JP2023536665A - アダプターポリペプチドおよびその使用方法 - Google Patents

アダプターポリペプチドおよびその使用方法 Download PDF

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Abstract

細胞外小胞の組成物、ならびに細胞外小胞を産生する方法およびシステムが本明細書に記載される。細胞外小胞を使用する方法も本明細書に記載される。本開示は、体内の異なる細胞および器官、ならびに疾患または障害に関連する細胞を含む、多種多様な細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞を提供する。場合によっては、本明細書で提供される細胞外小胞は、標的に特異的に結合するように容易に改変することができる。例えば、それらは、細胞表面マーカーに結合する細胞外ドメイン（例えば、細胞外小胞の膜内の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン）を含み得る。一般に、本明細書で提供される細胞外小胞は、細胞外ドメインと、必要に応じて、細胞表面マーカーに結合する膜貫通ドメインとを有するアダプターポリペプチドを含む。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年８月５日に出願された米国仮出願第６３／０６１，７４９号の利益を主張するものである。優先権は、米国特許法第１１９条（３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９）に従って主張される。上記の特許出願は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
細胞外小胞は、多種多様な細胞型によって分泌される。一般に、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞は膜に結合しており、治療用カーゴで負荷され得る。例えば、エキソソームは、ほとんどの真核細胞によって分泌される膜結合細胞外小胞の一種である。エキソソーム生合成は、エンドソームの陥入を多胞体内にくびり切って腔内小胞を形成することから始まり得る。多胞体が細胞の原形質膜と融合すると、腔内小胞はエキソソームとして放出され得る。微小小胞は、細胞膜表面から出芽する。一方、アポトーシス小体は、死細胞から放出される。エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体は、インビボまたはインビトロ、例えば細胞培養で放出され得る。
細胞外小胞は、治療薬を封入および送達するためのビヒクルとして研究されてきた。細胞外小胞の大部分が肝臓、脾臓、および／または腎臓で分解されるため、細胞外小胞を標的に向けることは一般に困難である。また、標的化送達のための治療薬を封入するための細胞外小胞の設計および製造は、時間がかかり高額である。例えば、ある細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞は、別の細胞型を効果的に標的としない場合がある。したがって、複数の細胞型を標的とするように容易に改変することができる細胞外小胞が依然として必要とされている。標的化された細胞に送達される十分な量および品質の治療薬を封入することができる細胞外小胞も依然として必要とされている。
概要
本開示は、体内の異なる細胞および器官、ならびに疾患または障害に関連する細胞を含む、多種多様な細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞を提供する。場合によっては、本明細書で提供される細胞外小胞は、標的に特異的に結合するように容易に改変することができる。例えば、それらは、細胞表面マーカーに結合する細胞外ドメイン（例えば、細胞外小胞の膜内の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン）を含み得る。一般に、本明細書で提供される細胞外小胞は、細胞外ドメインと、必要に応じて、細胞表面マーカーに結合する膜貫通ドメインとを有するアダプターポリペプチドを含む。
本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、細胞外小胞が、１０－９Ｍ未満またはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で抗体のＦｃ領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、抗体は罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、抗体と、少なくとも１つの治療薬とを含む、組成物である。いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載され、前述の細胞外小胞は、抗体のＦｃ領域を特異的に認識するＦｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチド（ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む）と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の抗体（ここで、前述の抗体は罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する）と、少なくとも１つの治療薬とを含む。いくつかの態様では、前述の受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の罹患細胞ががん細胞または非がん性病変細胞である。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体は、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体クローンＣ２２５、ヒト化抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ２、およびヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローンＳＰ１４２からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧを含む。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体から放出されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞がエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の対象ががんまたは非がん性病変を有する。いくつかの態様では、前述の対象が神経膠腫を有する。いくつかの態様では、前述の対象が筋ジストロフィを有する。いくつかの態様では、前述の筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の対象が網膜疾患を有する。いくつかの態様では、前述の網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも６ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１週間に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、Ｆｃ受容体が抗体のＦｃ領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも１つの治療薬を含む、ステップと、抗体を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、抗体が罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体またはＦｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーまたは第２の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの場合、１０－９Ｍ未満またはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で抗体のＦｃ領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチド（ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む）と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の抗体（ここで、前述の抗体は免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する）と、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドとを含む少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、抗体は免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに特異的に結合する、抗体と、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドとを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体がＩｇＧである。いくつかの態様では、前述の抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質は、エンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前述のＳタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合には、対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも６ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１週間に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、本明細書に記載される組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、Ｆｃ受容体が抗体のＦｃ領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、抗体を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、抗体が免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体またはＦｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体がＩｇＧを含む。いくつかの態様では、前述の抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質は、エンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前述のＳタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、前述の細胞外小胞が、１０－９Ｍ未満またはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で結合分子のＦｃ領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチド（ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む）と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の結合分子（ここで、前述の結合分子は罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する）と、少なくとも１つの治療薬とを含む、組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、前述の細胞外小胞が、結合分子のＦｃ領域を特異的に認識するＦｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された結合分子であって、結合分子は罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに特異的に結合する、結合分子と、少なくとも１つの治療薬とを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の結合分子は、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体クローンＣ２２５、ヒト化抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ２、およびヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローンＳＰ１４２からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧを含む。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体から放出されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞がエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の対象ががんまたは非がん性病変を有する。いくつかの態様では、前述の対象が神経膠腫を有する。いくつかの態様では、前述の対象が筋ジストロフィを有する。いくつかの態様では、前述の筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の対象が網膜疾患を有する。いくつかの態様では、前述の網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも６ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１週間に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、Ｆｃ受容体が結合分子のＦｃ領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも１つの治療薬を含む、ステップと、結合分子を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、結合分子が罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体またはＦｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーまたは第２の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの場合、１０－９Ｍ未満またはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で結合分子のＦｃ領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチド（ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む）と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の結合分子（ここで、前述の結合分子は免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する）と、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドとを含む少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、結合分子のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、結合分子は免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに特異的に結合する、結合分子と、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドとを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の結合分子がＩｇＧである。いくつかの態様では、前述の結合分子がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質は、エンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前述のＳタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも６ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１ヶ月に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも１週間に１回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、本明細書に記載される組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、Ｆｃ受容体が結合分子のＦｃ領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、結合分子を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、結合分子が免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。いくつかの態様では、前述のＦｃ受容体がＣＤ６４である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーは、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第１の細胞表面マーカーと第２の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子がヒト化モノクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がＩｇＧである。いくつかの態様では、前述の結合分子がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のＦｃ領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質は、エンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前述のＳタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許または特許出願の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて官庁から提供される。
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、例示的な態様を記載する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。
図１は、細胞外小胞表面上のＣＤ６４に連結されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）とを含む標的化細胞外小胞（「ＥＸＯ」）の概略図を示す。これらの細胞外小胞（ＥＶ）は、腫瘍および病変を標的とすることができ、例示的な標的を図１に列挙する。ＣＤ６４またはＴＨＰ－ＣＤ６４を有するＥＶは、ドナー細胞をヒトＣＤ６４プラスミドＤＮＡまたはヒトＴＨＰ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡでトランスフェクトして、トランスフェクトしたドナー細胞から分泌されたＥＶ（エキソソームを含む）の表面にヒトＣＤ６４またはヒトＴＨＰ－ＣＤ６４のいずれかを発現させることによって生成することができる。ＣＤ６４は、ヒト化モノクローナル抗体（ｈｍＡＢ）に結合するための生物学的アンカーを提供する。ヒトＣＤ６４の細胞外Ｄ１－Ｄ２ヒンジは、約１０－９Ｍ（ナノモル濃度）もの高親和性（解離定数（Ｋｄ））でヒトＩｇＧ１におけるＦｃの下部ヒンジ領域に結合する。結合したｈｍＡｂが細胞標的を特異的に認識する能力に加えて、小さな腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）による標的化もまた、ＣＤ６４のＮ末端に操作することができる。ＥＶ（またはエキソソーム）表面上のｈｍＡｂおよびＴＨＰの両方の二重標的化は、インビボでの腫瘍および他の病変への標的化および送達を増強する。がん／腫瘍標的化のためのｈｍＡｂの例としては、抗ｈＥＧＦＲ、例えばセツキシマブ、抗ｈＰＤ－Ｌ１、例えばアテゾリズマブ、および抗ヒト化ＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。がん／腫瘍標的化のためのＴＨＰの例としては、ＣＫＡＡＫＮ（ＣＫ）、ＣＲＥＫＡ（ＣＲ）、およびＡＲＲＰＫＬＤ（ＡＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
図２Ａ～２Ｄは、更なる腫瘍ホーミングペプチドを有するＣＤ６４をコードするプラスミドの例示的な構築物設計を示す。図２Ａ．プラスミドを、それぞれ形質転換およびトランスフェクションのためにアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）およびＥＧＦＲマーカーの遺伝子を有するベクターを用いて構築した。機能的ＣＤ６４は、ＥＦ－１αプロモーターによって駆動されるＣＤ６４のコード配列（ＣＤ６４＿ＣＤＳ）によってコードされた。図２Ｂ．ＣＤ６４＿ＣＤＳ（３５５アミノ酸）は、（ｉ）シグナルペプチド（ＳＰ）と、（ｉｉ）細胞外領域（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３）と、（ｉｉｉ）膜貫通（ＴＭ）領域と、（ｉｖ）細胞内（ＩＣ）ドメインとを含み、ＴＨＰは、シグナルペプチドと細胞外Ｄ１領域との間のギャップに挿入され、ＣＤ６４のＮ末端でＴＨＰの発現を可能にした。図２Ｃ．ＴＨＰをＦｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＫ）リンカーによって細胞外Ｄ１のＮ末端に連結し、ＣＤ６４のＤ１－Ｄ２ヒンジにおけるＦｃ結合領域のコンフォメーションのブロックを制限した。図２Ｄ．選択されたＴＨＰ［Ｆｌａｇ＿対照、ＣＫＡＡＫＮ（ＣＫ）、ＣＲＥＫＡ（ＣＲ）、ＡＲＲＰＫＬＤ（ＡＲ）］の例示的なペプチドおよびヌクレオチド配列のリスト。
図３Ａ～３Ｃは、ＣＤ６４上へのＴＨＰの添加がヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）との結合親和性にどのように影響を与えないかを示す。図３Ａ．固体支持体上の固定化ｈＩｇＧに結合し、ＥＬＩＳＡ基質と反応した異なるＴＨＰを有する精製ＣＤ６４タンパク質の概略図。Ｋｄ値は、ＣＤ６４とｈＩｇＧとの間の一価モデリングによって決定した。図３Ｂ．ｈＩｇＧおよび組換え野生型ＣＤ６４（ｗｔ＿ＣＤ６４）の親和性指数Ｋｄを測定した。図３Ｃ．異なる操作されたＴＨＰ－ＣＤ６４タンパク質とｈＩｇＧとのの親和性指数Ｋｄは、異なるＴＨＰ（Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲ、ＡＲ）を有する操作されたＣＤ６４がｗｔ＿ＣＤ６４と比較してｎＭレベルでｍＡｂとの高い結合親和性に影響を及ぼさないことを示唆した。
図４Ａ～４Ｂは、ＴＨＰ－ＣＤ６４および治療用ＲＮＡプラスミドによるナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）でトランスフェクトしたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）からの内因性ｍＲＮＡのＥＶ数および含量を示す。図４Ａ．ＰＢＳ中の未処理ＭＥＦ（対照群）、ＮＥＰによってＴＨＰ－ＣＤ６４およびヒトＴＰ５３プラスミドの両方をトランスフェクトしたＭＥＦ、ならびに２４時間のＮＥＰによってＴＨＰ－ＣＤ６４およびｓｈＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異プラスミドの両方をトランスフェクトしたＭＥＦによって産生された細胞あたりのＥＶ数。図４Ｂ．ｑＲＴ－ＰＣＲによる、未処理およびＮＥＰでトランスフェクトしたＭＥＦによって産生されたＥＶにおけるＴＰ５３ ｍＲＮＡの倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）。
図５Ａ～５Ｄは、ＴＨＰ－ＣＤ６４発現エキソソームがｈＩｇＧとの高い結合親和性を保持したことを示す。図５Ａ．操作されたＴＨＰ－ＣＤ６４を有する精製エキソソームをラテックスビーズによって捕捉し、フローサイトメトリーアッセイのために抗ＣＤ６４－ＡＰＣ、抗ＣＤ６３－ＢＶ５１０およびＦＩＴＣコンジュゲートｈＩｇＧと共にインキュベートした概略図。図５Ｂ．表面発現のプロファイリングは、ＣＤ６４発現およびｈＩｇＧ結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定するために、シングレットビーズおよびＣＤ６３＋エキソソーム集団をゲートする標準プロトコルに従った。図５Ｃ．ＣＤ６３＋エキソソーム集団内のＣＤ６４の表面共発現をＦＩＴＣのＭＦＩによって決定し、Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲまたはＡＲ ＴＨＰのいずれかを有する操作されたＣＤ６４のエキソソーム発現を確認した。図５Ｄ．ＣＤ６３＋エキソソーム集団内のｈＩｇＧおよびＣＤ６４の表面共発現をＦＩＴＣのＭＦＩによって決定し、Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲまたはＡＲ ＴＨＰのいずれかを有するＣＤ６４を発現するエキソソームに対するｈＩｇＧの高い結合親和性を確認した。
図６は、ヒト膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ－１由来のがんスフェロイドにおけるリポソームおよびＥＶの取り込みを示す。Ｆｌａｇ－ＣＤ６４またはＣＫ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡ（ＣＫ－ＣＤ６４）のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞から放出された精製ＥＶを、ヒト化抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（セツキシマブ）またはｈＩｇＧのいずれかと共に製剤化した。がんスフェロイドをＰＫＨ６７（緑色）標識リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）および種々のＥＶで２４時間処理し、その後、固定、透過および抗ｈＩｇＧ－ＴＲＩＴＣ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）による染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なＥＶによるがんスフェロイド処置はすべて、蛍光強度および分布に基づいて市販のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００よりも良好なスフェロイド取り込みを示した。様々なＥＶの中で、二重標的化ＥＶ（ＣＫ－ＣＤ６４－Ｃｅｔ＿Ｅｘｏ）は、最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
図７Ａ～７Ｃは、ＣＫ－ＣＤ６４およびヒト化抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（セツキシマブ）の二重標的化がＰＡＮＣ－１がんスフェロイド細胞、特にＣＤ２４＋ＣＤ４４＋亜集団におけるＥＶ取り込みを増強することを示す。図７Ａ．ＰＡＮＣ－１がんスフェロイドを形成し、直径約５００μｍに達するまで一週間培養し、次いで培養培地中の約１０９個のＰＫＨ ６７標識エキソソームで２４時間処理した。図７Ｂ．処理したスフェロイドを単一細胞懸濁物に分解して、フローサイトメトリーを使用したＣＤ２４およびＣＤ４４の発現によって亜集団を同定した。図７Ｃ．ＣＤ２４ｌｏｗＣＤ４４ｌｏｗまたはＣＤ２４＋ＣＤ４４＋亜集団において測定されたＰＫＨ６７の平均蛍光強度は、それらのＥＶ取り込みを表す。ヒト化抗体結合（セツキシマブ：抗ＥＧＦＲ、アテゾリズマブ：抗ＰＤ－Ｌ１、またはｈＩｇＧ）を有するＦｌａｇ－ＣＤ６４、ＣＫ－ＣＤ６４、ＣＲ－ＣＤ６４、またはＡＲ－ＣＤ６４を含有する操作されたＥＶはすべて、特にＣＤ４４＋ＣＤ２４＋亜集団について良好な細胞取り込みを示した。抗ｈＥＧＦＲ（セツキシマブ）およびＣＫ－ＣＤ６４を用いた二重標的化ＥＶは、両方のＰＡＮＣ－１細胞亜集団について最良の細胞取り込みを提供した。
図８は、膵臓がんの８５％で高度に発現されるＲＯＲ１をＰＡＮＣ－１から形成されたスフェロイド内で標的化することによって、細胞外小胞の取り込みが増強されることを示す。ＰＡＮＣ－１スフェロイドを形成し、直径が３００～５００μｍになるまで１週間安定に培養し、次いで培養培地中の１０１０個のＰＫＨ６７標識エキソソームで２４時間処理した。
図９は、ＰＡＮＣ－１同所性モデルにおけるインビボでのＲＯＲ１に標的化された細胞外小胞の取り込みの増強を示す。マウス（ＰＡＮＣ－１細胞外小胞の異種移植の４週間後）を細胞外小胞溶液（２５０μｌ）による１．０Ｅ１２／５０μｌ（腹腔内）注射で処置し、２４時間後に屠殺した。ＰＫＨ２６（励起／発光：５３５／５８０ｎｍ）；ＧＦＰ（４６５／５４０ｎｍ）；ＩＶＩＳ（落射照明、Ｂｉｎ：（Ｍ）１、ＦＯＶ：２２、ｆ２、５ｓ。分布：脳／心臓／肺／肝臓／脾臓／膵臓／腎臓。
図１０は、腫瘍組織を貫通することによるＲＯＲ１に標的化された細胞外小胞の増強された取り込みを示す。抗ＲＯＲ１標的化は、腫瘍病変における細胞外小胞の取り込みを高めるが、ＣＫ＿ペプチド細胞外小胞の更新は、ｆｌａｇ対照と比較して有意ではない。
図１１Ａ～１１Ｄは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン開発のためのエピトープおよび構造予測からのｖａｃｏｓｏｍｅおよび５つの提案されたワクチンペプチド（すなわち、スパイク、Ｓタンパク質、断片）の例示的な設計を示す。図１１Ａ．ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体として作用し、それが細胞に感染することを可能にする。図１１Ｂ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介した強力なワクチン接種は、ＣＤ６４のＮ末端上のペプチドのワクチン接種およびＣＤ６４のヒンジＤ１－Ｄ２上の事前負荷された抗αＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂによる共刺激によって相乗的に達成することができる。エキソソーム表面上のＣＤ６４に融合した様々なウイルスタンパク質断片を過剰発現するエキソソームは、ワクチン（「ｖａｃｏｓｏｍｅ」と呼ばれる）として機能することができる。図１１Ｃ．操作されたＣＤ６４とＴＣＲとの間の免疫学的シナプスの形成は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いた蛍光タグおよびＴ細胞表面マーカー染色によって確認することができる。同様に、Ｂ細胞（抗αＣＤ１９／ＣＤ２０）および樹状細胞（ＤＣ）（抗αＬＩＬＲＡ ４）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするｍＡｂの同時負荷は、ＡＰＣ－Ｔ細胞応答を増強するはずである。図１１Ｄ．ＣＯＶＩＤ－１９のワクチンペプチドとして機能する可能性が高い５つの融合Ｓタンパク質断片候補をエピトープおよび構造予測から選択する。それらは、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＤＣなどのＮＥＰでトランスフェクトしたドナー細胞を介して生成されたｖａｃｏｓｏｍｅ上に発現され得る。
図１２Ａ～１２Ｂは、ヒト免疫グロブリンおよび古典的Ｆｃ受容体の結合親和性強度を示す。原形質膜に埋め込まれたＦｃ受容体は、下流の活性化または抑制を引き起こすことができる細胞内ドメインまたはサブユニットを含む。図１２Ａ．ＩｇＧ親和性変化バリアントは、非常に高い（濃いオレンジ色）、高い（オレンジ色）、中程度（黄色）、低い（薄い青色）から結合しない（濃い青色）まで、それぞれのヒトＦｃγ受容体メンバーで強調される。ＦｃＲｎ受容体は、酸性条件下（例えばｐＨ＝６）ではＩｇＧサブクラスに結合するが、生理学的条件下、ｐＨ＝７．４では結合能力を低下させる。図１２Ｂ．ＩｇＥは、ＦｃεＲＩ受容体に対して非常に高い結合親和性を有するが、ＦｃεＲＩＩ受容体に対しては低い親和性を有する。ＩｇＡはＦｃαＲＩ受容体との結合親和性が低い。＊＊＊ヒト免疫グロブリンとＦｃリピーターとの間の結合親和性は、非常に高い＋＋＋：約１０－９Ｍ；高い＋＋：１０－９～１０－８Ｍ；中程度：約１０－７Ｍ；または低い：＞１０－７Ｍのレベルで定数Ｋｄとして示される。
図１３Ａ～１３Ｄは、ＮＥＰにおけるＥＶ放出の動態を示す。図１３Ａは、ＮＥＰ後の経時的なＥＶ分泌プロファイルを示す。図１３Ｂは、ｑＰＣＲによって測定された経時的なＥＶ内のＴＰ５３ｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す。図１３Ｃは、８時間ごとに回収したＥＶについてＥＬＩＳＡによって測定したＥＶ表面上のＣＤ６４発現を示す。図１３Ｄは、ＮＥＰ後の８時間ごとのＥＶ内のＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡの発現レベルを示す。
図１４Ａ～Ｃは、ＴＰ５３ｍＲＮＡ／ＣＤ６４ＥＶの逐次的ＮＥＰ（ｓＮＥＰ）設計を示す。図１４Ａは、（図１４Ａ）８時間、（図１４Ｂ）１６時間および（図１４Ｃ）２４時間のｓＮＥＰ例におけるＥＶ数およびＴＰ５３ｍＲＮＡ発現を提供する。Ｃｔｒｌは、ＣＤ６４プラスミドによる１回のＮＥＰである。
図１５Ａ～Ｆは、調製されたままの標的化ＥＶ（ｔＥＶ）の特徴付けを提供する。図１５Ａは、ブランクＥＶ（対照）およびＮＥＰによって得られた操作されたＥＶのサイズ分布、（図１５Ｂ）調製されたままのＥＶのエキソソームバイオマーカー、代表的なＥＶの（図１５Ｃ）ＳＥＭおよび（図１５Ｄ）ＣｒｙｏＴＥＭ画像を提供する。（図１５Ｅ）ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡおよびＴＰ５３ｍＲＮＡについての蛍光標識抗ＣＤ６４および分子ビーコンを用いたＴＩＲＦ顕微鏡のＩＬＮバイオチップを使用した単一ＥＶ捕捉および共局在化の特徴付け、（図１５Ｆ）ＣＤ６４タンパク質、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ、ＴＰ５３ｍＲＮＡを含有するＥＶの比率、ならびにＣＤ６４／ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡおよびＣＤ６４／ＴＰ５３ｍＲＮＡの共局在化。
図１６Ａ～Ｇ、ＣＤ６４／ＥＶ表面上の腫瘍特異的抗体（αｈＲＯＲ１およびαｈＥＧＦＲ）に結合すると、ＰＡＮＣ－１細胞におけるＥＶの細胞内在化を増強できることを示す。図１６Ａは、ＣＤ６４ｆｌａｇペプチド上のヒト化抗体の取り込み効率を提供する。図１６Ｂは、ＣＫペプチドによるＣＤ６４上のヒト化抗体の取り込み効率を提供する。図１６Ｃは、各製剤による相対的なＥＶ取込みを定量化する。図１６Ｄは、処理なし（Ｃｏｎ）、ならびに４時間のＩｇＧ＿ＥＶ、αＥＧＦＲ＿ＥＶおよびαＲＯＲ１＿ＥＶ処理によるＰＡＮＣ－１細胞の染色を比較する。図１６Ｅ～１６Ｆは、αＥＧＦＲ＿ＥＶ（図１６Ｅ）およびαＲＯＲ１＿ＥＶ（図１６Ｆ）についてのＰＡＮＣ－１細胞の３Ｄ腫瘍スフェロイドに対するＥＶ取り込みアッセイを提供する。図１６Ｇは、３７℃で６時間のヒト血清（５０％）による置換アッセイを提供する。
図１７Ａ～Ｄは、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）に基づくトランスサイトーシスアッセイおよび結果を示す。図１７Ａは、アッセイの概略図を提供する。図１７Ｂは、エンドサイトーシスおよびＥＶ分泌を遮断するように選択された様々な阻害剤を提供する（クラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害剤であるｐｉｔｓｔｏｐ ２；カベオラ媒介エンドサイトーシスの阻害剤であるメチル－β－シクロデキストリン；マイクロピノサイトーシスの阻害剤であるサイトカラシンＤ；およびエキソソーム分泌の阻害剤であるネチコナゾールを含む）。図１７Ｃは、様々な阻害剤（「ｃｔｌ」：上部ＰＡＮＣ－１細胞における阻害剤を含まない１Ｅ１０非標的化ＥＶ；「Ｐｏｓ ｃｔｌ」：上部細胞層なし）を使用したＰＡＮＣ－１によるトランスサイトーシスアッセイからのデータを提供する。図１７Ｄは、ＥＶ表面上の標的化ｈｍＡｂを使用してＰＡＮＣ－１によるトランスサイトーシスレベルを比較する。
図１８Ａ～Ｂは、ヒト血清ＩｇＧがＥＶ表面上のヒトｍＡｂに影響を及ぼさないことを実証している。図１８Ａ～Ｂは、３７℃で６時間ヒト血清（５０％）と共にインキュベートし、次いで単層ＰＡＮＣ－１細胞で処理したαｈＥＧＦＲ＿ＥＶ（左パネル）およびαｈＲＯＲ１＿ＥＶ（右パネル）が、ヒト血清インキュベーション後に同じ標的化能力を維持したことを示す。
図１９Ａ～Ｂは、ＰＡＮＣ－１同所性ＮＳマウスにおける標的化ＥＶの生体内分布を示す。図１９Ａはインビボイメージング（ＩＶＩＳ）を示し、図１９Ｂは脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、および腎臓における発現を示す。
詳細な説明
本開示の好ましい態様を本明細書に示し説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の態様に対する様々な代替態様が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図される。
絶対的または逐次的な用語、例えば、「する」、「しない」、「すべきである」、「すべきでない」、「しなければならない」、「してはならない」、「まず」、「最初に」、「次に」、「続いて」、「前に」、「後に」、「最後に」、および「最終的に」の使用は、本明細書に開示される本態様の範囲を限定することを意味するものではなく、例示としてのものである。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることを意図している。
本明細書で使用される場合、「または」は、「および」、「または」、または「および／または」を指すことができ、排他的および包括的の両方で使用され得る。例えば、「ＡまたはＢ」という用語は、「ＡまたはＢ」、「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、および「ＡおよびＢ」を指すことができる。いくつかの場合、文脈が特定の意味を決めることもある。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」、「１つまたはそれを超える」、および「および／または」という語句は、動作において接続的および選言的の両方であるオープンエンド表現である。例えば、「Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの１つまたはそれを超える」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つまたはそれを超える」および「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」の各表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとを一緒に、ＡとＣとを一緒に、ＢとＣとを一緒に、またはＡとＢとＣとを一緒に、を意味する。
本明細書に記載される任意のシステム、方法、組成物およびプラットフォームはモジュール式であり、逐次的なステップに限定されない。したがって、「第１」および「第２」などの用語は、必ずしも優先順位、重要性の順序、または行為の順序を意味するものではない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内であることを意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、所与の値における慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差を超えることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容され得る誤差範囲を意味すると仮定されるべきである。
「増加した」、「増加」、または「増加する」という用語は、本明細書では、一般に、静的に有意な量の増加を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「増加した」または「増加する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベル、標準または対照と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または最大１００％（１００％を含む）の増加、または１０～１００％の間の任意の増加を意味する。「増加する」の他の例には、基準レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれを超える増加が含まれる。
「減少した」、「減少」、または「減少する」という用語は、本明細書では、一般に、統計的に有意な量の減少を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「減少した」または「減少する」とは、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％または最大１００％（１００％を含む）の減少（例えば、基準レベルと比較して存在しないレベルまたは検出不能なレベル）、または１０～１００％の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状の文脈において、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。「減少する」の他の例には、基準レベルと比較して、多くとも２分の１、多くとも５分の１、多くとも１０分の１、多くとも２０分の１、多くとも５０分の１、多くとも１００分の１、多くとも１０００分の１またはそれを超える減少が含まれる。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれを超えるものであり得、好ましくは、所与の疾患を有しない個体について正常範囲内として認められるレベルまで低下する。
本明細書で使用される場合、「細胞」は、一般に、生物学的細胞を指す。細胞は、生存生物の基本的な構造、機能および／または生物学的単位である。細胞は、１つまたはそれを超える細胞を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果実、野菜、穀粒、ダイズ、コーン、メイズ、コムギ、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、綿、アサ、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ（ｈｏｒｎｗｏｒｔ）、ゼニコケ（ｌｉｖｅｒｗｏｒｔ）、コケ類由来の細胞）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈなど）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）などが挙げられる。細胞は、天然の生物に由来しないときがある（例えば、細胞は、人工細胞と呼ばれることもある、合成的に作製されたものである）。細胞は、細胞株に由来し得る。
「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は、一般に、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞への核酸分子の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であり得る。いくつかの場合、核酸分子は非コード配列であり得る。いくつかの場合、トランスフェクション方法は、トランスジェニック動物を作製するために細胞への核酸分子の導入に利用される。そのような技術には、前核マイクロインジェクション、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞、例えば、卵丘細胞もしくは乳腺細胞、または成体、胎児もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、その後の核移植が含まれ得る。
「ナノエレクトロポレーション」または「ナノチャネルエレクトロポレーション」は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをナノチャネルにロードし、電界を発生させることによって少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞内に促進することによって、ベクターなどの少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることを指す。トランスフェクトされる細胞はナノチャネルの開口部に位置し、ここでナノエレクトロポレーションの電界が細胞膜に細孔を作り出して、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入されることを可能にする。
本明細書で使用される「プラスミド」は、一般に、非ウイルス発現ベクター、例えば遺伝子および／または遺伝子の発現に必要な調節エレメントをコードする核酸分子を指す。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、一般に、ペイロード核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指す。ペイロード核酸分子は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入され得る。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含むことができ、または宿主細胞遺伝子（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）への組み込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。ベクターの例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターを挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ウイルスベクター」は、一般に、別の核酸を細胞内に輸送することができるウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって担持される１つまたはそれを超える遺伝子によってコードされる１つまたはそれを超えるタンパク質の発現を指示することができる。ウイルスベクターの例としては、ガンマ－レトロウイルス、αレトロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の実施形態のいずれかのベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性または異種の制御配列を含むことができる。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般に、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体を含み得る。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰおよび７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指すことができる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰを挙げることができるが、これらに限定されない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一本鎖形態、二本鎖形態、または多鎖形態のいずれかの、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは細胞にとって外因性（例えば異種ポリヌクレオチド）である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは細胞にとって内因性である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは無細胞環境に存在し得る。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは遺伝子またはその断片である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える類似体（例えば、変更された骨格、糖または核酸塩基）を含む。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。類似体のいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ケウオシンおよびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される１つまたは複数の遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、非コードＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される。本明細書に記載されるヌクレオチドまたは核酸は、修飾された核酸、核酸類似体、修飾された糖、糖類似体、修飾された核酸結合、骨格リン酸修飾、またはそれらの組み合わせを含むように修飾することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。いくつかの場合、ポリペプチドは、コードするオープンリーディングフレームから翻訳されるか、またはその成熟形態にプロセシングされる完全長ポリペプチドを指す。いくつかの場合、ポリペプチドまたはペプチドは、タンパク質の分解断片またはプロセシング断片であり得、それでもなお特定のタンパク質に固有にまたは同定可能にマッピングされるものである。いくつかの場合、ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸の単一の線状ポリマー鎖であり得る。ポリペプチドは、例えば、炭水化物の添加、リン酸化などによって修飾することができる。本明細書で使用される場合、「断片」という用語または同等の用語は、タンパク質の全長未満を有し、必要に応じてタンパク質の機能を維持するタンパク質の部位を指すことができる。
「同一性パーセント」および「同一性％」は、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアラインメント中の同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は、配列番号ＹとＸ％同一である」とは、配列番号Ｙに対するアミノ酸配列の同一性％を指し、アミノ酸配列中の残基のＸ％が配列番号Ｙに開示されている配列の残基と同一であると精緻に表現される。一般に、そのような計算にはコンピュータプログラムが用いられる。配列の対を比較およびアラインメントする例示的なプログラムとしては、ＡＬＩＧＮ、ＦＡＳＴＡ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧが挙げられる。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合することができる抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体などを包含する。いくつかの場合、抗体の結合ドメインは、抗体の結合ドメインまたは非抗体結合ドメインを含む、抗原に特異的に結合する任意のドメインである。いくつかの場合、抗体結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体または腫瘍抗原に対する抗体などの腫瘍細胞に結合する。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、またはそれらの抗原結合断片、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であり得る。いくつかの場合、非抗体足場の結合ドメインは、リポカリン、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、「Ｔボディ（Ｔ－ｂｏｄｙ）」、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、アビマー、ノッチン、モノボディ、アフィニティークランプ、エクトドメイン、受容体エクトドメイン、受容体、サイトカイン、リガンド、免疫サイトカイン、セントリイン（ｃｅｎｔｒｙｉｎ）、Ｔ細胞受容体、または組換えＴ細胞受容体であり得る。いくつかの場合、抗体構築物の結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の抗原結合ドメインであり、軽鎖および重鎖を含む。いくつかの場合、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断などによって改変された抗体などの誘導体化抗体である。抗体は、脱フコシル化または脱グリコシル化などによって改変することもできる。
「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。いくつかの場合、抗体の実質的に均一な集団から得られる個々のモノクローナル抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異を除いて同一である。いくつかの場合、腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体は、腫瘍抗原抗体の軽鎖および腫瘍抗原抗体の重鎖を含む。いくつかの場合、モノクローナル抗体は、免疫細胞（免疫細胞抗原）の表面上の抗原に結合し、抗免疫細胞抗原抗体の軽鎖および抗免疫細胞抗原抗体の重鎖を含む。いくつかの場合、モノクローナル抗体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ抗原）の表面上に存在する抗原に特異的に結合し、ＡＰＣ抗原に結合する抗ＡＰＣ抗原抗体の軽鎖および抗ＡＰＣ抗原抗体の重鎖を含む。
本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。パパインで抗体を消化すると、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名される残留「Ｆｃ」断片とが生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたはそれを超える可変領域および定常領域を有するすべての抗体を含む。いくつかの場合、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（「完全ヒト抗体」と呼ばれる）。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体など、組換え方法によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有し得る。いくつかの場合、組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異に供されている。したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部がその初期形態から変化して、それをよりヒト免疫グロブリンに類似させた抗体である。いくつかのバージョンでは、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖定常（Ｃ）領域がヒト配列で置き換えられている。これは、可変（Ｖ）領域および異種免疫グロブリンＣ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。いくつかのバージョンでは、相補性決定領域（ＣＤＲ）は非ヒト抗体配列を含むが、Ｖフレームワーク領域もヒト配列に変換されている。いくつかのバージョンでは、Ｖ領域は、ヒトおよびマウスＶ領域のコンセンサス配列を設計し、コンセンサス配列間で異なるＣＤＲ外の残基を変換することによってヒト化される。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、対象の体外で起こる事象を説明するために使用される。「エクスビボ」アッセイは、対象に対して行うことができない。むしろ、それは対象とは別の試料に対して行われる。エクスビボは、対象の体外のインタクトな細胞において生じる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、実験試薬を保持するための容器に収容され、その材料が得られる生物学的供給源生物から分離されて起こる事象を説明するために使用される。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が使用される細胞ベースのアッセイを包含し得る。インビトロアッセイはまた、インタクトな細胞が使用されない無細胞アッセイを包含し得る。
本明細書で使用される場合、「微小環境」は、本明細書に記載される細胞外小胞によって標的化される細胞が位置する細胞外環境を指す。いくつかの場合、微小環境は、プロテアーゼならびに他の可溶性タンパク質および因子が位置する細胞外空間を有し得る。微小環境は、例えば、血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含み得る。
「処置する」または「処置」とは、治療的処置および防止的または予防的手段の両方を指すことができ、この目的は、標的化される病理学的状態または障害を防止または減速（軽減）することである。処置を必要とする者には、既に障害を有する者、ならびに障害を有する傾向がある者、または障害を防止すべき者が含まれる。治療上の利益は、処置されている障害の根絶または処置されている障害の症状の改善を指すことができる。また、治療上の利益は、対象が依然として根底にある障害に罹患する可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、根底にある障害に関連する１つまたはそれを超える生理学的症状の根絶または改善によって達成され得る。予防的効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させる、防止する、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発症を遅延させる、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を減速させる、停止させる、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。予防的利益のために、特定の疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の１つまたはそれを超えるものを報告する対象は、疾患の診断がなされていなくても、処置を受けることができる。
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一般に、医薬組成物、例えば、本明細書に記載される組成物を含む医薬組成物の量であって、医薬組成物を必要とする対象への投与時に所望の活性をもたらすのに十分な量を指す。本開示の文脈内で、「治療上有効」という用語は、本開示の方法によって処置される障害の少なくとも１つの症状の発現を遅延させ、進行を停止させ、軽減または緩和するのに十分な医薬組成物の量を指す。
「薬学的に許容され得る担体」、「薬学的に許容され得る賦形剤」、「生理学的に許容され得る担体」または「生理学的に許容され得る賦形剤」という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容され得る材料、組成物、またはビヒクルを指す。成分は、医薬製剤の他の成分と適合性であるという意味で「薬学的に許容され得る」。それはまた、合理的な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の組織または器官と接触して使用するのに適し得る。
「医薬組成物」という用語は、希釈剤または担体などの他の化学成分を含む本明細書に開示される組成物を指す。医薬組成物は、対象への投与を容易にすることができる。経口、注射、エアロゾル、非経口、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が当該技術分野に存在する。
「患者」または「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、哺乳動物を包含する。哺乳動物の非限定的な例としては、哺乳動物クラスの任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物；ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜；ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物が挙げられる。
概要
本開示は、抗体と複合体化することができる少なくとも１つのアダプターポリペプチド（例えば、Ｆｃ受容体、ＣＤ６４）を発現する細胞外小胞の設計および産生に関する。抗体は、抗体によって認識および結合され得る細胞表面マーカー（例えば、抗体に対する抗原）を発現する細胞に細胞外小胞を誘導および標的化することができる。細胞表面マーカーを発現する細胞は、罹患細胞であり得る。いくつかの場合、細胞表面マーカーを発現する細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、非がん性病変細胞、損傷組織の一部としての細胞、健康な組織の一部としての細胞、または免疫細胞である。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、標的化された細胞における細胞外小胞の標的化および蓄積を増強するための更なる標的化ドメインを含むようにさらに操作することができる。この標的化ドメインは、アダプターポリペプチドに複合体化された抗体によって標的化されたものと同じ標的化された細胞によって発現される同じまたは異なる細胞表面マーカーに結合することができる。細胞外小胞は、アダプターポリペプチドを、異なる細胞によって発現される異なる細胞表面マーカーを標的とする別の抗体と複合体化することによって、異なる細胞（例えば、異なる細胞型、罹患細胞）または異なる細胞マーカーを標的とするように構成することができる。細胞外小胞は、標的化された細胞に送達される治療薬などのペイロードを運ぶように設計することができる。細胞外小胞によって送達される治療薬には、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物もしくはがん薬物、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
本開示はまた、少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含み、治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用メッセンジャーＲＮＡ）などの大量かつ高品質の治療薬を含む細胞外小胞を産生する方法を提供する。本明細書に記載されるいくつかのアプローチは、ナノエレクトロポレーションによって少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞内にトランスフェクトすることを含み、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアダプターポリペプチドおよび／または少なくとも１つの治療薬に転写および／または翻訳される。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、抗体のＦｃ領域と複合体化することができるＦｃ受容体またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、ナノエレクトロポレーションによって刺激されて、大量の治療薬（例えば、治療用ｍＲＮＡ）を含む多数の細胞外小胞を産生および分泌する。分泌された細胞外小胞は、Ｆｃ領域を含む任意の抗体と複合体化することができ、複合体化された抗体は、複合体化された抗体によって認識および結合され得る第１の細胞表面マーカーを発現する標的化された細胞に細胞外小胞を標的化および誘導する。少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、同じ標的化された細胞によって発現される第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含むことができる。したがって、二重標的化ドメイン（例えば、抗体および標的化ドメイン）を含む細胞外小胞の標的化された細胞における蓄積は、抗体、標的化ドメイン、またはそれらの組み合わせによる標的化を伴わない細胞外小胞の蓄積と比較して増加し得る。
細胞外小胞
細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。細胞外小胞を産生する方法も本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体と、少なくとも１つの治療薬とを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、細胞表面タンパク質のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３表面タンパク質と少なくとも７０％同一のペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、別の細胞表面タンパク質と少なくとも７０％同一のペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、ＲＯＲ１、ＰＤ－Ｌ１、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＩＩＩ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ１、ＧＰＣ３、ＤＬＬ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＬＡＳＴおよびＣＤ１３８の群から選択される細胞表面タンパク質と少なくとも７０％同一のペプチドを含む。
いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、抗体のＦｃ領域を認識および結合するＦｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体、またはその断片のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一のペプチド配列を含む。ある特定の場合、細胞外小胞表面タンパク質はＦｃ受容体である。Ｆｃ受容体には、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体、またはＦｃ－ε受容体が含まれる。例示的なＦｃ受容体としては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ１（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ２（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ１（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ２（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ３（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ４（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ５（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα／μＲ、ＦｃＲｎ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはｐｌｇＲが挙げられる。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載されるＦｃ受容体のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のＦｃ受容体のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも２つのアダプターポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも２つのアダプターポリペプチドのうちの１つは、Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体、またはその断片のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも２つのアダプターポリペプチドのうちの１つは、ＣＤ４７またはその断片のペプチド配列を含む。いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、第１および第２のアダプターポリペプチドを含み、第１のアダプターポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体またはその断片のペプチド配列を含み、第２のアダプターポリペプチドは、ＣＤ４７またはその断片のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体またはその断片を含むペプチド配列を含むアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、標的化された細胞によって発現される第１の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、細胞外ドメインに結合し、標的化ドメインは、第１の細胞表面マーカーを発現する同じ標的化された細胞によって発現される第２の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、細胞外ドメインに結合した標的化ドメインは、同じ標的化された細胞によって発現される第２の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、標的化された細胞は、健康な組織の一部としての細胞または免疫細胞である。場合によっては、標的化された細胞は罹患細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、非がん性病変細胞、または損傷組織の一部としての細胞である。いくつかの場合、標的化された細胞によって発現される第１および第２の細胞表面マーカーは同一である。いくつかの場合、標的化された細胞によって発現される第１および第２の細胞表面マーカーは異なる。
場合によっては、抗体および標的化ドメインの両方が、標的化された細胞によって発現される第１および第２の細胞表面マーカーにそれぞれ結合する。ある特定の場合、抗体および標的化ドメインは、第１および第２の細胞表面マーカーに同時に結合する。ある特定の場合、抗体および標的化ドメインは、第１および第２の細胞表面マーカーに逐次的に結合する。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放され（すなわち、もはや第１の細胞表面マーカーに結合していない）、一方、標的化ドメインは、第２の細胞表面マーカーに結合したままである。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの場合、エキソソームは、Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体またはその断片のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドを含む。Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体またはその断片を含むアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか１つのＦｃ領域と複合体化することができる。いくつかの場合、アダプターペプチドは、標的化ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）、組織ホーミングペプチド、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの場合、標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドまたは腫瘍ホーミングペプチドである。いくつかの場合、標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）である。いくつかの場合、標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドである。
いくつかの場合、第１の細胞表面マーカーは、本明細書に記載される抗体によって認識および結合され得る本明細書に記載される細胞表面マーカー（例えば、抗原またはその断片）のいずれか１つであり得る。いくつかの場合、第２の細胞表面マーカーは、標的化ドメインによって認識および結合され得、第１の細胞表面マーカーと同じであっても異なっていてもよい。いくつかの場合、第２の細胞表面マーカーは、細胞の表面上に発現される任意の高分子またはタンパク質であり得る。いくつかの場合、第２の細胞表面マーカーは、特定の組織の細胞によって発現される。いくつかの場合、第２の細胞表面マーカーは、がん性細胞または非がん性病変細胞によって発現される。第２の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、血管受容体、フィブロネクチン受容体、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＥＳＡ、ＳＳＥＡ１、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ２６、ＣＤ１６６、またはＣＤ９０が挙げられる。
場合によっては、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞の蓄積よりも高い。場合によっては、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれよりも高い。ある特定の場合、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積よりも高い。場合によっては、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第１および第２の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれよりも高い。
アダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される抗体の抗体断片または結合ドメインのいずれか１つを含む。いくつかの場合、抗体はＦｃ領域に融合され、Ｆｃ領域はアダプターポリペプチドによって認識される。場合によっては、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを含む。いくつかの場合、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧを含む。場合によっては、Ｆｃ領域はＩｇＧを含む。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。場合によっては、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む。いくつかの場合、本明細書に記載される抗体は、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドと複合体化されるＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含むＦｃ領域を含む。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドの抗体のＦｃ領域への非共有結合的な複合体化を介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含む。場合によっては、アダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合した少なくとも１つの標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも１つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの場合、組織標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドである。
場合によっては、少なくとも１つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、この腫瘍ホーミングペプチドは、がん性細胞を標的とする。場合によっては、少なくとも１つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、この腫瘍ホーミングペプチドは、腫瘍（スフェロイド腫瘍など）の一部として細胞を標的とする。場合によっては、少なくとも１つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、ここで、腫瘍ホーミングペプチドは、非がん性病変細胞を標的とする。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５またはそれを超える標的化ドメインを含む。場合によっては、少なくとも２つの標的化ドメインは同一であり得る。いくつかの場合、少なくとも２つの標的化ドメインは異なり得る。標的化ドメインは、アダプターポリペプチドのＮ末端に複合体化され得る。代替案として、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドのＣ末端に複合体化され得る。場合によっては、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドに組み込まれ得る。いくつかの場合、標的化ドメインは、ペプチドリンカーを介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、リンカーペプチドは、５個～２００個のアミノ酸を含む。他の場合において、リンカーペプチドは、５個～２５個のアミノ酸を含む。場合によっては、リンカーペプチドは、剛性（例えば、（ＥＡＡＡＫ）１～３、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、または（ＡＰ）１０～３４）、可撓性（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１～４もしくは（Ｇｌｙ）６～８）、または切断可能（例えば、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲ↓ＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧ↓ＬＷＡ、ＲＶＬ↓ＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣ↓ＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲ↓ＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲ↓ＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲ↓ＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲ↓Ｒ↓Ｒ、もしくはＧＦＬＧ↓）であり得る。いくつかの場合、リンカーペプチドは、ＤＹＫＤＤＤＤＫのペプチド配列を含むＦＬＡＧリンカーである。ある特定の場合、ＦＬＡＧリンカーは、ＹＫＤＨＤ－Ｇ－ＤＹＫＤＨＤ－Ｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫのペプチド配列を含む３×ＦＬＡＧリンカーであり得る。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも１つの腫瘍ホーミングペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５またはそれを超える腫瘍ホーミングペプチドを含む。場合によっては、少なくとも２つの腫瘍ホーミングペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも２つの腫瘍ホーミングペプチドは異なる。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、腫瘍ホーミングペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を含む。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはＣＤＸ（ＦＫＥＳＷＲＥＡＲＧＴＲＩＥＲＧ）ペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはＣＫＡＡＫＮペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはＡＲＲＰＫＬＤペプチドである。他の例示的な腫瘍ホーミングペプチドとしては、肺がん（ＳＶＳＶＧＭＫＰＳＰＲＰ、ＰＲＰＳＰＫＭＧＶＳＶＳ、ＴＤＳＩＬＲＳＹＤＷＴＹ、ＣＳＮＩＤＡＲＡＣ、およびＡＲＲＰＫＬＤを含む）、胃がん（ＣＧＮＳＮＰＫＳＣ、ＧＲＲＴＲＳＲＲＬＲＲＳ、ＣＴＫＮＳＹＬＭＣ、およびＡＡＤＮＡＫＴＫＳＦＰＶを含む）、膵臓がん（ＣＲＧＲＲＳＴ、ＣＲＳＲＫＧ、およびＣＫＡＡＫＮを含む）、前立腺がん（ＦＲＰＮＲＡＱＤＹＮＴＮ、ＩＡＧＬＡＴＰＧＷＳＨＷＬＡＬ、ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ、およびＣＡＧＲＲＳＡＹＣを含む）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＣＳＲＰＲＲＳＥＣ、ＣＧＫＲＫ、およびＣＤＴＲＬを含む）、黒色腫（ＴＡＡＳＧＶＲＳＭＨ、ＬＴＬＲＷＶＧＬＭＳ、ＣＶＮＨＰＡＦＡＣ、およびＣＬＳＤＧＫＲＫＣを含む）、肝細胞癌（ＫＳＬＳＲＨＤＨＩＨＨＨ、およびＳＦＳＩＩＨＴＰＩＬＰＬを含む）、結腸がん（ＣＰＨＳＫＰＣＬＣ、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ、ＣＴＰＳＰＦＳＨＣ、およびＶＨＬＧＹＡＴを含む）、膀胱がん（ＣＳＮＲＤＡＲＲＣおよびＣＱＤＧＲＭＧＦＣを含む）、乳がん（ＣＲＥＫＡを含む）、神経膠腫（ＬＷＡＴＦＰＰＲＰＰＷＬおよびＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴを含む）、卵巣がん（ＣＤＧＬＧＤＤＣ、ＣＤＧＷＧＰＮＣ、およびＲＬＬＤＴＮＲＰＬＬＰＹを含む）、ならびに頭頸部がん（ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬおよびＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫＹを含む）を標的とするものを挙げることができる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも１つの組織標的化ドメインを含み、これは、アダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を特定の組織に標的化および誘導する。いくつかの場合、組織標的化ドメインは、組織ホーミングドメインである。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５またはそれを超える組織標的化ペプチドを含む。場合によっては、少なくとも２つの組織標的化ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも２つの組織標的化ペプチドは異なる。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、組織標的化ペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を含む。内皮組織または心臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＳＩＧＹＰＬＰ、ＬＳＩＰＰＫＡ、ＦＱＴＰＰＱＬ、ＬＴＰＡＴＡＩ、ＣＮＩＷＧＶＶＬＳＷＩＧＶＦＰＥＣ、ＮＴＴＴＨ、ＶＨＰＫＱＨＲ（四量体）、ＣＲＫＲＬＤＲＮＣＣＲＴＬＴＶＲＫＣ、ＣＬＷＴＶＧＧＧＣ、ＱＰＷＬＥＱＡＹＹＳＴＦ、ＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ、ＳＡＨＧＴＳＴＧＶＰＷＰ、ＶＰＷＭＥＰＡＹＱＲＦＬ、ＴＬＰＷＬＥＥＳＹＷＲＰ、ＨＷＲＲ、ＣＳＴＳＭＬＫＡＣ、ＤＤＴＲＨＷＧ、ＣＡＲＰＡＲ、ＣＫＲＡＶＲ、ＣＲＳＴＲＡＮＰＣ、ＣＰＫＴＲＲＶＰＣ、ＣＳＧＭＡＲＴＫＣ、またはＣＲＰＰＲが挙げられる。膵臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＣＲＶＡＳＶＬＰＣ、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ、ＬＳＧＴＰＥＲＳＧＱＡＶＫＶＫＬＫＡＩＰ、ＣＨＶＬＷＳＴＲＣＣＶＳＮＰＲＷＫＣ、またはＬＳＡＬＰＲＴが挙げられる。腎臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＣＬＰＶＡＳＣ、ＥＬＲＧＤ（Ｒ／Ｍ）ＡＸ（Ｗ／Ｌ）、ＧＶ（Ｋ／Ｒ）ＧＸ３（Ｔ／Ｓ）ＲＤＸＲ、ＨＩＴＳＬＬＳＨＴＴＨＲＥＰまたはＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲが挙げられる。肺組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＣＧＦＥＬＥＴＣＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ、ＱＰＦＭＱＣＬＣＬＩＹＤＡＳＣＲＮＶＰＰＩＦＮＤＶＹＷＩＡＦ、ＶＮＴＡＮＳＴ、ＣＴＳＧＴＨＰＲＣ、またはＳＧＥＷＶＩＫＥＡＲＧＷＫＨＷ－ＶＦＹＳＣＣＰＴＴＰＹＬＤＩＴＹＨが挙げられる。腸組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＹＳＧＫＷＧＷ、ＬＥＴＴＣＡＳＬＣＹＰＳＹＱＣＳＹＴＭＰＨＰＰＶＶＰＰＨＰＭＴＹＳＣＱＹ、ＹＰＲＬＬＴＰ、ＣＳＱＳＨＰＲＨＣ、ＣＳＫＳＳＤＹＱＣ、ＣＫＳＴＨＰＬＳＣ、ＣＴＧＫＳＣＬＲＶＧ、ＳＦＫＰＳＧＬＰＡＱＳＬ、またはＣＴＡＮＳＳＡＱＣが挙げられる。脳組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ、ＧＨＫＡＫＧＰＲＫ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ、ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲＣ、ＣＡＧＡＬＣＹ、ＣＬＥＶＳＲＫＮＣ、ＲＰＲＴＲＬＨＴＨＲＮＲ（Ｄ－ａａ）、ＡＣＴＴＰＨＡＷＬＣＧ、ＧＬＡＨＳＦＳＤＦＡＲＤＦＶ、ＧＹＲＰＶＨＮＩＲＧＨＷＡＰＧ、ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ、ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ、ＣＴＳＴＳＡＰＹＣ、ＣＳＹＴＳＳＴＭＣ、ＣＭＰＲＬＲＧＣ、ＴＰＳＹＤＴＹＡＡＥＬＲ、ＲＬＳＳＶＤＳＤＬＳＧＣ、ＣＡＱＫ、またはＳＧＶＹＫＶＡＹＤＷＱＨを挙げることができる。様々な組織を標的とする更なる例示的な組織標的化ドメインとしては、ＬＭＬＰＲＡＤ（副腎を標的とする）、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（網膜を標的とする）、ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（網膜を標的とする）、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（皮膚皮下脈管構造を標的とする）、ＧＬＳＧＧＲＳ（子宮を標的とする）、ＷＹＲＧＲＬ（軟骨を標的とする）、ＣＰＧＰＥＧＡＧＣ（乳房脈管構造を標的とする）、ＳＭＳＩＡＲＬＶＳＦＬＥＹＲ（前立腺を標的とする）、ＧＰＥＤＴＳＲＡＰＥＮＱＱＫＴＧＣ（皮膚ランゲルハンスを標的とする）、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣ（白色脂肪脈管構造を標的とする）、ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（創傷または損傷組織を標的とする）、ＣＨＡＱＧＳＡＥＣ（胸腺を標的とする）、ＬＥＰＲＷＧＦＧＷＷＬＫＬＳＴＨＴＴＥＳＲＳＭＶ（耳もしくは蝸牛組織を標的とする）、ＡＣＳＴＥＡＬＲＨＣＧＧＧＳ（網膜血管を標的とする）またはＡＳＳＬＮＩＡ（筋肉組織を標的とする）が挙げられる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５またはそれを超える細胞透過性ペプチドを含む。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドを含むアダプターポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。場合によっては、少なくとも２つの細胞透過性ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも２つの細胞透過性ペプチドは異なる。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、細胞透過性ペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、ＤＳＬＫＳＹＷＹＬＱＫＦＳＷＲ、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ、ＫＳＫＴＥＹＹＮＡＷＡＶＷＥＲＮＡＰ、ＧＮＧＥＱＲＥＭＡＶＳＲＬＲＤＣＬＤＲＱＡ、ＨＴＰＧＮＳＮＫＷＫＨＬＱＥＮＫＫＧＲＰＲＲ、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ、Ｒ９ＧＰＬＧＬＡＧＥ８、Ａｃ－ＧＡＦＳＷＧＳＬＷＳＧＩＫＮＦＧＳＴＶＫＮＹＧ、ＲＬＲＷＲ、ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹ、ＩＬＧＫＬＬＳＴＡＡＧＬＬＳＮＬ、ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ、Ａｃ－ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＸ－Ｂｐｇ－Ｇ、Ａｃ－ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ、またはＭＶＲＲＦＬＶＴＬＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶが挙げられる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５またはそれを超えるウイルス膜タンパク質またはその断片を含む。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質を含むアダプターポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。場合によっては、少なくとも２つのウイルス膜タンパク質は同一である。いくつかの場合、少なくとも２つのウイルス膜タンパク質は異なる。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質はアダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、ウイルス膜タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。ウイルス膜タンパク質の非限定的な例としては、赤血球凝集素、糖タンパク質４１、エンベロープタンパク質、ＶＳＶ Ｇ、ＨＳＶ０１ ｇＢ、エボラウイルス糖タンパク質、または融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質が含まれる。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つの治療薬を含む。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリペプチドである。場合によっては、治療薬は治療用化合物である。いくつかの場合、治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含むがん薬物である。場合によっては、細胞外小胞は複数の治療薬を含み、複数の治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は少なくとも１つの治療薬を含み、少なくとも１つの治療薬は細胞外小胞の細胞外表面に発現される。いくつかの場合、少なくとも１つの治療薬は、少なくとも１つの治療薬をアダプターポリペプチドに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される。場合によっては、少なくとも１つの治療薬は発現され、細胞外小胞の膜内に挿入される。いくつかの場合、少なくとも１つの治療薬は細胞外小胞内にある。
いくつかの場合、細胞外小胞は、任意の膜結合粒子であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、細胞によって分泌される任意の膜結合粒子であり得る。場合によっては、細胞外小胞は、インビトロで産生される任意の膜結合粒子であり得る。場合によっては、細胞外小胞は、細胞なしで産生される任意の膜結合粒子であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）、オンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）、エクソファー（ｅｘｏｐｈｅｒ）、エンベロープウイルス、エキソマー（ｅｘｏｍｅｒｅ）、または他の非常に大きな細胞外小胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームである。
いくつかの場合、細胞外小胞は、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍまたは約１０，０００ｎｍの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍまたは約５，０００ｎｍの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍまたは約１０，０００ｎｍの直径を有することができる。
抗体
抗体と複合体化された少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドと抗体のＦｃ領域との間の非共有結合的な複合体化を介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化すると、抗体は、細胞によって発現される細胞表面マーカーに結合することによって細胞外小胞を細胞に誘導する。いくつかの場合、抗体は、罹患細胞によって発現される細胞表面マーカーに結合することによって細胞外小胞を罹患細胞に誘導する。いくつかの場合、罹患細胞はがん細胞である。場合によっては、罹患細胞は非がん性病変細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は腫瘍細胞である。場合によっては、細胞表面マーカーは、がん細胞または非がん性病変細胞に関連する抗原である。本明細書に記載される抗体によって認識および結合され得るがん細胞または非がん性病変細胞に関連する例示的な細胞表面マーカーとしては、１－４０－β－アミロイド、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、５ＡＣ、５’－ヌクレオチダーゼ、５Ｔ４、活性化Ｆ９、Ｆ１０、アクチビン受容体様キナーゼ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、アミロイド、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、炭疽毒素、保護抗原、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ａｎｔｈｒａｘ）、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、βアミロイド、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ１ｓ、Ｃ２４２抗原、Ｃ５、ＣＡ－１２５、ＣＡ－１２５（模倣（ｉｍｉｔａｔｉｏｎ））、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチドα、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ ＩＬ３１、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、心筋ミオシン、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１９、ＣＤ１９、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ２７、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、別名ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３ε、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３１９、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４１（インテグリンα－ＩＩｂ）、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ９７Ｂ、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡ関連抗原、ＣＦＤ、ＣＧＲＰ、クローディン１８アイソフォーム２、ＣＬＤＮ１８．２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、クランピング因子Ａ、ｃ－Ｍｅｔ、凝固因子ＩＩＩ、補体Ｃ５ａ、ＭＣＳＦ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ－４、ＣＸＣＲ ４（ＣＤ１８４）、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、ダビガトラン、樹状細胞関連レクチン２、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ４、ＤＲ５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）志賀毒素１型、大腸菌志賀毒素２型、エボラウイルス糖タンパク質、ＥＧＦＬ７、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ細胞外ドメインＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ＥＧＲＦ、ＥＲＢＢ１ ＨＥＲ１、エンドグリン、エンドトキシン、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ３、エフリン受容体Ａ３、エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）、ＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、呼吸器多核体ウイルスのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＣＧＲＴ、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ２、フィブリンＩＩ、β鎖、フィブロネクチンエクストラドメイン－Ｂ、葉酸ヒドロラーゼ、葉酸受容体１、葉酸受容体α、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＧＣＧＲ、ＧＤ２ガングリオシド、ＧＤＦ－８、ゼラチナーゼＢ、グリピカン３、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ受容体α鎖、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３、成長分化因子８、ＧＵＣＹ２Ｃ、赤血球凝集素、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３、ＨＧＦ、ＨＧＦＲ、ＨＨＧＦＲ、ヒストン複合体、ＨＩＶ－１、ＨＬＡ－ＤＲ？、ＨＮＧＦ、Ｈｓｐ９０、ヒト散乱因子受容体キナーゼ（ｈｕｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ）、ヒトＴＮＦ、ヒトβアミロイド、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳＬ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＧＦ－１受容体（ＣＤ２２１）、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２２１、ＩＧＨＥ、ＩＬ １７Ａ、ＩＬ １７ＡおよびＩＬ １７Ｆ、ＩＬ ２０、ＩＬ ３受容体、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７ Ｆ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ－２２、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ－４、ＩＬ－４ Ｒα、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ６受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ９、ＩＬＧＦ２、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素、インテグリンα４β７、インテグリンα４、インテグリンα４β７、インテグリンα５β１、インテグリンαＩＩｂβ３、インテグリンαｖβ３、インテグリンβ７、インターフェロンγ、インターフェロン受容体、インターフェロンα／β受容体、インターフェロンγ誘導タンパク質、インターロイキン１α、インターロイキン１３、インターロイキン１７α、インターロイキン１７α、ＴＮＦ、インターロイキン１７Ａ、ＩＴＧＡ２（ＣＤ４９ｂ）、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、カリクレイン、ＫＩＲ２Ｄ、ＬＡＧ３、ルイスＹ抗原、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＬＩＮＧＯ－１、リポテイコ酸、ＬＩＶ－１、ＬＯＸＬ ２、ＬＲＲＣ１５、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、ＬＴＡ、ＬＹＰＤ３、ＭＡＳＰ－２、ＭＣＡＭ、ＭＣＰ－１、メソテリン、ＭＩＦ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＬＮ、ＭＳＴ１Ｒ（別名ＲＯＮ）、ムチンＣａｎＡｇ、粘膜アドレシン細胞接着分子、ミエリン関連糖タンパク質、ミオスタチン、ＮＡＣＰ、ＮＣＡ－９０（顆粒球抗原）、ネクチン－４、神経アポトーシス制御プロテイナーゼ１、ＮＧＦ、ＮＧＮＡガングリオシド、ＮＫＧ２Ａ、ＮＯＧＯ－Ａ、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＮＲＰ１、ＯＸ－４０、ｏｘＬＤＬ、ＰＣＤＣ１、ＰＣＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ－Ｌ１、リン酸－ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、血小板由来成長因子受容体β、前立腺癌細胞、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、緑膿菌ＩＩＩ型分泌系、ＰＴＫ ７、狂犬病ウイルスＧ糖タンパク質、ＲＡＮＫＬ、呼吸器多核体ウイルス、ＲＧＭＡ、ＲＨＤ、アカゲザル因子、板根（ｒｏｏｔ ｐｌａｔｅ）特異的スポンジン３、ＲＯＲ１、ＲＳＶ融合糖タンパク質、ＲＳＶＦＲ、ＲＴＮ４、スクレロスチン、ＳＤＣ１、セレクチンＰ、血清アミロイドＡタンパク質、血清アミロイドＰ成分、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＯＳＴ、スフィンゴシン－１－リン酸、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、黄色ブドウ球菌α毒素、黄色ブドウ球菌２成分ロイコシジン、ＳＴＥＡＰ１、ＴＡＧ－７２、タウタンパク質、Ｔ細胞受容体、ＴＥＭ１、テネイシンＣ、ＴＦＰＩ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー４、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＰ、ＴＲＯＰ－２、ＴＳＬＰ、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１の腫瘍特異的グリコシル化、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５）、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＡおよびＡｎｇ－２、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、ＶＳＩＲ、ＶＷＦまたはザイールエボラウイルス糖タンパク質が挙げられる。場合によっては、本明細書に記載される抗体によって認識および結合される細胞表面マーカーは、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、またはＲＯＲ１を含む。
場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される抗体の抗体断片または結合ドメインのいずれか１つを含む。いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される１つもしくはそれを超えるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体またはその断片に結合するペプチド配列を含むＦｃ領域を含む。Ｆｃ領域は抗体由来であり得る。抗体のＦｃ領域は、免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのクラスから選択することができる。いくつかの異なるクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのアイソタイプにさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応するＦｃの重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμであり得る。軽鎖は、カッパすなわちκおよびラムダすなわちλのいずれか１つであり得る。Ｆｃ領域は、抗体の種類に応じて、いくつかのＦｃドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。
免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭを含むＦｃ領域を含む任意の抗体を、Ｆｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体、またはその断片を含むアダプターポリペプチドと複合体化することができる。いくつかの場合、Ｆｃ領域はＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの場合、Ｆｃ領域はＩｇＧ２アイソタイプを有する。いくつかの場合、Ｆｃ領域はＩｇＧ３アイソタイプを有する。いくつかの場合、Ｆｃ領域はＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの場合、Ｆｃ領域は、２つまたはそれを超えるアイソタイプ由来の定常領域を含むハイブリッドアイソタイプを有する。アダプターポリペプチドと複合体化される抗体は、Ｆｃドメインを含む任意の抗体または抗原結合断片を含むことができる。本明細書に記載されるアダプターポリペプチドと複合体化される例示的な抗体は、セツキシマブ（クローンＣ２２５を含む）、アテゾリズマブ、抗ＰＤ－Ｌ１（クローンＳＰ１４２を含む）または抗ＲＯＲ１ ｍＡｂ（クローン２Ａ２を含む）を含む。
いくつかの場合、Ｆｃ領域は、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体またはその断片のいずれか１つを含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドに対するＫｄを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体またはその断片を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドに対するＫｄを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ１（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ２（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ１（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ２（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ３（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ４（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ５（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα／μＲ、ＦｃＲｎ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはｐｌｇＲを含む。いくつかの場合、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ１（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ２（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ１（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ２（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ３（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ４（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ５（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドに対するＫｄを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドに対するＫｄを有するペプチド配列を含む。
いくつかの例では、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、野生型Ｆｃ領域を含む対応する抗体と比較して少なくとも１つの定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を変更するように改変されたペプチド配列を有する。例えば、解離定数（Ｋｄ）の変化に対して決定されるように、Ｆｃ受容体への少なくとも１つのＦｃ媒介結合を減少または増加させるために、Ｆｃ領域をアミノ酸置換によって改変することができる。
いくつかの場合、本明細書に記載される抗体のいずれか１つは、改変されていないＦｃドメインを含む抗体と比較して、少なくとも１つのＦｃ領域に媒介される生物学的エフェクター機能を増加させるように改変されたＦｃ領域を含み得る。例えば、野生型Ｆｃ領域を含む対応する抗体よりも高い親和性で本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体のいずれか１つに結合する改変されたＦｃ領域を有する本明細書に記載される抗体。そのような改変されたＦｃ領域は、当業者に公知の方法に従って生成することができる。場合によっては、本明細書に記載されるＦｃ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるアミノ酸改変を有するペプチド配列を含む。
場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、野生型Ｆｃと、同じＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体との間の結合のＫｄと比較して、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体のいずれか１つに対する結合の減少したＫｄを示す。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、６．５～８．４のｐＨ範囲にわたって、野生型Ｆｃと、同じＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体との間の結合のＫｄと比較して、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体のいずれか１つに対する減少したＫｄを示す。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、酸性ｐＨまたは酸性微小環境において、Ｆｃ受容体を含むアダプターポリペプチドと複合体化するように構成される。
場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、野生型Ｆｃと、同じＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体との間の結合のＫｄと比較して、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体のいずれか１つに対する結合の増加したＫｄを示す。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、６．５～８．４のｐＨ範囲にわたって、野生型Ｆｃと、同じＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体との間の結合のＫｄと比較して、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体のいずれか１つに対する増加したＫｄを示す。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃ領域は、酸性ｐＨまたは酸性微小環境において、Ｆｃ受容体を含むアダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成される。
Ｆｃ結合
場合によっては、Ｆｃ結合ドメインまたはＦｃ受容体を含むアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか１つのＦｃ領域と複合体化することができる。いくつかの場合、Ｆｃ結合ドメインは、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体の断片である。例示的なＦｃ受容体としては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ１（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｂ２（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ１（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ２（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ３（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ４（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩｃ５（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα／μＲ、ＦｃＲｎ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはｐｌｇＲが挙げられる。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のＦｃ受容体のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、抗体のＦｃ領域に結合する細菌タンパク質を含むＦｃ結合ドメインを含む。いくつかの場合、Ｆｃ結合ドメインは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＺ、プロテインＬＧ、プロテインＬＡ、プロテインＡＧ、またはそれらの断片を含む。いくつかの場合、Ｆｃ結合ドメインは、ペプチドまたはペプチド模倣体を含む。例示的なＦｃ結合ペプチド配列またはペプチド模倣体としては、ＴＷＫＴＳＲＩＳＩＦ、ＦＧＲＬＶＳＳＩＲＹ、ＥＰＩＨＲＳＴＬＴＡＬＬ ＨＷＲＧＷＶ、ＨＹＦＫＦＤ、ＨＦＲＲＨＬ、ＨＷＣｉｔＧＷＶ、Ｄ２ＡＡＧ、ＤＡＡＧ、シクロ［（Ｎα－Ａｃ）－Ｄａｐ（Ａ）－ＲＷＨＹＦＫ－Ｌａｃｔ－Ｅ］、シクロ［（Ｎα－Ａｃ）－Ｄａｐ（Ａ）－ＲＷＨＹＦＫ－Ｌａｃｔ－Ｅ］、シクロ［Ｌｉｎｋ－Ｍ－ＷＦＲＨＹＫ］、ＮＫＦＲＧＫＹＫ、ＮＡＲＫＦＹＫＧ、ＦＹＷＨＣＬＤＥ（１）、ＦＹＣＨＷＡＬＥ（２）、ＦＹＣＨＴＩＤＥ、ＲＲＧＷ、ＫＨＲＦＮＫＤ、ＡＰＡＲ、ＰＡＭ、Ｆｃ－ｌｌｌ、ＦｃＢＰ－１、ＦｃＢＰ－２、Ｆｃ－ＩＩＩ－４Ｃ、ＦｃＲＭが挙げられる。
治療用カーゴ
いくつかの場合、少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞が本明細書に記載される。場合によっては、少なくとも１つの治療薬は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞内にトランスフェクトされた少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクター（例えば、プラスミド）によってコードされる治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドによって標的化および結合された細胞によって治療用ポリペプチドに翻訳され得る核酸配列を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも１、２、５、１０、５０、１００、５００、１，０００、またはそれを超えるコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドを含み、少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドは異なる。いくつかの場合、細胞外小胞によって封入された少なくとも２つの異なる治療用ポリヌクレオチドは、異なる比を含む。例えば、２つの異なる治療用ポリヌクレオチドの第１と第２との比は、１：１，０００、１：５００、１：１００、１：５０、１：１０、１：５、１：４、１：３、１：２、または１：１であり得る。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＳＲＰ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含む。いくつかの場合、ｍＲＮＡはインタクトであり、すなわちタンパク質の全長をコードする。いくつかの場合、ｍＲＮＡはタンパク質の一部をコードする。いくつかの場合、ｍＲＮＡは、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、５，０００、またはそれを超えるＲＮＡヌクレオチドを含む。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードするベクター（例えば、プラスミド）などのＤＮＡを含む。
場合によっては、細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用ポリヌクレオチドの少なくとも１、２、３、５、１０、１００、またはそれを超えるコピーである。場合によっては、細胞外小胞に封入されたＲＮＡを含む治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用ポリヌクレオチドの少なくとも１、２、３、５、１０、１００、またはそれを超えるコピーである。場合によっては、細胞外小胞に封入された治療用メッセンジャーＲＮＡを含む治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用メッセンジャーＲＮＡの少なくとも１、２、３、５、１０、１００、またはそれを超えるコピーである。
場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬）のコピー数は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬）のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する（すなわち、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクトする）ことによって細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。
場合によっては、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞内に封入された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬）は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞内に封入された治療用ポリヌクレオチドと比較してよりインタクトである。例えば、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたより多くのコピーの治療用ＲＮＡは、標的化された細胞によって治療用ポリヌクレオチド内に翻訳され得るインタクトなまたは完全長メッセンジャーＲＮＡである。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなＲＮＡ治療薬のコピー数は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなＲＮＡ治療薬のコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなＲＮＡ治療薬のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する（すなわち、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクトする）ことから産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなＲＮＡ治療薬のコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。
場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用ポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも１つの治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクター（例えば、プラスミド）によってコードされる。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって翻訳されて、少なくとも１つの治療用ポリペプチドを得ることができる。いくつかの場合、治療用ポリペプチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドに結合している。いくつかの場合、治療用ポリペプチドは細胞外小胞の膜に挿入される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドによってコードされる治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞によって封入され得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、ナノエレクトロポレーションされたベクター（例えば、プラスミド）によってコードされる治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドの両方を封入することができる。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームであり得る。
場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用化合物を含むことができる。いくつかの場合、少なくとも１つの治療用化合物は、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドのいずれか１つによって複合体化または固定される。いくつかの場合、少なくとも１つの治療用化合物は細胞外小胞内にある。例示的な治療用化合物としては、がん薬物が挙げられる。
細胞外小胞による処置
本明細書に記載される細胞外小胞を含む治療有効量の組成物または医薬組成物を投与することによって対象の疾患を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと、本明細書に記載される少なくとも１つの治療薬とを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか１つのＦｃ領域と複合体化されるＦｃ受容体を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドはさらに、腫瘍ホーミングペプチド、組織ホーミングペプチド、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片を含む標的化ドメインを含む。場合によっては、抗体および標的化ドメインはそれぞれ、罹患細胞に関連する第１および第２の細胞表面マーカーに結合し、罹患細胞に結合すると、細胞外小胞は少なくとも１つの治療薬を罹患細胞に送達する。いくつかの場合、罹患細胞はがん細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は非がん性病変細胞である。場合によっては、罹患細胞は腫瘍細胞である。場合によっては、少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みは、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みは、アダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて増加する。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の取り込みが増加した標的化された細胞は、がん性細胞、非がん性病変細胞、腫瘍の一部としての細胞、または組織の一部としての細胞である。
いくつかの場合、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるようなアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて疾患を処置する方法である。いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞で腫瘍を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、腫瘍を処置する方法は、細胞外小胞を介して、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを腫瘍細胞に送達することを含む。本明細書に記載される方法で処置され得る腫瘍細胞の非限定的な例としては、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、肝臓がん、乳がんまたは脳がんの細胞が挙げられる。いくつかの場合、細胞外小胞によって標的化されるがん細胞は、がん幹細胞などのがん細胞集団内の亜集団を表す。
いくつかの場合、疾患の処置を必要とする対象に、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を投与することによって疾患を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、毎日（ｄａｉｌｙ）、毎日（ｅｖｅｒｙ ｄａｙ）、１日おき、週に５日、週に１回、隔週、月に２週間、月に３週間、月に１回、月に２回、月に３回、またはそれよりも多く投与される。アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２年、３年、またはそれより長い期間にわたって投与することができる。
対象の状態が改善する場合、投与されるアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の用量は、一定期間（すなわち、「休薬日」）、一時的に減少させるか、または一時的に中断することができる。場合によっては、休薬期間の長さは、２日間～１年間の間で変動し、例としてのみ、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、１５日間、２０日間、２８日間、３５日間、５０日間、７０日間、１００日間、１２０日間、１５０日間、１８０日間、２００日間、２５０日間、２８０日間、３００日間、３２０日間、３５０日間、または３６５日間が挙げられる。休薬期間中の用量減少は、例としてのみ、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含めて、１０％～１００％であり得る。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む有効量の細胞外小胞を必要とする対象に、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む有効量の細胞外小胞を、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、またはより長期間にわたって１回投与することができる。
対象の疾患または疾患に関連する状態の改善が起こったら、必要に応じて細胞外小胞の維持用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、症状の関数として、改善された疾患、障害または状態が維持されるレベルまで減少させることができる。
いくつかの場合、そのような量に対応するアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の量は、疾患の重症度、処置を必要とする対象または宿主の正体（例えば、重量）などの因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、例えば、投与される特定の細胞外小胞、投与経路、および処置される対象または宿主を含む事例を取り巻く特定の状況に従って当該技術分野で公知の方法で日常的に決定される。場合によっては、所望の用量は、好都合には、単回用量で、または同時に（または短期間にわたって）もしくは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４またはそれを超える部分用量として提示される。いくつかの場合、投与量は、対象におけるグレード３またはグレード４の有害事象の発生または重症度によって少なくとも部分的に決定することができる。
個々の処置レジメンに関する変数の数は多く、これらの推奨値からかなり逸脱することも珍しくないため、上記の範囲は単なる示唆的なものに過ぎない。そのような投与量は、使用される化合物の活性、処置される疾患または状態、投与様式、個々の対象の要件、処置される疾患または状態の重症度、および実施者の判断に限定されないいくつかの変数に応じて変更される。
いくつかの場合、そのような処置レジメンの毒性および治療有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定される。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投与量を製剤化する際に使用される。そのような化合物の投与量は、最小の毒性でＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
細胞外小胞の産生
いくつかの場合、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を産生するための方法およびシステムが本明細書に記載される。いくつかの場合、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドおよび少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生するための方法およびシステムも本明細書に記載される。
いくつかの場合、本方法は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含む。いくつかの場合、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの場合、ベクターはプラスミドである。場合によっては、細胞内に導入された少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの標的化ドメインをコードする。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドをコードする。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする。
場合によっては、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドが同じ細胞内に導入され、第１の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアダプターポリペプチドをコードする第１のベクター（例えば、プラスミド）を含む。いくつかの場合、同じ細胞内に導入された第２の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする第２のベクター（例えば、プラスミド）を含む。第１および第２の異種ポリヌクレオチドは、同時にまたは逐次的に同じ細胞内に導入することができる。いくつかの場合、第１および第２の異種ポリヌクレオチドは、同じトランスフェクション方法によって同じ細胞内に導入することができる。いくつかの場合、第１および第２の異種ポリヌクレオチドは、異なるトランスフェクション方法によって同じ細胞内に導入することができる。
いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入することができる。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって本明細書に記載される細胞内に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、トランスフェクションの生物学的、化学的または物理的方法によって細胞内に移入することができる。
目的の異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための生物学的トランスフェクション方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含み得る。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を非ヒト哺乳動物細胞内に挿入するための最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、いくつかの場合、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来する。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶ）が挙げられる。場合によっては、レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ、ＭＭＬＶ、ＭｕＬＶ、もしくはＭＬＶ）またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノムに由来するベクターなどのガンマ－レトロウイルスベクターが挙げられる。場合によっては、レトロウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ゲノムに由来するものなどのレンチウイルスベクターも挙げられる。場合によっては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型を含む。場合によっては、ウイルスベクターは、２つまたはそれを超えるウイルスからのウイルス部分を含むキメラウイルスベクターである。更なる例では、ウイルスベクターは組換えウイルスベクターである。
異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのトランスフェクションの化学的方法としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系であって、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含むものを挙げることができる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化されたナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチドの送達など、核酸の最先端の標的化された送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）内への核酸の導入のために、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合している。脂質と会合した核酸は、いくつかの場合、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体化し、脂質を含有する溶液中に分散し、脂質と混合し、脂質と組み合わさり、脂質中に懸濁物として包含され、ミセルに包含されるかもしくはミセルと複合体化し、または他の方法で脂質と会合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、いくつかの場合、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造で存在する。あるいは、それらは単に溶液中に散在し、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する場合もある。脂質は、いくつかの場合、天然に存在する脂質または合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に適した脂質は、商業的供給元から入手される。例えば、いくつかの場合、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス在）から入手され、いくつかの場合、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ニューヨーク州プレインビュー在）から入手され、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、いくつかの場合、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇ社から入手され、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、多くの場合、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．社（アラバマ州バーミンガム）から入手される。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、多くの場合、約－２０℃で保存される。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、多くの場合、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とする。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再編成（ｓｅｌｆ－ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質とを捕捉する（Ｇｈｏｓｈら、１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、いくつかの場合、ミセル構造をとるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－核酸複合体も企図される。
異種ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのトランスフェクションの物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理または化学的浸透を挙げることができる。エレクトロポレーションとしては、マイクロフルイディクスエレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションが挙げられる。ある特定の場合、細胞外小胞細胞は、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのベクター（例えば、プラスミド）は、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の表面に結合させることができる。いくつかの場合、基材はバイオチップを含む。いくつかの場合、基材の表面は金属材料を含む。いくつかの場合、基材は金属材料を含む。金属材料の非限定的な例としては、アルミニウム（Ａｌ）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ、Ｉｎ２Ｏ３：ＳｎＯ２）、クロム（Ｃｒ）、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）、金（Ａｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、有機残留物およびフォトレジスト、白金（Ｐｔ）、ケイ素（Ｓｉ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）タンタル（Ｔａ）、チタン（Ｔｉ）、窒化チタン（ＴｉＮ）、タングステン（Ｗ）が挙げられる。いくつかの場合、金属材料を処理またはエッチングしてアレイまたはチャネルを作製することができる。いくつかの場合、金属表面は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、酢酸、硝酸（ＨＮＯ３）、水（Ｈ２Ｏ）、塩酸（ＨＣｌ）、（ＨＮＯ３）、硝酸セリウムアンモニウム（（ＮＨ４）２Ｃｅ（ＮＯ３）６、クエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、王水、ヨウ素溶液、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、フッ化水素酸（ＨＦ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、エチレンジアミンピロカテコール（ＥＤＰ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、緩衝酸化物、フッ化アンモニウム（ＮＨ４Ｆ）、ＳＣ１、Ｃｌ２、ＣＣｌ４、ＳｉＣｌ４、ＢＣｌ３、ＳｉＣｌ４、ＢＣｌ３、ＣＣｌ２Ｆ２、ＣＦ４、Ｏ２、ＣＦ４、ＳＦ６、ＮＦ３、ＣＨＦ３、またはそれらの組み合わせで処理またはエッチングすることができる。
いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ＡＢＳ、ポリアミド、ポリエチレンコポリマー、エポキシ、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、フェノール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンコポリマー、フッ素化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、シリコーン、天然ゴム、ラテックス、ポリウレタン、スチレンブタジエンゴム、フルオロカーボンコポリマーエラストマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアリールエーテルケトン、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、ＰＢＴ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリテトラフルオロエチレン、酸化ベリリウムなどのポリマー製の基質の表面に結合させることができる。いくつかの場合、ポリマー製の表面は、少なくとも１つの細孔を有する半透性であり得る。場合によっては、半透性ポリマー表面の細孔径は、約０．０１μｍ～約１０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、または約５μｍ～約１０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、または約１０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、少なくとも約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、または約５μｍの間であり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、最大で約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、または約１０μｍの間であり得る。
いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ナノエレクトロポレーション
いくつかの場合、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって任意の細胞をエレクトロポレーションして、細胞外小胞ドナー細胞になり、本明細書に記載される細胞外小胞を産生することができる。細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の基底レベル分泌よりも高いレベルで細胞外小胞を産生および分泌するように遺伝子改変または操作され得る任意の細胞であり得る。したがって、細胞外小胞の分泌の基底レベルが低いかまたは無視できる程度である細胞は、本明細書に記載される細胞外小胞を産生および分泌するために、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトすることもできる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は自己細胞であり得る。そのような場合、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される細胞外小胞も受けている、例えば投与されている対象から得られる。いくつかの場合、ドナー細胞は遺伝子改変されている（例えば、ＥＶ表面上の標的化ポリペプチドおよび／またはＥＶ中の治療用ＲＮＡで遺伝子改変されている）。
いくつかの場合、細胞外ドナー細胞（ｃａｌｌ）から産生および分泌された細胞外小胞は、Ｔ細胞による炎症促進性同種免疫応答を誘導することができ、したがって、細胞外小胞を治療薬として使用することに対する課題を提起する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は同種異系細胞であり得、細胞外小胞ドナー細胞は、同じ種であるが、本明細書に記載される細胞外小胞を受けている対象とは遺伝的に異なる供給源から得られる細胞である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、同種細胞外小胞を産生および分泌する細胞スタイルであり得る。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）および共刺激分子の発現が欠如しているために低免疫原性を示し、これにより、ＭＳＣは、同種細胞外小胞を産生および分泌する親ＭＳＣと同様の抗炎症特性および栄養特性を共有する同種細胞外小胞を産生および分泌するための細胞外小胞ドナー細胞として働くことができる。
いくつかの場合、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、任意の真核細胞であり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株、幹細胞、初代細胞、または分化細胞に由来する細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、脱核細胞、神経幹細胞、未熟樹状細胞、および免疫細胞からなる群より選択され得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかの遺伝子改変細胞であり得、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入される。いくつかの場合、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって細胞外小胞内にトランスフェクトされる。いくつかの場合、エレクトロポレーションは、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ナノチャネルエレクトロポレーションによって細胞外小胞内にトランスフェクトされる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、ナノエレクトロポレーションされた細胞の染色体に組み込まれる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、ナノエレクトロポレーションされた細胞の染色体に組み込まれない。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクトされる。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクトされる。いくつかの場合、トランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株に由来する細胞であり得る。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの場合、ベクターはプラスミドである。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を定常速度または基底速度で連続的に産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度で細胞外小胞を産生および分泌し、細胞を刺激することによって更なる細胞外小胞を産生および分泌することができる。例えば、細胞外小胞ドナー細胞にヒートショックを行うか、または細胞外小胞ドナー細胞をＣａ２＋と接触させることによって、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞にエレクトロポレーションすることによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドの細胞内へのマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドの細胞内へのナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。場合によっては、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞外小胞ドナー細胞の基底速度よりも少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するためのナノエレクトロポレーション以外のトランスフェクションの方法によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞の速度よりも、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。
細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞は、遠心分離または超遠心分離によって回収および精製することができ、細胞外小胞は他の細胞残屑または分子から精製される。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞は、本明細書に記載される細胞外小胞以外の他の細胞残屑または分子を連続的に除去することができるタンジェンシャルフローろ過によって回収および精製することができる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療薬をコードする。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。場合によっては、治療薬は治療用ポリペプチドである。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を産生および分泌する。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つのアダプターポリペプチドおよび少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドはベクター（例えば、プラスミド）である。いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載されるＦｃ結合ドメイン、Ｆｃ受容体、またはその断片のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、細胞外ドメインのペプチド配列を含む。いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している標的化ドメインのペプチド配列を含む。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の細胞外表面上に発現される少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの治療薬をアダプターポリペプチドに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの治療薬をアダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の膜に発現および挿入される少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞内にある少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、任意の膜結合粒子である。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポトソーム、オンコソーム、エクソファー、エンベロープウイルス、エキソマー、または他の非常に大きな細胞外小胞である。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞はエキソソームである。
いくつかの場合、金属またはポリマー表面に成長または結合した細胞は、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、本システムは、上側境界および下側境界を有する流体チャンバを備える。流体チャンバ内に細胞を有する基質を配置することにより、上側チャンバおよび下側チャンバが形成される。いくつかの場合、本システムはさらに少なくとも１つのナノチャネルを含む。いくつかの場合、ナノチャネルを基質内に埋め込むことができる。いくつかの場合、ナノチャネルは半透性ポリマー基質の細孔を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ～約５００μｍの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約２μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０１μｍ～約２０μｍ、約０．０１μｍ～約５０μｍ、約０．０１μｍ～約１００μｍ、約０．０１μｍ～約５００μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約２μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約２０μｍ、約０．０５μｍ～約５０μｍ、約０．０５μｍ～約１００μｍ、約０．０５μｍ～約５００μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約２μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約２０μｍ、約０．１μｍ～約５０μｍ、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１μｍ～約５００μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約２μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約２０μｍ、約０．５μｍ～約５０μｍ、約０．５μｍ～約１００μｍ、約０．５μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約２μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約５０μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、約２μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約２０μｍ、約２μｍ～約５０μｍ、約２μｍ～約１００μｍ、約２μｍ～約５００μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５００μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１０μｍ～約１００μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、約２０μｍ～約５０μｍ、約２０μｍ～約１００μｍ、約２０μｍ～約５００μｍ、約５０μｍ～約１００μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、または約１００μｍ～約５００μｍの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、または約５００μｍの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、または約１００μｍの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、または約５００μｍの高さを含む。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは異なり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは、高電界ゾーン（例えば、ナノチャネルの内側）でナノエレクトロポレーションされている分子を加速するのに十分大きくなければならないが、ナノエレクトロポレーションされている大きな分子が短時間の電気パルスですり抜けることを可能にするほど十分小さくなければならない。
いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ～約０．１ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約０．５ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約０．５ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約５ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約５００ｎｍ、約５ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍの直径を含む。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は異なり得る。
いくつかの場合、ナノチャネルをナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネルは、ナノチャネル間に間隔を置いてナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ～約５，０００μｍであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０１μｍ～約５０μｍ、約０．０１μｍ～約１００μｍ、約０．０１μｍ～約５００μｍ、約０．０１μｍ～約１，０００μｍ、約０．０１μｍ～約５，０００μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約５０μｍ、約０．０５μｍ～約１００μｍ、約０．０５μｍ～約５００μｍ、約０．０５μｍ～約１，０００μｍ、約０．０５μｍ～約５，０００μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約５０μｍ、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１μｍ～約５００μｍ、約０．１μｍ～約１，０００μｍ、約０．１μｍ～約５，０００μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約５０μｍ、約０．５μｍ～約１００μｍ、約０．５μｍ～約５００μｍ、約０．５μｍ～約１，０００μｍ、約０．５μｍ～約５，０００μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約５０μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約１，０００μｍ、約１μｍ～約５，０００μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５００μｍ、約５μｍ～約１，０００μｍ、約５μｍ～約５，０００μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１０μｍ～約１００μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、約１０μｍ～約１，０００μｍ、約１０μｍ～約５，０００μｍ、約５０μｍ～約１００μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、約５０μｍ～約１，０００μｍ、約５０μｍ～約５，０００μｍ、約１００μｍ～約５００μｍ、約１００μｍ～約１，０００μｍ、約１００μｍ～約５，０００μｍ、約５００μｍ～約１，０００μｍ、約５００μｍ～約５，０００μｍ、または約１，０００μｍ～約５，０００μｍであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、約１，０００μｍ、または約５，０００μｍであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、少なくとも約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、または約１，０００μｍであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、最大で約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、約１，０００μｍ、または約５，０００μｍであり得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションシステムは、流体チャンバ内に電界を生成するための上部および下部電極層を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．１ボルト／ｍｍ～約０．５ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、または約１０，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０，０００ボルト／ｍｍ、または約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約０．１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、または約１０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０，０００ボルト／ｍｍ、または約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を含む。
場合によっては、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．０１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．０５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．１ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約０．１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、または約１，０００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約０．０１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、約１，０００ミリ秒／パルス、または約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約０．０１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、または約１，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、約１，０００ミリ秒／パルス、または約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションは、１パルス、２パルス、３パルス、４パルス、５パルス、６パルス、７パルス、８パルス、９パルス、１０パルス、１１パルス、１２パルス、１３パルス、１４パルス、１５パルス、１６パルス、１７パルス、１８パルス、１９パルス、２０パルスまたはより多くを含む。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を産生する方法およびシステムは、細胞内にナノエレクトロポレーションされる複数の異種ポリヌクレオチド（ベクターなど）をナノチャネルにロードすることを含む。いくつかの場合、ポリヌクレオチド以外の分子（例えば、タンパク質、生体分子、化合物など）をナノチャネルにロードして、細胞にナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、上部電極および下部電極によって生成された電界は、細胞内へ、ベクター（例えば、プラスミド）を加速させる。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために生成された電界が膜の細胞に細孔を作り出して、ベクター（例えば、プラスミド）のナノエレクトロポレーションを可能にする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞の膜中の細孔は、焦点、例えば、電界が細胞膜と直接接触するナノチャネルの出口で形成され得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションなど）によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞よりも、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、またはそれを超える細胞外小胞を産生および分泌し得る。
場合によっては、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞と比較して、少なくとも５０％、１倍、２倍、５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、またはそれを超える治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドは、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドよりも、治療用ポリペプチドをコードするためにインタクトである可能性が少なくとも１０％高い、２０％高い、３０％高い、４０％高い、５０％高い、６０％高い、７０％高い、８０％高い、９０％高い、９５％高い、９９％高いまたはそれよりも高い。
ワクチン
本明細書に記載される細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、本明細書に記載されるＦｃ受容体のいずれか１つのペプチド配列と４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドを含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のＦｃ受容体のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一のペプチド配列を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む。いくつかの場合、抗体は、免疫細胞の第１の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、細胞外小胞はさらに少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドを含む。少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、ウイルス模倣ペプチドが由来するウイルスに対する適応免疫をもたらす免疫応答を誘発することができる。いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合される。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合した標的化ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、同じ免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する。いくつかの例では、免疫細胞は、骨髄系細胞、Ｔ細胞、例えばαβ細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、マクロファージ、肥満細胞、食細胞、リンパ系細胞、顆粒球、マクロファージ、または樹状細胞である。いくつかの場合、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
場合によっては、第１の細胞表面マーカーは、Ｃ ５ａＲ、ＣＤ１０、ＣＤ１０７、ＣＤ１１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８／Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９３、ＣＤ２０、ＣＤ２０３、ＣＤ２０６、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２３５、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６５、ＣＤ６８、ＣＤ７、ＣＤ７１、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９４、クラスタリン、ＣＸＣＲ３Ｂ特異的、Ｆ４／８０、ＦｃεＲＩ、グリコホリンＡ、ＧＰ９、ＧＺＭＢ、ＨＢＥ１特異的、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＬ３Ｒα、インテグリンα－４、インテグリンβ－１、インテグリンβ－３、ＬＩＬＲＡ４、ＮＫｐ４、Ｐ－セレクチン、Ｓｉｇｌｅｃ－８、またはＶＥＧＦＲ－１／ＦＬＴ－１を含む。いくつかの場合、第１の細胞表面マーカーは、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２８を含む。
いくつかの場合、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの場合、抗体はＩｇＧである。いくつかの場合、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。いくつかの場合、抗体は、Ｆｃ受容体を含むアダプターポリペプチドと複合体化されるＦｃ領域を含む。いくつかの場合、抗体はアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化される。
いくつかの場合、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの場合、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、細胞外小胞の膜に部分的に挿入される。いくつかの場合、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合される。いくつかの場合、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドおよび標的化ドメインの両方が、アダプターポリペプチドの同じ細胞外ドメインに結合される。いくつかの場合、少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドは、第１のアダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合され、一方、標的化ドメインは、第２のアダプターポリペプチドの別個の細胞外ドメインに結合される。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、ウイルスのウイルスタンパク質に由来する。ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。ＤＮＡウイルスは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、またはｓｓおよびｄｓ ＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウイルスであり得る。ＲＮＡウイルスは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスまたは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルスであり得る。ｓｓＲＮＡウイルスは、プラスセンスＲＮＡウイルスまたはマイナスセンスＲＮＡウイルスにさらに分類することができる。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、コロナウイルス科のコロナウイルスタンパク質に由来する。コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）には、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスが含まれ得る。いくつかの場合、コロナウイルスには、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれる。いくつかの場合、コロナウイルスタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのタンパク質である。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号１に提供される核酸配列によってコードされるウイルスタンパク質に由来する。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質に由来し、ｏｒｆ１ａ、ｏｒｆ１ａｂ、スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）、３ａ、３ｂ、エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）、膜タンパク質（Ｍタンパク質）、ｐ６、７ａ、７ｂ、８ｂ、９ｂ、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、ｏｒｆ１４、ｎｓｐ１（リーダータンパク質）、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ５（３Ｃ様プロテイナーゼ）、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、ｎｓｐ８、ｎｓｐ９、ｎｓｐ１０（成長因子様タンパク質）、ｎｓｐ１２（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲｄＲｐ）、ｎｓｐ１３（ＲＮＡ ５’－トリホスファターゼ）、ｎｓｐ１４（３’→５’エキソヌクレアーゼ）、ｎｓｐ１５（エンドＲＮＡｓｅ）、およびｎｓｐ１６（２’－Ｏ－リボース－メチルトランスフェラーゼ）からなる群より選択される。
場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号２～５のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のウイルスタンパク質に由来する。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号６～１０のペプチド配列を含む。
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多くの前駆体タンパク質のＮ末端の前に存在するシグナルペプチド（通常１６～３０アミノ酸長）は、成熟および分泌輸送プロセスにおける細胞内運命に向けてそれらのタンパク質を誘導することができる。エキソソームで発現されるヒト膜貫通タンパク質ＣＤ６４の場合、シグナルペプチドは、ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＿ＦＣＧＲ１＿ＨＵＭＡＮの１～１５アミノ酸（配列番号１１）であり得る。エキソソーム表面上のヒト標的タンパク質発現をガイドすることができる同様のシグナルペプチドには以下も含まれる：ＬＡＭＰ１＿１～２８アミノ酸：ＭＡＡＰＧＳＡＲＲＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＬＭＨＣＡＳＡ（配列番号１２）；ＬＡＭＰ ２＿１～２８アミノ酸：ＭＶＣＦＲＬＦＰＶＰＧＳＧＬＶＬＶＣＬＶＬＧＡＶＲＳＹＡ（配列番号１３）；ＨＬＡ－Ｇ＿１～２４アミノ酸：ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡ（配列番号１４）；ＨＬＡ－ＤＲＡ＿１～２５＿アミノ酸：ＭＡＩＳＧＶＰＶＬＧＦＦＩＩＡＶＬＭＳＡＱＥＳＷＡ（配列番号１５）。そのようなシグナルペプチドモチーフの導入は、合成されたタンパク質が細胞質ゾルで消費されるのを防ぐことができ、エキソソーム表面でのタンパク質発現を増加させる。
いくつかの場合、細胞外小胞を含む組成物は、免疫細胞と接触するウイルス模倣ペプチドによって引き起こされる免疫応答を増強するための免疫調節剤またはアジュバントをさらに含むことができる。例示的な免疫調節剤としては、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）分子、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、１Ｌ－１５もしくはＩＬ２１）が挙げられる。例示的なアジュバントとしては、無機化合物（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または水酸化リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ））、鉱油、パラフィン油、落花生油、細菌産物、例えば不活化百日咳菌、非細菌有機物、例えばスクアレン、植物サポニン、フロイント完全アジュバント、またはフロイント不完全アジュバントが挙げられる。
場合によっては、ワクチン接種を必要とする対象にワクチン接種する方法が本明細書に記載され、前述の方法は、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドを含む医薬組成物は、１日に少なくとも１回、１週間に少なくとも１回、１ヶ月に少なくとも１回、１年間に少なくとも１回、または１年間よりも長い期間に少なくとも１回、対象に投与される。
ウイルス模倣ペプチドに対する中和抗体が対象において観察されたら、投与を停止することができる。あるいは、必要に応じて、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を含む医薬組成物の維持用量またはブースター用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、対象において検出される中和抗体のレベルに応じて減少させることができる。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を産生する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内に導入することを含む。いくつかの場合、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドはベクター（例えば、プラスミド）である。場合によっては、細胞外小胞細胞内に導入された少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの標的化ドメインをコードする。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ウイルス模倣物ペプチドをコードする。
いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入することができる。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって本明細書に記載される細胞内に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、本明細書に記載されるトランスフェクションの生物学的、化学的または物理的方法によって細胞内に移入することができる。いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションによって細胞外ドナー細胞内にトランスフェクトされる。
医薬組成物
いくつかの場合、細胞外小胞を医薬組成物に製剤化することができる。いくつかの場合、細胞外小胞を含む医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞を含む医薬組成物は、非経口、経口、頬側、直腸、舌下または経皮投与経路を含むがこれらに限定されない複数の投与経路によって対象に投与することができる。いくつかの場合、非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨内注入、腹腔内、または髄腔内投与を含む。場合によっては、医薬組成物は局所投与用に製剤化される。他の例では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内、皮下および筋肉内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、筋肉内投与によって対象に投与される。
キット／製造物品
ある特定の場合、本明細書に記載される１つまたはそれを超える方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製造物品が本明細書に開示される。本明細書に記載される細胞外小胞を産生するシステムも本明細書に記載される。いくつかの場合、本システムは、細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションして、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞の産生および分泌を刺激するための構成要素を含む。
いくつかの場合、キットは、バイアル、チューブなどの１つもしくはそれを超える容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含むことができ、容器の各々は、本明細書に記載される方法で使用される別個の要素の１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。いくつかの場合、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。キットは、典型的には、内容物および／または使用についての指示を列挙するラベル、および使用についての指示を含む添付文書を含む。指示のセットを含めることもできる。
一実施形態では、ラベルは、容器上にあるか、または容器に付随している。一実施形態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされるときに容器上にあり、ラベルは、容器も保持する容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）または担体内に存在するとき、例えば添付文書として容器に付随している。一実施形態では、内容物が特定の治療適用に使用されることを示すためにラベルが使用される。ラベルはまた、本明細書に記載される方法などにおける内容物の使用のための指示を示す。
ある特定の場合、アダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する１つもしくはそれを超える単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。ある特定の場合、本明細書に記載される抗体のいずれか１つと複合体化されたアダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する１つもしくはそれを超える単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイス中に提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示を伴う。一実施形態では、パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知を伴い、その通知は、ヒトまたは獣医学的投与のための薬物の形態の機関による承認を反映している。そのような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって薬物について承認されたラベル、または承認された製品添付文書である。一実施形態では、適合性医薬担体で製剤化された本明細書で提供されるアダプターポリペプチドおよび治療用含有物を含む細胞外小胞も調製され、適切な容器に入れられ、適応された症状の処置のために標識される。いくつかの場合、キットは、本明細書に記載されるワクチン、治療薬、養子療法、および処置方法を開発するのに有用な製造物品を含む。
以下の例示的な例は、本明細書に記載される刺激、システム、および方法の態様を表すものであり、決して限定することを意味するものではない。
実施例１．ＴＨＰ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡの設計および試験
抗体とペプチドが連結した細胞外小胞（「ＥＶ」）、特にエキソソームの新しいプラットフォームは、ＥＶおよびエキソソーム表面上にＣＤ６４、ＣＤ６４ペプチドまたは他のＦｃ受容体を発現するプラスミドＤＮＡでドナー細胞をトランスフェクトすることによって確立された。ＣＤ６４はＦｃ－γ受容体１（ＦｃγＲ１）としても知られており、これは、その細胞外Ｄ１およびＤ２ドメインによってＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＦｃ領域のヒンジに、ナノモル濃度（ｎＭ）レベルの解離定数Ｋｄで高い親和性で結合する。また、内因性ＲＮＡおよびタンパク質をＥＶおよびエキソソームに添加して治療薬として機能させるために、ドナー細胞にプラスミドＤＮＡを同時トランスフェクトした。これらの治療用ＥＶ（ｔＥＶ）およびエキソソーム（ｔＥｘｏ）は、がん細胞および腫瘍、非がん病変、ならびに損傷組織への標的化された薬物送達ビヒクルとして機能した。それらはまた、ワクチン開発および他の医学的処置のために設計された。
ＦＬＡＧタグ、ＣＫＡＡＫＮ（ＣＫ）、ＣＲＥＫＡ（ＣＲ）、またはＡＲＲＰＫＬＤ（ＡＲ）をコードするように設計された腫瘍ホーミングペプチド（「ＴＨＰ」）をＣＤ６４のＮ末端に付加し、様々なヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＣＤ６４のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインに結合させて、図１に示されるような二重標的化能を達成した。ＣＤ６４またはＴＨＰ－ＣＤ６４を有する細胞外小胞（「ＥＶ」）は、トランスフェクトされたドナー細胞から分泌されたＥＶ（例えばエキソソーム）の表面上にヒトＣＤ６４またはヒトＴＨＰ－ＣＤ６４のいずれかを発現するヒトＣＤ６４プラスミドＤＮＡまたはヒトＴＨＰ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡをドナー細胞にトランスフェクトすることによって生成された。ＣＤ６４は、ヒト化モノクローナル抗体（「ｈｍＡｂ」）に結合するための生物学的アンカーとして機能した。ヒトＣＤ６４の細胞外Ｄ１およびＤ２ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃの下部ヒンジ領域に高親和性で、例えばナノモル濃度レベルの解離定数（Ｋｄ）で結合した。結合したｈｍＡｂの特異的認識能力に加えて、小腫瘍ホーミングペプチド（ＴＨＰ）による標的化もまた、ＣＤ６４のＮ末端に対して操作された。ＥＶ（またはエキソソーム）表面上のｈｍＡｂおよびＴＨＰの両方の二重標的化は、インビボでの腫瘍および他の病変へのＥＶ（またはエキソソーム）送達の標的化を増強した。
プラスミドを、それぞれ形質転換およびトランスフェクションのためのアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）ならびにＥＧＦＲマーカーの遺伝子を有するベクターを用いて構築した。機能的ＣＤ６４は、ＥＦ１－プロモーターによって駆動されるＣＤ６４のコード配列（ＣＤ６４＿ＣＤＳ）によってコードされた（図２Ａ）。ＣＤ６４＿ＣＤＳ（３５５アミノ酸）は、（ｉ）シグナルペプチド（ＳＰ）、（ｉｉ）細胞外（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３）ドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および（ｉｖ）細胞内（ＩＣ）ドメインからなり、シグナルペプチドと細胞外Ｄ１との隙間にＴＨＰを挿入してＣＤ６４のＮ末端に発現させた（図２Ｂ）。ＴＨＰをＦｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＫ）リンカーによって細胞外Ｄ１のＮ末端に接続し、ＣＤ６４のＤ１－Ｄ２ヒンジのＦｃ結合領域上のコンフォメーションのブロックを制限した（図２Ｃ）。ＴＨＰ：Ｆｌａｇ＿対照、ＣＫＡＡＫＮ（ＣＫ）、ＣＲＥＫＡ（ＣＲ）およびＡＲＲＰＫＬＤ（ＡＲ）のペプチドおよびヌクレオチド配列を図２Ｄに列挙する。
ＣＤ６４のＮ末端に連結された腫瘍ホーミングペプチド（「ＴＨＰ」）がＣＤ６４とヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）との相互作用を変化させるかどうかを試験するために、異なるＴＨＰを有する操作されたＣＤ６４タンパク質を精製し、固定化ｈＩｇＧ（９６ウェルプレート上にコーティング）と反応させて、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った（図３Ａ）。異なるＴＨＰを有する結合したＣＤ６４タンパク質を抗ＣＤ６４／Ｆｌａｇおよび第２のＨＲＰ抗体と反応させ、続いてＥＬＩＳＡ基質（テトラメチルベンジジン）と反応させた。４５０ｎｍでの吸光度は、操作されたＣＤ６４タンパク質による滴定の濃度を明らかにした。結合滴定曲線をＣＤ６４とｈＩｇＧとの間の一価モデリングに適合させて、解離定数Ｋｄ（Ｏ．Ｄ．＝［Ｂｍａｘ×Ｃｏｎ］ ／ ［Ｋｄ＋Ｃｏｎ］（ここで、Ｏ．Ｄ．は吸光度の光学濃度であり、ＢｍａｘはＯ．Ｄ単位での結合の最大値であり、Ｃｏｎは濃度である）を決定した。ｈＩｇＧおよび組換え野生型ＣＤ６４（ｗｔ＿ＣＤ６４）のＫｄを、参照として最初に測定した（Ｋｄ＝０．０４５６ｎＭ、図３Ｂ）。異なる操作されたＴＨＰ－ＣＤ６４タンパク質とｈＩｇＧとの親和性指数Ｋｄを、Ｆｌａｇ－ＣＤ６４（Ｋｄ＝０．０５３６ｎＭ）、ＣＫ－ＣＤ６４（Ｋｄ＝０．０５８８ｎＭ）、ＣＲ－ＣＤ６４（Ｋｄ＝０．０６５８ｎＭ）およびＡＲ－ＣＤ６４（Ｋｄ＝０．０５０６ｎＭ）として決定した（図３Ｃ）。これらの結果は、異なるＴＨＰ（Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲ、またはＡＲ）を有する操作されたＣＤ６４が、ｗｔ＿ＣＤ６４と比較して、ｎＭレベルでｍＡｂに対する高い結合親和性に影響を及ぼさないことを示した。
実施例２．ナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）がトランスフェクトされた細胞からのＥＶおよびエキソソーム放出を誘発した
ＥＶおよびエキソソームを含有するＴＨＰ－ＣＤ６４を、ナノチャネルエレクトロポレーション（「ＮＥＰ」）システムを使用することによって産生した。チップ表面上でドナー細胞を培養した。１日培養した後、カーゴチャンバーに事前負荷されたプラスミドを、２５～２５０Ｖ電界（細胞の種類および供給源に依存する）を用いて、１０ｍｓ／パルスで０．１秒間隔で１０回のパルスを用いて、ナノチャネルを介して個々の細胞に注入した。細胞トランスフェクション後、機能性ＲＮＡおよび表面受容体を含有する放出されたＥＶ（エキソソームを含む）を、まず遠心分離によって回収した培養培地から精製して細胞および大きな細胞残屑を除去し、続けてタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を行った。
図４は、ＴＨＰ－ＣＤ６４および治療用ＲＮＡプラスミドによるＮＥＰトランスフェクトマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）からのＥＶ数および内因性ＲＮＡ含有量を示す。２４時間のＮＥＰ処理後、遠心分離およびＴＦＦによるＥＶの精製および回収のために細胞培養培地を回収した。精製後、操作されたＥＶを、スピンカラムを使用して約２００μＬの体積で高濃度にさらに精製した。図４Ａに示すように、ヒトＴＨＰ－ＣＤ６４＋ヒトＴＰ５３群およびヒトＴＨＰ－ＣＤ６４＋ｓｈＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異群の両方のＥＶ数は、対照群（すなわち、ＮＥＰ処理なし）と比較した場合、ＮＥＰ処理後に約１０倍の増加を示した。図４ＢのＴＰ５３ ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲは、ＮＥＰによって産生されたＥＶが、ＮＥＰ処理なしの対照群と比較して多量の転写ｍＲＮＡを含有し、４０で未決定に対してＣｔ値２７．５に基づいて推定約６，０００倍増加したことを明らかにした。
操作されたＴＨＰ－ＣＤ６４を有する精製エキソソームをラテックスビーズによって捕捉し、フローサイトメトリーアッセイのために抗ＣＤ６４－ＡＰＣ、抗ＣＤ６３－ＢＶ５１０およびＦＩＴＣコンジュゲートｈＩｇＧと共にインキュベートした（図５Ａ）。表面発現のプロファイリングは、図５Ｂに示すように、ＣＤ６４発現およびｈＩｇＧ親和（ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定するために、シングレットビーズおよびＣＤ６３＋エキソソーム集団をゲートする標準的なプロトコルに従った。ＣＤ６３＋エキソソーム集団内のＣＤ６４の表面共発現をＦＩＴＣのＭＦＩによって決定し、図５Ｃに示すように、Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲまたはＡＲ ＴＨＰのいずれかを有する操作されたＣＤ６４のエキソソーム発現を確認した。ＣＤ６３＋エキソソーム集団内のｈＩｇＧおよびＣＤ６４の表面共発現をＦＩＴＣのＭＦＩによって決定し、図５Ｄに示すように、Ｆｌａｇ、ＣＫ、ＣＲまたはＡＲ ＴＨＰのいずれかを有するＣＤ６４を発現するエキソソームに対するｈＩｇＧの高い結合親和性を確認した。
実施例３．ＰＡＮＣ－１スフェロイドにおけるｈｍＡｂを含むかまたは含まないＴＨＰ－ＣＤ６４含有エキソソームの取り込み
膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ－１のスフェロイドを、セルロースおよび１型コラーゲンを使用する懸滴法によって形成し、図７Ａに示すように直径約５００～６００μｍに達するまで１週間培養した。膵臓がん幹細胞（ＣＳＣ）は、一般に、ＣＤ４４およびＣＤ２４のそれらの表面発現によって定義される。直径４００μｍを超えるスフェロイドは低酸素コアを発達させ、この低酸素微小環境は生存シグナル伝達経路を活性化し、細胞生存度を維持するために再プログラミングする。ＰＡＮＣ－１細胞をスフェロイド中で安定に培養すると、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋集団が徐々に増加した。
Ｆｌａｇ－ＣＤ６４またはＣＫ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡ（ＣＫ－ＣＤ６４）のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞から放出された精製ＥＶを、ヒト化抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（セツキシマブ）またはｈＩｇＧのいずれかと共に製剤化した。ヒト膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ－１から形成されたがんスフェロイドを、ＰＫＨ６７（緑色）標識リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）または種々のＥＶで２４時間処理し、その後、固定、透過および抗ｈＩｇＧ－ＴＲＩＴＣ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）による染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なＥＶによるがんスフェロイド処理はすべて、蛍光強度および分布に基づいて市販のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００よりも良好なスフェロイド取り込みを示した。様々なＥＶの中で、二重標的化エキソソーム（ＣＫ－ＣＤ６４－Ｃｅｔ＿Ｅｘｏ）は、図６に示すように最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
ヒトモノクローナル抗体（ｈｍＡｂ）を含むかまたは含まない様々なＴＨＰ－ＣＤ６４ ＥＶの細胞取り込みをさらに評価するために、処理したスフェロイドを単一細胞懸濁物に分解して、図７Ｂに示すようにフローサイトメトリーを使用したＣＤ２４およびＣＤ４４発現によって亜集団を同定した。ＣＤ２４ｌｏｗＣＤ４４ｌｏｗまたはＣＤ２４＋ＣＤ４４＋亜集団において測定されたＰＫＨ６７の平均蛍光強度は、それらのＥＶ取り込みを表す。ヒト化抗体親和（セツキシマブ：抗ＥＧＦＲ、アテゾリズマブ：抗ＰＤ－Ｌ１、またはｈＩｇＧ）を有するＦｌａｇ－ＣＤ６４、ＣＫ－ＣＤ６４、ＣＲ－ＣＤ６４、またはＡＲ－ＣＤ６４を含有する操作されたＥＶはすべて、図７Ｃに示すように、特にＣＤ４４＋ＣＤ２４＋亜集団について良好な細胞取り込みを示した。抗ｈＥＧＦＲ（セツキシマブ）およびＣＫ－ＣＤ６４を用いた二重標的化ＥＶは、両方のＰＡＮＣ－１細胞亜集団について最良の細胞取り込みを提供した。
実施例４：ＰＡＮＣ－１スフェロイドおよび同所性マウスモデルにおけるＣＫ－ＣＤ６４／抗ＲＯＲ１含有エキソソームの取り込み
Ｆｌａｇ－ＣＤ６４またはＣＫ－ＣＤ６４プラスミドＤＮＡ（ＣＫ－ＣＤ６４）のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞から放出された精製ＥＶを、ヒト化抗ＲＯＲ１と共に製剤化した。ヒト膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ－１から形成されたがんスフェロイドを、ＰＫＨ６７（緑色）標識リポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）または種々のＥＶで２４時間処理し、その後、抗ｈＩｇＧ－ＴＲＩＴＣ（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）による固定、透過および染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なＥＶの中で、二重標的化エキソソーム（ＣＫ－ＣＤ６４－ＲＯＲ１＿Ｅｘｏ）は、図８に示すように最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
ＰＡＮＣ－１細胞に、インビボでのそれらの局在を追跡するためにＧＰおよびルシフェラーゼを形質導入した。ＰＡＮＣ－１がん細胞を同所的に異種移植した４週間後に、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスに様々なＥＶを尾静脈注射した。ＥＶ送達の２４時間後の脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および膵臓におけるＥＶの生体内分布を、ＥＶ脂質二重層のＰＫＨ２６染色によって調べた。ＥＶ濃度は各々約１０Ｅ１２／５０μＬであり、ドナー細胞はＭＥＦであった。図９および図１９Ａ～Ｂは、ＣＫ－ＣＤ６４－ＲＯＲ１＿Ｅｘｏが膵臓における最も高いＥＶ蓄積を明らかにしたことを示す。ＰＫＨ２６、ＧＦＰおよびルシフェラーゼ強度の共局在化は、膵臓腫瘍病変に送達されたＣＫ－ＣＤ６４－ＲＯＲ１＿Ｅｘｏの精度を反映した。
図１０は、ＰＫＨ染色による様々なＥＶの肝臓、脾臓および膵臓におけるＥＶ取り込みの平均と腫瘍組織におけるＥＶ分布とを比較する。ＣＫ－ＣＤ６４－ＲＯＲ１＿Ｅｘｏが、ＣＫ－ＣＤ６４－ＲＯＲ１標的化を用いてＥＶの優れた膵臓標的化および腫瘍組織取り込みを提供し得ることは明らかである。
実施例５．ワクチン開発のためのＶａｃｏｓｏｍｅの設計概念
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、現在のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの原因因子であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むいくつかのサブタイプで見られる様々な流行病によって証明されるように、世界的な健康にとって大きなリスクと関連付けられている。スパイク（Ｓ）タンパク質は、ウイルスエンベロープの不可欠な構造成分であり、ワクチン開発のための戦略的標的である。エキソソーム表面上のＣＤ６４に融合した様々なウイルスＳタンパク質断片を過剰発現するエキソソームは、ワクチン（「ｖａｃｏｓｏｍｅ」と呼ばれる）として機能することができる（図１１）。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介した強力なワクチン接種は、ＣＤ６４のＮ末端上のペプチドのワクチン接種およびＣＤ６４のヒンジＤ１－Ｄ２上の事前負荷された抗αＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂによる共刺激によって相乗的に達成することができる。操作されたＣＤ６４とＴＣＲとの間の免疫学的シナプスの形成は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いた蛍光タグおよびＴ細胞表面マーカー染色によって確認することができる。同様に、Ｂ細胞（抗αＣＤ１９／ＣＤ２０）および樹状細胞（ＤＣ）（抗αＬＩＬＲＡ ４）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするｍＡｂの同時負荷は、ＡＰＣ－Ｔ細胞応答を増強するはずである。ＣＯＶＩＤ－１９のワクチンペプチドとして機能する可能性が高い５つの融合Ｓタンパク質断片候補をエピトープおよび構造予測から選択する。それらは、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＤＣなどのＮＥＰトランスフェクトドナー細胞を介して生成されたｖａｃｏｓｏｍｅ上に発現され得る。
実施例６．ヒト免疫グロブリンおよび古典的Ｆｃ受容体の結合親和性強度
Ｆｃγ－ＩｇＧ結合に加えて、他のヒト免疫グロブリンおよびＦｃ受容体が存在する。原形質膜に埋め込まれたＦｃ受容体は、下流の活性化または抑制を引き起こすことができる細胞内ドメインまたはサブユニットを含む。ＩｇＧ親和性変化バリアントは、図１２Ａにおいて、非常に高い（濃いオレンジ色）、高い（オレンジ色）、中程度（黄色）、低い（薄い青色）から結合しない（濃い青色）まで、それぞれのヒトＦｃγ受容体メンバーで強調される。ＦｃＲｎ受容体は、酸性条件下（例えばｐＨ＝６）ではＩｇＧサブクラスに結合するが、生理学的条件下、ｐＨ＝７．４では結合能力を低下させる。図１２Ｂは、ＩｇＥがＦｃεＲＩ受容体に対して非常に高い結合親和性を有するが、ＦｃεＲＩＩ受容体に対しては低い親和性を有することを示す。ＩｇＡはＦｃαＲＩ受容体との結合親和性が低い。
実施例７．最適化されたＮＥＰによるＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡ／ＣＤ６４およびＴＰ５３ ｍＲＮＡ／ＣＤ６４標的化ＥＶ（ｔＥＶ）の構築
ＰＤＡＣにおける効率的な標的化送達のための操作されたＥＶを設計するために、細胞刺激によって誘発されるＥＶ放出の動態、および分泌ＥＶにおける治療薬（ＫｒａｓＧ１２Ｄ特異的ｓｈＲＮＡおよびｈＴＰ５３ ｍＲＮＡ）の負荷プロファイル、ならびにＥＶ表面上のＣＤ６４タンパク質発現を調査した。図１３に示すように、ＭＥＦから分泌されたＥＶは、有意に増加し、１０回の１０ｍｓパルスにより１５０Ｖで１μｍ細孔のＴｒａｎｓｗｅｌｌを使用したＮＥＰ後約１６時間でピークに達し、次いで急速に低下したが、ＴＰ５３－ｍＲＮＡの発現レベルは約４時間および８時間で急速にピークに達し、次いで発現はＮＥＰ後１２時間で非常に低いレベルに低下した。ＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とするｓｈＲＮＡの発現傾向（図１３Ｄ）は、ＥＶ分泌プロファイルの発現傾向と同様であり、すなわち、有意に増加し、約１６時間でピークに達した。経時的なＥＶ分泌およびＥＶに封入されたヌクレオチドの発現と比較して、ＥＶ表面上のＣＤ６４タンパク質は、ＮＥＰ後約２４時間でピークを有し、ＮＥＰ後長期間にわたって高レベルで発現することができた。放出プロファイルは、ＥＶ内にＣＤ６４タンパク質および所望のヌクレオチドの両方を有するＥＶを産生すると考えられる。ＴＰ５３発現とＥＶ分泌との間に大きなピーク時間差があるため、親細胞の逐次的なトランスフェクションアプローチが採用される。ＣＤ６４プラスミドを最初にトランスフェクトし、続いて８、１６および２４時間のタイムラグでＴＰ５３プラスミドを送達した３種類の逐次的なトランスフェクション設計を比較した。図１４に示すように、８時間の場合は、２回目の細胞刺激後にＥＶ分泌の劇的な増加を示したが、ＥＶ内のＴＰ５３ ｍＲＮＡ発現は非常に低く、これは短期間内の過剰な細胞刺激が不十分な細胞生存度を引き起こすことに起因し得る。対照的に、１６時間および２４時間の場合は、ＴＰ５３ ｍＲＮＡのはるかに高い発現をもたらした。これらの間で、１６時間の場合は、最も高いＴＰ５３ ｍＲＮＡ発現および非常に高いＥＶ分泌の両方を示した。したがって、ＴＰ５３ ｍＲＮＡ／ＣＤ６４ ＥＶは、ＣＤ６４プラスミドの最初のトランスフェクションの１６時間後に送達されたＴＰ５３プラスミドを用いた逐次的ＮＥＰによって産生された。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ／ＣＤ６４ ＥＶについては、ＮＥＰにおけるＣＤ６４およびＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡプラスミドの両方の同時送達が良好に機能した。
実施例８．調製されたままの標的化ＥＶ（ｔＥＶ）の特徴付け
ｑＮＡＮＯ、ＳＥＭ、ｃｒｙｏ－ＴＥＭ、ウェスタンブロットおよび免疫リポプレックスナノ粒子（ＩＬＮ）バイオチップアッセイを実施して、生成されたｔＥＶを観察および特徴付けを行った。ｑＮＡＮＯの結果（図１５Ａ）は、ブランクＥＶの平均直径が約１１０ｎｍであったことを示しているが、カーゴなしのＥＶ（ＰＢＳのみ）および治療薬ありのＥＶ（ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ／ＣＤ６４ ＥＶを代表とした）を含む操作されたＥＶはより大きな直径を示し、大量のヌクレオチドおよび他の生体分子がＥＶに封入されていることを示唆した。図１５Ｂは、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＴＳＧ１０１などの典型的なエキソソームタンパク質が調製されたままのＥＶで高度に発現されることを示す。ＳＥＭおよびｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像（図１５Ｃ～図１５Ｄ）に示すように、これらの操作された小胞は球形のままであった。ｔＥＶ内の封入された核酸、表面タンパク質、およびそれらの共局在化を確認するために、ＴＩＲＦＭ顕微鏡上のＩＬＮバイオチップを単一ＥＶの捕捉および検出に利用した。計算されたＴＩＲＦＭ結果（図１５Ｅ～図１５Ｆ）によれば、ｔＥＶ内の封入されたヌクレオチド（ＴＰ５３ ｍＲＮＡおよびＫｒａｓＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ）およびＣＤ６４－ＣＫ表面タンパク質の共局在化率は、それぞれ５１．１９％および５８．３１％であった。
実施例９．逐次的なＴｒａｎｓｗｅｌｌエレクトロポレーション（ｓＴＥＰ）プロトコル
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞、ヒト骨髄由来幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、および他の細胞型を治療的ＥＶ（ｔＥＶ）産生のために使用することができる。ここでは、ＭＥＦを例に挙げて説明する。
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社から入手）を使用して、治療用ＥＶ（ｔＥＶ）産生のための細胞クローンを生成する。組織培養フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、カタログ番号ＦＢ ０１２９３７）を使用する従来の細胞培養の場合、ＭＥＦ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加補充したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。ＭＥＦ細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌエレクトロポレーション（ＴＥＰ）インサート（例えば、１２ｍｍ）に、インサートあたり２００，０００～３００，０００個の細胞で播種する。細胞を８０％コンフルエントまで成長させる場合、細胞を１×ＤＰＢＳで３回洗浄し、ＴＥＰ処理のために無血清培地に置き換える。細胞を、エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ）を用いて、エレクトロポレーションパラメータを一定にした上でＴＥＰにより処理する。最適化のために、ＴＥＰによって誘発されるＥＶ放出の量、治療薬（ＣＤ６４タンパク質、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡおよびｈＴＰ５３ ｍＲＮＡ）の負荷プロファイルを、ｈＣＤ６４ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ製）およびｑＲＴ－ＰＣＲによって経時的にスクリーニングすることができる。細胞培養馴化培地（ＣＣＭ）をＴＥＰ処理後に経時的に回収し、２００×ｇで５分間遠心分離して細胞および残屑を除去する。ｑＮＡＮＯシステム（Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）は、調整可能な抵抗パルス感知（ＴＲＰＳ）法を利用して、ＣＣＭ溶液中の５０～３３０ｎｍの範囲のナノ粒子をカウントする。ＣＤ６４タンパク質を測定するために、ＥＶをＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）８９９００）およびｈＣＤ６４ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ社製）によって溶解し、次いで製造プロトコルに従って使用する。ＥＶ内のＴＰ５３ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とするｓｉＲＮＡの発現レベルを測定するために、ＥＶを細胞培養培地から全エキソソーム単離（ＴＥＩ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によって精製する。次いで、全ＲＮＡをＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ社製）から単離する。ヒトＴＰ５３ ｍＲＮＡとＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡの相対発現量は、ＲＴ－ＰＣＲにより測定し、次いで２△△Ｃｔ（下記のｔＥＶ ＲＮＡについてのｑＲＴ－ＰＣＲを参照のこと）を用いてＬｉｖａｋ法により算出することができる。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ／ＣＤ６４治療用ＥＶは１回のＴＥＰ処理後に回収され、一方で、ＴＰ５３ ｍＲＮＡ／ＣＤ６４治療用ＥＶは連続的なＴＥＰ処理後に回収される。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡ／ＣＤ６４治療用ＥＶの場合、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ｓｈＲＮＡおよびＣＤ６４プラスミド混合物で１回のＴＥＰによって処理した細胞を無血清培地中で１６時間インキュベートする。ＴＰ５３ ｍＲＮＡ／ＣＤ６４治療用ＥＶの場合、細胞を最初にＣＤ６４プラスミドによるＴＥＰによって処理し、１６時間インキュベートする。次いで、細胞をＴＰ５３ ｍＲＮＡプラスミドでＴＥＰによって処理し、無血清培地中でさらに１６時間インキュベートする。それに応じて細胞培養馴化培地（ＣＣＭ）を回収し、２００×ｇで５分間遠心分離して細胞および残屑を除去する。細胞を除去したＣＣＭを２０００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。細胞残屑を除去したＣＣＭを、ペレットを乱すことなく新しいチューブに移す。ＣＣＭは、下流のｔＥＶの単離および特徴付けのために４℃で保存するか、または凍結して－８０℃で保存する。
ｔＥＶ ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ。細胞培地を２０００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞および残屑を除去する。無細胞培養培地を含有する上清を、ペレットを乱すことなく新しいチューブに移す。エレクトロポレーション細胞培養培地のＮＴＡ測定後、全エキソソーム単離試薬（細胞培養培地から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号４４７８３５９から）を使用して試料を精製する。ＮＴＡデータからのＥＶ濃度が２ｅ９／ｍＬ未満である場合、全エキソソーム単離試薬（血清から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号）（下記のピペットを使用して上清を廃棄するステップに進む）を用いて試料を精製する。必要な容量（１ｍＬ）の無細胞培養培地を新しいチューブに移し、０．５容量（０．５ｍＬ）の全エキソソーム単離（細胞培養培地からのＴＥＩ）試薬を添加する。均一な溶液が存在するまでボルテックスし、ピペットで吸引排出することによって、培養培地／試薬混合物を十分に混合する。試料を４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、試料を１０，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離する。ピペットを用いて上清を廃棄する。ＥＶは、チューブの底部のペレットに含まれている（ほとんどの場合見えない）。溶液が再び透明になるまでボルテックスし、ピペットで吸引排出することによって、ペレットを好都合な体積（１００μＬ）のＲＮａｓｅフリー１×ＤＰＢＳ中に再懸濁する。開始体積が２ｍＬの培養培地である場合、再懸濁溶液（１００μＬ）をペレットを用いて他のチューブに戻す。ＥＶ ＲＮＡ抽出には、血漿／血清ＲＮＡ精製Ｍｉｎｉキット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ社、カタログ番号５５０００）を使用する。溶解緩衝液Ａを６０℃で２０分間加温し、沈殿が存在する場合は溶液が再び透明になるまで十分に混合する。１００μＬのＴＥＩ試薬処理試料を１．５ｍＬチューブに入れ、３００μＬの溶解緩衝液Ａを添加する。１０秒間ボルテックスすることによって十分に混合する。４００μＬの１００％エタノール（２００プルーフ）を添加する。１０秒間ボルテックスすることによって十分に混合する。１００μＬのＴＥＩ試薬処理試料をマイクロスピンカラムに入れるステップから４００μＬの混合物を移す。混合物を３，３００×ｇおよび室温（ＲＴ）で２分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、スピンカラムをその回収チューブと再び組み立てる。４００μＬの１００％エタノールを添加し、混合し、もう一度移して試料混合物をスピンカラムに移すステップを繰り返す。４００μＬの洗浄溶液Ａをカラムに適用し、３，３００×ｇおよびＲＴで１分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、スピンカラムをその回収チューブと再び組み立てる。フロースルーを廃棄し、再び組み立て、エタノールを加えるステップをさらに２回繰り返し、合計３回洗浄する。空のカラムを１３，０００×ｇおよびＲＴで２分間回転させ、回収チューブを廃棄する。スピンカラムを新しい１．７ｍＬ溶出チューブに移す。１２．５μＬの溶出溶液Ａからカラムに適用し、室温で２分間放置する。溶出チューブを用いてスピンカラムを４００×ｇで１分間、続けて５，８００×ｇで２分間遠心分離する。最大回収のために、溶出した緩衝液をスピンカラムに戻し、室温で２分間放置する。再び４００×ｇで１分間遠心分離し、続けて５，８００×ｇで２分間遠心分離する。抽出された全ＲＮＡ溶液（約１０μＬ）の濃度を測定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用する。測定体積は、核酸の水溶液に対して１μＬが推奨される。ＲＮＡモード（ＲＮＡ－４０）を選択して全ＲＮＡ濃度を測定する。サンプリングアームを上昇させ、１×ＤＰＢＳを下部測定ペデスタル上にピペットで移す。サンプリングアームを下げ、ＰＣ上のソフトウェアを使用してスペクトル測定を開始する。ブランクをクリックして基準スペクトルを測定し保存する。測定を選択することによって、ブランクの新しい複製物を試料と同じように分析する。結果は、０．０４Ａ（１０ｍｍの吸光度相当）以下で変化するスペクトルになるはずである。サンプリングアームを上昇させ、試料を下部測定ペデスタル上にピペットで移す。サンプリングアームを下げ、ＰＣ上のソフトウェアを使用してスペクトル測定を開始する。測定が完了したら、サンプリングアームを上昇させ、糸くずを含まない乾燥した実験室用ワイプを使用して、上部ペデスタルおよび下部ペデスタルの両方から試料を拭き取る。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度比２６０／２８０を確認する。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度比を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡの純度を評価する。約１．８の比は、一般に、ＤＮＡについて「純粋」として認められており、約２．０の比は、一般にＲＮＡについて「純粋」と認められている。いずれの場合も比がかなり低い場合、２８０ｎｍまたはその付近で強く吸収するタンパク質、フェノールまたは他の汚染物質の存在を示し得る。２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでの吸光度比２６０／２３０を確認する。これは、核酸純度の二次的な尺度である。「純粋な」核酸の２６０／２３０値は、多くの場合、それぞれの２６０／２８０値よりも高く、一般に１．８～２．２の範囲である。比がかなり低い場合、これは、共精製された汚染物質の存在を示し得る。ＲＴ－ＰＣＲの前のＲＮＡ試料の正規化のために、全ＲＮＡ濃度から試料体積を調整する。１０００ｎｇの全ＲＮＡ量（１０μＬの１００ｎｇ／μＬ）を超えない。プラスおよびマイナス逆転写酵素（ＲＮＡ）試料を増幅反応に使用する場合は、二連のチューブを調製する。ＲＮａｓｅフリーの０．５ｍＬ微量遠心チューブに氷上で以下を添加する。ＤＮａｓｅ Ｉ、増幅グレード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１８－０６８－０１５）；１μＬの１０×ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液；ＤＮａｓｅ Ｉ１μＬ、Ａｍｐグレード、１Ｕ／μＬ；全ＲＮＡ正規化のために調整された体積を有する１～８μＬの抽出された全ＲＮＡ試料を使用。通常、１００ｎｇの全ＲＮＡを５μＬの２０ｎｇ／μＬ、ＤＥＰＣ処理したＲＮａｓｅフリー水１０μＬまで添加する。チューブを室温で１５分間インキュベートする。反応混合物に１μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加することによってＤＮａｓｅ Ｉを不活性化する。６５℃で１０分間加熱する。ＲＮＡ試料は、ＰＣＲ増幅の前に、逆転写で使用する準備ができている。逆転写（ＲＴ）プロセスについては、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号４３－７４９－６６）を使用する。最大２μｇ（２０μＬ反応の場合）の全ＲＮＡをｃＤＮＡに定量的に変換して２×逆転写マスターミックスを調製する：２．０μＬの１０×ＲＴ緩衝液；０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ混合物（１００ｍＭ）；２．０μＬの１０×ＲＴオリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマー；１．０μＬのＲＮａｓｅ阻害剤；１．０μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素；３．２μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ；１０μＬのＤＮａｓｅ処理した全ＲＮＡを１０μＬの２×ＲＴマスターミックスに添加して、２０μＬの１×ミックスを生成する。短時間ボルテックスして混合する。短時間遠心分離して、反応混合物をチューブの底部に運び、気泡を除去する。サーマルサイクラーで２時間１５分間、オリゴｄＴまたはランダムヘキサマー法で逆転写を行う。ｑＲＴ－ＰＣＲ実験用の反応混合物を調製する：ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは２倍濃度で供給され、これはＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ウラシル－Ｎグリコシラーゼ（ＵＮＧ）；ｄＵＴＰを有するｄＮＴＰ；ＲＯＸ（商標）色素（受動的基準（ｐａｓｓｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ））；最適化された緩衝液成分を含有する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを氷上に保つ。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを氷上で解凍し、次いでボルテックスし、短時間遠心分離して再懸濁する。適切な容量のＰＣＲ反応混合物を光学反応プレート（９６ウェルプレート）の各ウェルに移す。１０μＬの２×マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、カタログ番号４４４４５５７）；ＴＰ５３、ＶＥＧＦＡおよびＣＯＬ１Ａ１遺伝子の標的プローブおよびプライマーと混合した１μＬの２０×ＴａｑＭａｎアッセイミックス；２μＬのｃＤＮＡ鋳型（ＲＴ試料中１０ｎｇ／μＬの２μＬで２０ｎｇ）；７μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ。反応プレートを光学接着フィルムで密封し、次いで短時間遠心分離してＰＣＲ反応混合物をウェルの底部に運び、気泡を除去する。システムソフトウェア内の反応プレートに対応するプレート文書または実験ファイルを開く。反応プレートをリアルタイムＰＣＲシステムにロードする。ｑＰＣＲ反応の実行を開始する。すべての反応が完了した後、反応の増幅プロットを見る。自動ベースラインおよび自動閾値設定を使用して、増幅曲線の閾値サイクル（Ｃｔ）を決定する。データを分析するためにＧＡＰＤＨ参照を用いた比較Ｃｔ（ΔＣр）法を使用する。ΔΔＣт法を用いてｑＰＣＲデータを解析する。
実施例１０．ＰＡＮＣ－１膵がん細胞への濃縮ＥＶ内在化
標的化に加えて、ＥＶ表面上にヒト化モノクローナル抗体（ｈｍＡｂ）および組織ホーミングペプチド（ＴＨＰ）を含む開示されたＣＤ６４濃縮ＥＶは、細胞内在化および組織透過（トランスサイトーシスを含む）を実質的に増強することができる。ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）およびＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）の高い表面発現のため、ＰＡＮＣ－１細胞を膵臓がんモデルとして使用した。ＰＡＮＣ－１細胞を培養し、以下の標的化製剤の１つとＣＤ６４／ＥＶと共にインキュベートした：（ｉ）ｆｌａｇ－対照（標的化部分なし）、（ｉｉ）ＩｇＧを含まないＣＫ（ＣＫＡＡＫＮＫ）ペプチド、（ｉｉｉ）正常ＩｇＧ（特異性なしのＩｇＧ）を含むＣＫペプチド、（ｉｖ）ＣＫペプチドおよびαｈＥＧＦＲ＿ＩｇＧ、ならびに（ｖ）ＣＫペプチドおよびαｈＲＯＲ１＿ＩｇＧ。ＣＤ６４／ＥＶを個々のｈｍＡｂと室温で１時間予備混合し、次いで、結合していないｈｍＡｂを洗い流した。単層培養のＰＡＮＣ－１細胞を、各ｈｍＡｂを含む製剤化ＣＤ６４／ＥＶで２４時間処理し、次いで洗浄し、フローサイトメトリーのために懸濁した。フローアッセイを行って、ＰＫＨ６７で蛍光標識された内在化ＥＶの量を定量化した。最初の比較は、異なるｈｍＡｂを負荷したｆｌａｇペプチド（図１６Ａ）またはＣＫペプチド（図１６Ｂ）発現ＥＶの取り込み効率であった。蛍光強度は、ＰＡＮＣ－１細胞上の表面ＲＯＲ１またはＥＧＦＲに対する選択性のために、αｈＲＯＲ１で標的化されたＥＶがαｈＥＧＦＲで標的化されたＥＶまたはＩｇＧ対照よりも良好に取り込まれることを明らかにした。ＥＶ表面のＣＤ６４上の臨床的に利用可能なｈｍＡｂ、特にαｈＲＯＲ１に結合すると、標的化されていないＩｇＧ＿ＥＶと比較して、ＰＡＮＣ－１がん細胞に内在化されたＥＶの量をαｈＲＯＲについては約６０％、αｈＥＧＦＲについては約３０％増加させることができた（図１６Ｃ）。さらに、ＥＶ表面上の更なるＣＫペプチドは、ＰＡＮＣ－１細胞におけるαｈＲＯＲ１＿ＥＶの取り込みをほぼ２倍にすることができる（平均蛍光強度［ＭＦＩ］、Ｆｌａｇ＿αＲＯＲ１：５５８５±７５５．９；ＣＫ＿αＲＯＲ１：１１２２０９±１９１４に示されるとおり）。図１６Ｃは、フローサイトメトリーアッセイからの定量的な結果をまとめたものである。ＥＶ取り込みのｈｍＡｂ支援濃縮をさらに定量化するために、ＰＡＮＣ－１細胞上の表面ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１発現を、ｈｍＡｂ標的化製剤を伴ってまたは伴わずに染色した。４時間のαＲＯＲ１＿ＥＶ処理によるＰＡＮＣ－１細胞の染色から、表面ＲＯＲ１発現の減少が観察され、αｈＲＯＲ１が、薬物送達の増強のためにαｈＥＧＦＲよりも強いＥＶ内在化を誘導できることを示唆している（図１６Ｄ）。次いで、ＰＡＮＣ－１細胞の３Ｄ腫瘍スフェロイドに対するＥＶ取り込みアッセイを行った。一貫して、αｈＲＯＲ１＿ＥＶは、より強い表面ＲＯＲ１内在化を示し、濃縮されたＥＶ取り込みをもたらし、一方で、αｈＥＧＦＲ＿ＥＶは、ＰＡＮＣ－１表面を良好に標的とすることができたが、６時間のインキュベーション後に内在化はより少なかった（図１６Ｅおよび１６Ｆ）。ヒトＩｇＧは６～１６ｇ／Ｌの濃度でヒト血清中に天然に存在するので、置換アッセイを実施してＥＶ上のαｈＲＯＲ１およびαＥＧＦＲの安定性を評価した。ＥＶに最初に標的化抗体（すなわち、αｈＥＧＦＲおよびαｈＲＯＲ１）を負荷し、次いで、ヒト血清（５０％）と共に３７℃で６時間インキュベートした。この置換アッセイの目的は、事前負荷されたｈｍＡｂを血液循環中の血清ヒトＩｇＧで置換できるかどうかを理解することであった。置換アッセイの前後のＥＶの標的化能力を比較した後、標的化能力の大きな損失は観察されなかった（図１６Ｇおよび図１８Ａ～図１８Ｂ）。このデータは、臨床使用におけるＣＤ６４／ＥＶ上のヒト化抗体の安定性を裏付けている。
実施例１１．標的化ＥＶの組織透過の増強
異なる標的化設計を有する各ＥＶ製剤について、ｔｒａｎｓｗｅｌｌベースのアッセイを確立して、ＰＡＮＣ－１細胞の複数の層を介した透過能を定量化した。トランスサイトーシスの活性を、５μｍ細孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜によって分離されたＰＡＮＣ－１細胞の上層と下層との間のＥＶ交換によって決定した（図１７Ａ）。上層は、ヒト膵管上皮細胞のタイトジャンクションを模倣するために単層培養で９０％コンフルエンスを超えるＰＡＮＣ－１細胞から構成された。ＥＶをＰＫＨ６７で蛍光標識し、第１のレシピエントとして上層細胞とインキュベートした。トランスサイトーシスが徐々に起こると、蛍光標識ＥＶは第１のレシピエント細胞に取り込まれたが、多くはエキソサイトーシスを介して細胞外領域に分泌する。中間領域の蛍光標識ＥＶの一部は、後に下層の第２のレシピエント細胞によって取り込まれ、指標として検出可能な蛍光シグナルをもたらす。市販のＰＥＧ化リポソームであるＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）を、対照として製造元の指示に従って合成した。ＥＶは、上部細胞単層に出入りし、リポソームよりも２～３倍良好に下部細胞単層によって取り込まれ得ることが見出された（図１７Ｃ）。エンドサイトーシスおよびＥＶ分泌を遮断するために選択される様々な阻害剤を図１７Ｂに示す。クラスリンおよびカベオラ媒介エンドサイトーシスを阻害すると、ＥＶトランスサイトーシスが有意に減少し、レシピエント細胞（この場合はＰＡＮＣ－１）へのＥＶ侵入が主にクラスリンおよびカベオラ媒介エンドサイトーシスによって媒介されることが示唆された。興味深いことに、ネチコナゾールによる上部ＰＡＮＣ－１細胞のＥＶ分泌の阻害は、トランスサイトーシス活性を強く低下させた（図１７Ｃ）。ＥＶ表面上に標的化ｈｍＡｂがあると、トランスサイトーシス活性は、非標的化ＥＶのそれと比較して３～４倍濃縮され得る（図１７Ｄ）。ここでも、αｈＲＯＲ１を負荷したＣＤ６４／ＥＶ表面は、ＰＡＮＣ－１細胞のトランスサイトーシスを最も向上させることができ、ＣＤ６４／ＥＶ上のｈｍＡｂとＣＫ－ペプチドとの組み合わせは、トランスサイトーシスをさらに改善するであろう（図１７Ｄ）。
上記の開示は、明確さおよび理解のためにある程度詳細に記載されているが、本開示の理解から当業者には、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることは明らかであろう。例えば、上述したすべての技術および装置は、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれるように個別かつ別個に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

Claims (117)

  1. 少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、前記細胞外小胞が、
    ａ．１０－９Ｍ未満またはそれに等しい解離定数（Ｋｄ）で抗体のＦｃ領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、少なくとも１つのアダプターポリペプチドと、
    ｂ．前記アダプターポリペプチドと複合体化された前記抗体であって、前記抗体は罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、抗体と、
    ｃ．少なくとも１つの治療薬と
    を含む、組成物。
  2. 抗体のＦｃ領域に結合する前記ペプチド配列が、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記Ｆｃ受容体がＣＤ６４である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに結合している、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記標的化ドメインが、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記罹患細胞ががん細胞または非がん性病変細胞である、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記第１の細胞表面マーカーが、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが異なる、請求項６に記載の組成物。
  11. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが同一である、請求項６に記載の組成物。
  12. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記抗体が、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体クローンＣ２２５、ヒト化抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ２、およびヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローンＳＰ１４２からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧを含む、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記ヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項１６に記載の組成物。
  19. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外小胞内にある、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外ドメインに結合している、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記少なくとも１つの治療薬が、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記治療用ポリヌクレオチドが、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である、請求項１に記載の組成物。
  25. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記医薬組成物が請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
  27. 前記医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記対象ががんまたは非がん性病変を有する、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記対象が神経膠腫を有する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記対象が筋ジストロフィを有する、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記筋ジストロフィが、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記対象が網膜疾患を有する、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記対象に、前記治療有効量の前記医薬組成物を少なくとも１日に１回、週に１回、月に１回、または年に１回の頻度で投与する、請求項２６に記載の方法。
  35. 前記医薬組成物が水性製剤である、請求項２６に記載の方法。
  36. 前記医薬組成物が注射用に製剤化される、請求項２６に記載の方法。
  37. 前記医薬組成物を、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、鼻腔内、またはそれらの組み合わせで前記対象に投与する、請求項２６に記載の方法。
  38. 組成物を製造する方法であって、前記方法が、
    ａ．アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、前記アダプターポリペプチドが、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、前記Ｆｃ受容体が抗体のＦｃ領域を認識する、ステップと、
    ｂ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が前記アダプターポリペプチドを発現し、前記アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、前記細胞外小胞が少なくとも１つの治療薬を含む、ステップと、
    ｃ．前記抗体を前記細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、前記抗体が罹患細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップと
    を含む、方法。
  39. 前記Ｆｃ受容体がＦｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体またはＦｃ－ε受容体である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記Ｆｃ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記Ｆｃ受容体がＣＤ６４である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記罹患細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが前記細胞外ドメインに結合している、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記第１の細胞表面マーカーまたは前記第２の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記第１の細胞表面マーカーが、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１またはＲＯＲ１を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが異なる、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが同一である、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記標的化ドメインが、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
  48. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外小胞内にある、請求項３８に記載の方法。
  49. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項３８に記載の方法。
  50. 前記少なくとも１つの治療薬が前記細胞外ドメインに結合している、請求項３８に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの治療薬が、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載の方法。
  52. 前記治療用ポリヌクレオチドが、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である、請求項３８に記載の方法。
  54. 前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項３８に記載の方法。
  56. 前記マイクロチャネルエレクトロポレーションまたは前記ナノチャネルエレクトロポレーションが、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して前記細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む、請求項３８に記載の方法。
  59. 前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項３８に記載の方法。
  60. 少なくとも１つの細胞外小胞を含む組成物であって、
    ａ．抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む少なくとも１つのアダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、
    ｂ．前記アダプターポリペプチドと複合体化された前記抗体であって、前記抗体は免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに特異的に結合する、抗体と、
    ｃ．少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドと
    を含む、組成物。
  61. 前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体または、Ｆｃ－ε受容体である、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む、請求項６１に記載の組成物。
  63. 前記Ｆｃ受容体がＣＤ６４である、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに結合している、請求項６０に記載の組成物。
  65. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項６０に記載の組成物。
  66. 前記第１の細胞表面マーカーが、ＬＩＬＲＡ ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む、請求項６０に記載の組成物。
  67. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが異なる、請求項６４に記載の組成物。
  68. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが同一である、請求項６４に記載の組成物。
  69. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項６０に記載の組成物。
  70. 前記ヒト化モノクローナル抗体がＩｇＧである、請求項６９に記載の組成物。
  71. 前記ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ３を含む、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項６０に記載の組成物。
  73. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項７０に記載の組成物。
  74. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項７０に記載の組成物。
  75. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項６０に記載の組成物。
  76. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外ドメインに結合している、請求項６０に記載の組成物。
  77. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
  78. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が、エンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前記Ｓタンパク質である、請求項７８に記載の組成物。
  80. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体を含む、請求項６０に記載の組成物。
  81. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項８０に記載の組成物。
  82. 対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記医薬組成物が請求項６０～８１のいずれか１項に記載の組成物を含む、方法。
  83. 前記医薬組成物が少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記対象に、前記治療有効量の前記医薬組成物を少なくとも１日に１回、週に１回、月に１回、または年に１回の頻度で投与する、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記医薬組成物が水性製剤である、請求項８２に記載の方法。
  86. 前記医薬組成物が注射用に製剤化される、請求項８２に記載の方法。
  87. 前記医薬組成物を、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｌｌａｒｌｙ）、側脳室内、実質内（ｉｎｔｒａｐｅｒｅｎｃｈｙｍａｌｌｙ）、皮下、鼻腔内、またはそれらの組み合わせで前記対象に投与する、請求項８２に記載の方法。
  88. 組成物を製造する方法であって、前記方法が、
    ａ．アダプターポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、前記アダプターポリペプチドが、Ｆｃ受容体と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含み、前記Ｆｃ受容体が抗体のＦｃ領域を認識する、ステップと、
    ｂ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が前記アダプターポリペプチドを発現し、前記アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、前記細胞外小胞が少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、
    ｃ．前記抗体を前記細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、前記抗体が免疫細胞に関連する第１の細胞表面マーカーに結合する、ステップと
    を含む、方法。
  89. 前記Ｆｃ受容体がＦｃ－γ受容体、Ｆｃ－α受容体またはＦｃ－ε受容体である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記Ｆｃ受容体がＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）またはＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記Ｆｃ受容体がＣＤ６４である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記免疫細胞に関連する第２の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが前記細胞外ドメインに結合している、請求項８８に記載の方法。
  93. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項８８に記載の方法。
  94. 前記第１の細胞表面マーカーが、ＬＩＬＲＡ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２８を含む、請求項８８に記載の方法。
  95. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが異なる、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記第１の細胞表面マーカーと前記第２の細胞表面マーカーとが同一である、請求項９２に記載の方法。
  97. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体を含む、請求項９２に記載の方法。
  98. 前記抗体がＩｇＧである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項８８に記載の方法。
  101. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記抗体の前記Ｆｃ領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項１００に記載の方法。
  103. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが、前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項８８に記載の方法。
  104. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外ドメインに結合している、請求項８８に記載の方法。
  105. 前記少なくとも１つのウイルス模倣ペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と少なくとも７０％同一のペプチド配列を含む、請求項８８に記載の方法。
  106. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、またはスパイク（Ｓ）タンパク質を含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質が前記Ｓタンパク質である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体を含む、請求項８８に記載の方法。
  109. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項８８に記載の方法。
  111. 前記マイクロチャネルエレクトロポレーションまたは前記ナノチャネルエレクトロポレーションが、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して前記細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む、請求項８８に記載の方法。
  114. 前記少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項８８に記載の方法。
  115. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、除核細胞、神経幹細胞、未熟樹状細胞、および免疫細胞からなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
  116. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、動物初代細胞、ヒト初代細胞、動物細胞株およびヒト細胞株からなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
  117. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、遺伝子改変された動物初代細胞、遺伝子改変されたヒト初代細胞、遺伝子改変された動物細胞株、および遺伝子改変されたヒト細胞株からなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
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