JP2023538409A - 組み換えａａｖの作製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生するプロセスに関するものであり、本明細書では、これをトランスシュードタイピング（trans-pseudotyping）として記載している。前記プロセスは、第１の宿主細胞内で組み換えＡＡＶ粒子を産生し、次いで第２の宿主細胞内で組み換えＡＡＶ粒子を産生することを含み、前記第１の宿主細胞および前記第２の宿主細胞において、それぞれ第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現させることにより、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれた第１の組み換えＡＡＶ粒子と、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれた第２の組み換えＡＡＶ粒子とを産生する。前記第１の組み換えＡＡＶ粒子および前記第２の組み換えＡＡＶ粒子のそれぞれは、好ましくは、産生細胞株（ＡＡＶの高効率産生のため）および治療適応症に関連する細胞（当該適応症の治療のため）に対する細胞向性が異なる。【選択図】図１

Description

本発明は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生するプロセスに関するものであり、本明細書では、これをトランスシュードタイピング（trans-pseudotyping）として記載している。前記プロセスは、第１の宿主細胞内で組み換えＡＡＶ粒子を産生し、次いで第２の宿主細胞内で組み換えＡＡＶ粒子を産生することを含み、前記第１の宿主細胞および前記第２の宿主細胞において、それぞれ第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現させることにより、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれた第１の組み換えＡＡＶ粒子と、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれた第２の組み換えＡＡＶ粒子とを産生する。前記第１の組み換えＡＡＶ粒子および前記第２の組み換えＡＡＶ粒子のそれぞれは、好ましくは、産生細胞株（ＡＡＶの高効率産生のため）および治療適応症に関連する細胞（当該適応症の治療のため）に対する細胞指向性が異なる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する単鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは、ほとんどの患者において限定的な免疫応答のみを引き起こす、非病原性ウイルスである。ＡＡＶ粒子の表面のカプシドにより、ウイルスの細胞向性および組織向性が規定される。カプシドのなかには、分裂細胞および非分裂細胞の両方を含む、広範囲の宿主細胞に感染できるものもあれば、かなり制限されるものもある。カプシドによっては、ＨＥＫ２９３細胞などの標準的な産生細胞株または製造細胞株に感染しないものもある。

ここ数年間、ＡＡＶ由来のベクターが、遺伝子送達の非常に有用かつ有望な形態として浮上している。これは、これらのベクターの下記の特性による。
－ＡＡＶは、小さいノンエンベロープのウイルスであり、その内在遺伝子は２つのみ（ｒｅｐおよびｃａｐ）である。したがって、様々な遺伝子療法用のベクターを開発するために容易に操作できる。これは、ＡＡＶゲノム中のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の除去によって、また、これらの配列を患者に治療効果を提供しうる外因性配列（導入遺伝子）に置き換えることによって、達成される。
－ＡＡＶ粒子は、剪断力、酵素または溶媒によって容易に分解されない。このことは、これらのウイルスベクターの精製および最終製剤化を容易にする。
－ＡＡＶは非病原性であり、免疫原性が低い。これらのベクターを使用することにより、好ましくない炎症反応のリスクをさらに低減する。レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは違い、ＡＡＶは害がなく、なんらかのヒトの疾患を起こす原因になるとは考えられていない。
－ＡＡＶベクターを使用して、患者に約４５００ｂｐ以下の遺伝子配列を送達することができる。
－野生型ＡＡＶベクターはヒト染色体１９へ遺伝物質を挿入する時があることが示されている一方で、この特性は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をウイルスゲノムから取り除くことにより、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターから一般的には除去されている。かかる場合に、前記ウイルスは、宿主細胞内でエピソーム形態のままである。これらのエピソームは非分裂細胞中で保全されるが、分裂細胞中では細胞分裂の間に失われる。

天然型ＡＡＶゲノムは、それぞれが複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子との２つの遺伝子を含み、ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノムの非構造タンパク質の、ＡＡＶのライフサイクルおよび部位特異的な組み込みに必要な非構造的タンパク質をコードし、ｃａｐ遺伝子は構造カプシドタンパク質をコードする。また、これらの２つの遺伝子の両側には、ヘアピン構造を構成する能力がある１４５個の塩基からなる末端逆位反復配列（ＩＴＲ）がある。これらのヘアピン配列は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼに依存しない合成と、ウイルスＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込みとのために必要である。

ウイルスの組み込み能力を除去するために、組み換えＡＡＶベクターでは、ウイルスゲノムのＤＮＡからｒｅｐおよびｃａｐを除去する。かかるベクターを製造するために、所望の導入遺伝子（単数または複数）が、その導入遺伝子（単数または複数）の転写を駆動するためのプロモーターとともに、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入される。ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子をコードする第２のプラスミドまたはヘルパーウイルスからトランスで提供される。アデノウイルスＥ４遺伝子、アデノウイルスＥ２ａ遺伝子およびアデノウイルスＶＡ遺伝子などのヘルパー遺伝子も、プラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供される。ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびヘルパー遺伝子は、細胞にトランスフェクトされた追加のプラスミド上に提供されてもよく、ヘルパーウイルスを介して提供されてもよい。

従来、ＡＡＶベクターの産生は異なる多数の経路で達成されている。

当初、ＡＡＶは野生型（ＷＴ）アデノウイルス血清型５を用い、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子とＡＡＶゲノムとをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトして生成された。これにより、ＷＴアデノウイルスがウイルス複製を容易にする数多くの因子をトランスに提供できるようになった。しかし、この手法には数多くの限界があった。たとえば、ＡＡＶの各バッチは純粋な生成物を提供するためには製造後にアデノウイルス（ＡＶ）粒子から分離しなければならないが、すべてのＡｄ５を確実に除去することは困難である。さらに、製造中に、細胞が、ＡＡＶよりむしろアデノウイルス粒子の産生にかなりのリソースを充当していることも望ましくない。

他の系では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現する安定的なパッケージ細胞株が使用されてきた。かかる系では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれ、したがってプラスミドベースのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が不要になる。しかしながら、これらの遺伝子は、通常、その固有の毒性のせいで、組み込まれる頻度が低い（たとえば、細胞あたり１～２コピー）。これらの系はアデノウイルスベクターの感染を必要とする。

さらに最近では、アデノウイルスに基づく系は、ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルスゲノムの部分をコードするプラスミドに置き換えられた。これにより、最終ウイルス調製物中に存在するアデノウイルス粒子に関する懸念の一部は解決したが、数多くの問題が残っている。その問題には、産生細胞株にトランスフェクションするのに十分なプラスミドを予め製造しておく必要があることや、トランスフェクションのプロセスそれ自体が本質的に非効率であること、などがある。

現在のすべてのＡＡＶ産生方法では、より多くのＡＡＶを産生するために、毎回、プラスミドのトランスフェクション、細胞株の組み込み、またはヘルパーウイルスによって、ＡＡＶゲノムをトランスで提供する必要がある。

本発明者らは、細胞に、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現するアデノウイルスと、上記いずれかの方法で産生された感染性ＡＡＶ粒子とを共感染させると、すでに産生された、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を増殖させることができるということを見出した。

しかし、ＡＡＶ粒子の表面に用いられるＡＡＶカプシドのなかには、特定の標的治療組織（たとえば、網膜ニューロンまたは肝細胞）に対する選択性を示すものもあるため、上記のようなＡＡＶの継続的増殖という新しい手法が機能するのは、産生されるＡＡＶが産生細胞株（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）に感染する能力がある場合に限られる。多くの場合、ＡＡＶは感染できないか、できたとしても効率が低い（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞中のＡＡＶ６およびＡＡＶ９など）。

本発明者らは、本明細書において、新たに命名されたトランスシュードタイピングというプロセスにより、この問題を克服する方法について説明する。

各ＡＡＶ粒子は、ｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドポリペプチドに基づいて、さまざまな細胞への指向性を有する。ｃａｐ遺伝子によっては、産生細胞株に効率よく感染できるカプシドもあるが（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞中のＡＡＶ２カプシド）、産生細胞株に効率よく感染できないカプシドもある（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞中のＡＡＶ９カプシド）。上記のように、本発明者らは、ＡＡＶを用いて産生細胞株に感染させ、ｃａｐ遺伝子をトランスで提供することにより、ＡＡＶを産生する新しい方法を開発した。したがって、産生細胞株に感染する能力を「シードストック（seed stock）」ＡＡＶ粒子に付与するｃａｐ遺伝子が提供されることで（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＡＶ２）、ＡＡＶは、最初は継続的に増殖することができる。産生細胞株に感染するカプシドに包まれたシードストックＡＡＶ材料が十分に産生されたら、最終産生工程において、別のカプシドをトランスで提供して、所望の新しい指向性を有するＡＡＶを産生することができる。このような代替の第２のｃａｐ遺伝子を搭載して産生されたＡＡＶ粒子は、産生細胞株には感染しないかもしれないが、治療適応症に関連する細胞に感染させるのに用いられる。また、その表面のカプシドにより、標的細胞または標的組織に感染するための選択性や優れた特異性は得られるが、産生細胞株に対する感染力は失われるか、または低下する可能性がある。本明細書において、このプロセスをトランスシュードタイピングと称する。

したがって、本発明の目的は、組み換えＡＡＶ粒子を産生するプロセスを提供することであって、第１の組み換えＡＡＶ粒子は、第１の宿主細胞において産生され、ここで、前記ＡＡＶ粒子は、第２の宿主細胞（たとえば、産生細胞株）に対する指向性を有し、その後、第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるような条件下で、前記第２の宿主細胞を培養し、第２の組み換えＡＡＶ粒子は、所望の治療標的組織または治療標的臓器の細胞に感染するための指向性を有する。

一実施形態において、本発明は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生するプロセスを提供する。前記プロセスは、下記（ａ）～（ｄ）を含み、必要に応じて下記（ｅ）を含む。
（ａ）第１の宿主細胞群を培養する工程であって、第１の宿主細胞のそれぞれは、
（ｉ）組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子と、
（ｉｉ）第１のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子であって、前記第１のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドを含むＡＡＶ粒子に、第２の宿主細胞に対する指向性を付与する、核酸分子と、
（ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子と、
（ｉｖ）ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子と、を含み、
前記第１の宿主細胞内での前記（ｉ）～（ｉｖ）のそれぞれの発現は、前記第１の宿主細胞において、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第１の組み換えＡＡＶ粒子が産生するのに十分な条件下で、第１の宿主細胞群を培養し、前記第１のＡＡＶ粒子は、前記第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている、工程；
（ｂ）第２の宿主細胞群に、前記工程（ａ）で産生された前記第１の組み換えＡＡＶ粒子を感染させる工程；
（ｃ）前記第２の宿主細胞群において、（ｉ）～（ｉｉｉ）を発現させる工程であって、
（ｉ）第２のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子であって、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドを含むＡＡＶ粒子に、第３の宿主細胞に対する指向性を付与する、核酸分子、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子、
（ｉｉｉ）ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子、
前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のすべては、それぞれ独立して前記第２の宿主細胞に存在するか、または前記第２の宿主細胞に後から導入されており、
前記第２の宿主細胞内で前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のそれぞれの発現は、前記第２の宿主細胞において、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるのに十分であり、前記第２の組み換えＡＡＶ粒子は、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている、工程；
（ｄ）前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるような条件下で、前記第２の宿主細胞を培地で培養する工程であって、前記第２の組み換えＡＡＶ粒子のそれぞれが、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれている、工程；
（ｅ）前記第２の宿主細胞もしくは前記培地から前記第２の組み換えＡＡＶ粒子を精製および／または単離する工程。

配列の詳細
下記の配列は、本願明細書の一部を構成する配列表に示されている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さく（約２０ｎｍ）、複製欠損のあるノンエンベロープウイルスである。一部の実施形態において、ＡＡＶは、アデノ随伴ディペンドパルボウイルスＡである。他の実施形態において、ＡＡＶは、アデノ随伴ディペンドパルボウイルスＢである。

ＡＡＶ粒子は、ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムをカプシドで包むカプシドタンパク質から形成されている。野生型ＡＡＶゲノムは、２つの遺伝子を含み、それぞれが複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。すなわち、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶのライフサイクルおよびウイルスゲノムの部位特異的な組み込みに必要な非構造的タンパク質をコードし、ｃａｐ遺伝子は、構造カプシドタンパク質をコードする。本明細書において、「組み換えＡＡＶ粒子」という用語は、組み換えＡＡＶゲノムを含むＡＡＶ粒子を指す。

本明細書において、「組み換えＡＡＶゲノム」という用語は、介在配列に隣接するＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶゲノムを指す。介在配列は、１００ｂｐを超えることが好ましい。また、介在配列は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子もＡＡＶ ｃａｐ遺伝子も含まない。介在配列は、好ましくは、導入遺伝子を含む。
好ましくは、「組み換えＡＡＶゲノム」という用語は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の代わりに）含むＡＡＶゲノムを指す。

本明細書において、「ＡＡＶゲノム」、「ＡＡＶトランスファーベクター」および「トランスファープラスミド」という用語は、交換可能に使用される。それらはすべて、介在配列に隣接する５'－および３'－ウイルス性（好ましくは、ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むベクターのことを指す。

導入遺伝子は、コーディング配列であっても、非コーディング配列であってもよく、また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよい。好ましくは、導入遺伝子は、ポリペプチドまたはその断片をコードする。

好ましくは、導入遺伝子は、１つ以上の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメント（たとえば、エンハンサー配列、プロモーター配列、ターミネーター配列など）と作動可能に関連している。

一部の実施形態において、導入遺伝子は、治療ポリペプチドまたはその断片をコードする。好ましい治療ポリペプチドとしては、たとえば、抗体、ＣＡＲ－Ｔ分子、ｓｃＦＶ、ＢｉＴＥｓ、ＤＡＲＰｉｎｓおよびＴ細胞受容体が挙げられる。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ＤＲＤ１などのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ＣＤ１９、ＣＤ４０またはＣＤ３８などの免疫療法ターゲットである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ヒトの視覚または網膜機能に関与する遺伝子、たとえば、ＲＰＥ６５またはＲＥＰの機能的コピーである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、ヒトの血液産生に関与する遺伝子の機能的コピーであるか、または第ＩＸ因子などの血液成分であるか、またはβおよびαサラセミアもしくは鎌形赤血球貧血に関与するものである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）またはアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）におけるものなどの免疫機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、細胞の増殖を増加／減少させるタンパク質、たとえば、増殖因子受容体である。一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、イオンチャネルポリペプチドである。

一部の実施形態では、治療ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子である。好ましくは、免疫チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー（たとえば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲまたはＣＤ１３７）、またはＢ７－ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバー（たとえば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳ）である。好ましくは、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ１またはＧＩＴＲである。一部の好ましい実施形態において、導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ酵素（たとえば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１またはその変異体もしくは誘導体）またはＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡをコードする。

工程（ａ）は、第１の宿主細胞群を培養することを含み、第１の宿主細胞のそれぞれは、（ｉ）組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子を含む。

本明細書において、前記核酸分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、好ましくは、ＤＮＡである。

一実施形態において、前記核酸分子は、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子を含むベクターまたはプラスミドの形態であってもよい。

別の実施形態において、前記核酸分子は、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子を含む組み換えＡＡＶ粒子の形態であってもよい。

本実施形態では、前記組み換えＡＡＶ粒子は、第１の宿主細胞に対する指向性を付与するＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている。

前記組み換えＡＡＶ粒子は、適切な方法で作製することができる。組み換えＡＡＶ粒子を作製する一般的な方法は、当該技術分野において周知である。

別の実施形態において、前記核酸分子は、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子を含む組み換えアデノウイルス（ＡＶ）粒子の形態であってもよい（たとえば、ＷＯ２０１９／０２０９２２に記載され、さらに本明細書にも記載されている）。

別の実施形態において、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子は、前記第１の宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれていてもよい。

本発明の一部の実施形態において、工程（ａ）は、前記第１の宿主細胞に、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子を導入する前工程をさらに含む。組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子は、上記の形態のいずれであってもよい。

本明細書において、「導入する」という用語は、形質転換を含み、特に、エレクトロポレーション、接合、感染、形質導入またはトランスフェクションのいずれの形態をも含む。「導入された」という用語も、必要な変更を加えて、同様に解釈される。

第１の組み換えＡＡＶ粒子は、第２の宿主細胞に対する指向性を付与する第１のＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。第２の組み換えＡＡＶ粒子は、第３の宿主細胞に対する指向性を付与する第２のＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。

ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によってコードされる。本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子をいい、前記ＯＲＦのそれぞれは、ＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｃａｐ構造タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶカプシドを形成する。

前記３つのＣａｐタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３であり、これらのサイズは、一般的にはそれぞれ８７ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６２ｋＤａである。したがって、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、３つのＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする遺伝子である。野生型ＡＡＶにおいて、これらの３つのタンパク質はｐ４０プロモーターから翻訳され、１つのｍＲＮＡを形成する。このｍＲＮＡが合成されたのちに、長いイントロンまたは短いイントロンを切り取ることができ、その結果、２．３ｋｂまたは２．６ｋｂのｍＲＮＡが形成される。前記ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシドタンパク質サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成され、前記サブユニットは、１：１：１０の比率の正二十面体対称で配置され、３．９ ＭＤａの推定サイズを有する。本明細書において、「ｃａｐ遺伝子」という用語は、野生型ｃａｐ遺伝子およびその誘導体、ならびに、同等の機能を有する人工のｃａｐ遺伝子を含む。

本明細書において、ＡＡＶ血清型１～９のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列およびＣａｐポリペプチド配列は、それぞれ配列番号１～１８に示されている。本明細書における「ｃａｐ遺伝子」またはＣａｐポリペプチドコーディング配列という用語は、好ましくは、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。
（ａ）ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１７）に示されるヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド分子；
（ｂ）ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１７）に示されるヌクレオチド配列の変異体を含むか、または前記変異体からなるポリペプチド分子であって、前記変異体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１７）に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％（好ましくは、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子；
（ｃ）ヌクレオチド配列が、下記（ｉ）または（ｉｉ）をコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド分子：
（ｉ）アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１８）に示されるポリペプチド、
（ｉｉ）（ｉ）の変異体であって、前記変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１８）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％（好ましくは、少なくとも９５％）の配列同一性を有する変異体。

好ましくは、前記変異体は、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチドおよびＶＰ３ポリペプチドの１つ以上であるか、またはこれらのポリペプチドの１つ以上をコードする。

第１の組み換えＡＡＶ粒子は、第２の宿主細胞に対する指向性を付与する第１のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれており、必要に応じて、第２の宿主細胞と第１の宿主細胞に対しても指向性を付与する第１のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれている。したがって、第２の宿主細胞は、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれたＡＡＶ粒子を感染させることができる細胞である。

第２の組み換えＡＡＶ粒子は、第３の宿主細胞（標的細胞）に対する指向性を付与する第２のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれている。したがって、第３の宿主細胞（標的細胞）は、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれたＡＡＶ粒子を感染させることができる細胞である。

好ましくは、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、第２の宿主細胞に対する指向性を付与しない、すなわち、第２の宿主細胞は、第２の組み換えＡＡＶ粒子を高効率で感染させることができない。この点に関して、「高効率」という用語は、検出可能な導入遺伝子の発現を実現するために、細胞あたり１００を超えるウイルス粒子を必要とするものとして定義されうる。

したがって、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドおよび第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有するであろう。好ましくは、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドと第２のＡＡＶカプシドポリペプチドとのアミノ酸配列同一性は、９９．５％未満であり、たとえば、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満または９０％未満であり、少なくとも５０％である。好ましくは、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドと第２のＡＡＶカプシドポリペプチドとのアミノ酸配列同一性は、８０％～９５％の間である。好ましくは、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドおよび第２のＡＡＶカプシドポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸で異なり、たとえば、１～５、５～１０または１０～２０のアミノ酸で異なる。

第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第２の宿主細胞内では発現しない。第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第１の宿主細胞内では発現しない。

ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶの宿主細胞への指向性によって決まる。血清型は、ウイルスの種内の明確な変異である。これらのウイルスは、細胞表面（すなわち、カプシド）の抗原に基づいてまとめて分類されるため、ウイルスの疫学的分類が亜種レベルまで可能になる。

ＡＡＶカプシドタンパク質には、１２の超可変表面領域が含まれる。天然カプシドポリペプチドは、アミノ酸配列が互いに異なる。主要な変異領域は、カプシド遺伝子のＶＰ３領域内にあると認識されている。ただし、ＶＰ３領域は、ＶＰ１コーディング配列およびＶＰ２コーディング配列で共有される。したがって、Ｃａｐポリペプチドの可変領域は、より一般的には、ｃａｐ遺伝子のＣ末端側の半分にあることから、通常はすべてのカプシドコーディング配列が変異を共有する、という方が正確である。したがって、第１の組み換えＡＡＶ粒子および第２の組み換えＡＡＶ粒子は、血清型が異なることが好ましい。

１１の異なるＡＡＶ血清型が公知である。前記公知の血清型は、いずれも多種多様な宿主細胞型の細胞に感染することができる。第１の組み換えＡＡＶ粒子および第２の組み換えＡＡＶ粒子の血清型は、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０および血清型１１、またはこれらの血清型の改変型もしくは変異型からなる群から選択されてもよい。第１の組み換えＡＡＶ粒子および第２の組み換えＡＡＶ粒子の血清型は、好ましくは、血清型１、血清型２、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８および血清型９、またはこれらの血清型の改変型もしくは変異型からなる群から選択される。

第１の組み換えＡＡＶ粒子は、最も好ましくは、血清型２（すなわち、ＡＡＶ２）である。第２の組み換えＡＡＶ粒子は、最も好ましくは、血清型９（すなわち、ＡＡＶ９）である。

さらにより好ましくは、第２の組み換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９の指向性と比較して、第３の宿主細胞（標的細胞）への指向性が高い血清型であるか、またはその血清型の改変誘導体もしくは変異誘導体である。

本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする遺伝子をいい、前記ＯＲＦのそれぞれは、ＡＡＶ Ｒｅｐ非構造的タンパク質またはその変異体もしくは誘導体をコードする。これらのＡＡＶ Ｒｅｐ非構造的タンパク質（またはその変異体もしくは誘導体）は、ＡＡＶゲノム複製および／またはＡＡＶゲノムパッケージングに関与している。

野生型ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０という３つのプロモーターを含む。

異なる長さの、２つの重複するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）は、ｐ５から、およびｐ１９から、産生することができる。これらのｍＲＮＡのそれぞれは、１つのスプライスドナー部位と２つの異なるスプライスアクセプター部位とを使用し、スプライスアウトできるイントロンを含むか、またはスプライスアウトできないイントロンを含む。このように、６つの異なるｍＲＮＡが形成でき、そのうち４つのみが機能的である。前記イントロンを除去していない２つのｍＲＮＡ（ｐ５から転写されたものと、ｐ１９から転写されたもの）は、共通ターミネーター配列まで読み取られ、かつ、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２をそれぞれコードする。前記イントロンの除去および前記５'モストスプライスアクセプター部位の使用は、なんらかの機能的なＲｅｐタンパク質の産生をもたらすわけではない－前記配列の残りのフレームがシフトするから正しいＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ４０タンパク質を産生できず、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ５２のターミネーターがスプライスアウトされるので、それらの正しいＣ末端を産生することもないだろう。逆に、前記イントロンの除去および前記３'スプライスアクセプターの使用は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０の正しいＣ末端を含み、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のターミネーターをスプライスアウトすることになるだろう。したがって、機能的スプライシングのみで、イントロンをまとめてスプライスアウトすることを回避する（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２を産生する）か、または前記３'スプライスアクセプターを使用する（Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０を産生する）かのどちらかになるだろう。その結果、重複した配列を持つ４つの異なる機能的Ｒｅｐタンパク質が、これらのプロモーターから合成できる。

野生型ｒｅｐ遺伝子では、ｐ４０プロモーターは３'末端に位置する。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）の転写は、野生型ＡＡＶゲノムでは、このプロモーターから開始される。

前記４つの野生型Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０である。したがって、野生型ｒｅｐ遺伝子は、前記４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする遺伝子である。

本明細書において、「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、野生型ｒｅｐ遺伝子およびその誘導体、ならびに同等の機能を有する人工のｒｅｐ遺伝子を含む。野生型ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐ７８ポリペプチド、Ｒｅｐ６８ポリペプチド、Ｒｅｐ５２ポリペプチドおよびＲｅｐ４０ポリペプチドをコードする。

完全な野生型ＡＡＶ（血清型２）ｒｅｐ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１９に示されている。本明細書において、野生型ＡＡＶ（血清型２）Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２４および２６に示されている。本明細書において、野生型ＡＡＶ（血清型２）Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１、２３、２５および２７に示されている。

本明細書における「ｒｅｐ遺伝子」またはＲｅｐポリペプチドコーディング配列という用語は、好ましくは、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。
（ａ）ヌクレオチド配列が配列番号１９、２０、２２、２４または２６のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１９）に示されるヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド分子；
（ｂ）ヌクレオチド配列が配列番号１９、２０、２２、２４または２６のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１９）に示されるヌクレオチド配列の変異体を含むか、または前記変異体からなるポリペプチド分子であって、前記変異体は、配列番号１９、２０、２２、２４または２６のいずれか１つ（好ましくは、配列番号１９）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％（好ましくは、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子；
（ｃ）ヌクレオチド配列が下記（ｉ）または（ｉｉ）をコードするヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド分子：
（ｉ）アミノ酸配列が配列番号２１、２３、２５または２７のいずれか１つ（好ましくは、配列番号２１）に示されるポリペプチド、
（ｉｉ）（ｉ）の変異体であって、前記変異体は、配列番号２１、２３、２５または２７のいずれか１つ（好ましくは、配列番号２１）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％（好ましくは、少なくとも９５％）の配列同一性を有する変異体。

好ましくは、前記変異体は、Ｒｅｐ７８ポリペプチド、Ｒｅｐ６８ポリペプチド、Ｒｅｐ５２ポリペプチドおよびＲｅｐ４０ポリペプチドの１つ以上であるか、またはこれらのポリペプチドの１つ以上をコードする。

ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（およびその中のタンパク質コーディングＯＲＦのそれぞれ）は、１つ以上の異なるウイルス（たとえば、２つ、３つまたは４つの異なるウイルス）由来であってもよい。たとえば、前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２由来であってもよく、一方で前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ５由来であってもよい。

ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が系統や分離株によって異なることは、当業者に認識されている。かかる系統や分離株のすべてから由来するこれら遺伝子の配列が本明細書において含まれ、またそれらの誘導体も含まれる。

ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子も宿主細胞内で発現する。ヘルパー遺伝子は、ＡＡＶゲノムの複製および感染性ＡＡＶ粒子の産生を促進するのに必要である。好適なウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡの１つ以上またはそれらのすべてを含み、さらに必要に応じてＥ２Ａ遺伝子を含む。ヘルパー遺伝子は、好ましくは、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスに由来するウイルスヘルパー遺伝子である。ヘルパー遺伝子は、最も好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子である。一部の宿主細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）のゲノムには、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子が安定的に組み込まれているため、そのような宿主細胞に、これらの後者の遺伝子のさらなるコピーを導入する必要はない。

組み換えＡＡＶゲノムを含む組み換えＡＡＶ粒子を産生するためには、ＡＡＶゲノムが宿主細胞内に存在するとともに、ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドが宿主細胞内で産生されるか、またはトランスで提供されなければならない。さらに、十分なウイルスヘルパー遺伝子（たとえば、アデノウイルスＥ４、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＶＡ ＲＮＡ、ならびに必要に応じてＥ２Ａ遺伝子）が必要とされる。

本明細書において、「導入する」という用語は、形質転換を含み、特に、エレクトロポレーション、接合、感染、形質導入またはトランスフェクションのいずれの形態をも含む。「導入された」という用語も、必要な変更を加えて、同様に解釈される。

ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子ならびにウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子は、下記（ｉ）～（ｖ）のうちの１つ以上の形態で、第１の宿主細胞および／または第２の宿主細胞に独立して存在してもよいし、第１の宿主細胞および／または第２の宿主細胞に別々に導入してもよい。
（ｉ）宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる；
（ｉｉ）宿主細胞内にエピソームとして存在する；
（ｉｉｉ）宿主細胞内の組み換えアデノウイルスに存在する；
（ｉｖ）宿主細胞に組み換えアデノウイルスで導入される；または
（ｖ）宿主細胞にベクターまたはプラスミドで導入される。

第１の宿主細胞および第２の宿主細胞における、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子ならびにウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子の形態は、同じであっても異なっていてもよい。

工程（ａ）において、上記（ｉｖ）または（ｖ）が宿主細胞に導入される実施形態の場合、この導入は、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子の導入前または導入後に行えばよい。

第１の宿主細胞および第２の宿主細胞のそれぞれについて、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子は、ベクターもしくはプラスミドの形態であるか、または組み換えアデノウイルスに存在することが好ましい。

ベクター、プラスミドまたは組み換えアデノウイルスは、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子の導入前または導入後に宿主細胞に導入されるか、あるいは組み換えＡＡＶ粒子のトランスフェクション前またはトランスフェクション後に宿主細胞に導入されることが好ましい。

最も好ましくは、第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子は、第１の宿主細胞に、プラスミドの形態で導入されるか、またはＡＶ組み換えゲノムで導入される（たとえば、ＷＯ２０１９／０２０９２２に記載され、さらに本明細書にも記載されている）。

最も好ましくは、第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子は、第２の宿主細胞に、ＡＶ組み換えゲノムで導入される（たとえば、ＷＯ２０１９／０２０９２２に記載され、さらに本明細書にも記載されている）。

好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子は、第１の宿主細胞に、プラスミドの形態で導入されるか、またはＡＶ組み換えゲノムで導入される（たとえば、ＷＯ２０１９／０２０９２２に記載され、さらに本明細書にも記載されている）。好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子は、第２の宿主細胞に、ＡＶ組み換えゲノムで導入される（たとえば、ＷＯ２０１９／０２０９２２に記載され、さらに本明細書にも記載されている）。

ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子は、好ましくは、ヘルパーアデノウイルスの形態である。ＡＶ Ｅ１ａ遺伝子およびＡＶ Ｅ１ｂ遺伝子は、好ましくは、宿主細胞ゲノム（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）に組み込まれる。

最も好ましくは、工程（ａ）の構成要素（ｉ）～（ｉｖ）は、同時に送達されることであろう。

上記のように、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、１つ以上の組み換えアデノウイルスで、宿主細胞に別々に導入（たとえば、トランスフェクト）されてもよく、もしくは宿主細胞内にすでにある１つ以上の組み換えアデノウイルスに存在してもよい。

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を順応するために、１つ以上のアデノウイルス遺伝子の一部または全部を欠失させてもよい。これらには、宿主細胞ゲノム（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）に組み込まれるＥ１ａおよびＥ１ｂなどのヘルパー遺伝子が含まれうる。

たとえば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルス初期遺伝子の１つに挿入されてもよく、アデノウイルスから初期遺伝子が欠失した部位に挿入されてもよい。後者の例では、欠失した初期遺伝子は、前記欠失した遺伝子を含む細胞株、たとえば、アデノウイルスＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域を含むＨＥＫ２９３細胞によって、トランス補完されてもよい。

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ１欠失を含む領域に挿入されてもよい。他の例では、アデノウイルスに必須ではない遺伝子も欠失させることができ、これらの部位を本発明の核酸分子の挿入に用いることができる。たとえば、アデノウイルスベクターでは、ほとんどのＥ３遺伝子を欠失させることができるので、アデノウイルスのＥ３領域に、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を挿入してもよい。

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、（アデノウイルス遺伝子の転写の方向に対して）センスの向きで、またはアンチセンスの向きで、アデノウイルス遺伝子に挿入されてもよい。本発明の好ましい実施形態は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、Ｅ１領域に挿入される場合、Ｅ４、Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ発現カセットと同じ転写方向にあることであろう。これは、（Ｅ１欠失ＡＶに保持されることが多い）Ｅ１Ａプロモーターが、ｒｅｐ遺伝子発現を駆動するプロモーターとして動作しないようにするためである。前記Ｅ１Ａプロモーターは、ＡＶパッケージングシグナルを含んでいるので、除去できない。

本発明の好ましい実施形態は、Ｒｅｐコーディング配列が上流プロモーターを含まないことであろう。

一部の好ましい実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、アデノウイルスＥ１遺伝子に挿入され、好ましくは、Ｅ１遺伝子の一部が欠失している。好ましくは、前記Ｅ１遺伝子は、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂである。

ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにウイルスヘルパー遺伝子は、それぞれ独立して、構成型プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターまたは最小プロモーターなどのプロモーターと作動可能に関連していてもよく、もしくはプロモーターと作動可能に関連していなくてもよい。本明細書において、プロモーターおよび遺伝子という文脈での「作動可能に関連する」という用語は、問題となっているプロモーターと遺伝子とが、前記プロモーターが前記遺伝子の転写を促進できるほど互いに十分に近い距離で位置しているということを意味する。一部の実施形態において、前記プロモーターと前記遺伝子とは、並置されているか、または近接している。

ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に関連するプロモーターは、好ましくは、構成型プロモーターまたは誘導性プロモーターであり、より好ましくは、最小ＣＭＶプロモーターなどの構成型プロモーターである。一部の実施形態において、第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／または第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、プロモーターと作動可能に関連していないか、または最小プロモーターと作動可能に関連している。

好ましくは、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子と作動可能に関連するプロモーターが組み換えＡＶ内にコードされる場合、使用されるプロモーターは、アデノウイルスに対するｃａｐ遺伝子の毒性および必要とされる発現レベルに基づいて選択されることであろう。本発明者らは、ｃａｐ遺伝子のなかには、ＣＭＶプロモーターの下で発現することができ、ＡＶの複製にほとんどまたは全く影響を及ぼさないものがあることを見出した（たとえば、ＡＡＶ９）。逆に、比較的発現が少ない最小ＣＭＶプロモーターによって駆動される場合にのみ、ＡＶに挿入することができるｃａｐ遺伝子もある（たとえば、ＡＡＶ６）。したがって、ｃａｐ遺伝子を駆動するプロモーターは、低発現プロモーターおよび高発現プロモーターの実験的試験に基づくことが好ましいであろう。この場合、高発現プロモーターはＣＭＶプロモーターであり、低発現プロモーターは同じプロモーターの最小プロモーター領域である。

一部の実施形態において、Ｒｅｐポリペプチドは、低レベル、ベースラインレベルまたは最小限レベルで発現する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、いかなる機能的プロモーターとも作動可能に関連していない。本明細書において、「低レベル、ベースラインレベルまたは最小限レベル」という用語は、（野生型ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の）野生型ｐ５プロモーターと作動可能に関連する野生型Ｒｅｐ７８ポリペプチドの発現レベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満である、Ｒｅｐ７８ポリペプチドの発現レベルのことを指す。このようにして、少なくともいくつかのＡＡＶの産生を可能にするために、十分なＲｅｐポリペプチドが提供されるが、Ｒｅｐポリペプチドの発現レベルはアデノウイルスの複製を完全に阻害するには不十分である。

ヘルパー遺伝子と作動可能に関連するプロモーターは、好ましくは、構成型プロモーターまたは誘導性プロモーターであり、より好ましくは、構成型プロモーターである。

構成型プロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ（ヒトまたはマウス）、ＨＳＶ ＴＫ、ＳＦＦＶ、ユビキチン、伸長因子アルファ、ＣＨＥＦ－１、ＦｅｒＨ、Ｇｒｐ７８、ＲＳＶ、アデノウイルスＥ１Ａ、ＣＡＧもしくはＣＭＶ－ベータ－グロブリンプロモーター、またはそれらから誘導されたプロモーターなどがある。

好ましくは、ｒｅｐ遺伝子プロモーターは、ＳＶ４０プロモーターもしくはそれから誘導されたプロモーター、または、ヒト細胞およびヒト細胞株（たとえば、ＨＥＫー２９３細胞）中のＳＶ４０プロモーターと比較して同じかそれより小さい強度のプロモーターである。

一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導可能または抑制可能な調節（プロモーター）エレメントを含むことにより、誘導性または抑制性である。たとえば、前記プロモーターは、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧまたはラクトースで誘導可能なものであってもよい。

ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、それぞれ独立して、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどのターミネーターと作動可能に関連していてもよい。

本発明の実施形態において、組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子が組み換えＡＡＶ粒子の形態である場合、前記組み換えＡＡＶ粒子は、第１の宿主細胞に対する指向性を付与するＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている。第２の宿主細胞は、第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれたＡＡＶ粒子を感染させることができる細胞である。第３の宿主細胞（標的細胞）は、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれたＡＡＶ粒子を感染させることができる細胞である。

工程（ａ）の目的は、工程（ｂ）で使用される多量の組み換えＡＡＶ粒子を産生することである。したがって、第１の宿主細胞は、高力価の第１の組み換えＡＡＶ粒子を産生できる細胞であることが好ましい。一部の実施形態において、第１の宿主細胞は、ＡＡＶ産生細胞株またはＡＡＶ製造細胞株、すなわち、ＡＡＶカプシドの作製およびＡＡＶの成熟に必要なすべてのポリペプチドを含む細胞株に由来する。第１の宿主細胞は、１つ以上の異なる種類の細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞とＰｅｒＣ６細胞との混合物）を含んでもよい。好ましくは、第１の宿主細胞は、すべて同じ種類である。

第１の宿主細胞は、好ましくは、哺乳類細胞である。哺乳類細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウシおよび類人猿に由来する任意の臓器または組織に由来するものが挙げられる。前記細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。前記細胞は、初代細胞であってもよく、不死化細胞であってもよい。

好ましい第１の宿主細胞には、ＨＥＫ－２９３細胞株、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｅ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ｓ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧ細胞株、ＨＥＫ－２９３ ＦＴＭ細胞株、ＨＥＫ－２９３ＳＧＧＤ細胞株、ＨＥＫ－２９３Ａ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、Ｃ１２７細胞株、Ａ５４９細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＣＨＯ細胞株、マウス骨髄腫細胞株、ＰｅｒＣ６細胞株、９１１細胞株およびＶｅｒｏ細胞株がある。ＨＥＫー２９３細胞は、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を含むように改変されているため、これらのタンパク質がヘルパープラスミドに供給される必要がない。同様に、ＰｅｒＣ６細胞および９１１細胞も、より小さな改変を含み、使用することができる。最も好ましくは、ヒト細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＰｅｒＣ６、９１１またはＨｅＬａＲＣ３２である。他の好ましい細胞には、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞およびＶＥＲＯ細胞などがある。最も好ましくは、第１の宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、ＰｅｒＣ６細胞または９１１細胞である。

工程（ａ）の目的は、工程（ｂ）で使用される多量の第１の組み換えＡＡＶ粒子を産生することである。工程（ｂ）は、第２の宿主細胞群に、工程（ａ）で産生された第１の組み換えＡＡＶ粒子を感染させることを含む。

この工程では、組み換えＡＡＶ粒子を第２の宿主細胞群に接触させて、第２の宿主細胞に第１の組み換えＡＡＶ粒子を感染させるようにする。これらの第２の宿主細胞に第１の組み換えＡＡＶ粒子を感染させることができるのは、第１の組み換えＡＡＶ粒子を包むＡＡＶカプシドにより、第２の宿主細胞に対する指向性が付与されているからであろう。

工程（ｂ）の感染工程は、精製されたＡＡＶ粒子を含む組成物を用いて行うことが好ましい。すなわち、前記組成物は第１の宿主細胞を何も含まず、好ましくは、前記組成物は細胞を何も含まない。

工程（ｂ）の目的は、その後の治療に使用される多量の組み換えＡＡＶ粒子を産生することである。したがって、第２の宿主細胞は、高力価の第２の組み換えＡＡＶ粒子を産生できる細胞であることが好ましい。

第２の宿主細胞は、第１の宿主細胞の種類のいずれかであってもよく、それらの混合物であってもよい。第２の宿主細胞は、最も好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、ＰｅｒＣ６細胞または９１１細胞である。

第１の宿主細胞の種類は、第２の宿主細胞の種類と同じであっても異なっていてもよい。

第１の宿主細胞／第２の宿主細胞と、これらの宿主細胞に対する指向性を備えた、特定の血清型のＡＡＶ粒子との好ましい組み合わせを以下の表に示す。

第１の宿主細胞および／または第２の宿主細胞は、組み換え宿主細胞であってもよい。

工程（ｃ）は、
（ｃ）前記複数の第２の宿主細胞において、（ｉ）～（ｉｉｉ）を発現させる工程であって、
（ｉ）第２のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子であって、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドを含むＡＡＶ粒子に、第３の宿主細胞に対する指向性を付与する、核酸分子、
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子、
（ｉｉｉ）ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子、
前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のすべては、それぞれ独立して前記第２の宿主細胞に存在するか、または前記第２の宿主細胞に後から導入されており、
前記第２の宿主細胞内で前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のそれぞれの発現は、前記第２の宿主細胞において、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるのに十分であり、
前記第２の組み換えＡＡＶ粒子は、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている、工程である。

工程（ｃ）では、ＡＡＶゲノムの複製を促進し、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれた第２の組み換えＡＡＶ粒子を産生するために、第２の（すなわち、異なる）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、（工程（ａ）と比較して）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびウイルスヘルパー遺伝子とともに発現させる。これにより、第３の宿主細胞に対する指向性を備えた組み換えＡＡＶ粒子が産生される。

第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第２の宿主細胞内で発現する。第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とは異なる。第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、上記で定義した通りである。第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、第２の宿主細胞内では発現しない。

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子は、上記で定義した通りである。工程（ａ）および工程（ｃ）で用いられる、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子は、同じであっても異なっていてもよい。

ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子は、上記で定義した通りである。工程（ａ）および工程（ｃ）で用いられる、ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子は、同じであっても異なっていてもよい。

工程（ｄ）は、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるような条件下で、前記第２の宿主細胞を培地で培養することを含み、該第２の組み換えＡＡＶ粒子は、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれている。ＡＡＶ産生のための宿主細胞の培養条件は、当技術分野において周知である。培養工程中に、Ｒｅｐポリペプチドおよび第２のＣａｐポリペプチドが産生され、さらにウイルスヘルパーポリペプチドも産生されるであろう。第１のＣａｐポリペプチドは産生されないであろう（なぜなら、第２の宿主細胞は第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を発現しないからである）。組み換えＡＡＶゲノムが複製されて、第２のＣａｐ（カプシド）ポリペプチドによってカプシドに包まれることにより、第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるであろう。

工程（ｅ）は任意である。工程（ｅ）は、前記第２の宿主細胞または前記培地から前記第２の組み換えＡＡＶ粒子を精製および／または単離する工程を含む。宿主細胞および培地から組み換えＡＡＶ粒子を精製および／または単離する方法は、当技術分野において周知である。

第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、第２の組み換えＡＡＶ粒子に、第３の宿主細胞（標的細胞）に対する向性を付与する。第３の宿主細胞は、高効率の産生細胞株／製造細胞株（ＨＥＫ２９３、ＰｅｒＣ６、９１１など）と同じＡＡＶ受容体を持たない細胞であることが好ましい。第１のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドによってカプシドに包まれたＡＡＶ粒子に、第３の宿主細胞に対する有効な指向性を付与しないことが好ましい。第２の組み換えＡＡＶ粒子は、第１の宿主細胞または第２の宿主細胞よりも第３の宿主細胞に対して強い指向性を示すであろう。第３の宿主細胞は、好ましくは、第１の宿主細胞とも第２の宿主細胞とも同じ種類ではない。

好ましい第３の宿主細胞（標的細胞）としては、ニューロン（好ましくは、網膜ニューロン）、肝細胞、筋細胞、幹細胞（たとえば、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、脂肪幹細胞および人工多能性幹細胞ならびにそれらの派生株）、免疫細胞 （Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージおよび顆粒球を含む）、内皮細胞、心血管細胞、上皮細胞、間葉細胞、膵臓ａ細胞、膵臓ｂ細胞、心筋細胞、脾臓細胞、脂肪細胞、グリア細胞、線維芽細胞、クッパー細胞および癌細胞（たとえば、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、癌腫細胞、肉腫細胞および黒色腫細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、前記プロセスは、第３の宿主細胞に本発明の第２の組み換えＡＡＶ粒子を感染させる工程（ｆ）をさらに含む。第２の組み換えＡＡＶ粒子は、第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれるため、第３の宿主細胞に対する指向性が付与される。これにより、第２の組み換えＡＡＶ粒子の第３の宿主細胞への感染が促進される。

前記プロセスの各工程は、指定された順序で行われることが好ましい。

本発明は、本発明のプロセスによって得られるか、または得ることができる第２の組み換えＡＡＶ粒子も提供する。

本発明は、組み換えＡＡＶ粒子をシュードタイピングして、それらの宿主向性の範囲を変更するプロセスも提供する。前記プロセスは、本発明の工程（ａ）～（ｄ）を含み、必要に応じて工程（ｅ）を含む。

ＷＯ２０１９／０２０９９２は、後期アデノウイルス遺伝子の転写が、主要後期プロモーターへのリプレッサーエレメントの挿入により調節（阻害など）できることを開示している。アデノウイルス後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことにより、細胞のタンパク質製造能力を所望の組み換えタンパク質またはＡＡＶ粒子の産生に転用することができる。ＷＯ２０１９／０２０９９２の内容は、その全体が、本明細書中に具体的に援用される。

したがって、一部の実施形態において、組み換えアデノウイルス（すなわち、アデノウイルスベクター）は、抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）と複数のアデノウイルス後期遺伝子とを含み、前記ＭＬＰは、前記アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することができる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、かつ、前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。

他の実施形態において、組み換えアデノウイルス（すなわち、アデノウイルスベクター）は、（ａ）複数のアデノウイルス初期遺伝子と、（ｂ）主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある複数のアデノウイルス後期遺伝子と、（ｃ）導入遺伝子（たとえば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む）とを含み、前記ＭＬＰは、前記アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することができる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、かつ、前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。

ウイルス（好ましくは、ＡＡＶ）粒子を産生するのに好ましい特徴としては、下記のものがある。
－ＭＬＰ ＴＡＴＡボックスと転写＋１位との間に、１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
－前記リプレッサーエレメントは、リプレッサータンパク質と結合することができる。
－前記リプレッサーエレメントと結合することができるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、アデノウイルスゲノム内でコードされる。
－前記リプレッサータンパク質は、前記ＭＬＰの制御下で転写される。
－前記リプレッサータンパク質は、テトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーであり、好ましくは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である。
－前記リプレッサーエレメントは、配列番号２８に示される配列を含むか、または前記配列からなるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である。
－前記ＭＬＰのヌクレオチド配列は、配列番号２９または配列番号３０に示される配列を含むか、または前記配列からなる。
－前記リプレッサーエレメントの存在は、アデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響を及ぼさない。
－アデノウイルスベクターは、前記ＭＬＰの制御下にないアデノウイルスＬ４ １００Ｋタンパク質をコードする。
－導入遺伝子は、アデノウイルス初期領域の１つに挿入され、好ましくは、トランスファープラスミドの代わりにアデノウイルスＥ１領域に挿入される。
－前記導入遺伝子は、その５'－ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
－前記導入遺伝子は、治療ポリペプチドをコードする。
－前記導入遺伝子は、ウイルスタンパク質をコードし、好ましくは、細胞の中または外に集まってウイルス様粒子を産生することができるタンパク質をコードし、好ましくは、前記導入遺伝子は、ノロウイルスＶＰ１または肝炎Ｂ ＨＢｓＡＧをコードする。

好ましくは、リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される。好ましくは、導入遺伝子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。

２つのアミノ酸配列または核酸配列を整合するために利用できるアルゴリズムは、多数確立されている。典型的には、１つの配列が参照配列となり、参照配列に対して試験配列を比較すればよい。配列比較アルゴリズムは、試験配列の参照配列に対する百分率配列同一性を、指定されたプログラムパラメータに基づいて算出する。比較を目的としたアミノ酸配列または核酸配列の整合（alignment）は、たとえば、コンピュータ実行アルゴリズム（たとえば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムなどによって実施されてもよい。

百分率アミノ酸配列同一性および百分率ヌクレオチド配列同一性は、ＢＬＡＳＴ整合法を使用して判定してもよい（Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。

タンパク質データベース内の類似した配列を見つけるために、標準タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を使用してもよい。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは類似した局所的な領域を発見することができるように設計されている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐは全般的整合も報告し、これはタンパク質同定の目的には好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。一部の場合では、「低複雑度フィルター」を外してもよい。

ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施してもよい。比較を目的としたギャップ整合を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389の記載に従ってギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することができる。またその代わりに、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する累次検索を実施することができる（Altschul et al. (1997) 上記参照）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。

ヌクレオチド配列の比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いてこの目標を達成してもよい。好ましくは、標準またはデフォルトの整合パラメータを用いる。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間で長い整合を効率よく発見するよう特に設計されている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが、同一ではないヌクレオチド配列を発見することができる。

ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、始めにクエリワードとの完全一致を特定する（ワードヒット）。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で拡張し、最終ギャップ整合を生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。

ＢＬＡＳＴ検索の精度を支配する重要なパラメータの一つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、より短いデフォルトワードサイズ（１１）を用いることである。このためｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列に対する整合発見において、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ｂｌａｓｔｎではワードサイズを調節することが可能であり、デフォルト値より短縮して最小で７とし、検索感度を高めることができる。

新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページを用いることにより、より感度の高い検索を遂行することができる（www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html）。このページでは、Ｍａら（Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5）によって報告されたものと同様のアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、整合拡張のシードとして完全ワードマッチを必要とするのではなく、テンプレートのより長いウインドウ内で非連続ワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置での一致の発見に注目する一方で、第３位の不一致を無視することにより、第３塩基のゆれを考慮に入れる。同じワードサイズを用いた不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴにおける検索は、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度および効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメータは、ワードサイズ：１１または１２；テンプレート：１６、１８または２１；テンプレートタイプ：コーディング（０）、非コーディング（１）または両方（２）である。

一部の実施形態においては、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＰ２．５．０＋アルゴリズム（ＮＣＢＩから入手できるものなど）を用いうる。

他の実施形態においては、ギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ １による２つのタンパク質配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ整合を用いたＢＬＡＳＴ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを用いうる（ＮＣＢＩから入手できるものなど）。

本発明の核酸分子、プラスミドおよびベクターは、適切な技術によって作製することができる。本発明の核酸分子および産生細胞株を製造するための組み換え方法は、当技術分野において周知である（たとえば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (updated 2014)）。

本願に記載された各参照文献の開示は、その全体が、参照により、本明細書中に具体的に援用される。

図１は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９と、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ２遺伝子をコードするテトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス（ＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ２）との共感染による、ＨＥＫ２９３細胞内での組み換えＡＡＶ２ベクターの産生を示す。 図２は、組み換えＡＡＶ２または組み換えＡＡＶ９のいずれかと、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ９遺伝子をコードするテトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス（ＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ９）との共感染による、ＨＥＫ２９３細胞内での組み換えＡＡＶ９ベクターの産生を示す。

本発明は以下の実施例によってさらに例示され、別段の言及がない限りその部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。したがって、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法も付属の請求項の範囲内となることを意図している。

一般的方法
ＡＡＶ成分を含むアデノウイルスベクターの回収
すべての組み換えアデノウイルスベクターは、最初は、ＨＥＫ２９３細胞内で、各ウイルスゲノムをコードするプラスミドＤＮＡから回収される。細菌プラスミドのバックボーンからウイルスＩＴＲを遊離させるためにプラスミド（２０μｇ）をＳｗａｌ制限酵素で線形化し、ゲノム用ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（インビトロジェン（Invitrogen）、カリフォルニア州、米国）を用いて精製した。ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、複数のＴ２５組織培養フラスコに、フラスコあたり２×１０⁶細胞の密度で播種した。各フラスコに対して、製造業者のプロトコルに従い、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロジェン）を用いて、２．５μｇの線形化ＤＮＡをトランスフェクトした。４時間後、トランスフェクション培地を、新しい２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯを添加）と交換した。トランスフェクションから１２日以内に、完全なＣＰＥが観察された時点で、増殖培地から組み換えウイルスを採取した。２回続けて希釈することで単一のクローンを単離し、ＨＥＫ２９３細胞内でさらに増殖させた（そしてドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで培養した）。ウイルスは、感染後３日目に、３回の凍結融解を経て採取された。細胞デブリを遠心分離によってペレット化し、上清を０．２μｍフィルターに通した。大規模なウイルスの増幅および精製のために、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州、米国）に、４８時間播種し、感染前に９５％コンフルエントまで培養した。ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスベクターの場合、ウイルスストック溶液を用いて、３日間、ＭＯＩ ３で、それぞれのＨＹＰＥＲＦｌａｓｋに感染させた。ｔｅｔＲタンパク質によって調節される改変主要後期プロモーターを含むアデノウイルスベクターの場合、ドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬを添加して細胞培養を行った。完全なＣＰＥが現れたら、細胞を採取して、３回の凍結融解によってウイルスを放出させた。ウイルスは、ＣｓＣｌ勾配バンド形成を２回繰り返して精製された。その際、１回目の後にベンゾナーゼ（Benzonase）２５０Ｕ／ｍＬ（シグマアルドリッチ、ミズーリ州、米国）を添加して、遊離ＤＮＡを分解した。

ＡＡＶ形質導入アッセイ
形質導入能力のあるＡＡＶは、改変したＴＣＩＤ５０アッセイで測定できる。ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル組織培養プレートに、ウェルあたり１×１０⁴細胞の密度で、２４時間播種する。その後、総量１．２ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで、それぞれのＡＡＶ粗溶解物のストック溶液を１０倍ずつ８段階希釈する。次に、各希釈サンプル（１×１０^-2～１×１０^-10）の１０回の複製を、各プレートにウェルあたり１００μＬの容量で加える。ネガティブコントロールとして、最後の２列に、１００μＬの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加える。さらに、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Scientific）、マサチューセッツ州、米国）を用いてプレートを観察し、９６ｈｐｉ（感染後９６時間）のウェルごとにＥＧＦＰ発現細胞の存在を確認する。ＫＡＲＢＥＲ－ＳＰＥＡＲＭＡＮ統計法により、１ｍＬあたりの形質導入単位を算出することができる。

ｑＰＣＲを用いたウイルスゲノムおよび遺伝子発現の定量化
ＨＥＫ２９３細胞におけるすべてのアデノウイルスゲノムを定量化するために、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（インビトロジェン、カリフォルニア州、米国）を用いて、培地および細胞溶解物から全ＤＮＡを抽出した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、カリフォルニア州、米国)のＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州、米国) を用いたｑＰＣＲ反応に５μＬのＤＮＡ溶出液を使用した。
ゲノムをカプセル化したＡＡＶ粒子およびアデノウイルス粒子の定量化のために、培地または細胞溶解物から採取したウイルスサンプル２μＬを、２０μＬの反応液中で１ＵのＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州、米国)で、３７℃で２時間処理した。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅは、７５℃で１０分間熱失活させた。ヌクレアーゼを含まない水で１：２００に希釈したサンプル５μＬをＰＣＲ反応に使用することにより、Ａｄ５ヘキソンプライマーとプローブを用いてカプセル化Ａｄ５を定量化し、ＥＧＦＰプライマーとプローブを用いてカプセル化ＡＡＶゲノムを定量化した。ヘルパーアデノウイルスを用いて産生されたＡＡＶベクター全体の力価は、ゲノムをカプセル化したアデノウイルスを差し引くことで求められた。ｑＰＣＲ分析の標準曲線は、ヌクレアーゼを含まない水（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies）、アイオワ州、米国）に懸濁したｇＢＬＯＣＫ遺伝子断片を用いて作成された。また、ＰＣＲ反応のＣＴ値を用いて標準曲線に外挿することにより、ＤＮＡコピー数を算出した（ｑＰＣＲ標準は、３×１０⁸－３×１０¹コピー／ウェル）。

ＥＬＩＳＡによるＡＡＶカプシドの定量化
組み立てられたＡＡＶ２カプシドの検出は、製造業者の指示に従い、ＡＡＶ２ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（プロジェン（Progen）、ハイデルベルク、ドイツ)を用いて行うことができる。

実施例１：プラスミドまたはアデノウイルスのいずれかの手法による第１の宿主細胞におけるＡＡＶの産生
ヘルパーフリーＡＡＶ２およびヘルパーフリーＡＡＶ９の産生は、Ｔａｋａｒａ ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック（Clontech）、カリフォルニア州、米国）に従って行われた。６ウェル組織培養処理プレートでＡＡＶ２およびＡＡＶ９を産生する場合、ＨＥＫ２９３細胞を、ウェルあたり７．５×１０⁴細胞の密度で、トランスフェクションの２４時間前に播種した。ヘルパーフリーで産生するために、各ウェルに対して、ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰおよびｐＲｅｐＣａｐ２またはｐＲｅｐＣａｐ９をＤＮＡ質量比１：１：１で含み、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ギブコ（Gibco）、マサチューセッツ州、米国)で希釈した２．５μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、線形ＰＥＩ２５ｋＤＡ（ポリサイエンス（Polysciences））を用いて、ＤＮＡとＰＥＩとの質量比が１：３の複合体を形成した。
ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むアデノウイルスベクターを用いてＡＡＶを産生する場合、ＨＥＫ２９３細胞を、４８ウェル組織培養プレートに、ウェルあたり７．５×１０⁴細胞の密度で、産生の２４時間前に播種した。各ウェルに、ＥＧＦＰをコードするＡＡＶゲノムを含むＡＡＶと、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の両方を含むアデノウイルスとを共感染させた。処理の４時間後、新しい２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯを添加）と感染培地を交換した。遊離ＤＮＡの分解におけるＤＮａｓｅ反応の効率を判断するために、実験ごとにヘルパーフリー産生対照（helper-free production control）が含まれており、ｐＲｅｐＣａｐ２またはｐＲｅｐＣａｐ９の代わりに、スタッファープラスミドｐＵＣ１９を使用した。ＡＡＶベクターは、増殖培地に懸濁した細胞の凍結融解を３回繰り返すことで採取された。細胞を３０００ｇで２０分間遠心分離してペレット化し、上清を０．２μｍフィルターに通した。

実施例２：ＡＡＶ２を産生するための、異なるＡＡＶ血清型を用いた第２の宿主細胞の感染
図１は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９と、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ２遺伝子をコードするテトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス（ＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ２）との共感染による、ＨＥＫ２９３細胞内での組み換えＡＡＶ２ベクターの産生を示す。上記データは、同じ濃度で異なる血清型のＡＡＶを使用すると、第２の宿主細胞からその後に産生されるＡＡＶの量に著しい影響を与えうることを示している。ＡＡＶ２およびＡＡＶ６は、ＨＥＫ２９３細胞に効率的に感染することが知られているが、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ＡＡＶ５は、ＨＥＫ２９３細胞に効率的に感染しにくいことが知られている。この感染効率は、各血清型の産生量に直接影響する。これらの産生レベルは、ヘルパーフリープラスミドトランスフェクション法と直接比較される。
本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞を、４８ウェル組織培養プレートフォーマットに、９ｅ４細胞/ウェルで２４時間播種した。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ２をコードするテトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス、ならびにＥＧＦＰレポーターをコードする組み換えＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡ６またはＡＡＶ９を、細胞あたり５０ゲノムコピーで用いて、ヘルパーフリープラスミドとともにトリプルトランスフェクトするか、あるいは、共感染させた。
形質導入の９６時間後にＡＡＶベクターを採取し、ＱＰＣＲでカプセル化ＡＡＶ粒子を定量化した。

実施例３：ＡＡＶ９を産生するための、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９を用いた第２の宿主細胞の感染
図２は、組み換えＡＡＶ２または組み換えＡＡＶ９のいずれかと、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ９遺伝子をコードするテトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス（ＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ９）との共感染による、ＨＥＫ２９３細胞内での組み換えＡＡＶ９ベクターの産生を示す。組み換えＡＡＶの生産は、ヘルパーフリープラスミドトランスフェクション法と比較される。上記データは、ＨＥＫ２９３細胞に、ＭＯＩ ５０でＡＡＶ２およびＭＯＩ ７５でＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ９を感染させると、ＭＯＩ ７５０でＡＡＶ９およびＭＯＩ ７５でＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ９を用いた場合に比べて、４．６９倍多くのＡＡＶ９が産生されることを示している。したがって、ＡＡＶの１分子あたりでは、ＨＥＫ２９３細胞において、ＡＡＶ２を用いてＡＡＶ９を作製する方が、ＡＡＶ９を用いてＡＡＶ９を作製するよりも、約７０倍効率がよい。これは、本発明の基本的な例示を表している。
本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞を、４８ウェル組織培養プレートフォーマットに、９ｅ４細胞/ウェルで２４時間播種した。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐ９をコードするＴＥＲＡ－ＲｅｐＣａｐ９ウイルス、ＥＧＦＰレポーターをコードする組み換えＡＡＶ２ベクターまたは組み換えＡＡＶ９ベクターを用いて、表示されたＭＯＩで、ヘルパーフリープラスミドとともにトリプルトランスフェクトするか、あるいは、共感染させた。
形質導入の９６時間後にＡＡＶベクターを回収し、ＱＰＣＲでカプセル化ＡＡＶ粒子を定量化した。

実施例４：標的細胞の感染
標的細胞に、第２の宿主細胞からのＡＡＶを形質導入する。これは、治療中の病状に適したさまざまな手法で達成される。第３の宿主細胞への送達は、患者への注射による直接的なインビボ送達を介してなされる。その結果、ＡＡＶは、治療標的組織に直接注入されるか、または静脈内に送達されるが、第２のカプシドポリペプチドによって標的細胞に感染することが可能である。
患者から単離された細胞にＡＡＶを適用することにより、生体外（ex vivo）でも細胞に感染させることができる。このような感染細胞は、患者に再投与される。

SEQUENCE LISTING FREE TEXT
<210> 1 <223> AAV1 - Capsid Nucleotide Sequence (AF063497.1)
<210> 2 <223> AAV1 - Capsid Protein Sequence
<210> 9 <223> AAV5 - Capsid Nucleotide Sequence (AF085716.1)
<210> 10 <223> AAV5 - Capsid Protein Sequence
<210> 11 <223> AAV6 - Capsid Nucleotide Sequence (AF028704.1)
<210> 12 <223> AAV6 - Capsid Protein Sequence
<210> 13 <223> AAV7 - Capsid Nucleotide Sequence (AF513851.1)
<210> 14 <223> AAV7 - Capsid Protein Sequence
<210> 15 <223> AAV8 - Capsid Nucleotide Sequence (AF513852.1)
<210> 16 <223> AAV8 - Capsid Protein Sequence
<210> 17 <223> AAV9 - Capsid Nucleotide Sequence (AY530556.1)
<210> 18 <223> AAV9 - Capsid Protein Sequence
<223> 28 <223> TetR binding site
<223> 29 <223> Modified MLP
<223> 30 <223> Modified MLP

Claims (12)

1. 組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を製造するためのプロセスであって、前記プロセスは、下記（ａ）～（ｄ）を含み、必要に応じて下記（ｅ）を含むプロセス。
   （ａ）第１の宿主細胞群を培養する工程であって、第１の宿主細胞のそれぞれは、
   （ｉ）組み換えＡＡＶゲノムをコードする核酸分子と、
   （ｉｉ）第１のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子であって、前記第１のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドを含むＡＡＶ粒子に、第２の宿主細胞に対する指向性を付与する、核酸分子と、
   （ｉｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子と、
   （ｉｖ）ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子と、を含み、
   前記第１の宿主細胞内での前記（ｉ）～（ｉｖ）のそれぞれの発現は、前記第１の宿主細胞において、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第１の組み換えＡＡＶ粒子を産生するのに十分な条件下で、第１の宿主細胞群を培養し、前記第１の組み換えＡＡＶ粒子は、前記第１のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている、工程；
   （ｂ）第２の宿主細胞群に、前記工程（ａ）で産生された前記第１の組み換えＡＡＶ粒子を感染させる工程；
   （ｃ）前記第２の宿主細胞群において、（ｉ）～（ｉｉｉ）を発現させる工程であって、
   （ｉ）第２のＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子であって、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドは、該ポリペプチドを含むＡＡＶ粒子に、第３の宿主細胞に対する指向性を付与する、核酸分子、
   （ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸分子、
   （ｉｉｉ）ウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸分子、
   前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のすべては、それぞれ独立して前記第２の宿主細胞に存在するか、または前記第２の宿主細胞に後から導入されており、
   前記第２の宿主細胞内での前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のそれぞれの発現は、前記第２の宿主細胞において、前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるのに十分であり、前記第２の組み換えＡＡＶ粒子は、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドによってカプシドに包まれている、工程；
   （ｄ）前記組み換えＡＡＶゲノムを含む第２の組み換えＡＡＶ粒子が産生されるような条件下で、前記第２の宿主細胞を培地で培養する工程であって、前記第２の組み換えＡＡＶ粒子のそれぞれが、前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドを含むカプシドに包まれている、工程；
   （ｅ）前記第２の宿主細胞もしくは前記培地から前記第２の組み換えＡＡＶ粒子を精製および／または単離する工程。
2. 前記工程（ａ）は、前記第１の宿主細胞に、組み換えＡＡＶゲノムをコードする前記核酸分子を導入する前工程をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記第１の宿主細胞および／または前記第２の宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、ＰｅｒＣ６細胞または９１１細胞である、請求項１または２に記載のプロセス。
4. 前記第１の宿主細胞に導入される、前記組み換えＡＡＶゲノムをコードする前記核酸分子は、プラスミドの形態であるか、組み換えアデノウイルスの形態であるか、または細胞もしくは組み換えＡＡＶ粒子のゲノムに組み込まれている、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
5. 前記第１のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする前記核酸分子および／または前記ｒｅｐ遺伝子をコードする前記核酸分子は、前記第１の宿主細胞に、プラスミドの形態で導入されるか、またはＡＶ組み換えゲノムで導入される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
6. 前記第２のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする前記核酸分子および／または前記ｒｅｐ遺伝子をコードする前記核酸分子は、前記第２の宿主細胞に、プラスミドの形態で導入されるか、またはＡＶ組み換えゲノムで導入される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
7. 前記第１のＡＡＶカプシドポリペプチドと前記第２のＡＡＶカプシドポリペプチドとのアミノ酸配列同一性は、９９．５％未満であり、好ましくは、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満または９０％未満であり、少なくとも５０％である、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
8. 前記第１の組み換えＡＡＶ粒子は、血清型２（ＡＡＶ２）である、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
9. 前記第２の組み換えＡＡＶ粒子は、血清型９（ＡＡＶ９）であるか、または血清型９の改変誘導体もしくは変異誘導体である、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
10. 前記第３の宿主細胞は、ニューロン（たとえば、網膜ニューロン）、肝細胞、筋細胞、幹細胞（好ましくは、造血幹細胞、間葉幹細胞、胚性幹細胞、脂肪幹細胞および人工多能性幹細胞ならびにそれらの派生株）、免疫細胞 （Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージおよび顆粒球を含む）、内皮細胞、心血管細胞、上皮細胞、間葉細胞、膵臓ａ細胞または膵臓ｂ細胞、心筋細胞、脾臓細胞、脂肪細胞、グリア細胞、線維芽細胞、クッパー細胞および癌細胞（好ましくは、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、癌腫細胞、肉腫細胞または黒色腫細胞）からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
11. 前記第１のｃａｐ遺伝子および／または前記第２のｃａｐ遺伝子および／または前記ｒｅｐ遺伝子をコードする前記核酸分子は、組み換えアデノウイルス（ＡＶ）に存在しており、前記組み換えアデノウイルスは、抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）と複数のアデノウイルス後期遺伝子とを含み、前記ＭＬＰは、前記アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することができる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
12. 前記請求項のいずれか１項に記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる第２の組み換えＡＡＶ粒子。

Images