JP2023532003A - 単一ドメイン抗体、サポニン及びエフェクター分子のコンジュゲート、それを含む医薬組成物、前記医薬組成物の治療的使用 - Google Patents

単一ドメイン抗体、サポニン及びエフェクター分子のコンジュゲート、それを含む医薬組成物、前記医薬組成物の治療的使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞中に移行させるためのコンジュゲートであって、互いに共有結合された、細胞に移行されることになる少なくとも１つのエフェクター分子、モノ－デスモサイドトリテルペングリコシド型又はバイ－デスモサイドトリテルペングリコシド型の少なくとも１つのサポニン、及び少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み、ｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合することができるコンジュゲートに関する。本発明はまた、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬としての使用のための本発明の医薬組成物に関する。加えて、本発明は、以下のいずれか１つ以上の治療又は発症予防における使用のための本発明の医薬組成物に関する：癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシス。本発明はまた、コンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させるため又は本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させるためのインビトロ又はインビボでの方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞中に移行させるためのコンジュゲートであって、互いに共有結合された、細胞に移行されることになる少なくとも１つのエフェクター分子、モノ－デスモサイドトリテルペングリコシド型又はバイ－デスモサイドトリテルペングリコシド型の少なくとも１つのサポニン、及び少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み、ｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合することができるコンジュゲートに関する。本発明はまた、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬としての使用のための本発明の医薬組成物に関する。加えて、本発明は、以下のいずれか１つ以上の治療又は発症予防における使用のための本発明の医薬組成物に関する：癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシス。本発明はまた、コンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させるため又は本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させるためのインビトロ又はインビボでの方法に関する。
治療的生物活性を有する分子は、理論上は必要とするヒト患者における癌などの疾患の治療のための効果的な治療薬としての適用に好適な場合が多い。典型的な例は、小分子生物活性部分である。しかしながら、現在クリニックで使用されている有望な薬物様分子及び治療薬の多くは、全てではないにしても、多くの欠点及び欠陥のうちの少なくとも１つを抱えている。ヒトの身体に投与されるとき、治療活性分子は、疾患又は健康問題の治療に関する所望の生物活性に加えて、オフターゲット効果を発揮する場合がある。そのようなオフターゲット効果は望まれないものであり、投与された分子の健康を或いは生命をも脅かす副作用の誘導のリスクを有する。そのような有害事象の発生により、多くの薬物様化合物及び治療薬部分が第ＩＩＩ相臨床試験又は第ＩＶ相臨床試験（市販後の調査監視）で不合格になる。したがって、小分子治療薬などの薬物分子を提供することが強く望まれており、薬物分子の治療効果は、とりわけ、例えば、（１）疾患を促進する生体因子又は生物プロセスに高度に特異的である必要があり、（２）十分に安全である必要があり、（３）十分に効果的である必要があり、（４）非疾患細胞に対してほとんど又は全くオフターゲット活性を伴わずに疾患細胞に十分に誘導される必要があり、（５）十分に時宜を得た作用機序を有する必要があり（例えば、投与された薬物分子は、ある特定の時間枠内でヒト患者の標的化部位に到達し、及びある特定の時間枠において標的化部位に留まる必要がある）、及び／又は（６）患者の身体において十分に持続性の治療活性を有する必要がある。残念ながら、今日までに、本明細書において上で概説された有利な特徴の多くを又はさらには全てを有する「理想的な」治療薬は、既に長期間の集中的な調査並びに個別に対処された直面した困難及び欠陥のいくつかの分野においてなされた印象的な進展にもかかわらず、患者に利用可能ではない。
化学療法は、癌治療のための最も重要な治療選択肢の１つである。しかしながら、健康な組織における分裂細胞を超えて癌細胞に対する特異性を有しないため、狭い治療域を付随する場合が多い。モノクローナル抗体の発明は、それらの特異的な結合特性を利用して、正常細胞を温存しながら癌細胞に細胞傷害性薬剤を標的化して送達するための機構としての可能性をもたらした。これは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための抗体への細胞傷害性エフェクター（ペイロード又はワーヘッドとしても知られる）の化学的コンジュゲーションによって達成され得る。通常、コンジュゲートされていない形態で限定的な治療指数（毒性用量と効果的な用量を比較する比率）を有するエムタンシン（ＤＭ１）などの非常に強力なペイロードが使用される。ＤＭ１のＫａｄｃｙｃｌａとしても知られるトラスツズマブ（ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン）へのコンジュゲーションは、サルにおいてＤＭ１の耐容量を少なくとも２倍高める。治療用ＡＤＣを開発するために過去数十年に途方もない労力及び投資がなされてきた。しかしながら、有望な前臨床データにもかかわらず、ＡＤＣをクリニックに導くことは困難なままである。臨床使用のために承認された最初のＡＤＣは、２０００年の再発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のためのゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ、ＣＤ３３標的化、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ）であった。しかしながら、マイロターグは、その安全性プロファイルを含むいくつかの懸念のために連邦医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）の要求で販売中止になった。マイロターグで治療された患者は、従来の化学療法で治療された患者より多くの場合で死亡することが見出された。マイロターグは、推奨用量の引き下げ、化学療法との組み合わせ又は単剤での異なるスケジュール、及び新しい患者集団で２０１７年に再び上市が認められた。今日までに、５種のＡＤＣのみが臨床使用のために承認されており、一方でおよそ５５種のＡＤＣの臨床開発が停止されている。しかしながら、関心は高いままであり、現時点でおよそ８０種のＡＤＣが依然として、ほぼ６００の臨床試験において臨床開発中である。
患者によって通常許容されない毒性ペイロードを使用する可能性があるにもかかわらず、低い治療指数は、臨床開発において多くのＡＤＣの中止を占める主要な問題であり、これは、正常細胞に対するオフターゲット毒性、細胞傷害性薬剤に対する耐性の発生及び血行中の薬物の早計な放出などのいくつかの機構によって引き起こされ得る。ＦＤＡによるＡＤＣの系統的再評価は、大部分のＡＤＣの毒性プロファイルが、使用される抗体ではなく使用されるペイロードに従って分類することができることを見出し、毒性が、大部分はペイロードの早計な放出によって決定されることを示唆している。中止されたおよそ５５種のＡＤＣのうち、少なくとも２３種が不十分な治療指数に起因したと推定される。例えば、トラスツズマブテシリンコンジュゲート（ＡＤＣＴ－５０２、ＨＥＲ２－標的化、ＡＤＣ治療薬）の開発は、顕著なレベルのＨＥＲ２を発現する肺組織におけるオンターゲット、組織外効果におそらく起因する、低い治療指数のために最近中止された。加えて、第３相試験におけるいくつかのＡＤＣは、主要評価項目の欠落のために中止されている。例えば、新たに診断された神経膠芽腫を有する患者において試験されたデパツキシズマブマホドチンコンジュゲート（ＡＢＴ－４１４、ＥＧＦＲ標的化、ＡｂｂＶｉｅ）、及び白金耐性卵巣癌を有する患者において試験されたミルベツキシマブソラブタンシンコンジュゲート（ＩＭＧＮ８５３、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）標的化、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）の第３相試験は、最近中止され、延命効果がないことを示している。臨床的に使用可能な用量のいくつかのＡＤＣは、その完全な抗癌活性に十分ではない可能性があることを認めることが重要である。例えば、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンは、ヒトにおいて３．６ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを有する。乳癌の前臨床モデルにおいて、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンは、３ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベルで腫瘍退縮を誘導したが、より強力な有効性は１５ｍｇ／ｋｇで観察された。これは、臨床的に投与される用量で、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンが、その最大の潜在的抗腫瘍効果を発揮しない可能性があることを示唆している。
ＡＤＣは主に、抗体、ペイロードなどの細胞傷害性部分、及びリンカーで構成される。いくつかの新規の戦略が提案され、ＡＤＣの構成成分の各々を標的にする既存の問題を克服するための新規のＡＤＣの設計及び開発において実行された。例えば、抗体構成成分のための十分な抗原標的の同定及び検証によって、腫瘍における高い発現レベルを有し、正常組織において発現をほとんど又は全く有しない抗原、循環ＡＤＣにとって到達可能になるように細胞表面上に存在する抗原、及び結合後のＡＤＣの細胞中への内部移行を可能にする抗原、並びに活性の代替的機構を選択することによって、ＡＤＣの溶解性及び薬物抗体比（ＤＡＲ）を高めるリンカーを設計し、最適化し、細胞外に化学療法剤を輸送することができるタンパク質によって誘導される耐性を克服し、さらなるペイロードの包含によりＤＡＲ比を高め、抗体均一性及び開発可能性を向上させるために抗体を選択し、最適化する。ＡＤＣの技術的開発に加えて、分割された投与により投与スケジュールを変更する、体内分布試験を実施する、応答シグナルを早く捕捉し、応答の期間及び深さをモニターし、及び組み合わせ試験を通知するための患者選択を最適化するバイオマーカーを含める、などの新たな臨床的及びトランスレーショナルな戦略もまた、治療指数を最大化するために採用されている。
臨床的な潜在力を有するＡＤＣの例は、ブレンツキシマブベドチン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスードトクス、及びポラツズマブベドチンなどのＡＤＣであり、リンパ性腫瘍及び多発性骨髄腫のための治療選択肢として評価される。（悪性）Ｂ細胞上のＣＤ７９ｂに結合するポラツズマブベドチン、及びＣＤ２２に結合するピナツズマブベドチンは、臨床試験において試験され、ＡＤＣはそれぞれ、同時投与されるリツキシマブ、ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体と組み合わせられ、ペイロードとともに提供されない［Ｂ．Ｙｕ ａｎｄ Ｄ．Ｌｉｕ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１９）１２：９４］。これらの例などのモノクローナル抗体の組み合わせは、前述のＡＤＣの望ましい特徴の多く又は全てを組み合わせる「魔法の弾丸」に到達するためのさらなるアプローチ及び試みである。
一方、過去数十年において、核酸に基づく治療薬が開発中である。治療用核酸は、遺伝子療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などのアプローチのためのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、及び短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、並びにＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーに基づくものであり得る。それらの多くは、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現のいずれかの阻害による作用の同じ基本的基盤を共有し、それにより疾患に関連する異常なタンパク質の発現を妨げる。遺伝子治療の分野において最も多くの臨床試験が行われており、世界中でほぼ２６００件の臨床試験が進行中であるか又は完了しているが、第３相に入っているのは約４％にすぎない。この後にＡＳＯによる臨床試験が続く。ＡＤＣと同様に、多数の手法が探索されているにもかかわらず、治療用核酸は、臨床開発中に２つの主要な問題を共有している：細胞への送達及びオフターゲット効果。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホラアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び架橋核酸（ＢＮＡ）などのＡＳＯは、標的遺伝子を特異的に阻害し、及び特に小分子阻害剤又は中和抗体で標的化することが難しい遺伝子を阻害する魅力的な戦略として調査されている。現在、異なるＡＳＯの有効性は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び筋萎縮性側索硬化症などの多くの神経変性疾患、並びにいくつかの癌段階においても試験されている。潜在的な治療剤としてのＡＳＯの適用は、標的細胞及び組織の細胞質及び／又は核へのそれらの送達のために安全及び有効な方法を必要とする。ＡＳＯの臨床的意義は実証されているが、インビトロ及びインビボの両方での非効率的な細胞への取り込みは、ＡＳＯの有効性を制限し、治療薬開発に対する障壁となっている。細胞への取り込みは用量の２％未満であり、活性部位でのＡＳＯ濃度が低すぎるため効果的及び持続的なアウトカムが得られない。これは結果的に、オフターゲット効果を誘導する投与される用量の増加を必要とする。最も一般的な副作用は、補体カスケードの活性化、凝固カスケードの阻害及び免疫系のトール様受容体媒介性刺激である。
化学療法は、最も一般的な小分子であるが、それらの有効性は、重篤なオフターゲット副作用毒性、並びにそれらの不十分な溶解性、迅速なクリアランス及び限定的な腫瘍暴露によって妨害される。ポリマー－薬物コンジュゲート（ＰＤＣ）などの足場－小分子薬物コンジュゲートは、薬理学的活性を有する高分子構築物であり、担体足場（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に結合される小分子薬物の１つ以上の分子を含む。
そのようなコンジュゲート原理は、数十年間注目され、調査されている。前臨床又は臨床開発下の小分子薬物のコンジュゲートの大部分は、腫瘍学的効能のためのものである。しかしながら、今日まで、癌に関連しない１つの薬物のみが２０１４年に慢性疼痛を有する患者におけるオピオイド誘導性便秘に関して承認されており（Ｍｏｖａｎｔｉｋ、オピオイドアンタゴニストナロキソンのＰＥＧオリゴマーコンジュゲート、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、これは非腫瘍学効能である。ヒト対象の治療への薬物－足場コンジュゲートのトランスレーショナルな適用は、今のところ臨床的にほとんど成功していない。例えば、ＰＫ１（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマードキソルビシン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｆｉｚｅｒによる開発）は、マウスモデルにおける固形腫瘍及び白血病の両方において優れた抗癌活性を示し、腫瘍学的効能のための臨床研究中であった。それがヒトにおいて非特異的毒性の著しい軽減及び薬物動態の改善を実証したにもかかわらず、患者における抗癌活性の改善はわずかであることが判明し、結果として、ＰＫ１のさらなる開発は中止された。
足場－小分子薬物コンジュゲートの失敗は、腫瘍部位でのその不十分な蓄積に少なくとも部分的に起因する。例えば、マウスモデルにおいて、ＰＫ１は、健康な組織（肝臓、腎臓、肺、脾臓、及び心臓）より腫瘍において４５～２５０倍高い蓄積を示したが、腫瘍における蓄積は、臨床試験における患者の小さいサブセットにおいてのみ観察された。
前述の問題に対する潜在的な解決策は、リポソームなどの薬物送達のためのナノ粒子系の適用である。リポソームは、１つ以上のリン脂質二重層からなる球状小胞であり、リン脂質が水中で分散されるときに自発的に形成される。リン脂質の両親媒性の特徴は、それに自己組織化の特性、乳化及び湿潤の特徴をもたらし、これらの特性は新薬及び新しい薬物送達系の設計に採用され得る。リポソーム送達系における薬物の封入は、薬物動態及び薬力学にわたる改善及び制御、組織標的化特性、毒性の減少及び薬物活性の強化などの薬物の直接的な投与と比較していくつかの利点をもたらし得る。そのような成功例は、小分子化学療法剤ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ：ドキソルビシンのペグ化リポソーム－被包形態；Ｍｙｏｃｅｔ：非ペグ化リポソームドキソルビシン）のリポソーム被包形態であり、臨床使用のために承認されている。
したがって、望まれる場合に非全身使用に適用可能である抗腫瘍療法などの薬物療法を可能にする解決策を見出す必要性が依然として存在し、薬物は、例えば、許容される安全性プロファイル、少ないオフターゲット活性、十分な有効性、患者の身体からの十分に低いクリアランス速度、十分に広い治療域などを有する。
欧州特許第１６２３７１５Ｂ１において、サポニンと組み合わされた標的細胞特異的結合分子にカップリングされた薬理学的に活性な薬剤を含む組成物が記載されている。薬理学的に活性な薬剤は、例えば、毒物である。
本発明の実施形態に関して、生物活性化合物の改善又はそのような改善された生物活性化合物を含む組成物を提供することが第１の目標である。
本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、（小分子）治療活性化合物を、それを必要とするヒト患者に投与するときに直面する非特異性の問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、疾患を促進する生体因子又は生物プロセスに対して最適化されていない特異性を有する薬物の問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、必要とするヒト患者に投与されるときの現行の薬物の不十分な安全性の特徴の問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、必要とするヒト患者に投与されるときに所望のものより効果が低い現行の薬物の問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、必要とするヒト患者に投与されるときに非疾患細胞に対してほとんど又は全くオフターゲット活性を伴わずに疾患細胞に十分に誘導されていない現行の薬物の問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、現行の薬物が、必要とするヒト患者に投与されるときに十分に時宜を得た作用機序を有しない（例えば、投与された薬物分子は、ある特定の時間枠内でヒト患者の標的化部位に到達し、及びある特定の時間枠において標的化部位に留まる必要がある）という問題に対する解決策を提供することである。本発明の実施形態のいくつかの目的の１つは、現行の薬物が必要とするヒト患者に投与されるときに患者の身体において十分に持続性の治療活性を有しないという問題に対する解決策を提供することである。
本発明の実施形態の上記の目的の少なくとも１つは、本発明に従って、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である細胞標的化部分、並びに少なくとも１つのサポニン及びタンパク質性毒素などの少なくとも１つのエフェクター部分及び／又はＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、共有結合的に連結されたサポニンとともに提供されるＡＤＣ及び／又は医薬としての使用にも好適な共有結合的に連結されたサポニンとともに提供されるＡＯＣを含む、本発明の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又は抗体－ＢＮＡ共有結合性複合体などの抗体－オリゴヌクレオチド（ＡＯＣ）を提供することによって達成される。
本発明は、特定の実施形態に関して記載されることになるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書に記載される本発明の実施形態は、別段の指定がない限り、組み合わせ及び協同作用において機能し得る。
本発明の第１の態様は、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞中に移行させるためのコンジュゲートであって、直接的に又は少なくとも１つのリンカーを介して互いに共有結合された、細胞に移行されることになる少なくとも１つのエフェクター分子と、少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、少なくとも１つのサポニンとを含み、少なくとも１つのサポニンが、モノ－デスモサイドトリテルペングリコシドであるか又はバイ－デスモサイドトリテルペングリコシドであり、ｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合することができるコンジュゲートに関する。コンジュゲートが２つ以上のｓｄＡｂを含む場合、これらのｓｄＡｂは、同じ細胞上に存在する同じ細胞表面分子、すなわち、同じ分子若しくは細胞表面分子の同じ型の異なるコピーに結合するか、又はこれらのｓｄＡｂは、第１の細胞表面分子及び第１の細胞表面分子と同じ細胞に存在する第２の細胞表面分子に結合する。細胞表面分子は通常、（ａ）細胞表面受容体である。
本発明の第２の態様は、本発明のコンジュゲート、並びに任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物に関する。
本発明の第３の態様は、医薬としての使用のための本発明の医薬組成物に関する。
本発明の第４の態様は、以下のいずれか１つ以上の治療又は発症予防における使用のための本発明の医薬組成物に関する：癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシス。
本発明の第５の態様は、本発明のエフェクター分子（本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子）を細胞の外部から前記細胞の内部に、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させるための、インビトロ又はエクスビボでの方法であって、
ａ）その細胞表面上で、本発明のコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのｓｄＡｂのための結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、本明細書に記載されるとおり、細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）本発明のコンジュゲートであって、工程ａ）において提供される細胞に移行されることになるエフェクター分子を含む前記コンジュゲートを提供する工程；及び
ｃ）工程ａ）の細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）のコンジュゲートと接触させる工程
を含み、
それにより、エフェクター分子を含む前記コンジュゲートを、細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程、及び前記コンジュゲートの移行により、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させる工程を含む、方法に関する。
本発明の第６の態様は、本発明のコンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させるためのインビトロ又はエクスビボでの方法であって、
ａ）その細胞表面上で、本発明のコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのｓｄＡｂのための結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、本明細書に記載されるとおり、細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）本発明のいずれか１つのコンジュゲートを提供する工程；及び
ｃ）工程ａ）の細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）のコンジュゲートと接触させる工程を含み、それにより、コンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程
を含む方法に関する。
本発明の態様は、本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物、並びに以下のいずれか１つ以上：癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシスの治療又は発症予防のための使用における前記コンジュゲート又は前記医薬組成物の使用のための指示書、又は本発明によるインビトロ又はエクスビボでの方法の適用のための指示書を含むキット・オブ・パーツに関する。
本発明の態様は、本発明のｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化分子を含み及び本発明の少なくとも１つのエフェクター部分を含み及び／又は本発明の少なくとも１つのサポニンを含む、構造ＣのＡＤＣ若しくはＡＯＣなどのコンジュゲート、又は半完成状態のＡＤＣコンジュゲート若しくは半完成状態のＡＯＣコンジュゲート：
Ａ（－Ｓ）ｂ（－Ｅ）ｃ
（構造Ｃ）
（式中、Ａは、ｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化分子であり；
Ｓは、サポニンであり；
Ｅは、エフェクター部分であり；
ｂ＝０～６４、好ましくは、０、１、２、３、４、８、１６、３２、６４又はその間にある任意の整数（若しくは小数部）であり；
ｃ＝０～８、好ましくは、０、１、２、３、４、６、８又はその間にある任意の整数（若しくは小数部）であり；
Ｓは、Ａ及び／又はＥにカップリングされ、Ｅは、Ａ及び／又はＳにカップリングされ、好ましくは、Ｓは、Ａにカップリングされ、Ｅは、Ａにカップリングされる）に関する。
定義
用語「タンパク質性」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、タンパク質様である分子を指し、分子が、ある程度、タンパク質に特徴的な物理化学的特性を有するか、タンパク質のものであるか、タンパク質に関連するか、タンパク質を含有するか、タンパク質に属するか、タンパク質からなるか、タンパク質に類似するか、又はタンパク質であることを意味する。例えば、「タンパク質性分子」において使用される場合の用語「タンパク質性」は、タンパク質に類似するか又はタンパク質である分子の少なくとも一部の存在を指し、「タンパク質」は、少なくとも２つの残基長のアミノ酸残基の鎖を含むように理解されることになり、したがって、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質並びにタンパク質又はタンパク質ドメインの集合体を含む。タンパク質性分子において、少なくとも２つのアミノ酸残基は、例えば、ペプチド結合などのアミド結合を介して結合される。タンパク質性分子において、アミノ酸残基は、天然のアミノ酸残基であり及び／又は修飾された天然のアミノ酸残基などの人工的なアミノ酸残基である。好ましい実施形態では、タンパク質性分子は、少なくとも２つのアミノ酸残基、好ましくは、２～約２０００のアミノ酸残基を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２～２０個（ペプチドに関して典型的）のアミノ酸を含む分子である。一実施形態では、タンパク質性分子は、２１～１０００個（ポリペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＥＧＦなどの受容体のためのリガンドに関して典型的）のアミノ酸を含む分子である。好ましくは、アミノ酸残基は、ペプチド結合を介して（典型的には）結合される。本発明によれば、前記アミノ酸残基は、（修飾された）（非）天然アミノ酸残基であるか又はそれを含む。
例えば、共有結合性コンジュゲートの一部としてエフェクター分子を参照する場合の用語「エフェクター分子」、又は「エフェクター部分」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、例えば、標的分子：タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、（リン）脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、酵素のいずれか１つ以上に選択的に結合することができる分子を指し、そのような１つ以上の標的分子の生物活性を調節する。本発明のコンジュゲートにおいて、エフェクター部分は、例えば、細胞質ゾル及び／又は細胞核においてその効果を発揮し、及び／又はエンドソーム及び／又はリソソームにおいて細胞内に送達され、及び／又はエンドソーム－リソソーム経路を出たか若しくは脱出した後に活性である。エフェクター分子は、例えば、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、異物性核酸若しくはｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、又はその活性断片若しくは活性ドメイン、又はその任意の組み合わせのいずれか１つ以上から選択される分子である。したがって、例えば、エフェクター分子又はエフェクター部分は、標的分子：タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、（リン）脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、酵素のいずれか１つ以上に選択的に結合することができ、及び標的分子への結合時に、そのような１つ以上の標的分子の生物活性を調節する、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、異物性核酸若しくはｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、又はその任意の組み合わせのいずれか１つ以上から選択される分子又は部分である。例えば、エフェクター部分は、毒素若しくはその活性な毒性断片又はその活性な毒性誘導体若しくは活性な毒性ドメインである。通常、エフェクター分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞の内部、例えば、前記細胞の細胞質ゾル中において生物学的効果を発揮することができる。したがって、本発明のエフェクター分子又は部分は、細胞内エフェクター分子標的との相互作用によって細胞の代謝に影響を及ぼす任意の物質であり、このエフェクター分子標的は、エンドサイトーシス及びリサイクリング経路の区画及び小胞の内腔を除くが、これらの区画及び小胞の膜を含む細胞内部の任意の分子又は構造である。したがって、細胞内部の前記構造は、核、ミトコンドリア、クロロプラスト、小胞体、ゴルジ体、他の輸送小胞、細胞膜及び細胞質ゾルの内部を含む。したがって、典型的なエフェクター分子は、薬物分子、酵素、プラスミドＤＮＡ、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によって含まれる毒素などの毒素、ｓｉＲＮＡ、ＢＮＡ、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）によって含まれる核酸などのオリゴヌクレオチドである。例えば、エフェクター分子は、（細胞内）酵素活性、遺伝子発現、又は細胞シグナル伝達を増大させることができるか又は低減することができるリガンドとして作用することができる分子である。通常、コンジュゲートによって含まれるエフェクター部分は、細胞質ゾル及び／又は細胞核中でその治療的（例えば、毒性、酵素性、阻害性、遺伝子サイレンシングなど）効果を発揮する。通常、エフェクター部分は、エンドソーム及び／又はリソソームにおいて細胞内に送達され、通常、エフェクター部分は、エンドソーム－リソソーム経路を出たか又は脱出した後に活性である。
用語「サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、サポゲニンである親油性アグリコンコアと組み合わせられた１つ以上の親水性グリコン部分を含む両親媒性グリコシドの基を指す。サポニンは、天然に存在してもよいし、合成的（すなわち、天然に存在しない）であってもよい。用語「サポニン」は、天然に存在するサポニン、天然に存在するサポニンの機能性誘導体並びに化学的及び／又は生物工学的合成経路を介して新規に合成されるサポニンを含む。サポニンは、トリテルペン骨格を有し、サポゲニン又はアグリコンとも称される五員環Ｃ３０テルペン骨格である。本発明のコンジュゲート内で、サポニンは、本発明によるコンジュゲートにおいてエフェクター分子ともエフェクター部分ともみなされない。したがって、サポニン及びエフェクター部分を含むコンジュゲートにおいて、エフェクター部分は、コンジュゲートされたサポニンとは異なる分子である。
用語「サポニン誘導体」（「修飾されたサポニン」としても知られる）は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、官能基の酸化、官能基の還元及び／又は別の分子との共有結合の形成（「コンジュゲーション」又は「共有結合性のコンジュゲーション」とも称される）などの１つ以上の化学修飾によって誘導体化されている天然に存在するサポニンに対応する化合物を指す。好ましい修飾は、アグリコンのアルデヒド基の；糖鎖のカルボキシル基の又は糖鎖のアセトキシ基の誘導体化を含む。通常、サポニン誘導体は、天然の対応物を有さず、すなわち、サポニン誘導体は、例えば、植物又は木によって天然に生成されない。用語「サポニン誘導体」は、天然に存在するサポニンの誘導体化によって得られる誘導体並びに１つ以上の化学修飾によって誘導体化されている天然に存在するサポニンに対応する化合物をもたらす化学的及び／又は生物工学的合成経路を介して新規に合成される誘導体を含む。本発明に関連してサポニン誘導体は、サポニン機能性誘導体として理解されるべきである。サポニン誘導体に関連して「機能性」は、サポニン又はサポニン誘導体と合わせて細胞と接触されるエフェクター分子のエンドソーム脱出を強化するサポニン又はサポニン誘導体の能力又は活性として理解される。
用語「アグリコンコア構造」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、１つ又は２つの炭水化物アンテナ又はそれに結合される糖鎖（グリカン）を有しないサポニンのアグリコンコアを指す。例えば、キラ酸は、ＳＯ１８６１、ＱＳ－７及びＱＳ２１に関するアグリコンコア構造である。通常、サポニンのグリカンは、直鎖状又は分岐状グリカンなどの単糖又はオリゴ糖である。
用語「糖鎖」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、グリカン、炭水化物アンテナ、単糖部分（単糖）又は複数の糖部分を含む鎖（オリゴ糖、多糖）のいずれかを指す。糖鎖は、糖部分のみからなる場合があるか又は例えば、ＯＳ－２１中に存在するものなどの４Ｅ－メトキシケイ皮酸、４Ｚ－メトキシケイ皮酸、及び５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）のいずれか１つなどのさらなる部分を含んでもよい。
糖鎖の名称に関連して用語「Ａｐｉ／Ｘｙｌ－」又は「Ａｐｉ－又はＸｙｌ－」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、アピオース（Ａｐｉ）部分を含むか、又はキシロース（Ｘｙｌ）部分を含む糖鎖を指す。
用語「修飾されたサポニンが基づくサポニン」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾されたサポニンをもたらすために修飾されているサポニンを指す。通常、修飾されたサポニンが基づくサポニンは、天然に存在するサポニンであり、修飾されたサポニンをもたらすために化学修飾にかけられる。
用語「サポニンに基づく修飾されたサポニン」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾されたサポニンがもたらされるように化学修飾工程にかけられたサポニンを指し、修飾されたサポニンが作製されたサポニンは通常、天然に存在するサポニンである。
用語「オリゴヌクレオチド」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、とりわけ、ＢＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短い又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの一本鎖分子又は二本鎖分子として提示されるＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、合成核酸を包含する核酸の任意の天然の又は合成的な連なりを指す。本明細書では、用語「オリゴヌクレオチド」はまた、２個以上のヌクレオチドの連なりを指し、すなわち、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドで構成される短いオリゴマーである。例は、ＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに任意の修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノエチレン又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（ＢＮＡＮＣ）としても知られる架橋核酸（ＢＮＡ）などのヌクレオチド類似体を含む核酸の連なりであり、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。
用語「抗体－薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、１つ又は複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ類ＶＨなどの抗体の任意のコンジュゲート、並びに活性な医薬成分、毒素、オリゴヌクレオチド、酵素、小分子薬物化合物などの、ヒト患者などの対象の細胞と接触されるときに治療効果を発揮することができる任意の分子を指す。
用語「抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート」又は「ＡＯＣ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、１つ又は複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ類ＶＨなどの抗体の任意のコンジュゲート、並びにＢＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短い又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの一本鎖分子又は二本鎖分子として提示されるＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、合成核酸を包含する核酸の天然の又は合成的な連なりから選択されるオリゴヌクレオチドなどのヒト患者などの対象の細胞と接触されるときに治療効果を発揮することができる任意のオリゴヌクレオチド分子を指す。
用語「架橋核酸」、若しくは要するに「ＢＮＡ」、又は「ロックド核酸」若しくは要するに「ＬＮＡ」又は２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノエチレン若しくは２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（ＢＮＡＮＣ）は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、修飾されたＲＮＡヌクレオチドを指す。ＢＮＡはまた、「束縛されたＲＮＡ分子」又は「接近し難いＲＮＡ分子」と称される。ＢＮＡ単量体は、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する５員、６員又は７員架橋構造を含有し得る。架橋は、リボースの２’，４’－位で合成的に組み込まれて、２’，４’－ＢＮＡ単量体をもたらす。ＢＮＡ単量体は、当技術分野で知られる標準的なホスホラミダイト化学反応を使用してオリゴヌクレオチドポリマー構造に組み込まれ得る。ＢＮＡは、結合親和性及び安定性の増大を有する構造的に強固なオリゴヌクレオチドである。
用語「単一ドメイン抗体」、又は要するに「ｓｄＡｂ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。本発明のコンジュゲートにおいて、２つ以上のｓｄＡｂが存在してもよく、ｓｄＡｂは、同じ（多価及び単一特異性）であってもよいし、異なってもよい（多価及び／又は例えば、多パラトープ、二パラトープ、多重特異性、二重特異性）。加えて、例えば、３つ以上のｓｄＡｂは、例えば、単一特異性及び多価ｓｄＡｂ並びに異なるエピトープに結合する（例えば、多重特異性又はバイパラトープ）少なくとも１つのさらなるｓｄＡｂの組み合わせである。
リンカーを含む抗体－サポニンコンジュゲートなどにおいて使用される場合の用語「Ｓ」は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームにおいて、したがって、弱酸性条件（ｐＨ＜６．６、例えば、ｐＨ４．０～５．５）下で未変化なままである「安定なリンカー」を表す。
リンカーを含む抗体－サポニンコンジュゲートなどにおいて使用される場合の用語「Ｌ」は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームにおける弱酸性条件（ｐＨ＜６．６、例えば、ｐＨ４．０～５．５）下で切断される「不安定なリンカー」を表す。
明細書及び特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、例えば、組成物中の同様の要素、組成物、成分、又は別々の方法工程間で区別するために使用され、必ずしも逐次的な又は時間的な順序を記載するためのものではない。その用語は、適切な状況下で互換性があり、本発明の実施形態は、別段の指定がない限り、本明細書に記載されるか又は図示される順序以外で機能することができる。
本明細書に記載される本発明の実施形態は、別段の指定がない限り、組み合わせ及び協同作用において機能し得る。
さらに、様々な実施形態は、「好ましい」又は「例えば（ｅ．ｇ．）」又は「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」又は「特に」などと参照されるが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明が実施され得る例示的な様式として解釈されことになる。
特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、例えば、その後に列挙される組成物の要素又は方法工程又は成分に限定されると解釈すべきではなく；ある特定の組成物における他の要素又は方法工程又は成分を排除するものではない。それは、参照されるとおりの記載された特徴、整数、（方法）工程又は構成成分の存在を指定するものと解釈される必要があるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程若しくは構成成分、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、表現「工程Ａ及びＢを含む方法」の範囲は、工程Ａ及びＢのみからなる方法に限定されるべきではなく、むしろ本発明に関して、方法の列挙された工程はＡ及びＢのみであり、さらに特許請求の範囲は、それらの方法工程の均等物を含むものとして解釈されるべきである。したがって、表現「構成成分Ａ及びＢを含む組成物」の範囲は、構成成分Ａ及びＢのみからなる組成物に限定されるべきではなく、むしろ本発明に関して、組成物の列挙された構成成分はＡ及びＢのみであり、さらに特許請求の範囲は、それらの構成成分の均等物を含むものとして解釈されるべきである。
加えて、ある要素又は構成成分に対する不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による参照は、文脈から要素又は構成成分が１つしかないことを明確に要求されない限り、２つ以上の要素又は構成成分が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
用語「サポニナムアルバム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＳＡ１６５７及び主にＳＡ１６４１を含有するギプソフィラ・パニキュラタ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）及びギプソフィラ・アロスティ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ａｒｏｓｔｉｉ）由来のサポニンを含有するＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって製造されるサポニンの混合物を指す。
用語「キラヤサポニン」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）のサポニン画分、したがって、主にＱＳ－１８及びＱＳ－２１を含有する全ての他のＱＳサポニンのための供給源を指す。
「ＱＳ－２１」又は「ＱＳ２１」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ（約６３％）、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ（約３２％）、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ（約３．３％）、及びＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ（約１．７％）の混合物を指す。
同様に、「ＱＳ－２１Ａ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ（約６５％）及びＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ（約３５％）の混合物を指す。
同様に、「ＱＳ－２１Ｂ」は、その通常の科学的意味を有し、本明細書では、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ（約６５％）及びＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ（約３５％）の混合物を指す。
用語「Ｑｕｉｌ－Ａ」は、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の市販されている半精製抽出物を指し、可変量の５０種を超える異なるサポニンを含有し、その多くは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ１８及びＱＳ－２１に見出されるトリテルペン－三糖の部分構造Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－をＣ－３β－ＯＨ基で組み込んでいる。Ｑｕｉｌ－Ａに見出されるサポニンは、ｖａｎ Ｓｅｔｔｅｎ（１９９５）、表２［Ｄｉｒｋ Ｃ．ｖａｎ Ｓｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｒｉｔ ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｒｋｅｎ，Ｇｉｊｓｂｅｒｔ Ｚｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｉｄｅｏｎ Ｆ．Ａ．Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏ－ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｃｔｉｖｅ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｑｕｉｌ Ａ，ＲＡＰＩＤ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ，ＶＯＬ．９，６６０－６６６（１９９５）］において列挙される。Ｑｕｉｌ－Ａ及びキラヤサポニンもまた、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンの画分であり、両方が、大部分は重複している含量を有して多種多様の異なるサポニンを含有する。２つの画分は、２つの画分が異なる精製手順によって得られるため、その具体的な組成が異なる。
用語「ＱＳ１８６１」及び用語「ＱＳ１８６２」は、ＱＳ－７及びＱＳ－７ ａｐｉを指す。ＱＳ１８６１は、１８６１ダルトンの分子質量を有し、ＱＳ１８６２は、１８６２ダルトンの分子質量を有する。ＱＳ１８６２は、Ｆｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１９）表１、列番号２８において記載される［Ｊｕｌｉａｎｅ Ｄｅｉｓｅ Ｆｌｅｃｋ，Ａｎｄｒｅｓａ Ｈｅｅｍａｎｎ Ｂｅｔｔｉ，Ｆｒａｎｃｉｎｉ Ｐｅｒｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅｄｕａｒｄｏ Ａｒｔｕｒ Ｔｒｏｉａｎ，Ｃｒｉｓｔｉｎａ Ｏｌｉｖａｒｏ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｅ Ｇａｓｐａｒｉｎ Ｖｅｒｚａ，Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ ａｎｄ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ：Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９，２４，１７１；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２４０１０１７１］。記載された構造は、ＱＳ－７のａｐｉ－バリアントＱＳ１８６２である。分子質量は、この質量がグルクロン酸でプロトンを含む正式な質量であるため、１８６２ダルトンである。中性ｐＨでは、分子は脱プロトン化される。陰イオンモードの質量分析において測定するとき、測定される質量は１８６１ダルトンである。
（図１Ａ）：標的化された２構成成分のアプローチ（１標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（例えば、リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ、標的細胞への送達及び内部移行のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）に別々にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１が、細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 （図１Ｂ）：標的化された２構成成分のアプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ、標的細胞への送達及び内部移行のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）に別々にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１が、それらの対応する細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 （図１Ｃ）：標的化された２構成成分のアプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ、標的細胞への送達及び内部移行のためにＶＨＨに別々にコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びＶＨＨ－ＳＯ１８６１が、それらの対応する細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 図１Ｄ）：標的化された２構成成分のアプローチ（２標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ、標的細胞への送達及び内部移行のためにＶＨＨ又はｍＡｂに別々にコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びｍＡｂ－ＳＯ１８６１が、それらの対応する細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 （図１Ｅ）：標的化された２構成成分のアプローチ（１標的）。ＳＯ１８６１及び毒素（リボソーム不活性化タンパク質）はそれぞれ、標的細胞への送達及び内部移行のためにＶＨＨ又は抗体（ｍＡｂ）に別々にコンジュゲートされる。１）ＶＨＨ－毒素及びｍＡｂ－ＳＯ１８６１が、細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 （図１Ｆ）：本発明の例示的な分子及びコンジュゲートを示す模式図。抗体の軽鎖に結合された４つのサポニン分子「Ｓ」と共有結合的にコンジュゲートされ、及び抗体の重鎖の定常ドメインに共有結合されるエフェクター分子「Ｅ」を有するＩｇＧ抗体が示される。 （図１Ｇ）：本発明の例示的な分子及びコンジュゲートを示す模式図。４つの三価リンカー（各リンカーは、サポニンに共有結合され、エフェクター分子に共有結合される）と共有結合的にコンジュゲートされたＩｇＧ抗体が示される。三価リンカーは、抗体軽鎖に共有結合される。 （図１Ｈ）：本発明の例示的な分子及びコンジュゲートを示す模式図。２つの三価リンカー（各リンカーは、サポニンに共有結合され、エフェクター分子に共有結合される）と共有結合的にコンジュゲートされた単一ドメイン抗体が示される。 （図１Ｉ）：本発明の例示的な分子及びコンジュゲートを示す模式図。三価リンカー（三価リンカーは、サポニンに共有結合され、エフェクター分子に共有結合される）と共有結合的にコンジュゲートされた単一ドメイン抗体が示される。 （図１Ｊ）：（Ｓ）ｎ－（Ｌ）（Ｅ）の概念：ｍＡｂ－（ＳＯ１８６１）ｎ（タンパク質毒素）ｍ。システイン残基（Ｃｙｓ）で共有結合的に連結されたＳＯ１８６１及びリジン残基のタンパク質毒素（リボソーム不活性化タンパク質）の両方が、標的細胞への送達及び内部移行のために同じ抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（Ｌｙｓ－タンパク質毒素）２が、その対応する細胞表面受容体に結合し、２）コンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドリソソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質への毒素の放出が発生し、５）毒素が細胞死を誘導する。 （図１Ｋ）：（Ｓ）ｎ－（Ｌ）（Ｅ）の概念：ｍＡｂ－（ＳＯ１８６１）ｎ（アンチセンスＢＮＡオリゴ）ｍ。システイン残基（Ｃｙｓ）に結合されたＳＯ１８６１及びリジン残基に結合されたアンチセンスＢＮＡオリゴヌクレオチドの両方が、標的細胞への送達及び内部移行のために同じ抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。１）ｍＡｂ－（Ｃｙｓ－ＳＯ１８６１）４（Ｌｙｓ－ＢＮＡオリゴ）２が、その対応する細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドソーム、リソソーム及びエンドリソソームｐＨ並びに適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドソーム、リソソーム及びエンドリソソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質へのＢＮＡオリゴの放出が発生し、５）標的遺伝子サイレンシングが誘導される。 （図１Ｌ）：（Ｓ）ｎ－（Ｌ）（Ｅ）の概念：ｍＡｂ－（ＳＯ１８６１－足場－アンチセンスＢＮＡオリゴ）ｎ。（ＳＯ１８６１－三官能性リンカー－ＢＮＡオリゴ）ｎは、標的細胞への送達及び内部移行のための抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、ＩｇＧ、又はＶＨＨなどのｓｄＡｂである。１）ｍＡｂ－（ＳＯ１８６１－三官能性リンカー－ＢＮＡオリゴ）４が、その対応する細胞表面受容体に結合し、２）両方のコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスが発生し（受容体へのコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）、３）低いエンドソームｐＨ及び適切な濃度で、ＳＯ１８６１が、エンドソーム脱出が可能になるように活性になり、４）細胞質へのＢＮＡオリゴの放出が発生し、５）標的遺伝子サイレンシングが誘導される。本発明のコンジュゲートに関連して用語「足場」は、サポニン分子及び／又はタンパク質毒素若しくはオリゴヌクレオチドなどのエフェクター分子などの１つ又は複数のさらなる分子に共有結合するための１つ又は複数の化学基を有し、及びＩｇＧ又はｓｄＡｂなどの抗体などのタンパク質に共有結合的にカップリングするための少なくとも１つの化学基を有するオリゴマー分子又はポリマー分子として理解されることになる。 （図２）：ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又は１０ｐＭ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。グラフに続いて示される図２Ｂに対する凡例はまた図２Ａにも適用される。 （図３）：ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するトラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４）又はＣＤ７１－サポリン（ＤＡＲ４）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。グラフに続いて示される図３Ｂに対する凡例はまた図３Ａにも適用される。 （図４）：ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＶＨＨ（ＨＥＲ２）－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。グラフに続いて示される図４Ｂに対する凡例はまた図４Ａにも適用される。 （図５）：ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。グラフに続いて示される図５Ｂに対する凡例はまた図５Ａにも適用される。 （図６）：Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＝／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 （図７）：ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／ＣＤ７１＋）（Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）（Ｂ）に対するＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 （図８）：腫瘍標的化タンパク質毒素送達は、担腫瘍マウスにおけるインビボでの腫瘍体積の減少及び腫瘍増殖の阻害をもたらす。Ａ）Ａ４３１担腫瘍マウスにおけるセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２の用量漸増（腹腔内、ｉ．ｐ．）は、対照と比較して２６日目に腫瘍体積の減少を明らかにしている。Ｂ、Ｃ）Ａ４３１担腫瘍マウスにおけるセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２の（腹腔内、ｉ．ｐ．（Ｂ）又は静脈内 ｉ．ｖ．（Ｃ））の用量漸増は、対照と比較して腫瘍増殖の減少を明らかにしている。本発明の共有結合性コンジュゲートに関連して用語「Ｃｙｓ－Ｌ－」は、システイン側鎖に対する共有結合として理解されることになり、結合は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームに存在するような酸性条件下で不安定であり及び切断可能である。本発明の共有結合性コンジュゲートに関連して用語「Ｌｙｓ－Ｓ－」は、リジン側鎖に対する共有結合として理解されることになり、結合は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームに存在するような酸性条件下で安定であり及び切断不可能である。 （図８）：腫瘍標的化タンパク質毒素送達は、担腫瘍マウスにおけるインビボでの腫瘍体積の減少及び腫瘍増殖の阻害をもたらす。Ａ）Ａ４３１担腫瘍マウスにおけるセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２の用量漸増（腹腔内、ｉ．ｐ．）は、対照と比較して２６日目に腫瘍体積の減少を明らかにしている。Ｂ、Ｃ）Ａ４３１担腫瘍マウスにおけるセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２の（腹腔内、ｉ．ｐ．（Ｂ）又は静脈内 ｉ．ｖ．（Ｃ））の用量漸増は、対照と比較して腫瘍増殖の減少を明らかにしている。本発明の共有結合性コンジュゲートに関連して用語「Ｃｙｓ－Ｌ－」は、システイン側鎖に対する共有結合として理解されることになり、結合は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームに存在するような酸性条件下で不安定であり及び切断可能である。本発明の共有結合性コンジュゲートに関連して用語「Ｌｙｓ－Ｓ－」は、リジン側鎖に対する共有結合として理解されることになり、結合は、ヒト腫瘍細胞などのヒト細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソームに存在するような酸性条件下で安定であり及び切断不可能である。 （図９）：担腫瘍マウスにおける腫瘍標的化アンチセンスＢＮＡオリゴヌクレオチド送達及び遺伝子サイレンシング。Ａ４３１担腫瘍マウスにおける３０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）１，８は、対照と比較して、効率的な腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシングを誘導したことを明らかにしている。 （図１０）：担腫瘍マウスにおける腫瘍標的化アンチセンスＢＮＡオリゴヌクレオチド送達及び遺伝子サイレンシング。Ａ４３１担腫瘍マウスにおける３０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７は、対照と比較して、効率的な腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシングを誘導したことを明らかにしている。 （図１１）：癌細胞（腫瘍細胞）においてＨＥＲ２又はＥＧＦＲ標的化タンパク質毒素送達及び細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－）に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７治療及び対照。注釈：図１１Ｂに関する凡例はまた、図１１Ａにおけるグラフに関する。Ｃ、Ｄ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２，０又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０治療及び対照。注釈：図１１Ｄに関する凡例はまた、図１１Ｃにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１１）：癌細胞（腫瘍細胞）においてＨＥＲ２又はＥＧＦＲ標的化タンパク質毒素送達及び細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－）に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７治療及び対照。注釈：図１１Ｂに関する凡例はまた、図１１Ａにおけるグラフに関する。Ｃ、Ｄ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２，０又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０治療及び対照。注釈：図１１Ｄに関する凡例はまた、図１１Ｃにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１１）：癌細胞（腫瘍細胞）においてＨＥＲ２又はＥＧＦＲ標的化タンパク質毒素送達及び細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－）に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７治療及び対照。注釈：図１１Ｂに関する凡例はまた、図１１Ａにおけるグラフに関する。Ｃ、Ｄ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２，０又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０治療及び対照。注釈：図１１Ｄに関する凡例はまた、図１１Ｃにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１１）：癌細胞（腫瘍細胞）においてＨＥＲ２又はＥＧＦＲ標的化タンパク質毒素送達及び細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－）に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７治療及び対照。注釈：図１１Ｂに関する凡例はまた、図１１Ａにおけるグラフに関する。Ｃ、Ｄ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２，０又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０治療及び対照。注釈：図１１Ｄに関する凡例はまた、図１１Ｃにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１２）：本発明による癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達及び遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，８治療及び対照。注釈：図１２Ｂに関する凡例はまた、図１２Ａにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１２）：本発明による癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達及び遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，８治療及び対照。注釈：図１２Ｂに関する凡例はまた、図１２Ａにおけるグラフに関する。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１３）：癌細胞におけるＨＥＲ２標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達及び遺伝子サイレンシング。ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，５治療及び対照。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１４）：癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達及び遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するセツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７治療及び対照。注釈：各細胞株の標的受容体発現データ（ＦＡＣＳ分析により決定される）については、表Ａ２を参照されたい。 （図１５）：１－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療的組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の１００～４００倍低下された濃度が、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、３００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に細胞を死滅させる。１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、両方のセツキシマブコンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体について競合するため、治療的組み合わせと比較してより効率的である。両方のセツキシマブコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。注釈：図１５Ｂに示される凡例はまた、図１５Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１５Ｄに示される凡例はまた、図１５Ｃにおけるグラフに関する。 （図１５）：１－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ高発現）。治療的組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋）及びＣａＳＫｉ（ＥＧＦＲ＋＋）におけるＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の１００～４００倍低下された濃度が、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、３００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンと対照的に細胞を死滅させる。１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンは、両方のセツキシマブコンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体について競合するため、治療的組み合わせと比較してより効率的である。両方のセツキシマブコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。注釈：図１５Ｂに示される凡例はまた、図１５Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１５Ｄに示される凡例はまた、図１５Ｃにおけるグラフに関する。 （図１６）：１－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴点は、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＥＧＦＲ受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。注釈：図１６Ｂに示される凡例はまた、図１６Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１６Ｄに示される凡例はまた、図１６Ｃにおけるグラフに関する。 （図１６）：１－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞におけるＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴点は、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＥＧＦＲ受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は細胞死滅を誘導する。注釈：図１６Ｂに示される凡例はまた、図１６Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１６Ｄに示される凡例はまた、図１６Ｃにおけるグラフに関する。 （図１７）：１－標的２－構成成分（ＨＥＲ２高発現）。治療的組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ）６７３ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の１０００倍低下された濃度が、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｂ）９．４ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、１０ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に細胞を死滅させる。１０７５ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、両方のトラスツズマブコンジュゲートが同じＨＥＲ２受容体について競合するため、治療的組み合わせと比較してより効率的である。両方のトラスツズマブコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図１８）：１－標的２－構成成分（ＨＥＲ２発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＨＥＲ２受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。注釈：図１８Ｂに示される凡例はまた、図１８Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１８Ｄに示される凡例はまた、図１８Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図１８）：１－標的２－構成成分（ＨＥＲ２発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＨＥＲ２受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。注釈：図１８Ｂに示される凡例はまた、図１８Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１８Ｄに示される凡例はまた、図１８Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図１９）：２－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療的組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の１００倍低下された濃度が、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、３００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に細胞を死滅させる。１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、両方のコンジュゲートが同じ受容体について競合しないため、治療的組み合わせ、２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して同等の細胞死滅効率を有する。両方のコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。注釈：図１９Ｂに示される凡例はまた、図１９Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１９Ｄに示される凡例はまた、図１９Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図１９）：２－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ高発現及びＨＥＲ２低発現）。治療的組み合わせによるＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋＋／ＨＥＲ２＋／－）及びＣａｓｋｉ（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の１００倍低下された濃度が、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、３００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと対照的に細胞を死滅させる。１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンは、両方のコンジュゲートが同じ受容体について競合しないため、治療的組み合わせ、２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンと比較して同等の細胞死滅効率を有する。両方のコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。注釈：図１９Ｂに示される凡例はまた、図１９Ａにおけるグラフに関する。注釈：図１９Ｄに示される凡例はまた、図１９Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２０）：２－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は、効率的な細胞の死滅を誘導する。低ＥＧＦＲ受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的である。注釈：図２０Ｂに示される凡例はまた、図２０Ａにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２０）：２－標的２－構成成分（ＥＧＦＲ低発現及びＨＥＲ２発現なし／低発現）。治療的組み合わせによるＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたセツキシマブ－ＳＯ１８６１滴定は、トラスツズマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたトラスツズマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を増強しないが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は、効率的な細胞の死滅を誘導する。低ＥＧＦＲ受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的である。注釈：図２０Ｂに示される凡例はまた、図２０Ａにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２１）：２－標的２－構成成分（ＨＥＲ２高発現及びＥＧＦＲ低発現）。治療的組み合わせによるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、コンジュゲートされたＳＯ１８６１の４００倍低下された濃度が、ＥＧＦジアンチンによる細胞死滅を誘導するために、コンジュゲートされていないＳＯ１８６１に対して必要となることを示す。Ｂ）９．４ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたＥＧＦジアンチン滴定は、１０ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンと対照的に細胞を死滅させることができる。１０７５ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンは、両方のコンジュゲートが同じ受容体について競合しないため、治療的組み合わせ、９．４ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋ＥＧＦジアンチンと比較して同等の細胞死滅効率を有する。両方のコンジュゲートの同時に標的化される送達のみが、いずれかのコンジュゲート単独による単剤療法と対照的に効率的な細胞死滅をもたらす。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２２）：２－標的２－構成成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低又は高発現）。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＨＥＲ２受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高ＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、これは、細胞死滅活性に関するボトルネックが、ＨＥＲ２発現レベルが低すぎて、標的細胞内部でのＳＯ１８６１が不十分となり、エンドソーム脱出に切り替えることができないことを示している。注釈：図２２Ｂに示される凡例はまた、図２２Ａにおけるグラフに関する。注釈：図２２Ｄに示される凡例はまた、図２２Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２２）：２－標的２－構成成分（ＨＥＲ２低発現及びＥＧＦＲ低又は高発現）。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋）及びＡ４３１（ＨＥＲ２＋／－）細胞におけるＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度と組み合わせたトラスツズマブ－ＳＯ１８６１滴定は、セツキシマブ－サポリンによる細胞死滅を誘導しない。Ｃ、Ｄ）１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせたセツキシマブ－サポリン滴定は、細胞死滅を誘導できない。低ＨＥＲ２受容体発現は、十分なＳＯ１８６１が抗体媒介性送達を介して送達されることに関して禁制的であるが、１５００ｎＭのコンジュゲートされていないＳＯ１８６１は効率的な細胞死滅を誘導する。セツキシマブ－サポリンの送達のための高ＥＧＦＲ受容体発現レベル（Ｄ）でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の存在下でその効力を変化させず、これは、細胞死滅活性に関するボトルネックが、ＨＥＲ２発現レベルが低すぎて、標的細胞内部でのＳＯ１８６１が不十分となり、エンドソーム脱出に切り替えることができないことを示している。注釈：図２２Ｂに示される凡例はまた、図２２Ａにおけるグラフに関する。注釈：図２２Ｄに示される凡例はまた、図２２Ｃにおけるグラフに関する。ＳＰＴ００１は、ＳＯ１８６１である。 （図２３）：２－標的２－構成成分対Ｔ－ＤＭ１。高ＥＧＦＲ発現及び低ＨＥＲ２発現を有する細胞（Ａ４３１）は、治療的組み合わせにより効率的に死滅させられるが、Ｔ－ＤＭ１は、そのような低毒性濃度で効果的ではない。Ｔ－ＤＭ１は、トラスツズマブ－エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））であり、抗体当たり３．５個のＤＭ１毒素分子を保有する。 （図２４Ａ－Ｅ）：トラスツズマブ（図２４Ａ）、セツキシマブ（図２４Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図２４Ｃ）、遊離毒素サポリン（図２４Ｄ）及びジアンチン（図２４Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｄ）、及び遊離サポニンＳＯ１８６１と合わせられた非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｅ）が、指定の細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触されるときの相対的な細胞生存率を示す。注釈：図２４Ｃに示される凡例はまた、図２４Ａ及び２４Ｂにおける曲線に関する。 （図２４Ａ－Ｅ）：トラスツズマブ（図２４Ａ）、セツキシマブ（図２４Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図２４Ｃ）、遊離毒素サポリン（図２４Ｄ）及びジアンチン（図２４Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｄ）、及び遊離サポニンＳＯ１８６１と合わせられた非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｅ）が、指定の細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触されるときの相対的な細胞生存率を示す。注釈：図２４Ｃに示される凡例はまた、図２４Ａ及び２４Ｂにおける曲線に関する。 （図２４Ａ－Ｅ）：トラスツズマブ（図２４Ａ）、セツキシマブ（図２４Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図２４Ｃ）、遊離毒素サポリン（図２４Ｄ）及びジアンチン（図２４Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｄ）、及び遊離サポニンＳＯ１８６１と合わせられた非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｅ）が、指定の細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触されるときの相対的な細胞生存率を示す。注釈：図２４Ｃに示される凡例はまた、図２４Ａ及び２４Ｂにおける曲線に関する。 （図２５）：１Ｔ２Ｃインビボ活性。Ａ４３１担腫瘍マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の１Ｔ２Ｃの組み合わせは、対照と比較して、強力な腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシングを明らかにしている。 （図２６）：１Ｔ２Ｃインビボ活性。ＰＤＸ腫瘍マウスモデル（高ＨＥＲ２発現）における４０ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋０．０２／０．０３ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリンの１Ｔ２Ｃの組み合わせは、効果的な腫瘍増殖阻害を示す。 （図２７）：Ａ４３１担腫瘍マウスモデルで試験される２Ｔ２構成成分系は、腫瘍退縮を明らかにしている。 （図２８）：Ａ４３１担腫瘍マウスモデルで試験される２Ｔ２構成成分系は、腫瘍退縮及び根絶を明らかにしている。 （図２９）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７滴定＋固定された濃度の５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の７５ｎＭ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７及び対照。凡例及びｙ軸は、Ａ、Ｂに関して同じであり、凡例及びｙ軸は、図Ｃ及びＤに関して同じである。 （図２９）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＣａＳＫｉ細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）Ａ４３１細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７滴定＋固定された濃度の５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）Ｃａｓｋｉ細胞に対するトラスツズマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の７５ｎＭ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７及び対照。凡例及びｙ軸は、Ａ、Ｂに関して同じであり、凡例及びｙ軸は、図Ｃ及びＤに関して同じである。 （図３０）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７滴定＋固定された濃度の５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の７５ｎＭ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７及び対照。凡例及びｙ軸は、図３０Ａ及び図３０Ｂに関して同じである。 （図３０）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）（Ｂ、Ｄ）におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＨｅＬａ細胞に対するセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７滴定＋固定された濃度の５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）Ａ２０５８細胞に対するトラスツズマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の７５ｎＭ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７及び対照。凡例及びｙ軸は、図３０Ａ及び図３０Ｂに関して同じである。 （図３１）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ）ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するＥＧＦジアンチン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。 （図３２）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。凡例及びｙ軸は、Ｃ及びＤに関して同じである。 （図３２）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＥＧＦジアンチン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。凡例及びｙ軸は、Ｃ及びＤに関して同じである。 （図３３）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｂ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ）ＳＫＢＲ３細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１０ｐＭ セツキシマブ－サポリン及び対照。Ｂ）ＳＫＢＲ３細胞に対するセツキシマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。 （図３４）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１０ｐＭ セツキシマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。凡例及びｙ軸は、Ａ、Ｂに関して同じであり、凡例及びｙ軸は、Ｃ及びＤに関して同じである。 （図３４）：２－標的２－構成成分。本発明による治療的組み合わせによるＪＩＭＴ－１細胞（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）（Ａ、Ｃ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）（Ｂ、Ｄ）におけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ標的化細胞死滅。Ａ、Ｂ）ＪＩＭＴ－１細胞に対するトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４滴定＋固定された濃度の１０ｐＭ セツキシマブ－サポリン及び対照。Ｃ、Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するセツキシマブ－サポリン滴定＋固定された濃度の２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び対照。凡例及びｙ軸は、Ａ、Ｂに関して同じであり、凡例及びｙ軸は、Ｃ及びＤに関して同じである。 ＳＯ１８６１＋ＶＨＨ－毒素による細胞死滅アッセイ。 ＳＯ１８６１＋ＶＨＨ－毒素による細胞死滅アッセイ。 Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＣ）Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－）に対する二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）、セツキシマブ－サポリン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はセツキシマブ－サポリン＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＣ）Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－）に対する二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）、セツキシマブ－サポリン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はセツキシマブ－サポリン＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）、Ｂ）Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＣ）Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－）に対する二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）、セツキシマブ－サポリン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はセツキシマブ－サポリン＋セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＢ）Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対するＳＯ１８６１＋１又は５ｐＭ 二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン又はセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）＋１又は５ｐＭ 二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチンによる細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ＋／－）、Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ＋／－）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２－）に対するセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）＋５０ｐＭ 二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン（組換え融合タンパク質）又はトラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）＋５０ｐＭ 二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン（組換え融合タンパク質）の本発明による組み合わせ治療による細胞死滅（ＭＴＳ）アッセイ。 ＶＨＨ－Ｌ－ＢＮＡの合成。 三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）、中間体２、３の合成。 三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）、中間体４の合成。 三官能性リンカー－（デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）、中間体５、６の合成。 三官能性リンカー－（デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）の合成。 ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン（コンジュゲート）を、単独又は４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ若しくは７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定し、標的化されたタンパク質毒素（ジアンチン）に媒介される細胞死滅は、Ａ）Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）細胞、及びＢ）Ａ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞に対して決定された。「ＳＰＴ００１」は、サポニンＳＯ１８６１である。
生理活性分子（例えば、エフェクター分子）が機能するために、分子は、例えば、血清中において、細胞表面の外部又は細胞若しくはオルガネラの内部にあるその標的と結合することが可能である必要がある。ほとんど全てのタンパク質に基づく標的化毒素の活性部分は、例えば、標的細胞の細胞質ゾルに入るか又はその標的調節性の効果を媒介しなければならない。多くの集合において、毒素は、（１）標的化部分が、内部移行が不十分であり、及び細胞の外部に結合されたままであり、（２）内部移行後に細胞表面に戻って再利用されるか又は（３）それが分解されるエンドリソソームに輸送されるため、無効なままである。これらの基本的な問題は、何十年もの間知られており、５００を超える標的化毒素が、過去数十年に調査されており、問題はまだ解決されておらず、一対の抗体標的化タンパク質毒素のみが、重篤な毒性に関して警告ラベルを伴ってはいるが市場に承認されている。モキセツモマブパスードトクス－ｔｄｆｋ（ＬＵＭＯＸＩＴＩ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＬＰ）は、現在までにＦＤＡによって再発性又は難治性ヘアリー細胞白血病のために承認されている。そのような承認されたＡＤＣの他のものは、Ｅｌｚｏｎｒｉｓ、Ｏｎｔａｋである。
これらの問題を克服するために、小胞体にある生合成経路の細胞内膜輸送複合体に毒素を誘導するアプローチ及びエンドソーム、すなわち、細胞内のエンドサイトーシス経路の区画の膜の完全性を破壊するか又は弱め、それによりエンドソーム脱出を促進する技術を含む多くの戦略が記載されている。これは、リソソーム向性アミン、カルボキシイオノフォア、カルシウムチャネルアンタゴニスト、ウイルス、細菌、植物、動物、ヒト及び合成源の様々な細胞透過性ペプチド、他の有機分子並びに光誘導性の手法の使用を含む。標的化毒素の有効性は通常、細胞培養物中で１００又は１０００倍、例外的な場合、百万倍を超えて増大されるが、他の物質とエンドソーム脱出エンハンサーを同時投与するための要件は、さらなる副作用、標的特異性の喪失、治療域を決定する難しさ及び細胞型依存的変動を含む新たな問題を抱えている。
物理化学的手法を含む全ての戦略は、多かれ少なかれ膜と直接的に相互作用し、本質的に小さい化学分子、二次代謝物、ペプチド及びタンパク質を含むエンハンサー分子を必要とする。全てのこれらの物質の共通の特徴は、それら自体が標的細胞特異的でなく、標的化毒素とは異なる動態で分布することである。これは、既存のアプローチの１つの主要な欠陥である。
本発明の第１の目標は、増加した治療域を有する改良型ＡＤＣ及びＡＯＣを提供すること、及び、例えば、標的細胞の外部から前記細胞への送達が考慮される場合、又はより具体的には前記標的細胞の細胞質ゾルにおけるエフェクター分子の送達が考慮される場合、エフェクター分子の有効量又は用量の送達のための改良型ＡＤＣ及びＡＯＣを提供することである。本発明の第２の目標は、ＥＧＦ、サイトカイン、Ｈｅｒ２標的化ＶＨＨ又はＩｇＧ、ＥＧＦＲ標的化ＩｇＧなどのエフェクター分子及びリガンド、又は活性ドメイン、その活性誘導体若しくは活性断片、好ましくは、例えば、標的腫瘍細胞のための１つ以上のＶＨＨなどのｓｄＡｂ若しくは複数のｓｄＡｂを含むコンジュゲートで治療されることになる疾患に罹患している（ヒト）患者の治療の改善された方法を提供すること、すなわち、例えば、標的腫瘍細胞の細胞質ゾルにおいて送達されることになるエフェクター分子を含むＡＤＣ又はＡＯＣの治療域を改善することである。複数のｓｄＡｂは、細胞表面分子の同じコピーなどの細胞表面分子の同じ型に又は同じ細胞上に存在する細胞表面分子の異なるコピーに結合することができるか、又は２つのｓｄＡｂなどの複数のｓｄＡｂは、第１の細胞表面分子及び同じ細胞上に存在する異なる第２の細胞表面分子に結合することができる。複数のｓｄＡｂは、細胞表面分子上の同じ結合部位に対して多価であってもよく、バイパラトピックなどのマルチパラトピックであってもよく、及び／又は同じ細胞に存在する第１の細胞表面分子及び第２の細胞表面分子に対して二重特異的などの多重特異的であってもよい。２つのｓｄＡｂ（第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂ）などの複数のｓｄＡｂは、本発明のコンジュゲートの結合のために選択される単一の細胞に存在する同じ又は異なる結合部位に対するそれらの結合能について選択される。少なくとも２つのｓｄＡｂに関する結合部位は、同じ細胞に存在する。通常、結合部位は、腫瘍細胞特異的細胞表面受容体などの細胞表面受容体におけるエピトープである。
本発明の目的は、抗癌療法などの療法における使用のためのエフェクター分子活性強化分子及びＡＤＣ又はＡＯＣの組み合わせであるコンジュゲートを提供することである。本発明のそのようなコンジュゲートの提供によって、ＡＤＣ又はＡＯＣなどのコンジュゲートの一部であるエフェクター分子の治療域は、効率的に広げられる。
上の目的の少なくとも１つは、エフェクター分子活性強化分子をさらに含むコンジュゲートである改良型ＡＤＣ及び改良型ＡＯＣを提供することによって達成される。
本発明は、特定の実施形態に関して記載されることになるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本発明は、いくつかの実施形態の点で記載されているが、その代替物、変更形態、並べ換え及び均等物は、明細書を読むとき並びに図面及びグラフの調査時に当業者に明らかであろう。本発明は、図示される実施形態に何ら限定されない。変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される範囲から逸脱せずになされ得る。
本発明者らは、抗体薬物コンジュゲート又は抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートなどのコンジュゲートの治療域が、コンジュゲートが投与される担腫瘍哺乳動物（マウス）に投与されるとき、前記コンジュゲートが、少なくとも１つの共有結合されたサポニンを含むときに増大することを確立した（例えば、エフェクター分子及び抗体に共有結合されたサポニンの効果の一連のインビトロでの腫瘍細胞及びインビボでの腫瘍モデルの例については実施例の節における図８～１４を参照のこと）。サポニンは、抗体並びにタンパク質毒素及びＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドなどのエフェクター分子とコンジュゲートされる。本発明者らは、完全長インタクトＩｇＧなどの抗体、又はＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの細胞表面分子に結合するためのリガンドと本発明のサポニンをコンジュゲートすることが、その細胞表面にある細胞表面分子を露出させる標的細胞の細胞表面でのサポニンの細胞特異的送達、その後の細胞エンドソーム、エンドリソソーム、リソソームなどの細胞内部及び最終的には細胞の細胞質ゾル中へのサポニンの送達のためのコンジュゲートを提供することを最初に確立し、決定した。そのような細胞標的化サポニンコンジュゲートの例は、例えば、本明細書の下の実施例の節において概説されるとおり、サポニン－ＶＨＨコンジュゲートに関して図２～５並びに図５～７、１５～２３、及び２５～３４において提供される。サポニンは、ＥＧＦ、Ｈｅｒ２標的化ＶＨＨ又はＩｇＧ、ＥＧＦＲ標的化ＩｇＧ、配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＶＨＨ ７Ｄ１２、配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＶＨＨ ９Ｇ８、配列番号７３として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＥＧＦＲに結合する共有結合的に連結された直列のバイパラトピックＶＨＨ ７Ｄ１２－９Ｇ８などのリガンドにコンジュゲートされる。
本発明のコンジュゲートにおける細胞表面分子結合分子としてのｓｄＡｂ又は完全長抗体若しくは異なる免疫グロブリン（Ｉｇ）形式を含む本発明のコンジュゲートは、好ましくは、及び全ての例示的な例において、共有結合的に、より好ましくは、（切断可能）リンカーを介してそれに結合された本発明のサポニンなどの少なくとも１つのグリコシドを有する。サポニンは、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、おそらくエフェクター部分の活性が望まれる細胞質ゾルへのエンドソーム脱出を強化することによって、細胞表面分子標的化分子（抗体、ｓｄＡｂ）に結合されたエフェクター部分の治療的有効性を増強する。このようにして、既に、ＡＤＣ又はＡＯＣの従来の用量よりも低いエフェクター分子の用量で、すなわち、本発明のコンジュゲートの低い用量で、サポニンを含むコンジュゲートの存在の影響下で治療効果が確立され、それによってサポニンが標的化される細胞の近傍、標的化される細胞及び／又は標的化される細胞内部に運ばれる。標的化される細胞は、例えば、腫瘍細胞又は自己免疫細胞又はＢ細胞疾患関連Ｂ細胞などの疾患細胞である。エフェクター部分は、例えば、ＡＤＣの一部としての毒素又は本発明によるＡＯＣの一部としてのアンチセンスＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドである。
本発明の第１の態様は、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞中に移行させるためのコンジュゲートであって、直接的に又は少なくとも１つのリンカーを介して互いに共有結合された、細胞に移行されることになる少なくとも１つのエフェクター分子と、少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、少なくとも１つのサポニンとを含み、少なくとも１つのサポニンが、モノ－デスモサイドトリテルペングリコシドであるか又はバイ－デスモサイドトリテルペングリコシドであり、ｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合することができるコンジュゲートに関する。
本発明者らは、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性画分中のサポニンなどのサポニン、ＱＳ－２１、ＳＡ１６４１、ＳＯ１８６１を、細胞表面分子標的化分子、例えば、抗体、ｓｄＡｂに、例えば、三官能リンカー、例えば、構造Ａの三官能性リンカー（本明細書で下に示される）を介して、又は共有結合したサポニンを含む足場のオリゴマー又はポリマー構造を介して共有結合的にカップリングすることが、コンジュゲート中の共有結合的にカップリングされたサポニンの影響下で本発明のコンジュゲートによって含まれる毒素などのエフェクター部分によって発揮される細胞毒性の向上をもたらすことを本明細書で開示している。
したがって、本発明のある態様は、エンドソーム脱出強化分子、すなわち、サポニン、エフェクター部分及び結合分子、例えば、ｓｄＡｂを含むコンジュゲート、したがって、グリコシド分子及びエフェクター分子が、例えば、エンドソーム脱出強化コンジュゲート中の１つ及び同じ結合分子に結合され、エンドソーム脱出強化コンジュゲートが、標的細胞特異的表面分子又は構造に特異的に結合することができ、それによりコンジュゲート及び標的細胞特異的表面分子の複合体の受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する（受容体に対するコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）コンジュゲートに関する。好ましくは、エンドソーム脱出強化コンジュゲートにおけるサポニン及びエフェクター部分の組み合わせは、前記サポニンによる前記エフェクター部分のエンドソーム脱出の増強を可能にする。そうすることによって、コンジュゲートは、好ましくは、サポニンを伴わずに結合分子及びエフェクター部分を含むＡＤＣと比較して、エフェクター分子の効果を向上させる。
本発明をより詳細に説明するために、物質の細胞への取り込みのプロセス及び本発明において使用される用語法がまず記載される。小胞出芽による細胞への細胞外物質の取り込みは、エンドサイトーシスと呼ばれる。前記小胞出芽は、（１）細胞質タンパク質クラスリンによって媒介される受容体依存的リガンド取り込み、（２）コレステロール結合タンパク質カベオリンによって媒介される脂質ラフト取り込み、（３）非特異的な液体取り込み（ピノサイトーシス）、又は（４）非特異的な粒子取り込み（食作用）によって特徴付けられ得る。全ての種類のエンドサイトーシスは、小胞輸送の以下の細胞プロセス及びエンドサイトーシス経路と呼ばれる物質ソーティングに行き当たる。エンドサイトーシス経路は、複雑であり、完全には理解されていない。以前は、オルガネラは新規に形成され、エンドサイトーシス経路を経て次のオルガネラに成熟すると考えられていた。現在では、エンドサイトーシス経路は、小胞輸送によって接続される安定した区画を含むという仮説が立てられている。区画は、細胞のための必須の機能の特定のセットに特定化される複雑な多機能性膜オルガネラである。小胞は、組成においてより単純な一過性のオルガネラであるとみなされ、既存の区画から出芽することによって新規に形成する膜に封入された入れ物として定義される。区画と対照的に、小胞は、生理的に不可逆的な一連の生化学的変化である成熟を経てもよい。初期エンドソーム及び後期エンドソームは、エンドサイトーシス経路において安定な区画となるが、初期エンドサイトーシス小胞、ファゴソーム、多胞体（エンドソームキャリア小胞とも呼ばれる）、分泌顆粒、及びリソソームでさえ小胞となる。エンドサイトーシス小胞は、最も顕著にクラスリン被覆小窩から細胞膜に生じ、まず初期エンドソームと融合し、およそｐＨ６．５の主要なソーティング区画である。内部移行されたカーゴ及び膜の大部分は、リサイクリング小胞（リサイクリング経路）を介して細胞膜に戻って再利用される。分解されるべき構成成分は、多胞体を介して酸性の後期エンドソーム（６未満のｐＨ）に輸送される。リソソームは、成熟リソソーム酵素を構築し、必要な場合にそれらを後期エンドソーム区画に送達することができる小胞である。得られたオルガネラは、ハイブリッドオルガネラ又はエンドリソソームと呼ばれる。リソソームは、リソソーム再編成と称されるプロセスにおいてハイブリッドオルガネラを出芽する。後期エンドソーム、リソソーム、及びハイブリッドオルガネラは、非常に動的なオルガネラであり、その間の区別は難しい場合が多い。形質膜陥入した分子の分解は、エンドリソソーム内部で起こる。エンドソーム脱出は、エンドサイトーシス経路、好ましくは、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、又はリサイクリング経路に由来するあらゆる種類の区画又は小胞の内腔から、物質が能動的又は受動的に細胞質に放出されることである。したがって、エンドソーム脱出は、中間体及びハイブリッドオルガネラを含む、エンドソーム、エンドリソソーム又はリソソームからの放出を含むが、これらに限定されない。細胞質ゾルに入った後、前記物質は、核などの他の細胞単位に移動する可能性がある。本発明に関連してグリコシド分子（サポニン）は、エフェクター分子の効果を、特に、エンドソーム脱出を促進することによって強化することができる化合物である。グリコシド分子は、エンドサイトーシス経路及びリサイクリング経路の区画及び小胞の膜と相互作用し、それらを前記エフェクター分子が漏れるようにして、エンドソーム脱出の増強をもたらす。
用語「エフェクター分子の効果を改善すること」は、サポニンが、好ましくは、その標的結合を可能にするか又は向上させることによって、エフェクター分子の機能的有効性（例えば、毒素又は薬物の治療指数；生物工学的プロセスにおける修飾因子の代謝有効性；細胞培養調査実験における遺伝子のトランスフェクションの有効性）を増大させることを意味する。抗原特異的免疫応答の加速、延長、又は強化は含まれないことが好ましい。治療的有効性は、より少ない投与及び／又はより少ない副作用を伴うより強力な治療効果を含むが、これに限定されない。「エフェクター分子の効果を改善すること」はまた、効果の欠如のために使用できなかった（例えば、エフェクター分子であると知られなかった）エフェクター分子が、本発明と組み合わせて使用されるときに効果的になることを意味し得る。本発明によって提供されるとおりの有益であるか又は望ましく、１つのコンジュゲートにおけるエフェクター部分及びサポニンの組み合わせに起因し得る任意の他の効果は、「改善された効果」であるとみなされる。本発明の文脈において、本発明のサポニンは、本発明のコンジュゲートにおけるエフェクター分子の機能的有効性の「エンハンサー」である。
本発明に至るまでの例えば、サポニンなどのグリコシドによる標的化毒素の強化の１つの主要な欠陥は、標的化毒素が受容体媒介性エンドサイトーシス（コンジュゲートの受容体への結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）によって内部移行される一方で、グリコシドが細胞膜を通して受動的に拡散し、おそらくコレステロールとの相互作用を介してエンドソーム膜に到達することである。原則的に、グリコシドは、任意の細胞、非標的細胞（オフターゲット細胞）にも入ることができ、標的化毒素の効果的な放出について標的細胞における非効率的なエンハンサーの利用能及び場合によっては非標的細胞における副作用を引き起こす。１つの主要な問題は、標的化毒素及びグリコシドの移行が異なる動態で進むこと及びこれらの動態が細胞（株）毎及び組織毎に異なり、その結果、２つの物質（ＡＤＣ、遊離サポニン）の適用のための正確な時間差が、腫瘍（細胞（株））毎に広く変動する可能性があることである。さらに、生物において、これらの物質の遊離、吸収、分布、代謝及び排出もまた異なる。さらに、標的化されない細胞によるグリコシドの非特異的取り込みは、これらの細胞において望まれない効果を誘導し得る。これは、例えば、リソソームに送達されるべきであった化合物の細胞質ゾルへの送達、抗原提示の妨害などであり得る。グリコシド及び標的化薬物の非標的化投与はまた、薬物開発において問題になる可能性があり、関連する当局（例えば、ＦＤＡ又はＥＭＡ）による販売承認を妨げる可能性があるか又は少なくとも延期する可能性がある。本発明に関連して標的化毒素又は標的化薬物は、毒素又は薬物が、標的細胞上の膜結合分子に特異的に標的化されるもの、例えば、膜受容体のリガンドに結合されるか又は標的細胞の細胞膜上の構造を特異的に認識する抗体に結合される毒素又は薬物を意味する。
したがって、エフェクター分子と同じ経路を介して、例えば、エンハンサーが標的細胞のエンドサイトーシス経路の酸性区画内部の有効濃度で利用可能になるために及び毒素と相乗的な作用を呈するために標的細胞にリガンドを標的化することを介して、グリコシドを方向付けることが非常に有用である。したがって、本発明は、リガンド（結合分子）を標的細胞のエンドサイトーシス経路の酸性区画に標的化することを介してエフェクター分子及びエンドソーム脱出エンハンサー（すなわち、本発明のサポニン）の両方を再指示する新規のアプローチを提供する。
本発明者らは、ｓｄＡｂを含むコンジュゲートの一部であるエフェクター分子が、細胞内部のエフェクター分子の効果が考慮されるとき、コンジュゲートによっても含まれるサポニンの影響下で高い効率を有して細胞内部に送達されることを確立した。驚くべきことに、ＶＨＨなどの相対的に小さいサイズのｓｄＡｂにもかかわらず、そのようなｓｄＡｂを含むコンジュゲートの細胞表面受容体への結合はやはり、エフェクター分子及びサポニンの両方がＶＨＨなどのｓｄＡｂを含むコンジュゲートによって含まれるときに生じる。ＶＨＨなどのｓｄＡｂへのサポニンの結合及びエフェクター分子の結合を合わせても、例えば、細胞表面分子に結合するＶＨＨの能力が考慮されるときの立体障害を引き起こさない。すなわち、例えば、腫瘍細胞を最適以下の用量の例えば、ＡＤＣと接触させることは、前記ＡＤＣに共有結合的にカップリングされたサポニンの非存在下で細胞内エフェクター分子活性をもたらさない（標的細胞は、エフェクター分子の生物活性に触れるときに効率的に殺されない）。しかしながら、標的腫瘍細胞が、エフェクター分子を含み、サポニンを含み、及び標的細胞結合ｓｄＡｂをさらに含む本発明のコンジュゲートと接触されるとき、効率的な腫瘍細胞の死滅が達成される。
本発明のコンジュゲートで単一の細胞表面分子を標的化することによって、本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化抗体に結合されるサポニン及びエフェクター部分の、細胞表面上の細胞表面分子を露出している標的化される細胞の細胞質ゾル及びその内部への送達は、例えば、本発明のサポニンを欠く、したがって、細胞標的化サポニン（本発明のコンジュゲート）の存在を伴わない通常のＡＤＣのみと細胞を接触させることと比較して改善され、より特異的になる。コンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂによる標的化のために選択された異常細胞は、理想的には、細胞表面分子標的化分子が結合することができる細胞表面分子上のエピトープを高度に有し（すなわち、例えば、腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの標的化される細胞上の標的化される細胞表面分子の発現が、例えば、健常細胞などの標的化されない細胞上の発現よりも相対的に高い）、及び／又は特に患者内の（隣接している）健常細胞が考慮されるとき、コンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂの結合に対して標的化される細胞表面分子中のエピトープを露出させる。好ましくは、本発明のコンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂによって標的化される細胞表面分子は、健常細胞と比較して、標的化（疾患、腫瘍）細胞上で相対的に高く及び／又は特異的に発現される。ある実施形態は、本発明のコンジュゲートであり、腫瘍細胞受容体などのコンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂのための標的細胞表面分子は、健常（隣接している）細胞の表面上の細胞表面分子の発現と比較して特異的に発現されるか又は相対的に高い程度で発現される。したがって、標的化される細胞表面分子上のエピトープは、理想的には、標的化疾患細胞に固有であり、及び標的化される細胞の表面に少なくとも特異的に存在し、露出される。標的化される細胞上の細胞表面分子上のエピトープに対する本発明のコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート及び細胞表面分子の複合体のエンドサイトーシスが続く（受容体に対するコンジュゲートの結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）。コンジュゲートは、標的化されるべきではない健常細胞と比較して標的化される細胞上で十分な程度で特異的に発現されるか又は固有に発現される細胞表面分子との結合相互作用を介してのみ標的細胞に入ることができるため、コンジュゲートによって含まれるエフェクター部分及びサポニンの治療的に有効な量の標的細胞内部での蓄積は、標的化される細胞表面分子の発現レベルが、ある特定の最小発現閾値を超える場合にのみ可能であり、発生する。同時に、コンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂに結合されるエフェクター部分が、共有結合されたサポニンを有する全く同じコンジュゲートの存在下でのみその細胞内（例えば、細胞傷害性又は遺伝子サイレンシング）活性を発揮することが可能であるという事実はまた、共有結合されたサポニンを有しないＡＤＣへの細胞の暴露と比較して、例えば、エフェクター部分によって標的化され、影響されることにならない健常細胞及び健常組織に対するエフェクター部分の負の望まれない副作用に対する保護を提供する。すなわち、コンジュゲートが結合する可能性のある露出された細胞表面分子の十分に低い発現或いは欠如により、理想的には、コンジュゲートによって含まれるサポニンの影響下でエフェクター部分のエンドソーム脱出をもたらすことになる量までコンジュゲートを（非標的化）健常細胞に進入させない。本発明によるカップリングされたサポニンを有するＡＤＣ又は共有結合的にカップリングされたサポニンを有するＡＯＣは、カップリングされたサポニンを有しないＡＤＣ又はＡＯＣが治療レジメンにおいて適用されたときと比較して低用量で使用することができるため、健常細胞における低い程度でのカップリングされたサポニンを有するＡＤＣの進入又はカップリングされたサポニンを有するＡＯＣの進入は既に、例えば、腫瘍細胞及び自己免疫細胞などの標的疾患細胞の標的化及び死滅が考慮されるときに望まれない副作用の発生に関してより低いリスクを有する。
したがって、コンジュゲートにおけるｓｄＡｂの包含は、ＩｇＧなどの抗体、又はその結合断片若しくは結合ドメインの包含と比較して多数の利点を有する。重要なこととして、ｓｄＡｂはＩｇＧ中に存在するＦｃテイルを含まないため、コンジュゲートが投与される宿主の内皮細胞などの細胞上のＦｃ受容体に対するコンジュゲートの結合に起因するオフターゲット副作用に関するリスクは存在しない。したがって、本発明のコンジュゲートのリスクプロファイルは、ＩｇＧに基づくＡＤＣ及びＡＯＣと比較して、又はＦｃテイルを含むＡＤＣ若しくはＡＯＣと比較して改善される。加えて、本発明のコンジュゲートはＦｃ受容体によって結合できないため、コンジュゲートは既に、目的の標的細胞表面分子とは異なる細胞表面受容体によるコンジュゲートの望まれない捕捉が少ないこと又はないことに起因して、完全長抗体に基づくＡＤＣ及びＡＯＣにより同じエフェクター分子活性に達するために必要とされる用量より少ない用量で効果的である。さらに、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧと比較してｓｄＡｂの相対的に小さいサイズに起因して、組織移行が改善され、コンジュゲートが療法を必要とする患者に投与されると、標的細胞に達するのに有利である。本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂの適用の全てのこれらの利点は、Ｆｃテイルを含むＩｇＧなどのより大きい抗体又はその断片の適用と比較したとき、ＡＤＣ又はＡＯＣと同様に、本発明のコンジュゲートによって含まれるときにエフェクター分子に関する治療域の改善をもたらす。例えば、ｓｄＡｂに基づくＡＤＣは、エフェクター分子が例えば毒素であるときに、標的化される腫瘍細胞の場合において標的細胞の死滅の改善を達成する可能性があり、同じ用量で、ＩｇＧに基づき及び同じエフェクター分子を含むＡＤＣは、有効ではないか又は最適以下で有効であるにすぎない。本発明の態様のために、ここで、同じエフェクター分子を含む抗体に基づくＡＤＣ又はＡＯＣが使用される場合に必要なより高い用量と比較して、ｓｄＡｂを含むコンジュゲート、すなわち、本発明のコンジュゲートの一部としてより低用量のエフェクター分子で患者を治療し、それとともに標的細胞において同じ又は改善されたエフェクター分子媒介性効果に到達することが可能になる。より低い用量での本発明のそのようなコンジュゲートの投与は、例えば、非標的化、健常細胞への非特異的な進入によって、副作用の発生に関して患者のリスクを低下させる。これは、例えば、コンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂによって標的化される細胞表面分子が、標的（腫瘍）細胞上でより高度に発現されるが、そのような標的細胞上で固有に発現されないときに重要である。より低い用量のコンジュゲートは、非腫瘍健常細胞などのそのように低い発現体へのコンジュゲートの結合に関するリスクを低下させる。
本発明者らはまた、本発明のコンジュゲートの治療域が、本発明のコンジュゲートにおける共有結合されたサポニンの組み込みに起因して広げられることを見出さした。すなわち、サポニンとともに提供されるＡＤＣ又はＡＯＣ（すなわち、本発明のコンジュゲート）が、標的細胞の表面でのその結合パートナーへのｓｄＡｂの結合時に標的細胞と接触されるとき、本発明のコンジュゲートによって含まれるサポニンもまた、コンジュゲートのエフェクター分子とともに近接して、すなわち、標的細胞の表面に運ばれる。細胞表面分子を有する標的細胞、すなわち、コンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂのための標的が、本発明のコンジュゲートと接触されるとき、エフェクター分子の有効量及びサポニンの有効量の両方は、標的細胞がサポニンの非存在下又は遊離（非標的化）サポニンの存在下でＡＤＣ又はＡＯＣと接触されときより低い。本発明のコンジュゲートの一部としての標的化サポニンの存在は、標的細胞中のエフェクター分子の活性を増強し、その結果、コンジュゲートの治療域、及びそれとともにエフェクター分子の治療域が広げられる。十分なエフェクター分子の効率は、標的細胞が本発明のコンジュゲートと接触されるときにより低い用量で達成される。同様の効果は、サポニンのエフェクター分子増強活性が考慮されるとき、ＡＤＣ又はＡＯＣがサポニン又はその機能性誘導体の存在下で標的細胞と接触されるときであるが、標的（腫瘍）ｍ細胞へのコンジュゲートの標的化された結合のためのｓｄＡｂとともに本明細書でエフェクター分子及びエフェクター分子活性強化サポニンの両方を含む本発明のコンジュゲートが適用されるときに確立された有効用量と比較して１００倍～１０００倍高い遊離サポニン（機能性誘導体）の濃度で本発明者らによって見出される。したがって、サポニン又はその機能性誘導体に結合分子（すなわち、本発明のコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂ）を提供すること及びまた全く同じコンジュゲートにエフェクター分子（すなわち、本発明のコンジュゲートにより含まれるエフェクター分子）を提供することは、本発明のコンジュゲートが、その表面上の細胞表面分子、すなわち、ｓｄＡｂのための結合標的を発現する標的細胞と接触されるとき、エフェクター分子活性増強効果の改善をもたらす。標的化サポニンは既に、標的細胞内へのエフェクター分子の送達、及びエンドソーム又はリソソームから細胞質ゾルへの前記細胞の送達における遊離サポニンより低い用量で効果的であり、エフェクター分子は、その標的結合パートナーに結合するべきであり、その生物活性（例えば、標的細胞が腫瘍細胞である場合及びエフェクター分子が、例えば毒素である場合の細胞死滅）を発揮するべきであるが、本発明者らは、単一の分子におけるサポニン、標的化部分（ｓｄＡｂ）及びエフェクター分子（例えば、毒素、ＡＯＮ）の組み合わせは、さらにより効果的であることを見出した。
したがって、本発明者らは、サポニン（機能性誘導体）、エフェクター分子及び標的細胞でのコンジュゲートの標的化された送達のためのｓｄＡｂを含むコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、医薬組成物は、共有結合的に連結されたサポニンとともに提供されない完全長抗体又はそのコンストラクトを含むＦｃに基づく既存のＡＤＣと比較したとき、改善された治療域、コンジュゲートによって含まれる有効用量のエフェクター分子がエフェクター分子に基づく療法を必要とする患者に投与されるときに副作用を誘導するリスクの低減、及び本発明のコンジュゲートの一部としての標的化サポニンの影響下での標的細胞内部への、より具体的には、そのような標的細胞の細胞質ゾル内部へのコンジュゲートの送達の改善に起因する改善されたエフェクター分子活性を有する。本発明のそのようなコンジュゲートが、ある用量の遊離サポニン（機能性誘導体）とともにエフェクター分子に基づく療法を必要とする患者に投与されることは本発明の一部であるが、コンジュゲート単独での適用が好ましい。
本発明のコンジュゲートにおける適用に好適なサポニンの例は、Ｃ－２３位でアルデヒド基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択により、サポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸基を含むモノ－デスモサイド又はバイ－デスモサイドトリテルペンサポニン、好ましくは、Ｃ－２３位でアルデヒド基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及びサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸基を含むバイ－デスモサイドトリテルペンサポニンである。本発明による例示的なサポニンは、サポニンＡとして示され、以下の構造によって図示されるサポニンの特徴の１つ、複数、又は全てを含む：
Figure 2023532003000001
サポニンのこの群は、サポニン及びエフェクター部分が細胞のエンドソーム中に存在したときにエフェクター部分に対するエンドソーム脱出強化活性を示した。通常、コンジュゲートにおける適用に好適なサポニンは、トリテルペン骨格を有するサポニンであり、トリテルペン骨格の構造は、五員環Ｃ３０テルペン骨格（サポゲニン又はアグリコンとも称される）である。表Ａ１は、ＶＨＨなどの少なくとも１つのｓｄＡｂを含み及び少なくとも１つのサポニン、例えば、１～１６個のサポニン部分、１～８個、例えば、２、４又は８個のサポニン部分を含むコンジュゲートを合成するのに好適なサポニンを列挙し、サポニンは、例えば、ＳＯ１８６１又はＱＳ－２１、好ましくは、ＳＯ１８６１である。
ある実施形態は、抗体、好ましくは、免疫グロブリンＧ起源、好ましくは、ヒト起源の重鎖に由来するＶＨドメイン；抗体、好ましくは、免疫グロブリンＧ起源、好ましくは、ヒト起源の軽鎖に由来するＶＬドメイン；ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源又は可変重鎖の新規の抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインなどのＩｇ－ＮＡＲ起源などの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）に由来するものなどのＶＨＨドメイン（好ましくは、ＨＣＡｂは、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源に由来する）のいずれか１つ以上である少なくとも１つのｓｄＡｂを含み；好ましくは、少なくとも１つのｓｄＡｂが、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、ビクーナ、グアナコ及びフタコブラクダからのＨＣＡｂに由来するものなどのラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源（ラクダ類ＶＨ）のＨＣＡｂに由来するＶＨＨドメインである本発明のコンジュゲートである。
特に、ＶＨＨドメインは、本発明のコンジュゲートにおける適用に好適である。そのようなＶＨＨドメインは、それらの高い安定性、すなわち、アンフォールディングに対する耐性、例えばＩｇＧに存在し、ＩｇＧが２つのＶドメインを介してその結合パートナーに結合するのに必要な第２のＶドメインの存在を必要とせずに結合パートナーに結合するそれらの能力、当技術分野で知られる技術（ラクダ類動物の免疫化、ファージディスプレイ技術など）によるそれらの生産の容易さ、標的（腫瘍）細胞がそのような（器官）組織の内部又は一部として位置する場合に有益である完全長ＩｇＧに見られるよりも高い程度に組織に浸透するそれらの能力のために一般に有名である。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子の１つ及び／若しくは少なくとも１つのサポニンの１つに共有結合された単一の第１のｓｄＡｂ、又は少なくとも１つのｓｄＡｂが少なくとも１つのエフェクター分子に結合され及び／又は少なくとも１つのｓｄＡｂが少なくとも１つのサポニンに結合される２つ以上のｓｄＡｂ、又は少なくとも１つのエフェクター分子のエフェクター分子若しくは少なくとも１つのサポニンのサポニン、又は両方にそれぞれ別々に結合される少なくとも２つのｓｄＡｂの全てとともに少なくとも２つのｓｄＡｂを含む本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、少なくとも２つのｓｄＡｂを含み、これらは同じｓｄＡｂであり、好ましくは、２～８つのｓｄＡｂ、より好ましくは、２～４つのｓｄＡｂである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、バイパラトピックである少なくとも２つのｓｄＡｂを含む、好ましくは、バイパラトピックである２つのｓｄＡｂを含む本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、細胞表面分子上の同じ結合部位に結合することができる１～８つのｓｄＡｂを含み、少なくとも１つのエフェクター分子及び／又は少なくとも１つのサポニンが、１～８つのｓｄＡｂのうちの単一の第１のｓｄＡｂに結合されるか又は少なくとも１つのエフェクター分子及び／又は少なくとも１つのサポニンが、存在する場合、ｓｄＡｂの２つ以上に結合され、少なくとも１つのエフェクター分子及び少なくとも１つのサポニンが、同じｓｄＡｂに結合されるか又は異なるｓｄＡｂに結合され、好ましくは、少なくとも１つのエフェクター分子の各々が、別々のｓｄＡｂに結合され及び／又は少なくとも１つのサポニンの各々が、別々のｓｄＡｂに結合され、エフェクター分子及びサポニンが、同じｓｄＡｂに結合されるか又は別々のｓｄＡｂに結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、バイパラトピックである少なくとも２つのｓｄＡｂを含む、好ましくは、バイパラトピックである２つのｓｄＡｂを含む本発明のコンジュゲートである。そのようなバイパラトピックの直列のｓｄＡｂの例は、配列番号７４として示されるとおりのアミノ酸配列を有するバイパラトピックの直列のｓｄＡｂである。配列番号７４のアミノ酸配列を有する二価の直列のｓｄＡｂは、ＥＧＦＲに結合する。配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有する第１のｓｄＡｂ、７Ｄ１２は、ＥＧＦＲ上の第１のエピトープに結合し、配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有する第２のｓｄＡｂ、９Ｇ８は、ＥＧＦＲ上の第２のエピトープに結合する。当然、ｓｄＡｂ ７Ｄ１２又はｓｄＡｂ ９Ｇ８はまた、単一のｓｄＡｂを含むか、又は７Ｄ１２及び９Ｇ８とは異なる少なくとも１つのさらなるｓｄＡｂ（少なくとも１つのさらなるｓｄＡｂは、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲが露出される同じ細胞表面上に存在するさらなる細胞表面分子に結合する）を含む本発明のコンジュゲートにおける適用に好適である。本発明のコンジュゲートを提供するために、エフェクター分子は、ジアンチン（配列番号７３において概説されるとおりのアミノ酸配列を有する実施例の節における７Ｄ１２－９Ｇ８－ジアンチンの例を参照のこと）などのタンパク質毒素などの１つ又は複数のｓｄＡｂに共有結合的に連結され、ＱＳ－２１又はＳＯ１８６１などのサポニンの少なくとも１つのコピーは、例えば、リンカーを介して及び／又はオリゴマー分子若しくはポリマー分子（オリゴマー分子又はポリマー分子は、１つ又は複数のサポニン分子及びｓｄＡｂに共有結合的に連結される）を介してｓｄＡｂに共有結合的に連結される。
互いに共有結合的に連結される複数のｓｄＡｂの（直鎖状の）連なりを含む本発明のコンジュゲートを提供することによって、より高いアビディティーで標的細胞に結合するコンジュゲートの能力の利点を提供することができ、標的細胞によるコンジュゲートの取り込み（エンドサイトーシス）の改善をもたらすことができる（コンジュゲートの受容体への結合の後に、コンジュゲート／受容体複合体の内部移行が続く）。
同期化は、エフェクター分子に対するサポニンのエンドソーム脱出強化効果の適用が考慮されるとき、マウスに関して成功した送達戦略とヒトへのその適用の間にあるミッシングリンクである。実際に、本発明者らは、一連のインビボマウス腫瘍モデルにおいて、ある用量の遊離サポニン及びある用量の例えばカップリングされたサポニンを有しないＡＤＣをマウスに別々に投与することが、遊離サポニンの存在下にてＡＤＣで治療されない対照動物と比較して腫瘍増殖の遅延、腫瘍退縮、腫瘍増殖の減少及び緩徐化などのいずれかの所望の抗腫瘍活性をもたらさなかったことを確立した。また、本明細書の下の実施例４～１８を参照されたい。遊離サポニンは、様々な投与経路及びＡＤＣを投与する瞬間と比較して遊離サポニンを投与する様々な時点（ＡＤＣの投与前、投与中及び投与後に遊離サポニンを投与する）を使用して投与された。インビボ腫瘍モデルにおいて試験されるＡＤＣは、セツキシマブ－ジアンチン（遊離ＳＯ１８６１を伴う）、又はトラスツズマブ－サポリン（遊離ＳＯ１８６１を伴う）であった。遊離サポニンの用量を変化させることは、効果的な抗腫瘍活性をもたらさなかった。参照されるＡＤＣは、それ自体が担腫瘍動物に対するいずれかの有利な抗腫瘍効果を与えなかった用量で投与された。驚くべきことに、本発明者らはここで、ヒト腫瘍細胞を使用する様々なインビトロでの哺乳動物細胞に基づくアッセイ及び／又は様々なインビボ動物腫瘍モデルにおける有利な抗腫瘍活性が、本発明によるコンジュゲートで細胞又は動物を治療することによって達成され得ることを確立した。コンジュゲートは任意選択により本発明による足場を含む（下記を参照のこと；それに共有結合される１つ又は複数のサポニン部分を有するオリゴマー又はポリマー構造を含む共有結合性サポニンコンジュゲート）。足場は、例えば、切断可能又は切断不可能な結合を介する共有結合されたサポニン（例えば、ＳＯ１８６１、ＱＳ－２１）及び／又は切断不可能な結合又は切断可能な結合を介する共有結合されたエフェクター部分（例えば、ジアンチン、遺伝子サイレンシングアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７））を有する三官能性リンカーであり、足場は、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＯＫＴ－９などのモノクローナル抗体などのコンジュゲートの細胞表面分子標的化分子に対して共有結合で連結されるか、又は足場は、デンドロン、例えば、Ｇ４－デンドロン（例えば、４つのサポニン分子などの４つの部分が結合することができる）などのデンドロン、又は例えば、２つのサポニン及び２つのエフェクター分子を結合するためのデンドロンであって、コンジュゲートのｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化抗体に（共有結合的に）カップリングするための化学基を含むデンドロンである。例えば、タンパク質性毒素によって発揮される細胞毒性が考慮されるとき又は腫瘍細胞における遺伝子サイレンシングが考慮されるとき、インビボ及び／又はインビトロ抗腫瘍細胞活性を示す、本発明によるこれらの足場のいくつかを例示する、さらなる実施形態及び実施例の節に対する参照がなされる。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、遊離サポニンと合わせたＡＤＣによる担癌動物の治療が考慮されるときに観察される失敗を鑑みて、標的細胞、例えば、腫瘍細胞又は自己免疫細胞のエンドサイトーシス経路の区画又は小胞における、少なくとも１つのサポニン、及びエフェクター部分、好ましくは毒素又はオリゴヌクレオチドの両方の存在を同期させることが好ましい。ＡＤＣ及び遊離サポニンでは、インビボで相乗効果を得るために、後期エンドソームでの分子の存在を同期させることは、本発明者らの試みに従って有利には得られなかった。一態様では、本発明は、好ましくは、単一のコンジュゲート分子においてエフェクター部分及びサポニンを組み合わせることに関して少なくとも以下の問題を解決する：いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、（共有結合性の）特に、単一の切断可能である保持可能なカップリングのために使用され得るサポニン内の唯一の適切な化学基が、エンドソーム脱出活性のために必要となる。例えば、本明細書に例示される本発明のサポニンの著しいエンドソーム脱出エンハンサー効果は１０年を超えて知られているが、免疫増強アジュバント物質の使用が暗示されたワクチン接種管理体制におけるサポニンの適用以外に臨床試験においてサポニンが薬学的に活性な物質と組み合わせて使用されてこなかったのは、既知の制約のためである可能性が最も高い。例えば、共有結合されたサポニンとともに本発明のコンジュゲートを提供することは、例えば、いくつかのサポニンを有する足場の文脈において、少なくとも部分的にはこれらの困難を解決する。驚くべきことに、アジュバント構成成分としてサポニンを含むワクチン接種の文脈においてそれらの免疫増強活性のために以前に適用されたサポニンは、インビトロ又はインビボでの抗腫瘍活性のための本発明のコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化抗体に（共有結合的に）カップリングするのに現在においても好適である。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが単一のｓｄＡｂであるか若しくは少なくとも２つ、好ましくは２つのｓｄＡｂであり、ｓｄＡｂが、ＨＩＶｇｐ４１などの細胞の細胞表面分子に結合することができるか、又はｓｄＡｂが、細胞の腫瘍細胞表面受容体などの細胞の細胞表面受容体、好ましくは、腫瘍細胞特異的受容体、より好ましくは、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管性インテグリンアルファ－Ｖベータ－３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリン－アルファＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソセリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）のいずれか１つ以上から選択される、最も好ましくはＨＥＲ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＸＣＲ７、ＣＤ７１、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ１から選択される受容体に結合することができる本発明のコンジュゲートである。
本発明のコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂが、標的細胞上に特異的に発現される細胞表面分子のための結合特異性を有することは、本発明の一部である。「特異的に発現される」は、標的細胞上のみの細胞表面分子の固有の発現として本明細書で理解されるべきであるか（例えば、コンジュゲートに結合するべきではない健常細胞は、標的化される分子の細胞表面の露出の欠如に起因して標的化されない）、又は例えば、コンジュゲートに結合するべきではないか又は少なくともはるかに低い程度で結合するべき健常細胞上の細胞表面分子の低い発現と比較して標的細胞上の標的細胞表面分子の上方制御されたか又は相対的に高い発現として本明細書で理解されるべきである。これらの列挙される細胞受容体は、コンジュゲートの標的である細胞に十分に特異的であり、それとともにコンジュゲートによる結合のための好ましい候補であるそのような細胞表面分子である。標的細胞上の細胞表面分子の発現が本発明のコンジュゲートによって標的化されることならない他の細胞上の発現と比較されるときにある特定の細胞表面分子の特異性が高いほど、細胞内部のエフェクター分子の活性が考慮されるときに治療域が良好になることが理解されることになる。例えば、コンジュゲートによる標的化のための好適な標的は、他の腫瘍細胞特異的受容体、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、例えば、ＥＧＦＲ１、及びＣＤ７１の中にある。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、単一のｓｄＡｂであるか又は少なくとも２つ、好ましくは、２つであり、ｓｄＡｂが、抗ＣＤ７１ ｓｄＡｂ、抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２０ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ１２５ ｓｄＡｂ、抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３０ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３３ ｓｄＡｂ、抗血管性インテグリンアルファ－ｖベータ－３ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２２ ｓｄＡｂ、抗ＣＥＡ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ４４ｖ６ ｓｄＡｂ、抗ＦＡＰ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、抗ＣａｎＡｇ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５６ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３８ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ６ ｓｄＡｂ、抗ＩＧＦ－１Ｒ ｓｄＡｂ、抗インテグリンｓｄＡｂ、抗シンデカン－１ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ７９ｂ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ１ ｓｄＡｂ、抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＸＣＲ７ ｓｄＡｂ、抗ＨＩＶｇｐ４１から選択され、ｓｄＡｂが、好ましくは、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、ＨＥＲ２、ＣＤ７１、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はＥＧＦＲに結合することができるｓｄＡｂを含み、前記ｓｄＡｂが、好ましくは、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７若しくはクローンＱ１７－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂを含むか；又はＥＧＦＲに結合するための及びクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又はＣＤ７１に結合するための及びクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又はＨＩＶｇｐ４１に結合するための及びクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂを含むか；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つを含むか、又は配列番号７４として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２及びＶＨＨ ９Ｇ８からなるＥＧＦＲに結合するバイパラトピックの直列のＶＨＨドメインを含むか、又は配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２及び／又は配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ９Ｇ８を含み、任意選択により、コンジュゲートがさらに、少なくとも１つのｓｄＡｂとは異なるさらなるｓｄＡｂであって、配列番号３３、３４及び３５のアミノ酸配列を有するさらなるｓｄＡｂのいずれか１つ以上などのアルブミンに結合するためのさらなるｓｄＡｂを含み、好ましくは、さらなるｓｄＡｂが、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである本発明のコンジュゲートである。ある実施形態は、コンジュゲートが、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７、クローンＱ１７－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂ；ＥＧＦＲに結合するための及びクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂ；又はＣＤ７１に結合するための及びクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂ；又はＨＩＶｇｐ４１に結合するための及びクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂ；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂ；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つ、又はバイパラトピックの直列の配列番号７４のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂ ７Ｄ１２及び９Ｇ８若しくは配列番号７５のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂ ７Ｄ１２若しくは配列番号７６のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂ ９Ｇ８を含み、任意選択により、コンジュゲートがさらに、配列番号３３、３４及び３５のアミノ酸配列を有するｓｄＡｂのいずれか１つ以上などのアルブミンに結合するためのｓｄＡｂを含む本発明のコンジュゲートである。例えば、サポニンのコンジュゲート、エフェクター部分及び少なくとも１つのＶＨＨは、配列番号７４のアミノ酸配列を有する直列のバイパラトピックｓｄＡｂを含むか、又は７Ｄ１２の１つ以上のコピー及び／又は９Ｇ８の１つ以上のコピーを含む。
本発明のコンジュゲートにおける組み込みに好適なＶＨＨは、例えば、単一ドメイン抗体データベース（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８））、特許出願の米国特許出願公開第２０１６０２５１４４０号明細書（抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ）、米国特許第９６８３０４５号明細書（抗ｃ－Ｍｅｔ），米国特許出願公開第２００９０２５２６８１号明細書（抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ）、米国特許第９９６９８０５号明細書（抗ＨＥＲ２）、米国特許出願公開第２０１９００２３７９６Ａ１号明細書（抗ＨＥＲ３）、及び抗ＨＥＲ２に関してＫｉｊａｎｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、及び抗ＨＥＲ２に関してＭｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）において見出される。一連の好適なＶＨＨのアミノ酸配列及び／又はｃＤＮＡ配列もまた、腫瘍細胞特異的受容体に結合するそれらの能力に鑑みて、配列番号１～３２及び３６～７２及び７４（直列のＶＨＨの７Ｄ１２及び９Ｇ８）としての抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ３、抗ＣＤ１２３、抗ＣＥＡＣＡＭ、抗ｃ－Ｍｅｔ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ－１Ｒ、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ１９、抗ＨＥＲ１及び抗ＶＧＦＲ２並びに配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２並びに／又は配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ９Ｇ８に関して本明細書の下で提供される。特に、腫瘍細胞特異的な受容体ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＣＤ７１のいずれかの結合部位に結合することができるＶＨＨは、本発明のコンジュゲートにおける組み込みに好適である。特に、腫瘍細胞特異的受容体ＥＧＦＲ上の結合部位に結合することができるＶＨＨは、配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２及び配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ９Ｇ８などの本発明のコンジュゲートにおける組み込みに好適である。本発明者らは、そのような受容体のいずれか１つを標的化するＶＨＨを含むＡＤＣが、ｓｄＡｂに結合されるエフェクター分子の送達において効果的であることを明らかにした。例えば、実施例の節、及び図４～７を参照されたい。
ある実施形態は、エフェクター分子が、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、異物性核酸又はｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、又はその任意の組み合わせの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる。
ある実施形態は、エフェクター分子が、タンパク質性毒素などの毒素、薬物、ポリペプチド又はポリヌクレオチドなどの薬学的に活性な物質である本発明によるコンジュゲートである。本発明における薬学的に活性な物質は、生物、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、ヒトにおいて有益なアウトカムを達成するために使用されるエフェクター分子である。利点は、疾患及び／又は症状の診断、予後、治療、治癒及び予防を含む。薬学的に活性な物質はまた、望まれない有害な副作用を引き起こす可能性がある。この場合、薬学的に活性な物質が特定の症例に好適であるかどうかを判断するために、長所及び短所が比較されなければならない。細胞内部にある薬学的に活性な物質の効果が、生物体全体、例えば、ヒト患者にとって支配的に有益である場合、細胞は標的細胞と呼ばれる。細胞内部での効果が、生物体全体にとって支配的に有害である場合、細胞はオフターゲット細胞と呼ばれる。細胞培養物及びバイオリアクターなどの人工系において、標的細胞及びオフターゲット細胞は、目的に依存し、使用者によって定義される。エフェクター分子の例は、非天然アミノ酸又は核酸を含むポリペプチド及びポリヌクレオチドを含む薬物、毒素、ポリペプチド（酵素など）、及びポリヌクレオチドである。エフェクター分子としては、とりわけ、ＤＮＡ：一本鎖ＤＮＡ（例えば、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼのためのＤＮＡ）；直鎖状二本鎖ＤＮＡ；環状二本鎖ＤＮＡ（例えば、プラスミド）；ＲＮＡ：－ｍＲＮＡ（例えば、ＴＬＡエフェクター分子ヌクレアーゼ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｓＲＮＡ、ＬＮＡ及びＢＮＡ；タンパク質及びペプチド；毒素（例えば、サポリン、ジアンチン、ゲロニン、（デ）ボーガニン、アグロスチン、リシン（毒素Ａ鎖）；ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アポプチン、ジフテリア毒素、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素）代謝酵素（アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素）、凝固カスケードの酵素、修復酵素；細胞シグナル伝達のための酵素；細胞周期調節因子；遺伝子調節因子（ＮＦ－κＢなどの転写因子又はメチオニンリプレッサーなどの遺伝子リプレッサー）が挙げられる。本発明において使用されるとおりの毒素は、細胞を死滅させるか又は不活性化させることができる薬学的に活性な物質として定義される。好ましくは、標的化毒素は、標的細胞にとってのみ、又は少なくとも支配的に毒性であるがオフターゲット細胞には毒性ではない毒素である。標的化毒素の正味の効果は、好ましくは、生物体全体に有益である。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、ベクター、遺伝子、細胞自殺誘導導入遺伝子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｍＲＮＡ、小環状ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホラミダイトモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、３’－フルオロヘキシトール核酸（ＦＨＮＡ）、プラスミド、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）、又はその誘導体、より好ましくは、ＢＮＡ、例えば、ＨＳＰ２７タンパク質発現をサイレンシングするためのＢＮＡ又はアポリポタンパク質Ｂ発現をサイレンシングするためのＢＮＡのいずれか１つ以上から選択される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋核酸（ＢＮＡＮＣ）、ＢＮＡに基づくｓｉＲＮＡ、及びＢＮＡに基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ－ＡＯＮ）のいずれか１つ以上から選択されるオリゴヌクレオチドである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、抗ｍｉＲＮＡ、ＢＮＡに基づくｓｉＲＮＡなどのＢＮＡ－ＡＯＮ又はｓｉＲＮＡのいずれか１つから選択される、好ましくは、化学修飾されたｓｉＲＮＡ、代謝的に安定なｓｉＲＮＡ、及び化学修飾され代謝的に安定なｓｉＲＮＡから選択されるオリゴヌクレオチドである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、遺伝子を、そのような遺伝子を含む細胞中に存在するときにサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチドであり、遺伝子が、遺伝子：アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、デルタ－アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）、アンチトロンビン３（ＡＴ３）、グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）、補体成分Ｃ５（ＣＣ５）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＸ遺伝子、ＨＢＶのＳ遺伝子、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のいずれか１つであり、並びに／又は異常なｍｉＲＮＡを、そのような異常なｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在するときに標的化することができる本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、エフェクター分子が、ｍＲＮＡを、そのようなｍＲＮＡを含む細胞中に存在するときに標的化することができるオリゴヌクレオチドであり、ｍＲＮＡが、タンパク質：ａｐｏＢ、ＴＴＲ、ＰＣＳＫ９、ＡＬＡＳ１、ＡＴ３、ＧＯ、ＣＣ５、ＨＢＶのＸ遺伝子の発現産物、ＨＢＶのＳ遺伝子の発現産物、ＡＡＴ及びＬＤＨのいずれか１つの発現に関与するか、又は発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏ－ｍｉＲ）の阻害又はｏｎｃｏ－ｍｉＲの発現の抑制などのｍｉＲＮＡ機能を、そのようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在するときに弱めるか又は回復させることができる本発明のコンジュゲートである。
本発明者らは、腫瘍細胞と接触される、ＢＮＡ（ＨＳＰ２７）などの共有結合的にカップリングされたアンチセンスＢＮＡ及び本発明の共有結合的にカップリングされたサポニン（ＢＮＡ及びサポニンの両方が切断可能な結合を介して抗体（例えば、セツキシマブ）にカップリングされる）とともに提供される腫瘍細胞標的化モノクローナル抗体が、対照と比較して及びＢＮＡのみを有し、サポニン（ＳＯ１８６１、Ｑｕｉｌ－Ａ）を有しないＡＯＣと比較して、腫瘍においてインビボでＨＳＰ２７をサイレンシングすることができることを示す。したがって、本発明のＡＤＣ－サポニンコンジュゲート又は本発明の抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート－サポニンコンジュゲート（ＡＯＣ－サポニン）、例えば、抗体－ＢＮＡ－サポニンコンジュゲートを投与することによって、ＡＤＣ－サポニン又はＡＯＣ－サポニンに、同じ用量でモノクローナル抗体に共有結合的に結合されたサポニンを有しないＡＤＣのみ又はＡＯＣのみでは見られない抗腫瘍細胞活性を与える。注目すべきことに、２つの別々のコンジュゲートの組み合わせとしてのＡＯＣ及び共有結合的にカップリングされたサポニンを有する別々のモノクローナル抗体は、マウスの別々の群において別々に担腫瘍マウスに投与されるとき、対照群（溶媒のみが投与される）と比較して腫瘍細胞のＨＳＰ２７発現を増加させる。本発明のエフェクター部分を含む本発明のＡＯＣ－サポニンコンジュゲートの投与のみが、対照と比較したときにＨＳＰ２７発現の減少を示す。アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）［Ｙ Ｚｈａｎｇ，Ｚ Ｑｕ，Ｓ Ｋｉｍ，Ｖ Ｓｈｉ，Ｂ Ｌｉａｏ１，Ｐ Ｋｒａｆｔ，Ｒ Ｂａｎｄａｒｕ，Ｙ Ｗｕ，ＬＭ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ ＩＤ Ｈｏｒａｋ，Ｄｏｗｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１８，３２６－３３３］に従うオリゴ核酸配列を有するＢＮＡであった。注目すべきことに、本発明者らの知る限り、ＢＮＡは、遊離核酸としての適用のために設計される。本発明者らは、現在、アンチセンスＢＮＡが、リガンド又は抗体と（非）切断可能なリンカーを介して、遺伝子サイレンシング活性がインビトロで、より重要なことにインビボで担腫瘍動物の腫瘍細胞で保持されるように共有結合的にカップリングされ得ることを初めて実証している。ＢＮＡに基づくＡＯＣを提供するこのアプローチは、必要とするヒト（癌）患者に標的化ＢＮＡを投与する新規の方法を切り開いている。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、好ましくは、ペプチド、タンパク質、酵素及びタンパク質毒素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのタンパク質性分子を含むか又はそれからなる本発明のコンジュゲートである。本発明者らは、非常に効果的な腫瘍細胞の死滅は、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ７１のいずれかに結合するｓｄＡｂが選択され、ｓｄＡｂが、ジアンチン又はサポリンなどのタンパク質毒素などの毒素と組み合わせて合わせられ、及びｓｄＡｂが、サポニンと組み合わせられるときに達成されることを見出した。ｓｄＡｂ及びエフェクター分子を含むある特定のコンジュゲートの高い有効性を実証する例は、実施例の節において提供され、図４～７において示される。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、ウレアーゼ及びＣｒｅ－リコンビナーゼ、タンパク質性毒素、リボソーム－不活性化タンパク質、タンパク質毒素、細菌毒素、植物毒素の少なくとも１つを含むか又はそれらからなり、より好ましくは、アポプチンなどのウイルス毒素；志賀毒素、志賀毒素様毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素（ＰＥ）又はＰＥの外毒素Ａ、全長又は短縮型ジフテリア毒素（ＤＴ）、コレラ毒素などの細菌毒素；アルファ－サルシンなどの真菌毒素；リボソーム不活性化タンパク質及びジアンチン、例えば、ジアンチン－３０又はジアンチン－３２、サポリン、例えば、サポリン－Ｓ３又はサポリン－Ｓ６、ボーガニン又はボーガニンの脱免疫化誘導体デボーガニン、志賀毒素様毒素Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシン、リシンＡ鎖、モデクシン、モデクシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ボルケンシン、ボルケンシンＡ鎖、ビスクミン、ビスクミンＡ鎖などの２型リボソーム不活性化タンパク質のＡ鎖を含む植物毒素；又はカエルＲＮａｓｅなどの動物若しくはヒト毒素、又はグランザイムＢ若しくはヒトアンジオゲニン、又はその任意の毒性断片若しくは毒性誘導体のいずれか１つ以上から選択され；好ましくは、タンパク質毒素は、ジアンチン及び／又はサポリンである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、少なくとも１つのペイロードを含むか又はそれらからなる本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、リボソームを標的化する毒素、伸長因子を標的化する毒素、チューブリンを標的化する毒素、ＤＮＡを標的化する毒素及びＲＮＡを標的化する毒素の少なくとも１つ、より好ましくは、エムタンシン、パスードトクス、マイタンシノイド誘導体ＤＭ１、マイタンシノイド誘導体ＤＭ４、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ、マホドチン）、カリチアマイシン、Ｎ－アセチル－γ－カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、ベンゾジアゼピン、ＣＣ－１０６５類似体、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、シクロホスファミド、エトポシド、ドセタキセル、５－フルオロフラシル（５－ＦＵ）、ミトキサントン、ツブリシン、インドリノベンゾジアゼピン、ＡＺ１３５９９１８５、クリプトフィシン、リゾキシン、メトトレキサート、アントラサイクリン、カンプトテシン類似体、ＳＮ－３８、ＤＸ－８９５１ｆ、エキサテカンメシル酸塩、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素の短縮形態（ＰＥ３８）、デュオカルマイシン誘導体、アマニチン、α－アマニチン、スプライソスタチン、タイランスタチン、オゾガマイシン、テシリン、アンバースタチン２６９及びソラブタンシン、若しくはその誘導体のいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる本発明のコンジュゲートである。
本発明において有用なエフェクター部分は、その効果を発揮するために後期エンドソーム脱出に依拠することが好ましい。例えば、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素などのいくつかのエフェクター分子は、「後期エンドソーム段階」の前に他のオルガネラに経路を変更し、したがって、通常、本発明によるコンジュゲートにおける組み込みから恩恵を被らないことになる。しかしながら、そのような毒素は、例えば、経路変更に関与するシグナルペプチドを欠失させることによって、本発明による使用のために適応させられ得る。特に、高度に毒性であり及びエンドソームを脱出して細胞を死滅させるのに１分子のみを必要とすることになる毒素は、効力が弱くなるように修飾され得る。少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも１００個の毒素分子がエンドソームを脱出する（そして細胞質ゾルに入る）場合、細胞を死滅させる毒素を使用することが好ましい。本発明のコンジュゲートは、腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの標的細胞で結合された１つ又は複数のエフェクター部分を含む足場を標的化するための、共有結合された１つ又は複数のエフェクター部分を含む、共有結合的にコンジュゲートされた機能を持たされた足場、すなわち、オリゴマー若しくはポリマー足場などの足場又は三官能性リンカーを含むことがさらに好ましい。さらに、オフターゲット毒性を低減するために、細胞膜非透過性小分子毒素は、細胞膜透過性毒素より好ましいエフェクター分子である。
好ましくは、効果がコンジュゲートによって含まれるサポニンによって強化される本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター部分は、コンジュゲートから脱離し、例えば、形質膜陥入するときにコンジュゲートの細胞表面分子標的化部分としてコンジュゲート中に存在するｓｄＡｂなどの抗体から脱離する。これは、例えば、酸性、還元的、酵素的又は光誘導性条件下で切断する切断可能な結合によって達成され得る。
ある実施形態は、コンジュゲートが、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスードトクス及びポラツズマブベドチンに由来する少なくとも１つのｓｄＡｂを含むＡＤＣ、並びに／又はゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスードトクス及びポラツズマブベドチンのいずれか１つ以上において存在する毒素であり及び／若しくはジアンチン及びサポリンから選択される少なくとも１つのエフェクター分子を含むＡＤＣなどの抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む本発明のコンジュゲートである。ｓｄＡｂがそのようなヒト抗体に由来するとき、そのようなヒト抗体のＶＨドメインは、当技術分野で知られるドメイン安定性に関していくつかの改善（ヒトＶＨドメインの「ラクダ化」）を必要とする場合があることが理解されるであろう。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、（群Ｃ）：
２アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
１６アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
１６アルファ，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
ギプソゲニン；
キラ酸；
プロトエシゲニン－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－２２－アセテート；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノエート）；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－１６，２２－ジアセテート；
ジギトゲニン；
３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；
ギプソゲニン酸；又は
その誘導体
から選択されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、キラ酸及びギプソゲニンから選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、アグリコンコア構造キラ酸を含む本発明のコンジュゲートである。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、サポニンのアグリコンコア構造（本明細書では「アグリコン」とも称される）におけるアルデヒド基（又はその誘導体）の存在は、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子のエンドソーム脱出を、そのようなサポニンが細胞中、前記細胞のエンドソーム中に本発明のコンジュゲートの一部としてこれらのエフェクター分子とともに共存するとき又は遊離形態でエンドソーム中にある（例えば、コンジュゲートが標的細胞エンドソーム又はリソソーム内部に送達されるとコンジュゲートから分離する）ときに刺激し及び／又は増強するサポニンの能力にとって有益である。したがって、アルデヒド基を伴うアグリコンを有するサポニンを含む本発明のコンジュゲートが好ましい。キラ酸及びギプソゲニンにおいて、アルデヒド基は、アグリコンのＣ２３原子にある。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造のＣ３原子又はＣ２８原子に結合された、好ましくは、Ｃ３原子に結合された第１の糖鎖、及び少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造のＣ２８原子に結合された第２の糖鎖の一方又は両方を含み、好ましくは少なくとも１つのサポニンが、第１の糖鎖及び第２の糖鎖を含む本発明のコンジュゲートである。したがって、本発明のコンジュゲートによって含まれるサポニンが、２つのグリカン（糖鎖）を有するとき、第１の糖鎖は、アグリコンコア構造のＣ３位で結合され、及び第２の糖鎖が、サポニンのアグリコンコア構造のＣ２８位で結合される。
ある実施形態は、
・少なくとも１つのサポニンが、（群Ａ）：
ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－、
Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、及び
その任意の誘導体
から選択される第１の糖鎖を含み、
並びに／又は
・少なくとも１つのサポニンが、（群Ｂ）：
Ｇｌｃ－、
Ｇａｌ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
Ａｒａ－、
Ｘｙｌ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１は、４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ２は、４Ｚ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ３は、４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ４は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ５は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ６は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ７は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ８は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ９は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１０は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１１は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１２は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－、及び
その任意の誘導体
から選択される第２の糖鎖を含む本発明のコンジュゲートである。
したがって、本発明のコンジュゲートによって含まれるサポニンが、２つのグリカン（糖鎖）を有するとき、第１の糖鎖は、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３位で結合され、及び第２の糖鎖が、サポニンのアグリコンコア構造のＣ２８位で結合される。好ましくは、サポニンは、アグリコン中にアルデヒド基を有する。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、それぞれ群Ａ及び群Ｂに従って第１の糖鎖を含み及び第２の糖鎖を含み、第１の糖鎖が２個以上の糖部分を含み、及び第２の糖鎖が２個以上の糖部分を含み、アグリコンコア構造が、好ましくは、キラ酸又はギプソゲニン、より好ましくはキラ酸であり、
ｉ．アグリコンコア構造中のアルデヒド基が誘導体化されている、
ｉｉ．第１の糖鎖におけるグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている、及び
ｉｉｉ．第２の糖鎖における少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基が誘導体化されている
の１、２又は３つ、好ましくは１又は２つである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、
ｉ．
－ アルコールへの還元；
－ Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）であって、ＥＭＣＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＥＭＣＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換；
－ Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）であって、ＢＭＰＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＢＭＰＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換；又は
－ Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨであって、ＫＭＵＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＫＭＵＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換
によって誘導体化されているアルデヒド基を含むアグリコンコア構造；
ｉｉ．２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）又はＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介するアミド結合への転換によって誘導体化されているカルボキシル基、好ましくは、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含む第１の糖鎖；
ｉｉｉ．脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への転換によって誘導体化されているアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）を含む第２の糖鎖；又は
ｉｖ．２つ又は３つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ、好ましくは、２つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉの任意の組み合わせ
を含む本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、キラヤ属（Ｑｕｉｌｌａｊａ）樹皮サポニン、ディプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシン酸塩、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、アルファ－ヘデリン、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＡＥ Ｘ５５、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１、ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１９０４、ＳＯ１８６２、ＱＳ－７、ＱＳ１８６１、ＱＳ－７ ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ、ベータ－エスシン、エスシンＩａ、ティーシードサポニンＩ、ティーシードサポニンＪ、アッサムサポニンＦ、ジギトニン、プリムラ酸１及びＡＳ６４Ｒ、若しくはその誘導体、若しくはその立体異性体、及び／又はその任意の組み合わせ、好ましくはＱＳ－２１又はＱＳ－２１誘導体、ＳＯ１８６１又はＳＯ１８６１誘導体、ＳＡ１６４１又はＳＡ１６４１誘導体及びＧＥ１７４１又はＧＥ１７４１誘導体のいずれか１つ以上、より好ましくはＱＳ－２１誘導体又はＳＯ１８６１誘導体、最も好ましくはＳＯ１８６１誘導体、例えば、本発明によるサポニン誘導体のいずれか１つ以上である本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナムアルバム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシドＡ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、若しくはその誘導体、若しくはその立体異性体、及び／又はその任意の組み合わせのいずれか１つ以上であり、好ましくは、サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体及び／又はＧＥ１７４１誘導体及び／又はＳＡ１６４１誘導体及び／又はＱＳ－２１誘導体であり、より好ましくは、サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体又はＱＳ２１誘導体であり、最も好ましくは、サポニン（機能性）誘導体が、本発明によるＳＯ１８６１誘導体である本発明のコンジュゲートである。
少なくとも１つのサポニンが、３－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－［ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）］－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシルキラ酸２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→４）－アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→２）－［ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－４ＯＡｃ－ベータ－Ｄ－キノボピラノシル－（１→４）］－ベータ－Ｄ－フコピラノシド、キラヤ属（Ｑｕｉｌｌａｊａ）樹皮サポニン、ディプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシン酸塩、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、アルファ－ヘデリン、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＡＥ Ｘ５５、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１、ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＱＳ－７、ＱＳ１８６１、ＱＳ－７ ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ａ－ ｘｙｌｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ ｘｙｌｏ、ベータ－エスシン、エスシンＩａ、ティーシードサポニンＩ、ティーシードサポニンＪ、アッサムサポニンＦ、ジギトニン、プリムラ酸１及びＡＳ６４Ｒから選択され、好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、ＱＳ－２１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１及びＳＯ１８６１、及び／又はその機能性誘導体、少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造中のアルデヒド基を欠き、及び／又は少なくとも１つのサポニンの第１の糖鎖中のカルボキシル基を含むグルクロン酸部分を伴わない機能性誘導体、より好ましくはＱＳ－２１、ＳＯ１８６１、最も好ましくはＳＯ１８６１から選択される本発明のサポニンを含むコンジュゲートが好ましい。通常、サポニンは、エフェクター分子（ＡＤＣ又はＡＯＣのエフェクター部分の一部など）とともに選択された細胞と接触されるときにエフェクター分子に対するエンドソーム脱出強化活性のために知られる表Ａ１から選択されるサポニンである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナムアルバム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシドＡ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４から選択され、好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１及びＱＳ－２１、好ましくは、少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造中にアルデヒド基を伴わず、及び／又は少なくとも１つのサポニンの第１の糖鎖中にカルボキシル基を含むグルクロン酸部分を伴わないその機能性誘導体から選択される本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。通常、ｓｄＡｂ－サポニンコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのサポニンは、表Ａ１から選択される。ＳＯ１８６１が好ましい。
そのようなトリテルペングリコシド型のサポニンは、コンジュゲートによって含まれ、及び細胞のエンドソーム（又はリソソーム）に存在するエフェクター分子のエンドソーム脱出を、コンジュゲートの一部としての又は遊離形態のサポニンが細胞内部のそのようなエフェクター分子と共存するときに強化することができる。本発明者らは、これらのサポニンのエンドソーム脱出強化活性が、サポニンが本発明のコンジュゲートの一部として細胞と接触されるときに約１００～１０００倍を超えて強力であることを確立した。遊離サポニンは、細胞の細胞質ゾル中のエフェクター分子の送達を、そのような細胞が、ＡＤＣ又はＡＯＣなどのある特定の細胞標的化コンジュゲートの一部としてのエフェクター分子、及びサポニンと接触されるとき、標的細胞の外部からエンドソーム内部及び最終的には前記細胞の細胞質ゾルへのエフェクター分子の同じ程度の送達を達成するのに要求される本発明のコンジュゲートによって含まれる同じサポニンの濃度と比較して１００～１０００倍高いサポニン濃度で刺激することができる。そのようなエンドソーム脱出強化活性を示すサポニン、及びコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の細胞質ゾル送達を増強する能力が確立されているサポニンと高い構造的類似性を有するサポニンは表Ａ１において列挙される。したがって、サポニンが本発明のコンジュゲートの一部であるとき、コンジュゲートのｓｄＡｂの結合時、標的細胞上の標的化される細胞表面結合部位への結合時、前記細胞への結合時、及びエンドサイトーシスの後、前記細胞のエンドソーム中へのサポニンの標的化された送達は、同じ細胞を標的細胞の細胞表面分子への結合のための抗体又はｓｄＡｂなどの結合分子とともに提供されない遊離の標的化されないサポニン（誘導体）と接触させることと比較して約１００～１０００倍効果的である。
例えば、ＩｇＧ型の抗体、又はＦａｂ、ｓｃＦｖなどのその断片と比較して小さいサイズの本発明のコンジュゲートのｓｄＡｂは、コンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂの結合のための結合部位を露出する標的細胞による効率的な取り込み、例えば、エンドサイトーシスによる取り込みに寄与する。通常、本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂは、腫瘍細胞特異的細胞表面受容体などの標的細胞の細胞表面受容体に結合することができる。このようにして、本発明のコンジュゲートは、例えば、細胞表面受容体を発現する腫瘍細胞へのエンドサイトーシスに特に好適である。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、細胞の細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂを含み、細胞が、腫瘍細胞、自己免疫細胞、ウイルス感染細胞などの感染細胞、又は遺伝子欠損若しくは酵素欠損を含む細胞などの異常な細胞である本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのｓｄＡｂが、細胞の細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂであって、免疫グロブリン：ＩｇＧ型ＯＫＴ－９などの抗ＣＤ７１抗体、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブイブリツモマブなどの抗ＣＤ２０抗体、オレゴボマブなどの抗ＣＡ１２５抗体、エドレコロマブなどの抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）抗体、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体、ブレンツキシマブなどの抗ＣＤ３０抗体、ゲムツズマブ、ｈｕＭｙ９－６などの抗ＣＤ３３抗体、エタラシズマブなどの抗血管性インテグリンアルファ－ｖベータ－３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体、エプラツズマブ、ピナツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２２抗体モキセツモマブの結合断片（Ｆｖ）、ヒト化モノクローナル抗体イノツズマブ、ラベツズマブなどの抗ＣＥＡ抗体、ビバツズマブなどの抗ＣＤ４４ｖ６抗体、シブロツズマブなどの抗ＦＡＰ抗体、ｈｕＢ４などの抗ＣＤ１９抗体、ｈｕＣ２４２などの抗ＣａｎＡｇ抗体、ｈｕＮ９０１などの抗ＣＤ５６抗体、ダラツムマブなどの抗ＣＤ３８抗体、ＯＫＴ－１０抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、ＤＳ６などの抗ＣＡ６抗体、シズツムマブなどの抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体、３Ｂ７、ＣＮＴＯ ９５などの抗インテグリン抗体、Ｂ－Ｂ４などの抗シンデカン－１抗体、ポラツズマブなどの抗ＣＤ７９ｂ、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか１つ以上、好ましくは、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体のいずれか１つ、より好ましくは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、マツズマブ、抗ＣＤ７１抗体、ＯＫＴ－９、最も好ましくは、トラスツズマブ、セツキシマブ、抗ＣＤ７１抗体 ＯＫＴ－９のいずれか１つに由来するか又は基づくｓｄＡｂを含む本発明のコンジュゲートである。
これらの細胞表面分子は通常、少なくともある特定の程度で腫瘍細胞特異性を有する腫瘍細胞上に存在する。腫瘍細胞特異性は、これらの受容体を本発明のコンジュゲートのための好適な標的にし、したがって、コンジュゲートにおけるｓｄＡｂは、そのような細胞表面受容体に結合することができる。本発明のコンジュゲートによって含まれるサポニンは、本発明のコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂによって標的化される（腫瘍）細胞などの細胞の細胞質ゾルにおける本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の放出及び送達を刺激することができるため、例えば、ＡＤＣ及びＡＯＣのための標的として機能するためのその適合性に関して知られる細胞表面受容体であるｓｄＡｂのための標的（腫瘍）細胞表面分子として選択することが特に好適である。それとともに、本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートの一部であるエフェクター分子の、本発明の全く同じコンジュゲートによって含まれるサポニンと合わせた同時送達に好適であり、そのコンジュゲートは、ｓｄＡｂを含み及びサポニンを含む改良型ＡＤＣ又は改良型ＡＯＣである。本発明のコンジュゲートで腫瘍細胞特異的受容体を標的化することによって、標的細胞エンドソーム及び／又はリソソームへのコンジュゲートの一部としてのサポニンのエンドサイトーシス及び送達を促進する。腫瘍細胞が本発明のコンジュゲートと接触されるとき、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子は、エンドソーム又はリソソームに同時送達され、共存したサポニンの影響下で、引き続いてエフェクター分子が標的細胞の細胞質ゾルに移行させられる。本明細書で先に説明されるとおり、本発明のコンジュゲートの一部としての標的化サポニンの適用は、受容体リガンド、抗体又はｓｄＡｂなどの細胞標的化結合分子を欠く遊離サポニンの適用と比較して、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の生物活性が考慮されるとき、サポニンの増強効果の約１００倍～１０００倍の改善をもたらす。
本発明のコンジュゲートにおけるラクダ類ＶＨなどの小さいｓｄＡｂの適用は、抗体に基づくＡＤＣについて一般的に観察されるクリアランス速度と比較して、コンジュゲートが投与されたヒト対象の血行から及び身体からの本発明のコンジュゲートのクリアランスを妨げるか又は遅くする。加えて、相対的に小さいサイズのｓｄＡｂに起因して、連結されたタンパク質ドメインの存在に起因する標的細胞内部のサポニン活性を制限するか又は妨害するためのリスクは、より大きいサイズの、例えば、抗体と比較して、そのような抗体がサポニンに結合されるときに制限される。一般に、サポニンに連結された分子のサイズが小さいほど、結合される分子、例えば、ＶＨＨなどのｓｄＡｂの存在に起因する細胞内部のサポニン活性との干渉のリスクが小さくなる。さらに、相対的に小さいサイズのｓｄＡｂは、腫瘍組織などの組織中における迅速な分布をもたらし、例えば、ＡＤＣ、ＯＡＣにおいて一般的に適用される相対的に大きなサイズのＩｇＧと比較して、本発明のコンジュゲートによる標的細胞への到達の改善を可能にし、それとともに標的細胞への結合（の程度）の改善を可能にしている。本発明のコンジュゲートにおいてｓｄＡｂを適用する多くの利点の１つは、例えば、ＩｇＧ型の通常の抗体に共通するＦｃテイルの欠如である。本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂのＦｃテイルの欠如は、コンジュゲートが必要とする患者に投与されるとき、Ｆｃγ－受容体活性化に関連する望まれない副作用などのＦｃγ－受容体媒介性オフターゲット効果の発生を予防する。Ｆｃテイルの欠如は、例えば、抗体に基づくＡＤＣが投与される患者の細胞へのＦｃの結合によって生成される副作用のリスクを排除する。本発明のｓｄＡｂを含むコンジュゲートは、Ｆｃに媒介される望まれない副作用のこのリスクを有しない。
ある実施形態は、少なくとも１つのエフェクター分子が、少なくとも１つのｓｄＡｂ、好ましくは、少なくとも１つのｓｄＡｂのうちの１つ及び／若しくは少なくとも１つのサポニンのうちの少なくとも１つ、好ましくは１つにリンカーを介して共有結合されるか若しくはｓｄＡｂ及び／若しくはサポニンに直接的に共有結合され、並びに／又は少なくとも１つのサポニンが、少なくとも１つのｓｄＡｂ、好ましくは、少なくとも１つのｓｄＡｂのうちの１つ及び／若しくは少なくとも１つのエフェクター分子、好ましくは、少なくとも１つのエフェクター分子のうちの１つにリンカーを介して共有結合されるか若しくはｓｄＡｂ及び／若しくはエフェクター分子に直接的に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、コンジュゲートが、少なくとも１つのｓｄＡｂ、少なくとも１つのサポニン及び少なくとも１つのエフェクター分子の各々が、好ましくは別々に、直接的に、又はリンカーを介して三官能性リンカーに共有結合された三官能性リンカーを含み、好ましくは、コンジュゲートが、１つのｓｄＡｂ、少なくとも１つのサポニン及び少なくとも１つ、好ましくは、１つのエフェクター分子が別々に、直接的に、又はリンカーを介して三官能性リンカーに共有結合された三官能性リンカーを含む本発明のコンジュゲートである。
リンカーを介するｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子へのサポニンのカップリングは、ｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子へのサポニンのカップリングのための結合部位が考慮されるときに柔軟性をもたらす。さらに、そのようなリンカーは、ｓｄＡｂとサポニンとエフェクター分子の間でスペーサーとして作用してもよく、その結果、ｓｄＡｂは、細胞表面分子上の結合部位に結合するその能力を維持し、サポニンは、コンジュゲートによって含まれるエフェクター分子のエンドソーム脱出を強化するその能力を維持し、エフェクター分子は、その細胞内結合パートナーに対するその生物活性を維持する。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、少なくとも１つのｓｄＡｂの１つ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子の１つにおけるスルフヒドリル基に対するチオ－エーテル結合を介して共有結合され、その共有結合が、好ましくは、サポニンのアグリコンコア構造のＣ２３位におけるアルデヒド基に共有結合され及びシステインのスルフヒドリル基などのｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子におけるスルフヒドリル基に共有結合されるリンカーＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）を介するものである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、Ｃ２３位においてアルデヒド官能基を任意選択により有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及びサポニンのアグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基で結合される第１の糖鎖においてグルクロン酸単位を含むバイ－デスモサイドトリテルペンサポニン又はその誘導体であり、サポニンが、第１の糖鎖におけるグルクロン酸単位のカルボキシル基を介して、好ましくは、リンカーを介して少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子のアミノ酸残基に共有結合され、アミノ酸残基が、好ましくは、システイン及びリジンから選択される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基での第１の糖鎖においてグルクロン酸単位を含み、グルクロン酸単位がリンカーに共有結合され、リンカーが、好ましくは、ｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子のリジン又はＮ末端のアミン基などの少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子におけるアミン基にアミド結合を介して共有結合され、好ましくは、前記リンカーが、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）である本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンの２つ以上の共有結合されたサポニン部分、好ましくは、そのような部分の２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２、６４、１２８若しくは１～１００個、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のそのような部分を含む本発明のコンジュゲートである。ある実施形態は、コンジュゲートが、少なくとも１つのサポニンの１～１００個のサポニン部分、好ましくは、２～６４個のサポニン部分、より好ましくは、４～３２個のサポニン部分、最も好ましくは、８～１６個のサポニン部分、又はその間の任意の数を含む本発明のコンジュゲートである。通常、本発明のコンジュゲートは、１、２、４、８又は１６個のサポニン部分（サポニン分子のコピー）を含む。例えば、４個のサポニン分子が、Ｇ２デンドロンに共有結合的に連結され、１又は２個などの少なくとも１個のデンドロン－（サポニン）４コンジュゲート（サポニンコンジュゲート）が、ｓｄＡｂに共有結合的に連結される。例えば、８個のサポニン分子が、Ｇ３デンドロンに共有結合的に連結され、１又は２個などの少なくとも１個のデンドロン－（サポニン）８コンジュゲート（サポニンコンジュゲート）が、ｓｄＡｂに共有結合的に連結される。ある実施形態は、コンジュゲートが、２個以上のサポニン部分を含み、サポニン部分が、同じであるか又は異なる本発明のコンジュゲートである。すなわち、２個以上のサポニンが、本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂに共有結合的に連結される場合、これらのサポニンは全て同じサポニンのコピーであり得るか、又はサポニンは異なるサポニンである。複数のサポニン部分を含むコンジュゲートが好ましく、ｓｄＡｂに結合されるサポニンは同じである。例えば、コンジュゲート中のｓｄＡｂに共有結合的に連結された２、４、８、１６個のサポニン分子、例えば、２～１６個のＳＯ１８６１コピー又はＱＳ－２１コピー、好ましくは、ＳＯ１８６１。
ある実施形態は、２つ以上の共有結合されたサポニン部分が、少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／若しくは少なくとも１つのエフェクター分子のアミノ酸残基に、好ましくは、システイン及び／若しくはリジンに直接的に共有結合され、並びに／又はリンカー及び／若しくは切断可能なリンカーを介して共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、分子構造（ＩＩ）：
（サポニン－リンカー－）ａ免疫グロブリン－エフェクター部分
（構造（ＩＩ））
（式中、ａ＝１～４、好ましくは、１、２、４であり、及び免疫グロブリンは、好ましくは、ｓｄＡｂである）の分子形式を本質的に有するか
又は分子構造（ＩＩＩ）：
（サポニン－デンドロン（－サポニン）ｘ）ｂ－免疫グロブリン－エフェクター部分
（構造（ＩＩＩ））
（式中、ｘ＝１～１００、好ましくは、１～６３、１～３１、１～１５、１～７、又は３；ｂ＝１～４、好ましくは、１、２、４であり、及び免疫グロブリンは、好ましくは、ｓｄＡｂである）の分子形式を本質的に有するか
又は分子構造（ＩＶ）：
（サポニン－三官能性リンカー（－エフェクター部分））ｃ－免疫グロブリン
（構造（ＩＶ））
（式中、ｃ＝１～４、好ましくは、１、２、４であり、及び免疫グロブリンは、好ましくは、ｓｄＡｂである）の分子形式を本質的に有するか
又は分子構造（Ｖ）：
（（サポニン－デンドロン（－サポニン）ｙ）－三官能性リンカー（－エフェクター部分））ｄ－Ｉｇ
（構造（Ｖ））
（式中、ｙ＝１～１００、好ましくは、１～６３、１～３１、１～１５、１～７、又は３；ｄ＝１～４、好ましくは、１、２、４であり、及び免疫グロブリン（「Ｉｇ」）は、好ましくは、ｓｄＡｂである）の分子形式を本質的に有する本発明によるエンドソーム及び／又はリソソーム脱出強化コンジュゲートである。
好ましくは、ｘ又はｙは、３、７又は１５である。好ましくは、ｂ又はｄは、１、２又は４であるが、いくつかの実施形態では、ｂ又はｄは、３であり、免疫グロブリンが、ＶＨＨなどのｓｄＡｂであるとき、ａは、好ましくは、１であり、ｂは、好ましくは、１であり、ｃは、好ましくは、１であり、ｄは、好ましくは、１である。デンドロンは、例えば、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロンである。好ましくは、サポニンは、＜６．５のｐＨ条件（すなわち、エンドソーム、エンドリソソーム、リソソーム中のｐＨ）下にて細胞内で切断されるヒドラゾン結合などの切断可能な結合を介してリンカーに結合される。好ましくは、リンカーは、ＥＭＣＨである。好ましくは、三官能性リンカーは、本明細書の下で示されるとおりの構造Ａを有するリンカーである。構造ＩＩ及びＩＩＩに関して、好ましくは、エフェクター部分は、切断可能なリンカーなどのリンカーを介してＩｇに結合される。
ある実施形態は、２つ以上の共有結合されたサポニン部分が、少なくとも１つのオリゴマー分子又はポリマー分子及びそれに共有結合された２つ以上のサポニンを含む共有結合性サポニンコンジュゲートの一部であり、共有結合性サポニンコンジュゲートが、少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つに共有結合される本発明のコンジュゲートである。ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、サポニンが共有結合されるオリゴマー分子又はポリマー分子を含む共有結合性サポニンコンジュゲートの一部であり、及びｓｄＡｂもまた、サポニンが結合されるものと同じオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のコンジュゲートである。したがって、オリゴマー分子又はポリマー分子は、１つ以上の共有結合されたサポニン部分を含み、ｓｄＡｂに共有結合される。サポニン及びｓｄＡｂは、ポリマー分子又はオリゴマー分子を介して互いに共有結合される。オリゴマー分子又はポリマー分子は、ｓｄＡｂとサポニンを合わせて連結して、本発明のサポニンを含むコンジュゲートをもたらす。加えて、エフェクター分子は、オリゴマー分子又はポリマー分子に結合されるか、又はｓｄＡｂに結合される。
オリゴマー又はポリマー分子に結合されたサポニンのそのような共有結合性サポニンコンジュゲートは、複数のサポニン部分のための担体（支持体、足場）として機能し、これは、単結合を介して、好ましくは（切断可能な）リンカーを介してコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂに結合され得る。共有結合性サポニンコンジュゲートは、これらのサポニンを共有結合的に連結するための結合部位を含む選択されたオリゴマー又はポリマー構造の型に関連する１～２００個のサポニン部分などの任意の選択された数の共有結合されたサポニン部分を有し得るため、そのような共有結合性サポニンの適用は、本発明のコンジュゲートにおけるサポニン部分の数が考慮されるときに自由度を提供する。例えば、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の細胞質ゾル送達に関して、本発明のコンジュゲート中に存在するサポニンの数は、共有結合性サポニンコンジュゲートが本発明のコンジュゲートの一部であるとき、及びエフェクター分子が、エフェクター分子がその生物活性を発揮するべきである標的細胞のエンドソーム又はリソソームにおける全く同じコンジュゲートの複合的な部分としてサポニンと共存するとき、エフェクター分子の細胞質ゾル送達を刺激するのに足りており及び十分ないくつかのサポニン部分を有する共有結合性サポニンコンジュゲートを提供することによって適応させられ得る。
好ましくは、１～８個の共有結合性サポニンコンジュゲートが、より好ましくは２～４個のそのような共有結合性サポニンコンジュゲートが、ｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子に結合され、少なくとも１つの共有結合性サポニンコンジュゲートは、任意選択により、デンドロン（例えば、Ｇ２デンドロン、Ｇ３デンドロン、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロン）に基づき、任意選択により、１～３２個のサポニン部分、好ましくは、２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２個のそのような部分、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間にある任意の数のそのような部分は、直接的に又はリンカーを介して、少なくとも１つの共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される。例えば、４個のサポニン部分は、Ｇ２デンドロンに結合され、８個のサポニン部分は、Ｇ３デンドロンに結合され、１６個のサポニン部分は、Ｇ４デンドロンに結合され、サポニンは、例えば、ＳＯ１８６１又はＱＳ２１、好ましくは、ＳＯ１８６１である。
ある実施形態は、２つ以上の共有結合されたサポニン部分が、サポニンが共有結合されるオリゴマー分子又はポリマー分子を含む共有結合性サポニンコンジュゲートの一部であり、及びｓｄＡｂもまた、サポニンが結合される同じオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合され、及びエフェクター部分が、ｓｄＡｂ又はオリゴマー分子若しくはポリマー分子に共有結合され、好ましくは、サポニンを含む１～８個のそのようなオリゴマー分子又はポリマー分子が、ｓｄＡｂに共有結合されるか、又はサポニンを含む２～４個のオリゴマー分子又はポリマー分子が、ｓｄＡｂに共有結合され、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子が、任意選択により、それぞれ４、８、１６又は３２個のサポニン部分を共有結合するための４、８、１６及び３２個の結合部位を有するＧ２デンドロン、Ｇ３デンドロン、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロンなどのデンドロンであり、任意選択により、１～３２個のサポニン部分、好ましくは、２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２個のそのような部分、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のそのような部分が、直接的に又はリンカーを介して、少なくとも１つの共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
好ましくは、共有結合性サポニンコンジュゲートの１又は２つは、本発明のコンジュゲート中の単一のｓｄＡｂに結合される。多くの目的のために、コンジュゲートによって含まれる単一のｓｄＡｂへの単一のサポニンのカップリング又は単一の共有結合性サポニンコンジュゲートのカップリングは、標的細胞及び前記細胞の細胞質ゾルへのエフェクター分子の送達の効率的な刺激のために十分であり、エフェクター分子は、本発明のコンジュゲートによって含まれる。通常、４、８又は１６個のサポニンは、本発明のコンジュゲート中のｓｄＡｂにカップリングされた単一の共有結合性サポニンコンジュゲートによって含まれる４又は８個のサポニンなどの本発明のコンジュゲートによって含まれる。例えば、４、８又は１６個のサポニン部分は、それぞれＧ２デンドロン、Ｇ３デンドロン又はＧ４デンドロンに共有結合的にカップリングされる。通常、本発明のそのようなコンジュゲートは、１つ又は複数のサポニン又は共有結合性サポニンコンジュゲートが結合される単一のｓｄＡｂを含み、好ましくは、単一のサポニン又は単一の共有結合性サポニンコンジュゲートは、コンジュゲートの一部である。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子が、Ｇ２デンドロン、Ｇ３デンドロン、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロンなどのデンドロンであり、１～３２個のサポニン部分、好ましくは、２、３、４個（例えば、Ｇ２デンドロンに関して）、５、６、８個（例えば、Ｇ３デンドロンに関して）、１０、１６個（例えば、Ｇ４デンドロンに関して）、３２個（例えば、Ｇ５デンドロンに関して）のサポニン部分、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のサポニン部分が、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、サポニンを含む１～８個のオリゴマー分子又はポリマー分子が、ｓｄＡｂに共有結合される本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。
ある実施形態は、サポニンを含む２～４個のオリゴマー分子又はポリマー分子が、ｓｄＡｂに共有結合される本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子がデンドロンである本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。生物学的に十分に不活性であるか又は活性のない、好ましくは、生物学的に不活性であるか又は活性のないデンドロン又はポリエチレングリコールなどのオリゴマー分子又はポリマー分子が好ましい。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子が、それぞれ４、８、１６又は３２個のサポニン部分に共有結合するための４、８、１６又は３２個の結合部位を有するＧ２デンドロン、Ｇ３デンドロン、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロンである本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。
ある実施形態は、１～３２個のサポニン部分、好ましくは、２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２個のサポニン部分、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のサポニン部分が、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のサポニンを含むコンジュゲートである。本発明に関連して「サポニンを含むコンジュゲート」は、少なくとも１つのサポニン分子及び少なくとも１つのｓｄＡｂ及び少なくとも１つのエフェクター分子のコンジュゲートを指しており、単一のｓｄＡｂ及び単一のサポニン分子を含む本発明のコンジュゲートに限定されないことが理解されるべきである。例えば、コンジュゲートは、ＶＨＨなどの１又は２個のｓｄＡｂ、及び２、４、８、１６個のサポニン分子などの１～３２個のサポニン分子、及び少なくとも１個のエフェクター部分を含むか又はそれらからなる。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、切断可能なリンカーを介して少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つに共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、切断可能なリンカーが、酸性条件、還元的条件、酵素的条件及び／又は光誘導性条件下で切断にかけられ、好ましくは、切断可能なリンカーが、酸性条件下で切断にかけられるヒドラゾン結合及びヒドラジド結合、並びに／又はタンパク質分解、例えば、カテプシンＢによるタンパク質分解に影響されやすい結合、並びに／又はジスルフィド結合などの還元的条件下で切断されやすい結合から選択される切断可能な結合を含む本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、切断可能なリンカーが、例えば、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞のエンドソーム及び／又はリソソームに存在するような酸性条件下、好ましくは、ｐＨ４．０～６．５、より好ましくは、ｐＨ≦５．５でインビボでの切断にかけられる本発明のコンジュゲートである。
エンドソーム及びリソソームに見られるような条件下で切断可能なリンカーであるそのような切断可能なリンカーは、本発明のコンジュゲートの残部からのサポニンの切断（分離）時にエンドソーム又はリソソーム内部への遊離サポニンの送達を促進する。このように、本発明のコンジュゲートは、エンドソーム（又はリソソーム）から標的細胞の細胞質ゾルへの本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の送達を刺激し及び／又は促進する遊離サポニンの能力に寄与する、標的細胞上の細胞表面分子へのｓｄＡｂの特異的結合時のサポニンの細胞標的化送達の利点、及び細胞内、すなわち、エンドソーム（又はリソソーム）内部での遊離サポニンの存在の利点を組み合わせている。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子が、少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つに、好ましくは、ｓｄＡｂ及び／又はエフェクター分子のアミノ酸残基に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、本発明による切断可能なリンカーを介して共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、イミン結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジド結合、オキシム結合、１，３－ジオキソラン結合、ジスルフィド結合、チオ－エーテル結合、アミド結合、ペプチド結合又はエステル結合のいずれか１つ以上を介して、好ましくはリンカーを介して、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合される本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、Ｃ２３位におけるアルデヒド官能基を含むアグリコンコア構造を含み、及び少なくとも１つのサポニンが、任意選択により、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基で第１の糖鎖においてグルクロン酸官能基を含み、アルデヒド官能基が、共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子への共有結合に関与し、及び／又は存在する場合、グルクロン酸官能基が、直接的な共有結合を介する、又はリンカー（リンカーは、切断可能なリンカー又は安定なリンカーである）を介するサポニンの結合である共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子に対する共有結合に関与する本発明のコンジュゲートである。本明細書では、安定とは、サポニンとｓｄＡｂ又はエフェクター分子の間の結合、又はサポニンとオリゴマー又はポリマー構造の間の結合を指し、この結合は、細胞内の酸性条件、特に、そのような細胞のエンドソーム又はリソソーム内の酸性条件下で未変化のままである（切断されない）。加えて、そのような安定な結合は、例えば、共有結合性サポニンコンジュゲートを含む本発明のコンジュゲートが投与されるヒト対象の血行及び器官において未変化のままである（すなわち、切断されない）。対照的に、コンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂ又はエフェクター分子へのサポニンの結合に関連して切断可能なリンカー、又はオリゴマー構造若しくはポリマー構造は、ヒト細胞、例えば、腫瘍細胞などの哺乳動物細胞のエンドソーム及びリソソーム内部で見られるとおりの酸性条件下で切断される結合を指すが、そのような切断可能なリンカーは、そのような切断可能な結合を含むコンジュゲートが、血行又は器官中、すなわち、例えば、本発明のコンジュゲートが投与されるヒト対象の細胞の外部に存在するときに未変化のままである（切断されない）。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造のＣ２３位におけるアルデヒド官能基が、リンカーＥＭＣＨに共有結合され、ＥＭＣＨが、システインのスルフヒドリル基などの共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子におけるスルフヒドリル基に対するチオ－エーテル結合を介して共有結合される本発明のコンジュゲートである。サポニンのアグリコンのアルデヒド基へのＥＭＣＨリンカーの結合は、ヒドラゾン結合の形成をもたらす。そのようなヒドラゾン結合は、エンドソーム及びリソソーム内の酸性条件下で切断可能な結合の典型的な例である。本発明のコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂ若しくは本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子、又は共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー構造若しくはポリマー構造にカップリングされるサポニンであって、そのような共有結合性サポニンコンジュゲートは、コンジュゲートのｓｄＡｂ又はエフェクター分子にカップリングされ、コンジュゲートのｓｄＡｂが結合することができる細胞表面分子を露出する標的細胞のエンドソーム又はリソソームにおいて送達されると本発明のコンジュゲートから遊離可能である。このように、本発明のコンジュゲートにおけるｓｄＡｂ又はエフェクター分子にカップリングされたサポニンは、細胞の外部からエンドソーム（又はリソソーム）に移行させられ、エンドソーム（又はリソソーム）において、サポニンは、ヒドラゾン結合のｐＨに駆動される切断時にコンジュゲートの残部から遊離される。エンドソーム（又はリソソーム）において、遊離サポニンは、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター分子の細胞質ゾルへの送達が考慮されるときにその刺激活性を発揮することができる。驚くべきことに、本発明者らは、サポニンに関して、サポニンが遊離形態でエンドソーム又はリソソーム中に存在することはサポニンのエンドソーム脱出強化活性に必須ではないことを確立した。また、例えば、ある特定のコンジュゲートによって含まれるサポニンは、ある特定のコンジュゲートの一部としてのエフェクター分子及びサポニンの両方が同じ標的細胞と接触されると、エンドソーム／リソソームから標的化される細胞の細胞質ゾルへのエフェクター分子の送達を増強している。
ある実施形態は、サポニンのアグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基での第１の糖鎖におけるグルクロン酸官能基が、リンカーＨＡＴＵに共有結合され、ＨＡＴＵが、タンパク質のリジン又はＮ末端のアミン基などの共有結合性サポニンコンジュゲートのオリゴマー分子又はポリマー分子におけるアミン基に対するアミド結合を介して共有結合される本発明のコンジュゲートである。ＨＡＴＵリンカーが本発明のコンジュゲートのサポニン及びｓｄＡｂ又はエフェクター分子にカップリングされるとき、サポニンは、例えば、ｓｄＡｂ又はエフェクター分子のＮ末端（そのようなエフェクター分子がタンパク質毒素などのタンパク質性エフェクター分子である場合）又はｓｄＡｂ中に存在するか又はエフェクター分子中に存在するリジンのアミン基に結合される。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子が、少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは１つ、及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つ、好ましくは１つに、好ましくはｓｄＡｂのアミノ酸残基及び／又はエフェクター分子のアミノ酸残基に結合され、共有結合性サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子上のクリックケミストリー基を含み、クリックケミストリー基が、好ましくは、テトラジン、アジド、アルケン若しくはアルキン、又はこれらの基の環状誘導体から選択され、より好ましくは、クリックケミストリー基が、アジドである本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、共有結合性サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子が、直鎖状ポリマー、分岐状ポリマー及び／又は環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、Ｇ２デンドロン又はＧ３デンドロン又はＧ４デンドロン又はＧ５デンドロンなどのデンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、ＤＮＡ、ポリペプチド、ポリ－リジン、ポリ－エチレングリコール、ＯＥＧ３、ＯＥＧ４及びＯＥＧ５などのオリゴ－エチレングリコール（ＯＥＧ）、又は集合体が好ましくは共有結合的な架橋によって構築されるこれらのポリマー構造及び／又はオリゴマー構造の集合体から選択されるポリマー構造及び／又はオリゴマー構造を含み、好ましくは、共有結合性サポニンコンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子がポリ－アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーなどのデンドロンである本発明のコンジュゲートである。ある実施形態は、共有結合性サポニン／ｓｄＡｂ／エフェクター部分コンジュゲートのポリマー分子又はオリゴマー分子が、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、ＤＮＡ、例えば、２～２００個の核酸、ポリ－エチレングリコール、ＯＥＧ３、ＯＥＧ４及びＯＥＧ５などのオリゴ－エチレングリコール（ＯＥＧ）から選択されるポリマー構造及び／又はオリゴマー構造を含む本発明のコンジュゲートである。オリゴマー分子又はポリマー分子は、内因性の生物活性の欠如について選択される。通常、選択されたオリゴマー分子又はポリマー分子は、そのようなオリゴマー分子又はポリマー分子を含む本発明のサポニンを含むコンジュゲートが前記ヒト対象に投与されるときに健康リスクをもたらすことになるか若しくはもたらす可能性があるか又はヒト対象において有害事象をもたらすことになるか若しくはもたらす可能性がある生物活性が考慮されるときに活性のない分子である。本発明のコンジュゲートにおいて組み込まれることになる選択されたサポニンの数によって駆動されるため、オリゴマー構造又はポリマー構造の型及びサイズ又は長さが選択される。すなわち、本発明のコンジュゲートの形成のためのコンジュゲートによって含まれるｓｄＡｂ又はエフェクター分子にカップリングされることになるサポニンの数は、所望の数のサポニンをカップリングするための十分な量の結合部位を有する好適なオリゴマー又はポリマー構造の選択を決定することができ、それとともに、本発明のコンジュゲートの提供のためｓｄＡｂ又はエフェクター分子にカップリングされることになる選択された数のサポニン部分を有する共有結合性サポニンコンジュゲートを提供することができる。例えば、ＯＥＧの長さ又はデンドロン若しくはポリ－リジン分子のサイズは、そのようなオリゴマー又はポリマー構造に共有結合的に連結され得るサポニンの最大数を決定する。
したがって、本発明によるコンジュゲートは、少なくとも１つのサポニンを含む。これに関連して「少なくとも１つ」は、コンジュゲートが１つのサポニン分子を含むが、一対（例えば、２、３又は４個）のサポニン又は多数（例えば、１０、２０又は１００個）のサポニンも含む場合があることを意味する。適用に応じて、コンジュゲートは、共有結合されたサポニンを有する共有結合された足場（共有結合性サポニンコンジュゲート）を含んでもよく、足場は、それが定義された数のサポニンを含むように設計されてもよい。好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、無作為な数ではなく定義された数又は範囲のサポニンを含む。これは、販売承認に関連する薬物開発のために特に有利である。これに関する定義された数は、コンジュゲートが好ましくは、前に定義された数のサポニンを含むことを意味する。これは、例えば、サポニンが結合するためのある特定の数の可能な部分を有するポリマー構造を含む足場を設計することによって達成される。理想的な状況下で、これらの部分の全ては、サポニンにカップリングされ、足場は前に定義された数のサポニンを含む。例えば、２、４、８、１６、３２、６４などのサポニンを含む足場の標準的なセットを提供し、最適な数が使用者の必要に応じて使用者によって容易に試験され得ることが想定される。ある実施形態は、本発明の足場を含む本発明のコンジュゲート（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）であり、サポニンは、例えば、理想的ではない状況下では、ポリマー構造中に存在する全ての部分がサポニンに結合するわけではないため、定義された範囲に存在する。そのような範囲は、例えば、足場当たり２～４個のサポニン分子、足場当たり３～６個のサポニン分子、足場当たり４～８個のサポニン分子、足場当たり６～８個のサポニン分子、足場当たり６～１２個のサポニン分子などであり得る。したがって、そのような場合、本発明による足場を含むコンジュゲートは、範囲が２～４として定義される場合、２、３又は４個のサポニンを含む。
足場は、足場に共有結合されるサポニンの型に基本的に依存せず、足場はその後（順次）コンジュゲートに共有結合的にカップリングされる。したがって、足場を含む本発明のコンジュゲート（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）は、プラットフォーム技術のための基礎製品である。少なくとも１つの共有結合されたサポニンは、本発明のコンジュゲートによって含まれる細胞表面分子標的化ｓｄＡｂに結合されたエフェクター分子の細胞内送達を媒介するため、本発明による足場技術は、サポニンによる制御された細胞内へのエフェクター部分の送達を媒介するシステムである。足場は、ｓｄＡｂにおける単一の定義された位置でコンジュゲートによって含まれるサポニン及び細胞表面分子標的化ｓｄＡｂに連結され得る最適化された機能的に活性な単位を提供する。
ある実施形態は、ポリマー又はオリゴマー構造の単量体の数が正確に定義された数又は範囲である本発明による足場を含む本発明のコンジュゲート（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）である。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は、ポリ（アミン）、例えば、ポリエチレンイミン及びポリ（アミドアミン）などの構造、又はポリエチレングリコール、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクタム）、ポリラクチド－コ－グリコリドコポリマー、ポリ（デキストリン）などのポリ（エステル）、又はペプチド若しくはタンパク質などの構造、又は天然及び／又は人工ポリアミノ酸、例えば、ポリ－リジン、２～１００個のヌクレオチドを含むＤＮＡなどのＤＮＡポリマー、例えば、２～２００個のヌクレオチドを含む安定化ＲＮＡポリマー又はＰＮＡ（ペプチド核酸）ポリマーを含み、直鎖状、分岐状又は環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン（例えば、それぞれ４、８、１６又は３２個のサポニン部分の最大限共有結合するためのＧ２、Ｇ３、Ｇ４又はＧ５デンドロンのいずれか）、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー又は純粋な若しくは混合されたこれらの構造の集合体として現れる。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は、生体適合性であり、生体適合性は、ポリマー又はオリゴマー構造が、生物体において実質的な急性又は慢性毒性を示さず、そのまま排出されるか又は身体の代謝により排出可能な化合物及び／又は生理的化合物に完全に分解できることを意味する。集合体は、共有結合性の架橋若しくは非共有結合及び／又は引力によって構築され得る。したがって、それらはまた、ナノゲル、ミクロゲル、又はヒドロゲルを形成することができるか、又はコレステロール及び／若しくはリン脂質を含む無機ナノ粒子、コロイド、リポソーム、ミセル又は粒子様構造などの担体に結合することができる。前記ポリマー又はオリゴマー構造は、好ましくは、グリコシド分子（及び／又はエフェクター分子及び／又はリガンド、モノクローナル抗体若しくはｓｄＡｂなどのその断片などの担体分子）のカップリングのための正確に定義された数又は範囲のカップリング部分（化学基）を有する。ポリマー又はオリゴマー構造におけるカップリング部分（化学基）の正確に定義された数又は範囲の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは（約）１００％が、本発明による足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）におけるグリコシド分子（本発明のサポニン）によって占有される。
好ましくは、デンドロンは、フォーカルポイントと呼ばれる木の起点で単一の化学的にアドレス指定できる基を有する分岐状の明確に定義された樹木状ポリマーである。デンドリマーは、２つ以上のデンドロンをそれらのフォーカルポイントで連結したものである。デンドロン化ポリマーは、１つ以上のデンドロンのフォーカルポイントがポリマーに連結されたものである。好ましい実施形態では、本発明による足場が提供され、ポリマー又はオリゴマー構造は、直鎖状、分岐状若しくは環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー又は純粋な若しくは混合されたこれらの構造の集合体を含み、集合体は、共有結合性架橋又は非共有結合性引力によって構築することができ、及びナノゲル、ミクロゲル、又はヒドロゲルを形成することができ、及び好ましくは、ポリマーは、ポリ（アミン）の誘導体、例えば、ポリエチレンイミン及びポリ（アミドアミン）、並びにポリエチレングリコール、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクタム）、ポリラクチド－コ－グリコリドコポリマー、及びポリ（デキストリン）などのポリ（エステル）などの構造、並びにポリ－リジン、又はペプチド若しくはタンパク質などの天然及び／若しくは人工ポリアミノ酸又は２～１００個のヌクレオチドを含むＤＮＡなどのＤＮＡポリマー、例えば、２～２００個のヌクレオチドを含む安定化ＲＮＡポリマー又はＰＮＡ（ペプチド核酸）ポリマーなどの構造である。好ましくは、ポリマー又はオリゴマー構造は、生体適合性である。
ある実施形態は、少なくとも１つのサポニンが、三官能性リンカー、好ましくは、構造Ａ：
Figure 2023532003000002
Figure 2023532003000003
によって表される分子構造を有し、
Ｓが、本発明による少なくとも１つのサポニン又は共有結合性サポニンコンジュゲートであり、Ｅが、少なくとも１つ、好ましくは１つのエフェクター分子であり、Ａが、単一のｓｄＡｂなどの少なくとも１つのｓｄＡｂであり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３がそれぞれ個別に、それぞれ三官能性リンカー及びサポニン又は共有結合性サポニンコンジュゲート、エフェクター分子及びｓｄＡｂ間の結合であるか、又はＬ１、Ｌ２及びＬ３がリンカー（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、同じであるか又は異なる）である本発明のコンジュゲートである。
構造Ａを有する三官能性リンカーに基づき及び構造Ｂとして一般的に示される構造による構造を有するコンジュゲートの例は、分子１６として図４４に示され；分子１６の化学合成は、図４０～４４に示される（本明細書の下の実施例の節も参照のこと）。エフェクター部分Ｅは、ＢＮＡ（ＡｐｏＢ）であり、サポニンは、デンドロン分子に共有結合的に連結された４個のＳＯ１８６１であり、ここでｓｄＡｂは、細胞クローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８Ｃ－タグによって生成されるＶＨＨであり、したがって、ＨＩＶｇｐ４１に結合するためのｓｄＡｂである。別の例では、サポニンは、配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２及び／若しくは配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ９Ｇ８、又は直列の７Ｄ１２－９Ｇ８（例えば、アミノ酸配列は、配列番号７３に従う）などの１つ以上の７Ｄ１２ドメイン及び１つ以上の９Ｇ８ドメインの直鎖状多量体である。
別段の指示がない限り、本発明のサポニンのエンドソーム脱出機構に関連する場合は特に、「エンドソーム」又は「エンドソーム脱出」という用語が本明細書で使用される場合は常に、それはエンドリソソーム及びリソソーム、並びにそれぞれエンドリソソーム及びリソソームからの脱出も含む。細胞質ゾルに入った後、前記物質は、核などの他の細胞単位に移動する可能性がある。
正式の用語において、グリコシドは、糖基がそのアノマー炭素を介してグリコシド結合により別の基に結合されている任意の分子である。本発明に関連してサポニンなどのグリコシド分子は、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、特に、エフェクター部分のエンドソーム脱出を促進することによってエフェクター部分の効果をさらに強化することができるような分子である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、グリコシド分子（本明細書及び特許請求の範囲において例示されるものなどの本発明のサポニン）は、エンドサイトーシス経路及びリサイクリング経路の区画及び小胞の膜と相互作用し、それらを前記エフェクター部分が漏れるようにして、エンドソーム脱出の増強をもたらす。用語「足場がエフェクター部分のエンドソーム脱出を増強することができる」は、リンカーを介して若しくは直接的にｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化抗体にカップリングされるか又は足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）のポリマー若しくはオリゴマー構造を介してカップリングされる少なくとも１つのサポニン（グリコシド分子）が、両方の分子がエンドソーム、例えば、後期エンドソーム内にあるとき、任意選択により及び好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、例えば、少なくとも１つのグリコシド（サポニン）とコンジュゲート（例えば、足場のポリマー若しくはオリゴマー構造を介する及び／又はリンカーを介する）の間の切断可能な結合の切断によって前記コンジュゲートによって含まれるリンカー又はポリマー若しくはオリゴマー構造からなど、コンジュゲートから遊離された後にエフェクター部分のエンドソーム脱出を強化することができることを意味する。たとえ任意選択によりリンカー又は足場を介する本発明による少なくとも１つのサポニンと本発明のコンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂの間の結合が「安定な結合」であっても、そのような結合が、例えば、酵素によってエンドソームにおいて切断できないことを意味するわけではない。例えば、任意選択によりリンカー又は足場のオリゴマー若しくはポリマー構造の一部と合わせたサポニンは、残っているリンカー断片又はオリゴマー若しくはポリマー構造から切断され得る。例えば、プロテアーゼが、（タンパク質性）リンカー又はタンパク質性ポリマー構造、例えば、アルブミンを切断し、それによって少なくとも１つのサポニンを遊離する可能性もある。しかしながら、グリコシド分子（好ましくはサポニン）が活性形態、好ましくは、任意選択により、リンカー及び／又はオリゴマー若しくはポリマー足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）を介して本発明のコンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂにカップリング（されるように調製される）される前に有した本来の形態で遊離され、したがって、グリコシド（サポニン）がそのような切断後にその天然の構造を有するか又はグリコシド（サポニン）がそのような切断後に化学基又はそれに結合されるリンカー（の一部）を有する一方で、グリコシド生物活性（サポニン生物活性）、例えば、同じエンドソーム又はリソソーム中に存在するエフェクター部分に対するエンドソーム／リソソーム脱出強化活性が、任意選択により本発明のリンカー及び／又は足場を含むグリコシド（サポニン）とｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化抗体の間の結合の前記切断時に維持されるか又は回復されることが好ましい。本発明に関して、例えば、コンジュゲート、リンカー、ポリマー又はオリゴマー構造（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲートとしても知られる足場の）、リガンド、（モノクローナル）免疫グロブリン若しくは結合ドメイン又はその断片、及び／又はエフェクター（エフェクター部分、エフェクター分子）におけるサポニンと細胞表面分子標的化ｓｄＡｂのアミノ酸残基の間の結合に関する用語「安定な」は、結合が容易に切断されないか又は少なくとも、例えば、ｐＨの差、塩濃度、又はＵＶ光、還元的条件によって容易に切断されるように設計されていない結合であることを意味する。本発明に関して、例えば、サポニンと細胞表面分子標的化ｓｄＡｂ、リンカー、アミノ酸残基、共有結合性サポニンコンジュゲートのポリマー若しくはオリゴマー構造、リガンド、抗体及び／又はエフェクター分子の間の結合に関する用語「切断可能」は、結合が、例えば、ｐＨの差、塩濃度、還元的条件下などによって容易に切断されるように設計されていることを意味する。当業者は、そのような切断可能な結合及びそれらを調製する方法をよく知っている。
本発明の以前は、ＡＤＣ及びＡＯＣを市場に導入する主要なハードルの１つは、狭い治療域であった：治療有効用量のＡＤＣ又はＡＯＣは、ＡＤＣによる患者の治療における開発及び意義を妨害する（許容されない）副作用を伴う。ＡＤＣ－サポニンコンジュゲート及びＡＯＣ－サポニンコンジュゲートなどの本発明のコンジュゲートの適用によって、ペイロードを有するＡＤＣとともに又は本発明によるＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた（モノクローナル）抗体（ｓｄＡｂ）とともに、１つ又は複数のグリコシド分子（サポニン）を（標的）細胞に導くことが現在可能になった。特に、以前は、ＡＤＣ若しくはＡＯＣ又はペイロードの任意の他のコンジュゲートのエフェクター部分及び（タンパク質性）細胞表面分子標的化分子、並びにエフェクター部分当たり（既定の、制御可能な）特定の数又は範囲のグリコシド分子（サポニン）を、細胞のエンドサイトーシス経路などを介して同時に細胞の細胞質ゾルに特異的に導くことが可能ではなかった。
本発明によって提供される解決策は、本発明のコンジュゲートの細胞表面分子標的化分子、すなわち、ｓｄＡｂへの少なくとも１つのサポニンの共有結合を含む。本発明によって提供されるさらなる解決策は、オリゴマー又はポリマー足場を使用してグリコシド分子（サポニン）を（最初に）重合すること、及び一群の共有結合されるサポニンを有する本発明のコンジュゲートによって含まれる細胞表面分子標的化分子をもたらして、例えば、エンドサイトーシスの後にサポニンの作用機序が望まれる細胞内部位での１つ以上のサポニンの再単量体化を可能にすることを含む。これに関連して「重合する」は、リンカーを介する、又は直接的な若しくはポリマー若しくはオリゴマー構造を介するｓｄＡｂへのサポニン分子の可逆的な及び／又は不可逆的な多重のコンジュゲーションにより足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）を形成すること又は（修飾された）サポニンの可逆的な及び／又は不可逆的な多重のコンジュゲーションによりポリマー又はオリゴマー構造を形成して、足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）を形成することを意味する。これに関連して「再単量体化」は、例えば、エンドサイトーシス後に、サポニンをコンジュゲートから、サポニンをコンジュゲートの細胞表面分子標的化ｓｄＡｂに連結するリンカーから、又は足場から切断して、未結合サポニンの（天然の）化学的状態を回復させることを意味し、未結合サポニンは、サポニンをリンカー、コンジュゲートのアミノ酸残基又は足場に連結するための化学基、及び／又はアルデヒド基又はカルボン酸基などのサポニンの化学基に結合された（化学的）リンカーなどの追加の化学基を含んでもよいし、含まなくてもよい。サポニンの複雑な化学作用に起因して、例えば、足場又は他の連結リンカーでのサポニンの「重合」及び例えば、エンドサイトーシス後の細胞内などの所望の位置でのそれらの「再単量体化」は、難しい課題であった。特に、リンカー及びコンジュゲート、例えば、トリテルペノイドサポニン（グリコシドの重合）に共有結合するための共有結合的に連結されたグリコシドを含む足場を提供するために使用される化学反応は通常、水を含まない有機溶媒中で起こるが、サポニン及び例えば、結合サポニンを有するための足場として適用される生体適合性ポリマーは、水溶性の分子である。未修飾サポニンの化学的特性はさらにそれ自体での重合を禁止し、複数のサポニンを（直接的に）エフェクター分子に結合するための１つの他の可能な解決策は、あまり有望ではないと推定されたが、それは、エフェクター分子（薬物、毒素、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が通常、十分な結合部位を提供しないためであり、カップリング生成物が、非常に不均一になり及び／又はサポニンなどの生物活性分子及び例えば、ペプチド、毒素、核酸を合わせてカップリングすると、そのようなサポニンを含むコンジュゲートに合わせて結合された分子の一方又は両方の活性に影響を及ぼし及び妨害するリスクを有するためである。さらに、サポニンが、例えばＡＤＣ又は抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）にカップリングされるとき、本発明のコンジュゲートによって含まれるエフェクター部位がその機能を失うリスクが大きかった。本発明の実施形態は、これらの欠陥の少なくとも１つを解決する。
本発明の第２の態様は、本発明のコンジュゲート、及び任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物に関する。
１つ以上の（切断可能な）リンカー及び／又は任意選択により足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）をさらに含むか又は含まない、サポニンを含む本発明のコンジュゲートが、酸性環境を妨害し、少なくとも１つのグリコシド（サポニン）のエンドソーム脱出機能を阻害できるかどうかは、実施例の節に記載されるとおりのアッセイにより、当技術分野で知られるとおりに容易に決定され得る。阻害は、「５０％の細胞の死滅の誘導に必要なグリコシド（本発明のサポニン）の量の増加倍率」として記載される。足場は、少なくとも、陽性対照としてクロロキンを使用するときに観察される５０％の細胞の死滅を得るのに必要なグリコシド分子（サポニン）における増加量である増加量をもたらさないことが好ましい。或いは、及び好ましくは、１つ以上の（切断可能な）リンカー及び／又は任意選択により足場を含むか又はさらに含まない、サポニンを含むコンジュゲートは、５０％の細胞の死滅を誘導するためにグリコシド分子の少なくとも４倍の増加をもたらさず、より好ましくは、少なくとも２倍の増加をもたらさない。増加倍率は、アッセイにおいて測定されることになり、陽性対照としてのクロロキンは、グリコシドの量、好ましくは、サポニンの量の２倍の増加を誘導し、サポニンは、５０％の細胞の死滅を観察する本発明のサポニン（前の実施形態）のいずれか１つ以上である。
前述のとおり、本発明によるコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのサポニンは、本発明で定義されるとおりの少なくとも既存の及び新規のエフェクター部分の有効性を増大させる。潜在的な副作用は、コンジュゲートによって含まれるエフェクター部分の投与が減少されるため、有効性の低下を伴わずに減少されることになる。したがって、本発明は、医療における使用のための又は医薬としての使用のための本発明によるコンジュゲートを提供する。本発明の第３の態様は、医薬としての使用のための本発明の医薬組成物に関する。
いくつかの好ましい特徴が、本発明のコンジュゲートによって含まれるエンドソーム脱出エンハンサー、すなわち、本発明のサポニンのために配合され得る：（１）それらは、好ましくは、毒性ではなく、免疫応答を引き起こさない、（２）それらは、好ましくは、エフェクター部分のオフターゲット細胞への細胞質ゾル取り込みを媒介しない、（３）作用部位でのそれらの存在は、好ましくは、エフェクター部分の存在と同期する、（４）それらは、好ましくは、生物分解性であるか又は排出可能である、及び（５）それらは、好ましくは、エンドソーム脱出エンハンサーが合わせられるエフェクター分子の生物活性に関連しない生物体の生物プロセスに実質的に支障をきたさない、例えば、ホルモンと相互作用しない。少なくともある程度、前述の判定基準を満たす本発明のサポニンの例は、ビデスモサイドトリテルペンであり、好ましくは、ビデスモサイドトリテルペンサポニン、例えば、ＳＯ１８６１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＧＥ１７４１、及び本明細書全体にわたって、より具体的には表Ａ１に列挙されるさらなるサポニンである。ＳＯ１８６１が好ましい。
また、医薬を製造するための本発明によるコンジュゲートの使用が提供される。特に、癌医薬、及び特に、従来の化学療法医薬は、それらの副作用で有名である。コンジュゲートによって含まれる薬学的に活性な物質及び全く同じコンジュゲート分子によって含まれるサポニンの両方の時機及び場所の標的化及び同期化のために、本発明による治療的コンジュゲートは、医薬としての使用、特に、癌を治療する方法における使用に特に有用である。したがって、本発明は、癌を治療する方法における使用のための本発明による治療的コンジュゲートを提供する。本発明はまた、後天的又は遺伝性障害、特に、一遺伝子性欠損障害を治療する方法における使用のための本発明による治療的コンジュゲートを提供する。したがって、治療的コンジュゲートは、少なくとも１つのサポニン及び少なくとも１つのエフェクター部分、並びに腫瘍細胞又は自己免疫細胞などの異常な標的細胞でコンジュゲートを標的化するためのｓｄＡｂを含む。したがって、本発明のある態様は、本発明による治療的コンジュゲートに関し、コンジュゲートは、癌又は自己免疫疾患の治療のための方法における使用のために、共有結合されたエフェクター部分を含み、及び共有結合されたサポニン、及びｓｄＡｂなどの細胞表面分子結合抗体を含む。
医療における本発明のコンジュゲートのさらなる適用は、不十分な量又は不十分な機能性においてこれらの酵素を生成する標的細胞における細胞内酵素の置換である。結果として生じる疾患は、遺伝性又は後天的であり得る。多くの場合、対症療法のみが可能であり、いくつかの希少疾患に関して、不十分な治療選択肢は、当該患者の寿命の短縮につながる。そのような疾患に関する例は、フェニルケトン尿症であり、これは、アミノ酸フェニルアラニンの代謝の低下を引き起こす代謝の先天的異常である。その疾患は、肝臓酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼのための遺伝子における変異によって特徴付けられる。フェニルケトン尿症は、現在までに治癒可能ではない。発生率は、およそ１：１０，０００であり、知られている最も高い発生率はトルコにおける１：２，６００である。結合されたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ又はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする結合されたポリヌクレオチドを伴う本発明のコンジュゲートによって含まれる細胞表面分子標的化抗体、好ましくは、ＶＨＨなどのｓｄＡｂを使用して、好適な特異的抗体又はｓｄＡｂの使用によって肝臓細胞を標的化し、肝細胞における欠損酵素を置換することができる。これは、置換又は遺伝子治療のための、本発明による結合されたサポニン及び結合された酵素又はオリゴヌクレオチドを含む本発明の治療的コンジュゲートの使用の一例である。好ましい実施形態では、遺伝子治療又は置換療法の方法における使用のための本発明による治療的コンジュゲートが提供される。
本発明のコンジュゲートにより、一成分の非ウイルス性の臨床的に適用可能な遺伝子送達技術を設計し、製造することが現在可能になった。例えば、本発明のコンジュゲートは、より低い治療用量による治療有効性を高め、それにより患者の健康を改善する非ウイルス系遺伝子送達技術の開発を可能にする。本発明のコンジュゲートは、特に、（腫瘍、自己免疫）細胞表面特異的分子に結合するためのモノクローナル抗体又はｓｄＡｂなどの共有結合された細胞表面分子標的化抗体を含むとき、及びオリゴヌクレオチド、例えば、ＢＮＡなどのエフェクター部分に結合されるとき、遺伝子送達の分野における長期にわたる主要なボトルネックを克服すること、すなわち、効率的であり、安全であり及び対費用効果の高い遺伝子治療製品のエンドソーム膜を通過する細胞質ゾル／ヌクレオゾルへの移行を可能にする。実際に、遺伝子治療は、広範な疾患における将来の先進的な療法のための最も有望な治療選択肢の１つである。遺伝子送達の成功には、標的細胞の認識並びに遺伝子の細胞質ゾル及びヌクレオゾル取り込みが必要となる。非ウイルス性遺伝子治療の分野における主要な問題の１つは、患者における治療的使用のための遺伝子材料の非効率的であり及び安全性が不十分な送達である。
したがって、リガンド又は好ましくは、抗体（その断片、ドメイン、好ましくはｓｄＡｂ）などの細胞標的化細胞表面分子標的化分子を含み及びアンチセンスＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートを適用するとき、本発明者らは現在、遺伝子送達の分野における長期にわたる主要なボトルネック：遺伝子治療製品のエンドソーム膜を通過する細胞質ゾル／ヌクレオゾルへの安全な移行を克服することを可能にした。本発明のコンジュゲートは、全ての既知の遺伝因子による任意のアドレス指定できる細胞型の標的化を可能にし、それにより遺伝性障害に限定されないが、癌療法についても良好な患者療法を確実にするために設計された技術となり、したがって、大きい患者群にとって重要である。本発明のコンジュゲートに基づく技術は、本明細書で例示されるとおりのサポニン、及び本発明による実施形態のサポニンなどのエンドソーム脱出エンハンサー（ＥＥＥ）のため、標的化リガンド若しくは（モノクローナル）（腫瘍細胞特異的）抗体、又はその断片、又は好ましくはＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの細胞表面分子標的化分子、及びエフェクター部分、本明細書のＬＮＡ又はＢＮＡなどのエフェクター遺伝子のための担体として機能するポリマー又はオリゴマー足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）を含み得る。例えば、細胞標的化抗体（断片）又はｓｄＡｂ及びＢＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートの使用は、あらゆる種類の生体高分子を細胞質ゾル及び核に運ぶ潜在力を有する。新規の標的化リガンド、ｓｄＡｂ及びモノクローナル（ヒト、ヒト化）抗体の開発は、世界中の多数の研究グループ及び会社によって継続的に検討されている。癌細胞などの疾患細胞の細胞質ゾルにおける送達を目的としたオリゴヌクレオチドについても同じである。したがって、本発明のコンジュゲートは、現在及び将来の標的化ｓｄＡｂ及び抗体並びに現在及び将来の治療用オリゴヌクレオチド（並びにタンパク質毒素などのペイロード）が、例えば、本発明のオリゴマー又はポリマー足場モジュール（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）にクリックケミストリーによって連結されるか又は連結され得る分子インターフェースとしてもふるまい、個別化された薬物適用並びに組織及び細胞標的化技術の分野における将来の発展を可能にしている。本発明のコンジュゲートは、細胞表面分子標的化分子としての抗体及びリガンドを含み得るが、ｓｄＡｂが好ましい。遺伝子治療薬の世界市場は急速に成長しており、癌、心血管疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＨＩＶ及び多くの希少（単性の）疾患などの広範な疾患領域のための可能な治療を包含している。既存のウイルス性ベクターに基づく遺伝子治療薬技術は、安全性、製造ロジスティクス、及びそれに伴う高コストなどの重要な課題を有する。本発明のコンジュゲートは、既存のウイルス性遺伝子送達技術のための代替物となる技術プラットフォームにおける使用を可能にする。したがって、本発明のコンジュゲートは、癌、心血管疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＨＩＶ感染及び多くの希少（単性の）疾患などの疾患のための非ウイルス性遺伝子治療を開発するためのアプローチにおける実践に好適である。本発明のコンジュゲートは、標的化アンチセンスＢＮＡに基づくものなどの非ウイルス性ベクターに基づく遺伝子治療薬を作製することによって抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びオリゴヌクレオチドに基づく治療薬の分野を一変させるための新規の治療を開発するのに好適である。特に、ｓｄＡｂなどの抗体及びＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのサポニンを有する共有結合性コンジュゲートにおける本発明のコンジュゲートの適用は、本発明に起因して可能になった多くの有利なアプローチの１つである。例えば、本発明のコンジュゲートの使用は現在、哺乳動物細胞のエンドサイトーシス経路の活用を可能にする。エンドサイトーシスは、治療薬の送達のために活用され、本発明のコンジュゲートは、例えば、コンジュゲートによって含まれるｓｉＲＮＡの取り込み及びエンドソーム脱出の改善に寄与する。本発明のコンジュゲートは、例えば、ペイロード、オリゴヌクレオチドのための送達エンハンサーとして作用する小分子とともに使用されるのが好適である。これに加えて、ＢＮＡなどの共有結合的にカップリングされたオリゴヌクレオチドを有し、リガンド及び好ましくは抗体（ドメイン又は断片、好ましくはＶＨＨ）などの共有結合的にカップリングされた細胞標的化部分を有し、本発明のサポニンを有する本発明のコンジュゲートは、二構成成分としてのそれらの適用に関連し、それにより治療上の承認及び臨床適用性を複雑にしている既存のエンドソーム脱出エンハンサー及び遺伝子治療製品に見られる既存の問題に対する解決策を提供し、それは、本発明のそのようなコンジュゲートが、サポニン、ＢＮＡなどの遺伝子産物及び（モノクローナル）抗体又はｓｄＡｂなどの（腫瘍）細胞標的化部分を包含する単一コンジュゲート治療分子であるためである。したがって、本発明は、非ウイルス性遺伝子送達技術を提供し、エンドソーム脱出エンハンサー（例えば、本発明の実施形態及び提供される例のグリコシド）、遺伝子治療製品（ＢＮＡなどの本発明によるオリゴヌクレオチド）及び標的化リガンド又は抗体（例えば、本発明の実施形態によるもの及び実施例の節において本明細書の下で例示されるｓｄＡｂ）は全て、本発明のコンジュゲートによって含まれる。したがって、そのような本発明のコンジュゲートは、広範な疾患及び大きい患者群に対して既存の及び将来の高分子薬物のための治療機会を提供する。少なくとも１つのサポニン、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び免疫グロブリン又はｓｄＡｂなどの少なくとも１つの特異的な細胞標的化部分を含むそのような本発明のコンジュゲートの適用により、エンドソーム脱出エンハンサー及び遺伝子治療製品を別々に適用する既存の方法（既存の方法は、両方の化合物が相互作用部位で同時に存在することを保証しない）に関して明らかな問題が対処される。この問題は現在、本発明のコンジュゲートを使用することによって克服される。すなわち、そのような本発明のコンジュゲートは、両方の化合物、すなわち、サポニン及びＢＮＡなどの遺伝子産物の同期化（時機及び場所）の増大を有する非ウイルス性遺伝子送達技術を提供する。
遺伝子治療は、嚢胞性線維症、コレラ、ハンチントン病又は血友病などの遺伝性の以前は治癒可能ではなかった疾患に役立つ可能性がある。しかしながら、現在のいくつかの問題は克服されていない：例えば、治療用遺伝子は、身体の特定の標的細胞に正確に到達しなければならない。他方で、治療用遺伝子は、標的化される細胞によって吸収されるべきであるが、治療用遺伝子は破壊されてはならない。既存の遺伝子治療アプローチは、遺伝子のための連絡船としてウイルスを使用する。しかしながら、これらの手順は、多大なリスクを含み、他の生体分子の導入に転用することができない。ある実施形態は、担体分子としてのコンジュゲートによって含まれるときに遺伝子の送達を可能にするだけではなく、標的細胞に導入されることになる異なる治療用生体分子の送達も可能にするプラットフォーム技術の使用のための（植物由来）グリコシド（例えば、本発明のサポニンのいずれか１つ）を含む本発明のコンジュゲートである。したがって、本発明のコンジュゲートは、嚢胞性線維症、コレラ、ハンチントン病又は血友病のための核酸に基づく治療を開発するために使用される。これに加えて、本発明のコンジュゲートにより、新規の遺伝子治療戦略は、嚢胞性線維症、ハンチントン病、及び血友病を有するそれらの患者を含む遺伝性疾患を有する患者の健康を改善するために利用可能である。本発明の一部として、全てが単一のコンジュゲートにおいて含まれる植物由来エンドソーム脱出エンハンサー（グリコシド；すなわち、本発明のサポニン）、遺伝子治療製品、及び標的化リガンド（すなわち、ｓｄＡｂ）を組み合わせる非ウイルス性遺伝子送達技術が開発される。本発明のコンジュゲートに基づく結果として生じる非ウイルス性遺伝子治療は、現在利用可能な戦略より低い投与量で約４０倍の送達効率の増大を示す。これに加えて、本発明のコンジュゲートは、嚢胞性線維症患者におけるような欠陥のある遺伝子の修復又は置き換えのため、及び例えば、癌細胞を破壊するための特定の遺伝子の標的化された送達のためなどの臨床適用における使用のためのものである。実際に、本発明のコンジュゲートは、嚢胞性線維症、ハンチントン病及び血友病などの現在治癒可能ではない遺伝子の欠陥によって引き起こされるいずれかの疾患のための治療レジメンにおける適用に好適である。本発明のコンジュゲートを利用する遺伝子治療は、２つの既存の問題を克服する際に有用である：第一に、本発明のコンジュゲートにより、身体の特定の標的細胞に治療用遺伝子を送達することが可能であり；第二に、治療用遺伝子は、例えば、本発明のオリゴマー又はポリマー足場（本発明の共有結合性サポニンコンジュゲート）を使用することによって全てが本発明のコンジュゲートにおいて合わせて共有結合的に連結されたサポニン、オリゴヌクレオチド産物及び標的細胞に結合するための抗体又はｓｄＡｂなどの標的化部分の存在のために、これらの細胞の内部に入るが、破壊されない。
本発明はまた、癌を治療する方法であって、本発明による治療用コンジュゲートを含む医薬を、それを必要とする患者に投与すること、好ましくは、有効用量の前記医薬を、それを必要とする患者、好ましくは、ヒト癌患者に投与することを含む方法を提供する。
投与に好適な形態に関する考慮事項は当技術分野で知られており、毒性作用、溶解性、投与経路、及び活性の維持を含む。例えば、血流に注射される薬理学的組成物は可溶性である必要がある。
好適な剤形は、用途又は進入経路、例えば、経皮的又は注射によるものに部分的に依存する。そのような剤形は、標的細胞が多細胞性宿主に存在するか否かにかかわらず、化合物を標的細胞に到達させなければならない。他の要因は、当技術分野で知られており、毒性などの考慮事項及び化合物又は組成物にその作用の発揮を遅らせる剤形を含む。
本発明の第４の態様は、以下のいずれか１つ以上の治療又は発症予防における使用のための本発明の医薬組成物に関する：癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシス。
驚くべきことに、本発明者らは、いずれの腫瘍細胞の死滅ももたらさないＡＤＣのある用量が、そのようなＡＤＣが腫瘍細胞標的化抗体又はＶＨＨにカップリングされるサポニンの存在下で腫瘍細胞と接触されるときに効率的な腫瘍細胞の死滅に足りており及び十分であることを見出した。例は、図２～７において提供される。例えば、ある用量のＡＤＣ抗ＣＤ７１ ＶＨＨ－毒素、抗ＨＥＲ２ ＶＨＨ－毒素又は抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ－毒素などのＡＤＣは、腫瘍細胞と接触されるときに腫瘍細胞に対する毒性作用を発揮しない。典型的な毒素は、タンパク質毒素、例えば、ジアンチン及びサポリンである。しかしながら、そのようなＡＤＣがサポニンを含むコンジュゲートとともに同時投与されるとき、効率的な腫瘍細胞の死滅が達成される。サポニンを含むコンジュゲートは、例えば、抗ＨＥＲ２ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、抗ＣＤ７１ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ－ＳＯ１８６１、セツキシマブ－ＳＯ１８６１、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１である。ＡＤＣは、例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ７１又はＥＧＦＲに結合することができるＶＨＨを含むＡＤＣであり、例えば、ＡＤＣは、ジアンチン又はサポリンなどのタンパク質毒素を含む。サポニン及び腫瘍細胞標的化抗体又はＶＨＨを含むコンジュゲートを適用することによって、標的細胞内部でのＡＤＣ、すなわち、ＡＤＣ又はＡＯＣによって含まれるエフェクター分子の効率的な生物活性を達成するのに必要なサポニン用量は、サポニンを含むコンジュゲートが、標的細胞にＡＤＣ、すなわち、ＡＤＣ又はＡＯＣで同時投与されるとき、ＡＤＣが遊離サポニンとともに標的細胞に同時投与されるときに必要とされる遊離サポニンの用量と比較して、約１００～１０００倍低い。これに加えて、サポニンを含むコンジュゲートは、ＡＤＣ、すなわち、ＡＤＣ又はＡＯＣを含むｓｄＡｂを、標的化サポニンの非存在下でそれを必要とする患者に投与されたとき、そうでなければ腫瘍細胞に効果がないであろうＡＤＣ又はＡＯＣの用量で増強し、それに加えて、サポニンを含むコンジュゲートは既に、ＡＤＣ又はＡＯＣのエフェクター分子の増強が考慮されるとき、相対的に低い用量、すなわち、ｓｄＡｂなどの腫瘍細胞標的化結合分子とともに提供されない遊離サポニンがエフェクター分子の増強に十分には効果的ではない用量で既に十分に効果的である。組み合わせて、本発明者らは、ＡＤＣ又はＡＯＣが既に、腫瘍細胞標的化抗体又はＶＨＨを含み及びサポニンを含むコンジュゲートの存在下で患者に同時投与されるときにより低い用量で効果的であるため、治療有効量の腫瘍細胞標的化ｓｄＡｂを含むＡＤＣ又はＡＯＣによる治療を必要とするヒト患者を治療するための改善された方法を提供した。この組み合わせの多くの利点の１つは、ＡＤＣ、また好ましくはサポニンを含むコンジュゲートにおけるｓｄＡｂ部分においてＦｃテイルが存在しないことにある。Ｆｃテイルの欠如は、そうでなければ結合が多くの従来のＡＤＣ、ＡＯＣに関して見られるものなどのそのようなＦｃテイルが存在する場合に副作用をもたらす可能性がある、コンジュゲートのＦｃ受容体を有するオフターゲット患者細胞への望まれない結合を妨げる。Ｆｃテイルを含む抗体に基づくＡＤＣ及びＡＯＣは、そのようなＩｇＧに基づくＡＤＣ、ＡＯＣのＦｃ受容体への望まれない結合のために有効性の低下を欠点として持つ。Ｆｃ受容体結合の結果として、そのようなＩｇＧに基づくＡＤＣ及びＡＯＣの有効量が減少される。それに加えて、Ｆｃテイルの欠如は、これに関していくつかの利点を提供する。Ｆｃ受容体に対するＡＤＣ、ＡＯＣ並びに本発明の改良型ＡＤＣ及び改良型ＡＯＣ（すなわち、本発明のコンジュゲート）のオフターゲット及び望まれない結合は起こり得ない。これに加えて、本発明のＡＤＣ、ＡＯＣ及びコンジュゲートは、ＩｇＧに基づくコンジュゲートで見られる欠陥であるＦｃ受容体結合に起因してコンジュゲートが「失われ」ないため、標的受容体媒介性エンドサイトーシス及びエンドソーム内部への本発明のＡＤＣ、ＡＯＣ及びコンジュゲートの送達が考慮されるときにより低い有効用量を有する。結果として、全てがＦｃを含む抗体の代わりに細胞標的化ｓｄＡｂを含む本発明のＡＤＣ、ＡＯＣ及びコンジュゲートの治療域は、ｓｄＡｂがＦｃテイルを含む従来のＩｇＧによって置き換えられるときに達成されたであろう治療域より広い。同様に、結果として、サポニンを含むコンジュゲートの治療域は、腫瘍細胞標的化ｓｄＡｂ及びサポニンのそのようなコンジュゲートにおけるｓｄＡｂが、Ｆｃテイルを含む従来のＩｇＧなどの標的細胞上の細胞表面分子に結合するための結合分子によって置き換えられるときに達成されたであろう治療域より広い。
ある実施形態は、サポニンが、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１誘導体、ＱＳ－２１、又はＱＳ－２１誘導体、好ましくはＳＯ１８６１誘導体又はＱＳ－２１誘導体、より好ましくは本発明によるＳＯ１８６１誘導体である本発明の使用のための医薬組成物である。
ある実施形態は、本発明の使用のための医薬組成物であり、
－ 前記使用は、ヒト対象における癌の治療又は予防におけるものであり；及び／又は
－ 前記使用は、必要とする患者における癌の治療若しくは発症予防におけるものであり、少なくとも１つのｓｄＡｂが、細胞の細胞表面分子、好ましくは、細胞の腫瘍細胞表面分子、より好ましくは、細胞の腫瘍細胞特異的表面分子に結合し；及び／又は
－ 医薬組成物、好ましくは、治療有効量の医薬組成物は、必要とする患者、好ましくは、ヒト患者に投与される。
本発明の第５の態様は、本発明のエフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部に、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させるためのインビトロ又はエクスビボでの方法であって、
ａ）その細胞表面上で、本発明のコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのｓｄＡｂのための結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）本発明のコンジュゲートであって、工程ａ）において提供される細胞に移行されることになるエフェクター分子を含む前記コンジュゲートを提供する工程；及び
ｃ）工程ａ）の細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）のコンジュゲートと接触させる工程
を含み、
それにより、エフェクター分子を含む前記コンジュゲートを、細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程、及び前記コンジュゲートの移行により、エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させる工程を含む、方法に関する。
本発明の第６の態様は、本発明のコンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させるためのインビトロ又はエクスビボでの方法であって、
ａ）その細胞表面上で、本発明のコンジュゲートによって含まれる少なくとも１つのｓｄＡｂのための結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）本発明のコンジュゲートを提供する工程；及び
ｃ）工程ａ）の細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）のコンジュゲートと接触させる工程を含み、それにより、コンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程
を含む方法に関する。
Figure 2023532003000004
Figure 2023532003000005
Figure 2023532003000006
Figure 2023532003000007
本発明の態様は、本発明によるエンドソーム脱出強化コンジュゲートを含有する容器を含むキットであって、コンジュゲートを使用するための指示書をさらに含むキットに関する。
本発明のある態様は、本発明の細胞表面分子標的化分子（すなわち、ｓｄＡｂ）を含み、及びＡＤＣ又はＡＯＣをもたらす本発明の少なくとも１つのエフェクター部分を含むか又は少なくとも１つの本発明のサポニンを含む、少なくとも１つの共有結合的に連結されたサポニンとともに提供される以下のＡＤＣ及び少なくとも１つの共有結合的に連結されたサポニンとともに提供される以下のＡＯＣ、並びにそれらの半完成状態のコンジュゲートのいずれかに関し、以下の抗体は、ｓｄＡｂ又は２若しくは３つの直鎖状に共有結合的に連結されたｓｄＡｂなどの複数のｓｄＡｂ（二価などの多価、バイパラトピックなどのマルチマラトピック、二重特異性などの多重特異性、又はそれらの任意の組み合わせ）である：
抗ＥＧＦＲ抗体－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
抗ＥＧＦＲ抗体－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し、任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
抗ＥＧＦＲ抗体－ＳＯ１８６１；
抗ＥＧＦＲ抗体－ＧＥ１７４１；
抗ＥＧＦＲ抗体－ＳＡ１６４１；
抗ＥＧＦＲ抗体－Ｑｕｉｌ－Ａ；
抗ＥＧＦＲ抗体－ＱＳ－２１；
抗ＥＧＦＲ抗体－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
セツキシマブに由来するｓｄＡｂ－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
セツキシマブに由来するｓｄＡｂ－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＯ１８６１；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＧＥ１７４１；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＡ１６４１；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－Ｑｕｉｌ－Ａ；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＱＳ－２１；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
抗ＨＥＲ２抗体－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
抗ＨＥＲ２抗体－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
抗ＨＥＲ２抗体－ＳＯ１８６１；
抗ＨＥＲ２抗体－ＧＥ１７４１；
抗ＨＥＲ２抗体－ＳＡ１６４１；
抗ＨＥＲ２抗体－Ｑｕｉｌ－Ａ；
抗ＨＥＲ２抗体－ＱＳ－２１；
抗ＨＥＲ２抗体－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＯ１８６１；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＧＥ１７４１；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＡ１６４１；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－Ｑｕｉｌ－Ａ；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＱＳ－２１；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
抗ＣＤ７１抗体－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
抗ＣＤ７１抗体－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
抗ＣＤ７１抗体－ＳＯ１８６１；
抗ＣＤ７１抗体－ＧＥ１７４１；
抗ＣＤ７１抗体－ＳＡ１６４１；
抗ＣＤ７１抗体－Ｑｕｉｌ－Ａ；
抗ＣＤ７１抗体－ＱＳ－２１；
抗ＣＤ７１抗体－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－ＳＯ１８６１；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－ＧＥ１７４１；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－ＳＡ１６４１；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－Ｑｕｉｌ－Ａ；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－ＱＳ－２１；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
抗ＨＩＶｇｐ４１抗体は、例えば、クローンＱ８ｃによって産生されるＶＨＨである；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－サポニン（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンである）；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＯ１８６１；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＧＥ１７４１；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＳＡ１６４１；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－Ｑｕｉｌ－Ａ；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ＱＳ－２１；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン；
抗ＥＧＦＲ抗体－オリゴヌクレオチド；
抗ＥＧＦＲ抗体－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
抗ＥＧＦＲ抗体－ｓｉＲＮＡ；
抗ＥＧＦＲ抗体－アンチセンスＢＮＡ；
抗ＥＧＦＲ抗体－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
抗ＥＧＦＲ抗体－タンパク質性毒素；
抗ＥＧＦＲ抗体－リボソーム不活性化タンパク質；
抗ＥＧＦＲ抗体－ジアンチン；
抗ＥＧＦＲ抗体－サポリン；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－オリゴヌクレオチド；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ｓｉＲＮＡ；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－タンパク質性毒素；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－リボソーム不活性化タンパク質；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ジアンチン；
セツキシマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－サポリン；
抗ＨＥＲ２抗体－オリゴヌクレオチド；
抗ＨＥＲ２抗体－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
抗ＨＥＲ２抗体－ｓｉＲＮＡ；
抗ＨＥＲ２抗体－アンチセンスＢＮＡ；
抗ＨＥＲ２抗体－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
抗ＨＥＲ２抗体－タンパク質性毒素；
抗ＨＥＲ２抗体－リボソーム不活性化タンパク質；
抗ＨＥＲ２抗体－ジアンチン；
抗ＨＥＲ２抗体－サポリン；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－オリゴヌクレオチド；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ｓｉＲＮＡ；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－タンパク質性毒素；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－リボソーム不活性化タンパク質；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ジアンチン；
トラスツズマブのＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－サポリン；
抗ＣＤ７１抗体－オリゴヌクレオチド；
抗ＣＤ７１抗体－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
抗ＣＤ７１抗体－ｓｉＲＮＡ；
抗ＣＤ７１抗体－アンチセンスＢＮＡ；
抗ＣＤ７１抗体－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
抗ＣＤ７１抗体－タンパク質性毒素；
抗ＣＤ７１抗体－リボソーム不活性化タンパク質；
抗ＣＤ７１抗体－ジアンチン；
抗ＣＤ７１抗体－サポリン；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－オリゴヌクレオチド；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスオリゴヌクレオチド；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ｓｉＲＮＡ；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－アンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－タンパク質性毒素；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－リボソーム不活性化タンパク質；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－ジアンチン；
ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ－サポリン；
抗ＥＧＦＲ抗体（－オリゴヌクレオチド）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＢＮＡ、及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）のいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＥＧＦＲ抗体は、好ましくは、セツキシマブである）；
抗ＥＧＦＲ抗体（－タンパク質性毒素）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、タンパク質性毒素は、リボソーム不活性化タンパク質、ジアンチン及びサポリンのいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＥＧＦＲ抗体は、好ましくは、セツキシマブである）；
抗ＨＥＲ２抗体（－オリゴヌクレオチド）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＢＮＡ、及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）のいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＨＥＲ２抗体は、好ましくは、トラスツズマブである）；
抗ＨＥＲ２抗体（－タンパク質性毒素）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、タンパク質性毒素は、リボソーム不活性化タンパク質、ジアンチン及びサポリンのいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＨＥＲ２抗体は、好ましくは、トラスツズマブである）；
抗ＣＤ７１抗体（－オリゴヌクレオチド）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＢＮＡ、及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）のいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＣＤ７１抗体は、好ましくは、ＯＫＴ－９である）；並びに
抗ＣＤ７１抗体（－タンパク質性毒素）（－サポニン）（例えば、サポニンは、表Ａ１から選択されるサポニンであり、タンパク質性毒素は、リボソーム不活性化タンパク質、ジアンチン及びサポリンのいずれか１つ以上であるか、又はサポニンは、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニンのいずれか１つ以上であり、抗ＣＤ７１抗体は、好ましくは、ＯＫＴ－９である）。
ある実施形態は、細胞表面分子標的化分子が、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ（すなわち、ｓｄＡｂは、そのようなモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬに基づき、及び標的細胞の細胞表面上の標的受容体に特異的に結合することができる）から選択され、及び／又はエフェクター部分が、ジアンチン、サポリン及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）、アンチセンスＢＮＡ（ＡｐｏＢ）から選択され及び／又はサポニンが、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１及びキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン又はその誘導体などの表Ａ１から選択される本発明の半完成状態のコンジュゲート（ｓｄＡｂ－サポニン又はｓｄＡｂ－エフェクター部分）又は本発明のコンジュゲートである。
ある実施形態は、細胞表面分子標的化分子が、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＯＫＴ－９のＶＨ又はＶＬに由来するｓｄＡｂ（すなわち、ｓｄＡｂは、そのようなモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬに基づき、及び標的細胞の細胞表面上の標的受容体に特異的に結合することができる）から選択され、及び／又はエフェクター部分が、ジアンチン、サポリン及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）又はアンチセンスＢＮＡ（ＡｐｏＢ）から選択され及び／又はサポニンが、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１及びキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン又はその誘導体などの表Ａ１から選択される本発明によるコンジュゲートである。
本発明のある態様は、本発明の細胞表面分子標的化分子ｓｄＡｂを含み及び本発明の少なくとも１つのエフェクター部分を含み及び／又は本発明の少なくとも１つのサポニンを含む、構造ＣのＡＤＣ若しくはＡＯＣ、又は半完成状態のＡＤＣコンジュゲート若しくは半完成状態のＡＯＣコンジュゲート：
Ａ（－Ｓ）ｂ（－Ｅ）ｃ
（構造Ｃ）
（式中、Ａは、細胞表面分子標的化ｓｄＡｂであり；
Ｓは、サポニンであり；
Ｅは、エフェクター部分であり；
ｂ＝０～６４、好ましくは、０、１、２、３、４、８、１６、３２、６４又はその間にある任意の整数若しくは小数部であり；
ｃ＝０～８、好ましくは、０、１、２、３、４、６、８又はその間にある任意の整数若しくは小数部であり；
Ｓは、Ａ及び／又はＥにカップリングされ、Ｅは、Ａ及び／又はＳにカップリングされ、好ましくは、Ｓは、Ａにカップリングされ、Ｅは、Ａにカップリングされる）に関する。
ある実施形態は、Ａが、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体、トラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体、ｓｄＡｂ Ｑ８ｃなどの抗ＨＩＶｇｐ４１抗体、ＯＫＴ－９などの抗ＣＤ７１抗体に由来するｓｄＡｂであり、及び／又はＳが、サポニン、Ｃ－２３位においてアルデヒド官能基を有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び任意選択によりサポニンのＣ－３ベータ－ＯＨ基での炭水化物置換基においてグルクロン酸官能基を含むトリテルペノイドサポニン及び／又はビデスモサイドトリテルペンサポニン、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＱＳ－２１、並びにキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の水溶性サポニン画分におけるサポニン、又は表Ａ１に示されるサポニンのいずれかのいずれか１つ以上であり、及び／又はＥが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＢＮＡ、及びアンチセンスＢＮＡ（ＨＳＰ２７）又はアンチセンスＢＮＡ（ＡｐｏＢ）のいずれか１つ以上、並びに／又はタンパク質性毒素、リボソーム不活性化タンパク質、ジアンチン及びサポリンのいずれか１つ以上である本発明の構造Ｃである。
ある実施形態は、サポニン（存在する場合）、及び／又はエフェクター部分（存在する場合）が、切断可能なリンカーなどの少なくとも１つのリンカーを介して並びに／又はＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロパン酸サクシニミジル又は３－（２－ピリジルジチオ）プロパン酸Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステル（ＳＰＤＰ）、及び１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）に基づくリンカーなど及びＧ４－デンドロン（例については図４４、分子１６を参照のこと）などのデンドロン又は構造Ａの三官能性リンカー（例については図４４、分子１６を参照のこと）などの三官能性リンカーに基づく共有結合性サポニンコンジュゲート（足場）などの共有結合性サポニンコンジュゲート（すなわち、少なくとも１つのオリゴマー又はポリマー足場）を介して共有結合的にカップリングされ、及び／又は細胞表面分子標的化抗体、好ましくは、本発明によるＶＨＨなどのｓｄＡｂの少なくともリジン側鎖及び／又はシステイン側鎖が、サポニン及び／又はエフェクター部分及び／又はリンカー及び／又は切断可能なリンカー及び／又は共有結合性サポニンコンジュゲートとの共有結合に関与し、好ましくは、サポニン及び／又はエフェクター部分が、細胞表面分子標的化分子、好ましくは、ｓｄＡｂなどの抗体に共有結合的に連結され、共有結合的連結が、アミド結合、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合を含むか又はそれらからなる本発明の構造Ｃ、本発明のコンジュゲート又は本発明の半完成状態のコンジュゲートである。
本発明のある態様は、医薬としての前述のコンジュゲート、共有結合的に連結されたサポニンを含むＡＤＣ、共有結合的に連結されたサポニンを含むＡＯＣ、半完成状態のＡＤＣ、半完成状態のＡＯＣのいずれかの使用に関する。
本発明のある態様は、癌又は自己免疫疾患の治療又は発症予防における使用のための前述のコンジュゲート、共有結合的に連結されたサポニンを含むＡＤＣ、共有結合的に連結されたサポニンを含むＡＯＣ、半完成状態のＡＤＣ、半完成状態のＡＯＣのいずれかの使用に関する。
実施例及び例示的実施形態
実施例１．ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋ｍＡｂ－サポリン（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨ及びｍＡｂは、同じ細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ａ）。２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ＶＨＨは、ｍＡｂと異なる細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ｂ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、（不安定な）末端システイン残基（Ｃｙｓ）を介してＤＡＲ１で抗ＨＥＲ２ＶＨＨにコンジュゲートした（ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１）。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（ＤＡＲ４でタンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたＣＤ７１モノクローナル抗体）又は５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４でタンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたトラスツズマブ）の固定された濃度に対して滴定した。ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅が決定された。これは、１０ｐＭのＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又は５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンとの両方の組み合わせに関してＳＫ－ＢＲ－３において低濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１での細胞死滅の亢進を明らかにした（ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図２Ａ）。同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独で、高濃度にて細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）、同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンは、細胞死滅活性を誘導できなかった（ＩＣ５０＞５０００ｎＭ；図２Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）において、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋１０ｐＭ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせは、高濃度で細胞死滅活性を明らかにした一方で（ＩＣ５０＝２，０００ｎＭ；図２Ｂ）、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの組み合わせは、はるかに高い濃度で細胞死滅活性を示した（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図２Ｂ）。同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋トラスツズマブ－サポリンは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において細胞死滅活性を誘導できなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図２Ｂ）。
これら全ては、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのＨＥＲ２標的化ＶＨＨへのコンジュゲーションが、標的化されるタンパク質毒素（同じ又は異なる細胞表面受容体を標的化する）のエンドソーム脱出及び細胞質内送達を高めて、ＨＥＲ２発現細胞の細胞死滅をもたらすことを示している。
次に、トラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンを、９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンと組み合わせた９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１で既に、ＳＫ－ＢＲ－３の効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝０．０００１ｐＭ；図３Ａ）、ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ又はトラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨが、高濃度でのみ細胞死滅を誘導できたことを明らかにした（それぞれＩＣ５０＝５０ｐＭ；ＩＣ５０＝４００ｐＭ；図３）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）において、ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、ＩＣ５０＝０．０１ｐＭで細胞死滅を示した一方で、トラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、ＩＣ５０＝２，０００ｐＭで活性を示した。トラスツズマブ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨは、（それぞれＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ及びＩＣ５０＝２０ｐＭ、図３Ｂ）でのみ細胞死滅を示した。このことは、相対的に低い濃度のトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンが、ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋発現細胞において相対的に低いＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）濃度と組み合わせて効果的であり及び細胞死滅を誘導できることを示す。
実施例２．ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋ＶＨＨ－ジアンチン（２Ｔ２Ｃ）
２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ＶＨＨ１－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ２－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、各ＶＨＨは、別の細胞表面受容体を認識する（図１Ｃ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、ＨＥＲ２を標的化するＶＨＨの末端システイン残基にコンジュゲートして、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ１）を生成した。ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を、５０ｎＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの固定された濃度に対して滴定し、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、相対的に低い濃度のＶＨＨ－ＨＥＲ２－Ｌ－ＳＯ１８６１で細胞死滅の亢進を明らかにした（ＳＫ－ＢＲ－３；ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図４Ａ）。同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１単独で、高濃度にて細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝４，０００ｎＭ）、同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンは、細胞死滅を誘導できなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）において、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンの組み合わせは、より高い濃度で細胞死滅活性を明らかにした一方で（ＩＣ５０＝６００ｎＭ；図４Ｂ）、同濃度のＨＥＲ２ＶＨＨ、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１又はＨＥＲ２ＶＨＨ＋５０ｐＭ ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンは、細胞死滅活性を誘導できなかった（ＩＣ５０＞５，０００ｎＭ；図４Ｂ）。
次に、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンを、９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンと組み合わせた９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝０．０５ｐＭ；図５Ａ）、ＣＤ７１ＶＨＨジアンチン又はＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨは、高濃度でのみ細胞死滅を誘導できた（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）；図５Ａ）。加えて、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンもまた、７７ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定され、これはまた、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）細胞において細胞死滅活性の強力な強化を明らかにした（（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）において、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ－ＳＯ１８６１は、はるかに高い濃度でのみ細胞死滅を示した一方で（ＩＣ５０＝１０ｐＭ、図５Ｂ）、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋９００ｎＭ ＨＥＲ２ＶＨＨ又はＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、ＩＣ５０＝２，０００ｐＭでのみ細胞死滅を示した（図５Ｂ）。
これら全ては、相対的に低い濃度のＶＨＨＣＤ７１－ジアンチンが、高ＨＥＲ２／ＣＤ７１発現細胞において低ＶＨＨＨＥＲ２－ＳＯ１８６１コンジュゲート濃度と組み合わせて効果的であり及び細胞死滅を誘導できることを示す。
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）における本発明による組み合わせは、いずれの細胞死滅活性も明らかにしなかった。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内送達ＳＯ１８６１濃度が、タンパク質毒素のエンドソーム脱出及び細胞質内送達を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。
実施例３．ＶＨＨ－ジアンチン＋ｍＡｂ－ＳＯ１８６１（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、同じ細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ｅ）。２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）もまた、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、別の細胞表面受容体を認識する（図１Ｄ）。
ジアンチン－Ｃ（末端システインを有するジアンチン）を、ＨＥＲ２を標的化するＶＨＨ、ＣＤ７１を標的化するＶＨＨ又はＥＧＦＲを標的化するＶＨＨの末端システイン残基にコンジュゲートして、ＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）及びＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン（ＤＡＲ１）を生成した。
ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＨＲＥ２ＶＨＨ－ジアンチン又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチンを、セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定し、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた非常に低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンが、Ａ４３１細胞の効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ；図６Ａ）、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン単独で、ＩＣ５０＝２０００ｐＭにて活性を示したことを明らかにした。他の２つの組み合わせＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１及びＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれＩＣ５０＝２０ｐＭ及びＩＣ５０＝５０ｐＭで効率的な細胞死滅を示した一方で、ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン単独で、Ａ４３１細胞において効率的な細胞死滅を誘導できなかった（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図６Ａ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）において、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン及びＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれＩＣ５０＝３，０００ｐＭ及びＩＣ５０＝１，０００ｐＭで細胞死滅活性を示した一方で、全ての他の治療又は組み合わせは、Ａ２０５８細胞においてＩＣ５０＝１０，０００ｐＭ ＶＨＨ－毒素まで細胞死滅を示さなかった（図６Ｂ）。
これは、セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、３つの異なるＶＨＨ－ジアンチンコンジュゲートのエンドソーム脱出を効率的に誘導することによって、Ａ４３１細胞において細胞死滅の亢進を誘導することができることを示す。
次に、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン、ＨＲＥ２ＶＨＨ－ジアンチン又はＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチンを、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定し、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＝／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、７７ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた非常に低濃度のＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチンが、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＜０．０００１ｐＭ；図７Ａ）、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン単独で、ＩＣ５０＝１０，０００ｐＭにて活性を示したことを明らかにした。他の２つの組み合わせＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１及びＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれＩＣ５０＝４００ｐＭ及びＩＣ５０＝６ｐＭで効率的な細胞死滅を示した一方で、ＥＧＦＲＶＨＨ－ジアンチン又はＨＥＲ２ＶＨＨ－ジアンチン単独で、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において効率的な細胞死滅を誘導できなかった（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図７Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）において、ＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン及びＣＤ７１ＶＨＨ－ジアンチン＋７７ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１は、それぞれＩＣ５０＝３０００ｐＭ及びＩＣ５０＝２０００ｐＭで細胞死滅活性を示した一方で、全ての他の治療又は組み合わせは、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においてＩＣ５０＝１０，０００ｐＭ ＶＨＨ－ジアンチンまで細胞死滅を示さなかった（図７Ｂ）。これは、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、３つの異なるＶＨＨ－ジアンチンコンジュゲートのエンドソーム脱出を効率的に誘導することによって、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において細胞死滅の亢進を誘導することができることを示す。
材料及び方法
材料
ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から得られる生の植物抽出物からＡｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって単離され、精製された。ＶＨＨは、ＱＶＱ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ＨＥＲ２ＶＨＨ：クローン名：Ｑ１７ｃ；ＣＤ７１ＶＨＨ：クローン名：Ｑ５２ｃ ＥＧＦＲＶＨＨ：クローン名：Ｑ８６ｃ）から購入された。トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）は、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入された。ＣＤ７１モノクローナル抗体は、ＢｉｏＣｅｌｌ（Ｏｋｔ９、＃ＢＥ００２３）から購入された。注文のトラスツズマブ－サポリン及び抗ＣＤ７１ｍａｂ－サポリンコンジュゲートが製造され、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。ジアンチン－Ｃｙｓ（Ｄｉａ－Ｃｙｓ、単一のＣ末端システインを有するジアンチン変異体）は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅによって製造された。
トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（２ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ ビス－トリスタンパク質ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ事前染色済みタンパク質標準液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）タンパク質染色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ Ｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９９．６％、ＶＷＲ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス．ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－ヒスチジン（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水Ｄ－（＋）－トレハロース（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウリン酸塩（ＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、グアニジン塩酸塩（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ－Ｎａ２、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、滅菌フィルター０．２μｍ及び０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸サクシニミジル（ＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ビバスピンＴ４及びＴ１５濃縮機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸テトラ（エチレングリコール）サクシニミジル（ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィドオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、［Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート］（ＨＡＴＵ、９７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－システイン（９８．５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌａｂ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｅｒｃｋ）から新鮮に得た脱イオン水（ＤＩ）、ニッケル－ニトリロ三酢酸アガロース（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース、Ｐｒｏｔｉｎｏ）、グリシン（９９．５％、ＶＷＲ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（エルマン試薬、ＤＴＮＢ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）炭酸水素ナトリウム（９９．７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸ナトリウム（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５レジンを有するＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、０．５、２、５、及び１０ｍＬにおけるＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ビバスピン遠心フィルターＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔ４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ、及びＴ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｂｉｏｓｅｐ ｓ３０００ ａＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｖｉｖａｃｅｌｌ限外濾過ユニット１０及び３０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）。
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１（１２１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）及びＥＭＣＨ．ＴＦＡ（１１０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に、メタノール（過乾燥、３．００ｍＬ）及びＴＦＡ（０．０２０ｍＬ、０．２６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。１．５時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（１２０ｍｇ、９０％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０６９［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：１．０８４
細胞生存率アッセイ
処理の後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、細胞生存率を、製造業者の指示書（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実施されるＭＴＳ－アッセイによって決定した。簡潔には、ＭＴＳ溶液を、１０％ ＦＢＳで補充されたフェノールレッド（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を伴わないＤＭＥＭ中で２０倍希釈した。細胞を、２００μＬ／ＰＢＳウェルで１回洗浄した後、１００μＬの希釈されたＭＴＳ溶液をウェル毎に加えた。プレートを、３７℃でおよそ２０～３０分間インキュベートした。その後、４９２ｎｍでのＯＤを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、全ての他のウェルから減算した後、処理／未処理細胞の細胞生存率のパーセンテージを、処理されたウェルのバックグラウンド補正シグナルを未処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルで割ることによって計算した（ｘ１００）。
ＦＡＣＳ分析
細胞を、１０ｃｍのディッシュ中において５００，０００ｃ／プレートで、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）が補充されたＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中に播種し、９０％の培養密度に達するまで４８時間インキュベートした（５％ ＣＯ２、３７℃）。次に、細胞をトリプシン処理して（ＴｒｙｐｌＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、単一細胞にした。０．７５ｘ１０６個の細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、遠心分離した（１，４００ｒｐｍ、３分）。細胞ペレットを浸したまま上清を捨てた。ペレットを、ボルテックス振盪機上でファルコンチューブを緩やかにタッピングすることにより解離させ、細胞を４ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）で洗浄した。洗浄の後、細胞を、３ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）中で再懸濁させ、３つの丸底ＦＡＣＳチューブ（１ｍＬ／チューブ）に等しく分割した。細胞を再度遠心分離し、２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）又は１９５μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）中の５μＬの抗体を含有する２００μＬ 抗体溶液中で再懸濁させた。ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（＃３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＥＧＦＲ受容体を染色した。ＰＥ抗－ヒトＨＥＲ２ ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（＃３２４４０８ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＨＥＲ２受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をそれに見合うアイソタイプ対照として使用した。ＰＥ抗ヒトＣＤ７１（＃３３４１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ７１受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をそれに見合うアイソタイプ対照として使用した。試料を、チューブローラーミキサー上において４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ ＰＦＡ溶液を使用して室温で２０分間固定した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２５０～３５０μＬの冷ＰＢＳ中で再懸濁した。試料をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。様々な細胞に対するＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ７１の細胞表面発現の分析の結果は、表Ａ２において要約される。
Figure 2023532003000008
ＶＨＨ－ＳＯ１８６１のコンジュゲーションのための手順
一定分量のＶＨＨに、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨ－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過によりＴＢＳ ｐＨ ７．５に精製した。得られたＶＨＨ－ＳＨに、新たに調製されたＳＰＴ－ＥＭＣＨ溶液を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。
インキュベーションの後、一定分量のＶＨＨ－ＳＯ１８６１混合物を除去し、エルマンアッセイによって特徴付けて、ＳＯ１８６１の組み込みを確認した。コンジュゲートを、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムによって精製して、精製されたＶＨＨ－ＳＯ１８６１を得た。一定分量を０．２μｍに濾過し、濃縮し、１．０ｍｇ／ｍｌまで標準化して、ＶＨＨ－ＳＯ１８６１を得た。
ＶＨＨ－ジアンチンのコンジュゲーションのための手順
ジアンチン－Ｃｙｓを、ビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたジアンチン－Ｃｙｓに、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたジアンチン－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。得られたジアンチン－ＳＨを、ＤＭＳＯ中で新たに調製されたＤＴＭＥ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ジアンチン－ＤＴＭＥを、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過による精製の後に得た。ジアンチン－ＤＴＭＥを、コンジュゲートされるまで２０℃で保管した。同時に、一定分量のＶＨＨを、ビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたＶＨＨに、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ４ ５ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。一定分量の得られたＶＨＨ－ＳＨを、ジアンチン－ＤＴＭＥと反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。
抗体－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４
トラスツズマブ、セツキシマブは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、１、２、３、４、５、及び６のＤＡＲでマイケル型チオール－エンコンジュゲーション反応を介してサポニンＳＯ１８１６１－ＥＭＣＨにコンジュゲートされた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ分子は、その構造とそのマレイミド官能基の間に不安定な（Ｌ）ヒドラゾン結合を得て、サポニンとＡｂの間に不安定な結合を生成する。手順は、トラスツズマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４に関して例示的に記載される。
セツキシマブ（４０ｍｇ、８．０ｍｌ）の溶液に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
４つの部分に分割されたセツキシマブ（それぞれ９．７３ｍｇ、４．８６４ｍｇ／ｍｌ、６５ｎｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（０．５～２．０ｍｇ／ｍｌ、１．１５～７．０２モル当量、７５～４５５ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で３００分間インキュベートした。インキュベーションの後（ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの添加の前）、約１ｍｇ（０．２１０ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（それぞれのチオール対Ａｂ比＝２．０、４．２、５．９及び６．８）。原体Ａｂ－ＳＨの各々に、一定分量の新たに調製されたＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、０．１５～０．６１μｍｏｌ、０．１６～０．６３ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。各コンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（０．２５ｍｇ、１．６７ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、４．３～１７．４ｎｍｏｌ、２．２～８．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（２．２～８．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．２００ｍｌの一定分量のＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み込みを得た。原体Ａｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ、２．５～１０モル当量、０．１５～０．５８μｍｏｌ）を加え、混合物をＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａスピン脱塩カラムにより精製して、精製されたセツキシマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）コンジュゲートを得た。生成物を２．５ｍｇ／ｍｌに標準化し、０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。トラスツズマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートに関する反応条件及び結果並びにセツキシマブ－Ｌ－ＳＯ１８６１コンジュゲートに関する反応条件及び結果は、表Ａ３及び表Ａ４において要約される。
Figure 2023532003000009
Figure 2023532003000010
材料
明細書、特許請求の範囲及び図面全体を通して、「ＶＨＨ」、「Ｖｈｈ」、「Ｖｈｈ」及び「ＶＨＨ」は、同じ型の単一ドメイン抗体を参照するものとして理解されるべきである。「ＶＨ」、「Ｖｈ」、「Ｖｈ」及び「ＶＨ」のいずれかとして参照される型の単一ドメイン抗体についても同様である。
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、ＣＤ７１－ＶＨＨ（購入される）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（２ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ ビス－トリスタンパク質ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ事前染色済みタンパク質標準液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）タンパク質染色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ Ｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９９．６％、ＶＷＲ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス．ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－ヒスチジン（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水Ｄ－（＋）－トレハロース（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウリン酸塩（ＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、グアニジン塩酸塩（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ－Ｎａ２、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、滅菌フィルター０．２μｍ及び０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ビバスピンＴ４及びＴ１５濃縮機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィドオリゴヌクレオチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、［Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウム－ヘキサフルオロホスフェート］（ＨＡＴＵ、９７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－システイン（９８．５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌａｂ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｅｒｃｋ）から新鮮に得た脱イオン水（ＤＩ）、ニッケル－ニトリロ三酢酸アガロース（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース、Ｐｒｏｔｉｎｏ）、グリシン（９９．５％、ＶＷＲ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（エルマン試薬、ＤＴＮＢ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸水素ナトリウム（９９．７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸ナトリウム（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５レジンを有するＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、０．５、２、５、及び１０ｍＬにおけるＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ビバスピン遠心フィルターＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔ４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ、及びＴ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｂｉｏｓｅｐ ｓ３０００ ａＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｖｉｖａｃｅｌｌ限外濾過ユニット１０及び３０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、アクリルアミド（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ドデシル硫酸ナトリウム（９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、グリセロール（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ－３５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。全てのＳＯ１８６１誘導体（ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－ＡＥＭ、デンドロン－［Ｌ－ＳＯ１８６１］ｎ）、全てのＱＳ２１誘導体（ＱＳ２１－ＥＭＣＨ、ＱＳ２１－ＡＥＭ、デンドロン－［Ｌ－ＱＳ２１］ｎ）、及び三官能性リンカー誘導体が内製された。
合成
１．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
２．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
３．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。「ｎ」は、４、８、又は８より多いＳＯ１８６１分子の数を指す。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
４．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
５．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
６．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ＨＳＰ２７－Ｍａｌ」と称されるＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのＨＳＰ２７－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）であった。「ｎ」は、４、８、又は８より多いＱＳ２１分子の数を指す。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）４）－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のＨＳＰ２７ ＢＮＡ－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
７．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
８．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ジアンチン）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
９．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）であった。「ｎ」は、４、８、又は８より多いＳＯ１８６１分子の数を指す。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（Ｌ－ジアンチン）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
１０．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｌ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
１１．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）であった。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－ＱＳ２１）－（Ｌ－ジアンチン）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
１２．ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４
ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン）］４、ＣＤ７１－ＶＨＨ－［Ｓ－トリ－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン）］４、
ＨＥＲ２－ＶＨＨ、ＥＧＦＲ－ＶＨＨ、及びＣＤ７１－ＶＨＨは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、マイケル型チオール－エン反応を介して、後で「ジアンチン－Ｍａｌ」と称されるジアンチン誘導体を有する２つの異なるマレイミド（Ｍａｌ）にコンジュゲートされた。これらのジアンチン－Ｍａｌ誘導体は、すなわち：１）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）ｎ）－（Ｌ－ジアンチン－Ｍａｌ）、２）Ｍａｌ－三官能性リンカー－（遮断）－（Ｌ－ジアンチン－Ｍａｌ）であった。「ｎ」は、４、８、又は８より多いＱＳ２１分子の数を指す。手順は、ＨＥＲ２－ＶＨＨ－［Ｓ－三官能性リンカー－（Ｓ－デンドロン－（Ｌ－ＱＳ２１）４）－（Ｌ－ジアンチン－Ｍａｌ）］４について例示的に記載される：
Ａｂを、脱イオン水（ＤＩ）で２１ｍｇ／ｍｌに再構成し、続いてヒスチジン緩衝液ｐＨ６を使用して５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２０ｍｇ（４．０ｍｌ）の一定分量に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
Ａｂ（２．１ｍｇ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１４μｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１．００ｍｇ／ｍｌ、２．３５モル当量、０．３２μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後（コンストラクトの添加の前）、約０．２ｍｇ（０．０４４ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（チオール対ａｂ比＝４．０）。原体Ａｂ－ＳＨを、２つの一定分量（０．１１ｍｇ、７．６ｎｍｏｌ及び０．１２ｍｇ、８．３ｎｍｏｌ）に分割し、それぞれの一定分量に、一定分量のジアンチン－Ｍａｌ誘導体１－２の各々（ＴＢＳ ｐＨ７．５中で新たに調製される、２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、４０ｎｍｏｌ及び４３ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。Ａｂ－ジアンチン誘導体２のコンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（５０μｇ、３．３ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、１７．３ｎｍｏｌ、６．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（６．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．１００ｍｌの一定分量のＡｂ－コンストラクト２の混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ジアンチン誘導体２の組み込みを得た。各原体Ａｂ－コンストラクト混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５モル当量、１９及び２１ｎｍｏｌ）を加え、混合物を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６×３０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍを使用するゲル濾過により精製した後、１００ＫＤａ ＭＷＣＯ濃縮機を使用して遠心濾過及び洗浄を繰り返して、精製されたＡｂ－コンストラクト１－２コンジュゲートを得た。生成物を０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
実施例４
本発明のコンジュゲート。図１Ｆ～Ｉは、本発明の４つの典型的な分子集合体又はコンジュゲート（共有結合性複合体）を示す。これらのコンジュゲートは、細胞系バイオアッセイ、インビボ動物モデルなどにおいて試験するために製造され、精製される。
図１Ｆは、ＩｇＧ（又はいくつかの実施形態ではｓｄＡｂ）などの標的化リガンドと複合体を形成した（共有結合された）少なくとも１つのサポニン部分「Ｓ」を含む本発明によるエンドソーム／リソソーム脱出強化コンジュゲートを表す模式図であり、サポニンは、抗体に直接的に連結されるか、又は（切断可能な）リンカーを介して抗体に結合され、抗体はさらに、（切断可能な）結合を介して少なくとも１つのエフェクター部分「Ｅ」と複合体を形成する（共有結合される）。サポニンは通常、リガンド、ここでは抗体におけるシステインの－ＳＨ基に連結される。１つ又は複数のエフェクター部分は通常、リガンド、ここでは抗体におけるシステインの－ＳＨ基に連結される。通常、少なくとも１つのサポニンは、ＳＡ１６４１、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－７、又はその誘導体、及びその組み合わせから選択され、サポニンＳＯ１８６１（誘導体）が好ましい。本発明のコンジュゲートにおける組み込みのために選択される典型的な細胞表面分子標的化リガンドは、トラスツズマブ、セツキシマブ、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、又はＥＧＦＲに結合するためのＥＧＦなどの（腫瘍）細胞表面受容体に特異的な免疫グロブリンである。図１Ｆにおいて、細胞標的化リガンドは、細胞表面受容体に特異的な抗体である。典型的な標的化される細胞表面分子は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ、ＰＳＭＡ、ＣａｎＡｇ、インテグリン－アルファＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソセリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ１２３、ＤＬＬ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ７１である。既知の腫瘍標的化抗体もまた、図１Ｆによる本発明のコンジュゲートを製造するのに好ましい。通常、１つ又は複数のエフェクター部分は、ジアンチン、サポリン、リボソーム不活性化タンパク質などの（タンパク質）毒素から選択されるか、又はＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、又は酵素である。サポニン及びペイロード（エフェクター部分）は、抗体に共有結合的に直接的にカップリングされるか又は４．５～５．５のｐＨなどの酸性条件下で切断可能な、切断可能なリンカーなどのリンカーを介して抗体に連結される。
本発明者らによって製造され、活性について試験される図１Ｆのエンドソーム／リソソーム脱出強化コンジュゲートの例は少なくとも、（末端）ＳＯ１８６１にカップリングされ及びＨＳＰ２７サイレンシングＡＳＯ（ＢＮＡ）、ジアンチン、酵素Ｃｒｅ－リコンビナーゼなどのペイロードにカップリングされたセツキシマブ、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、及びトラスツズマブである。本発明に関連して用語「末端」は、本発明のコンジュゲートにおける単一のさらなる分子に共有結合的に連結される分子として理解されることになる。例えば、コンジュゲートサポニン－ｓｄＡｂ－エフェクター部分において、サポニン及びエフェクター部分の両方は、コンジュゲートにおける末端部分である一方で、ｓｄＡｂは、２つの末端部分を有する中心的な部分である。
図１Ｇは、デンドロン又はＰＡＭＡＭなどの足場部分を介してＩｇＧなどの標的化リガンドと複合体を形成した少なくとも１つのサポニン部分「Ｓ」を含む本発明によるエンドソーム／リソソーム脱出強化コンジュゲートを表す模式図であり、サポニンは、デンドロンに直接的に、又は（切断可能な）リンカーを介して連結される。１つ又は複数のデンドロン部分は通常、リガンド（抗体）におけるシステインの－ＳＨ基に連結される。通常、サポニンは、ＳＡ１６４１、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－７並びにその組み合わせ及びその誘導体から選択され、サポニンＳＯ１８６１（誘導体）が好ましい。本発明のコンジュゲートにおける組み込みのために選択される典型的な細胞表面分子標的化リガンドは、トラスツズマブ、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体、セツキシマブなどの（腫瘍）細胞表面受容体に特異的な免疫グロブリンである。当技術分野で知られる抗腫瘍モノクローナル抗体もまた、図１Ｇによる本発明のコンジュゲートを製造するのに好ましい。コンジュゲートは、少なくとも１つのエフェクター部分「Ｅ」とさらに複合体を形成した抗体を含み、１つ又は複数のエフェクター部分は、少なくとも１つのサポニン部分がカップリングされるデンドロンなどの同じ足場に連結され、エフェクター部分は、リンカーなどの（切断可能な）結合を介してデンドロンにカップリングされる。通常、抗体は、細胞表面分子はＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ、ＰＳＭＡ、ＣａｎＡｇ、インテグリン－アルファＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソセリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ１２３、ＤＬＬ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ７１のいずれかに結合する。
本発明者らによって製造され、活性について試験される図１Ｇのエンドソーム／リソソーム脱出強化コンジュゲートの例は、少なくとも１つのデンドロンとともに提供される少なくともトラスツズマブであり、その少なくとも１つのデンドロンは、１つ又は複数の（末端）サポニン部分及び１つ又は複数の（末端）ペイロード部分（１つ又は複数のエフェクター部分）に結合される。サポニンは通常、ＳＯ１８６１であり、ペイロードは通常、ＨＳＰ２７（ＡＳＯ（ＢＮＡ））若しくはＡｐｏＢ、又は（タンパク質）毒素若しくはｓｉＲＮＡをサイレンシングすることができるＢＮＡである。ＳＯ１８６１（誘導体）は、切断可能なヒドラゾン結合（共有結合）を介してデンドロンにカップリングされる。
実施例５
ＳＯ１８６１は、（不安定な）システイン残基（Ｃｙｓ）を介してコンジュゲートされ、ジアンチン（タンパク質毒素）は、（安定な）リジン残基（Ｌｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートされて、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２をもたらした。コンジュゲートは、図１Ｊにおいて示されるとおりのＥＧＦＲ腫瘍標的化細胞死滅に関してＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）異種移植マウス腫瘍モデルにおいて試験された。投与は腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達した１２日目に開始され、腫瘍体積は各投与の後に測定された。マウス（ｎ＝３）は、１２日目：０．５ｍｇ／ｋｇ；１５日目：１ｍｇ／ｋｇ及び２４日目：１．５ｍｇ／ｋｇにセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，６で治療された（腹腔内；ｉ．ｐ．；用量漸増）。２６日目に、対照群と比較して、腫瘍体積の縮小は、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２で治療された担腫瘍マウスにおいて観察された（図８Ａ）。これは、抗体－タンパク質毒素（安定な）コンジュゲートに対するＳＯ１８６１の不安定なコンジュゲーションが、腫瘍標的化抗体－タンパク質毒素の標的化される治療有効性を強化することによって、より効果的な腫瘍標的化療法を誘導することを示す。
次に、ＳＯ１８６１は、（不安定な）システイン残基（Ｃｙｓ）を介してコンジュゲートされ、ジアンチン（タンパク質毒素）は、（不安定な）リジン残基（Ｌｙｓ）を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートされて、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２をもたらした。コンジュゲートは、図１Ｊにおいて示されるとおりのＥＧＦＲ腫瘍標的化細胞死滅に関してＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）異種移植マウス腫瘍モデルにおいて試験された。投与は腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達した１２日目に開始され、腫瘍体積は各投与の後に測定された。マウス（ｎ＝３）は、１２日目：０．５ｍｇ／ｋｇ；１５日目：１ｍｇ／ｋｇ、２４日目：１．５ｍｇ／ｋｇにセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，６で治療された（腹腔内；ｉ．ｐ．；用量漸増）。これは、３５日後に、対照と比較して、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２で治療された担腫瘍マウスが、腫瘍増殖の阻害を示したことを明らかにした（図８Ｂ）。マウス（ｎ＝３）が、１２日目：０．５ｍｇ／ｋｇ；１５日目：１ｍｇ／ｋｇ、１８日目：２ｍｇ／ｋｇ、２４日目：２．５ｍｇ／ｋｇに本発明によるセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２で治療されたとき（静脈内、ｉ．ｖ．；用量漸増）、腫瘍増殖の阻害もまた、対照と比較して観察された（２頭のマウスが治療中に死亡したため、データは、１頭のマウスを表す）。これは、抗体－タンパク質毒素（不安定な）コンジュゲートに対するＳＯ１８６１の不安定なコンジュゲーションが、腫瘍標的化抗体－タンパク質毒素の標的化される治療有効性を強化することによって、サポニンを含まない抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートと比較してより効果的な腫瘍標的化療法を誘導することを示す。
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してＤＡＲ ３．９でセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）に、及びアンチセンスＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴヌクレオチド（癌細胞における腫瘍標的ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの分解を標的化し、誘導する（遺伝子サイレンシング））を不安定な（Ｌ）リンカーを介してＤＡＲ １．８で抗体のリジン残基（Ｌｙｓ）にコンジュゲートして、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）１，８の生成をもたらした。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）１，８は、図１Ｋに示されるとおりの本発明によるＥＧＦＲ媒介性腫瘍標的化ＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングのためのＡ４３１異種移植「ヌード」マウス腫瘍モデルにおいて試験された。投与は腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達した１２日目に開始され、ＨＳＰ２７ ｍＲＮＡ発現が決定された。これに関して、腫瘍試料は、最初の投与後の７２時間目に回収され、細胞性対照ｍＲＮＡ発現レベル（参照遺伝子）と比較してＨＳＰ２７遺伝子発現レベルについて分析された。３０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）１，８で治療された（腹腔内；ｉ．ｐ．）担腫瘍マウス（ｎ＝３）は、１回の投与後に、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）１，５の単回投与と比較して腫瘍においてＨＳＰ２７ ｍＲＮＡ発現の４０％の低下を示した（図９）。溶媒対照の腫瘍と比較して、２５％ ＨＳＰ２７遺伝子発現の低下が観察された。これは、本発明によるＳＯ１８６１及びＨＳＰ２７ＢＮＡの同じ標的化抗体へのコンジュゲーションが、担腫瘍マウスの固形腫瘍における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にしている。
別の例において、三官能性リンカー足場は、一方のアーム上でのＳＯ１８６１及び他方のアーム上のＨＳＰ２７ＢＮＡによるコンジュゲーションのための３つの特定の化学末端基を伴って設計され、生成されて、ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡを生成した。次に、ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡは、その第３のアームにより抗ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ（セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７）のシステイン残基（Ｃｙｓ）にコンジュゲートされ、図１Ｌに示されるとおりの本発明によるＥＧＦＲ媒介性の腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシング活性に関してＡ４３１異種移植「ヌード」マウス腫瘍モデルにおいて試験された。投与は腫瘍のサイズが約１５０ｍｍ３に達した１２日目に開始され、ＨＳＰ２７ ｍＲＮＡ発現が決定された。これに関して、腫瘍試料は、最初の投与後の７２時間目に回収され、細胞性対照ｍＲＮＡ発現レベル（参照遺伝子）と比較してＨＳＰ２７遺伝子発現レベルについて分析された。これは、３０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７の１回の投与が、２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８又は２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４単剤療法の単回投与と比較して腫瘍においてＨＳＰ２７遺伝子発現の４０％の低下をもたらしたことを明らかにした（図１０）。溶媒対照腫瘍と比較して、２５％ ＨＳＰ２７遺伝子発現の低下は、セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７の１回の投与で治療された担腫瘍マウスにおいて観察された。これは、セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７が、担腫瘍マウスの固形腫瘍における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、インビボで標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にする。
実施例６
本発明による別の例において、ＳＯ１８６１（不安定）及びタンパク質毒素、ジアンチン（不安定又は安定）は、ＨＥＲ２標的化抗体、トラスツズマブにコンジュゲートされた。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０が生成され、図１Ｊに示されるとおりのＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）において細胞死滅の亢進について試験された。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７（ＩＣ５０＝０．８ｎＭ）及びトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２，０（ＩＣ５０＝０．８ｎＭ）の両方が、ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）の細胞死滅を効率的に誘導する（図１１Ａ）。これは、トラスツズマブ、トラスツズマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，７、トラスツズマブ－（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７又はトラスツズマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８単独で治療されたＳＫ－ＢＲ－３細胞において観察されなかった（図１１Ａ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－）において、細胞死滅活性は、本発明によるコンジュゲートのいずれかについて観察され得ない（図１１Ｂ）。これは、ＨＥＲ標的化抗体－タンパク質毒素コンジュゲートへのＳＯ１８６１のコンジュゲーションが、標的細胞においてタンパク質毒素のＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、標的細胞の死をもたらすことを示す。
本発明による別の例において、ＳＯ１８６１（不安定）及びタンパク質毒素、ジアンチン（不安定又は安定）は、ＥＧＦＲ標的化抗体、セツキシマブにコンジュゲートされた。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）２は、図１Ｊに示されるとおりのＡ４３１（ＨＥＲ２＋＋）及びＡ２０５８（ＨＥＲ２－）において細胞死滅の亢進について試験された。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，９（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）２（ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）及びセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，７（ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）の両方が、セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ジアンチン）１，６（ＩＣ５０＝２ｐＭ）、セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｓ－ジアンチン）１，６（ＩＣ５０＝２ｐＭ）単独と比較してＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）において細胞死滅の亢進を示した（図１１Ｃ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）において、本発明による組み合わせは、いずれの細胞死滅活性も示さなかった（ＩＣ５０＞２００ｎＭ；図１１Ｄ）。これは、ＥＧＦＲ標的化抗体－タンパク質毒素コンジュゲートへのＳＯ１８６１のコンジュゲーションが、標的細胞においてタンパク質毒素のＳＯ１８６１媒介性の細胞質内送達を効率的に強化して、標的細胞の死の亢進をもたらすことを示す。
実施例７
本発明による別の例において、ＳＯ１８６１（不安定）及びＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴヌクレオチド（不安定、Ｌ）は、ＥＧＦＲ標的化抗体、セツキシマブにコンジュゲートされた。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，８は、図１Ｋに示されるとおりの本発明によるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの強化について試験された。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，８は、セツキシマブ、セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，９又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８単独と比較してＡ４３１細胞（ＩＣ５０＝３ｎＭ）においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングを効率的に誘導する（図１２Ａ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）において、遺伝子サイレンシング活性は、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，８で観察され得ない（ＩＣ５０＞１００ｎＭ；図１２Ｂ）。これは、本発明によるＳＯ１８６１及びＨＳＰ２７ＢＮＡの同じ標的化抗体へのコンジュゲーションが、標的細胞における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にする。
本発明による別の例において、ＳＯ１８６１（不安定）及びＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴ（不安定）は、ＨＥＲ２標的化抗体、トラスツズマブにコンジュゲートされた。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，５は、図１Ｋに示されるとおりの本発明によるＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＨＥＲ２＋＋）細胞においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの強化について試験された。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，８（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，５は、トラスツズマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４，４単独と比較してＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＩＣ５０＝９ｎＭ）においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングを効率的に誘導する（図１３）。これは、本発明によるＳＯ１８６１及びＨＳＰ２７ＢＮＡのＨＥＲ２標的化抗体へのコンジュゲーションが、標的細胞における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にする。
別の例において、セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７は、図１Ｌに示されるとおりの本発明によるＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの強化について試験された。セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７は、セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４又はセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７単独と比較してＡ４３１細胞（ＩＣ５０＝２ｎＭ）においてＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングを効率的に誘導する（図１４Ａ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）において、遺伝子サイレンシング活性は、高濃度（＞８０ｎＭ）のセツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７でのみ観察された（ＩＣ５０＝１００ｎＭ；図１４Ｂ）。これは、高ＥＧＦＲ発現細胞において、セツキシマブ－Ｃｙｓ－（ＳＯ１８６１－Ｌ－三官能性リンカー－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）３，７が、標的細胞において治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＯ１８６１媒介性の強化された細胞質内送達を効率的に誘導して、標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にする。
タンパク質毒素又はサポニンに共有結合された抗体及び受容体リガンドに関連するいくつかの実施形態の概要
ｍＡｂ：トラスツズマブ（ＨＥＲ２）又はセツキシマブ（ＥＧＦＲ）
リガンド：ＥＧＦ
タンパク質毒素：リボソーム不活性化タンパク質、サポリン又はジアンチン
リガンドを伴うサポニンのエンドソーム脱出強化コンジュゲート：
ｍＡｂ－ＳＯ１８６１エンドソーム脱出強化コンジュゲート
・切断可能なヒドラゾンリンカーを含有する
・トラスツズマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ４．０
・セツキシマブ－ＳＯ１８６１ ＤＡＲ ３．７；
以下によるインビトロ又はインビボ試験モデルで組み合わせられたリガンドとサポニンのエンドソーム脱出強化コンジュゲート：
ｍＡｂ／リガンド－タンパク質毒素コンジュゲート
・切断不可能な化学的リンカーを含有するか又は組換え融合タンパク質である
・トラスツズマブ－サポリン ＤＡＲ ３．０
・セツキシマブ－サポリン ＤＡＲ ２．６
・トラスツズマブ－ジアンチン ＤＡＲ １．０
・ＥＧＦ－ジアンチン（融合タンパク質） ＤＡＲ １．０
・ＩｇＧ－サポリン ＤＡＲ ２．２
実施例８～１３に関して：
材料：
トラスツズマブ及びセツキシマブは、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入された。ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）から得られる生の植物抽出物からＡｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって単離され、精製された。
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス Ｌ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）（Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨ）からのものであり、当技術分野で知られる従来の工程に従ってＥＭＣＨにカップリングされた。
ＳＯ１８６１の抗体へのコンジュゲーション
トラスツズマブ－ＳＯ１８６１及びセツキシマブ－ＳＯ１８６１の注文生産は、ＦｌｅｅｔＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＵＫ）によって実施された。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨは、抗体のシステインにコンジュゲートされた。
サポリンのトラスツズマブ及びセツキシマブへのコンジュゲーション
注文のトラスツズマブ－サポリン及びセツキシマブ－サポリンコンジュゲートが製造され、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。ＩｇＧ－サポリン及びサポリンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された。
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアによるデータ分析に対して実施され、ＦＡＣＳ抗体は、１）アイソタイプ：ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ（ＦＣ）（４００１２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。ＥＧＦＲ：ＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ＨＥＲ２：ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（３２４４０８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
ジアンチン生成
ジアンチンは、細菌培養物において発現され、タンパク質は、当技術分野で知られる従来の細胞培養及びタンパク質精製工程に従って精製された。
抗体のジアンチンへのコンジュゲーション
抗体及びジアンチンのコンジュゲーションは、当技術分野で知られる一般的な手順に従う。
細胞培養
細胞は、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）が補充されたＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中において３７℃及び５％ ＣＯ２で培養された。
細胞生存率アッセイ
細胞を、１００μＬ／ウェル中において５，０００～１０，０００ｃ／ｗで９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１０倍濃縮された処理混合物試料を、ＰＢＳ中で調製し、これは、両方ともに１０×最終濃度で抗体にコンジュゲートされたＳＯ１８６１（すなわち、本発明の「結合分子」又は「エンドソーム脱出強化コンジュゲート」）及び標的化毒素（すなわち、「結合分子」）を含有する。培地を、細胞培養プレートから除去し、１８０μＬの培養培地によって置き換えた後、２０μＬの処理混合物／ウェルを加えた。対照に関して、対応する濃度の抗体にコンジュゲートされたＳＯ１８６１のみ、抗体のみ、ＳＯ１８６１のみ、標的化毒素のみ、又は溶媒対照として化合物を伴わないＰＢＳを含有した１０×処理混合物試料を調製した。エンドソーム酸性化阻害剤（クロロキン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）又はバフィロマイシンＡ１（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））が使用された場合、処理の工程１における細胞培養培地を、１μＭ クロロキン又は０．２μＭ バフィロマイシンＡ１を含有する１８０μＬの培地によって置き換えた。プレートを、３７℃で１時間インキュベートした後、１０×処理混合物試料を加えた。残りのインキュベーション及び処理工程を、当技術分野で知られる標準的な手順に従って実施した。
処理の後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、細胞生存率を、製造業者の指示書（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実施されるＭＴＳ－アッセイによって決定した。簡潔には、ＭＴＳ溶液を、１０％ ＦＢＳ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）で補充されたフェノールレッド（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を伴わないＤＭＥＭ中で２０倍希釈した。細胞を、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄した後、１００μＬの希釈されたＭＴＳ溶液をウェル毎に加えた。プレートを、３７℃でおよそ２０～３０分間インキュベートした。その後、４９２ｎｍでの光学密度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、全ての他のウェルから減算した後、未処理／処理細胞の比率を、未処理のウェルのバックグラウンド補正シグナルを処理されたウェルのバックグラウンド補正シグナルで割ることによって計算した。
結果
実施例８．１標的２－構成成分系
１標的２－構成成分系は、ｍＡｂ１－タンパク質毒素及びｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ治療である一方で（図１Ａ、Ｅを参照のこと）、２標的２－構成成分系は、ｍＡｂ－タンパク質毒素及びｍＡｂ２－ＳＯ１８６１又はｍＡｂ２－タンパク質毒素＋ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせである（図１Ｂ～Ｄ）。本発明の１－標的１構成成分系（ＩｇＧなどの抗体又はＶＨＨなどのｓｄＡｂなどの同じリガンドが、サポニンを前記リガンドの第１の部分に共有結合的にコンジュゲートするため及びエフェクター分子を前記リガンドの第２の別々の部分に共有結合的にコンジュゲートするために適用される）は、例えば、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ１－エフェクター部分を含む（図１Ｆ～Ｌを参照のこと）。
セツキシマブ－ＳＯ１８６１（サポニン分子、ＳＯ１８６１にコンジュゲートされた、ＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体；エンドソーム脱出強化コンジュゲート）を、１０ｐＭのセツキシマブ－サポリン（タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされた、ＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）の固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１濃度に対して計算される）、高ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を決定した。高ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１又はＣａＳＫｉ）は、１０ｐＭのセツキシマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、効率的な細胞死滅を示した（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝６００ｎＭ及びＣａｓｋｉ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝７００ｎＭ；図１５Ａ、１５Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、セツキシマブ－サポリンがセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、低濃度のＳＯ１８６１で既に強力な細胞死滅が誘導された（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝５ｎＭ及びＣａｓｋｉ［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝８ｎＭ；図１５Ａ、１５Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較してエンドソーム脱出を誘導する際により効果的であることを示す。次に、セツキシマブ－サポリンを、３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、ＥＧＦＲ発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。高ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１又はＣａＳＫｉ）は、非標的化非コンジュゲートの３００ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせた高いセツキシマブ－サポリン濃度でのみ細胞死滅を示す一方で（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；図１５Ｃ、１５Ｄ；図Ａ７）、低いセツキシマブ－サポリン濃度と組み合わせた３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１で既に、効率的な細胞死滅を誘導した（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．４ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝２ｐＭ；図１５Ｃ及び１５Ｄ；表Ａ７）。最も高い細胞死滅効率は、高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）が低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせられるときに達成される（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；ＣａＳｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝０．０２ｐＭ；図１５Ｃ、１５Ｄ；表Ａ７）。このことは、セツキシマブにコンジュゲートされるとき、相対的に低い濃度のＳＯ１８６１が、相対的に低い濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせて高ＥＧＦＲ発現細胞を効率的に死滅させることができることを示す。低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、１標的２－構成成分系において両方のコンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体について競合するので、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への進入に役割を果たさないため、依然として最も効果的である。受容体競合原理はまた、セツキシマブを伴わないか（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ；Ｃａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝４０ｐＭ）又は７５ｎＭ セツキシマブを伴う（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝１０００ｐＭ；Ｃａｓｋｉ：ＩＣ５０＝１０００ｐＭ；図１５Ｃ、１５Ｄ）セツキシマブ－毒素滴定処理においても明確に示される。
次に、セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、低／無ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を決定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）は、１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたときのみ細胞死滅を示した一方で、ＥＧＦＲを発現しないＡ２０５８細胞（Ａ２０５８）は全く感受性がなかった（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１６Ａ、１６Ｂ；表Ａ６）。１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンと増加した濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１の組み合わせは、両方の細胞株においていずれの著しい細胞死滅も誘導しなかった（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１６Ａ、１６Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内ＳＯ１８６１濃度が、エンドソームタンパク質毒素脱出及び毒素媒介性の細胞死滅を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。次に、セツキシマブ－サポリンを、３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、低／無ＥＧＦＲ発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）は、２７８ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１又は３００ｎＭの非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせた非常に高いセツキシマブ－サポリン濃度でのみ細胞死滅を示す一方で、Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ）は、いずれの試験濃度でも感受性ではない（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＝６０ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１６Ｃ、１６Ｄ；表Ａ７）。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す一方で、Ａ２０５８細胞において、標的化されない１５００ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせた非常に高いセツキシマブ－サポリン濃度でのみ非特異的な細胞死滅が誘導される（Ｈｅｌａ：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＝２０ｐＭ；図１６Ｃ、１６Ｄ；表Ａ５）。このことは、低いＥＧＦＲ受容体発現を有するか又はＥＧＦＲ受容体発現を有しない細胞が、細胞内の十分なＳＯ１８６１及び毒素の進入を促進する十分なＥＧＦＲ受容体の欠如に起因して、セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（サポニン分子、ＳＯ１８６１にコンジュゲートされた、ＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体；本発明によるエンドソーム脱出強化コンジュゲート）を、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされた、ＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）の固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１濃度に対して計算される）、高ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を決定した。高ＨＥＲ２発現細胞（ＳＫＢＲ３）は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、効率的な細胞死滅を示した（ＳＫＢＲ３；図１７Ａ、１７Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、トラスツズマブ－サポリンがトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、強力な細胞死滅が、低濃度のＳＯ１８６１で既に誘導された（ＳＫＢＲ３；図１７Ａ、１７Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較してエンドソーム脱出を誘導する際により効果的であることを示す。次に、トラスツズマブ－サポリンを、５０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。高ＨＥＲ２発現細胞（ＳＫＢＲ３又はＢＴ４７４）は、非標的化非コンジュゲートの１０ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせた高トラスツズマブ－サポリン濃度でのみ細胞死滅を示す一方で（表Ａ７）、低トラスツズマブ－サポリン濃度と組み合わせた１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１で既に、効率的な細胞死滅を誘導した（表Ａ７）。最も高い細胞死滅効率は、高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）が低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせられるときに達成される（表Ａ７）。このことは、トラスツズマブにコンジュゲートされるとき、低い濃度のＳＯ１８６１が、相対的に低い濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせて高ＨＥＲ２発現細胞を効率的に死滅させることができることを示す。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、１標的２－構成成分系において両方のコンジュゲートが同じＥＧＦＲ受容体について競合するので、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への進入に役割を果たさないため、依然として最も効果的である。受容体競合原理はまた、２．５ｎＭのトラスツズマブを伴わないか又は伴うトラスツズマブ－毒素滴定処理においても明確に示される（ＳＫＢＲ３：［毒素］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ）。
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、低／無ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を決定した。低ＥＧＦＲ発現細胞（ＪＩＭＴ１；Ａ４３１）は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、細胞死滅をわずかに示した（ＪＩＭＴ１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１８Ａ、１８Ｂ；表Ａ６）。５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンと増加した濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１の組み合わせは、両方の細胞株においていずれの著しい細胞死滅も誘導しなかった（ＪＩＭＴ１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図１８Ａ、１８Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内ＳＯ１８６１濃度が、エンドソームタンパク質毒素脱出及び毒素媒介性の細胞死滅を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。次に、トラスツズマブ－サポリンを、１０ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、低／無ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。低ＨＥＲ２発現細胞（ＪＩＭＴ１；Ａ４３１）は、１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた高トラスツズマブ－サポリン濃度で著しい細胞死滅を示さない（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１８Ｃ、１８Ｄ；表Ａ７）。低ＨＥＲ２発現細胞における低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す（ＪＩＭＴ１：［毒素］ＩＣ５０＝０．１ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．８ｐＭ；図１８Ｃ、１８Ｄ；表Ａ５）。このことは、低ＨＥＲ２受容体発現を有する細胞が、細胞内の十分なＳＯ１８６１及び毒素の進入を促進する十分なＥＧＦＲ受容体の欠如に起因して、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
実施例９．２標的２－構成成分系
セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を決定した。Ａ４３１及びＣａＳｋｉ細胞は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、効率的な細胞死滅を示した（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１０００ｎＭ；図１９Ａ、１９Ｂ；表Ａ６）。しかしながら、トラスツズマブ－サポリンがセツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、低濃度のＳＯ１８６１で既に強力な細胞死滅が誘導された（Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝１２ｎＭ及びＣａｓｋｉ［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝４０ｎＭ；図１９Ａ、１９Ｂ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較してエンドソーム脱出を誘導する際により効果的であることを示す。次に、トラスツズマブ－サポリンを、３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１及びＣａＳｋｉ）に対して標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。非標的化非コンジュゲートの３００ｎＭ ＳＯ１８６１と組み合わせた高トラスツズマブ－サポリン濃度により効果的な細胞死滅は観察されなかった一方で（Ａ４３１及びＣａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図１９Ｃ、１９Ｄ；図Ａ７）、低いトラスツズマブ－サポリン濃度と組み合わせた３００ｎＭのセツキシマブ－ＳＯ１８６１で既に、効率的な細胞死滅を誘導した（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝３ｐＭ；Ｃａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１９Ｃ及び１９Ｄ；表Ａ７）。Ａ４３１細胞において、同等の細胞死滅効率は、高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１が低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせられるときに達成される（Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ；図１９Ｃ；表Ａ７を参照のこと）。Ｃａｓｋｉ細胞において、応答は、これらの細胞におけるＥＧＦＲ発現がＡ４３１と比較して著しく低く、したがって、ＳＯ１８６１のＣａｓｋｉ細胞への標的化された送達が不十分であるという事実に起因して、セツキシマブ－ＳＯ１８６１及びトラスツズマブ－サポリンの組み合わせと比較してわずかに強力であった（Ｃａｓｋｉ：［毒素］ＩＣ５０＝０．２ｐＭ；図１９Ｄ；表Ａ７を参照のこと）。このことは、セツキシマブにコンジュゲートされるとき、低濃度のＳＯ１８６１が、相対的に低い濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせて高ＥＧＦＲ発現細胞を効率的に死滅させることができることを示す。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、２－標的２－構成成分系において両方のコンジュゲートが異なる受容体を介して、ＥＧＦＲを介してＳＯ１８６１及びＨＥＲ２受容体を介して毒素が送達されるので、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への進入に役割を果たさないため、同等の活性を有する。
次に、セツキシマブ－ＳＯ１８６１を、５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、低／無ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する細胞死滅を決定した。低ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞は、５０ｐＭのトラスツズマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、細胞死滅をわずかに示した（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２０Ａ、２０Ｂ；表Ａ６）。５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンと増加した濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１の組み合わせのみが、両方の細胞株において高濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１で著しい細胞死滅を示した（ＨｅＬａ：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ２０５８：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２０Ａ、２０Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内ＳＯ１８６１濃度が、エンドソームタンパク質毒素脱出及び毒素媒介性の細胞死滅を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。次に、トラスツズマブ－サポリンを、セツキシマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、低／無ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。低／無ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（ＨｅＬａ及びＡ２０５８）は、２７８ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた高トラスツズマブ－サポリン濃度で著しい細胞死滅を示さない（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図２０Ｃ、２０Ｄ；表Ａ７）。低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す（ＨｅＬａ：［毒素］ＩＣ５０＝０．４ｐＭ；Ａ２０５８：［毒素］ＩＣ５０＝０．５ｐＭ；図２０Ｃ、２０Ｄ；表Ａ５）。このことは、低／無ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現を有する細胞が、細胞内の毒素の効率的な細胞質内送達を確実にする十分なＳＯ１８６１の進入を促進する十分なＥＧＦＲ受容体の欠如に起因して、セツキシマブ－ＳＯ１８６１＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、１．５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を決定した。ＳＫＢＲ３は、１．５ｐＭのＥＧＦ－ジアンチンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、効率的な細胞死滅を示した（ＳＫＢＲ３：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝８００ｎＭ；図２１Ａ；表Ａ６）。しかしながら、ＥＧＦ－ジアンチンがトラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせられたとき、低濃度のコンジュゲートされたＳＯ１８６１で既に強力な細胞死滅が誘導された（ＳＫＢＲ３：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＝２ｎＭ；図２１Ａ；表Ａ６）。これは、標的化コンジュゲートＳＯ１８６１が、非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と比較してエンドソーム脱出を誘導する際により効果的であることを示す。次に、ＥＧＦ－ジアンチンを、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅をＳＫＢＲ３に対して決定した。非標的化非コンジュゲートの１０ｎＭのＳＯ１８６１と組み合わせた高ＥＧＦ－ジアンチン濃度により効果的な細胞死滅は観察されなかった一方で（ＳＫＢＲ３（示される）及びＢＴ４７４（示されない）：［毒素］ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図２１Ｂ；図Ａ７）、低ＥＧＦ－ジアンチン濃度と組み合わせた９．４ｎＭのトラスツズマブ－ＳＯ１８６１で既に、効率的な細胞死滅を誘導した（ＳＫＢＲ３：［毒素］ＩＣ５０＝３ｐＭ（示される）；ＢＴ４７４：［毒素］ＩＣ５０＝１ｐＭ（示されない）；図２１Ｂ；表Ａ７）。同等の細胞死滅効率は、高濃度（１０７５ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１が低濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせられるときに達成される（図２１Ｂ；表Ａ７）。このことは、トラスツズマブにコンジュゲートされるとき、低い濃度のＳＯ１８６１が、相対的に低い濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせて高ＨＥＲ２発現細胞を効率的に死滅させることができることを示す。低濃度のＥＧＦ－ジアンチンと組み合わせた高濃度（１５００ｎＭ）の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１は、２－標的２－構成成分系において両方のコンジュゲートが異なる受容体を介して、ＨＥＲ２を介してＳＯ１８６１及びＥＧＦＲ受容体を介して毒素が送達されるので、受容体競合がＳＯ１８６１の細胞への進入に役割を果たさないため、同等の活性を有する。
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を、５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し（ＳＯ１８６１の濃度に対して計算される）、低ＨＥＲ２、低／高ＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞死滅を決定し、５ｐＭ セツキシマブ－サポリンが高濃度の非標的化非コンジュゲートＳＯ１８６１と組み合わせられたときに細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２２Ａ、２２Ｂ；表Ａ６）。５ｐＭ セツキシマブ－サポリンと増加した濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１の組み合わせは、両方の細胞株において高濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１でのみ細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；Ａ４３１：［ＳＯ１８６１］ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図２２Ａ、２２Ｂ；表Ａ６）。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内ＳＯ１８６１濃度が、エンドソームタンパク質毒素脱出及び毒素媒介性の細胞死滅を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。次に、セツキシマブ－サポリンを、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１の固定された濃度に対して滴定し、ＪＩＭＴ－１及びＡ４３１に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。細胞死滅は、１０ｎＭ トラスツズマブ－ＳＯ１８６１と組み合わせた高セツキシマブ－サポリン濃度のみで観察された（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＞９０ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＞２０ｐＭ；図２２Ｃ、２２Ｄ；表Ａ７）。低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた高濃度の非コンジュゲートＳＯ１８６１（１５００ｎＭ）は、効率的な細胞死滅を示す（ＪＩＭＴ－１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０２ｐＭ；Ａ４３１：［毒素］ＩＣ５０＝０．０３ｐＭ；図２２Ｃ、２２Ｄ；表Ａ５）。このことは、低ＨＥＲ２、低／高ＥＧＦＲ発現を有する細胞が、細胞内の毒素の効率的な細胞質内送達を確実にする十分なＳＯ１８６１の進入を促進する十分なＨＥＲ２受容体の欠如に起因して、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。Ａ４３１細胞における非常に高いＥＧＦＲ発現でさえ、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１を介するＳＯ１８６１の取り込みを促進するであろうＨＥＲ２受容体の欠如に起因してＳＯ１８６１の閾値に達しなかったため、セツキシマブ－サポリンによる効率的な細胞死滅をもたらさなかった。
実施例１０．
２標的２構成成分系は、非常に低い標的発現細胞の細胞死滅をもたらす。Ａ４３１細胞において、Ｔ－ＤＭ１は、ナノモル濃度で細胞を死滅させる一方で、標的化２構成成分系は、ピコモル濃度で細胞を効率的に死滅させることができる（毒素濃度における約７０００倍の低下）（図２３）。
実施例１１．作用機序
エンドソーム酸性化が妨げられるとき、標的化２構成成分系は、ＳＰＴ００１（植物由来のサポニン、ＳＯ１８６１）が低いエンドソームｐＨでわずかに活性であるという事実に起因して、活性ではない。
実施例１２
エンドソーム酸性化阻害剤は、標的化２構成成分系活性を妨げ、エンドソームの酸性化が妨げられるときにＳＯ１８６１機能が低減されることを示している。
実施例１３
図２４Ａ～Ｅは、トラスツズマブ（図２４Ａ）、セツキシマブ（図２４Ｂ）又はＴ－ＤＭ１（図２４Ｃ）、遊離毒素サポリン（図２４Ｄ）及びジアンチン（図２４Ｄ）、非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｄ）、及び遊離サポニンＳＯ１８６１と合わせられた非細胞結合ＩｇＧにカップリングされたサポリン（図２４Ｅ）が、指定の細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ａ４３１、ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ａ２０５８、ＢＴ－４７４と接触されるときの相対的な細胞生存率を示す。
トラスツズマブ及びセツキシマブは、細胞株の大部分に暴露されるとき細胞生存率に影響を及ぼさないか又はほとんど影響を及ぼさず、トラスツズマブが相対的に高い用量でＳＫ－ＢＲ－３細胞に暴露されるときに細胞生存率に多少の影響を及ぼし、及びセツキシマブが相対的に高い用量でＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に暴露されるときに細胞生存率に多少の影響を及ぼす。
ＴＤＭ－１、又はａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンは、ハーセプチン（化学名：トラスツズマブ）及びタキサン化学療法で以前に治療されたＨＥＲ２陽性転移性乳癌；残存病変がハーセプチン及びタキサン化学療法によるネオアジュバント（手術前）治療後に見出された場合、手術後の初期ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するためにアメリカ食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された標的化療法である。ＴＤＭ－１は、ハーセプチン及び化学療法薬エムタンシンの組み合わせである。図２４Ｃは、ＴＤＭ－１が、治療される全ての細胞株に関して細胞生存率の低下をもたらすことを示す。
試験された細胞株上の細胞表面分子のいずれかに対して親和性を有しない対照ＩｇＧにカップリングされた遊離毒素サポリン及びジアンチン及び毒素サポリンは、最大１００００ｐＭの試験された広範な濃度の毒素にわたって細胞生存率に対して影響を及ぼさないか又はほとんど影響を及ぼさない。
毒素サポリンが非細胞結合ＩｇＧにカップリングされるとき、コンジュゲートを遊離サポニンＳＯ１８６１と合わせることによって、相対的な細胞生存率のＩｇＧ－サポリン用量依存的な低下をもたらす（図２４Ｅ）。
Figure 2023532003000011
Figure 2023532003000012
Figure 2023532003000013
実施例１４－生存及び腫瘍退縮におけるＡＤＣ結果と組み合わせた本発明のコンジュゲートによる哺乳動物担腫瘍動物の治療
雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに、ヒトＡ４３１腫瘍細胞の懸濁液を皮下注射した。マウスの皮下で、ヒト表皮癌が、異種移植動物腫瘍モデルにおいて発症した。腫瘍細胞の注射後、異種移植腫瘍を、およそ１７０～１８０ｍｍ３のサイズまで発達させた。Ａ４３１腫瘍細胞は、以下の特徴を有する：高ＥＧＦＲ発現体、中ＣＤ７１発現体、低ＨＥＲ２発現体。
表８Ａにおいて、対照マウス及び担腫瘍マウスの治療の結果が示される。担腫瘍マウスを、異種移植腫瘍上の細胞表面受容体であるヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、ヒトＥＧＦＲ、又はヒトＣＤ７１のいずれかに向けられる指定の抗体で治療した。セツキシマブは、サポニンＳＯ１８６１と共有結合的にコンジュゲートされた。ＳＯ１８６１はまず、リンカーＥＭＣＨ（Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド）とともに提供され、ＥＭＣＨは、スルフヒドリル（抗体の還元されたシステイン）をカルボニル（アルデヒド又はケトン；ここでは、サポニンのＣ－２３位でのアルデヒドのカルボニル）に共有結合的にコンジュゲートするためのマレイミド－及び－ヒドラジドクロスリンカーである。サポニン－ＥＭＣＨを、セツキシマブの還元されたシステインに共有結合的にカップリングして、ＥＭＣＨとシステイン側鎖の間で共有結合性のチオ－エーテル結合を形成した。ＡＤＣトラスツズマブ－サポリン（共有結合性コンジュゲート）及び抗ＣＤ７１ ｍＡｂ（ＯＫＴ－９、ＩｇＧ）－サポリン（共有結合性コンジュゲート）を、マウスにおいてＡＤＣによる治療の開始後の時間で腫瘍体積として測定されるそれらの腫瘍攻撃の有効性に関して試験した。ＡＤＣの用量は、腫瘍モデルにおいて最適以下であった。すなわち、前の実験から、ＡＤＣの最適以下の用量では、腫瘍退縮又は腫瘍増殖の停止が観察可能ではないことが確立された。
Figure 2023532003000014
これらの結果は、ＡＤＣ単独での担癌マウスの治療が考慮されるときに効果的ではない（腫瘍増殖、マウスの死亡が予防されない（安楽死））用量のＡＤＣと、サポニン、すなわち、ＳＯ１８６１に共有結合された腫瘍細胞特異的受容体標的化抗体からなる本発明のコンジュゲート（単独で投与されるときに有効ではない（腫瘍増殖、マウスの死亡が予防されない（安楽死））用量で癌に罹患しているマウスに投与される共有結合性コンジュゲート）との組み合わせ療法が、治療される動物の腫瘍の退縮及び生存の延長（実験の期間を超える）として表される効率的及び効果的な治療レジメンを提供することを実証している。したがって、単独で投与されるときに抗腫瘍活性を有しない本発明の共有結合されたサポニンを含むコンジュゲートと合わされたＡＤＣの最適以下の用量は、癌患者に関する効果的な治療選択肢を提供し、相対的に低い用量のＡＤＣが効果的である。ＡＤＣのより低い用量は、有害事象のリスクが少ないか、又は副作用が全くないという見込みを有する。加えて、ＡＤＣの有効性が考慮されるときのサポニンを有するコンジュゲートの刺激効果は、腫瘍患者治療が考慮されるときに有効性を欠くことが以前に証明されたＡＤＣが、ＡＤＣ有効性が本明細書の例で実証されるとおりの組み合わせ療法の設定において改善されるため、再認識され及び価値が高まる可能性があることを示している。ヒト臨床現場において以前に調査されたが、いくつかのＡＤＣに関してさらなる臨床的検討から撤退された当技術分野で知られるＡＤＣに対する参照がなされる。特に、観察される有効性がないこと及び／又は許容されない有害事象の発生に起因して臨床開発が終わったＡＤＣは、試験されたセツキシマブ－サポニンなどの共有結合されたサポニンを含むコンジュゲートと組み合わせられるときに癌患者に関して新たな価値を得る可能性があるＡＤＣである。
実施例１５－エンドソーム／リソソーム脱出強化活性を有するＱＳ－２１を含むキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）のサポニン混合物
スキームＱは、一連のＱＳ－２１サポニンの共通の分子構造を示す（部分的にＣｏｎｒａｄｏ Ｐｅｄｅｂｏｓ，Ｌａｅｒｃｉｏ Ｐｏｌ－Ｆａｃｈｉｎ，Ｒａｍｏｎ Ｐｏｎｓ，Ｃｉｌａｉｎｅ Ｖ．Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ｈｕｇｏ Ｖｅｒｌｉ，Ａｔｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｍｉｃｅｌｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＱＳ－２１ Ｓａｐｏｎｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１９，３７４４－３７６０を参考にした；４種の異性体、示されるグリカンの各々がＲ基として結合され得る）。キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）から得られる水溶性サポニンの混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｓ４５２１；Ｒｏｔｈ、物品番号６８５７；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、製品「Ｑｕｉｌ－Ａ」）は、混合物中に存在する少なくとも１つの個々のサポニン、例えば、ＱＳ－２１のエンドソーム／リソソーム脱出強化特性に基づくか、又はＱＳ－２１及びＱＳ－７などの混合物によって含まれるサポニンの２つ以上の組み合わせに基づく本発明のエンドソーム／リソソーム脱出強化コンジュゲート、組成物及び組み合わせにおいて適用され得る。
本発明者らは、２．５マイクログラム／ｍｌ用量でのキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンの混合物が、細胞系バイオアッセイにおいて哺乳動物腫瘍細胞で試験されるとおり、ジアンチンのエンドソーム脱出を強化することができたことを実証した。細胞に暴露されるエフェクター分子は、リガンドＥＧＦに共有結合的にカップリングされたジアンチン：ＥＧＦ－ジアンチンであった。試験された細胞は、遊離サポニンに関しては腫瘍細胞株ＨｅＬａであり、セツキシマブに共有結合的にカップリングされるときにサポニンを試験することに関してはＡ４３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＣａＳｋｉ及びＡ２０５８であった。
Figure 2023532003000015
実施例１６
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、図１Ａ、Ｅに示されるとおり、ｍＡｂ１－タンパク質毒素及びｍＡｂ１－ＳＯ１８６１の組み合わせ治療である。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、両方ともにＤＡＲ４で、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してコンジュゲートし、ＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴを、リジン残基を介してセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートして、２つのコンジュゲートの生成をもたらす：セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内投与、（ｉ．ｐ．））及びセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の組み合わせは、ＥＧＦＲ腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシング活性に関してＡ４３１異種移植マウス腫瘍モデルにおいて試験された。投与は、腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３のサイズに達したときに１２日目に開始され、腫瘍試料は、最初の投与の７２時間後に回収され、対照遺伝子ｍＲＮＡ発現レベル（参照遺伝子）と比較してＨＳＰ２７遺伝子発現について分析された。これは、５０ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４の１回の投与が、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はセツキシマブ－（Ｌｙｓ－Ｌ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ）４単剤療法の単回投与と比較してＡ４３１腫瘍においてＨＳＰ２７遺伝子発現の５０％の低下をもたらしたことを明らかにした（図２５）。溶媒対照腫瘍と比較して、４０％のＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングの低下が観察された。これは、１Ｔ２Ｃの本発明によるセツキシマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１＋セツキシマブにコンジュゲートされたＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴの組み合わせが、固形腫瘍細胞の細胞質において治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な標的化送達を誘導することによって、インビボでの腫瘍に標的化された遺伝子サイレンシングを誘導することを示し、可能にする。
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介して、ＤＡＲ ４でトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートして、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の生成をもたらした。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びトラスツズマブ－サポリン（トラスツズマブタンパク質毒素コンジュゲート）の組み合わせを、高ＨＥＲ２発現レベル及びトラスツズマブ単剤療法に対する抵抗性を有するマウス腫瘍モデル（患者由来の異種移植腫瘍モデル、ＰＤＸ）において試験した。４０ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内投与、（ｉ．ｐ．））＋０．０３（１、８日目）／０．０２（１５、２２、３０、３６、４３日目）ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の１Ｔ２Ｃの本発明による組み合わせは、溶媒対照及び４０ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又は０．０３／０．０２ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン単剤療法と比較して強力な腫瘍増殖阻害を明らかにした（図２６）。加えて、より低い用量の組み合わせ（４０ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋０．０１ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン）で治療された担腫瘍マウスにおいて、腫瘍増殖阻害活性は観察されなかった（図２６）。これは、トラスツズマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１＋トラスツズマブにコンジュゲートされたタンパク質毒素の１Ｔ２Ｃの組み合わせが、固形腫瘍細胞の細胞質において治療用タンパク質毒素の効率的な標的化送達を誘導することによって、インビボでの腫瘍細胞死及び腫瘍増殖阻害を誘導することを示し、可能にする。
実施例１７．２標的２－構成成分系（インビボ）
２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２－タンパク質毒素の組み合わせ治療である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してＤＡＲ４でセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートして、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の生成をもたらした。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びトラスツズマブ－サポリン又はＣＤ７１ｍａｂ－サポリンの組み合わせを、図１Ｂ～Ｄに示されるとおりＥＧＦＲ腫瘍標的化細胞死滅に関してＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）異種移植「ヌード」マウス腫瘍モデルにおいて試験した。用量漸増を実施して、治療有効性を決定した（９日目：０．３ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．１ｍｇ／ｋｇ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４；１４、１８日目：０．１ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４；２１日目：０．０５ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．０５ｍｇ／ｋｇ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４；２８日目：０．０２ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．０２ｍｇ／ｋｇ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン＋１５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４ トラスツズマブ－サポリン／セツキシマブ－ＳＯ１８６１。対照は、それぞれ同じ投与スキームで行われ、セツキシマブのみ（ｉ．ｖ．）、治療日毎に２５ｍｇ／ｋｇで与えられた）。３２日目（破線の鉛直線）、３５日目及び３９日目に、本発明者らは、２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．）＋０．０２ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．０２ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））の２Ｔ２Ｃの本発明による組み合わせを開始し、これは、溶媒対照、２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又は０．０２ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン／ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン単剤療法と比較して両方の２Ｔ２Ｃ組み合わせ群に関して強力な腫瘍退縮を明らかにした（図２７）。２Ｔ２Ｃ系は、臨床的に使用されるＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体であるセツキシマブをも凌駕している。次に、本発明者らは同じ実験を実施したが、続いて、９及び１４日目の投与、その後の週１回の投与による２５ｍｇ／ｋｇ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４（腹腔内注射（ｉ．ｐ．）＋０．０３ｍｇ／ｋｇ トラスツズマブ－サポリン又は０．０３ ＣＤ７１ｍａｂ－サポリン（静脈内投与、（ｉ．ｖ．））治療で試験を開始した。本発明による２Ｔ２Ｃ系は、全てのマウスにおいて腫瘍退縮を示し、さらに両方の２Ｔ２Ｃ群の１頭のマウスは、完全な腫瘍根絶（腫瘍体積＝０ｍｍ３）を示した（図２８）。またここで、対照は、腫瘍体積の著しい増大を示した一方で、このＡ４３１マウスモデルに関する陽性対照であるセツキシマブは、腫瘍増殖阻害のみを示し、退縮を示さなかった（図２８）。これは、セツキシマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１＋トラスツズマブにコンジュゲートされたタンパク質毒素又はＣＤ７１ｍａｂにコンジュゲートされたタンパク質毒素の２Ｔ２Ｃ系のアプローチが、インビボで担腫瘍マウスの固形腫瘍の細胞質内への治療用タンパク質毒素の非常に効率的な標的化送達を誘導することによって、サイズが大きい腫瘍（２０００ｍｍ３）においても一部のマウスでさらに完全な腫瘍根絶及び他のマウスでは強力な腫瘍退縮を誘導することを示し、可能にする。
実施例１８．２標的２－構成成分系（インビトロ）
結果
２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ１－ＳＯ１８６１及びｍＡｂ２－タンパク質毒素の組み合わせ治療である（図１Ｂ～Ｄ）。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介してＤＡＲ ３．７でセツキシマブ（ヒトＥＧＦＲを認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートした（セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７）。セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７を、５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリン（タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたトラスツズマブ）の固定された濃度に対して滴定し、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１、ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－；ＣａＳＫｉ、ＥＧＦＲ＋／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示されるとおりに決定した。これは、低濃度のセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７（Ａ４３１：ＩＣ５０＝３ｎＭ及びＣａＳＫｉ ＩＣ５０＝１０ｎＭ；図２９Ａ、２９Ｂ）で強力な細胞死滅を明らかにした一方で、同濃度のセツキシマブ、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７又はセツキシマブ＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞においていずれの細胞死滅活性も誘導できなかった。これは、相対的に低い濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１コンジュゲートが、トラスツズマブにコンジュゲートされたタンパク質毒素のエンドソーム脱出を効率的に強化することによって（非有効濃度で）、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞の効率的な細胞死滅を誘導することを示す。
次に、トラスツズマブ－サポリンを、７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７の固定された濃度に対して滴定し、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のトラスツズマブ－サポリンと組み合わせた７５ｎＭ セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７で既に、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞における効率的な細胞死滅を誘導したことを明らかにした一方で（Ａ４３１：ＩＣ５０＝５ｐＭ；及びＣａＳＫｉ：ＩＣ５０＝１ｐＭ；図２９Ｃ及び２９Ｄ）、トラスツズマブ－サポリン単独又はトラスツズマブ－サポリン＋７５ｎＭ セツキシマブは、両方の細胞株において著しい細胞死滅活性（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）を示さなかった（図２９Ｃ、２９Ｄ）。このことは、相対的に低い濃度のトラスツズマブ－サポリンが、高ＥＧＦＲ／低ＨＥＲ２発現細胞において低セツキシマブ－ＳＯ１８６１コンジュゲート濃度と組み合わせて効果的であり及び細胞死滅を誘導できることを示す。
次に、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７を、５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）又はＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示されるとおりに決定した。ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）細胞の両方ともに、低濃度のセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７＋５０ｐＭ トラスツズマブ－サポリンで細胞死滅を示さない（ＨｅＬａ：ＩＣ５０＝４００ｎＭ；Ａ２０５８：ＩＣ５０＞４００ｎＭ；図３０Ａ、３０Ｂ）。これは、十分な受容体発現がない場合、有効な細胞内送達ＳＯ１８６１濃度が、タンパク質毒素のエンドソーム脱出及び細胞質内送達を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。次に、トラスツズマブ－サポリンを、７５ｎＭのセツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７の固定された濃度に対して滴定し、ＨｅＬａ（ＨＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）又はＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋／－／ＨＥＲ２＋／－）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）は両方ともに、細胞死滅活性を示さなかった（ＨｅＬａ：ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；Ａ２０５８：ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ；図３０Ｃ、３０Ｄ）。このことは、低又は無ＥＧＦＲ受容体発現を有する細胞が、細胞の細胞質内の毒素のエンドソーム脱出を確実にする十分なＳＯ１８６１（閾値）の抗体媒介性送達を促進する十分なＥＧＦＲ受容体の欠如に起因して、セツキシマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７＋トラスツズマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介して、ＤＡＲ ４でトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートした（トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン（ＥＧＦＲ標的化リガンド毒素融合タンパク質）の固定された濃度に対して滴定し、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンで強力な細胞死滅を明らかにした一方で（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｎＭ；図３１Ａ）、同濃度のトラスツズマブ、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はトラスツズマブ＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンは、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞においていずれの細胞死滅活性も誘導できなかった。これは、トラスツズマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１が、ＥＧＦ融合タンパク質毒素のエンドソーム脱出を効率的に強化することによって（非有効濃度で）、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞の細胞死滅を誘導することを示す。
次に、ＥＧＦジアンチンを、２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の固定された濃度に対して滴定し、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）発現細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のＥＧＦジアンチンと組み合わせた２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４で既に、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞において効率的な細胞死滅を誘導したことを明らかにした一方で（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｐＭ）（図３１Ｂ）、ＥＧＦジアンチン単独又はＥＧＦジアンチン＋２．５ｎＭ トラスツズマブは、細胞死滅活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）（図３１Ｂ）。このことは、相対的に低い濃度のＥＧＦジアンチンが、高ＨＥＲ２／低ＥＧＦＲ発現細胞において低トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４濃度との組み合わせにおいてのみ効果的であり及び細胞死滅を誘導できることを示す。
次に、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの固定された濃度に対して滴定し、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。両方の細胞株は、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンのいずれかの組み合わせに対して感受性ではなかった（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図３２Ａ、３２Ｂ）。これは、十分なＨＥＲ２受容体発現がない場合、有効な細胞内送達ＳＯ１８６１濃度が、タンパク質毒素のエンドソーム脱出及び細胞質内送達を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。
次に、ＥＧＦジアンチンを、２．５ｎＭのトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の固定された濃度に対して滴定し、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。両方の細胞株が、２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を伴うか又は伴わずに高ＥＧＦジアンチン濃度で細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＝１０．０００ｐＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＝２００ｐＭ 図３２Ｃ、３２Ｄ）。
このことは、低又は無ＨＥＲ２受容体発現を有する細胞が、細胞の細胞質内の毒素のエンドソーム脱出を確実にする十分なＳＯ１８６１（閾値）の抗体媒介性送達を促進する十分なＨＥＲ２受容体の欠如に起因して、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）３，７＋１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
次に、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨを、システイン残基（Ｃｙｓ）を介して、ＤＡＲ ４でトラスツズマブ（ヒトＨＥＲ２を認識し、結合するモノクローナル抗体）にコンジュゲートした（トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）。トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、５ｐＭ セツキシマブ－サポリン（ＥＧＦＲ標的化抗体－タンパク質毒素コンジュゲート）の固定された濃度に対して滴定し、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を、図１Ｂ～Ｄに示されるとおりに決定した。これは、低濃度のトラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリン（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｎＭ；図３３Ａ）で強力な細胞死滅を明らかにした一方で、同濃度のトラスツズマブ、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４又はトラスツズマブ＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンは、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞においていずれの細胞死滅活性も誘導できなかった。これは、トラスツズマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１が、セツキシマブにコンジュゲートされたタンパク質毒素のエンドソーム脱出を効率的に強化することによって（非有効濃度で）、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞の細胞死滅を誘導することを示す。
次に、セツキシマブ－サポリンを、２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及び７５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の固定された濃度に対して滴定し、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３：ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、低濃度のセツキシマブ－サポリンと組み合わせた２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４で既に、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において効率的な細胞死滅を誘導したことを明らかにした一方で（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＝１ｐＭ；図３３Ｂ）、セツキシマブ－サポリン単独又はセツキシマブ－サポリン＋２．５ｎＭ トラスツズマブは、高濃度のトラスツズマブ－サポリンでのみ細胞死滅活性を示した（ＳＫ－ＢＲ－３：ＩＣ５０＞４０００ｐＭ；図３３Ｂ）。このことは、相対的に低い濃度のセツキシマブ－サポリンが、ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／－発現細胞において低トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４濃度との組み合わせにおいてのみ効果的であり及び細胞死滅を誘導できることを示す。
次に、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を、５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの固定された濃度に対して滴定し、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。両方の細胞株は、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンの組み合わせに対して感受性ではなかった（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＞１０００ｎＭ；図３４Ａ、３４Ｂ）。これは、十分なＨＥＲ２受容体発現がない場合、有効な細胞内送達ＳＯ１８６１濃度が、タンパク質毒素のエンドソーム脱出及び細胞質内送達を誘導するための（閾値）に達しないことを示す。
次に、セツキシマブ－サポリンを、２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４の固定された濃度に対して滴定し、ＪＩＭＴ－１（ＨＥＲ２＋／－／ＥＧＦＲ＋／－）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）細胞に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。両方の細胞株が、２．５ｎＭ トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４を伴うか又は伴わずに同様のセツキシマブ－サポリン濃度で細胞死滅を示した（ＪＩＭＴ－１：ＩＣ５０＝８０ｐＭ；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＩＣ５０＝１００ｐＭ；図３４Ｃ、３４Ｄ）。
このことは、低又は無ＨＥＲ２受容体発現を有する細胞が、細胞の細胞質内の毒素のエンドソーム脱出を確実にする十分なＳＯ１８６１（閾値）の抗体媒介性送達を促進する十分なＨＥＲ２受容体の欠如に起因して、トラスツズマブ－（Ｃｙｓ－Ｌ－ＳＯ１８６１）４＋セツキシマブ－サポリンの組み合わせに影響を受けないことを示す。
実施例１９．ＳＯ１８６１＋ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＣＤ７１標的化ＶＨＨ－タンパク質毒素
ＳＯ１８６１を、５０ｐＭ ＶＨＨ－ＣＤ７１－ジアンチン、５０ｐＭ ＶＨＨ－ＨＥＲ２－ジアンチン又は５０ｐＭ ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンの固定された濃度に対して滴定した。Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）、Ａ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－／ＣＤ７１＋）、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋／ＣＤ７１＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋／ＣＤ７１＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨＣＤ７１－ジアンチンが、Ａ４３１（ＣＤ７１＋）及びＡ２０５８（ＣＤ７１＋）細胞においてＩＣ５０＝２００ｎＭで活性を示した一方で、ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチンは、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）においてＩＣ５０＝４００ｎＭで活性を示したが、Ａ２０５８（ＥＧＦＲ－）において活性を示さなかった（図３５）。ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＨＥＲ２－ジアンチンは、Ａ４３１（ＨＥＲ２＋／－）において許容的なＳＯ１８６１濃度（ＳＯ１８６１の許容的な濃度ＩＣ５０＝１０００ｎＭ）のいずれかで活性を示さなかった一方で、Ａ２０５８（ＨＥＲ２＋／－）において、ほんのわずかな活性を、ＩＣ５０＝７００ｎＭ ＳＯ１８６１で検出することができた（図３５）。さらに、ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＣＤ７１－ジアンチン又はＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＨＥＲ２－ジアンチンは、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＣＤ７１＋）においてＩＣ５０＝２００ｎＭで活性を示した一方で、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－／ＣＤ７１＋）細胞において、ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＣＤ７１－ジアンチンは、ＩＣ５０＝２００ｎＭで活性を示し、ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＨＥＲ２－ジアンチンは、ＳＯ１８６１単独と比較して活性の強化を示さなかった（図３６）。ＳＯ１８６１＋５０ｐＭ ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンは、ＳＫ－ＢＲ－３（ＥＧＦＲ＋）においてＩＣ５０＝７００ｎＭで活性を示し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ＋＋）において強力な活性（ＳＯ１８６１ ＩＣ５０＝３００ｎＭ）を示した（図３６）。
実施例２０ ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はｍＡｂ－ＳＯ１８６１
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、同じ細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ｅ）。
ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン（コンジュゲート）を、単独又は４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ若しくは７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定し、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）に対して標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）、ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み合わせは、ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン単独と比較してＩＣ５０＝４ｐＭを明らかにした一方で（ＩＣ５０＞１０，０００ｐＭ）、ｔＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、ＩＣ５０＝４００ｐＭを明らかにした（図４５Ａ）。Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）において、ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み合わせのみが、高濃度で活性を示した一方で（ＩＣ５０＝１０００ｐＭ）、ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン単独又はＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、１０，０００ｐＭまで活性を示さなかった（図４５Ｂ）。
実施例２１．二価－ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン又はｍＡｂ－毒素＋ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はｍＡｂ－ＳＯ１８６１
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、同じ細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ｅ）。
セツキシマブ－サポリン（コンジュゲート）又は二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン（組換え融合タンパク質）を、単独又は４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ若しくは７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の固定された濃度に対して滴定し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ＋＋）、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）に対して標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）において、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、セツキシマブ－サポリン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はセツキシマブ－サポリン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）の組み合わせは、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン又はセツキシマブ－サポリン単独（それぞれＩＣ５０＝４０００ｐＭ又はＩＣ５０＝３００ｐＭ）と比較してＥＧＦＲに標的化される毒素媒介性の細胞死滅活性（ＩＣ５０＝０．５ｐＭ）の強力な増大を明らかにした（図３７Ａ）。Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋＋）において、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み合わせは、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン単独（ＩＣ５０＝３００ｐＭ）と比較してＩＣ５０＝０．０５ｐＭを明らかにし、セツキシマブ－サポリン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨは、セツキシマブ－サポリン単独（ＩＣ５０＝４０００ｐＭ）と比較してＩＣ５０＝３ｐＭを明らかにし、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はセツキシマブ－サポリン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は両方ともにＩＣ５０＝１０ｐＭを明らかにした（図３７Ｂ）。
Ａ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）において、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ又はセツキシマブ－サポリン＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み合わせのみが、高濃度で活性を示した一方で（それぞれＩＣ５０＝５０ｐＭ及びＩＣ５０＞１００ｐＭ）、二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン、セツキシマブ－サポリン単独又は二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）又はセツキシマブ－サポリン＋７６．９ｎＭ セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、１０，０００ｐＭまで活性を示さなかった（図３７Ｃ）。
実施例２２．ＳＯ１８６１＋二価－ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン
ＳＯ１８６１又はセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）を、１ｐＭ又は５ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンの固定された濃度に対して滴定し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）及びＡ２０５８細胞（ＥＧＦＲ－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＥＧＦＲ＋＋）において、これは、１ｐＭ又は５ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンと組み合わせた非常に低濃度のセツキシマブにコンジュゲートされたＳＯ１８６１が、効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝２０ｎＭ）、非コンジュゲートＳＯ１８６１＋１ｐＭ又は５ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンは、ＩＣ５０＝１０００ｎＭで活性を示した（図３８Ａ）。Ａ２０５８（ＥＧＦＲ－）において、活性は、ＩＣ５０＞１０００ｎＭでわずかに観察された（図３８Ｂ）。
実施例２３．ｍＡｂ－ＳＯ１８６１＋二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン（１Ｔ２Ｃ及び２Ｔ２Ｃ）
１標的２－構成成分系（１Ｔ２Ｃ）は、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、同じ細胞表面受容体を認識し、それに結合する（図１Ｅ）。２標的２－構成成分系（２Ｔ２Ｃ）はまた、ｍＡｂ－ＳＯ１８６１及びＶＨＨ－タンパク質毒素の組み合わせ治療であり、ｍＡｂ及びＶＨＨは、別の細胞表面受容体を認識する（図１Ｄ）。
二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン（配列番号７３の配列として示されるアミノ酸配列を有する）を、組換え融合タンパク質として生成した。セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）を、５０ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンの固定された（非有効）濃度に対して滴定し、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋）及びＡ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、５０ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンと組み合わせた非常に低濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ＋＋）細胞（ＩＣ５０＝０．５ｎＭ）及びＡ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）細胞（ＩＣ５０＝４ｎＭ）の効率的な細胞死滅を誘導した一方で、ＳＫ－ＢＲ－３（ＥＧＦＲ＋）又はＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞に対して、活性は、非常に高濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１でのみ検出された（それぞれＩＣ５０＝２００ｎＭ及びＩＣ５０＝４００ｎＭ）（図３９）。
これは、低濃度のセツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、高ＥＧＦＲ発現細胞においてのみ二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンのエンドソーム脱出を効率的に誘導することによって、細胞死滅の亢進を誘導することができることを示す。
次に、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）を、５０ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンの固定された（非有効）濃度に対して滴定し、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋／ＨＥＲ２＋／－）、Ａ２０５８（ＥＧＦＲ－／ＨＥＲ２＋／－）、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋／ＥＧＦＲ＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ＨＥＲ２－／ＥＧＦＲ＋＋）に対する標的化されたタンパク質毒素に媒介される細胞死滅を決定した。これは、５０ｐＭ 二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンと組み合わせた非常に低濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の効率的な細胞死滅を誘導した一方で（ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）、組み合わせは、Ａ４３１（ＨＥＲ２＋／－）、Ａ２０５８（ＨＥＲ２＋／－）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）細胞における細胞死滅活性を非常に高濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１でのみ示した（ＩＣ５０＝４００ｎＭ）（図３９）。これは、低濃度のトラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）が、高ＨＥＲ２発現細胞においてのみ二価ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチンのエンドソーム脱出を効率的に誘導することによって、細胞死滅の亢進を誘導することができることを示す。
材料及び方法
材料
ＳＯ１８６１は、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）から得られる生の植物抽出物からＡｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨによって単離され、精製された。トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）は、薬局（Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）から購入された。二価－ＶＨＨ－ＥＧＦＲ－ジアンチン融合（配列番号７３）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での標準的な手順に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質として生成した。一価ＶＨＨは、ＱＶＱ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ＶＨＨ－ＨＥＲ２：クローン名：Ｑ１７ｃ；ＶＨＨ－ＣＤ７１：クローン名：Ｑ５２ｃ ＶＨＨ－ＥＧＦＲ：クローン名：Ｑ８６ｃ）から購入された。セツキシマブ－サポリンが製造され、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。ジアンチン－ｃｙｓが製造され、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅから購入された。
トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（２ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ ビス－トリスタンパク質ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｓｈａｒｐ事前染色済みタンパク質標準液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）タンパク質染色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ Ｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９９．６％、ＶＷＲ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス．ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－ヒスチジン（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、無水Ｄ－（＋）－トレハロース（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウリン酸塩（ＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、グアニジン塩酸塩（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ－Ｎａ２、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、滅菌フィルター０．２μｍ及び０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ビバスピンＴ４及びＴ１５濃縮機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、テトラ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－システイン（９８．５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌａｂ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｅｒｃｋ）から新鮮に得た脱イオン水（ＤＩ）、ニッケル－ニトリロ三酢酸アガロース（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース、Ｐｒｏｔｉｎｏ）、グリシン（９９．５％、ＶＷＲ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（エルマン試薬、ＤＴＮＢ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）炭酸水素ナトリウム（９９．７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸ナトリウム（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５レジンを有するＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、０．５、２、５、及び１０ｍＬにおけるＺｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ビバスピン遠心フィルターＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔ４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ、及びＴ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｂｉｏｓｅｐ ｓ３０００ ａＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｖｉｖａｃｅｌｌ限外濾過ユニット１０及び３０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）。
方法
ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ合成
ＳＯ１８６１（１２１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）及びＥＭＣＨ．ＴＦＡ（１１０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に、メタノール（過乾燥、３．００ｍＬ）及びＴＦＡ（０．０２０ｍＬ、０．２６０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。１．５時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（１２０ｍｇ、９０％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０６９［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：１．０８４
細胞生存率アッセイ
処理の後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、細胞生存率を、製造業者の指示書（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ一溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実施されるＭＴＳ－アッセイによって決定した。簡潔には、ＭＴＳ溶液を、１０％ ＦＢＳで補充されたフェノールレッド（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を伴わないＤＭＥＭ中で２０倍希釈した。細胞を、２００μＬ／ＰＢＳウェルで１回洗浄した後、１００μＬの希釈されたＭＴＳ溶液をウェル毎に加えた。プレートを、３７℃でおよそ２０～３０分間インキュベートした。その後、４９２ｎｍでのＯＤを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で測定した。定量化のために、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、全ての他のウェルから減算した後、処理／未処理細胞の細胞生存率のパーセンテージを、処理されたウェルのバックグラウンド補正シグナルを未処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルで割ることによって計算した（ｘ１００）。
ＦＡＣＳ分析
細胞を、１０ｃｍのディッシュ中において５００，０００ｃ／プレートで、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）が補充されたＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中に播種し、９０％の培養密度に達するまで４８時間インキュベートした（５％ ＣＯ２、３７℃）。次に、細胞をトリプシン処理して（ＴｒｙｐｌＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、単一細胞にした。０．７５ｘ１０６個の細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、遠心分離した（１，４００ｒｐｍ、３分）。細胞ペレットを浸したまま上清を捨てた。ペレットを、ボルテックス振盪機上でファルコンチューブを緩やかにタッピングすることにより解離させ、細胞を４ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）で洗浄した。洗浄の後、細胞を、３ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）中で再懸濁させ、３つの丸底ＦＡＣＳチューブ（１ｍＬ／チューブ）に等しく分割した。細胞を再度遠心分離し、２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）又は１９５μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）中の５μＬの抗体を含有する２００μＬ 抗体溶液中で再懸濁させた。ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（＃３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＥＧＦＲ受容体を染色した。ＰＥ抗－ヒトＨＥＲ２ ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４０（ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ－２）（＃３２４４０８ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＨＥＲ２受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をそれに見合うアイソタイプ対照として使用した。ＰＥ抗ヒトＣＤ７１（＃３３４１０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ７１受容体を染色し、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００２１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をそれに見合うアイソタイプ対照として使用した。試料を、チューブローラーミキサー上において４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋遊離、２％ ＦＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ ＰＦＡ溶液を使用して室温で２０分間固定した。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために２５０～３５０μＬの冷ＰＢＳ中で再懸濁した。試料をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。細胞株毎のＦＡＣＳデータは、表Ａ２にある。
ＶＨＨ－ジアンチンのコンジュゲーションのための手順
ジアンチン－Ｃｙｓを、ビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたジアンチン－Ｃｙｓに、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたジアンチン－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。得られたジアンチン－ＳＨを、ＤＭＳＯ中で新たに調製されたＤＴＭＥ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ジアンチン－ＤＴＭＥを、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過による精製の後に得た。ジアンチン－ＤＴＭＥを、コンジュゲートされるまで２０℃で保管した。同時に、一定分量のＶＨＨを、ビバスピンＴ１５ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたＶＨＨに、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（１０．０ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ４ ５ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。一定分量の得られたＶＨＨ－ＳＨを、ジアンチン－ＤＴＭＥと反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。
抗体－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４
トラスツズマブ、セツキシマブは、後で「Ａｂ」と称される。Ａｂは、１、２、３、４、５、及び６のＤＡＲでマイケル型チオール－エンコンジュゲーション反応を介してサポニンＳＯ１８１６１－ＥＭＣＨにコンジュゲートされた。ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ分子は、その構造とそのマレイミド官能基の間に不安定な（Ｌ）ヒドラゾン結合を得て、サポニンとＡｂの間に不安定な結合を生成する。手順は、トラスツズマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）４に関して例示的に記載される（表Ａ３を参照のこと）。
セツキシマブ（４０ｍｇ、８．０ｍｌ）の溶液に、トリス濃縮物（１２７ｍｇ／ｍｌ、１．０５Ｍ）、トリス．ＨＣｌ濃縮物（６２３ｍｇ／ｍｌ、３．９５Ｍ）及びＥＤＴＡ－Ｎａ２濃縮物（９５ｍｇ／ｍｌ、０．２６Ｍ）の１０μｌ／ｍｌの各々を加えて、５０ｍＭ ＴＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７．５を得た。
４つの部分に分割されたセツキシマブ（それぞれ９．７３ｍｇ、４．８６４ｍｇ／ｍｌ、６５ｎｍｏｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（０．５～２．０ｍｇ／ｍｌ、１．１５～７．０２モル当量、７５～４５５ｎｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により２０℃で３００分間インキュベートした。インキュベーションの後（ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの添加の前）、約１ｍｇ（０．２１０ｍｌ）の一定分量のＡｂ－ＳＨを各混合物から除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。これらの一定分量は、ＵＶ－ｖｉｓ分析及びエルマンアッセイにより特徴付けられた（それぞれのチオール対Ａｂ比＝２．０、４．２、５．９及び６．８）。原体Ａｂ－ＳＨの各々に、一定分量の新たに調製されたＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、「チオール」当たり１．３モル当量、０．１５～０．６１μｍｏｌ、０．１６～０．６３ｍｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で１２０分間インキュベートした。各コンジュゲーション反応に加えて、２つの一定分量の脱塩されたＡｂ－ＳＨ（０．２５ｍｇ、１．６７ｎｍｏｌ）を、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてＮＥＭ（「チオール」当たり１．３モル当量、４．３～１７．４ｎｍｏｌ、２．２～８．７μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液）又はＴＢＳ ｐＨ７．５緩衝液（２．２～８．７μｌ）と２０℃で１２０分間反応させた。インキュベーションの後（ＮＥＭの添加の前）、０．２００ｍｌの一定分量のＡｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物を除去し、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製した。この一定分量を、ＵＶ－ｖｉｓにより特徴付けし、陽性対照及び陰性対照を並べてエルマンアッセイにより特徴付けして、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの組み込みを得た。原体Ａｂ－ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ混合物に、一定分量の新たに調製されたＮＥＭ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ、２．５～１０モル当量、０．１５～０．５８μｍｏｌ）を加え、混合物をＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａスピン脱塩カラムにより精製して、精製されたセツキシマブ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）コンジュゲートを得た（表Ａ４を参照のこと）。生成物を２．５ｍｇ／ｍｌに標準化し、０．２μｍに濾過した後、生物学的評価のために分注した。
材料及び方法
略語
ＡＥＭ Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩
ＡＭＰＤ ２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール
ＢＯＰ （ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＴＭＥ ジチオビスマレイミドエタン
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＥＤＣＩ．ＨＣｌ ３－（（エチルイミノ）メチレンアミノ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミニウムクロリド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＭＣＨ．ＴＦＡ Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩
ＨＡＴＵ１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート
ｍｉｎ 分
ＮＭＭ ４－メチルモルホリン
ｒ．ｔ． 保持時間
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＢＥＵ （トリス－ヒドロキシメチル）－アミノメタン）－ホウ酸－ＥＤＴＡ－尿素
ＴＣＥＰ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
Ｔｅｍｐ 温度
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
分析方法
ＬＣ－ＭＳ 方法１
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．ポンプ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを伴うＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ、ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０～３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に依存する質量範囲：
１５００～２４００又は２０００～３０００の範囲内のｎｅｇ又はｎｅｇ／ｐｏｓ；ＥＬＳＤ：気体圧力 ４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８、５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ 温度：６０℃、流速：０．６ｍＬ／分、ｌｉｎ．生成物の極性に依存する勾配：
Ａｔ０＝２％ Ａ、ｔ５．０分＝５０％ Ａ、ｔ６．０分＝９８％ Ａ
Ｂｔ０＝２％ Ａ、ｔ５．０分＝９８％ Ａ、ｔ６．０分＝９８％ Ａ
ポストタイム：１．０分、溶離液Ａ：アセトニトリル、溶離液Ｂ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
ＬＣ－ＭＳ 方法２
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．ポンプ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを伴うＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ、ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０～３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に依存する質量範囲：ｐｏｓ／ｎｅｇ １００～８００又はｎｅｇ ２０００～３０００；ＥＬＳＤ：気体圧力 ４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標） ＣＳＨ Ｃ１８、５０×２．１ｍｍ、２．５μｍ、温度：２５℃、流速：０．５ｍＬ／分、勾配：ｔ０分＝５％ Ａ、ｔ２．０分＝９８％ Ａ、ｔ２．７分＝９８％ Ａ、ポストタイム：０．３分、溶離液Ａ：アセトニトリル、溶離液Ｂ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
ＬＣ－ＭＳ 方法３
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．ポンプ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを伴うＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ、ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０～３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に依存する質量範囲 ｐｏｓ／ｎｅｇ １０５～８００、５００～１２００又は１５００～２５００；ＥＬＳＤ：気体圧力 ４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標） ＣＳＨ Ｃ１８、５０×２．１ｍｍ、２．５μｍ、温度：４０℃、流速：０．５ｍＬ／分、勾配：ｔ０分＝５％ Ａ、ｔ２．０分＝９８％ Ａ、ｔ２．７分＝９８％ Ａ、ポストタイム：０．３分、溶離液Ａ：アセトニトリル中の０．１％ ギ酸、溶離液Ｂ：水中の０．１％ ギ酸。
ＬＣ－ＭＳ 方法４
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．ポンプ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを伴うＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ、ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０～３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に依存する質量範囲：ｐｏｓ／ｎｅｇ １００～８００又はｎｅｇ ２０００～３０００；ＥＬＳＤ：気体圧力 ４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃ カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８、５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ、温度：２５℃、流速：０．５ｍＬ／分、勾配：ｔ０分＝５％ Ａ、ｔ２．０分＝９８％ Ａ、ｔ２．７分＝９８％ Ａ、ポストタイム：０．３分、溶離液Ａ：アセトニトリル、溶離液Ｂ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
分取方法
分取ＭＰ－ＬＣ方法１
機器タイプ：Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ（商標） ｐｒｅｐ ＭＰＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標） ＣＳＨ Ｃ１８（１４５×２５ｍｍ、１０μｍ）；流速：４０ｍｌ／分；カラム温度：室温；溶離液Ａ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム ｐＨ＝９．０；溶離液Ｂ：水中の９９％ アセトニトリル＋１％ １０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム；勾配：
Ａｔ０分＝５％ Ｂ、ｔ１分＝５％ Ｂ、ｔ２分＝１０％ Ｂ、ｔ１７分＝５０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
Ａｔ０分＝５％ Ｂ、ｔ１分＝５％ Ｂ、ｔ２分＝２０％ Ｂ、ｔ１７分＝６０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
；検出ＵＶ：２１０、２３５、２５４ｎｍ及びＥＬＳＤ。
分取ＭＰ－ＬＣ方法２
機器タイプ：Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ（商標）分取ＭＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＬＵＮＡ Ｃ１８（３）（１５０×２５ｍｍ、１０μｍ）；流速：４０ｍｌ／分；カラム温度：室温；溶離液Ａ：水中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸；勾配：
Ａｔ０分＝５％ Ｂ、ｔ１分＝５％ Ｂ、ｔ２分＝２０％ Ｂ、ｔ１７分＝６０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
Ｂｔ０分＝２％ Ｂ、ｔ１分＝２％ Ｂ、ｔ２分＝２％ Ｂ、ｔ１７分＝３０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
Ｃｔ０分＝５％ Ｂ、ｔ１分＝５％ Ｂ、ｔ２分＝１０％ Ｂ、ｔ１７分＝５０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
Ｄｔ０分＝５％ Ｂ、ｔ１分＝５％ Ｂ、ｔ２分＝５％ Ｂ、ｔ１７分＝４０％ Ｂ、ｔ１８分＝１００％ Ｂ、ｔ２３分＝１００％ Ｂ
；検出ＵＶ：２１０、２３５、２５４ｎｍ及びＥＬＳＤ。
分取ＬＣ－ＭＳ方法３
ＭＳ機器のタイプ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ６１３０Ｂ四重極；ＨＰＬＣ機器タイプ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２９０分取ＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ（Ｃ１８、１５０×１９ｍｍ、１０μｍ）；流速：２５ｍｌ／分；カラム温度：室温；溶離液Ａ：１００％ アセトニトリル；溶離液Ｂ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウムｐＨ＝９．０；勾配：
Ａｔ０＝２０％ Ａ、ｔ２．５分＝２０％ Ａ、ｔ１１分＝６０％ Ａ、ｔ１３分＝１００％ Ａ、ｔ１７分＝１００％ Ａ
Ｂｔ０＝５％ Ａ、ｔ２．５分＝５％ Ａ、ｔ１１分＝４０％ Ａ、ｔ１３分＝１００％ Ａ、ｔ１７分＝１００％ Ａ
；検出：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）；検出：ＭＳＤ（ＥＳＩ ｐｏｓ／ｎｅｇ）質量範囲：１００～８００；ＤＡＤに基づく分画収集物。
分取ＬＣ－ＭＳ方法４
ＭＳ機器のタイプ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ６１３０Ｂ四重極；ＨＰＬＣ機器タイプ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２９０分取ＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４、１５０×１９ｍｍ、１０μｍ）；流速：２５ｍｌ／分；カラム温度：室温；溶離液Ａ：１００％ アセトニトリル；溶離液Ｂ：水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウムｐＨ＝９．０；勾配：
Ａｔ０＝２％ Ａ、ｔ２．５分＝２％ Ａ、ｔ１１分＝３０％ Ａ、ｔ１３分＝１００％ Ａ、ｔ１７分＝１００％ Ａ
Ｂｔ０＝１０％ Ａ、ｔ２．５分＝１０％ Ａ、ｔ１１分＝５０％ Ａ、ｔ１３分＝１００％ Ａ、ｔ１７分＝１００％ Ａ
Ｃｔ０＝５％ Ａ、ｔ２．５分＝５％ Ａ、ｔ１１分＝４０％ Ａ、ｔ１３分＝１００％ Ａ、ｔ１７分＝１００％ Ａ
；検出：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）；検出：ＭＳＤ（ＥＳＩ ｐｏｓ／ｎｅｇ）質量範囲：１００～８００；ＤＡＤに基づく分画収集物
フラッシュクロマトグラフィー
Ｇｒａｃｅ Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ Ｘ２（登録商標）Ｃ－８１５ Ｆｌａｓｈ；溶媒送達系：自動プライミングを有する３位置ポンプ、１回の実行における最大４溶媒による４つの独立したチャネル、溶媒の枯渇時のラインの自動切り替え；最大ポンプ流速２５０ｍＬ／分；最大圧力５０ｂａｒ（７２５ｐｓｉ）；検出：ＵＶ ２００～４００ｎｍ、最大４ＵＶシグナル及び全体ＵＶ範囲のスキャンの組み合わせ、ＥＬＳＤ；カラムサイズ：機器に対して４～３３０ｇ、ルアータイプ、オプションのホルダーを伴って７５０ｇ～３０００ｇ。
ＵＶ－ｖｉｓ分光光度法
タンパク質濃度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００質量分析計を使用して決定し、以下の質量ε２８０値（（ｍｇ／ｍｌ）－１ｃｍ－１）を得た；Ｑ８ｃ（１．７７２）、Ｑ５２ｃ、（１．７６９）、Ｑ１７ｃ（１．８０２）及びＱ８６（ｃ）（２．２４６）。オリゴ濃度を、１５３，０００Ｍ－１ｃｍ－１のモルε２６０値を使用して決定した。エルマンアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ２５分光光度計及びＴＮＢに関する１４１５０Ｍ－１ｃｍ－１の文献のモルε４１２値を使用して実行した。実験的に決定されたモルε４９５＝５８，７００Ｍ－１ｃｍ－１及びＲｚ２８０：４９５＝０．４２８を、ＳＡＭＳ－フルオレセインのために使用した。
ＳＥＣ
コンジュゲートを、Ａｋｔａ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０システム及びＤＰＢＳ：ＩＰＡ（８５：１５）で溶出するＢｉｏｓｅｐ ＳＥＣ－ｓ３０００カラムを使用するＳＥＣによって分析した。コンジュゲート純度を、不純物／凝集体形態に関するコンジュゲートピークの積分によって決定した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
天然のタンパク質及びコンジュゲートを、４～１２％ ビス－トリスゲル及びランニング緩衝液としてのＭＥＳを使用するタンパク質ラダーに対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによる熱変性非還元及び還元条件下で分析した（２００Ｖ、約４０分）。ＬＤＳ試料緩衝液及び希釈液としてのＭＯＰＳランニング緩衝液を含む試料を０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。試料を還元するために、ＤＴＴを５０ｍＭの最終濃度まで加えた。試料を９０～９５℃で２分間熱処理し、５μｇ（１０μｌ）を各ウェルに加えた。タンパク質ラダー（１０μｌ）を、前処理を行わずにロードした。空の列を、１×ＬＤＳ試料緩衝液（１０μｌ）で満たした。ゲルに流した後、それを振盪させながらＤＩ水（１００ｍｌ）で３回洗浄した（１５分、２００ｒｐｍ）。クーマシー染色を、ゲルをＰＡＧＥＢｌｕｅタンパク質染色（３０ｍｌ）で振盪によりインキュベートすることによって実施した（６０分、２００ｒｐｍ）。過剰な染色溶液を除去し、ＤＩ水（１００ｍｌ）で２回すすぎ、ＤＩ水（１００ｍｌ）で脱色した（６０分、２００ｒｐｍ）。得られたゲルを画像化し、ｉｍａｇｅＪを使用して処理した。
ＴＢＥＵ－ＰＡＧＥ
未変性のタンパク質、コンジュゲート及びＢＮＡ標準物質を、１５％ ＴＢＥ－尿素ゲル及びランニング緩衝液としてのＴＢＥを使用するオリゴラダーに対するＴＢＥＵ－ＰＡＧＥによる熱変性非還元及び還元条件下で分析した（１８０Ｖ、約６０分）。それぞれＴＢＥ尿素試料緩衝液及び希釈液としての精製Ｈ２Ｏを含む試料を０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、ＢＮＡ標準物質を２０μｇ／ｍｌに調製した。試料及び標準物質を、７０℃で３分間熱処理し、１０μｌを各ウェルに加え、レーン当たり５μｇのタンパク質及びコンジュゲート試料、並びに０．２μｇのＢＮＡに相当する。ＴＥ ｐＨ７．５（２μｌ）中の０．１μｇ／バンド／ｍｌに再構成されたオリゴラダーを、前処理を行わずにロードした。ゲルに流した後、それを振盪させなが新たに調製されたエチジウムブロマイド溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色した（４０分、２００ｒｐｍ）。得られたゲルを、ＵＶ落射照明（２５４ｎｍ）により可視化し、ｉｍａｇｅＪを使用して画像化し、処理した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルを、ＭＡＬＤＩ－質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ）上で記録した。通常、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の範囲でＭｉｌｌｉＱ水に溶解された試料を、乾燥液滴法によりアセトニトリル（試験されたＭＡＤＬＩ－ＴＯＦ－ＭＳ、Ｓｉｇｍａ）／０．１％ ＴＦＡ（７：３ ｖ／ｖ）中に溶解されたマトリックスとしてｓｕｐｅｒ－ＤＨＢ（９９％、Ｆｌｕｋａ）又はシナピン酸（ＳＡ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを使用して標的（ＭＴＰ ３８４ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ ｐｏｌｉｓｈｅｄ ｓｔｅｅｌ Ｔ Ｆ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｓ）上にスポットした。ＰｅｐＭｉｘ（ペプチド較正標準物質、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｓ）又はＰｒｏｔｅＭａｓｓ（タンパク質較正標準物質、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は、較正標準物質として働いた。
ＶＨＨ－Ｌ－ＢＮＡ合成（図４０）
中間体１：
ＢＮＡ－ＤＴＭＥ（分子３）
ＴＢＳ ｐＨ７．５中の凍結乾燥されたＢＮＡの１０ｍｇ／ｍｌまでの再構成によって調製された一定分量のＡｐｏＢ ＢＮＡジスルフィド（９．４ｍｇ、１．６μｍｏｌ、１．００ｍｌ）に、一定分量の新たに調製されたＤＴＴ溶液（５０．０ｍｇ／ｍｌ、１０モル当量、１３．０μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＢＮＡ－ＳＨを、ＴＢＳ ｐＨ７．５で溶出するＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラムを使用するゲル濾過により＜１ｍｌまで濃縮し、精製した。得られたＢＮＡ－ＳＨ（６．４ｍｇ、１．１μｍｏｌ、２．００ｍｌ）を、ＤＭＳＯ中の新たに調製されたＤＴＭＥ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０モル当量、１１．０μｍｏｌ、０．１７１ｍｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ＢＮＡ－ＤＴＭＥ（５．４ｍｇ、０．９２μｍｏｌ、１．２２ｍｇ／ｍｌ）を、ＴＢＳ ｐＨ７．５にするＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラムを使用するゲル濾過による精製の後に得た。ＢＮＡ－ＤＴＭＥを、コンジュゲートされるまで２０℃で保管した。
ＶＨＨ－Ｌ－ＢＮＡ（分子５）
一定分量のＶＨＨ（３．０ｍｇ、０．２μｍｏｌ）を、ビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたＶＨＨ（２．８ｍｇ、０．１９μｍｏｌ、２．８３ｍｇ／ｍｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（５．０ｍｇ／ｍｌ、４モル当量、０．７７μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨ－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。得られたＶＨＨ－ＳＨ（２．０ｍｇ、０．１３μｍｏｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、ＶＨＨ：ＳＨ＝１．０）を、ＢＮＡ－ＤＴＭＥ（１．１モル当量、０．８３ｍｇ、０．１４μｍｏｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。生成物画分を回収し、プールし、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して＜１ｍｌに濃縮した。収量：０．８１ｍｇ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、２９％。
三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）（図４１、４２）
図４１～４４を参照して、ＶＨＨ、サポニン ＳＯ１８６１及びＡｐｏＢ ＢＮＡを含むコンジュゲートを、以下の分子構造を有する三官能性リンカーＴＦＬを使用して合成した：
Figure 2023532003000016
コンジュゲートＳＯ１８６１－Ｌ－ＡｐｏＢ ＢＮＡ－ＶＨＨ合成（ＶＨＨ－ＡｐｏＢ ＢＮＡ－ＳＯ１８６１コンジュゲート）が形成された。
ＳＯ１８６１－Ｌ－アジド（分子７）
ＳＯ１８６１（６０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）及び１－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－ヒドラジド（３９．３ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）に、メタノール（過乾燥、１．００ｍＬ）及びＴＦＡ（９．８６μｌ、０．１２９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（５８．４ｍｇ、８４％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 １００％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１５０［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：１．１０３Ｂ
中間体２：
三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（分子８）
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のＴＦＬ－（ＤＢＣＯ）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（１５ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）の溶液を、ＳＯ１８６１－Ｌ－アジド（２６．８ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）に加えた。反応混合物を３０分間振盪させ、室温で静置した。３０分後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１Ｃ生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（３１．４ｍｇ、７５％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３５４［Ｍ－１］１－
中間体３：
三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（ＴＯＣ）－（ＶＨＨ）（分子９）
一定分量のＶＨＨ（３．０ｍｇ、０．２μｍｏｌ）を、ビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたＶＨＨ（２．８ｍｇ、０．１９μｍｏｌ、２．８３ｍｇ／ｍｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（５．０ｍｇ／ｍｌ、４モル当量、０．７７μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。得られたＶＨＨ－ＳＨ（２．０ｍｇ、０．１３μｍｏｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、ＶＨＨ Ｑ８ｃ：ＳＨ＝１．０）を、ＴＦＬ－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（１．１モル当量、０．５ｍｇ、０．１５μｍｏｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。生成物画分を回収し、プールし、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して＜１ｍｌに濃縮した。収量：１．３ｍｇ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、５４％。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８０６２［Ｍ＋Ｎａ］１＋
中間体４：
メチルテトラジン－Ｌ－ＡｐｏＢ ＢＮＡ（分子１１）
ＡｐｏＢ ＢＮＡ－ジスルフィド（５．００ｍｇ、０．６８６μｍｏｌ）に、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ（１．００ｍＬ、２．５μｍｏｌ）を伴う２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウムの溶液を加えた。反応混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。１時間後、反応混合物を、３０００Ｄａの分子量カットオフを有する遠心フィルターを使用することによって濾過した（３０分間５０００×ｇ、２×０．５ｍＬ）。次に、残渣の溶液を、２．５ｍＭ ＴＣＥＰを伴う２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（０．５０ｍＬ）の溶液で２回洗浄し、上記の同じ条件下で毎回濾過した。次に、残渣の溶液を、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（１．５０ｍＬ）で希釈し、得られた混合物を、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中の（Ｅ）－１－（４－（（２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル）ヒドラジンイリデン）メチル）ベンズアミド）－Ｎ－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（１．３６ｍｇ、１．７３μｍｏｌ）の溶液に直接的に加えた。反応混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。３０分後、反応混合物を凍結させ、一晩凍結乾燥させて、桃色のふわふわした固体として粗製の標題の生成物を得た。粗生成物に、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（１．５０ｍＬ）の溶液を加え、得られた懸濁液を０．４５μｍシリンジフィルター上で濾過した。濾液を一晩凍結乾燥させて、桃色のふわふわした固体として標題の生成物（５．４４ｍｇ、定量的）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９０％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２６４８［Ｍ－３］３－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：０．６２４
三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）（分子１２）
ＤＰＢＳ ｐＨ７．５中で溶解された三官能性リンカー－（Ｌ－ＳＯ１８６１）－（ＴＣＯ）－（ＶＨＨ）（３ｍｇ、０．１６μｍｏｌ、０．４０ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、メチルテトラジン－ＢＮＡオリゴ（０．６３ｍｇ、９６ｎｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１分間振盪させ、一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。生成物画分を回収し、プールし、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して＜１ｍｌに濃縮した。収量：２．４ｍｇ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、６１％。
三官能性リンカー－（デンドロン（Ｌ－ＳＯ１８６１）４－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）（図４３及び４４）
図４１～４４を参照して、ＶＨＨ、デンドロン－（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４及びＡｐｏＢ ＢＮＡを含むコンジュゲートを、以下の分子構造を有する三官能性リンカー（ＴＦＬ）を使用して合成した：
Figure 2023532003000017
コンジュゲートデンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４－Ｌ－ＢＮＡ－ＶＨＨ合成（ＶＨＨ－ＢＮＡ－デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４コンジュゲート）が形成された。
デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４－アジド（分子１３）
デンドロン（ＳＯ１８６１）４－アミン（６．８１ｍｇ、０．７４８μｍｏｌ）及び１－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２．９０ｍｇ、７．４８μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．００ｍＬ）中で溶解した。次に、ＤＩＰＥＡ（１．３０２μＬ、７．４８μｍｏｌ）を加え、混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。２時間後、反応混合物を分取ＬＣ－ＭＳにかけた。３Ｃ生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（５．８６ｍｇ、８４％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９０％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２３４４［Ｍ－４］４－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：４．７８５Ｂ
中間体５：
三官能性リンカー－（デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（分子１４）
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のＴＦＬ－（ＤＢＣＯ）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（５ｍｇ、４．１μｍｏｌ）の溶液を、デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４－アジド（３９．４ｍｇ、４．２μｍｏｌ）に加えた。反応混合物を９０分間振盪させ、室温で静置した。９０分後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣにかけた。１Ｃ生成物に対応する画分を直ちに合わせてプールし、凍結させ、一晩凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体として標題の化合物（３１．２ｍｇ、７２％）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９６％。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０６１１［Ｍ＋Ｎａ］１＋
中間体６：
三官能性リンカー－（デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（ＴＯＣ）－（ＶＨＨ）（分子１５）
一定分量のＶＨＨ（３．０ｍｇ、０．２μｍｏｌ）を、ビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して限外濾過により濃縮し、ＴＢＳ ｐＨ７．５に緩衝液交換した。濃縮されたＶＨＨ（２．８ｍｇ、０．１９μｍｏｌ、２．８３ｍｇ／ｍｌ）に、一定分量の新たに調製されたＴＣＥＰ溶液（５．０ｍｇ／ｍｌ、４モル当量、０．７７μｍｏｌ）を加え、混合物を短時間ボルテックスし、続いてローラー混合により３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、得られたＶＨＨ－ＳＨを、ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用するゲル濾過により精製し、続いてビバスピンＴ４ ５ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用して遠心洗浄サイクルを繰り返してＴＢＳ ｐＨ７．５にした。得られたＶＨＨ－ＳＨ（２．０ｍｇ、０．１３μｍｏｌ、０．９０ｍｇ／ｍｌ、ＶＨＨ：ＳＨ＝１．０）を、ＴＦＬ－（デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（ＴＣＯ）－（マレイミド）（１．１モル当量、１．５ｍｇ、０．１４μｍｏｌ）と反応させ、混合物を短時間ボルテックスし、続いて２０℃で一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。生成物画分を回収し、プールし、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して＜１ｍｌに濃縮した。収量：０．９５ｍｇ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、２９％。ＶＨＨは、例えば、ＶＨＨ Ｑ８ｃ：ＳＨであり、これはＨＩＶｇｐ４１に結合するためのｓｄＡｂであり、クローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８Ｃ－タグによって生成されるか、又はＶＨＨは、例えば、ＶＨＨ ７Ｄ１２（配列番号７５）若しくはＶＨＨ ９Ｇ８（配列番号７６）、又は直列の２つのＶＨＨの７Ｄ１２－９Ｇ８（配列番号７４）である。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２９５［Ｍ＋Ｎａ］１＋
中間体４：
メチルテトラジン－Ｌ－ＡｐｏＢ ＢＮＡ（分子１１）
ＡｐｏＢ ＢＮＡジスルフィド（５．００ｍｇ、０．６８６μｍｏｌ）に、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ（１．００ｍＬ、２．５μｍｏｌ）を伴う２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウムの溶液を加えた。反応混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。１時間後、反応混合物を、３０００Ｄａの分子量カットオフを有する遠心フィルターを使用することによって濾過した（３０分間５０００×ｇ、２×０．５０ｍＬ）。次に、残渣の溶液を、２．５ｍＭ ＴＣＥＰを伴う２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（０．５０ｍＬ）の溶液で２回洗浄し、上記の同じ条件下で毎回濾過した。次に、残渣の溶液を、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（１．５０ｍＬ）で希釈し、得られた混合物を、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中の（Ｅ）－１－（４－（（２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル）ヒドラジンイリデン）メチル）ベンズアミド）－Ｎ－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（１．３６ｍｇ、１．７３μｍｏｌ）の溶液に直接的に加えた。反応混合物を１分間振盪させ、室温で静置した。３０分後、反応混合物を凍結させ、一晩凍結乾燥させて、桃色のふわふわした固体として粗製の標題の生成物を得た。粗生成物に、２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（１．５０ｍＬ）の溶液を加え、得られた懸濁液を０．４５μｍシリンジフィルター上で濾過した。濾液を一晩凍結乾燥させて、桃色のふわふわした固体として標題の生成物（５．４４ｍｇ、定量的）を得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度 ９０％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２６４８［Ｍ－３］３－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（分）：０．６２４
三官能性リンカー－（デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（Ｌ－ＢＮＡ）－（ＶＨＨ）（分子１６）
ＤＰＢＳ ｐＨ７．５中で溶解されたＴＦＬ－（デンドロン（－Ｌ－ＳＯ１８６１）４）－（ＴＣＯ）－（ＶＨＨ）（２．２ｍｇ、８７ｎｍｏｌ、０．４０ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、メチルテトラジン－ＢＮＡ（０．４ｍｇ、６０ｎｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１分間振盪させ、一晩インキュベートした。その後、反応混合物を、ビバスピンＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して濃縮し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５に溶出する１．６×３５ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを使用してゲル濾過により精製した。生成物画分を回収し、プールし、ビバスピンＴ４ １０ＫＤａ ＭＷＣＯ遠心チューブを使用して＜１ｍｌに濃縮した。収量：２．０ｍｇ、０．４０ｍｇ／ｍｌ、７３％。
参考文献
・Ｗｉｌｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）“ｓｄＡｂ－ＤＢ：Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄａｔａｂａｓｅ”，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（１１）：２４８０－２４８４．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．８ｂ００４０７
・Ｍａｒｔａ Ｋｉｊａｎｋａ ＆ Ｆｒａｎｋ－Ｊａｎ Ｗａｒｎｄｅｒｓ ＆ Ｍｏｈａｍｅｄ Ｅｌ Ｋｈａｔｔａｂｉ ＆ Ｍａｒｊｏｌｉｊｎ Ｌｕｂ－ｄｅ Ｈｏｏｇｅ ＆ Ｇｏｏｉｔｚｅｎ Ｍ．ｖａｎ Ｄａｍ ＆ Ｖａｓｉｌｉｓ Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ ＆ Ｌｉｅｓｂｅｔｈ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ＆ Ｓａｂｒｉｎａ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＆ Ｐａｕｌ Ｍ．Ｐ．ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ，“Ｒａｐｉｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ＶＨＨｓ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ｆｏｒ ｉｍａｇｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ”，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ（２０１３）４０：１７１８－１７２９ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５９－０１３－２４７１－２
・Ｋａｒｅｎ Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｒａｉｍｏｎｄ Ｈｅｕｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｉｒａｚ Ｆｒｙｄｍａｎ，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ（ＳＰＲｉ）－ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｑ１７ｃ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｈｏｒｉｂａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＳＰＲｉ ４２，２０１９
配列番号
配列番号１：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ２Ｒｂ１７ｃのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000018
配列番号２：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ２Ｒｂ１７ｃのアミノ酸配列
Figure 2023532003000019
配列番号３：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ＮＢ２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000020
配列番号４：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ＮＢ２のアミノ酸配列
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号５：抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｐｃＮＢ２、合成コンストラクトのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000021
配列番号６：抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｐｃＮＢ２、合成コンストラクトのアミノ酸配列
ＭＥＶＱＬＶＥＫＧＧＧＲＶＱＡＧＧＳＬＲＬＲＣＡＡＳＧＩＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＲＩＲＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＲＭＲＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＲＶＴＶＳＫＨＨＨＨＨＨ
配列番号７：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ７Ｄ１２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000022
配列番号８：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ７Ｄ１２のアミノ酸配列
ＡＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号９：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ９Ｇ８のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000023
配列番号１０：ラクダ科由来の抗ＨＥＲ１ ｓｄＡｂ ９Ｇ８のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１１：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ１、合成コンストラクトのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000024
配列番号１２：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ１、合成コンストラクトのアミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＶＩＮＤＦＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＶＡＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＶＧＧＲＤＬＧＷＰＹＥＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ２、合成コンストラクトのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000025
配列番号１４：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ２、合成コンストラクトのアミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＮＫＴＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＧＳＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＫＧＮＲＬＧＰＡＡＬＲＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１５：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ３、合成コンストラクトのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000026
配列番号１６：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ３、合成コンストラクトのアミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＲＶＮＹＫＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＴＳＲＮＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＲＡＨＨＡＰＶＲＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１７：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ４、合成コンストラクトのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000027
配列番号１８：抗ＶＧＦＲ２ ｓｄＡｂ ＮＴＶ４、合成コンストラクトのアミノ酸配列
ＡＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＶＴＩＴＤＥＤＭＴＲＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＬＮＴＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＨＥＫＡＡＤＭＮＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－８５のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000028
配列番号２０：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－８５のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＳＣＥＡＳＧＦＮＡＭＴＳＩＤＳＷＴＤＡＶＫＧＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＦＡＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＳＫＣＹＴＲＶＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２１：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－３７のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000029
配列番号２２：フタコブラクダ由来の抗ヒトＣＤ１９ ｓｄＡｂ ＳＲＢ－３７のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＹＭＶＧＩＫＴＥＲＤＧＶＫＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳＲＦＴＩＰＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＴＥＥＮＤＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２３：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ１６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000030
配列番号２４：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ１６のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＧＶＤＧＴＤＭＧＷＹＲＱＡＰＧＮＥＣＥＬＶＳＳＩＳＳＩＧＩＧＹＹＳＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＶＹＹＣＧＲＲＷＩＧＹＲＣＧＮＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ３６のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000031
配列番号２６：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ３６のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＲＹＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＶＡＩＴＡＦＧＳＰＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＮＮＴＩＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＭＹＹＣＡＡＲＧＳＳＧＴＳＹＫＷＮＥＹＧＳＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２７：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ９１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000032
配列番号２８：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ＣＴＬＡ－４ ｓｄＡｂ ＮＢ９１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＫＹＴＳＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＶＶＡＨＩＤＳＧＰＲＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＬＹＬＥＭＳＴＬＫＰＤＤＴＡＭＹＹＣＡＡＧＰＭＹＳＧＳＣＮＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２９：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ａ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000033
配列番号３０：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ａ１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＩＳＧＳＣＬＬＥＤＹＧＭＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３１：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ｂ１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列
Figure 2023532003000034
配列番号３２：ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）由来の抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｄＡｂ Ｂ１のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＮＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＧＳＥＧＲＲＹＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＡＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＴＶＧＦＣＳＳＱＹＧＭＥＦＶＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３３：抗マウス血清アルブミンｓｄＡｂ ＭＳＡ２１（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＦＴＦＳＲＦＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＶＥＷＶＳＧＩＳＳＬＧＤＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＮＰＧＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３４：抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ Ａｌｂ－１（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＮＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＥＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＴＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３５：抗ヒト血清アルブミンｓｄＡｂ Ａｌｂ２３（ヒト化、最適化Ａｌｂ１）（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＩＧＧＳＬＳＲＳＳＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３６：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ ７Ａ５（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＤＲＴＦＳＳＮＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＧＷＧＧＬＥＴＨＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＲＹＹＣＡＶＳＳＴＲＴＶＩＹＴＬＰＲＭＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３７：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ ７Ｄ１２（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３８：抗ＥＧＦＲ ＶＨＨ ７Ｃ１２（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＴＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３９：抗インスリン様増殖因子１受容体 ＶＨＨ ４Ｂ１１（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＴＦＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＶＩＩＳＧＧＳＴＨＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＭＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＫＫＦＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４０：抗インスリン様増殖因子１受容体 ＶＨＨ ３Ｇ７（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＳＩＳＴＩＮＶＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＲＳＧＲＴＮＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＮＬＥＤＴＡＶＹＹＣＲＴＩＤＧＳＷＲＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４１：抗インスリン様増殖因子１受容体 ＶＨＨ ２Ｃ７（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＮＹＡＩＶＩＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＦＶＡＡＩＮＷＮＳＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＬＮＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＤＣＡＡＳＨＤＳＤＹＧＧＴＮＡＮＬＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４２：抗インスリン様増殖因子１受容体 ＶＨＨ １Ｃ７（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＲＴＡＮＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＴＷＮＳＧＴＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＦＩＳＫＤＳＡＫＮＴＩＹＬＥＭＮＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＡＡＶＩＴＰＴＲＧＹＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４３：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨ ＮｂＣＥＡ５（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４４：抗ＣＥＡＣＡＭ ＶＨＨ ＣＥＡ５（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＹＧＳＹＷＭＧＷＦＲＱＡＰＧＱＥＲＥＡＶＡＡＩＮＲＧＧＧＹＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＤＤＴＡＤＹＹＣＡＡＳＧＶＬＧＧＬＨＥＤＷＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４５：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５７Ａ０７（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＶＭＧＷＹＲＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＡＳＧＧＳＩＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＳＨＰＰＴＬＰＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４６：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５７Ｂ０４（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＮＦＲＦＮＳＭＧＷＷＲＲＲＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＡＩＴＳＧＤＩＴＮＹＲＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＶＫＮＴＶＹＬＱＭＮＴＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＮＴＦＰＰＩＡＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４７：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５１Ｄ０９（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＧＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＳＳＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＡＩＬＬＹＲＬＹＧＹＥＥＧＤＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４８：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５５Ｃ０５（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＰＡＧＤＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＬＮＴＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＣＥＥＶＡＡＩＮＷＮＧＶＹＲＤＹＡＤＳＡＫＧＲＥＴＡＳＲＤＮＡＭＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＴＡＴＱＧＷＤＲＨＴＥＰＳＤＦＧＳＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４９：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５０Ｆ０７（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＧＳＴＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＳＧＧＲＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＲＩＳＡＧＴＡＦＷＬＷＳＤＹＥＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５０：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５５Ｆ０３（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＰＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＹＷＳＮＧＫＴＱＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＤＫＤＥＴＧＦＲＴＬＰＩＡＹＤＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５１：抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ ５５Ａ０１（生物体：人工；組換えペプチド）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＴＳＧＲＡＬＮＭＹＶＭＧＷＦＲＱＡＰＧＮＥＲＥＦＶＡＡＴＳＳＳＧＧＳＴＳＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＡＹＲＣＡＡＳＰＹＶＳＴＰＴＭＮＩＬＥＥＹＲＹＷＧＬＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５２：抗ＭＥＴ ＶＨＨ ０４Ｅ０９（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＬＣＩＤＡＳＤＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＴＰＩＧＬＳＳＳＣＬＬＥＹＤＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５３：抗ＭＥＴ ＶＨＨ ０６Ｂ０８（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＳＲＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＤＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＰＮＴＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＹＲＳＧＳＹＹＱＡＳＥＷＴＲＰＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５４：抗ＭＥＴ ＶＨＨ ０６Ｃ１２（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＤＹＦＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＥＩＳＣＩＳＮＳＤＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＩＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＴＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＰＶＧＬＧＰＦＣＫＴＴＮＤＹＤＹＳＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５５：抗ＭＥＴ ＶＨＨ ０６Ｆ１０（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＧＧＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＬＧＬＳＳＳＣＨＧＤＧＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ ２１Ｆ６（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＹＹＬＮＡＭＧＷＦＲＱＧＰＧＫＤＲＥＦＶＡＡＩＤＷＳＤＧＮＫＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＴＰＰＷＧＰＭＩＹＩＥＳＹＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５７：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ ４Ｃ７（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＡＷＶＳＴＶＳＰＧＧＩＴＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＤＬＮＮＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５８：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ １７Ｂ５（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＧＧＬＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＧＩＦＧＶＧＳＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＩＡＫＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＮＳＥＤＴＡＶＹＹＣＲＭＳＳＶＴＲＧＳＳＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５９：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ １８Ｇ１１（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＴＬＦＫＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＲＲＥＬＶＡＬＩＴＳＳＤＴＴＤＹＡＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＷＮＡＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＨＳＤＨＹＳＭＧＶＰＥＫＲＶＩＭＹＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６０：抗Ｈｅｒ３ ＶＨＨ ３４Ｃ７（生物体：人工配列）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＧＬＳＣＶＡＳＧＳＩＦＲＩＮＡＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＥＩＴＡＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＶＤＮＡＷＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＶＥＤＴＡＶＹＹＣＮＬＤＨＹＴＴＷＤＲＲＳＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ ４７Ｄ５（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＧＦＮＤＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＲＶＧＶＴＳＳＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＶＮＡＫＤＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＤＱＲＬＤＧＳＴＬＡＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ ２Ｄ３（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６３：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ ５Ｆ７（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＮＴＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＬＩＳＳＩＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＲＦＲＴＡＡＱＧＴＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６４：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １３Ｄ１１（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＨＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＮＰＥＤＴＡＶＹＹＣＧＱＧＷＫＩＶＰＴＮＰＲＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６５：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ ２Ｂ４（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＦＳＬＤＤＹＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＳＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＱＧＷＫＩＲＰＴＩＰＭＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６６：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ ２Ｇ２（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＳＬＤＤＹＧＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＮＬＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＲＧＷＫＩＶＰＴＤＬＧＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６７：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １３Ｇ１１（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＩＳＮＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＮＷＳＧＳＨＳＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＰＧＷＧＴＡＰＬＳＴＳＶＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６８：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １２Ｅ３３（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＭＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＬＳＮＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＹＤＡＤＦＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＧＷＧＴＧＲＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６９：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １３Ｆ２１（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＴＩＶＳＩＮＡＴＳＷＹＲＱＡＰＧＮＱＲＥＬＶＡＴＩＩＧＤＧＲＴＨＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＡＡＡＮＬＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＳＤＴＡＩＹＳＣＮＡＮＧＩＥＳＹＧＷＧＮＲＨＦＮＹＷＴＶＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７０：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １１Ａ１０１（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＰＧＶＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＴＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＤＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＬＡＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７１：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １１Ａ２２（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７２：抗Ｈｅｒ２ ＶＨＨ １２Ｄ４４（生物体：ラマ）のアミノ酸配列
ＫＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＡＷＦＲＱＡＰＧＴＥＲＥＦＩＡＧＩＲＷＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＡＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＧＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＦＹＶＳＴＬＡＨＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７３：二価ＶＨＨＥＧＦＲ－ジアンチン－Ｃｙｓのアミノ酸配列
Figure 2023532003000035
配列番号７４：二価ＶＨＨＥＧＦＲ－Ｃｙｓのアミノ酸配列
Figure 2023532003000036
配列番号７５：ＶＨＨ ７Ｄ１２のアミノ酸配列
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７６：ＶＨＨ ９Ｇ８のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

Claims (56)

  1. エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞中に移行させるためのコンジュゲートであって、直接的に又は少なくとも１つのリンカーを介して互いに共有結合された、前記細胞に移行されることになる少なくとも１つのエフェクター分子と、少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、少なくとも１つのサポニンとを含み、前記少なくとも１つのサポニンが、モノ－デスモサイドトリテルペングリコシドであるか又はバイ－デスモサイドトリテルペングリコシドであり、前記ｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合することができるコンジュゲート。
  2. 抗体、好ましくは、免疫グロブリンＧ起源、好ましくは、ヒト起源の重鎖に由来するＶＨドメイン；抗体、好ましくは、免疫グロブリンＧ起源、好ましくは、ヒト起源の軽鎖に由来するＶＬドメイン；ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源又は可変重鎖の新規の抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインなどのＩｇ－ＮＡＲ起源などの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）に由来する、好ましくは、前記ＨＣＡｂがラクダ科起源（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）に由来するものなどのＶＨＨドメインのいずれか１つ以上である、少なくとも１つのｓｄＡｂを含み；好ましくは、前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、ビクーナ、グアナコ及びフタコブラクダからのＨＣＡｂに由来するものなどのラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）起源（ラクダ類ＶＨ）のＨＣＡｂに由来するＶＨＨドメインである、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 前記少なくとも１つのエフェクター分子の１つ及び／若しくは前記少なくとも１つのサポニンの１つに共有結合された単一の第１のｓｄＡｂ、又は少なくとも１つのｓｄＡｂが前記少なくとも１つのエフェクター分子に結合され及び／若しくは少なくとも１つのｓｄＡｂが前記少なくとも１つのサポニンに結合される２つ以上のｓｄＡｂ、又は前記少なくとも１つのエフェクター分子のエフェクター分子若しくは前記少なくとも１つのサポニンのサポニン、又は両方にそれぞれ別々に結合される前記少なくとも２つのｓｄＡｂの全てとともに少なくとも２つのｓｄＡｂを含む、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、少なくとも２つのｓｄＡｂを含み、それらが同じｓｄＡｂであり、好ましくは、２～８つのｓｄＡｂ、より好ましくは、２～４つのｓｄＡｂであるか、又は前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、バイパラトピックである少なくとも２つのｓｄＡｂ、好ましくはバイパラトピックである２つのｓｄＡｂである、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. 細胞表面分子上の同じ結合部位に結合することができる１～８つのｓｄＡｂを含み、前記少なくとも１つのエフェクター分子及び／若しくは前記少なくとも１つのサポニンが前記１～８つのｓｄＡｂのうちの単一の第１のｓｄＡｂに結合されるか、又は前記少なくとも１つのエフェクター分子及び／若しくは前記少なくとも１つのサポニンが、存在する場合、前記ｓｄＡｂの２つ以上に結合され、前記少なくとも１つのエフェクター分子及び前記少なくとも１つのサポニンが、同じｓｄＡｂに結合されるか若しくは異なるｓｄＡｂに結合され、好ましくは、前記少なくとも１つのエフェクター分子の各々が別々のｓｄＡｂに結合され、並びに／又は前記少なくとも１つのサポニンの各々が別々のｓｄＡｂに結合され、エフェクター分子及びサポニンが同じｓｄＡｂに結合されるか若しくは別々のｓｄＡｂに結合される、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが単一のｓｄＡｂであるか若しくは少なくとも２つ、好ましくは２つのｓｄＡｂであり、前記ｓｄＡｂが、ＨＩＶｇｐ４１などの前記細胞の細胞表面分子に結合することができるか、又は前記ｓｄＡｂが、前記細胞の腫瘍細胞表面受容体などの前記細胞の細胞表面受容体、好ましくは、腫瘍細胞特異的受容体、より好ましくは、ＣＤ７１、ＣＡ１２５、ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＤ４４ｖ６、ＦＡＰ、ＥＧＦ－ＩＲ、インテグリン、シンデカン－１、血管性インテグリンアルファ－Ｖベータ－３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、葉酸受容体１、ＣＤ１４６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＣＤ２７Ｌ受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣａｎＡｇ、インテグリン－アルファＶ、ＣＡ６、ＣＤ３３、メソセリン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ２３９、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＣＤ２５、エフリンＡ４、ＭＵＣ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＥＲ３、ＣＤ７４、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ３、ＦＧＦ２、Ｃ４．４Ａ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＦＧＦＲ３、ＣＤ７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ５２、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＥＧＦＲ１、ＲＡＮＫＬ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＣＤ１６、ＣＸＣＲ７（ＡＣＫＲ３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）のいずれか１つ以上から選択される、最も好ましくはＨＥＲ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＸＣＲ７、ＣＤ７１、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ１から選択される受容体に結合することができる、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、単一のｓｄＡｂであるか又は少なくとも２つ、好ましくは、２つであり、前記ｓｄＡｂが、抗ＣＤ７１ ｓｄＡｂ、抗ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２０ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ１２５ ｓｄＡｂ、抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３０ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３３ ｓｄＡｂ、抗血管性インテグリンアルファ－ｖベータ－３ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５２ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ２２ ｓｄＡｂ、抗ＣＥＡ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ４４ｖ６ ｓｄＡｂ、抗ＦＡＰ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ１９ ｓｄＡｂ、抗ＣａｎＡｇ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ５６ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ３８ ｓｄＡｂ、抗ＣＡ６ ｓｄＡｂ、抗ＩＧＦ－１Ｒ ｓｄＡｂ、抗インテグリンｓｄＡｂ、抗シンデカン－１ ｓｄＡｂ、抗ＣＤ７９ｂ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｄＡｂ、抗ＥＧＦＲ１ ｓｄＡｂ、抗ＶＥＧＦＲ２ ｓｄＡｂ、抗ＣＸＣＲ７ ｓｄＡｂ、抗ＨＩＶｇｐ４１から選択され、前記ｓｄＡｂが、好ましくは、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである、請求項１～６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、ＨＥＲ２、ＣＤ７１、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はＥＧＦＲに結合することができるｓｄＡｂを含み、前記ｓｄＡｂが、好ましくは、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである、請求項１～７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  9. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、クローン１１Ａ４、クローン１８Ｃ３、クローン２２Ｇ１２、クローンＱ１７若しくはクローンＱ１７－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂから選択されるＨＥＲ２に結合するためのｓｄＡｂを含むか；又はＥＧＦＲに結合するための及びクローン抗ＥＧＦＲ Ｑ８６－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又はＣＤ７１に結合するための及びクローン抗ＣＤ７１ Ｑ５２－Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又はＨＩＶｇｐ４１に結合するための及びクローン抗ＨＩＶｇｐ４１ Ｑ８Ｃ－タグによって生成されるｓｄＡｂを含むか；又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１のいずれか１つのｃＤＮＡによってコードされるｓｄＡｂを含むか；又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６～７２のアミノ酸配列を有する前記ｓｄＡｂのいずれか１つを含むか、又は配列番号７４のアミノ酸配列を有する直列の２つのｓｄＡｂを含むか、又は配列番号７５として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ７Ｄ１２及び／又は配列番号７６として示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨＨ ９Ｇ８を含み、任意選択により、前記コンジュゲートがさらに、前記少なくとも１つのｓｄＡｂとは異なるさらなるｓｄＡｂであって、配列番号３３、３４及び３５のアミノ酸配列を有するさらなる前記ｓｄＡｂのいずれか１つ以上などの、アルブミンに結合するためのさらなるｓｄＡｂを含み、好ましくは、前記さらなるｓｄＡｂが、ＶＨＨ、より好ましくは、ラクダ類ＶＨである、請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  10. 前記エフェクター分子が、薬物分子などの小分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、異物性核酸又はｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、又はその任意の組み合わせの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  11. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、ベクター、遺伝子、細胞自殺誘導導入遺伝子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＡＯＮ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｍＲＮＡ、小環状ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホラミダイトモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、３’－フルオロヘキシトール核酸（ＦＨＮＡ）、プラスミド、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）、又はその誘導体、より好ましくは、ＢＮＡ、例えば、ＨＳＰ２７タンパク質発現をサイレンシングするためのＢＮＡ又はアポリポタンパク質Ｂ発現をサイレンシングするためのＢＮＡのいずれか１つ以上から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ，４’－アミノエチレン架橋核酸（ＢＮＡＮＣ）、ＢＮＡに基づくｓｉＲＮＡ、及びＢＮＡに基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ－ＡＯＮ）のいずれか１つ以上から選択されるオリゴヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、抗ｍｉＲＮＡ、ＢＮＡに基づくｓｉＲＮＡなどのＢＮＡ－ＡＯＮ又はｓｉＲＮＡのいずれか１つから選択される、好ましくは、化学修飾されたｓｉＲＮＡ、代謝的に安定なｓｉＲＮＡ、及び化学修飾され代謝的に安定なｓｉＲＮＡから選択されるオリゴヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、遺伝子を、そのような遺伝子を含む細胞中に存在するときにサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチドであり、前記遺伝子が、遺伝子：アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、デルタ－アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）、アンチトロンビン３（ＡＴ３）、グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）、補体成分Ｃ５（ＣＣ５）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＸ遺伝子、ＨＢＶのＳ遺伝子、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のいずれか１つであり、並びに／又は異常なｍｉＲＮＡを、そのような異常なｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在するときに標的化することができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  15. 前記エフェクター分子が、ｍＲＮＡを、そのようなｍＲＮＡを含む細胞中に存在するときに標的化することができるオリゴヌクレオチドであり、前記ｍＲＮＡが、タンパク質：ａｐｏＢ、ＴＴＲ、ＰＣＳＫ９、ＡＬＡＳ１、ＡＴ３、ＧＯ、ＣＣ５、ＨＢＶのＸ遺伝子の発現産物、ＨＢＶのＳ遺伝子の発現産物、ＡＡＴ及びＬＤＨのいずれか１つの発現に関与するか、又は発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏ－ｍｉＲ）の阻害又はｏｎｃｏ－ｍｉＲの発現の抑制などのｍｉＲＮＡ機能を、そのようなｍｉＲＮＡを含む細胞中に存在するときに弱めるか又は回復させることができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  16. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、好ましくは、ペプチド、タンパク質、酵素及びタンパク質毒素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのタンパク質性分子を含むか、又は請求項１～９のいずれか一項に依存するとき、それらからなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  17. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、ウレアーゼ及びＣｒｅ－リコンビナーゼ、タンパク質性毒素、リボソーム－不活性化タンパク質、タンパク質毒素、細菌毒素、植物毒素の少なくとも１つを含むか、又は請求項１～９のいずれか一項に依存するとき、その少なくとも１つからなり、より好ましくは、アポプチンなどのウイルス毒素；志賀毒素、志賀毒素様毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素（ＰＥ）又はＰＥの外毒素Ａ、全長又は短縮型ジフテリア毒素（ＤＴ）、コレラ毒素などの細菌毒素；アルファ－サルシンなどの真菌毒素；リボソーム不活性化タンパク質及びジアンチン、例えば、ジアンチン－３０又はジアンチン－３２、サポリン、例えば、サポリン－Ｓ３又はサポリン－Ｓ６、ボーガニン又はボーガニンの脱免疫化誘導体デボーガニン、志賀毒素様毒素Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシン、リシンＡ鎖、モデクシン、モデクシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ボルケンシン、ボルケンシンＡ鎖、ビスクミン、ビスクミンＡ鎖などの２型リボソーム不活性化タンパク質のＡ鎖を含む植物毒素；又はカエルＲＮａｓｅなどの動物若しくはヒト毒素、又はグランザイムＢ若しくはヒトアンジオゲニン、又はその任意の毒性断片若しくは毒性誘導体のいずれか１つ以上から選択され；好ましくは、前記タンパク質毒素が、ジアンチン及び／又はサポリンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  18. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、少なくとも１つのペイロードを含むか、又は請求項１～９のいずれか一項に依存するとき、少なくとも１つのペイロードからなる、請求項１～１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  19. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、リボソームを標的化する毒素、伸長因子を標的化する毒素、チューブリンを標的化する毒素、ＤＮＡを標的化する毒素及びＲＮＡを標的化する毒素の少なくとも１つ、より好ましくは、エムタンシン、パスードトクス、マイタンシノイド誘導体ＤＭ１、マイタンシノイド誘導体ＤＭ４、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ、マホドチン）、カリチアマイシン、Ｎ－アセチル－γ－カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、ベンゾジアゼピン、ＣＣ－１０６５類似体、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、シクロホスファミド、エトポシド、ドセタキセル、５－フルオロフラシル（５－ＦＵ）、ミトキサントン、ツブリシン、インドリノベンゾジアゼピン、ＡＺ１３５９９１８５、クリプトフィシン、リゾキシン、メトトレキサート、アントラサイクリン、カンプトテシン類似体、ＳＮ－３８、ＤＸ－８９５１ｆ、エキサテカンメシル酸塩、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素の短縮形態（ＰＥ３８）、デュオカルマイシン誘導体、アマニチン、α－アマニチン、スプライソスタチン、タイランスタチン、オゾガマイシン、テシリン、アンバースタチン２６９及びソラブタンシン、若しくはその誘導体のいずれか１つ以上を含むか、又は請求項１～９のいずれか一項に依存するとき、それらからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  20. 前記コンジュゲートが、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスードトクス及びポラツズマブベドチンに由来する少なくとも１つのｓｄＡｂを含むＡＤＣ、並びに／又はゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、モキセツモマブパスードトクス及びポラツズマブベドチンのいずれか１つ以上において存在する毒素であり及び／若しくはジアンチン及びサポリンから選択される少なくとも１つのエフェクター分子を含むＡＤＣなどの、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  21. 前記少なくとも１つのサポニンが、
    ２アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
    １６アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
    ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
    １６アルファ，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
    ギプソゲニン；
    キラ酸；
    プロトエシゲニン－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－２２－アセテート；
    ２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノエート）；
    ２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノエート）－１６，２２－ジアセテート；
    ジギトゲニン；
    ３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；
    ギプソゲニン酸；又は
    その誘導体
    から選択されるアグリコンコア構造を含み、
    好ましくは、少なくとも１つのサポニンが、キラ酸及びギプソゲニンから選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、前記少なくとも１つのサポニンが、アグリコンコア構造キラ酸を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 前記少なくとも１つのサポニンが、前記少なくとも１つのサポニンのアグリコンコア構造のＣ３原子又はＣ２８原子に結合された、好ましくは、前記Ｃ３原子に結合された第１の糖鎖、及び前記少なくとも１つのサポニンの前記アグリコンコア構造の前記Ｃ２８原子に結合された第２の糖鎖の一方又は両方を含み、好ましくは前記少なくとも１つのサポニンが、前記第１の糖鎖及び前記第２の糖鎖を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  23. 前記少なくとも１つのサポニンが、
    ＧｌｃＡ－、
    Ｇｌｃ－、
    Ｇａｌ－、
    Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－、
    Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－、
    Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－、
    Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－、
    Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－、及び
    その任意の誘導体
    から選択される前記第１の糖鎖を含み、
    並びに／又は
    前記少なくとも１つのサポニンが、
    Ｇｌｃ－、
    Ｇａｌ－、
    Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
    Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－、
    Ａｒａ－、
    Ｘｙｌ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１は、４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
    Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ２は、４Ｚ－メトキシケイ皮酸である）、
    Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ３は、４Ｅ－メトキシケイ皮酸である）、
    Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    （Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－又はＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－又はＦｕｃ－）、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ４は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ５は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    ６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ジ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    ６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－、
    Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ６は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ７は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ８は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ９は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１０は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１１は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－（式中、Ｒ１２は、５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸である）、
    Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－、及び
    その任意の誘導体
    から選択される前記第２の糖鎖を含む、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  24. 前記少なくとも１つのサポニンが、請求項２２又は２３の前記第１の糖鎖を含み及び請求項２２又は２３の前記第２の糖鎖を含み、前記第１の糖鎖が２個以上の糖部分を含み、及び前記第２の糖鎖が２個以上の糖部分を含み、前記アグリコンコア構造が、好ましくは、キラ酸又はギプソゲニン、より好ましくはキラ酸であり、
    ｉ．前記アグリコンコア構造中のアルデヒド基が誘導体化されている、
    ｉｉ．前記第１の糖鎖におけるグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている、及び
    ｉｉｉ．前記第２の糖鎖における少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基が誘導体化されている
    の１、２又は３つ、好ましくは１つ又は２つである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記少なくとも１つのサポニンが、
    ｉ．
    － アルコールへの還元；
    － Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）であって、前記ＥＭＣＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＥＭＣＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換；
    － Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）であって、前記ＢＭＰＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＢＭＰＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換；又は
    － Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）であって、前記ＫＭＵＨのマレイミド基が、メルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により任意選択により誘導体化されるＫＭＵＨとの反応を介するヒドラゾン結合への転換
    によって誘導体化されているアルデヒド基を含むアグリコンコア構造；
    ｉｉ．２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）又はＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介するアミド結合への転換によって誘導体化されているカルボキシル基、好ましくは、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含む第１の糖鎖；
    ｉｉｉ．脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への転換によって誘導体化されているアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）を含む第２の糖鎖；又は
    ｉｖ．２つ又は３つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉ．の任意の組み合わせ、好ましくは、２つの誘導体化ｉ．、ｉｉ．及び／又はｉｉｉの任意の組み合わせ
    を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  26. 前記少なくとも１つのサポニンが、キラヤ属（Ｑｕｉｌｌａｊａ）樹皮サポニン、ディプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシン酸塩、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、アルファ－ヘデリン、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＡＥ Ｘ５５、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１、ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１９０４、ＳＯ１８６２、ＱＳ－７、ＱＳ１８６１、ＱＳ－７ ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ、ベータ－エスシン、エスシンＩａ、ティーシードサポニンＩ、ティーシードサポニンＪ、アッサムサポニンＦ、ジギトニン、プリムラ酸１及びＡＳ６４Ｒ、若しくはその誘導体、若しくはその立体異性体、及び／又はその任意の組み合わせ、好ましくはＱＳ－２１又はＱＳ－２１誘導体、ＳＯ１８６１又はＳＯ１８６１誘導体、ＳＡ１６４１又はＳＡ１６４１誘導体及びＧＥ１７４１又はＧＥ１７４１誘導体のいずれか１つ以上、より好ましくはＱＳ－２１誘導体又はＳＯ１８６１誘導体、最も好ましくはＳＯ１８６１誘導体、例えば、請求項２４又は２５のサポニン誘導体のいずれか１つ以上である、請求項１～２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  27. 前記少なくとも１つのサポニンが、ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナムアルバム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシドＡ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、若しくはその誘導体、若しくはその立体異性体、及び／又はその任意の組み合わせのいずれか１つ以上であり、好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体及び／又はＧＥ１７４１誘導体及び／又はＳＡ１６４１誘導体及び／又はＱＳ－２１誘導体であり、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体又はＱＳ２１誘導体であり、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、請求項２４又は２５によるＳＯ１８６１誘導体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  28. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂを含み、前記細胞が、腫瘍細胞、自己免疫細胞、ウイルス感染細胞などの感染細胞、又は遺伝子欠損若しくは酵素欠損を含む細胞などの異常な細胞である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  29. 前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子に結合するためのｓｄＡｂであって、免疫グロブリン：ＩｇＧ型ＯＫＴ－９などの抗ＣＤ７１抗体、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブイブリツモマブなどの抗ＣＤ２０抗体、オレゴボマブなどの抗ＣＡ１２５抗体、エドレコロマブなどの抗ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）抗体、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体、ブレンツキシマブなどの抗ＣＤ３０抗体、ゲムツズマブ、ｈｕＭｙ９－６などの抗ＣＤ３３抗体、エタラシズマブなどの抗血管性インテグリンアルファ－ｖベータ－３抗体、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体、エプラツズマブ、ピナツズマブなどの抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２２抗体モキセツモマブの結合断片（Ｆｖ）、ヒト化モノクローナル抗体イノツズマブ、ラベツズマブなどの抗ＣＥＡ抗体、ビバツズマブなどの抗ＣＤ４４ｖ６抗体、シブロツズマブなどの抗ＦＡＰ抗体、ｈｕＢ４などの抗ＣＤ１９抗体、ｈｕＣ２４２などの抗ＣａｎＡｇ抗体、ｈｕＮ９０１などの抗ＣＤ５６抗体、ダラツムマブなどの抗ＣＤ３８抗体、ＯＫＴ－１０抗ＣＤ３８モノクローナル抗体、ＤＳ６などの抗ＣＡ６抗体、シズツムマブなどの抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体、３Ｂ７、ＣＮＴＯ ９５などの抗インテグリン抗体、Ｂ－Ｂ４などの抗シンデカン－１抗体、ポラツズマブなどの抗ＣＤ７９ｂ、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体のいずれか１つ以上、好ましくは、抗ＨＩＶｇｐ４１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体のいずれか１つ、より好ましくは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、マツズマブ、抗ＣＤ７１抗体、ＯＫＴ－９、最も好ましくは、トラスツズマブ、セツキシマブ、抗ＣＤ７１抗体 ＯＫＴ－９のいずれか１つに由来するか又は基づく前記ｓｄＡｂを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  30. 前記少なくとも１つのエフェクター分子が、少なくとも１つのｓｄＡｂ、好ましくは、前記少なくとも１つのｓｄＡｂのうちの１つ及び／若しくは前記少なくとも１つのサポニンのうちの少なくとも１つ、好ましくは１つにリンカーを介して共有結合されるか若しくは前記ｓｄＡｂ及び／若しくは前記サポニンに直接的に共有結合され、並びに／又は前記少なくとも１つのサポニンが、少なくとも１つのｓｄＡｂ、好ましくは、前記少なくとも１つのｓｄＡｂのうちの１つ及び／若しくは少なくとも１つのエフェクター分子、好ましくは、前記少なくとも１つのエフェクター分子のうちの１つにリンカーを介して共有結合されるか若しくは前記ｓｄＡｂ及び／若しくは前記エフェクター分子に直接的に共有結合される、請求項１～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  31. 前記コンジュゲートが、前記少なくとも１つのｓｄＡｂ、前記少なくとも１つのサポニン及び前記少なくとも１つのエフェクター分子の各々が、好ましくは別々に、直接的に、又はリンカーを介して三官能性リンカーに共有結合された前記三官能性リンカーを含み、好ましくは、前記コンジュゲートが、１つのｓｄＡｂ、前記少なくとも１つのサポニン、及び少なくとも１つ、好ましくは、１つのエフェクター分子が別々に、直接的に、又はリンカーを介して三官能性リンカーに共有結合された前記三官能性リンカーを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  32. 前記少なくとも１つのサポニンが、前記少なくとも１つのｓｄＡｂの１つ及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子の１つにおけるスルフヒドリル基に対するチオ－エーテル結合を介して共有結合され、前記共有結合が、好ましくは、前記サポニンの前記アグリコンコア構造のＣ２３位におけるアルデヒド基に共有結合され及びシステインのスルフヒドリル基などの前記ｓｄＡｂ及び／又は前記エフェクター分子における前記スルフヒドリル基に共有結合されるリンカーＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）を介するものである、請求項１～３１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  33. 前記少なくとも１つのサポニンが、Ｃ２３位においてアルデヒド官能基を任意選択により有する１２，１３－デヒドロオレアナンの型に属し及び前記サポニンの前記アグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基で結合される第１の糖鎖においてグルクロン酸単位を含むバイ－デスモサイドトリテルペンサポニン又はその誘導体であり、前記サポニンが、前記第１の糖鎖における前記グルクロン酸単位の前記カルボキシル基を介して、好ましくは、リンカーを介して前記少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子のアミノ酸残基に共有結合され、前記アミノ酸残基が、好ましくは、システイン及びリジンから選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  34. 前記少なくとも１つのサポニンが、前記サポニンの前記アグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基での前記第１の糖鎖においてグルクロン酸単位を含み、グルクロン酸単位がリンカーに共有結合され、リンカーが、好ましくは、前記ｓｄＡｂ及び／又は前記エフェクター分子のリジン又はＮ末端のアミン基などの前記少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子におけるアミン基にアミド結合を介して共有結合され、好ましくは、前記リンカーが、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. 前記少なくとも１つのサポニンの２つ以上の共有結合されたサポニン部分、好ましくは、そのような部分の２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２、６４、１２８若しくは１～１００個、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のそのような部分を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  36. 前記２つ以上の共有結合されたサポニン部分が、前記少なくとも１つのｓｄＡｂ及び／若しくは前記少なくとも１つのエフェクター分子のアミノ酸残基に、好ましくは、システイン及び／若しくはリジンに直接的に共有結合され、並びに／又はリンカー及び／若しくは切断可能なリンカーを介して共有結合される、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  37. 前記２つ以上の共有結合されたサポニン部分が、前記サポニンが共有結合されるオリゴマー分子又はポリマー分子を含む共有結合性サポニンコンジュゲートの一部であり、及び前記ｓｄＡｂもまた、前記サポニンが結合される同じオリゴマー分子又はポリマー分子に共有結合され、並びに前記エフェクター部分が、前記ｓｄＡｂ又は前記オリゴマー分子若しくは前記ポリマー分子に共有結合され、好ましくは、前記サポニンを含む１～８個のそのようなオリゴマー分子又はポリマー分子が前記ｓｄＡｂに共有結合されるか、又は前記サポニンを含む２～４個の前記オリゴマー分子又はポリマー分子が前記ｓｄＡｂに共有結合され、前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子が、任意選択により、それぞれ４、８、１６又は３２個のサポニン部分を共有結合するための４、８、１６及び３２個の結合部位を有するＧ２デンドロン、Ｇ３デンドロン、Ｇ４デンドロン又はＧ５デンドロンなどのデンドロンであり、任意選択により、１～３２個のサポニン部分、好ましくは、２、３、４、５、６、８、１０、１６、３２個のそのような部分、又は７、９、１２個のサポニン部分などのその間の任意の数のそのような部分が、直接的に又はリンカーを介して、少なくとも１つの前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子に共有結合される、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  38. 前記少なくとも１つのサポニンが、切断可能なリンカーを介して前記少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つに共有結合される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  39. 前記切断可能なリンカーが、酸性条件、還元的条件、酵素的条件及び／又は光誘導性条件下で切断にかけられ、好ましくは、前記切断可能なリンカーが、酸性条件下で切断にかけられるヒドラゾン結合及びヒドラジド結合、並びに／又はタンパク質分解、例えば、カテプシンＢによるタンパク質分解に影響されやすい結合、並びに／又はジスルフィド結合などの還元的条件下で切断されやすい結合から選択される切断可能な結合を含む、請求項３８に記載のコンジュゲート。
  40. 前記切断可能なリンカーが、例えば、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞のエンドソーム及び／又はリソソームに存在するような酸性条件下、好ましくは、ｐＨ４．０～６．５、より好ましくは、ｐＨ≦５．５でインビボでの切断にかけられる、請求項３８又は３９に記載のコンジュゲート。
  41. 前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子が、前記少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つに、好ましくは、前記ｓｄＡｂ及び／又は前記エフェクター分子のアミノ酸残基に共有結合される、請求項３７に記載の又は請求項３７に依存するとき請求項３８～４０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  42. 前記少なくとも１つのサポニンが、請求項３８～４０のいずれか一項による切断可能なリンカーを介して前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子に共有結合される、請求項４１に記載のコンジュゲート。
  43. 前記少なくとも１つのサポニンが、イミン結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジド結合、オキシム結合、１，３－ジオキソラン結合、ジスルフィド結合、チオ－エーテル結合、アミド結合、ペプチド結合又はエステル結合のいずれか１つ以上を介して、好ましくはリンカーを介して、前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子に共有結合される、請求項４１又は４２に記載のコンジュゲート。
  44. 前記少なくとも１つのサポニンが、Ｃ２３位におけるアルデヒド官能基を含むアグリコンコア構造を含み、及び前記少なくとも１つのサポニンが、任意選択により、前記サポニンの前記アグリコンコア構造のＣ３ベータ－ＯＨ基で第１の糖鎖においてグルクロン酸官能基を含み、アルデヒド官能基が、前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又はポリマー分子への共有結合に関与し、及び／又は存在する場合、前記グルクロン酸官能基が、直接的な共有結合を介する、又はリンカーを介するサポニンの結合である前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子に対する共有結合に関与する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  45. 前記少なくとも１つのサポニンの前記アグリコンコア構造のＣ２３位における前記アルデヒド官能基が、リンカーＥＭＣＨに共有結合され、ＥＭＣＨが、システインのスルフヒドリル基などの前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子におけるスルフヒドリル基に対するチオ－エーテル結合を介して共有結合される、請求項４４に記載のコンジュゲート。
  46. 前記サポニンの前記アグリコンコア構造の前記Ｃ３ベータ－ＯＨ基での前記第１の糖鎖における前記グルクロン酸官能基が、リンカーＨＡＴＵに共有結合され、ＨＡＴＵが、タンパク質のリジン又はＮ末端のアミン基などの前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記オリゴマー分子又は前記ポリマー分子におけるアミン基に対するアミド結合を介して共有結合される、請求項４４又は４５に記載のコンジュゲート。
  47. 前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子が、前記少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは１つ、及び／又は前記少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つ、好ましくは１つに、好ましくは前記ｓｄＡｂのアミノ酸残基及び／又は前記エフェクター分子のアミノ酸残基に結合され、前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子上のクリックケミストリー基を含み、前記クリックケミストリー基が、好ましくは、テトラジン、アジド、アルケン若しくはアルキン、又はこれらの基の環状誘導体から選択され、より好ましくは、前記クリックケミストリー基が、アジドである、請求項４１～４６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  48. 前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子が、直鎖状ポリマー、分岐状ポリマー及び／又は環状ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、Ｇ２デンドロン又はＧ３デンドロンなどのデンドロン、デンドロン化ポリマー、デンドロン化オリゴマー、ＤＮＡ、ポリペプチド、ポリ－リジン、ポリ－エチレングリコール、ＯＥＧ３、ＯＥＧ４及びＯＥＧ５などのオリゴ－エチレングリコール（ＯＥＧ）、又は集合体が好ましくは共有結合的な架橋によって構築されるこれらのポリマー構造及び／又はオリゴマー構造の集合体から選択されるポリマー構造及び／又はオリゴマー構造を含み、好ましくは、前記共有結合性サポニンコンジュゲートの前記ポリマー分子又は前記オリゴマー分子がポリ－アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーなどのデンドロンである、請求項４１～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  49. 前記少なくとも１つのサポニンが、三官能性リンカー、好ましくは、構造Ａ：
    Figure 2023532003000037
    によって表される前記三官能性リンカーを介して前記少なくとも１つのｓｄＡｂの少なくとも１つ、好ましくは１つに共有結合され、及び前記少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つ、好ましくは１つに共有結合され、
    前記コンジュゲートが、好ましくは、構造Ａの前記三官能性リンカーを含み、及び構造Ｂ：
    Figure 2023532003000038
    によって表される分子構造を有し、
    Ｓが、請求項３７及び４１～４８のいずれか一項に記載の前記少なくとも１つのサポニン又は前記共有結合性サポニンコンジュゲートであり、Ｅが、少なくとも１つ、好ましくは１つの前記エフェクター分子であり、Ａが、単一のｓｄＡｂなどの前記少なくとも１つのｓｄＡｂであり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３がそれぞれ個別に、それぞれ前記三官能性リンカー及び前記サポニン又は前記共有結合性サポニンコンジュゲート、前記エフェクター分子及び前記ｓｄＡｂ間の結合であるか、又はＬ１、Ｌ２及びＬ３がリンカー（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、同じであるか又は異なる）である、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  50. 請求項１～４９のいずれか一項に記載のコンジュゲート、並びに任意選択により薬学的に許容される賦形剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物。
  51. 医薬としての使用のための請求項５０に記載の医薬組成物。
  52. 癌、関節リウマチなどの自己免疫疾患、酵素欠損症、酵素欠損症に関連する疾患、遺伝子欠損、遺伝子欠損に関連する疾患、ウイルス感染などの感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、アミロイドーシス及びトランスサイレチン媒介性アミロイドーシスのいずれか１つ以上の治療又は発症予防における使用のための、請求項５０に記載の医薬組成物。
  53. 前記サポニンが、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１誘導体、ＱＳ－２１、又はＱＳ－２１誘導体、好ましくはＳＯ１８６１誘導体又はＱＳ－２１誘導体、より好ましくは請求項２４～２７のいずれか一項に記載のＳＯ１８６１誘導体である、請求項５１又は５２に記載の医薬組成物。
  54. － 前記使用が、ヒト対象における癌の治療又は予防におけるものであり；及び／又は
    － 前記使用が、必要とする患者における癌の治療若しくは発症予防におけるものであり、前記少なくとも１つのｓｄＡｂが、前記細胞の細胞表面分子、好ましくは、前記細胞の腫瘍細胞表面分子、より好ましくは、前記細胞の腫瘍細胞特異的表面分子に結合し；及び／又は
    － 前記医薬組成物、好ましくは、治療有効量の前記医薬組成物が、必要とする患者、好ましくは、ヒト患者に投与される、請求項５２又は５３に記載の使用のための医薬組成物。
  55. 請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記エフェクター分子を細胞の外部から前記細胞の内部に、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させるための、インビトロ又はエクスビボでの方法であって、
    ａ）その細胞表面上で、請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記コンジュゲートによって含まれる前記少なくとも１つのｓｄＡｂのための前記結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、請求項４～９、２０、２８又は２９のいずれか一項に記載の前記細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
    ｂ）請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記コンジュゲートであって、工程ａ）において提供される前記細胞に移行されることになる前記エフェクター分子を含む前記コンジュゲートを提供する工程；及び
    ｃ）工程ａ）の前記細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）の前記コンジュゲートと接触させる工程
    を含み、
    それにより、前記エフェクター分子を含む前記コンジュゲートを、前記細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程、及び、前記コンジュゲートの移行により、前記エフェクター分子を前記細胞の外部から前記細胞の内部、好ましくは、前記細胞の細胞質ゾルに移行させる工程
    を含む、方法。
  56. 請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記コンジュゲートを細胞の外部から前記細胞の内部に移行させるための、インビトロ又はエクスビボでの方法であって、
    ａ）その細胞表面上で、請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記コンジュゲートによって含まれる前記少なくとも１つのｓｄＡｂのための前記結合部位であって、前記結合部位が、好ましくは、請求項４～９、２０、２８又は２９のいずれか一項に記載の前記細胞の細胞表面分子上に存在し、前記細胞が、好ましくは、肝臓細胞、ウイルス感染細胞などの異常な細胞、自己免疫細胞、遺伝子欠損を含む細胞、酵素欠損を含む細胞及び腫瘍細胞から選択される結合部位を発現する細胞を提供する工程；
    ｂ）請求項１～４９のいずれか一項に記載の前記コンジュゲートを提供する工程；及び
    ｃ）工程ａ）の前記細胞をインビトロ又はエクスビボで工程ｂ）の前記コンジュゲートと接触させる工程を含み、それにより、前記コンジュゲートを前記細胞の外部から前記細胞の内部に移行させる工程
    を含む方法。
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