JP2023533936A - ゴリラ・アデノウイルスの核酸配列およびアミノ酸配列、それを含むベクター、およびそれらの使用 - Google Patents

ゴリラ・アデノウイルスの核酸配列およびアミノ酸配列、それを含むベクター、およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫原性が高く、一般的なヒト集団における既存の免疫が非常に低い新規アデノウイルス株に関する。検出可能な中和抗体が存在しないのは、アデノウイルスキャプシドタンパク質ヘキソンにおける新規の超可変領域によるものである。本発明は、これらの新規アデノウイルス株のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにこれらの株に基づく組換えウイルス、ウイルス様粒子およびベクターを提供する。さらに、疾患の治療または予防における医薬組成物および医薬用途、ならびに新規配列、組換えウイルス、ウイルス様粒子およびベクターを利用したアデノウイルスまたはウイルス様粒子の製造方法が提供される。

Description

本発明は、免疫原性が高く、一般的なヒト集団における既存の免疫が非常に低い新規アデノウイルス株に関する。検出可能な中和抗体が存在しないのは、アデノウイルスキャプシドタンパク質ヘキソンにおける新規の超可変領域によるものである。本発明は、これらの新規アデノウイルス株のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにこれらの株に基づく組換えウイルス、ウイルス様粒子およびベクターを提供する。さらに、疾患の治療または予防における医薬組成物および医薬用途、ならびに新規配列、組換えウイルス、ウイルス様粒子およびベクターを利用したアデノウイルスまたはウイルス様粒子の製造方法が提供される。
アデノウイルス (Ad) は、両生類、鳥類、および哺乳類に見られる二本鎖 DNA ウイルスの大きなファミリーを構成し、非エンベロープ正二十面体キャプシド構造を持っている(非特許文献１; 非特許文献２; 非特許文献３; 非特許文献４)。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは、宿主細胞のゲノムに統合することなく、分裂細胞と非分裂細胞の両方を含む、いくつかの哺乳類種の多数の細胞型を形質導入できる。
一般的には、アデノウイルス DNA は通常非常に安定しており、形質転換または腫瘍形成が起こらない限り、エピソーム (例えば、染色体外など) のままである。さらに、アデノウイルスベクターは、臨床グレードの組成物の薬学的規模の生産に容易に適合する、明確に定義された生産システムにおいて高収率で増殖することができる。これらの特徴と十分に特徴付けられた分子遺伝学により、組換えアデノウイルスベクターはワクチンキャリアとして使用するための優れた候補となる。組換えアデノウイルスベクターの産生は、非機能的になるように欠失されるかまたは操作されたアデノウイルス遺伝子産物の機能を補完することができるパッケージング細胞株の使用に依存し得る。
現在、よく特徴づけられた２つのヒト サブグループＣアデノウイルス血清型 (すなわち、hAd2 および hAd5) は、遺伝子治療に使用されるほとんどのアデノウイルスベクターのウイルス骨格の供給源として広く使用されている。複製欠損のヒトアデノウイルスベクターは、さまざまな感染病原体に由来するさまざまな免疫原を送達するためのワクチンキャリアとしても試験されている。実験動物（例えば、げっ歯類、イヌ科、および非ヒト霊長類）で行われた研究では、免疫原および他の抗原をコードする導入遺伝子を運ぶ組換え複製欠損のヒトアデノウイルスベクターは、導入遺伝子産物に対する体液性および細胞性免疫応答の両方を誘発することを示している。一般的には、研究者は、免疫応答を誘発すると予測される高用量の組換えアデノウイルスベクターを利用する免疫化プロトコルを使用するか、または異なる血清型に由来するが同一の導入遺伝子産物を有するアデノウイルスベクターの追加免疫としての連続投与を採用する免疫化プロトコルを使用することにより、ヒト以外の実験系でヒトアデノウイルスベクターをワクチンキャリアとして使用することに成功したことを報告している（非特許文献５）。
C種のアデノウイルス (例えば、Ad5、Ad6、ChAd3 など) に由来するベクターは、最も免疫原性が高い（非特許文献６）。特に、ヒトアデノウイルス５型 (Ad5) に基づくウイルスベクターは、遺伝子治療やワクチンへの適用のために開発された。Ad5ベースのベクターは動物モデルでは非常に効率的であるが、Ad5野生型ウイルス（特に図１に示すようにキャプシドに向けられたもの）に対するヒトの既存の中和抗体が存在すると、遺伝子導入の効率が低下することが臨床試験で実証されている（非特許文献７）。このような抗体は、主にヘキソンタンパク質の超可変領域に向けられている。一般集団における免疫は、Ad5に基づくAdベクター化ワクチンの広範な適用を制限する。一方、希少な（rare）ヒトアデノウイルスはAd5よりも免疫原性が低い（非特許文献６）。非ヒトアデノウイルスに基づくベクターは、一般的なヒト集団における既存の免疫が非常に低い（非特許文献８）。
Straus, Adenovirus infections in humans; TheAdenoviruses, 451-498, 1984 Hierholzer et al.,J. Infect.Dis.,158:804-813,1988 Schnurr and Dondero, Intervirology., 36:79-83,1993 Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37:3940-3945: 1999 Mastrangeli, et. al., Human Gene Therapy, 7:79-87 (1996) Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115),2012 Moore JP et al. Science. 2008 May 9;320(5877):753-5 Farina et al., J. Virol. 75 (23),11603-11613, 2001
いくつかの非ヒトアデノウイルスベクターが知られているが、これらに対する免疫がヒトで発生（develop）できる可能性があるため、ヒトにおいて、免疫原性が高く、既存の中和抗体が少ないかまたは存在しないアデノウイルスベクターが引き続き必要とされている。
第１の態様において、本発明は、
A) (i) 配列番号２の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号２の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号２の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号２の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号２の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号２の314～322 Y位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号２の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
B) (i) 配列番号９の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号９の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号９の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号９の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号９の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号９の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号９の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
C) (i) 配列番号１１の136～163位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号１１の182～196位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号１１の214～220位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号１１の252～262位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号１１の270～278位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号１１の302～310位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号１１の419～442位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
D) (i) 配列番号１７の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号１７の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号１７の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号１７の257～267位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号１７の275～289位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号１７の313～321位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号１７の430～455位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
E) (i) 配列番号１９の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号１９の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号１９の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号１９の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号１９の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号１９の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号１９の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
F) (i) 配列番号２１の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号２１の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号２１の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号２１の257～267位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号２１の275～289位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号２１の313～321位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号２１の430～455位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
G) (i) 配列番号２３の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
(ii) 配列番号２３の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iii) 配列番号２３の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
(iv) 配列番号２３の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
(v) 配列番号２３の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
(vi) 配列番号２３の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
(vii) 配列番号２３の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、
を含むアデノウイルスヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、G)に記載のアデノウイルスヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、さらに配列番号６のアデノウイルスファイバータンパク質（adenovirus fiber protein）、または２つまでの変異を含むその変異体をさらにコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
第２の態様において、第１の態様のA)、B)、C)、D)、E)またはF)で規定されるポリヌクレオチドによってコードされるヘキソンポリペプチドを提供する。
第３の態様において、本発明は、A)～F)に関して、ヘキソンは、第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされるヘキソンであり、G) に関して、ヘキソンおよびファイバーは、第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされるヘキソンおよびファイバーである、ヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質を含むアデノウイルスキャプシドを提供する。
第４の態様において、本発明は、（ｉ）第１の態様のポリヌクレオチドによりコードされるアデノウイルス、（ｉｉ）第１の態様によるポリヌクレオチドを含むアデノウイルス、および／または（ｉｉｉ）第２の態様のヘキソンポリペプチドまたは第３の態様のキャプシドを含むアデノウイルス、を提供する。
第５の態様において、本発明は、（ｉ）第１の態様のポリヌクレオチドによりコードされるウイルス様粒子、および／または（ｉｉ）第２の態様のヘキソンポリペプチドまたは第３の態様のキャプシドを含むウイルス様粒子、を提供する。
第６の態様において、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
第７の態様において、本発明は、（ｉ）アジュバント、（ｉｉ）第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシドポリペプチド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、または第６の態様のベクター、および任意で（ｉｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、を含む組成物を提供する。
第８の態様において、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシドポリペプチド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、または第６の態様のベクターを含む細胞を提供する。
第９の態様において、本発明は、疾患の治療または予防に使用するための、第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシドポリペプチド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、第６の態様のベクター、第７の態様の組成物および／または第８の態様の細胞を提供する。
第１０の態様において、本発明は、アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を産生するためのインビトロ法であって、
（ｉ）アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子が細胞内で集合するように、細胞内で第１の態様のポリヌクレオチドを発現させる工程、
（ｉｉ） 細胞または細胞を取り囲む培地からアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を単離する工程を含む、インビトロ法に関する。
アデノウイルスキャプシドの構造 シャトルプラスミドの模式図 pGRAd23 DE1 GAG BACの模式図 pGRAd23 DE1 GAG DE3 BACの模式図 pGRAd23 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5 E4orf6 BACの模式図 マウス脾細胞に対する T 細胞応答。各点は１匹のマウスの反応を表し、線は各用量群の平均に対応する。注入された用量をウイルス粒子数で表したものが、x軸に示される。 Gag抗原をコードするGRAd23 DE1に対する体液性応答。各点は１匹のマウスの反応を表し、線は各用量群の平均に対応する。 ヒト血清のパネルにおけるGRAd23ベクターの血清有病率。単一の点は、単一の血清サンプルを表す (y軸の中和力価)。表は、陰性（<18）、中程度の中和力価（<200）、または高力価（>200）の血清の％を示す。 ヒト血清のパネルにおけるGRAd32ベクターの血清有病率。単一の点は単一の血清サンプルを表し、縦軸は中和力価を表す。 Gag抗原をコードするGRAd21 DE1に対する体液性応答。各点は１匹のマウスの反応を表し、線は各用量群の平均に対応する。 SARS-COV2スパイク抗原をコードするGRAd32 DE1を使用したスパイク抗原発現。 SARS-COV2スパイク抗原をコードするGRAd32 DE1を使用したスパイク抗原免疫原性 (ELIspot)。 SARS-COV2スパイク抗原をコードするGRAd32 DE1による免疫後の抗スパイク血清抗体応答。 スパイク2P発現。HeLa細胞に50 MOIの指定されたベクターを感染させた。感染の48時間後、細胞溶解物を収集し、SDS-PAGEウエスタンブロットで分析した。上のパネルでは、スパイク 2P タンパク質 (HA タグ) を認識する抗 HA 抗体でメンブレンをブロットした。下のパネルでは、 GAPDH はローディングコントロールとして使用される。1:Mock、2: GRAd23b-S2P、3:GRAd33b-S2P、4: GRAd34b-S2P、2:GRAd39b-S2P。 指定された用量（ウイルス粒子）によるBALB/cマウスの免疫化の2週間後（w2）または5週間後（w5）のGRAdベクターの抗体エンドポイント力価によって測定される免疫原性。データポイントの各群の下の数字は、幾何平均を示す。 GRAd-COV2ワクチン接種ボランティアにおけるSARS-CoV-2特異的結合および中和抗体応答。低用量(LD-5x10^10 vp-丸)、中用量 (ID-1x10^11 vp-直立三角形) および高用量 (HD-2x10^11 vp-逆三角形)のGRAd-COV2ワクチン接種によって誘導されたSARS-CoV-2に対する抗体反応。18～55 歳と 65～85 歳は、それぞれ、より若い年齢のコホートとより歳をとった年齢のコホートを識別する。データポイントの各群内の水平の黒い線は、すべてのパネルの中央値に設定されている。以前に入院したか（hosp-ダークグレー）または入院していない（non-hosp-ライトグレー）COVID-19患者から得たヒト回復期血清（HCS: humanconvalescent sera）（ダイアモンド）およびNIBSC 20/130標準血漿 (黒丸)を参照用に示す。(A) ワクチン接種日 (d0)、およびワクチン接種の 1、2、または 4 週間後に CLIA によって測定された S1-S2 へのIgG結合。データは、任意単位 (AU)/ml として表される。 塗りつぶし線と破線は 12 および 15 AU/ml に設定されている。製造元によると、15を超える結果は明らかに陽性であり、12から15の間は多義的であり、12未満は陰性であるか、病原体に対するIgG抗体のレベルが低いことを示している可能性がある。(B-C)ワクチン接種後 d0 およびw4 に収集された血清中のSARS-CoV-2特異的IgG力価は、組換え全長スパイク (B) または RBD(C)でELISAによって測定された。データはエンドポイントの力価として表され、力価を計算できない陰性血清については、任意の値 50 (またはテストされた最初の血清希釈の半分) が割り当てられる。(D-E)ワクチン接種後 4 週目のSARS-CoV-2 中和抗体は、SARS-CoV-2マイクロ中和アッセイ(D)またはプラーク減少中和試験(E)によって検出された。SARS-CoV-2 の中和力価は、MNA90 および PRNT50、またはそれぞれ90%または50%の中和を達成する血清希釈の逆数として表される。破線はLODを示し、陰性の血清にはLODの1/2の値が割り当てられる。 同上 同上 低用量(LD-5x10^10 vp-丸)、中用量(ID-1x10^11 vp-直角三角形)、および高用量(HD-2x10^11 vp-逆三角形)のGRAd-COV2ワクチン接種によって誘導されるスパイクペプチドに対するT細胞応答。18～55 歳および65～85 歳のラベルは、それぞれ、より若い年齢のコホートとより歳をとった年齢のコホートを識別する。水平の黒い線は、すべてのパネルの中央値に設定されている。(A-B) w2で新たに単離されたPBMC上のIFNγELISpot。データは、IFN-γ スポット形成細胞 (SFC)/106 PBMC として表される。(A)個々のデータポイントは、各ボランティアのS1a、S1b、S2a、およびS2bペプチドプール刺激に対する応答を合計し、バックグラウンド（DMSO刺激）を補正することによって計算された、累積スパイクT細胞応答を表す。症候性 SARS-CoV-2 感染から回復した対象から得られた、新たに単離されたヒト回復期 PBMC（HCP: human convalescent PBMC）。(B) 個々のスパイクペプチドプールに対する IFNγ ELISpot 応答の分布。破線は、アッセイ陽性カットオフ (48SFC/100万 PBMC) を示す。 (C-D-E-F) IFNγ/IL2/IL4/IL17細胞内染色と若い (C-D) および歳をとったボランティア(E-F) の新鮮な PBMC の w2 での FACS 分析。データは、各サイトカインを分泌するスパイク特異的 CD4 (C-E) または CD8 (DF) のパーセンテージとして表され（または、任意のTh1のサイトカインの組み合わせ、すなわちIFNγ単独、IL2単独、およびIFNγとIL2の両方を分泌するCD4の総和）、4つのスパイクペプチドプールのそれぞれに対する応答を合計することによって得られ、バックグラウンド (DMSO刺激) に対して補正される。C-E の下の表(CD4 グラフ) は、各用量群内の 任意Th1、IFN-g および IL-2 プロファイルを IL-4 および IL-17 プロファイルと比較する Kruskal-Wallis 検定によって得られた P 値を示す。 同上 同上
以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集: (IUPAC 勧告)（A multilingual glossary ofbiotechnological terms: (IUPAC Recommendations)）」,Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel, Switzerland) に記載されているように定義され、また、 「医薬品原料：合成、特許、出願（Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications）」 by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; 「メルクインデックス：化学物質、医薬品、および生物製剤の百科事典（Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals）」, edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996、および米国薬局方-25/ナショナルフォーミュラリー-20（the United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20）, published by the United States Pharmcopeial Convention, Inc.,Rockville Md., 2001に記載されているように定義される。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「含む（comprise）」という言葉、および「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのバリエーションは、記載された特徴、整数もしくは工程または特徴の群、整数または工程を含むことを意味するが、他の特徴、整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除するものではないことを意味すると理解される。以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様では、これに反することが明確に示されない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の任意の特徴と組み合わせることができる。
本明細書の本文全体で、いくつかの文献が引用される。本明細書で引用された各文献（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記または下記にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
以下の表１ａおよび１ｂは、本明細書で言及されるGRAdおよびその配列の概要を提供する（GRAd + 番号: 単離されたアデノウイルス株。 ＊: アミノ酸配列をコードする GRAd ゲノムの対応するヌクレオチド配列）。GRAd（Gorilla Adenovirus、ゴリラ・アデノウイルス）は発明者による株名である。以下に示すヘキソン、ペントン、ファイバーのゲノム座標の範囲には、最終終止コドンは含まれないが、この座標を使用したヘキソン、ペントン、またはファイバーをコードするポリヌクレオチドを言及する場合には、本開示に任意で含まれ／追加される。
表１ａ：本願で言及する配列番号を有するGRAd
表１ｂ：本願で言及する配列番号
次の表２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、および２ｅは、ゲノムにおけるＣＤＳ、ＲＮＡおよびＩＴＲの、のゲノム境界／座標を提供する。これらは、これらの表に列挙され、それぞれの実施形態に好ましいものとして組み込まれる本明細書のゲノム要素への言及に適用される。
表２ａ：GRAd32 および GRAd23 の CDS、RNA、および ITR のゲノム境界。
E3_CR1-alpha は、GTG を開始コドンとして持つ推定オープンリーディングフレームを示す。rc は逆相補（reverse complement）を示す。スプライシングによって生成された産物は、複数の座標ペアで示される。
表２ｂ： GRAd21およびGRAd37の CDS、RNA、および ITR のゲノム境界。
E3_CR1-alpha は、GTG を開始コドンとして持つ推定オープンリーディングフレームを示す。rc は逆相補（reverse complement）を示す。スプライシングによって生成された産物は、複数の座標ペアで示される。
表２ｃ： GRAd33およびGRAd34の CDS、RNA、および ITR のゲノム境界。
E3_CR1-alpha は、GTG を開始コドンとして持つ推定オープンリーディングフレームを示す。rc は逆相補（reverse complement）を示す。スプライシングによって生成された産物は、複数の座標ペアで示される。
表２ｄ：GRAd35およびGRAd36の CDS、RNA、および ITR のゲノム境界。
E3_CR1-alpha は、GTG を開始コドンとして持つ推定オープンリーディングフレームを示す。rc は逆相補（reverse complement）を示す。スプライシングによって生成された産物は、複数の座標ペアで示される。
表２ｅ： GRAd37およびGRAd38の CDS、RNA、および ITR のゲノム境界。
E3_CR1-alpha は、GTG を開始コドンとして持つ推定オープンリーディングフレームを示す。rc は逆相補（reverse complement）を示す。スプライシングによって生成された産物は、複数の座標ペアで示される。
本発明の態様およびその特定の実施形態
本発明は、本発明の概要で上述したいくつかの態様に関する。これらの態様は、以下に説明する代替実施形態および好ましい実施形態を含む。
第１の態様において、本発明は、本発明の概要に記載のポリヌクレオチドを提供する。そこでは、「その変異体」は、引用された配列番号全体ではなく、引用されたアミノ酸断片を指す。１つの好ましい実施形態において、HVR変異体は１つの変異を含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは単離されたポリヌクレオチドである。当該技術分野、例えば、 Bradley et al. (J Virol., 2012 Jan;86(2):1267-72) で知られているように、アデノウイルス中和抗体はしばしばヘキソン超可変領域を標的とし、アデノウイルスのHVR領域を血清有病率（serumprevalence）で置き換えることにより、そのアデノウイルスは免疫宿主の免疫系を回避することができる。このように、上記の HVR は、以下に定義するそれぞれのヘキソンタンパク質とともに使用できるが、これらのヘキソンタンパク質、および以下のペントンおよびファイバータンパク質とは独立して有用性がある、すなわち、他のヘキソン、ペントン、および／またはファイバータンパク質を有する別のアデノウイルスにおいてヘキソンHVRを置き換えることによって、そのような有用性を発揮する。
好ましくは、
A) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
B) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
C) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
D) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
E) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
F) に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、および／または
G)に記載のヘキソンタンパク質は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスファイバータンパク質および／またはアデノウイルスペントンタンパク質をさらにコードする。
ここで、アデノウイルスファイバータンパク質は、
A)に関して、配列番号３または配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
B)、D)、E) および／または F)に関して、配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、および／または
C) に関して、配列番号１２または配列番号１５に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
アデノウイルスペントンタンパク質は、
A) に関して、配列番号４または配列番号７に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、
B)、D)、E)、F) および／または G) に関して、配列番号７に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む、および／または
C)に関して、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、またはその変異体を含む。
上記のアデノウイルスのヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質のヘキソン、ファイバー、およびペントンの変異体は、それぞれの配列番号によるアデノウイルスのヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質の代わりにアデノウイルスキャプシドに組み込むことができ、それぞれの配列番号により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8% または少なくとも99.9%の配列同一性の配列同一性を独立して有する(すなわち、各変異体は異なる配列同一性を持つことができる)ものであって、それぞれの高い値は、先行する低い値のいずれよりも優先される。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代わりに、ヘキソン、ファイバー、およびペントン変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のアミノ酸変異を独立して有する（すなわち、各変異体は異なる番号を有することができる）と定義することができる。変異の数は次のとおりである: 最大 30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6 、5、4、3、2、または 1 つの変異であって、それぞれの低い値は、先行する高い値のいずれよりも優先される。
キャプシドの３つのタンパク質、ヘキソン、ファイバー、およびペントンのそれぞれ（図１も参照）は他のものとは独立した有用性を有する、なぜなら他のヘキソン、ペントン、および／またはファイバータンパク質を有する異なるアデノウイルスの対応するキャプシドタンパク質を置き換えることができるからである。このように、本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスのヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質の１つをコードする。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスのヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質のうちの２つ、例えば、(i)アデノウイルスヘキソンタンパク質およびアデノウイルスファイバータンパク質、(ii)アデノウイルスのヘキソンタンパク質およびアデノウイルスペントンタンパク質、および／または(iii)アデノウイルスファイバータンパク質およびアデノウイルスペントンタンパク質、をコードする。しかしながら、１つの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスのヘキソン、ファイバー、およびペントンタンパク質のすべてをコードする。
第１の態様のポリヌクレオチドは、基準として配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０、および／または２２を使用して、アデノウイルスゲノム中のヘキソン、ペントンおよび／またはファイバー遺伝子に隣接する他のアデノウイルス遺伝子およびヌクレオチドセグメントをさらに含むことが好ましい。これらは表２に示される。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子にパッケージングするために必要な配列も含むことが特に好ましい。
概して、第１の態様のポリヌクレオチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことが好ましい：
(a) アデノウイルスの５’末端、好ましくは、アデノウイルスの５’ 逆位末端配列（inverted terminal repeat）；
(b) アデノウイルスE1a領域、または13S、12Sおよび 9S領域から選択されるその断片;
(c) アデノウイルスE1b領域、またはE1b 19k、E1b 55kおよびIX領域からなる群から選択されるその断片；
(d) アデノウイルスVA RNA領域、またはVA RNAI およびVA RNA II 領域からなる群から選択されるその断片；
(e) アデノウイルスE2b領域、またはpTP、ポリメラーゼおよびIVa2領域からなる群から選択されるその断片;
(f) アデノウイルスL1領域、または28.1 kDタンパク質、ポリメラーゼ、アグノプロテイン、52/55 kDaタンパク質、およびIIIaタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(g) アデノウイルスL2領域、または上記で定義したペントンタンパク質、VII、V、および X タンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(h) アデノウイルスL3領域、またはVIタンパク質、上記で定義したヘキソンタンパク質、およびエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(i) アデノウイルスE2a領域、またはDBPタンパク質からなるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(j) アデノウイルスL4領域、または100 kDタンパク質、22 kD ホモログ、33 kD ホモログ、およびVIIIタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするその断片；
(k) アデノウイルスE3領域、またはE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8およびE3 ORF9からなる群から選択されるその断片；
(l) アデノウイルスL5領域、または上記で定義したファイバータンパク質をコードするその断片；
(m) アデノウイルスE4領域、またはE4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2、およびE4 ORF1からなる群から選択されるその断片；および／または
(n) アデノウイルス３’末端、好ましくは、アデノウイルス３’ 逆位末端配列（invertedterminal repeat）。
これらのエレメントは配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２（すなわち表２に示されるとおり）に示されるアデノウイルスまたは他のアデノウイルス、特に、例えばキメラアデノウイルスを形成するヒトアデノウイルスのような他の種の１つに由来してよい。
前述のポリヌクレオチドのいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記で概説したように、１つまたは複数のゲノム領域を含まないこと(例えば、E3および／またはE4領域のように、(a)から(m)に記載のとおり) および／または少なくとも１つの遺伝子を非機能的にする欠失および／または変異を含むアデノウイルス遺伝子を含むことが望ましい場合がある。これらの好ましい実施形態において、適切なアデノウイルス領域は、前述の領域／遺伝子を含まないように改変されるか、または選択された領域／遺伝子を非機能的にするように改変される。それらを非機能にする１つの可能性としては、これらの遺伝子のオープンリーディングフレームに１つまたは複数の終止コドン (TAA など) を導入することである。ウイルスを複製欠損にする方法は、当技術分野で周知である(例えば、Brody et al, 1994 Ann NY Acad Sci.,716: 90-101を参照)。欠失は、好ましくは本明細書に記載のミニ遺伝子カセットなどの発現カセット内に導入遺伝子を挿入するためのスペースを作ることができる。さらに、欠失は、当技術分野でよく知られているように、パッケージング細胞株またはヘルパーウイルスを使用せずには複製能力のないアデノウイルスベクターを生成するために使用することができる。このように、特定の遺伝子／領域の欠失または機能喪失変異の１つまたは複数を含む、上記で概説したポリヌクレオチドを含む最終的な組換えアデノウイルスは、例えば、遺伝子治療やワクチン接種のための、より安全な組換えアデノウイルスを提供することができる。
ポリヌクレオチドは、（ｉ）本明細書で概説するように、少なくとも１つのゲノム領域／遺伝子（例えば、E3および／またはE4領域など）、特に、E1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3ORF9、E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4ORF3、E4 ORF2および／またはE4 ORF1、好ましくはE1A, E1B、E2A、E2B、E3 および／またはE4を含まなくてもよく、および／または（ｉｉ）少なくとも１つのゲノム領域／遺伝子を非機能的にする欠失および／または変異を含むアデノウイルスゲノム領域／遺伝子（例えば、上記（ｉ）で特定されているようなもの）を含み得るが、無傷のE1Aおよび／またはE1B領域は任意に保持され得る。そのような無傷のE1領域は、アデノウイルスゲノムの本来の位置に位置してよく、または天然のアデノウイルスゲノムの欠失部位(例えば、E3領域)に配置され得る。
１つの好ましい実施形態において、第１の態様のポリヌクレオチドは、以下のアデノウイルスタンパク質の１つまたは複数、好ましくはすべてをさらにコードする：タンパク質ＶＩ、タンパク質ＶＩＩＩ、タンパク質ＩＸ、タンパク質ＩＩＩａおよび／またはタンパク質ＩＶａ２。
アデノウイルスの平均的な当業者は、上記特定のアデノウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを決定する方法をよく知っている。当業者はまた、アデノウイルスゲノムの構造を認識しており、過度の負担なしに、本明細書で概説する個々のアデノウイルス領域およびORFを任意のアデノウイルスゲノムにマッピングすることができる。
別の実施形態において、第１の態様のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片をさらにコードする。１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片は、好ましくは非アデノウイルスタンパク質またはその断片である。１つの好ましい実施形態において、１つまたは複数の非アデノウイルスタンパク質またはその断片は、１つまたは複数の抗原性タンパク質またはその抗原性断片である。好ましくは、１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片は、１つまたは複数の発現カセットの一部である遺伝子によってコードされる。異種タンパク質をコードする配列、および好ましくは異種タンパク質をコードするそのような配列を含む発現カセットは、例えば、本明細書で定義されるアデノウイルスゲノムの欠失領域に挿入され得る。
１つの好ましい実施形態において、異種タンパク質またはその断片は、コロナウイルスタンパク質またはその断片であり、より好ましくは、SARS-CoV-2タンパク質またはその断片である。用語「SARS-CoV-2」は、好ましくは国際ウイルス分類委員会 (ICTV) によって SARS-CoV-2 の株として分類されている任意のコロナウイルス株をいう。さらにまたは代替的には、それは、2019年のアウトブレイクの元の株の配列「重症急性呼吸器症候群 コロナウイルス 2 分離株武漢-Hu-1（Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1）」(Genbank Acc. NoMN908947に基づく、NCBI Reference Sequence NC_045512.2,version of March 30, 2020)またはその配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または好ましくは少なくとも99%（高い値は、それより前の低い値よりも優先される）の配列同一性を有するその変異体のコロナウイルスである。特に、タンパク質またはその断片は、コロナウイルス（好ましくはSARS-CoV-2）スパイクタンパク質またはその断片であってよく、例えば、スパイクタンパク質（またはその断片）は、（ｉ）配列番号３０による配列またはその変異体を含むか、またはそれからなり、および／または(ii) 配列番号２９の６～３８２４位によるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含むか、それからなる。配列番号２９または３０の変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（高い値は、それより前の低い値よりも優先される）の配列同一性を有する。変異体は、好ましくは機能的であり、すなわちヒトACE2タンパク質に結合することができる。
１つの好ましい実施形態において、SARS-CoV-2 タンパク質またはその変異体は、以下の１つまたは複数のアミノ酸変異（置換および欠失を含む）を有する：
a) 配列番号３０の、Asp 614（または変異体における対応する位置のAsp）が Glyに置換されている（配列番号２４）、
b) 配列番号３０の、２つのアミノ酸Lys 986およびVal 987（または変異体における対応する位置のLysおよびVal）が両方Proに置換されている（配列番号２５）、
c) 配列番号３０の、アミノ酸69、70および144が欠失し、Asn 501がTyrに置換され、Ala 570がAspに置換され、Asp614がGlyに置換され、Pro 681がHisに置換され、Thr 716がIleに置換され、Ser 982が Alaに置換され、 および Asp 1118がHis に置換されている、
d) 配列番号３０の、 Leu 18 が Phe に置換され、Asp 80 が Ala に置換され、Asp215 が Gly に置換され、アミノ酸 242、243、および 244 が欠失し、Lys417が Asn に置換され、Glu 484 が Lys に置換され、Asn 501 がTyr に置換され、Asp 614 が Gly に置換され、および Ala 701がVal に置換されている、
e) 配列番号３０の、Leu18 が Phe に置換され、Thr 20 が Asn に置換され、Pro26 が Ser に置換され、Asp138 が Tyr に置換され、Arg 190 がSer に置換され、Lys 417 が Thr に置換され、Glu 484 が Lys に置換され、Asn501が Tyr に置換され、Asp 614がGlyに置換され、His 655がTyrに置換され、Thr 1027がIleに置換され、およびThr 1027、およびVal 1176がPheに置換されている、
f) 配列番号３０の、Ser 13がIleに置換され、Trp 152がCysに置換され、Leu452がArgに置換され、およびAsp 614がGlyに置換されている、,
g) 配列番号３０の、Gln 52がArgに置換され、アミノ酸69、70および144が欠失し、 Glu 484がLysに置換され、Gln677がHisに置換され、およびPhe 888がLeuに置換されている、
h) 配列番号３０の、Leu 5がPheに置換され、Thr 95がIleに置換され、Asp253がGlyに置換され、Asp 614がGlyに置換され、Ala 701がValに置換され、およびGlu 484がLysに置換されている、
i) 配列番号３０の、 Leu 5がPheに置換され、Thr 95がIleに置換され、Asp253 がGlyに置換され、Asp 614がGlyに置換され、Ala 701がValに置換され、および Ser 477がAsnに置換されている、
j) 配列番号３０の、Thr 478がLysに置換され、Asp 614がGlyに置換され、Pro681がHisに置換され、およびThr 732がAlaに置換されている、
k) 配列番号３０の、Thr 95がIleに置換され、Gly 142がAspに置換され、Glu154がLysに置換され、Leu 452がArgに置換され、Glu 484がGlnに置換され、Asp 614がGlyに置換され、Pro681がArgに置換され、およびGln 1071がHisに置換され、および／または（好ましくは、または）
l) 配列番号３０の、Thr 19がArgに置換され、Gly 142がAspに置換され、Glu156がGlyに置換され、アミノ酸157および158が欠失し、Leu 452がArgに置換され、Thr 478がLysに置換され、Asp614がGlyに置換され、Pro 681がArgに置換され、 およびAsp 950がAsnに置換されている。
換言すると、SARS-CoV-2タンパク質は、上記項目ａ）からｌ）に記載の配列を有してよく、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（項目ａ）からｌ）の置換／欠失を維持）でのその変異体の配列を有してよい。例えば、SARS-CoV-2タンパク質は、配列番号２４による配列（Asp 614からGlyへの置換）を有してよく、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（置換を維持）での、任意でｂ）による置換を伴うものでの、その変異体の配列を有してよく、あるいは、SARS-CoV-2タンパク質は、配列番号２５による配列（Lys 986およびVal987の両者がProへの置換）を有してよく、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（置換を維持）での、その変異体の配列を有してよい。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、好ましくは第１の態様のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスゲノムを含む、アデノウイルスをコードする。１つの好ましい実施形態において、アデノウイルスゲノムは、配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２に示される配列を含むか、または、その配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（高い値は、それより前の低い値よりも優先される）を有する変異体の配列を含む。この点に関し用語「コードする」は、ポリヌクレオチドがコード配列のみを含むことを必要とするものではなく、好ましくは本明細書に記載されるように、特にアデノウイルスゲノムの非コード配列を含んでもよい。すなわち、ポリヌクレオチドは、アデノウイルスのコード配列および任意で非コード配列も含む。
１つの好ましい実施形態において、コード化されたアデノウイルスは、複製能力のないアデノウイルスであり、好ましくは、上記に特定されるアデノウイルスゲノムを含むものであるが、ゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3および／またはE4の１つまたは複数を欠失している。
最も好ましくは、コード化されたアデノウイルスは、組換えアデノウイルスをコードし、好ましくは、配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２に示されるアデノウイルスゲノムまたは上記で定義されるその変異体を含み、好ましくは、１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片をコードする１つまたは複数の遺伝子が挿入されている（キャリアアデノウイルス）。好ましくは、これらの１つまたは複数の異種遺伝子は、１つまたは複数のゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4ORF2および／またはE4 ORF1、より好ましくはE1、E3および／またはE4を置換することによって挿入される。異種遺伝子は、好ましくは発現カセットの一部として挿入される。任意で、キャリアアデノウイルスはまた、本明細書に記載されるように複製能力がなく、すなわちゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3および／またはE4の１つまたは複数を欠いている。例えば、組換えアデノウイルスは、配列番号２６、２７または２８による配列、またはこれらの配列と少なくとも８０％（好ましくは、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％、ここで高い値は、それより前の低い値よりも優先される）の配列同一性を有する変異体による配列によってコードされ得るものであって、任意で、１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片をコードする１つまたは複数の遺伝子の配列が挿入されている。
例示的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３１（任意で、配列番号２５によるスパイクタンパク質をもたらす置換を伴う、例えば、Pos 2487 C->T、Pos 2488 A->G、Pos 2489 C->G、Pos 2490 C->A、Pos 2491 T->G、および Pos 2492 T->G）、配列番号３２または配列番号３３によるポリヌクレオチドを含む、またはこれらのポリヌクレオチドと少なくとも８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％（ここで高い値は、それより前の低い値よりも優先される）の配列同一性を有する変異体によるポリヌクレオチドを含む、アデノウイルスをコードする。その中で好ましくは、アデノウイルスベクターについて上記で定義された欠失が考慮され、すなわち、それらは配列同一性の低下に寄与しない。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは組換えアデノウイルスをコードするものであって、該組換えアデノウイルスの少なくとも１つのアデノウイルスゲノム領域は、上記で定義したヘキソン、ファイバーおよび／またはペントンタンパク質の１つまたは複数を含まないアデノウイルス（キメラアデノウイルス）に由来する。好ましくは、キメラアデノウイルスは、１つまたは複数のヘキソン、ファイバーおよび／またはペントンタンパク質を中心としてまたは好ましくはそれらのみをキメラ化したものである。換言すると、ポリヌクレオチドは、上記で定義したヘキソン、ファイバー、および／またはペントンタンパク質のうちの１つまたは複数をコードするが、１つまたは複数、好ましくはすべての他のゲノム領域が異なるアデノウイルス、特に、配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２に示されるアデノウイルスに由来する。異なるアデノウイルスは、好ましくは異なる宿主に天然に見出されるものであり、より好ましくはヒトアデノウイルスである。このポリヌクレオチドは、好ましくは、上記で定義された１つまたは複数の異種非アデノウイルスタンパク質またはその断片もコードする。このように、１つまたは複数の異種非アデノウイルス遺伝子が、キメラアデノウイルスのアデノウイルスゲノムに挿入される。すなわち、キメラアデノウイルスのアデノウイルスゲノムは、上で定義したヘキソン、ファイバーおよび／またはペントンタンパク質の１つまたは複数をコードするＤＮＡを除いて、サル以外のアデノウイルス、例えば、ヒトアデノウイルス、好ましくは非サル（例えば、ヒト）キャリアアデノウイルスに由来する。
一般に、アデノウイルスは複製能力がないことが好ましい。この目的を達成するために、アデノウイルスは、ゲノム領域E1A、E1B、E2A、E2B、E3および／またはE4の１つまたは複数を欠失していることが好ましい、またはゲノム領域またはそれによってコードされる発現産物を非機能的にする欠失および／または変異を含むことが好ましい。
１つの特定の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるそのすべての変異体において、機能的に損なわれたIVa2遺伝子、好ましくはその欠失またはヌル変異を有し得る。この遺伝子はウイルス DNAのパッキングに関与しており、その障害によってウイルス様粒子が生成される。この実施形態において、第１の態様のポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数の非アデノウイルスＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープをコードする。
第２の態様において、本発明は、第１の態様のA) 、B) 、C) 、D) 、E)またはF)で定義されるポリヌクレオチドによってコードされるヘキソンポリペプチドを提供する。好ましくは、ヘキソンポリペプチドは単離されたポリペプチドである。
第３の態様において、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされるヘキソンタンパク質および好ましくは第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされるファイバータンパク質およびペントンタンパク質の一方または両方を含むアデノウイルスキャプシドを提供する。好ましくは、アデノウイルスキャプシドは単離されたアデノウイルスキャプシドである。
アデノウイルスキャプシドポリペプチドおよびキャプシドは、細胞内での発現によって得ることができる。発現されたポリペプチドは、標準技術を使用して任意に精製することができる。例えば、細胞は、沈殿およびクロマトグラフィー工程にかけられる前に、機械的または浸透圧ショックによって溶解されてよく、その性質および順序は、回収される特定の組換え材料に依存する。あるいは、発現されたポリペプチドは、タンパク質発現の分野で知られているように、組換え細胞が培養された培地から分泌されおよび回収され得る。
第４の態様において、本発明は、（ｉ）第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされる、（ｉｉ） 第１の態様によるポリヌクレオチドを含む、および／または（ｉｉｉ）第１の態様によるポリヌクレオチド、および／または（ｉｉｉ）第２の態様のヘキソンポリペプチドまたは第３の態様のアデノウイルスキャプシを含む、アデノウイルス（本明細書ではアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスのベクターとも呼ばれる）を提供する。好ましくは、アデノウイルスは単離されたアデノウイルスである。
すなわち、アデノウイルスは、例えば、配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２によってコードされるアデノウイルス、または上記で定義されたキャリアアデノウイルスもしくはキメラアデノウイルスなどの組換えアデノウイルスであり得る。
例示的な実施形態において、本発明は、配列番号２６～２８および３１～３３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチドを含むアデノウイルス、または上記で定義されるその変異体を提供する。
アデノウイルスは、第１の態様のポリヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい。このポリヌクレオチドがアデノウイルスに含まれない場合、トランスで（すなわち、アデノウイルスに組み込まれたアデノウイルスゲノムではない遺伝要素によって）提供されることが好ましい。それは通常、ヘルパーコンストラクト（例えば、プラスミドまたはウイルス）によって、またはパッケージング宿主細胞（本明細書に記載の補完細胞（complementing cell））のゲノムまたはヘルパーコンストラクトによって提供される。トランスで提供されるポリヌクレオチドは、アデノウイルスに組み込まれたゲノムには含まれないものであり、これらのポリヌクレオチドの相同体または他の配列変異体を含むことがさらに好ましい。例えば、トランスで提供されるポリヌクレオチドがヘキソン、ペントンおよび／またはファイバー遺伝子を含む場合、アデノウイルスに組み込まれたゲノムは、ヘキソン、ペントンおよび／またはファイバータンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含まない。最も好ましくは、トランスで提供されるポリヌクレオチドは、本明細書で定義される少なくとも１つ（好ましくはすべて）のアデノウイルスキャプシドポリペプチドをコードする。
遺伝子を宿主（例えば、ヒトまたは他の哺乳類細胞）に送達するためのアデノウイルスベクターの構築において、一連のアデノウイルス核酸配列を使用することができる。例えば、アデノウイルス遅延初期遺伝子（delayed early gene）E3の全部または一部は、組換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から除去されてもよい。サルのE3 の機能は、組換えウイルス粒子の機能および産生とは無関係であると考えられている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、E4遺伝子の少なくともORF6領域、より望ましくは、この領域の機能における冗長性のために、E4領域全体を欠失させたものを構築することもできる。本発明のさらに別のベクターは、遅延初期遺伝子E2Aにおける欠失を含み得る。欠失は、サルアデノウイルスゲノムのL1からL5までの後期遺伝子のいずれにおいても行うことができる。同様に、中期遺伝子IXおよびIVa2の欠失は、いくつかの目的に役立つ可能性がある。他の欠失は、他の構造的または非構造的アデノウイルス遺伝子で行うことができる。上記の欠失は個別に使用することができ、すなわち、本発明で使用するアデノウイルス配列は、単一の領域のみに欠失を含むことができる。あるいは、それらの生物学的活性を破壊するのに有効な遺伝子全体またはその一部の欠失は、任意の組み合わせで使用されてよい。例えば、アデノウイルス配列は、E3の欠失を伴うかまたは伴わずに、E1およびE4領域、またはE1、E2aおよびE3領域、またはE1およびE3領域、またはE1、E2AおよびE4領域などの欠失を有し得る。そのような欠失は、所望の結果を達成するために、温度感受性変異などの他のアデノウイルス遺伝子変異と組み合わせて使用することができる。
任意の必須アデノウイルス配列（例えば、E1A、E1B、E2A、E2b、E4 ORF6、L1またはL4から選択される領域）を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルスの感染性およびアデノウイルス粒子の増殖に必要なアデノウイルス遺伝子産物が欠損している状態で培養することができる。これらのヘルパー機能は、１つまたは複数のヘルパーコンストラクト(例えば、プラスミドまたはウイルス)またはパッケージング宿主細胞（本明細書で定義される補完細胞）の存在下でアデノウイルスベクターを培養することによって提供され得る。例えば、WO96/13597の「最小限の」ヒトアデノウイルスベクターの調製について説明されている技術を参照。
有用なヘルパーコンストラクトは、ベクターおよびベクターがトランスフェクトされる細胞によって欠失および／または発現されないそれぞれの遺伝子を補完する、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、ヘルパーコンストラクトは複製欠損性であり、必須のおよび任意のさらなるアデノウイルス遺伝子を含む。
ヘルパーコンストラクトは、Wu et al, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989)；K. J. Fisher and J. M. Wilson,Biochem. J., 299: 49 (April 1, 1994)に記載されているように、ポリカチオン結合体に形成してもよい。ヘルパーコンストラクトは、任意でレポーター遺伝子を含んでいてもよい。多くのそのようなレポーター遺伝子が当技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子とは異なるヘルパーコンストラクト上のレポーター遺伝子の存在により、アデノウイルスおよびヘルパーコンストラクトの両方を独立してモニターすることが可能になる。この第２のレポーターは、得られた組換えアデノウイルスと精製時のヘルパーコンストラクトとの間の分離を容易にするために使用され得る。好ましいヘルパーコンストラクトはヘルパーウイルスである。
本明細書の好ましい実施形態に関連して記載される遺伝子のいずれかが欠失した組換えアデノウイルス（Ａｄ）を生成するために、欠失遺伝子領域の機能が、ウイルスの複製および感染性に必須である場合、好ましくは、ヘルパーコンストラクトまたは細胞（すなわち、補完細胞またはパッケージング細胞）によって組換えウイルスに供給される。多くの場合、ヒトE1を発現するコンストラクト／細胞は、組換えアデノウイルスを生成するために使用されるベクターをトランス補完（transcomplement）するために使用することができる。これは、本発明のポリヌクレオチド配列と、現在入手可能なパッケージングコンストラクト／細胞に見られるヒトアデノウイルスE1配列との間に多様性があり、現在のヒトE1含有コンストラクト／細胞の使用は、複製および生産プロセス中に複製能力のあるアデノウイルスの生成を防ぐため、特に有利である。しかしながら、特定の条件において、E1欠失組換えアデノウイルスの産生のためにE1遺伝子産物を発現するコンストラクト／細胞を利用することが望ましい。
必要に応じて、本明細書で提供される配列を利用して、選択された親細胞株（例えばHeLa細胞）における発現のためのプロモーターの転写制御下で配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０または２２に示されるアデノウイルスから少なくともアデノウイルスE1遺伝子を発現するヘルパーコンストラクト／細胞または細胞株を生成することができる。この目的のために、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターを使用することができる。プロモーターの例としては例えば本明細書の実施例で提供される。そのようなE1発現細胞は、組換えアデノウイルスE1欠失ベクターの生成に有用である。さらに、あるいは、本発明は、１つ以上のアデノウイルス遺伝子産物、例えば、E1A、E1B、E2A、および／またはE4 ORF6、好ましくはAd5 E4 ORF6を発現するコンストラクト／細胞を提供し、これは組換えアデノウイルスベクターの生成に使用するのと本質的に同じ手順を使用して構築することができる。このようなコンストラクト／細胞は、それらの産物をコードする必須遺伝子が欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完（transcomplement）するために利用することができ、またはヘルパー依存性ウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するために利用することができる。
一般的に、トランスフェクションによってアデノウイルスベクターを送達する場合、ベクターは、約1 x 104細胞～約1 x 103細胞、および好ましくは約105細胞に対して、約0.1μgから約100μg、好ましくは約10～約50μｇのDNAの量で送達される。 しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞などの要因を考慮して調整され得る。宿主細胞へのベクターの導入は、例えばCaPO4トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用するトランスフェクションおよび感染を含む、当技術分野で公知のまたは本明細書に開示される任意の手段によって達成され得る。
目的の組み換えアデノウイルスの構築および組み立てのために、１つの例において、アデノウイルスベクターは、ヘルパーコンストラクトの存在下でインビトロでパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができ、ヘルパーとアデノウイルスベクター配列との間で相同組換えが起こることを可能にし、ベクター中のアデノウイルス導入遺伝子配列が複製され、ウイルス粒子（ビリオン）キャプシドにパッケージ化され、当技術分野で周知の組換えウイルスベクター粒子が得られる。本発明の組換えアデノウイルスは、例えば、選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞に導入するのに有用である。
１つの好ましい実施形態において、第４の態様のアデノウイルスは、ヒト対象の５％未満で血清有病率を有し、好ましくはヒト対象で血清有病率を有さない、最も好ましくは非ヒト大型類人猿アデノウイルス、より好ましくは、配列番号１、５、８、１０、１４、１６、１８、２０および／または２２に示される１つまたは複数のアデノウイルスと以前に接触したことのないヒト対象で血清有病率を有さない。この文脈において、ヒト対象は、ヨーロッパ人、アフリカの先住民、アジア人、アメリカの先住民、およびオセアニアの先住民からなる群から選択される民族グループに属することが好ましい。ヒト対象の民族的起源を同定する方法は、当技術分野（例えば、WO 2003/102236を参照）に含まれる。
組換えアデノウイルスのさらなる好ましい１つの実施形態において、アデノウイルスは哺乳類の標的細胞に侵入することができる、すなわち、感染性がある。本発明の感染性組換えアデノウイルスは、ワクチンとして、また本明細書に記載の遺伝子治療のために使用することができる。このように、別の実施形態において、組換えアデノウイルスは、標的細胞への送達のための分子を含むことが好ましい。好ましくは、標的細胞は哺乳動物細胞、例えば非ヒト大型類人猿細胞、げっ歯類細胞またはヒト細胞である。例えば、標的細胞への送達のための分子は、好ましくは発現カセット内で、本明細書で定義される異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、異種遺伝子）であり得る。アデノウイルスのゲノムに発現カセットを導入する方法は、当技術分野で周知である。１つの実施形態において、例えば異種遺伝子をコードする発現カセットを含む本発明の組換えアデノウイルスは、E1A、E1B、E2A、E2B、E3および／またはE4から選択されるアデノウイルスのゲノム領域を前記発現カセットで置換することによって生成することができる。本発明のアデノウイルスのゲノム領域E1A、E1B、E2A、E2B、E3およびE4は、ヒトAd5などの既知で注釈付きのアデノウイルスゲノムとのアライメントによって簡単に識別できる(BirgittTaeuber and Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, p. 7847 - 7854; およびAndrew J. Davison, et al., Journal of General Virology (2003), 84,p. 2895-2908を参照)。
標的細胞への送達のための分子は、好ましくは異種ポリヌクレオチドであるが、好ましくは治療または診断活性を有する、ポリペプチドまたは小分子化合物であってもよい。１つの特定の好ましい実施形態において、標的細胞への送達のための分子は、アデノウイルスの5’逆位末端配列(ITR)および3’ITRを含む異種ポリヌクレオチドである。組換えアデノウイルスが例えばパッケージング細胞において産生される場合、分子の分子サイズは、キャプシドが分子の周りに形成され、分子をパッケージ化できるように選択されなければならないことは、当業者には明らかであろう。したがって、好ましくは、異種遺伝子は、例えば、最大 7000塩基対 または最大 8000 塩基対を有することができるミニ遺伝子である。
第５の態様において、本発明は、（ｉ）第１の態様のポリヌクレオチドによってコードされるウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および／または（ｉｉ）第２の態様のヘキソンポリペプチドまたは第３の態様のキャプシドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。好ましくはVLPは単離されたVLPである。
１つの実施形態において、VLPをコードするポリヌクレオチドは、欠失したIVa2遺伝子を有するか、またはIVa2遺伝子にヌル変異を有する。
下記VLPの定義によれば、第５の態様のVLPは、アデノウイルスゲノムDNAを実質的に含まない。アデノウイルスVLPを含むVLPは、ワクチン接種、遺伝子治療、または例えば抗がん剤などの直接的な薬物送達に使用されている（Chroboczek et al., ACTA ABP BIOCHIMICA POLONICA, Vol. 61, No. 3/2014）。すなわち、第４の態様のVLPは、上記で定義した１つまたは複数の異種遺伝子を含んでよく、またはその１つまたは複数のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含んでよい。別の実施形態において、それは遺伝子治療のための１つまたは複数の非アデノウイルス遺伝子、および／または１つまたは複数の医薬品（例えば抗がん剤）を含み得る。１つの実施形態において、VLPは、上記で定義した１つまたは複数の異種タンパク質またはその断片（好ましくはＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープ）を組み込み、好ましくは提示する。
第６の態様において、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターは単離されたベクターである。１つの好ましい実施形態において、ベクターはプラスミドベクター、例えば発現ベクターである。プラスミドベクターは、本明細書に記載の組換えアデノウイルスを生成するために有利に使用することができる。本発明の新規ヘキソン、ペントンおよびファイバータンパク質の配列情報が提供されるので、前記組換えアデノウイルスは、例えば、第１の態様のポリヌクレオチドおよび任意の他のアデノウイルスゲノム領域によってコードされる組換えアデノウイルスを構築することによって得ることができる。組換えアデノウイルスの構築方法は、当技術分野で周知である。組換えアデノウイルスの調製に有用な技術は、例えば、Graham & Prevec, 1991 In Methodsin Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray,EJ.), p. 109; およびHitt et al., 1997, Advances inPharmacology 40:137-206に概説されている。さらなる方法はWO 2006/086284に記載されている。
第１の態様のポリヌクレオチドを発現させるために、好ましくは発現カセットを用いて、転写を指示する強力なプロモーターを含む発現ベクターに前記ポリヌクレオチドをサブクローニングすることができる。適切な細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp）、およびサルモネラ菌（Salmonella）であり、このような発現系のキットは市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核細胞発現系は、当技術分野で周知であり、市販もされている。発現カセットの詳細については、以下を参照のこと。
遺伝情報を細胞に輸送するのに有用な特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞での発現に使用される従来の任意のベクターのいずれかを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23DなどのプラスミドならびにGSTおよびLacZなどの融合発現系が含まれるが、有用に使用できる当業者に知られているさらに多くのものがある。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン-バーウイルス由来のベクターで使用される。他の真核ベクターの例では、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、pcDNA3.1、pIRESならびに、例えば、HCMV前初期プロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。発現系のいくつかには、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーがある。あるいは、遺伝子増幅を含まない高収量発現系も適している。発現ベクターに含めることもできるエレメントには、大腸菌で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、ならびに真核生物の配列の挿入を可能にする、プラスミドの非必須領域の固有の制限部位が含まれる。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野で知られている多くの薬剤耐性遺伝子のいずれも適切である。原核の配列は、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製を妨げないように任意に選択される。
第７の態様において、本発明は、(i) アジュバント、(ii) 第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、または第６の態様のベクター、および任意で (iii) 薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
好ましくは、アジュバントは、I型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、TNF受容体、転写因子として作用するビタミンD受容体、およびToll様受容体 1（TLR1）、TLR-2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7およびTLR9からなる群から選択される受容体に対するアゴニストである。
アジュバントを含む組成物は、例えばヒト対象のためのワクチンとして使用することができる。例えば、特定の受容体の活性化は、免疫応答を刺激することができる。そのような受容体は当業者に知られており、例えばサイトカイン受容体、特にＩ型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、TNF受容体；および転写因子として働くビタミンD受容体；およびToll様受容体 1（TLR1）、TLR-2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7およびTLR9を含む。そのような受容体に対するアゴニストは、アジュバント活性を有する、すなわち免疫刺激性である。１つの好ましい実施形態において、組成物のアジュバントは、１つまたは複数のToll様受容体アゴニストであってよい。１つのより好ましい実施形態において、アジュバントは、Toll様受容体4アゴニストである。特に１つの好ましい実施形態において、アジュバントは、Toll様受容体9アゴニストである。アジュバントの例としては以下を参照のこと。また、好ましい薬学的に許容される賦形剤を以下に記載する。
第８の態様において、本発明は、第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシドポリペプチド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、または第６の態様のベクターを含む細胞を提供する。好ましくは、細胞は単離された細胞である。
好ましくは、細胞は、アデノウイルスを複製能力のないものにするために、上記で説明したように欠失または非機能化された、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子、または好ましくはすべてのアデノウイルス遺伝子を発現する宿主細胞である。この少なくとも１つの遺伝子の発現により、宿主細胞は、好ましくは、そうでなければ複製能力のないアデノウイルスの複製を可能にする。１つの実施形態において、E1A、E1B、E2A、E2B、E3およびE4からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子を発現する宿主細胞。特に、この少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスゲノムにおいて欠失されているまたは非機能的である。このような補完細胞は、例えば前述の遺伝子産物の１つを欠失しているため、複製能力のないアデノウイルスの増殖およびレスキューに使用することができる。
細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisなどの酵母細胞、植物細胞、SF9やHi5細胞などの昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択することができる。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、ヒト胚性腎臓 (HEK 293) 細胞、HELA 細胞、ヒト肝癌細胞 (例えばHuh7.5)、Hep G2 ヒト肝癌細胞、Hep 3B ヒト肝癌細胞などである。
細胞が第１の態様によるポリヌクレオチドを含む場合、このポリヌクレオチドは、（ｉ）そのまま自由に分散するか、または（ｉｉ）細胞ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれるかのいずれかにより細胞内に存在し得る。
さらに好ましい実施形態では、細胞は、E1A、E1B、E2A、E2B、E4、L1、L2、L3、L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子を発現する宿主細胞、好ましくはHEK 293細胞またはPER.C6TM細胞である。
標準的なトランスフェクション法を使用して、細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫の細胞株を生成できる。外来ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順のいずれかを使用することができる。例えば、リポフェクタミン（商標）(Invitrogen)などの市販のリポソームベースのトランスフェクションキット、Fugene(Roche Diagnostics)などの市販の脂質ベースのトランスフェクションキット、ポリエチレングリコールベースのトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃 (biolistic)、エレクトロポレーション、またはウイルス感染、およびクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかを使用することができる。使用される特定の遺伝子操作手順が、受容体を発現できる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入できることだけが必要である。
細胞のさらなる実施形態は、上記の本発明の第３の態様に関して記載されている。
第９の態様において、本発明は、疾患の治療または予防における使用のための、第１の態様のポリヌクレオチド、第２の態様のヘキソンポリペプチド、第３の態様のアデノウイルスキャプシドポリペプチド、第４の態様のアデノウイルス、第５の態様のウイルス様粒子、または第６の態様のベクター、第７の態様の組成物および／または第８の態様の細胞を提供する。
１つの実施形態において、治療または予防はワクチン接種によるものである。別の実施形態では、治療は遺伝子治療によるものである。ワクチン接種に関して、疾患は、好ましくは本明細書に記載の病原体によって引き起こされる感染性疾患、または好ましくは健康な細胞によって発現されない抗原を発現する疾患細胞（例えば腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞など）によって特徴付けられる非感染性疾患である。遺伝子治療に関して、疾患は、遺伝子またはタンパク質の機能喪失または機能獲得につながる１つまたは複数の体細胞変異によって引き起こされる遺伝性疾患である。１つの好ましい実施形態において、使用用途はコロナウイルス病の治療または予防のためのものである。「コロナウイルス病（coronavirus disease）」という用語は、本明細書において、少なくとも１つのコロナウイルス病の症状の存在によるコロナウイルス感染（coronavirus infection）（対象の少なくとも１つの細胞へのコロナウイルスの侵入および少なくとも１つの細胞におけるその複製）と区別される。感染がコロナウイルス病の少なくとも１つの症状を伴わない限り、それ（または対象）は無症候性（発症前を含む）である。本明細書で使用されるコロナウイルス病という用語は、コロナウイルス感染の存在およびコロナウイルス病の少なくとも１つの症状(本明細書では症候性感染とも呼ばれる)を必要とする。コロナウイルス症状は、乾いた咳、発熱（37.8℃以上）、鼻水および／または鼻づまり、疲労、呼吸困難、肺炎、臓器（例えば、心臓、肺、肝臓および／または腎臓）の障害、喉のかゆみ、頭痛、関節痛、吐き気、下痢、震え、リンパ球減少症、嗅覚の喪失および／または味覚の喪失を含む。好ましくは、コロナウイルス病は、２つ以上、３つ以上、または４つ以上の症状、好ましくは乾いた咳、発熱（37.8℃以上）、呼吸困難、嗅覚および／または味覚の喪失のうちの１つ以上を含む症状の存在によって特徴づけられる。コロナウイルス病は、好ましくは呼吸器疾患（例えば、SARSまたはMERS）、より好ましくはSARS、最も好ましくはCovid-19である。
アデノウイルスが遺伝子治療やワクチンにおいて有用であることはよく知られている。前臨床および臨床研究では、このシステムを使用したベクター設計、堅牢な抗原発現、および防御免疫の実現可能性が実証されている。したがって、使用用途の１つの好ましい実施形態は、例えばヒト対象への、ワクチン接種での使用である。ワクチン接種のためにアデノウイルスをどのように使用し、調製するかについての詳細な説明書は、当技術分野に含まれ、当業者に知られている十分な文献として提供されている。例えば非ヒト大型類人猿アデノウイルスに基づくウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためのヒト由来Ａｄベクターの使用に代わるものである(Farina SF, J Virol. 2001 Dec;75(23):11603-13.; Fattori E, GeneTher. 2006 Jul;13(14):1088-96)。ヒト以外の大型類人猿から単離されたアデノウイルスは、ヒト由来の細胞で効率的に増殖することからわかるように、ヒトから単離されたアデノウイルスと密接に関連している。しかしながら、ヒトおよびヒト以外の類人猿アデノウイルスは関連しているため、2 つのウイルス種の間にはある程度の血清学的交差反応性があるか、またはまったくない可能性がある。この推定は、チンパンジーのアデノウイルスが単離され、特徴付けられたときに確認された。このように、本発明による非ヒト大型類人猿アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスの一般的な血清型に対するヒトの既存の免疫に関連する悪影響を低減するための基礎を提供し、それにより、例えば、免疫および／または遺伝子治療に使用できる、貴重な医療ツールを提供する。
これは、ヘキソン、ペントン、およびファイバータンパク質を含むアデノウイルスキャプシドタンパク質の新規配列によるものである。すなわち、本発明によるキャプシドタンパク質に特異的な中和抗体は、ヒト血液血清中に存在しないか、または非常に少ないと予想される。したがって、新規配列の１つの利点は、例えば医療目的のために、操作された先行技術のアデノウイルスを増強するために使用できることである。例として、例えばこの配列を使用して、異なるアデノウイルス（例えば先行技術のアデノウイルス）の主要な構造キャプシドタンパク質の１つまたは複数を交換／置換して、ヒトにおける血清有病率が低下した改良された組換えアデノウイルス（キメラアデノウイルス）を得ることができる。新規配列、したがって記載したように再設計されたアデノウイルスは、投与された場合、ヒトにおいて有意な阻害性免疫応答に遭遇しないため、それらの全体的な形質導入効率と感染性が強化される。このように、このような改良されたアデノウイルスは、宿主細胞への侵入および抗原の発現が有意な力価の中和抗体によって妨げられないため、より効果的なワクチンであると予想される。
ワクチンはアジュバントを含むことが好ましい。好ましい免疫学的アジュバントは本明細書に記載されており、そのようなワクチンで使用することができる。
用途がワクチン接種である場合、本発明の組換えアデノウイルスは、好ましくは1x108から1x1011ウイルス粒子（すなわち、1 x 108、5 x 108、1 x 109、5 x 109、1 x 1010、2.5 x 1010または5 x 1010粒子）である免疫学的および／または予防的に有効な用量で投与することができる。
さらに、追加免疫が必要なワクチン接種の場合、「異種プライムブースト」方法論を適用することが好ましい。ワクチン接種では、第１から第９の態様（それぞれ、ポリヌクレオチド、ヘキソンポリペプチド、アデノウイルスキャプシドポリペプチド、アデノウイルス、ＶＬＰ、ベクター、組成物、細胞）のいずれか１つの薬剤をプライミングまたはブースティング、特に、異種プライムブーストワクチン接種用に使用することができる。異種プライムブーストの好ましい実施形態において、２つの異なるワクチン、例えばアデノウイルスを使用することができ、例えばヒトでは、抗体の欠如または中和のために、第１から第９の態様のいずれか１つの薬剤がブーストワクチンとして使用されることが特に有利である。
本発明によるポリヌクレオチドまたは組換えアデノウイルスタンパク質またはその断片を使用して調製された組換えアデノウイルスは、宿主細胞にポリヌクレオチド（例えばDNA）を形質導入するために使用することができる。したがって、感染性（すなわち、宿主細胞に侵入できる）ではあるが、好ましくは複製欠損のアデノウイルスは、宿主細胞で任意のカスタムタンパク質またはポリペプチドを発現するように調製することができる。したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明による使用において言及される治療は、遺伝子治療である。遺伝子治療は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ遺伝子治療であり得る。好ましくは、体細胞遺伝子治療である。第１から第９の態様のいずれか１つの薬剤が遺伝子治療に使用され、治療対象に投与される場合、治療により患者の１つまたは複数の細胞がトランスフェクトされる、すなわち形質導入されるように、十分に大量の用量で投与されることが好ましい。本発明による組換えアデノウイルス、ＶＬＰおよび／または薬学的組成物が、本明細書に開示される好ましい投与手段のいずれかによって投与される場合、好ましくは1x108から5x1011ウイルス粒子（すなわち、1 x 108、5 x 108、1 x 109、5 x 109、1 x 1010、2.5 x 1010、5 x 1010、1 x 1011または最も好ましくは5 x 1011粒子）の有効量である。好ましい実施形態において、本発明の組換えアデノウイルスに含まれる好ましい異種ポリヌクレオチドは、対象の宿主細胞においてタンパク質またはポリペプチドを発現することができるものであって、前記タンパク質またはポリペプチドは、前記宿主細胞からのタンパク質またはポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。例えば、特定のタンパク質を必要とする患者は、そのタンパク質の分泌型をコードするｃＤＮＡを含む本発明のアデノウイルスを使用して治療することができる。
本発明の使用のさらなる実施形態において、第１から第９の態様のいずれか１つの薬剤（以下では、本発明による医薬品とも呼ばれる）は、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体；充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、および吸着剤を含む賦形剤；および／または防腐剤をさらに含むように処方される。
本発明による医薬品は、経口、直腸、胃内、非経口投与など、よく知られているさまざまな経路、例えば、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下および類似の投与経路で投与できる。非経口投与、筋肉内投与および静脈内投与が好ましい。好ましくは本発明による医薬品は、シロップ、輸液または注射溶液、錠剤、カプセル、カプレット、ロゼンジ、リポソーム、座薬、絆創膏、バンドエイド、遅延カプセル、粉末、または徐放製剤として処方される。希釈剤は、水、緩衝液、緩衝塩溶液または塩溶液であることが好ましく、担体は、カカオバターおよびビテベゾールからなる群から選択されることが好ましい。
本発明の使用中の本発明による医薬品の投与のための特に好ましい医薬形態は、注射可能な使用に適した形態であり、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。典型的には、そのような溶液または分散液は、例えば水緩衝水溶液、例えば生体適合性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、それらの適切な混合物、界面活性剤または植物油を含む溶媒または分散媒体を含む。
輸液または注射溶液は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメルサールなどの抗菌剤または抗真菌剤などの防腐剤の添加を含むがこれらに限定されない、技術的に認められた任意の数の技術によって達成することができる。さらに、糖または塩などの等張剤、特に塩化ナトリウムを注入または注射溶液に組み込むことができる。
本発明の好ましい希釈剤は、水、生理学的に許容される緩衝液、生理学的に許容される緩衝塩溶液または塩溶液である。好ましい担体は、ココアバターおよびビテベソールである。本発明による医薬品の様々な薬学的形態と共に使用できる賦形剤は、以下の非限定的なリストから選択することができる：
ａ） 乳糖、マンニトール、結晶性ソルビトール、二塩基性リン酸塩、リン酸カルシウム、糖類、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；
ｂ） ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、硬化植物油、ロイシン、グリセリド、およびフマル酸ステアリルナトリウムなどの潤滑剤、
ｃ） デンプン、クロスカラメロース、メチルセルロースナトリウム、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの崩壊剤
他の適切な賦形剤は、American Pharmaceutical Association が発行した Handbook of Pharmaceutical Excipients に記載されている。
特定の量の本発明による医薬品は、疾患の治療または予防に好ましい。しかしながら、疾患の重症度、疾患の種類、および治療されるべきそれぞれの患者に応じて、例えば、患者の一般的な健康状態に応じて、治療効果または予防効果を引き出すために、本発明による医薬品の異なる用量が必要とされることが理解される。適切な投与量の決定は、主治医の裁量の範囲内にある。本発明による医薬品が予防的に使用される場合、それはワクチンとして処方され得る。この場合、本発明による医薬品は、好ましくは、上で概説した好ましい用量および特に好ましい用量で投与される。好ましくは、ワクチンの投与は、ワクチン接種を受けた対象が本発明による医薬に対する十分な抗体を生成し、それぞれの疾患の発症リスクが減少するまで、定められた期間の間に少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回または少なくとも10回、繰り返される。この場合の期間は、通常、ワクチンの抗原性によって異なる。好ましくはこの期間は、4 週間、3 か月、6 か月、または 3 年以内である。１つの実施形態において、本発明によるアデノウイルスがワクチン接種目的で使用される場合、ヘキソンタンパク質の超可変領域の少なくとも１つは、ワクチン接種の対象となるそれぞれの病原体の免疫原性エピトープによって置換され得る。ワクチンには通常、上記で概説したように１つまたは複数のアジュバントが含まれる。ワクチン接種のためのアデノウイルスの使用およびそれに関連する方法の詳細な要約は、以下に提供されている：Bangari DS and Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), p. 849-862; また、Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan;6(1):63-72; および、Folgori A, et al., Nat Med. 2006 Feb;12(2):190-7.; さらに、Draper SJ, et al., Nat Med. 2008 Aug;14(8):819-21. Epub 2008 Jul 27。
第１０の態様において、本発明は、アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を生成するためのインビトロ法に関し、前記インビトロ法は以下の工程を含む：
（ｉ）アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子が細胞内で集合するように、細胞内で第１の態様のポリヌクレオチドを発現させる工程、
（ｉｉ） 細胞または細胞を取り囲む培地からアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を単離する工程。
この方法は、工程（ｉ）の前に、第１の態様のポリヌクレオチドまたは第６の態様のベクターを細胞に導入する（例えば上述のように）さらなる工程を任意に含む。
ポリヌクレオチドが第４の態様のアデノウイルスまたは第５の態様のウイルス様粒子をコードすることが一般に好ましい。アデノウイルスは、好ましくは複製能力のないものである。細胞は、好ましくは、第８の態様の細胞である。ポリヌクレオチドが複製能力のないアデノウイルスをコードする場合、上述のとおり細胞はヘルパー細胞であるか、またはヘルパーコンストラクト（例えば、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス、例えば、ヘルパーコンストラクトで形質導入され、好ましくはステップ(i)の前または最中にヘルパーウイルスに感染する）を含むことが好ましく、ヘルパー細胞またはヘルパーコンストラクトはそれぞれ、アデノウイルスを複製能力のないものにする遺伝子／ゲノム領域を発現する。
工程（ｉ）の「アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子が細胞内で集合するように」 とは、本明細書に記載されるように、アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を組み立てるために必要なすべての遺伝子が細胞内で発現されることを意味する。これは、アデノウイルスを組み立てる場合、アデノウイルスをパッケージングする（つまり、ゲノムをウイルスキャプシドにパッケージングする）ために必要なすべての遺伝子を含む。
１つのさらなる態様において、本発明は以下に関する：
(i) アデノウイルスをコードする単離されたポリヌクレオチド、
(ii) 単離されたアデノウイルス、
(iii) アデノウイルスキャプシドを含むウイルス様粒子（VLP）、
(iv) (i)を含む単離されたベクター、
(v) (i)～(iv)のいずれか１つを含む単離された細胞、
(vi) アジュバント、（ｉ）～（ｖ）のいずれか１つ、および任意で（ｉｉｉ）薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、
(vii) コロナウイルス病の治療または予防に使用するための、(i)～(vi)のいすれか１つ、および
(viii) アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を生成するためのインビトロ法であって、以下の工程を含む：
(a) アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子が細胞内で集合するように、細胞内でアデノウイルスをコードするポリヌクレオチドを発現させること、
(b) 細胞または細胞を取り囲む培地からアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を単離すること。
上記中、アデノウイルス、それをコードするポリヌクレオチド、またはVLPは、上記で定義したコロナウイルススパイク遺伝子またはタンパク質を含む。好ましくは、コロナウイルスのスパイク遺伝子は、アデノウイルスのゲノムに含まれている。
アデノウイルスベクターは、本明細書で言及されるもの、例えば、Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63およびChAd82（例えば、Ad5,Ad11は好ましくは複製能力がなく、またはAd4およびAd7複製能力があるものであり得る）を含むがこれらに限定されない任意のアデノウイルスに由来することができる。
コロナウイルススパイク遺伝子またはタンパク質を含む任意のアデノウイルスに適用可能である限り、本明細書の上記および下記で示されるすべての実施形態および定義は、本発明のこのさらなる態様にも適用される。
本発明の定義およびさらなる実施形態
以下に、本明細書で頻繁に使用される用語の定義をいくつか示す。これらの用語は、その使用の各例において、明細書の残りの部分において、それぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。
本明細書で使用されるとおり、用語「単離された」とは、天然に関連する他の分子を実質的に含まない分子を指す。特に、単離されたとは、分子が動物体中または動物体のサンプル中にないことを意味する。したがって、単離された分子は、動物内で遭遇または接触する他の分子とは無縁である。単離されたとは、本明細書に記載されるように関連する他の成分から単離されることではなく、例えば、分子が含まれる組成物の他の成分から単離されること、または分子が含まれるベクターまたは細胞から単離されることを意味するものではない。
用語「ポリヌクレオチド」は、核酸、すなわち複数のヌクレオチドから構成される生体分子を指すことを意図している。 これには、DNA、RNA、および合成類似体、例えばPNAが含まれ、DNAが好ましい。
用語「オープンリーディングフレーム」（ORF）は、アミノ酸に翻訳できるヌクレオチドの配列を指す。典型的には、ORF には開始コドンが含まれ、後続の領域は通常 3 ヌクレオチドの倍数の長さを有するが、所定の読み枠に終止コドン (TAG、TAA、TGA、UAG、UAA、または UGA) は含まない。ORF は、翻訳されるアミノ酸がペプチド結合鎖を形成するタンパク質をコードする。
本明細書で使用されるとおり、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド（複数形）」および「ポリペプチド（複数形）」は、全体を通して交換可能に使用される。これらの用語は、天然に存在するペプチド（例えば天然に存在するタンパク質）と天然または非天然に存在するアミノ酸を含み得る合成ペプチドの両方を指す。ペプチドは、天然または非天然に存在するアミノ酸の側鎖または遊離アミノまたはカルボキシ末端を修飾することによって化学的に修飾することもできる。この化学修飾には、さらなる化学部分の付加、およびグリコシル化などのアミノ酸の側鎖の官能基の修飾が含まれる。ペプチドは、好ましくは少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または少なくとも100個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも8または少なくとも30のアミノ酸を有するポリマーである。本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質はアデノウイルスに由来することから、本明細書で使用される単離されたポリペプチドまたはタンパク質の分子量は200kDaを超えないことが好ましい。
アデノウイルス (Ad) は、いくつかの鳥類および哺乳類の宿主で同定されており、エンベロープを持たない正二十面体ウイルスである。ヒトアデノウイルス (hAds) は、知られているすべてのヒトおよび動物（例えば、ウシ、ブタ、イヌ、ネズミ、ウマ、サルおよびヒツジ）起源の多くのAd を含むマスタデノウイルス属に属する。ヒトアデノウイルスは、一般に、ラットおよびアカゲザルの赤血球凝集能、DNA相同性、制限酵素切断パターン、G+C含有率、発癌性など、多くの生物学、化学、免疫学および構造的基準に基づいて６つのサブグループ（A～F）に分類される (Straus,1984, in The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, pps.451-498, New York: PlenusPress, and Horwitz, 1990; in Virology, eds. B. N. Fields and D. M. Knipe, pps.1679-1721)。
アデノウイルスのウイルス粒子（ビリオン）は正二十面体の対称性を持ち、血清型に応じて直径は 60～90 nm である。正二十面体キャプシドは、３つの主要なタンパク質、ヘキソン (II)、ペントンベース (III)、およびこぶ状ファイバー (IV)の タンパク質を含む(W. C. Russel, J. Gen.Virol., 81: 2573-2604 (2000))。より具体的には、アデノウイルスキャプシドは、252個のカプソメアを含み、そのうち240個がヘキソンであり、12個がペントンである。ヘキソンとペントンは、３つの異なるウイルスポリペプチドに由来する。ヘキソンは、３つの同一のポリペプチド、すなわちポリペプチドＩＩを含む。ペントンは、キャプシドへの結合点を提供するペントンベースと、ペントンベースに非共有結合し、そこから突出する三量体ファイバータンパク質を含む。他のタンパク質、すなわちタンパク質 IX、VI、および IIIa も、通常、アデノウイルスキャプシドに存在する。これらのタンパク質は、ウイルスのキャプシドを安定させると考えられる。
ヒトで観察される既存の免疫の１つの側面は体液性免疫であり、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生と持続をもたらす可能性がある。アデノウイルスによって誘発される液性反応は、キャプシドに対して向けられる。ヒト以外の類人猿から単離されたアデノウイルスは、ヒト起源の細胞内で効率的に増殖することによって示されるように、ヒトから単離されたアデノウイルスと密接に関連している。
キャプシドは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープなどの非アデノウイルスポリペプチドを組み込むことによって、本明細書に記載のように改変することができる。
用語「ヘキソンタンパク質」はアデノウイルスに含まれるヘキソン (II) タンパク質を指す。本発明によるヘキソンタンパク質またはその変異体は、感染性アデノウイルスビリオンにおけるヘキソンタンパク質またはその断片と同じ機能を有する。したがって、前記ヘキソンまたはその変異体を好ましくはキャプシドタンパク質として含むアデノウイルスは、宿主細胞に侵入することができる。ヘキソンタンパク質の変異体を生成するための適切な方法は、米国特許5,922,315に記載されている。この方法において、アデノウイルスヘキソンの少なくとも１つのループ領域が、別のアデノウイルス血清型の少なくとも１つのループ領域で変更されている。組換えアデノウイルスが宿主細胞に侵入できるかどうかは容易に判断できる。例えば、宿主細胞をアデノウイルスと接触させた後、組換え宿主細胞を洗浄および溶解することができ、例えばアデノウイルスRNAおよび／またはDNAに特異的な適切なハイブリダイゼーションプローブを使用して、アデノウイルスRNAおよび／またはDNAが宿主細胞に見出されるかどうかを決定することができる。あるいは、または追加的に、組換えアデノウイルスと接触させた後の宿主細胞を洗浄し、溶解し、例えばウエスタンブロットを使用して、アデノウイルス特異的抗体でプローブすることができる。さらに別の方法では、宿主細胞が遺伝子産物を発現するかどうか、例えば宿主細胞内で遺伝子産物を発現するのに適した発現カセットを含む組換えアデノウイルスによる感染時に蛍光タンパク質を発現するかどうかが、例えばインビボで観察される。
「アデノウイルスペントンタンパク質」とは、アデノウイルスに含まれるペントンベース(III)タンパク質を意味する。アデノウイルスのペントンタンパク質は、キャプシドの正二十面体対称の角に局在するという特徴がある。本発明によるペントンタンパク質またはその変異体は、感染性アデノウイルスビリオン中のペントンタンパク質と同じ機能を有する。したがって、前記ペントンまたはその変異体を好ましくはキャプシドタンパク質として含むアデノウイルスは宿主細胞に侵入することができ、これは上記のように試験することができる。さらに、機能的なペントンは、アデノウイルスファイバータンパク質に親和性がある。平均的な当業者は、タンパク質間親和性を試験する方法をよく知っている。第１のタンパク質が第２のタンパク質に結合できるかどうかを決定するために、当業者は、例えば、遺伝的な酵母ツーハイブリッドアッセイ、またはプルダウン、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、蛍光活性化セルソーティング (FACS) ベースのアッセイまたはプラズモン共鳴アッセイなどの生化学的アッセイを使用することができる。プルダウンアッセイまたはプラズモン共鳴アッセイを使用する場合、生化学の分野でよく知られているように、少なくとも１つのタンパク質をHISタグ、GSTタグなどのアフィニティタグに融合させることが有用である。
用語「ファイバータンパク質」は、アデノウイルスに含まれるこぶのあるファイバー（IV）タンパク質を指す。本発明によるファイバータンパク質またはその変異体は、感染性アデノウイルスビリオンにおけるファイバータンパク質またはその断片と同じ機能を有する。したがって、好ましくはキャプシドタンパク質として前記ファイバーまたはファイバー変異体を含むアデノウイルスは宿主細胞に侵入することができ、これは上記のように試験することができる。さらに、機能的なファイバータンパク質は、アデノウイルスのペントンタンパク質に親和性がある。また、グリコシル化された形態の機能的なアデノウイルスファイバータンパク質は、三量体化することができる。このように、その変異体がグリコシル化および／または三量体を形成できることもまた好ましい。三量体化を含む親和性は、上記のように試験することができ、グリコシル化アッセイも当技術分野で周知である。
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列の文脈における用語「同一性」または「同一」は、最大限対応するためにアライメント（整列）させた場合に同一である２つの配列中の残基の数を指す。特に、２つの配列のパーセント配列同一性は、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つのアライメント配列間の正確な一致の数を短い方の配列の長さで割り、100を掛けたものである。２つの配列をアライメントするために使用できるアライメントツールは、当業者に周知であり、例えばワールドワイドウェブの例えばポリペプチドアライメント用のClustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)または MUSCLE (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)またはポリヌクレオチドアライメント用のMAFFT (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ mafft/) またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドアライメント用のWATER (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ emboss_water/)で入手できる。２つの配列間のアライメントは、デフォルトパラメータ設定、例えばMAFFTでは好ましくは: Matrix: Blosum62, Gap Open1.53, Gap Extend 0.123、WATERのポリペプチドでは好ましくは: MATRIX: DNAFULL, Gap Open: 10.0, Gap Extend 0.5 およびWATERのポリペプチドでは好ましくは MATRIX: BLOSUM62, GapOpen: 10.0, Gap Extend: 0.5. を使用して実行できる。当業者は、満足のいくアライメントを生成するためにいずれかの配列にギャップを導入することが必要であり得ることを理解する。「最良の配列アライメント」は、最小限の数のギャップを持ちながら、最大数のアラインされた同一残基を生成するアライメントとして定義される。好ましくは、これはグローバルアライメントであり、アライメント内のすべての配列のすべての残基が含まれる。
ポリペプチドに関する用語「変異体」は、一般に、ポリペプチドの改変バージョン、例えば突然変異を指し、そのため、ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸が欠失、挿入、改変および／または置換され得る。一般に、変異体は機能的であり、機能的変異体を含むアデノウイルスが宿主細胞に感染できることを意味する。より特定された機能が本明細書で定義されており、一般的な定義よりも優先される。「変異」または「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入であり得る（「および」は、複数の突然変異が存在する場合に適用され得る）。好ましくは、それは置換（すなわち、保存的または非保存的アミノ酸置換）であり、より好ましくは保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、置換には、天然に存在しないアミノ酸との天然に存在するアミノ酸の交換も含まれる。保存的置換は、置換されるアミノ酸と同様の化学的性質を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。好ましくは、保存的置換は、以下からなる群から選択される置換である：
（ｉ）塩基性アミノ酸による別の異なる塩基性アミノ酸への置換；
（ｉｉ）酸性アミノ酸による別の異なる酸性アミノ酸への置換；
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸による別の異なる芳香族アミノ酸への置換;
（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸による別の異なる非極性脂肪族アミノ酸への置換；および
（ｖ）極性の無電荷アミノ酸による別の極性の無電荷アミノ酸への置換。
塩基性アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択される。極性の無電化アミノ酸は、好ましくは、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、上記で概説した保存的置換(i)から(v)に該当しない任意のアミノ酸との１つのアミノ酸の交換である。
配列同一性を決定するための手段は上記に記載されている。
タンパク質のアミノ酸も修飾、例えば化学修飾される場合がある。例えば、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸の側鎖または遊離アミノまたはカルボキシ末端は、例えば、グリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化などで修飾され得る。化学修飾は当技術分野で周知のように、インビボにおいて、例えば宿主細胞において、起こり得る。例えば、適切な化学修飾モチーフ、例えば、タンパク質のアミノ酸配列に存在するグリコシル化配列モチーフにより、タンパク質がグリコシル化される。改変が修飾されたアミノ酸の同一性の変化（例えば、置換または欠失）をもたらさない限り、修飾されたポリペプチドは、特定の配列番号に関して言及されたポリペプチドの範囲内であり、すなわち、本明細書で定義された変異体ではない。
ポリヌクレオチドに関する用語「変異体」は、一般に、ポリヌクレオチドの改変バージョン、例えば突然変異を指し、そのため、ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドが欠失、挿入、改変および／または置換され得る。一般に、変異体は機能的であり、機能的変異体を含むアデノウイルスが宿主細胞に感染できることを意味する。より特定された機能が本明細書で定義されており、一般的な定義よりも優先される。「変異」は、ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入であり得る（「および」は、複数の変異が存在する場合に適用され得る）。好ましくは、それは置換であり、より好ましくは、アミノ酸置換、最も好ましくは保存的アミノ酸置換を引き起こす。
「抗原性タンパク質またはその断片」（その断片も抗原性である）は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。好ましくは、それは腫瘍抗原または病原体由来の抗原である。用語「病原体」は、対象に疾患を引き起こし得る任意の生物を指す。病原体には、細菌、原生動物、真菌、線虫、ウイロイド、ウイルス、および寄生生物が含まれるが、これらに限定されないものであって、各病原体は、単独で、または別の病原体と共同して、ヒトを含むがこれに限定されない哺乳動物を含むがこれに限定されない脊椎動物に疾患を誘発することができる。本明細書で使用されるとおり、用語「病原体」はまた、非免疫無防備状態の宿主では通常病原性ではないかもしれないが、免疫無防備状態の宿主では病原性である生物を包含する。
概して、アデノウイルスゲノムはよく特徴付けられている。アデノウイルスゲノムの全体的な構成には、例えば、各ウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5遺伝子の位置のように、特定のオープンリーディングフレームが同じような位置にあることに関して、一般的な保存性がある。アデノウイルスゲノムの各末端は、ウイルスの複製に必要な逆位末端配列(ITR) として知られる配列を含む。ウイルスはまた、感染性ウイルス粒子（ビリオン）の産生に必要な構造タンパク質の一部を処理するために必要とされる、ウイルスがコードするプロテアーゼを含む。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞への形質導入後にウイルス遺伝子が発現する順序に基づいて記載されている。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写が DNA 複製の開始前または開始後に起こるかどうかに従って、初期 (E) または後期 (L) 遺伝子と呼ばれる。形質導入の初期段階では、アデノ ウイルスの E1A、E1B、E2A、E2B、E3、および E4 遺伝子が発現され、ウイルス複製のための宿主細胞が準備される。感染の後期段階では、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子 L1～L5 の発現が活性化される。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウイルス（Ad）ベクター（例えば、上記の本発明のさらなる態様で例示される）、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター（例えば、AAV5型）、アルファウイルスベクター（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）、シンドビスウイルス (SIN)、セムリキフォレストウイルス (SFV)、および VEE-SIN キメラ）、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター (例えば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ (MVA)、NYVAC (ワクシニアのコペンハーゲン株）、およびアビポックスベクター：カナリア痘(ALVAC) および鶏痘 (FPV) ベクター)および水疱性口内炎ウイルスベクターなどのウイルスベクター、ウイルス様粒子、または細菌胞子（bacterial spore）を含む、当業者に知られている任意のベクターを含む。ベクターには、発現ベクター、クローニングベクター、および宿主細胞で組換えアデノウイルスを生成するのに有用なベクターも含まれる。
上述のとおり、「異種タンパク質またはその断片」は、非アデノウイルスタンパク質またはその断片、特に抗原性タンパク質またはその断片であり得る。この目的のために、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的細胞に送達される分子、例えば、抗原タンパク質またはその断片、好ましくは、病原性ウイルス、細菌、真菌、原生動物または寄生生物などの病原体の抗原タンパク質もしくはこれらの断片、または腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドであり得る。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる任意のタンパク質またはペプチドを指す。抗原は、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸を含み、最も好ましくは８～１２個のアミノ酸を含む。
用語「発現カセット」は、発現される少なくとも１つの核酸配列を、その転写および翻訳制御配列とともに含む核酸分子を指す。発現カセットを変更すると、それが組み込まれているベクターにおいて、異なる配列または配列の組み合わせの発現を指示するようになる。制限部位は好ましくは５’および３’末端に存在するように設計されているため、発現カセットは容易に挿入、除去することができ、または別のカセットと交換することができる。好ましくは、発現カセットは、プロモーター、開始部位および／またはポリアデニル化部位など、所与の遺伝子の効率的な発現のためのシス調節エレメントを含む。本発明に関してより具体的には、発現カセットは、宿主細胞における第１の態様のポリヌクレオチドの発現に必要なすべての追加のエレメントを含む。したがって、典型的な発現カセットは、第１の態様のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、ならびに転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを含む。発現カセットの追加のエレメントには、例えばエンハンサーが含まれ得る。発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。終止領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよいし、異なる遺伝子から得てもよい。
本明細書で使用される、用語「ミニ遺伝子」は、遺伝子の１つまたは複数の機能的に非必須のセグメントが、天然に存在する遺伝子に関して欠失している異種遺伝子構築物を指す。「ミニ遺伝子カセット」は、発現のためのミニ遺伝子を含む発現カセットである。
用語「複製能力がある（replication-competent）」組換えアデノウイルス（ＡｄＶ）は、宿主細胞に含まれる任意の組換えヘルパータンパク質の非存在下の宿主細胞内で複製できるアデノウイルスを指す。好ましくは、「複製能力がある」アデノウイルスは、次の完全なまたは機能的な必須初期遺伝子：E1A、E1B、E2A、E2B、E3およびE4を含む。特定の動物から単離された野生型アデノウイルスは、その動物で複製能力がある。
用語「複製欠損の（replication-defective）」または「複製能力のない（replication-incompetent）」 アデノウイルスは、少なくとも機能的欠失、すなわち遺伝子を完全に除去することなく遺伝子の機能を損なう欠失、例えば、人工ストップコドンの導入、活性部位または相互作用ドメインの欠失または変異、遺伝子の制御配列の変異または欠失など、またはE1、E2、E3およびE4から選択される１つまたは複数のアデノウイルス遺伝子のようなウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子の完全な除去、を含むように操作されていることから複製不能にされたアデノウイルスを指す。本発明の組換えアデノウイルスウイルスは、好ましくは複製欠損のものである。
用語「組換えアデノウイルス」は、特に、異種ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列を含むように改変されたアデノウイルスを指す。「異種」は、別のアデノウイルス株、特に異なる宿主（例えば、ヒト宿主、すなわちＡｄ３またはＡｄ５などのヒトアデノウイルス）由来の株、または本明細書に記載の病原体由来の抗原またはヒト腫瘍抗原などのヒトに由来するなどの非アデノウイルス生物由来を意味し得る。したがって、この用語は、キメラアデノウイルスおよびキャリアアデノウイルスをそれぞれ含む。組換えアデノウイルスは、他のアデノウイルスまたは非アデノウイルス生物の両方に由来する異種ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列を含むことができる、すなわち、キメラアデノウイルスおよびキャリアアデノウイルスの両方であり得る。
本明細書で使用されるとおり、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、この場合、アデノウイルスに由来する、複製しない空のウイルスシェルを指す。ＶＬＰは一般に、キャプシド（capsid）、コート（coat）、シェル（shell）、表面および／またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質などであるがこれらに限定されない１つまたは複数のウイルスタンパク質から構成される。それらは、ウイルスによる細胞透過を担う機能的なウイルスタンパク質が含み、効率的な細胞侵入を保証する。ＶＬＰは、適切な発現系でのタンパク質の組換え発現時に自然に形成される。特定のＶＬＰを産生する方法は、当技術分野で知られている。特に、アデノウイルスＶＬＰは、ウイルスＤＮＡパッキングに関与するアデノウイルスのＩｖａ２遺伝子を欠失またはヌル変異を導入するなど、機能を損なうことによって産生することができる(Ostapchuk et al. J Virol. 2011 Jun; 85(11): 5524-5531)。ＶＬＰの存在は、電子顕微鏡法、Ｘ線結晶学などにより、当技術分野で知られている従来の技術を使用して検出することができる。例えば、Baker et al., Biophys. J. (1991) 60:1445-1456; Hagensee et al., J.Virol. (1994) 68:4503-4505を参照。例えば、クライオ電子顕微鏡は、問題のＶＬＰ調製物のガラス化水性サンプルで実行でき、画像は適切な暴露条件下で記録される。
ＶＬＰに含まれる「アデノウイルスゲノムDNAを実質的に含まない」とは、ＶＬＰにそのようなゲノム DNA が存在しないか、または、ＶＬＰに感染した細胞でウイルス複製を可能にするのに十分な DNA がＶＬＰになく、ウイルス複製を行うことができるようにＶＬＰ中に DNA を補完する DNA を発現していないかのいずれかを意味する。
上記に加えて、抗原決定基としても知られる「エピトープ」は、免疫系、特に抗体、B 細胞、または T 細胞によって認識される高分子のセグメントである。本発明の文脈において、用語「エピトープ」は、免疫系によって認識されるタンパク質またはポリタンパク質のセグメントを指すことが好ましい。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループで構成され、通常、特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を持っている。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
「非アデノウイルスＴ細胞エピトープ」は、エピトープがＭＨＣ分子に結合している抗原提示細胞の表面に提示され得るエピトープである。ヒトでは、プロフェッショナル抗原提示細胞は MHC クラス II ペプチドを提示するように特化されているが、ほとんどの有核体細胞は MHC クラス I ペプチドを提示する。 MHC クラス I 分子によって提示される T 細胞エピトープは、通常、長さが 8～11 アミノ酸のペプチドであるのに対し、MHC クラス II 分子は、長さが13～17アミノ酸であるより長いペプチドを提示する。
「非アデノウイルスB細胞エピトープ」は、B細胞によって天然抗原の表面上の三次元構造として認識されるエピトープである。
B細胞およびT細胞のエピトープは、IEDB Analysis Resource のオンラインB細胞またはT細胞予測ツールなどのインシリコツールで予測できる。
用語「１つまたは複数の非アデノウイルスB細胞エピトープを提示する」とは、１つまたは複数のエピトープが、B細胞によって認識されるようにキャプシドに組み込まれていることを意味する。用語「１つまたは複数の非アデノウイルス B細胞／T細胞エピトープを組み込む」とは、エピトープが、キャプシドに組み込まれることなくＶＬＰに含まれるか、キャプシドに組み込まれていることを意味する。キャプシドに組み込まれている場合、免疫細胞が認識できるように外部に提示されている場合とされてない場合がある。
「免疫アジュバント」または単に「アジュバント」は、抗原単独の投与と比較して、抗原／免疫原に対する免疫応答の質および／または強度を加速、延長、および／または増強する物質であり、したがって、所与のワクチンに必要な抗原／免疫原の量、および／または目的の抗原／免疫原に対する適切な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を減らす。本発明による組成物に関連して使用され得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウム（ミョウバン）のゲル状沈殿物；AlPO4；アルヒドロゲル；グラム陰性菌の外膜由来の細菌生成物、特にモノホスホリルリピド A (MPLA)、リポ多糖類 (LPS)、ムラミルジペプチドおよびそれらの誘導体；フロイントの不完全アジュバント；リポソーム、特に中性リポソーム、組成物および任意でサイトカインを含むリポソーム；非イオン性ブロック共重合体；ISCOMATRIXアジュバント(Drane et al., 2007)； CpGジヌクレオチド (CpG モチーフ) を含む非メチル化DNA、特にホスホロチオエート (PTO) バックボーン (CpG PTO ODN) またはホスホジエステル (PO) バックボーン (CpG PO ODN) を持つ CpG ODN；合成リポペプチド誘導体、特にPam3Cys; リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質 (HSP)、特に HSP 70；dsRNAおよびその合成誘導体、特にポリＩ：ポリＣ；ポリカチオン性ペプチド、特にポリ-L-アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にGM-CSF、インターロイキン-(IL-)2、IL-6、IL-7、IL-18、I型およびII型インターフェロン、特にインターフェロン-γ、TNF-α；25-ジヒドロキシビタミン D3 (カルシトリオール)；および合成オリゴペプチド、特にMHCII提示ペプチドである。ポリオキシエチレン (POE) とポリオキシプロピレン (POP) を含む非イオン性ブロック重合体（POE-POP-POEブロック共重合体など）はアジュバントとして使用できる(Newman et al., 1998)。このタイプのアジュバントは、有効成分として核酸を含む組成物に特に有用である。
本発明に関して用語「ワクチン接種」は、適切な免疫原性製剤中の抗原（ワクチン接種を受けた個人の免疫系によって異物として認識され、免疫原性である物質）を（例えば、皮下、皮内、筋肉内、経口、経鼻的に）投与することによる特定の免疫応答の誘導である、能動免疫である。したがって、抗原は、免疫系が抗原に対する特異的な免疫応答を構築するための引き金として使用される。本発明の範囲内のワクチン接種は、原則として、治療的な意味でも予防的な意味でも実施することができる。これには、感染症を治療または予防するための本明細書に記載の病原体に対するワクチン接種、または癌などの非感染性疾患を治療または予防するためのワクチン接種が含まれる。非感染性疾患の場合、抗原は、好ましくは細胞膜抗原であり、特に疾患細胞によってのみ発現され、非疾患細胞によっては発現されない抗原である。一つの例としては腫瘍関連抗原である。この文脈において、「腫瘍関連抗原」という用語は、主に腫瘍細胞によって提示され、それによって非悪性組織からの区別を可能にする構造を意味する。好ましくは、そのような腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞膜上または細胞膜内に位置する。腫瘍関連抗原は、例えば、DeVita et al. (Eds., "Biological Therapy of Cancer", 2.Edition, Chapter 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN0-397-51416-6 (1995))に記載されている。
本明細書で使用される「プライミング（Priming）」は、哺乳動物において免疫応答を誘導／生成するためのワクチンの投与を指し、「ブースティング（boosting）」は哺乳動物における免疫応答を増強するためのワクチンの投与を指す。「異種プライムブースト（heterologous prime-boost）」という語句は、哺乳動物において免疫応答を誘導／生成する（プライミング）ためのワクチンと、哺乳動物において免疫応答を増強する（ブースティング）ためのワクチンとが異なることを意味する。異種プライムブーストは、対象、例えば患者が第１のベクターに対する抗体を作り出し、ブーストが必要な場合に有用である。この文脈において、第１の（プライム）ワクチンと第２の（ブースト）ワクチン、例えばアデノウイルスは、第１のワクチンによるプライミング中に誘導された抗体応答が、ブースティングのために投与された第２のワクチン粒子の 70% 以上、好ましくは 80% 以上が、プライミングおよびブースティングを受けた動物の細胞核に入るのを妨げない場合、十分に異なる。
用語「遺伝子治療（gene therapy）」は、患者の臨床状態を改善する目的で欠陥遺伝子を修正するために、細胞、組織、または器官に外来遺伝物質を直接導入する概念として広く定義できる。本明細書で使用されるように、用語「遺伝子治療」は、好ましくは「体細胞治療（somatic therapy）」を指し、世代から世代へと受け継がれる遺伝的変化を誘発する「生殖細胞治療（germline therapy）」を指すものではなく、該体細胞治療は、治療効果が治療を受けた個人に限定されるものである。遺伝子治療、好ましくは、体細胞治療は、生物への迅速かつ容易な直接遺伝子導入（「インビボ」）、または、体外移植される細胞または組織への精巧な、しかしより特異的で制御可能な遺伝子導入（「エクスビボ」または「インビトロ」）であって、治療後に再移植されるもの、によってさらに区別することができる。
用語「中和抗体」は、アデノウイルスのエピトープに結合して、アデノウイルスが宿主細胞で増殖性感染を引き起こすのを防ぐか、または導入遺伝子（例えば、細胞、特に宿主細胞に侵入することができるアデノウイルスDNA）を発現する複製能力のないベクターによる標的細胞の形質導入を防ぐ抗体を指す。
用語「SARS CoV-2」、「SARS-COV2」、「SARS-CoV-2」、「重症急性呼吸器症候群 コロナウイルス 2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）」および「2019-nCoV」は、本明細書全体で互換的に使用され、2019年のコロナウイルス病（COVID-2019またはCOVID-19）を引き起こすウイルスを指す。
本発明のさまざまな修正および変形については、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明によってカバーされることが意図されている。
以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。
実施例１： GRAd32、GRAd23 および GRAd21
pGRAd ベクターの構築は、以下に詳述する手順を経て進められた。pGRAd32、pGRAd23、およびGRAd21 ベクターは、標準的な手順を使用して健康なゴリラから得られた糞便サンプルから単離された野生型アデノウイルス株に由来する。野生型ウイルスは、A549細胞の単層に糞便抽出物を播種することにより単離された。細胞変性効果の出現について、細胞単層を毎日観察した。顕微鏡下での観察により陽性と記録されたサンプルを採取し、細胞を凍結融解(-80℃/37℃)により溶解した。次いで、清澄化した細胞溶解物を、新鮮な細胞の単層に感染させることによるウイルス増殖に使用した。ウイルス増幅の２継代後、アデノウイルスは標準的な手順を用いて精製された。
ウイルスゲノム（GRAd32、配列番号１； GRAd23、配列番号２２；GRAd21、配列番号１０）SDS／プロテイナーゼK消化とそれに続くフェノール－クロロホルム抽出によって精製ウイルスから抽出された。精製されたアデノウイルスDNAをシャトルプラスミドベクターにクローニングし、ウイルスゲノムに以下の欠失を導入することによってさらに改変した：
GRAd32:
1) ウイルスゲノムのE1領域の欠失 (bp 445から bp 3403まで)
2) ウイルスゲノムのE3 領域の欠失 (bp 28479からbp 32001まで)
3) ウイルスゲノムのE4領域の欠失(bp 34144からbp 36821まで) 。
GRAd23:
1) ウイルスゲノムのE1領域の欠失(bp 451からbp 3403まで)
2) ウイルスゲノムのE3領域の欠失(bp 28494からbp 32016まで)
3) ウイルスゲノムのE4領域の欠失(bp 34159 からbp 36836まで)。
GRAd21:
1) ウイルスゲノムのE1領域の欠失(bp 456からbp 3403まで)
2) ウイルスゲノムのE3領域の欠失(bp 28343からbp 31875まで)
3) ウイルスゲノムのE4領域の欠失(bp 34005からbp 36681まで) 。
GRAd シャトルベクター
ゴリラ グループ C アデノウイルスシャトルベクターは、次の手順に従って構築された:
第１の工程は、プラスミド pGRAd ITRs-only シャトルの構築だった: GRAd 左端は、プラスミド「pUC57-GRAd ends」（配列番号３４）をテンプレートとして、以下のプライマーを使用して PCR により増幅された：
Fw: 5' - cca ggc cgt gcc ggc acg ttc - 3' (配列番号７０)
Rev: 5' - att acc ctg tta tcc cta cgt c - 3' (配列番号７１)
GRAd 右端は、プラスミド「pUC57-GRAd ends」（配列番号３４）をテンプレートとして、以下のプライマーを使用して PCR により増幅された：
Fw: 5' - gta ggg ata aca ggg taa tgc a - 3' (配列番号７２)
Rev: 5' - aaa cat gag aat tgg tcg acg g - 3' (配列番号７３)
GRAd 左端および GRAd 右端を、ギブソンアセンブリ法に従って、事前に HpaI/SfiIで消化した pBeloBAC11 （配列番号３５）にクローニングし、「pGRAd ITRs-only シャトル」（配列番号３６）を得た。
第２の工程は、はプラスミド「pDE1_GRAd_シャトル」の構築だった：
hCMVtetO-GAG-bGHpolyAカセットは、テンプレートとして、プラスミド「phCMVtetO-GAG-bGHpolyA」（配列番号３７）、配列番号３７のヌクレオチド1220から2719にコードされるGag抗原、および以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - gtt ttt att gtc gcc gtc atc tga cgg gcc gcc att gca tac gtt gta tccata tc -3' （配列番号７４）
Rev: 5' - aag cgc gat cgc ggc cgc ggc cat aga gcc cac cgc atc c - 3' （配列番号７５）
pIX コード領域を含む GRAd 断片は、プラスミド「pGRAd pIX」（配列番号３８）をテンプレートとして使用し、以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ccg cgg ccg cga tcg cgc tta ggc ctg acc atc tgg - 3' （配列番号７６）
Rev: 5' - ctg tta tcc cta ggc gcg cct tag ggg gag gca agg ctg - 3' （配列番号７７）
Amp-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し、以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ggc gcg cct agg gat aac agg gta ata ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa -3' （配列番号７８）
Rev: 5' - tgc tgg tgc tgt gag agt gcg act cgg gtc tag gcg cgc cat tac cct gtt atccct att att tgt taa ctg tta att gt - 3' （配列番号７９）
hCMVtetO::GAG-bGHpolyA カセット、pIXを含む断片、および AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、Gibson アセンブリ法を使用して、事前に I-SceI で消化された「pITRs-only GRAd シャトル」にクローニングし、「pDE1 GRAd シャトル」（配列番号４０）を生成した。
シャトルプラスミドは、両方の ITR の末端にのみ存在する制限酵素部位 (PmeI) を含むように設計され、プラスミド DNA からのウイルス DNA の放出を可能にした。模式図の図２を参照。
実施例２： GRAd23ベクター構築
GRAd23 DE1ベクター
プロテイナーゼ K 消化とそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によって GRAd23 wt ゲノムDNA （配列番号２２）を単離し、大腸菌株BJ5138での相同組換えによってpDE1 GRAd シャトルに挿入し、pGRAd23ベクターを得た。pIX 遺伝子、シャトルの末端に存在するright ITR DNA 配列 (I-SceI で消化)、およびウイルスゲノム DNA の間の相同組換えにより、シャトルベクターへの挿入が可能になり、同時に発現カセットに置換された E1 領域が欠失され、最終的に「pGRAd23 DE1 GAG」BACベクター（配列番号４１）が生成された。pGRAd23 DE1 GAG BACの模式図は図３に示される。
GRAd23 DE1 左向き（leftward）ベクター
構築ストラテジーは２つの異なる工程に基づくものだった:
第１の工程：AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE1 領域の置換
AmpR-LacZ-SacB選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し、以下のプライマーを使用したPCRによって増幅された：
Fw: 5' - gtt ccg ggt caa agt ctc cgt ttt tat tgt cgccgt cat ctg acg ggc cga ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号８０）
Rev: 5' - tgg tgc agg cca gca cca gat ggt cag gcc taagcg cga tcg cgg ccc ggt tat ttg tta act gtt aat tgt cc -3' （配列番号８１）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学（recombineering）により「pGRAd23 DE1 GAG」BAC（配列番号４１）にクローニングし、「pGRAd23 DE1 A/L/S」BAC（配列番号４２）を得た。
第２の工程：AmpR-LacZ-SacB 選択カセットの欠失および左向きの E1 での hCMVtetO::GAG-bGHpA の挿入
hCMVtetO-GAG-bGHpolyAカセットは、プラスミド「phCMVtetO-GAG-bGHpolyA」（配列番号３７）をテンプレートとして使用し、以下のプライマーを使用したPCRにより増幅された：
Fw: 5' - gtt ccg ggt caa agt ctc cgt ttt tat tgt cgccgt cat ctg acg ggc cgc cat aga gcc cac cgc atc - 3' （配列番号８２）
Rev: 5' - tgg tgc agg cca gca cca gat ggt cag gcc taagcg cga tcg cgg ccc ggc cat tgc ata cgt tgt atc cat -3' （配列番号８３）
PCRにより得られたDNA断片を、組換え工学により「pGRAd23 DE1 A/L/S」BAC（配列番号４２）にクローニングし、「pGRAd23 DE1L GAG」BAC（配列番号４３）を得た。
GRAd23 DE1DE3ベクター
構築ストラテジーは２つの異なる工程に基づくものだった；
第１の工程－ AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE3 領域の置換:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmp-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し、以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctgaga tca gaa tct act cga ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号８４）
Rev: 5' - agt gat ttt tta ttg att aca gtt atg atc aattga aag gga taa ggt ctt att tgt taa ctg tta att gtc c -3' （配列番号８５）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd23 DE1」BAC（配列番号４１）に挿入し、「pGRAd23 DE1 GAG DE3 A/L/S」BAC（配列番号４４）を得た。
第２の工程－ E3領域欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、一本鎖オリゴヌクレオチド5'- ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct actcgg acc tta tcc ctt tca att gat cat aac tgt aat caa taa aaa atc act - 3'（配列番号８６）を使用して欠失させた。一本鎖 DNA断片オリゴを使用して、該選択カセットを「pGRAd23 DE1 GAG DE3A/L/S」BAC（配列番号４４）に組換え工学により置換し、「pGRAd23DE1 GAG DE3」BAC （配列番号４５）を作製した。この方法は、GRAd 23野生型ゲノムのbp 28494からbp 32016までのE3領域の欠失をもたらした。模式図は図４に示される。
E1E4欠失 GRAd23ベクター
ネイティブ E4 領域の欠失を含む GRAd23ベクターバックボーンの構築およびAd5 E4 orf6 コード領域での置換のストラテジーは、２つの異なるステップに基づくものだった：
第１の工程－ AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE4 領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gcaaat gga aaa aaa atc aaa ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号８７）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtgctg gtg ctg tga gag tgt tat ttg tta act gtt aat tgt cc -3' （配列番号８８）
次に、PCRで得られたDNA断片を、「pGRAd23 DE1 GAG」（配列番号４１）BACのネイティブGRAd23 E4領域を組換え工学により置換することにより挿入し、「pGRAd23DE1 GAG DE4 A/L/S」BAC（配列番号４６）を得た。
第２の工程－ E4 領域削除のためのAmpR-LacZ-SacB 選択カセットの欠失:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットが欠失され、精製された野生型ヒト アデノ ウイルス 5 （配列番号４７）のゲノムをテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用してPCR によって増幅されたヒトアデノ ウイルス5 E4orf6 に置換された。
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gcaaat gga aaa aaa atc aac tac atg ggg gta gag tca ta - 3' （配列番号８９）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtgctg gtg ctg tga gag tga tga ctac gtc cgg cgt tcc -3' （配列番号９０）
次いで、PCRによって得られたヒトAd5 E4 orf6コード領域を含むDNA断片を「pGRAd23 DE1 GAG DE4 A/L/S」BAC（配列番号４６）に挿入し、組換え工学によってAmpR-LacZ-SacB選択カセットを置換した。最終産物「pGRAd23 DE1 DE4 hAd5E4orf6」 BAC （配列番号４８）が得られた。
E1E3E4欠失 GRAd23ベクター
E3領域の欠失とネイティブE4領域の欠失の両方を含むGRAd23ベクターバックボーンの構築とAd5 E4 orf6コード領域での置換のストラテジーは２つの異なる工程に基づくものだった：
第１の工程－ Amp-LacZ-SacB 選択カセットによるE3 領域の置換:
Amp-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用したPCRによって増幅された：
Fw: 5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctgaga tca gaa tct act cga ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号９１）
Rev: 5' - agt gat ttt tta ttg att aca gtt atg atc aattga aag gga taa ggt ctt att tgt taa ctg tta att gtc c -3' （配列番号９２）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd23 DE1 DE4 hAd5E4 orf6」（配列番号４８）BACに挿入し、「pGRAd23 DE1 GAG DE3 A/L/S DE4 hAd5 E4orf6」BAC（配列番号４９）を得た。
第２の工程－E3領域欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、一本鎖オリゴヌクレオチド5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct actcgg acc tta tcc ctt tca att gat cat aac tgt aat caa taa aaa atc act - 3'（配列番号８６）を使用して欠失された。一本鎖 DNA断片オリゴを使用して、選択カセットを組換え工学によって「pGRAd23 DE1GAG DE3 A/L/S DE4 hAd5 E4orf6」BAC （配列番号４９）に置換し、「pGRAd23 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5 E4orf6」BAC （配列番号５０）を作製した。模式図は図５に示される。
実施例３：SARS-CoV2スパイク遺伝子を発現するGRAd23ベクターの構築
pGRAd23 SARS CoV-2 スパイクベクターの構築は、以下に概説する工程を経て進んだ。
phCMV-IntronA::I-SceI-WPRE-bGHpAの作製
最初に、「pUC19-hCMVtetO::SEAP-bGHpA」プラスミド（配列番号５１）を改変することによりpCMV-IntronA::I-SceI-WPRE-bGHpAシャトルプラスミドを作製した。
イントロンA - I-SceI カセットは、「pVIJnsA」プラスミド（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - acc ggg acc gat cca gcc - 3' （配列番号９３）
Rev1: 5' - taa tcc aga ggt tga tta tta ccc tgt tat ccctag aat tct ttg cca aaa tga tgc tgc aga aaa gac cca tgg aa - 3' （配列番号９４）
Rev2: 5' - caa att ttg taa tcc aga ggt tga ttc ccg ggtaat cca gag gtt gat tat tac c - 3' （配列番号９５）
この PCR は、リバースプライマーに I-SceI タグを挿入するためのスペースを確保するために、１つのフォワードプライマーと２つのリバースプライマーを使用して実行された。
WPREカセットは、プラスミドpCAG21（配列番号５３）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用してPCRによって増幅された：
Fw: 5' - caa cct ctg gat tac aaa att tg - 3' （配列番号９６）
Rev: 5' - acg cgg gga cca cgg gtt aac ccg ggg cgg gga ggc ggc cca aa - 3' （配列番号９７）
イントロンA-I-SceI PCR 産物と WPRE カセット PCR 産物をギブソン法に従って、事前に HindIII-SmaI で消化した「pUC19-hCMVtetO::SEAP-bGHpA」プラスミド（配列番号５１）に連結し、「phCMVtetO-IntronA::I-SceI-WPRE-bGHpA」（配列番号５４）を作製した。
phCMV-IntronA::SARS CoV-2 S-WPRE-bGHpAの作製
SARS CoV-2 virus (Genbank Accession NC_045512.2identical to MN908947)の表面糖タンパク質S(Genbank Accession No.QHD43416 identical to YP_009724390)の完全長コーディング配列 は、最初のATGの上流に最小限のコザック配列を含めコドンの使用を変更し、S遺伝子（配列番号２９）の３’末端にヒトインフルエンザ血球凝集素（HA）TAGコード配列を融合させ（Kozak:ヌクレオチド1～5、スパイクタンパク質ヌクレオチド 6～3824、HA TAG ヌクレオチド 3825～3857、ストップコドン ヌクレオチド 3858～3860）、Doulix(Via Torino, 107, 30172 Venezia VE) によって化学的に合成された。 改変された S 遺伝子を、ギブソンアセンブリ法により Doulix によって「pCMV-IntronA::I-SceI-WPRE-bGHpA」（配列番号５４）のI-SceI サイトにクローニングされ、プラスミド「phCMVtetO-IntronA::SARS CoV-2S-WPRE-bGHpA」（配列番号５５）が作製された。
DE1L DE3 GRAd23 SARS CoV-2 Sの構築
DE1L DE3 欠失 GRAd23 ベクターへの左向きでのSARSCoV-2 S 遺伝子発現カセットの挿入物は以下の工程を経て得られた：
第１の工程－DE1L バックボーンのAmpR-LacZ-SacB 選択カセットによる E3 領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct act cgaccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号９８）
Rev: 5' - agt gat ttt tta ttg att aca gtt atg atc aat tga aag gga taa ggt cttatt tgt taa ctg tta att gtc c -3' （配列番号９９）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd23 DE1L GAG」BAC（配列番号４３）に挿入し、「pGRAd23 DE1L GAG DE3 A/L/S」BAC（配列番号５６）を得た。
第２の工程－ E3領域欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、一本鎖オリゴヌクレオチド5' - ctg tca ttt gtgtgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct act cgg acc tta tcc ctt tca att gatcat aac tgt aat caa taa aaa atc act - 3' （配列番号８６） を使用して欠失させた。この一本鎖 DNA断片オリゴを使用して、選択カセットを「pGRAd23 DE1L GAG DE3A/L/S」BAC（配列番号５６） に置換し、組換え工学により「pGRAd23 DE1L GAG DE3」BAC（配列番号５７） を作製した。
第３の工程－ Amp-LacZ-SacB選択カセットによる左向きのGAG領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - gat ggc tgg caa cta gaa ggc aca gca gat cgc ggc cgc tgt cga ctg aattct gat ggg ctt tat ttt att att tgt taa ctg tta att gtc - 3' （配列番号１００）
Rev: 5' - cga tcc agc ctc cgc ggc cgg gaa cgg tgc att gga acg cgg att ccc cgtgcc aag agt gag atc tac cac ccc tat ttg ttt att ttt ct - 3' （配列番号１０１）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd23 DE1L GAG DE3」BAC（配列番号５７）にクローニングし、「pGRAd23 DE1L A/L/S DE3」BAC（配列番号２７）を得た。
第４の工程－左向きで E1 の hCMVtetO-IntronA::SARS-CoV-2S-WPRE-bGHpA と置換するための AmpR-LacZ-SacB 選択カセットの欠失:
完全長カセットhCMVtetO-IntronA::kozak - SARS CoV-2 S - HA -WPRE - bGHpAカセットは、プラスミド「phCMVtetO-IntronA::SARS CoV-2S-WPRE-bGHpA」（配列番号５５）から SpeI/PacI 消化によって取得され、「pGRAd23 DE1L A/L/S DE3」BAC （配列番号２７）にクローニングされ、「pGRAd23 DE1L hCMVtetO-IntronA::SARS CoV-2 S-WPRE-bGHpA DE3」BAC（配列番号３２）が作製された。
実施例４： GRAd32ベクター構築
GRAd32 DE1ベクターの構築
GRAd32 wt ゲノム DNA （配列番号１）は、プロテイナーゼ K 消化とそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離され、大腸菌株BJ5138 での相同組換えによって pDE1 GRAd シャトル（配列番号４０）に挿入され、pGRAd32 ベクターが得られた。pIX 遺伝子、(I-SceI で消化された)シャトルの末端に存在する正しい ITR DNA 配列、およびウイルスゲノム DNA の間の相同組換えにより、GAG発現カセットにより置換された E1 領域を同時に欠失させることにより、シャトルベクターへの挿入が可能になり、GRAd32 の pIX と右 ITR、およびシャトル BAC の左 ITR を保持している、「pGRAd32 DE1 GAG wrongITR-L」BACベクター（配列番号５８）を最終的に作製した。
GRAd32 DE1ベクター ITR-Lの修正
構築ストラテジーは、以下に説明する 2 つの異なる工程に基づくものだった：

第１の工程：AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるITR-L 領域の置換
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - tgt cct gct tat cca caa cat ttt gcg cac ggt tat gtg gac aaa ata cctggt tac ccc tat ttg ttt att ttt ct - 3' （配列番号１０２）
Rev: 5' - gac atg agc caa tat aaa tgta cat att atg ata tgg ata caa cgt atg caatgg tta ttt gtt aac tgt taa ttg tc -3' （配列番号１０３）
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd32 DE1 GAG wrongITR-L」BAC（配列番号５８）にクローニングし、「pGRAd23 DE1 GAG wrongITR-L ALS in ITR-L」BAC（配列番号５９）を得た。
第２の工程：AmpR-LacZ-SacB 選択カセットの欠失と修正 ITR-L の挿入：
ITR-L は、GRAd32 ゲノム DNA（配列番号１） をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - tgt cct gct tat cca caa cat ttt gcg cac ggt tat gtg gac aaa ata cctggt tgc cgt tta aac cat cat caa taa tat acc tta ttt tg - 3' （配列番号１０４）
Rev: 5' - gac atg agc caa tat aaa tgt aca tat tat gat atg gat aca acg tat gcaatg gcg gcc atg acg gtg aca ata aaa acg ga -3' （配列番号１０５）。
PCRにより得られたDNA断片は、その後、組換え工学により「pGRAd23 DE1 GAG wrongITR-L ALS in ITR-L」BAC（配列番号５９）にクローニングされ、「pGRAd23 DE1 GAG」ITR修正BAC（配列番号６０）を得た。
GRAd32 DE3DE4ベクターの構築
構築ストラテジーは、以下に説明する4 つの異なる工程に基づくものだった:
第１の工程－AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE3 領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmp-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct act cgaccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号１０６）
Rev: 5' - agt gat ttt tta ttg att aca gtt atg atc aat tga aag gga taa ggt cttatt tgt taa ctg tta att gtc c -3' （配列番号１０７）。
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd32 DE1 GAG」BAC（配列番号６０）に挿入し、「pGRAd32 DE1 GAG DE3 ALS」BAC（配列番号６１）を得た。
第２の工程－ E3領域欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、一本鎖オリゴヌクレオチド 5'- ctg tca ttt gtgtgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct act cgg acc tta tcc ctt tca att gatcat aac tgt aat caa taa aaa atc act - 3'（配列番号８６）を使用して欠失させた。一本鎖 DNA 断片オリゴを使用して、選択カセットを組換え工学によって「pGRAd32 DE1GAG DE3 ALS」BAC（配列番号６１） に置き換え、「pGRAd32DE1 GAG DE3」BAC（配列番号６２） を作製した。この方法により、GRAd32野生型ゲノムのbp 28479からbp 32001までのE3領域が欠失した。
第３の工程－AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE4 領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gca aat gga aaa aaa atc aaaccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号１０８）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtg ctg gtg ctg tga gag tgttat ttg tta act gtt aat tgt cc -3' （配列番号１０９）
PCRで得られたDNA断片を、「pGRAd32 DE1 GAG DE3」BAC（配列番号６２）のネイティブGRAd32 E4領域を組換え工学により置換することにより挿入し、「pGRAd32DE1 GAG DE3 DE4 ALS」BAC（配列番号６３）を得た。
第４の工程－ E4 領域欠失のためのAmpR-LacZ-SacB 選択カセットの欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットを欠失させ、精製された野生型ヒトアデノウイルス5 （配列番号４７）のゲノムをテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCRによって増幅されたヒトアデノ ウイルス 5 E4orf6 に置換した：
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gca aat gga aaa aaa atc aac tacatg ggg gta gag tca ta - 3' （配列番号１１０）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtg ctg gtg ctgt gag agt gatgac tac gtc cgg cgt tcc -3' （配列番号１１１）。
次いで、PCRによって得られたヒトAd5 E4 orf6コード領域を含むDNA断片を「pGRAd32 DE1 GAG DE3 DE4 ALS」BAC（配列番号６３）に挿入し、組換え工学によってAmpR-LacZ-SacB選択カセットを置換した。最終産物は「pGRAd32 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5E4orf6」 BAC（配列番号６４）だった。この方法は、GRAd32野生型ゲノムのbp 34144からbp 36821までのE4領域の欠失をもたらした。
GRAd32 DE1DE3DE4ベクターの構築
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによる E1 領域の置換:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - tta cgt gaa ttt ccg cgt tcc ggg tca aag tct ccg ttt tta ttg tca ccgtca tac ccc tat ttg ttt att ttt ct - 3' （配列番号１１２）
Rev: 5' - gct aga ccc aaa ctc ggc cct ggt gca ggc cag cac cag atg gtc agg cct aagctt att tgt taa ctg tta att gtc -3' （配列番号１１３）
PCR で得られた DNA 断片は、「pGRAd32 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5E4orf6」 BAC（配列番号６４）のCMV::GAG-bGHpA カセットを組換え工学により置換することで挿入し、「pGRAd32 DE1 ALS DE3 DE4 hAd5E4orf6」 BAC（配列番号２６）を得た。
実施例５： pGRAd32 DE1 SARS-COV2 DE3DE4 ベクターの生成
完全長hCMVtetO-IntronA::kozak - SARS CoV-2 S - HA - WPRE- bGHpAカセットは、「phCMVtetO-IntronA::SARS CoV-2S-WPRE-bGHpA」（配列番号５４）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された：
Fw: 5' - tta cgt gaa ttt ccg cgt tcc ggg tca aag tct ccg ttt tta ttg tcg ccgtca tct gac ggg ccg cca tag agc cca ccg cat ccc cag cat gcc tgc tat t - 3' （配列番号１１４）
Rev: 5' - gct aga ccc aaa ctc ggc cct ggt gca ggc cag cac cag atg gtc agg cctaag cgc gat cgc ggc ccg gcc att gca tac gtt gta tc - 3' （配列番号１１５）。
このPCRを事前にHpaI消化した「pGRAd32 DE1 ALS DE3 DE4 hAd5E4orf6」（配列番号２６）に大腸菌BJ5138株で相同組換えによりクローニングし、「pGRAd32 DE1SARS-COV2 DE3 DE4」（配列番号３１）を得た。
実施例６：GRAd23 DE1 Gagの免疫原性
tet オペレーター (tetO) の制御下で HIV-1 Gag 抗原を発現する GRAd23 DE1 は、Tet リプレッサーを発現する HEK 293 由来のパッケージング細胞株に GRAd23 DE1 Gag DNA（配列番号４１） をトランスフェクトすることによってレスキューされ、標準的な手順に従って連続継代によって増幅された。精製ウイルスは、HIV-1 Gag抗原を発現するヒトAd5ベクターと並行して、マウスに注射した。
Gag 抗原に対する T 細胞応答を評価するために、6 匹のマウスのグループに 1x10^6 および 1x10^7 vp/マウスを注射した。Ｔ細胞応答は、BALB/cマウスにおいてマッピングされたHIV GagペプチドＴ細胞エピトープを用いて、ex vivoインターフェロン－γ酵素結合免疫スポット（Elispot）アッセイにより、免疫後3週間の脾臓細胞におけるT細胞応答を評価した。
結果は図６に示され、100 万個の脾細胞あたりの IFN-γスポット形成細胞 (SFC) として表される。各点は 1 匹のマウスの反応を表し、線は各用量群の平均に対応する。ウイルス粒子の数で注入された用量は、x 軸に表示される。結果は、ベンチマークのヒト Ad5 ベクターと比較して、GRAd23ベクターの免疫学的効力が高いことを示す。
HIV-1 Gag 抗原に対する B 細胞応答を評価するために、HIV-Gag 抗原を発現するAd5 または GRAd23のウイルス粒子をマウス１匹あたり 5x10^8個筋肉内注射することにより、5 匹のマウスのグループにワクチン接種した。B細胞応答は、ELISAによってHIV-1 Gagに対する抗体応答を測定することにより、免疫化の3週間後および6週間後に測定された。結果は図７に示され、ベンチマークであるヒト Ad5 ベクターと比較して、GRAd23 ベクターのマウスにおけるより高い抗体価を実証する。各点は 1 匹のマウスの反応を表し、線は各用量群の平均に対応する。
実施例７：ヒトにおけるGRAd23およびGRAd32の血清有病率
このアッセイでは、分泌型アルカリホスファターゼ (SEAP) の遺伝子を保有するHEK 293 細胞を形質導入するヒト Ad5、ゴリラ GRAd23 (図８)、またはゴリラGRAd32 (図９) の能力に対する、ヒト血清 (40 サンプル) 由来の中和抗体力価の影響を評価した。感染細胞の上清における SEAP 発現は、比色アッセイによって明らかにされる。中和力価は、ウイルス単独の陽性対照で観察された SEAP 活性の 50% 減少を与えるヒト血清の希釈として定義される。結果は、GRAd23 (図８) と GRAd32(図９) の両方の血清有病率が低いことを示す。臨床的に関連する中和力価 (ヒトのワクチン接種効率に悪影響を及ぼす力価＞200) のパーセンテージは、Ad5 で 67.5% であるのに対し、GRAd23ではわずか10%、GRAd32では 0% である。
実施例８： GRAd21ベクター構築
GRAd21 wt ゲノム DNA（配列番号１０）は、プロテイナーゼ K 消化とそれに続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離され、大腸菌株 BJ5138 での相同組換えによって pDE1 GRAd シャトル（配列番号４０）に挿入され、pGRAd21 ベクターが得られた。pIX 遺伝子、シャトルの末端に存在するright ITR DNA 配列 (I-SceI で消化)、およびウイルスゲノム DNA の間の相同組換えにより、シャトルベクターへの挿入が可能になり、同時に発現カセットに置換された E1 領域が欠失され、最終的に「pGRAd21 DE1 GAG」 BAC ベクター（配列番号６５）が生成された。
GRAd21 DE1 GAG DE3DE4の構築
構築ストラテジーは、以下に説明する 4 つの異なるステップに基づくものだった：
第１の工程－ AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE3 領域の置換:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmp-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct act cgaccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号９８）
Rev: 5' - agt gat ttt tta ttg att aca gtt atg atc aat tga aag gga taa ggt cttatt tgt taa ctg tta att gtc c -3' （配列番号９９）.。
PCRで得られたDNA断片を組換え工学により「pGRAd21 DE1 GAG」BAC（配列番号６５）に挿入し、「pGRAd21 DE1 GAG DE3 ALS」BAC（配列番号６６）を得た。
第２の工程－ E3領域欠失:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、一本鎖オリゴヌクレオチド5'- ctg tca ttt gtg tgc tga gta taa taa agg ctg aga tca gaa tct actcgg acc tta tcc ctt tca att gat cat aac tgt aat caa taa aaa atc act - 3'（配列番号８６）を使用して欠失させた。一本鎖 DNA 断片オリゴを使用して、選択カセットを組換え工学によって「pGRAd21 DE1 GAG DE3 ALS」BAC （配列番号６６）に置換し、「pGRAd21 DE1 GAG DE3」BAC （配列番号６７） を作製した。この方法は、GRAd21野生型ゲノムのbp 28343からbp 31875までのE3領域の欠失をもたらした。
第３の工程－AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによるE4 領域の置換:
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gcaaat gga aaa aaa atc aaa ccc cta ttt gtt tat ttt tct aa - 3' （配列番号８７）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtgctg gtg ctg tga gag tgt tat ttg tta act gtt aat tgt cc -3' （配列番号８８）
次に、PCR で得られた DNA 断片を、「pGRAd21 DE1 GAG DE3」BAC （配列番号６７）のネイティブ GRAd21 E4 領域を組換え工学により置換して挿入し、「pGRAd21 DE1GAG DE3 DE4 ALS」BAC （配列番号６８）を得た。
第４の工程－E4 領域欠失のための AmpR-LacZ-SacB選択カセットの欠失：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットを欠失させ、精製された野生型ヒトアデノウイルス 5 （配列番号４７）のゲノムをテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用してPCR によって増幅したヒトアデノウイルス 5 E4orf6 に置換した：
Fw: 5' - ccc ttc cac ata gct taa att atc acc agt gcaaat gga aaa aaa atc aac taca tgg ggg tag agt cat a - 3' （配列番号８９）
Rev: 5' - cgg cac ttg gcc ttt ttc aca ctc tga tta gtgctg gtg ctgt gag agt gat gac tac gtc cgg cgt tcc -3' （配列番号９０）。
次いで、PCRによって得られたヒトAd5 E4 orf6コード領域を含むDNA断片を「pGRAd21 DE1 GAG DE3 DE4 ALS」BAC（配列番号６８）に挿入し、組換え工学によってAmpR-LacZ-SacB選択カセットを置換した。最終的に「pGRAd21 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5E4orf6」 BAC（配列番号６９）が得られた。この方法は、GRAd21野生型ゲノムのbp 34005からbp 36681までのE4領域の欠失をもたらした。
GRAd21DE1DE3DE4空ベクターの構築
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットによる E1 領域の置換：
AmpR-LacZ-SacB 選択カセットは、プラスミド「pAmpR-LacZ-SacB」（配列番号３９）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用して PCR によって増幅された：
Fw: 5' - tta cgt gaa ttt ccg cgt tcc ggg tca aag tct ccg ttt tta ttg tca ccgtca tac ccc tat ttg ttt att ttt ct - 3' （配列番号１１２）
Rev: 5' - gct aga ccc aaa ctc ggc cct ggt gca ggc cag cac cag atg gtc agg cctaag ctt att tgt taa ctg tta att gtc -3' （配列番号１１３）。
「pGRAd21 DE1 GAG DE3 DE4 hAd5E4orf6」 BAC（配列番号６８） のCMV::GAG-bGHpAカセットを組換え工学で置換することにより、PCR で得られた DNA 断片を挿入し、「pGRAd21 DE1 ALS DE3 DE4 hAd5E4orf6」（配列番号２８） を得た。
pGRAd21 DE1 SARS-COV2 DE3 DE4 hAd5E4orf6 ベクターの作製
完全長hCMVtetO-IntronA::kozak - SARS CoV-2 S - HA - WPRE- bGHpAカセットは、「phCMVtetO-IntronA::SARS CoV-2S-WPRE-bGHpA」（配列番号５５）をテンプレートとして使用し以下のプライマーを使用した PCR によって増幅された。
Fw: 5' - acc caa act cgg ccc tgg tgc agg cca gca cca gat ggt cag gcc taa gcgaca ttg att att gac tag tta tta - 3' （配列番号１１６）
Rev: 5' - tcc gcg ttc cgg gtc aaa gtc tcc gtt ttt att gtc gcc gtc atc tga cgtccc cag cat gcc tgc tat t - 3' （配列番号１１７）。
このPCRを、大腸菌株SW102での組換え工学により「pGRAd21 DE1 ALS DE3 DE4 hAd5E4orf6」（配列番号２８）にクローニングし、「pGRAd21 DE1 SARS-COV2 DE3 DE4」（配列番号３３）を得た。
実施例９： GRAd33、GRAd34、GRAd35、GRAd36、GRAd37およびGRAd38ベクターの構築
GRAd33、GRAd34、GRAd35、GRAd36、およびGRAd38ベクターコンストラクトは、GRAd33、GRAd34、GRAd35、GRAd36、およびGRAd38ヘキソンの以下のセグメントを標準的な相同組換えによってGRAd23由来の標的ベクターコンストラクトに挿入することによって構築された：
GRAd33組換えセグメント：配列番号１６のヌクレオチド19381～21586
GRAd34組換えセグメント：配列番号２０のヌクレオチド19381～20491
GRAd35組換えセグメント：配列番号１８のヌクレオチド19381～20491
GRAd36組換えセグメント：配列番号５のヌクレオチド19381～21591
GRAd38組換えセグメント：配列番号８のヌクレオチド19381～20491
GRAd37ベクターコンストラクトは、標準的な相同組換えにより、GRAd37 ファイバーの以下のセグメントを GRAd21 由来の標的ベクターコンストラクトに挿入することによって構築された：
GRAd37組換えセグメント：配列番号１４のヌクレオチド 33189～33779
実施例１０：GRAd21 DE1 Gagの免疫原性
ヒトAd5と比較したGRAd21ゴリラベクターの免疫原性。Balb/c マウスは、HIV-1 gag タンパク質をコードする hAd5 または GRAd21 ベクターの106および107ウイルス粒子 (VP) で免疫化された。プライミング後 21 日後、脾臓を採取し、gag ペプチドで刺激した後、IFNg-ELISpot によって T 細胞応答を測定した。水平バーは平均値を示す。GRAd21の免疫原性は、ヒトAd5で観察された免疫原性と同等だった（図１０）。
実施例１１： GRAd32 DE1スパイクの発現および免疫原性
SARS-COV2スパイク抗原（GRAd32-S）をコードするGRAd32 DE1の発現および免疫原性。図１１：MOI=250でGRAd32-Sに感染したHeLa細胞の全細胞FACS分析。 感染の 48 時間後に細胞を分離し、SinoBiologicals の抗 S2 ポリクローナル抗体 (40590-T62) で染色した。図１２：107、106、または 105 VP による免疫後の IFN-γ 脾臓 ELISpot 応答。 Balb/cマウスの筋肉内に免疫化し、完全長Ｓタンパク質にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答について、免疫化の２週間後にアッセイした。図１３：Balb/c マウスにおける GRAd32-S による免疫後のスパイク抗原に対する血清抗体応答を、スパイクでコーティングされた96ウェル プレートで ELISA によって測定した。データは、免疫化の５週間後に109 VPおよび108 VPのGRAd32-Sで免疫化された動物からの個々の血清のIgGエンドポイント力価として表される。
実施例１２：異なるGRAd ベクターを使用した SARSCoV2スパイクのインビトロ発現。
融合前のコンフォメーション（S2P）で安定化されたプロトタイプSARS CoV2スパイクタンパク質をコードするベクターであるGRAd23b-S2P、GRAd32b-S2P、GRAd34b-S2PおよびGRAd39b-S2Pの抗原発現。これらすべてのベクターについて、「b」は、E1 領域と E3 領域の両方がそれぞれのウイルスゲノムで欠失していることを示す。
GRAD32b-S2Pは、標準的な相同組換えにより、「pGRAd32DE1 GAG DE3」（配列番号６２）中のGAGを、Lys986と Val987 のコドンを Pro に置換して融合前のコンフォメーションで安定化された改変バージョンのSARS CoV2スパイクタンパク質（配列番号２９）に置換することによって作製された。次に、標準的な相同組換えにより、GRAD32b S2Pのヘキソンコード領域を GRAd34ヘキソン（配列番号２０のヌクレオチド19381～20491）で置換することにより、GRAd39b-S2P を作製した。GRAD23b S2Pは、標準的な相同組換えにより、「pGRAd23 DE1 GAG DE3 BAC」（配列番号４５）中のGAGをスパイクタンパク質のS2Pバージョンに置換して同様に構築された。
これらのベクターの生産性レベルに統計的に有意な差はなかったが (同期感染の開始後の特定の時点で細胞あたりに生成されたウイルス粒子、データは示さず)、スパイク抗原の発現は、GRAd ベクターのうちの１つで予想外の増加を示した。HeLa細胞に 50 MOI の各ベクターを感染させ、感染の48時間後に細胞ライセートを回収した。ウエスタンブロット分析により、細胞によって産生された抗原のレベルは、GRAd34b-S2Pに感染したサンプルでより高いことが明らかになった（図１４）。
実施例１３：異なる GRAd ベクターを使用した SARSCoV 2スパイクのインビボ発現。
GRAd32b-S2P、GRAd34b-S2P、および GRAd39b-S2P は、マウスの免疫原性実験でさらに試験された。野生型BALB/c マウスに、GRAd32b-S2P、GRAd34b-S2P、または GRAd39b-S2P の10^8 または 10^7 ウイルス粒子を感染させ、血清はワクチン接種の 2 または 5 週間後に収集した。図１５は、組換えスパイク受容体結合ドメイン (RBD) タンパク質の ELISA によって測定された、スパイク（Spike）-2P 抗原に対して生成された抗体の終点力価を示す。この場合も、GRAD34b-S2P は、GRAD32b-S2Pと比較して、低用量でも約2～3 倍の明らかな改善を示した。
実施例１４： SARS CoV2スパイクを発現するGRAdベクターの臨床試験
配列番号２５に示されるスパイクタンパク質を生じる、２つのPro変異によって安定化されたSARS-COV2スパイクタンパク質を発現するGRAD32b-S2P (以下GRAd-COV2と呼ばれ、配列番号３１に示される配列であるが、Pos 2487C->T、Pos 2488 A->G、Pos2489 C->G、Pos 2490 C->A、Pos2491 T->G、Pos 2492 T->Gの置換を有する) は、次に、その安全性と免疫原性を確認するために設計された用量漸増非盲検臨床試験にかけられた。この研究には、若年成人(18～55) または高齢者 (65～85) の成人の２つの年齢コホートが含まれていた。各コホートは、それぞれ15 人のボランティアからなる３つの群で構成され、GRAd-COV2の３つの異なる用量レベル： 低用量 (LD) 5x10^10; 中用量 (ID) 1x10^11および高用量(HD) 2x10^11のウイルス粒子 (vp)、での単回投与を評価した。安全性と免疫原性のエンドポイントは、両方の年齢コホートに登録されたボランティアのワクチン接種後最初の4 週間で収集された。GRAd-COV2 は医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（good manufacturing practice：GMP） 条件下で製造され、2 x 10^11 vp/mL の濃度で製剤緩衝液に懸濁された。ボランティアは、三角筋に単回筋肉注射を受けた。HDの投与には、1mlのGRAd-COV2を希釈せずに注射した。IDおよびLDでは、ワクチンを無菌生理食塩水で希釈して、最終注射量を 1 ml にした。免疫原性分析の比較対照として、発症後20～60 日で収集された、入院中または軽度の症候性疾患から回復中のCOVID-19患者からの匿名化された３つの独立した検体セット (血清および PBMC) が使用された。陽性対照として、COVID-19 から回収されたドナーのヒト血漿を抗 SARS-CoV-2 Ab(NIBSC コード 20/130) の研究用試薬が含まれた。
GRAd-COV2ワクチン接種に対する抗体反応は、臨床的に検証された化学発光免疫測定法（CLIA）によってモニターされ、すべての研究グループで抗S IgG誘導の同様の動態が明らかになった（図１６Ａ）。重要なことに、高用量ワクチンは、ワクチン接種後 4 週間後に両方の年齢コホートで同様の IgG レベルを提供した (高用量群の IgG の中央値は、若年成人で 61.8、高齢者で 56.3 だった)。ELISAアッセイでは、９０人のボランティアのうち８９人（98.8%）が検出可能なレベルの抗ＳＩｇＧ （スパイクタンパク質全体に対する抗体およびRBDに特異的な抗体の両方）を発現したことを示した（図１６Ｂ～Ｃ）。
SARS-CoV-2に対する中和抗体は SARS-CoV-2生ウイルスを使用した２つの異なるインビトロアッセイによって評価された。ワクチン接種後 4 週目のマイクロ中和アッセイ (MNA90) では、25/44 (56.8%) の若年成人ボランティアと 33/45 (73.3%) の高齢者ボランティアの血清中に中和抗体が検出された（図１６Ｄ）。プラーク減少中和試験(PRNT50) は、SARS-CoV-2 中和抗体が42/44 (92.5%) の若年成人と 45/45 (100%) の高齢者ボランティアで検出可能であることを明らかにした（図１６Ｅ）。すべての群で、GRAd-COV2ワクチン接種によって誘発された結合および中和抗体の力価は、軽度の COVID-19 から回復した対象で測定された値の範囲内だった（図１６Ａ～Ｄ）。
次に、定量的 IFNγ ELISpot アッセイを使用して、ワクチン接種後 2 週目に両方のコホートのボランティアから新たに単離された PBMC に対する T 細胞応答を評価した。３つの用量すべてでGRAd-COV2を投与すると、両方のコホートで強力なS特異的IFNγ産生T細胞応答が誘導され（図１７Ａ）、２つの年齢コホート全体で評価可能な対象の 80% が 1000 SFC/100万PBMC を超える応答を示した。同じワクチン用量を投与された若年成人研究群と高齢者研究群の間に有意差はなかった (p は、LD、ID、および HD のそれぞれで 0.116、0.984、および 0.152 だった)。S タンパク質のすべての領域は、両方の年齢コホートで同程度の免疫原性を示した（図１７Ｂ）。S 特異的 T 細胞応答は、一般に、発症から1～2 か月後にサンプリングされたSARS-CoV-2 回復期の対照よりも、GRAd-COV2 ワクチンを接種した対象の方が高かった。細胞内サイトカイン染色(ICS)および FACS 分析により、若年成人および高齢者のボランティアの S タンパク質特異的 CD4 およびCD8 T リンパ球の両方にワクチン誘導応答が関与し（図１７Ｃ～ＤおよびＥ～Ｆ）、CD8 T細胞応答よりもS特異的CD4がわずかに高いことが明らかになった。重要なことに、 GRAd-COV2 ワクチン誘導 S 特異的 CD4 の中で、IFNγ 産生は両方の年齢コホートで IL4 および IL17 よりも顕著であり、ワクチンが主に T ヘルパー 1 (Th1) 応答を誘導したことを示す (図１７Ｃおよび １７Ｅの下の表)。
これらのデータを総合すると、GRAd-COV2 がすべての年齢層にわたって抗体と T 細胞応答の両方を誘発する効率的なワクチンベクターであることを示す。
図面の用語
Hexon ヘキソン
Penton ペントン
Fiber ファイバー
IFNγSFC/106 splenocytes IFNγSFC/106脾細胞
vector dose ベクター用量
anti-p24 GAG serum titers 抗p24 GAG血清力価
weeks post immunization 免疫後の週
nAb titer nAb力価
Human sera ヒト血清
SFC/106 splenocytes SFC/106脾細胞
Negative staining control ネガティブ染色対照
Uninfected cells 感染していない細胞
GRAd32-2P infected cells GRAd32-2P感染細胞
#positive mice #陽性マウス
Spike IgG titer スパイクIgG力価
IgG endpoint titer IgGエンドポイント力価
Endpoint titer (spike RBD) エンドポイント力価 (スパイク RBD)
% of CD4 secreting cytokine サイトカインを分泌するCD4の％
% of CD8 secreting cytokine サイトカインを分泌するCD8の％

Claims (15)

  1. A) (i) 配列番号２の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号２の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号２の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号２の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号２の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号２の314～322 Y位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号２の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    B) (i) 配列番号９の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号９の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号９の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号９の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号９の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号９の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号９の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    C) (i) 配列番号１１の136～163位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号１１の182～196位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号１１の214～220位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号１１の252～262位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号１１の270～278位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号１１の302～310位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号１１の419～442位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    D) (i) 配列番号１７の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号１７の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号１７の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号１７の257～267位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号１７の275～289位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号１７の313～321位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号１７の430～455位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    E) (i) 配列番号１９の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号１９の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号１９の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号１９の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号１９の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号１９の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号１９の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    F) (i) 配列番号２１の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号２１の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号２１の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号２１の257～267位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号２１の275～289位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号２１の313～321位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号２１の430～455位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、または
    G) (i) 配列番号２３の136～168位のアミノ酸配列を含むHVR1、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (ii) 配列番号２３の187～201位のアミノ酸配列を含むHVR2、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iii) 配列番号２３の219～225位のアミノ酸配列を含むHVR3、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (iv) 配列番号２３の257～268位のアミノ酸配列を含むHVR4、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (v) 配列番号２３の276～290位のアミノ酸配列を含むHVR5、または２つまでの変異を含むその変異体、
    (vi) 配列番号２３の314～322位のアミノ酸配列を含むHVR6、または２つまでの変異を含むその変異体、および
    (vii) 配列番号２３の431～456位のアミノ酸配列を含むHVR7、または２つまでの変異を含むその変異体、
    を含むアデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、G)に記載のアデノウイルスヘキソンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、さらに配列番号６のアデノウイルスファイバータンパク質、または２つまでの変異を含むその変異体をさらにコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  2. A)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、
    B)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、
    C)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、
    D)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、および／または
    E)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号１９のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、
    F)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、および／または
    G)に記載のヘキソンタンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、
    請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  3. A)に関して、配列番号３または配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスファイバータンパク質をさらにコードする、
    B)、D) 、E)および／またはF)に関して、配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスファイバータンパク質をさらにコードする、および／または
    C) に関して、配列番号１２または配列番号１５に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスファイバータンパク質をさらにコードする、
    請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  4. A)に関して、配列番号４または配列番号７に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスペントンタンパク質をさらにコードする、
    B)、D) 、E) 、F) および／または G)に関して、配列番号７に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスペントンタンパク質をさらにコードする、および／または
    C)に関して、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含む、アデノウイルスペントンタンパク質をさらにコードする、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. アデノウイルスは、非アデノウイルスの遺伝子、タンパク質またはその断片を含み、任意で、非アデノウイルスの遺伝子またはタンパク質は、コロナウイルスの遺伝子またはタンパク質であり、好ましくはSARS-CoV-2遺伝子またはタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  6. 非アデノウイルスの遺伝子またはタンパク質は、コロナウイルスの遺伝子またはタンパク質であって、該コロナウイルスの遺伝子またはタンパク質は、スパイク遺伝子またはタンパク質であり、好ましくは、配列番号３０に示される配列またはその少なくとも８０％配列同一性を有する変異体を含むものである、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  7. 請求項１に記載のA)、B) 、C) 、D) 、E)またはF)で規定されるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたヘキソンポリペプチド、または、
    請求項２に記載のA)、B) 、C) 、D) 、E)またはF)で規定されるポリヌクレオチドによってコードされる単離されたヘキソンポリペプチド。
  8. 請求項１～４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドにコードされる、ヘキソンを含む、および好ましくはファイバーおよび／またはペントンタンパク質も含む、単離されたアデノウイルスキャプシド。
  9. （ｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアデノウイルス、
    （ｉｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むアデノウイルス、および／または
    （ｉｉｉ）請求項７に記載のヘキソンポリペプチドまたは請求項８に記載のアデノウイルスキャプシドを含むアデノウイルス。
  10. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるウイルス様粒子。
  11. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. （ｉ）アジュバント、（ｉｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のヘキソンポリペプチド、請求項８に記載のアデノウイルスキャプシド、請求項９に記載のアデノウイルス、請求項１０に記載のウイルス様粒子、または請求項１１に記載のベクター、および任意で（ｉｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、を含む組成物。
  13. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のヘキソンポリペプチド、請求項８に記載のアデノウイルスキャプシド、請求項９に記載のアデノウイルス、請求項１０に記載のウイルス様粒子、または請求項１１に記載のベクターを含む単離された細胞。
  14. 疾患、好ましくはコロナウイルス病、より好ましくはCovid-19の治療または予防に使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のヘキソンポリペプチド、請求項８に記載のアデノウイルスキャプシド、請求項９に記載のアデノウイルス、請求項１０に記載のウイルス様粒子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の組成物および／または請求項１３に記載の細胞。
  15. アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を産生するためのインビトロ法であって、
    （ｉ）アデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子が細胞内で集合するように、細胞内で請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを発現させる工程、
    （ｉｉ） 細胞または細胞を取り囲む培地からアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子を単離する工程を含む、インビトロ法。
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