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９と高レベルの配列同一性を有し、同じガイドＲＮＡを使用する。その他は、より多様であり、異なるｇＲＮＡを使用し、異なるＰＡＭ配列を同様に認識する（ＲＮＡによって特定された配列に隣接する、タンパク質によって特定されたヌクレオチド２～５つの配列。）。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらは、大きな細菌グループからのＣａｓ９タンパク質を分類し（参照により本明細書に組み込まれる、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５、１～１２頁；２０１３）、多数のＣａｓ９タンパク質がその補足図１及びその補足表１に記載されている。それらを、参照により本明細書に組み込まれる。追加的なＣａｓ９タンパク質は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１０（１１）：１１１６～２１及びＦｏｎｆａｒａら、「Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ－ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：２５７７～９０（２０１４）に記載されている。
Ｃａｓ９は、したがって多様な種のＣａｓ９ポリペプチドを含むＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物は、本明細書に記載される技術に用いられる。Ｓ．ピオゲネス及びＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９分子が広く使用されるのに対し、本明細書に列挙される他の種のＣａｓ９タンパク質の、それに由来するか、又はそれに基づくＣａｓ９分子は、技術の実施形態に使用される。したがって、技術は、Ｓ．ピオゲネス及びＳ．サーモフィルスのＣａｓ９並びにＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物の、例えば下記のような他の種からのＣａｓ９及びＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物による置換えを提供する：
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 細菌
３０３２２９４６６ ヴェイロネラ・アティピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａ）ＡＣＳ－１３４－Ｖ－Ｃｏｌ７ａ
３４７６２５９２ フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティイ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）
３７４３０７７３８ フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）ＡＴＣＣ３５８９６
３２０５２８７７８ ソロバクテリウム・モーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）Ｆ０２０４
２９１５２０７０５ コプロコッカス・カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）ＧＤ－７
４２５２５８４３ トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ３５４０５
３０４４３８９５４ ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１６４０
２２４５４３３１２ カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）ＤＳＭ１５８９７
２４３７９８０９ ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９
１５６７５０４１ ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＦ３７０
１６８０１８０５ リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃｌｉｐ１１２６２
１１６６２８２１３ ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ－９
３２３４６３８０１ スタフィロコッカス・シュードインテルメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＥＤ９９
３５２６８４３６１ アシダミノコッカス・インテスティニ（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｉ）ＲｙＣ－ＭＲ９５
３０２３３６０２０ オルセネラ・ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）ＤＳＭ７０８４
３６６９８３９５３ オエノコッカス・キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）ＤＳＭ１７３３０
３１０２８６７２８ ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）Ｓ１７
２５８５０９１９９ ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ
３００３６１５３７ ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＪＶ－Ｖ０３
１６９８２３７５５ フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）ＡＴＣＣ２９３２８
４７４５８８６８ マイコプラズマ・モビーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）１６３Ｋ
２８４９３１７１０ マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）Ｆ株
３６３５４２５５０ マイコプラズマ・オビニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＣ０１
３８４３９３２８６ マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）ＰＧ１４
７１８９４５９２ マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）５３
２３８９２４０７５ ユーバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）ＡＴＣＣ３３６５６
１１６６２７５４２ ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９
３１５１４９８３０ エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＴＸ００１２
３１５６５９８４８ スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）Ｍ２３５９０
１６０９１５７８２ ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）ＤＳＭ３９９１
３３６３９３３８１ ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｏｒｑｕｅｎｓ）
３１０７８０３８４ イリオバクター・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）ＤＳＭ２９２６
３２５６７７７５６ ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）８
１８７７３６４８９ アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５
１１７９２９１５８ アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）１１Ｂ
１８９４４０７６４ ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＤＪＯ１０Ａ
２８３４５６１３５ ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）Ｂｄ１
３８２３２６７８ コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ＮＣＴＣ１３１２９
１８７２５０６６０ エルシミクロビウム・ミニュータム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）Ｐｅｉ１９１
３１９９５７２０６ ニトラティフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）ＤＳＭ１６５１１
３２５９７２００３ スフェロヘータ・グロブス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）Ｂｕｄｄｙ株
２６１４１４５５３ フィブロバクター・スクシノゲネス亜種スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）
６０６８３３８９ バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＮＣＴＣ９３４３
２５６８１９４０８ カプノサイトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）ＤＳＭ７２７１
９０４２５９６１ ロードシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＢｉｓＢ１８
３７３５０１１８４ プレボテラ・ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）Ｆ０４３８
２９４６７４０１９ プレボテラ・ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）２３
３６５９５９４０２ フラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）ＡＴＣＣ４９５１２
３１２８７９０１５ アミノモナス・ポーシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１２２６０
８３５９１７９３ ロドスピリルム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）ＡＴＣＣ１１１７０
２９４０８６１１１ カンジダタス・プニセイスピリラム・マリナム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）ＩＭＣＣ１３２２
１２１６０８２１１ ベルミネフロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）ＥＦ０１－２
３４４１７１９２７ ラルストニア・シジギイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）Ｒ２４
１５９０４２９５６ ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）ＤＦＬ１２
２８８９５７７４１ アゾスピリラム種（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ）Ｂ５１０
９２１０９２６２ ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）Ｘ１４
１４８２５５３４３ ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ）ＢＴＡｉ１
３４５５７７９０ ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ１７４０
２１８５６３１２１ カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ）
２９１２７６２６５ ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）１２１９８
２２９１１３１６６ バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）Ｒｏｃｋ１－１５
２２２１０９２８５ アシドボラックス・エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）ＴＰＳＹ
１８９４８５２２５ 未培養テルマイト（Ｔｅｒｍｉｔｅ）グループ１
１８２６２４２４５ クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｄ株
２２０９３０４８２ クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｈ１０
１５４２５０５５５ パルビバキュラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳ－１
２５７４１３１８４ ロセブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）Ｌ１－８２
２１８７６７５８８ ナイセリア・メニンギティディスＺ２４９１
１５６０２９９２ パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）
３１９９４１５８３ スッテレラ・ワズワーテンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）３１
２５４４４７８９９ ガンマプロテオバクテリウム（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５
５４２９６１３８ レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｐａｒｉｓ株
３３１００１０２７ パラスッテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）ＹＩＴ１１８５９
３４５５７９３２ ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ１７４０
１１８４９７３５２ フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２
参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の図３、４、５も参照のこと。
一部の実施形態では、本明細書に記載される技術は、任意のＣａｓ９タンパク質（例えば、上記のもの）及びそれらの対応するガイドＲＮＡ又は適応可能な他のガイドＲＮＡに由来するＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質の使用を包含する。ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９ ＣＲＩＳＰＲ１システムからのＣａｓ９は、ヒト細胞において機能することが示されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９頁を参照のこと。）。追加的に、Ｊｉｎｅｋは、Ｓ．サーモフィルス及びＬ．イノキュアからのＣａｓ９オルソログが、二重Ｓ．ピオゲネスｇＲＮＡによってガイドされて、標的プラスミドＤＮＡを切断することができることをインビトロで示した。
一部の実施形態では、本技術は、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９タンパク質（ｓｐＣａｓ９）を、細菌にコードされたもの、又は哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたもののいずれかとして含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に使用されるＣａｓ９は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列と少なくともおよそ５０％同一、例えば、以下の配列（配列番号９）と少なくとも５０％同一である。
Figure 2023539117000007
Figure 2023539117000008
Figure 2023539117000009
Figure 2023539117000010
一部の実施形態では、技術は、配列番号９によって記載されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列とおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列の使用を含む。
一部の実施形態では、本明細書に使用されるＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質のＣａｓ９部分は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一、例えば、配列番号９と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である。
一部の実施形態では、ＲＮＰのポリペプチド（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）は、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣａｓ様タンパク質である。本明細書に使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」、「Ｃａｓ９タンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、及び「Ｃａｓ様タンパク質」という用語には、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる。）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、それらのホモログ、又はそれらの改変体（例えば、ＢＥ２７バリアントの、これらのＣａｓタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、及び／又は当技術分野において公知のＣａｓ様タンパク質のいずれかとの融合物を含む。）として当技術分野において公知のタンパク質の、又はそれらとして当技術分野において公知の遺伝子によってコードされるタンパク質の、ポリペプチド、酵素活性及びこれらのタンパク質と類似の活性を有するポリペプチドが含まれる。
実施形態では、技術は、ＢＥ２７バリアントとの融合物を提供するためのＣｐｆ１又はＣ２ｃ１又はＣ２ｃ２などのポリペプチド（例えば、Ｖ型／ＶＩ型タンパク質）、並びにＣｐｆ１又はＣ２ｃ１又はＣ２ｃ２などのＶ型／ＶＩ型タンパク質のホモログ及びオルソログの使用を含む。実施形態は、Ｃｐｆ１、改変Ｃｐｆ１（例えば、Ｃｐｆ１－ＢＥ２７バリアント融合物）、及びＣｐｆ１、並びにＣｐｆ１、改変Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１－ＢＥ２７バリアント融合物）、及びキメラＣｐｆ１に関するＣＲＩＳＰＲシステムを包含する。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１又はＣ２ｃ１又はＣ２ｃ２などのポリペプチド（例えば、Ｖ型／ＶＩ型タンパク質）は、例えば、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラティフラクター、スタフィロコッカス、パルビバキュラム、ロセブリア、ナイセリア、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム、スフェロヘータ、ラクトバチルス、ユーバクテリウム、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）；リステリア、パルディバクター（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ、バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レトスピラ（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルフォナトロナム（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピトゥトゥス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）である属からのものである。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１又はＣ２ｃ１又はＣ２ｃ２などのポリペプチド（例えば、Ｖ型／ＶＩ型タンパク質）は、例えば、Ｓ．ミュータンス、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、Ｓ．ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス、Ｎ．テルガルクス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、Ｎ．ゴノレー（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；Ｃ．ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、又はＣ．ソルデリ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）である生物からのものである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７９０，４９０号を参照のこと。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物は、Ｃｐｆ１タンパク質を含み、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８０１５５７１６号に記載されるように用いられる。
一部の実施形態では、配列番号９との差異は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５、１～１２頁；２０１３（例えば、その補足図１及び補足表１）；Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ １１月；１０（１１）：１１１６～２１及びＦｏｎｆａｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）４２（４）：２５７７～２５９０頁に示される配列の配列アラインメントによって特定された場合の非保存領域中にある。
したがって、一部の実施形態では、ＲＮＰのＣａｓ９部分のポリペプチドは天然ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＲＮＰのＣａｓ９部分のポリペプチドは、天然ポリペプチドではない（例えば、キメラポリペプチド、例えば、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、挿入を含む操作核酸によって産生された１つ以上のアミノ酸置換によって改変された天然ポリペプチド）。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるＲＮＰ複合体のポリペプチド及びＲＮＡ構成要素のもの。）を選択、設計、合成、及び分析することは、２つ以上のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列における類似性及び差異を特定するための配列アラインメント方法の使用を含む。２つの配列の同一性パーセントを決定するために、配列が、最適比較の目的でアラインメントされる（最適アラインメントへの必要に応じて、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入され、比較目的で非相同配列は無視され得る）。比較目的でアラインメントされる参照配列の長さは、少なくとも５０％である（一部の実施形態では、参照配列の長さの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は１００％。）。次いで、対応する位置でヌクレオチド又は残基が比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチド又は残基によって占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
配列の比較及び２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（参照により本明細書に組み込まれる、（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４～４５３頁。）を使用して、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ ６２スコア行列をギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５で使用して決定される。他の方法は、当技術分野において公知であり、例えば、本明細書の他の箇所に記載される通りである。
一部の実施形態では、ＲＮＰは、Ｃａｓ９又はＣａｓ９誘導体、例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物であるタンパク質を含む。したがって、一部の実施形態では、タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼドメインを部分的に除去するように操作されている（例えば、「デッド型Ｃａｓ９」又は「Ｃａｓ９ニッカーゼ」；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９～４０２頁（２０１４）を参照のこと。）。一部の実施形態では、ＲＮＰタンパク質は、Ｓ．ピオゲネスシステム以外のＣＲＩＳＰＲシステムからのタンパク質、例えば、Ｖ型Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、若しくはＣ２ｃ３タンパク質、又は前述のうち１つの誘導体である。
一部の実施形態では、ＲＮＰのポリペプチドは、キメラ又は融合ポリペプチド、例えば、２つ以上の機能的ドメイン（例えば、Ｃａｓ９及びＢＥ２７バリアントドメイン）を含むポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＲＮＡと相互作用（例えば、結合）して、ＲＮＰ（上記）を形成する。ＲＮＡは、ポリペプチドを標的ＤＮＡ内の標的配列（例えば、染色体配列又は染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、クロロプラスト配列など）へとガイドする。したがって、一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、標的ＤＮＡと結合する。
キメラ又は融合ポリペプチドは、少なくとも２つの部分、例えば、ＲＮＡ結合部分及び「活性」部分（例えば標識）を含む。キメラ又は融合ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラ又は融合ポリペプチドは、改変及び／又は天然ポリペプチド配列（例えば、改変又は非改変Ｃａｓ９タンパク質からの第１のアミノ酸配列；及びＣａｓ９タンパク質以外の第２のアミノ酸配列、例えば、ＢＥ２７バリアントドメイン。）を含み得る。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、天然ポリペプチドである。一部の実施形態では、キメラポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、天然分子ではない（例えば、天然ポリペプチドに対して、例えば、置換、欠失、及び／又は挿入によって改変されている。）。一部の実施形態では、目的の天然ＲＮＡ結合部分は、当技術分野において公知の、例えば、本明細書に述べられる、ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９及び類似のポリペプチド）に由来する。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドのＲＮＡ結合部分は、本明細書に記載されるポリペプチドのＲＮＡ結合部分と少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９８％、少なくともおよそ９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、本明細書に提供されるＣａｓ９アミノ酸配列の一部分と少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＲＮＡ結合部分に加えて、キメラポリペプチドは、「活性部分」、例えば、ＢＥ２７バリアントドメインを含む。
ｇＲＮＡは、第１のセグメント（本明細書において「ＤＮＡ標的付けセグメント」又は「ＤＮＡ標的付け配列」とも称される）及び第２のセグメント（本明細書において「タンパク質結合セグメント」又は「タンパク質結合配列」とも称される）を含む。
ｇＲＮＡのＤＮＡ標的付けセグメントは、標的ＤＮＡ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。言い換えると、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的付けセグメントは、ハイブリダイゼーション（例えば、相補性塩基対合）を介して標的ＤＮＡと配列特異的に相互作用する。このように、ＤＮＡ標的付けセグメントのヌクレオチド配列は、変動する場合があり、ＤＮＡ標的付けＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的付けセグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするために、改変され得る（例えば、遺伝子操作によって）。
ＤＮＡ標的付けセグメント（例えば、ＤＮＡ標的付け配列及び一部の実施形態では追加的な核酸を含む。）は、およそ８ヌクレオチド～およそ１００ヌクレオチド長を有することができる。例えば、ＤＮＡ標的付けセグメントは、およそ１２ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ８０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、又はおよそ１２ｎｔ～およそ１９ｎｔ長を有し得る。例えば、ＤＮＡ標的付けセグメントは、およそ１９ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ４５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ６０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ７０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ８０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ９０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ１００ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ４５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ６０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ７０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ８０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ９０ｎｔ長、又はおよそ２０ｎｔ～およそ１００ｎｔ長を有し得る。
一部の実施形態では、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的付け配列）は、少なくともおよそ１２ｎｔ長を有し得る。例えば、標的ＤＮＡの標的配列と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列は、少なくともおよそ１２ｎｔ長、少なくともおよそ１５ｎｔ長、少なくともおよそ１８ｎｔ長、少なくともおよそ１９ｎｔ長、少なくともおよそ２０ｎｔ長、少なくともおよそ２５ｎｔ長、少なくともおよそ３０ｎｔ長、少なくともおよそ３５ｎｔ長又は少なくともおよそ４０ｎｔ長を有し得る。例えば、標的ＤＮＡの標的配列と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列は、およそ１２ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ８０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ４５ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、およそ１２ｎｔ～およそ１９ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ４５ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ１９ｎｔ～およそ６０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ４５ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、又はおよそ２０ｎｔ～およそ６０ｎｔ長を有し得る。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的付け配列）は、少なくともおよそ１２ｎｔ長を有し得る。
追加的な実施形態では、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的付け配列）は、およそ８ヌクレオチド～およそ３０ヌクレオチド長を有し得る。例えば、ＤＮＡ標的付けセグメントは、およそ８ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ３０ｎｔ長、およそ８ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ８ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ８ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、およそ８ｎｔ～およそ１８ｎｔ長、およそ８ｎｔ～およそ１５ｎｔ長、又はおよそ８ｎｔ～およそ１２ｎｔ長、例えば、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、又は１２ｎｔ長を有し得る。
一部の実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列は、８～２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列と相補的であるＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列は、９～１２ヌクレオチド長である。
ＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の連続する７ヌクレオチドにわたり１００％である。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、連続するおよそ２０ヌクレオチドにわたり少なくとも６０％である。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の連続する１４ヌクレオチドにわたり１００％であり、残りにわたっては０％と低い。このような場合、ＤＮＡ標的付け配列は、１４ヌクレオチド長とみなすことができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的付けセグメントのＤＮＡ標的付け配列と標的ＤＮＡの標的配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’側の連続する７ヌクレオチドにわたり１００％であり、残りにわたっては０％と低い。このような場合、ＤＮＡ標的付け配列は、７ヌクレオチド長とみなすことができる。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物、又はＣａｓ９様タンパク質－ＢＥ２７バリアント融合物と相互作用する。ｇＲＮＡは、上述のＤＮＡ標的付けセグメントを介して、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列へとガイドする。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチド配列を含む２つのセグメントを含む。タンパク質結合セグメントの相補性ヌクレオチドは、ハイブリダイズして、二重鎖ＲＮＡ二本鎖を形成する。
ｄｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。ｄｇＲＮＡの２つのＲＮＡ分子の各々は、２つのＲＮＡ分子の相補性ヌクレオチドはハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントの二重鎖ＲＮＡ二本鎖を形成するように、互いに相補的であるセグメントを含む。
一部の実施形態では、アクティベーター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示されるアクティベーター－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ、又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり少なくともおよそ６０％同一である。例えば、アクティベーター－ＲＮＡ（又はアクティベーター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）の二本鎖形成セグメントは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つ又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり、少なくともおよそ６０％同一、少なくともおよそ６５％同一、少なくともおよそ７０％同一、少なくともおよそ７５％同一、少なくともおよそ８０％同一、少なくともおよそ８５％同一、少なくともおよそ９０％同一、少なくともおよそ９５％同一、少なくともおよそ９８％同一、少なくともおよそ９９％同一、又は１００％同一である。
一部の実施形態では、ターゲター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示されるターゲター－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つ又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり、少なくともおよそ６０％同一である。例えば、ターゲター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメント（又はターゲター－ＲＮＡの二本鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示されるｃｒＲＮＡ配列の１つ又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり、少なくともおよそ６５％同一、少なくともおよそ７０％同一、少なくともおよそ７５％同一、少なくともおよそ８０％同一、少なくともおよそ８５％同一、少なくともおよそ９０％同一、少なくともおよそ９５％同一、少なくともおよそ９８％同一、少なくともおよそ９９％同一、又は１００％同一である。
２分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）に含まれ得るヌクレオチド配列の非限定的な例には、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示される配列、又は参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示される任意の配列と対合するその相補体、又はハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントを形成することができるその相補体のいずれかが含まれる。
単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、互いに相補的であり、介在ヌクレオチド（「リンカー」又は「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合的に連結され、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二重鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成し、したがってステム－ループ構造をもたらす、ヌクレオチドの２つのセグメント（ターゲター－ＲＮＡ及びアクティベーター－ＲＮＡ）を含む。ターゲター－ＲＮＡ及びアクティベーター－ＲＮＡは、ターゲター－ＲＮＡの３’末端及びアクティベーター－ＲＮＡの５’末端を介して共有結合的に連結され得る。あるいは、ターゲター－ＲＮＡ及びアクティベーター－ＲＮＡは、ターゲター－ＲＮＡの５’末端及びアクティベーター－ＲＮＡの３’末端を介して共有結合的に連結され得る。
単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡのリンカーは、およそ３ヌクレオチド～およそ１００ヌクレオチド長を有し得る。例えば、リンカーは、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ９０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ８０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ７０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ６０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ５０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ４０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ３０ｎｔ長、およそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ２０ｎｔ長又はおよそ３ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ１０ｎｔ長を有し得る。例えば、リンカーは、およそ３ｎｔ～およそ５ｎｔ長、およそ５ｎｔ～およそ１０ｎｔ長、およそ１０ｎｔ～およそ１５ｎｔ長、およそ１５ｎｔ～およそ２０ｎｔ長、およそ２０ｎｔ～およそ２５ｎｔ長、およそ２５ｎｔ～およそ３０ｎｔ長、およそ３０ｎｔ～およそ３５ｎｔ長、およそ３５ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ４０ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ５０ｎｔ～およそ６０ｎｔ長、およそ６０ｎｔ～およそ７０ｎｔ長、およそ７０ｎｔ～およそ８０ｎｔ長、およそ８０ｎｔ～およそ９０ｎｔ長、又はおよそ９０ｎｔ～およそ１００ｎｔ長を有し得る。一部の実施形態では、単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡのリンカーは４ｎｔである。
例示的な単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補性セグメントを含む。一部の実施形態では、単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（又はセグメントをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補性セグメントのうち１つは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示されるアクティベーター－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ、又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり少なくともおよそ６０％同一である。例えば、単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補性セグメントの１つ（又はセグメントをコードするＤＮＡ）は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号４３１～５６２として示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つ、又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり少なくともおよそ６５％同一、少なくともおよそ７０％同一、少なくともおよそ７５％同一、少なくともおよそ８０％同一、少なくともおよそ８５％同一、少なくともおよそ９０％同一、少なくともおよそ９５％同一、少なくともおよそ９８％同一、少なくともおよそ９９％同一、又は１００％同一である。
一部の実施形態では、単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡのヌクレオチドの２つの相補性セグメント（又はセグメントをコードするＤＮＡ）の１つは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示されるターゲター－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列の１つ、又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのセグメントにわたり少なくともおよそ６０％同一である。例えば、単一分子ＤＮＡ標的付けＲＮＡ（又はセグメントをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補性セグメントのうちの１つは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号に配列番号５６３～６７９として示されるｃｒＲＮＡ配列のうちの１つ、又はその相補体と、連続する少なくとも８ヌクレオチドのストレッチにわたり少なくともおよそ６５％同一、少なくともおよそ７０％同一、少なくともおよそ７５％同一、少なくともおよそ８０％同一、少なくともおよそ８５％同一、少なくともおよそ９０％同一、少なくともおよそ９５％同一、少なくともおよそ９８％同一、少なくともおよそ９９％同一、又は１００％同一である。
ｓｇＲＮＡ及びｄｇＲＮＡの両方に関して、技術は、特にＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造が保存されているので、Ｃａｓ９及びＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物を用いて配列特異性を有する標的核酸にＲＮＰを送達するように機能する天然ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡと広範囲の同一性（およそ少なくとも５０％の同一性）を共有する人工ヌクレオチド配列を含む。したがって、ＤＮＡ標的付けＲＮＡの天然タンパク質結合ドメインのＲＮＡ折畳み及びＲＮＡ二次構造に関する情報及びモデリングは、人工タンパク質結合ドメイン（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのいずれかにおけるもの。）を設計するためのガイダンスを提供する。非限定的な例として、機能的人工ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、ＲＮＡの天然ＤＮＡ標的付けセグメントのタンパク質結合セグメントの構造に基づいて設計され得る（例えば、ＲＮＡ二本鎖に沿って同じ又は類似の数の塩基対を含むもの、及び天然ＲＮＡに存在するものと同じ又は類似の「バルジ」領域を含むもの。）。任意の種からの任意の天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対について、構造は、当業者によって容易に産生され得；したがって、一部の実施形態では、人工ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、所与の種からのＣａｓ９（又は関連Ｃａｓ９）を使用する場合に、その種についての天然構造を模倣するように設計される。したがって、一部の実施形態では、適切なＤＮＡ標的付けＲＮＡは、天然ＤＮＡ標的付けＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造を模倣するように設計されたタンパク質結合ドメインを含む、人工的に設計されたＲＮＡ（非天然ＲＮＡ）である。例示的な実施形態では、タンパク質結合セグメントは、およそ１０ヌクレオチド～およそ１００ヌクレオチド長を有し；例えば、タンパク質結合セグメントは、およそ１５ヌクレオチド（ｎｔ）～およそ８０ｎｔ長、およそ１５ｎｔ～およそ５０ｎｔ長、およそ１５ｎｔ～およそ４０ｎｔ長、およそ１５ｎｔ～およそ３０ｎｔ長又はおよそ１５ｎｔ～およそ２５ｎｔ長を有する。
核酸は、多様なコンピュータツール、例えば、核酸のためのベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びタンパク質の比較配列分析のためのＡｌｉｇｎＸを使用して分析及び設計することができる。さらに、ＲＮＡ構造及び折畳みのインシリコモデリングは、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージアルゴリズムを使用して行うことができ、ＲＮＡ二次構造及び折畳みモデルは、それぞれＲＮＡｆｏｌｄ及びＲＮＡｃｏｆｏｌｄを用いて予測し、ＶＡＲＮＡを用いて視覚化することができる。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｎｍａｎ（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５、１０９０；Ｈｏｆａｃｋｅｒ及びＳｔａｄｌｅｒ（２００６）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２、１１７２；並びにＤａｒｔｙ及びＰｏｎｔｙ（２００９）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５、１９７４を参照のこと。
したがって、本明細書に記載される場合、一部の実施形態では、技術は、ポリペプチド及び１つ以上のＲＮＡを含むＲＮＰを含む、及び／又はその使用を含む、方法、システム、キット、組成物、反応混合物、使用などを提供する。一部の実施形態では、ＲＮＡは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と相補性（例えば、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９８．５、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９、又は１００％相補性）であるセグメント（例えば、６～１０個のヌクレオチドを含む、例えば、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを含む。）を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の配列番号４３１～６８２（例えば、配列番号４３１～５６２）に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つと連続する少なくとも８ヌクレオチドにわたり少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列（例えば、足場配列、例えば、ポリペプチドと相互作用する（例えば結合する）配列。）を含むセグメントを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の配列番号５６３～６８２に示されるヌクレオチド配列のうちいずれか１つと連続する少なくとも８ヌクレオチドにわたり少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列（例えば、足場配列、例えば、ポリペプチドと相互作用する（例えば結合する）配列。）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７００５１３１２号の配列番号１～２５６及び７９５～１３４６として示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸７～１６６又は７３１～１００３と少なくともおよそ７５％アミノ酸同一であるアミノ酸配列を含むセグメントを含む。
一部の実施形態では、技術は、Ｃａｓ９及びＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物と類似のメカニズムにより機能するＲＮＡ標的付けタンパク質（例えば、Ｃａｓ１３及びＣａｓ１３－ＢＥ２７バリアント融合物）の使用を含む。標的付けゲノムＤＮＡに加えて、Ｃａｓ９及び他のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３）はまた、ｇＲＮＡによって方向付けられたＲＮＡを標的付ける（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｂｕｄａｙｙｅｈら（２０１７）「ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３」Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２８０を参照のこと。）。したがって、一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞におけるＲＮＡ転写物及び非コードＲＮＡを編集するためのＣａｓ９又は他のＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＶＩ型ＲＮＡガイドＲＮＡ標的付けＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター（例えば、Ｃａｓ１３）、Ｃｐｆ１など）がＢＥ２７バリアントドメインと融合されたものと複合体化する。したがって、一部の実施形態では、技術は、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物又はＲＮＡ標的付けＣａｓ１３－ＢＥ２７バリアント融合物と複合体化されたガイドＲＮＡを使用して、ＲＮＡを標的付けることに関する。
ドナー核酸
一部の実施形態では、技術は、ドナー核酸、例えばＤＮＡ分子の使用を含む。一部の実施形態では、ドナー分子は、ドナーからの配列でＤＳＢを「修復する」ためのＨＤＲに関与する。このように、ＣＲＩＳＰＲは、標的部位で特定の核酸配列の標的付け挿入を行うために、例えば、ノックイン（ＫＩ）を産生するために用いられる。
一部の実施形態では、ドナー核酸は二重鎖である。一部の実施形態では、ドナー核酸は単鎖である。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、線状分子（例えば、プラスミドＤＮＡなどの環状分子ではない。）である。
ドナーＤＮＡ分子は、任意の所望の配列を有し得る。一部の実施形態では、ドナー核酸は、標的座位にノックインすべき核酸を含む部分を含む（例えば、一部の実施形態では、ドナー核酸は、挿入配列を含む部分を含む。）。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の少なくとも一方の末端の最も３’側のヌクレオチドはＣである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の１つだけの末端の最も３’側のヌクレオチドはＣである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の少なくとも１つの末端の最も３’側のヌクレオチドはＧである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の１つだけの末端の最も３’側のヌクレオチドはＧである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の少なくとも１つの末端の最も３’側のヌクレオチドはＡである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の１つだけの末端の最も３’側のヌクレオチドはＡである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の少なくとも１つの末端の最も３’側のヌクレオチドはＴである。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子の１つだけの末端の最も３’側のヌクレオチドはＴである。
一部の実施形態では、線状ドナー（例えば、ＤＮＡ）分子は、１０～１０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の範囲（例えば、１５～５００、２０～５００、３０～５００、３３～５００、３５～５００、４０～５００、４５～５００、５０～５００、１５～２５０、２０～２５０、３０～２５０、３３～２５０、３５～２５０、４０～２５０、４５～２５０、５０～２５０、１５～１５０、２０～１５０、３０～１５０、３３～１５０、３５～１５０、４０～１５０、４５～１５０、５０～１５０、１５～１００、２０～１００、３０～１００、３３～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、１５～５０、２０～５０、３０～５０、３３～５０、３５～５０、４０～５０、又は４５～５０ｎｔ）を有する。一部の実施形態では、線状ドナー核酸は、１Ｋｂｐ以上（例えば、１～１０Ｋｂｐ（例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０Ｋｂｐ）の長さを有する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象線状ドナーＤＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標識（例えば、上に定義されるもの、例えば、ビオチン標識、蛍光色素など。）を含む。
一部の実施形態では、線状ドナーＤＮＡ分子は、３’－オーバーハングを含む。例えば、一部の実施形態では、線状ドナーＤＮＡ分子は、１～６ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１～５ｎｔ、１～４ｎｔ、１～３ｎｔ、１～２ｎｔ、２～６ｎｔ、２～５ｎｔ、２～４ｎｔ、２～３ｎｔ、３～６ｎｔ、３～５ｎｔ、３～４ｎｔ、４～６ｎｔ、４～５ｎｔ、５～６ｎｔ、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、又は６ｎｔ）の範囲の長さを有する３’－オーバーハングを含む。一部の実施形態では、線状ドナーＤＮＡ分子は、３’－オーバーハングを有しない。したがって、一部の実施形態では、線状ドナーＤＮＡ分子は、０～６ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、０～５ｎｔ、０～４ｎｔ、０～３ｎｔ、０～２ｎｔ、０～１ｎｔ、１～６ｎｔ、１～５ｎｔ、１～４ｎｔ、１～３ｎｔ、１～２ｎｔ、２～６ｎｔ、２～５ｎｔ、２～４ｎｔ、２～３ｎｔ、３～６ｎｔ、３～５ｎｔ、３～４ｎｔ、４～６ｎｔ、４～５ｎｔ、５～６ｎｔ、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、又は６ｎｔ）の範囲の長さを有する３’－オーバーハングを含む。
ＲＮＰの合成及び組立て並びにＲＮＰの送達
一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、インビトロで合成、精製、及び組み立てられる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、インビトロで転写される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、デノボで化学合成される。一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、インビトロ転写されたか、又はデノボ合成された単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びインビトロで合成、精製、及び折畳みされたタンパク質を使用してインビトロで組み立てられる。
一部の実施形態では、発現システム（例えば、発現ベクター及び適切な発現宿主を含むもの）は、ＲＮＰのポリペプチド及び／又はＲＮＡを産生することに用いられる。数多くの適切な発現ベクターが当業者に公知であり、多くが市販されている。以下のベクターが、真核宿主細胞についての例として提供される、例えば、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合するならば、任意の他のベクターが、使用され得る。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６～５４４頁を参照のこと。）。
一部の実施形態では、タンパク質は、単一のポリペプチド（例えば、完全ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）として提供される。一部の実施形態では、タンパク質は、複数のポリペプチドとして、例えば、２つの部分、３つの部分などとして提供されるスプリットＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質として提供される。
一部の実施形態では、ＲＮＰは、生きた生物への投与のためにナノ粒子として提供される。
一部の実施形態では、ＲＮＰは、ヌクレオフェクション、細胞透過性ペプチド、ウイルス小胞、細胞表面トンネリングタンパク質、超音波、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ナノ粒子、金又は他の金属粒子、脂質粒子、リポソーム、ウイルス形質導入、ウイルス粒子、細胞－細胞融合、弾道学、マイクロインジェクション、及びエキソソーム取入れに関係する技術又は組成物を使用して細胞内に送達される。
一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、核に進入するようにＲＮＰを方向付けるために核局在シグナル（ＮＬＳ）、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、タンパク質（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物）は、例えば、インポーチンによる、例えば、細胞核へのポリペプチドの搬入を促進するための、インポーチンベータ結合（ＩＢＢ）ドメイン配列を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｔｔ及びＣｉｎｇｏｌａｎｉ（２０１１）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８１３（９）：１５７８～９２を参照のこと。）。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を発現する細胞に導入される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（例えば、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｒｃｒＲＮＡを含む。）は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を安定的に発現している細胞に導入される。一部の実施形態では、標識ｓｇＲＮＡが、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を安定的に発現している細胞に導入される。
遺伝子編集ヌクレアーゼ（ＧＥＮ）
一部の実施形態では、技術は、例えば、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮなどであるＧＥＮが１つ以上のＢＥ２７バリアントドメインと融合されたものを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物の使用を含む。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、又はＺＦＮは、複数のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個以上のＢＥ２７バリアントドメイン）と融合されている。一部の実施形態では、ポリペプチドは、遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮなど。）及び連続的に、例えば縦列に配列された複数のＢＥ２７バリアントドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上のリンカー配列（例えば、複数のＢＥ２７バリアントドメインのうち１つ以上を分離している。）によって分離された複数のＢＥ２７バリアントドメインと融合された遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮなど。）を含む。
一部の実施形態では、技術は、ＤＳＢでのＲＡＤ５１の組立てを促進及び／又は安定化して、ＨＤＲの速度をさらに改善するためのＴＡＬＥＮ－ＢＥ２７バリアントを含む、及び／又はその使用を含む、組成物、方法、キット、使用、反応混合物、及びシステムを含む。特に、一部の実施形態では、技術は、ＦｏｋＩが、本明細書に記載される１つ以上のＢＥ２７バリアントドメインにより置き換えられたＴＡＬＥＮを含む。
ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質及び活性は、標的付けられた遺伝子の機能的ノックアウトを導くことができる、ゲノム内のＤＳＢの生成に効率的であるか、又はいくつかの種においてゲノム内の特異的座位（ＫＩ）にＤＮＡ配列を組み入れるために使用される（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｌｓｏｎら（２０１２）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＴＡＬＥＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９（４３）：１７３８２～８７；Ｃｌａｒｋら（２０１１）「Ａ ＴＡＬＥ ｏｆ ｔｗｏ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｓｓｅｓ？」Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ８（３）：１４７～４９を参照のこと。）。ＣＲＩＳＰＲタンパク質によるＤＳＢの産生と同様に、ＮＨＥＪ及びＨＤＲは、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮによって産生されたＤＳＢを修復するように機能する。さらにＮＨＥＪにおいて、切断末端は、相同テンプレートの必要なしに直接ライゲートされ、したがって、標的付け部位に一般に予測不可能な挿入又は欠失（インデル）をもたらす。ＨＤＲは、相同なドナーテンプレートが存在する場合、ＮＨＥＪに追加して起こる場合があり、正しい修復又はノックイン事象をもたらす。ＺＦＮ及びＣａｓ９は、ウサギにおいてＫＯを産生するために使用されている（例えば、それぞれ本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇら（２０１４）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６（１）：９７～９９頁；Ｙａｎｇら（２０１３）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ－ＩＩＩ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｂｂｉｔｓ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ（８１）：ｅ５０９５７を参照のこと。）。Ｃａｓ９システムを使用するＫＯ率は、インビトロで１０～１００％、インビボで３２．１～８３．３％の範囲であった（同上）。しかし、ＨＤＲの頻度は、ＮＨＥＪの頻度よりもずっと低いように見える。何ら介入なしに、ノックイン事象の数に対するインデル事象の数によって計算されたＨＤＲ／ＮＨＥＪ比は、ウサギシステムで１０％未満であり、これは、他の種における報告と一致した。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚらは、２０１４年にヒトＥＳ及びｉＰＳ細胞においてＨＤＲ率が２～３％であり、それに対してインデル率が１３～４９％であると報告した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕら（２０１４）「Ｔｈｅ ｉＣＲＩＳＰＲ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５４６：２１５～２５０頁を参照のこと。）。同様に、あるマウスの研究では、ＮＨＥＪ媒介遺伝子編集は２８～５０％であり、一方で、ＨＤＲ媒介ノックインは１０％未満であった（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇら（２０１３）「Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｃｅｌｌ １５３（４）：９１０～９１８頁）。まとめると、ＨＤＲ事象は、ＮＨＥＪ事象の１／３又はさらにより低い率で起きる。
このような低いノックイン率は、いくつかの生物医学研究応用においてカスタマイズ可能なヌクレアーゼシステム（例えば、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓ９、及びＺＦＮ）の幅広い適用についてのボトルネックの問題になっている。それは、信頼できる疾患モデル化及び遺伝子修正のために、配列に特異的変化が導入される必要があることが多いからである。遺伝子付加療法のためであっても、このような付加が場所及びコピー数制御されることが望ましく、これは、ＲＯＳＡ２６又は類似のセーフ・ハーバー座位へのノックインによって実証されている。したがって、ＴＡＬＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄに融合されたＴＡＬＥＮ。）、ＴＡＬＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を使用する方法、ＴＡＬＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含むキット、及びＴＡＬＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含むシステムが、本明細書に提供される。したがって、ＺＦＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄと融合されたＺＦＮ。）、ＺＦＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を使用する方法、ＺＦＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含むキット、及びＺＦＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含むシステムもまた、本明細書に提供される。
方法
一部の実施形態では、本明細書に提供される技術は、例えば、細胞（例えば、生きた細胞、例えば、生きた初代細胞）において、標的ＤＮＡを遺伝子編集する（例えば、ノックインを生成する）ための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、標的をＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物と接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡをＲＮＰ複合体（「標的付け複合体」）と接触させることを含み、この複合体は、ＤＮＡ標的付けＲＮＡ及びＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）、及び標的座位に挿入するための核酸を含むドナー核酸を含む。一部の実施形態では、ドナー核酸は、標的部位と相補的な核酸（「相同アーム」）によって隣接される標的座位に挿入するための核酸を含む標的付けベクター及び／又は単鎖核酸である。
一部の実施形態では、小さな挿入（例えば、およそ５０ｂｐ未満（例えば、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、又は２塩基対））の挿入又は単一点変異（例えば、１ｎｔ又は１ｂｐ）を導入するために、技術は、単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドの、ドナー核酸（例えば、標的細胞へのトランスフェクションのためのもの）としての使用を含む。一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、小さな挿入又は点変異に隣接する標的部位とおよそ１００～１５０ｂｐの同一性及び／又は高い相同性を含み、したがって、変異の各端に隣接している各「相同アーム」におよそ５０～７５ｂｐを提供している。一部の実施形態では、大きな挿入（例えば、およそ５０ｂｐ、およそ１００ｂｐ、およそ１０００ｂｐ以上よりも大きいものを含む挿入又は欠失）を導入するために、プラスミドは、典型的にはドナー核酸として使用される。一部の実施形態では、大きな挿入を導入するために、およそ３００～８００ｂｐを含む２つの相同アームが所望の挿入又は変異に隣接する。一部の実施形態では、このようなプラスミドドナーのサイズは、およそ５Ｋｂｐである（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ １５４（６）：１３７０～１３７９頁、２０１３を参照のこと）。一部の実施形態では、８００ｂｐ長である相同アームが、１Ｋｂｐ断片の効率的なノックインのために使用される。
一部の実施形態では、ドナー構築物は、線状核酸の形態で細胞内に導入されるか、又は細胞内で切断されて線状核酸を産生する。一部の実施形態では、これは、細胞内に核酸を導入するために適した任意の方法によって送達される。例えば、ドナー構築物は、トランスフェクション、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、遺伝子銃の使用、ＤＮＡベクター輸送体の使用、及び微粒子銃（例えば、粒子衝突）を含む、当技術分野において公知の多様な手段によって細胞内に導入することができる（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｕら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３－９６７頁；Ｗｕ及びＷｕ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１～１４６２４頁；並びにＷｉｌｌｉａｍｓら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６～２７３０頁を参照のこと。）。受容体媒介ＤＮＡ送達アプローチもまた、使用することができる（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｉｅｌら、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７～１５４頁；並びにＷｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９～４４３２頁）。
本明細書に述べられる場合、ＤＮＡ標的付けＲＮＡ及びポリペプチド（ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物））は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的であるヌクレオチド配列を含むことによってＲＮＰ複合体に対する標的特異性を提供する。ＲＮＰ複合体のポリペプチド（ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物））は、部位特異的活性を提供する。一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、標的ＤＮＡ中にＤＳＢを産生する。標的ＤＮＡは、例えば、インビトロのネイキッドＤＮＡ、インビトロ細胞中の染色体ＤＮＡ、インビボ細胞中の染色体ＤＮＡなどであり得る。
一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、ＤＮＡ標的付けＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補性領域によって定義される標的ＤＮＡ配列で、標的ＤＮＡ中にＤＳＢを産生する。一部の実施形態では、ポリペプチドがＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）である場合、部位特異的ヌクレアーゼ活性は、（ｉ）ＤＮＡ標的付けＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。）の両方によって決定される場所で、標的ＤＮＡ中にＤＳＢを産生する。一部の実施形態では（例えば、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９又は近縁のＣａｓ９が使用される場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＸＧＧ－３’であり、式中、Ｘは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の直接３’側である。このように、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’－ＣＣＹ－３’であり、式中、Ｙは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の直接５’側である。一部のこのような実施形態では、Ｘ及びＹは相補的であり得、Ｘ－Ｙ塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｘ＝Ｃ及びＹ＝Ｇであり；Ｘ＝Ｇ及びＹ＝Ｃであり；Ｘ＝Ａ及びＹ＝Ｔであり、Ｘ＝Ｔ及びＹ＝Ａである。）。一部の実施形態では、ＲＮＰは、ＰＡＭ配列についての必要性を有しない。
一部の実施形態では、方法は、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント。）をインビトロ産生する段階を含む。一部の実施形態では、方法は、核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、１種以上のｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及び／又はｓｇＲＮＡをインビトロ産生する段階を含む。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＡを折畳む及び／又は組み立てる（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを折畳み及び／又はアニールする；ｓｇＲＮＡを折畳みする；ｄｇＲＮＡを折畳み及び／又はアニールする）段階を含む。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＰ複合体、例えば、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物））及び１種以上のＲＮＡ分子を含むＲＮＰをインビトロで組み立てる段階を含む。一部の実施形態では、方法は、細胞（例えば、生きた細胞、例えば、生きた初代細胞）内にＲＮＰを導入する段階を含む。
一部の実施形態では、同じ標的ＤＮＡ又は異なる標的ＤＮＡ上の異なる核酸配列を同時に改変（例えばノックインによる）して、例えば、マルチプレックス方法を提供するために、複数のＤＮＡ標的付けＲＮＡ及び／又は複数のＲＮＰが同時に使用される。一部の実施形態では、２種以上のＤＮＡ標的付けＲＮＡは、同じ遺伝子又は転写物又は座位を標的付ける。一部の実施形態では、２種以上のＤＮＡ標的付けＲＮＡは、異なる無関係の座位を標的付ける。一部の実施形態では、２種以上のＤＮＡ標的付けＲＮＡは、異なるが、関連する座位を標的付ける。
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント。）は、タンパク質として直接提供される。一部の実施形態では、核酸は、細胞内に導入され、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント。）は、細胞中の核酸から発現される。非限定的な一例として、真菌（例えば、酵母）は、スフェロプラスト形質転換を使用して外因性タンパク質、核酸、及び／又はＲＮＰ複合体により形質転換され得る（各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｗａｉら、Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０年１１～１２月；１（６）：３９５～４０３頁、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」；及びＴａｎｋａら、Ｎａｔｕｒｅ．２００４年３月１８日；４２８（６９８０）：３２３～８：「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｒｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ」を参照のこと。）。したがって、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント。）、核酸（例えば、ＲＮＡ）、及び／又はＲＮＰは、スフェロプラスト内に組み込むことができ、スフェロプラストは、ＲＮＰを酵母細胞内に導入するために使用することができる。ＲＮＰは、任意の好都合な方法によって細胞内に導入する（細胞に提供する）ことができ；このような方法は、当業者に公知である。別の非限定的な例として、ＲＮＰは、細胞内、例えば、ヒト細胞、ゼブラフィッシュ胚の細胞、受精マウス卵母細胞の前核などに直接注射することができる。
一部の実施形態では、方法は、標的細胞（例えば、真核細胞）内に１種以上の核酸（例えば、対象ドナーＤＮＡ分子、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸など）を導入することを含む。細胞内に核酸を導入する方法は、当技術分野において公知であり、任意の好都合な方法が使用され得る（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、注射、ウイルスベクターなど。）。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子は、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物も含む組成物の状態で細胞内に導入される。
ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物をコードするヌクレオチドを含む１種以上の核酸が使用される場合、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物をコードする配列は、コドン最適化され得る。任意の適切なＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物をコードする配列は、コドン最適化され得る。非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞であるならば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（又はそのバリアント）をコードするマウスコドン最適化ヌクレオチド配列が適切である。コドン最適化は必要ないものの、それは、許容され、ある特定の場合に好ましい場合がある。
一部の実施形態では、上記核酸のうち１種以上が組換え発現ベクター中に提供される。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７８，３８７号を参照のこと。）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などである。
適切な発現ベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９、１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４、１９９９；Ｌｉ及びＤａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４、１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７、１９９９；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４；及びＷＯ９５／００６５５を参照のこと。）；アデノ随伴ウイルス（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６、１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１、１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３、１９９７；Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０、１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８、１９９９；Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４、１９９６；ＳｒｉｖａｓｔａｖａのＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２～３８２８頁；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４～１６５頁；及びＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３～１０６１７頁を参照のこと。）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３、１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６、１９９９を参照のこと。）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）；その他に基づくウイルスベクター）が含まれるが、それに限定されない。
数多くの適切な発現ベクターが、当業者に公知であり、多くが市販されている。以下のベクターは、例として提供される。例えば、真核宿主細胞について、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。しかし、任意の他のベクターは、それが宿主細胞と適合性であるならば、使用され得る。
利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクター中に使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６～５４４頁を参照のこと。）。
一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物をコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び／又は原核細胞（例えば、細菌又は古細菌細胞）のいずれかにおいて、例えば、接触させる段階の前にＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が単離／精製される場合に、機能性であり得る。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方においてＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。
適切な真核プロモーター（真核細胞において機能するプロモーター）の非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復配列（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉからのものが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲内である。一部の実施形態では、プロモーターは、所望のレベルの発現（例えば、オフターゲット効果を低減しながら所望の目標を達成するために、例えば、一部の実施形態では、可能な限り高く、一部の実施形態では、所望の閾値を超えるか、又は下回るもの。）を達成するために選択される。発現ベクターはまた、翻訳開始及び転写ターミネーターのためのリボソーム結合部位を含有し得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するために適した配列を含み得る。発現ベクターにはまた、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質と融合された１種以上のタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードし、したがって１種以上のキメラポリペプチドをもたらすヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、構成性プロモーターに作動可能に連結される。
宿主細胞内に核酸を導入する方法は、当技術分野において公知であり、細胞内に核酸（例えば発現構築物）を導入するために任意の公知の方法が使用され得る。適切な方法には、例えば、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介核酸送達（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｎｙａｍら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２を参照のこと。）、その他が含まれる。
細胞
本明細書に提供される技術の一部の実施形態では、技術は、有糸分裂又は有糸分裂後細胞において核酸をインビボ及び／又はエクスビボ及び／又はインビトロで（例えば、ノックインにより）改変するために用いられる。ＤＮＡ標的付けＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズすることによって特異性を提供するので、目的の有糸分裂及び／又は有糸分裂後細胞には、任意の生物からの細胞（例えば、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガジターナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッスム・パテンス（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．アガルディ（Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）、その他）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）からの細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）からの細胞、哺乳動物からの細胞、げっ歯動物からの細胞、ヒトからの細胞など）が含まれ得る。
任意の種類の細胞に関心がもたれ得る（例えば、幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚細胞）；体細胞（例えば、線維芽、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞）；任意の胚期のインビトロ又はインビボ胎児胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞期などのゼブラフィッシュ胚など）。細胞は、樹立された細胞株からであってもよく、また、それらは、初代細胞であり得、「初代細胞」、「初代細胞株」、及び「初代培養物」は、対象に由来し、限られた培養継代回数（例えば「分割」）の培養の間にインビトロ増殖可能であった細胞及び細胞培養物を指すために、本明細書において互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、又は１５回であるが、クライシスステージ（ｃｒｉｓｉｓ ｓｔａｇｅ）を通過するには不十分な回数継代された場合がある培養物である。典型的には、本技術の初代細胞株は、１０回未満の継代の間インビトロで維持される。標的細胞は、多くの実施形態で単細胞生物であるか、又は培養で増殖される。
一部の実施形態では、初代細胞は、個体から任意の好都合な方法によって得られる。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって好都合に得られる場合があり、それに対し、組織、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などからの細胞は、生検によって最も好都合に得られる。得られた細胞の分散又は懸濁に適した溶液が使用され得る。このような溶液は、一般に、５～２５ｍＭの低濃度の許容される緩衝液と共にウシ胎児血清又は他の天然因子を好都合に補充した、一般に、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液などである。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などが含まれる。細胞は、直ちに使用される場合があるか、又は細胞は、長期間保管、凍結され、解凍されて、再利用が可能であり得る。このような場合、細胞は通常、１０％ ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝媒、又は細胞をこのような凍結温度で保存するために当技術分野において一般に使用されるようないくつかの他のこのような溶液中で凍結され、凍結された培養細胞を解凍するために当技術分野において一般に公知の様式で解凍される。
試料
一部の実施形態では、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、染色体、遺伝子、遺伝子座位、遺伝子マーカーなど）は、タンパク質、脂質、及び非標的核酸などの多様な他の構成要素を含有する生体試料から得られ、それに由来し、かつ／又はそれから単離される。一部の実施形態では、試料は、動物、植物、細菌、古細菌、真菌、又は任意の他の生物から得られた多様な物質（例えば、細胞物質（生細胞又は死細胞）、細胞外物質、ウイルス物質、環境試料（例えば、メタゲノム試料）、合成物質（例えば、アンプリコン、例えば、ＰＣＲ又は他の温度サイクル若しくは等温増幅技術によって提供されるもの。））から得られ、かつ／又はそれを含み、かつ／又はそれに由来する若しくはそれから調製される。本技術に使用するための生体試料には、ウイルス粒子又はその調製物が含まれる。一部の実施形態では、試料は、生物から直接、又は生物から得られた生体試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、毛髪、汗、涙、皮膚、羊水、及び組織（例えば、臍帯組織）から得られる。例示的な試料には、全血、リンパ液、血清、血漿、口腔細胞、汗、涙、唾液、痰、毛髪、皮膚、生検、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、精液、膣排泄物、漿液、滑液、心膜液、腹水、胸膜液、漏出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞便試料、及びスワブ、吸引液（例えば、骨髄、細針など）、洗浄液（例えば、口腔、鼻咽頭、気管支、気管支肺胞、眼、直腸、腸、膣、表皮など）、及び／又は他の検体が含まれるが、それに限定されない。
法医学標本、アーカイブ標本、保存された標本、及び／又は長期間保管された標本、例えば、新鮮凍結、メタノール／酢酸固定、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本及び試料を含む任意の組織又は体液標本が、本技術に使用するための試料又は試料の起源として使用され得る。特定の実施形態では、試料は、初代細胞培養物又は細胞株などの培養細胞を含む。一部の特定の実施形態では、試料は、生きた初代細胞を含む。
一部の実施形態では、試料（例えば、細胞又は組織）は、ウイルス又は他の細胞内病原体に感染する。試料はまた、非細胞起源、例えば増幅／単離された核酸（例えば、一部の実施形態では、冷凍庫に保管されたもの。）から単離することができる。
技術の一部の実施形態では、技術は、インビボ、エクスビボ、及び／又はインビトロで適用される。一部の実施形態では、技術は、例えば、試料を対象又は患者から除去せずに、インサイチューの試料に使用される。一部の実施形態では、試料は、粗試料、最小限の処理をされた細胞溶解物、又は生物学的液体溶解物である。
キット
一部の実施形態では、技術は、核酸を改変する（例えば、核酸中にノックインを生成する）ためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント）を含む。一部の実施形態では、キットは、１つ以上のＢＥ２７バリアントドメイン（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ）と融合されたＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、及び／又はメガヌクレアーゼを含むＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含む。
一部の実施形態では、キットは、ａ）ＤＮＡ標的付けＲＮＡが：ｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；及びｉｉ）ポリペプチドと相互作用して本明細書に記載されるＲＮＰを形成する第２のセグメントを含む、ＤＮＡ標的付けＲＮＡ又はＤＮＡ標的付けＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；並びに任意選択的に、ｂ）緩衝剤を含む。一部の実施形態では、キットは、１種以上の追加的な試薬をさらに含み、このような追加的な試薬は、緩衝剤；洗浄緩衝剤；対照試薬；対照発現ベクター又はＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡからのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合ポリペプチドのインビトロ産生のための試薬；その他から選択することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、核への増強又は改善した局在（例えば輸送）を提供するドメイン（例えば、ＮＬＳ、ＩＢＢなど）をさらに含む。一部の実施形態では、キットの構成要素は、別個の容器内にあり；一部の実施形態では、キットの１つ以上の構成要素は、単一の容器内に組み合わされる。さらに、一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、例えば、使用者による使用のための１つ以上の容器中にパッケージされた、本明細書に記載される１種以上の組成物を含む。さらに、一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含み得る。
本開示は、本明細書に記載される方法を実行するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及び／又はＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む。一部の実施形態では、キットは、線状ＤＮＡ分子（例えば、ドナー分子）をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、１種以上の追加的な試薬をさらに含み得、このような追加的な試薬は、例えば、希釈緩衝剤；再構成溶液；洗浄緩衝剤；対照試薬；対照発現ベクター又はＲＮＡポリヌクレオチド；ＤＮＡからのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質のインビトロ産生のための試薬、その他から選択することができる。対象キットの構成要素は、同一又は異なる容器中に（任意の所望の組合せで）あり得る。
上述の構成要素のうち１つ以上を含む実施形態に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して本明細書に記載される方法を実施するための説明書をさらに含み得る。方法を実施するための説明書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、基材、例えば紙又はプラスチックなどに印刷され得る。このように、説明書は、キット中に添付文書として、キット又はその構成要素の容器のラベル（例えば、パッケージング又はサブパッケージングに伴うもの。）などに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスク、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。なお他の実施形態では、実際の説明書は、キット中に存在せず、遠隔入手源から、例えばインターネットを介して、説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書が閲覧され得る、及び／又は説明書がダウンロードされ得る、ウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、適切な基材に記録される。
システム
技術の一部の実施形態は、核酸を改変する（例えば、ノックインを生成する。）ためのシステムを提供する。本技術によるシステムは、例えば、ポリペプチド（例えば、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物（例えば、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物）及び／又はその改変バリアント）を含む。一部の実施形態では、システムは、ＲＮＡ（例えば、ｄｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）を含む。関連する実施形態は、インビトロシステムを使用して本明細書に記載のポリペプチド及び／又はＲＮＡを産生するための発現システム（例えば、ポリペプチド及び／又はＲＮＡをコードする核酸；及び１つ以上の発現宿主を含むもの。）を提供する。一部の実施形態では、システムは、ＲＮＰ複合体の組立てのためのインビトロシステムをさらに含む。一部の実施形態は、試料、試薬、及び核酸をＲＮＰで改変するための他の組成物を輸送するための流体取扱い（例えば、一部の実施形態では微少流体技術）構成要素を含む。一部の実施形態は、流体保管及び廃液保管のための構成要素を含む。一部の実施形態では、１つ以上の構成要素は、システムにキットの形態で提供される。
一部の実施形態では、システムは、細胞（例えば、培養細胞、初代細胞、例えば、対象から得られた試料中の細胞。）を含む。例えば、一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されるＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物を含む細胞を含む。特定の実施形態では、システムは、細胞、ポリペプチド、及び１種以上のＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態は、コンピュータ及びコンピュータが実行するための命令をコードするソフトウェアを含む。例えば、一部の実施形態は、本技術の実施形態が実装され得るコンピュータシステムを含む。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、情報を通信するためのバス又は他の通信機構及び情報を処理するためのバスと結合されたプロセッサを含む。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、バスと結合された、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他のダイナミック記憶デバイスであり得るメモリ、及びプロセッサによって実装されるべき命令を含む。メモリはまた、プロセッサによって実装されるべき命令の実行の間にテンポラリ変数又は他の中間情報を記憶するために使用することができる。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、静的情報及びプロセッサのための命令を記憶するための、バスに結合された読出し専用メモリ（ＲＯＭ）又は他の静的記憶デバイスをさらに含み得る。磁気ディスク又は光学ディスクなどの記憶デバイスが提供され、情報及び命令を記憶するためにバスに結合され得る。
様々な実施形態では、コンピュータシステムは、バスを介して、コンピュータ使用者に情報を表示するための、陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのディスプレイに結合される。英数字及び他のキーを含む入力デバイスは、情報及びコマンド選択をプロセッサに通信するためにバスに結合され得る。別の種類のユーザ入力デバイスは、指示情報及びコマンド選択をプロセッサに通信するため、及びディスプレイ上のカーソルの動きを制御するためのマウス、トラックボール、又はカーソル方向キーなどのカーソル制御である。この入力デバイスは、典型的には、第１の軸（例えば、ｘ）及び第２の軸（例えば、ｙ）の２つの軸で２自由度を有し、デバイスが平面内の位置を特定できるようにする。
コンピュータシステムは、本技術の実施形態を実施することができる。本技術のある特定の実装と一致して、結果は、プロセッサがメモリ内に含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行することに応答して、コンピュータシステムによって提供され得る。このような命令は、記憶デバイスなどの別のコンピュータ可読媒体からメモリ内に読み出すことができる。メモリ内に含まれる命令の配列の実行は、プロセッサに、本明細書に記載される方法を実行させることができる。あるいは、本教示を実装するためのソフトウェア命令の代わりに、又はそれと組み合わせて、ハードワイヤード回路網が使用され得る。したがって、本技術の実装は、ハードウェア回路網及びソフトウェアの任意の特定の組合せに限定されない。
例えば、技術の一部の実施形態は、コンピュータソフトウェア及び／又はコンピュータハードウェアを伴う（例えば、それに実装される。）。一態様では、技術は、メモリの形態、算術及び論理演算を実行するための要素、並びにデータを読み出し、操作し、記憶するための一連の命令（例えば本明細書に提供される方法。）を実行するための処理要素（例えば、マイクロプロセッサ）を含むコンピュータに関する。
一部の実施形態は、記憶媒体及びメモリ構成要素を含む。メモリ構成要素（例えば、揮発及び／又は不揮発メモリ）は、命令（例えば、本明細書に提供される工程の実施形態）及び／又はデータを記憶するのに用いられる。一部の実施形態は、ＣＰＵ、グラフィックスカード及びユーザインターフェース（例えば、ディスプレイなどの出力デバイス及びキーボードなどの入力デバイスを含む）のうち１つ以上もまた含むシステムに関する。
技術に伴うプログラム可能機械は、従来からの実在の技術及び開発中又は未開発の技術（例えば、量子コンピュータ、化学コンピュータ、ＤＮＡコンピュータ、光学コンピュータ、スピントロニクスに基づくコンピュータなど。）を含む。
一部の実施形態では、技術は、データを伝送するための有線式（例えば、金属ケーブル、光ファイバー）又は無線式伝送媒体を含む。例えば、一部の実施形態は、ネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、アドホックネットワーク、インターネットなど）によるデータ伝送に関する。一部の実施形態では、プログラム可能機械は、このようなネットワークにピアとして存在し、一部の実施形態では、プログラム可能機械は、クライアント／サーバ関係を有する。例えば、一部の実施形態は、例えば、クラウドコンピューティング配置で配置されたシステムを提供するために、プロセッサがシステムの１つ以上の他の構成要素から遠隔であるシステムを提供する。
一部の実施形態では、データは、コンピュータ可読記憶媒体、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリ、光学媒体、フロッピーディスクなどに記憶される。
一部の実施形態では、本明細書に提供される技術は、本明細書に記載される方法を実行することに合わせて動作する複数のプログラム可能デバイスを伴う。例えば、一部の実施形態では、複数のコンピュータ（例えば、ネットワークによって接続されたもの）は、例えば、従来のネットワークインターフェース、例えば、イーサネット、光ファイバーによる、若しくは無線ネットワーク技術によりネットワーク（プライベート、パブリック、又はインターネット）に接続された完全コンピュータ（オンボードＣＰＵ、記憶装置、電源、ネットワークインターフェースなどを有する。）に依存するクラスターコンピューティング又はグリッドコンピューティング又は一部の他の分散型コンピュータアーキテクチャの実装において、データを収集及び処理することと平行して機能し得る。
例えば、一部の実施形態は、コンピュータ可読媒体を含むコンピュータを提供する。実施形態は、プロセッサと結合されたランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。プロセッサは、メモリに記憶されたコンピュータ実装可能プログラムの命令を実行する。このようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、ＡＳＩＣ、状態機械、又は他のプロセッサを含む場合があり、カリフォルニア州サンタクララのＩｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びイリノイ州ショームバーグのＭｏｔｏｒｏｌａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のプロセッサなどのいくつかのコンピュータプロセッサのいずれかであり得る。このようなプロセッサは、プロセッサによって実行された場合、プロセッサに、本明細書に記載される段階を行わせる命令を記憶する媒体、例えば、コンピュータ可読媒体を含む又はそれと通信し得る。
コンピュータ可読媒体の実施形態には、プロセッサにコンピュータ可読命令を与えることが可能な電子、光学、磁気、又は他の記憶又は伝送デバイスが含まれるが、それに限定されない。適切な媒体の他の例には、フロッピーディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、全ての光学媒体、全ての磁気テープ若しくは他の磁気媒体、又はコンピュータプロセッサが命令を読み出すことができる任意の他の媒体が含まれるが、それに限定されない。また、有線及び無線式の両方のルータ、プライベート若しくはパブリックネットワーク、又は他の伝送デバイス若しくはチャネルを含む様々な他の形態のコンピュータ可読媒体が、命令をコンピュータに伝送又は運搬し得る。命令は、例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、Ｓｗｉｆｔ、及びＪａｖａＳｃｒｉｐｔを含む任意の適切なコンピュータプログラミング言語からのコードを含み得る。
コンピュータは、一部の実施形態ではネットワークに接続される。コンピュータはまた、マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、又は他の入力若しくは出力デバイスなどの、いくつかの外部又は内部デバイスを含み得る。コンピュータの例は、パーソナルコンピュータ、デジタルアシスタント、パーソナルデジタルアシスタント、セルラー電話、携帯電話、スマートフォン、ポケットベル、デジタルタブレット、ラップトップコンピュータ、インターネット機器、及び他のプロセッサに基づくデバイスである。一般に、本明細書に提供される技術の態様に関係するコンピュータは、本明細書に提供される技術を含む１つ以上のプログラムをサポートすることが可能な任意のオペレーティングシステム、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、ｍａｃＯＳ（登録商標）、ＮｅＸＴＳＴＥＰ（登録商標）などで動作する任意の種類のプロセッサに基づくプラットフォームであり得る。一部の実施形態は、他のアプリケーションプログラム（例えば、アプリケーション）を実行するパーソナルコンピュータを含む。アプリケーションは、メモリ中に含まれる場合があり、例えば、文書処理アプリケーション、表計算アプリケーション、電子メールアプリケーション、インスタントメッセンジャーアプリケーション、プレゼンテーションアプリケーション、インターネットブラウザーアプリケーション、カレンダ／オーガナイザーアプリケーション、及びクライアントデバイスによって実行可能な任意の他のアプリケーションを含み得る。
技術に伴うと本明細書に記載される、全てのこのような構成要素、コンピュータ、及びシステムは、論理又は仮想であり得る。
このようなコンピュータシステムによると、本明細書に提供される技術の一部の実施形態は、データを収集、記憶、及び／又は解析するための機能性をさらに含む。例えば、一部の実施形態は、例えば、命令を記憶及び実行する、データを解析する、データを使用して計算を行う、データを変換する、及びデータを記憶するための、プロセッサ、メモリ、及び／又はデータベースを含むシステムを企図している。一部の実施形態では、アルゴリズムは、データに統計モデルを当てはめる。
多くの診断法は、１種以上の核酸の存在、非存在、同一性、又はヌクレオチド配列を決定することを伴う。したがって、一部の実施形態では、複数の核酸の存在、非存在、同一性、濃度、量、又は配列特性を表す変数を含む式は、診断を行う又は核酸の存在若しくは量を評価することに用いられる値を産生する。このように、一部の実施形態では、この値は、デバイスによって、例えば、結果に関係する指標（例えば、ＬＥＤ、ディスプレイ上のアイコン、音、その他）によって提示される。一部の実施形態では、デバイスは、値を記憶する、値を伝送する、又は追加的な計算のために値を使用する。
したがって、一部の実施形態では、本技術は、遺伝学又は分子生物学の専門家ではない可能性がある臨床医が生データを理解する必要がないというさらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接提示される。次いで、臨床医は、この情報を利用して対象のケアを最適化することが可能である。本発明は、アッセイを行っている研究室、情報提供者、医療関係者、及び／又は対象に、及びそれらから、情報を受け取る、処理する、及び伝送することが可能な任意の方法を企図している。例えば、本技術の一部の実施形態では、試料は、対象から得られ、世界の任意の地域（例えば、対象が住む、又は情報が最終的に使用される国と異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設での臨床検査室、ゲノムプロファイリングビジネスなど）に提出されて、生データを生成する。試料が組織又は他の生体試料を含む場合、対象は、試料を取得させ、プロファイリングセンターに送らせるために医療センターを訪れる場合があるか、又は対象が試料自体を収集し、それをプロファイリングセンターに直接送る場合がある。試料が予め決定された生体情報を含む場合、情報は、対象によってプロファイリングサービスに直接送られ得る（例えば、情報を含む情報カードがコンピュータによってスキャンされ、データが、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピュータに伝送され得る。）。プロファイリングサービスによって受け取られた後、試料が処理され、対象について望まれる診断又は予後情報に特異的なプロファイルが産生される。次いで、プロファイルデータが、処置している臨床医による解釈に適した形態で準備される。例えば、生の発現データを用意するよりも、準備された形式は、特定の処置選択肢の推奨と共に、対象についての診断又はリスク評価を表し得る。データは、任意の適切な方法によって臨床医に表示され得る。例えば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医（例えば、臨床現場の臨床医）のために印刷すること又は臨床医に対してコンピュータモニタ上に表示することができるレポートを作成する。一部の実施形態では、情報は、臨床現場又は地域施設で最初に解析される。次いで、生データは、さらなる解析のために、及び／又は生データを臨床医若しくは患者に有用な情報に変換するために、中央処理施設に送られる。中央処理施設は、プライバシー（全てのデータは均一なセキュリティプロトコールで中央施設に記憶される。）、速度、及びデータ解析の均一性の利点を提供する。次いで、中央処理施設は、対象の処置後のデータの運命を制御することができる。例えば、電子通信システムを使用して、中央施設は、臨床医、対象、又は研究者にデータを与えることができる。一部の実施形態では、対象は、電子通信システムを使用してデータにアクセスすることが可能である。対象は、結果に基づいてさらなる介入又はカウンセリングを選択し得る。一部の実施形態では、データは、研究使用のために使用される。例えば、データは、疾患に伴う特定の状態の有用な指標としてのマーカーの包含又は排除をさらに最適化するために使用され得る。
使用
一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、任意の望ましい核酸、例えば、超らせんを形成した標的ＤＮＡ分子、染色体、染色体外エレメントなどへのドナーＤＮＡ分子の組入れに用いられる。以下の使用は、単に説明に役立つ実例であり、決して対象方法の使用を限定するつもりはない。一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、細胞外のインビトロ使用のために用いられる（例えば、プラスミドＤＮＡを改変するため、単離された染色体ＤＮＡを改変するためなど。）。一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、真核細胞の内部で（例えば、インビトロ及び／又はインビボ及び／又はエクスビボで）用いられる。一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、制御エレメント（例えば、転写制御エレメント、例えばエンハンサー、プロモーター、転写ターミネーターなど。）を挿入及び／又は改変するために使用される。一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、標的遺伝子を改変するために用いられる（例えば、場合によっては標的遺伝子の発現を破壊する、場合によっては転写されたＲＮＡを改変するなど。）。一部の実施形態では、組成物、キット、及び方法は、コード及び／又は非コード配列を改変する（例えば、遺伝子コード配列を改変する、マイクロＲＮＡなどの非コードＲＮＡをコードする配列を改変する）ために用いられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される技術は、例えば、研究、イメージング、診断学、及び患者の処置に用いられる。応用には、研究応用；診断応用；工業応用；及び処置応用が含まれる。研究応用は、例えば、細胞（例えば、生きた細胞）内の核酸を特徴付ける、検出する、改変する、及び／又は特定することを含む。本明細書に記載される技術の実施形態のさらなる使用には、以下：ゲノムイメージング；コピー数分析；生きた細胞の分析；高反復ゲノム配列又は構造の検出；複合ゲノム配列又は構造の検出；遺伝子重複又は再編成の検出；染色体標識；ゲノム欠失、重複、及び再編成に関係する疾患及び遺伝障害の大規模診断；高スループットイメージング及び／又は診断学のための複数のユニークなｓｇＲＮＡの使用；標的配列のマルチカラー分別検出；未知の原因又は起源の疾患の特定又は診断；及び細胞（例えば、生きた細胞）、組織、又は生物の四次元（例えば、タイムラプス）又は五次元（例えば、マルチカラータイムラプス）イメージングのうち１つ以上が含まれる。
細胞又は生物を改変するためのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物の使用
一部の実施形態では、技術は、細胞又は生物を改変する方法を含む。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯動物、又はマウスの細胞であり得る。細胞は、家禽、魚類、又はエビなどの非哺乳動物真核細胞であり得る。細胞はまた、植物細胞であり得る。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、又はコメなどの作物のものであり得る。植物細胞はまた、藻類、樹木、又は野菜の細胞であり得る。本技術によって細胞に導入される改変は、細胞及び細胞の子孫が、抗体、デンプン、アルコール、又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生改善のために変更されたものであり得る。本技術によって細胞に導入される改変は、細胞及び細胞の子孫が、産生された生物学的産物を変化させる変更を含むものであり得る。
技術は、１種以上の異なるベクターの使用を含み得る。技術の一部の実施形態では、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質は、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又はヒト細胞の発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ２細胞又はＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びその後の宿主内への組入れに必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現すべきポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられている。失われたウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノムへの組入れに必要なＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列だけを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐ、ＩＴＲ配列を欠くｈｕｔをコードするヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染し得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される１種以上のベクターは、非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を産生するために使用される。一部の実施形態では、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギである。トランスジェニック動物及び植物を産生するための方法は、当技術分野において公知であり、一般に、本明細書に記載されるものなどの細胞トランスフェクションの方法で開始する。別の実施形態では、針アレイを有する液体送達デバイス（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１０２３０８３９号を参照のこと。）が、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合物の固形組織への送達のために企図され得る。流体の固形組織への送達のための米国特許公開第２０１１０２３０８３９号のデバイスは、アレイ状に配置された複数の針；各々が複数の針の１つずつと流体連通する複数のリザーバ；及び複数のリザーバの１つずつに作動可能に結合され、リザーバ内の液圧を制御するように構成された複数のアクチュエータを含み得る。
一部の実施形態では、技術は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドの切断を引き起こし、それによって標的ポリヌクレオチドの改変を引き起こすために、核酸標的付け複合体に前記標的ポリヌクレオチドと結合させることを含み、核酸標的付け複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内で標的配列にハイブリダイズされたガイドＲＮＡと複合体化された核酸標的付けエフェクタータンパク質を含む。
一部の実施形態では、技術は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、核酸標的付け複合体に、ポリヌクレオチドと結合させることにより、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少をもたらすことを含み；核酸標的付け複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイドＲＮＡと複合体化された核酸標的付けエフェクタータンパク質を含む。
一部の実施形態では、技術は、真核細胞のゲノム内にポリヌクレオチドを挿入する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、核酸標的付け複合体に、ポリヌクレオチドと結合させることにより、前記結合が、標的座位での前記ポリヌクレオチドの挿入をもたらすことを含み；核酸標的付け複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイドＲＮＡと複合体化された核酸標的付けエフェクタータンパク質を含む。
本明細書における開示が、ある特定の例証された実施形態を指すものの、これらの実施形態は、例として提示されるものであり、限定として提示されるわけではないことを理解されたい。
改善された遺伝子編集のための改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が、本明細書に提供される。本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間に、実験は、改善されたＣＲＩＳＰＲ技術が、大サイズ遺伝子ノックインのＫＩ効率を増加させたことを示した。さらに、本明細書に提供される改善されたＣＲＩＳＰＲ技術は、特にオフターゲットＣＲＩＳＰＲ改変を受けがちであることが知られているいくつかの遺伝子座位（例えば、ＶＥＧＦＡ、ＥＭＸ１、及びＦＮＡＣＦ）で、オフターゲット挿入及び欠失（「インデル」）事象を低減した。本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲ技術は、一連の遺伝子編集研究及び治療応用に用いられる。
従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、ゲノム内の標的座位に二重鎖切断（ＤＳＢ）を作る。２つの主要なメカニズム、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ＤＳＢを修復するように機能する。大部分のＤＳＢは、ＮＨＥＪメカニズムによって修復される（例えば、Ｚｈｕら（２０１４）「Ｔｈｅ ｉＣＲＩＳＰＲ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５４６：２１５～２５０頁；Ｗａｎｇら（２０１３）「Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｃｅｌｌ １５３（４）：９１０～９１８頁。）。ＮＨＥＪは、相同なテンプレートを使用せずに切断末端を直接ライゲートし、そのことは、頑健で有用な遺伝子編集ツールを提供するために低い予測性又は不十分な予測性でゲノム内に挿入及び欠失（インデル）を産生する。対照的に、ＨＤＲは、相同なドナーテンプレートが存在する場合に起こり、したがって正しい修復又はノックイン事象を産生する。したがって、ＤＳＢが核酸挿入配列を含むドナーテンプレートの存在下でＨＤＲ経路によって修復される場合、挿入物のノックインが、標的座位に対する特異性の増加と共に起こる。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、並びに短い単鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートを含む、組立て済みリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の使用は、核酸修復のための単鎖アニーリング（ＳＳＡ）経路を誘導し、これは、変異を産生する精度を２桁の効率で改善することが示されている。これらの進歩にかかわらず、相同組換え（ＨＲ）経路により大型断片ドナーテンプレートをノックインするためのＣＲＩＳＰＲ技術の使用が達成した効率は、およそ１％以下であった。
ＢＥ２７のゲノム編集ヌクレアーゼ（ＧＥＮ）（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９））への融合は、レシピエントＧＥＮの有効性及び安全性プロファイルを改善する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０９１３を参照のこと。本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間に、相同組換え修復（ＨＤＲ）をモジュレートするＢＥ２７ポリペプチド中のアミノ酸が特定された。これらのアミノ酸は、１５位のセリン（Ｓ１５）及び２２位のセリン（Ｓ２２）を含む。
本明細書に記載される技術の実施形態の開発の間に、ｓｐＣａｓ９を、ＢＥ２７アミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｓ１５Ａ、Ｓ２２Ｙ、又はＳ２２Ｄをコードする核酸変異（用語「ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ」、「ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ」、及びＢＥ２７－Ｓ２２Ｄによって称される；まとめて用語「ＢＥ２７－Ａ／Ｙ／Ｄ」によって称される。）を含むＢＥ２７バリアントと融合することによって、新たなＣａｓ９バリアント（用語「Ｃａｓ９－Ａ」、「Ｃａｓ９－Ｙ」、及び「Ｃａｓ９－Ｄ」によって称される；まとめて用語「ｍｉＣａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄ」によって称される。）を構築した。
本明細書に記載される技術の実施形態の開発の間に、実験においてＣａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄを使用して収集されたデータは、オンターゲット及びオフターゲットの挿入及び欠失（インデル）事象が、精密な遺伝子編集の効率を減少させずに顕著に低い頻度で起こったことを示した。さらに、Ｃａｓ９－Ａ／Ｙ／Ｄの使用は、大サイズ遺伝子ノックイン率を増加させた。データは、例えば、ゲノム編集応用における有効性及び安全性プロファイルの増加を有するＧＥＮ－ＢＥ２７－Ａ／Ｙ／Ｄ融合タンパク質を生成するために、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、及びＢＥ２７－Ｓ２２Ｄバリアントが、二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生する活性を有する任意のＧＥＮと融合することができるユニバーサルポリペプチドを提供することを示した。
材料及び方法
ヒト線維芽細胞（Ｃａｔ＃ＣＲＬ２５２２）を、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から取得した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｃａｔ＃ＦＢＳ１８２４－００１、Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｔ＃１１８７５１１９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて細胞を培養した。ヒトＡｄ２９３細胞（Ｃａｔ＃２４００８５、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を、１０％ウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃａｔ＃１１９９５－０６５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。オリゴヌクレオチドは、ＩＤＴによって商業的に合成されたものであった。
参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０９１３に記載されたように、ＢＥ２７は、配列番号１によるアミノ酸配列を有するアミノ酸３６個のペプチドである。参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０９１３に以前に記載されたように、デッド型ｓｐＣａｓ９、リンカー配列、及びＢＥ２７を含むＣａｓ９－ＢＥ２７タンパク質融合物を産生した。Ｃａｓ９－ＢＥ２７融合物のＢＥ２７を、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄによって置き換えて、それぞれＣａｓ９－Ａ、Ｃａｓ９－Ｙ、及びＣａｓ９－Ｄを産生することによって、本明細書に記載されるＣａｓ９－ＢＥ２７バリアントを構築した。
アニールされたＤＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖をｐｈＵ６－ｓｇＲＮＡ（Ｃａｔ＃５３１８８、Ａｄｄｇｅｎｅ）内にライゲートすることによって、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを産生した。ｓｇＲＮＡ配列は、下記に提供される：
Figure 2023539117000011
 ＲＮＰ実験について、ｇＲＮＡ合成キット（Ｃａｔ＃Ａ２９３７７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｓｇＲＮＡをインビトロで転写した。
ＧＦＰコード配列及び標的配列を使用してノックインドナーテンプレートを構築した。特に、標的部位に対応する左及び右相同アームによって隣接されるＧＦＰコード配列を使用して二重鎖ＤＮＡドナーテンプレートを構築した。ＰＣＲのために５’－ビオチン改変プライマーを使用して、実験においてビオチン化ＧＦＰ発現ドナーテンプレートを産生した。「ＧＦＰ－ドナー－１ｋ－ＡＡＶＳ１」という名の二重鎖ノックインドナー核酸を産生して、配列ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号５）を有するガイドＲＮＡ（「ｓｇ－ＡＡＶＳ１」）を使用してＡＡＶＳ１遺伝子を標的付けた。左相同アームは、長さ８０４ｂｐを有し、右相同アームは、長さ８３７ｂｐを有し、ノックイン断片は長さ９８９ｂｐを有した。５’－ビオチン改変プライマーをＰＣＲのために使用して、実験においてビオチン化ＧＦＰ発現ドナーテンプレートを産生した。
チューブ型エレクトロポレーション機（モデル＃ＣＴＸ－１５００Ａ ＬＥ、Ｃｅｌｅｔｒｉｘ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用してエレクトロポレーションを行い、Ｃａｓ９エレメント（例えば、Ｃａｓ９プラスミドＤＮＡ又はＲＮＰ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレート）を細胞に送達した。２～３×１０６個の細胞をエレクトロポレーション緩衝液（Ｃａｔ＃１３－０１０４、Ｃｅｌｅｔｒｉｘ）１２０μＬ中に再懸濁した。Ｃａｓ９をプラスミドＤＮＡ形態で送達するために、Ｃａｓ９発現プラスミドＤＮＡ ４．５μｇ及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡ １．５μｇを緩衝液に添加した。Ｃａｓ９をＲＮＰ形態で送達するために、Ｃａｓ９ １０μｇをｇＲＮＡ ３．３μｇと予備混合し、緩衝液に添加した。両方の送達方法について、ノックイン実験のためにＧＦＰ発現ドナーテンプレート ４μｇ又はｓｓＯＤＮドナーテンプレート １０μｇを緩衝液に添加した。エレクトロポレーション条件は、線維芽細胞、気道上皮細胞ｉＰＳＣ、及びＡｄ２９３細胞について６２０Ｖで３０ｍｓであった。エレクトロポレーション条件は、ＨＳＣについて６３５Ｖで３０ｍｓであった。
Ｔ７ＥＩ（Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ）アッセイを、以前に記載されたように行った（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｘ．Ｘｕ、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｕｂｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８：１１６４９頁（２０１８）を参照のこと。）。完全にはマッチしていないＤＮＡ（例えば、インデル部位）は、Ｔ７ＥＩによって認識及び切断されて、電気泳動及び視覚化の際に２つの切断されたバンドを産生する。完全に（例えば、本質的に及び／又は実質的に完全に）マッチしたＤＮＡはＴ７ＥＩによって認識及び切断されず、したがって、電気泳動及び視覚化の際に１本のバンド（野生型バンド）を産生する。野生型バンドの平均の強度に対する２本の切断されたバンドの平均の強度の比をインデル効率のための量的推定として使用した。
ディープシーケンシング（ｄｅｅｐ－ｓｅｑ）及び解析のために、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃Ａ１１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｃａｔ＃Ｆ５３２Ｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び以下のヌクレオチド配列：
Figure 2023539117000012
 を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって標的付けられた領域を増幅した。
ＡＡＶＳ１－Ｆ及びＡＡＶＳ１－Ｒプライマーを使用して、ｓｇ－ＡＡＶＳ１標的座位でオンターゲットアンプリコンを産生した。Ｆ２－Ｆ及びＦ２－Ｒプライマーを使用して、ｓｇ－ＦＡＮＣＦ２標的座位でオンターゲットアンプリコンを産生した。ＶＥＧＦＡ１－Ｆ及びＶＥＧＦＡ１－Ｒプライマーを使用して、ｓｇ１－ＶＥＧＦＡ標的座位でオンターゲットアンプリコンを産生した。ＥＭＸ－ＯＴ１－Ｆ及びＥＭＸ－ＯＴ１－Ｒプライマーを使用してｓｇ－ＥＭＸ１オフターゲット座位の１つでアンプリコンを産生した。
Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル精製キット（Ｃａｔ＃２８７０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して産物を単離し、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のＣＣＩＢ ＤＮＡコア施設でシーケングした。簡潔には、ユニークなバーコードを含むＩｌｌｕｍｉｎａ適合性アダプターをライブラリー構築の間に各試料にライゲートした。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いた２×１５０運転パラメーターでのマルチプレックスシーケンシングのために等モル濃度でプールした。シーケンシング運転が完了した際に、データを解析し、デマルチプレックスし、続いて自動化デノボパイプラインに入力した。ＭＧＨ ＣＣＩＢデノボアセンブラＵｌｔｒａＣｙｃｌｅｒ ｖ１．０により解析を完了し、品質管理のために手作業で点検した。
アルゴリズムの簡単な説明は、ｄｎａｃｏｒｅ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｎｅｗ－ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｉｔｅ／ｐａｇｅｓ／ｃｒｉｓｐｒ＿ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｐａｇｅｓ／ｃｒｉｓｐｒ＿ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．ｊｓｐから入手可能である。
ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ツール（ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ．ｐｉｎｅｌｌｏｌａｂ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／）によって、．ｆａｓｔｑファイルを使用してＰＧＥ及びインデル率を決定した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋ．Ｃｌｅｍｅｎｔ、「ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７、２２４～２２６頁（２０１９）を参照のこと。
プライマー及びアンプリコン配列がＣＣＲ２での配列と高度に相同であるＣＣＲ５－ｄｅｌ３２でのＰＧＥ及びインデル率の分析のために、ＨＤＲアンプリコン配列及び野生型アンプリコン配列に対するＢｌａｓｔｎ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって．ｓｅｑファイルを分析した。
蛍光関連細胞分取（ＦＡＣＳ）によってノックイン事象を分析した。トランスフェクションの３日後に培養細胞を解離させ、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ ３００μＬ中に懸濁し、７０μｍナイロンストレーナで濾過した。ミシガン大学フローサイトメトリーコアでＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓ ＥＱｓ Ｓｏｒｔｅｒ（モデル＃Ｂ５２１０２、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して細胞をフローサイトメトリーに供した。ＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０、Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータを分析した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを遺伝子ノックイン事象の指標として使用した。
データを平均±ＳＥＭとして提示する。測定は、３つの別個の試料で行ったが、ガイド－ｓｅｑで予測された座位でのオフターゲット分析は、例外的に２～３つの別個の試料で測定を行った。対応のないｔ検定（両側）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを比較した。正確なＰ値を図に表示する。
［実施例１］ ＣＲＩＳＰＲシステムの設計
ＨＤＲ工程は、ＢＲＣＡ２が、切除されたＤＮＡオーバーハングへとＤＳＢにＲＡＤ５１を送達してＲＡＤ５１／ＤＮＡフィラメントを形成することを伴う。ＢＲＣＡ２の役割に関して、データは、ＢＲＣＡ２エクソン２７（本明細書において用語「ＢＥ２７」によって称される。）によってコードされるＲＡＤ５１結合配列がＲＡＤ５１をガイドしてＤＳＢに配置することを示している。Ｃａｓ９を含むＮ末端ドメイン及びＢＥ２７を含むＣ末端ドメインを含む融合物の構築は、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３０９１３に記載される。その後の実験において、データが収集され、それにより、ＨＤＲに重要なＢＥ２７ポリペプチド中の２つの特定のアミノ酸を同定した。これらのアミノ酸は、アミノ酸１５のセリン（Ｓ１５）及びアミノ酸２２のセリン（Ｓ２２）である。これらのアミノ酸は、ＢＥ２７アミノ酸配列中の下記のＢＥ２７アミノ酸配列に下線を付すことによって示される：
Figure 2023539117000013
 実験を行い、それにより、本明細書に記載される技術の実施形態の開発の間に構築されたＣａｓ９及び置換されたＢＥ２７ポリペプチドの融合物（Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質）を使用する遺伝子編集において改善されたＨＤＲアウトカムを産生した、これらの２つのアミノ酸での特異的アミノ酸置換が特定された。特に、本明細書に記載される技術の実施形態の開発の間に実験を行って、ＢＥ２７バリアント（例えば、ＢＥ２７－Ｓ１５Ａ、ＢＥ２７－Ｓ２２Ｙ、又はＢＥ２７－Ｓ２２Ｄ）及びＣａｓ９（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９））の融合物を産生した。ＢＥ２７バリアントのアミノ酸配列は下記に提供される：
Figure 2023539117000014
Figure 2023539117000015
ＢＥ２７バリアントを使用してＣａｓ９融合物を構築して、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄを産生した。ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合物は、Ｃａｓ９ポリペプチドであるＮ末端ドメイン及びＢＥ２７バリアントポリペプチドであるＣ末端ドメインを含む。これらの実験の間に収集されたデータは、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合物がＤＳＢでのＲＡＤ５１の効率的な沈着を提供し、したがって、ＲＡＤ５１及びＤＳＢの量並びに／又は濃度を増加させ、結果として標的座位での大きな断片挿入物のＨＤＲ媒介ノックインを改善したことを示した。
したがって、技術の実施形態は、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合タンパク質（まとめて、ｍｉＣａｓ９バリアント）を提供する。一部の実施形態では、ｍｉＣａｓ９バリアントは、Ｎ末端Ｃａｓ９ポリペプチドとＣ末端ＢＥ２７バリアントポリペプチドとの間に核局在シグナルを含む。
一部の実施形態では、技術は、例えば、ｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸、ｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸を含むベクター、ｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸を含む及び／若しくは発現している細胞、並びに／又はｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、若しくはｍｉＣａｓ９－Ｄ）を含む及び／若しくは発現している細胞を含む。一部の実施形態では、技術は、例えば、ＮＬＳを含むｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸、ＮＬＳを含むｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸を含むベクター、ＮＬＳを含むｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）をコードする核酸を含む及び／若しくは発現している細胞、並びに／又はＮＬＳを含むｍｉＣａｓ９バリアント（例えば、ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、又はｍｉＣａｓ９－Ｄ）を含む及び／若しくは発現している細胞を含む。本明細書に使用される場合、「ｍｉＣａｓ９バリアント」という用語は、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及びＮＬＳを含むＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質の両方を指す。さらに、本明細書に使用される場合、「ｍｉＣａｓ９」という用語は、本明細書に記載されるＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及びＮＬＳを含むＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質の実施形態を指すために使用され、「ｍｉＣＲＩＳＰＲ」という用語は、本明細書に記載されるＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及びＮＬＳを含むＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を使用するＣＲＩＳＰＲ技術を指すために使用される。
［実施例２］ Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質はオフターゲットインデル率を低減する
本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間に、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及びｓｇ－ＥＭＸ１ガイドＲＮＡを使用して、予測されるオフターゲット部位１で産生されたオフターゲットインデル率を、Ｔ７Ｅ１アッセイによって評価するために実験を行った。結果を図１に示す。「ＷＴ」とマークしたレーンは、Ｔ７Ｅ１アッセイによって予期される、ＷＴバンドのサイズについての陽性対照マーカーである。
図１に提供されるデータによって示されるように、ｓｐＣａｓ９は、野生型（ＷＴ）バンドの下に観察される複数のインデルバンドによって示されるような実質的なオフターゲット編集を誘導した（図１、「ｓｐＣａｓ９」と表示したレーン。）。以前に記載されたＣａｓ９－ＢＥ２７融合物は、ＷＴバンドの下のインデルバンドについて観察された強度がより低いことによって示されるように、インデル率を効果的に低減した（図１、「ｍｉＣａｓ９」と表示したレーン。）。Ｓ２２Ｅ置換を含むＢＥ２７と融合されたＣａｓ９（ｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅ）は、インデルバンドの強度を増加させ、ＢＥ２７におけるＳ２２Ｅ置換がオフターゲットインデル率を低減しないことを示唆している（図１、「ｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅ」と表示したレーン。）。しかし、その他のＣａｓ９－ＢＥ２７バリアントｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ及びｍｉＣａｓ９－Ｄは、インデルバンドの強度を顕著に低減した。特に、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ及びｍｉＣａｓ９－Ｄについてのインデルバンドの強度は、ｓｐＣａｓ９及びＣａｓ９－ＢＥ２７融合物についてのインデルバンドの強度よりもずっと低かった（図１、それぞれ「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」、「ｍｉＣａｓ９－Ａ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」と表示したレーン。）。実際に、インデルバンドは、Ｔ７１アッセイによってｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄについて検出不能であり、これは、オフターゲットインデル編集の１００％近い低減を示した。
［実施例３］ Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質はオンターゲットインデル率を低減する
次に、本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間に、Ｃａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及びｓｇ－ＦＡＮＣＦ２ガイドＲＮＡ又はｓｇ－ＶＥＧＦＡ３ガイドＲＮＡを使用して産生されたオンターゲットインデル率をＴ７Ｅ１アッセイによって評価するために実験を行った。結果を図２に示す。図２又は図３に「ＷＴ」と表示したレーンは、Ｔ７Ｅ１アッセイによって予期されるＷＴバンドのサイズについての陽性対照マーカーである。
図２及び３で提供されるデータによって示されるように、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合タンパク質は、ＦＡＮＣＦ２（図２、それぞれ「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」、「ｍｉＣａｓ９－Ａ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」と表示したレーン。）又はＶＥＧＦＡ３座位（図３、それぞれ「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」、「ｍｉＣａｓ９－Ａ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」と表示したレーン。）のどちらでも検出可能なインデルを産生しなかった。ｓｐＣａｓ９（図２及び３、「ｓｐＣａｓ９」と表示したレーン。）及びＣａｓ９－ＢＥ２７（図２及び３、「ｍｉＣａｓ９」と表示したレーン。）は、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合タンパク質によるインデル産生率よりも高い検出可能な率でインデルを産生した。これらのデータは、ＢＥ２７におけるＳ１５Ａ、Ｓ２２Ｙ、及びＳ２２Ｄ置換、並びに結果としてのｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合タンパク質が、オンターゲットインデル率を、例えば、非存在、最小限、及び／又は検出不能のレベルに顕著に低減したことを示す。
［実施例４］ Ｃａｓ９－ＢＥバリアント融合タンパク質は、大サイズ遺伝子ノックインを生成する
本明細書に提供される技術の実施形態の開発の間、ｍｉＣａｓ９－Ｙ、ｍｉＣａｓ９－Ａ、及びｍｉＣａｓ９－Ｄ融合タンパク質による大サイズ遺伝子ノックインの産生を評価するために実験を行った。結果を図４に示す。
図４において、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（％ＧＦＰ＋）を、ノックイン（ＫＩ）事象の指標として使用した。以前に記載されたＣａｓ９－ＢＥ２７は、％ＧＦＰ＋細胞に２倍よりも大きな増加を生じ（図４、「ｍｉＣａｓ９」と表示したバー。）、これは、ｍｉＣａｓ９－Ｄ、ｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅ、及びｍｉＣａｓ９－Ｙバリアントによって提供された増加に類似していた（図４、それぞれ「ｍｉＣａｓ９－Ｄ」、「ｍｉＣａｓ９－Ｓ２２Ｅ」、及び「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」と表示したバー。）。ｍｉＣａｓ９－Ａタンパク質融合物は、％ＧＦＰ＋細胞において４倍よりも大きな増加を生じることが観察された（図４、「ｍｉＣａｓ９－Ｙ」と表示したバー。）。
これらのデータは、ＢＥ２７置換Ｓ１５Ａ、Ｓ２２Ｄ、及びＳ２２Ｙが、例えば、ノックインを生成するために、二重鎖切断（ＤＳＢ）を産生するためのＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を減少させないことを示している。特に、新しいＣａｓ９－ＢＥ２７バリアント融合物（ｍｉＣａｓ９－Ａ、ｍｉＣａｓ９－Ｄ、ｍｉＣａｓ９－Ｅ、及びｍｉＣａｓ９－Ｙ）は、以前に記載されたＣａｓ９－ＢＥ２７融合タンパク質及び野生型ｓｐＣａｓ９によって産生されたＫＩ率に類似するか、又はそれよりも高いレベルにＫＩ率を増加させる。
上記明細書中で指摘される全ての刊行物及び特許は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。記載された組成物、方法、及び技術の使用の様々な改変及び変形が、記載される技術の範囲及び精神から逸脱せずに当業者に明らかである。特定の例示的な実施形態に関連して技術が記載されたものの、請求された発明がこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者に明白な、本発明を実行するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (47)

  1. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメイン及びＢＥ２７バリアントドメインを含む、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質。
  2. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメインが、ＣＲＩＳＰＲ関連システムタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質。
  3. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質。
  4. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びｘＣａｓ９からなる群から選択されるＣａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質。
  5. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメインが、ＴＡＬＥＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  6. 遺伝子編集ヌクレアーゼドメインが、ＺＦＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  7. １つのＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  8. 複数のＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  9. １～１０個のＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  10. ＢＥ２７バリアントドメインが、Ｓ１５Ａ置換を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  11. ＢＥ２７バリアントドメインが、Ｓ２２Ｙ置換を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  12. ＢＥ２７バリアントドメインが、Ｓ２２Ｄ置換を含む、請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合体。
  13. 請求項１に記載のＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を含む、組成物。
  14. ｇＲＮＡをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. ドナー核酸をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  16. 標的核酸をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  17. ドナー核酸が、１００～１０００ｂｐを含む、請求項１５に記載の組成物。
  18. ドナー核酸が、１０００～１０，０００ｂｐを含む、請求項１５に記載の組成物。
  19. ＲＡＤ５１タンパク質又はＲＡＤ５１タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  20. 複数のＲＡＤ５１タンパク質をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  21. ノックインを含む核酸をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  22. ノックインを含む核酸が、ドナー核酸の配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 標的核酸中にノックインを生成する方法であって、標的核酸をＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質と接触させることを含む、方法。
  24. 標的核酸中にノックインを生成する方法であって、標的核酸を、ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質及び標的核酸と相補的な配列を含むｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質と接触させることを含む、方法。
  25. ノックイン配列を含むドナー核酸を提供することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 細胞内にリボ核タンパク質を導入することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 細胞内にリボ核タンパク質及びドナー核酸を導入することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  28. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、Ｓ１５Ａ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  29. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、Ｓ２２Ｙ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  30. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、Ｓ２２Ｄ置換を含むＢＥ２７バリアントドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  31. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連システムタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  32. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、Ｃａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  33. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びｘＣａｓ９からなる群から選択されるＣａｓタンパク質、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  34. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、ＴＡＬＥＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  35. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質が、ＺＦＮ、その一部分、そのホモログ、又はその改変体である遺伝子編集ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２４に記載の方法。
  36. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を含む、キット。
  37. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を含む、システム。
  38. トランスジェニック細胞を産生するためのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質の使用。
  39. トランスジェニック動物を産生するためのＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質の使用。
  40. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードする、核酸。
  41. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。
  42. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を含む、細胞。
  43. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードする核酸を含む、細胞。
  44. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を発現している細胞。
  45. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードする核酸を発現している細胞。
  46. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質を発現しているトランスジェニック動物。
  47. ＧＥＮ－ＢＥ２７バリアント融合タンパク質をコードする核酸を発現しているトランスジェニック動物。
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