JP2023537995A - 微小液滴を維持する方法における、またはそれに関連する改善 - Google Patents

Abstract

調整油に分散された水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持し、エマルジョンを形成する方法が提供される。方法は、未調整油に少なくとも１つの成分を補充し、調整油を形成するステップと、並びに、少なくとも１つの成分を含む水性微小液滴を準備するステップであって、エマルジョンを形成するため微小液滴から調整油への成分の分配が減少するように、微小液滴が調整油に分散され、ここで、微小液滴内の成分の維持は成分の分配係数値がゼロ以上であることに基づくものである、該水性微小液滴を準備するステップか、または、調整油を形成するため、水性微小液滴から調整油への成分の分配が減少するように、少なくとも１つの成分を含有する培地もしくは緩衝液で未調整油を平衡化するステップであって、ここで、微小液滴内の成分の維持は、分配係数および微小液滴内の成分濃度の積と同等またはそれ以上である調整油内の成分濃度に基づくものである、該未調整油を平衡化するステップか、のいずれかのステップと、を備える。調整油の製造方法も提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、微小液滴（microdroplet）中に少なくとも１つの成分を維持する方法、特に、調整油（conditioned oil）に分散された水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持してエマルジョンを形成する方法に関する。本発明はまた、調整油の製造方法にも関する。

細胞、酵素、オリゴヌクレオチド、さらには単一のヌクレオチドなどの生物学的成分を、ＤＮＡおよびＲＮＡのシーケンシング並びに、細胞およびウイルスの検出および特徴付けを含む一連の分析を実行する目的で、微小液滴内で操作する方法が知られている。これらの方法は、エレクトロウェッティング推進力を用いるか、または担体液（carrier fluid）でコーティングされた基板上に微小液滴を直接印刷することにより、分析デバイス内の微小流体（microfluidic）経路に沿って不混和性の担体液中に分散した微小液滴を移動させることを含む。

これには、必要に応じて生物学的成分を含む担体油中の培地成分（media components）のエマルジョンがデバイスに保存される必要がある。エマルジョンでは多くの場合、培地交換はなく、細胞は液滴内の培地成分に限定される。同様に、有毒な廃棄物が時間の経過とともに液滴内に蓄積し、細胞の寿命を制限する。液滴がチャネル内でインキュベートまたは保存される一般的に知られている機器は、ガスの供給が制限されているため、細胞の生存率が低いレベルであることがしばしばである。ガスは、油の平衡化および、その油がデバイスを通過することによって交換することができる。

一部の培地は、ビタミン、塩、アミノ酸、栄養緩衝成分（ｐＨ緩衝液など）、および成長因子などのＦＢＳ（ウシ胎児血清）成分などの１つ以上の成分を含んでもよく、細胞の増殖および代謝に不可欠である。ビタミンなどのこれら重要な成分は、インビトロ細胞培養を可能にするが、これら重要な成分のいくつかは、優先して油に大量に分配される。そうすると、かかる成分は液滴内の細胞には利用できない。

各培地成分は、平衡状態にある水に対する油中のその成分の相対濃度を表す、オクタノール／水分配係数（partition coefficient）といった関連する十分に文書にて裏付けされた油／水分配係数を有する。

分配係数がゼロでない成分は、油相と培地相との間にその成分が分布するため、成分の一部が油に分配されてしまう。したがって、微小液滴内の成分が失われることとなる。

分配係数が１を超える成分は油に多く分配されるため、これらの成分の損失は大きくなる。さらに、微小液滴がチャネル内でインキュベートまたは保存される場合、ガスの供給が制限されるため、細胞生存率のタイムスケールもまた低下する。ガスは、油の平衡化および、その油がデバイスを通過することによって交換することができる。

最近では、光学的に媒介されるエレクトロウェッティング・オン・デバイス（ｏＥＷＯＤ）によって、微小液滴を油の流れ内に保持できるデバイスが開発された。これにより、液滴内の各培地成分の一部を油に移動させることができる。微小液滴から油に移動する成分の量は、成分の分配係数によって決定できる。油に分配された成分は、油の流れとともに微小液滴から運び去られ、その後失われる。したがって、ガスを補給し、また細胞生存率のタイムスケールを改善することを目的とした油の流れは、微小液滴からの培地の損失をもたらすことにより、細胞の生存率を低下させ得る。

分配係数は濃度比であるため、相対的な油の体積が液滴の体積よりも大きい場合、成分のモル分率が液滴からより多く失われる。そのため、さまざまな油／水の体積または同等に異なる液滴間隔のアレイを有するエマルジョンで生存率アッセイを実行するだけで、細胞生存率に幅広い変動を与えることができる。同様の制限は、例えば薬物などの小分子を使用する代替アッセイで発生する。

したがって、水性微小液滴内に最初に含まれる成分の分配の問題に対処しなければ、多くの重要な成分がデバイスへの液滴の装填中に単純に失われ得る。したがって、このことは、微小液滴内に含まれる細胞の生存率に悪影響を与え得る。

本発明が生まれたのは、上記背景に対抗するものである。

本発明の一態様によれば、水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持する方法が提供され、該方法は、
調整油を形成するため、未調整油（unconditioned oil）に少なくとも１つの成分を補充するステップと、並びに、
少なくとも１つの成分を含む水性微小液滴を準備するステップであって、エマルジョンを形成するため、該微小液滴から調整油への成分の分配が減少するように、該微小液滴が該調整油に分散され、ここで、微小液滴内の成分の維持は成分の分配係数値がゼロ以上であることに基づくものである、該水性微小液滴を準備するステップか、または
調整油を形成するため、水性微小液滴から調整油への成分の分配が減少するように、少なくとも１つの成分を含有する培地もしくは緩衝液で未調整油を平衡化するステップであって、ここで、該微小液滴内の該成分の維持は、分配係数および微小液滴内の成分濃度の積と同等またはそれ以上である該調整油内の成分濃度に基づくものである、該未調整油を平衡化するステップか、のステップと、
を含む、方法である。

本発明で開示されるように、特に明記しない限り、「積（product）」という用語は、指定された係数と濃度との乗算を指す。

本発明の別の態様によれば、調整油に分散された水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持してエマルジョンを形成する方法が提供され、該方法は、
調整油を形成するため、未調整油に、分配係数値がゼロ以上の少なくとも１つの成分を補充するステップか、または
培地からの少なくとも１つの成分の未調整油への分配が調整油を形成するように、少なくとも１つの成分を含有する培地で未調整油を平衡化するステップであって、該調整油中の少なくとも１つの成分濃度は、分配係数および微小液滴中の少なくとも１つの成分濃度の積に等しいか、もしくはそれ以上である、該平衡化するステップか、のステップと、並びに、
調整油および水性微小液滴を含むエマルジョンを形成するステップと、
を含む、方法である。

調整油を使用してエマルジョンを形成すると、培地成分が油相に分配されるのを防ぐことができるため、液滴内でアクセス可能なままになる。したがって、これにより、成分が微小液滴から調整油に分配されることを減少させる。

したがって、本明細書で提供される方法は、微小液滴内のタンパク質発現並びに／または分泌速度、細胞生存率および増殖を改善するなど、例えば細胞生産性にとって重要であり得る微小液滴内の少なくとも１つの成分濃度を維持するために使用できるので、有利であり得る。培地成分を含有する液滴を未調整油に入れた場合は、液滴からの成分損失が発生するだろう。

培地は、１つ以上の細胞、化学試薬および／または非培地成分を含んでもよい。さらにはまたはあるいは、培地は、以下に限定されないが、１つ以上の細胞、化学試薬並びに／または１つ以上の非培地成分、例えば酵素、蛍光色素、レポーター剤（一次抗体および蛍光色素結合検出抗体など）、ビーズ、ポリマー（例えばＰＥＧ、ポリマーもしくはオリゴヌクレオチドなど）を含んでもよい。

一部の培地としては、以下に限定されないが、ビタミン、塩、アミノ酸、ｐＨ緩衝液などの栄養緩衝成分、および成長因子などのＦＢＳ（ウシ胎児血清）成分の１つ以上を挙げることができ、これらは細胞の増殖および代謝に不可欠である。したがって、中に含有される細胞の生存率を延ばすために、液滴内の培地濃度を維持することが重要である。

本明細書で提供される成分は、ビタミン、塩、アミノ酸および／または栄養素であり得るが、これらに限定されない。これらの成分は、多くの場合、細胞の増殖および代謝に必要である。

培地で与えられる成分濃度は、成分の分配係数に依存し得る。例えば、分配係数の値が高い成分は油に容易に移行し得るため、成分の分配効果の帳尻を合わせるには、培地内の成分濃度が１倍を超える必要がある場合がある。本質的に、成分は、前記成分の分配後に微小液滴が１倍の培地濃度に相当するものを保持するようにバランスが取られる。

ゼロでない分配係数を有する成分は、油相と培地相との間に成分が分布し、つまり、液滴が未調整油に入れられた場合、いくらかの損失が発生する。分配係数が１を超えるものは油を好むため、損失ははるかに大きくなる。

いくつかの実施形態では、培地成分は、オクタノール／水といった油／水において付随する分配係数値を有する。オクタノール／水では、分配を通じて失われ得る培地成分の例としては、ビオチン（Ｐ＝２．４５）、パラアミノ安息香酸（Ｐ＝６．７６）、ナイアシンアミド（Ｐ＝０．４１７）などのビタミンが挙げられ、これらはインビトロ培養にとって必須のビタミンである。したがって、本発明で開示される調整油を準備する方法は、重要な成分が微小液滴から油に分配されるのを大きく減少させるのに役立ち得る。

さらに、硫酸マグネシウム（Ｐ＝０．１２３）は酵素補因子であり、細胞増殖に重要なＡＴＰおよび核酸のカウンターイオンである。Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアナリン、Ｌ－トリプトファンなどの必須アミノ酸は細胞のアポトーシスを防ぐために必要であり、これらはすべて０．０１を超える分配係数を有するため、これらの培地成分を含有する液滴が未調整油に置かれた場合、これら成分の一部が分配によって失われ得る。

分配係数（Ｐ）は、Ｐ＝Ｃｏ／Ｃｗとして定義できる。分配係数（Ｐ）＝油相の濃度（Ｃｏ）／水相の濃度（Ｃｗ）である。

いくつかの実施形態では、培地中の少なくとも１つの成分と未調整油との比は、調整油の配合中において１：１である。いくつかの実施形態では、培地中の少なくとも１つの成分と未調整油との比は、調整油の配合中において２：１以上である。これにより、液滴内の培地成分と比較して、調整油の培地成分の効果的なバランスが可能になり、液滴と調整油とが組み合わされるときに、培地成分が油相に分配されるのを防ぐ。

いくつかの実施形態では、微小液滴は、１つ以上の生物学的細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、微小液滴は、生物学的細胞を含まなくてもよい。

いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの試薬を含有する微小液滴および／または調整油をさらに含み得る。試薬の一例は生物製剤であり得る。典型的には、試薬は、微小液滴内の細胞の増殖を助けるか、または代謝を増加させるために供給され得る。

いくつかの実施形態では、調整油は、Ｏ_２およびＣＯ_２で平衡化できる。通常、５％濃度のＣＯ_２（残りは空気）が、細胞を含有する微小液滴に供給され得る。他の実施形態では、ハイブリドーマは７％ＣＯ_２を使用し得る。これは、培地を調和させ、ｐＨを維持するためである。典型的な範囲は、およそｐＨ６～８である。

ＣＯ_２は調整油のｐＨ調節を補助するために使用することができ、Ｏ_２は細胞呼吸に必要であるため、Ｏ_２およびＣＯ_２を供給することは有利である。

いくつかの実施形態では、培地は、細胞増殖培地であり得、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｆ１２－Ｋ、ＨＡＴ培地、またはそれらの改変バージョンの１つ以上から選択される。

いくつかの実施形態では、培地は、細胞生存率、増殖および／または生産性を補助することを目的とした付加的な成長因子または補充を含み得る。

いくつかの実施形態では、１つ以上の微小液滴は化学試薬を含有してもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の微小液滴はビーズまたはレポーター剤を含有してもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の微小液滴は、細胞の継続的な染色を容易にするための染色剤を含有してもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、調整油に分散された１つ以上の微小液滴をＥＷＯＤまたはｏＥＷＯＤデバイスに装填するステップをさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態では、微小液滴は、ＥＷＯＤまたはｏＥＷＯＤデバイスなどの微小流体デバイス内で、すなわち、バルク培地を調整油に流すことによって、例えばフローフォーカシングまたはチップ上での段階的乳化（step emulsification）によって形成され得る。

いくつかの実施形態では、ｏＥＷＯＤデバイスは、第１および第２の複合壁を備える。第１および第２の複合壁のそれぞれは、その上に導体層が設けられた基板を備える。第１の複合壁は、導体層上に光活性層を有する。第１および第２の複合壁のそれぞれは、厚さが２０ｎｍ未満の連続的な誘電体層を有する。第１の誘電体層は、第１の複合壁の光活性層上に設けられる。第２の誘電体層は、第２の複合壁の導体層上に設けられる。

第１の基板および第１の導体層並びに／または第２の基板および第２の導体層は透明であってもよい。

デバイスは、第１および第２の導体層を接続する第１および第２の複合壁に電圧を供給するためのＡ／Ｃ電源と、光活性層に衝突して、対応するエフェメラルエレクトロウェッティング位置を第１誘電体層の表面に誘導するように適合された、光励起可能な層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する少なくとも１つの電磁放射源と、並びに、光活性層上の電磁放射線の衝突点を操作して、エフェメラルエレクトロウェッティング位置の配置を変化させ、それによって微小液滴を移動させることができる少なくとも１つのエレクトロウェッティング経路を作成するためのマイクロプロセッサと、をさらに備え得る。

デバイスは、酸化ケイ素の間隙（interstitial）層をさらに備えてもよい。間隙層の利点は、防汚層または非汚染層の結合層として使用できることである。間隙層は、誘電体層と疎水性層との間に設けられる。間隙層の厚さは、０．１ｎｍ～５ｎｍの間であり得る。間隙層の厚さは、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、もしくは４．５ｎｍより大きくてもよく、または５ｎｍ、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．７５、０．５もしくは０．２５ｎｍ未満であってもよい。

第１のおよび第２の誘電体層の露出面は、微小液滴を含有するように適合された微小流体空間を画定するために、２００μｍ未満離して配置され得る。微小流体空間の幅は２～５０μｍである。いくつかの実施形態では、微小流体空間は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８μｍより大きい。いくつかの実施形態では、微小流体空間は、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６または４μｍ未満であってもよい。

第１および第２の誘電体層の露出面は、第１および第２の壁を所定の量だけ離して保持し、微小液滴を含有するように適合された微小流体空間を画定する１つ以上のスペーサーを含み得る。スペーサーの物理的形状を使用して、デバイス内の微小液滴の分割（splitting）、融合（merging）および伸長を補助することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の微小流体チップは、以下、すなわち、
第１の複合壁であり、
第１の基板、
該基板上の７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有する第１の透明な導体層、
該導体層上の４００～１０００ｎｍの波長範囲の電磁放射によって活性化される光活性層であり、３００～１５００ｎｍの範囲の厚さを有する光活性層、および、
該光活性層上の３０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する第１の誘電層、
で構成される、第１の複合壁と、
第２の複合壁であり、
第２の基板、
該基板上の７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有する第２の導体層、および、
任意で、該第２の導体層上の、３０～１６０ｎｍまたは１２０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する第２の誘電体層、
で構成される、第２の複合壁であって、ここで、第１および第２の誘電体層の露出面は、微小液滴を含有するように適合された微小流体空間を画定するために、１８０μｍ未満離して配置されるものである、第２の複合壁と、
第１および第２の導体層を接続する第１および第２の複合壁に電圧を供給するためのＡ／Ｃ電源と、
光活性層に衝突して、対応する仮想エレクトロウェッティング位置を第１の誘電体層の表面に誘導するように適合された、該光活性層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する少なくとも１つの電磁放射源と、並びに、
光活性層上の電磁放射線の衝突点を操作して、仮想エレクトロウェッティング位置の配置を変化させ、それによって微小液滴を移動させることができる少なくとも１つのエレクトロウェッティング経路を作成するための手段と、
で構成される、ｏＥＷＯＤ構造、を備える。

いくつかの実施形態では、第１および第２の誘電体層は、単一の誘電体材料から構成されてもよく、または２つ以上の誘電体材料の複合体であってもよい。誘電体層は、Ａｌ_２Ｏ_３およびＳｉＯ_２から作られてもよいが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、第１の誘電体層と第２の誘電体層との間に構造体を設けてもよい。第１誘電体層と第２誘電体層との間の該構造体は、エポキシ、ポリマー、シリコーンもしくはガラス、またはそれらの混合物もしくは複合物で作ることができるが、これらに限定されず、直線の、角度のある、湾曲した、または微細構造の壁／面を有する。

第１誘電体層と第２誘電体層との間の構造体は、上部複合壁および底部複合壁に接続されて、封止された微小流体デバイスを作成し、デバイス内のチャネルおよび領域を画定し得る。構造体は、２つの複合壁の間のギャップを占め得る。

いくつかの実施形態では、方法は、さらに、代替の担体液をデバイス内に導入するステップであって、該代替の担体液は調整油である、導入するステップを含む。

代替の担体液をデバイス内に導入するステップは、代謝経路の結果として液滴内の生物学的成分によって排泄される有毒廃棄物の蓄積を防ぐ。時間の経過とともに有毒廃棄物が液滴内に蓄積すると、細胞の寿命が制限される。例えば、オクタノール／水中の乳酸（Ｐ＝０．１９）およびアンモニア（Ｐ＝１．７０）などの廃棄物成分は油に分配し得るため、油の流れによって除去できる。

いくつかの実施形態では、微小液滴は離型剤を含んでもよい。離型剤は、トリプシン、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ、クエン酸、またはＡｃｃｕｔａｓｅのうちの１つ以上であり得る。

いくつかの実施形態では、方法は、さらに、微小液滴をインキュベートするステップを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、さらに、細胞増殖について微小液滴を監視するステップを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、方法は、さらに、細胞のスクリーニングなどの細胞アッセイを実施するステップを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、方法は、さらに、微小液滴を融合するステップ、微小液滴を分割するステップ、および／または微小液滴を分注（dispensing）するステップのうちの１つ以上を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、調整油は、鉱油、シリコーン油、またはフルオロカーボン油から選択され得る。

いくつかの実施形態では、成分は生物学的成分、小分子または化合物である。

いくつかの実施形態では、未調整油は界面活性剤を含み得る。

本発明の別の態様によれば、調整油の製造方法が提供され、該方法は、
未調整油を少なくとも１つの成分を含有する水性培地と一緒に混合して、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度で、該調整油を含むエマルジョンを形成するステップであって、混合により、未調整油への少なくとも１つの成分の分配を生じさせ、調整油を形成することができる、エマルジョンを形成するステップと、
成分の分配に続いて調整油を回収および／または分離するステップであって、培地の濃度は、成分の係数値に基づく所望の濃度によって決定され、その後の液滴形成において成分の分配係数値を維持する、回収および／または分離するステップと、
を含む。

本発明のさらなる態様によれば、前述の請求項のいずれか一項に記載の調整油を含む液滴形成の方法が提供され、ここで、水性培地と混合された調整油は、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度でエマルジョンを形成し、分配後に調整油を回収／分離し、ここで、培地の濃度は、液滴形成中および形成後に少なくとも１つの成分の分配係数を維持するための所望の濃度によって決定される。

未調整油は界面活性剤を含有し得る。

本発明の一態様によれば、本発明の任意の態様に係る方法によって得られる調整油が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の前述の態様のいずれかに従って調製および配合された調整油を含むパーツのキットが提供される。パーツのキットは、さらに、細胞培地であり得る培地を備えてもよい。パーツのキットは、さらに、油または油／界面活性剤混合物を含んでもよい。パーツのキットは、本発明の前述の態様のいずれかに係る１つ以上の成分をさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の非培地成分も含み得る。例えば、非培地成分は、以下に限定されないが、酵素、蛍光色素、レポーター剤（例えば、一次抗体および蛍光色素結合検出抗体など）、ビーズ、ポリマー（例えばＰＥＧ、ポリマー、オリゴヌクレオチドなど）などのうちの１つ以上を含んでもよい。

キットはまた、ユーザーが使用前に油を調整するための原料を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、キットは、精製抗体などの対照を含み得る。

いくつかの実施形態では、調整油は、少なくとも１つの試薬を含有してもよい。試薬の一例は生物製剤であり得る。典型的には、試薬は、微小液滴内の細胞の増殖または代謝の向上を助けるために提供され得る。さらにまたはあるいは、培地は、１つ以上の細胞、化学試薬および／または非培地成分を含んでもよい。

ここで、添付の図面を参照して、例としてのみ、本発明をさらに詳細に説明する。
油流下のデバイス内における液滴内のアミノ酸濃度が時間の経過とともにどのように減少するかを示す一連の理論的結果の例を示している。 成分の分配係数が高いほど、油流によってその成分濃度が大きく低下することを示す一連の理論的結果を示している。 油流量が多いほど、デバイスからの培地成分の除去が速くなることを示す一連の理論的結果を示している。 一定期間にわたるジャーカット（Jurkat）の生存率の一連の実験結果を示しており、栄養素のバランスが崩れると細胞の健康に悪影響を与え得ることを示している。 油量がエマルジョンを超えていない場合の、調整油中のジャーカット細胞の生存率の改善を示す一連の実験結果を示している。 調整油の使用による細胞アポトーシスの減少を示す一連の実験結果を示している。 分配のバランスが正しくとれていない場合の、油流が細胞の生存率に有害であることを示す一連の実験結果を示している。 微小流体チップ上で本発明の方法を実行するための構成例を示している。 調整油中の細胞生存率の改善を示すグラフである。 細胞生存率の改善を示す例を示している。 調整油中のフルオレセインを示している。

本明細書における本発明は、調整油に分散された水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持してエマルジョンを形成する方法を開示する。該方法は、調整油を形成するためにゼロ以上の分配係数値を有する少なくとも１つの成分を未調整油に補充するステップを含んでもよい。

あるいは、少なくとも１つの成分培地から未調整油へ分配することにより調整油を形成するように、調整油は、少なくとも１つの成分を含有する培地で未調整油を平衡化することによって調製されてもよい。調整油中の少なくとも１つの成分の濃度比は、分配係数と微小液滴中の少なくとも１つの成分の濃度との積と同等またはそれ以上である。

さらに、温度は、平衡化プロセス中、すなわち、微小液滴から調整油への成分の分配または移動の速度をある程度まで制御できるように、少なくとも１つの成分を含有する培地で未調整油を平衡化する際に制御することができる。一例では、平衡化プロセス中に温度を制御することは、微小液滴内での細胞増殖の効率を改善させることができるので有利であり得る。別の例としては、平衡化プロセス中に温度を上昇および／または低下させて、微小液滴内の細胞増殖の収量に影響を与えることができる。

いくつかの実施形態では、調整油は、平衡化後、室温または‐２０℃未満で長期保存することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の平衡プロセス後の調整油の回収率は、平衡プロセス中に形成されるエマルジョンの量に依存し得る。

場合によっては、培地中の少なくとも１つの成分と未調整油との比率は、調整油の配合中において１：１ｖ／ｖである。あるいは、中の培地少なくとも１つの成分と未調整油との比率は、調整油の形成中において２：１ｖ／ｖ以上である。場合によっては、培地中の成分と未調整油との比率は、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０： １、８０：１、９０：１、または１００：１であり得る。培地と未調整油との間の比率は、体積比または質量比によって決定され得る。その後、培地中の１つの成分と調整油との比率は、１：１もしくは２：１であり得、または３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０： １、８０：１、９０：１もしくは１００：１ｖ／ｖであってもよい。

培地と未調整油との濃度比は、以下の式を使用して決定され得る：
必要とされる初期培地濃度を計算する式：
平衡培地ｘ＝［１＋Ｖｏ/Ｖｗ］Ｐ
ここで、１ｘは、微小液滴の培地濃度になる。
Ｐ＝分配係数＝Ｃｏ／Ｃｗ
Ｖｏ、Ｖｗ＝油相の体積、水相の体積
Ｃｏ、Ｃｗ＝油相中の成分濃度、水相中の成分濃度

単なる例として、１：１の油／水の混合物において分配係数が１の場合、調整油のバランスをとるために２倍の培地を必要とする。

調整油を調製する方法は、未調整油を少なくとも１つの成分を含有する水性培地と一緒に混合して、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度で該調整油を含むエマルジョンを形成するステップであって、該混合により、未調整油への少なくとも１つの成分の分配が生じて、調整油を形成する、形成するステップを含み得る。混合は、界面表面積を増加させることにより、分配をさらに促進することができる。

本発明のさらなるステップにおいて、鉱油、シリコーン油またはフルオロカーボン油などの未調整油を、水性培地または水および少なくとも１つの成分を含有する培地粉末と一緒に混合するステップを行うことができ、ここで、該未調整油は界面活性剤を含有してもよい。

いくつかの実施形態では、油相と水相との間の界面の特徴が、微小液滴から油への成分の分配を減少させるのに役立ち得る。例えば、界面活性剤の種類および濃度、または界面でのタンパク質の配置が、水相から油への輸送および輸送速度に影響を与える。

例えばＢＳＡなどの他の界面活性成分も、１つ以上の成分の微小液滴の水相から油相への輸送に影響を与え得る。ＢＳＡは、例えば、細胞培地中のウシ胎児血清中に存在する。油がその後使用されることとなる同じ培地で平衡化されている限り、バランスを維持することができる。

いくつかの実施形態では、液滴生成プロセス中に、液滴を高濃度の界面活性剤油に入れ、続いて別の低濃度の界面活性剤平衡油に移動させることができる。油が正しい界面活性剤濃度で平衡化されている限り、さまざまな成分の交換が発生し得る。異なる界面活性剤濃度の２つの調整油を混合することは、微小液滴と油との間で交換される成分のバランスを維持するのに役立ち得る。

界面活性剤濃度のより低い方への微小液滴を移動させることで、微小液滴内における保持を増加させることができる。これは、微小液滴内のより少ない成分が分配されることを意味する。

本明細書で言及される場合、別段の指定がない限り、低い界面活性剤濃度は、臨界ミセル濃度未満またはそれに近い濃度と呼ばれる。高い界面活性剤濃度とは、臨界ミセル濃度の２倍以上の濃度を意味する。

臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、それを超えるとミセルが形成され、システムに追加されたすべての付加的な界面活性剤がミセルを形成する界面活性剤の濃度として定義できる。

成分は、ビタミン、塩、アミノ酸、栄養素、および液滴内の試薬のバランスをとるのに適したｐＨバッファーなどのバッファー成分であり得るが、これらに限定されない。油は、Ｏ_２またはＣＯ_２で平衡化して、ｐＨのバランスを取り、細胞の呼吸を促進することもできる。いくつかの実施形態では、成分は、増殖因子などのＦＢＳ（ウシ胎児血清）成分であり得る。

本明細書に開示される本発明の文脈内で、特に明記しない限り、「混合（mixing）」という用語は、油および水などの流体が接触していることを指す。

これは、未調整油に、アミノ酸、タンパク質、栄養素、または分配係数の高いガスなどの重要な成分を補充することで達成できる。高分配係数は、分配係数がゼロ以上を有する任意の成分であると見なされ、油相と水相との間に分布する。

いくつかの実施形態では、分配係数値がゼロであることは、成分の分配がほとんどまたは全くないことを示す。したがって、微小液滴から出て未調整油に移動する成分の損失がまったくないか、ほとんどない可能性がある。いくつかの実施形態では、０から１の間、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９の分配係数値は、成分の中程度から高度の分配を示す。したがって、微小液滴から出て未調整油に移動する成分の移動活性が中程度である可能性がある。いくつかの実施形態では、分配係数値が１を超える場合は、成分の分配が高いことを示している可能性がある。したがって、かなりの量の成分が微小液滴から出て、未調整油に移動し得るため、微小液滴内の成分の実質的な損失がある可能性がある。

あるいは、調整油は、分配効果自体を利用して、エマルジョン液滴中の成分または過剰の成分のバランスをとるのに十分な成分を含有する培地を未調整油に添加することによって作ることができる。この技術は、分配効果を利用して、成分を含有する培地から油中に成分を移動させる。必要に応じて、この段階で、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの付加的な成分を追加することもできる。

未調整油を水性培地または水および培地粉末と混合した結果、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度で該調整油を含むエマルジョンが得られる。混合により、少なくとも１つの成分の未調整油への分配が生じ、調整油を形成することが可能になる。混合とは、未調整油と水相とを組み合わせ、かつ成分を分配させておくことを指す場合がある。あるいは、混合とは、撹拌によって２つの相を強制的に組み合わせて互いに分散させ、２つの相間の境界表面積を増加させることを指し、これにより分配プロセスが高速化される。

調整油は、成分の分配に続いて回収および／または分離することができ、ここで、培地の濃度は、成分の係数値に基づく所望の濃度によって決定され、その後の液滴形成における成分の分配係数値を維持する。水相および油相の密度に応じて、上相および下相が形成され、調整油は、使用される水性流体および油の密度に応じて上相または下相のいずれかを形成する。２相の分離は自然に起こり得るが、１０００ｇで１０秒間遠心分離することでそのプロセスを加速させることもできる。

エマルジョンを形成することができる。エマルジョンは、調整油および水性微小液滴を含み得る。微小液滴は、任意の適切な形状であってよいが、好ましくは、微小液滴は球状であり得る。微小液滴は、１つ以上の細胞を含んでもよく、またはタンパク質、核酸、多糖類、小さな生物製剤、ビーズ、小分子もしくは化合物を含んでもよい。

本明細書に開示される本発明は、液滴形成のための調整油の使用または液滴形成方法も開示する。液滴形成における調整油の所望の使用温度で、水または水性培地と混合された調整油を含む液滴のエマルジョンが調製される。液滴は任意に細胞を含有することができ、使用される培地は細胞増殖培地であり、次の、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、Ｈａｍ’s Ｆ１０、Ｆ１２－Ｋ、ＨＡＴ培地のうちの１つ以上であり得る。細胞を含有する液滴で使用する場合の望ましい温度は３７℃である。液滴は、他の生物学的成分、小分子、または化合物を含有し得る。液滴はまた、任意に試薬を含有することができ、または任意に離型剤を含有してもよい。エマルジョン液滴は、フローフォーカシングジャンクションまたはステップ乳化機（step emulsifier）などの微小流体デバイスを使用して形成することができる。培地並びに細胞および／またはビーズを含む任意の追加成分を乳化装置に流して液滴を形成することができる。細胞またはその他の成分は、液滴全体に分散される。

エマルジョンの液滴は調整油に分散され、エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）または光エレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）デバイスに装填される。油の調整とは、調整された油によるエマルジョン液滴中の培地のさらなる分配が起こらないことを意味する。液滴は、細胞増殖のためにインキュベートおよび／または監視することができる。液滴は、細胞の含有物またはサイズなどの所望のパラメーターに応じて、ｏＥＷＯＤデバイスによって任意で仕分けすることができる。必要に応じて、液滴をアレイに仕分けすることができる。液滴は、ともに融合または分割することもできる。別の選択肢として、液滴およびその内容物をデバイスから分注できる。

調整油などの代替の担体液をデバイスに導入して、ガスおよび培地を補給することができる。さらに、一部の廃棄物成分が液滴から油の中に分配されるため、デバイスに保持された液滴内に含有され得る細胞の周囲において、蓄積された毒性環境を軽減できる。

代替の担体液が未調整油である場合、微小液滴から油相への成分の分配が生じ、熱力学的平衡に達する。この場合、ガスを補給するために担体液を交換すると、油に分配された成分がデバイスの外に輸送される。その後、成分のさらなる分配が新鮮な未調整油に起こり、損失を悪化させる。調整された担体液を交換することで、バランスのとれた成分の損失を打ち消すが、バランスの取れていない老廃物をデバイスから輸送することを可能にする。

図１を参照すると、成分分配効果の例が示されている。培地を含む１０００個の液滴が単一の長さのデバイスに添加され、デバイスを通る未調整油の流れは、０．０５μＬ／ｍｉｎの速度で制御される。デバイス上の液滴内のさまざまなアミノ酸濃度は、８０時間にわたってモデル化される。図１は、デバイス内で時間とともに枯渇する測定された全アミノ酸濃度を示している。図１は、細胞による培地の使用を考慮していないため、油流による微小液滴からのアミノ酸の移動を示している。

図２を参照すると、成分分配効果の別の例が示されている。Ｐ＝０．０１およびＰ＝０．１の分配係数を有する培地を含む１０００個の液滴を単一の長さのデバイスに追加し、未調整油を０．０５μＬ／ｍｉｎの速度でデバイスに８０時間流す。デバイス上の液滴に残っている成分のパーセンテージがモデル化されている。図２は、分配係数が高いほど、時間の経過とともに液滴からその成分がより速く枯渇することを示している。

図３を参照すると、成分分配効果のさらなる例が示されている。Ｐ＝０．１の分配係数を有する培地を含む１０００個の液滴を単一の長さのデバイスに添加し、未調整油を０．０５μＬ／ｍｉｎおよび０．００５μＬ／ｍｉｎの速度でデバイスに８０時間流す。液滴に残っている測定された成分のパーセンテージがモデル化されている。図３は、デバイスを通過する油の流量が多いほど、液滴からの成分の除去が速くなることを示している。

図４を参照すると、調整油の存在下で４８時間にわたるジャーカット生存率に関する一連の実験結果が示されている。この実験では、図４に示すように、１ｘ、２ｘ、３ｘ、５ｘ濃度のＲＰＭＩ＋ＨＥＰＥＳ粉末（Thermo Fisher Scientific、英国）を滅菌水に溶解し、濃度は油分配後の液滴の培地成分を基準にしている。図４に示すように、栄養素のバランスが崩れると、細胞の生存率が低下することが示されている。

溶液を滅菌濾過し、０．２μｍ滅菌フィルターで再度濾過する前に、１０～２０ｖｏｌ.％ ＦＢＳを添加する。６つの増殖培地の組成は、表１に詳述されている。

表１は、調製された増殖培地調製物の組成を示している。

調製した増殖培地調製物を使用して、調製した増殖培地の２倍量をＨＦＥ７５００－２％界面活性剤油の１倍量と組み合わせることにより調整油を生成し、一晩回転させた。次いで、エマルジョンを遠心機にて１０００ｇで１０秒間回転させ、濾過した。

ジャーカットＷＴ細胞を計数し、ＨＥＰＥＳを加えた１ｍＬ ＲＰＭＩに３Ｍの濃度で再懸濁した。

ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ３／７は、最初に完全培地ＨＥＰＥＳで１：１００希釈液１００μＬを調製し、次いで希釈したカスパーゼ２０μＬを細胞に添加することにより、最終濃度１μＭ（１：５，０００希釈）で添加した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、完全培地＋ＨＥＰＥＳで１：８００希釈液８００μＬを調製し、次いで希釈したＨｏｅｃｈｓｔ液１０μＬを細胞に添加することによって（さらに１００倍希釈）、最終濃度２５０ｎＭ（１：８０，０００希釈液）で添加した。続いて乳化である。６つの増殖培地調製物はすべて、５０μＬのエマルジョンおよび１５０μＬの油を含む１．５ｍＬチューブ、並びに５０μＬのエマルジョンのみを含む第２の１．５ｍＬチューブを用いて調製した。チューブを封止し、３７℃で一晩インキュベートした。

分析は、自動カウントとそれに続く手動ＱＣを使用して実行し、手動ＱＣでは、条件ごとに少なくとも２つの視野（ＦＯＶ）をカウントマークアップの品質について目測でチェックした。自動カウントでは、一部のＦＯＶの４０５／Ｈｏｅｃｈｓｔチャネルで強い蛍光を発する液滴エッジに問題があることが判明し、そのＦＯＶは、総細胞カウントにおいて偽陽性カウントを引き起こし、その結果、見かけの％細胞死の読み取り値を人為的に減少さえ得る。必要に応じて、自動化されたデータを改良または置換するために手動カウントを実施した。

図５を参照すると、調整油が細胞死をどのように減少させ得るかの例が示されている。０時間、２３時間、５０時間、および７７時間でのジャーカット細胞死のパーセンテージが示されている。図５は、調整された油を表す結果を示している。調整油は、未調整油と比較して、細胞死率が低いことが示されている。ジャーカット細胞の生存率は、油の量がエマルジョンを超えていない場合に、分配される成分が少なくなるため、より良好であると判断される。

図６を参照すると、成分分配効果の別の例が示されている。担体油の調整の有無にかかわらず、インキュベーター内の液滴におけるジャーカット細胞アポトーシスのパーセンテージが示されている。成分に分配された調整油は、未調整油と比較して、２４時間後および４８時間後の細胞アポトーシスのパーセンテージが減少する。さらに、エマルジョンの体積を超える油の体積も変化し、調整油がこの油溜まり（oil reservoir）への分配効果を低下させることを示している。

図７を参照すると、不適切に調整された／バランスの崩れた油の流れが細胞の生存率に及ぼす影響の別の例が示されている。デバイス上で１２時間経過した後のジャーカット細胞アポトーシスのパーセンテージは、調整油および未調整油の流れがある場合とない場合とで示されている。図７は、調整油を表す結果を示している。調整油を流すと、調整油を流さない場合と比較して、１２時間後の細胞アポトーシスのパーセンテージが高くなる。これは、分配のバランスが正しく取れていない場合、油の流れが細胞の生存率に悪影響を与えることを示しており、これは、油の流れが液滴から成分を運び去り、それによってさらに多くの成分が分配されるためである。

調整油および微小液滴を含むエマルジョンは、エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）または光エレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）デバイスに装填することができる。エレクトロウェッティングデバイスの例は、以下のようにさらに説明することができる。

図８に示す例としてのｏＥＷＯＤデバイスは、フルオロカーボンオイルに乳化され、２５℃で１センチストーク以下の粘度を有し、また、非密閉状態で２００μｍ未満、例えば、２０～１８０μｍの範囲の直径を有する水性微小液滴１の操作に適し得る。いくつかの実施形態では、直径は、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、または１８０μｍを超えてもよい。いくつかの実施形態では、直径は、２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、５０、３０、３０、または２０μｍ未満であってもよい。

デバイスのｏＥＷＯＤスタックは、厚さ１３０ｎｍの導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の透明層３でコーティングされた厚さ５００μｍの上部２ａおよび底部２ｂのガラスプレートを備えている。導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の各層３は、Ａ／Ｃ電源４に接続され、底部ガラスプレート２ｂ上のＩＴＯ層が接地されている。底部ガラスプレート２ｂは、厚さ８００ｎｍのアモルファスシリコン層５でコーティングされている。上部ガラスプレート２ａおよびアモルファスシリコン層５は、厚さ１６０ｎｍの高純度アルミナまたはハフニアの層６でそれぞれコーティングされ、これらの層は、ポリ（３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート）の単層７でコーティングされており、高純度アルミナまたはハフニアの層６の表面を疎水性にしている。

上部ガラス板２ａおよびアモルファスシリコン層５は、スペーサ（図示せず）を使用して８μｍの間隔をあけて、微小液滴がデバイスキャビティに導入されるときにある程度の圧縮を受けるようにする。ＬＥＤ光源８によって照明された、反射型ピクセル化スクリーンの画像は、一般に底部ガラス板２ｂの下に配置され、並びに、０．０１Ｗｃｍ２のレベルの可視光（波長６６０または８３０ｎｍ）が各光スポット９から放射され、底部ガラス板２ｂおよび導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）層３を通って複数の上向き矢印の方向に伝搬することによってアモルファスシリコン層５に衝突する。

衝突のさまざまな点で、電荷の光励起領域１０が、対応するエレクトロウェッティング位置１１で高純度アルミナまたはハフニアの層６上に、修正された液体－固体接触角を引き起こすアモルファスシリコン層５に生み出される。これらの修正された特性は、微小液滴１を１つのエレクトロウェッティング位置１１から別の位置に推進するのに必要な毛管力をもたらす。ＬＥＤ光源８はマイクロプロセッサ１２によって制御され、マイクロプロセッサ１２は、予めプログラムされたアルゴリズムによって、アレイ内のどのダイオード９を所定の時間に点灯させるかを決定する。

図９を参照すると、調整油中の細胞の結果が示されている。図９に示すように、細胞が調整油中にある場合、未調整油中にある場合と比較して、細胞死またはアポトーシスは大幅に減少する。細胞の生存率は、油の体積がエマルジョンを超えていない場合には分配される成分が少なくなるため、より良いと判断される。

図１０を参照すると、細胞を含む液滴が、培地中の少なくとも１つの成分で調整された（水和された）油中にある場合と、培地中の成分の調整／平衡化がない場合とのグラフが示されている。図１０に示すように、細胞を含む液滴が培地中の少なくとも１つの成分と１：１ｖ／ｖの比率で平衡化された調整油内にある場合、細胞死は大幅に減少する。該結果はまた、調整油が培地中の成分と１００：１ｖ／ｖの比率で平衡化された場合、細胞死がさらに減少することを示している。

図１１を参照すると、フルオレセインによる油の調整についての結果を示すグラフが提示されている。図１１は、未調整油に入れられたフルオレセイン液滴を示しており、数時間にわたって、フルオレセインは液滴から漏れ出すかまたは分配される。場合によっては、流量が漏れに違いをもたらし得る。例えば、流速が速いと、液滴から油へのフルオレセインの損失が増加し得る。図１１に示すように、１つ以上の成分および／またはフルオレセインを未調整油に添加して、調整油を形成することができる。調整油がフルオレセインを含有する場合、図１１に示すグラフは、液滴から調整油へのフルオレセインの漏出が少ないことを示している。さらに、液滴にフルオレセインおよび／または他の必須成分を定期的に再供給して、経時的に液滴からのフルオレセインの分配をさらに減少させることができる。

本発明の任意の態様および／または本明細書の任意の実施形態で開示されるように、液滴からの成分の分配は、液滴が本発明で記載されるような調整油に入れられるときに効果的に制御することができる。一例として、微小液滴からの成分の分配を減らすことができる。本明細書に記載の本発明は、細胞アッセイおよび／または、細胞が一切関与しない化学反応アッセイなどの多くの生物学的および／または化学的ワークフローに適用可能である。

本発明の種々あるさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。

「および／または（and/or）」は、本明細書で使用される場合、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれについて他方を含むまたは含まない状態での具体的な開示とみなされるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）Ａ並びにＢのそれぞれ特定の開示とみなされるべきであり、あたかもそれぞれが本明細書において個別に記載されているという意である。

文脈上別段の指示がない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用する。

さらに、本発明は、いくつかの実施形態を参照して例として説明されてきたが、開示された実施形態に限定されず、また添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく代替の実施形態を構築可能であることは、当業者にはさらに理解されるであろう。

Claims (24)

1. 水性微小液滴中に少なくとも１つの成分を維持する方法であって、該方法は、
   調整油を形成するため、未調整油に少なくとも１つの成分を補充するステップと、並びに、
   少なくとも１つの成分を含む前記水性微小液滴を準備するステップであり、エマルジョンを形成するため、該微小液滴から前記調整油への前記成分の分配が減少するように、該微小液滴が該調整油に分散され、
   ここで、前記微小液滴内の前記成分の維持は、該成分の分配係数値がゼロ以上であることに基づくものである、該水性微小液滴を準備するステップか、または
   前記調整油を形成するため、前記水性微小液滴から前記調整油への前記成分の分配が減少するように、少なくとも１つの成分を含有する培地もしくは緩衝液で前記未調整油を平衡化するステップであり、
   ここで、前記微小液滴内の前記成分の維持は、前記分配係数および該微小液滴内の該成分濃度の積と同等またはそれ以上である該調整油内の該成分濃度に基づくものである、前記未調整油を平衡化するステップか、のステップと、
   を含む、方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記培地中の前記少なくとも１つの成分と未調整油との比は、前記調整油の配合の際において１：１ｖ／ｖである、方法。
3. 請求項１に記載の方法において、前記培地中の前記少なくとも１つの成分と未調整油との比は、前記調整油の配合の際において２：１ｖ／ｖ以上である、方法。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の方法において、少なくとも１つの試薬を含有する前記微小液滴および／または前記調整油をさらに含む、方法。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の方法において、前記調整油は、Ｏ_２およびＣＯ_２で平衡化される、方法。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の方法において、前記微小液滴は、少なくとも１つの生物学的細胞をさらに含む、方法。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の方法において、前記培地は細胞増殖培地である、方法。
8. 請求項７に記載の方法において、前記細胞増殖培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｆ１２－Ｋ、ＨＡＴ培地のうちの１つ以上から選択される、方法。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法において、前記調整油に分散された１つ以上の微小液滴をＥＷＯＤまたはｏＥＷＯＤデバイスに装填するステップをさらに含む、方法。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法において、前記微小液滴は、前記ＥＷＯＤまたはｏＥＷＯＤデバイス内で形成される、方法。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法において、代替の担体液を前記デバイス内に導入するステップであって、前記代替の担体液は調整油である、導入するステップをさらに含む、方法。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法において、前記微小液滴は離型剤を含む、方法。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法において、前記離型剤は、トリプシン、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ、クエン酸、またはＡｃｃｕｔａｓｅのうちの１つ以上である、方法。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法において、前記微小液滴をインキュベートするステップをさらに含む、方法。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法において、細胞増殖について前記微小液滴を監視するステップをさらに含む、方法。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法において、細胞アッセイを実施するステップをさらに含む、方法。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法において、前記微小液滴を融合するステップ、該微小液滴を分割するステップ、および／または該微小液滴を分注するステップのうちの１つ以上をさらに含む、方法。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法において、前記調整油は、鉱油、シリコーン油、またはフルオロカーボン油から選択される、方法。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法において、前記成分は、生物学的成分、小分子または化合物である、方法。
20. 調整油の製造方法であって、
    未調整油に少なくとも１つの成分を含有する水性培地と一緒に混合して、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度で、該調整油を含むエマルジョンを形成するステップであり、混合により、前記未調整油への少なくとも１つの成分の分配を生じさせ、前記調整油を形成することができる、エマルジョンを形成するステップと、
    前記成分の分配に続いて前記調整油を回収および／または分離するステップであり、前記培地の濃度は、前記成分の係数値に基づく所望の濃度によって決定され、その後の液滴形成において該成分の分配係数値を維持する、前記調整油を回収および／または分離するステップと、
    を含む、方法。
21. 請求項２０に記載の方法において、前記培地中の前記少なくとも１つの成分と未調整油との比は、１：１ｖ／ｖである、方法。
22. 請求項２０に記載の方法において、前記培地中の前記少なくとも１つの成分と未調整油との比は、２：１ｖ／ｖ以上である、方法。
23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の調整油を含む液滴形成の方法であって、ここで、水性培地と混合された前記調整油は、調整油を液滴形成で使用するための所望の温度でエマルジョンを形成し、分配後に該調整油を回収／分離し、ここで、前記培地の濃度は、前記所望の濃度によって決定され、液滴形成中および液滴形成後に少なくとも１つの成分の分配係数を維持する、液滴形成の方法。
24. 請求項２０に記載のプロセスによって得られる調整油。
    

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