JP2023536918A - ヒト及びマウスｉｎｓｌ５を標的とする化合物及び方法 - Google Patents

ヒト及びマウスｉｎｓｌ５を標的とする化合物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗体を含む、インスリン様ペプチド－５（ＩＮＳＬ５）を標的とする化合物及び方法、これをコードするＤＮＡを含む細胞及びベクター、並びに抗体を産生する方法を提供する。さらに、本発明は、診断アッセイにおけるＩＮＳＬ５抗体の使用を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト及びマウスインスリン様ペプチド－５（ＩＮＳＬ５）に対する抗体又はその断片を含む化合物、診断法及び方法に関する。本発明の化合物及び方法は、腫瘍学、生殖、及び代謝疾患、例えば、糖尿病及び肥満の分野において、それらに関する診断を含めて有用であると期待されている。
消化管ホルモンＩＮＳＬ５は、ペプチドのリラキシン／インスリン様ファミリーに属する。他のＩＮＳＬファミリーメンバーと同様に、ＩＮＳＬ５は、２つのジスルフィド結合で結合されたＢ鎖及びＡ鎖で構成される。ＩＮＳＬ５は様々な組織で発現しているが、それは、主に、遠位腸、特に、結腸及び直腸におけるＬ細胞と呼ばれる特殊な腸内分泌細胞（ＥＥＣ）から他のホルモンと共分泌される。これらの細胞は、腸の運動性、ホルモン分泌、グルコース恒常性、食欲などの代謝及び生理学的プロセスを調節する。ＩＮＳＬ５は、受容体ＲＸＦＲ４／ＧＰＣＲ１４２／ＧＰＲ１００のリガンドであり、その受容体－リガンド相互作用により、細胞内ｃＡＭＰレベルの阻害がもたらされる。ＩＮＳＬ５は、食欲促進（食欲刺激）ホルモンと考えられており、その分泌は、カロリー制限によって上昇するが、ＩＮＳＬ５－ＲＸＦＰ４活性化シグナル伝達経路の生物学的結果は、ほとんどとらえどころのないままである。
ＩＮＳＬ５を研究するためには、ＩＮＳＬ５についての高信頼性及び高感度のアッセイが必要である。ＩＮＳＬ５は、代謝機能障害、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、不妊症を有する患者、及びこれらの疾患の前臨床モデルにおいて研究されている。しかしながら、これらの効果を更に研究するために、ヒト及びマウスのＩＮＳＬ５に結合する抗体を提供する必要性が残されたままである。特に、ヒト及びマウスの両方のＩＮＳＬ５に高い親和性を有するＩＮＳＬ５抗体の必要性が残されたままである。現在利用可能なアッセイには、感度、再現性、性能、及び／又は定量的な問題点がある。したがって、ヒト又はマウスの試料を試験する追加の方法が必要である。
本開示の特定の実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＩＮＳＬ５に結合する抗体が提供され、ＶＨは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、ＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＧ（配列番号１０）を含み、ＨＣＤＲ２は、ＴＩＳＡＧＧＹＴＹ（配列番号１１）を含み、ＨＣＤＲ３は、ＡＲＥＲＷＮＹＤＲＳＧＧＡＧＡＧＹＦＤＬ（配列番号１２）を含み、ＬＣＤＲ１は、ＱＡＳＱＳＩＴＳＳＹＬＳ（配列番号１４）を含み、ＬＣＤＲ２は、ＹＰＡＡＮＬＡＳ（配列番号１５）を含み、ＬＣＤＲ３は、ＬＹＧＹＦＳＳＳＩＤＦＡ（配列番号１６）を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号９を含むＶＨ及び配列番号１３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号５を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号７を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号５のアミノ酸２～４４６を含む重鎖（ＨＣ）、及び配列番号７を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号５からなるＨＣ及び配列番号７からなるＬＣを含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号５若しくは配列番号７、又はそれらの両方をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のベクターは、配列番号５若しくは配列番号７、又はそれらの両方をコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号７をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、組成物を提供する。他の実施形態によれば、本開示は、配列番号５及び配列番号７をコードする核酸を含むベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号５若しくは配列番号７、又はその両方をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号７をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、細胞を提供する。他の実施形態によれば、本開示は、配列番号５をコードする核酸及び配列番号７をコードする第２の核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。更なる実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
本開示の特定の実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＩＮＳＬ５に結合する抗体が提供され、ＶＨは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、ＴＶＳＧＩＤＬＴＴＹＡＭＧ（配列番号２２）を含み、ＨＣＤＲ２は、ＩＩＧＧＧＧＲＴＹ（配列番号２３）を含み、ＨＣＤＲ３は、ＶＲＧＧＤＦＦＤＬ（配列番号２４）を含み、ＬＣＤＲ１は、ＱＡＳＥＤＩＳＫＹＬＳ（配列番号２６）を含み、ＬＣＤＲ２は、ＹＹＶＳＮＬＥＦ（配列番号２７）を含み、ＬＣＤＲ３は、ＨＱＧＹＴＧＶＮＶＥＮＶ（配列番号２８）を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号２１を含むＶＨ及び配列番号２５を含むＶＬを含む。更なる実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１７を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１７のアミノ酸２～４３５を含む重鎖（ＨＣ）、及び配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、配列番号１７からなるＨＣ及び配列番号１９からなるＬＣを含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号１７若しくは配列番号１９、又はそれらの両方をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のベクターは、配列番号１７若しくは配列番号１９、又はそれらの両方をコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号１７をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、配列番号１７及び配列番号１９をコードする核酸を含むベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１７若しくは配列番号１９、又はその両方をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１７をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、細胞を提供する。他の実施形態によれば、本開示は、配列番号１７をコードする核酸及び配列番号１９をコードする第２の核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。更なる実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ヒトＩＮＳＬ５に結合する。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、ヒトＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号１）及びＢ鎖（配列番号２）に結合する。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、マウスＩＮＳＬ５に結合する。いくつかの実施形態によれば、本開示の抗体は、マウスＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号３）及びＢ鎖（配列番号４）に結合する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、抗体が発現される条件下で細胞を培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することを含む、抗体を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、抗体が発現される条件下で細胞を培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することによって産生される抗体を産生する方法を提供する。
本開示の更なる実施形態によれば、患者試料におけるヒト又はマウスＩＮＳＬ５を検出する方法が提供される。このような方法は、試料を、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する本開示の抗体と接触させるステップと、当該接触させるステップによってシグナルを検出するステップとを含む。
いくつかの実施形態によれば、試料中のヒト又はマウスＩＮＳＬ５を定量化する方法が提供される。このような方法は、当該試料を、ＩＮＳＬ５に特異的に結合させる本開示の抗体と接触させるステップと、当該接触させるステップによってシグナルを検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、対照標準を抗体と当該接触させるステップと、対照標準を接触させるステップによって提供されたシグナルを検出するステップとを更に含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態によれば、このような方法は、試料におけるＩＮＳＬ５を定量化するステップを更に含む。このような実施形態では、ＩＮＳＬ５を定量化するステップは、参照標準と比較した場合に試料中のＩＮＳＬ５を定量化することを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態によれば、試料は、血液、血漿、血清、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）のうちの１つである。
本開示の方法のいくつかの実施形態によれば、方法は、試料を、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する抗体及び第２の抗体と接触させるステップを更に含み、当該第２の抗体がまた、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に結合する。いくつかのこのような方法では、抗体又は第２の抗体のうちの１つは、検出可能な標識を含み、当該検出するステップは、抗体、第２の抗体及びヒト又はマウスＩＮＳＬ５を含む複合体の形成に際して検出可能な標識によって提供されたシグナルを検出することを含む。いくつかのこのような実施形態によれば、抗体及び第２の抗体のうちの１つは、基材上に固定化されている。本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料を抗体と接触させるステップ及び試料を第２の抗体と接触させるステップは同時に起こる。いくつかのより特定の実施形態によれば、第２の抗体は、本明細書に開示されるヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する本開示の抗体を含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態によれば、方法は、試料を、ＩＮＳＬ５に特異的に結合する抗体及び第２の抗体と接触させるステップを更に含み、当該第２の抗体がまた、ＩＮＳＬ５に特異的に結合する。いくつかのこのような方法では、抗体又は第２の抗体のうちの１つは、検出可能な標識を含み、当該検出するステップは、抗体、第２の抗体及びＩＮＳＬ５を含む複合体の形成に際して検出可能な標識によって提供されたシグナルを検出することを含む。いくつかのこのような実施形態によれば、抗体及び第２の抗体のうちの１つは、基材上に固定化されている。他の実施形態では、第２の抗体は、ＩＮＳＬ５の異なるエピトープに結合する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、試料を抗体と接触させるステップ及び患者試料を第２の抗体と接触させるステップは同時に起こる。任意のこのような実施形態では、抗体若しくは第２の抗体、又はそれらの両方は、本明細書に開示されるＩＮＳＬ５に結合する抗体である。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。
本開示の例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成された、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＢＨ）及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に更に分割され得る。
ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖のうちの３つのＣＤＲを、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗体との特定の相互作用を形成する残基の大半を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ．ａｌ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ．ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ．ａｌ．、“Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７）），Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ．ａｌ，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、又はＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能な国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照されたい）に記載されているものを含む、周知のスキームに従って行われ得る。本発明の抗体のＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｎｏｒｔｈに基づいている。ＬＣは、本開示のいくつかの実施形態によれば、カッパ又はラムダとして分類され、これらは各々、当該技術分野で既知の特定の定常領域によって特徴付けられる。ＨＣは、本開示のいくつかの実施形態によれば、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥとして定義する。いくつかの実施形態によれば、抗体はＩｇＧ ＨＣを含み、これは、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に更に分割され得る。各ＨＣのカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、エフェクター機能を低減する、各ＨＣの定常領域内の１つ以上の修飾を有する。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一のコピー又はクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物、若しくはファージクローンを含む）に由来する抗体であり、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばＣＤＲ移植、又はこのような技術又は当該技術分野で既知の他の技術の組み合わせにより産生することができる。
抗体を産生及び精製する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ５－８ ａｎｄ １５，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２で見出すことができる。例えば、マウス又はウサギを、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５で免疫化してもよく、得られた抗体を回収、精製することができ、アミノ酸配列を、当該技術分野で周知の従来の方法を使用して決定することができる。同様に、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５との相互作用について数千のＦａｂ断片をスクリーニングし、得られた相互作用を回収、精製することができ、アミノ酸配列を、当該技術分野で周知の従来の方法を使用して決定することができ、初期のリード抗体を構築することができる。
本発明の特定の実施形態では、抗体、又は抗体をコードする核酸は、単離された形態で提供される。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞環境において見出される他の高分子種を含まないか、又は実質的に含まない、タンパク質、ペプチド、又は核酸を指す。
本明細書で使用される「結合する」という用語は、別段の定めがない限り、当該分野において既知である一般的な方法によって決定される２つのタンパク質又は分子の近接をもたらす、別のタンパク質若しくは分子との化学結合又は引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味する。
ヒト又はマウスのＩＮＳＬ５に結合する本開示の抗ＩＮＳＬ５抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、免疫組織化学又はＥＬＩＳＡベースのアッセイなどの技術によって、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５のアイソフォームを単離及び／又は検出することができる。このようなアッセイを使用して、臨床試験手順の一部として、例えば、血清、血漿、血液又はＣＳＦにおけるポリペプチドレベルをモニターする、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定する、診断、予後、又は治療のために、ＩＮＳＬ５の存在量及び／又はパターンを検出及び／又は評価することができる。当該技術分野において理解されるように、本発明の抗体は、その検出を容易にするために、検出可能な物質又は標識に結合され得る。検出可能な物質又は標識の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、化学発光物質及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトナジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ルテニウム及びエクオリンが含まれ、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。本発明の抗体はまた、薬理ゲノム分析においても有用であり得る。このような実施形態は、特定の若しくは修飾された治療手法から利益を得ることができる個体を特定するために、及び／又は現在の治療レジメンの有効性をモニターするために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「対照標準」は、本発明の方法において試料から得られた結果を比較するために使用され得る試料を指す。対照標準は、細胞、血液、血漿、ＣＳＦ、組織又は培地中にスパイクされた既知のタンパク質の濃度であり得る。対照標準における濃度レベルは、ＩＮＳＬ５の絶対量若しくは相対量、量の範囲、又は最小量、平均量、及び／若しくは中央値量であり得る。対照標準はまた、ＩＮＳＬ５のベースラインとして作用し得、それに対して患者試料が比較される。対照標準には、同一患者からの濃度値、又はＩＮＳＬ５の既知の正常な参照が含まれ得る。更に、いくつかの実施形態では、対照標準は、ＩＮＳＬ５濃度を標準曲線の形で表し得る。
本明細書で使用される場合、「捕捉抗体」という用語は、ＩＮＳＬ５に結合する抗体を指す。このような実施形態では、捕捉抗体は、捕捉抗体－ＩＮＳＬ５複合体を残りの試料から分離することができるように、ＩＮＳＬ５に結合し、ＩＮＳＬ５を捕捉することができ、例えば、好適な条件下で試料中のＩＮＳＬ５に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、ＩＮＳＬ５に特異的に結合する抗体であり得、ＩＮＳＬ５に特異的に結合する抗体は、二次（又は検出）抗体として使用される。更なる実施形態では、捕捉抗体は、本明細書で提供される抗体である。更なる実施形態では、捕捉抗体は、それぞれ配列番号１０～１２に対応するＨＣＤＲ及び配列番号１４～１６に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。更なる実施形態では、捕捉抗体は、それぞれ配列番号２２～２４に対応するＨＣＤＲ及び配列番号２６～２８に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、固定化されている。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出可能な標識で標識されている。いくつかの実施形態では、二次（又は検出）抗体は、本明細書で提供される抗体である。更なる実施形態では、二次（又は検出）抗体は、それぞれ配列番号１０～１２に対応するＨＣＤＲ及び配列番号１４～１６に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。更なる実施形態において、二次（又は検出）抗体は、それぞれ配列番号２２～２４に対応するＨＣＤＲ及び配列番号２６～２８に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。
いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、「サンドイッチ」イムノアッセイで固定化され、捕捉抗体又は一次抗体は、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する。いくつかのこのような実施形態では、捕捉抗体は、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する本発明の抗体である。更なる実施形態では、捕捉抗体は、配列番号１０～１２に対応するＨＣＤＲ及び配列番号１４～１６に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。更なる実施形態では、捕捉抗体は、配列番号２２～２４に対応するＨＣＤＲ及び配列番号２６～２８に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。このようなサンドイッチイムノアッセイでは、「検出（又は二次）抗体」がまた利用される。いくつかの実施形態によれば、検出又は第２の抗体は、捕捉抗体に特異的に結合することができ、検出可能な標識で標識され得る。いくつかの実施形態では、二次抗体の検出は、捕捉又は一次抗体によって、既に結合又は捕捉されているヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する。いくつかのこのような実施形態では、二次抗体は、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５に特異的に結合する本発明の抗体である。いくつかの実施形態では、二次（又は検出）抗体は、本明細書で提供される抗体である。更なる実施形態では、二次（又は検出）抗体は、配列番号１０～１２に対応するＨＣＤＲ及び配列番号１４～１６に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。更なる実施形態では、二次（又は検出）抗体は、配列番号２２～２４に対応するＨＣＤＲ及び配列番号２６～２８に対応するＬＣＤＲを有する抗体である。
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、ヒト又はマウスＩＮＳＬ５のＡ鎖及びＢ鎖に特異的に結合する本発明の抗体間の複合体の形成を検出するために使用され得る部分、組成物又は技術である。いくつかの実施形態によれば、検出可能な標識は、抗体（場合によって、捕捉又は検出のいずれか）に直接的又は間接的にコンジュゲートされ得る。検出可能な標識の例示的な実施形態には、ビオチン、放射性同位体、フルオロフォア又は他の蛍光部分、及び酵素部分が含まれる。
このような抗体の抗原結合断片には、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片が含まれる。
「フレームワーク領域」又は「フレームワーク配列」は、フレームワーク領域１～４のうちのいずれか１つを指す。本発明に包含されるヒト化抗体及びその抗原結合断片は、フレームワーク領域１～４のうちのいずれか１つ以上がヒト化される、すなわち、個々のヒト化される領域１～４の可能な組み合わせのいずれかが存在する、分子を含む。例えば、これには、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域２、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２、及び３などがヒト化される分子が含まれる。ヒト化されるフレームワークは、既知のヒト生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。ヒトフレームワークの生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、又はＭａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ及びＧｅｒａｒｄ ＬｅｆｒａｎｃのＴｈｅ ２０ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１）から入手することができる。例えば、生殖系列軽鎖フレームワークは、Ａ１１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ１、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、及びＯ８からなる群から選択することができ、生殖系列重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２－５、ＶＨ２－２６、ＶＨ２－７０、ＶＨ３－２０、２５ ＶＨ３－７２、ＶＨ１－４６、ＶＨ３－９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－７４、ＶＨ４－３１、ＶＨＩ－１８、ＶＨＩ－６９、ＶＩ－１３－７、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ３－４８、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－５９、及びＶＨ５－５１からなる群から選択することができる。
タンパク質「ＩＮＳＬ５」（インスリン様ペプチド－５としても知られる）は、Ｉｎｓｌ５遺伝子によってコードされる消化管ホルモンを指す。ＩＮＳＬ５は、ヒト及びマウスにおける遠位結腸の腸内分泌細胞で産生されたペプチドである。
以下のアッセイの結果は、例示された本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合断片がＩＮＳＬ５に結合及び／又は中和することを示しており、したがって、糖尿病及び肥満を含むがこれらに限定されない代謝性疾患におけるＩＮＳＬ５の役割を研究するために、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを含むがこれに限定されない診断アッセイに使用され得る。
ＩＮＳＬ５の存在又はレベルを検出する診断アッセイなどの診断に使用するための抗体が、本明細書に開示される。
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
実施例１：抗体Ｉの組換え発現
抗体Ｉは、配列番号５の重鎖アミノ酸配列及び配列番号７の軽鎖アミノ酸配列を有する抗体である。
抗体Ｉは、ＣＨＯ－Ｋ１細胞誘導体（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して哺乳動物細胞発現系で生成される。配列番号５及び配列番号７をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧＳ含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）にサブクローニングされる。ｃＤＮＡ配列を、シグナルペプチド配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２９）のコード配列をフレーム中に融合させて、組織培養培地への抗体の分泌を増強させる。両方のｃＤＮＡ配列発現を、ウイルス性ＣＭＶプロモーターにより駆動させる。
一過性トランスフェクションを介して抗体を生成する場合、ＰＥＩベースの方法を使用して、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、同一の化学量論比の組換え発現プラスミドでトランスフェクトする。簡単に説明すると、密度４×１０６細胞／ｍＬの適切な体積のＣＨＯ－Ｋ１懸濁細胞を振盪フラスコに移し、ＰＥＩ及び組換えプラスミドＤＮＡの両方を細胞に加える。細胞を、浮遊培養液中３２℃で６日間インキュベートする。インキュベーション期間の終了時に、細胞を低速遠心分離によって除去し、抗体を馴化培地から精製する。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞から培地に分泌された抗体は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び／又はイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。具体的には、採取した培地からの抗体を、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔタンパク質Ａ樹脂（ＧＥ）上で捕捉する。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）又はトリス含有緩衝液などの泳動用緩衝液で樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。タンパク質を、１０ｍＭクエン酸ｐＨ３などの低ｐＨ溶液で樹脂から溶出させる。抗体を含有する画分を低ｐＨでプールし、可能性のあるウイルスを不活化することができる。ｐＨ８．０の０．１Ｍトリスなどの塩基を加えることによって、ｐＨを中性化することができる。抗体は、イソクラティック溶離を用いてＰＢＳ ｐＨ７．４でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に濃縮プロテインＡプールをロードすることにより、ＳＥＣによって更に精製する。抗体を、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィーステップによって更に精製することができる。その場合、１５カラム容量以上で２０ｍＭのＮａＯＡｃ中ｐＨ５．０で０～５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を使用して、抗体をカラムから溶出させる。精製された抗体は、ｐＨ７．４のＰＢＳに緩衝液交換し、例えば、遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５０Ｋ遠心フィルターユニットなど）を使用することによって、又は再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）におけるタンジェンシャルフロー限外濾過によって濃縮し得る。
したがって、抗体は、この様式で、又は当業者によって容易に決定される類似の様式で調製する。
実施例２：抗体ＩＩの組換え発現
抗体ＩＩは、（配列番号１７）の重鎖アミノ酸配列及び（配列番号１９）の軽鎖アミノ酸配列を有する抗体である。
ここでは、配列番号１７及び配列番号１９をコードするｃＤＮＡ配列を発現プラスミド中で使用することを除いて、配列番号１７及び配列番号１９を、実施例１について説明したように本質的に生成する。
インビトロ機能
実施例３：ＳＰＲを介したヒト及びマウスＩＮＳＬ５への抗体結合
実施例１及び２の抗体のヒト及びマウスＩＮＳＬ５へのインビトロ結合は、２５℃及び３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定する。特に、実施例１及び２の抗体の親和性を、以下の表１及び２に要約する。
実施例１及び２の抗体のヒト及びマウスＩＮＳＬ５への結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置で実施する。１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０）（Ｔｅｋｎｏｖａ）を泳動用緩衝液として使用する。シリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へのプロテインＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ番号５３９２０２－５ｍｇ）の固定化を、メーカーの説明書（Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＢＲ－１０００－５０）に従って、２５℃で行う。簡単に説明すると、センサーチップ表面（フローセル１及び２）上のカルボキシル基は、７５ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ及び１１．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳを含む混合液７０μＬを１０μＬ／分で注入することによって活性化する。５０μｇ／ｍＬのプロテインＡの溶液は、１０μｌの５ｍｇ／ｍＬストック溶液を１ｍＬの１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中に希釈することによって調製する。この溶液７０μＬを、活性化されたチップ表面（フローセル１及び２、チャネル１～８）上に１０μＬ／分で７分間注入する。次いで、表面（フローセル１及び２）上の過剰量の反応基は、７０μＬの１Ｍ ＥＴＡ ＨＣｌ－ＮａＯＨ ｐＨ８．５を１０μＬ／分で注入することによって非アクティブ化させる。チップは、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５を３０μＬ／分での１５秒間の注入６回によって調整する。
ヒトＩＮＳＬ５（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓカタログ番号０３５－７０Ａ）及びマウスＩＮＳＬ５（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ０３５－４０）は、それぞれ、ＤＭＳＯで０．５（９９μＭ）又は１ｍｇ／ｍＬ（１９５μＭ）に再構成する。ペプチドの２倍希釈シリーズは、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、及び０ｎＭの濃度で１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で調製する。実施例１、２の抗体、又は陰性対照を、それらを１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈することによって調製する。
実験は、２５℃及び３７℃で実施し、１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を注入する５回のスタートアップサイクルで開始する。次いで、各サイクルにおいて、抗体は、１０μＬ／分で２０秒間、チャネル１～８のフローセル２上で捕捉させる。次に、１８０μＬのそれぞれのＩＮＳＬ５ペプチド試料を、フローセル１及び２全体に６０μＬ／分で１８０秒間個別に注入し、次いで、６０μＬ／分の流速で１２００秒間解離させる。表面を、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＢＲ－１００３－５４）の１５秒パルスを３０μＬ／分で２回注入することによって再生する。６０μＬ／分の流速で６０秒間の安定化期間後に、次のサイクルを開始する。
得られたセンサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析する。１：１結合カイネティクスモデルフィッティングを使用して、結合カイネティクスパラメーター結合速度（ｋａ）、結合カイネティクスパラメーター解離速度（ｋｄ）、及び平衡解離定数（ＫＤ）を算出する。
抗体Ｉの場合、２５℃でのＫＤは、ヒトＩＮＳＬ５に対して４１ｐＭ、マウスＩＮＳＬ５に対して４．６ｐＭと決定する。抗体ＩＩの場合、２５℃でのＫＤは、ヒトＩＮＳＬ５に対して２１ｐＭ、マウスＩＮＳＬ５に対して６．１ｐＭとして決定する。
抗体Ｉの場合、３７℃でのＫＤは、ヒトＩＮＳＬ５に対して１１０ｐＭ、マウスＩＮＳＬ５に対して６．７ｐＭとして決定する。抗体ＩＩの場合、３７℃でのＫＤは、ヒトＩＮＳＬ５に対して８１ｐＭ、マウスＩＮＳＬ５に対して１４ｐＭと決定する。
実施例４：ＩＮＳＬ５活性のインビトロ中和は、ｃＡＭＰ産生を増加させる
抗体Ｉ及び抗体ＩＩによるヒト及びマウスのＩＮＳＬ５活性のインビトロ中和は、ｃＡＭＰ動的２アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏカタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＪ）で決定する。このキットは、細胞内のｃＡＭＰ蓄積を測定するＨＴＲＦ技術に基づいている。一定濃度のフォルスコリンで刺激された細胞は、ｃＡＭＰ産生を増加させる。一定濃度のヒト及び／又はマウスＩＮＳＬ５を細胞に導入することにより、ＲＸＦＰ４受容体に結合することによってｃＡＭＰ産生を阻害する。抗体Ｉ及び抗体ＩＩは、ＲＸＦＰ４受容体に結合する前に、ヒト及びマウスＩＮＳＬ５に結合してその影響を中和する。抗体Ｉ及び抗体ＩＩの抗体連続希釈データから導き出されたＥＣ５０値は、以下の表３に要約されており、抗体の濃度が増加するにつれてｃＡＭＰ産生が増加することを示している。細胞プレートの調製：マウスＲＸＦＰ４ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ Ｐａｒｔ番号９３－０９２９Ｅ２）及びヒトＣＨＯ ＲＸＦＰ４細胞（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ ９３－０７０１Ｅ２）を、３７℃のウォーターバス内で急速に解凍し、（３７℃のウォーターバス内で）予熱されたＣｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ２（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ９３－０５６３Ｒシリーズ）５００μＬで再構成する。細胞を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、（３７℃のウォーターバス内で）予熱された１１．５ｍＬのＣｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ２に加える。細胞を、白色全面積プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ３９１７）にウェル当たり１００μＬで８，０００細胞／ウェルで播種する。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、細胞をプレートに付着させる。４８時間後に、増殖培地を吸引し、４０μＬのＣｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ［ＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００２８．０３）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０２３７．０１）、１％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １０４３８－０２６）、１ｍＭのＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ１５８７９、ＤＭＳＯ中に希釈）］を各ウェルに加える。１７μＭのフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ－ＣＡＳ番号Ｆ３９１７（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ））を含有する３０μＬの化合物アッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１％ＦＢＳ）を各ウェル中に希釈する。
試料（抗体－ＩＮＳＬ５ペプチド混合物）の調製：ヒトＩＮＳＬ５ペプチド（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号０３５－７０）又はマウスＩＮＳＬ５ペプチド（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号０３５－４０）が、Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ２中にそれぞれのＩＣ８０濃度で調製する。次いで、１０μＬのそれぞれのＩＮＳＬ５ペプチド（アッセイにおける最終濃度の１６倍、すなわち、マウスＩＮＳＬ５について１４４ｎＭ及びヒトＩＮＳＬ５について１２８０ｎＭ）を、実施例１又は２の抗体１０μＬの連続希釈（１６０ｎＭで開始）と混合する（最終的な抗体開始濃度は１０ｎＭである）。試料は、ＰＣＲプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄカタログ番号１４２３０２４４）中で穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートする。
細胞アッセイの実施：１０μＬの抗体－ＩＮＳＬ５ペプチド混合物を、アッセイプレート（細胞を含有する）中７０μＬの緩衝液混合物に加え、適度に振盪しながら室温で１時間インキュベートする。インキュベーション中に、ｃＡＭＰ検出試薬を調製する。５００μＬのｃＡＭＰ－ｄ２及びＡｎｔｉ－ｃＡＭＰ－Ｃｒｙｐｔａｔｅストック試薬溶液（ｃＡＭＰ動的２ １００，０００テストキットカタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＪ）を、各々９．５ｍＬのＣｏｎｊｕｇａｔｅ／Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中で希釈する。１時間のインキュベーション後に、４０μＬのｃＡＭＰ－ｄ２検出試薬を、細胞アッセイプレートの各ウェルに加える。次いで、直ちに、Ａｎｔｉ－ｃＡＭＰ－Ｃｒｙｐｔａｔｅ検出試薬４０μＬを、細胞アッセイプレートに加える。プレートを、アルミニウムシールを用いて室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読み取り、機械の６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比から結果を算出する。
データの統計分析：データを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーからＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬＬＣ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にインポートする。ＥＣ５０値は、可変勾配－４パラメータ用量応答曲線解析によって生成する。ＳＥＭは、独立した実験間のＥＣ５０標準偏差（ｎ）を独立した実験の平方根で除算することによって算出する。
抗体Ｉの場合、ＥＣ５０は、ヒトＩＮＳＬ５に対して４．３５ｎＭ及びマウスＩＮＳＬ５に対して０．８４ｎＭとして決定する。抗体ＩＩの場合、ＥＣ５０は、ヒトＩＮＳＬ５に対して１．２７ｎＭ及びマウスＩＮＳＬ５に対して０．４５ｐＭとして決定する。
実施例５：ＴＤＦによる熱安定性
抗体Ｉ及び抗体ＩＩの熱安定性は、熱変性蛍光定量法（ＴＤＦ）によって決定する。特に、実施例１及び２の抗体のＦｃ及びＦａｂドメインの融解温度（Ｔｍ）について、表４に報告する。
熱蛍光アッセイを、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（５０００×濃縮物、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ６６５１）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ ＰＣＲ機械で行う。励起フィルター及び発光フィルターを、それぞれ４６５ｎｍ及び５８０ｎｍに設定し、温度を、２５℃から９５℃まで１℃／秒の速度で連続的に上昇させる。最終アッセイ条件は、ＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２１－０４０－ＣＶ）中に０．２ｍｇ／ｍＬの実施例１又は２及び１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素を含む。
実験は、実施例１又は２を０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の２０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素と等量で混合して、試料（ＢＥ０５７４６－００５）当たり３０μＬの最終容量に到達させることによって行う。混合物は、３８４マルチウェルアッセイプレート（Ｒｏｃｈｅ０４－７２９－７４９－００１）中に三つ組の６μＬのアリコートとして分注する。実施例１及び２のＴｍ値は、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、一次微分法によって決定される。この解析ソフトウェアは、生の蛍光データを平滑化し、Ｔｍは、温度に対する蛍光の上昇勾配が最大になる温度（変曲点）を決定することによって収集する。平均Ｔｍ値及びＳＤは、各三つ組のセットについて算出する。
抗体Ｉの場合、Ｔｍは、Ｆｃドメインについて７６．１℃及びＦａｂドメインについて８７．９℃として決定する。抗体ＩＩの場合、Ｔｍ値は、Ｆｃドメインについて７６．４℃及びＦａｂドメインについて８２．５℃として決定する。
実施例６：ＩＮＳＬ５検出アッセイ
抗体Ｉ及び抗体ＩＩは、サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒト及びマウスＩＮＳＬ５濃度を検出及び定量化するために使用する。特に、このアッセイの検出範囲は、以下の表５に要約されているように、検出下限についての３０ｐｇ／ｍＬと検出上限についての１００，０００ｐｇ／ｍＬとの間で近似する。
ＭＳＤ ＳｕｌｆｏＴａｇ（ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ１５０ｎｍｏｌｅ、カタログ番号Ｒ９１ＡＮ－１）による抗体Ｉの標識化：ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇ粉末を、３ｎｍｏｌ／μμＬの濃度について、元のバイアル内に５０μＬの氷冷のＭｉｌｌｉ Ｑ水で再懸濁させる。標識チャレンジ比１２を使用して、２．７μＬの試薬を、１ｍｇ／ｍＬの抗体１００μＬに加える。溶液をよく混合し、混合物を、室温で２時間振盪させながら遮光する。インキュベーションの終わりに向かって、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８７７６６）を準備する。全ての樹脂が均一な混合物になるまで、カラムを反転させる。カラムの底のバルブを開け、１５００×ｇでの１分間の遠心分離によって液体を排出する。カラムを、１分間の１５００×ｇスピンを使用して、５００μｌの１×ＰＢＳで３回洗浄する。２時間のインキュベーション後に、抗体標識反応溶液を、カラム樹脂中に滴下する。カラムを、エッペンドルフチューブに入れて、１５００ｘｇで２分間スピンさせた後に、標識抗体を収集する。標識抗体は、暗所において４℃で保存する。
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの場合、１日目に、抗体Ｉを１ｘＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１４１９０－１４４）中で４μｇ／ｍＬに希釈する。この溶液３５μＬ／ウェルを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレート（カタログ番号Ｌ１５ＸＡ－３）に適用する。プレートは、ウェルを均一にコーティングするようにタップする。プレートを密封し、室温で一晩インキュベートする。２日目に、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有する１×ＰＢＳ（２０×ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２８３５２）で、自動プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５）を使用して３回洗浄する。プレートを、ペーパータオル上でタップして乾かす。１００μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔ２０）Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３７５３６）を各ウェルに加え、室温で２時間適度に振盪させる。上記のように、プレートを、３回洗浄し、タップして乾かす。２５μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液を、プレートの全てのウェルに加える。次いで、５００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＮＳＬ５（ＤＭＳＯ中に作製されたＰｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓカタログ番号０３５－７０）又はマウスＩＮＳＬ５（ＤＭＳＯ中に作製されたＰｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓカタログ番号０３５－４０）のどちらかで開始する２５μＬの４倍連続希釈物（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔ２０）中に作製された）を、プレートにおけるそれぞれのウェルに加える。プレートを、密封し、室温で２時間適度に振盪する。上記のように、プレートを、３回洗浄し、タップして乾かす。実施例２のＭＳＤ Ｓｕｌｆｏｔａｇ標識抗体を、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ０．０５％中の０．２×Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔ２０）緩衝液中に１μｇ／ｍＬ（すなわち、約１０００倍）に希釈する。この溶液２５μＬを、プレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。上記のように、プレートを、３回洗浄し、タップして乾かす。１ＸＭＳＤ読み取り緩衝液（ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）カタログ番号Ｒ９２ＴＣ－２）１５０μＬを各ウェルに加えて、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒプレートリーダーで読み取る。シグナルは電気化学発光（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ）単位（ＥＣＬＵ）で測定する。
データの統計分析：データを、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳｅｃｔｏｒリーダーからＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬＬＣ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にインポートして、正確なＩＮＳＬ５検出のための近似直線範囲を決定する。検出範囲は、ヒト及びマウスＩＮＳＬ５の両方について３０ｐｇ／ｍＬ～１００，０００ｐｇ／ｍＬで近似する。
アミノ酸及びヌクレオチド配列
配列番号１：ヒトＩＮＳＬ５ Ａ鎖
ＱＤＬＱＴＬＣＣＴＤＧＣＳＭＴＤＬＳＡＬＣ
配列番号２：ヒトＩＮＳＬ５ Ｂ鎖
ＫＥＳＶＲＬＣＧＬＥＹＩＲＴＶＩＹＩＣＡＳＳＲＷ
配列番号３：マウスＩＮＳＬ５ Ａ鎖
ＲＤＬＱＡＬＣＣＲＥＧＣＳＭＫＥＬＳＴＬＣ
配列番号４：マウスＩＮＳＬ５ Ｂ鎖
ＲＱＴＶＫＬＣＧＬＤＹＶＲＴＶＩＹＩＣＡＳＳＲＷ
配列番号５：抗体のＨＣ
ＩＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＧＷＶＲＱＴＰＧＥＧＬＥＷＶＧＴＩＳＡＧＧＹＴＹＹＡＨＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＳＳＴＴＶＤＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＲＷＮＹＤＲＳＧＧＡＧＡＧＹＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＴＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＮＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
配列番号６：抗体ＩのＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＣＧＴＡＣＴＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＴＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＡＧＴＡＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴＴＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号７：抗体ＩのＬＣ
ＡＤＶＶＭＴＱＴＡＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＱＳＩＴＳＳＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＰＡＡＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＹＧＹＦＳＳＳＩＤＦＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＲＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
配列番号８：抗体ＩのＬＣ ＤＮＡ
ＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＴＣＣＣＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＡＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＣＧＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＴＧＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＡＣＡＣＴＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＴ
配列番号９：抗体ＩのＶＨ
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＧＷＶＲＱＴＰＧＥＧＬＥＷＶＧＴＩＳＡＧＧＹＴＹＹＡＨＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＳＳＴＴＶＤＬＫＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＲＷＮＹＤＲＳＧＧＡＧＡＧＹＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０：抗体ＩのＨＣＤＲ１
ＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＧ
配列番号１１：抗体ＩのＨＣＤＲ２
ＴＩＳＡＧＧＹＴＹ
配列番号１２：抗体ＩのＨＣＤＲ３
ＡＲＥＲＷＮＹＤＲＳＧＧＡＧＡＧＹＦＤＬ
配列番号１３：抗体ＩのＶＬ
ＡＤＶＶＭＴＱＴＡＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＱＳＩＴＳＳＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＰＡＡＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＹＧＹＦＳＳＳＩＤＦＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＲ
配列番号１４：抗体ＩのＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＴＳＳＹＬＳ
配列番号１５：抗体ＩのＬＣＤＲ２
ＹＰＡＡＮＬＡＳ
配列番号１６：抗体ＩのＬＣＤＲ３
ＬＹＧＹＦＳＳＳＩＤＦＡ
配列番号１７：抗体ＩＩのＨＣ
ＱＳＶＥＥＳＧＧＧＬＶＴＰＧＧＳＬＴＬＴＣＴＶＳＧＩＤＬＴＴＹＡＭＧＷＶＲＱＡＰＧＥＧＬＥＷＩＧＩＩＧＧＧＧＲＴＹＹＡＡＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＲＩＴＳＰＡＴＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＧＧＤＦＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＴＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＮＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
配列番号１８：抗体ＩＩのＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＴＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＡＧＴＡＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＧＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴＴＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＣＴＡＴＣＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＡＡＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡ
配列番号１９：抗体ＩＩのＬＣ
ＡＱＶＬＴＱＴＰＡＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＤＩＳＫＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＹＶＳＮＬＥＦＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＤＬＥＣＤＤＡＡＴＹＹＣＨＱＧＹＴＧＶＮＶＥＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＲＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
配列番号２０：抗体ＩＩのＬＣ ＤＮＡ
ＧＣＴＣＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＴＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＣＧＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＴＧＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＡＣＡＣＴＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＴＣＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＧＴ
配列番号２１：抗体ＩＩのＶＨ
ＱＳＶＥＥＳＧＧＧＬＶＴＰＧＧＳＬＴＬＴＣＴＶＳＧＩＤＬＴＴＹＡＭＧＷＶＲＱＡＰＧＥＧＬＥＷＩＧＩＩＧＧＧＧＲＴＹＹＡＡＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＲＩＴＳＰＡＴＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＧＧＤＦＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２２：抗体ＩＩのＨＣＤＲ１
ＴＶＳＧＩＤＬＴＴＹＡＭＧ
配列番号２３：抗体ＩＩのＨＣＤＲ２
ＩＩＧＧＧＧＲＴＹ
配列番号２４：抗体ＩＩのＨＣＤＲ３
ＶＲＧＧＤＦＦＤＬ
配列番号２５：抗体ＩＩのＶＬ
ＡＱＶＬＴＱＴＰＡＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＤＩＳＫＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＹＶＳＮＬＥＦＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＤＬＥＣＤＤＡＡＴＹＹＣＨＱＧＹＴＧＶＮＶＥＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＲ
配列番号２６：抗体ＩＩのＬＣＤＲ１
ＱＡＳＥＤＩＳＫＹＬＳ
配列番号２７：抗体ＩＩのＬＣＤＲ２
ＹＹＶＳＮＬＥＦ
配列番号２８：抗体ＩＩのＬＣＤＲ３
ＨＱＧＹＴＧＶＮＶＥＮＶ
配列番号２９：シグナルペプチド
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ

Claims (36)

  1. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＩＮＳＬ５に結合する抗体であって、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
    前記ＨＣＤＲ１が、ＴＡＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＧ（配列番号１０）を含み、
    前記ＨＣＤＲ２が、ＴＩＳＡＧＧＹＴＹ（配列番号１１）を含み、
    前記ＨＣＤＲ３が、ＡＲＥＲＷＮＹＤＲＳＧＧＡＧＡＧＹＦＤＬ（配列番号１２）を含み、
    前記ＬＣＤＲ１が、ＱＡＳＱＳＩＴＳＳＹＬＳ（配列番号１４）を含み、
    前記ＬＣＤＲ２が、ＹＰＡＡＮＬＡＳ（配列番号１５）を含み、ならびに
    前記ＬＣＤＲ３が、ＬＹＧＹＦＳＳＳＩＤＦＡ（配列番号１６）を含む、抗体。
  2. 前記ＶＨが、配列番号９を含み、前記ＶＬが、配列番号１３を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、配列番号５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号７を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、配列番号５のアミノ酸２～４４６を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号７を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、配列番号５からなるＨＣと、配列番号７からなるＬＣとを含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  6. ヒトＩＮＳＬ５に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、ヒトＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号１）及びＢ鎖（配列番号２）に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  8. マウスＩＮＳＬ５に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、マウスＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号３）及びＢ鎖（配列番号４）に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 配列番号５又は配列番号７をコードする配列を含む、核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含む、ベクター。
  12. 配列番号５をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号７をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、組成物。
  13. （ａ）配列番号５をコードする核酸配列を含む第１のベクター、及び配列番号７をコードする核酸配列を含む第２のベクター、又は
    （ｂ）配列番号５をコードする第１の核酸配列と、配列番号７をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む、細胞。
  14. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  15. 抗体を産生する方法であって、請求項１３又は１４に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することを含む、方法。
  16. 請求項１３又は１４に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することによって産生された、抗体。
  17. ＶＨ及びＶＬを含むＩＮＳＬ５に結合する抗体であって、前記ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
    前記ＨＣＤＲ１が、ＴＶＳＧＩＤＬＴＴＹＡＭＧ（配列番号２２）を含み、
    前記ＨＣＤＲ２が、ＩＩＧＧＧＧＲＴＹ（配列番号２３）を含み、
    前記ＨＣＤＲ３が、ＶＲＧＧＤＦＦＤＬ（配列番号２４）を含み、
    前記ＬＣＤＲ１が、ＱＡＳＥＤＩＳＫＹＬＳ（配列番号２６）を含み、
    前記ＬＣＤＲ２が、ＹＹＶＳＮＬＥＦ（配列番号２７）を含み、ならびに
    前記ＬＣＤＲ３が、ＨＱＧＹＴＧＶＮＶＥＮＶ（配列番号２８）を含む、抗体。
  18. 前記ＶＨが、配列番号２１を含み、前記ＶＬが、配列番号２５を含む、請求項１７に記載の抗体。
  19. 前記抗体が、配列番号１７を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１７又は１８に記載の抗体。
  20. 前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸２～４３５を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１９を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１７又は１８に記載の抗体。
  21. 前記抗体が、配列番号１７からなるＨＣと、配列番号１９からなるＬＣとを含む、請求項１７又は１８に記載の抗体。
  22. 前記抗体が、ヒトＩＮＳＬ５に結合する、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 前記抗体が、ヒトＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号１）及びＢ鎖（配列番号２）に結合する、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 前記抗体が、マウスＩＮＳＬ５に結合する、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  25. マウスＩＮＳＬ５のＡ鎖（配列番号３）及びＢ鎖（配列番号４）に結合する、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  26. 配列番号１７又は配列番号１９をコードする配列を含む、核酸。
  27. 請求項２６に記載の核酸を含む、ベクター。
  28. 配列番号１７をコードする核酸配列を含む第１のベクターと、配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクターとを含む、組成物。
  29. （ａ）配列番号１７をコードする核酸配列を含む第１のベクター、及び配列番号１９をコードする核酸配列を含む第２のベクター、又は
    （ｂ）配列番号１７をコードする第１の核酸配列と、配列番号１９をコードする第２の核酸配列とを含むベクターを含む、細胞。
  30. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  31. 抗体を産生する方法であって、請求項２９又は３０に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することを含む、方法。
  32. 請求項２９又は３０に記載の細胞を、抗体が発現される条件下で培養し、次いで発現された抗体を培養培地から回収することによって産生された、抗体。
  33. 試料中のＩＮＳＬ５を検出する方法であって、前記試料を請求項１～９又は１７～２５のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、前記接触させるステップによって生成されるシグナルを検出するステップとを含む、方法。
  34. 試料中のＩＮＳＬ５を定量化する方法であって、前記試料を請求項１～９又は１７～２５のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、前記接触させるステップによって生成されたシグナルを検出するステップとを含む、方法。
  35. 対照標準を前記抗体と接触させるステップと、前記対照標準を接触させる前記ステップによって提供されたシグナルを検出するステップとを更に含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記試料を第２の抗体と接触させるステップを更に含み、前記抗体又は前記第２の抗体のうちの１つが、検出可能な標識を含み、前記接触させるステップが、前記抗体、前記第２の抗体、及びＩＮＳＬ５を含む複合体の形成に際して前記検出可能な標識によって提供されるシグナルを検出することを含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
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