JP2023535203A - 置換カンナビノイド及び前駆体を生成するための修飾酵素を有する方法及び細胞 - Google Patents

Abstract

本開示は概して、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞における、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体の生成のための方法及び細胞に関する。O-メチル、グリコシル、又はハロゲン等の置換基により植物性カンナビノイド又は前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により、宿主細胞を形質転換する工程を含む方法が記載される。形質転換された細胞は培養されて、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、2020年7月24日出願、タイトルMETHODS AND CELLS WITH MODIFYING ENZYMES FOR PRODUCING SUBSTITUTED CANNABINOIDS AND PRECURSORSの、米国仮特許出願第63/056,126号の利益及びこれに対する優先権を主張する。

本開示は概して、異種酵素を使用しての、宿主細胞における植物性カンナビノイドの生成に関する。植物性カンナビノイドの生成のための方法及び細胞株、並びにそのように形成される生成物が記載される。

植物性カンナビノイドは、アサ(Cannabis sativa)、他の植物、及び一部の真菌において天然に生成される。105種を超える植物性カンナビノイドが、アサにおいて生合成されるか、又はアサにおいて生合成された植物性カンナビノイドからの熱若しくは他の分解より生じることが知られている。アサ植物は種子、繊維、及び他の材料の有益な供給源でもあるが、植物性カンナビノイド生成のため、特に屋内でアサを育てることは、エネルギー及び労力の観点から高コストである。それに続く、アサ植物からの植物性カンナビノイドの抽出、精製、及び分画も、多大な労力及びエネルギーを必要とする。

植物性カンナビノイドは、アサの医療及び向精神効果に寄与する薬理学的に活性な分子である。アサ植物における生合成は、他の農業計画と同様の規模である。他の農業計画と同様に、アサを育てることによる植物性カンナビノイドの大規模生成には、多様なインプット(例えば養分、光、有害生物防除、CO₂、等)が必要である。アサを栽培するのに必要なインプットが供給されなければならない。更に、アサの栽培は、認められる場合、目下のところ厳しい規制、税金、及び植物から調製された生成物が商業用である場合、厳密な品質管理を課され、更にコストが増大する。結果として、丈夫で拡大縮小可能な発酵性の生物において植物性カンナビノイドを生成するのが経済的でありうる。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、工業規模の類似の分子を生成するのに使用されてきた。

植物性カンナビノイド生成のためにアサを育てるのに伴う時間、エネルギー、及び労力から、酵母における植物性カンナビノイドの生成のためのトランスジェニック細胞株を生成しようとする動機がもたらされる。そのような取り組みの一例が、参照により本明細書に組み込まれる、MookerjeeらのPCT特許出願WO2018/148848で提供される。

酵母ベースの生合成の利点は、株が、通常アサでは大量には生成されないカンナビノイドを合成するように容易に改変されうることである。CBGa、THCa及びCBDa以外のカンナビノイドはしばしば「マイナーカンナビノイド」とまとめて呼ばれ、このクラスの多くのメンバーが、医学及び関連分野において重要な用途を有する。例えばTHCVは、糖尿病、パーキンソン病及びてんかんの治療において使用できる可能性を有する(全て参照により本明細書に組み込まれる、Wargentら、2013;Garciaら、2011;米国特許第9,066,920号)。

植物性カンナビノイドの生成のための、及び/又は芳香族ポリケタイド等の、中間体若しくは前駆体化合物として植物性カンナビノイド合成において有用な化合物の生成のための、代替の方法を見つけるのが望ましい。

WO2018/148848 米国特許第9,066,920号 CA2020/050687 US2019/0338301 A1

植物性カンナビノイドを生成するための方法、細胞、及び他の態様が記載される。特に、酵素OMT1～OMT30を使用するO-メチル化カンナビノイド及びカンナビノイド前駆体の生成が記載され、GLY1～GLY11から選択される酵素を使用するグリコシル化カンナビノイド及びカンナビノイド前駆体の生成が記載され、HAL1～HAL20から選択される酵素を使用するハロゲン化カンナビノイド及びカンナビノイド前駆体の生成が記載される。

植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞において、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法であって、置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により、前記宿主細胞を形質転換する工程、及び前記形質転換された宿主細胞を培養して、前記置換植物性カンナビノイド又は前記置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する工程を含む、方法が本明細書で提供される。

更に、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法であって、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成することが可能な宿主細胞を用意する工程、前記植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、及び置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体の生成に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、方法が提供される。

置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有する酵素をコードするか、又はそれらに対し少なくとも70%の同一性を有する酵素をコードする、発現ベクターが本明細書で記載される。

更に、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞が提供される。

塩素化オリベトール酸等の、記載される方法に従って形成される独自の生成物も、本明細書で提供される。

一態様によれば、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞において、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法が本明細書で記載される。方法は、置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により、前記宿主細胞を形質転換する工程、及び前記形質転換された宿主細胞を培養して、前記置換植物性カンナビノイド又は前記置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する工程を含み、誘導体化する工程は、
(i)置換基がO-メチルであり、誘導体化するための酵素が、配列番号1～配列番号30のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むOMT1～OMT30タンパク質からなる群から選択されるO-メチル化酵素を含む、O-メチル化、
(ii)置換基がグリコシルであり、誘導体化するための酵素が、配列番号31～配列番号41のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むGLY1～GLY11タンパク質からなる群から選択されるグリコシル化酵素を含む、グリコシル化、又は
(iii)置換基がハロゲンであり、誘導体化するための酵素が、配列番号42～配列番号62のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むHAL1～HAL20タンパク質からなる群から選択されるハロゲン化酵素を含む、ハロゲン化
を含む。

本開示の他の態様及び特性は、添付の図面と併せて、具体的な実施形態についての以下の記載を確認すれば、当業者には明らかとなる。

本開示の実施形態が、あくまで例として、図面を参照してここで記載される。

グリコシラーゼ、ハロゲナーゼ及びO-メチルトランスフェラーゼが、THCa生成酵母株においてカンナビノイド又はカンナビノイド前駆体を誘導体化するのに使用可能である、一般的体系を描写する図である。

修飾酵素は、望ましい修飾された植物性カンナビノイド又は前駆体を生成するように、生物に挿入されうる。そのような酵素を組み込むことにより、グリコシル化、ハロゲン化及び/又はO-メチル化反応が、カンナビノイド生成酵母株において起こりうる。グリコシル化、O-メチル化及びハロゲン化は、有用な生成物につながる、天然に存在する植物性カンナビノイドの酵素的誘導体化により達成可能な化学修飾のうちの3つの例示的な種類である。O-メチル化カンナビノイド及び前駆体を生成する方法は、OMT1～OMT30から選択される酵素を使用して利用可能であり、グリコシル化カンナビノイド及び前駆体の生成は、GLY1～GLY11から選択される酵素を使用してなされうる。更に、ハロゲン化カンナビノイド及び前駆体は、本明細書で記載されるように、HAL1～HAL20から選択される酵素を使用して調製されうる。グリコシル化の場合、反応は遊離アルコール基で発生しうる。

植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞において、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法が記載される。方法は、置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により宿主細胞を形質転換する工程、及び形質転換された宿主細胞を培養して、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する工程を含む。

誘導体化する工程は、O-メチル化、グリコシル化、又はハロゲン化を含みうる。コードされる酵素は、(a)配列番号1～配列番号30のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むOMT1～OMT30タンパク質からなる群から選択されるO-メチル化酵素、配列番号31～配列番号41のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むGLY1～GLY11タンパク質からなる群から選択されるグリコシル化酵素、若しくは配列番号42～配列番号62のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むHAL1～HAL20タンパク質からなる群から選択されるハロゲン化酵素、(b)(a)に示されるタンパク質と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素、(c)(a)に示されるタンパク質と、置換、欠失及び/若しくは挿入されたアミノ酸残基1つ若しくは複数分異なるアミノ酸配列を含む酵素、又は(d)(a)、(b)、若しくは(c)の誘導体である酵素を含むか又はこれらからなっていてよい。

方法は、(a)に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する、例えばそれらに対し少なくとも85%又は少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれらからなるO-メチル化酵素を伴っていてよい。

酵素をコードする配列は、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つをコードするか、又はそれらに対し少なくとも70%の同一性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなっていてよい。例えば、ヌクレオチド配列は、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つに対し少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有する酵素をコードしていてよい。

方法において利用される植物性カンナビノイドは酸であってよく、カンナビゴルチン酸(cannabigorcinic acid)(CBGOa)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCa)、カンナビジオール酸(CBDa)、カンナビクロメン酸(CBCa)、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビゲロバリン酸(CBGVa)、テトラヒドロカンナビバリン酸(THCVa)、テトラヒドロカンナビオルセレン酸(tetrahydrocannabiorsellenic acid)(THCOa)、及びカンナビジオルセレン酸(cannabidiorsellenic acid)からなる群から任意で選択されてよい。好ましくは、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体は、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビジオール酸(CBDA)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)、又はオリベトール酸を含んでいてよい。

植物性カンナビノイド又は前駆体を誘導体化する置換基は、例えばO-メチル、グリコシル又はハロゲンであってよい。置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体は、O-メチル化THCa、グリコシル化CBGa、又は塩素化オリベトール酸であってよい。例えば、タンパク質は、配列番号1～配列番号30と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するO-メチル化酵素を含んでいてよい。更に、タンパク質は、配列番号31～配列番号41と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化酵素を含んでいてよい。更に、タンパク質は、配列番号42～配列番号62と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するハロゲン化酵素を含んでいてよい。

記載される方法において、例示的な実施形態は、植物性カンナビノイドがTHCaであれば置換基がO-メチルであり、植物性カンナビノイドがCBGaであれば置換基がグリコシルであり、又は植物性カンナビノイド前駆体がオリベトール酸であれば置換基が塩素等のハロゲンであることを含む。

記載される方法において、宿主細胞は、配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を更に含んでいてよい。

宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞であってよい。例えば、細菌細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、枯草菌(Bacillus subtilis)、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)、シネコシティス(Synechocytis)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、シネココッカス属(Synechococcus)の種、チフス菌(Salmonella typhi)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei)、志賀赤痢菌(Shigella disenteriae)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・メバロニ(Pseudomonas mevalonii)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドバクター・カプスラトゥス(Rhodobacter capsulatus)、ロドスピリルム・ルブルム(Rhodospirillum rubrum)、又はロドコッカス属(Rhodococcus)の種由来であってよい。例示的な真菌細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アカパンカビ(Neurospora crassa)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、マイセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属(Fusarium)の種、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・オプンティア(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピキア・ピペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、ピキア・メサノリカ(Pichia methanolica)、又はハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を含む。可能性のある原生生物宿主細胞は、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)、キイロタマホコリカビ(Dictyostelium discoideum)、クロレラ属(Chlorella)の種、ヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)、アルスロスピラ・プラテンシス(Arthrospira platensis)、ドナリエラ属(Dunaliella)の種、又はナンノクロロプシス・オケアニカ(Nannochloropsis oceanica)を含む。例示的な植物細胞は、アサ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、カカオ(Theobroma cacao)、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、フィールドピー、ヒマワリ、タバコ属(Nicotiana)の種、トマト、キャノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、モロコシ、ルピナス、又はイネを含む。

例えば、宿主細胞は、S・セレビシエ、大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、又はコマガタエラ・ファフィであってよい。

置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法が本明細書で記載される。方法は、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成することが可能な宿主細胞を用意する工程、前記植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、及び置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体の生成に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。

宿主細胞は、(a)配列番号73～配列番号87のうちのいずれか1つに示される核酸、(b)(a)のヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性を有する核酸、(c)(a)の核酸の相補鎖とハイブリダイズする核酸、(d)(a)の核酸配列のうちのいずれか1つによりコードされるポリペプチドと同じ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸、(e)置換、欠失、及び/若しくは挿入されたヌクレオチド1つ若しくは複数分(a)と異なるヌクレオチド配列、又は(f)(a)、(b)、(c)、(d)、若しくは(e)の誘導体等の1つ又は複数の遺伝子改変を更に含んでいてよい。

例えば、方法は、(a)に示される核酸と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性、例えばそれらに対し少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有する核酸を含む少なくとも1つの遺伝子改変を伴っていてよい。

宿主細胞は、配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つによる配列と少なくとも85%又は少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を更に含んでいてよい。宿主細胞は、配列番号64～配列番号72のうちのいずれか1つによる配列と少なくとも85%又は少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有するプラスミドを更に含んでいてよい。

置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有する酵素をコードするか、又はそれらに対し少なくとも70%の同一性、例えばそれらに対し少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する酵素をコードする、発現ベクターが提供される。そのような発現ベクターは、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つと少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。更に、発現ベクターは、配列番号64～配列番号72のうちのいずれか1つによるヌクレオチド配列を含んでいてよい。

発現ベクターにより形質転換された宿主細胞も記載される。宿主細胞は、(a)配列番号73～配列番号87のうちのいずれか1つに示される核酸、(b)(a)のヌクレオチド配列と少なくとも70%、例えば少なくとも85%若しくは少なくとも95%の同一性を有する核酸、(c)(a)の核酸の相補鎖とハイブリダイズする核酸、(d)(a)の核酸配列のうちのいずれか1つによりコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸、(e)置換、欠失、及び/若しくは挿入されたヌクレオチド1つ若しくは複数分(a)と異なる核酸、又は(f)(a)、(b)、(c)、(d)、若しくは(e)の誘導体のうちの1つ又は複数を含んでいてよい。更に、宿主細胞は、配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。

宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞であってよい。例示的な宿主細胞は、S・セレビシエ、大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、又はコマガタエラ・ファフィであってよい。

ハロゲン化オリベトール酸は、記載される方法により生成されてよく、又はより具体的には塩素化オリベトール酸であってよい。

酵母ベースの生合成の1つの利点は、株が、通常アサでは大量には生成されないカンナビノイドを合成するように容易に改変されうることである。CBGa、THCa及びCBDaを除いたカンナビノイドはしばしば「マイナーカンナビノイド」とまとめて呼ばれる。

マイナーカンナビノイドは、複数の異なる生合成経路を使用して合成可能であり、それらのうちの1つは、修飾酵素による既存のカンナビノイドの位置置換又は誘導体化によるものである。

図1は、修飾なしの生合成経路(パネルA)、ハロゲナーゼ(パネルB)、O-メチルトランスフェラーゼ(パネルC)、及びグリコシラーゼ(パネルD)を伴う合成経路を図示する。これらの生合成経路は、THCa生成酵母株においてカンナビノイド又はカンナビノイド前駆体を誘導体化するのに使用可能である。修飾は、経路における任意の段階で発生する可能性がある。図示されるように、グリコシル化、ハロゲン化及びO-メチル化反応が、参照により本明細書に組み込まれる、タイトルMETHODS AND CELLS FOR PRODUCTION OF PHYTOCANNABINOIDS AND PHYTOCANNABINOID PRECURSORS、2020年5月21日出願の、出願者らの同時係属PCT特許出願第CA2020/050687号で記載されるように、株HB1254等のTHCa生成酵母株において発生しうる。グリコシル化の場合、反応は(CBGa又はオリベトール酸では)いずれかの遊離アルコール基で発生しうる。

O-メチル化カンナビノイドは、株間で変動する量でアサに天然に存在する(Caprioglioら、2019;Yamauchiら、1968)。O-メチル化カンナビノイドの生化学的特性に対する研究はほとんどなされてこなかったが、O-ジメチルCBDAは有力な選択的15-LOX阻害剤と記述されており(Takedaら、2009)、肥満、粥状動脈硬化及びがんにおける用途を有しうる。グリコシル化及びハロゲン化カンナビノイドはアサにおいて天然には存在しないが、グリコシル化カンナビノイドは、グリコシルトランスフェラーゼの異種発現によりアサにおいて生成可能である(Hardmanら、2017)。

グリコシル化カンナビノイドは改善された水溶性を有し、グリコシルトランスフェラーゼの発現が、植物内でのカンナビノイド収率を大幅に改善することが記述されている(SayreらのUS2019/0338301 A1)。グリコシル化及びハロゲン化はともにカンナビノイドの可溶性を改善し、これらの酵素は酵母における力価も改善しうる。ハロゲン化カンナビノイドは生合成により作製されたことはないが、イリシコリン酸(ilicicolinic acid)等、類似の構造を有するハロゲン化プレニル化ポリケタイドは天然に存在する(Okadaら、2017)。CBDのハロゲン化類似体は、鎮静及び抗けいれん特性を有することが示されている(Usamiら、1999)。

グリコシル化、O-メチル化及びハロゲン化は、天然に存在する植物性カンナビノイドの酵素的誘導体化により達成可能な化学的多様性のうちの3つの例示的な種類である。

本明細書で記載される修飾は、CBDa又はCBCa等の異なるカンナビノイド骨格によっても実現されうる。

本明細書で使用される特定の用語が以下で記載される。

用語「カンナビノイド」は、本明細書で使用される場合、カンナビノイド受容体において直接的又は間接的な活性を示す化合物を指す。カンナビノイドの非限定的な例は、テトラヒドロカンナビノール(THC)、カンナビジオール(CBD)、カンナビノール(CBN)、カンナビゲロール(CBG)、カンナビクロメン(CBC)、カンナビシクロール(CBL)、カンナビバリン(CBV)、テトラヒドロカンナビバリン(THCV)、カンナビジバリン(CBDV)、カンナビクロムバリン(CBCV)、カンナビゲロバリン(CBGV)、テトラヒドロカンナビバリン(THCV)、テトラヒドロカンナビオルセレノール(tetrahydrocannabiorsellenol)(THCO)、カンナビジオルセレノール(cannabidiorsellenol)、及びカンナビゲロールモノメチルエーテル(CBGM)を含む。これらの酸は、用語「カンナビノイド」内に含まれる。

用語「植物性カンナビノイド」は、本明細書で使用される場合、植物種に通常存在する、酸形態を含むカンナビノイドを指す。本発明に従って生成される例示的な植物性カンナビノイドは、カンナビゲロール(CBG)、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビゲロバリン(CBGv)、カンナビゲロバリン酸(CBGva)、カンナビゲロシン(cannabigerocin)(CBGo)、又はカンナビゲロシン酸(cannabigerocinic acid)(CBGoa)を含む。

カンナビノイド及び植物性カンナビノイドは、1つ又は複数のカルボン酸官能基を含有していてもよく、これらを欠いていてもよい。そのような、カルボン酸官能基又は植物性カンナビノイドを含有するカンナビノイド又は植物性カンナビノイドの非限定的な例は、テトラヒドロカンナビノール酸(THCa)、カンナビジオール酸(CBDA)、及びカンナビクロメン酸(CBCA)を含む。

用語「ホモログ」は、同じ及び他の種由来の相同配列、並びに同じ及び他の種由来のオーソロガス配列を含む。相同性を有する異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドが、ホモログと呼ばれうる。

用語「相同性」は、位置同一性(すなわち、配列類似性又は同一性)のパーセントの観点からの、2つ以上のポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド配列間の類似性のレベルを指しうる。相同性は、異なるポリヌクレオチド又はポリペプチド間の類似の官能特性についての考え方も指す。ゆえに、本明細書での組成物及び方法は、本明細書で記載されるポリペプチド及びポリヌクレオチド配列に対するホモログを更に含んでいてよい。

用語「オーソロガス」は、本明細書で使用される場合、種分化の間に共通の先祖遺伝子から生じた、異なる種における相同のポリペプチド配列及び/又はポリヌクレオチド配列を指す。

本明細書で使用される場合、「ホモログ」は、本明細書でのポリヌクレオチド配列に対し、顕著な配列同一性(例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%及び/又は100%)を有しうる。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の、一定の枠内の整列全体で、2つの最適に整列されたポリヌクレオチド又はペプチド配列が不変である程度を指す。「同一性」は、既知の方法により容易に算出可能である。

本明細書で使用される場合、用語「パーセント配列同一性」又は「パーセント同一性」は、試験(「対象」)ポリヌクレオチド分子(又はその相補鎖)と比較された、参照(「クエリー」)ポリヌクレオチド分子(又はその相補鎖)の直鎖状ポリヌクレオチド配列中の、2つの配列が最適に整列された場合の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施形態において、「パーセント同一性」は、アミノ酸配列中の同一のアミノ酸のパーセンテージを指しうる。

用語「脂肪酸-CoA」、「脂肪酸アシル-CoA」、又は「CoA供与体」は、本明細書で使用される場合、伸長単位(マロニル-CoA等)との縮合反応において反応してポリケタイドを形成するプライマー分子として、ポリケタイド合成において有用な化合物を指しうる。本明細書で記載される合成経路において有用な脂肪酸-CoA分子(本明細書ではプライマー分子又はCoA供与体とも呼ばれる)の例は、アセチル-CoA、ブチリル-CoA、ヘキサノイル-CoAを含むがこれらに限定されない。これらの脂肪酸-CoA分子は、宿主細胞に供給されてもよく、又は本明細書で記載されるように、ポリケタイドの生合成のために宿主細胞により合成されてもよい。

2つのヌクレオチド配列は、2つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に「相補的」であると考えられる。一部の例において、実質的に相補的であると考えられる2つのヌクレオチド配列は、非常にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。

核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における、例えばサザンハイブリダイゼーション及びノザンハイブリダイゼーションにおける、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下では異なる。一部の例において、概して、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びpHで、特定の配列についての熱融解点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。

一部の例において、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される参照配列のいずれかに対し少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド又は「バリアント」を含み、通常、バリアントは参照配列の少なくとも1つの生物活性を維持する。

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」及び同様のものは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、又は例えばストリンジェントな条件下で、参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、1つ又は複数のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと比較して、付加されたか又は欠失したか又は異なるヌクレオチドで置換された、ポリヌクレオチドを含んでいてよい。変化したポリヌクレオチドに参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持させる、突然変異、付加、欠失及び置換を含む特定の変化が、参照ポリヌクレオチドに対しなされてよいことが理解されるはずである。

一部の例において、本明細書で記載されるポリヌクレオチドは、「ベクター」及び/又は「発現カセット」内に含まれていてよい。

一部の実施形態において、本明細書で記載されるヌクレオチド配列及び/又は核酸分子は、宿主細胞における発現のために多様なプロモーターに「作動可能に」又は「機能可能に」連結されていてよい。ゆえに、一部の例において、本発明は、形質転換された宿主細胞及び形質転換された宿主細胞を含む形質転換された生物を提供し、ここで宿主細胞及び生物は、本発明の1つ又は複数の核酸分子/ヌクレオチド配列により形質転換されている。本明細書で使用される場合、第2の核酸配列に作動可能に連結された第1の核酸配列を指す場合、「作動可能に連結された」は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係で配置された状態を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現を引き起こす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に結合している。

ポリペプチドの文脈では、第2のポリペプチド配列に作動可能に連結された第1のポリペプチド配列を指す場合、「作動可能に連結された」は、第1のポリペプチド配列が第2のポリペプチド配列と機能的な関係で配置された状態を指す。

用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、プロモーターと作動可能に結合したヌクレオチド配列(すなわちコード配列)の転写を制御又は調節するヌクレオチド配列を指す。通常、「プロモーター」は、RNAポリメラーゼIIの結合部位を含有し、転写開始に導くヌクレオチド配列を指す。概して、プロモーターは、対応するコード配列のコード領域の始まりに対して5'又は上流に見られる。プロモーター領域は、遺伝子発現の調節因子として作用する他のエレメントを含んでいてよい。

プロモーターは、組換え核酸分子、すなわちキメラ遺伝子の調製における使用のための、例えば、構成的、誘導性、時間に応じて調節される、発達に応じて調節される、化学的に調節される、組織優先的及び組織特異的プロモーターを含んでいてよい。

プロモーターの選択は、発現における時間及び空間の必要性次第で、かつ形質転換される宿主細胞次第でも変動する。ゆえに、例えば、刺激に応答しての発現が求められる場合、刺激又は化学物質により誘導されるプロモーターが使用可能である。比較的一定のレベルでの持続的な発現が生物の細胞又は組織全体で求められる場合、構成的プロモーターが選択可能である。

一部の例において、ベクターが使用されてよい。

一部の例において、本明細書で記載されるポリヌクレオチド分子及びヌクレオチド配列は、ベクターと連結して使用可能である。

用語「ベクター」は、核酸又はポリヌクレオチドを宿主細胞に移入、送達又は導入するための組成物を指す。ベクターは、移入、送達又は導入されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含んでいてよい。ベクターの一般的なクラスの非限定的な例は、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ、又は人工染色体を含むがこれらに限定されない。ベクターの選択は、好ましい形質転換技法及び形質転換の標的の種によって決まる。

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、対象のヌクレオチド配列を含む核酸分子を指し、ここで前記ヌクレオチド配列は、少なくとも制御配列(例えばプロモーター)と機能可能に結合している。ゆえに、一部の例は、本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列を発現するように設計された発現ベクターを提供する。

対象のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、その成分のうちの少なくとも1つが、その他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する「キメラ」であってよい。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態として得られたものであってもよい。しかし一部の例において、発現ベクターは、宿主に対して異種である。例えば、発現ベクターの特定のポリヌクレオチド配列は宿主細胞において天然に存在せず、形質転換イベントにより宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。

一部の例において、発現ベクターは他の調節配列も含んでいてよい。本明細書で使用される場合、「調節配列」は、コード配列の上流(5'非コード配列)、中又は下流(3'非コード配列)に位置し、結合したコード配列の転写、RNAプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、5'及び3'非翻訳領域、翻訳リーダー配列、終結シグナル、並びにポリアデニル化シグナル配列を含むがこれらに限定されない。

発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するのに使用可能な選択可能マーカーに対するヌクレオチド配列も含んでいてよい。

本明細書で使用される場合、「選択可能マーカー」は、発現されると、マーカーを発現する宿主細胞に明確な表現型を与え、ゆえにそのような形質転換された宿主細胞が、マーカーを有しない宿主細胞と識別されることを可能にするヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、選択剤(例えば、抗生物質、糖、炭素供給源、又は同様のもの)を使用すること等の化学的手段により選択可能な特徴を付与するかどうか、又はマーカーが単に、スクリーニング等による観察若しくは試験を介して特定可能な特徴であるかどうか次第で、選択可能又はスクリーニング可能マーカーのいずれかをコードしていてよい。適切な選択可能マーカーの例は当技術分野で既知であり、本明細書で記載される発現ベクターにおいて使用可能である。

ベクター及び/又は発現ベクター及び/又はポリヌクレオチドは、細胞に導入されてよい。

用語「導入すること」は、対象のヌクレオチド配列(例えば、核酸分子/構築物/発現ベクター)の文脈において、ヌクレオチド配列が細胞の内部にアクセスできるような様式で、対象のヌクレオチド配列を細胞宿主に提示することを指す。1つ超のヌクレオチド配列が導入される場合、これらのヌクレオチド配列は、単一のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物の一部として、又は別個のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物として集められてよく、同じ又は異なる形質転換ベクターに位置していてよい。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベント又は別個の形質転換イベントにおいて宿主細胞に導入されてよい。

本明細書で使用される場合、用語「接触させること」は、例えば、それにより化合物が細胞に送達されうるプロセスを指す。化合物は、細胞への直接導入(すなわち細胞内に)及び/又は腔、間隙、若しくは生物の循環への細胞外導入を含むがこれらに限定されない、複数の方法で投与されてよい。

用語「形質転換」又は「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド又は異種核酸の、細胞への導入を指す。細胞の形質転換は安定であっても一過性であってもよい。

用語「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドの文脈において本明細書で使用される場合、細胞に導入されたポリヌクレオチドを指し、細胞のゲノムには組み込まれない。

用語「安定に導入すること」又は「安定に導入された」は、細胞に導入されたポリヌクレオチドの文脈において、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定に組み込まれ、ゆえに細胞がポリヌクレオチドにより安定に形質転換されていることを表すことが意図される。

用語「宿主細胞」は、本発明の任意の組換えベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなりうる、又はレシピエントとなった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然、偶発的又は作為的突然変異及び/又は変化により、元の親細胞に対し必ずしも完全に同一(形態又はDNA相補体全体において)でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドによりin vivo又はin vitroで形質転換された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。

一部の例において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞であってよい。宿主細胞の具体的な例が以下に記載される。

宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞、例えば本明細書でTable 1(表1)に記述される例示的な細胞種のいずれかであってよい。例示的な宿主細胞種は、S・セレビシエ、大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、及びコマガタエラ・ファフィを含む。

Table 2(表2)は、本明細書で記載される配列を概説する。

宿主細胞を形質転換させるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、対象配列に対し少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有していてよい。

ヌクレオチド配列は、対象配列に対し少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有していてよい。

対象タンパク質をコードする対象ヌクレオチド配列を含む発現ベクターが記載される。そのような発現ベクターにおいて、対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、対象配列の該当の残基位置と、例えば、少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を含んでいてよい。

記載される発現ベクターのうちのいずれか1つにより形質転換された宿主細胞が本明細書で記載され、ここで形質転換は任意の既知の方法に従って行われる。

宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞、例えば本明細書で記載される任意の細胞であってよい。

使用されうる植物性カンナビノイド、及びそれらの酸の非限定的な例は、テトラヒドロカンナビノール(THC)、カンナビジオール(CBD)、カンナビノール(CBN)、カンナビゲロール(CBG)、カンナビクロメン(CBC)、カンナビシクロール(CBL)、カンナビバリン(CBV)、テトラヒドロカンナビバリン(THCV)、カンナビジバリン(CBDV)、カンナビクロムバリン(CBCV)、カンナビゲロバリン(CBGV)、及びカンナビゲロールモノメチルエーテル(CBGM)を含む。植物性カンナビノイドの酸形態は、カンナビゴルチン酸(CBGOa)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCa)、カンナビジオール酸(CBDa)、カンナビクロメン酸(CBCa)、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビゲロバリン酸(CBGVa)及びテトラヒドロカンナビバリン酸(THCVa)を含む。任意のそのようなカンナビノイド又は植物性カンナビノイド酸が、本発明による方法において利用可能である。

本明細書で記載される一部の例において、ポリケタイド又はカンナビノイド前駆体は、オリベトール、オリベトール酸、ジバリン、ジバリン酸、オルシノール、又はオルセリン酸であってよい。ポリケタイドが植物性カンナビノイドに変換されうる方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、タイトルMETHODS AND CELLS FOR PRODUCTION OF PHYTOCANNABINOIDS AND PHYTOCANNABINOID PRECURSORS、2020年5月21日出願の、出願者らの同時係属PCT特許出願第PCT/CA2020/050687号(Bourgeoisら)において記載される。例えば、以下の前駆体が以下の植物性カンナビノイドに変換されてよく、本明細書で記載されるようにO-メチル化、グリコシル化又は塩素化されてよい:オリベトールはカンナビゲロール(CBG)を形成するのに使用可能であり、オリベトール酸はカンナビゲロール酸(CBGa)を形成するのに使用可能であり、ジバリンはカンナビゲロバリン(CBGv)を形成するのに使用可能であり、ジバリン酸はカンナビゲロバリン酸(CBGva)を形成するのに使用可能であり、オルシノールはカンナビゲロシン(CBGo)を形成するのに使用可能であり、オルセリン酸はカンナビゲロシン酸(CBGoa)を形成するのに使用可能である。

本明細書で記載される本発明をよりよく理解するため、以下の実施例が示される。これらの実施例が例示のためだけのものであることが理解されるべきである。ゆえに、これらはいかようにも本発明の範囲を限定すべきでない。

以下の実施例において、材料及び方法についての特定の態様が共有され、ゆえに以下で一般的に記載される。

株増殖及び培地
概して、酵母株は、1.7g/L硫酸アンモニウム不含YNB+1.96g/L URAドロップアウトアミノ酸サプリメント+1.5g/L L-グルタミン酸マグネシウムの組成物、2%w/vガラクトース、2%w/vラフィノース、200μg/lジェネティシン、及び200μg/Lアンピシリン(Sigma-Aldrich Canada社)を含み、以下に示される場合、任意で他の成分及び改変を有する酵母最少培地で96時間増殖される。HB2130は非触媒性のmScarlettタンパク質を発現し、陰性対照として作用する。

実験条件
別途示されない限り、記載される実施例では株の3コロニーの反復について試験した。株は96ウェルディープウェルプレートにおいて96時間、培地1ml中で増殖される。ディープウェルプレートを30℃でインキュベートし、950rpmで96時間振とうした。新たな96ウェルディープウェルプレート中の培養物30μlに56%アセトニトリル270μlを添加することにより、代謝物抽出を実施した。次いでプレートを3750rpmで5分間遠心処理した。可溶層200μlを取り出し、96ウェルv底マイクロタイタープレートで保存した。分析まで試料を-20℃で保存した。

定量化プロトコル
LC条件。Agilent(商標)6560イオン移動度-QTOFを使用して、O-メチルTHCa、グリコシル化CBGa、及び塩素化オリベトール酸等の、実施例における対象のカンナビノイドの定量化を行った。クロマトグラフィー及びMS条件が以下に記載される。
カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7ミクロン 2.1×5mm
カラム温度:45℃
流速:0.3ml/分
溶離液A:水100%
溶離液B:アセトニトリル100%

正確な質量は、分析された特定のマイナーカンナビノイド及びそれらのポリケタイド前駆体のモノアイソトピックな質量を示すTable 3(表3)において、以下の通りである。勾配はTable 4(表4)に列挙される。

ESI-MS条件。ESI-MS条件は以下の通りであった。
キャピラリー:3.5kV
供給源温度:150℃
デソルベーションガス温度:300℃
乾燥ガス流速(窒素):600L/時間
シースガス流速(窒素):660L/時間

Table 5(表5)は、本明細書で使用されたプラスミドを概説する。

Table 6(表6)は、以下の実施例で使用された酵母株を概説する。

Table 7(表7)は、以下の実施例で使用された基本の株に組み込まれうる改変を列挙する。

(実施例1)
O-メチル化THCaの生成
導入。植物性カンナビノイドは、アサ、他の植物、及び一部の真菌において天然に生成される。105種を超える植物性カンナビノイドが、アサにおいて生合成されるか、又はアサにおいて生合成された植物性カンナビノイドからの熱若しくは他の分解より生じることが知られている。アサ植物は種子、繊維、及び他の材料の有益な供給源でもあるが、植物性カンナビノイド生成のため、特に屋内でアサを育てることは、エネルギー及び労力の観点から高コストである。それに続く、アサ植物からの植物性カンナビノイドの抽出、精製、及び分画も、多大な労力及びエネルギーを必要とする。

サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子改変株における植物性カンナビノイドの生成が実施される。特に、RFP又はOMT1～OMT30から選択される酵素のいずれかを発現するプラスミドにより、THCa生成酵母株(HB1254)を形質転換させた。O-メチルTHCaを生成するために、1.7g/L硫酸アンモニウム不含YNB+1.96g/L URAドロップアウトアミノ酸サプリメント+1.5g/L L-グルタミン酸マグネシウム)の組成物を有し、2%w/vガラクトース、2%w/vラフィノース、200μg/lジェネティシン、及び200μg/Lアンピシリン(Sigma-Aldrich Canada社)を有する酵母最少培地で96時間、株HB2031～HB2036を増殖させた。これらの条件下で、株はTHCaを生成し、これらの分子は好適な酵素の存在によりO-メチル化される。非触媒性のmScarlettタンパク質を発現するHB2031を、陰性対照として使用した。

増殖及びMS分析後、O-メチルTHCa(式I)が一部の試料で検出された。他のO-メチル化カンナビノイドもカンナビノイド前駆体も観察されなかった。これらの株により生成されたO-メチルTHCaの量がTable 8)(表8)に要約される。報告される値は、3つの生物学的反復の平均である。

(実施例2)
グリコシル化CBGaの生成
サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子改変株における植物性カンナビノイドの生成が記載される。特に、RFP又はGLY1～11から選択される酵素のいずれかを発現するプラスミドにより、THCa生成酵母株(HB1254)を形質転換させた。

1.7g/L硫酸アンモニウム不含YNB+1.96g/L URAドロップアウトアミノ酸サプリメント+1.5g/L L-グルタミン酸マグネシウム)の組成物を有し、2%w/vガラクトース、2%w/vラフィノース、200μg/lジェネティシン、及び200μg/Lアンピシリン(Sigma-Aldrich Canada社)を有する酵母最少培地での96時間の増殖により、生じた株HB2037～HB2038におけるグリコシル化CBGaの生成を実施した。これらの条件下で、株はCBGaを生成し、次いでこれが存在する好適な酵素によりグリコシル化される。非触媒性のmScarlettタンパク質を発現するHB2031が、陰性対照として作用した。

増殖及びMS分析後、グリコシル化CBGaが一部の試料で検出された。他のグリコシル化カンナビノイドもカンナビノイド前駆体も観察されなかった。これらの株により生成されたグリコシル化CBGaの量がTable 9)(表9)に要約される。CBGaがモノグリコシル化されていることは判明したが、この分析からは、我々はどのアルコール残基がグリコシル残基の結合部位であるかを決定することができなかった。報告される値は、3つの生物学的反復の平均である。モノグリコシル化CBGaの2つの可能性のある構造が式II及びIIIとして与えられる。

(実施例3)
塩素化オリベトール酸の生成
サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子改変株における植物性カンナビノイドの生成が記載される。特に、RFP又はHAL1～HAL20から選択される酵素のいずれかを発現するプラスミドにより、THCa生成酵母株(HB1254)を形質転換させた。

塩素化オリベトール酸を生成するために、1.7g/L硫酸アンモニウム不含YNB+1.96g/L URAドロップアウトアミノ酸サプリメント+1.5g/L L-グルタミン酸マグネシウム)の組成物を有し、2%w/vガラクトース、2%w/vラフィノース、200μg/lジェネティシン、及び200μg/Lアンピシリン(Sigma-Aldrich Canada社)+100mg/L塩化ナトリウム+100mg/L+100mg/L臭化カリウム+100mg/Lヨウ化ナトリウムを有する酵母最少培地で96時間、HB2030、HB2039、HB2040を増殖させた。株はオリベトール酸を生成し、次いで分子は、存在する好適なハロゲナーゼにより、塩素、臭素又はヨウ素でハロゲン化された。非触媒性のmScarlettタンパク質を発現することから、HB2031を陰性対照として使用した。

塩素、臭素及びヨウ素塩を含有する培地において株を増殖させた。MS分析後、塩素化オリベトール酸が一部の試料で検出された。他のハロゲン化(Br、I、Cl)カンナビノイドもカンナビノイド前駆体も見られなかった。これらの株により生成された塩素化オリベトール酸の量がTable 10(表10)に要約される。報告される値は、3つの生物学的反復の平均である。この実験ではハロゲン化カンナビノイドは観察されなかったが、記載されるように形成される前駆体からの、又は別個の経路を介してのハロゲン化カンナビノイドの生合成が、好適なプレニルトランスフェラーゼの存在下で実現できる。

式IVは、ハロゲン化オリベトール酸の構造を示す。

単なる例
前述の記載において、説明目的で、実施形態の完全な理解をもたらすために多くの詳細が示される。しかし、これらの具体的な詳細が必要でないことが当業者には明らかである。

本明細書で記載される実施形態は、単なる例であることが意図される。当業者により、特定の実施形態に対して変化、改変及び変更がなされてよい。請求項の範囲は本明細書で示される特定の実施形態により限定されるべきではなく、明細書全体と一致するように解釈されるべきである。

本発明はこのように記載され、本発明が様々に変更されてよいことが明らかである。そのような変更は本発明の趣旨及び範囲からの逸脱とみなされるべきでなく、当業者にとって明らかなそのような改変はすべて、以下の請求項の範囲内に含まれることが意図される。

参照
本明細書で言及される出版物、特許及び特許出願は全て、本発明が属する分野の技術者のレベルを示し、各個々の出版物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
［参考文献］

Claims (41)

1. 植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞において、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法であって、
   置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により、前記宿主細胞を形質転換する工程、及び
   前記形質転換された宿主細胞を培養して、前記置換植物性カンナビノイド又は前記置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する工程
   を含み、
   前記誘導体化する工程が、
   (i)置換基がO-メチルであり、誘導体化するための酵素が、配列番号1～配列番号30のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むOMT1～OMT30タンパク質からなる群から選択されるO-メチル化酵素を含む、O-メチル化、
   (ii)置換基がグリコシルであり、誘導体化するための酵素が、配列番号31～配列番号41のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むGLY1～GLY11タンパク質からなる群から選択されるグリコシル化酵素を含む、グリコシル化、又は
   (iii)置換基がハロゲンであり、誘導体化するための酵素が、配列番号42～配列番号62のうちのいずれか1つに示される配列に対し少なくとも95%の同一性のアミノ酸配列を含むHAL1～HAL20タンパク質からなる群から選択されるハロゲン化酵素を含む、ハロゲン化
   を含む、方法。
2. 前記植物性カンナビノイドがTHCaであれば前記置換基がO-メチルであり、
   前記植物性カンナビノイドがCBGaであれば前記置換基がグリコシルであり、又は
   前記植物性カンナビノイド前駆体がオリベトール酸であれば前記置換基がハロゲンである、
   請求項1に記載の方法。
3. 植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成する宿主細胞において、置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法であって、
   置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードする配列により、前記宿主細胞を形質転換する工程、及び
   前記形質転換された宿主細胞を培養して、前記置換植物性カンナビノイド又は前記置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する工程
   を含む、方法。
4. 前記誘導体化する工程が、O-メチル化、グリコシル化、又はハロゲン化を含む、請求項3に記載の方法。
5. コードされる酵素が、
   (a)(i)配列番号1～配列番号30のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むOMT1～OMT30タンパク質からなる群から選択されるO-メチル化酵素、(ii)配列番号31～配列番号41のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むGLY1～GLY11タンパク質からなる群から選択されるグリコシル化酵素、及び(iii)配列番号42～配列番号62のうちのいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むHAL1～HAL20タンパク質からなる群から選択されるハロゲン化酵素、
   (b)(a)に示されるタンパク質と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素、
   (c)(a)に示されるタンパク質と、置換、欠失及び/若しくは挿入されたアミノ酸残基1つ若しくは複数分異なるアミノ酸配列を含む酵素、又は
   (d)(a)、(b)、若しくは(c)の誘導体である酵素
   を含むか又はこれらからなる、請求項3に記載の方法。
6. O-メチル化酵素が、(a)に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
7. O-メチル化酵素が、(a)に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%又は少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の方法。
8. 酵素をコードする配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つをコードするか、又はそれらに対し少なくとも70%の同一性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなる、請求項3に記載の方法。
9. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つに対し少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有する酵素をコードする、請求項8に記載の方法。
10. 前記植物性カンナビノイドが酸である、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記植物性カンナビノイドが、カンナビゴルチン酸(CBGOa)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCa)、カンナビジオール酸(CBDa)、カンナビクロメン酸(CBCa)、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビゲロバリン酸(CBGVa)、テトラヒドロカンナビバリン酸(THCVa)、テトラヒドロカンナビオルセレン酸(THCOa)、及びカンナビジオルセレン酸からなる群から選択される酸である、請求項10に記載の方法。
12. 前記植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体が、カンナビゲロール酸(CBGa)、カンナビジオール酸(CBDA)、テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)、又はオリベトール酸を含む、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記置換基が、O-メチル、グリコシル又はハロゲンである、請求項3に記載の方法。
14. 置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体が、O-メチル化THCa、グリコシル化CBGa、又は塩素化オリベトール酸である、請求項1又は3に記載の方法。
15. 生成される置換植物性カンナビノイド前駆体が塩素化オリベトール酸である、請求項14に記載の方法。
16. 前記タンパク質が、配列番号1～配列番号30と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するO-メチル化酵素を含む、請求項5に記載の方法。
17. 前記タンパク質が、配列番号31～配列番号41と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するグリコシル化酵素を含む、請求項5に記載の方法。
18. 前記タンパク質が、配列番号42～配列番号62と少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するハロゲン化酵素を含む、請求項5に記載の方法。
19. 前記植物性カンナビノイドがTHCaであれば前記置換基がO-メチルであり、
    前記植物性カンナビノイドがCBGaであれば前記置換基がグリコシルであり、又は
    前記植物性カンナビノイド前駆体がオリベトール酸であれば前記置換基がハロゲンである、
    請求項3に記載の方法。
20. 宿主細胞が、配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を更に含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細菌細胞が、大腸菌、ストレプトマイセス・セリカラー、枯草菌、マイコプラズマ・ゲニタリウム、シネコシティス、ザイモモナス・モビリス、コリネバクテリウム・グルタミクム、シネココッカス属の種、チフス菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、志賀赤痢菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌、シュードモナス・メバロニ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラトゥス、ロドスピリルム・ルブルム、又はロドコッカス属の種由来であり、
    前記真菌細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、オガタエア・ポリモルファ、コマガタエラ・ファフィ、クルイベロマイセス・ラクティス、アカパンカビ、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、マイセリオフトラ・サーモフィラ、アスペルギルス・オリゼー、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属の種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタム、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラメ、ピキア・メンブラネファシエンス、ピキア・オプンティア、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティピティス、ピキア・メサノリカ、又はハンゼヌラ・ポリモルファ由来であり、
    前記原生生物細胞が、コナミドリムシ、キイロタマホコリカビ、クロレラ属の種、ヘマトコッカス・プルビアリス、アルスロスピラ・プラテンシス、ドナリエラ属の種、又はナンノクロロプシス・オケアニカ由来であり、又は
    前記植物細胞が、アサ、シロイヌナズナ、カカオ、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、フィールドピー、ヒマワリ、タバコ属の種、トマト、キャノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、モロコシ、ルピナス、又はイネ由来である、
    請求項21に記載の方法。
23. 前記宿主細胞が、S・セレビシエ、大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、又はコマガタエラ・ファフィである、請求項21に記載の方法。
24. 置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体を生成する方法であって、
    植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を生成することが可能な宿主細胞を用意する工程、
    前記植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程、及び
    置換植物性カンナビノイド又は置換植物性カンナビノイド前駆体の生成に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程
    を含む、方法。
25. 宿主細胞が、
    (a)配列番号73～配列番号87のうちのいずれか1つに示される核酸、
    (b)(a)のヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性を有する核酸、
    (c)(a)の核酸の相補鎖とハイブリダイズする核酸、
    (d)(a)の核酸配列のうちのいずれか1つによりコードされるポリペプチドと同じ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    (e)置換、欠失、及び/若しくは挿入されたヌクレオチド1つ若しくは複数分(a)と異なるヌクレオチド配列、又は
    (f)(a)、(b)、(c)、(d)、若しくは(e)の誘導体
    を含む少なくとも1つの遺伝子改変を更に含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
26. 少なくとも1つの遺伝子改変が、(a)に示される核酸と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する核酸を含む、請求項25に記載の方法。
27. 宿主細胞が、配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つと少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を更に含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記宿主細胞が、配列番号64～配列番号72のうちのいずれか1つと少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するプラスミドを含む、請求項1、請求項3又は請求項24に記載の方法。
29. 置換基により植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイド前駆体を誘導体化するための酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有する酵素をコードするか、又はそれらに対し少なくとも70%の同一性を有する酵素をコードする、発現ベクター。
30. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性の配列を有する酵素をコードする、請求項29に記載の発現ベクター。
31. ヌクレオチド配列が、配列番号1～配列番号62のうちのいずれか1つと少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有する酵素をコードする、請求項29に記載の発現ベクター。
32. 配列番号64～配列番号72のうちのいずれか1つによるヌクレオチド配列を含む、請求項29、30又は31に記載の発現ベクター。
33. 請求項29から32のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
34. (a)配列番号73～配列番号87のうちのいずれか1つに示される核酸、
    (b)(a)のヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性を有する核酸、
    (c)(a)の核酸の相補鎖とハイブリダイズする核酸、
    (d)(a)の核酸配列のうちのいずれか1つによりコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸、
    (e)置換、欠失、及び/若しくは挿入されたヌクレオチド1つ若しくは複数分(a)と異なる核酸、又は
    (f)(a)、(b)、(c)、(d)、若しくは(e)の誘導体
    のうちの1つ又は複数を更に含む、請求項33に記載の宿主細胞。
35. 核酸が、配列番号73～配列番号87のうちのいずれか1つに示される核酸と少なくとも85%又は少なくとも95%の同一性を有する、請求項33に記載の宿主細胞。
36. 配列番号88～配列番号92のうちのいずれか1つによるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項33又は34に記載の宿主細胞。
37. 細菌細胞、真菌細胞、原生生物細胞、又は植物細胞である、請求項33から36のいずれか一項に記載の宿主細胞。
38. S・セレビシエ、大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、又はコマガタエラ・ファフィである、請求項35に記載の宿主細胞。
39. 請求項13に記載の方法により生成されるハロゲン化オリベトール酸。
40. 請求項15に記載の方法により生成される塩素化オリベトール酸。
41. 塩素化オリベトール酸。