JP2023536665A - アダプターポリペプチドおよびその使用方法 - Google Patents

アダプターポリペプチドおよびその使用方法 Download PDF

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Abstract

細胞外小胞の組成物、ならびに細胞外小胞を産生する方法およびシステムが本明細書に記載される。細胞外小胞を使用する方法も本明細書に記載される。本開示は、体内の異なる細胞および器官、ならびに疾患または障害に関連する細胞を含む、多種多様な細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞を提供する。場合によっては、本明細書で提供される細胞外小胞は、標的に特異的に結合するように容易に改変することができる。例えば、それらは、細胞表面マーカーに結合する細胞外ドメイン(例えば、細胞外小胞の膜内の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン)を含み得る。一般に、本明細書で提供される細胞外小胞は、細胞外ドメインと、必要に応じて、細胞表面マーカーに結合する膜貫通ドメインとを有するアダプターポリペプチドを含む。

Description

[関連出願の相互参照]
本出願は、2020年8月5日に出願された米国仮出願第63/061,749号の利益を主張するものである。優先権は、米国特許法第119条(35 U.S.C.§119)に従って主張される。上記の特許出願は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
細胞外小胞は、多種多様な細胞型によって分泌される。一般に、エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞は膜に結合しており、治療用カーゴで負荷され得る。例えば、エキソソームは、ほとんどの真核細胞によって分泌される膜結合細胞外小胞の一種である。エキソソーム生合成は、エンドソームの陥入を多胞体内にくびり切って腔内小胞を形成することから始まり得る。多胞体が細胞の原形質膜と融合すると、腔内小胞はエキソソームとして放出され得る。微小小胞は、細胞膜表面から出芽する。一方、アポトーシス小体は、死細胞から放出される。エキソソーム、微小小胞、およびアポトーシス小体は、インビボまたはインビトロ、例えば細胞培養で放出され得る。
細胞外小胞は、治療薬を封入および送達するためのビヒクルとして研究されてきた。細胞外小胞の大部分が肝臓、脾臓、および/または腎臓で分解されるため、細胞外小胞を標的に向けることは一般に困難である。また、標的化送達のための治療薬を封入するための細胞外小胞の設計および製造は、時間がかかり高額である。例えば、ある細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞は、別の細胞型を効果的に標的としない場合がある。したがって、複数の細胞型を標的とするように容易に改変することができる細胞外小胞が依然として必要とされている。標的化された細胞に送達される十分な量および品質の治療薬を封入することができる細胞外小胞も依然として必要とされている。
概要
本開示は、体内の異なる細胞および器官、ならびに疾患または障害に関連する細胞を含む、多種多様な細胞型を標的とするように設計された細胞外小胞を提供する。場合によっては、本明細書で提供される細胞外小胞は、標的に特異的に結合するように容易に改変することができる。例えば、それらは、細胞表面マーカーに結合する細胞外ドメイン(例えば、細胞外小胞の膜内の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン)を含み得る。一般に、本明細書で提供される細胞外小胞は、細胞外ドメインと、必要に応じて、細胞表面マーカーに結合する膜貫通ドメインとを有するアダプターポリペプチドを含む。
本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、細胞外小胞が、10-9M未満またはそれに等しい解離定数(Kd)で抗体のFc領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、抗体は罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、抗体と、少なくとも1つの治療薬とを含む、組成物である。いくつかの態様では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載され、前述の細胞外小胞は、抗体のFc領域を特異的に認識するFc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチド(ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む)と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の抗体(ここで、前述の抗体は罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する)と、少なくとも1つの治療薬とを含む。いくつかの態様では、前述の受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の罹患細胞ががん細胞または非がん性病変細胞である。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、EGFR、PD-L1またはROR1を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体は、ヒト化抗EGFR抗体クローンC225、ヒト化抗ROR1抗体クローン2A2、およびヒト化抗PD-L1抗体クローンSP142からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がIgGを含む。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体から放出されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞がエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の対象ががんまたは非がん性病変を有する。いくつかの態様では、前述の対象が神経膠腫を有する。いくつかの態様では、前述の対象が筋ジストロフィを有する。いくつかの態様では、前述の筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の対象が網膜疾患を有する。いくつかの態様では、前述の網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも6ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1週間に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、Fc受容体が抗体のFc領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも1つの治療薬を含む、ステップと、抗体を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、抗体が罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFc-γ受容体、Fc-α受容体またはFc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)またはFcγRIII(CD16)である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーまたは第2の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、EGFR、PD-L1またはROR1を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの場合、10-9M未満またはそれに等しい解離定数(Kd)で抗体のFc領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチド(ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む)と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の抗体(ここで、前述の抗体は免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する)と、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドとを含む少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、抗体のFc領域に結合するFc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、抗体は免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに特異的に結合する、抗体と、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドとを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、LILRA 4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体がIgGである。いくつかの態様では、前述の抗体がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質は、エンベロープ(Envelopment)(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前述のSタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合には、対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも6ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1週間に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、本明細書に記載される組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、Fc受容体が抗体のFc領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、抗体を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、抗体が免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFc-γ受容体、Fc-α受容体またはFc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、LILRA 4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の抗体がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の抗体がIgGを含む。いくつかの態様では、前述の抗体がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の抗体がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の抗体のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質は、エンベロープ(Envelopment)(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前述のSタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの態様では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、前述の細胞外小胞が、10-9M未満またはそれに等しい解離定数(Kd)で結合分子のFc領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチド(ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む)と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の結合分子(ここで、前述の結合分子は罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する)と、少なくとも1つの治療薬とを含む、組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの態様では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、前述の細胞外小胞が、結合分子のFc領域を特異的に認識するFc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された結合分子であって、結合分子は罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに特異的に結合する、結合分子と、少なくとも1つの治療薬とを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、EGFR、PD-L1またはROR1を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の結合分子は、ヒト化抗EGFR抗体クローンC225、ヒト化抗ROR1抗体クローン2A2、およびヒト化抗PD-L1抗体クローンSP142からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がIgGを含む。いくつかの態様では、前述のヒト化モノクローナル抗体がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体から放出されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞がエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の対象ががんまたは非がん性病変を有する。いくつかの態様では、前述の対象が神経膠腫を有する。いくつかの態様では、前述の対象が筋ジストロフィを有する。いくつかの態様では、前述の筋ジストロフィは、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の対象が網膜疾患を有する。いくつかの態様では、前述の網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも6ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1週間に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、Fc受容体が結合分子のFc領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも1つの治療薬を含む、ステップと、結合分子を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、結合分子が罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFc-γ受容体、Fc-α受容体またはFc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)またはFcγRIII(CD16)である。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーまたは第2の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、EGFR、PD-L1またはROR1を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞内にある。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬が細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の治療用ポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。いくつかの態様では、前述のマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
いくつかの場合、10-9M未満またはそれに等しい解離定数(Kd)で結合分子のFc領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチド(ここで、前述のアダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む)と、前述のアダプターポリペプチドと複合体化された前述の結合分子(ここで、前述の結合分子は免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する)と、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドとを含む少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、結合分子のFc領域に結合するFc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体であって、結合分子は免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに特異的に結合する、結合分子と、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドとを含む、組成物である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、LILRA 4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子がヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、前述の結合分子がIgGである。いくつかの態様では、前述の結合分子がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質は、エンベロープ(Envelopment)(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前述のSタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。
本明細書に記載されるのは、いくつかの例では、対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、医薬組成物が本明細書に記載される組成物を含む、方法である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの態様では、前述の治療有効量の前述の医薬組成物は、治療有効用量を含む。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を治療有効頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも年1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも6ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1ヶ月に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の対象は、前述の治療有効量の前述の医薬組成物を少なくとも1週間に1回の頻度で投与される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が水性製剤である。いくつかの態様では、前述の医薬組成物が注射用に製剤化される。いくつかの態様では、前述の医薬組成物は、鼻腔内、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。
本明細書に記載されるのは、いくつかの場合では、本明細書に記載される組成物を製造する方法であって、方法は、アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、アダプターポリペプチドは、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、Fc受容体が結合分子のFc領域を認識する、ステップと、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞がアダプターポリペプチドを発現し、アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外小胞が少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、結合分子を細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、結合分子が免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である。いくつかの態様では、前述のFc受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む。いくつかの態様では、前述のFc受容体がCD64である。いくつかの態様では、前述のアダプターポリペプチドがさらに、免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、標的化ドメインは、細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーは、LILRA 4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが異なる。いくつかの態様では、前述の第1の細胞表面マーカーと第2の細胞表面マーカーとが同一である。いくつかの態様では、前述の結合分子がヒト化モノクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がIgGである。いくつかの態様では、前述の結合分子がIgG1またはIgG3を含む。いくつかの態様では、前述の結合分子がアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている。いくつかの態様では、前述の結合分子のFc領域は、酸性環境において、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが細胞外ドメインに結合している。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質は、エンベロープ(Envelopment)(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む。いくつかの態様では、前述のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前述のSタンパク質である。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、またはアポトーシス小体を含む。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの態様では、前述の細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップは、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む。いくつかの態様では、前述の少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである。
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許または特許出願の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて官庁から提供される。
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、例示的な態様を記載する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。
図1は、細胞外小胞表面上のCD64に連結されたモノクローナル抗体(mAb)と腫瘍ホーミングペプチド(THP)とを含む標的化細胞外小胞(「EXO」)の概略図を示す。これらの細胞外小胞(EV)は、腫瘍および病変を標的とすることができ、例示的な標的を図1に列挙する。CD64またはTHP-CD64を有するEVは、ドナー細胞をヒトCD64プラスミドDNAまたはヒトTHP-CD64プラスミドDNAでトランスフェクトして、トランスフェクトしたドナー細胞から分泌されたEV(エキソソームを含む)の表面にヒトCD64またはヒトTHP-CD64のいずれかを発現させることによって生成することができる。CD64は、ヒト化モノクローナル抗体(hmAB)に結合するための生物学的アンカーを提供する。ヒトCD64の細胞外D1-D2ヒンジは、約10-9M(ナノモル濃度)もの高親和性(解離定数(K))でヒトIgG1におけるFcの下部ヒンジ領域に結合する。結合したhmAbが細胞標的を特異的に認識する能力に加えて、小さな腫瘍ホーミングペプチド(THP)による標的化もまた、CD64のN末端に操作することができる。EV(またはエキソソーム)表面上のhmAbおよびTHPの両方の二重標的化は、インビボでの腫瘍および他の病変への標的化および送達を増強する。がん/腫瘍標的化のためのhmAbの例としては、抗hEGFR、例えばセツキシマブ、抗hPD-L1、例えばアテゾリズマブ、および抗ヒト化ROR1が挙げられるが、これらに限定されない。がん/腫瘍標的化のためのTHPの例としては、CKAAKN(CK)、CREKA(CR)、およびARRPKLD(AR)が挙げられるが、これらに限定されない。
図2A~2Dは、更なる腫瘍ホーミングペプチドを有するCD64をコードするプラスミドの例示的な構築物設計を示す。図2A.プラスミドを、それぞれ形質転換およびトランスフェクションのためにアンピシリン耐性(AmpR)およびEGFRマーカーの遺伝子を有するベクターを用いて構築した。機能的CD64は、EF-1αプロモーターによって駆動されるCD64のコード配列(CD64_CDS)によってコードされた。図2B.CD64_CDS(355アミノ酸)は、(i)シグナルペプチド(SP)と、(ii)細胞外領域(D1、D2、およびD3)と、(iii)膜貫通(TM)領域と、(iv)細胞内(IC)ドメインとを含み、THPは、シグナルペプチドと細胞外D1領域との間のギャップに挿入され、CD64のN末端でTHPの発現を可能にした。図2C.THPをFlag(DYKDDDK)リンカーによって細胞外D1のN末端に連結し、CD64のD1-D2ヒンジにおけるFc結合領域のコンフォメーションのブロックを制限した。図2D.選択されたTHP[Flag_対照、CKAAKN(CK)、CREKA(CR)、ARRPKLD(AR)]の例示的なペプチドおよびヌクレオチド配列のリスト。
図3A~3Cは、CD64上へのTHPの添加がヒトIgG(hIgG)との結合親和性にどのように影響を与えないかを示す。図3A.固体支持体上の固定化hIgGに結合し、ELISA基質と反応した異なるTHPを有する精製CD64タンパク質の概略図。K値は、CD64とhIgGとの間の一価モデリングによって決定した。図3B.hIgGおよび組換え野生型CD64(wt_CD64)の親和性指数Kを測定した。図3C.異なる操作されたTHP-CD64タンパク質とhIgGとのの親和性指数Kは、異なるTHP(Flag、CK、CR、AR)を有する操作されたCD64がwt_CD64と比較してnMレベルでmAbとの高い結合親和性に影響を及ぼさないことを示唆した。
図4A~4Bは、THP-CD64および治療用RNAプラスミドによるナノチャネルエレクトロポレーション(NEP)でトランスフェクトしたマウス胚性線維芽細胞(MEF)からの内因性mRNAのEV数および含量を示す。図4A.PBS中の未処理MEF(対照群)、NEPによってTHP-CD64およびヒトTP53プラスミドの両方をトランスフェクトしたMEF、ならびに24時間のNEPによってTHP-CD64およびshKRAS G12D変異プラスミドの両方をトランスフェクトしたMEFによって産生された細胞あたりのEV数。図4B.qRT-PCRによる、未処理およびNEPでトランスフェクトしたMEFによって産生されたEVにおけるTP53 mRNAの倍数変化(fold change)。
図5A~5Dは、THP-CD64発現エキソソームがhIgGとの高い結合親和性を保持したことを示す。図5A.操作されたTHP-CD64を有する精製エキソソームをラテックスビーズによって捕捉し、フローサイトメトリーアッセイのために抗CD64-APC、抗CD63-BV510およびFITCコンジュゲートhIgGと共にインキュベートした概略図。図5B.表面発現のプロファイリングは、CD64発現およびhIgG結合の平均蛍光強度(MFI)を決定するために、シングレットビーズおよびCD63+エキソソーム集団をゲートする標準プロトコルに従った。図5C.CD63+エキソソーム集団内のCD64の表面共発現をFITCのMFIによって決定し、Flag、CK、CRまたはAR THPのいずれかを有する操作されたCD64のエキソソーム発現を確認した。図5D.CD63+エキソソーム集団内のhIgGおよびCD64の表面共発現をFITCのMFIによって決定し、Flag、CK、CRまたはAR THPのいずれかを有するCD64を発現するエキソソームに対するhIgGの高い結合親和性を確認した。
図6は、ヒト膵臓がん細胞株PANC-1由来のがんスフェロイドにおけるリポソームおよびEVの取り込みを示す。Flag-CD64またはCK-CD64プラスミドDNA(CK-CD64)のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞から放出された精製EVを、ヒト化抗EGFR mAb(セツキシマブ)またはhIgGのいずれかと共に製剤化した。がんスフェロイドをPKH67(緑色)標識リポソーム(lipofectamine 3000)および種々のEVで24時間処理し、その後、固定、透過および抗hIgG-TRITC(赤色)およびDAPI(青色)による染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なEVによるがんスフェロイド処置はすべて、蛍光強度および分布に基づいて市販のlipofectamine 3000よりも良好なスフェロイド取り込みを示した。様々なEVの中で、二重標的化EV(CK-CD64-Cet_Exo)は、最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
図7A~7Cは、CK-CD64およびヒト化抗EGFR mAb(セツキシマブ)の二重標的化がPANC-1がんスフェロイド細胞、特にCD24+CD44+亜集団におけるEV取り込みを増強することを示す。図7A.PANC-1がんスフェロイドを形成し、直径約500μmに達するまで一週間培養し、次いで培養培地中の約10個のPKH 67標識エキソソームで24時間処理した。図7B.処理したスフェロイドを単一細胞懸濁物に分解して、フローサイトメトリーを使用したCD24およびCD44の発現によって亜集団を同定した。図7C.CD24lowCD44lowまたはCD24+CD44+亜集団において測定されたPKH67の平均蛍光強度は、それらのEV取り込みを表す。ヒト化抗体結合(セツキシマブ:抗EGFR、アテゾリズマブ:抗PD-L1、またはhIgG)を有するFlag-CD64、CK-CD64、CR-CD64、またはAR-CD64を含有する操作されたEVはすべて、特にCD44+CD24+亜集団について良好な細胞取り込みを示した。抗hEGFR(セツキシマブ)およびCK-CD64を用いた二重標的化EVは、両方のPANC-1細胞亜集団について最良の細胞取り込みを提供した。
図8は、膵臓がんの85%で高度に発現されるROR1をPANC-1から形成されたスフェロイド内で標的化することによって、細胞外小胞の取り込みが増強されることを示す。PANC-1スフェロイドを形成し、直径が300~500μmになるまで1週間安定に培養し、次いで培養培地中の1010個のPKH67標識エキソソームで24時間処理した。
図9は、PANC-1同所性モデルにおけるインビボでのROR1に標的化された細胞外小胞の取り込みの増強を示す。マウス(PANC-1細胞外小胞の異種移植の4週間後)を細胞外小胞溶液(250μl)による1.0E12/50μl(腹腔内)注射で処置し、24時間後に屠殺した。PKH26(励起/発光:535/580nm);GFP(465/540nm);IVIS(落射照明、Bin:(M)1、FOV:22、f2、5s。分布:脳/心臓/肺/肝臓/脾臓/膵臓/腎臓。
図10は、腫瘍組織を貫通することによるROR1に標的化された細胞外小胞の増強された取り込みを示す。抗ROR1標的化は、腫瘍病変における細胞外小胞の取り込みを高めるが、CK_ペプチド細胞外小胞の更新は、flag対照と比較して有意ではない。
図11A~11Dは、COVID-19ワクチン開発のためのエピトープおよび構造予測からのvacosomeおよび5つの提案されたワクチンペプチド(すなわち、スパイク、Sタンパク質、断片)の例示的な設計を示す。図11A.ACE2は、SARS-CoV-2ウイルスの受容体として作用し、それが細胞に感染することを可能にする。図11B.T細胞受容体(TCR)複合体を介した強力なワクチン接種は、CD64のN末端上のペプチドのワクチン接種およびCD64のヒンジD1-D2上の事前負荷された抗αCD3/CD28 mAbによる共刺激によって相乗的に達成することができる。エキソソーム表面上のCD64に融合した様々なウイルスタンパク質断片を過剰発現するエキソソームは、ワクチン(「vacosome」と呼ばれる)として機能することができる。図11C.操作されたCD64とTCRとの間の免疫学的シナプスの形成は、蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いた蛍光タグおよびT細胞表面マーカー染色によって確認することができる。同様に、B細胞(抗αCD19/CD20)および樹状細胞(DC)(抗αLILRA 4)などの抗原提示細胞(APC)を標的とするmAbの同時負荷は、APC-T細胞応答を増強するはずである。図11D.COVID-19のワクチンペプチドとして機能する可能性が高い5つの融合Sタンパク質断片候補をエピトープおよび構造予測から選択する。それらは、ヒト間葉系幹細胞(MSC)およびDCなどのNEPでトランスフェクトしたドナー細胞を介して生成されたvacosome上に発現され得る。
図12A~12Bは、ヒト免疫グロブリンおよび古典的Fc受容体の結合親和性強度を示す。原形質膜に埋め込まれたFc受容体は、下流の活性化または抑制を引き起こすことができる細胞内ドメインまたはサブユニットを含む。図12A.IgG親和性変化バリアントは、非常に高い(濃いオレンジ色)、高い(オレンジ色)、中程度(黄色)、低い(薄い青色)から結合しない(濃い青色)まで、それぞれのヒトFcγ受容体メンバーで強調される。FcRn受容体は、酸性条件下(例えばpH=6)ではIgGサブクラスに結合するが、生理学的条件下、pH=7.4では結合能力を低下させる。図12B.IgEは、FcεRI受容体に対して非常に高い結合親和性を有するが、FcεRII受容体に対しては低い親和性を有する。IgAはFcαRI受容体との結合親和性が低い。***ヒト免疫グロブリンとFcリピーターとの間の結合親和性は、非常に高い+++:約10-9M;高い++:10-9~10-8M;中程度:約10-7M;または低い:>10-7Mのレベルで定数Kとして示される。
図13A~13Dは、NEPにおけるEV放出の動態を示す。図13Aは、NEP後の経時的なEV分泌プロファイルを示す。図13Bは、qPCRによって測定された経時的なEV内のTP53mRNA発現の倍数変化を示す。図13Cは、8時間ごとに回収したEVについてELISAによって測定したEV表面上のCD64発現を示す。図13Dは、NEP後の8時間ごとのEV内のKRASG12D shRNAの発現レベルを示す。
図14A~Cは、TP53mRNA/CD64EVの逐次的NEP(sNEP)設計を示す。図14Aは、(図14A)8時間、(図14B)16時間および(図14C)24時間のsNEP例におけるEV数およびTP53mRNA発現を提供する。Ctrlは、CD64プラスミドによる1回のNEPである。
図15A~Fは、調製されたままの標的化EV(tEV)の特徴付けを提供する。図15Aは、ブランクEV(対照)およびNEPによって得られた操作されたEVのサイズ分布、(図15B)調製されたままのEVのエキソソームバイオマーカー、代表的なEVの(図15C)SEMおよび(図15D)CryoTEM画像を提供する。(図15E)KRASG12D shRNAおよびTP53mRNAについての蛍光標識抗CD64および分子ビーコンを用いたTIRF顕微鏡のILNバイオチップを使用した単一EV捕捉および共局在化の特徴付け、(図15F)CD64タンパク質、KRASG12D shRNA、TP53mRNAを含有するEVの比率、ならびにCD64/KRASG12D shRNAおよびCD64/TP53mRNAの共局在化。
図16A~G、CD64/EV表面上の腫瘍特異的抗体(αhROR1およびαhEGFR)に結合すると、PANC-1細胞におけるEVの細胞内在化を増強できることを示す。図16Aは、CD64flagペプチド上のヒト化抗体の取り込み効率を提供する。図16Bは、CKペプチドによるCD64上のヒト化抗体の取り込み効率を提供する。図16Cは、各製剤による相対的なEV取込みを定量化する。図16Dは、処理なし(Con)、ならびに4時間のIgG_EV、αEGFR_EVおよびαROR1_EV処理によるPANC-1細胞の染色を比較する。図16E~16Fは、αEGFR_EV(図16E)およびαROR1_EV(図16F)についてのPANC-1細胞の3D腫瘍スフェロイドに対するEV取り込みアッセイを提供する。図16Gは、37℃で6時間のヒト血清(50%)による置換アッセイを提供する。
図17A~Dは、TRANSWELL(登録商標)に基づくトランスサイトーシスアッセイおよび結果を示す。図17Aは、アッセイの概略図を提供する。図17Bは、エンドサイトーシスおよびEV分泌を遮断するように選択された様々な阻害剤を提供する(クラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害剤であるpitstop 2;カベオラ媒介エンドサイトーシスの阻害剤であるメチル-β-シクロデキストリン;マイクロピノサイトーシスの阻害剤であるサイトカラシンD;およびエキソソーム分泌の阻害剤であるネチコナゾールを含む)。図17Cは、様々な阻害剤(「ctl」:上部PANC-1細胞における阻害剤を含まない1E10非標的化EV;「Pos ctl」:上部細胞層なし)を使用したPANC-1によるトランスサイトーシスアッセイからのデータを提供する。図17Dは、EV表面上の標的化hmAbを使用してPANC-1によるトランスサイトーシスレベルを比較する。
図18A~Bは、ヒト血清IgGがEV表面上のヒトmAbに影響を及ぼさないことを実証している。図18A~Bは、37℃で6時間ヒト血清(50%)と共にインキュベートし、次いで単層PANC-1細胞で処理したαhEGFR_EV(左パネル)およびαhROR1_EV(右パネル)が、ヒト血清インキュベーション後に同じ標的化能力を維持したことを示す。
図19A~Bは、PANC-1同所性NSマウスにおける標的化EVの生体内分布を示す。図19Aはインビボイメージング(IVIS)を示し、図19Bは脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、および腎臓における発現を示す。
詳細な説明
本開示の好ましい態様を本明細書に示し説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本開示の態様に対する様々な代替態様が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図される。
絶対的または逐次的な用語、例えば、「する」、「しない」、「すべきである」、「すべきでない」、「しなければならない」、「してはならない」、「まず」、「最初に」、「次に」、「続いて」、「前に」、「後に」、「最後に」、および「最終的に」の使用は、本明細書に開示される本態様の範囲を限定することを意味するものではなく、例示としてのものである。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」という用語、またはそれらの変形が詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、「備える(comprising)」という用語と同様に包括的であることを意図している。
本明細書で使用される場合、「または」は、「および」、「または」、または「および/または」を指すことができ、排他的および包括的の両方で使用され得る。例えば、「AまたはB」という用語は、「AまたはB」、「AであるがBではない」、「BであるがAではない」、および「AおよびB」を指すことができる。いくつかの場合、文脈が特定の意味を決めることもある。
本明細書で使用される場合、「少なくとも1つ」、「1つまたはそれを超える」、および「および/または」という語句は、動作において接続的および選言的の両方であるオープンエンド表現である。例えば、「A、BおよびCの少なくとも1つ」、「A、B、またはCの少なくとも1つ」、「A、B、およびCのうちの1つまたはそれを超える」、「A、B、またはCのうちの1つまたはそれを超える」および「A、B、および/またはC」の各表現は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、AとBとを一緒に、AとCとを一緒に、BとCとを一緒に、またはAとBとCとを一緒に、を意味する。
本明細書に記載される任意のシステム、方法、組成物およびプラットフォームはモジュール式であり、逐次的なステップに限定されない。したがって、「第1」および「第2」などの用語は、必ずしも優先順位、重要性の順序、または行為の順序を意味するものではない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内であることを意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、所与の値における慣例に従って、1標準偏差以内または1標準偏差を超えることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容され得る誤差範囲を意味すると仮定されるべきである。
「増加した」、「増加」、または「増加する」という用語は、本明細書では、一般に、静的に有意な量の増加を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「増加した」または「増加する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、基準レベル、標準または対照と比較して少なくとも約10%、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または最大100%(100%を含む)の増加、または10~100%の間の任意の増加を意味する。「増加する」の他の例には、基準レベルと比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍またはそれを超える増加が含まれる。
「減少した」、「減少」、または「減少する」という用語は、本明細書では、一般に、統計的に有意な量の減少を意味するものとして使用される。いくつかの場合、「減少した」または「減少する」とは、基準レベルと比較して少なくとも10%の減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%または最大100%(100%を含む)の減少(例えば、基準レベルと比較して存在しないレベルまたは検出不能なレベル)、または10~100%の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状の文脈において、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。「減少する」の他の例には、基準レベルと比較して、多くとも2分の1、多くとも5分の1、多くとも10分の1、多くとも20分の1、多くとも50分の1、多くとも100分の1、多くとも1000分の1またはそれを超える減少が含まれる。減少は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれを超えるものであり得、好ましくは、所与の疾患を有しない個体について正常範囲内として認められるレベルまで低下する。
本明細書で使用される場合、「細胞」は、一般に、生物学的細胞を指す。細胞は、生存生物の基本的な構造、機能および/または生物学的単位である。細胞は、1つまたはそれを超える細胞を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞(例えば、植物作物、果実、野菜、穀粒、ダイズ、コーン、メイズ、コムギ、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、綿、アサ、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ(hornwort)、ゼニコケ(liverwort)、コケ類由来の細胞)、藻類細胞(例えば、Botryococcus braunii、Chlamydomonas reinhardtii、Nannochloropsis gaditana、Chlorella pyrenoidosa、Sargassum patens C.Agardhなど)、海藻(例えば、ケルプ)、真菌細胞(例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞)、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞(例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など)、脊椎動物由来の細胞(例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物)、哺乳動物由来の細胞(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど)などが挙げられる。細胞は、天然の生物に由来しないときがある(例えば、細胞は、人工細胞と呼ばれることもある、合成的に作製されたものである)。細胞は、細胞株に由来し得る。
「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は、一般に、非ウイルスまたはウイルスベースの方法による細胞への核酸分子の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であり得る。いくつかの場合、核酸分子は非コード配列であり得る。いくつかの場合、トランスフェクション方法は、トランスジェニック動物を作製するために細胞への核酸分子の導入に利用される。そのような技術には、前核マイクロインジェクション、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞、例えば、卵丘細胞もしくは乳腺細胞、または成体、胎児もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換、その後の核移植が含まれ得る。
「ナノエレクトロポレーション」または「ナノチャネルエレクトロポレーション」は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドをナノチャネルにロードし、電界を発生させることによって少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞内に促進することによって、ベクターなどの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることを指す。トランスフェクトされる細胞はナノチャネルの開口部に位置し、ここでナノエレクトロポレーションの電界が細胞膜に細孔を作り出して、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入されることを可能にする。
本明細書で使用される「プラスミド」は、一般に、非ウイルス発現ベクター、例えば遺伝子および/または遺伝子の発現に必要な調節エレメントをコードする核酸分子を指す。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、一般に、ペイロード核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指す。ペイロード核酸分子は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入され得る。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含むことができ、または宿主細胞遺伝子(例えば、宿主細胞DNA)への組み込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。ベクターの例としては、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターを挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ウイルスベクター」は、一般に、別の核酸を細胞内に輸送することができるウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって担持される1つまたはそれを超える遺伝子によってコードされる1つまたはそれを超えるタンパク質の発現を指示することができる。ウイルスベクターの例としては、ガンマ-レトロウイルス、αレトロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の実施形態のいずれかのベクターは、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの外因性、内因性または異種の制御配列を含むことができる。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般に、塩基-糖-リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA))。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸(ATP)、ウリジン三リン酸(UTP)、シトシン三リン酸(CTP)、グアノシン三リン酸(GTP)、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP、またはそれらの誘導体を含み得る。そのような誘導体としては、例えば、[αS]dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATP、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体を指すことができる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例としては、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPを挙げることができるが、これらに限定されない。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一本鎖形態、二本鎖形態、または多鎖形態のいずれかの、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは細胞にとって外因性(例えば異種ポリヌクレオチド)である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは細胞にとって内因性である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは無細胞環境に存在し得る。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは遺伝子またはその断片である。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはDNAである。いくつかの場合、ポリヌクレオチドはRNAである。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。いくつかの場合、ポリヌクレオチドは、1つまたはそれを超える類似体(例えば、変更された骨格、糖または核酸塩基)を含む。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。類似体のいくつかの非限定的な例としては、5-ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、7-デアザ-GTP、フルオロフォア(例えば、糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン)、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、CpGアイランド、メチル-7-グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ケウオシンおよびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される1つまたは複数の遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、非コードRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、無細胞DNA(cfDNA)および無細胞RNA(cfRNA)を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される。本明細書に記載されるヌクレオチドまたは核酸は、修飾された核酸、核酸類似体、修飾された糖、糖類似体、修飾された核酸結合、骨格リン酸修飾、またはそれらの組み合わせを含むように修飾することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。いくつかの場合、ポリペプチドは、コードするオープンリーディングフレームから翻訳されるか、またはその成熟形態にプロセシングされる完全長ポリペプチドを指す。いくつかの場合、ポリペプチドまたはペプチドは、タンパク質の分解断片またはプロセシング断片であり得、それでもなお特定のタンパク質に固有にまたは同定可能にマッピングされるものである。いくつかの場合、ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸の単一の線状ポリマー鎖であり得る。ポリペプチドは、例えば、炭水化物の添加、リン酸化などによって修飾することができる。本明細書で使用される場合、「断片」という用語または同等の用語は、タンパク質の全長未満を有し、必要に応じてタンパク質の機能を維持するタンパク質の部位を指すことができる。
「同一性パーセント」および「同一性%」は、2つの配列(ヌクレオチドまたはアミノ酸)がアラインメント中の同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は、配列番号YとX%同一である」とは、配列番号Yに対するアミノ酸配列の同一性%を指し、アミノ酸配列中の残基のX%が配列番号Yに開示されている配列の残基と同一であると精緻に表現される。一般に、そのような計算にはコンピュータプログラムが用いられる。配列の対を比較およびアラインメントする例示的なプログラムとしては、ALIGN、FASTA、ギャップBLAST、BLASTP、BLASTN、またはGCGが挙げられる。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合することができる抗体断片、例えばFab、F(ab’)2、Fv、一本鎖抗体(scFv)、ダイアボディ(diabody)、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体などを包含する。いくつかの場合、抗体の結合ドメインは、抗体の結合ドメインまたは非抗体結合ドメインを含む、抗原に特異的に結合する任意のドメインである。いくつかの場合、抗体結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体または腫瘍抗原に対する抗体などの腫瘍細胞に結合する。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、またはそれらの抗原結合断片、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL)であり得る。いくつかの場合、非抗体足場の結合ドメインは、リポカリン、アンチカリン(anticalin)、「Tボディ(T-body)」、アフィボディ(affibody)、ペプチボディ、DARPin、アフィマー、アビマー、ノッチン、モノボディ、アフィニティークランプ、エクトドメイン、受容体エクトドメイン、受容体、サイトカイン、リガンド、免疫サイトカイン、セントリイン(centryin)、T細胞受容体、または組換えT細胞受容体であり得る。いくつかの場合、抗体構築物の結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の抗原結合ドメインであり、軽鎖および重鎖を含む。いくつかの場合、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断などによって改変された抗体などの誘導体化抗体である。抗体は、脱フコシル化または脱グリコシル化などによって改変することもできる。
「モノクローナル抗体」および「mAb」という用語は、本明細書では互換的に使用され、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。いくつかの場合、抗体の実質的に均一な集団から得られる個々のモノクローナル抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異を除いて同一である。いくつかの場合、腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体は、腫瘍抗原抗体の軽鎖および腫瘍抗原抗体の重鎖を含む。いくつかの場合、モノクローナル抗体は、免疫細胞(免疫細胞抗原)の表面上の抗原に結合し、抗免疫細胞抗原抗体の軽鎖および抗免疫細胞抗原抗体の重鎖を含む。いくつかの場合、モノクローナル抗体は、抗原提示細胞(APC抗原)の表面上に存在する抗原に特異的に結合し、APC抗原に結合する抗APC抗原抗体の軽鎖および抗APC抗原抗体の重鎖を含む。
本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む分子を指す。抗体断片の例としては、Fab、Fab、F(ab’)2、Fv断片、および一本鎖可変断片(scFv);ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。パパインで抗体を消化すると、各々単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名される残留「Fc」断片とが生じる。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるF(ab’)2断片が得られる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する1つまたはそれを超える可変領域および定常領域を有するすべての抗体を含む。いくつかの場合、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する(「完全ヒト抗体」と呼ばれる)。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、NSOもしくはCHO細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、または宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体など、組換え方法によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有し得る。いくつかの場合、組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異に供されている。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、それらに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部がその初期形態から変化して、それをよりヒト免疫グロブリンに類似させた抗体である。いくつかのバージョンでは、重(H)鎖および軽(L)鎖定常(C)領域がヒト配列で置き換えられている。これは、可変(V)領域および異種免疫グロブリンC領域を含む融合ポリペプチドであり得る。いくつかのバージョンでは、相補性決定領域(CDR)は非ヒト抗体配列を含むが、Vフレームワーク領域もヒト配列に変換されている。いくつかのバージョンでは、V領域は、ヒトおよびマウスV領域のコンセンサス配列を設計し、コンセンサス配列間で異なるCDR外の残基を変換することによってヒト化される。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、対象の体外で起こる事象を説明するために使用される。「エクスビボ」アッセイは、対象に対して行うことができない。むしろ、それは対象とは別の試料に対して行われる。エクスビボは、対象の体外のインタクトな細胞において生じる事象を説明するために使用される。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、実験試薬を保持するための容器に収容され、その材料が得られる生物学的供給源生物から分離されて起こる事象を説明するために使用される。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が使用される細胞ベースのアッセイを包含し得る。インビトロアッセイはまた、インタクトな細胞が使用されない無細胞アッセイを包含し得る。
本明細書で使用される場合、「微小環境」は、本明細書に記載される細胞外小胞によって標的化される細胞が位置する細胞外環境を指す。いくつかの場合、微小環境は、プロテアーゼならびに他の可溶性タンパク質および因子が位置する細胞外空間を有し得る。微小環境は、例えば、血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス(ECM)を含み得る。
「処置する」または「処置」とは、治療的処置および防止的または予防的手段の両方を指すことができ、この目的は、標的化される病理学的状態または障害を防止または減速(軽減)することである。処置を必要とする者には、既に障害を有する者、ならびに障害を有する傾向がある者、または障害を防止すべき者が含まれる。治療上の利益は、処置されている障害の根絶または処置されている障害の症状の改善を指すことができる。また、治療上の利益は、対象が依然として根底にある障害に罹患する可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、根底にある障害に関連する1つまたはそれを超える生理学的症状の根絶または改善によって達成され得る。予防的効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させる、防止する、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発症を遅延させる、もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を減速させる、停止させる、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。予防的利益のために、特定の疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の1つまたはそれを超えるものを報告する対象は、疾患の診断がなされていなくても、処置を受けることができる。
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一般に、医薬組成物、例えば、本明細書に記載される組成物を含む医薬組成物の量であって、医薬組成物を必要とする対象への投与時に所望の活性をもたらすのに十分な量を指す。本開示の文脈内で、「治療上有効」という用語は、本開示の方法によって処置される障害の少なくとも1つの症状の発現を遅延させ、進行を停止させ、軽減または緩和するのに十分な医薬組成物の量を指す。
「薬学的に許容され得る担体」、「薬学的に許容され得る賦形剤」、「生理学的に許容され得る担体」または「生理学的に許容され得る賦形剤」という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容され得る材料、組成物、またはビヒクルを指す。成分は、医薬製剤の他の成分と適合性であるという意味で「薬学的に許容され得る」。それはまた、合理的な利益/リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の組織または器官と接触して使用するのに適し得る。
「医薬組成物」という用語は、希釈剤または担体などの他の化学成分を含む本明細書に開示される組成物を指す。医薬組成物は、対象への投与を容易にすることができる。経口、注射、エアロゾル、非経口、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が当該技術分野に存在する。
「患者」または「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、哺乳動物を包含する。哺乳動物の非限定的な例としては、哺乳動物クラスの任意のメンバー:ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物;ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜;ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物が挙げられる。
概要
本開示は、抗体と複合体化することができる少なくとも1つのアダプターポリペプチド(例えば、Fc受容体、CD64)を発現する細胞外小胞の設計および産生に関する。抗体は、抗体によって認識および結合され得る細胞表面マーカー(例えば、抗体に対する抗原)を発現する細胞に細胞外小胞を誘導および標的化することができる。細胞表面マーカーを発現する細胞は、罹患細胞であり得る。いくつかの場合、細胞表面マーカーを発現する細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、非がん性病変細胞、損傷組織の一部としての細胞、健康な組織の一部としての細胞、または免疫細胞である。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、標的化された細胞における細胞外小胞の標的化および蓄積を増強するための更なる標的化ドメインを含むようにさらに操作することができる。この標的化ドメインは、アダプターポリペプチドに複合体化された抗体によって標的化されたものと同じ標的化された細胞によって発現される同じまたは異なる細胞表面マーカーに結合することができる。細胞外小胞は、アダプターポリペプチドを、異なる細胞によって発現される異なる細胞表面マーカーを標的とする別の抗体と複合体化することによって、異なる細胞(例えば、異なる細胞型、罹患細胞)または異なる細胞マーカーを標的とするように構成することができる。細胞外小胞は、標的化された細胞に送達される治療薬などのペイロードを運ぶように設計することができる。細胞外小胞によって送達される治療薬には、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物もしくはがん薬物、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
本開示はまた、少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含み、治療用ポリヌクレオチド(例えば、治療用メッセンジャーRNA)などの大量かつ高品質の治療薬を含む細胞外小胞を産生する方法を提供する。本明細書に記載されるいくつかのアプローチは、ナノエレクトロポレーションによって少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞内にトランスフェクトすることを含み、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのアダプターポリペプチドおよび/または少なくとも1つの治療薬に転写および/または翻訳される。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、抗体のFc領域と複合体化することができるFc受容体またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、ナノエレクトロポレーションによって刺激されて、大量の治療薬(例えば、治療用mRNA)を含む多数の細胞外小胞を産生および分泌する。分泌された細胞外小胞は、Fc領域を含む任意の抗体と複合体化することができ、複合体化された抗体は、複合体化された抗体によって認識および結合され得る第1の細胞表面マーカーを発現する標的化された細胞に細胞外小胞を標的化および誘導する。少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、同じ標的化された細胞によって発現される第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含むことができる。したがって、二重標的化ドメイン(例えば、抗体および標的化ドメイン)を含む細胞外小胞の標的化された細胞における蓄積は、抗体、標的化ドメイン、またはそれらの組み合わせによる標的化を伴わない細胞外小胞の蓄積と比較して増加し得る。
細胞外小胞
細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。細胞外小胞を産生する方法も本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体と、少なくとも1つの治療薬とを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、細胞表面タンパク質のペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、CD63表面タンパク質と少なくとも70%同一のペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、別の細胞表面タンパク質と少なくとも70%同一のペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、ROR1、PD-L1、EpCAM、EGFR、EGFRIII、EGFRVIII、GPC1、GPC3、DLL3、L1CAM、GLASTおよびCD138の群から選択される細胞表面タンパク質と少なくとも70%同一のペプチドを含む。
いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、抗体のFc領域を認識および結合するFc結合ドメイン、Fc受容体、またはその断片のペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%同一のペプチド配列を含む。ある特定の場合、細胞外小胞表面タンパク質はFc受容体である。Fc受容体には、Fc-γ受容体、Fc-α受容体、またはFc-ε受容体が含まれる。例示的なFc受容体としては、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb1(CD32b)、FcγRIIb2(CD32b)、FcγRIIc1(CD32c)、FcγRIIc2(CD32c)、FcγRIIc3(CD32c)、FcγRIIc4(CD32c)、FcγRIIc5(CD32c)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn、DC-SIGN、またはplgRが挙げられる。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載されるFc受容体のいずれか1つのペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)のFc受容体のいずれか1つのペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、Fc受容体FcγRI(CD64)のペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも2つのアダプターポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも2つのアダプターポリペプチドのうちの1つは、Fc結合ドメイン、Fc受容体、またはその断片のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも2つのアダプターポリペプチドのうちの1つは、CD47またはその断片のペプチド配列を含む。いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、第1および第2のアダプターポリペプチドを含み、第1のアダプターポリペプチドは、Fc結合ドメイン、Fc受容体またはその断片のペプチド配列を含み、第2のアダプターポリペプチドは、CD47またはその断片のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、Fc結合ドメイン、Fc受容体またはその断片を含むペプチド配列を含むアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、標的化された細胞によって発現される第1の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、細胞外ドメインに結合し、標的化ドメインは、第1の細胞表面マーカーを発現する同じ標的化された細胞によって発現される第2の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、細胞外ドメインに結合した標的化ドメインは、同じ標的化された細胞によって発現される第2の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、標的化された細胞は、健康な組織の一部としての細胞または免疫細胞である。場合によっては、標的化された細胞は罹患細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は、がん細胞、腫瘍細胞、非がん性病変細胞、または損傷組織の一部としての細胞である。いくつかの場合、標的化された細胞によって発現される第1および第2の細胞表面マーカーは同一である。いくつかの場合、標的化された細胞によって発現される第1および第2の細胞表面マーカーは異なる。
場合によっては、抗体および標的化ドメインの両方が、標的化された細胞によって発現される第1および第2の細胞表面マーカーにそれぞれ結合する。ある特定の場合、抗体および標的化ドメインは、第1および第2の細胞表面マーカーに同時に結合する。ある特定の場合、抗体および標的化ドメインは、第1および第2の細胞表面マーカーに逐次的に結合する。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドとの複合体化から解放され(すなわち、もはや第1の細胞表面マーカーに結合していない)、一方、標的化ドメインは、第2の細胞表面マーカーに結合したままである。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの場合、エキソソームは、Fc結合ドメイン、Fc受容体またはその断片のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドを含む。Fc結合ドメイン、Fc受容体またはその断片を含むアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか1つのFc領域と複合体化することができる。いくつかの場合、アダプターペプチドは、標的化ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド(THP)、組織ホーミングペプチド、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの場合、標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドまたは腫瘍ホーミングペプチドである。いくつかの場合、標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド(THP)である。いくつかの場合、標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドである。
いくつかの場合、第1の細胞表面マーカーは、本明細書に記載される抗体によって認識および結合され得る本明細書に記載される細胞表面マーカー(例えば、抗原またはその断片)のいずれか1つであり得る。いくつかの場合、第2の細胞表面マーカーは、標的化ドメインによって認識および結合され得、第1の細胞表面マーカーと同じであっても異なっていてもよい。いくつかの場合、第2の細胞表面マーカーは、細胞の表面上に発現される任意の高分子またはタンパク質であり得る。いくつかの場合、第2の細胞表面マーカーは、特定の組織の細胞によって発現される。いくつかの場合、第2の細胞表面マーカーは、がん性細胞または非がん性病変細胞によって発現される。第2の細胞表面マーカーの非限定的な例としては、血管受容体、フィブロネクチン受容体、CD44、CD24、ESA、SSEA1、CD133、CD34、CD19、CD38、CD26、CD166、またはCD90が挙げられる。
場合によっては、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞の蓄積よりも高い。場合によっては、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、またはそれよりも高い。ある特定の場合、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積よりも高い。場合によっては、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む細胞外小胞の蓄積は、第1および第2の細胞表面マーカーを発現する細胞における、少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞の蓄積と比較して、少なくとも2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、またはそれよりも高い。
アダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される抗体の抗体断片または結合ドメインのいずれか1つを含む。いくつかの場合、抗体はFc領域に融合され、Fc領域はアダプターポリペプチドによって認識される。場合によっては、Fc領域は、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMを含む。いくつかの場合、Fc領域は、IgA、IgDまたはIgGを含む。場合によっては、Fc領域はIgGを含む。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であり得る。場合によっては、Fc領域は、IgG1またはIgG3を含む。いくつかの場合、本明細書に記載される抗体は、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドと複合体化されるIgG1またはIgG3を含むFc領域を含む。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドの抗体のFc領域への非共有結合的な複合体化を介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含む。場合によっては、アダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合した少なくとも1つの標的化ドメインを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド(THP)、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの場合、組織標的化ドメインは、組織ホーミングペプチドである。
場合によっては、少なくとも1つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、この腫瘍ホーミングペプチドは、がん性細胞を標的とする。場合によっては、少なくとも1つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、この腫瘍ホーミングペプチドは、腫瘍(スフェロイド腫瘍など)の一部として細胞を標的とする。場合によっては、少なくとも1つの標的化ドメインは、腫瘍ホーミングペプチドであり、ここで、腫瘍ホーミングペプチドは、非がん性病変細胞を標的とする。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5またはそれを超える標的化ドメインを含む。場合によっては、少なくとも2つの標的化ドメインは同一であり得る。いくつかの場合、少なくとも2つの標的化ドメインは異なり得る。標的化ドメインは、アダプターポリペプチドのN末端に複合体化され得る。代替案として、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドのC末端に複合体化され得る。場合によっては、標的化ドメインは、アダプターポリペプチドに組み込まれ得る。いくつかの場合、標的化ドメインは、ペプチドリンカーを介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、リンカーペプチドは、5個~200個のアミノ酸を含む。他の場合において、リンカーペプチドは、5個~25個のアミノ酸を含む。場合によっては、リンカーペプチドは、剛性(例えば、(EAAAK)1~3、A(EAAAK)ALEA(EAAAK)A、PAPAP、AEAAAKEAAAKA、または(AP)10~34)、可撓性(例えば、(GGGGS)1~4もしくは(Gly)6~8)、または切断可能(例えば、VSQTSKLTR↓AETVFPDV、PLG↓LWA、RVL↓AEA、EDVVCC↓SMSY、GGIEGR↓GS、TRHRQPR↓GWE、AGNRVRR↓SVG、RRRRRRR↓R↓R、もしくはGFLG↓)であり得る。いくつかの場合、リンカーペプチドは、DYKDDDDKのペプチド配列を含むFLAGリンカーである。ある特定の場合、FLAGリンカーは、YKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDKのペプチド配列を含む3×FLAGリンカーであり得る。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも1つの腫瘍ホーミングペプチドを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超える腫瘍ホーミングペプチドを含む。場合によっては、少なくとも2つの腫瘍ホーミングペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも2つの腫瘍ホーミングペプチドは異なる。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドのN末端に融合される。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドのC末端に融合される。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、腫瘍ホーミングペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50または100個のアミノ酸を含む。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはCDX(FKESWREARGTRIERG)ペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはCREKAペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはCKAAKNペプチドである。いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドはARRPKLDペプチドである。他の例示的な腫瘍ホーミングペプチドとしては、肺がん(SVSVGMKPSPRP、PRPSPKMGVSVS、TDSILRSYDWTY、CSNIDARAC、およびARRPKLDを含む)、胃がん(CGNSNPKSC、GRRTRSRRLRRS、CTKNSYLMC、およびAADNAKTKSFPVを含む)、膵臓がん(CRGRRST、CRSRKG、およびCKAAKNを含む)、前立腺がん(FRPNRAQDYNTN、IAGLATPGWSHWLAL、CREAGRKAC、およびCAGRRSAYCを含む)、扁平上皮癌(squamous carcinoma)(CSRPRRSEC、CGKRK、およびCDTRLを含む)、黒色腫(TAASGVRSMH、LTLRWVGLMS、CVNHPAFAC、およびCLSDGKRKCを含む)、肝細胞癌(KSLSRHDHIHHH、およびSFSIIHTPILPLを含む)、結腸がん(CPHSKPCLC、CPIEDRPMC、CTPSPFSHC、およびVHLGYATを含む)、膀胱がん(CSNRDARRCおよびCQDGRMGFCを含む)、乳がん(CREKAを含む)、神経膠腫(LWATFPPRPPWLおよびLLADTTHHRPWTを含む)、卵巣がん(CDGLGDDC、CDGWGPNC、およびRLLDTNRPLLPYを含む)、ならびに頭頸部がん(TSPLNIHNGQKLおよびSPRGDLAVLGHKYを含む)を標的とするものを挙げることができる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも1つの組織標的化ドメインを含み、これは、アダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を特定の組織に標的化および誘導する。いくつかの場合、組織標的化ドメインは、組織ホーミングドメインである。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超える組織標的化ペプチドを含む。場合によっては、少なくとも2つの組織標的化ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも2つの組織標的化ペプチドは異なる。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドのN末端に融合される。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドのC末端に融合される。いくつかの場合、組織標的化ペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、組織標的化ペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50または100個のアミノ酸を含む。内皮組織または心臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、SIGYPLP、LSIPPKA、FQTPPQL、LTPATAI、CNIWGVVLSWIGVFPEC、NTTTH、VHPKQHR(四量体)、CRKRLDRNCCRTLTVRKC、CLWTVGGGC、QPWLEQAYYSTF、YPHIDSLGHWRR、LLADTTHHRPWT、SAHGTSTGVPWP、VPWMEPAYQRFL、TLPWLEESYWRP、HWRR、CSTSMLKAC、DDTRHWG、CARPAR、CKRAVR、CRSTRANPC、CPKTRRVPC、CSGMARTKC、またはCRPPRが挙げられる。膵臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CRVASVLPC、SWCEPGWCR、LSGTPERSGQAVKVKLKAIP、CHVLWSTRCCVSNPRWKC、またはLSALPRTが挙げられる。腎臓組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CLPVASC、ELRGD(R/M)AX(W/L)、GV(K/R)GX3(T/S)RDXR、HITSLLSHTTHREPまたはANTPCGPYTHDCPVKRが挙げられる。肺組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CGFELETCCGFECVRQCPERC、QPFMQCLCLIYDASCRNVPPIFNDVYWIAF、VNTANST、CTSGTHPRC、またはSGEWVIKEARGWKHW-VFYSCCPTTPYLDITYHが挙げられる。腸組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、YSGKWGW、LETTCASLCYPSYQCSYTMPHPPVVPPHPMTYSCQY、YPRLLTP、CSQSHPRHC、CSKSSDYQC、CKSTHPLSC、CTGKSCLRVG、SFKPSGLPAQSL、またはCTANSSAQCが挙げられる。脳組織を標的とする例示的な組織標的化ドメインとしては、CLSSRLDAC、GHKAKGPRK、HAIYPRH、THRPPMWSPVWP、HLNILSTLWKYRC、CAGALCY、CLEVSRKNC、RPRTRLHTHRNR(D-aa)、ACTTPHAWLCG、GLAHSFSDFARDFV、GYRPVHNIRGHWAPG、TGNYKALHPHNG、CRTIGPSVC、CTSTSAPYC、CSYTSSTMC、CMPRLRGC、TPSYDTYAAELR、RLSSVDSDLSGC、CAQK、またはSGVYKVAYDWQHを挙げることができる。様々な組織を標的とする更なる例示的な組織標的化ドメインとしては、LMLPRAD(副腎を標的とする)、CSCFRDVCC(網膜を標的とする)、CRDVVSVIC(網膜を標的とする)、CVALCREACGEGC(皮膚皮下脈管構造を標的とする)、GLSGGRS(子宮を標的とする)、WYRGRL(軟骨を標的とする)、CPGPEGAGC(乳房脈管構造を標的とする)、SMSIARLVSFLEYR(前立腺を標的とする)、GPEDTSRAPENQQKTGC(皮膚ランゲルハンスを標的とする)、CKGGRAKDC(白色脂肪脈管構造を標的とする)、CARSKNKDC(創傷または損傷組織を標的とする)、CHAQGSAEC(胸腺を標的とする)、LEPRWGFGWWLKLSTHTTESRSMV(耳もしくは蝸牛組織を標的とする)、ACSTEALRHCGGGS(網膜血管を標的とする)またはASSLNIA(筋肉組織を標的とする)が挙げられる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超える細胞透過性ペプチドを含む。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドを含むアダプターポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。場合によっては、少なくとも2つの細胞透過性ペプチドは同一である。いくつかの場合、少なくとも2つの細胞透過性ペプチドは異なる。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのN末端に融合される。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのC末端に融合される。いくつかの場合、細胞透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、細胞透過性ペプチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸を含む。細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、DSLKSYWYLQKFSWR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、KSKTEYYNAWAVWERNAP、GNGEQREMAVSRLRDCLDRQA、HTPGNSNKWKHLQENKKGRPRR、DWLKAFYDKVAEKLKEAF、R9GPLGLAGE8、Ac-GAFSWGSLWSGIKNFGSTVKNYG、RLRWR、LGQQQPFPPQQPY、ILGKLLSTAAGLLSNL、TFFYGGSRGKRNNFKTEEY、Ac-LRKLRKRLLRX-Bpg-G、Ac-LRKLRKRLLR、またはMVRRFLVTLRIRRACGPPRVRVが挙げられる。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5またはそれを超えるウイルス膜タンパク質またはその断片を含む。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質を含むアダプターポリペプチドは、標的化された細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる細胞外小胞の速度を増加させる。場合によっては、少なくとも2つのウイルス膜タンパク質は同一である。いくつかの場合、少なくとも2つのウイルス膜タンパク質は異なる。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質はアダプターポリペプチドのN末端に融合される。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドのC末端に融合される。いくつかの場合、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドの任意のペプチド位置に組み込まれ得る。場合によっては、ウイルス膜タンパク質は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸を含む。ウイルス膜タンパク質の非限定的な例としては、赤血球凝集素、糖タンパク質41、エンベロープタンパク質、VSV G、HSV01 gB、エボラウイルス糖タンパク質、または融合関連小膜貫通(FAST)タンパク質が含まれる。
いくつかの場合、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの治療薬を含む。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリペプチドである。場合によっては、治療薬は治療用化合物である。いくつかの場合、治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含むがん薬物である。場合によっては、細胞外小胞は複数の治療薬を含み、複数の治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は少なくとも1つの治療薬を含み、少なくとも1つの治療薬は細胞外小胞の細胞外表面に発現される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療薬は、少なくとも1つの治療薬をアダプターポリペプチドに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される。場合によっては、少なくとも1つの治療薬は発現され、細胞外小胞の膜内に挿入される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療薬は細胞外小胞内にある。
いくつかの場合、細胞外小胞は、任意の膜結合粒子であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、細胞によって分泌される任意の膜結合粒子であり得る。場合によっては、細胞外小胞は、インビトロで産生される任意の膜結合粒子であり得る。場合によっては、細胞外小胞は、細胞なしで産生される任意の膜結合粒子であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポトソーム(apoptosome)、オンコソーム(oncosome)、エクソファー(exopher)、エンベロープウイルス、エキソマー(exomere)、または他の非常に大きな細胞外小胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームである。
いくつかの場合、細胞外小胞は、約10nm~約10,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、約10nm~約50nm、約10nm~約100nm、約10nm~約500nm、約10nm~約1,000nm、約10nm~約5,000nm、約10nm~約10,000nm、約50nm~約100nm、約50nm~約500nm、約50nm~約1,000nm、約50nm~約5,000nm、約50nm~約10,000nm、約100nm~約500nm、約100nm~約1,000nm、約100nm~約5,000nm、約100nm~約10,000nm、約500nm~約1,000nm、約500nm~約5,000nm、約500nm~約10,000nm、約1,000nm~約5,000nm、約1,000nm~約10,000nm、または約5,000nm~約10,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nmまたは約10,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nmまたは約5,000nmの直径を有することができる。いくつかの場合、細胞外小胞は、最大で約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nmまたは約10,000nmの直径を有することができる。
抗体
抗体と複合体化された少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの場合、抗体は、アダプターポリペプチドと抗体のFc領域との間の非共有結合的な複合体化を介してアダプターポリペプチドに複合体化される。いくつかの場合、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化すると、抗体は、細胞によって発現される細胞表面マーカーに結合することによって細胞外小胞を細胞に誘導する。いくつかの場合、抗体は、罹患細胞によって発現される細胞表面マーカーに結合することによって細胞外小胞を罹患細胞に誘導する。いくつかの場合、罹患細胞はがん細胞である。場合によっては、罹患細胞は非がん性病変細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は腫瘍細胞である。場合によっては、細胞表面マーカーは、がん細胞または非がん性病変細胞に関連する抗原である。本明細書に記載される抗体によって認識および結合され得るがん細胞または非がん性病変細胞に関連する例示的な細胞表面マーカーとしては、1-40-β-アミロイド、4-1BB(CD137)、5AC、5’-ヌクレオチダーゼ、5T4、活性化F9、F10、アクチビン受容体様キナーゼ1、ACVR2B、腺癌抗原、α-フェトプロテイン、アミロイド、アンジオポエチン2、アンジオポエチン3、炭疽毒素、保護抗原、AOC3(VAP-1)、AXL、B7-H3、炭疽菌(Bacillus anthracis anthrax)、BAFF、BAFF-R、BCMA、βアミロイド、Bリンパ腫細胞、C1s、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(模倣(imitation))、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチドα、Canis lupus familiaris IL31、炭酸脱水酵素9(CA-IX)、心筋ミオシン、CCL11(エオタキシン-1)、CCR2、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD123、CD125、CD134、CD147(ベイシジン)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD19、CD3E、CD2、CD20、CD200、CD22、CD23(IgE受容体)、CD25(IL-2受容体のα鎖)、CD27、CD276、CD278、別名ICOS、CD28、CD3、CD3ε、CD30(TNFRSF8)、CD319、CD33、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD41(インテグリンα-IIb)、CD44 v6、CD45、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CD97B、CEA、CEACAM5、CEA関連抗原、CFD、CGRP、クローディン18アイソフォーム2、CLDN18.2、Clostridium difficile、クランピング因子A、c-Met、凝固因子III、補体C5a、MCSF、CSF1、CSF1R、CSF2、CTGF、CTLA-4、CXCR 4(CD184)、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質B、ダビガトラン、樹状細胞関連レクチン2、DLL3、DLL4、DPP4、DR5、大腸菌(E.coli)志賀毒素1型、大腸菌志賀毒素2型、エボラウイルス糖タンパク質、EGFL7、EGFR、EGFR細胞外ドメインIII、EGFR、cMet、EGFR、HER1、EGRF、ERBB1 HER1、エンドグリン、エンドトキシン、EpCAM、EPHA3、エフリン受容体A3、エピシアリン(episialin)、ERBB3(HER3)、ERBB3、HER3、大腸菌(Escherichia coli)、呼吸器多核体ウイルスのFタンパク質、FAP、FCGRT、FGF23、FGFR2、フィブリンII、β鎖、フィブロネクチンエクストラドメイン-B、葉酸ヒドロラーゼ、葉酸受容体1、葉酸受容体α、Frizzled受容体、GCGR、GD2ガングリオシド、GDF-8、ゼラチナーゼB、グリピカン3、GMCSF、GMCSF受容体α鎖、GPNMB、GPRC5D、CD3、成長分化因子8、GUCY2C、赤血球凝集素、B型肝炎表面抗原、B型肝炎ウイルス、HER1、HER2、HER2/neu、HER2/neu、CD3、HGF、HGFR、HHGFR、ヒストン複合体、HIV-1、HLA-DR?、HNGF、Hsp90、ヒト散乱因子受容体キナーゼ(human scatter factor receptor kinase)、ヒトTNF、ヒトβアミロイド、ICAM-1、ICOSL、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc領域、IGF-1受容体(CD221)、IGF1、IGF2、IGF1R、CD221、IGHE、IL 17A、IL 17AおよびIL 17F、IL 20、IL 3受容体、IL-1、IL-12、IL-13、IL-17、IL17AおよびIL17 F、IL1A、IL1β、IL2、IL-22、IL23、IL23A、IL31RA、IL-4、IL-4 Rα、IL-5、IL-6、IL6受容体、IL-6受容体、IL6R、IL-6R、IL9、ILGF2、インフルエンザAウイルス赤血球凝集素、インテグリンα4β7、インテグリンα4、インテグリンα4β7、インテグリンα5β1、インテグリンαIIbβ3、インテグリンαvβ3、インテグリンβ7、インターフェロンγ、インターフェロン受容体、インターフェロンα/β受容体、インターフェロンγ誘導タンパク質、インターロイキン1α、インターロイキン13、インターロイキン17α、インターロイキン17α、TNF、インターロイキン17A、ITGA2(CD49b)、ITGB2(CD18)、カリクレイン、KIR2D、LAG3、ルイスY抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、リポテイコ酸、LIV-1、LOXL 2、LRRC15、L-セレクチン(CD62L)、LTA、LYPD3、MASP-2、MCAM、MCP-1、メソテリン、MIF、MS4A1、MSLN、MST1R(別名RON)、ムチンCanAg、粘膜アドレシン細胞接着分子、ミエリン関連糖タンパク質、ミオスタチン、NACP、NCA-90(顆粒球抗原)、ネクチン-4、神経アポトーシス制御プロテイナーゼ1、NGF、NGNAガングリオシド、NKG2A、NOGO-A、Notch 1、Notch受容体、NRP1、OX-40、oxLDL、PCDC1、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDCD1、CD279、PDGF-Rα、PDGFRA、PD-L1、リン酸-ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、血小板由来成長因子受容体β、前立腺癌細胞、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、緑膿菌III型分泌系、PTK 7、狂犬病ウイルスG糖タンパク質、RANKL、呼吸器多核体ウイルス、RGMA、RHD、アカゲザル因子、板根(root plate)特異的スポンジン3、ROR1、RSV融合糖タンパク質、RSVFR、RTN4、スクレロスチン、SDC1、セレクチンP、血清アミロイドAタンパク質、血清アミロイドP成分、SLAMF7、SLITRK6、SOST、スフィンゴシン-1-リン酸、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、黄色ブドウ球菌α毒素、黄色ブドウ球菌2成分ロイコシジン、STEAP1、TAG-72、タウタンパク質、T細胞受容体、TEM1、テネイシンC、TFPI、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ、TIGIT、TNFRスーパーファミリーメンバー4、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAP、TROP-2、TSLP、腫瘍抗原CTAA16.88、MUC1の腫瘍特異的グリコシル化、TWEAK受容体、TYRP1(糖タンパク質75)、VEGF-A、VEGF-AおよびAng-2、VEGFR-1、VEGFR2、ビメンチン、VSIR、VWFまたはザイールエボラウイルス糖タンパク質が挙げられる。場合によっては、本明細書に記載される抗体によって認識および結合される細胞表面マーカーは、EGFR、PD-L1、またはROR1を含む。
場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される抗体の抗体断片または結合ドメインのいずれか1つを含む。いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体は、本明細書に記載される1つもしくはそれを超えるFc結合ドメインまたはFc受容体またはその断片に結合するペプチド配列を含むFc領域を含む。Fc領域は抗体由来であり得る。抗体のFc領域は、免疫グロブリン、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMのクラスから選択することができる。いくつかの異なるクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2などのアイソタイプにさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応するFcの重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμであり得る。軽鎖は、カッパすなわちκおよびラムダすなわちλのいずれか1つであり得る。Fc領域は、抗体の種類に応じて、いくつかのFcドメイン、CH1、CH2、CH3およびCH4を含む。
免疫グロブリンIgA、IgD、IgE、IgG、またはIgMを含むFc領域を含む任意の抗体を、Fc結合ドメイン、Fc受容体、またはその断片を含むアダプターポリペプチドと複合体化することができる。いくつかの場合、Fc領域はIgG1アイソタイプを有する。いくつかの場合、Fc領域はIgG2アイソタイプを有する。いくつかの場合、Fc領域はIgG3アイソタイプを有する。いくつかの場合、Fc領域はIgG4アイソタイプを有する。いくつかの場合、Fc領域は、2つまたはそれを超えるアイソタイプ由来の定常領域を含むハイブリッドアイソタイプを有する。アダプターポリペプチドと複合体化される抗体は、Fcドメインを含む任意の抗体または抗原結合断片を含むことができる。本明細書に記載されるアダプターポリペプチドと複合体化される例示的な抗体は、セツキシマブ(クローンC225を含む)、アテゾリズマブ、抗PD-L1(クローンSP142を含む)または抗ROR1 mAb(クローン2A2を含む)を含む。
いくつかの場合、Fc領域は、本明細書に記載されるFc結合ドメイン、Fc受容体またはその断片のいずれか1つを含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドに対するKを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Fc領域は、Fc受容体またはその断片を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドに対するKを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Fc受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb1(CD32b)、FcγRIIb2(CD32b)、FcγRIIc1(CD32c)、FcγRIIc2(CD32c)、FcγRIIc3(CD32c)、FcγRIIc4(CD32c)、FcγRIIc5(CD32c)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn、DC-SIGN、またはplgRを含む。いくつかの場合、Fc領域は、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb1(CD32b)、FcγRIIb2(CD32b)、FcγRIIc1(CD32c)、FcγRIIc2(CD32c)、FcγRIIc3(CD32c)、FcγRIIc4(CD32c)、FcγRIIc5(CD32c)、FcγRIIIA(CD16a)またはFcγRIIIB(CD16b)を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドに対するKを有するペプチド配列を含む。いくつかの場合、Fc領域は、FcγRI(CD64)を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドに対するKを有するペプチド配列を含む。
いくつかの例では、Fc領域は、野生型Fc領域と比較して、野生型Fc領域を含む対応する抗体と比較して少なくとも1つの定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を変更するように改変されたペプチド配列を有する。例えば、解離定数(K)の変化に対して決定されるように、Fc受容体への少なくとも1つのFc媒介結合を減少または増加させるために、Fc領域をアミノ酸置換によって改変することができる。
いくつかの場合、本明細書に記載される抗体のいずれか1つは、改変されていないFcドメインを含む抗体と比較して、少なくとも1つのFc領域に媒介される生物学的エフェクター機能を増加させるように改変されたFc領域を含み得る。例えば、野生型Fc領域を含む対応する抗体よりも高い親和性で本明細書に記載されるFc結合ドメインまたはFc受容体のいずれか1つに結合する改変されたFc領域を有する本明細書に記載される抗体。そのような改変されたFc領域は、当業者に公知の方法に従って生成することができる。場合によっては、本明細書に記載されるFc領域は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超えるアミノ酸改変を有するペプチド配列を含む。
場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、野生型Fcと、同じFc結合ドメインまたはFc受容体との間の結合のKと比較して、本明細書に記載されるFc結合ドメインまたはFc受容体のいずれか1つに対する結合の減少したKを示す。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、6.5~8.4のpH範囲にわたって、野生型Fcと、同じFc結合ドメインまたはFc受容体との間の結合のKと比較して、本明細書に記載されるFc結合ドメインまたはFc受容体のいずれか1つに対する減少したKを示す。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、酸性pHまたは酸性微小環境において、Fc受容体を含むアダプターポリペプチドと複合体化するように構成される。
場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、野生型Fcと、同じFc結合ドメインまたはFc受容体との間の結合のKと比較して、本明細書に記載されるFc結合ドメインまたはFc受容体のいずれか1つに対する結合の増加したKを示す。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、6.5~8.4のpH範囲にわたって、野生型Fcと、同じFc結合ドメインまたはFc受容体との間の結合のKと比較して、本明細書に記載されるFc結合ドメインまたはFc受容体のいずれか1つに対する増加したKを示す。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸改変を含むFc領域は、酸性pHまたは酸性微小環境において、Fc受容体を含むアダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成される。
Fc結合
場合によっては、Fc結合ドメインまたはFc受容体を含むアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか1つのFc領域と複合体化することができる。いくつかの場合、Fc結合ドメインは、抗体のFc領域に結合するFc受容体の断片である。例示的なFc受容体としては、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb1(CD32b)、FcγRIIb2(CD32b)、FcγRIIc1(CD32c)、FcγRIIc2(CD32c)、FcγRIIc3(CD32c)、FcγRIIc4(CD32c)、FcγRIIc5(CD32c)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR、FcRn、DC-SIGN、またはplgRが挙げられる。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)のFc受容体のいずれか1つのペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、Fc受容体FcγRI(CD64)のペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、抗体のFc領域に結合する細菌タンパク質を含むFc結合ドメインを含む。いくつかの場合、Fc結合ドメインは、プロテインA、プロテインG、プロテインL、プロテインZ、プロテインLG、プロテインLA、プロテインAG、またはそれらの断片を含む。いくつかの場合、Fc結合ドメインは、ペプチドまたはペプチド模倣体を含む。例示的なFc結合ペプチド配列またはペプチド模倣体としては、TWKTSRISIF、FGRLVSSIRY、EPIHRSTLTALL HWRGWV、HYFKFD、HFRRHL、HWCitGWV、D2AAG、DAAG、シクロ[(Nα-Ac)-Dap(A)-RWHYFK-Lact-E]、シクロ[(Nα-Ac)-Dap(A)-RWHYFK-Lact-E]、シクロ[Link-M-WFRHYK]、NKFRGKYK、NARKFYKG、FYWHCLDE(1)、FYCHWALE(2)、FYCHTIDE、RRGW、KHRFNKD、APAR、PAM、Fc-lll、FcBP-1、FcBP-2、Fc-III-4C、FcRMが挙げられる。
治療用カーゴ
いくつかの場合、少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞が本明細書に記載される。場合によっては、少なくとも1つの治療薬は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞内にトランスフェクトされた少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクター(例えば、プラスミド)によってコードされる治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドによって標的化および結合された細胞によって治療用ポリペプチドに翻訳され得る核酸配列を含む。
いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1、2、5、10、50、100、500、1,000、またはそれを超えるコピーの治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドを含み、少なくとも2つの治療用ポリヌクレオチドは異なる。いくつかの場合、細胞外小胞によって封入された少なくとも2つの異なる治療用ポリヌクレオチドは、異なる比を含む。例えば、2つの異なる治療用ポリヌクレオチドの第1と第2との比は、1:1,000、1:500、1:100、1:50、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、または1:1であり得る。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、mRNA、rRNA、SRP RNA、tRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、gRNA、aRNA、crRNA、lncRNA、miRNA、ncRNA、piRNA、siRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドはmRNAを含む。いくつかの場合、mRNAはインタクトであり、すなわちタンパク質の全長をコードする。いくつかの場合、mRNAはタンパク質の一部をコードする。いくつかの場合、mRNAは、少なくとも100、200、500、1,000、5,000、またはそれを超えるRNAヌクレオチドを含む。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドはDNAを含む。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードするベクター(例えば、プラスミド)などのDNAを含む。
場合によっては、細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用ポリヌクレオチドの少なくとも1、2、3、5、10、100、またはそれを超えるコピーである。場合によっては、細胞外小胞に封入されたRNAを含む治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用ポリヌクレオチドの少なくとも1、2、3、5、10、100、またはそれを超えるコピーである。場合によっては、細胞外小胞に封入された治療用メッセンジャーRNAを含む治療用ポリヌクレオチドのコピー数は、治療用メッセンジャーRNAの少なくとも1、2、3、5、10、100、またはそれを超えるコピーである。
場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬)のコピー数は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬)のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する(すなわち、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクトする)ことによって細胞外小胞に封入された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。
場合によっては、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞内に封入された治療用ポリヌクレオチド(例えば、RNA治療薬)は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞内に封入された治療用ポリヌクレオチドと比較してよりインタクトである。例えば、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたより多くのコピーの治療用RNAは、標的化された細胞によって治療用ポリヌクレオチド内に翻訳され得るインタクトなまたは完全長メッセンジャーRNAである。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなRNA治療薬のコピー数は、他のトランスフェクション方法によってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなRNA治療薬のコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞から産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなRNA治療薬のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する(すなわち、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクトする)ことから産生された細胞外小胞に封入されたインタクトなRNA治療薬のコピー数と比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。
場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用ポリペプチドを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたはベクター(例えば、プラスミド)によってコードされる。
いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって翻訳されて、少なくとも1つの治療用ポリペプチドを得ることができる。いくつかの場合、治療用ポリペプチドは、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドに結合している。いくつかの場合、治療用ポリペプチドは細胞外小胞の膜に挿入される。いくつかの場合、治療用ポリヌクレオチドによってコードされる治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞によって封入され得る。いくつかの場合、細胞外小胞は、ナノエレクトロポレーションされたベクター(例えば、プラスミド)によってコードされる治療用ポリヌクレオチドおよび治療用ポリペプチドの両方を封入することができる。いくつかの場合、細胞外小胞はエキソソームであり得る。
場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも1つの治療用化合物を含むことができる。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用化合物は、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドのいずれか1つによって複合体化または固定される。いくつかの場合、少なくとも1つの治療用化合物は細胞外小胞内にある。例示的な治療用化合物としては、がん薬物が挙げられる。
細胞外小胞による処置
本明細書に記載される細胞外小胞を含む治療有効量の組成物または医薬組成物を投与することによって対象の疾患を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと、本明細書に記載される少なくとも1つの治療薬とを含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、本明細書に記載される抗体のいずれか1つのFc領域と複合体化されるFc受容体を含む。いくつかの場合、アダプターポリペプチドはさらに、腫瘍ホーミングペプチド、組織ホーミングペプチド、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片を含む標的化ドメインを含む。場合によっては、抗体および標的化ドメインはそれぞれ、罹患細胞に関連する第1および第2の細胞表面マーカーに結合し、罹患細胞に結合すると、細胞外小胞は少なくとも1つの治療薬を罹患細胞に送達する。いくつかの場合、罹患細胞はがん細胞である。いくつかの場合、罹患細胞は非がん性病変細胞である。場合によっては、罹患細胞は腫瘍細胞である。場合によっては、少なくとも1つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みは、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含まない細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みと比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みは、アダプターポリペプチドを含まない細胞外小胞によって送達される治療薬の標的化された細胞の取り込みと比較して、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、またはそれを超えて増加する。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体および標的化ドメインを含む細胞外小胞によって送達される治療薬の取り込みが増加した標的化された細胞は、がん性細胞、非がん性病変細胞、腫瘍の一部としての細胞、または組織の一部としての細胞である。
いくつかの場合、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるようなアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて疾患を処置する方法である。いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞で腫瘍を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、腫瘍を処置する方法は、細胞外小胞を介して、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを腫瘍細胞に送達することを含む。本明細書に記載される方法で処置され得る腫瘍細胞の非限定的な例としては、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、肝臓がん、乳がんまたは脳がんの細胞が挙げられる。いくつかの場合、細胞外小胞によって標的化されるがん細胞は、がん幹細胞などのがん細胞集団内の亜集団を表す。
いくつかの場合、疾患の処置を必要とする対象に、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を投与することによって疾患を処置する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、毎日(daily)、毎日(every day)、1日おき、週に5日、週に1回、隔週、月に2週間、月に3週間、月に1回、月に2回、月に3回、またはそれよりも多く投与される。アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、2年、3年、またはそれより長い期間にわたって投与することができる。
対象の状態が改善する場合、投与されるアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の用量は、一定期間(すなわち、「休薬日」)、一時的に減少させるか、または一時的に中断することができる。場合によっては、休薬期間の長さは、2日間~1年間の間で変動し、例としてのみ、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間、15日間、20日間、28日間、35日間、50日間、70日間、100日間、120日間、150日間、180日間、200日間、250日間、280日間、300日間、320日間、350日間、または365日間が挙げられる。休薬期間中の用量減少は、例としてのみ、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%を含めて、10%~100%であり得る。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む有効量の細胞外小胞を必要とする対象に、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む有効量の細胞外小胞を、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、9週間に1回、10週間に1回、11週間に1回、12週間に1回、またはより長期間にわたって1回投与することができる。
対象の疾患または疾患に関連する状態の改善が起こったら、必要に応じて細胞外小胞の維持用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、症状の関数として、改善された疾患、障害または状態が維持されるレベルまで減少させることができる。
いくつかの場合、そのような量に対応するアダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の量は、疾患の重症度、処置を必要とする対象または宿主の正体(例えば、重量)などの因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、例えば、投与される特定の細胞外小胞、投与経路、および処置される対象または宿主を含む事例を取り巻く特定の状況に従って当該技術分野で公知の方法で日常的に決定される。場合によっては、所望の用量は、好都合には、単回用量で、または同時に(または短期間にわたって)もしくは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、1日あたり2、3、4またはそれを超える部分用量として提示される。いくつかの場合、投与量は、対象におけるグレード3またはグレード4の有害事象の発生または重症度によって少なくとも部分的に決定することができる。
個々の処置レジメンに関する変数の数は多く、これらの推奨値からかなり逸脱することも珍しくないため、上記の範囲は単なる示唆的なものに過ぎない。そのような投与量は、使用される化合物の活性、処置される疾患または状態、投与様式、個々の対象の要件、処置される疾患または状態の重症度、および実施者の判断に限定されないいくつかの変数に応じて変更される。
いくつかの場合、そのような処置レジメンの毒性および治療有効性は、限定されないが、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定される。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50とED50との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投与量を製剤化する際に使用される。そのような化合物の投与量は、最小の毒性でED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
細胞外小胞の産生
いくつかの場合、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を産生するための方法およびシステムが本明細書に記載される。いくつかの場合、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドおよび少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生するための方法およびシステムも本明細書に記載される。
いくつかの場合、本方法は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの場合、ベクターはプラスミドである。場合によっては、細胞内に導入された少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの標的化ドメインをコードする。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドをコードする。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療用ポリペプチドをコードする。
場合によっては、少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドが同じ細胞内に導入され、第1の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのアダプターポリペプチドをコードする第1のベクター(例えば、プラスミド)を含む。いくつかの場合、同じ細胞内に導入された第2の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの治療用ポリヌクレオチドまたは少なくとも1つの治療用ポリペプチドをコードする第2のベクター(例えば、プラスミド)を含む。第1および第2の異種ポリヌクレオチドは、同時にまたは逐次的に同じ細胞内に導入することができる。いくつかの場合、第1および第2の異種ポリヌクレオチドは、同じトランスフェクション方法によって同じ細胞内に導入することができる。いくつかの場合、第1および第2の異種ポリヌクレオチドは、異なるトランスフェクション方法によって同じ細胞内に導入することができる。
いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入することができる。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって本明細書に記載される細胞内に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、トランスフェクションの生物学的、化学的または物理的方法によって細胞内に移入することができる。
目的の異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための生物学的トランスフェクション方法は、DNAおよびRNAベクターの使用を含み得る。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を非ヒト哺乳動物細胞内に挿入するための最も広く使用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、いくつかの場合、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来する。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター(HSV)が挙げられる。場合によっては、レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV、MMLV、MuLV、もしくはMLV)またはマウス幹細胞ウイルス(MSCV)ゲノムに由来するベクターなどのガンマ-レトロウイルスベクターが挙げられる。場合によっては、レトロウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ゲノムに由来するものなどのレンチウイルスベクターも挙げられる。場合によっては、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9血清型を含む。場合によっては、ウイルスベクターは、2つまたはそれを超えるウイルスからのウイルス部分を含むキメラウイルスベクターである。更なる例では、ウイルスベクターは組換えウイルスベクターである。
異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのトランスフェクションの化学的方法としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系であって、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含むものを挙げることができる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化されたナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチドの送達など、核酸の最先端の標的化された送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)内への核酸の導入のために、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合している。脂質と会合した核酸は、いくつかの場合、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体化し、脂質を含有する溶液中に分散し、脂質と混合し、脂質と組み合わさり、脂質中に懸濁物として包含され、ミセルに包含されるかもしくはミセルと複合体化し、または他の方法で脂質と会合する。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、いくつかの場合、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造で存在する。あるいは、それらは単に溶液中に散在し、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する場合もある。脂質は、いくつかの場合、天然に存在する脂質または合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用に適した脂質は、商業的供給元から入手される。例えば、いくつかの場合、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma社(ミズーリ州セントルイス在)から入手され、いくつかの場合、リン酸ジセチル(「DCP」)は、K&K Laboratories社(ニューヨーク州プレインビュー在)から入手され、コレステロール(「Choi」)は、いくつかの場合、Calbiochem-Behring社から入手され、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、多くの場合、Avanti Polar Lipids,Inc.社(アラバマ州バーミンガム)から入手される。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、多くの場合、約-20℃で保存される。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、多くの場合、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とする。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に自己再編成(self-rearrangement)を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質とを捕捉する(Ghoshら、1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、いくつかの場合、ミセル構造をとるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する。lipofectamine-核酸複合体も企図される。
異種ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのトランスフェクションの物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃(particle bombardment)、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理または化学的浸透を挙げることができる。エレクトロポレーションとしては、マイクロフルイディクスエレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションが挙げられる。ある特定の場合、細胞外小胞細胞は、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドまたは少なくとも1つのベクター(例えば、プラスミド)は、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、基材(substrate)の表面に結合させることができる。いくつかの場合、基材はバイオチップを含む。いくつかの場合、基材の表面は金属材料を含む。いくつかの場合、基材は金属材料を含む。金属材料の非限定的な例としては、アルミニウム(Al)、インジウムスズ酸化物(ITO、In:SnO)、クロム(Cr)、ガリウムヒ素(GaAs)、金(Au)、モリブデン(Mo)、有機残留物およびフォトレジスト、白金(Pt)、ケイ素(Si)、二酸化ケイ素(SiO)、シリコンオンインシュレータ(SOI)、窒化ケイ素(Si)タンタル(Ta)、チタン(Ti)、窒化チタン(TiN)、タングステン(W)が挙げられる。いくつかの場合、金属材料を処理またはエッチングしてアレイまたはチャネルを作製することができる。いくつかの場合、金属表面は、リン酸(HPO)、酢酸、硝酸(HNO)、水(HO)、塩酸(HCl)、(HNO)、硝酸セリウムアンモニウム((NHCe(NO、クエン酸(C)、過酸化水素(H)、王水、ヨウ素溶液、硫酸(HSO)、フッ化水素酸(HF)、水酸化カリウム(KOH)、エチレンジアミンピロカテコール(EDP)、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)、緩衝酸化物、フッ化アンモニウム(NHF)、SC1、Cl、CCl、SiCl、BCl、SiCl、BCl3、CCl、CF、O、CF、SF、NF、CHF、またはそれらの組み合わせで処理またはエッチングすることができる。
いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、金属表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞を成長させ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ABS、ポリアミド、ポリエチレンコポリマー、エポキシ、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、フェノール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンコポリマー、フッ素化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、シリコーン、天然ゴム、ラテックス、ポリウレタン、スチレンブタジエンゴム、フルオロカーボンコポリマーエラストマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアリールエーテルケトン、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、PBT、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリテトラフルオロエチレン、酸化ベリリウムなどのポリマー製の基質の表面に結合させることができる。いくつかの場合、ポリマー製の表面は、少なくとも1つの細孔を有する半透性であり得る。場合によっては、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm~約10μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、または約5μm~約10μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、または約10μmであり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、または約5μmの間であり得る。いくつかの実施形態では、半透性ポリマー表面の細孔径は、最大で約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、または約10μmの間であり得る。
いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して親水性を高めることができる。いくつかの場合、ポリマーの表面をガスまたはプラズマで処理して疎水性を高めることができる。金属表面の親水性または疎水性を増加させるための例示的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ナノエレクトロポレーション
いくつかの場合、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって任意の細胞をエレクトロポレーションして、細胞外小胞ドナー細胞になり、本明細書に記載される細胞外小胞を産生することができる。細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の基底レベル分泌よりも高いレベルで細胞外小胞を産生および分泌するように遺伝子改変または操作され得る任意の細胞であり得る。したがって、細胞外小胞の分泌の基底レベルが低いかまたは無視できる程度である細胞は、本明細書に記載される細胞外小胞を産生および分泌するために、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクトすることもできる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は自己細胞であり得る。そのような場合、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される細胞外小胞も受けている、例えば投与されている対象から得られる。いくつかの場合、ドナー細胞は遺伝子改変されている(例えば、EV表面上の標的化ポリペプチドおよび/またはEV中の治療用RNAで遺伝子改変されている)。
いくつかの場合、細胞外ドナー細胞(call)から産生および分泌された細胞外小胞は、T細胞による炎症促進性同種免疫応答を誘導することができ、したがって、細胞外小胞を治療薬として使用することに対する課題を提起する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は同種異系細胞であり得、細胞外小胞ドナー細胞は、同じ種であるが、本明細書に記載される細胞外小胞を受けている対象とは遺伝的に異なる供給源から得られる細胞である。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、同種細胞外小胞を産生および分泌する細胞スタイルであり得る。例えば、間葉系幹細胞(MSC)は、組織適合性遺伝子複合体クラスII(MHC-II)および共刺激分子の発現が欠如しているために低免疫原性を示し、これにより、MSCは、同種細胞外小胞を産生および分泌する親MSCと同様の抗炎症特性および栄養特性を共有する同種細胞外小胞を産生および分泌するための細胞外小胞ドナー細胞として働くことができる。
いくつかの場合、本明細書に記載されるマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、任意の真核細胞であり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株、幹細胞、初代細胞、または分化細胞に由来する細胞であり得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)、ヒト胚性線維芽細胞(HEF)、樹状細胞間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、脱核細胞、神経幹細胞、未熟樹状細胞、および免疫細胞からなる群より選択され得る。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかの遺伝子改変細胞であり得、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入される。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって細胞外小胞内にトランスフェクトされる。いくつかの場合、エレクトロポレーションは、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションを含む。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、ナノチャネルエレクトロポレーションによって細胞外小胞内にトランスフェクトされる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、ナノエレクトロポレーションされた細胞の染色体に組み込まれる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、ナノエレクトロポレーションされた細胞の染色体に組み込まれない。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクトされる。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクトされる。いくつかの場合、トランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株に由来する細胞であり得る。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの場合、ベクターはプラスミドである。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を定常速度または基底速度で連続的に産生および分泌する。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度で細胞外小胞を産生および分泌し、細胞を刺激することによって更なる細胞外小胞を産生および分泌することができる。例えば、細胞外小胞ドナー細胞にヒートショックを行うか、または細胞外小胞ドナー細胞をCa2+と接触させることによって、細胞外小胞ドナー細胞を刺激して、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞にエレクトロポレーションすることによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドの細胞内へのマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドの細胞内へのナノチャネルエレクトロポレーションによって、基底速度よりも速い速度で細胞外小胞を産生および分泌するように刺激され得る。場合によっては、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌する細胞外小胞ドナー細胞の基底速度よりも少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。いくつかの場合、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を産生および分泌するためのナノエレクトロポレーション以外のトランスフェクションの方法によって刺激された細胞外小胞ドナー細胞の速度よりも、少なくとも0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、またはそれを超える速度で細胞外小胞を産生および分泌することができる。
細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞は、遠心分離または超遠心分離によって回収および精製することができ、細胞外小胞は他の細胞残屑または分子から精製される。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞は、本明細書に記載される細胞外小胞以外の他の細胞残屑または分子を連続的に除去することができるタンジェンシャルフローろ過によって回収および精製することができる。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つの治療薬をコードする。いくつかの場合、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。場合によっては、治療薬は治療用ポリペプチドである。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞を産生および分泌する。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つのアダプターポリペプチドおよび少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。
いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクトされた異種ポリヌクレオチドはベクター(例えば、プラスミド)である。いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載されるFc結合ドメイン、Fc受容体、またはその断片のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、細胞外ドメインのペプチド配列を含む。いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合している標的化ドメインのペプチド配列を含む。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の細胞外表面上に発現される少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの治療薬をアダプターポリペプチドに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも1つの治療薬をアダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合させることによって細胞外小胞の表面上に発現される少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の膜に発現および挿入される少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞内にある少なくとも1つの治療薬を含む細胞外小胞を産生および分泌する。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、任意の膜結合粒子である。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、エキソソーム、微小小胞、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポトソーム、オンコソーム、エクソファー、エンベロープウイルス、エキソマー、または他の非常に大きな細胞外小胞である。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞はエキソソームである。
いくつかの場合、金属またはポリマー表面に成長または結合した細胞は、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、本システムは、上側境界および下側境界を有する流体チャンバを備える。流体チャンバ内に細胞を有する基質を配置することにより、上側チャンバおよび下側チャンバが形成される。いくつかの場合、本システムはさらに少なくとも1つのナノチャネルを含む。いくつかの場合、ナノチャネルを基質内に埋め込むことができる。いくつかの場合、ナノチャネルは半透性ポリマー基質の細孔を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm~約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約2μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.01μm~約20μm、約0.01μm~約50μm、約0.01μm~約100μm、約0.01μm~約500μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約2μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.05μm~約20μm、約0.05μm~約50μm、約0.05μm~約100μm、約0.05μm~約500μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約2μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.1μm~約20μm、約0.1μm~約50μm、約0.1μm~約100μm、約0.1μm~約500μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約2μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約0.5μm~約20μm、約0.5μm~約50μm、約0.5μm~約100μm、約0.5μm~約500μm、約1μm~約2μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、約1μm~約20μm、約1μm~約50μm、約1μm~約100μm、約1μm~約500μm、約2μm~約5μm、約2μm~約10μm、約2μm~約20μm、約2μm~約50μm、約2μm~約100μm、約2μm~約500μm、約5μm~約10μm、約5μm~約20μm、約5μm~約50μm、約5μm~約100μm、約5μm~約500μm、約10μm~約20μm、約10μm~約50μm、約10μm~約100μm、約10μm~約500μm、約20μm~約50μm、約20μm~約100μm、約20μm~約500μm、約50μm~約100μm、約50μm~約500μm、または約100μm~約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、約100μm、または約500μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、または約100μmの高さを含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約5μm、約10μm、約20μm、約50μm、約100μm、または約500μmの高さを含む。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは異なり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの高さは、高電界ゾーン(例えば、ナノチャネルの内側)でナノエレクトロポレーションされている分子を加速するのに十分大きくなければならないが、ナノエレクトロポレーションされている大きな分子が短時間の電気パルスですり抜けることを可能にするほど十分小さくなければならない。
いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm~約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm~約0.1nm、約0.01nm~約0.5nm、約0.01nm~約1nm、約0.01nm~約5nm、約0.01nm~約10nm、約0.01nm~約50nm、約0.01nm~約100nm、約0.01nm~約500nm、約0.01nm~約1,000nm、約0.01nm~約5,000nm、約0.01nm~約10,000nm、約0.1nm~約0.5nm、約0.1nm~約1nm、約0.1nm~約5nm、約0.1nm~約10nm、約0.1nm~約50nm、約0.1nm~約100nm、約0.1nm~約500nm、約0.1nm~約1,000nm、約0.1nm~約5,000nm、約0.1nm~約10,000nm、約0.5nm~約1nm、約0.5nm~約5nm、約0.5nm~約10nm、約0.5nm~約50nm、約0.5nm~約100nm、約0.5nm~約500nm、約0.5nm~約1,000nm、約0.5nm~約5,000nm、約0.5nm~約10,000nm、約1nm~約5nm、約1nm~約10nm、約1nm~約50nm、約1nm~約100nm、約1nm~約500nm、約1nm~約1,000nm、約1nm~約5,000nm、約1nm~約10,000nm、約5nm~約10nm、約5nm~約50nm、約5nm~約100nm、約5nm~約500nm、約5nm~約1,000nm、約5nm~約5,000nm、約5nm~約10,000nm、約10nm~約50nm、約10nm~約100nm、約10nm~約500nm、約10nm~約1,000nm、約10nm~約5,000nm、約10nm~約10,000nm、約50nm~約100nm、約50nm~約500nm、約50nm~約1,000nm、約50nm~約5,000nm、約50nm~約10,000nm、約100nm~約500nm、約100nm~約1,000nm、約100nm~約5,000nm、約100nm~約10,000nm、約500nm~約1,000nm、約500nm~約5,000nm、約500nm~約10,000nm、約1,000nm~約5,000nm、約1,000nm~約10,000nm、または約5,000nm~約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約0.01nm、約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nm、または約10,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約0.01nm、約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、または約5,000nmの直径を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約5nm、約10nm、約50nm、約100nm、約500nm、約1,000nm、約5,000nm、または約10,000nmの直径を含む。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は同じであり得る。いくつかの場合、ナノチャネルの直径は異なり得る。
いくつかの場合、ナノチャネルをナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネルは、ナノチャネル間に間隔を置いてナノチャネルアレイに配置することができる。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm~約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm~約0.05μm、約0.01μm~約0.1μm、約0.01μm~約0.5μm、約0.01μm~約1μm、約0.01μm~約5μm、約0.01μm~約10μm、約0.01μm~約50μm、約0.01μm~約100μm、約0.01μm~約500μm、約0.01μm~約1,000μm、約0.01μm~約5,000μm、約0.05μm~約0.1μm、約0.05μm~約0.5μm、約0.05μm~約1μm、約0.05μm~約5μm、約0.05μm~約10μm、約0.05μm~約50μm、約0.05μm~約100μm、約0.05μm~約500μm、約0.05μm~約1,000μm、約0.05μm~約5,000μm、約0.1μm~約0.5μm、約0.1μm~約1μm、約0.1μm~約5μm、約0.1μm~約10μm、約0.1μm~約50μm、約0.1μm~約100μm、約0.1μm~約500μm、約0.1μm~約1,000μm、約0.1μm~約5,000μm、約0.5μm~約1μm、約0.5μm~約5μm、約0.5μm~約10μm、約0.5μm~約50μm、約0.5μm~約100μm、約0.5μm~約500μm、約0.5μm~約1,000μm、約0.5μm~約5,000μm、約1μm~約5μm、約1μm~約10μm、約1μm~約50μm、約1μm~約100μm、約1μm~約500μm、約1μm~約1,000μm、約1μm~約5,000μm、約5μm~約10μm、約5μm~約50μm、約5μm~約100μm、約5μm~約500μm、約5μm~約1,000μm、約5μm~約5,000μm、約10μm~約50μm、約10μm~約100μm、約10μm~約500μm、約10μm~約1,000μm、約10μm~約5,000μm、約50μm~約100μm、約50μm~約500μm、約50μm~約1,000μm、約50μm~約5,000μm、約100μm~約500μm、約100μm~約1,000μm、約100μm~約5,000μm、約500μm~約1,000μm、約500μm~約5,000μm、または約1,000μm~約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、約1,000μm、または約5,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、少なくとも約0.01μm、約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、または約1,000μmであり得る。いくつかの場合、ナノチャネル間の間隔は、最大で約0.05μm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約50μm、約100μm、約500μm、約1,000μm、または約5,000μmであり得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションシステムは、流体チャンバ内に電界を生成するための上部および下部電極層を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm~約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm~約0.5ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約1ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約5ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約10ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約50ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約100ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約500ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約0.1ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約5ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約10ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約50ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約100ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約500ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約0.5ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約5ボルト/mm、約1ボルト/mm~約10ボルト/mm、約1ボルト/mm~約50ボルト/mm、約1ボルト/mm~約100ボルト/mm、約1ボルト/mm~約500ボルト/mm、約1ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約1ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約10ボルト/mm、約5ボルト/mm~約50ボルト/mm、約5ボルト/mm~約100ボルト/mm、約5ボルト/mm~約500ボルト/mm、約5ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約5ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約50ボルト/mm、約10ボルト/mm~約100ボルト/mm、約10ボルト/mm~約500ボルト/mm、約10ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約10ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約100ボルト/mm、約50ボルト/mm~約500ボルト/mm、約50ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約50ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約500ボルト/mm、約100ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約100ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約1,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約500ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約5,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約1,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm~約10,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mm、または約10,000ボルト/mm~約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、約10,000ボルト/mm、または約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約0.1ボルト/mm、約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、または約10,000ボルト/mmの電界強度を含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約0.5ボルト/mm、約1ボルト/mm、約5ボルト/mm、約10ボルト/mm、約50ボルト/mm、約100ボルト/mm、約500ボルト/mm、約1,000ボルト/mm、約5,000ボルト/mm、約10,000ボルト/mm、または約50,000ボルト/mmの電界強度を含む。
場合によっては、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス~約0.05ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約0.1ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.01ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約0.1ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約0.5ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約10ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約50ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約100ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約500ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス~約1,000ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルス、または約1,000ミリ秒/パルス~約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、約0.01ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、約1,000ミリ秒/パルス、または約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、少なくとも約0.01ミリ秒/パルス、約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、または約1,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために電極によって生成される電界は、最大で約0.05ミリ秒/パルス、約0.1ミリ秒/パルス、約0.5ミリ秒/パルス、約1ミリ秒/パルス、約5ミリ秒/パルス、約10ミリ秒/パルス、約50ミリ秒/パルス、約100ミリ秒/パルス、約500ミリ秒/パルス、約1,000ミリ秒/パルス、または約5,000ミリ秒/パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションは、1パルス、2パルス、3パルス、4パルス、5パルス、6パルス、7パルス、8パルス、9パルス、10パルス、11パルス、12パルス、13パルス、14パルス、15パルス、16パルス、17パルス、18パルス、19パルス、20パルスまたはより多くを含む。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドおよび治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を産生する方法およびシステムは、細胞内にナノエレクトロポレーションされる複数の異種ポリヌクレオチド(ベクターなど)をナノチャネルにロードすることを含む。いくつかの場合、ポリヌクレオチド以外の分子(例えば、タンパク質、生体分子、化合物など)をナノチャネルにロードして、細胞にナノエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合、上部電極および下部電極によって生成された電界は、細胞内へ、ベクター(例えば、プラスミド)を加速させる。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションのために生成された電界が膜の細胞に細孔を作り出して、ベクター(例えば、プラスミド)のナノエレクトロポレーションを可能にする。いくつかの場合、細胞外小胞ドナー細胞の膜中の細孔は、焦点、例えば、電界が細胞膜と直接接触するナノチャネルの出口で形成され得る。
いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション(例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、lipofectamineトランスフェクションなど)によってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞よりも、少なくとも10%、50%、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、またはそれを超える細胞外小胞を産生および分泌し得る。
場合によっては、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞は、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌される細胞外小胞と比較して、少なくとも50%、1倍、2倍、5倍、100倍、500倍、1000倍、またはそれを超える治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドは、非ナノエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生および分泌された細胞外小胞によって封入された治療用ポリヌクレオチドよりも、治療用ポリペプチドをコードするためにインタクトである可能性が少なくとも10%高い、20%高い、30%高い、40%高い、50%高い、60%高い、70%高い、80%高い、90%高い、95%高い、99%高いまたはそれよりも高い。
ワクチン
本明細書に記載される細胞外小胞を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの場合、細胞外小胞は、本明細書に記載されるFc受容体のいずれか1つのペプチド配列と40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%同一であるペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドを含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)のFc受容体のいずれか1つのペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。場合によっては、少なくとも1つのアダプターポリペプチドは、Fc受容体FcγRI(CD64)のペプチド配列と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%同一のペプチド配列を含む。いくつかの場合、細胞外小胞は、アダプターポリペプチドと複合体化された抗体を含む。いくつかの場合、抗体は、免疫細胞の第1の細胞表面マーカーに結合する。場合によっては、細胞外小胞はさらに少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドを含む。少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、ウイルス模倣ペプチドが由来するウイルスに対する適応免疫をもたらす免疫応答を誘発することができる。いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合される。
いくつかの場合、アダプターポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合した標的化ドメインを含む。いくつかの場合、標的化ドメインは、同じ免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する。いくつかの例では、免疫細胞は、骨髄系細胞、T細胞、例えばαβ細胞傷害性T細胞、γδT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ヘルパーT細胞、マクロファージ、肥満細胞、食細胞、リンパ系細胞、顆粒球、マクロファージ、または樹状細胞である。いくつかの場合、免疫細胞は、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはナチュラルキラー(NK)細胞である。
場合によっては、第1の細胞表面マーカーは、C 5aR、CD10、CD107、CD11、CD117、CD123、CD125、CD135、CD138/Syndecan-1、CD14、CD16、CD163、CD18、CD19、CD193、CD20、CD203、CD206、CD21、CD22、CD23、CD235、CD25、CD3、CD32、CD33、CD34、CD36、CD38、CD4、CD41、CD42、CD44、CD45、CD45R、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD65、CD68、CD7、CD71、CD8、CD9、CD90/Thy1、CD94、クラスタリン、CXCR3B特異的、F4/80、FcεRI、グリコホリンA、GP9、GZMB、HBE1特異的、HLA-DR、IL3Rα、インテグリンα-4、インテグリンβ-1、インテグリンβ-3、LILRA4、NKp4、P-セレクチン、Siglec-8、またはVEGFR-1/FLT-1を含む。いくつかの場合、第1の細胞表面マーカーは、LILRA 4、CD3、CD19、CD20、またはCD28を含む。
いくつかの場合、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと複合体化された抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、抗体はヒト化抗体である。いくつかの場合、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの場合、抗体はIgGである。いくつかの場合、抗体はIgG1またはIgG3である。いくつかの場合、抗体は、Fc受容体を含むアダプターポリペプチドと複合体化されるFc領域を含む。いくつかの場合、抗体はアダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化される。
いくつかの場合、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、細胞外小胞の細胞外表面上に発現される。いくつかの場合、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、細胞外小胞の膜に部分的に挿入される。いくつかの場合、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合される。いくつかの場合、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドおよび標的化ドメインの両方が、アダプターポリペプチドの同じ細胞外ドメインに結合される。いくつかの場合、少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドは、第1のアダプターポリペプチドの細胞外ドメインに結合され、一方、標的化ドメインは、第2のアダプターポリペプチドの別個の細胞外ドメインに結合される。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、ウイルスのウイルスタンパク質に由来する。ウイルスは、DNAウイルスまたはRNAウイルスであり得る。DNAウイルスは、一本鎖(ss)DNAウイルス、二本鎖(ds)DNAウイルス、またはssおよびds DNA領域の両方を含有するDNAウイルスであり得る。RNAウイルスは、一本鎖(ss)RNAウイルスまたは二本鎖(ds)RNAウイルスであり得る。ssRNAウイルスは、プラスセンスRNAウイルスまたはマイナスセンスRNAウイルスにさらに分類することができる。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドは、コロナウイルス科のコロナウイルスタンパク質に由来する。コロナウイルス科(Coronaviridae family)には、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスが含まれ得る。いくつかの場合、コロナウイルスには、MERS-CoV、SARS-CoVまたはSARS-CoV-2が含まれる。いくつかの場合、コロナウイルスタンパク質はSARS-CoV-2ウイルスのタンパク質である。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号1に提供される核酸配列によってコードされるウイルスタンパク質に由来する。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質に由来し、orf1a、orf1ab、スパイクタンパク質(Sタンパク質)、3a、3b、エンベロープタンパク質(Eタンパク質)、膜タンパク質(Mタンパク質)、p6、7a、7b、8b、9b、ヌクレオカプシドタンパク質(Nタンパク質)、orf14、nsp1(リーダータンパク質)、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5(3C様プロテイナーゼ)、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10(成長因子様タンパク質)、nsp12(RNA依存性RNAポリメラーゼまたはRdRp)、nsp13(RNA 5’-トリホスファターゼ)、nsp14(3’→5’エキソヌクレアーゼ)、nsp15(エンドRNAse)、およびnsp16(2’-O-リボース-メチルトランスフェラーゼ)からなる群より選択される。
場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号2~5のいずれか1つと少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一のウイルスタンパク質に由来する。場合によっては、ウイルス模倣ペプチドは、配列番号6~10のペプチド配列を含む。
Figure 2023536665000002
Figure 2023536665000003
Figure 2023536665000004
Figure 2023536665000005
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多くの前駆体タンパク質のN末端の前に存在するシグナルペプチド(通常16~30アミノ酸長)は、成熟および分泌輸送プロセスにおける細胞内運命に向けてそれらのタンパク質を誘導することができる。エキソソームで発現されるヒト膜貫通タンパク質CD64の場合、シグナルペプチドは、MWFLTTLLLWVPVDG、UniProtKB_FCGR1_HUMANの1~15アミノ酸(配列番号11)であり得る。エキソソーム表面上のヒト標的タンパク質発現をガイドすることができる同様のシグナルペプチドには以下も含まれる:LAMP1_1~28アミノ酸:MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASA(配列番号12);LAMP 2_1~28アミノ酸:MVCFRLFPVPGSGLVLVCLVLGAVRSYA(配列番号13);HLA-G_1~24アミノ酸:MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA(配列番号14);HLA-DRA_1~25_アミノ酸:MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA(配列番号15)。そのようなシグナルペプチドモチーフの導入は、合成されたタンパク質が細胞質ゾルで消費されるのを防ぐことができ、エキソソーム表面でのタンパク質発現を増加させる。
いくつかの場合、細胞外小胞を含む組成物は、免疫細胞と接触するウイルス模倣ペプチドによって引き起こされる免疫応答を増強するための免疫調節剤またはアジュバントをさらに含むことができる。例示的な免疫調節剤としては、病原体関連分子パターン(PAMP)分子、損傷関連分子パターン(DAMP)分子、Toll様受容体アゴニスト、STINGアゴニスト、RIG-Iアゴニスト、腫瘍壊死因子(TNF)リガンド、またはサイトカイン(例えば、IL-2、IL-12、1L-15もしくはIL21)が挙げられる。例示的なアジュバントとしては、無機化合物(例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または水酸化リン酸カルシウム(calcium phosphate hydroxide))、鉱油、パラフィン油、落花生油、細菌産物、例えば不活化百日咳菌、非細菌有機物、例えばスクアレン、植物サポニン、フロイント完全アジュバント、またはフロイント不完全アジュバントが挙げられる。
場合によっては、ワクチン接種を必要とする対象にワクチン接種する方法が本明細書に記載され、前述の方法は、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドを含む医薬組成物は、1日に少なくとも1回、1週間に少なくとも1回、1ヶ月に少なくとも1回、1年間に少なくとも1回、または1年間よりも長い期間に少なくとも1回、対象に投与される。
ウイルス模倣ペプチドに対する中和抗体が対象において観察されたら、投与を停止することができる。あるいは、必要に応じて、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を含む医薬組成物の維持用量またはブースター用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、対象において検出される中和抗体のレベルに応じて減少させることができる。
いくつかの場合、ウイルス模倣ペプチドを含む細胞外小胞を産生する方法が本明細書に記載される。いくつかの場合、本方法は、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内に導入することを含む。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドはベクター(例えば、プラスミド)である。場合によっては、細胞外小胞細胞内に導入された少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも1つのアダプターポリペプチドをコードする。いくつかの場合、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの標的化ドメインをコードする。場合によっては、少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドは、ウイルス模倣物ペプチドをコードする。
いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入することができる。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって本明細書に記載される細胞内に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、本明細書に記載されるトランスフェクションの生物学的、化学的または物理的方法によって細胞内に移入することができる。いくつかの場合、異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションによって細胞外ドナー細胞内にトランスフェクトされる。
医薬組成物
いくつかの場合、細胞外小胞を医薬組成物に製剤化することができる。いくつかの場合、細胞外小胞を含む医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む。いくつかの場合、細胞外小胞を含む医薬組成物は、非経口、経口、頬側、直腸、舌下または経皮投与経路を含むがこれらに限定されない複数の投与経路によって対象に投与することができる。いくつかの場合、非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨内注入、腹腔内、または髄腔内投与を含む。場合によっては、医薬組成物は局所投与用に製剤化される。他の例では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内、皮下および筋肉内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、投与によって対象に投与される。いくつかの場合、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、筋肉内投与によって対象に投与される。
キット/製造物品
ある特定の場合、本明細書に記載される1つまたはそれを超える方法および組成物と共に使用するためのキットおよび製造物品が本明細書に開示される。本明細書に記載される細胞外小胞を産生するシステムも本明細書に記載される。いくつかの場合、本システムは、細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションして、本明細書に記載されるアダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞の産生および分泌を刺激するための構成要素を含む。
いくつかの場合、キットは、バイアル、チューブなどの1つもしくはそれを超える容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含むことができ、容器の各々は、本明細書に記載される方法で使用される別個の要素の1つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。いくつかの場合、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。キットは、典型的には、内容物および/または使用についての指示を列挙するラベル、および使用についての指示を含む添付文書を含む。指示のセットを含めることもできる。
一実施形態では、ラベルは、容器上にあるか、または容器に付随している。一実施形態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされるときに容器上にあり、ラベルは、容器も保持する容器(receptacle)または担体内に存在するとき、例えば添付文書として容器に付随している。一実施形態では、内容物が特定の治療適用に使用されることを示すためにラベルが使用される。ラベルはまた、本明細書に記載される方法などにおける内容物の使用のための指示を示す。
ある特定の場合、アダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する1つもしくはそれを超える単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。ある特定の場合、本明細書に記載される抗体のいずれか1つと複合体化されたアダプターポリペプチドおよび治療薬を含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する1つもしくはそれを超える単位剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイス中に提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示を伴う。一実施形態では、パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知を伴い、その通知は、ヒトまたは獣医学的投与のための薬物の形態の機関による承認を反映している。そのような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって薬物について承認されたラベル、または承認された製品添付文書である。一実施形態では、適合性医薬担体で製剤化された本明細書で提供されるアダプターポリペプチドおよび治療用含有物を含む細胞外小胞も調製され、適切な容器に入れられ、適応された症状の処置のために標識される。いくつかの場合、キットは、本明細書に記載されるワクチン、治療薬、養子療法、および処置方法を開発するのに有用な製造物品を含む。
以下の例示的な例は、本明細書に記載される刺激、システム、および方法の態様を表すものであり、決して限定することを意味するものではない。
実施例1.THP-CD64プラスミドDNAの設計および試験
抗体とペプチドが連結した細胞外小胞(「EV」)、特にエキソソームの新しいプラットフォームは、EVおよびエキソソーム表面上にCD64、CD64ペプチドまたは他のFc受容体を発現するプラスミドDNAでドナー細胞をトランスフェクトすることによって確立された。CD64はFc-γ受容体1(FcγR1)としても知られており、これは、その細胞外D1およびD2ドメインによってIgG1およびIgG3のFc領域のヒンジに、ナノモル濃度(nM)レベルの解離定数Kで高い親和性で結合する。また、内因性RNAおよびタンパク質をEVおよびエキソソームに添加して治療薬として機能させるために、ドナー細胞にプラスミドDNAを同時トランスフェクトした。これらの治療用EV(tEV)およびエキソソーム(tExo)は、がん細胞および腫瘍、非がん病変、ならびに損傷組織への標的化された薬物送達ビヒクルとして機能した。それらはまた、ワクチン開発および他の医学的処置のために設計された。
FLAGタグ、CKAAKN(CK)、CREKA(CR)、またはARRPKLD(AR)をコードするように設計された腫瘍ホーミングペプチド(「THP」)をCD64のN末端に付加し、様々なヒト化モノクローナル抗体(mAb)をCD64のD1ドメインおよびD2ドメインに結合させて、図1に示されるような二重標的化能を達成した。CD64またはTHP-CD64を有する細胞外小胞(「EV」)は、トランスフェクトされたドナー細胞から分泌されたEV(例えばエキソソーム)の表面上にヒトCD64またはヒトTHP-CD64のいずれかを発現するヒトCD64プラスミドDNAまたはヒトTHP-CD64プラスミドDNAをドナー細胞にトランスフェクトすることによって生成された。CD64は、ヒト化モノクローナル抗体(「hmAb」)に結合するための生物学的アンカーとして機能した。ヒトCD64の細胞外D1およびD2ドメインは、ヒトIgG1のFcの下部ヒンジ領域に高親和性で、例えばナノモル濃度レベルの解離定数(K)で結合した。結合したhmAbの特異的認識能力に加えて、小腫瘍ホーミングペプチド(THP)による標的化もまた、CD64のN末端に対して操作された。EV(またはエキソソーム)表面上のhmAbおよびTHPの両方の二重標的化は、インビボでの腫瘍および他の病変へのEV(またはエキソソーム)送達の標的化を増強した。
プラスミドを、それぞれ形質転換およびトランスフェクションのためのアンピシリン耐性(AmpR)ならびにEGFRマーカーの遺伝子を有するベクターを用いて構築した。機能的CD64は、EF1-プロモーターによって駆動されるCD64のコード配列(CD64_CDS)によってコードされた(図2A)。CD64_CDS(355アミノ酸)は、(i)シグナルペプチド(SP)、(ii)細胞外(D1、D2、およびD3)ドメイン、(iii)膜貫通(TM)ドメイン、および(iv)細胞内(IC)ドメインからなり、シグナルペプチドと細胞外D1との隙間にTHPを挿入してCD64のN末端に発現させた(図2B)。THPをFlag(DYKDDDK)リンカーによって細胞外D1のN末端に接続し、CD64のD1-D2ヒンジのFc結合領域上のコンフォメーションのブロックを制限した(図2C)。THP:Flag_対照、CKAAKN(CK)、CREKA(CR)およびARRPKLD(AR)のペプチドおよびヌクレオチド配列を図2Dに列挙する。
CD64のN末端に連結された腫瘍ホーミングペプチド(「THP」)がCD64とヒト免疫グロブリンG(hIgG)との相互作用を変化させるかどうかを試験するために、異なるTHPを有する操作されたCD64タンパク質を精製し、固定化hIgG(96ウェルプレート上にコーティング)と反応させて、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った(図3A)。異なるTHPを有する結合したCD64タンパク質を抗CD64/Flagおよび第2のHRP抗体と反応させ、続いてELISA基質(テトラメチルベンジジン)と反応させた。450nmでの吸光度は、操作されたCD64タンパク質による滴定の濃度を明らかにした。結合滴定曲線をCD64とhIgGとの間の一価モデリングに適合させて、解離定数K(O.D.=[Bmax×Con] / [K+Con](ここで、O.D.は吸光度の光学濃度であり、BmaxはO.D単位での結合の最大値であり、Conは濃度である)を決定した。hIgGおよび組換え野生型CD64(wt_CD64)のKを、参照として最初に測定した(K=0.0456nM、図3B)。異なる操作されたTHP-CD64タンパク質とhIgGとの親和性指数Kを、Flag-CD64(K=0.0536nM)、CK-CD64(K=0.0588nM)、CR-CD64(K=0.0658nM)およびAR-CD64(K=0.0506nM)として決定した(図3C)。これらの結果は、異なるTHP(Flag、CK、CR、またはAR)を有する操作されたCD64が、wt_CD64と比較して、nMレベルでmAbに対する高い結合親和性に影響を及ぼさないことを示した。
実施例2.ナノチャネルエレクトロポレーション(NEP)がトランスフェクトされた細胞からのEVおよびエキソソーム放出を誘発した
EVおよびエキソソームを含有するTHP-CD64を、ナノチャネルエレクトロポレーション(「NEP」)システムを使用することによって産生した。チップ表面上でドナー細胞を培養した。1日培養した後、カーゴチャンバーに事前負荷されたプラスミドを、25~250V電界(細胞の種類および供給源に依存する)を用いて、10ms/パルスで0.1秒間隔で10回のパルスを用いて、ナノチャネルを介して個々の細胞に注入した。細胞トランスフェクション後、機能性RNAおよび表面受容体を含有する放出されたEV(エキソソームを含む)を、まず遠心分離によって回収した培養培地から精製して細胞および大きな細胞残屑を除去し、続けてタンジェンシャルフローろ過(TFF)を行った。
図4は、THP-CD64および治療用RNAプラスミドによるNEPトランスフェクトマウス胚性線維芽細胞(MEF)からのEV数および内因性RNA含有量を示す。24時間のNEP処理後、遠心分離およびTFFによるEVの精製および回収のために細胞培養培地を回収した。精製後、操作されたEVを、スピンカラムを使用して約200μLの体積で高濃度にさらに精製した。図4Aに示すように、ヒトTHP-CD64+ヒトTP53群およびヒトTHP-CD64+shKRAS G12D変異群の両方のEV数は、対照群(すなわち、NEP処理なし)と比較した場合、NEP処理後に約10倍の増加を示した。図4BのTP53 mRNA発現のRT-qPCRは、NEPによって産生されたEVが、NEP処理なしの対照群と比較して多量の転写mRNAを含有し、40で未決定に対してCt値27.5に基づいて推定約6,000倍増加したことを明らかにした。
操作されたTHP-CD64を有する精製エキソソームをラテックスビーズによって捕捉し、フローサイトメトリーアッセイのために抗CD64-APC、抗CD63-BV510およびFITCコンジュゲートhIgGと共にインキュベートした(図5A)。表面発現のプロファイリングは、図5Bに示すように、CD64発現およびhIgG親和(affiliation)の平均蛍光強度(MFI)を決定するために、シングレットビーズおよびCD63エキソソーム集団をゲートする標準的なプロトコルに従った。CD63エキソソーム集団内のCD64の表面共発現をFITCのMFIによって決定し、図5Cに示すように、Flag、CK、CRまたはAR THPのいずれかを有する操作されたCD64のエキソソーム発現を確認した。CD63エキソソーム集団内のhIgGおよびCD64の表面共発現をFITCのMFIによって決定し、図5Dに示すように、Flag、CK、CRまたはAR THPのいずれかを有するCD64を発現するエキソソームに対するhIgGの高い結合親和性を確認した。
実施例3.PANC-1スフェロイドにおけるhmAbを含むかまたは含まないTHP-CD64含有エキソソームの取り込み
膵臓がん細胞株PANC-1のスフェロイドを、セルロースおよび1型コラーゲンを使用する懸滴法によって形成し、図7Aに示すように直径約500~600μmに達するまで1週間培養した。膵臓がん幹細胞(CSC)は、一般に、CD44およびCD24のそれらの表面発現によって定義される。直径400μmを超えるスフェロイドは低酸素コアを発達させ、この低酸素微小環境は生存シグナル伝達経路を活性化し、細胞生存度を維持するために再プログラミングする。PANC-1細胞をスフェロイド中で安定に培養すると、CD44CD24集団が徐々に増加した。
Flag-CD64またはCK-CD64プラスミドDNA(CK-CD64)のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞から放出された精製EVを、ヒト化抗EGFR mAb(セツキシマブ)またはhIgGのいずれかと共に製剤化した。ヒト膵臓がん細胞株PANC-1から形成されたがんスフェロイドを、PKH67(緑色)標識リポソーム(lipofectamine 3000)または種々のEVで24時間処理し、その後、固定、透過および抗hIgG-TRITC(赤色)およびDAPI(青色)による染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なEVによるがんスフェロイド処理はすべて、蛍光強度および分布に基づいて市販のlipofectamine 3000よりも良好なスフェロイド取り込みを示した。様々なEVの中で、二重標的化エキソソーム(CK-CD64-Cet_Exo)は、図6に示すように最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
ヒトモノクローナル抗体(hmAb)を含むかまたは含まない様々なTHP-CD64 EVの細胞取り込みをさらに評価するために、処理したスフェロイドを単一細胞懸濁物に分解して、図7Bに示すようにフローサイトメトリーを使用したCD24およびCD44発現によって亜集団を同定した。CD24lowCD44lowまたはCD24CD44亜集団において測定されたPKH67の平均蛍光強度は、それらのEV取り込みを表す。ヒト化抗体親和(セツキシマブ:抗EGFR、アテゾリズマブ:抗PD-L1、またはhIgG)を有するFlag-CD64、CK-CD64、CR-CD64、またはAR-CD64を含有する操作されたEVはすべて、図7Cに示すように、特にCD44CD24亜集団について良好な細胞取り込みを示した。抗hEGFR(セツキシマブ)およびCK-CD64を用いた二重標的化EVは、両方のPANC-1細胞亜集団について最良の細胞取り込みを提供した。
実施例4:PANC-1スフェロイドおよび同所性マウスモデルにおけるCK-CD64/抗ROR1含有エキソソームの取り込み
Flag-CD64またはCK-CD64プラスミドDNA(CK-CD64)のいずれかのトランスフェクション後にマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞から放出された精製EVを、ヒト化抗ROR1と共に製剤化した。ヒト膵臓がん細胞株PANC-1から形成されたがんスフェロイドを、PKH67(緑色)標識リポソーム(lipofectamine 3000)または種々のEVで24時間処理し、その後、抗hIgG-TRITC(赤色)およびDAPI(青色)による固定、透過および染色によって処理した。がんスフェロイドの横断面を共焦点顕微鏡下で画像化した。様々なEVの中で、二重標的化エキソソーム(CK-CD64-ROR1_Exo)は、図8に示すように最も高いスフェロイド取り込みを明らかにした。
PANC-1細胞に、インビボでのそれらの局在を追跡するためにGPおよびルシフェラーゼを形質導入した。PANC-1がん細胞を同所的に異種移植した4週間後に、NOD scid gamma(NSG)マウスに様々なEVを尾静脈注射した。EV送達の24時間後の脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および膵臓におけるEVの生体内分布を、EV脂質二重層のPKH26染色によって調べた。EV濃度は各々約10E12/50μLであり、ドナー細胞はMEFであった。図9および図19A~Bは、CK-CD64-ROR1_Exoが膵臓における最も高いEV蓄積を明らかにしたことを示す。PKH26、GFPおよびルシフェラーゼ強度の共局在化は、膵臓腫瘍病変に送達されたCK-CD64-ROR1_Exoの精度を反映した。
図10は、PKH染色による様々なEVの肝臓、脾臓および膵臓におけるEV取り込みの平均と腫瘍組織におけるEV分布とを比較する。CK-CD64-ROR1_Exoが、CK-CD64-ROR1標的化を用いてEVの優れた膵臓標的化および腫瘍組織取り込みを提供し得ることは明らかである。
実施例5.ワクチン開発のためのVacosomeの設計概念
コロナウイルス(CoV)は、現在のCOVID-19パンデミックの原因因子であるSARS-CoV-2を含むいくつかのサブタイプで見られる様々な流行病によって証明されるように、世界的な健康にとって大きなリスクと関連付けられている。スパイク(S)タンパク質は、ウイルスエンベロープの不可欠な構造成分であり、ワクチン開発のための戦略的標的である。エキソソーム表面上のCD64に融合した様々なウイルスSタンパク質断片を過剰発現するエキソソームは、ワクチン(「vacosome」と呼ばれる)として機能することができる(図11)。T細胞受容体(TCR)複合体を介した強力なワクチン接種は、CD64のN末端上のペプチドのワクチン接種およびCD64のヒンジD1-D2上の事前負荷された抗αCD3/CD28 mAbによる共刺激によって相乗的に達成することができる。操作されたCD64とTCRとの間の免疫学的シナプスの形成は、蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いた蛍光タグおよびT細胞表面マーカー染色によって確認することができる。同様に、B細胞(抗αCD19/CD20)および樹状細胞(DC)(抗αLILRA 4)などの抗原提示細胞(APC)を標的とするmAbの同時負荷は、APC-T細胞応答を増強するはずである。COVID-19のワクチンペプチドとして機能する可能性が高い5つの融合Sタンパク質断片候補をエピトープおよび構造予測から選択する。それらは、ヒト間葉系幹細胞(MSC)およびDCなどのNEPトランスフェクトドナー細胞を介して生成されたvacosome上に発現され得る。
実施例6.ヒト免疫グロブリンおよび古典的Fc受容体の結合親和性強度
Fcγ-IgG結合に加えて、他のヒト免疫グロブリンおよびFc受容体が存在する。原形質膜に埋め込まれたFc受容体は、下流の活性化または抑制を引き起こすことができる細胞内ドメインまたはサブユニットを含む。IgG親和性変化バリアントは、図12Aにおいて、非常に高い(濃いオレンジ色)、高い(オレンジ色)、中程度(黄色)、低い(薄い青色)から結合しない(濃い青色)まで、それぞれのヒトFcγ受容体メンバーで強調される。FcRn受容体は、酸性条件下(例えばpH=6)ではIgGサブクラスに結合するが、生理学的条件下、pH=7.4では結合能力を低下させる。図12Bは、IgEがFcεRI受容体に対して非常に高い結合親和性を有するが、FcεRII受容体に対しては低い親和性を有することを示す。IgAはFcαRI受容体との結合親和性が低い。
実施例7.最適化されたNEPによるKRASG12D siRNA/CD64およびTP53 mRNA/CD64標的化EV(tEV)の構築
PDACにおける効率的な標的化送達のための操作されたEVを設計するために、細胞刺激によって誘発されるEV放出の動態、および分泌EVにおける治療薬(KrasG12D特異的shRNAおよびhTP53 mRNA)の負荷プロファイル、ならびにEV表面上のCD64タンパク質発現を調査した。図13に示すように、MEFから分泌されたEVは、有意に増加し、10回の10msパルスにより150Vで1μm細孔のTranswellを使用したNEP後約16時間でピークに達し、次いで急速に低下したが、TP53-mRNAの発現レベルは約4時間および8時間で急速にピークに達し、次いで発現はNEP後12時間で非常に低いレベルに低下した。KRASG12Dを標的とするshRNAの発現傾向(図13D)は、EV分泌プロファイルの発現傾向と同様であり、すなわち、有意に増加し、約16時間でピークに達した。経時的なEV分泌およびEVに封入されたヌクレオチドの発現と比較して、EV表面上のCD64タンパク質は、NEP後約24時間でピークを有し、NEP後長期間にわたって高レベルで発現することができた。放出プロファイルは、EV内にCD64タンパク質および所望のヌクレオチドの両方を有するEVを産生すると考えられる。TP53発現とEV分泌との間に大きなピーク時間差があるため、親細胞の逐次的なトランスフェクションアプローチが採用される。CD64プラスミドを最初にトランスフェクトし、続いて8、16および24時間のタイムラグでTP53プラスミドを送達した3種類の逐次的なトランスフェクション設計を比較した。図14に示すように、8時間の場合は、2回目の細胞刺激後にEV分泌の劇的な増加を示したが、EV内のTP53 mRNA発現は非常に低く、これは短期間内の過剰な細胞刺激が不十分な細胞生存度を引き起こすことに起因し得る。対照的に、16時間および24時間の場合は、TP53 mRNAのはるかに高い発現をもたらした。これらの間で、16時間の場合は、最も高いTP53 mRNA発現および非常に高いEV分泌の両方を示した。したがって、TP53 mRNA/CD64 EVは、CD64プラスミドの最初のトランスフェクションの16時間後に送達されたTP53プラスミドを用いた逐次的NEPによって産生された。KRASG12D shRNA/CD64 EVについては、NEPにおけるCD64およびKRASG12D shRNAプラスミドの両方の同時送達が良好に機能した。
実施例8.調製されたままの標的化EV(tEV)の特徴付け
qNANO、SEM、cryo-TEM、ウェスタンブロットおよび免疫リポプレックスナノ粒子(ILN)バイオチップアッセイを実施して、生成されたtEVを観察および特徴付けを行った。qNANOの結果(図15A)は、ブランクEVの平均直径が約110nmであったことを示しているが、カーゴなしのEV(PBSのみ)および治療薬ありのEV(KRASG12D shRNA/CD64 EVを代表とした)を含む操作されたEVはより大きな直径を示し、大量のヌクレオチドおよび他の生体分子がEVに封入されていることを示唆した。図15Bは、CD63、CD9およびTSG101などの典型的なエキソソームタンパク質が調製されたままのEVで高度に発現されることを示す。SEMおよびcryo-TEM画像(図15C~図15D)に示すように、これらの操作された小胞は球形のままであった。tEV内の封入された核酸、表面タンパク質、およびそれらの共局在化を確認するために、TIRFM顕微鏡上のILNバイオチップを単一EVの捕捉および検出に利用した。計算されたTIRFM結果(図15E~図15F)によれば、tEV内の封入されたヌクレオチド(TP53 mRNAおよびKrasG12D shRNA)およびCD64-CK表面タンパク質の共局在化率は、それぞれ51.19%および58.31%であった。
実施例9.逐次的なTranswellエレクトロポレーション(sTEP)プロトコル
マウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞、ヒト骨髄由来幹細胞(hBMSC)、および他の細胞型を治療的EV(tEV)産生のために使用することができる。ここでは、MEFを例に挙げて説明する。
マウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞(Millipore Sigma社から入手)を使用して、治療用EV(tEV)産生のための細胞クローンを生成する。組織培養フラスコ(Fisherbrand、カタログ番号FB 012937)を使用する従来の細胞培養の場合、MEF細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを追加補充したダルベッコの最小必須培地(DMEM)中で維持し、5%CO中37℃でインキュベートする。MEF細胞を、Transwellエレクトロポレーション(TEP)インサート(例えば、12mm)に、インサートあたり200,000~300,000個の細胞で播種する。細胞を80%コンフルエントまで成長させる場合、細胞を1×DPBSで3回洗浄し、TEP処理のために無血清培地に置き換える。細胞を、エレクトロポレーションシステム(Bio-Rad社製Gene Pulser Xcell)を用いて、エレクトロポレーションパラメータを一定にした上でTEPにより処理する。最適化のために、TEPによって誘発されるEV放出の量、治療薬(CD64タンパク質、KRASG12D siRNAおよびhTP53 mRNA)の負荷プロファイルを、hCD64 ELISAキット(Biocompare製)およびqRT-PCRによって経時的にスクリーニングすることができる。細胞培養馴化培地(CCM)をTEP処理後に経時的に回収し、200×gで5分間遠心分離して細胞および残屑を除去する。qNANOシステム(Izon Science社)は、調整可能な抵抗パルス感知(TRPS)法を利用して、CCM溶液中の50~330nmの範囲のナノ粒子をカウントする。CD64タンパク質を測定するために、EVをRIPA緩衝液(Thermo Scientific(商標)89900)およびhCD64 ELISAキット(Biocompare社製)によって溶解し、次いで製造プロトコルに従って使用する。EV内のTP53 mRNAおよびKRASG12Dを標的とするsiRNAの発現レベルを測定するために、EVを細胞培養培地から全エキソソーム単離(TEI)キット(Invitrogen社製)によって精製する。次いで、全RNAをRNA精製キット(Norgen社製)から単離する。ヒトTP53 mRNAとKRASG12D siRNAの相対発現量は、RT-PCRにより測定し、次いで2△△Ct(下記のtEV RNAについてのqRT-PCRを参照のこと)を用いてLivak法により算出することができる。KRASG12D shRNA/CD64治療用EVは1回のTEP処理後に回収され、一方で、TP53 mRNA/CD64治療用EVは連続的なTEP処理後に回収される。KRASG12D shRNA/CD64治療用EVの場合、KRASG12D shRNAおよびCD64プラスミド混合物で1回のTEPによって処理した細胞を無血清培地中で16時間インキュベートする。TP53 mRNA/CD64治療用EVの場合、細胞を最初にCD64プラスミドによるTEPによって処理し、16時間インキュベートする。次いで、細胞をTP53 mRNAプラスミドでTEPによって処理し、無血清培地中でさらに16時間インキュベートする。それに応じて細胞培養馴化培地(CCM)を回収し、200×gで5分間遠心分離して細胞および残屑を除去する。細胞を除去したCCMを2000×gで30分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。細胞残屑を除去したCCMを、ペレットを乱すことなく新しいチューブに移す。CCMは、下流のtEVの単離および特徴付けのために4℃で保存するか、または凍結して-80℃で保存する。
tEV RNAのqRT-PCR。細胞培地を2000×gで30分間遠心分離して、細胞および残屑を除去する。無細胞培養培地を含有する上清を、ペレットを乱すことなく新しいチューブに移す。エレクトロポレーション細胞培養培地のNTA測定後、全エキソソーム単離試薬(細胞培養培地から、Invitrogen社、カタログ番号4478359から)を使用して試料を精製する。NTAデータからのEV濃度が2e9/mL未満である場合、全エキソソーム単離試薬(血清から、Invitrogen社、カタログ番号)(下記のピペットを使用して上清を廃棄するステップに進む)を用いて試料を精製する。必要な容量(1mL)の無細胞培養培地を新しいチューブに移し、0.5容量(0.5mL)の全エキソソーム単離(細胞培養培地からのTEI)試薬を添加する。均一な溶液が存在するまでボルテックスし、ピペットで吸引排出することによって、培養培地/試薬混合物を十分に混合する。試料を4℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、試料を10,000×gで1時間、4℃で遠心分離する。ピペットを用いて上清を廃棄する。EVは、チューブの底部のペレットに含まれている(ほとんどの場合見えない)。溶液が再び透明になるまでボルテックスし、ピペットで吸引排出することによって、ペレットを好都合な体積(100μL)のRNaseフリー1×DPBS中に再懸濁する。開始体積が2mLの培養培地である場合、再懸濁溶液(100μL)をペレットを用いて他のチューブに戻す。EV RNA抽出には、血漿/血清RNA精製Miniキット(Norgen Biotek社、カタログ番号55000)を使用する。溶解緩衝液Aを60℃で20分間加温し、沈殿が存在する場合は溶液が再び透明になるまで十分に混合する。100μLのTEI試薬処理試料を1.5mLチューブに入れ、300μLの溶解緩衝液Aを添加する。10秒間ボルテックスすることによって十分に混合する。400μLの100%エタノール(200プルーフ)を添加する。10秒間ボルテックスすることによって十分に混合する。100μLのTEI試薬処理試料をマイクロスピンカラムに入れるステップから400μLの混合物を移す。混合物を3,300×gおよび室温(RT)で2分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、スピンカラムをその回収チューブと再び組み立てる。400μLの100%エタノールを添加し、混合し、もう一度移して試料混合物をスピンカラムに移すステップを繰り返す。400μLの洗浄溶液Aをカラムに適用し、3,300×gおよびRTで1分間遠心分離する。フロースルーを廃棄し、スピンカラムをその回収チューブと再び組み立てる。フロースルーを廃棄し、再び組み立て、エタノールを加えるステップをさらに2回繰り返し、合計3回洗浄する。空のカラムを13,000×gおよびRTで2分間回転させ、回収チューブを廃棄する。スピンカラムを新しい1.7mL溶出チューブに移す。12.5μLの溶出溶液Aからカラムに適用し、室温で2分間放置する。溶出チューブを用いてスピンカラムを400×gで1分間、続けて5,800×gで2分間遠心分離する。最大回収のために、溶出した緩衝液をスピンカラムに戻し、室温で2分間放置する。再び400×gで1分間遠心分離し、続けて5,800×gで2分間遠心分離する。抽出された全RNA溶液(約10μL)の濃度を測定するために、NanoDrop 2000C分光光度計(Thermo Scientific社)を使用する。測定体積は、核酸の水溶液に対して1μLが推奨される。RNAモード(RNA-40)を選択して全RNA濃度を測定する。サンプリングアームを上昇させ、1×DPBSを下部測定ペデスタル上にピペットで移す。サンプリングアームを下げ、PC上のソフトウェアを使用してスペクトル測定を開始する。ブランクをクリックして基準スペクトルを測定し保存する。測定を選択することによって、ブランクの新しい複製物を試料と同じように分析する。結果は、0.04A(10mmの吸光度相当)以下で変化するスペクトルになるはずである。サンプリングアームを上昇させ、試料を下部測定ペデスタル上にピペットで移す。サンプリングアームを下げ、PC上のソフトウェアを使用してスペクトル測定を開始する。測定が完了したら、サンプリングアームを上昇させ、糸くずを含まない乾燥した実験室用ワイプを使用して、上部ペデスタルおよび下部ペデスタルの両方から試料を拭き取る。260nmおよび280nmでの吸光度比260/280を確認する。260nmおよび280nmでの吸光度比を使用して、DNAおよびRNAの純度を評価する。約1.8の比は、一般に、DNAについて「純粋」として認められており、約2.0の比は、一般にRNAについて「純粋」と認められている。いずれの場合も比がかなり低い場合、280nmまたはその付近で強く吸収するタンパク質、フェノールまたは他の汚染物質の存在を示し得る。260nmおよび230nmでの吸光度比260/230を確認する。これは、核酸純度の二次的な尺度である。「純粋な」核酸の260/230値は、多くの場合、それぞれの260/280値よりも高く、一般に1.8~2.2の範囲である。比がかなり低い場合、これは、共精製された汚染物質の存在を示し得る。RT-PCRの前のRNA試料の正規化のために、全RNA濃度から試料体積を調整する。1000ngの全RNA量(10μLの100ng/μL)を超えない。プラスおよびマイナス逆転写酵素(RNA)試料を増幅反応に使用する場合は、二連のチューブを調製する。RNaseフリーの0.5mL微量遠心チューブに氷上で以下を添加する。DNase I、増幅グレード(Invitrogen社、カタログ番号18-068-015);1μLの10×DNaseI反応緩衝液;DNase I1μL、Ampグレード、1U/μL;全RNA正規化のために調整された体積を有する1~8μLの抽出された全RNA試料を使用。通常、100ngの全RNAを5μLの20ng/μL、DEPC処理したRNaseフリー水10μLまで添加する。チューブを室温で15分間インキュベートする。反応混合物に1μlの25mM EDTA溶液を添加することによってDNase Iを不活性化する。65℃で10分間加熱する。RNA試料は、PCR増幅の前に、逆転写で使用する準備ができている。逆転写(RT)プロセスについては、RNase阻害剤を含む高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems社、カタログ番号43-749-66)を使用する。最大2μg(20μL反応の場合)の全RNAをcDNAに定量的に変換して2×逆転写マスターミックスを調製する:2.0μLの10×RT緩衝液;0.8μLの25×dNTP混合物(100mM);2.0μLの10×RTオリゴ(dT)プライマーまたはランダムプライマー;1.0μLのRNase阻害剤;1.0μLのMultiScribe(商標)逆転写酵素;3.2μLのヌクレアーゼフリーHO;10μLのDNase処理した全RNAを10μLの2×RTマスターミックスに添加して、20μLの1×ミックスを生成する。短時間ボルテックスして混合する。短時間遠心分離して、反応混合物をチューブの底部に運び、気泡を除去する。サーマルサイクラーで2時間15分間、オリゴdTまたはランダムヘキサマー法で逆転写を行う。qRT-PCR実験用の反応混合物を調製する:TaqMan(登録商標)FastAdvanced Master Mixは2倍濃度で供給され、これはAmpliTaq(商標)Fast DNA Polymerase;ウラシル-Nグリコシラーゼ(UNG);dUTPを有するdNTP;ROX(商標)色素(受動的基準(passive reference));最適化された緩衝液成分を含有する。TaqMan(登録商標)Fast Advanced Master Mixを氷上に保つ。TaqMan(登録商標)アッセイを氷上で解凍し、次いでボルテックスし、短時間遠心分離して再懸濁する。適切な容量のPCR反応混合物を光学反応プレート(96ウェルプレート)の各ウェルに移す。10μLの2×マスターミックス(Applied Biosystems社、TaqMan Fast Advanced Master Mix、カタログ番号4444557);TP53、VEGFAおよびCOL1A1遺伝子の標的プローブおよびプライマーと混合した1μLの20×TaqManアッセイミックス;2μLのcDNA鋳型(RT試料中10ng/μLの2μLで20ng);7μLのヌクレアーゼフリーHO。反応プレートを光学接着フィルムで密封し、次いで短時間遠心分離してPCR反応混合物をウェルの底部に運び、気泡を除去する。システムソフトウェア内の反応プレートに対応するプレート文書または実験ファイルを開く。反応プレートをリアルタイムPCRシステムにロードする。qPCR反応の実行を開始する。すべての反応が完了した後、反応の増幅プロットを見る。自動ベースラインおよび自動閾値設定を使用して、増幅曲線の閾値サイクル(Ct)を決定する。データを分析するためにGAPDH参照を用いた比較Ct(ΔCр)法を使用する。ΔΔCт法を用いてqPCRデータを解析する。
実施例10.PANC-1膵がん細胞への濃縮EV内在化
標的化に加えて、EV表面上にヒト化モノクローナル抗体(hmAb)および組織ホーミングペプチド(THP)を含む開示されたCD64濃縮EVは、細胞内在化および組織透過(トランスサイトーシスを含む)を実質的に増強することができる。EGFR(上皮成長因子受容体)およびROR1(受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1)の高い表面発現のため、PANC-1細胞を膵臓がんモデルとして使用した。PANC-1細胞を培養し、以下の標的化製剤の1つとCD64/EVと共にインキュベートした:(i)flag-対照(標的化部分なし)、(ii)IgGを含まないCK(CKAAKNK)ペプチド、(iii)正常IgG(特異性なしのIgG)を含むCKペプチド、(iv)CKペプチドおよびαhEGFR_IgG、ならびに(v)CKペプチドおよびαhROR1_IgG。CD64/EVを個々のhmAbと室温で1時間予備混合し、次いで、結合していないhmAbを洗い流した。単層培養のPANC-1細胞を、各hmAbを含む製剤化CD64/EVで24時間処理し、次いで洗浄し、フローサイトメトリーのために懸濁した。フローアッセイを行って、PKH67で蛍光標識された内在化EVの量を定量化した。最初の比較は、異なるhmAbを負荷したflagペプチド(図16A)またはCKペプチド(図16B)発現EVの取り込み効率であった。蛍光強度は、PANC-1細胞上の表面ROR1またはEGFRに対する選択性のために、αhROR1で標的化されたEVがαhEGFRで標的化されたEVまたはIgG対照よりも良好に取り込まれることを明らかにした。EV表面のCD64上の臨床的に利用可能なhmAb、特にαhROR1に結合すると、標的化されていないIgG_EVと比較して、PANC-1がん細胞に内在化されたEVの量をαhRORについては約60%、αhEGFRについては約30%増加させることができた(図16C)。さらに、EV表面上の更なるCKペプチドは、PANC-1細胞におけるαhROR1_EVの取り込みをほぼ2倍にすることができる(平均蛍光強度[MFI]、Flag_αROR1:5585±755.9;CK_αROR1:112209±1914に示されるとおり)。図16Cは、フローサイトメトリーアッセイからの定量的な結果をまとめたものである。EV取り込みのhmAb支援濃縮をさらに定量化するために、PANC-1細胞上の表面EGFRおよびROR1発現を、hmAb標的化製剤を伴ってまたは伴わずに染色した。4時間のαROR1_EV処理によるPANC-1細胞の染色から、表面ROR1発現の減少が観察され、αhROR1が、薬物送達の増強のためにαhEGFRよりも強いEV内在化を誘導できることを示唆している(図16D)。次いで、PANC-1細胞の3D腫瘍スフェロイドに対するEV取り込みアッセイを行った。一貫して、αhROR1_EVは、より強い表面ROR1内在化を示し、濃縮されたEV取り込みをもたらし、一方で、αhEGFR_EVは、PANC-1表面を良好に標的とすることができたが、6時間のインキュベーション後に内在化はより少なかった(図16Eおよび16F)。ヒトIgGは6~16g/Lの濃度でヒト血清中に天然に存在するので、置換アッセイを実施してEV上のαhROR1およびαEGFRの安定性を評価した。EVに最初に標的化抗体(すなわち、αhEGFRおよびαhROR1)を負荷し、次いで、ヒト血清(50%)と共に37℃で6時間インキュベートした。この置換アッセイの目的は、事前負荷されたhmAbを血液循環中の血清ヒトIgGで置換できるかどうかを理解することであった。置換アッセイの前後のEVの標的化能力を比較した後、標的化能力の大きな損失は観察されなかった(図16Gおよび図18A~図18B)。このデータは、臨床使用におけるCD64/EV上のヒト化抗体の安定性を裏付けている。
実施例11.標的化EVの組織透過の増強
異なる標的化設計を有する各EV製剤について、transwellベースのアッセイを確立して、PANC-1細胞の複数の層を介した透過能を定量化した。トランスサイトーシスの活性を、5μm細孔Transwell(登録商標)膜によって分離されたPANC-1細胞の上層と下層との間のEV交換によって決定した(図17A)。上層は、ヒト膵管上皮細胞のタイトジャンクションを模倣するために単層培養で90%コンフルエンスを超えるPANC-1細胞から構成された。EVをPKH67で蛍光標識し、第1のレシピエントとして上層細胞とインキュベートした。トランスサイトーシスが徐々に起こると、蛍光標識EVは第1のレシピエント細胞に取り込まれたが、多くはエキソサイトーシスを介して細胞外領域に分泌する。中間領域の蛍光標識EVの一部は、後に下層の第2のレシピエント細胞によって取り込まれ、指標として検出可能な蛍光シグナルをもたらす。市販のPEG化リポソームであるInvivofectamine(Thermofisher社)を、対照として製造元の指示に従って合成した。EVは、上部細胞単層に出入りし、リポソームよりも2~3倍良好に下部細胞単層によって取り込まれ得ることが見出された(図17C)。エンドサイトーシスおよびEV分泌を遮断するために選択される様々な阻害剤を図17Bに示す。クラスリンおよびカベオラ媒介エンドサイトーシスを阻害すると、EVトランスサイトーシスが有意に減少し、レシピエント細胞(この場合はPANC-1)へのEV侵入が主にクラスリンおよびカベオラ媒介エンドサイトーシスによって媒介されることが示唆された。興味深いことに、ネチコナゾールによる上部PANC-1細胞のEV分泌の阻害は、トランスサイトーシス活性を強く低下させた(図17C)。EV表面上に標的化hmAbがあると、トランスサイトーシス活性は、非標的化EVのそれと比較して3~4倍濃縮され得る(図17D)。ここでも、αhROR1を負荷したCD64/EV表面は、PANC-1細胞のトランスサイトーシスを最も向上させることができ、CD64/EV上のhmAbとCK-ペプチドとの組み合わせは、トランスサイトーシスをさらに改善するであろう(図17D)。
上記の開示は、明確さおよび理解のためにある程度詳細に記載されているが、本開示の理解から当業者には、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることは明らかであろう。例えば、上述したすべての技術および装置は、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれるように個別かつ別個に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

Claims (117)

  1. 少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、前記細胞外小胞が、
    a.10-9M未満またはそれに等しい解離定数(Kd)で抗体のFc領域に結合するペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、少なくとも1つのアダプターポリペプチドと、
    b.前記アダプターポリペプチドと複合体化された前記抗体であって、前記抗体は罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、抗体と、
    c.少なくとも1つの治療薬と
    を含む、組成物。
  2. 抗体のFc領域に結合する前記ペプチド配列が、Fc受容体と少なくとも70%同一である、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記Fc受容体が、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である、請求項2に記載の組成物。
  4. 前記Fc受容体が、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む、請求項2に記載の組成物。
  5. 前記Fc受容体がCD64である、請求項4に記載の組成物。
  6. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに結合している、請求項1に記載の組成物。
  7. 前記標的化ドメインが、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される、請求項6に記載の組成物。
  8. 前記罹患細胞ががん細胞または非がん性病変細胞である、請求項1に記載の組成物。
  9. 前記第1の細胞表面マーカーが、EGFR、PD-L1またはROR1を含む、請求項1に記載の組成物。
  10. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが異なる、請求項6に記載の組成物。
  11. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが同一である、請求項6に記載の組成物。
  12. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項1に記載の組成物。
  13. 前記抗体が、ヒト化抗EGFR抗体クローンC225、ヒト化抗ROR1抗体クローン2A2、およびヒト化抗PD-L1抗体クローンSP142からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
  14. 前記ヒト化モノクローナル抗体がIgGを含む、請求項12に記載の組成物。
  15. 前記ヒト化モノクローナル抗体がIgG1またはIgG3を含む、請求項14に記載の組成物。
  16. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項1に記載の組成物。
  17. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項16に記載の組成物。
  18. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項16に記載の組成物。
  19. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外小胞内にある、請求項1に記載の組成物。
  20. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項1に記載の組成物。
  21. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外ドメインに結合している、請求項1に記載の組成物。
  22. 前記少なくとも1つの治療薬が、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の組成物。
  23. 前記治療用ポリヌクレオチドが、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む、請求項22に記載の組成物。
  24. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である、請求項1に記載の組成物。
  25. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項24に記載の組成物。
  26. 対象を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記医薬組成物が請求項1~25のいずれか1項に記載の組成物を含む、方法。
  27. 前記医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む、請求項26に記載の方法。
  28. 前記対象ががんまたは非がん性病変を有する、請求項26に記載の方法。
  29. 前記対象が神経膠腫を有する、請求項28に記載の方法。
  30. 前記対象が筋ジストロフィを有する、請求項26に記載の方法。
  31. 前記筋ジストロフィが、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィおよび筋緊張性ジストロフィからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
  32. 前記対象が網膜疾患を有する、請求項26に記載の方法。
  33. 前記網膜疾患が網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障である、請求項32に記載の方法。
  34. 前記対象に、前記治療有効量の前記医薬組成物を少なくとも1日に1回、週に1回、月に1回、または年に1回の頻度で投与する、請求項26に記載の方法。
  35. 前記医薬組成物が水性製剤である、請求項26に記載の方法。
  36. 前記医薬組成物が注射用に製剤化される、請求項26に記載の方法。
  37. 前記医薬組成物を、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、鼻腔内、またはそれらの組み合わせで前記対象に投与する、請求項26に記載の方法。
  38. 組成物を製造する方法であって、前記方法が、
    a.アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、前記アダプターポリペプチドが、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、前記Fc受容体が抗体のFc領域を認識する、ステップと、
    b.前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が前記アダプターポリペプチドを発現し、前記アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、前記細胞外小胞が少なくとも1つの治療薬を含む、ステップと、
    c.前記抗体を前記細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、前記抗体が罹患細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップと
    を含む、方法。
  39. 前記Fc受容体がFc-γ受容体、Fc-α受容体またはFc-ε受容体である、請求項38に記載の方法。
  40. 前記Fc受容体がFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)またはFcγRIII(CD16)である、請求項39に記載の方法。
  41. 前記Fc受容体がCD64である、請求項40に記載の方法。
  42. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記罹患細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが前記細胞外ドメインに結合している、請求項38に記載の方法。
  43. 前記第1の細胞表面マーカーまたは前記第2の細胞表面マーカーががん細胞または非がん性病変細胞に関連する、請求項42に記載の方法。
  44. 前記第1の細胞表面マーカーが、EGFR、PD-L1またはROR1を含む、請求項43に記載の方法。
  45. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが異なる、請求項43に記載の方法。
  46. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが同一である、請求項43に記載の方法。
  47. 前記標的化ドメインが、腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍標的化ドメイン、組織標的化ドメイン、細胞透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、およびそれらの任意の組み合わせまたは断片からなる群より選択される、請求項42に記載の方法。
  48. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外小胞内にある、請求項38に記載の方法。
  49. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項38に記載の方法。
  50. 前記少なくとも1つの治療薬が前記細胞外ドメインに結合している、請求項38に記載の方法。
  51. 前記少なくとも1つの治療薬が、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん薬物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項38に記載の方法。
  52. 前記治療用ポリヌクレオチドが、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、shRNA、またはそれらの組み合わせを含む、請求項51に記載の方法。
  53. 前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体である、請求項38に記載の方法。
  54. 前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項53に記載の方法。
  55. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項38に記載の方法。
  56. 前記マイクロチャネルエレクトロポレーションまたは前記ナノチャネルエレクトロポレーションが、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む、請求項55に記載の方法。
  57. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して前記細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる、請求項56に記載の方法。
  58. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む、請求項38に記載の方法。
  59. 前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項38に記載の方法。
  60. 少なくとも1つの細胞外小胞を含む組成物であって、
    a.抗体のFc領域に結合するFc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む少なくとも1つのアダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドと、
    b.前記アダプターポリペプチドと複合体化された前記抗体であって、前記抗体は免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに特異的に結合する、抗体と、
    c.少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドと
    を含む、組成物。
  61. 前記Fc受容体が、Fc-γ受容体、Fc-α受容体または、Fc-ε受容体である、請求項60に記載の組成物。
  62. 前記Fc受容体が、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、またはFcγRIII(CD16)を含む、請求項61に記載の組成物。
  63. 前記Fc受容体がCD64である、請求項62に記載の組成物。
  64. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに結合している、請求項60に記載の組成物。
  65. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージまたはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項60に記載の組成物。
  66. 前記第1の細胞表面マーカーが、LILRA 4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む、請求項60に記載の組成物。
  67. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが異なる、請求項64に記載の組成物。
  68. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが同一である、請求項64に記載の組成物。
  69. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項60に記載の組成物。
  70. 前記ヒト化モノクローナル抗体がIgGである、請求項69に記載の組成物。
  71. 前記IgGがIgG1またはIgG3を含む、請求項70に記載の組成物。
  72. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項60に記載の組成物。
  73. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項70に記載の組成物。
  74. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項70に記載の組成物。
  75. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項60に記載の組成物。
  76. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外ドメインに結合している、請求項60に記載の組成物。
  77. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む、請求項60に記載の組成物。
  78. 前記SARS-CoV-2ウイルスタンパク質が、エンベロープ(Envelopment)(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む、請求項77に記載の組成物。
  79. 前記SARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前記Sタンパク質である、請求項78に記載の組成物。
  80. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体を含む、請求項60に記載の組成物。
  81. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項80に記載の組成物。
  82. 対象にワクチン接種する方法であって、治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記医薬組成物が請求項60~81のいずれか1項に記載の組成物を含む、方法。
  83. 前記医薬組成物が少なくとも1つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む、請求項82に記載の方法。
  84. 前記対象に、前記治療有効量の前記医薬組成物を少なくとも1日に1回、週に1回、月に1回、または年に1回の頻度で投与する、請求項82に記載の方法。
  85. 前記医薬組成物が水性製剤である、請求項82に記載の方法。
  86. 前記医薬組成物が注射用に製剤化される、請求項82に記載の方法。
  87. 前記医薬組成物を、髄腔内、眼内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、脳内、小脳内(intracerebellarly)、側脳室内、実質内(intraperenchymally)、皮下、鼻腔内、またはそれらの組み合わせで前記対象に投与する、請求項82に記載の方法。
  88. 組成物を製造する方法であって、前記方法が、
    a.アダプターポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドで細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップであって、前記アダプターポリペプチドが、Fc受容体と少なくとも70%同一のペプチド配列を含み、前記Fc受容体が抗体のFc領域を認識する、ステップと、
    b.前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された細胞外小胞を回収するステップであって、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞が前記アダプターポリペプチドを発現し、前記アダプターポリペプチドが細胞外ドメインを含み、前記細胞外小胞が少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドを含む、ステップと、
    c.前記抗体を前記細胞外ドメインと複合体化させるステップであって、前記抗体が免疫細胞に関連する第1の細胞表面マーカーに結合する、ステップと
    を含む、方法。
  89. 前記Fc受容体がFc-γ受容体、Fc-α受容体またはFc-ε受容体である、請求項88に記載の方法。
  90. 前記Fc受容体がFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)またはFcγRIII(CD16)を含む、請求項89に記載の方法。
  91. 前記Fc受容体がCD64である、請求項90に記載の方法。
  92. 前記アダプターポリペプチドがさらに、前記免疫細胞に関連する第2の細胞表面マーカーに結合する標的化ドメインを含み、前記標的化ドメインが前記細胞外ドメインに結合している、請求項88に記載の方法。
  93. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項88に記載の方法。
  94. 前記第1の細胞表面マーカーが、LILRA4、CD3、CD19、CD20またはCD28を含む、請求項88に記載の方法。
  95. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが異なる、請求項92に記載の方法。
  96. 前記第1の細胞表面マーカーと前記第2の細胞表面マーカーとが同一である、請求項92に記載の方法。
  97. 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体を含む、請求項92に記載の方法。
  98. 前記抗体がIgGである、請求項97に記載の方法。
  99. 前記IgGがIgG1またはIgG3である、請求項98に記載の方法。
  100. 前記抗体が前記アダプターポリペプチドと非共有結合的に複合体化されている、請求項88に記載の方法。
  101. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドと複合体化するように構成されている、請求項100に記載の方法。
  102. 前記抗体の前記Fc領域が、酸性環境において、前記アダプターポリペプチドとの複合体化から解放されるように構成されている、請求項100に記載の方法。
  103. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが、前記細胞外小胞の細胞外表面上に発現される、請求項88に記載の方法。
  104. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが前記細胞外ドメインに結合している、請求項88に記載の方法。
  105. 前記少なくとも1つのウイルス模倣ペプチドが、SARS-CoV-2ウイルスタンパク質と少なくとも70%同一のペプチド配列を含む、請求項88に記載の方法。
  106. 前記SARS-CoV-2ウイルスタンパク質が、エンベロープ(E)タンパク質、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、膜(M)タンパク質、またはスパイク(S)タンパク質を含む、請求項105に記載の方法。
  107. 前記SARS-CoV-2ウイルスタンパク質が前記Sタンパク質である、請求項106に記載の方法。
  108. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小小胞またはアポトーシス小体を含む、請求項88に記載の方法。
  109. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項108に記載の方法。
  110. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、エレクトロポレーション、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションを含む、請求項88に記載の方法。
  111. 前記マイクロチャネルエレクトロポレーションまたは前記ナノチャネルエレクトロポレーションが、マイクロ細孔パターン化シリコンウェハ、ナノ細孔パターン化シリコンウェハ、トラックエッチング膜、セラミックマイクロ細孔膜、セラミックナノ細孔膜、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む、請求項110に記載の方法。
  112. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、ナノチャネルエレクトロポレーションを含み、前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドが、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して前記細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションされる、請求項111に記載の方法。
  113. 前記細胞外小胞ドナー細胞をトランスフェクトするステップが、遺伝子銃、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理、または化学的浸透の使用を含む、請求項88に記載の方法。
  114. 前記少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項88に記載の方法。
  115. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、マウス胚性線維芽細胞(MEF)、ヒト胚性線維芽細胞(HEF)、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、除核細胞、神経幹細胞、未熟樹状細胞、および免疫細胞からなる群より選択される、請求項88に記載の方法。
  116. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、動物初代細胞、ヒト初代細胞、動物細胞株およびヒト細胞株からなる群より選択される、請求項88に記載の方法。
  117. 前記細胞外小胞ドナー細胞が、遺伝子改変された動物初代細胞、遺伝子改変されたヒト初代細胞、遺伝子改変された動物細胞株、および遺伝子改変されたヒト細胞株からなる群より選択される、請求項88に記載の方法。
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