JP2023535809A - 血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド - Google Patents

血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP2023535809A
JP2023535809A JP2023506112A JP2023506112A JP2023535809A JP 2023535809 A JP2023535809 A JP 2023535809A JP 2023506112 A JP2023506112 A JP 2023506112A JP 2023506112 A JP2023506112 A JP 2023506112A JP 2023535809 A JP2023535809 A JP 2023535809A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
fusion protein
acid sequence
seq
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023506112A
Other languages
English (en)
Inventor
ジェンキンス，エマ
アダム，エステル
スタンリー，エマ
バスラン，アムリック
ピー ビンセント，マシュー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Avacta Life Sciences Ltd
Original Assignee
Avacta Life Sciences Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Avacta Life Sciences Ltd filed Critical Avacta Life Sciences Ltd
Publication of JP2023535809A publication Critical patent/JP2023535809A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合するステフィンポリペプチド（ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）の組換え操作された変異体およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するポリペプチドを含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、融合タンパク質を含有する組成物、融合タンパク質を使用する方法、および融合タンパク質を産生する方法がまた、本明細書で提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年７月３０日に出願された米国特許第６３／０５９，０２６号および２０２０年７月３０日に出願された米国特許第６３／０５９，０３７号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的な抗体は、抗がん剤として開発された（例えば、米国特許第９，２１２，２２４号および第８，００８，４４９号を参照のこと）。しかしながら、がん、感染性疾患、および神経変性疾患の処置に有用なさらなるＰＤ－Ｌ１抑制活性が必要である。
一部の態様では、ＰＤ－Ｌ１に結合するステフィンポリペプチド（ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）配列の（少なくとも１つの）組換え操作された変異体および血清アルブミン（ヒト血清アルブミンまたは「ＨＳＡ」など）に結合する（少なくとも１つの）ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド配列を含む治療用タンパク質が本明細書において提供される。「キメラ」タンパク質に含まれるＰＤ－Ｌ１およびＨＳＡ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド配列は、共有結合（例えば、化学架橋結合により、もしくは融合タンパク質として）、または非共有結合的に会合（例えば、多量体化ドメインもしくは小分子結合ドメインを介して）することができる。そうでなければ、腎臓の濾過閾値サイズ未満である２量体形態でさえ、これらのポリペプチドは、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）薬物動態（ＰＫ）研究において、少なくとも７日間の血清半減期を有し、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））において生成することができることが示された。
本開示の一部の実施形態は、キメラタンパク質、好ましくは、ステフィンポリペプチド（ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）のＨＳＡ結合組換え操作された変異体およびＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６．０で１×１０－６Ｍ以下のＫｄで、適宜、ｐＨ７．４で、ｐＨ６．０での結合についてのＫｄより少なくとも２分の１ｌｏｇ大きいＨＳＡ結合についてのＫｄでＨＳＡに結合し、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、１×１０－６Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する。
本開示の他の態様は、キメラタンパク質、好ましくは、ＨＳＡに結合するＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよびＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、タンパク質は、１０時間より長い、２４時間より長い、４８時間より長い、７２時間より長い、９６時間より長い、１２０時間より長い、１４４時間より長い、１６８時間より長い、１９２時間より長い、２１６時間より長い、２４０時間より長い、２６４時間より長い、２８８時間より長い、３１２時間より長い、３３６時間より長い、または３６０時間より長い、ヒト対象における循環半減期を有する。
本開示の他の態様は、キメラタンパク質、好ましくは、ＨＳＡに結合するＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよびＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、タンパク質は、少なくとも７日間、より好ましくは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４日間もの、ヒト対象における循環半減期を有する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＨＳＡの血清半減期の５０％より長い、６０％より長い、７０％より長い、または８０％より長いヒト患者における血清半減期を有する。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（ＨＳＡまたはＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）は、それぞれ独立して、一般式（Ｉ）：
ＦＲ１－（Ｘａａ）ｎ－ＦＲ２－（Ｘａａ）ｍ－ＦＲ３（Ｉ）
（式中、
・ＦＲ１は、ＭＩＰＧＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号１）またはＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号２）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列であり；
・ＦＲ２は、ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＫＳＬ（配列番号３）またはＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＮＧＰ（配列番号４）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列であり；
・ＦＲ３は、ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ（配列番号５）またはＥＤＬＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ（配列番号６）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列である
・Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸であり、
・ｎは、３～２０の整数であり、
・ｍは、３～２０の整数である
）で表されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＦＲ１は、配列番号１および／または２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ１は、配列番号１および／または２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列であり；一部の実施形態では、ＦＲ２は、配列番号３および／または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ２は、配列番号３および／または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列であり；一部の実施形態では、ＦＲ３は、配列番号５および／または６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ３は、配列番号５および／または６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列である。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、一般式：
ＭＩＰ－Ｘａａ１－ＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ－（Ｘａａ）ｎ－Ｘａａ２－ＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－（Ｘａａ）ｍ－Ｘａａ６－Ｄ－Ｘａａ７－ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号７）
（式中、
Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸残基であり；ｎおよびｍはそれぞれ、独立して、３～２０の整数であり；Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり、より好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、なおより好ましくは、ＧｌｙまたはＡｒｇであり；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、より好ましくは、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒであり、より好ましくは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、なおより好ましくは、ＬｙｓまたはＡｓｎであり；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、より好ましくは、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり、より好ましくは、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、なおより好ましくは、ＬｅｕまたはＰｒｏであり；Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、より好ましくは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、なおより好ましくは、ＡｌａまたはＧｌｕであり；Ｘａａ７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、より好ましくは、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｒｇであり、なおより好ましくは、ＬｅｕまたはＡｒｇである）で表されるアミノ酸配列を有する。
例えば、抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、一般式：
ＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ－（Ｘａａ）ｎ－ＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰ－（Ｘａａ）ｍ－ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号８）、
（式中、Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸残基であり；ｎおよびｍはそれぞれ、独立して、３～２０の整数である）で表されるアミノ酸配列を有することができる。
一部の実施形態では、ｎは、３～１５、３～１２、３～９、３～７、５～７、５～９、５～１２、５～１５、７～１２または７～９である。
一部の実施形態では、ｍは、３～１５、３～１２、３～９、３～７、５～７、５～９、５～１２、５～１５、７～１２または７～９である。
一部の実施形態では、Ｘａａは、出現ごとに独立して、原核生物または真核生物の細胞における組換え発現により、ポリペプチドに付加することができるアミノ酸であり、なおより好ましくは、２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１種である。
上記の配列および式の一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、一般式：
－ａａ１－ａａ２－ａａ３－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ａａ４－ａａ５－Ｔｒｐ－ａａ６－（配列番号３０８）
（式中、
ａａ１は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、ＬｙｓまたはＡｒｇを表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは非極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖、より好ましくは、小さい脂肪族側鎖、中性の極性側鎖または塩基性もしくは酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、なおより好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ３は、芳香族または塩基性の側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、なおより好ましくは、ＨｉｓまたはＴｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓを表し；
ａａ４は、中性の極性もしくは非極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖；好ましくは、中性の極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基；より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ５は、中性の極性または荷電した（酸性もしくは塩基性）あるいは小さい脂肪族または芳香族側鎖；好ましくは、中性の極性側鎖または荷電した側鎖を有するアミノ酸残基；より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇを表し；
ａａ６は、芳香族または酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；より好ましくは、ＴｒｐまたはＡｓｐ；なおより好ましくは、Ｔｒｐを表す）で表されるアミノ酸配列である。
上記の配列および式の一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、一般式：
－ａａ１－ａａ２－ａａ３－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－ａａ４－ａａ５－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－（配列番号３１０）
（式中、
ａａ１は、塩基性の側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎ、より好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ、なおより好ましくは、ＬｙｓまたはＡｓｎを表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは非極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖、より好ましくは、小さい脂肪族側鎖、中性の極性側鎖または塩基性もしくは酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、なおより好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ３は、芳香族または塩基性の側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓを表し；
ａａ４は、中性の極性もしくは非極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖；好ましくは、中性の極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基；より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ５は、中性の極性または荷電した（酸性もしくは塩基性）あるいは小さい脂肪族または芳香族側鎖；好ましくは、中性の極性側鎖または荷電した側鎖を有するアミノ酸残基；より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓ、なおより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇを表す）で表されるアミノ酸配列である。
上記の配列および式の一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号１６～５０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１６～５０から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％もの相同性を有するアミノ酸配列である。
上記の配列および式の一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、一般式：
－ａａ７－ａａ８－ａａ９－ａａ１０－ａａ１１－ａａ１２－ａａ１３－ａａ１４－ａａ１５－（配列番号３１１）
（式中、
ａａ７は、中性の極性もしくは非極性側鎖または酸性の側鎖を有するアミノ酸残基；好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、なおより好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ８は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは非極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖、より好ましくは、荷電した（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＰｈｅ、なおより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＧｌｎを表し；
ａａ９は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは非極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖、より好ましくは、中性の極性側鎖または酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒ、なおより好ましくは、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＡｓｐを表し；
ａａ１０は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは非極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖、より好ましくは、中性の極性側鎖または塩基性もしくは酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＧｌｙ、なおより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＧｌｙを表し；
ａａ１１は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖もしくは芳香族側鎖、より好ましくは、中性の極性側鎖または塩基性もしくは酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＧｌｙ、なおより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＨｉｓを表し；
ａａ１２は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖もしくは芳香族側鎖、より好ましくは、酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＧｌｙ、なおより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＬｙｓを表し；
ａａ１３は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性側鎖あるいは荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖もしくは芳香族側鎖、より好ましくは、酸性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅ、なおより好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；
ａａ１４は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎ、なおより好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎを表し；
ａａ１５は、アミノ酸残基、好ましくは、中性の極性もしくは中性の非極性側鎖または荷電した（酸性もしくは塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ、なおより好ましくは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎを表す）で表されるアミノ酸配列である。
上記の配列および式の一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号５１～８５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５１～８５から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％もの相同性を有するアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）アミノ酸配列は、配列番号１９２～２００のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）アミノ酸配列は、配列番号１９２～２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
さらなる説明のため、融合タンパク質のＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（複数可）は、一般式：
ＭＩＰ－Ｘａａ１－ＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ－（Ｘａａ）ｎ－Ｘａａ２－ＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦ－Ｘａａ３－Ｘａａ４－Ｘａａ５－（Ｘａａ）ｍ－Ｘａａ６－Ｄ－Ｘａａ７－ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号９）、
（式中、Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸であり；ｎは、３～２０の整数であり、ｍは、３～２０の整数であり；Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒであり；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；Ｘａａ７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓである）で表されるアミノ酸配列を有することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドのアミノ酸配列は、一般式：
ＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ－（Ｘａａ）ｎ－ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＫＳＬ－（Ｘａａ）ｍ－ＥＤＬ ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号１０）、
（式中、Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸であり；ｎは、３～２０の整数であり、ｍは、３～２０の整数である）で表される。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、式：
－ａａ１－ａａ２－ａａ３－ａａ４－ａａ５－ａａ６－ａａ７－ａａ８－ａａ９－
（式中、ａａ１は、中性の極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ２は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ３は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ４は、中性の極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ５は、正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ６は、正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ７は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ８は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ９は、中性の非極性親水性側鎖を有するアミノ酸である）により表される。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、式：
ａａ１－ａａ２－ａａ３－ａａ４－ａａ５－ａａ６－ａａ７－ａａ８－ａａ９（式中、ａａ１は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ２は、正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ３は、中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ４は、正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ５は、中性の極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ６は、中性の極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ７は、負に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ８は、正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸であり；ａａ９は、中性の非極性親水性側鎖を有するアミノ酸である）により表される。
一部の実施形態では、中性の非極性親水性側鎖を有するアミノ酸は、システイン（ＣまたはＣｙｓ）およびグリシン（ＧまたはＧｌｙ）から選択され；中性の非極性疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびバリン（ＶまたはＶａｌ）から選択され；中性の極性親水性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）から選択され；正に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、およびリジン（ＫまたはＬｙｓ）から選択され；負に荷電した極性親水性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）およびグルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）から選択される。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、式：
－ａａ１－ａａ２－ａａ３－ａａ４－ａａ５－ａａ６－ａａ７－ａａ８－ａａ９－（配列番号３０９）
（式中、ａａ１は、Ｄ、Ｇ、Ｎ、およびＶから選択されるアミノ酸であり；ａａ２は、Ｗ、Ｙ、Ｈ、およびＦから選択されるアミノ酸であり；ａａ３は、Ｗ、Ｙ、Ｇ、Ｗ、およびＦから選択されるアミノ酸であり；ａａ４は、Ｑ、Ａ、およびＰから選択されるアミノ酸であり；ａａ５は、Ａ、Ｑ、Ｅ、Ｒ、およびＳから選択されるアミノ酸であり；ａａ６は、Ｋ、Ｒ、およびＹから選択されるアミノ酸であり；ａａ７は、ＷおよびＱから選択されるアミノ酸であり；ａａ８は、ＰおよびＨから選択されるアミノ酸であり；ａａ９は、Ｈ、Ｇ、およびＱから選択されるアミノ酸である）により表される。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号８６～１３８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号８６～１３８のいずれか１つのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、式：
－ａａ１－ａａ２－ａａ３－ａａ４－ａａ５－ａａ６－ａａ７－ａａ８－ａａ９－（配列番号３１２）
（式中、ａａ１は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、およびＮから選択されるアミノ酸であり；ａａ２は、Ｋ、Ｐ、Ｈ、Ａ、およびＴから選択されるアミノ酸であり；ａａ３は、Ｖ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ａ、およびＦから選択されるアミノ酸であり；ａａ４は、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｋ、Ｖ、およびＲから選択されるアミノ酸であり；ａａ５は、Ｑ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、およびＮから選択されるアミノ酸であり；ａａ６は、Ｓ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、およびＴから選択されるアミノ酸であり；ａａ７は、Ｓ、Ｄ、Ｖ、およびＫから選択されるアミノ酸であり；ａａ８は、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｄ、およびＲから選択されるアミノ酸であり；ａａ９は、Ｇ、Ｑ、Ｅ、およびＡから選択されるアミノ酸である）により表される。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号１３９～１９１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号１３９～１９１のいずれか１つのアミノ酸配列である。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）アミノ酸配列は、配列番号２０１～２３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）アミノ酸配列は、配列番号２０１～２３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣにおける洗浄のストリンジェントな条件下で配列番号２０１～２３５のいずれか１つにハイブリダイズするコード配列を有するポリヌクレオチドによりコードすることができるアミノ酸配列を有し、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて６５℃での０．２×ＳＳＣにおける洗浄でのストリンジェントな条件下で配列番号１９２～２００のいずれか１つにハイブリダイズするコード配列を有するポリヌクレオチドによりコードすることができるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ＨＳＡに結合し、および／またはＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、１×１０－７ＭのＫｄ、１×１０－８ＭのＫｄ、または１×１０－９ＭのＫｄでＰＤＬ１に結合する。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で、ｐＨ６．０でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１ｌｏｇ大きい、ｐＨ６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１．５ｌｏｇ大きい、ｐＨ６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２ｌｏｇ、またはｐＨ６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２．５ｌｏｇ大きいＫｄでＨＳＡに結合する。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ヒト血清アルブミンのＨＳＡへの結合を阻害しない。
一部の実施形態では、タンパク質は、ＩｇＧのＨＳＡへの結合を阻害しない。
一部の実施形態では、本開示の治療用タンパク質は、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）配列および少なくとも１つのＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）配列に加えて、さらなる治療活性を付与し得る、および／または得られた治療用タンパク質にさらなるＰＫ／ＡＤＭＥ特性を付与し得る１つまたは複数のさらなるポリペプチドの配列（複数可）を含む。
一部の実施形態では、さらなるポリペプチドリガンドは、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１２などの、抗腫瘍免疫を促進する免疫賦活性サイトカイン、またはその変異型配列であり得る。
例えば、さらなるポリペプチドリガンドは、ＩＬ－２サイトカインまたはその変異型ポリペプチド配列であり得る。ＩＬ－２サイトカインは、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによって、複数の免疫作用を呈し、作用する。ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、およびＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２）サブユニットの会合は、３量体の高い親和性ＩＬ－２Ｒαβγをもたらす。ＣＤ２５は、ＩＬ－２への高い親和性結合を付与し、一方、βおよびγサブユニット（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージならびに休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現）は、シグナル伝達を仲介する。ＣＤ２５の発現は、免疫抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発現に必須であり、他方、細胞溶解性ＣＤ８＋ＴおよびＮＫ細胞は、増殖し、ＣＤ２５の不存在下で、ＩＬ－２Ｒβγ結合によりＩＬ－２に応答する標的細胞を殺滅することができることが明らかになった。ＩＬ－２配列を融合タンパク質の一部として含む一部の実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチド配列は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、中程度の親和性ＩＬ－２受容体（複数可）に対する天然の親和性の全ての部分または実質的な部分を保存しながら、高い親和性ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）に対する突然変異体ＩＬ－２ポリペプチド（融合タンパク質の状況におけるものを含む）の親和性を消失させるか、または低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含む突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドである。
ＩＬ－２配列への複数の突然変異を介するものを含む、ＣＤ２５結合の適当な低減を達し得る様々な公開されたアプローチが存在している。例えば、２つのアミノ酸Ｒ３８およびＦ４２の突然変異は、すなわち、高い親和性ＩＬ２Ｒの状況でのＣＤ２５への結合を有意に低減することが同定された。単に説明するために、使用することができる変異型ＩＬ－２ポリペプチド配列としては、例として、以下の残基、Ｔ３（例えば、Ｔ３Ａ）、Ｄ２０（例えば、Ｄ２０Ｔ）、Ｒ３８（例えば、Ｒ３８ＡおよびＲ３８Ｄ）、Ｆ４２（例えば、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２ＲもしくはＦ４２Ｋ）、Ｋ４３（例えば、Ｋ４３Ｅ）、Ｅ６１（例えば、Ｅ６１Ｒ）、Ｅ６２（例えば、Ｅ６２Ａ）、Ｙ４５（例えば、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲもしくはＹ４５Ｋ）および／またはＬ７２（例えば、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲもしくはＬ７２Ｋ）の１つまたは複数が変更されている、配列番号１１に対する変異型配列が挙げられる。一部の実施形態では、ＩＬ－２変異体は、荷電した残基を標的とするＲ３８Ｄ、Ｋ４３Ｅ、Ｅ６１Ｒのセット、両方の荷電した芳香族残基を標的とするＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａのセットを含む、変化の組み合わせを含み得る。対象である融合タンパク質の一部として利用することができる典型的な変異型ＩＬ－２配列もまた、例えば、米国特許第９，２６６，９３８号および米国特許出願第２００６０２５１６１７号；Ghasemi et al. Nat Commun. (2016) 7: 12878、Tang et al. Cytokine: X (2019) 1(1): 1-9;およびHeaton et al. Cancer Res Jun (1993) 53(11):2597-602に記載されており、そのそれぞれが、参照により本明細書に取り込まれる。
典型的なＰＤ－Ｌ１／ＸＴ／ＩＬ－２変異体融合物のポリペプチド配列は、以下を含み、１番目の下線を付された配列は、分泌シグナル配列であり、２番目の下線を付された配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ連結ＩＬ－２変異型ポリペプチド配列である。
一部の実施形態では、さらなるポリペプチド配列は、同時刺激性受容体のリガンドなどの、受容体リガンドであり、結合の際、同時刺激性受容体を刺激し得る。例えば、ポリペプチドリガンド配列は、Ｂ７．１、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬまたはＬＩＧＨＴから選択することができる。
さらなるポリペプチド配列が、機能するのに２量体化またはより高いオーダーの多量体化を必要とする、一部の実施形態では、治療用タンパク質はまた、例えば、融合タンパク質を含有する受容体リガンドまたは融合タンパク質を含有するサイトカイン、すなわち、多量体複合体において２、３、４、５、６、７、８、９または１０個もの融合タンパク質を含む複合体の多量体化を誘導する１つまたは複数の多量体化ドメインを含んでもよい。
本開示のなお別の態様では、さらなるポリペプチド配列は、融合タンパク質が、Ｔ細胞表面上のＣＤ３に結合するよう方向づけるＣＤ３結合ポリペプチド配列などの、結合を介してＴ細胞に結合するものであり得る。
一部の態様では、前述の請求項のいずれか１つのいずれかのキメラタンパク質、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、ヒト対象における治療使用に適した医薬組成物もまた本明細書で提供される。
一部の態様では、前述の請求項のいずれか１つのいずれかのポリペプチド（例えば、タンパク質）をコードする配列を含むポリヌクレオチドが、さらに本明細書で提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、転写制御配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、転写制御配列は、プロモーターおよびエンハンサーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複製起点、微小染色体維持エレメント（ＭＭＥ）、および／または核局在化エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする配列と作動可能に連結され、それと共に転写されるポリアデニル化シグナル配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、少なくとも１つのイントロン配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする配列と共に転写される少なくとも１つのリボソーム結合部位をさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、本開示のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはミニサークル、本開示のポリペプチドを含む細胞、本開示のポリヌクレオチド、本開示のウイルスベクター、および本開示のプラスミドまたはミニサークルもまた、本明細書で提供される。
さらなる態様は、本開示のキメラタンパク質を産生する方法を提供し、方法は、宿主細胞において、ポリペプチドをコードする核酸を発現させること、適宜、ポリペプチドを宿主細胞から単離することを含む。
本開示のキメラタンパク質、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、ヒト対象における治療使用に適した医薬組成物もまた、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、配列番号８６～１３８のいずれか１つから選択されるループ２配列および／または配列番号１３９～１９１のいずれか１つから選択されるループ４配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドは、配列番号１６～５０のいずれか１つから選択されるループ２配列および／または配列番号５１～８５のいずれか１つから選択されるループ４配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７７のアミノ酸配列、または配列番号２７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７８のアミノ酸配列、または配列番号２７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７９のアミノ酸配列、または配列番号２７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８０のアミノ酸配列、または配列番号２８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８１のアミノ酸配列、または配列番号２８１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８２のアミノ酸配列、または配列番号２８２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドをさらに含み、第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドは、１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する。
本開示の一部の態様は、ステフィンのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合組換え操作された変異体、第一のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチド、および第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドを含むインライン融合タンパク質を提供し、ＨＳＡ結合ポリペプチドは、ｐＨ６．０で１×１０－６Ｍ以下のＫｄ、適宜、ｐＨ７．４でｐＨ６．０での結合についてのＫｄより少なくとも２分の１ｌｏｇ大きいＨＳＡ結合についてのＫｄでＨＳＡに結合し、第一および第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドは、１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーをさらに含む。
一部の実施形態では、リンカーは、強固なリンカーまたは可動性リンカーである。
一部の実施形態では、強固なリンカーは、配列番号２９４の配列を含むか、または可動性リンカーは、配列番号２９３の配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８３のアミノ酸配列、または配列番号２８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８４のアミノ酸配列、または配列番号２８４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８５のアミノ酸配列、または配列番号２８５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８７のアミノ酸配列、または配列番号２８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９０のアミノ酸配列、または配列番号２９０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９１のアミノ酸配列、または配列番号２９１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、可動性リンカーであり、適宜、可動性リンカーは、配列番号２９３の配列を含む。
ＰＤ－Ｌ１／血清アルブミン結合インライン融合（ＩＬＦ）ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の略図。 精製後のＰＤ－Ｌ１／血清アルブミン結合ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲＳ（登録商標）のＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラム。 ＰＤ－Ｌ１／血清アルブミン結合３量体ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の略図。 精製ＰＤ－Ｌ１／血清アルブミン結合３量体ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の産生およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。 ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体が、ＰＤ－Ｌ１標的抗原と血清アルブミンの両方への結合を保持することを示す、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）動態分析。 ＥＬＩＳＡによるとヒトＰＤ－Ｌ１に結合し親分子ＡＶＡ０４－２５１への同様の結合を示す半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦ３量体を示すグラフ。 半減期延長ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの効力が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ［ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）］において親分子と同様であることを示す、グラフ。 ヒト血清アルブミン結合への半減期延長ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド結合が、ｐＨ７．４でＥＬＩＳＡにより均等であることを示す、グラフ。 ＩＬＦ半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体（ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４）が機能的であり、親分子と比較して、形成したとき効力を保持することを示す、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。 マウスにおけるＩＬＦ半減期延長３量体の薬物動態特性。 図１０Ａ～１０Ｃ。Ａ３７５異種移植モデルにおけるＩＬＦ ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４のインビボ有効性。経時的な個々の痕跡を、図１０Ａに示す。図１０Ｂは、群による強化された図１０Ａにおける結果を示す。図２１Ｃは、それぞれの群における腫瘍体積を示す。 図１０Ａ～１０Ｃ。Ａ３７５異種移植モデルにおけるＩＬＦ ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４のインビボ有効性。経時的な個々の痕跡を、図１０Ａに示す。図１０Ｂは、群による強化された図１０Ａにおける結果を示す。図２１Ｃは、それぞれの群における腫瘍体積を示す。 図１０Ａ～１０Ｃ。Ａ３７５異種移植モデルにおけるＩＬＦ ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４のインビボ有効性。経時的な個々の痕跡を、図１０Ａに示す。図１０Ｂは、群による強化された図１０Ａにおける結果を示す。図２１Ｃは、それぞれの群における腫瘍体積を示す。 大腸菌からのＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４－ｃｙｓの発現および精製。 図１２Ａ。抗マウスＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）半減期延長３量体産生および特徴決定。図１２Ｂ。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を使用したマウスＰＤ－Ｌ１ Ｆｃに対するＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０ ＫＤ決定。 図１３Ａおよび１３Ｂ。ｐＨ７．４（図１３Ａ）および６．０（図１３Ｂ）でのＭＳＡへのＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０結合を示す、ＥＬＩＳＡ。 図１３Ａおよび１３Ｂ。ｐＨ７．４（図１３Ａ）および６．０（図１３Ｂ）でのＭＳＡへのＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０結合を示す、ＥＬＩＳＡ。 ＡＶＡ０４－１８２とＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０の両方のｍＰＤ－Ｌ１競合ＥＬＩＳＡ。 マウスにおけるＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０ ３量体、ＡＶＡ０４－１８２ Ｆｃ形成ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの薬物動態特性。 図１５Ａ～１５Ｃ。ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓ ＩＬＦ２量体タンパク質の模式図（図１５Ａ）および特徴決定。図１５Ｂは、純度の分析を示し、図１５Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 図１５Ａ～１５Ｃ。ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓ ＩＬＦ２量体タンパク質の模式図（図１５Ａ）および特徴決定。図１５Ｂは、純度の分析を示し、図１５Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 図１５Ａ～１５Ｃ。ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓ ＩＬＦ２量体タンパク質の模式図（図１５Ａ）および特徴決定。図１５Ｂは、純度の分析を示し、図１５Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 図１６Ａおよび１６Ｂ。ｈｕＰＤ－Ｌ１への結合ＥＬＩＳＡを使用した、親分子と比較した蛍光標識ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓ８００（図１６Ａ）およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４ ｃｙｓ８００（図１６Ｂ）の結合能の評価。 図１６Ａおよび１６Ｂ。ｈｕＰＤ－Ｌ１への結合ＥＬＩＳＡを使用した、親分子と比較した蛍光標識ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓ８００（図１６Ａ）およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４ ｃｙｓ８００（図１６Ｂ）の結合能の評価。 処置の４時間後の２種のＡ３７５メラノーマ異種移植モデルにおける蛍光標識ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）抗ｈｕＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの体内分布の代表的な画像。 ＨＳＡ－１８半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（２種の異なるフォーマット：ＸＴ６０およびＸＴ６１）を有するＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ ＩＬＦの品質管理分析（純度）。 図１９Ａおよび１９Ｂ。ｐＨ７．４（図１９Ａ）およびｐＨ６．０（図１９Ｂ）でのＨＳＡへのＸＴ６０およびＸＴ６１ ＩＬＦ結合についてのＢｉａｃｏｒｅ動態分析。 図１９Ａおよび１９Ｂ。ｐＨ７．４（図１９Ａ）およびｐＨ６．０（図１９Ｂ）でのＨＳＡへのＸＴ６０およびＸＴ６１ ＩＬＦ結合についてのＢｉａｃｏｒｅ動態分析。 ｐＨ７．４でのＨＳＡおよびＭＳＡへのＸＴ６０およびＸＴ６１ ＩＬＦ結合についての結合ＥＬＩＳＡ。 ｐＨ６．０でのＭＳＡへの結合についてのＸＴ６０およびＸＴ６１ ＩＬＦ Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析。 ヒトＰＤ－Ｌ１ ＦｃへのＸＴ６０およびＸＴ６１ ＩＬＦポリペプチド結合についてのＢｉａｃｏｒｅ動態分析。
本開示は、ＰＤ－Ｌ１に結合するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むキメラタンパク質の生成に基づく。ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、調節された方法で、それがコンジュゲートされるＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの血清半減期を延長する。
結合表面を生成する２つのループを安定的に呈するよう操作された天然に存在するタンパク質（シスタチン）に基づき、本開示のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、および他の非抗体分子結合タンパク質より多くの利点をもたらす。１つは、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド自体の大きさが小さいことである。その単量体形態で、それは、約１４ｋＤａであるか、または抗体の１／１０の大きさである。このように大きさが小さいことにより、特に、あまり血管新生されていない、および／または線維性標的組織（腫瘍様）における、組織透過性の増加のより高い可能性が得られる。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、単純なタンパク質構造（多ドメイン抗体に対して）を有し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、機能するため、ジスルフィド結合または他の翻訳後修飾を必要としないため、これらのポリペプチドは、原核生物および真核生物システムにおいて製造することができる。
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（例えば、添付の実施例に記載されるファージディスプレイ技術）のライブラリーならびに部位特異的変異誘発を使用し、治療使用に理想的な範囲で調節可能な結合動態を有するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを生成することができる。例えば、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、一桁ナノモルまたは単量体ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドについてのより小さいＫｄ、ならびに多価形態のピコモルＫｄおよびアビディティーなどの、ＨＳＡまたはＰＤ－Ｌ１に対する高い親和性を有することができる。１０－４～１０－５（／秒）範囲の遅いＫｏｆｆ速度などの、ＨＳＡまたはＰＤ－Ｌ１についての厳格な結合動態を有するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを生成することができ、これは、標的組織局在化をもたらす。
本開示のキメラタンパク質は、非常に優れた選択性を有するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。
ジスルフィド結合および翻訳後修飾の必要がなくなると、タンパク質が、全身（例えば、筋組織からの発現）デリバリーされるか、または局所デリバリーされる（例えば、腫瘍内遺伝子デリバリーを介して）形態を含む、患者の組織に導入される遺伝子デリバリーコンストラクトの発現により、治療的にデリバリーされるべきＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質の多くの実施形態が可能になる。
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド［単にＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）としても言及される］は、ステフィンポリペプチドの組換え操作された変異体である、小さい高度に安定なポリペプチド（例えば、タンパク質）である。したがって、用語「ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド」は、「ステフィンポリペプチドの組換え操作された変異体」という用語と本明細書において互換的に使用され得る。ステフィンポリペプチドは、複数のシスタチン様配列を含有するタンパク質を包含するファミリーである、シスタチンスーパーファミリーにおけるタンパク質のサブグループである。シスタチンファミリーのステフィンサブグループは、比較的小さい（約１００アミノ酸）単一のドメインタンパク質である。それらは、公知の翻訳後修飾を受けず、ジスルフィド結合を欠き、それらが、広範の細胞外および細胞内環境で同様にフォールディングできることを示唆している。ステフィンＡは、９８個のアミノ酸の単量体の一本鎖単一ドメインタンパク質である。ステフィンＡの構造は解明され、これにより、ステフィンＡのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドへの合理的な変異が促進される。シスタチンの唯一の公知の生物学的活性は、カテプシン活性の阻害であり、操作されたタンパク質の残りの生物学的活性について徹底的に試験することが可能である。
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、同様の様式で、モノクローナル抗体と高い親和性および特異性で所望される標的タンパク質に結合するように全て無作為化することができる、２つのペプチドループおよびＮ末端配列を呈する。ステフィンＡタンパク質スキャフォールドによる２つのペプチドの安定化は、ペプチドがとり得る可能性のある立体構造を制限し、これにより、遊離のペプチドのライブラリーと比較して、結合親和性および特異性を増加させる。これらの操作された非抗体結合タンパク質は、異なる適用でのモノクローナル抗体の分子認識特徴を模倣するよう設計される。安定性の増加などの、これらの親和性試薬の特性を改善するこの様なバリエーション含む、ステフィンＡポリペプチド配列の他の部分のバリエーションを行い、それらを広範な温度およびｐＨなどにわたり頑強にすることができる。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ステフィンＡ由来の配列を含み、これにより、ヒトステフィンＡなどのステフィンＡ野生型配列と実質的な同一性を共有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ヒトステフィンＡに対応する配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％または６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。例えば、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性を共有するアミノ酸配列を有してもよく、例えば、配列バリエーションは、スキャフォールドが、所望される標的に結合する能力に有害に影響せず、例えば、野生型ステフィンＡが有するものなどの、生物学的機能を回復させも、生成もしないが、本明細書に記載される変異の変化で消失する。
二重特異性ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質
本開示の一態様は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に結合するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むキメラタンパク質を提供する。
ＰＤ－Ｌ１は、活性化ＴおよびＢ細胞により発現される鍵となる免疫チェックポイント受容体であり、免疫抑制を仲介する。ＰＤ－１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、およびＢＴＬＡを含む、受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンド、抗原提示細胞ならびに多くのヒトがん上で発現されており、ＰＤ－１への結合の際に、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御することが示されているプログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）およびプログラム死リガンド－２（ＰＤ－Ｌ２）が同定されている（Freeman et al., J. Exp. Med. 192(7): 1027-34 (2000)、 Latchm an et al., Nat Immunol 2:261-8 (2001)）。
ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞が、腫瘍および／またはストロマ細胞により発現された免疫抑制性ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４とも呼ばれる）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）リガンドに遭遇し得る、末梢組織において主に機能する（Flies et al., Yale J Biol Med 84:409-21 (2011)、Topalian et al., Curr Opin Immuno 24:1-6 (2012)）。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害は、前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を仲介する（米国特許第８，００８，４４９号および同第７，９４３，７４３号）。ＰＤ－Ｌ１の上方制御は、がんが、宿主免疫システムを逃れるのを可能にし得ると思われる。腎細胞癌腫を有する患者由来の１９６種の腫瘍標本の分析により、ＰＤ－Ｌ１を高発現する腫瘍は、増加した腫瘍攻撃性および４．５倍増加した死のリスクと関連することが見出された（Thompson et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 (49): 17174-9 (2004)）。より高い発現のＰＤ－Ｌ１を有する卵巣がん患者は、より低い発現を有する患者より、有意に悪い予後を有していた。ＰＤ－Ｌ１発現は、上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数と負に相関し、これは、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１が、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制し得ることを示唆している（Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (9): 3360-3365 (2007)）。
ＰＤ－Ｌ１はまた、感染性疾患、特に、慢性感染性疾患と関係している。細胞障害性ＣＤ８ Ｔ リンパ球（ＣＴＬ）は、感染の調整において中心的な役割を果たす。しかしながら、活性化ＣＴＬは、しばしば、慢性感染中のエフェクター機能を失っている。Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのＰＤ－１受容体およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞同時阻害経路として機能し、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ならびに慢性感染を確立し得る他の細菌、原虫、およびウイルス病原体の慢性感染中に、エフェクターＣＴＬを疲弊ＣＴＬに変換する主要な制御因子として出現している。このような細菌および原虫病原体としては、大腸菌、スタフィロコッカス種（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍａｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を挙げることができる。重要なことに、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の遮断は、疲弊ＣＴＬに機能を回復させることができる。したがって、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１は、慢性細菌およびウイルス感染に対する有効な予防および治療用ワクチン接種を開発するための標的である（例えば、Hofmeyer et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, vol. 2011, Article ID 451694, 9 pages, doi:10.1155/2011/451694を参照のこと）。
最近の研究により、全身免疫抑制は、神経変性疾患における脳修復に必要とされる保護細胞介在性免疫応答を開始する能力を減らし得ることも示された。アルツハイマー病のマウスモデルを使用することによって、プログラム死－１（ＰＤ－１）経路に対する免疫チェックポイント遮断は、インターフェロンγ依存性全身免疫応答、続いて、単球由来マクロファージの脳への動員を誘発することが示された。確立した病理を有するマウスにおいて誘導されるとき、この免疫応答は、脳アミロイド－β（Ａβ）プラークのクリアランスおよび認知性能の改善を導く。これらの知見は、免疫チェックポイントは、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体を使用して、アルツハイマー病などの神経変性疾患において治療標的化され得ることを示唆している（例えば、Baruch et al., Nature Medicine, January 2016, doi:10.1038/nm.4022を参照のこと）。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ＡＬＢ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＨＳＡは、約２０日の血清半減期を有する５８５個のアミノ酸ポリペプチド（約６７ｋＤａ）であり、コロイド浸透血圧、血液ｐＨ、ならびに多数の内在性および外来性リガンドの輸送および分布の維持に主に関与する。ＨＳＡは、３つの構造上相同なドメイン（ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を有し、ほぼ完全にアルファ－らせん形構造であり、１７個のジスルフィド架橋により高度に安定化されている。代表的なＨＳＡ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐｒｉｍａｒｙ受託番号Ｐ０２７６８により提供され、その他のヒトアイソフォームを含み得る。
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、溶媒が到達可能なループのうちの少なくとも１つが、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドが、一部の実施形態では、１０－６Ｍ以下のＫｄで、ＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに選択的に結合するのを可能にするアミノ酸配列を有する野生型ステフィンＡタンパク質由来である、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４～７．６で１×１０－９Ｍ～１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｐＨ７．４～７．６で１×１０－６Ｍ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４～７．６で１×１０－７Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４～７．６で１×１０－８Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４～７．６で１×１０－９Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で１×１０－９Ｍ～１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で１×１０－６Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で１×１０－７Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で１×１０－８Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ７．４で１×１０－９Ｍ以下のＫｄでＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡに結合する。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより２分の１ｌｏｇ～２．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより２分の１ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ５．８～６．２で、それぞれ、ｐＨ７．４～７．６でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより２分の１ｌｏｇ～２．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２分の１ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも１．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ｐＨ６で、ｐＨ７．４でのＨＳＡへの結合についてのＫｄより少なくとも２．５ｌｏｇ小さいＫｄでＨＳＡに結合する。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、１０時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、２４時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、４８時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、７２時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、９６時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、１２０時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、１４４時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、１６８時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、１９２時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、２１６時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、２４０時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、２６４時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、２８８時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、３１２時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、３３６時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、３６０時間より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質は、２４～３６０時間、４８～３６０時間、７２～３６０時間、９６～３６０時間、または１２０～３６０時間のヒト患者における血清半減期を有する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＨＳＡの血清半減期の５０％より長い、６０％より長い、７０％より長い、または８０％より長い、ヒト患者における血清半減期を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＨＳＡの血清半減期の５０％～８０％、５０％～９０％、または５０％～１００％のヒト患者における血清半減期を有する。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（ＨＳＡまたはＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）は、それぞれ独立して、一般式（Ｉ）：
ＦＲ１－（Ｘａａ）ｎ－ＦＲ２－（Ｘａａ）ｍ－ＦＲ３（Ｉ）
（式中、
・ＦＲ１は、ＭＩＰＧＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号１）またはＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号２）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列であり；
・ＦＲ２は、ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＫＳＬ（配列番号３）またはＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＮＧＰ（配列番号４）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列であり；
・ＦＲ３は、ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ（配列番号５）またはＥＤＬＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ（配列番号６）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列であり；
・Ｘａａは、個別に、出現ごとにアミノ酸であり、
・ｎは、３～２０の整数であり、
・ｍは、３～２０の整数である）で表されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＦＲ１は、配列番号１および／または２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ１は、配列番号１および／または２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列であり；一部の実施形態では、ＦＲ２は、配列番号３および／または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ２は、配列番号３および／または４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ３は、配列番号５および／または６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの相同性を有するポリペプチド配列である。一部の実施形態では、ＦＲ３は、配列番号５および／または６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％もの同一性を有するポリペプチド配列である。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号１６～５０のいずれか１つから選択されるループ２アミノ酸配列を含む（表１）。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号５１～８５のいずれか１つから選択されるループ４アミノ酸配列を含む（表１）。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号１６～５０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号１６～５０のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号１６～５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号５１～８５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号５１～８５のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号５１～８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号８６～１３８のいずれか１つから選択されるループ２アミノ酸配列を含む（表２）。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号８６～１３８のいずれか１つから選択されるループ４アミノ酸配列を含む（表２）。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号８６～１３８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号８６～１３８のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｎは、配列番号８６～１３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号１３９～１９１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号１３９～１９１のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、（Ｘａａ）ｍは、配列番号１３９～１９１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号１９２～２００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む（表３）。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号１９２～２００のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号１９２～２００のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号１９２～２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２０１～２３５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む（表４）。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２０１～２３５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２０１～２３５のいずれか１つのアミノ酸配列と８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２０１～２３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２３６～２４３および２９７のいずれか１つから選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる（表５）。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２３６～２４３および２９７のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２３６～２４３および２９７のいずれか１つの核酸配列と８０％～９０％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２３６～２４３および２９７のいずれか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２４４～２７６のいずれか１つから選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる（表６）。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２４４～２７６のいずれか１つの核酸配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２４４～２７６のいずれか１つの核酸配列と８０％～９０％の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、配列番号２４４～２７６のいずれか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。
融合タンパク質は、本明細書において、任意の１つもしくは複数のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよび／または任意の１つもしくは複数のＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含み得る。例えば、融合タンパク質は、１、２、３つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド分子および１、２、３つ以上のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド分子を圧縮し得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、３つ（少なくとも３つ）のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド分子および１つ（少なくとも１つ）のＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド分子を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよび１つのＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、第一のＰＤＬ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、第二のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、およびＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、第一のＰＤＬ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、および第二のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、第一のＰＤＬ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、および第二のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、互いに直接コンジュゲートされる。一部の実施形態では、融合タンパク質のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、本明細書に記載される通り、１つまたは複数のリンカーを介して互いにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、表７におけるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号２７７～２９１）。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２７７～２９１のアミノ酸配列のいずれか１つと８０％～９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２７７～２９１のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２７７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２７８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２７９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２８９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２９０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）融合タンパク質は、配列番号２９１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書で提供される融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドに結合したＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含み、結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの存在に起因して、延長した半減期を有する。半減期という用語は、物質（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含むタンパク質）が、その薬理的もしくは生理的活性または濃度の半分を失うのにかかる時間の量を指す。生物学的半減期は、物質の除去、排出、分解（例えば、酵素分解）、または身体のある特定の器官もしくは組織における吸収および濃度が影響し得る。生物学的半減期は、例えば、物質の血漿濃度が、その定常状態レベルの半分に達するのにかかる時間（「血漿半減期」）を決定することによって、評価することができる。
一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、インビボでのＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの血清半減期を延長する。例えば、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと結合していないＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも１．２倍、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期を延長し得る。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと結合していないＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期を延長する。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと結合していないＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期と比べて、１．２倍～５倍、１．２倍～１０倍、１．５倍～５倍、１．５倍～１０倍、２倍～５倍、２倍～１０倍、３倍～５倍、３倍～１０倍、１５倍～５倍、４倍～１０倍、または５倍～１０倍、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期を延長する。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと結合していないＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期と比べて、インビボ投与の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、例えば、少なくとも１週間後まで、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドの半減期を延長する。
ポリペプチド
ポリペプチドは、任意の長さのアミノ酸（天然に存在するまたは天然に存在しない、例えば、アミノ酸アナログ）のポリマーである。「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、別段示されない限り、本明細書において互換的に使用される。タンパク質は、ポリペプチドの一例である。ポリペプチドが、直鎖もしくは分岐であってもよく、それは、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しない（例えば、修飾された）アミノ酸を含んでもよく、ならびに／またはそれは、非アミノ酸（例えば、ポリマーを介して散在する）を含んでもよいことは、理解されるべきである。本明細書で提供されるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションを介して、修飾されてもよい（例えば、天然または非天然）。ポリペプチドは、場合によっては、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸を含む）の少なくとも１つのアナログおよび／または他の修飾を含有してもよい。
アミノ酸（アミノ酸残基としても言及される）は、ポリペプチドのペプチド結合に関与する。一般に、アミノ酸を示すために本明細書で使用される略語は、生化学的命名法についてのＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ委員会の推奨に基づく［Biochemistry (1972) 11:1726-1732を参照］。例えば、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＧｌｙは、それぞれ、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニンおよびグリシンの「残基」を表す。残基は、カルボキシル基のＯＨ部分およびα－アミノ基のＨ部分を除去することによって、対応するα－アミノ酸からもたらされたラジカルである。アミノ酸側鎖は、K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33により記載される、－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ部分を除く、アミノ酸のその一部である。
本明細書で使用されるアミノ酸は、一部の実施形態では、タンパク質で見られる天然に存在するアミノ酸、例えば、またはアミノおよびカルボキシル基を含有する、このようなアミノ酸の天然に存在する同化もしくは異化産物である。アミノ酸側鎖の例としては、以下のアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、ならびにペプチジルグリカン細菌細胞壁の成分として同定されたそのアミノ酸およびアミノ酸アナログのものから選択される側鎖が挙げられる。
塩基性側鎖を有するアミノ酸は、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓを含む。酸性側鎖を有するアミノ酸は、ＧｌｕおよびＡｓｐを含む。中性極性側鎖を有するアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＴｙｒを含む。中性の非極性側鎖を有するアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＰｈｅを含む。非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕを含む。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含む。小さい疎水性側鎖を有するアミノ酸は、ＡｌａおよびＶａｌを含む。芳香族側鎖を有するアミノ酸は、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｈｅを含む。
アミノ酸という用語は、本明細書で言及される任意の特定のアミノ酸のアナログ、誘導体または同類物を含み、例えば、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（特に、化学合成により生成される場合）は、例えば、シアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３－ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシ－フェニルアラニン、５－ヒドロキシトリプトファン、１－メチルヒスチジン、３－メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｉｏｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ）、オルニチン、またはジアミノ酪酸などのアミノ酸アナログを含み得る。ここで適当な側鎖を有する他の天然に存在するアミノ酸代謝産物または前駆物質は、当業者により理解され、本開示の範囲内に含まれる。
アミノ酸の構造が、立体異性体形態を許容するとき、このようなアミノ酸の（Ｄ）および（Ｌ）立体異性体がまた、本明細書に含まれる。本明細書におけるアミノ酸の配置およびアミノ酸は、適切な記号（Ｄ）、（Ｌ）または（ＤＬ）により示され、さらに、配置が示されないとき、アミノ酸または残基は、配置（Ｄ）、（Ｌ）または（ＤＬ）を有し得る。本開示の化合物の一部の構造は、非対称の炭素原子を含むことがわかるであろう。したがって、このような非対称性から生じる異性体が、本開示の範囲内に含まれることは、理解されるべきである。このような異性体は、古典的な分離技術により、および立体的に調節された合成により、実質的に純粋な形態で得ることができる。本開示の目的のため、対照的に明らかに示されない限り、命名されたアミノ酸は、（Ｄ）または（Ｌ）立体異性体の両方を含むと解釈されるだろう。
２種以上の核酸またはポリペプチドの文脈における、パーセント同一性は、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮することなく、最大の一致について比較され、整列された（必要に応じて、ギャップを導入する）とき、同じ（同一／１００％の同一性）か、または特定の割合（例えば、少なくとも７０％の同一性）の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウエアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査により測定されてもよい。アミノ酸またはヌクレオチド配列の整列を得るために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウエアが、当該技術分野で周知である。これらは、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、およびその変形を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本開示の２つの核酸またはポリペプチドは、実質的に同一であり、これは、それらが、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査により測定される、最大の一致について比較され、整列されるとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約１０残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約４０～６０残基、少なくとも約６０～８０残基、またはその間の任意の整数値であるアミノ酸配列の領域にわたり存在する。一部の実施形態では、同一性は、少なくとも約８０～１００残基などの、６０～８０残基より長い領域にわたり存在し、一部の実施形態では、配列は、標的タンパク質または抗体のコード領域などの、比較されている配列の全長にわたり実質的に同一である。一部の実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約１０塩基、少なくとも約２０塩基、少なくとも約４０～６０塩基、少なくとも約６０～８０塩基またはその間の任意の整数値であるヌクレオチド配列の領域にわたり存在する。一部の実施形態では、同一性は、少なくとも約８０～１０００塩基以上などの、６０～８０塩基より長い領域にわたり存在し、一部の実施形態では、配列は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列などの、比較されている配列の全長にわたり実質的に同一である。
保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において一般的に規定されている。例えば、チロシンに代わるフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。一般に、本開示のポリペプチド、可溶性タンパク質、および／または抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチド、可溶性タンパク質、または抗体の、標的結合部位への結合を阻止しない。結合を除去しないアミノ酸の保存的置換の同定方法は、当該技術分野で周知である。
本明細書において、単離された分子［例えば、ポリペプチド（例えば、可溶性タンパク質、抗体など）、ポリヌクレオチド（例えば、ベクター）、細胞、または他の組成物］は、天然で見出されない形態であることは、理解されるべきである。単離された分子は、例えば、天然で可能でない程度まで精製されている。
一部の実施形態では、単離された分子［例えば、ポリペプチド（例えば、可溶性タンパク質、抗体など）、ポリヌクレオチド（例えば、ベクター）、細胞、または他の組成物］は、実質的に純粋であり、それは、少なくとも５０％純粋（例えば、精製されていない形態の分子に付随する混入物の５０％を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である、単離された分子を指す。
ポリペプチド融合物を含むコンジュゲート
ｖｅｒｂコンジュゲート（ｖｅｒｂ連結と互換的に使用される）は、本明細書において、別の分子を形成するための２つ以上の分子（例えば、ポリペプチドおよび／または化学部分）を繋ぎ合わせることを指す。したがって、別の分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、薬物分子、または他の治療用タンパク質もしくは核酸）にコンジュゲートされたある分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）は、コンジュゲートを形成する。２つ以上の分子の結合は、例えば、非共有結合または共有結合を介したものであることができる。コンジュゲートの非限定的な例としては、化学コンジュゲート（例えば、「クリック」ケミストリーまたは別の化学反応を介して繋がれた）および融合物（連続するペプチド結合により連結された２つの分子）が挙げられる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、融合ポリペプチド、例えば、融合タンパク質である。
融合ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）は、少なくとも２つの別々の分子（例えば、２つの遺伝子）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる少なくとも２つのドメイン（例えば、タンパク質ドメイン）を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、アミド結合を介して共有結合されて、連続する融合ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を形成する、（ポリペプチドのアミノ酸に）２つのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、アミド結合を介して共有結合されて、連続する融合ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を形成する、（ポリペプチドのアミノ酸に）３つのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（例えば、２、３、４つ以上のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）は、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド）のＣ末端またはＮ末端に、連続するペプチド結合を介して、互いにコンジュゲートされる。
リンカーは、第一のポリペプチド［例えば、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド］と第二のポリペプチド［例えば、別のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド、Ｆｃドメイン、リガンド結合ドメインなど］の間に挿入された分子である。リンカーは、任意の分子、例えば、１つまたは複数のヌクレオチド、アミノ酸、化学官能基であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、２つ以上のアミノ酸）である。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌、または生理活性に不利に作用すべきではない。一部の実施形態では、リンカーは、抗原性ではなく、免疫応答を誘発しない。免疫応答は、自然免疫システムおよび／または養子免疫システムからの応答を含む。したがって、免疫応答は、細胞介在性応答および／または液性免疫応答であってもよい。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答、Ｂ細胞応答、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答、単球応答、および／またはマクロファージ応答であってもよい。他の細胞応答が、本明細書において企図される。
一部の実施形態では、リンカーは、タンパク質をコードしていない。
研究者により設計された経験的なリンカーは、それらの構造により３つのカテゴリー：可動性リンカー、強固なリンカー、およびインビボで切断可能なリンカーに一般的に分類される。機能的ドメインを一緒に連結するか（可動性および強固なリンカーにおけるように）、またはインビボで遊離機能ドメインを放出する（インビボで切断可能なリンカーにおけるように）際の基本的な役割の他に、リンカーは、生物学的活性の改善、発現量の増加、および所望の薬物動態特性の達成などの、融合タンパク質の産生について多くの他の利点を提供し得る。リンカーは、融合タンパク質の発現、分泌、または生理活性に不利に影響すべきでない。リンカーは、抗原性であるべきでなく、免疫応答を誘発すべきでない。
適当なリンカーは、当業者に公知であり、しばしば、グリシンとセリン残基の混合物を含み、しばしば、立体的に妨げられないアミノ酸を含む。有用なリンカーに取り込むことができる他のアミノ酸としては、スレオニンおよびアラニン残基が挙げられる。リンカーは、例えば、長さ１～５０アミノ酸、長さ１～２２アミノ酸、長さ１～１０アミノ酸、長さ１～５アミノ酸、または長さ１～３アミノ酸の範囲にあり得る。一部の実施形態では、リンカーは、切断部位を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、第二のポリペプチドが、第一のポリペプチドとは異なり得るように、酵素切断部位を含んでもよい。
一部の実施形態では、リンカーは、可動性と特徴付けることができる。可動性リンカーは、通常、結合されたドメインが、ある特定の程度の移動または相互作用を必要とするとき、適用される。それらは、一般的に、小さい非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）アミノ酸から構成される。例えば、Argos P. (1990) “An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion” J Mol Biol. 211:943-958を参照のこと。これらのアミノ酸の小さいサイズが、可動性をもたらし、結合している機能的ドメインの移動を可能にする。ＳｅｒまたはＴｈｒの取り込みは、水分子と水素結合を形成することによって、水溶液におけるリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーとタンパク質部分の間の好ましくない相互作用を低減する。最も一般的に使用される可動性リンカーは、主に、ＧｌｙとＳｅｒ残基（「ＧＳ」リンカー）の区画からなる配列を有する。最も広く使用される可動性リンカーの例は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎの配列を有する。コピー数「ｎ」を調節することにより、このＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成するか、または必須のドメイン間相互作用を維持することができる。ＧＳリンカーのほかに、多くの他の可動性リンカーは、組換え融合タンパク質のため設計されている。これらの可動性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小さいアミノ酸または極性アミノ酸がリッチであるが、可動性を維持するためにＴｈｒおよびＡｌａなどのさらなるアミノ酸、ならびに可溶性を改善するためにＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を含有することができる。
一部の実施形態では、リンカーは、強固と特徴付けることができる。可動性リンカーが、受動的に機能的ドメインを結合し、ある特定の程度の移動を可能にするという利点を有する一方、これらのリンカーの強固さの欠如は、発現量または生物学的活性などの、ある特定の融合タンパク質実施形態における限界であり得る。これらの場合での可動性リンカーが無効であることは、タンパク質ドメインの非効率的な分離または互いのそれらの干渉の不十分な低減に起因した。これらの状況下で、強固なリンカーは、ドメイン間の固定した距離を保ち、それらの独立した機能を維持するためにうまく適用されている。
多くの天然のリンカーは、αらせん構造を示した。αらせん構造は、セグメント内水素結合および密接に詰められた骨格を有して、強固かつ安定であった。したがって、堅いαらせんリンカーは、タンパク質ドメイン間の強固なスペーサーとして作用することができる。George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9を参照のこと。一般に、強固なリンカーは、αらせん構造を適合することによって、または複数のＰｒｏ残基を含有することによって、比較的堅い構造を示す。多くの状況下で、それらは、可動性リンカーより効率的に機能的ドメインを分ける。リンカーの長さは、コピー数を変えて、ドメイン間の最適な距離を達成することによって容易に調節することができる。結果として、ドメインの空間的分離が融合タンパク質の安定性または生理活性を保存するのに重大であるとき、強固なリンカーが選ばれる。この点について、（ＥＡＡＡＫ）ｎの配列を有するアルファらせん形成リンカーが、多くの組換え融合タンパク質の構築に適用されている。別のタイプの強固なリンカーは、Ｐｒｏリッチな配列である（ＸＰ）ｎを有し、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを示す。
単に説明するために、代表的なリンカーを挙げる。
対象の融合タンパク質において使用され得る他のリンカーとしては、ＳｅｒＧｌｙ、ＧＧＳＧ（配列番号３１３）、ＧＳＧＳ（配列番号３１４）、ＧＧＧＳ（配列番号３１５）、Ｓ（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１５）（式中、ｎは、１～７である）、ＧＲＡ、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ）、ｐｏｌｙ（Ａｌａ）、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号３１６）、ＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号３１７）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号３１８）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号３１９）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号３２０）、およびＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号３２１）が挙げられるが、これらに限定されない。以下で記載されるＦｃ融合物のヒンジ領域もまた、リンカーとみなされ得る。
例えば、Hunter,et al., (1962) Nature 144:945; David,et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain,et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219;およびNygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407により記載される方法を含む、任意のコンジュゲーション法が、分子を本開示のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドに結合するため使用されるか、または容易に適合され得る。
治療剤
一部の実施形態では、融合タンパク質は、治療分子（例えば、治療用タンパク質）を含んでもよく、使用して、例えば、ヒト対象または他の動物対象などの、対象における疾患を予防および／または処置してもよい。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、自己免疫疾患（対象の免疫システムが、誤って彼／彼女の身体を攻撃する状態）の処置のためのものである。自己免疫疾患の非限定的な例としては、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ギランバレー症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ループス）、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性蕁麻疹、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、乾癬、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、炎症性腸疾患、クローン病、シェーグレン症候群、溶血性貧血、好中球減少症、傍腫瘍性小脳変性症、異常タンパク質性多発ニューロパチー、原発性胆汁性肝硬変、全身硬直症候群、白斑、温式特発性溶血性貧血、多発性硬化症、１型糖尿病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性脈管炎、悪性貧血、およびセリアック病が挙げられる。他の自己免疫疾患が、本明細書で企図される。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、がんの処置のためのものである。がんの非限定的な例としては、皮膚がん（例えば、基底細胞もしくは扁平細胞などの、メラノーマまたは非メラノーマ）、肺がん、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、腎臓（腎臓の）がん、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、外分泌がん、および膵臓がんが挙げられる。他のがんが、本明細書で企図される。
当該技術分野で公知の、処置するという用語は、疾患と関連する少なくとも１つの症状を軽快させるプロセスを指す。症状は、疾患の身体的、精神的、または病理学的徴候であり得る。様々な疾患と関連する症状が公知である。特定の状態を処置または予防するために、本明細書で提供されるコンジュゲート（例えば、治療分子に連結されたＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質）は、状態を処置または予防するために使用される任意の量であり得る、有効量で投与されるべきである。したがって、一部の実施形態では、有効量は、処置されている特定の疾患と関連する症状を軽快させるために使用される量である。様々な治療分子などの有効量を決定するための方法は公知である。
対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、およびげっ歯類を含むが、これらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳類）であってもよい。「患者」は、ヒト対象を指す。
一部の実施形態では、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドは、「医薬的に許容し得る」とみなされ、一部の実施形態では、医薬的に許容し得る賦形剤と共に製剤化される。分子または他の物質／剤は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されるか、もしくは承認され得るか、またはヒトを含む、動物における使用についての米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に挙げられる場合、「医薬的に許容し得る」とみなされる。賦形剤は、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと組み合わせて投与される任意の不活性な（不活性化）無毒性薬剤であってもよい。賦形剤の非限定的な例としては、バッファー（例えば、無菌の生理食塩水）、塩、担体、保存剤、充填剤、着色剤が挙げられる。
使用方法
本開示の融合タンパク質は、非限定的に、がんのための免疫療法などの、治療処置方法を含む、様々な適用において有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、免疫応答の活性化、促進、増加、および／もしくは増強、腫瘍成長の阻害、腫瘍体積の低減、腫瘍退縮の誘導、腫瘍細胞アポトーシスの増加、ならびに／または腫瘍形成の低減に有用である。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドまたは薬剤はまた、ウイルスなどの、病原体に対する免疫療法に有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、ウイルス感染の阻害、ウイルス感染の低減、ウイルス感染細胞アポトーシスの増加、および／またはウイルス感染細胞の殺滅の増加に有用である。使用方法は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ、またはインビボ方法であってもよい。
本開示は、融合タンパク質を使用した、対象における免疫応答を活性化する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質を使用した、対象における免疫応答を促進する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、融合タンパク質を使用した、対象における免疫応答を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、融合タンパク質を使用した、対象における免疫応答を増強する方法を提供する。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、細胞介在性免疫を増加することを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔｈ１タイプ応答を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＴＬ活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させること、およびＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＣＵ活性を増加させること、およびＮＫ細胞活性を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を阻害するか、または減少することを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、ＭＤＳＣの抑制活性を阻害するか、または減少することを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、メモリーＴ細胞の割合数を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、長期免疫メモリー機能を増大させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、長期メモリーを増大させることを含む。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、実質的な副作用および／または免疫ベースの毒性の証拠を含まない。一部の実施形態では、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの証拠を含まない。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原刺激の結果である。一部の実施形態では、抗原刺激は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、抗原刺激は、がんである。一部の実施形態では、抗原刺激は、病原体である。一部の実施形態では、抗原刺激は、ウイルス感染細胞である。
融合タンパク質が活性化するか、または免疫応答を阻害するかどうかを決定するためのインビボおよびインビトロアッセイは、当該技術分野で公知である。
一部の実施形態では、対象における免疫応答を増加させる方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含み、融合タンパク質は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。一部の実施形態では、対象における免疫応答を増加させる方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含み、融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、対象における免疫応答を増加させる方法は、対象に、治療上有効量の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者において発現するとき、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を産生する。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、腫瘍に対する持続性または長期免疫応答を活性化するか、または増強する方法は、対象に、治療上有効量の、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍に対する持続性免疫応答を活性化するか、または増強する方法は、対象に、治療上有効量の記載される融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍に対する持続性免疫応答を活性化するか、または増強する方法は、対象に、治療上有効量の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者において発現されるとき、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を産生する。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性または長期免疫を誘導する方法は、対象に、治療上有効量の、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性免疫を誘導する方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する持続性免疫を誘導する方法は、対象に、治療上有効量の、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者において発現されるとき、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を産生する。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、対象に、治療上有効量の、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、腫瘍再発または腫瘍再成長を阻害する方法は、対象に、治療上有効量の、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者において発現されるとき、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を産生する。
一部の実施形態では、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドと共に、融合タンパク質においてもたらされるさらなる結合実体により標的とされる、腫瘍抗原を発現するか、または過剰発現する。
一部の実施形態では、腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、または対象は、腫瘍を有していたが、それは除去された。
一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫、および頭頸部腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、卵巣腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、肺腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、膵腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、メラノーマである。一部の実施形態では、腫瘍は、膀胱腫瘍である。
さらに説明するために、対象である融合タンパク質を使用して、骨肉腫、横紋筋肉腫、ニューロブラストーマ、腎臓がん、白血病、腎移行上皮がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、膵臓がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを含む）、前立腺がん、骨がん、肺がん（例えば、小細胞もしくは非小細胞肺がん）、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸部がん、滑膜肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、メラノーマ、腎臓のラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳がん、神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体アデノーマ、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟部組織肉腫、甲状腺がん、子宮内膜がん、カルチノイドがんもしくは肝臓がん、乳がんまたは胃がんなどの、がんに罹患している患者を処置することができる。本開示の一部の実施形態では、がんは、転移性がん、例えば、上記の様々なものの転移性がんである。
一部の実施形態では、がんは、血液のがんである。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）からなる群から選択される。
本開示はまた、本明細書に記載される融合タンパク質および医薬的に許容し得る媒体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫療法での使用を見出す。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫腫瘍学での使用を見出す。一部の実施形態では、組成物は、腫瘍成長の阻害での使用を見出す。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における腫瘍成長の阻害での使用を見出す。一部の実施形態では、組成物は、がんの処置での使用を見出す。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）におけるがんの処置での使用を見出す。
製剤は、本開示の精製融合タンパク質を医薬的に許容し得る媒体（例えば、担体または賦形剤）と組み合わせることによって、保存および使用のため調製される。当業者は、一般に、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、および／または安定剤を、製剤または医薬組成物の不活性な成分であるとみなす。
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、凍結乾燥され、および／または凍結乾燥された形態で保存される。一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質を含む製剤は、凍結乾燥される。
適当な医薬的に許容し得る媒体としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの無毒性バッファー；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメタノイウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどの、アルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールなどの保存剤；小分子量ポリペプチド（例えば、約１０アミノ酸残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；Ｚｎ－タンパク質複合体などの金属錯体；ならびにＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London）。
本開示の医薬組成物は、局所または全身処置のいずれかのための、任意の数の方法で投与することができる。投与は、上皮もしくは経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末による局所；噴霧器、気管内、および鼻腔内によるものを含む、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは注入による経肺；経口；あるいは静脈内、動脈内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内（例えば、注射もしくは注入）、または頭蓋内（例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内）を含む非経口であり得る。
治療用製剤は、単位投薬形態であり得る。このような製剤は、錠剤、ピル、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の溶液もしくは懸濁液、または座薬を含む。錠剤などの固体組成物において、主要な有効成分は、医薬担体と混合される。従来の錠剤化成分としては、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ニカルシウムまたはガム、および希釈剤（例えば、水）が挙げられる。これらを使用して、本開示の化合物、またはその無毒性の医薬的に許容し得る塩の均一な混合物を含有する固体プレ製剤組成物を形成することができる。次いで、固体プレ製剤組成物は、上記のタイプの単位投薬形態に細分される。製剤または組成物の錠剤、ピルなどをコーティングするか、またはそうでなければ調合して、延長した作用という利点をもたらす投薬形態を提供することができる。例えば、錠剤またはピルは、外部成分により覆われる内部組成物を含むことができる。さらに、２つの成分は、分解に抵抗するよう働き、内部成分が、胃を無傷で通過するか、または放出を遅延することを可能にする腸溶層によって分けることができる。様々な材料を、このような腸溶層またはコーティングのために使用することができ、このような材料としては、多数の高分子酸および高分子酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物が挙げられる。
本明細書に記載される融合タンパク質はまた、マイクロカプセル剤に封入することができる。このようなマイクロカプセル剤は、例えば、コロイド状薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル剤）における、またはRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonに記載されるマクロエマルジョンにおける、それぞれ、コアセルベーション技術により、または界面重合作用、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセル剤およびポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル剤により、調製される。
一部の実施形態では、医薬製剤は、リポソームと複合体化された本開示の融合タンパク質を含む。リポソームを産生する方法は、当業者に公知である。例えば、一部のリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発により生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るための規定の孔サイズのフィルターを通して排除することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質を含む徐放性調製物を産生することができる。徐放性調製物の適当な例としては、融合タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）などのヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ－グルタミン酸と７エチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、スクロースアセテートイソブチラート、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
疾患の処置のため、本開示の融合タンパク質の適当な投薬量は、全て主治医の裁量で、処置されるべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、融合タンパク質が、治療または予防目的のため投与されるかどうか、従前の療法、患者の臨床歴などに依存する。融合タンパク質は、１回もしくは数日から数カ月続く一連の処置にわたり、または治癒がもたらされるか、もしくは疾患状態の減少が達成される（例えば、腫瘍サイズの低減）まで、投与することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から計算することができ、個々の薬剤の相対的効力に応じて変動する。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法論、および繰り返し率を決定することができる。一部の実施形態では、投薬量は、０．０１μｇ～１００ｍｇ／体重１ｋｇ、０．１μｇ～１００ｍｇ／体重１ｋｇ、１μｇ～１００ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ～１００ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ～８０ｍｇ／体重１ｋｇ、１０ｍｇ～１００ｍｇ／体重１ｋｇ、１０ｍｇ～７５ｍｇ／体重１ｋｇ、または１０ｍｇ～５０ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約０．１ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約０．２５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約０．５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約１ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約１．５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約２ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約２．５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約７．５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約１０ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約１２．５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、融合タンパク質の投薬量は、約１５ｍｇ／体重１ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、毎日、毎週、毎月、または毎年、１回または複数回与えることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または４週間毎に１回与えられる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、開始のより多い「負荷」用量、続いて、１回または複数回のより少ない用量で投与されてもよい。一部の実施形態では、投与頻度は、変動してもよい。一部の実施形態では、投与計画は、開始用量、続いて、追加用量（または「維持」用量）を１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または１カ月毎に１回投与することを含んでもよい。例えば、投与計画は、開始負荷用量、続いて、例えば、開始用量の半分の毎週の維持用量を投与することを含んでもよい。または投与計画は、開始負荷用量、続いて、例えば、隔週での開始用量の半分の維持用量を投与することを含んでもよい。または投与計画は、３週間の３回の開始用量、続いて、例えば、隔週での同じ用量の維持用量を投与することを含んでもよい。
当業者に公知である通り、任意の治療剤の投与は、副作用および／または毒性を導き得る。ある場合では、副作用および／または毒性は、あまりに重篤であり治療上有効な用量で特定の薬剤の投与を妨げる。ある場合では、薬物療法は、中止されなければならず、他の薬剤が試されてもよい。しかしながら、同じ治療クラスの多くの薬剤は、しばしば、同様の副作用および／または毒性を呈し、これは、患者が、療法を停止しなければならないか、または可能であれば、治療剤に関連する不快な副作用に悩まされることを意味する。
一部の実施形態では、投薬スケジュールは、特定の回数の投与または「サイクル」に限定され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、３、４、５、６、７、８回以上のサイクルの間投与される。例えば、融合タンパク質は、６サイクルの間、２週毎に投与され、融合タンパク質は、６サイクルの間、３週毎に投与され、融合タンパク質は、４サイクルの間、２週毎に投与され、融合タンパク質は、４サイクルの間、３週毎に投与される。投薬スケジュールは、当業者により決定され、続いて改変され得る。
したがって、本開示は、融合タンパク質、化学療法剤などの投与と関連する副作用および／または毒性を低減し得る、１種または複数種の薬剤を投与するための間欠投薬ストラテジーを使用することを含む、対象に、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬剤を投与する方法を提供する。一部の実施形態では、ヒト対象におけるがんを処置する方法は、対象に、治療上有効用量の融合タンパク質を、治療上有効用量の化学療法剤と組み合わせて投与することを含み、薬剤の一方または両方は、間欠投薬ストラテジーに従い投与される。一部の実施形態では、間欠投薬ストラテジーは、開始用量の融合タンパク質を対象に投与すること、および続く用量の融合タンパク質を約２週間毎に１回投与することを含む。一部の実施形態では、間欠投薬ストラテジーは、開始用量の融合タンパク質を対象に投与すること、および続く用量の融合タンパク質を約３週間毎に１回投与することを含む。一部の実施形態では、間欠投薬ストラテジーは、開始用量の融合タンパク質を対象に投与すること、および続く用量の融合タンパク質を約４週間毎に１回投与することを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、間欠投薬スケジュールを使用して投与され、化学療法剤は、毎週投与される。
一部の実施形態では、本開示は、本開示の融合タンパク質を使用して対象を処置する方法を提供し、対象は、ウイルス感染に罹患している。一部の実施形態では、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、もしくはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、水いぼウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスまたはアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスの感染である。
一部の実施形態では、本開示は、本開示のその融合タンパク質を使用して、対象を処置する方法を提供し、対象は、細菌感染に罹患している。一部の実施形態では、細菌感染は、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア細菌、マイコバクテリア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒｉｃｉｓ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプロマトーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、ならびにボレリア属（Ｂｏｒｒｉｅｌｌａ）からなる群から選択される細菌の感染である。
一部の実施形態では、本開示は、本開示の融合タンパク質を使用して、対象を処置する方法を提供し、対象は、真菌感染に罹患している。一部の実施形態では、真菌感染は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）（ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ユミケカビ（ａｂｓｉｄｉａ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロスリックス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）からなる群から選択される真菌の感染である。
一部の実施形態では、本開示は、本開示の融合タンパク質を使用して、対象を処置する方法を提供し、対象は、寄生虫感染症に罹患している。一部の実施形態では、寄生虫感染症は、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される寄生虫の感染である。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド（核酸としても言及される）は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーであり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに取り込むことができる任意の基質が挙げられ得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において、ＨＳＡ結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドおよびＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含む融合タンパク質などの、ポリペプチドをコードする。当該技術分野で公知である通り、ポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの順序は、コードされるポリペプチド（例えば、タンパク質）に沿ってアミノ酸の順序を決定する。
ポリヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの任意の配列であってもよく、１本鎖、２本鎖、または部分的に２本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドの長さは、変動し、限定されない。したがって、ポリヌクレオチドは、例えば、２～１，０００，０００個のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、長さ１００～１００，０００、長さ１００～１０，０００、長さ１００～１，０００、長さ１００～５００、長さ２００～１００，０００、長さ２００～１０，０００、長さ２００～１，０００、または長さ２００～５００個のヌクレオチドを有する。
本明細書において、ベクターは、分子を細胞にデリバリーするための媒体を指す。一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、誘導可能または恒常的）を含む発現ベクターである。ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、ファージベクター、陽イオン縮合剤と関連するＤＮＡおよび／またはＲＮＡ発現ベクター、ならびにリポソームに被包されるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介性トランスフェクション、ポリブレン仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、または微粒子銃テクノロジー（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、例えば、任意のトランスフェクション法を使用して、細胞にトランスフェクションされてもよい。
［実施例１］
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）結合剤セレクション
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドライブラリーからのＨＳＡまたはＭＳＡ結合ファージのセレクションを、約６×１０１０種のサイズのライブラリーから加えた約１×１０１２ファージを使用して行った。
本開示のＨＳＡ結合ペプチドを、ＳＱＴの配列に基づく定常ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）フレームワーク骨格において提示される、長さ９アミノ酸の無作為なループ配列を含むファージディスプレイライブラリーからのセレクションによって同定した。ファージの懸濁液を、標的抗原（ストレプトアビジンビーズに捕捉されたビオチン化抗原またはプレートに捕捉された非ビオチン化抗原のいずれか）とインキュベートした。次いで、結合していないファージを洗い流し、続いて、結合したファージを、低ｐＨ、続いて高ｐＨで抗原をインキュベートすることによって溶出した。次いで、大腸菌に、放出させた中性化したｐＨのファージを感染させ、第一ラウンドのファージ調製物を得た。サイクルを、２または３回繰り返した。標的とするファージを濃縮するために、後のラウンドのセレクションにおいて、条件のストリンジェンシーを厳密にした。条件のストリンジェンシーの厳密は、洗浄工程の回数の増加、抗原濃度の低減、および／または遮断試薬でコーティングした遮断したストレプトアビジンビーズまたはウェルを用いたプレセレクションを含んでいた。
ファージセレクションのため本明細書で使用した抗原は、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ；Ａ３７８２）およびＭＳＡ（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；ＡＬＢ１３－Ｎ－２５）であった。抗原のビオチン化を、ＥＺ Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、施設内で行った。
連続ラウンドのファージ増幅によるセレクション後、ＨＳＡおよびＭＳＡ結合クローンを、以下に記載する通り、ファージＥＬＩＳＡにより同定した。ファージセレクション後、ファージミドベクターを含有する個々の細菌クローンを、タイトレーションプレートから９６ウェル細胞培養フォーマットに移動させた。遺伝子ＩＩＩマイナーコートタンパク質に融合したＨＳＡ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを呈した組換えファージ粒子を、ヘルパーファージレスキューおよび一晩増殖後、培養上清に放出した。続いて、上清に含有されるファージを、ＥＬＩＳＡにより、抗原への結合についてスクリーニングした。プレートに固定した抗原へのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質結合を呈しているファージを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、ＥＬＩＳＡを、１ステップウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して展開した。
［実施例２］
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）大腸菌タンパク質産生
大腸菌において発現した全てのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを、Ｃ末端のヘキサ－ＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２９２）を用いてクローニングして、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂（ＩＭＡＣ樹脂）を用いたタンパク質精製を単純化した。必要なときは、さらなるペプチド配列を、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質と、検出のためのＭＹＣ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ配列番号２９５）などのＨＩＳタグまたはタグの除去を可能にするためのＴＥＶタンパク質分解酵素切断部位［ＥＮＬＹＦＱ（Ｇ／Ｓ）配列番号２９６］の間に加えることができる。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を大腸菌から発現させ、ＩＭＡＣ、ＩＥＸ、およびＳＥＣを使用して精製した。大腸菌からのＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）単量体精製を、製造元のプロトコールを使用して、発現プラスミドｐＤ８６１（Ａｔｕｍ）をＢＬ２１大腸菌細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換することによって行った。全ての形質転換した細胞混合物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有するＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、形質転換した大腸菌の菌叢を、１×テリフィックブロス培地（Ｍｅｌｆｏｒｄ）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンの無菌のフラスコに移し、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でインキュベートした。細胞が、約０．８～１．０の光学密度ＯＤ６００に達したら、１０ｍＭラムノース（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を用いて発現を誘導した。次いで、培養物を、３７℃でさらに５時間インキュベートした。遠心分離し、得られた細胞ペレットを溶解することによって、細胞を回収した。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質精製を、Ｈｉｓタグの結合したタンパク質のバッチ結合親和性精製を使用して行った。具体的には、ニッケル寒天親和性樹脂（Ｓｕｐｅｒ－ＮｉＮＴＡ５００；Ｇｅｎｅｒｏｎ）を使用した。樹脂を、ＮＰＩ２０バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、結合したタンパク質を、５カラム容量（ＣＶ）のＮＰＩ４００バッファーを用いて溶出した。次いで、溶出したタンパク質を、クローンＨＳＡ－３１についてランニングバッファー２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、およびクローンＨＳＡ－４１について２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０においてＣＭ ＦＦイオン交換カラム（ＧＥ）を使用した陽イオン交換により精製した。両方のタンパク質精製は、０．１％トリトン１１４×（Ｓｉｇｍａ）洗浄工程をさらに含み、タンパク質を、１Ｍ ＮａＣｌ直線勾配を用いて溶出した。第三段階の精製を、ＰＢＳ １×バッファーにおけるＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）実行を使用して行う分取ＳＥＣにて行った。クローンＨＳＡ－４１およびＨＳＡ－３１の発現および純度を、ＰＢＳ １×移動相を使用したＡｃｃｌａｉｍ ＳＥＣ－３００カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いたＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して分析した。タンパク質収量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）Ａ２８０読み取りを使用して推定し、還元バッファー中で試料を加熱しながら、最終産物を、２００ボルト、Ｎｏｖｅｘ（商標）２０×Ｂｏｌｔ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｂｏｌｔ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ｐｌｕｓ ４～１２％ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ）を泳動させた。ゲル上のタンパク質バンドを、Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）を用いて染色した。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ染色済みタンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ）をゲル泳動させて、３段階の精製後の融合タンパク質の分子量を推定した。
［実施例３］
血清アルブミン結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質特徴決定
ヒト、マウス、およびカニクイザルについての血清に対するＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質親和性を、ｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方で、Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｏｃｔｅｔ）により評価した。ビオチン化抗原を、ｐＨ６．０または７．４のいずれかで、ＰＢＳ－Ｔ（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）＋１％カゼインを含むバッファー中、６００秒間、１μｇ／ｍｌでＳＡセンサーに捕捉した。３００秒間の結合、６００秒間の解離を行い、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、３×５秒間、再生を行った。全ての工程を、１０００ｒｐｍかつ２５℃で行った。精製したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、約１０×ＫＤ値の開始濃度、２倍の連続希釈液において分析した。Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウエアを使用し、参照センサー（抗原を添加）を減じ、Ｙ軸をベースラインに並べ、結合から解離に並べるための工程間の補正を使用して、動態分析を行った。Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用し、データを処理した。データの分析を、１：１モデル、グローバルフィット、センサーの付いていないＲｍａｘを用いて行った。
［実施例４］
インライン融合（ＩＬＦ）２量体で延長したＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質半減期
３種のＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質であるＡＶＡ０４－２３６（配列番号２７７および２７８）、ＡＶＡ０４－２６１（配列番号２７９および２８０）、ならびにＡＶＡ０４－２６９（配列番号２８１および２８２）の半減期を、ＮまたはＣ末端でのＡＶＡ－４１に遺伝子融合することによって、延長した。強固な（Ａ（ＥＡＡＡＫ）６（配列番号２９４））または可動性（Ｇ４Ｓ）６（配列番号２９３）反復遺伝子リンカーを使用して２量体遺伝子融合物として形成された、半減期の延長したＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の略図を図１Ａに示す。ＩＬＦ配向および命名の表を以下の表８に示す。表７は、ＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質との半減期延長インライン融合物の例を示す。
大腸菌からのＩＬＦ２量体産生を、３段階：親和性捕捉、ＩＥＸ、および分取ＳＥＣを使用して精製した。最終ＩＬＦタンパク質純度を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して評価し、＞９５％純粋であることを示した（図１Ｂ）。Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析により、遺伝子融合したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の両方が、標的抗原、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）に結合することができることを示した（表９）。ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ結合動態を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００動態分析を、アミンカップリング試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０において、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と固定したランニングバッファーＨＢＳ－ＥＰ＋およびシリーズＳセンサーＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップＦｃ２を使用して行った。ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の濃度タイトレーションを、３０μｌ／分の流速で分析物として行った。再生したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを、２０μｌ／分の流速で２０秒間、３ｍＭ ＮａＯＨ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面に固定した。Ｆｃ２－１データブランクを減じ、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウエア；ＧＥ）にフィットさせて、見かけＫＤ値を計算した。
［実施例５］
インライン融合３量体において延長したＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）２量体の半減期
図２は、ＨＳＡ－４１に強固なリンカーＡ（ＥＡＡＡＫ）６（配列番号２９４）を用いて遺伝子融合したＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）２量体の略図を示す。大腸菌におけるＩＬＦ産生を、親和性捕捉、ＩＥＸ、および分取ＳＥＣを使用して精製したタンパク質を使用して、行った。タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して評価した。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質は、９９．８％～１００％の純度であることを見出した（図３）。Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析により、遺伝子融合したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）２量体が、それらの標的タンパク質の両方に結合することができることを示した（図４Ａ）。ＡＶＡ０４ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１とＨＳＡ－４１に結合し、ＨＳＡに結合することを見出した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析を行い、ＨＳＡ結合を分析し、実施例８に記載した通り、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ結合を分析した（表１０）。
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）インライン融合フォーマットにおける様々な位置でのＨＳＡ－４１の付加が、ＡＶＡ０４－２５１のヒトＰＤ－Ｌ１への結合に影響するかを評価するために、ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡを、３種のＩＬＦ形成ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を用いて行った（図５）。簡単に言うと、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）キメラタンパク質を、炭酸塩バッファー中０．５ｍｇ／ｍｌで、９６ウェルプレートにコーティングした。５％カゼイン／ＰＢＳバッファーでの飽和後、プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質または対照の希釈液を、９０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ビオチン化ポリクローナル抗体抗シスタチンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え１時間おいた。プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出した。最後の洗浄工程後、ＴＭＢを、実験の展開のため加え、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。試験した３種のコンストラクトは、同様のＥＣ５０（０．０３～０．１ｎＭの範囲にある）を示し、抗ＰＤ－Ｌ１親ＩＬＦ２量体分子（ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ）と同一である。親分子と比較して、半減期の延長したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行い、これを確認した（図６）。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを、製造元の指示に従い、二連で行い、試験した３種のコンストラクトが、同様のＥＣ５０値（２倍以内の差）を有し、親２量体分子（ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ）と同一であることを示した。
同様に、ヒト血清アルブミンへの結合を、ｐＨ７．４でＥＬＩＳＡを使用して、３種の半減期の延長したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）コンストラクトについて評価した。簡単に言うと、ＨＳＡを、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌで９６ウェルプレートにコーティングした。５％ ＰＢＳカゼイン、ｐＨ７．５で飽和後、プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質または対照の希釈液を、９０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ビオチン化ポリクローナル抗体抗シスタチンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え１時間おいた。プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出した。最後の洗浄工程後、ＴＭＢを、実験の展開のため加え、プレートを４５０ｎｍで読み取った。試験した３種のコンストラクトは、同様のＥＣ５０（０．０３～０．０６ｎＭの範囲にある）を示し、親分子（ＨＳＡ－４１）と同一である（図７）。
［実施例６］
半減期の延長したＩＬＦ３量体の混合したリンパ球の反応
ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴインライン融合形成ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、混合したリンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて試験した（図８）。簡単に言うと、単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を、７日間培養したＣＤ１４＋単球から調製した。未熟ＤＣを７日目に使用し、同種Ｔ細胞（負の単離）および参照物質または媒体対照（ＲＰＭＩ－１０培地）と一緒に培養した。細胞を４日間培養し、上清中のＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡにより、培養期間の終わりに測定した。データを、平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍ．ｐｇ／ｍｌとして示すか、または媒体対照に正規化する（ｎ＝６）。点線は、平均媒体（ＲＰＭＩ－１０）値を表す。半減期形成ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４は、その対照（半減期の延長していない）と同様に、ＩＦＮγのレベルを増加させることを見出した（図８）。
［実施例７］
マウスにおけるＰＤ－Ｌ１結合半減期延長インライン融合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の薬物動態特性
半減期の延長を有するＩＬＦ ＡＶＡ０４－２５１ ３量体を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおける薬物動態研究において試験した。図９に記載する通り、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射した。６匹のマウスを使用し、血清を、９個の時間点（０、０．２５、６、２４、７２、１２０、１６８、および３３６時間）で集めた。それぞれの時間点についての血清試料をプールし、参照標準として注射した精製した分子を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。結果を、１５分での開始用量の割合として表した。半減期延長を有さないＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦ（ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ）は、迅速なクリアランス（３．２時間のｔ１／２）を有し、一方、ＩＬＦ ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴフォーマットは全て、ベータ期に推定した半減期延長を示した（２３．８～２４．２時間の範囲にある）。
［実施例８］
ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦ３量体のマウス異種移植片モデル試験
ＰＢＭＣを、１匹の健常なドナーから単離した。全Ｔ細胞を単離し、ＩＬ－２を添加した完全培地において７～１０日間、２ラウンド、Ａ３７５細胞上で拡大した。マウス（ｎ＝１０）に、腫瘍発生のため、Ａ３７５腫瘍細胞および活性化Ｔ細胞（ＰＢＳ中０．２ｍｌ）を右翼領域に皮下接種した。処置を、細胞接種の１時間後に開始した。ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４（配列番号２８３）精製タンパク質を、３週間にわたり、１週間に２回投与した。全体として、無作為化の１３日後に比較したとき、腫瘍成長の阻害を、両方の処置について示した。ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４（配列番号２８３）で処置した７０％より多くのマウスは、非結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦ ＳＱＴ ｇｌｙ ＸＴ２８（配列番号２８８）を生じる対照群と比較して、低減した腫瘍サイズを有していた（図１０Ａ～１０Ｃ）。
［実施例９］
ＡＶＡ０４半減期延長ＩＬＦ３量体Ｃ末端のｃｙｓ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質発現
迅速な変化である変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ）により、Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグ後にＣ末端のシステインアミノ酸をさらに含む半減期延長３量体を合成して、ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４ ｃｙｓ（配列番号１２６）を生成した。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を大腸菌から産生させ、親和性、ＩＥＸ、および分取サイズ除外を用いて精製した。２ｍＭ ＴＣＥＰを含む還元条件下での精製タンパク質の特徴決定により、最終タンパク質の純度が、＞９７％であることを示した（図１１）。したがって、マレイミド化学を使用して続くコンジュゲーションのため、遊離システインを有するかたちでＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦタンパク質を産生して、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質と薬物のコンジュゲートの生成を可能にすることができる。
［実施例１０］
抗マウスＰＤ－Ｌ１結合剤である半減期延長インライン融合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体の例
ＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０半減期延長ＩＬＦ３量体を、大腸菌から産生した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を、実施例２に記載の通り行い、＞９８％を超える最終タンパク質純度を示した（図１２Ａ）。精製したタンパク質をＢｉａｃｏｒｅで実行して、マウスＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタグ付き組み換え抗原（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）へのその親和性を評価した。抗原を、プロテインＡチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦフォーマットを、最高濃度１ｎＭからタイトレーションし、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して再生する、単一のサイクル動態を使用して分析物として流した。Ｆｃ２－１動態データからブランクを減じ、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウエア；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にフィットさせて、９０．６ｐＭのＫＤ値を計算し、これにより、この形態の半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の付加が、マウスＰＤ－Ｌ１標的抗原へのＡＶＡ０４－１８２結合に影響しないことを確認した（図１２Ｂ）。
ＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０ ＩＬＦを、ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でのＨＳＡへのその結合能について、ＥＬＩＳＡで評価した（実施例４に記載した通り）。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＶＡ０４－１８２ ＸＴ２０が、ＨＳＡ－４１がＭＳＡに結合する能力を保持したことを示している。加えて、半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質が機能的であるかどうかを評価するために、競合的ＥＬＩＳＡ（ｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１）を行った。簡単に言うと、ＰＤ－１を、炭酸塩バッファー中の１μｇ／ｍｌで一晩プレートにコーティングした。次いで、プレートを、５％カゼイン／ＰＢＳバッファーを使用して飽和させた。その間に、ｍＰＤ－Ｌ１を、半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質およびその対照の希釈液と共にプレインキュベートした。飽和後、混合物をプレートに加え、９０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、検出ポリクローナル抗体であるビオチン化抗ＰＤ－Ｌ１を加えた。プレートを洗浄後、ストレプトアビジン－ＨＲＰを加え３０分間おいた。最後の洗浄後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、反応を展開し、プレートを、４５０ｎｍでプレートリーダーを使用して読み取った（図１３Ｃ）。図は、半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質が、その親分子と同様の中和能を有することを示す。
概念の証拠として、薬物動態研究をマウスで行った。１群当たり１２匹の動物に、２５ｍｇ／ｋｇ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を腹腔内（ＩＰ）注射し、時間点当たり３匹の動物を使用した。８個の時間点で、注射の最長３３６時間後に、血清を集めた。プールした血清を、ＥＬＩＳＡを使用して分析して、血清におけるＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質のレベルを定量した。半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質薬物動態特性は、本研究において約１７時間の半減期を示した（図１４）。
［実施例１１］
Ａ３７５マウス異種移植モデルにおけるＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ－８００ＣＷの体内分布
抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質が、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍を標的とするかどうかを、マウス異種移植モデルにおいて評価して、蛍光画像化を使用して、経時的なＩＲ色素コンジュゲートＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の体内分布を調べた。ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ ｃｙｓおよびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４ ｃｙｓを、マレイミド化学を用いてＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ（ＬＩ－ＣＯＲ）にコンジュゲートして、タンパク質上のアクセス可能なアミノ基を修飾した。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ中１ｍｇ／ｍｌに希釈し、室温（約２３℃）、暗所条件下で２時間、９：１の色素：タンパク質の化学量論で、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ（水中の４ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートした。遊離色素を、製造元の指示に従い、５ｍＬのＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７０００；Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、色素コンジュゲートＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質から分離した。色素：タンパク質の比を、方程式：
色素：タンパク質の比＝（Ａ７８０／ε色素）／（Ａ２８０－（０．０３×Ａ７８０））／εタンパク質
［式中、０．０３は、２８０ｎｍでのＩＲＤｙｅ ８００ＣＷの吸光度についての補正因子であり、ε色素およびεタンパク質は、それぞれ、ＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ Ｃｙｓについて、色素２７０，０００Ｍ－１ｃｍ－１およびタンパク質３９８７１Ｍ－１ｃｍ－１およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４ ｃｙｓについて３７６２６Ｍ－１ｃｍ－１のモル吸光係数である］に従い、２８０および７８０ｎｍでの吸光度に基づき計算した。図１５Ａ～１５Ｃは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法を使用してコンジュゲートした材料の概要フォーマットおよび純度を示す。
組換えヒトＰＤ－Ｌ１への色素コンジュゲートＡＶＡ０４－２５１ ＢＨ－８００またはＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ１４－８００の結合を、ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡを使用して、非コンジュゲートＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質と比較した。
簡単に言うと、ヒトＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）キメラタンパク質を、炭酸塩バッファー中０．５μｇ／ｍＬで、９６ウェルプレートにコーティングした。５％カゼイン／ＰＢＳバッファーで飽和後、プレートを洗浄し、コンジュゲートＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質または非コンジュゲート対照の希釈液を、９０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ビオチン化ポリクローナル抗シスタチンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出した。最後の洗浄工程後、ＴＭＢを加え、プレートを４５０ｎｍで読み取った。コンジュゲートＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質は、親分子と比較して、同様のＥＣ５０を示した。したがって、データは、同等の結合曲線に基づき、ＰＤ－Ｌ１標的に対する両方のコンジュゲート形成分子の親和性に影響しないことを示す（図１６Ａ～１６Ｂ）。
Ａ３７５マウス異種移植モデルを、Ａ３７５細胞（無菌のＰＢＳ１００μＬ中５×１０６細胞［ＡＴＣＣ］）の動物の横腹への皮下注射後のメスの胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において確立した。腫瘍を、発生している腫瘍をカリパスで測定しながら、１週間当たり３回モニターした。腫瘍を、３匹のマウスの尾静脈へのＡＶＡ０４－２５１ ＢＱ－８００およびＢＨ－８００（１ｎｍｏｌ）の静脈内投与前に、５００～１０００ｍｍ３まで成長させた。蛍光画像を、注射直後（時間０）ならびに投与の１、２、４、８、２４、および４８時間後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｉｍａｇｅｒを用いて記録した。４時間の時間点で、腫瘍への半減期延長を有する抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の標的化を検出した。データを図１７に示し、矢印は、腫瘍のおよその位置を示す。
［実施例１２］
ＨＳＡ－１８半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを用いたＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ ＩＬＦの形成
２種のＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体インライン融合（ＩＬＦ）フォーマットを設計した。それぞれが、２種の融合ＡＶＡ０４－２５１ヒトＰＤ－Ｌ１結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含み、それをＨＳＡ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（ＨＳＡ－１８）とさらに融合して、半減期を延長させた。ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０（配列番号２９０）は、Ｃ末端に位置する半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質を含み、一方、ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１（配列番号２９１）は、フォーマットの中程に半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを含み、これにより、２種の抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチドを分けている（模式図、図１８）。ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド間に反復性強固な遺伝子リンカーＡ（ＥＡＡＡＫ）６（配列番号２９４）を有するフォーマットを設計した。実施例２に記載した通り、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体を大腸菌から産生し、分取サイズ除外後に親和性ＮｉＮＴＡ樹脂を用いて精製した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析は、タンパク質フォーマットの最終純度は＞９８％であったことを示す（図１８）。
［実施例１３］
血清アルブミンに結合する半減期延長ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１ ＩＬＦフォーマット
実施例３に既に記載した方法を使用して、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４のランニングバッファーを用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析を行った。データは、半減期延長ＨＳＡ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ポリペプチド（ＨＳＡ－１８）を含有するＩＬＦフォーマットが、１０９～１５２ｎＭのＨＳＡ－１８単量体親和性の２～４倍内の、ｐＨ７．４で３桁のｎＭの親和性およびｐＨ６．０での２桁のｎＭの親和性のＫＤでＨＳＡに結合することを示した（図１９Ａ～１９Ｂ）。ｐＨ６．０条件でのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）について、ＩＬＦフォーマットの結合親和性は、単量体血清アルブミン結合ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質の約２倍以内であった（図２１）。
［実施例１４］
血清アルブミンに結合する半減期延長ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１ ＩＬＦフォーマット
ヒト血清アルブミンおよびマウス血清アルブミンへの結合を、ＥＬＩＳＡを用いてｐＨ７．４で、２種の半減期延長ＩＬＦ ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）フォーマット（ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０、配列番号２９０；ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１、配列番号２９１）について評価した。簡単に言うと、ＨＳＡまたはＭＳＡを、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌで、９６ウェルプレートにおいてコーティングした。５％ ＰＢＳカゼイン、ｐＨ７．５で飽和後、プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体または対照の希釈液を、９０分間、プレート上でインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ビオチン化ポリクローナル抗体抗シスタチンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え１時間おいた。プレートを洗浄し、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）ＩＬＦを、ストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して検出した。最後の洗浄工程後、ＴＭＢを、実験の展開のため加え、プレートを、４５０ｎｍで読み取った。試験した２種のＩＬＦであるＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１は、ＨＳＡ（５．７～８．８の範囲である）とＭＳＡ（１３３．６～６０．８の範囲である）の両方について、同様のＥＣ５０値を示した（図２０）。
［実施例１５］
ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃに結合するＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０およびＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１ ＩＬＦフォーマット
実施例３に記載した通り、Ｂｉａｃｏｒｅ動態分析を、単一サイクルの動態を用いて行い、ＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６０ならびにＡＶＡ０４－２５１ ＸＴ６１（それぞれ、配列番号２９０および２９１）の結合を評価した。実験を行い、ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）３量体をＨＳＡ－４１と比較した。結合親和性ＫＤ値は、３桁のｎＭの範囲にあり、半減期延長ＡＦＦＩＭＥＲ（登録商標）タンパク質が、フォーマットの中程またはＣ末端にあるかどうかにかかわらず、観察した結合速度（ｏｎ）および解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）で同様であった（図２２）。

Claims (40)

  1. ステフィンポリペプチドのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合組換え操作された変異体およびＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ＨＳＡ結合ポリペプチドが、ｐＨ６．０で１×１０－６Ｍ以下のＫｄ、適宜、ｐＨ７．４で、ｐＨ６．０での結合についてのＫｄより少なくとも２分の１ｌｏｇ大きいＨＳＡ結合についてのＫｄでＨＳＡに結合し、ＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドが、１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する、融合タンパク質。
  2. ＨＳＡに結合するステフィンポリペプチドのＨＳＡ結合組換え操作された変異体およびＰＤ－Ｌ１に結合するステフィンポリペプチドのＰＤ－Ｌ１結合組換え操作された変異体を含む融合タンパク質であって、少なくとも７日間のヒト対象における循環半減期を有する融合タンパク質。
  3. ＨＳＡ結合ポリペプチドが、配列番号８６～１３８のいずれか１つから選択されるループ２配列および／または配列番号１３９～１９１のいずれか１つから選択されるループ４配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. ＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドが、配列番号１６～５０のいずれか１つから選択されるループ２配列および／または配列番号５１～８５のいずれか１つから選択されるループ４配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 配列番号２７７のアミノ酸配列、または配列番号２７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 配列番号２７８のアミノ酸配列、または配列番号２７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 配列番号２７９のアミノ酸配列、または配列番号２７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 配列番号２８０のアミノ酸配列、または配列番号２８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 配列番号２８１のアミノ酸配列、または配列番号２８１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. 配列番号２８２のアミノ酸配列、または配列番号２８２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドをさらに含み、第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドが、１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  12. ステフィンのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合組換え操作された変異体、第一のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチド、および第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドを含むインライン融合タンパク質であって、ＨＳＡ結合ポリペプチドが、ｐＨ６．０で１×１０－６Ｍ以下のＫｄ、適宜、ｐＨ７．４で、ｐＨ６．０での結合についてのＫｄより少なくとも２分の１ｌｏｇ大きいＨＳＡ結合についてのＫｄでＨＳＡに結合し、第一および第二のＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチドが、１×１０－６ＭのＫｄでＰＤ－Ｌ１に結合する、インライン融合タンパク質。
  13. リンカーをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. リンカーが、強固なリンカーまたは可動性リンカーである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 強固なリンカーが、配列番号２９４の配列を含むか、または可動性リンカーが、配列番号２９３の配列を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. 配列番号２８３のアミノ酸配列、または配列番号２８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 配列番号２８４のアミノ酸配列、または配列番号２８４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 配列番号２８５のアミノ酸配列、または配列番号２８５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 配列番号２８６のアミノ酸配列、または配列番号２８６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 配列番号２８７のアミノ酸配列、または配列番号２８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. 配列番号２９０のアミノ酸配列、または配列番号２９０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  22. 配列番号２９１のアミノ酸配列、または配列番号２９１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  23. 可動性リンカーをさらに含み、適宜、可動性リンカーが、配列番号２９３の配列を含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  24. 前記請求項のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、ヒト対象における治療使用に適した医薬組成物。
  25. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
  26. 融合タンパク質をコードする配列が、転写制御配列に作動可能に連結されている、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター。
  28. 請求項２５または２６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはミニサークル。
  29. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチド、請求項２７に記載のウイルスベクター、または請求項２８に記載のプラスミドもしくはミニサークルを含む細胞。
  30. 感染性疾患を処置する方法において使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  31. がんを処置する方法において使用するための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  32. さらなる治療活性および／またはさらなるＰＫ／ＡＤＭＥ特性を融合タンパク質に付与し得る、１つまたは複数のさらなるポリペプチド配列をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  33. さらなるポリペプチド配列が、受容体リガンドである、請求項３２に記載の融合タンパク質。
  34. 受容体リガンドが、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１２などの免疫賦活性サイトカイン、またはその変異型配列である、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  35. さらなるポリペプチド配列が、配列番号１２８２のアミノ酸配列、または野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドの高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を消失させるか、もしくは低減し、突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドの中親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を保存する、配列番号１２８２に対して１個または複数のアミノ酸置換を有する、その少なくとも７０％同一の配列を含む突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドである、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  36. さらなるポリペプチド配列が、配列番号１２８２のアミノ酸配列を含むが、Ｔ３（例えば、Ｔ３Ａ）、Ｄ２０（例えば、Ｄ２０Ｔ）、Ｒ３８（例えば、Ｒ３８ＡおよびＲ３８Ｄ）、Ｆ４２（例えば、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２ＲもしくはＦ４２Ｋ）、Ｋ４３（例えば、Ｋ４３Ｅ）、Ｅ６１（例えば、Ｅ６１Ｒ）、Ｅ６２（例えば、Ｅ６２Ａ）、Ｙ４５（例えば、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５ＲもしくはＹ４５Ｋ）および／またはＬ７２（例えば、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２ＲもしくはＬ７２Ｋ）から選択される位置に１個または複数のアミノ酸置換を有する突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドである、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  37. 受容体リガンドが、同時刺激性受容体についてのものであり、融合タンパク質が結合の際、同時刺激性受容体を刺激する、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  38. 受容体リガンドが、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤＢ７．１、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬまたはＬＩＧＨＴから選択される、請求項３７に記載の融合タンパク質。
  39. 融合タンパク質の２量体化またはより高いオーダーの多量体化を誘導するポリペプチド配列をさらに含む、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  40. さらなるポリペプチド配列が、Ｔ細胞表面のＣＤ３に結合するよう方向づけるＣＤ３結合ポリペプチド配列である、請求項３３に記載の融合タンパク質。
JP2023506112A 2020-07-30 2021-07-30 血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド Pending JP2023535809A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063059026P 2020-07-30 2020-07-30
US202063059037P 2020-07-30 2020-07-30
US63/059,037 2020-07-30
US63/059,026 2020-07-30
PCT/EP2021/071417 WO2022023538A2 (en) 2020-07-30 2021-07-30 Serum half-life extended pd-l1 inhibitory polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023535809A true JP2023535809A (ja) 2023-08-21

Family

ID=77543464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023506112A Pending JP2023535809A (ja) 2020-07-30 2021-07-30 血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230272081A1 (ja)
EP (1) EP4188956A2 (ja)
JP (1) JP2023535809A (ja)
KR (1) KR20230058064A (ja)
AU (1) AU2021319015A1 (ja)
CA (1) CA3187459A1 (ja)
IL (1) IL300242A (ja)
MX (1) MX2023001262A (ja)
TW (1) TW202221031A (ja)
WO (1) WO2022023538A2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023057946A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0607351A2 (pt) 2005-02-15 2009-09-01 Novartis Vaccines & Diagnostic métodos para tratamento de linfomas empregando uma combinação de agente quimioterapêutico e il-2 e opcionalmente um anticorpo anti-cd20
CN109485727A (zh) 2005-05-09 2019-03-19 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
MX2007015942A (es) 2005-07-01 2008-03-07 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para ligandos 1 (pd-l1) de muerte programada.
SI2673294T1 (sl) 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
US9212224B2 (en) 2012-05-15 2015-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies that bind PD-L1 and uses thereof
GB201805963D0 (en) * 2018-04-11 2018-05-23 Avacta Life Sciences Ltd PD-L1 Binding Affirmers and Uses Related Thereto
CN112601554A (zh) * 2018-06-04 2021-04-02 塔夫茨大学信托人 肿瘤微环境活化的药物-结合剂缀合物和与其相关的用途
WO2021074683A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Avacta Life Sciences Limited Bispecific anti-pd-l1 and anti-fcrn polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021319015A1 (en) 2023-03-02
WO2022023538A3 (en) 2022-03-10
MX2023001262A (es) 2023-07-19
CA3187459A1 (en) 2022-02-03
IL300242A (en) 2023-03-01
TW202221031A (zh) 2022-06-01
KR20230058064A (ko) 2023-05-02
EP4188956A2 (en) 2023-06-07
WO2022023538A2 (en) 2022-02-03
US20230272081A1 (en) 2023-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11884721B2 (en) Erythrocyte-binding therapeutics
US11919931B2 (en) Anti-cancer fusion polypeptide capable of binding both CD137 and glypican-3 (GPC3)
CN109563148B (zh) T细胞受体
EP3327040B1 (en) Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
US9212231B2 (en) TRAIL R2-specific multimeric scaffolds
CN108948196B (zh) Cd40l-特异性tn3-衍生的支架及其使用方法
KR20150014443A (ko) Ｃｔｌａ－４ 변이체
TW201130501A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
JP6917368B2 (ja) 一本鎖ｃｄ２７受容体アゴニストタンパク質
WO2021074683A1 (en) Bispecific anti-pd-l1 and anti-fcrn polypeptides
KR20210063351A (ko) 항-cd3 항체 폴레이트 생체접합체 및 이들의 용도
JP2023535809A (ja) 血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド
JP2023550191A (ja) Ｄｒ４および／またはｄｒ５を標的とするポリペプチドならびに関連する組成物および方法
CN109867725B (zh) PD-1-Fc融合蛋白及其制备方法和用途
CA3133136A1 (en) Process for the preparation of lipidated proteinaceous structures
CN116507635A (zh) 血清半衰期延长的pd-l1抑制性多肽
JP2023532760A (ja) 特異的結合分子
CN113874393A (zh) 对hbv包膜蛋白具有特异性的结合分子
CN115867310A (zh) 用于治疗癌症的识别kras g12d的抗cd3的可溶性tors和融合物

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20231222