JP2023538418A - 腫瘍浸潤性リンパ球からの抗原特異的ＴＣＲを有するｉＰＳＣの優先的生成 - Google Patents

Abstract

がん反応性Ｔ細胞をｉＰＳＣ細胞へ再プログラムする方法、及びそのような細胞をがん抗原特異的ＴＣＲの同定及びがんの治療に利用する方法が開示される。【選択図】図２－１

Description

関連出願の相互参照
この特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０２０年８月２１日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６３／０６８，４５８号の利益を主張する。

連邦支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立がん研究所によって、プロジェクト番号Ｚ０１ＺＩＡ ＢＣ０１００７６３の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。

電子的に提出された材料の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に援用される：２０２１年８月２０日に作成された「７５５１２４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の３２，６６２バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

腫瘍浸潤リンパ球等のＴ細胞は、エクスビボで成長、増幅させることができ、例えば、メラノーマ、子宮頸がん、消化器（ＧＩ）がん、及び乳がん等のがんを治療するために対象に注入し得る。このような治療方法の例としては、養子細胞療法（ＡＣＴ）が挙げられる。しかし、多くのがん抗原（例えば、ネオアンチゲン）の対象特異的な性質から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からがん特異的ＴＣＲを同定することは困難であり得る。

更に、がん抗原に慢性的に曝露されると、Ｔ細胞、例えばＴＩＬは、最終分化し、老化し、かつアネルギー性になる場合がある。従って、そのような細胞の治療効力が減弱する可能性がある。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の再プログラミングを介したＴＩＬの若返りは、これら制約に対処することができる。しかし、Ｔ細胞集団からがん抗原特異的ｉＰＳＣを作製する従来の方法は、非効率的である場合がある。そのような方法は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８の抗体によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を活性化して、遺伝性ＴＣＲを有するｉＰＳＣにＴ細胞を確率論的に再プログラムすることを含む。しかし、そのような広範なＴＣＲ活性化によって、がん抗原特異的ＴＣＲを有しない場合であっても、Ｔ細胞が再プログラムされる場合がある。従って、Ｔ細胞を再プログラムする従来の方法は、典型的には、予め増幅され、がん抗原特異性について予めスクリーニングされたモノクローナルＴＣＲを有するＴ細胞株で始める。そのため、これら従来の方法は、困難であり、非効率的であり、かつ時間がかかる場合があり、生成されるがん抗原特異的ＴＣＲの多様性が制限される場合がある。

従って、これまでに同定されていないがん抗原特異的ｉＰＳＣ株を製造するのに好適な改善された方法、及び新規がん抗原特異的ＴＣＲを同定するために使用し得る方法が必要とされている。

本開示の態様は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞誘導多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）の単離集団を製造する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を該共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、がんを治療又は予防する方法であって、
（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
（ｂ）該ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
（ｃ）対象においてがんを治療又は予防するのに有効な量の該分化したＴ系列細胞を該対象に投与することと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、がんを有する対象におけるがんを治療又は予防するための医薬を製造する方法であって、
（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
（ｂ）該ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
（ｃ）該分化したＴ系列細胞を、該対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化することと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、がん抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
（ｂ）該ｉＰＳＣの単離集団に含まれる核酸のＲＮＡ又はＤＮＡのシーケンシングを行うことにより、がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定することと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、腫瘍抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
（ｅ）ｉＰＳＣコロニーからＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードするＤＮＡ配列を決定することと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、腫瘍抗原特異的ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のポリクローナル集団を作製する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
（ｅ）該ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
を含む方法を含む。

本開示の態様はまた、
（ａ）配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
（ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
（ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
（ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
（ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
を含む組換えＴＣＲを含む。

本開示の態様はまた、
（ａ）配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
（ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
（ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
（ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
（ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
を含むキメラＴＣＲを含む。

本開示の態様はまた、本開示の他の態様に係る組換えＴＣＲ又はキメラＴＣＲを発現する単離細胞も含む。

本発明の態様はまた、本明細書に記載の方法に従って製造されたｉＰＳＣを含む組成物も含む。

本発明の態様はまた、本明細書に記載の方法に従って製造された分化したＴ系列細胞を含む組成物も含む。

図１は、ＴＣＲ刺激の有り無しで１×１０^５個のＴ細胞に由来するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性コロニーの数を示す棒グラフである。各ドナーにつきＮ＝３。 図２Ａは、ＴＩＬが選別され、ｉＰＳＣに再プログラムされるプロセスの概略図を提供する図である。簡潔にまとめると、自己腫瘍細胞株及びＴＩＬ断片培養物を１６時間共培養し、ＣＤ３^＋ ＣＤ４^－ ＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋ ＴＩＬを選別し、４つの山中因子及びＳＶ４０ラージＴ抗原を含有するセンダイウイルスで形質導入した。２０～２１日目に細胞がドーム状のＥＳ様コロニーを形成したら、クローンとしてピックアップした。 図２Ｂは、出発細胞（バルク）及び選別されたＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋（ＤＰ）細胞における、予め同定されていた腫瘍反応性ＴＣＲの頻度を示すグラフである。 図２Ｃは、これら６つの予め同定されていたＴＣＲの濃縮解析（ＤＰ／バルクの比）を表すグラフである。 図３Ａは、腫瘍－ＴＩＬの共培養後にＣＤ３^＋ ＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋ ＴＩＬ（患者３７８４由来）を選別するために使用したＦＡＣＳゲーティング戦略を表す一連のグラフである。上図は、腫瘍細胞と共培養しなかったＴＩＬの表現型を示す。ダンプゲートは、Ｔ_ｒｅｇ細胞（ＣＤ２５）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６）、及びガンマデルタＴ細胞を除外するための異なる系統のマーカーの混合物である。 図３Ａは、腫瘍－ＴＩＬの共培養後にＣＤ３^＋ ＣＤ８^＋ ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋ ＴＩＬ（患者３７８４由来）を選別するために使用したＦＡＣＳゲーティング戦略を表す一連のグラフである。上図は、腫瘍細胞と共培養しなかったＴＩＬの表現型を示す。ダンプゲートは、Ｔ_ｒｅｇ細胞（ＣＤ２５）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６）、及びガンマデルタＴ細胞を除外するための異なる系統のマーカーの混合物である。 図３Ｂは、ＴＣＲクローンの相対頻度を示す一連の５つの棒グラフ（図３Ｂ～３Ｆ）のうちの１番目である。ＴＣＲは、バルク集団（すなわち、出発細胞）に存在し、ＴＩＬ－腫瘍細胞の共培養後の４つの選別された集団（ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^＋、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋）においてｉＰＳＣへと再プログラミングされた。共培養前の各ＴＣＲクローンのバルク頻度に対する頻度を提示する。 図３Ｃは、ＴＣＲクローンの相対頻度を示す一連の５つの棒グラフ（図３Ｂ～３Ｆ）のうちの２番目である。ＴＣＲは、バルク集団（すなわち、出発細胞）に存在し、ＴＩＬ－腫瘍細胞の共培養後の４つの選別された集団（ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^＋、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋）においてｉＰＳＣへと再プログラミングされた。共培養前の各ＴＣＲクローンのバルク頻度に対する頻度を提示する。 図３Ｄは、ＴＣＲクローンの相対頻度を示す一連の５つの棒グラフ（図３Ｂ～３Ｆ）のうちの３番目である。ＴＣＲは、バルク集団（すなわち、出発細胞）に存在し、ＴＩＬ－腫瘍細胞の共培養後の４つの選別された集団（ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^＋、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋）においてｉＰＳＣへと再プログラミングされた。共培養前の各ＴＣＲクローンのバルク頻度に対する頻度を提示する。 図３Ｅは、ＴＣＲクローンの相対頻度を示す一連の５つの棒グラフ（図３Ｂ～３Ｆ）のうちの４番目である。ＴＣＲは、バルク集団（すなわち、出発細胞）に存在し、ＴＩＬ－腫瘍細胞の共培養後の４つの選別された集団（ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^＋、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋）においてｉＰＳＣへと再プログラミングされた。共培養前の各ＴＣＲクローンのバルク頻度に対する頻度を提示する。 図３Ｆは、ＴＣＲクローンの相対頻度をＨ示す一連の５つの棒グラフ（図３Ｂ～３Ｆ）のうちの５番目である。ＴＣＲは、バルク集団（すなわち、出発細胞）に存在し、ＴＩＬ－腫瘍細胞の共培養後の４つの選別された集団（ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^－、ＰＤ１^－ ４－１ＢＢ^＋、ＰＤ１^＋ ４－１ＢＢ^＋）においてｉＰＳＣへと再プログラミングされた。共培養前の各ＴＣＲクローンのバルク頻度に対する頻度を提示する。 図４Ａは、腫瘍細胞と１６時間共培養した様々な候補ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを提示する一連のグラフである。 図４Ｂは、様々な条件における４－１ＢＢ＋細胞の百分率を示す棒グラフである。４回の独立した実験の代表的なデータを提示する：対照ＰＢＬ；導入遺伝子無し、ＧＦＰ－ＰＢＬ；ＧＦＰ形質導入、ＴＩＬ；腫瘍反応性Ｔ細胞を含有する増幅されたＴＩＬ。 図４Ｃは、ＴＩＬ－ｉＰＳＣから同定された候補ＴＣＲα及びβの対で形質導入され、腫瘍細胞と１６時間共培養されたＴ細胞のＥＬＩＳＡ ＩＦＮｇ産生アッセイをまとめたグラフである。 図５Ａは、健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の再プログラミングプロセスを表す図である：Ｔ細胞を分離し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズによって刺激し、４つの山中因子及びＳＶ４０ラージＴ抗原を含有するセンダイウイルスで形質導入した。 図５Ｂは、健常ドナーＰＢＭＣからナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＥＭＲＡ（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋）の細胞集団を選別するための戦略を表す一連の代表的なＦＡＣＳプロットである。 図５Ｃは、以下の各細胞集団の純度を確認するための選別後ゲーティングを表す一連の代表的なＦＡＣＳプロットである：ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－）、及びＥＭＲＡ（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋）。 図６は、ＴＩＬ－ｉＰＳＣのＴＣＲシーケンシング及び反応性試験の概略図を提供する図である。簡潔に述べると、ＴＩＬ－ｉＰＳＣコロニーの各皿からできる限り多くのクローンをピックアップし、培養プレートの各ウェルに入れ、増幅させ、最大３回継代し、更なる実験のために凍結させた。凍結前に約１５～２０個の個々のｉＰＳＣ株、それぞれ約１０万個の細胞をマスターチューブに一緒にプールし、ＴＣＲβのｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析のためにゲノムＤＮＡを抽出した。コロニーをピックアップした後、ゲノムＤＮＡ抽出及びＴＣＲβのｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析のためにマザーチューブから残り全てのｉＰＳＣコロニー（約６００～９００個のｉＰＳＣコロニー）もチューブに回収した。ＴＩＬ－ｉＰＳＣマスターチューブで同定されたＴＣＲの反応性を試験するために、個々のｉＰＳＣをＴＣＲアルファ及びベータのシーケンシングのために再提出し、ガンマレトロウイルスベクターにクローニングし、健常ボランティアのＰＢＬに形質導入し、４－１ＢＢアップレギュレーションアッセイ及びＥＬＩＳＡによるサイトカイン産生アッセイを介して患者の腫瘍細胞に対する反応性について試験した。 図７Ａは、患者１９１３からの腫瘍－ＴＩＬの共培養後のＣＤ３＋ ＣＤ４－ＣＤ８＋ ＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋ ＴＩＬを選別するためのＦＡＣＳゲーティング戦略を示す一連のプロットを表す一連の３つの図（図７Ａ～７Ｃ）のうちの１番目である。上図は、腫瘍細胞と共培養しなかったＴＩＬの表現型を示す。中図は、自己腫瘍細胞と１６時間共培養した後のＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の表現型発現を示す。下図は、ＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の選別後の純度を示す。 図７Ｂは、患者１９１３からの腫瘍－ＴＩＬの共培養後のＣＤ３＋ ＣＤ４－ＣＤ８＋ ＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋ ＴＩＬを選別するためのＦＡＣＳゲーティング戦略を示す一連のプロットを表す一連の３つの図（図７Ａ～７Ｃ）のうちの２番目である。上図は、腫瘍細胞と共培養しなかったＴＩＬの表現型を示す。中図は、自己腫瘍細胞と１６時間共培養した後のＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の表現型発現を示す。下図は、ＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の選別後の純度を示す。 図７Ｃは、患者１９１３からの腫瘍－ＴＩＬの共培養後のＣＤ３＋ ＣＤ４－ＣＤ８＋ ＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋ ＴＩＬを選別するためのＦＡＣＳゲーティング戦略を示す一連のプロットを表す一連の３つの図（図７Ａ～７Ｃ）のうちの３番目である。上図は、腫瘍細胞と共培養しなかったＴＩＬの表現型を示す。中図は、自己腫瘍細胞と１６時間共培養した後のＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の表現型発現を示す。下図は、ＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞の選別後の純度を示す。 図７Ｄは、患者１９１３からの選別後ＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋細胞における９つの異なるＴＣＲの濃縮（ＤＰ／バルクの比）を表す棒グラフである。

抗原特異的Ｔ細胞を選択的に再プログラムする方法が、本明細書において開示される。様々な実施形態では、再プログラムするためのＴ細胞は、腫瘍から単離された不均一なＴＩＬ集団である。本開示の態様では、例えば、腫瘍抗原との（共培養による）接触を通じたＴＣＲ刺激に続いて再プログラミング因子（例えば、４つの山中因子＋ＳＶ４０）に曝露することにより、Ｔ細胞の不均一な集団から（例えば、ＴＩＬの集団から）腫瘍反応性Ｔ細胞が優先的に再プログラムされることが見出された。様々な実施形態では、本開示は、再プログラミング因子を使用してｉＰＳＣ細胞に再プログラムされる前に、１つ以上の活性化マーカー（例えば、４－１ＢＢ及び／又はＰＤ－１）を発現するＴ細胞を選択することにより、腫瘍抗原との共培養後に活性化Ｔ細胞の集団を濃縮することを提供する。そのような方法によって、特定の腫瘍抗原に対して反応性であるＴＣＲを有する不均一な集団のＴ細胞に由来するＩＰＳＣ（Ｔ－ＩＰＳＣ）が実現されることが実証された。様々な実施形態では、本開示は、新規抗腫瘍Ｔ細胞療法を開発する方法を提供する。様々な実施形態では、そのような方法は、極めて稀な腫瘍抗原特異的ＴＣＲを含む新規抗原特異的Ｔ細胞及びＴＣＲを同定するために使用し得、それは、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）において使用するための新規の遺伝子操作されたＴＣＲを構築するために使用し得る。あるいは、本開示の様々な態様では、Ｔ－ｉＰＳＣの不均一な集団は、腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞に分化することができる。

Ｉ． Ｔ細胞誘導多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）に再プログラムするための単離Ｔ細胞
様々な実施形態では、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞誘導多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）の単離集団を生成する方法が提供される。本明細書で使用するとき、「Ｔ細胞誘導多能性幹細胞」又は「Ｔ－ｉＰＳＣ」は、抗原特異的Ｔ細胞から作製され、ＴＣＲ遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊ組換えを保持しているか又はその他の方法で元の単離Ｔ細胞のＴＣＲ特異性を保持している誘導多能性幹細胞である。

様々な実施形態では、Ｔ－ｉＰＳＣは、がんを有する対象からのサンプルから採取した単離Ｔ細胞から生成される。「単離された」という用語は、本明細書で使用するとき、例えば、非非反応性／バイスタンダー腫瘍反応性Ｔ細胞の場合、その自然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」は、本明細書で使用するとき、純度が増大したことを意味し、「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈されるものではない。例えば、純度は少なくとも約５０％であってよく、約６０％超、約７０％超、又は約８０％超、約９０％であってもよく、約１００％であってもよい。

本開示の態様は、一般に、がんを有する対象からＴ細胞を含むサンプルを提供することを含み得る。Ｔ細胞を含む任意の生体サンプルを使用してよい。態様では、生体サンプルは、腫瘍サンプル又は末梢血のサンプルである。本開示に従って使用され得る生体サンプルの例としては、限定されないが、原発性腫瘍からの組織、転移性腫瘍の部位からの組織、滲出液、胸水、腹水、分画された末梢血細胞、骨髄、末梢血バフィーコート、及び脳脊髄液が挙げられる。態様では、サンプルは、断片培養によって得られ得る。このように、生体サンプルは、吸引、生検、切除、静脈穿刺、動脈穿刺、腰椎穿刺、シャント、カテーテル処置、採血、白血球アフェレーシス、又はドレーンの配置を含むがこれらに限定されない任意の好適な手段によって得られ得る。

様々な実施形態では、本開示は、供給源からＴ細胞を単離し、該Ｔ細胞を再プログラムすることに関する。好適な供給源細胞の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が挙げられるが、これに限定されない。本明細書における方法で使用するためのＴ細胞としては、培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳類から得られたＴ細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。哺乳類から得られる場合、供給源細胞は、血液、骨髄、リンパ節、腫瘍、胸腺、脾臓、又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。また、供給源細胞は、濃縮又は精製されていてもよい。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋ＣＤ８αβ＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞等を含むが、これらに限定されない。

一実施形態では、本明細書に記載の再プログラミング方法において使用するためのＴ細胞は、ＴＩＬから単離される。本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に遊走した、元々白血球として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、及びＭ１マクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＩＬは、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方を含む。「一次ＴＩＬ」とは、本明細書で概説する患者組織サンプルから得られた（「新たに収集された」と称されることもある）ものである。幾つかの実施形態では、ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上の発現によって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ ａｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。

本開示の態様は、一般に、Ｔ細胞を含む懸濁液に腫瘍サンプルを解離させることを含み得る。態様では、腫瘍細胞は、断片培養によって得られ得る。腫瘍サンプルの解離は、例えば、線維芽細胞、腫瘍細胞、Ｔ細胞、及び他の多くの種類の細胞を含む腫瘍において通常みられる細胞の懸濁液を得るのに十分な時間及び条件下で実施してよい。腫瘍サンプルの解離は、当技術分野で公知の様々な異なる方法のいずれかで実施され得る。例えば、腫瘍サンプルは、酵素的、機械的、用手的（例えば、鋭的切開）、又は前述のいずれかの組み合わせで解離され得る。機械的解離は、例えば、ＧＥＮＴＬＥＭＡＣＳ解離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））を使用して実施し得る。

本開示の態様は、対象からサンプルを提供することを含む。特に断らない限り、本明細書で使用するとき、用語「対象」は、ウサギ等のウサギ目、ネコ及びイヌを含む食肉目、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目の哺乳類を含むがそれらに限定されない任意の哺乳類を指す。態様では、哺乳類は、例えば、霊長目、サル目（Ｃｅｂｏｉｄｓ又はＳｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の非ヒト霊長類である。幾つかの態様では、哺乳類は、マウス及びハムスター等の齧歯目の哺乳類であってもよい。態様では、哺乳類は、非ヒト霊長類又はヒトである。他の態様では、対象は、ヒトである。

本開示の態様は、がん及び／又は腫瘍を有する対象からのサンプルを提供することを含む。態様では、がんは、がん細胞を含む。態様では、がん細胞は、腫瘍細胞を含む。がんは、例えば、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、胆管細胞がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、及び膀胱がんを含む任意のがんであってよい。態様では、がんは、メラノーマ、子宮頸がん、ＧＩがん、又は乳がんである。態様では、がんは、メラノーマである。

態様では、対象は、腫瘍、例えば、固形腫瘍を有し得る。腫瘍は、対象における組織の異常で過剰な増殖に起因する腫瘤であってよい。腫瘍は、腫瘍細胞を含み得る。腫瘍は、潜在的に悪性であってもよく、悪性（すなわち、がん性）であってもよい。腫瘍は、原発性腫瘍であってもよく、転移性腫瘍であってもよい。態様では、腫瘍は、がん、例えば、本明細書に記載されるがんのいずれかに関連している。そのような態様では、腫瘍は、本明細書においてがん細胞とも称される腫瘍細胞を含む。態様では、腫瘍は、メラノーマ、子宮頸がん、ＧＩがん、又は乳がんに関連している。態様では、腫瘍は、メラノーマに関連している。

本開示の態様は、Ｔ細胞を含む対象からのサンプルを提供することを含む。本明細書で使用するとき、Ｔ細胞は、例えば、ヒトＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階のＴ細胞であってよく、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ_１及びＴｈ_２細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔｈ_９細胞、ＴＩＬ、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞等を含むがこれらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ Ｔ細胞であってよい。ナイーブＴ細胞は、その周辺部内で同種抗原に遭遇しなかった成熟Ｔ細胞である。ナイーブＴ細胞は、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）の表面発現、活性化マーカーＣＤ２５、ＰＤ－１、若しくはＣＤ６９の非存在、メモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在、並びに／又はサブユニットＩＬ－７受容体－αを含む機能的ＩＬ－７受容体、ＣＤ１２７、及び共通γ鎖、ＣＤ１３２の発現を特徴とする。態様では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。

本開示によれば、Ｔ細胞は、少なくとも１つのＴ細胞受容体すなわち「ＴＣＲ」を含み得る。ＴＣＲは、抗原、例えばＭＨＣの文脈ではがん抗原を認識し、結合する、Ｔ細胞又はＴリンパ球の表面にみられるタンパク質複合体である。Ｔ細胞は、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、若しくは約１０個のＴＣＲ、又は前述の任意の数の範囲（例えば、約１～約１０個、約２～約１０個、約１～約９個、約２～約９個等）を含み得る。ＴＣＲは、一般に、ＴＣＲのアルファ－鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＴＣＲのγ鎖、ＴＣＲのδ鎖、又はそれらの組み合わせ等の２つのポリペプチド（すなわち、ポリペプチド鎖）を含む。そのようなＴＣＲのポリペプチド鎖は、当技術分野で公知である。抗原特異的ＴＣＲは、例えば、がん抗原、腫瘍抗原、又はそれらのエピトープ等の対象となる抗原に特異的に結合し、免疫学的に認識することができる限り、任意のアミノ酸配列を含み得る。本開示の特定の態様では、ＴＣＲは、がん抗原特異的ＴＣＲであってよい。態様では、ＴＣＲは、腫瘍抗原特異的ＴＣＲであってよい。

態様では、本開示は、がん及び／又は腫瘍を有する対象からＴ細胞を含有するサンプルを提供することを含む。サンプルは、十分な量のＴ細胞が存在する任意の好適なサンプル（液体又は固体）であってよい。

方法は、Ｔ細胞をＴ細胞ではないサンプルの他の細胞から単離して、単離Ｔ細胞及びＴ細胞ではない細胞の単離集団を製造することを更に含み得る。この単離工程は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気分離（ＭＡＣ）、音響分離、及び動電分離等の、当業者に公知の任意の好適な技術を使用して達成し得る。

ＩＩ． 単離Ｔ細胞の腫瘍抗原との共培養
本開示の様々な実施形態では、単離Ｔ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造する。本明細書で使用するとき、用語「共培養されたＴ細胞」とは、少なくとも１つの腫瘍抗原の存在下において一定期間インビトロで培養されたＴ細胞を指す。様々な実施形態では、この共培養工程に続いて再プログラミングを行うと、Ｔ細胞の不均一な集団から腫瘍反応性Ｔ細胞が優先的に再プログラムされることが示されている。

共培養は、好適な期間にわたって実施してよい。態様では、共培養は、約３～７２時間進行し得る。特定の態様では、共培養は、約３～４８時間進行し得る。態様では、共培養は、約８～４８時間進行し得る。態様では、共培養は、約８～２４時間進行し得る。態様では、共培養は、約１２～２０時間進行し得る。態様では、共培養は、約１６時間進行し得る。

用語「腫瘍抗原」とは、本明細書で使用するとき、腫瘍細胞又はがん細胞によって単独で若しくは主に発現される、又は過剰に発現され、その結果、該抗原が腫瘍又はがんに関連する任意の分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物等）を指す。様々な実施形態では、腫瘍抗原は、がん抗原である。がん抗原は、更に、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞によっても発現され得る。しかし、そのような場合、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞によるがん抗原の発現は、腫瘍細胞又はがん細胞による発現ほどロバストではない。これに関して、腫瘍細胞又はがん細胞は、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞による抗原の発現と比較して、抗原を過剰発現することができる又は抗原を著しくより高いレベルで発現することができる。また、がん抗原は、更に、異なる発生又は成熟の状態の細胞によって発現され得る。例えば、がん抗原は、更に、成体宿主では通常みられない胚期又は胎生期の細胞によって発現され得る。あるいは、がん抗原は、更に、成体宿主では通常みられない幹細胞又は前駆細胞によっても発現され得る。実施形態では、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の対は、メラノーマ抗原に対する特異性を有する。

がん抗原は、本明細書に記載のがん及び腫瘍を含む、任意のがん又は腫瘍の任意の細胞によって発現される抗原であってよい。がん抗原は、１種類のみのがん又は腫瘍のがん抗原であってよく、その結果、がん抗原は１種類のみのがん又は腫瘍に関連するか又はそれを特徴とする。あるいは、がん抗原は、１種類を超えるがん又は腫瘍のがん抗原であってもよい（例えば、特徴としてもよい）。例えば、がん抗原は、乳がん細胞及び前立腺がん細胞の両方によって発現し得、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん細胞によっては全く発現し得ない。がん抗原は、当技術分野において公知であり、例えば、ＣＸｏｒｆ６１、メソテリン、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＡＧ－３としても知られている）、ＭＡＥ－１、ＭＡＧＥ－３等が挙げられる。

本開示の態様では、がん／腫瘍抗原は、がん／腫瘍ネオアンチゲンである。ネオアンチゲンとは、がん特異的変異によってコードされている免疫原性の変異したアミノ酸配列である。ネオアンチゲンは、正常細胞、非がん性細胞によっては発現せず、対象に固有のものであり得る。ネオアンチゲンに対する抗原特異性を有するＴ細胞を用いたＡＣＴは、対象に「個別化」された療法を提供し得る。

様々な実施形態では、単離Ｔ細胞は、腫瘍抗原を含むペプチドプールと共培養される。ペプチドプールは、抗原特異的なＴ細胞集団を刺激し、Ｔ細胞応答について研究するために、当技術分野において日常的に使用されている。例えば、Ｓｕｎｅｅｔｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，３４２（１－２）：３３－４８を参照。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍抗原を発現することができる生体サンプルの存在下で共培養される。様々な実施形態では、生体サンプルは、がん及び／又は腫瘍を有する同一の対象から単離される。様々な実施形態では、単離Ｔ細胞は、該腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される。様々な実施形態では、単離Ｔ細胞は、自己腫瘍細胞と共培養される。様々な実施形態では、単離Ｔ細胞は、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される。様々な実施形態では、単離Ｔ細胞は、腫瘍細胞株と共培養される。

がん細胞を含む任意の生体サンプル、例えば、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される生体サンプルのいずれかを使用することができる。生体サンプルは、当業者に公知の任意の好適な方法によって得ることができる。そのような方法としては、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の態様によれば、第２のサンプル中のがん細胞を単離して、単離がん細胞を製造し得る。がん細胞を単離する方法は、当技術分野において公知である。この単離工程は、例えば、ＦＡＣＳ、磁気分離（ＭＡＣ）、音響分離、及び動電分離等の、当業者に公知の任意の好適な技術を使用して達成し得る。

本開示の態様では、単離されたがん細胞及び／又は腫瘍細胞は、単離Ｔ細胞と共培養される。適切な細胞培養技術は、当業者に周知である。Ｔ細胞とその自己の単離されたがん／腫瘍細胞との共培養は、例えば、任意の好適な細胞培養培地で細胞を培養することを含み得る。開示される方法において有用であり得る細胞培養培地の例としては、Ｔ細胞の培養に通常使用されるものが挙げられ、例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清を挙げ得る。細胞培養培地は、種々の添加剤のいずれかを更に含んでいてもよい。例えば、細胞培養培地は、１つ以上の抗体及び／又は１つ以上のサイトカインを更に含んでいてもよい。態様では、細胞培養は、サイトカインの非存在下で進行し得る。細胞培養は、任意の好適な容器（複数可）において実施し得る。例えば、細胞培養は、マルチウェルプレート、例えば、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、又は３８４ウェルプレートで実施してよい。

態様では、Ｔ細胞をがん細胞及び／又は腫瘍細胞と共培養すると、共培養されたＴ細胞が製造される。次いで、共培養されたＴ細胞をスクリーニングして、がん反応性Ｔ細胞、すなわち、がん抗原に特異的な少なくとも１つのＴＣＲを有するＴ細胞を同定し得る。

ＩＩＩ． 活性化Ｔ細胞集団の濃縮
様々な実施形態では、より多くの腫瘍反応性Ｔ－ｉＰＳＣが得られる確率を更に高めるために、腫瘍抗原との共培養後に活性化Ｔ細胞集団を濃縮してもよい。方法は、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞を同定するために、共培養されたＴ細胞をスクリーニングすることを含み得る。Ｔ細胞が活性化すると、Ｔ細胞は、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの発現をアップレギュレートする。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８０（Ｂ７－１）又はＣＤ８６（Ｂ７－２）に結合するＣＤ２８と同樣に、ＴＣＲ及びＣＤ３が抗原及び主要組織適合複合体（ＭＨＣ）及び共刺激分子に結合したときに生じる。様々なＴ細胞活性化マーカーのいずれか１つ以上が、生体サンプルからの他の細胞からがん反応性Ｔ細胞を分離するのに有用であり得る。Ｔ細胞活性化マーカーの例としては、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、及びＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）のうちのいずれか１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の態様では、Ｔ細胞活性化マーカーは、１つ以上のＴ細胞活性化の細胞表面マーカーである。そのようなＴ細胞活性化の細胞表面マーカーとしては、例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、及びＴＩＧＩＴのいずれか１つ以上を挙げ得る。態様では、共培養されたＴ細胞をスクリーニングして、ＰＤ－１を発現する細胞を同定し得る。ＰＤ－１又はＣＤ２７９とも呼ばれるプログラム細胞死タンパク質１は、自己細胞に対する免疫応答をダウンレギュレートし、自己寛容を促進する役割を有するＴ細胞の表面上にあるタンパク質である。あるいは又は更に、共培養されたＴ細胞をスクリーニングして、４－１ＢＢを発現する細胞を同定し得る。４－１ＢＢ（又はＣＤ１３７）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。Ｔ細胞活性化マーカー、例えば、ＰＤ－１及び／又は４－１ＢＢを発現するＴ細胞のスクリーニングは、公知の方法を利用して実施し得る。

本開示の態様は、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現していない、スクリーニングされ、共培養されたＴ細胞から該１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞を単離して、単離されたがん抗原特異的Ｔ細胞を得ることを含み得る。これに関して、方法は、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現していない共培養物からの他の細胞から該１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞を物理的に分離し得る。また、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８の一方又は両方を発現し得る。

１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞の単離は、様々な異なる方法のいずれかで実施され得る。本開示の態様では、単離は、フローサイトメトリーを用いて実施される。フローサイトメトリーには、任意の好適な抗体及び染色を使用してよい。抗体は、それが研究対象の特定のＴ細胞活性化マーカーを特異的に認識し、結合するように選択してよい。抗体（複数可）は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）又は蛍光色素にコンジュゲートされてもよい。態様では、分離は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて実施され得る。

本開示の態様では、がん反応性Ｔ細胞、例えば、ＰＤ－１及び／又は４－１ＢＢを発現するＴ細胞を単離して、単離がん反応性Ｔ細胞を得る。好適な分離及び単離の方法は、当業者に公知である。

ＩＶ． Ｔ細胞のＩＰＳＣへの再プログラミング
方法は、単離がん反応性Ｔ細胞を、ｉＰＳＣの単離集団を製造するのに十分な条件下で培養することを更に含み得る。ｉＰＳＣ技術によって、例えばＴ細胞等の体細胞を胚性幹細胞のような段階に再プログラムすることが可能になり、これにより、無限に増幅し、任意の種類の体細胞に分化する潜在力を保持することができる。Ｔ細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の再プログラミングが望ましい場合があるが、その理由は、Ｔ細胞の抗原特異性を提供するＴＣＲはゲノム組換えによって製造されるので、生成されたｉＰＳＣ細胞株に遺伝するためである。従って、本開示の態様では、ｉＰＳＣに再プログラムされたがん反応性Ｔ細胞から、がん抗原特異的ＴＣＲをコードするＤＮＡを含むｉＰＳＣの集団が得られる。

態様では、単離がん反応性Ｔ細胞を、本明細書に開示される通り再プログラミング因子と接触させる。本明細書で使用するとき、用語「再プログラミング因子」とは、細胞の分化状態を変化させることができる任意のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又は低分子を指す。このような再プログラミング因子としては、本明細書において「ＯＳＫＭ」又は「山中因子」と称される、山中らによって発見された転写因子ＯＣＴ４（又はＯＣＴ３／４）、ＳＯＸ３、ＫＬＦ４、及びｃ－Ｍｙｃ（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６，Ｃｅｌｌ，１３６，３６４－３７７を参照）を挙げることができるが、これらに限定されない。再プログラミング因子とは、細胞の分化状態を変化させ得るか又は細胞の再プログラミングの効率を向上若しくは変化させ得る他の因子を指す。そのような因子は、当技術分野において公知である。例示的な再プログラミング因子は、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖｉｅｗ，４：３０１－３１３に記載されている。

様々な実施形態では、４つの山中因子の全てが厳密に必要なわけではない。様々な実施形態では、単離免疫細胞をＯＣＴ３／４及びＳＯＸ２と接触させる。様々な実施形態では、単離免疫細胞をＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、及びｃ－ｍｙｃと接触させる。様々な実施形態では、単離細胞をＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４と接触させる。一実施形態では、Ｔ細胞をＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４、並びにｃ－ｍｙｃ又はＳＶ４０のいずれかと接触させる。

単離免疫細胞を再プログラムするために、様々な実施形態において追加の再プログラミング因子を使用してもよい。そのような因子としては、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、Ｅｓｒｒｂ、Ｐａｘ５ ｓｈＲＮＡ、Ｃ／ＥＢＰａ、ｐ５３ ｓｉＲＮＡ、ＵＴＦ１、ＤＮＭＴ ｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔ３ａ、ＧＬＩＳ１、ＤＬＸ４、ＣＤＨ１、ＳＶ４０ ＬＴ（Ｔ）、及びｈＴＥＲＴが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、再プログラミング因子は、再プログラミングに関与する特定のｍｉＲＮＡをアップレギュレート又はダウンレギュレートし得る。一実施形態では、再プログラミング因子は、山中因子のうちの１つ以上の上流又は下流の遺伝子のうちの１つ以上の発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートし得る。様々な実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子としては、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、Ｌ型カルシウムチャネルアゴニスト、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、又はＴＧＦ－Ｂ阻害剤を挙げることができるが、これらに限定されない。再プログラミング転写因子の上流又は下流の分子経路を調節する任意の因子は、本明細書の再プログラミング方法における使用が企図される。

様々な実施形態では、１つ以上の再プログラミング因子は、低分子であってもよい。

単離がん反応性Ｔ細胞は、任意の好適な技術を使用して、ｉＰＳＣの単離集団を製造するために培養することができる。例えば、単離がん反応性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体から刺激を受けることができる。態様では、単離がん反応性Ｔ細胞に、山中因子（すなわち、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧ－ボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、及びＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びＳＶ４０（例えば、Ｖｉｚｃａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２：３１－３６（２０１３）を参照）の配列を形質導入（例えば、ベクターを用いて）してもよい。態様では、がん反応性Ｔ細胞は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、又は上記のうちの２つ以上の組み合わせの存在下で培養してよい。他の態様では、ｉＰＳＣの単離集団は、再プログラミング遺伝子のＲＮＡ発現、タンパク質送達、化学的誘導、再プログラミングに必須の遺伝子経路（例えば、Ｓｏｘ２、ＫＬｆ４、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ等）の上流若しくは下流のターゲティングによる活性化、又はこれらの方法の任意の組み合わせによって生成することができる。

特定の態様では、単離がん反応性Ｔ細胞を多能性幹細胞段階に再プログラムするのに十分な条件下で該細胞を再プログラミング因子と接触させ、それによって、がん抗原特異的ＴＣＲ（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含むｉＰＳＣの単離集団が得られる。態様では、再プログラミング因子は、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む。

本開示の態様では、再プログラミングは、単離Ｔ細胞と単離がん細胞との共培養の終了後短時間のうちに開始される。例えば、幾つかの態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の２４時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、共培養の終了の約２０時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、共培養の終了の約１６時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約１２時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約８時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、共培養の終了の約６時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約２時間以内に開始される。特定の態様では、がん反応性Ｔ細胞のスクリーニング、単離、及び再プログラミングは、共培養工程の完了直後に逐次実施される。

本開示の様々な実施形態では、Ｔ細胞をまず腫瘍抗原と共培養し、次いで、活性化マーカーを発現するそれらの共培養されたＴ細胞（すなわち、活性化Ｔ細胞）を単離し、活性化Ｔ細胞のみを再プログラムする。様々な実施形態では、活性化Ｔ細胞は、共培養の終了後直ちに濃縮される。例えば、幾つかの態様では、濃縮工程は、共培養の終了の２４時間以内に開始される。他の態様では、濃縮工程は、共培養の終了の約２０時間以内に開始される。他の態様では、濃縮工程は、共培養の終了の約１６時間以内に開始される。他の態様では、濃縮工程は、共培養の終了の約１２時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約８時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、共培養の終了の約６時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約２時間以内に開始される。特定の態様では、がん反応性Ｔ細胞のスクリーニング、単離、及び再プログラミングは、共培養工程の完了直後に逐次実施される。

幾つかの態様では、再プログラミング工程は、濃縮工程の終了の２４時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、濃縮工程の終了の約２０時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、濃縮工程の終了の約１６時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、濃縮工程の終了の約１２時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、共培養の終了の約８時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミングは、濃縮工程の終了の約６時間以内に開始される。他の態様では、再プログラミング工程は、濃縮工程の終了の約２時間以内に開始される。特定の態様では、がん反応性Ｔ細胞のスクリーニング、単離、及び再プログラミングは、濃縮工程の完了直後に逐次実施される。

ＶＩ． 新規ＴＣＲ配列の同定
本開示の態様は、抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。そのような方法は、（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に記載される方法のいずれかに従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、（ｂ）ｉＰＳＣの単離集団に含まれる核酸のＲＮＡ又はＤＮＡのシーケンシングを行うことによってがん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定することと、を含み得る。そのような方法はまた、がん抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ系列細胞にｉＰＳＣを分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、Ｔ系列細胞の単離集団に含まれる核酸のＲＮＡ又はＤＮＡのシーケンシングを行うことによってがん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定することと、を含み得る。本明細書に開示される方法は、先行技術の方法では検出することができなかった低頻度の腫瘍抗原特異的ＴＣＲを同定することができる。

様々な実施形態では、本開示は、腫瘍抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて共培養されたＴ細胞を製造することと、共培養されたＴ細胞から、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するものを単離することと、単離Ｔ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で該細胞を１つ以上の再プログラム因子と接触させることと、ｉＰＳＣコロニーからＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードするＤＮＡ配列を決定することと、を含む方法を提供する。

開示される方法において有用であり得るシーケンシング技術の例としては、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（「超並列シーケンシング技術」又は「ディープシーケンシング」とも称される）及び第３世代シーケンシングが挙げられる。ＮＧＳとは、非サンガーベースのハイスループットＤＮＡシーケンシング技術を指す。ＮＧＳでは、数百万又は数十億のＤＮＡ鎖を並行してシーケンシングし得るため、スループットが大幅に向上し、ゲノムのサンガーシーケンシングにおいて用いられることが多い断片クローニング法の必要性が最小限に抑えられる。ＮＧＳでは、ゲノム全体を小片に分解することによって、核酸テンプレートをゲノム全体に沿って並行してランダムに読み取り得る。ＮＧＳは、有利なことに、非常に短い期間、例えば、約１～約２週間以内、約１～約７日以内、又は約２４時間未満以内に核酸配列情報を提供し得る。市販されているか又は文献に記載されている複数のＮＧＳプラットフォームを、開示される方法の状況で使用することができ、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８（３）：９５－１０９（２０１１）及びＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：６４１－６５８（２００９）に記載のものである。

ＮＧＳの技術及びプラットフォームの非限定的な例としては、合成によるシーケンシング（「パイロシーケンシング」としても知られている）（例えば、ＧＳ－ＦＬＸ ４５４ゲノムシーケンサー、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、ＳＯＬＥＸＡゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＨＩＳＥＱ ２０００ゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＮＥＸＴＳＥＱシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＭＩＳＥＱシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して又は例えば、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５）：３６３－３６５（１９９８）に記載の通り実施）、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬＩＤプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））又はＰＯＬＯＮＡＴＯＲ Ｇ．００７プラットフォーム（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｌｅｍ，ＮＨ））を使用して実施）、単一分子シーケンシング（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））又はＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォーム（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して実施）、単一分子シーケンシングのためのナノテクノロジー（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧＲＩＤＯＮプラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）によって開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシング（ＨＡＮＳ）プラットフォーム、及びプローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）と称されるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）技術によるリガーゼベースのＤＮＡシーケンシングプラットフォームを使用して実施）、及び単一分子シーケンシングのための電子顕微鏡ベースの技術、及びイオン半導体シーケンシングが挙げられる。

様々な実施形態では、同定されたＴＣＲ配列は、抗原反応性を判定するために更にスクリーニングされる。様々な実施形態では、同定されたＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の配列を含む発現ベクターを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入し、がんに関連する１つ以上の腫瘍抗原と接触させる。次に、形質導入されたＰＢＭＣの１つ以上の腫瘍抗原に対する反応性を測定して、ＴＣＲが腫瘍抗原特異的であることを確認する。反応性を測定する技術は、当技術分野で説明されている。

様々な実施形態では、ＴＣＲは、希少腫瘍抗原特異的ＴＣＲである。本明細書で使用するとき、「希少腫瘍抗原特異的ＴＣＲ」とは、抗原特異的Ｔ細胞の不均一な集団において比較的低い頻度を有する腫瘍抗原を指す。様々な実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の不均一な集団は、腫瘍に由来する。様々な実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の不均一な集団は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来する。様々な実施形態では、希少腫瘍抗原特異的ＴＣＲは、抗原特異的Ｔ細胞の不均一な集団（すなわち、バルク）の９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又は０．１％未満を占める。

様々な実施形態では、本明細書で同定された新規ＴＣＲ配列を使用して、がんを治療するための養子細胞療法用の遺伝的に操作された細胞を製造し得る。特定の実施形態では、本明細書で同定される腫瘍抗原特異的ＴＣＲをコードする発現ベクター（ウイルスベクター等）をＰＢＭＣに形質導入する。別の実施形態では、腫瘍生検又はＴＩＬ等からのＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞を含有する任意の生体サンプルが、本明細書に開示されるＴＣＲを発現するように形質導入されるのに適している。一実施形態では、がんを有する対象からの単離Ｔ細胞に、本明細書に開示される腫瘍抗原に特異的なＴＣＲをコードする発現ベクターを形質導入する。様々な実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、内因性ＴＣＲを除去するように遺伝的に改変されている。ＴＣＲ配列をＴ細胞に遺伝子操作するための方法論は、当技術分野で開示されている。例えば、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２８（１）８ Ｊａｎ．２０２０，６４－７４；Ｂｌｏｏｄ ２０１８；１３１（３）：３１１－３２２；Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ Ａｌｌｉａｎｃｅ，２０１９ Ａｐｒ；２（２）：ｅ２０１９００３６７；Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｍａｒ ２；５４３（７６４３）：１１３－１１７を参照。本開示のコンストラクト及び遺伝子操作されたＴ細胞を作製するための特定の方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／１４５２０号に記載されている。コンストラクト及び細胞を作製する追加の方法は、米国仮特許出願第６２／２４４，０３６号に見出すことができる。

ポリヌクレオチドをクローニングする場合、ベクターを宿主細胞（単離宿主細胞）に導入してベクター自体の複製を可能にし、それによって、それに含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅させてよい。クローニングベクターは、一般に、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、及び選択可能マーカーを含むがこれらに限定されない配列成分を含有していてよい。これら要素は、当業者であれば適宜選択し得る。例えば、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進するために、複製起点を選択してよい。

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含有する単離宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現又はクローニングにおいて有用であり得る。好適な宿主細胞としては、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞等の高等真核細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。この目的のために好適な原核細胞としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のエシェリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等のサルモネラ属、例えば霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃ－ｅｓｃａｎｓ）等のセラチア属、及びシゲラ属等の腸内細菌科、並びに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス属、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属、並びにストレプトミセス属が挙げられるが、これらに限定されない。

ベクターは、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサン及びペプチドによって媒介される送達が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて宿主細胞に導入することができる。対象となるベクターを発現させるために細胞をトランスフェクト及び形質転換するための標準的な方法は、当技術分野で周知である。更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞のドナー集団の遺伝的改変において異なる発現ベクターの混合物を使用することができ、各ベクターは、本明細書に開示される異なる組換えＴＣＲをコードする。その結果、形質導入された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された細胞の混合集団を形成し、該遺伝子操作された細胞の一部は、１つを超える異なる組換えＴＣＲを発現する。

様々な実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、自己Ｔ細胞である。様々な実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、同種である。様々な実施形態では、新規ＴＣＲ配列を使用して、がん又は腫瘍を治療するための同種細胞株を生成する。様々な実施形態では、本開示は、がんを有する対象におけるがんを治療するための医薬を製造する方法であって、本明細書に記載の方法を用いてｉＰＳＣの単離集団を製造することと、新規ＴＣＲ配列を同定することと、Ｔ細胞の集団において該ＴＣＲ配列のＶａ及びＶｂの配列を発現させることと、遺伝子操作されたＴ細胞を対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化することと、を含む方法に関する。

様々な実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座は、配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されており、ＴＣＲＢ遺伝子座は、ノックアウトされている。様々な実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座は、配列番号１のＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されている。様々な実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座は、配列番号２のＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号６のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されている。様々な実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座は、配列番号３のＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号７のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されている。様々な実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座は、配列番号４のＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されている。特定の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸配列は、適切な定常領域をコードする核酸も含む。本明細書で使用するのに好適な定常領域は、当技術分野で公知である（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８４８（ＴＲＡＣ）、Ｐ０１８５０（ＴＲＢＣ１）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ０Ｇ２ＪＭＢ４（ＴＲＢＣ２）を参照されたい）。

様々な実施形態では、本開示は、配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖を含む組換えＴＣＲ又はキメラＴＣＲを提供する。様々な実施形態では、本開示は、配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖を含む組換えＴＣＲ又はキメラＴＣＲを提供する。様々な実施形態では、本開示は、配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖を含む組換えＴＣＲ又はキメラＴＣＲを提供する。様々な実施形態では、本開示は、配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖を含む組換えＴＣＲ又はキメラＴＣＲを提供する。様々な実施形態では、本開示は、配列番号９～１２のいずれか１つを含む組換え又はキメラのＴＣＲを発現する単離細胞を提供する。

Ｖ．腫瘍特異的ｉＰＳＣ株を樹立する方法
様々な実施形態では、方法は、腫瘍特異的ｉＰＳＣ株の作製を提供する。様々な実施形態では、方法は、Ｔ細胞の不均一な集団から腫瘍反応性Ｔ細胞を優先的に再プログラムする。様々な実施形態では、腫瘍抗原特異的Ｔ－ｉＰＳＣ株は、様々ながんを治療するための新規細胞療法の開発において有利であり得る。特定の実施形態では、Ｔ－ｉＰＳＣコロニーは、確立されたプロトコルを用いて幹細胞を維持するための適切な市販の培地でｉＰＳＣ株を維持し得る（例えば、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０２０ Ｓｅｐ；５４（１）：ｅ１１７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｐｓｃ．１１７；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０２１ Ａｐｒ １０．ｄｏｉ：１０．１００７／７６５１＿２０２１＿３５８を参照）。そのようなＴ－ｉＰＳＣ株は、一般に、（それらが再プログラムされた腫瘍抗原特異的Ｔ細胞からの）それらの再配置されたＴＣＲ遺伝子に関してモノクローナルである。特定の実施形態では、複数のそのようなＴ－ｉＰＳＣ株をプールして、ポリクローナルＴ－ｉＰＳＣ株を生成し得る。

本開示の態様は、がん抗原特異的ＴＣＲをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む開示されたｉＰＳＣの単離集団を使用して、対象におけるがんを治療する方法を含む。そのような方法は、（ａ）本発明の他の態様に関して本明細書に開示される通りｉＰＳＣの単離集団を製造することと、（ｂ）ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、（ｃ）対象におけるがんを治療又は予防するのに有効な量の分化したＴ系列細胞を対象に投与することと、を含み得る。態様では、分化したＴ系列細胞は、ナイーブＴ細胞であってよい。

Ｔ－ｉＰＳＣのＴ系列細胞への分化は、当技術分野で開示されている方法を用いて達成することができる。例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．，Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（２０１２）．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｕｍｍｕｎｏｌ．，１２，２６９－２８１を参照。様々な実施形態では、方法は、Ｔ－ｉＰＳＣを培養してＣＤ４－ＣＤ８－（二重陰性）Ｔ細胞を製造することを更に含み得る。二重陰性Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８共受容体を発現しない。二重陰性Ｔ細胞は、リンパ球共通前駆（ＣＬＰ）細胞から分化し、胸腺に生着する。Ｔ－ｉＰＳＣは、任意の好適な技術を使用してＣＤ４－ＣＤ８－（二重陰性）Ｔ細胞を製造するために培養することができる。

本開示に従って製造された細胞の集団は、対象におけるがんを治療又は予防する方法において使用することができる。これに関して、本開示の態様は、対象におけるがんを治療又は予防する方法であって、該対象におけるがんを治療又は予防するのに有効な量の、（ｉ）本明細書に記載の方法のいずれかに従って製造された細胞を該対象に投与すること又は（ｉｉ）本明細書に記載の細胞の単離集団若しくは医薬組成物のいずれかを該対象に投与することを含む方法を含む。

ＶＩＩ． 治療方法及び医薬組成物
本開示の態様では、がんを治療又は予防する方法は、対象における転移を低減するのに有効な量の細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含み得る。例えば、開示される方法は、対象における転移性結節を低減し得る。

対象に投与される細胞は、対象に対して同種又は自己であり得る。「自己」投与法では、細胞を対象から取り出し、保存（及び任意で改変）し、同じ対象に戻す。「同種」投与法では、対象が遺伝的に類似しているが同一ではないドナーから細胞を受け取る。態様では、Ｔ細胞は、対象に対して自己である。自己細胞は、有利なことに、例えば移植片対宿主病等の同種細胞を標的とし得る望ましくない免疫応答を低減又は回避し得る。

本開示の目的のために、投与される用量、例えば、細胞数は、合理的な時間枠にわたって対象において効果、例えば治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、投与される細胞の数は、投与時点から約２時間以上、例えば、１２～２４時間又はそれ以上の期間、対象となる抗原に結合するか又はがんを治療若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の態様では、期間は更に長くてもよい。投与される細胞の数は、例えば、投与される特定の細胞集団の有効性、及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。

投与される細胞の数は、特定の細胞集団の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。典型的には、主治医は、様々な要因、例えば、年齢、体重、全体的な健康状態、食生活、性別、投与経路、及び治療される病態の重症度を考慮して、各個々の対象を治療するための細胞の数を決定する。例として、限定するものではないが、投与される細胞、例えば、分化したＴ系列細胞又は本明細書に記載の通り同定された腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するように遺伝子操作された細胞の数は、注入１回当たり約１０×１０^６～約１０×１０^１１細胞、注入１回当たり約１０×１０^９細胞～約１０×１０^１１細胞、又は注入１回当たり１０×１０^７～約１０×１０^９細胞であってよい。

１つ以上の追加の治療剤を対象に共投与してもよい。本明細書における「共投与」の使用は、単離された細胞の集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強することができ、逆もまた同様であるように、１つ以上の追加の治療剤及び単離された細胞の集団が十分に近い時間に投与されることを意味する。これに関して、単離された細胞の集団を最初に投与し、１つ以上の追加の治療剤を２番目に投与してもよく、逆もまた同様である。あるいは、単離された細胞の集団及び１つ以上の追加の治療剤を同時に投与してもよい。単離された細胞の集団の機能を増強し得る追加の治療剤としては、例えば、１つ以上のサイトカイン又は１つ以上の抗体（例えば、ＰＤ－１の機能を阻害する抗体）を挙げ得る。単離された細胞の集団と共投与することができる例示的な治療剤は、ＩＬ－２である。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、ＩＬ－２が単離された細胞の集団、例えば、分化したＴ系列細胞の治療効果を高め得ると考えられる。

用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれから派生する語は、本明細書で使用するとき、必ずしも１００％、すなわち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、開示される方法は、対象における任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供することができる。更に、開示される方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１つ以上の病態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の発症又は再発を遅らせることを包含し得る。

本開示の態様では、がんを治療又は予防する方法は、対象における転移を低減するのに有効な量の細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含み得る。例えば、開示される方法は、対象における転移性結節を低減し得る。

本開示の態様は、開示される単離された細胞の集団を使用して、がんを有する対象におけるがんを治療又は予防するための医薬を製造する方法を含む。そのような方法は、（ａ）本明細書に開示される通りｉＰＳＣの単離集団を製造する工程と、（ｂ）ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて分化したＴ系列細胞を得る工程と、（ｃ）分化したＴ系列細胞を、対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化する工程と、を含み得る。態様では、分化したＴ系列細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。そのような方法は、（ａ）本明細書に開示される通りＴ－ｉＰＳＣの単離集団を製造する工程と、（ｂ）抗原特異的ＴＣＲの配列を決定する工程と、（ｃ）ＴＣＲを発現するベクターをＴ細胞の集団に形質導入する工程と、（ｄ）ＴＣＲが遺伝子操作されたＴ細胞を、対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化する工程と、を含み得る。

開示される方法に従って製造される単離された細胞の集団（例えば、ｉＰＳＣの単離集団、及び／又は分化したＴ系列細胞、及び／又はＴＣＲが遺伝子操作されたＴ細胞）は、医薬組成物等の組成物に含まれ得る。これに関して、本開示の態様は、本明細書に記載の単離又は精製された細胞の集団と、担体と、を含む医薬組成物を含む。態様では、組成物は、１つ以上のがん抗原特異的ＴＣＲをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むｉＰＳＣを含み得る。態様では、組成物は、そのようなｉＰＳＣを分化させることによって得られる分化したＴ系列細胞を含み得る。本開示の態様は、がんの治療又は予防において使用するための組成物を含み得る。そのような組成物は、例えば、本明細書に開示の通りｉＰＳＣを分化させることによって調製される、分化したＴ系列細胞を含み得る。

態様では、本開示に係る組成物は、担体を含み得る。担体は、薬学的に許容し得る担体であってよい。医薬組成物に関して、担体は、細胞を投与するために従来使用されているもののいずれかであってよい。そのような薬学的に許容し得る担体は、当業者に周知であり、公に容易に入手可能である。態様では、薬学的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しない。

担体の選択は、細胞の集団を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、本開示に係る医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、腫瘍内、又は腹腔内に投与するもののいずれかを含み得る。１つを超える経路を使用して細胞の集団を投与してもよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時かつ有効な応答を提供し得る。

細胞の集団は、注射によって、例えば静脈内に投与してよい。注射用の細胞のための好適な薬学的に許容し得る担体は、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液を含み得る。態様では、薬学的に許容し得る担体にヒト血清アルブメン（ａｌｂｕｍｅｎ）を補給する。

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用するとき、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これら用語は、分子の一次構造を指し、従って、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ、二本鎖及び一本鎖のＲＮＡ、並びに二本鎖のＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。この用語には、等価物として、例えばメチル化及び／又はキャッピングされたポリヌクレオチド等であるがこれらに限定されない、ヌクレオチドアナログ及び修飾ポリヌクレオチドから作製されるＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログが含まれる。本開示の態様では、核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。

用語「ヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基からなるポリヌクレオチドの単量体サブユニットを指す。天然に存在する塩基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ））は、典型的には、プリン又はピリミジンの誘導体であるが、本開示は、天然に存在する及び天然には存在しない塩基アナログの使用も含む。天然に存在する糖は、ペントース（五炭糖）のデオキシリボース（ＤＮＡを形成する）又はリボース（ＲＮＡを形成する）である。核酸は、典型的には、リン酸結合を介して連結されて核酸又はポリヌクレオチドを形成するが、他の多くの結合も当技術分野において公知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート等）。ポリヌクレオチドの調製方法は、当業者の技能の範囲内である（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２））。

態様では、ｉＰＳＣの単離集団は、１つ以上の抗原特異的ＴＣＲをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むｉＰＳＣを含む。

本開示の態様では、分化したＴ系列細胞のＴＣＲは、がんに対する抗原特異性を有する（すなわち、がん抗原）。本開示の更なる態様では、分化したＴ系列細胞のＴＣＲは、がん細胞の１つ以上のがん抗原に特異的に結合する。態様では、がん抗原は、腫瘍抗原である。

がん抗原は、本明細書に記載のがん及び腫瘍を含む、任意のがん又は腫瘍の任意の細胞によって発現される抗原であってよい。がん抗原は、１種類のみのがん又は腫瘍のがん抗原であってよく、その結果、がん抗原は１種類のみのがん又は腫瘍に関連するか又はそれを特徴とする。あるいは、がん抗原は、１種類を超えるがん又は腫瘍のがん抗原であってもよい（例えば、特徴としてもよい）。例えば、例えば乳がん細胞及び前立腺がん細胞の両方が、がん抗原を発現する場合もある。がん抗原は、当技術分野において公知であり、例えば、ＣＸｏｒｆ６１、メソテリン、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＡＧ－３としても知られている）、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３等が挙げられる。

本開示の態様
本明細書に記載の本発明主題の態様は、単独で又は１つ以上の他の態様と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を制限するものではないが、本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかになるように、個別に付番された各態様は、先行又は後続の個別に付番された態様のいずれかと併用又は組み合わせてもよい。これは、そのような態様の組み合わせを全てサポートすることを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されるものではない。

１． 腫瘍抗原特異的Ｔ細胞誘導多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）の単離集団を製造する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を該共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
を含む方法。

２． 該第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、態様１に記載の方法。

３． 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、態様１に記載の方法。

４． 該共培養が、約３～４８時間進行する、態様１に記載の方法。

５． 該共培養が、約８～４８時間進行する、態様１に記載の方法。

６． 該共培養が、約８～２４時間進行する、態様１に記載の方法。

７． 該共培養が、約１２～２０時間進行する、態様１に記載の方法。

８． 該共培養が、約１６時間進行する、態様１に記載の方法。

９． 該腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１０． 該がん細胞が、該対象から単離される、態様９に記載の方法。

１１． 該単離されたＴ細胞が、該腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１２． 該単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１３． 該単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１４． 該単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１５． 該単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、該ペプチドプールが、腫瘍抗原に由来する、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。

１６． 該１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、態様１～１１のいずれか１つに記載の方法。

１７． 該再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、態様１～１２のいずれか１つに記載の方法。

１８． 該対象が、哺乳類である、態様１～１４のいずれか１つに記載の方法。

１９． 該哺乳類が、ヒトである、態様１５に記載の方法。

２０． 該がんが、固形腫瘍を含む、態様１～１６のいずれか１つに記載の方法。

２１． ｉＰＳＣの単離集団におけるｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることを更に含む、態様１～１７のいずれか１つに記載の方法。

２２． がんを有する対象におけるがんを治療又は予防するための医薬を製造する方法であって、
（ａ）態様１～１７のいずれか１つに記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
（ｂ）該ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
（ｃ）該分化したＴ系列細胞を、該対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化することと、
を含む方法。

２３． がん抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
（ａ）態様１～１７のいずれか１つに記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
（ｂ）該ｉＰＳＣの単離集団に含まれる核酸のＲＮＡ又はＤＮＡのシーケンシングを行うことにより、がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定することと、
を含む方法。

２４． 該がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が、ＤＮＡシーケンシングを行うことによって決定される、態様２３に記載の方法。

２５． 該がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が、ＩｍｍｕｎｏＳＥＱによって決定される、態様２３に記載の方法。

２６． 態様１～１７のいずれか１つに記載の方法に従って製造されたｉＰＳＣと、薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。

２７． 態様１９に記載の方法に従って製造された分化したＴ系列細胞と、薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。

２８． がんを有する対象におけるがんの治療又は予防において使用するための、態様１～１７のいずれか１つに記載の方法に従って製造されたｉＰＳＣの単離集団又は態様２６に記載の組成物。

２９． 該対象が、哺乳類である、態様２４に記載の使用のためのｉＰＳＣの単離集団又は組成物。

３０． 該哺乳類が、ヒトである、態様２５に記載の使用のためのｉＰＳＣの単離集団又は組成物。

３１． がんを有する対象におけるがんの治療又は予防において使用するための、態様１９に記載の方法に従って製造されたＴ系列細胞又は態様２３に記載の組成物。

３２． 該対象が、哺乳類である、態様２７に記載の使用のためのＴ系列細胞又は組成物。

３３． 該哺乳類が、ヒトである、態様２８に記載の使用のためのＴ系列細胞又は組成物。

３４． 腫瘍抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
（ｅ）ｉＰＳＣコロニーからＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードするＤＮＡ配列を決定することと、
を含む方法。

３５．
（ｆ）（ｅ）のＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の配列を含む発現ベクターを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入する工程と、
（ｇ）形質導入されたＰＢＭＣを該がんに関連する１つ以上の腫瘍抗原と接触させる工程と、
（ｈ）該形質導入されたＰＢＭＣの該１つ以上の腫瘍抗原に対する反応性を測定する工程であって、該反応性によって、該ＴＣＲが腫瘍抗原特異的であることが確認される工程と、
を更に含む、態様３４に記載の方法。

３６． 更に、該反応性が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションによって測定される、態様３５に記載の方法。

３７． 更に、該反応性が、１つ以上のサイトカインの産生によって測定される、態様３５に記載の方法。

３８． 更に、該反応性が、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞を殺傷する該形質導入されたＰＢＭＣの能力によって測定される、態様３５に記載の方法。

３９． 該第１のサンプルが、腫瘍サンプルである、態様３４～３８に記載の方法。

４０． 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、態様３４～３８に記載の方法。

４１． 該接触が、約３～４８時間進行する、態様３４～３８に記載の方法。

４２． 該接触が、約８～４８時間進行する、態様３４～３８に記載の方法。

４３． 該接触が、約８～２４時間進行する、態様３４～３８に記載の方法。

４４． 該接触が、約１２～２０時間進行する、態様３４～３８に記載の方法。

４５． 該接触が、約１６時間進行する、態様３４～３８に記載の方法。

４６． 該腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

４７． 該がん細胞が、該対象から単離される、態様３４～４５に記載の方法。

４８． 該単離されたＴ細胞が、該腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

４９． 該１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５０． 該再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５１． 該腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５２． 該がん細胞が、該対象から単離される、態様５１に記載の方法。

５３． 該単離されたＴ細胞が、該腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５４． 該単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５５． 該単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５６． 該単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５７． 該単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、該ペプチドが、腫瘍抗原である、態様３４～４５のいずれか１つに記載の方法。

５８． 該腫瘍抗原特異的ＴＣＲが、該対象からの該第１のサンプルから単離されたＴ細胞の９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又は０．１％未満を占める、態様３４に記載の方法。

５９． 該第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、態様５８に記載の方法。

６０． 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、態様５８に記載の方法。

６１． 腫瘍抗原特異的ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のポリクローナル集団を作製する方法であって、
（ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
（ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
（ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
（ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、該細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
（ｅ）該ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
を含む方法。

６２． 該第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、態様６１に記載の方法。

６３． 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、態様６１に記載の方法。

６４． 該共培養が、約３～４８時間進行する、態様６１に記載の方法。

６５． 該共培養が、約８～４８時間進行する、態様６１に記載の方法。

６６． 該共培養が、約８～２４時間進行する、態様６１に記載の方法。

６７． 該共培養が、約１２～２０時間進行する、態様６１に記載の方法。

６８． 該共培養が、約１６時間進行する、態様６１に記載の方法。

６９． 該腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、態様６１～６８のいずれか１つに記載の方法。

７０． 該がん細胞が、該対象から単離される、態様６９に記載の方法。

７１． 該単離されたＴ細胞が、該腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、態様６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

７２． 該単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、態様６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

７３． 該単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、態様６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

７４． 該単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、態様６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

７５． 該単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、該ペプチドプールが、腫瘍抗原に由来する、態様６１～７０のいずれか１つに記載の方法。

７６． 該１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、態様６１～７５のいずれか１つに記載の方法。

７７． 該再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、態様６１～７６のいずれか１つに記載の方法。

７８． 該対象が、哺乳類である、態様６１～７７のいずれか１つに記載の方法。

７９． 該哺乳類が、ヒトである、態様７８に記載の方法。

８０． 該がんが、固形腫瘍を含む、態様６１～７９のいずれか１つに記載の方法。

８１． 配列番号１～１６から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列。

８２．
（ａ）配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
（ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
（ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
（ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
（ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
を含む、組換えＴＣＲ。

８３．
（ａ）配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
（ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
（ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
（ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
（ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
を含む、キメラＴＣＲ。

８４． 態様８２に記載の組換えＴＣＲ又は態様８３に記載のキメラＴＣＲを発現する単離細胞。

８５． 該単離細胞が、ヒトＴ細胞である、態様８４に記載の単離細胞。

８６． 該ヒトＴ細胞が、内因性ＴＣＲを除去するように遺伝的に改変されている、態様８５に記載の単離細胞。

８７． 内因性ＴＲＡＣ遺伝子座が、配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されており、ＴＣＲＢ遺伝子座が、ノックアウトされている、態様８５に記載の単離細胞。

以下の実施例は、いかなる方法においても、本開示の範囲又は特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１～３に記載する実験では、以下の材料及び方法を使用した。

対象、ＴＩＬ、及び自己腫瘍株の選択
凍結した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）サンプルは、ＮＣＩ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ ＴＩＬラボのリポジトリから入手した。ＴＩＬは、既述のように生成した。（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１８：２５５－６２を参照；また、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４；１２４：２２４６－５９も参照；また、Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１６；４：７３４－４３も参照）簡潔に述べると、外科的に切除した腫瘍を約１～２ｍｍの断片に切り分け、高用量ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ）を含有する完全培地（ＣＭ）中で培養した。ＴＩＬ断片培養物を、短時間培養した後（１３～１６日目）に凍結した。４０６９と命名された１人の対象のＴＩＬを、タンデムミニジーンスクリーニングによってネオアンチゲン反応性について更にスクリーニングし（Ｔｒａｎ、上掲を参照）、注入及び凍結のために、放射線照射したフィーダー細胞、５０ｎｇ ＯＫＴ－３、及び３０００ＩＵ ＩＬ－２の存在下において５０－５０培地（ペニリシン－ストレプトマイシン及びＬ－グルタミンを含む５％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ－ＡＩＭ－Ｖ）中で約１０００～１５００億細胞に達するまで反応性ＴＩＬを増幅させた。

変異特異的抗原を有する対応するメラノーマ細胞株を断片培養から樹立し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＲＰＭＩ １６４０培地において３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した。メラノーマ細胞株はマイコプラズマ陰性であり、患者特異的体細胞変異及びＨＬＡ分子の同定に基づいて確認された。全ての患者は、外科手術、化学療法、及び免疫療法を含む前治療を受けたことがある。

ＴＩＬ及び腫瘍細胞の共培養
Ｔ細胞及び腫瘍細胞の共培養アッセイを行うために、最低限のインビトロ培養を行ったＴＩＬ（すなわち、「新鮮」ＴＩＬ）をＴ細胞培地に解凍し、遠心分離し、サイトカインの非存在下で２４ウェルプレートに２×１０^６細胞／ウェルでプレーティングした。３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩静置した後、ＴＩＬ（１×１０^５細胞）を、９６ウェル丸底プレートにおいて２００μＬの腫瘍細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）中自己腫瘍細胞株（１×１０^５細胞）の有り無しで培養した。ＴＩＬを洗浄し、計数し、腫瘍細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁させ、９６ウェル丸底プレートにおいて１００μＬの腫瘍細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）にプレーティング（１ウェル当たり１×１０^５細胞）した。同種及び自己の腫瘍細胞株をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン処理して、プレートから細胞を除去した。次いで、腫瘍細胞株をスピンダウンし、計数した。次いで、Ｔ細胞を単独で又は同種及び自己の腫瘍細胞株１×１０^５個と共に２００μＬの培養体積、Ｅ／Ｔ比１：１でインキュベートした。細胞を１６時間培養した。次いで、細胞を収集し、フローサイトメトリーを用いて選別した。

ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ解析
１群当たり約１．０×１０^５細胞のバルクＴＩＬ、選別されたＴ細胞、又はｉＰＳＣをスピンダウンし、１×ＰＢＳで洗浄し、５０～１００μＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー中で急速凍結した。ＴＩＬ－ｉＰＳＣについては、細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液に解離させ、自動細胞計数器で計数した。１５～２０個の個々のｉＰＳＣ株からの約１．０×１０^５個の細胞を混合し、氷上で１５ｍＬのチューブ（「マスターチューブ」と称される）に一緒にプールした。サンプルを１５００ＲＰＭで５分間スピンダウンし、１×ＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー中で急速凍結した。ピックアップ後に残ったコロニーをトリプシン処理後に回収し、凍結させた。ゲノムＤＮＡの抽出及びＩｍｍｕｎｏｓｅｑ ＴＣＲＢサーベイシーケンシングは、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって実施された。ＩＭＭＵＮＯＳＥＱ（登録商標）分析機（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて結果を解析した。プールしたサンプルについては、０．５％を超える増殖性ＴＣＲを含むＴＣＲを真とみなした。

ＰＢＭＣの単離
健常ボランティアからの２５ｍＬバフィーコートバッグは、リンパ球分離の前にＮＩＨの血液バンクから入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用いて単離した。

Ｔ細胞のインビトロ活性化
健常ドナーＰＢＭＣをナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、及びＥＭＲＡのサブセットに選別し、３００ＩＵ ｒｈＩＬ－２の存在下で完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清）中において、１：１の細胞対ビーズ比（製造業者の説明書に従って）で、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて４日間インビトロで刺激した。４日目にビーズを磁石で分離し、これら細胞をＰＢＳで１回洗浄し、センダイウイルス感染前の各群からの細胞数を正規化するために自動細胞計数器（ｃｏｕｎｔｅｓｓ）を用いて計数した。

ＴＣＲ遺伝子のレトロウイルスによる形質導入
９３ ＧＰ細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、０．７μｇのヘルパープラスミド ＲＤ１１４と共に、ＰＭＳＧＶ１にクローニングした各ＴＣＲをコードするレトロウイルスプラスミドＤＮＡ１．５μｇで８時間トランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後に培地を交換し、細胞を完全培地中で更に４８時間細胞をインキュベートした。ウイルス粒子を捕捉するため、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）でコーティングした６ウェル非組織培養処理プレートで、レトロウイルス上清を３２℃で２時間２，０００×ｇでスピンした。形質導入のためのドナーＴ細胞として、健常ドナーの末梢血リンパ球を使用した。５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３（ｍｉｌｔｅｎｙ）／ｍＬ（培地）を用いて４８時間Ｔ細胞を活性化し、感染させるために１ウェル当たり２００万個の細胞を添加した。ＴＣＲ形質導入の約５～６日後に、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を抗原特異性について評価した。

実施例１
この実施例では、末梢血及びＴＩＬから得られたＴ細胞を再プログラムする方法について検討した。

ＣＤ３／２８ビーズによるＴＣＲ刺激の有り無しで、末梢血Ｔ細胞をｉＰＳＣに再プログラムした。（図５Ａ参照）。Ｔ細胞を刺激した場合にのみｉＰＳＣが樹立され、ＳＶ４０の添加により再プログラミングの効率が向上した（図１Ａ参照）。このことは、Ｔ細胞を再プログラムする際にはＴＣＲ刺激が必須の工程であることを示す。適切な刺激条件により、任意のＴ細胞サブセット（すなわち、ナイーブ、ＣＭ、ＥＭ、ＥＭＲＡ）からｉＰＳＣを生成することができる。適用可能な選別戦略を、図５Ｂ及び５Ｃに提示する代表的なＦＡＣＳプロットによって示す。

次いで、このアプローチを用いて、４０６９と命名された膵臓がん患者において同定された腫瘍ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞を再プログラムした。ＴＩＬ－ｉＰＳＣのＴＣＲシーケンシング及び反応性試験の一般的なプロセスを示す図を図６に提供する。表１は、患者４０６９の増幅されたＴＩＬにおける上位１０個のＴＣＲベータ配列をまとめた表を提供し、ＣＤＲ３アミノ酸配列、Ｖベータファミリー、及びバルクサンプルにおける頻度を示す。最も頻度の高いＴＣＲは、患者のネオアンチゲン特異的ＴＣＲであった。

表１に示すように、患者４０６９からのＴＩＬのこの集団はほぼモノクローナルであり、９２．７％がＴＣＲ ＴＣＲＢＶ１１－０２^＊０２（患者のネオアンチゲン、ＺＦＹＶＥ２７ Ｒ６Ｈに特異的）を発現していた。このほぼモノクローナルなＴＩＬの集団をＣＤ３抗体によって活性化し、再プログラムして、ＴＩＬ－ｉＰＳＣを得た。１３個の異なるＴＩＬ－ｉＰＳＣクローンを樹立し、ＴＣＲベータ遺伝子をシーケンシングした。驚くべきことに、出発集団の９２．７％を構成するＺＦＹＶＥ２７ Ｒ６Ｈ（患者のネオアンチゲン）に特異的なＴＣＲを有するＴＩＬ－ｉＰＳＣクローンは存在せず、代わりに、全てのＴＣＲが単一のＴ細胞クローンに由来しており、これは出発集団ではＴＣＲディープシーケンシングによって検出されなかった非常に少数の集団であった。表２は、単一のＴ細胞クローンのＴＣＲベータ配列をまとめた表であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列、Ｖβファミリー、及び抗ＣＤ３抗体のみを用いて樹立されたＴＩＬ－ｉＰＳＣクローンの数を示す。

従って、この実験は、Ｔ細胞をｉＰＳＣに再プログラムするためにはＴＣＲ刺激が重要であることを実証するが、腫瘍ネオアンチゲン特異的クローンを高度に濃縮した増幅ＴＩＬからであっても、ＣＤ３抗体による非特異的ＴＣＲ刺激によって腫瘍反応性Ｔ細胞から常にＴＩＬ－ｉＰＳＣが生成されるものではないことも示す。ＴＩＬ中の腫瘍反応性Ｔ細胞の頻度は非常に低いため、非特異的ＣＤ３刺激は、（腫瘍ネオアンチゲン特異的クローンを高度に濃縮したＴＩＬの増幅集団に適用した場合であっても）腫瘍反応性Ｔ細胞の選択的再プログラミングに有効ではない。

更に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズで刺激すると、患者４０６９からのＴＩＬから希少な抗原特異的Ｔ細胞クローンを刺激することが可能であった（表３参照）。表３は、再プログラミングのために抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズを用いて刺激する改良された方法によって得られた２７個の異なるＴＣＲのＴＣＲ ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析をまとめたものである。ＴＣＲ１は、全てのマスターチューブに存在していた予め同定されていた反応性ＴＣＲであり、ＴＣＲ２～２６は、ｉＰＳＣクローンでもみられた少数のクローンである。この表は、ＴＣＲのリスト、各ＴＣＲのそれぞれのＣＤＲ３ベータアミノ酸配列、そのＶβファミリー、及びマスターチューブでみられたｉＰＳＣの最小数を提供する。

更に、表４にまとめたように、異なるがん及び患者からの様々ながん抗原依存性Ｔ細胞をｉＰＳＣに再プログラムし得ことが確認された。表４は、再プログラミングに使用した４人の患者のＴＩＬサンプルの概要を提供する。手術室患者ＩＤ、がんの種類、腫瘍及びＴ細胞を収集するために使用した組織、Ｔ細胞のクローン性、生成されたｉＰＳＣコロニー数、各患者から得られた全ＴＣＲ数、及びｉＰＳＣクローンで得られた予め同定されていた腫瘍抗原反応性ＴＣＲの数を示す。

実施例２
この実施例は、自己腫瘍細胞と共培養した際に、腫瘍反応性Ｔ細胞がＴＩＬ－ｉＰＳＣに選択的に再プログラムされ得るかどうかを調べる実験について説明する。

その方法を図２Ａにまとめる。この研究のために、最小限のインビトロ培養を行ったＴＩＬの入手可能性、自己腫瘍細胞の入手可能性、及び予め同定されていた腫瘍反応性ＴＣＲの存在に従って、メラノーマ患者のＴＩＬを選択した。

具体的には、１９１３と命名されたメラノーマ患者からのＴＩＬを選択した。新鮮ＴＩＬをその自己腫瘍細胞株と１６時間共培養し、ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞を図７Ａ～Ｃに示す通り選別し、標準の山中因子及びＳＶ４０（すなわち、再プログラミング因子）をコードするセンダイウイルスに感染させた。（図２Ａ及び図７Ａ～Ｃ参照）。３週間後、典型的なＥＳ細胞様のコロニーが出現し、顕微鏡下で２２１個のコロニーを用手的にピッキングした。次いで、２２１個をピッキングした後に残ったコロニーを１つのサンプルとしてプールした。１３本の各マスターチューブに約２０個のクローンをプールした。各マスターチューブから全ＤＮＡを抽出し、ＴＣＲベータディープシーケンシングによってＴＣＲを同定した。表５にまとめたように、これら１３本のマスターチューブから合計９つの異なるＴＣＲが検出された。表５に、患者１９１３からのマスターチューブから得られた９つの異なるＴＣＲのＴＣＲ ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析をまとめる。列は、左から右に向かって、ＴＣＲの番号、各ＴＣＲのそれぞれのＣＤＲ３ベータアミノ酸配列、それらのＶベータファミリー、バルク（出発材料における共培養前）及び選別されたＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋（ＤＰ）集団における頻度、濃縮（ＤＰ／バルク）、並びに樹立されたｉＰＳＣクローンにおける各ＴＣＲの存在を示す。

ＴＣＲのうち４つは、１３本のマスターチューブ全てで検出された。他の５つのＴＣＲは、それぞれマスターチューブのうちの１本でしか検出されなかった。６つのＴＣＲは、自己腫瘍細胞に対して反応性であることが既に確認されており（Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ；４（９）Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１６）、その６つ全てが、新鮮ＴＩＬ及び選別されたＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団において様々な頻度で検出可能であった。出発細胞（単離ＴＩＬ；バルクとも称される）及びその自己腫瘍細胞と１６時間共培養し、ＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋に基づいて選別した後（ＤＰ）の９つの異なるＴＣＲの頻度を、表５にまとめる。濃縮（すなわち、ＤＰ／バルクの頻度の比）を表すグラフを図７Ｅとして提供する。

表６は、６つの既に同定されていた（予め同定されていた）腫瘍反応性ＴＣＲのＴＣＲベータ配列解析をまとめた表であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列、Ｖベータファミリー、バルク（出発材料における共培養前）及び選別されたＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋（ＤＰ）集団における頻度、濃縮（ＤＰ／バルク）、並びに樹立されたｉＰＳＣクローンにおける存在を示す。サンプル５に関して、このＴＣＲは、樹立されたｉＰＳＣクローンでは見られなかったが、残りのコロニーをプールしたサンプル（２２１個のｉＰＳＣ細胞のコロニーをピックアップした後に残ったもの）では検出され、このことは、このＴＣＲが、活性化Ｔ細胞集団に存在し、より多くのコロニーのスクリーニングを行っていればｉＰＳＣでも検出された可能性があることを示す。

ＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団では、予め同定されていた６つのＴＣＲの頻度が出発時のバルク集団と比較して高く、このことは、再プログラミング前にＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団を濃縮することが有効な戦略であることを示す。（図２Ｃ及び図２Ｄ参照）。予め同定されていた６つの腫瘍抗原特異的ＴＣＲのうち３つが、ＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団に比較的高い頻度（＞２％）で存在していた。これらＴＣＲは、全てのｉＰＳＣマスターチューブで検出されたことから、多数（すなわち、少なくとも１３）のクローンがＴＣＲを保有していたことを示唆している。他の３つの予め同定されていた腫瘍抗原特異的ＴＣＲは、ＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団において比較的低い頻度で検出され（＜２％）、いずれのｉＰＳＣマスターチューブでも検出されなかった。

従って、この実施例は、ＴＩＬを自己腫瘍細胞で刺激し、ＰＤ－１及び４－１ＢＢの発現に基づいて同定された反応性集団を濃縮することにより、ＴＩＬがｉＰＳＣに再プログラムされることを実証する。

実施例３
この実施例では、ＴＩＬのｉＰＳＣへの再プログラミングとその後のその解析について説明する。

患者＃３７８４からのＴＩＬを自己腫瘍細胞株と共培養した。ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＰＤ１＋４－１ＢＢ＋細胞を選別し（図３Ａ参照）、既述のようにｉＰＳＣに再プログラムした。合計１７８個のｉＰＳＣ株を樹立し、ＴＣＲベータ配列を同定した。様々な方法を用いて、患者の腫瘍細胞が発現する変異抗原に特異的な８つの異なるＴＣＲを予め同定しておいた。その大部分は、初期のバルクＴＩＬ及びＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団では比較的低頻度であった。表７は、予め同定されていた８つの腫瘍反応性ＴＣＲのＴＣＲベータ配列解析をまとめたものを提供する。表７に、ＣＤＲ３アミノ酸配列、Ｖベータファミリー、バルク集団における頻度、選別されたＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋（ＤＰ）集団における頻度、濃縮（ＤＰ／バルク）、及び樹立されたｉＰＳＣクローンにおける存在を示す。

表７からわかる通り、ある主要なＴＣＲは、バルク集団と比較してＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団で１．４３倍多く存在し、９本のマスターチューブ中２本で検出された。その他は、樹立されたクローンでは検出されなかった。９本のマスターチューブから、合計２５個の異なるＴＣＲベータ鎖が検出された。表８に、患者３７８４から得られた２５個の異なるＴＣＲのＴＣＲ ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析をまとめる。列は、左から右に向かって、ＴＣＲの番号、各ＴＣＲのそれぞれのＣＤＲ３ベータアミノ酸配列、それらのＶベータファミリー、バルク（出発材料における共培養前）及び選別されたＰＤ１＋ ４－１ＢＢ＋集団（ＤＰ）における頻度、濃縮（ＤＰ／バルク）、並びに樹立されたｉＰＳＣクローンにおける各ＴＣＲの存在を示す。

興味深いことに、ＴＩＬ－ｉＰＳＣクローンで同定されたＴＣＲのほとんどは、初期ＴＩＬ又はＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団において検出不可能であったか又は非常に低頻度であった。そのうちの幾つかは、バルク集団に比べてＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋の集団では高度に濃縮されていた。（表８を参照）

特定の理論に束縛されることを望むものではないが、それらの低頻度Ｔ細胞クローンは、自己腫瘍細胞によって活性化され、優先的にＴＩＬ－ｉＰＳＣに再プログラムされた可能性がある。

これらＴＣＲが患者の腫瘍細胞に対して反応性であるかどうかを調べるために、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ株の一部からＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖をシーケンシングし、同定した。表９は、個別にシーケンシングした、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ集団で同定された４つの候補ＴＣＲアルファ及びベータ対をまとめたものである。表には、アルファ鎖及びベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列、ＶＡファミリー、ＴＣＲ ＡＪファミリー、ＶＢ、ＤＢ、及びＪＢファミリー、並びにバルク（出発材料における共培養前）及び選別したＤＰ集団での頻度を含有するＴＣＲベータのｉｍｍｕｎｏｓｅｑ解析、並びに濃縮（ＤＰ集団／バルク）が含まれる。ポジティブコントロールは、バルクＴＩＬ集団に比較的高い頻度（７．１８％）で存在する予め同定されていた腫瘍細胞反応性ＴＣＲ（ＰＩＲ－ＴＣＲ）である。内因性ＴＣＲとの対合を低減するために、マウスＴＣＲ定常領域を使用した。公開データベースから入手可能なヒト定常領域配列も使用することができた（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８４８（ＴＲＡＣ）、Ｐ０１８５０（ＴＲＢＣ１）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ０Ｇ２ＪＭＢ４（ＴＲＢＣ２）を参照）。

ＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団でＴＣＲベータ配列が検出されなかったＴＩＬ－ｉＰＳＣクローンからの３つのＴＣＲ対、ＴＣＲベータの頻度が非常に低い（０．１３％）クローンからの１つのＴＣＲ対、及びポジティブコントロールを全て、自己腫瘍細胞に対する特異性について試験した。ＴＣＲアルファ及びベータ対をレトロウイルスベクターにクローニングし、健常ドナーの末梢血Ｔ細胞に形質導入し、自己腫瘍細胞の特異的認識について試験した。新たに試験した４対のＴＣＲのうちの３対（ＴＣＲ－１、２、及び４）は、予め同定されていた反応性ＴＣＲ（ポジティブコントロール）と同様に、自己腫瘍細胞に対して反応性であった（図４Ｂ、Ｃ、及びＤを参照）。

従って、この開示は、ＴＩＬを自己腫瘍細胞で刺激し、ＰＤ－１及び４－１ＢＢの発現に基づいて同定された反応性集団を濃縮することによるＴＩＬのｉＰＳＣへの再プログラミングによって、希少腫瘍抗原特異的ＴＣＲが効率的に同定できることを実証する。腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のクローニングを成功させるためには、出発ＴＩＬ集団における腫瘍特異的Ｔ細胞の頻度が重要な要因となっている。単一細胞からＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖を同定するための最先端の技術を用いたとしても、処理能力の問題もあり、検出限界はいまだ１０００細胞中１個程度である。本明細書に開示される方法では、バルクＴＩＬ又は選別されたＰＤ－１＋ ４－１ＢＢ＋集団のディープシーケンシングによって検出不可能であった腫瘍反応性ＴＣＲが検出された。これら腫瘍抗原特異的ＴＣＲは、養子細胞療法に使用することができる患者ＰＢＭＣを遺伝的に改変するために使用することができる。更に、本開示は、従来可能であったものよりも多様なＴＣＲのセットを有するｉＰＳＣを作製するための有効な方法を提供する。これらｉＰＳＣは、細胞療法において使用するためのＴ細胞に再分化することができる。

本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって組み入れられると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「等」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。

本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められているところに従い、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。

Claims (87)

1. 腫瘍抗原特異的Ｔ細胞誘導多能性幹細胞（Ｔ－ｉＰＳＣ）の単離集団を製造する方法であって、
   （ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
   （ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
   （ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を前記共培養されたＴ細胞から単離することと、
   （ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、前記細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
   を含む方法。
2. 前記第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、請求項１に記載の方法。
4. 前記共培養が、約３～４８時間進行する、請求項１に記載の方法。
5. 前記共培養が、約８～４８時間進行する、請求項１に記載の方法。
6. 前記共培養が、約８～２４時間進行する、請求項１に記載の方法。
7. 前記共培養が、約１２～２０時間進行する、請求項１に記載の方法。
8. 前記共培養が、約１６時間進行する、請求項１に記載の方法。
9. 前記腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記がん細胞が、前記対象から単離される、請求項９に記載の方法。
11. 前記単離されたＴ細胞が、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、前記ペプチドプールが、腫瘍抗原に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記対象が、哺乳類である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
20. 前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
21. ｉＰＳＣの単離集団におけるｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
22. がんを有する対象におけるがんを治療又は予防するための医薬を製造する方法であって、
    （ａ）請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
    （ｂ）前記ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
    （ｃ）前記分化したＴ系列細胞を、前記対象におけるがんを治療又は予防するための医薬に製剤化することと、
    を含む方法。
23. がん抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
    （ａ）請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従ってｉＰＳＣの単離集団を製造することと、
    （ｂ）前記ｉＰＳＣの単離集団に含まれる核酸のＲＮＡ又はＤＮＡのシーケンシングを行うことにより、がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を決定することと、
    を含む方法。
24. 前記がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が、ＤＮＡシーケンシングを行うことによって決定される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記がん抗原特異的ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が、ＩｍｍｕｎｏＳＥＱによって決定される、請求項２３に記載の方法。
26. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従って製造されたｉＰＳＣと、薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。
27. 請求項１９に記載の方法に従って製造された分化したＴ系列細胞と、薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。
28. がんを有する対象におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従って製造されたｉＰＳＣの単離集団又は請求項２６に記載の組成物。
29. 前記対象が、哺乳類である、請求項２４に記載の使用のためのｉＰＳＣの単離集団又は組成物。
30. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項２５に記載の使用のためのｉＰＳＣの単離集団又は組成物。
31. がんを有する対象におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項１９に記載の方法に従って製造されたＴ系列細胞又は請求項２３に記載の組成物。
32. 前記対象が、哺乳類である、請求項２７に記載の使用のためのＴ系列細胞又は組成物。
33. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項２８に記載の使用のためのＴ系列細胞又は組成物。
34. 腫瘍抗原特異的ＴＣＲを同定する方法であって、
    （ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
    （ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
    （ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
    （ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、前記細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
    （ｅ）ｉＰＳＣコロニーからＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードするＤＮＡ配列を決定することと、
    を含む方法。
35. （ｆ）（ｅ）のＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の配列を含む発現ベクターを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入する工程と、
    （ｇ）形質導入されたＰＢＭＣを前記がんに関連する１つ以上の腫瘍抗原と接触させる工程と、
    （ｈ）前記形質導入されたＰＢＭＣの前記１つ以上の腫瘍抗原に対する反応性を測定する工程であって、前記反応性によって、前記ＴＣＲが腫瘍抗原特異的であることが確認される工程と、
    を更に含む、請求項３４に記載の方法。
36. 更に、前記反応性が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーのアップレギュレーションによって測定される、請求項３５に記載の方法。
37. 更に、前記反応性が、１つ以上のサイトカインの産生によって測定される、請求項３５に記載の方法。
38. 更に、前記反応性が、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞を殺傷する前記形質導入されたＰＢＭＣの能力によって測定される、請求項３５に記載の方法。
39. 前記第１のサンプルが、腫瘍サンプルである、請求項３４～３８に記載の方法。
40. 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、請求項３４～３８に記載の方法。
41. 前記接触が、約３～４８時間進行する、請求項３４～３８に記載の方法。
42. 前記接触が、約８～４８時間進行する、請求項３４～３８に記載の方法。
43. 前記接触が、約８～２４時間進行する、請求項３４～３８に記載の方法。
44. 前記接触が、約１２～２０時間進行する、請求項３４～３８に記載の方法。
45. 前記接触が、約１６時間進行する、請求項３４～３８に記載の方法。
46. 前記腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記がん細胞が、前記対象から単離される、請求項３４～４５に記載の方法。
48. 前記単離されたＴ細胞が、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記がん細胞が、前記対象から単離される、請求項５１に記載の方法。
53. 前記単離されたＴ細胞が、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、前記ペプチドが、腫瘍抗原である、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記腫瘍抗原特異的ＴＣＲが、前記対象からの前記第１のサンプルから単離されたＴ細胞の９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又は０．１％未満を占める、請求項３４に記載の方法。
59. 前記第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、請求項５８に記載の方法。
60. 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、請求項５８に記載の方法。
61. 腫瘍抗原特異的ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のポリクローナル集団を作製する方法であって、
    （ａ）がんを有する対象からの第１のサンプルからＴ細胞を単離することと、
    （ｂ）（ａ）で単離されたＴ細胞を１つ以上の腫瘍抗原と接触させて、共培養されたＴ細胞を製造することと、
    （ｃ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現するＴ細胞を（ｂ）の共培養されたＴ細胞から単離することと、
    （ｄ）（ｃ）で単離されたＴ細胞をＴ－ｉＰＳＣに再プログラムするのに十分な条件下で、前記細胞を１つ以上の再プログラミング因子と接触させることと、
    （ｅ）前記ｉＰＳＣをＴ系列細胞に分化させて、分化したＴ系列細胞を得ることと、
    を含む方法。
62. 前記第１のサンプルが、腫瘍サンプル又はＰＢＭＣである、請求項６１に記載の方法。
63. 工程（ａ）で単離されたＴ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、請求項６１に記載の方法。
64. 前記共培養が、約３～４８時間進行する、請求項６１に記載の方法。
65. 前記共培養が、約８～４８時間進行する、請求項６１に記載の方法。
66. 前記共培養が、約８～２４時間進行する、請求項６１に記載の方法。
67. 前記共培養が、約１２～２０時間進行する、請求項６１に記載の方法。
68. 前記共培養が、約１６時間進行する、請求項６１に記載の方法。
69. 前記腫瘍抗原が、がん細胞に由来する、請求項６１～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記がん細胞が、前記対象から単離される、請求項６９に記載の方法。
71. 前記単離されたＴ細胞が、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞と共培養される、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記単離されたＴ細胞が、自己腫瘍細胞と共培養される、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記単離されたＴ細胞が、放射線照射された腫瘍細胞と共培養される、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記単離されたＴ細胞が、腫瘍細胞株と共培養される、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記単離されたＴ細胞が、ペプチドプールと共培養され、前記ペプチドプールが、腫瘍抗原に由来する、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記１つ以上のＴ細胞活性化マーカー（複数可）が、ＰＤ－１又は４－１ＢＢを含む、請求項６１～７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記再プログラミング因子が、クルッペル様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、八量体結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、ＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））、及びラージＴ抗原（ＳＶ４０）のうちの１つ以上を含む、請求項６１～７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記対象が、哺乳類である、請求項６１～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記哺乳類が、ヒトである、請求項７８に記載の方法。
80. 前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項６１～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 配列番号１～１６から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列。
82. （ａ）配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
    （ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
    （ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
    （ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
    （ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
    を含む、組換えＴＣＲ。
83. （ａ） 配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域；
    （ｂ）配列番号９のＶアルファ鎖及び配列番号１３のＶベータ鎖；
    （ｃ）配列番号１０のＶアルファ鎖及び配列番号１４のＶベータ鎖；
    （ｄ）配列番号１１のＶアルファ鎖及び配列番号１５のＶベータ鎖；又は
    （ｅ）配列番号１２のＶアルファ鎖及び配列番号１６のＶベータ鎖
    を含む、キメラＴＣＲ。
84. 請求項８２に記載の組換えＴＣＲ又は請求項８３に記載のキメラＴＣＲを発現する単離細胞。
85. 前記単離細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項８４に記載の単離細胞。
86. 前記ヒトＴ細胞が、内因性ＴＣＲを除去するように遺伝的に改変されている、請求項８５に記載の単離細胞。
87. 内因性ＴＲＡＣ遺伝子座が、配列番号１～４のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖａ領域及び配列番号５～８のいずれか１つのＣＤＲ３ Ｖｂ領域を含むＴＣＲをコードする核酸配列で置換されており、ＴＣＲＢ遺伝子座が、ノックアウトされている、請求項８５に記載の単離細胞。